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特表2022-514407新規ドロシグラニュラム ピグラム(DOLOSIGRANULUM PIGRUM)株およびその使用
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(54)【発明の名称】新規ドロシグラニュラム ピグラム(DOLOSIGRANULUM PIGRUM)株およびその使用
(51)【国際特許分類】
   C12N 1/20 20060101AFI20220203BHJP
   A61P 31/10 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 31/04 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 11/02 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 27/16 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 37/08 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 17/00 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 11/00 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 11/06 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 11/14 20060101ALI20220203BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20220203BHJP
   A61K 35/741 20150101ALI20220203BHJP
   A61K 35/747 20150101ALI20220203BHJP
   A23L 33/135 20160101ALI20220203BHJP
【FI】
C12N1/20 A
A61P31/10 ZNA
A61P31/04
A61P11/02
A61P27/16
A61P37/08
A61P17/00 101
A61P11/00
A61P11/06
A61P11/14
A61P43/00 105
A61K35/741
A61K35/747
C12N1/20 E
A23L33/135
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021535728
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(85)【翻訳文提出日】2021-08-17
(86)【国際出願番号】 EP2019086763
(87)【国際公開番号】W WO2020128022
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】18215583.8
(32)【優先日】2018-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.TWEEN
(71)【出願人】
【識別番号】307020198
【氏名又は名称】ユニバーシタット アントウェルペン
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(74)【代理人】
【識別番号】100163544
【弁理士】
【氏名又は名称】平田 緑
(74)【代理人】
【識別番号】100183656
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 晃
(72)【発明者】
【氏名】レベール,サラ
(72)【発明者】
【氏名】ヨリッセン,ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】デ ブック,イルク
【テーマコード(参考)】
4B018
4B065
4C087
【Fターム(参考)】
4B018MD85
4B018ME09
4B065AA01X
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AA42X
4B065AA49
4B065AA53X
4B065AA57X
4B065AA73X
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC55
4C087BC56
4C087CA09
4C087NA14
4C087ZA34
4C087ZA59
4C087ZA62
4C087ZA90
4C087ZB13
4C087ZB21
4C087ZB35
4C087ZC61
(57)【要約】
本発明は、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の単離された新規細菌株およびその新規株に対してその16SrRNA遺伝子の少なくとも99%の配列同一性を有するその変異体に関する。本発明はさらに、これらの細菌株の使用、および気道および皮膚の細菌叢/微生物叢を改善または回復するためなどのプロバイオティクスとして使用するための前記株を含む組成物に関する。本発明はさらに、ヒト医薬または獣医薬に使用するため、ヒトまたは動物の病気の治療に使用するため、または、個人衛生産業、食品産業、クリーニング産業、製薬産業、または生物的防除用途に使用するための、抗菌剤としてのこれらの細菌株の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株から選択される株との16S rRNAにおいて少なくとも99%の配列同一性を有する単離されたドロシグラニュラムピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の細菌株。
【請求項2】
前記株は、アクセッション番号LMG P-31124またはLMGP-31154で寄託された株を含むリストから選択される、請求項1に記載の細菌株。
【請求項3】
請求項1または2に記載の細菌株を含む組成物。
【請求項4】
請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物の、プロバイオティクスとしての使用、もしくは気道および皮膚の細菌叢/微生物叢を改善または回復するためのプロバイオティクスとして使用。
【請求項5】
請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物の、抗病原性剤としての使用、または
請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物の、抗病原性剤としての使用であって、前記抗病原性剤は、以下を含むリストから選択される1つまたは複数の細菌に対して有効である: コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(Corynebacterium tuberculostearicum)、C.アクコレンス(C. accolens)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、H.エジプチウス(H.aegyptius)、プレボテラ(Prevotella)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、モラクセラ カタラーリス(Moraxellacatarrhalis)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、赤痢菌(Shigella)/大腸菌(E. coli);スタフィロコッカス ヒイカス(Staphylococcus hyicus)、スタフィロコッカス種(Staphylococcusspp)、 インフルエンザ菌(Haemophilus influenze)、ヘモフィルス エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、プレボテラ種(Prevotellaspp) ;および/またはカンジダによる真菌感染症に対して有効である、使用。
【請求項6】
ヒト医薬または獣医薬に使用するための、請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物。
【請求項7】
鼻咽腔(oronasopharyngeal cavity)の障害、例えば、急性および慢性(鼻)副鼻腔炎、急性および慢性中耳炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、喘息および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による皮膚感染、嚢胞性線維症、肺炎、肺障害を含むリストから選択される疾患の治療に使用するための、請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物。
【請求項8】
製薬産業、バイオテクノロジー産業、個人衛生産業、食品産業、または生物的防除用途での、請求項1または2に記載の細菌株、または請求項3の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の単離された新規細菌株およびその新規株に対してその16SrRNA遺伝子の少なくとも99%の配列同一性を有するその変異体に関する。本発明はさらに、これらの細菌株の使用、および気道および皮膚の細菌叢/微生物叢を改善または回復するためなどのプロバイオティクスとして使用するための前記株を含む組成物に関する。本発明はさらに、ヒト医薬または獣医薬に使用するため、ヒトまたは動物の病気の治療に使用するため、または、個人衛生産業、食品産業、クリーニング産業、製薬産業、または生物的防除用途に使用するための、抗菌剤としてのこれらの細菌株の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
上気道の感染症は、世界中の人間と動物における抗生物質使用の主要な原因の1つである。小児では、上気道(URT)感染の最も一般的な結果の1つは、中耳炎(OM)である。OMは、中耳腔への体液の蓄積と中耳裂の炎症を特徴とする一連の病状を包含する。急性中耳炎(AOM)は、中耳内のウイルス性または細菌性病原体による急性感染の急速な発症であり、耳痛や発熱などの兆候や症状を特徴とする。AOMの抗生物質処方率は、オランダの56%から米国の95%までさまざまである。抗生物質耐性とマイクロバイオームの巻き添え被害の世界的な問題(2050年までに癌よりも多くの人を殺すと推定された;医療が直面している主要な問題の1つとしてWHOによって特徴づけられた)のために、抗生物質の使用を減らすことができるすべての努力が考慮されるべきことは明らかである。慢性副鼻腔炎(CRS)は、鼻腔と副鼻腔の炎症を特徴とする慢性炎症性疾患であり、症状は12週間以上続く。これは、一般に2つの主要な表現型:鼻ポリープを伴うCRS(CRSwNP)と鼻ポリープを伴わないCRS(CRSsNP)が区別される異種性の疾患である。しかしながら、CRSwNPおよびCRSsNPでCRSを細分類しても、根本的な病態生理学に対する完全な洞察は得られない。根底にある病理をよりよく理解し、特定のマイクロバイオームの特徴などの新しい生物学的マーカーを特定し、患者のサブグループをさらに区別し、新しい治療戦略を開発する必要があることは明らかである。ほとんどのCRS患者は、抗生物質による治療を受けるが、それほど安心するものではない。また、動物では、抗生物質は、根本的な細菌の原因を常に知ることなく、気道感染症を予防または治療するために頻繁に使用される。
【0003】
近年、研究により、細菌の多様性の変化と特定の病原性細菌の関与に基づいて、OMおよびCRSの病理学におけるマイクロバイオームの役割の可能性が明らかになったが、結果は矛盾している。OMおよびCRSのマイクロバイオームの多様性に関連して、いくつかの研究では細菌のアルファ多様性(サンプル中の細菌分類群の数)の減少が報告されているが、他の研究ではアルファ多様性に有意差は見られていない。いくつかの研究グループはまた、OMとCRSの病理学において潜在的な原因となるまたは有益な関係を持っている細菌のメンバーを特定しようとした。例えば、コリネバクテリウムツベルクロステアリカム(Corynebacterium tuberculostearicum)、コリネバクテリウムアクコレンス(Corynebacterium accolens)、シアノバクテリアおよび黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、CRS患者の中鼻道の副鼻腔に著しく富んでいるように見える。急性OM (AOM)に関して、肺炎レンサ球菌(Streptococcuspneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)およびモラクセラカタラーリス(Moraxella catarrhalis)は、主な蓄積場所としての鼻咽頭に由来する、AOMに関連する3つの主要な病原体として長い間説明されてきた。滲出性中耳炎(OME)などのより慢性的な形態のOMについては、アロイオコッカス オチチディス(Alloiococcus otitidis)やツリセラ(Turicella)などの他の病原体も特定されている。
【0004】
これらの潜在的な病原性共生生物とは対照的に、例えば、ラクトバチルス(Lactobacillus)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、バークホルデリア(Burkholderia)およびペプトニフィラス(Peptoniphilus)のような他の微生物はURTの健康を促進するために提案されている。同様に、乳酸桿菌(lactobacilli)および特定の連鎖球菌は小児の鼻咽頭の健康を促進するようである。それにもかかわらず、URTの特定の場所と健康状態における潜在的な病原性共生生物と有益な微生物の組織分布的な発生についてはまだ発見されていないことがたくさんある。本研究において、2つの主要な慢性URT疾患、一方は成人のCRS、もう一方は小児のOMEについて、成人と小児のURTの統合マイクロバイオーム分析を実施した。CRSに関しては、URTの4つの主要なニッチ、すなわち前鼻腔、鼻咽頭、上顎洞および篩骨洞の組織分布(topography)の違いと連続性が研究された。また、前鼻腔および/または鼻咽頭が上顎洞および篩骨洞マイクロバイオームの代表的なニッチである可能性があるかどうかを調査することも目的とした。したがって、225人のCRS患者からのサンプルが収集され、イルミナMiSeqシーケンスにかけられ、微細スケール でのアンプリコンシーケンスバリアント(ASV)レベルで分析された。CRS患者と健康な対照(n=100)からの微生物サンプルを比較して、細菌のアルファとベータの多様性の違いを調査し、病気の重症度および/または健康に影響を与える可能性のある種を特定した。最後に、ミクロビオームプロファイルは、患者の特徴、CRS表現型の特徴、およびCRS患者の血清で測定された炎症マーカーと相関していた。OME患者に関しては、持続性の中耳滲出液(少なくとも3ヶ月間滲出液を伴う慢性中耳炎)に苦しんでいる70人の小児の鼻咽頭マイクロバイオームを2つの健康な対照群:(1)中耳炎の最近の病歴のない12人の人工内耳レシピエント、および (2)デイケアに参加するのに十分健康な41人の小児、のそれとを比較した。両マイクロバイオームの比較は、慢性URT感染症の患者のドロシグラニュラム(Dolosigranulum)レベルの低下を示した。その後、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)株を単離し、それらの有益な可能性を実証することに成功した。
【0005】
驚くべきことに、本発明において、鼻および/または鼻咽頭から単離されたドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)種もプロバイオティクスの可能性を持っている可能性があることがわかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、アクセッション番号LMGP-31124またはLMG P-31154で寄託された株から選択される株との16S rRNAで少なくとも99%の配列同一性を有する新規の単離されたドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の細菌株に関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
特定の態様において、ドロシグラニュラムピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の株は、アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株を含むリストから選択される。
【0008】
本発明は、本明細書で定義される細菌株、すなわち、アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株から選択される株との16S rRNAで少なくとも99%の配列同一性を有するドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種、特に、アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株を含む組成物もまた提供する。
【0009】
本発明は、抗病原性剤、特に抗菌剤として本明細書で定義される細菌株および組成物の使用にも関する。特定の態様において、前記抗病原性剤/抗菌剤は、抗病原性剤として効果的であって、特に、前記抗病原性剤は、以下を含むリストから選択される1つまたは複数の細菌に対して有効である: コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(Corynebacterium tuberculostearicum)、C.アクコレンス(C. accolens)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、H.エジプチウス(H.aegyptius)、プレボテラ(Prevotella)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、モラクセラ カタラーリス(Moraxellacatarrhalis)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、赤痢菌(Shigella)/大腸菌(E. coli);スタフィロコッカス ヒイカス(Staphylococcus hyicus)、スタフィロコッカス種(Staphylococcusspp)、 インフルエンザ菌(Haemophilus influenze)、ヘモフィルス &#8203;エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、プレボテラ種(Prevotella spp);および/またはカンジダによる真菌感染症に対して有効である。
【0010】
本発明は、ヒト医薬または獣医薬に使用するための本明細書で定義される細菌株および組成物にも関し、特に、口腔鼻咽頭腔および耳鼻咽頭領域の障害、例えば、急性および慢性(鼻)副鼻腔炎、急性および慢性中耳炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、喘息および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による皮膚感染、嚢胞性線維症、肺炎、肺障害を含むリストから選択される疾患の治療に使用するために用いられる。
【0011】
さらに、本発明は、個人衛生産業、食品産業、クリーニング産業、製薬産業、または生物的防除用途のための、本明細書で定義される細菌株および組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
ここで、図面を特に参照するが、図面に示されている内容は例示であり、本発明のさまざまな実施形態の例示的な議論のみを目的とすることを強調する。これらは、本発明の原理および概念的側面の最も有用で容易な説明であると考えられるものを提供するという理由で提示されている。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要であるよりも詳細に本発明の構造の詳細を示す試みはなされていない。本発明のいくつかの態様を実際にどのように具現化することができるかを、図面と併せて説明することで、当業者に明らかにする。
【0013】
図1】CRS患者の異なるURTニッチ内の細菌の多様性。ASVレベルのCRS患者における異なるURTニッチの逆(inverse)シンプソン指数(上のパネル)および種数(richness)(下のパネル)の比較。0.05未満のP値(対応のないt検定)は有意であると見なされた。アスタリスクは、ニッチ間の統計的に有意な差を表す(*p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 , **** p <0.0001 )
図2】前鼻孔(左パネル)と鼻咽頭(右パネル)の健康な対照、CRSsNP患者とCRSwNP患者の間のアルファ多様性測定値の比較。アスタリスクは、ニッチ間の統計的に有意な差を表す (*p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 )。
図3】健康な対照の細菌群集(CON)とCRS患者の細菌群集の存在/不在(A)および相対的な存在量(B)に基づく違い。A: 健康な対照(CON)におけるASVの存在と、前鼻孔(左パネル)と鼻咽頭(右パネル)におけるCRS患者間の相関。フィッシャーの正確確率検定を使用して、健康な対照またはCRS患者に多く存在するASVの有意性を検定した(p < 0.05)。少なくとも1つの条件で有意な存在と25%を超える存在を有するASVのみが、名称表示とともに示される。 B: 健康な対照におけるASVの平均相対存在量と前鼻孔(左パネル)および鼻咽頭(右パネル)におけるCRS患者との間の相関。少なくとも1つの条件で30%を超える平均相対存在量を有するASVのみが、名称表示とともに示される。
図4】CRS患者(n=172)の鼻咽頭マイクロバイオームプロファイルと共変量との関連。アドニステスト(Adonis tests)は、すべてのCRS被験者(左パネル)、CRSsNP被験者のみ(中央パネル)、およびCRSwNP被験者のみ(右パネル)のいずれかで、各共変量に対して実行された。バーは共変量の効果サイズ(R2値)を表す;統計的有意性(p <0.05)は星印で示される。共変量は、メタデータカテゴリに基づいて色付けされる。各バーの横に描かれている数字は、アドニスモデル(adonis model)で使用されている被験者の数を表す。ドロシグラニュラム(Dolosigranulum)が示される。
図5-1】数値マイクロバイオーム共変量とマイクロバイオームベースの被験者クラスターとの関連。A: 6つのマイクロバイオームクラスターの年齢、IFNy、IL5、ペリオスチン、SNOT22、およびVASスコアの箱ひげ図の視覚化。ヘモフィルス(Haemophilus) (クラスター 1)、モラクセラ(Moraxella) (クラスター 2)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)/スタフィロコッカス(Staphylococcus) (クラスター 3)、ストレプトコッカス(Streptococcus) (クラスター 4)、スタフィロコッカス(Staphylococcus) (クラスター 5) およびプレボテラ(Prevotella) (クラスター 7)。
図5-2】同上
図6】健康な参加者とCRS患者のURTにおけるドロシグラニュラム(Dolosigranulum)の有病率と相対的存在量。a) 有病率に基づくと、健康な対照の81%が前鼻孔にドロシグラニュラム(Dolosigranulum)を持っていたが、CRS患者では54%に減少した。鼻咽頭では、これらの数値は健康な対照で75%、CRS患者で42%だった。**** p< 0.0001。b) 存在時、ドロシグラニュラム(Dolosigranulum)の平均相対存在量は、CRS患者と比較して健康な対照の前鼻孔および鼻咽頭で有意に高かった。この違いは、鼻咽頭よりも前鼻孔でより顕著だった。場所(location)と状態ごとの平均は黒い点で示される。* p < 0.05。
図7】健康な小児とOMEの小児における分類群の存在量の違い。健康な鼻咽頭サンプルの50%超えに存在する分類群は、相対的な存在量データに基づいて示される。相対的な存在量は、有病率の影響を取り除くために分類群が存在するサンプルのみを考慮して計算された。正の健康-疾患(HD)比> 1の分類群は健康なサンプルでより豊富だったが、負のHD比<-1の分類群はOMEサンプルでより豊富だった。別々のコホートであるNP保因研究とOME マイクロバイオーム研究で収集されたOME鼻咽頭サンプルと健康な鼻咽頭サンプルの間のHD比は別々に計算され、個々の結果は横線で結ばれている。
図8】異なる宿主種およびヒト宿主の異なる身体部位内のドロシグラニュラム(Dolosigranulum)。a)異なる宿主種におけるドロシグラニュラム(Dolosigranulum)の存在と相対的な存在量。後ろの灰色の棒グラフは有病率を表す。利用可能なサンプルが10以上ある種のみが示される。ドットは相対的な存在量を表し、より多くのサンプルが同様の相対的な存在量を持っている場合、ドットはより濃く表示される。b)精選されたメタゲノミクスRパッケージからアクセスできる、ショットガンメタゲノミクスデータセットの母乳、鼻腔、口腔、皮膚、便、および膣由来のサンプルにおけるドロシグラニュラム(Dolosigranulum)の割合。c)研究中の異なる人体部位におけるドロシグラニュラム(Dolosigranulum)の相対的な存在量の比較。ドロシグラニュラム(Dolosigranulum)が検出されなかったため、膣サンプルは示されていない。
図9】L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)株およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)株の付着能力を調査するための付着アッセイ(AおよびB)。単離AMBR11は株LMG P-31124として寄託されている。
図10】安全性評価。Calu3細胞におけるドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)の炎症促進性相互作用の欠如および初代鼻上皮細胞におけるバリア破壊効果。Calu3細胞における黄色ブドウ球菌(S. aureus)およびドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)AMBR11(またはLMGP-31124)(またはLMG P-31124)によるIL-8(a)、TNF-α(b)またはIL-1β(c)mRNAの誘導。細菌を細胞とともに4時間、最終濃度108 CFU/mLでインキュベートした。提示されたデータは、2つの独立した実験の代表である。データは平均±標準偏差として表される。*** p< 0.001、**** p < 0.0001。d) 健康な対照(n=5)由来の初代NECにおける黄色ブドウ球菌(S. aureus)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)AMBR11(またはLMG P-31124)によるIL-8(黒)またはIL-1β(灰色)mRNAの誘導。細菌を細胞とともに6時間、最終濃度107 CFU/mLでインキュベートした。データは平均±標準偏差として表される。e) 健康な対照由来の初代NECにドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)AMBR11(またはLMGP-31124)および黄色ブドウ球菌(S. aureus)を加えた後6時間の上皮バリアの完全性を測定するためのTERの評価。TEER値は、初期TERに対する相対的な割合として表される。細菌株を107CFU/mLの濃度で添加し、TEERを2時間ごとに測定した。細胞自体(「中間(medium)」と呼ばれる条件)を負の対照として使用した。結果は、標準偏差を伴う平均として表される。 f) 健康な対照由来の初代NECにドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)AMBR11(またはLMGP-31124)および黄色ブドウ球菌(S. aureus)を加えた後6時間の上皮バリアの完全性を測定するためのFD4継代の評価。FD4値はpmolで表される。細菌株を107CFU/mLの濃度で加え、FD4を2時間ごとに測定した。細胞自体(「中間(medium)」と呼ばれる条件)を負の対照として使用した。結果は、平均として表される。
図11】ラクトバチルス(Lactobacillus) 種およびドロシグラニュラム(Dolosigranulum)種の抗菌効果と乳酸生産a) 黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対するL.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)、L.カゼイ(L. casei)AMBR2、ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)LMG15126およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)AMBR11(またはLMG P-31124)のCFSの抗菌効果は経時的に評価された。pH4.3およびBHI + 0.5%Tweenにした非接種MRSを負の対照として使用した。b)一晩のインキュベーション後のL.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)、L.カゼイ(L. casei)AMBR2、ドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum)LMG15126、およびD.ピグラムAMBR11(またはLMGP-31124)によるL-およびD-乳酸産生。
図12】ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)とTLR2/6およびTLR1/2との免疫調節相互作用 a) ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)株、ラクトバチルス(Lactobacillus)株、および黄色ブドウ球菌(S. aureus)によるTLR2/TLR6の活性化。Pam2CKS4を正の対照として使用した。ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum) AMBR11(またはLMGP-31124)と他のテスト菌株との有意差は、アスタリスクで示されている。**** p < 0.0001。 b) ドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum)株、ラクトバシラス(Lactobacillus)株、および黄色ブドウ球菌(S.aureus)によるTLR2/TLR1の活性化。Pam3CKS4を正の対照として使用した。ドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum) AMBR11(またはLMG P-31124)と他のテスト菌株との有意差は、アスタリスクで示されている。* p< 0.05、**** p < 0.0001。
図13】細胞株モデルにおけドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum)の抗病原性活性(A~C)および(D)ハチノスツヅリガ(Galleria mellonela)モデル。Calu-3細胞における黄色ブドウ球菌(S.aureus)、ドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum)AMBR11(またはLMG P-31124)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)LMG15126単独による、または黄色ブドウ球菌(S. aureus)をURT分離株ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)AMBR11(またはLMGP-31124)と共培養した場合のIL-8(a)、TNF(b)、およびIL-1 β(c)mRNAの誘導。細菌を細胞とともに4時間、最終濃度108 CFU/mLでインキュベートした。提示されたデータは、2つの独立した実験の代表である。データは平均±標準偏差として表される。有意差はアスタリスクで示される: *** p < 0.001 , **** p < 0.0001。(D) ハチノスツヅリガ(G. mellonella)幼虫の生存。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)AMBR11(またはLMG P-31124)と黄色ブドウ球菌(S.aureus)ATCC29213の共培養物を該幼虫の血リンパに接種し、感染後(p.i.)144時間の生存を調べた。ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)が黄色ブドウ球菌(S. aureus)によって誘発される病原性を部分的に阻害できるかどうかを調査するために、結果を黄色ブドウ球菌の単培養と比較した。
図14】配列番号1: AMBR11 (またはLMGP-31124) 単離の16S rRNA
図15】配列番号2: AMBR12 (またはLMGP-31154) 単離の16S rRNA
【発明を実施するための形態】
【0014】
上記で詳細に記載したとおり、本発明は、アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株から選択される株との16S rRNAで少なくとも99%の配列同一性を有する新規の単離されたドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の細菌株に関する。
【0015】
特定の態様において、本発明は配列番号1または配列番号2を有する16S rRNAとその16S rRNAで少なくとも99%の配列同一性を有するドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種を提供する。あるいは、本発明は配列番号1または配列番号2によって示される16S rRNAを含むドロシグラニュラムピグラム(Dolosigranulum pigrum)種を提供する。
【0016】
本発明の細菌株は特に、アクセッション番号LMGP-31124(2018年12月4日にBCCMで寄託)で寄託されたドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)株(AMBR11 (または LMG P-31124))およびアクセッション番号LMG P-31154(2018年12月11日にBCCMで寄託)で寄託されたドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)株(AMBR12)から選択されてよい。
【0017】
当業者に知られているとおり、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は、17属を含む系統発生的に多様な科であるカルノバクテリウム科(Carnobacteriaceae)の属である。16S rRNA遺伝子配列をもとに構築された系統樹によると、カルノバクテリウム科(Carnobacteriaceae)は2つのサブクラスターに分かれる。これらの属のほとんどは単一の種で構成されており、まだ十分に特徴付けられていない。他の産業上重要な乳酸菌とは異なり、この科の一部の属は臨床サンプルから頻繁に単離されており、ヒトの感染症に関連している可能性がある。ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は第1のサブクラスターに属する属であり、以下の属も含む :カルノバクテリウム(Carnobacterium)、 ババリコッカス(Bavariicocuus)、デセムジア(Desemzia)、Moraxella(Granulicatella)、イソバクルム(Isobaculum)およびトリココッカス(Trichococcus)、および第2のものは以下を含む、アルカリバクテリウム(Alkalibacterium)、アロフスティス(Allofustis)、アロイオコッカス(Alloiococcus)、アトポコッカス(Atopococcus)、アトポスティペス(Atopostipes)、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)、ラクティゲンティナム(Lactigentinum)およびマリニラクチバシルス(Marinilactibacillus)、ピシグロバス(Pisciglobus)、ジョトガリバカ(Jeotgalibaca)およびアトポバクター(Atopobacter)。本発明の別の態様は、アクセッション番号LMG P-31124またはLMG P-31154で寄託された株から選択される株との16S rRNAで少なくとも99%の配列同一性を有するドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種、特に、アクセッション番号LMG P-31124またはLMGP-31154で寄託された株を含む組成物を提供する。本発明は抗病原性剤、より具体的には抗菌剤として本明細書で定義される細菌株および組成物の使用にさらに関連する。
【0018】
特定の態様において、前記抗病原性剤/抗菌剤は抗病原性剤として有効であり、, より具体的には、前記抗病原性剤は、以下を含むリストから選択される1つまたは複数の細菌に対して有効である: コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(Corynebacterium tuberculostearicum)、C.アクコレンス(C. accolens)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、H.エジプチウス(H.aegyptius)、プレボテラ(Prevotella)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、モラクセラ カタラーリス(Moraxellacatarrhalis)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、赤痢菌(Shigella)/大腸菌(E. coli);スタフィロコッカス ヒイカス(Staphylococcus hyicus)、スタフィロコッカス種(Staphylococcusspp)、 インフルエンザ菌(Haemophilus influenze)、ヘモフィルス &#8203;エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、プレボテラ種(Prevotella spp);および/またはカンジダによる真菌感染症に対して有効である。
【0019】
本発明はさらに、ヒト医薬または獣医薬に使用するために本明細書で定義される細菌株および組成物に関連する。より具体的には、口腔鼻咽頭腔および耳鼻咽頭領域の障害、例えば、急性および慢性(鼻)副鼻腔炎、急性および慢性中耳炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、喘息および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による皮膚感染、嚢胞性線維症、肺炎、肺障害を含むリストから選択される疾患の治療に使用するために本明細書で定義される細菌株および組成物に関連する。
【0020】
さらに、本発明は、個人衛生産業、食品産業、クリーニング産業、製薬産業、または生物的防除用途に使用するために本明細書で定義される細菌株および組成物の使用を提供する。
【実施例
【0021】
実施例1:本発明のドロシグラニュラムピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の識別
【0022】
材料と方法
【0023】
調査対象母集団およびサンプル収集
【0024】
先に記載(De Boeck et al., 2017; de Boeck et 2019)されたように、100人の健康な参加者を募集した。両側内視鏡下機能的副鼻腔手術(FESS)を受けた18歳から65歳までのCRS(n = 225)の患者は、アントワープとルーベンの大学病院で募集された(研究B300201524257)。鼻腔スワブ(Copan、503CS01)を前鼻腔および鼻咽頭から採取した。FESS中に、上顎洞および篩骨洞から追加のサンプルが収集された。線毛機能不全、内反性乳頭腫、またはアスピリン不耐性の患者は除外された。書面によるインフォームドコンセントがすべての参加者から得られ、炎症マーカーを測定するための血液サンプルと、患者の特徴と表現型に関する情報を含む質問票が得られた(表1)。スワブからの細菌DNAは先に記載 (De Boeck et al., 2017) されたように単離された。
【0025】
表1: CRS患者の特性
【表1】
【0026】
イルミナ16SrRNAアンプリコンシーケンスと読み取り、分類群、およびサンプルの品質管理
【0027】
先に記載(De Boeck et al 2017) されたように、サンプルは処理され、シーケンスされた。簡単に説明すると、デュアルインデックスペアエンドシーケンス(dualindex paired-end sequencing)は、MiSeqデスクトップシーケンサー(M00984、lllumina)の16SrRNA遺伝子のV4領域で実行された。読み取りの処理および品質管理は、RパッケージDADA2バージョン1.6.0を使用して、実行ごとに個別に行われた。簡単に説明すると、これには、読み取りの品質フィルタリング、複製解除、ノイズ除去、キメラの除去、および読み取り分類が含まれていた。これらの工程の結果は、すべてのサンプルのすべてのASVの読み取りカウントを含むASVテーブルだった。品質管理後、葉緑体またはミトコンドリアとして分類された細菌界に分類されていないASVおよび混入として識別されたASVが除去された。各サンプルの「定性的」DNAの濃度は、読み取り数(読み取りおよびASV品質管理後にカウント)をシーケンス実行でプールされたサンプルの量で割ることによって推定された。負の対照の範囲のDNA濃度のサンプルを取り除いた。シーケンスデータはENAにアクセッション番号PRJEB30316として寄託された。
【0028】
データおよび統計分析
【0029】
すべてのデータ処理と視覚化は、Rバージョン3.4.4(R Core Team、2018)で、tidyverseパッケージセットと研究室内パッケージtidyampliconsを使用して実行された。上位11の最も豊富な属の視覚化(データは示さず)と被験者のマイクロバイオームタイプへのクラスター化を除いて、すべての分析はASVレベルで実行された(図5)。アルファ多様性の尺度は、多重検定のためのホルム-ボンフェローニ補正を使用したt検定を使用して比較された。すべてのベータ多様性分析では、ブレイ-カーチス非類似度が使用された。サンプル共変量とマイクロバイオームとの関連は、アドニステスト(ビーガンRパッケージの関数「アドニス」)を使用してテストされた。条件間のASVの存在の差(Differential presence of ASVs)は、変数の存在/不在と条件(CRS/CON)間の分割表のフィッシャーの正確確率検定を使用してテストされた。ASVの存在量の差(Differential abundance of ASVs)は、条件間の相対存在量ベクトルの対応のないt検定を使用してテストされた。データの希薄化バージョン(サンプルあたり1000回の読み取り)が、すべてのアルファ多様性分析および存在の差の分析(differential presence analysis)に使用された。
【0030】
健康な対照およびCRS患者の血清中の炎症性サイトカインの測定
【0031】
血清を採取し、その後の分析まで-20℃で保存した。ペリオスチンは、サンドイッチELISAを使用して、製造元のプロトコル(Thermofisher、California、USA)に従って測定した。サイトカインIL-4、IL-5、IL-13、およびIFN-gは、マルチプレックス96ウェルプレートベースのアッセイ(MesoScale Discovery、Gaithersburg、MD、USA)を使用して測定した。手順の詳細な説明は、オンラインデータ補足から見つけられる。
【0032】
結果
【0033】
CRS患者のURTニッチにおけるマイクロバイオームの連続性
【0034】
225人のCRS患者を募集し、前鼻孔、鼻咽頭、上顎洞および篩骨洞をサンプリングした。各ニッチについて、サンプルのそれぞれ82%、80%、77%、および78%が品質パイプラインを通過した。そのため、高品質のプロファイルを持つ少なくとも1つのニッチを持つ190人のCRS患者が含まれていた(表1)。
【0035】
スタフィロコッカス(Staphylococcus)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、モラクセラ(Moraxella)は、すべてのニッチで最も一般的な属であり(データは示さず)、平均相対存在量はそれぞれ22%、21%、および7.2%だった。4つのニッチは、サンプルを支配する細菌属で高い類似性を示したが、特定の鼻咽頭サンプルでは、ヘモフィルス(Haemophilus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、およびプレボテラ(Prevotella)が豊富な、より多様な細菌プロファイルを示した。後者の2つの属は、前鼻孔および副鼻腔のサンプルにはほとんど現れなかったが、ヘモフィルス(Haemophilus)は上顎洞および篩骨洞のサンプルのサブセットを支配していた。
【0036】
次の工程において、アルファ多様性は、ASVのレベル(亜属の分類学的レベル)で計算された(豊富さと逆シンプソン指数、図1B)。平均逆シンプソン指数と豊富さは低く、限られた数の細菌性ASVのみが、特定の人の前鼻孔、鼻咽頭、上顎洞および篩骨洞を支配していたことを強調する。逆シンプソン指数(図1、上のパネル)は、4つのニッチ間の多様性に有意差を示さなかった。前鼻孔で最も高い分類群の豊富さ(鼻咽頭でp<0.05、両方の副鼻腔でp <0.0001)、続いて鼻咽頭(両方の副鼻腔でp <0.01)および副鼻腔(図1、下のパネル)であり、豊富さは有意に差があることが示された。上顎洞と篩骨洞の間の豊かさは統計的に差はなかった(p> 0.05)。
【0037】
個人間レベルと個人内レベルの両方で、さまざまなURTニッチの細菌の組織分布(topography)と連続性をさらに調査するため、ブレイ-カーチス類似性(Bray-Curtis similarities)は、同じ参加者の異なる場所間(データは示さず)、および異なる参加者のニッチ間(データは示さず)で計算された。同じ参加者の中で、上顎洞と篩骨洞のマイクロバイオーム構造は互いに最も類似しており、ブレイ-カーチス類似性は0.73だった。前鼻孔では、0.57(上顎洞)と0.6(篩骨洞)の中央値の類似性が観察されたが、鼻咽頭では、これらの類似性は、上顎洞と篩骨洞でそれぞれ0.42と0.44だった。異なる参加者由来のサンプル間のブレイ-カーチス類似性は一般的に低く(中央値<0.20、同じニッチ由来のサンプルペアと異なるニッチ由来のサンプルペアの両方)、異なるURTニッチ間の連続性が個人内の特徴であることを示す(データは示さず)。
【0038】
CRSsNPでは前鼻孔と鼻咽頭の細菌の多様性が損なわれている
【0039】
CRS患者では、前鼻孔と副鼻腔を伴う鼻咽頭の両方の間の微生物群集の連続性が観察されたため、両方のニッチ由来のサンプルを健康な対照との比較に使用した(De Boeck et al ., 2017)。患者グループ内では、前鼻孔から174の高品質プロファイルが得られ、鼻咽頭では172のプロファイルが得られた。健康な対照群では、これらの数はそれぞれ86と94だった。
【0040】
CRSsNPとCRSwNPに分けられた、対照とCRSの母集団のさまざまなニッチのアルファ多様性、つまり豊富さと逆シンプソンが測定された(図2)。多様性の尺度を比較すると、CRSsNPの前鼻孔(p = 0.002)と鼻咽頭で全体的な豊かさの有意な減少が観察され、健康な対照と比較してCRSsNPの鼻咽頭(p = 0.0025)で逆シンプソン指数の有意な減少が観察された。興味深いことに、CRSwNPの場合、対照と比較してアルファ多様性の減少は観察されなかった。CRSsNPとCRSwNPを比較すると、鼻咽頭の逆シンプソンのみがCRSwNP(p = 0.042)の増加を示した。
【0041】
特定の細菌分類群はCRSで濃縮または減少
【0042】
健康な対照とCRS患者の間の特定のマイクロバイオームの違いを調査するために、我々の研究対象集団における疾患状態の効果量を分析した。前鼻孔の場合、細菌群集組成内で観察された変動の2%のみが、参加者が健康であるかCRSを持っているかという事実によって説明できたが、鼻咽頭の場合、これは1%だった。次に、 健康な対照とCRS患者の間の細菌プロファイルを、ASVの有無のレベル、および前鼻孔と鼻咽頭におけるそれらの相対的な存在量で比較した(図3)。モラクセラ(Moraxella) 1、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 2および3、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) 1、ならびにナイセリア(Neisseria) 3などの一部の分類群は、CRS患者と比較して健康な対照群でより一般的であることがわかったが、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) 1(D. pigrum)のみが、存在/不在と相対存在量(62%CONおよび30%CRSサンプルに存在、CONで0.13の平均相対存在量およびCRSで0.05)の両方に基づいて、健康な対照の前鼻孔と有意に関連していた。
【0043】
鼻咽頭において、モラクセラ(Moraxella) 1、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 2および3、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) 1 および ナイセリア(Neisseria) 3 は、健康な対照でより多く出現した(図3A、右パネル)。前鼻孔と同様、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)は、健康な鼻咽頭でより一般的であり(62%CON対CRSで25%)、CRS患者と比較して健康な対照でより高い相対存在量を示した(平均相対存在量は0.06対CRSで0.03)。
【0044】
疾患に関連する特性は、マイクロバイオームプロファイルとは関連していない
【0045】
CRSはさまざまな表現型とエンドタイプによって特徴付けられるため、表現型と炎症マーカーを説明するさまざまな関連する特徴に関連してマイクロバイオームを研究することを意図した(データは示さず)。我々のCRSグループ(n = 172)の高品質な鼻咽頭サンプルについて、関連性が調査された。
【0046】
最初に、研究コホート全体に対して関連付けが行われ、続いてCRSsNPとCRSwNPに細分化された(図4)。患者の特徴のカテゴリー内で、CRS患者のマイクロバイオーム組成は患者の年齢によって有意に影響を受けた(p = 0.002)が、CRSsNPでのみだった。また、性別は研究コホートの全体的なマイクロバイオーム構造との関連を示した(p = 0.005)が、これはCRSwNPグループでのみ有意だった。FESSの経緯は、CRSsNPのマイクロバイオーム全体にのみ関連しており(p = 0.043)、以前にFESSを受けたこれらの参加者は、以前にFESSを受けたことがない参加者とはわずかに異なる細菌を持っていることを示す。喘息、アレルギーおよび感染性は、全体的なマイクロバイオーム構造との有意な関連を示さず、異なる炎症マーカーもテストされなかった(図4)。
【0047】
FESSの性別、年齢、および経緯について観察された関連性をより深く調べるために、すべての患者は、ASVの存在量に基づいてマイクロバイオームクラスターにクラスター化された(データは示さず)。6つのクラスター(5人以上の参加者を有する)がさらなる分析に使用され、ヘモフィルス(Haemophilus) (クラスター1)、モラクセラ(Moraxella) (クラスター 2)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)スタフィロコッカス(Staphylococcus)混合クラスター (クラスター 3)、ストレプトコッカス(Streptococcus) (クラスター 4)、スタフィロコッカス(Staphylococcus) (クラスター 5) およびプレボテラ(Prevotella) (クラスター 7)が優勢だった。次に、これらのマイクロバイオームクラスターをすべての患者変数と視覚的に比較した。各クラスターは、実証された数値(データは示さず)およびカテゴリー(図5)のマイクロバイオーム共変量に対して分析された。FESSの性別と経緯については、女性の参加者とFESSの経緯のある参加者が、クラスター4とクラスター5にわずかに多く存在していた(図5)。年齢については、クラスター1内の参加者の平均年齢が低いようだった(データは示さず)。ポリープ、SNOT22、VASスコアなどの疾患関連パラメーターは、クラスターとの関連を示さず、テストされた炎症マーカーの1つも関連を示さなかった(図5)。
【0048】
考察
【0049】
いくつかの研究において、CRS患者のURTマイクロバイオームが調査されており、マイクロバイオームの組成と多様性に関して矛盾した結果が出ている。本研究では、225人のCRS患者の大規模コホートのURTマイクロバイオームを100人の健康な個人のマイクロバイオームと比較した。この比較には、CRS患者における前鼻孔、鼻咽頭、および上顎洞および篩骨洞の間のマイクロバイオームの類似性の分析が含まれた。興味深いことに、前鼻孔のマイクロバイオームは、鼻咽頭よりも副鼻腔に類似性を示した。鼻咽頭は他のURTニッチへの細菌の貯蔵庫であり(De Boeck et al. 2017)、鼻孔は外気と直接接触しているため、これは予想外のことである。前鼻孔のマイクロバイオームがCRSマイクロバイオームをよりよく表すという事実は、手術でなければ副鼻腔にアクセスできない臨床医にとって重要な観察である。我々の調査結果は、従前の結果を確認し、鼻孔と中鼻道(middle meatus)のマイクロバイオームがCRS患者の副鼻腔マイクロバイオームを表す可能性があることを示す。細菌の多様性の変化は、CRSを含む特定の病原体によって引き起こされない慢性多微生物性疾患の特徴としてしばしば探求される。健康な対照と比較して、CRSsNPでは前鼻孔と鼻咽頭の細菌多様性の減少が観察されたが、CRSwNPでは観察されなかった(データは示さず)。これらの結果は、対照と比較して、CRSwNP患者ではなくCRSsNPの中鼻道における細菌の豊富さの減少傾向が見られた最近の研究を裏付ける(Koeller et al. ,2018)。しかしながら、別の研究では、健康な対照と比較して、CRSwNP患者の中鼻道領域の細菌多様性が減少していることが示された(Chalermwatanachaiet al., 2018)。中耳道サンプルを使用した大規模な研究では、対照被験者とCRS患者の間でアルファ多様性に有意差は見られず(Mahdavinia et al., 2018)、これは他のグループによっても確認された。これらの不一致は、(1)CRSwNPおよびCRSsNPのCRSの表現型が不正確または表現型がないこと、(2)サンプル量の過小評価(under powering)、(3)対照サンプルの違い、によって説明される可能性がある。とはいえ、相対的なマイクロバイオームプロファイリングのみで細菌の多様性を結論づけることには注意が必要であり、定量的なマイクロバイオームプロファイリング手法を補完することで、URTの健康と疾患における細菌のアルファ多様性の役割についてさらなる知見が得られるかもしれない(De Boeck et al. , 2017)。ただし、URTの場合、腸などの高バイオマスニッチからのプロトコルを低バイオマスニッチに簡単に実装できないため、この定量的プロファイリングの最適化が必要である。
【0050】
本研究のもう1つの強みは、指標となる種を特定するための相対的な存在量と組み合わせた存在/不存在に基づいて、両方の研究グループの細菌プロファイルを比較したことです(データは示さず)。より優位で、健康な対照においてより高い相対的存在量を示した最も興味深いASVはドロシグラニュラムピグラム(Dolosigranulum pigrum)だった。小児のURTマイクロバイオームに関する従前の研究では、呼吸器の健康に対するドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の潜在的な保護効果が調査されている(Biesbroek et al., 2014; Laufer et al., 2011)。ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は乳酸菌の仲間であり、一般的にヒトの腸と膣に有益であることが知られている。したがって、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の健康促進効果と産業応用の可能性を検証するために、将来の研究が必要である。
【0051】
我々の比較では、発生の増加または相対的な存在量に基づいてCRSの病原体である可能性のあるいくつかの分類群も明らかになった。コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(C. tuberculostearicum)の相対的な存在量は、健康な対照と比較してCRS患者で有意に増加したことが観察された。これらの調査結果は、従前の研究にさらに基づいており、CRSにおけるコリネバクテリウムツベルクロステアリカム(C. tuberculostearicum)の相対的な存在量の増加を報告する。別の研究では、コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(C. tuberculostearicum)に密接に関連するコリネバクテリウム アクコレンス(Corynebacteriumaccolens)が、対照と比較してCRS患者で最も豊富な種であることが明らかになった。また、黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)は、炎症性気道疾患の病理学において重要な役割を果たす。CRSにおいて、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の相対的な存在量の増加は、鼻ポリープ組織で測定されており、Th2型の炎症を引き起こす。文献と一致して、我々の結果は、2つのブドウ球菌(Staphylococcus)ASVが、健康な対照と比較して、CRS患者の前鼻孔により多く存在し、より豊富であることを示す。しかしながら、本研究では、16S rRNA遺伝子のV4領域が使用されたが、これは異なるブドウ球菌(Staphylococcus)種を区別しないため、これらのASVが実際に黄色ブドウ球菌(S.aureus)であるかどうかをさらに調査することはできなかった。また、インフルエンザ菌(H. influenzae)とH.エジプチウス(H.aegyptius)として分類された2つのヘモフィルス(Haemophilus) ASVは、健康な対照と比較してCRS患者でより豊富だった。インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)は気道のよく知られた病原体であり、培養ベースの研究と培養に依存しない研究の両方でCRSと関連する。さらに、小児の重度の気管支炎などの他の炎症性気道疾患では、ヘモフィルス(Haemophilus)は病因として説明されている。最後に、2つのプレボテラ(Prevotella)ASVは、CRS患者の鼻咽頭でより多く発見された。この属は、CRS患者の副鼻腔に最も豊富な種の1つであると従前に説明されているが、疾患の病因におけるその寄与の可能性はまだ調査されていない。これらの病原体の正確な役割は、フォローアップ作業でさらに実証される必要がある。注目すべきは、URT における種間関係にも影響を与える可能性があるため、ASVの数が少ないことも無視してはいけない。
【0052】
本研究の最後のフェーズでは、いくつかの患者の特徴と表現型およびエンドタイプに関連する変数と特定のマイクロバイオームの特徴との関連が調査された。我々の患者グループでは、FESSの年齢、性別、経緯が全体的なマイクロバイオーム構造とのわずかな関連を示し、これは参加者をさまざまなマイクロバイオームクラスターにクラスター化した後にも確認した。これらの関連性は統計的に有意だったが、計算された効果量は非常に小さかった(<2%)ため、有意性と生物学的関連性を区別する必要がある。驚くべきことに、鼻ポリープと全体的なマイクロバイオーム構造との間に関連性は見られず、特定のマイクロバイオームクラスターとも関連性は見られなかった。また、アレルギー、喘息、感染症、およびテストされた炎症性血清マーカーについても、関連性は見られなかった。これは、喘息と化膿のマイクロバイオーム間の有意な関連を示した従前の研究とは対照的である(Ramakrishnan et al., 2015)。我々のより大規模な研究多施設コホートには、より多くの統計的な力という利点があったが、研究グループにはいくつかの欠点がある。より具体的には、治療や喫煙歴などのいくつかの変数については、参加者の自己報告データにしか頼ることができなかった。例えば、過去の抗生物質使用のデータは、抗生物質が手術前の過去3か月間に服用されたかどうかという質問に基づいていた。これは、抗生物質の使用によるマイクロバイオームプロファイルの違いが観察されなかった理由を説明している可能性があるが、他の研究では、さまざまな人体ニッチにおけるマイクロバイオームの枯渇に対する抗生物質の使用の重大な影響がすでにわかっている。将来の研究では、抗生物質の使用に注意を払い、手術前および手術中に使用される抗生物質の正確なタイミング、種類、および投与量を監視する必要がある。
【0053】
結論として、CRSの前鼻孔のマイクロバイオームは、鼻咽頭よりも副鼻腔に類似しており、前鼻孔が潜在的な副鼻腔病原体の重要なニッチである可能性があることを示す。この関連する発見は、前鼻孔のサンプリングを介した副鼻腔マイクロバイオーム組成に基づく個別化された医療の可能性を強調する。細菌の多様性の減少は、CRSwNPではなくCRSsNPで観察され、CRSsNPとCRSwNPの病態生理学の違いを浮き彫りにした。これらの結果はまた、細菌の多様性の変化がおそらくCRSwNPよりもCRSsNPの病気の発症に寄与するか、または特定のCRSsNP条件がCRSwNPよりも細菌の多様性に大きな影響を与えることを示唆する。さらに、コリネバクテリウム ツベルクロステアリカム(C. tuberculostearicum)、インフルエンザ菌(H. influenzae)/H.エジプチウス(H. aegyptius)、および1つのブドウ球菌(Staphylococcus)ASVなどの特定の細菌分類群が、CRSの潜在的な病原菌として確認または新たに明らかになった。また、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)は、URTにとって有益な細菌およびプロバイオティクスとして大きな可能性を秘めている可能性がある。今後の研究では、CRSの病因におけるこれらの細菌分類群の役割を調査するための機構研究に焦点を当てる必要がある。
【0054】
実施例2:本発明のドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulum pigrum)種の特徴づけ
【0055】
材料および方法
【0056】
研究計画およびサンプル収集
【0057】
鼻咽頭サンプルは、従前に記載されたとおり(De Boeck et al, 2017, De Boeck etal 2019) 2015年から2018年のアントワープ大学、アントワープ大学病院およびルーベン大学病院の研究(B300201524257) で健康な参加者とCRS患者から得られた。すべてのサンプルは、担当の耳鼻咽喉科専門医によって標準化された方法で収集された。書面によるインフォームドコンセントがすべての参加者から得られた。
【0058】
イルミナMiSeq16SrRNAアンプリコンシーケンスおよび生物統計分析
【0059】
サンプルは、従前に記載されたとおり(De Boeck et al 2017)処理、シーケンス、および分析された。簡単に説明すると、ベルギーのアントワープ大学の遺伝医学センターで、MiSeqデスクトップシーケンサー(M00984、イルミナ)の16S rRNA遺伝子のV4領域でデュアルインデックスペアエンドシーケンスを実行した。シーケンス後、生のシーケンス読み取りをフィルタリングし、DADA2(v 1.1.6)を使用してノイズを除去した。
【0060】
ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)分離株AMBR11 (またはLMG P-31124)およびAMBR12 (またはLMG 31154)の分離と全ゲノム配列決定
【0061】
健康なボランティアからの鼻咽頭スワブは、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)種の成長を促進するために、0.5%Tween80を補充した液体ブレインハートインフュージョン(BHI)で培養された。増殖した培養物は、さらに同定されるまで-80℃で保存された。次に、細菌のストックは、5%羊の血液を補充したトリプティックソイ寒天培地で培養した。ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum) ATCC51524と同様のコロニー形態を持つコロニーは、16S rRNA遺伝子を使用してさらに同定された。我々が単離したドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の単離の後、アントワープの遺伝医学センター(アントワープ大学)で、DNAを抽出し、Nextera XT DNAサンプル調製キット(イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して全ゲノム配列決定を行った後、イルミナMiSeqプラットフォームを使用してシーケンスを実行した(2 x 300サイクル)。
【0062】
ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR12 (またはLMG 31154) は、中耳炎、喘息、または呼吸器アレルギーの既往のない健康な子供の前鼻孔から、37℃でインキュベートした0.5%(v/v)Tween 80を添加したBHI(ブレインハートインフュージョン)培地を使用して単離された。全ゲノム配列決定とそれに続くドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)タイプ株ATCC51524との比較により、ANI(平均ヌクレオチド同一性)値0.9748(EZBioCloud ANI計算機1)でその同一性が確認された。Resfinderおよび病原性因子データベース(VFDB)に対してそれぞれスクリーニングを行っても、伝達可能な抗生物質耐性遺伝子も病原性遺伝子も予測されなかった。
【0063】
微生物株と培養条件
【0064】
ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)株は、0.5%Tween80を添加したBHIブロス(サプライヤー)中で振とう条件下で37℃で増殖させた。ラクトバチルス・ラムノサスGG(Lactobacillusrhamnosus GG)株 (ATCC53103)は、deMan, Rogosa および Sharpe (MRS) 培地(Difco, Erebodegem、Belgium)中で、振とうせずに37℃で増殖させた。
【0065】
細胞培養
【0066】
ヒト気管支上皮細胞株Calu-3 ATCC(登録商標)HTB-55(商標)(ATCCから購入)は、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)(サプライヤー)およびペニシリン-ストレプトマイシン(100 U/ml)(Life technologies)を添加した20mlの最小必須培地(MEM)(Life technologies、Ghent、Belgium)を含む75cm2の細胞組織フラスコ内で、37℃、5%CO2、90%相対湿度で培養された。3&#12316;4日ごとに培地を交換し、細胞が70&#12316;80%のコンフルエンシーに達したときに、0.25%トリプシン-EDTA溶液(LifeTechnologies)を使用して1:2の分割比で細胞を再播種した。Calu-3細胞を12ウェルまたは24ウェル培養プレート(Cellstar、Diegem、Belgium)に、接着および免疫調節実験のために、それぞれ3x105細胞/cm2(1.1 x 10^6細胞/ ml)の密度で播種した。播種後約1週間で、コンフルエントな単層が得られた。 ヒト単球THP-1細胞(ATCC)およびTLR1/2およびTLR2/6発現HEK292T細胞(Invivogen)は、FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを添加した完全RPMI1640培地中で25 cm2の組織培養フラスコ内で5%CO2および90%相対湿度で37℃で日常的に維持された。新鮮な完全RPMI1640培地を添加することにより、細胞を3日ごとに1:12の比率で再播種した。単球分化のため、接着および免疫調節実験の3日前に、ホルボールエステル12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート(phorbol ester 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate)(PMA)(Sigma)(10 ng/ml)を添加して、細胞を1 x106細胞/mlの濃度で12ウェル培養プレートに播種した。
【0067】
初代細胞の単離と培養
【0068】
鼻粘膜上皮細胞(NEC)の単離には、下鼻甲介を使用した。従前に報告されたとおり、高度に精製されたNEC集団が得られた。組織を滅菌生理食塩水で洗浄し、100 U/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン、および2%Ultroser G(Pall Life Sciences、Zaventem、Belgium)を添加したDMEM-F12培地中の0.1%プロナーゼ(Protease XIV、Sigma)溶液で酵素消化した。振とうしながら4℃で一晩インキュベートした後、FCS(10%)を添加してプロテアーゼ反応を停止させた。細胞を培地で洗浄し、100gで5分間の遠心分離によりペレット化した。次に、細胞を10 mLの培地に再懸濁し、プラスチック培養フラスコ内で37℃で1時間インキュベートして、線維芽細胞を除去した。細胞懸濁液を2x 107で事前に洗浄したCD45およびCD15磁気ビーズ(Dynabeads、Invitrogen、Merelbeke、Belgium)と混合し、上皮細胞を製造元の指示に従ってネガティブセレクションによって精製した。細胞の純度はサイトスピン(cytospin)調製物を使用して検証され、98%以上であることがわかった。
【0069】
Steelant et.al (2016)に記載されているように、新たに単離したNECを0.4mm、0.33cm2のポリエステルTranswellインサート(Costar、Corning、NY)にTranswellあたり105細胞の密度で播種した。培地は一日おきにリフレッシュした。NECが完全にコンフルエンスに成長したら、ALIでさらに細胞を分化させるために、頂端の(apical)培地を除去した。 ALIの21日目に、EVOM/Endohm(WPI、Sarasota、Fla)を使用した経上皮抵抗(TER)測定を使用して、上皮の完全性を評価した。十分に蓄積されていない培養物(TER、<200Ωx cm2)は実験に含まれなかった。
【0070】
走査型電子顕微鏡
【0071】
走査型電子顕微鏡。走査型電子顕微鏡を使用して、細菌表面上の線毛の有無を視覚化した。細菌を金でコーティングしたメンブレンにスポットし、2.5%グルタルアルデヒド(0.1 M Na+-カコジル酸中)で室温(RT)で1時間固定した後、さらに4℃で一晩固定した。次に細菌を20分間3回すすぎ、カコジル酸緩衝液(7.5%サッカロースを含む)に4℃で一晩放置した。続いて、バクテリアをエタノールの昇順シリーズ(RTで30分間、それぞれ50%、70%、90%、95%、100%で3x 30分間)で脱水し、臨界点をLeica EM CPD030で乾燥させた。メンブレンをスタブ(stub)に取り付けLeica EM Ace 600コーターで5nmのカーボンでコーティングした。SEMイメージングは、Quanta FEG250 SEMシステム(Thermo Fisher、Asse、Belgium)を使用して実行した。
【0072】
ヒト気道および単球/マクロファージ細胞株および初代細胞への付着アッセイ
【0073】
L.ラムノサスGG(L.rhamnosus GG)およびドロシグラニュラム (Dolosigranulum)株のCalu-3および刺激されたTHP-1細胞への接着を評価するための実験は、Lebeer et al. 2012の方法に基づいて実施された。1 x 108CFU/mlの濃度の細菌懸濁液1mlを、Calu-3または刺激されたTHP-1細胞を含む組織培養プレートに添加した。 細菌をヒト細胞とともに37℃で1時間インキュベートして付着させた。インキュベーション後、細胞を予め温めたPBSで一度すすいだ。細胞を剥がすために、300μLのトリプシン(0.25%)を37℃で10分間細胞に添加した。細胞を剥がした後、700 pLのPBSを添加し、L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)の場合は固体MRS培地に、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)株の場合は固体トッドヘヴィット(ToddHewitt)に段階希釈液をプレーティングした。細菌付着率は、付着後にカウントされたコロニーの総数を、最初にヒト細胞に添加された細菌懸濁液中の細胞の数と比較することによって計算された。
【0074】
ヒト気道および単球/マクロファージ細胞株におけるサイトカイン遺伝子発現の誘導
【0075】
1 x 108 CFU/mlの濃度の細菌懸濁液1mlを、Calu-3または刺激されたTHP-1細胞を含む組織培養プレートに添加した。細胞の種類に応じて、細菌をTHP-1細胞とCalu-3細胞について、それぞれ2時間または4時間、37℃、5% CO2、90%相対湿度でインキュベートし、サイトカイン遺伝子の発現を誘導した。インキュベーション後、細胞を予め温めたPBSで3回すすいだ。 MEM(Calu-3細胞用)およびRPMI(THP-1細胞用)を負の対照として使用した。RNAは、市販のRNeasyミニキット(QIAGEN)を使用して、製造元のプロトコルに従って抽出した。RNA濃度はTake3(Biotek)を使用して決定された。サイトカイン遺伝子発現は、以下に記載されるように定量的リアルタイムPCR(qPCR)によって決定された。実験は3回繰り返され、すべての株は毎回3回テストされた。
【0076】
qPCR分析
【0077】
単離された全RNA(1000 ng)は、Readyscript(登録商標)cDNA合成ミックス(Sigma Aldrich)を使用してcDNAに転写された。その後、ヌクレアーゼフリーの水を100μlの容量まで加えた。各サンプル(最終濃度40 ng)は、PowerSYBR Greenマスターミックス(ThermofisherScientific)を使用して総量20 μLで2回増幅した。最初に、6つの一般的に使用される参照遺伝子、すなわちGAPDH、CYC1、ATP5B、GNB2L1、PPIA、およびB2Mが内部対照としてテストされました(データは示さず)。MIQEガイドラインによると、テストされたすべての参照遺伝子は、Qbase+ソフトウェアを使用して良好なMスコアとCVスコアを示した。Calu3細胞でのさらなる実験のために、CYC1およびATP5B参照遺伝子を選択してすべての結果を正規化した。THP-1細胞については、CYC1とPPIAをさらなる分析のための参照遺伝子として選択した。qPCRは、StepOnePlusリアルタイムPCR(Applied Biosystems、Lennik、Belgium)で、IL-8、IL-1 β、TNF、および示された参照遺伝子に対して実行された。すべてのプライマーは、公開されている配列(ref)に基づいて設計され、Integrated DNA Technologies(IDT)によって化学的に合成された(表2)。各qPCR反応は、96ウェル反応プレート(カタログ番号; Life Technologies、Ghent、Belgium)で2回実施した。以下の条件を使用した:PowerSYBRの場合は50℃で10分間、開始の変性の場合は95℃で10分間、続いて95℃で15秒間、60℃で1分間を40サイクル。qPCRデータは、参照mRNAの量に対するサイトカインmRNAの量の比率として表される。テンプレート以外の対照(Non-templatecontrols)は、実行(run)ごとに含まれていた。
【0078】
表2:qPCRに使用されたプライマー
【表2】
【0079】
ハチノスツヅリガ(Galleria mellonella)生存アッセイ
【0080】
ハチノスツヅリガ(G. mellonella)は、幼虫の最終段階でAnaconda reptiles(Kontich、Belgium)から購入した。到着後、幼虫は4℃で保存され、7日以内に使用された。グループごとに、同じような体重とサイズでランダムに選択された15匹の幼虫を使用した。これらの実験は、応用微生物学およびバイオテクノロジーの研究室でCamilleAllonsiusと共同で行われた(Allonsius, 2019)。ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum) AMBR11(またはLMGP-31124)の安全性と忍容性を評価するために、ハミルトンシリンジ(Hamilton Company)を使用して、幼虫にさまざまな濃度の10pLの細菌溶液を最後の腹脚に注射した。2つの対照群を使用し、1つはPBS(10 pL)を注射し、もう1つは注射なしで一般的な生存率を制御した。モデルプロバイオティクス株L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)および黄色ブドウ球菌(S. aureus)を、ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum) AMBR11(またはLMGP-31124)と同じ条件下で追加の細菌対照として使用した。幼虫は37℃のペトリ皿で飼育し、生存を毎日モニターした。生存曲線をプロットし、カプランマイヤー検定(GraphPad Prism 7.00)を介して統計分析を実行した。p値 < 0.05は有意とみなされた。
【0081】
結果
【0082】
健康なURTサンプル由来の優性ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)株の単離、特性評価および全ゲノム配列決定
【0083】
実施例1において、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は、存在と相対的な存在量に基づいて、CRS患者と比較して健康な対照参加者でより関連していることがわかった。したがって、この細菌種をより詳細に分析した。研究対象集団全体で、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)属はURTの5番目に優勢なメンバーであり、平均相対存在量は5%だった。前鼻孔および鼻咽頭におけるドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の平均相対存在量は、CRS群と比較して対照群で有意に高かった(ウェルチのt検定、p <0.05)。前鼻孔では、平均相対存在量は健康な対照とCRS患者でそれぞれ13%と5%だったが、鼻咽頭では健康な対照で6%、CRS患者で2%だった(図6)。興味深いことに、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の平均相対存在量は、特にCRS患者の鼻咽頭において、二峰性の分布に発展(evolve)することが多いようである。これは、例えば、バクテロイデスエンテロタイプ(Bacteroides enterotype)の腸でも観察され、B1タイプとB2タイプに分けることができ、後者は微生物負荷が減少している(Vandeputte etal., 2017)。ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の有病率を評価すると、健康な対照の前鼻孔と鼻咽頭ではそれぞれ81%と75%が、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)を持っており、一方、CRS患者ではこれらの数値は有意に低く(フィッシャーの正確確率検定、p <0.05)、前鼻孔で54%、鼻咽頭で42%だった(図6)。小児では、差次的存在量分析(differential abundance analysis)により、ドロシグラニュラム ピグラム(Dolosigranulumpigrum)は症例と対照の両方の70%に存在するが、中耳炎群と比較して両方の健康な対照群でより高い相対存在量であることが確認された(平均相対存在量3.9%対2.6%)。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)は、前鼻孔でさらに高い相対存在量で発見された(12人の人工内耳レシピエントで10.3%、70人のCOME患者で9.3%)(図7)。
【0084】
ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)はLABのかなり未踏の細菌メンバーであるため、さまざまな宿主種におけるその有病率と相対的な存在量を調査することを目的した(図8a)。ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は、げっ歯類(Rattus norvegicus)、魚(Ictalurus punctatus、Cyprinus carpio、Catostomus)、鳥(Gila robusta)、および霊長類(pygathrix nemaeus、nasalis larvatus)など、さまざまな宿主種に蔓延、本明細書では存在すると定義されるが、相対的な存在量は非常に低かった(1%未満)(図8a)。一方、ヒトおよびイヌ(Canis lupusfamiliaris)では、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)がほぼ50%までの高い相対存在量で発見された(図8)。興味深いことに、相対的な存在量が高いイヌのサンプルは、鼻分泌物として分類された。
【0085】
また、シーケンスデータに基づいてヒトURTで高い相対存在量を観察したため、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は主に呼吸器系に関連している可能性があると仮定した。これは、Pasolli et al. , 2017に記載のとおり、curatedMetagenomicDataRパッケージで入手可能な公開されているショットガンシーケンスデータに基づいて、人体のさまざまな生息地におけるその存在と相対的な存在量を分析することによってさらに調査された。合計で、6つの異なる身体部位、すなわち鼻腔(n=93)、口腔(n=701)、皮膚(n=512)、糞便(n=6874)、膣(n=86)および母乳(n=8)からの7152サンプルが含まれていた(図8b、c)。ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)は、38の鼻腔サンプル(41%)、75の皮膚サンプル(15%)、1つの乳サンプル(12.5%)、36の糞便サンプル(0.53%)、1つの口腔サンプル(0.14%)で検出され、膣では検出されなかった。ただし、相対的な存在量に基づくと、鼻腔のみが高い存在量のドロシグラニュラム (Dolosigranulum)を示した(平均相対存在量17%)。これは、健康な対照の前鼻孔に平均13%の相対存在量が見られたという私たちの研究と一致する。
【0086】
上記の結果は、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)が主にヒトURTに関連しており、およびこの細菌がサンプリングされた健康な対照においてより高い有病率(prevalence)と相対的な存在量を持っていることを示すことから、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)はURTの健康に有益であり、URTのプロバイオティクスとし有望であると仮定した。プロバイオティクスに関して第2のコッホの原則によると、微生物は健康な生物から単離され、純粋な培養で増殖する必要がある。したがって、我々は、健康なURTから単離されたドロシグラニュラム (Dolosigranulum)を培養し、そのプロバイオティクスの可能性を探ることを目指した。しかしながら、URTには大量のドロシグラニュラム (Dolosigranulum)が見つけられるものの、単離は非常に困難であることが判明した。カルノバクテリウム(Carnobacterium)などのカルノバクテリウム科(Carnobacteriaceae)のメンバーは、例えば、所望の実験室条件下で成長が遅いことで知られており(Afzal et al., 2010)、その結果、他の一般的なURT細菌が培地中で増殖する。さらに、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)に最適な増殖条件はまだ定義されておらず、たとえば、嫌気性条件下での増殖を好む菌株もあれば、好気性条件下での増殖を好む菌株もある。また、コロニーは寒天プレート上で長期間生存し続けることはない。我々は、1つのドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)を単離することができた(16S rRNA遺伝子レベルで確認済)。この単離株を単離した後でも、この菌株の増殖が遅いことによる細菌ストックの混入を避けるために、追加の予防措置が取られた。DNAを抽出し、全ゲノム配列決定を行った。単離されたドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)のゲノムサイズは1.8Mbであり、GC含量は39.6%だった。次に、ペアワイズゲノム比較マトリックスANI(平均ヌクレオチド同一性)を方法として使用して、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)を種レベルでドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)として分類できるかどうかを調査した。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) LMG15126と我々自身の単離株の間の0.975のANI値は、この単離株がドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)として分類されることを確認するものであり、これは、我々の知る限りでは、これまでドロシグラニュラム (Dolosigranulum)属内で唯一記載されている種である。ドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum) AMBR12は、37℃でインキュベートした0.5%(v/v)Tween 80を添加したBHI(ブレインハートインフュージョン)培地を使用して、中耳炎、喘息、または呼吸器アレルギーの病歴のない健康な子供の前鼻孔から単離した。全ゲノム配列決定とそれに続くドロシグラニュラム ピグラム(D.pigrum)タイプ株ATCC 51524との比較により、その同一性が確認され、ANI(平均ヌクレオチド同一性)値は0.9748(EZBioCloud ANI計算機)だった。
【0087】
これらのゲノムに基づいて、抗生物質耐性または病原性および毒素遺伝子の存在をさらに評価した。これらは、プロバイオティクスとしての可能性を探求したい場合、どの細菌株にとっても望ましくない特徴であるためである。病原性因子データベース(VFDB)データベースを使用した場合、病原性遺伝子は同定されなかった。染色体および/またはプラスミド抗生物質耐性遺伝子はどちらも存在しなかった。
【0088】
ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の気道上皮細胞への付着
【0089】
次に、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)およびATCC 51524菌株を表現型的に評価し、互いに比較したり、モデルのプロバイオティクス菌株L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)と比較したりした。付着が有益な効果に向けた重要な最初のステップである可能性があるため、最初に、菌株の付着能力をスクリーニングした。付着は、健康な対照と鼻ポリープのCRS患者の両方の気道上皮細胞(Calu-3)および初代鼻上皮細胞の両方で調査された(図9)。すべての菌株の付着は、Calu-3細胞への付着と比較して前記初代細胞で著しく高かった。L.ラムノサスGG(L.rhamnosus GG)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) ATCC 51524はすべての細胞タイプに同程度に付着したが、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の付着は著しく低かった。
【0090】
次に、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)が接着に関与している可能性のある線毛/線毛様構造を発現しているかを調査することを目的とした。潜在的な線毛の存在を調査するために、走査型電子顕微鏡(SEM)を実施した(データは示さず)。L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)の細胞表面に長い糸状のSpaCBA線毛が存在することを観察した。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) ATCC51524とドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の両方の細胞表面では、SpaCBA線毛の構造とは異なるように見えるが、糸状の構造も観察された(データは。
【0091】
安全性評価
【0092】
URTIはしばしば明白な炎症に関連しているため、過剰な炎症誘発性反応を誘発しないように、潜在的なプロバイオティクス株をスクリーニングすることが重要である。したがって、ヒト細胞を細菌と共培養した際の、重要な炎症性サイトカインであるIL-1β、TNFおよびIL-8の発現をテストした(図10a~d)。経上皮電気抵抗(TEER)およびフルオレセインイソチオシアネート-デキストラン(FD4)の通過も、バリアの完全性の尺度として使用された(図10e~f)。健康な対照由来の初代NECでは、TEER値は細菌と細胞の6時間のインキュベーション期間を通して安定したままであり、細胞自体のTEERに匹敵するため、テストされた乳酸桿菌およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)はバリアの完全性に影響を与えなかった。一方、黄色ブドウ球菌(S. aureus)は、6時間のインキュベーション後に平均TEERが48%に減少したため、バリアの完全性に大きな影響を及ぼした(図10d)。CRSwNP患者のNECでも同じ傾向が見られた。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)およびL.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)は、細胞自体と比較して上皮バリアの完全性に影響を与えていないようであったが、黄色ブドウ球菌(S.aureus)は相対TEER値が23%に減少し、有意な減少を引き起こした。これらの結果は、FD4継代に基づいても反映され、FD4継代は黄色ブドウ球菌(S.aureus)の条件で有意に高く、健康な対照のNECおよびCRSwNP患者の両方でバリア破壊が多いことを示す(図10f)。炎症性サイトカインの誘導と潜在的なバリア破壊効果(TEER分析およびFD4継代によって測定)をモデルプロバイオティクスL.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)、両ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)株および重要な病原性共生生物黄色ブドウ球菌(S.aureus)間で比較した。これらの実験では、我々の単離株がモデルプロバイオティクス株L.ラムノサスGG(L.rhamnosus GG)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) ATCC 51524と同程度に炎症性サイトカインの発現を誘導することを示したが、一方、黄色ブドウ球菌(S.aureus)は、有意に多くその発現を誘導した。
【0093】
プロバイオティクス効果:抗病原性、バリア強化、および免疫調節特性
【0094】
次に、さまざまなプロバイオティクス作用メカニズムに関連するドロシグラニュラム (Dolosigranulum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の表現型の可能性を調査することを目的とした。黄色ブドウ球菌(S.aureus)は重要なURT病原性共生生物と見なされているため、黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対するドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の抗菌活性および免疫調節効果に焦点が当てられた。
【0095】
潜在的な抗菌産物が分泌されるドロシグラニュラムピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の無細胞上清(CFS)を使用して、成長阻害アッセイにより黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖に対するドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の抗菌効果を評価することから始めた。このCFSでは、ドロシグラニュラムピグラム (D. pigrum) LMG15126およびよく説明されているモデルプロバイオティクスL.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)およびURT単離株L.カゼイ(L. casei)AMBR2のCFSの抗菌効果と比較した。後者は、URT適応に関連する独自の機能を備えていることが示され、URTプロバイオティクスとしての可能性を秘めている可能性がある。黄色ブドウ球菌(S.aureus)それ自体、または乳酸桿菌(lactobacilli)もしくはドロシグラニュラム (Dolosigranulum)のCFSを添加した黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖を経時的に測定した(図11a)。興味深いことに、テストしたすべての乳酸菌のCFSは、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖を部分的に阻害することができた。しかしながら、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の阻害効果は、L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)およびL.カゼイ(L. casei)AMBR2の効果よりも顕著ではなかった。ドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) LMG15126は、最初は自身の単離株と比較して黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖を阻害するようにみえたが、28時間後、ドロシグラニュラムピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)による阻害はドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) LMG15126による阻害と比較して大きかった。pH 4.3にした非接種MRS培地は、乳酸桿菌(lactobacilli)の影響の負の対照として使用され、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖のわずかな遅延のみを誘発した、これは、乳酸桿菌(Lactobacillus)を介した阻害の部分的なpH影響を示す。0.5%Tweenを添加した非接種BHI培地をドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の負の対照として使用し、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖をわずかに促進した。
【0096】
乳酸菌(lactobacilli)の抗菌作用の重要な要素として乳酸が知られていることから(van den Broek et al., 2018)、一晩のインキュベーション後、テストした乳酸桿菌(lactobacilli)と両方のドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum)株との間の乳酸産生の違いを調査することを目的とした(図11b)。乳酸菌に属することと一致して、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)はL-乳酸を産生することができたが、L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)およびL.カゼイ(L. casei)AMBR2と比較して有意に少なく、L.ラムノサスGG(L. rhamnosus GG)およびL.カゼイ(L. casei)AMBR2の両者は7g/Lの濃度であり、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) LMG15126は、それぞれ0.41 g/L and 0.37 g/Lの濃度だった。ただし、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の増殖は乳酸桿菌(lactobacilli)の増殖よりも大幅に低く、ドロシグラニュラム (Dolosigranulum)の一晩培養では+/- 5x107 CFU/mLであるのに対し、乳酸菌(Lactobacillus)では1x109 CFU/mLであることを考慮に入れる必要がある。この乳酸産生の少なさはまた、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum)による黄色ブドウ球菌(S. aureus)の増殖に対するそれほど顕著でない阻害効果が増殖阻害アッセイで観察された理由を説明するかもしれない。
【0097】
次にドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum)がトール様受容体(TLR)と相互作用する能力を調査した(図12)。TLR2/6は、腸内プロバイオティクスのバリア強化効果における重要な経路である。ここで、トランスフェクトされたヒト胎児腎臓(HEK)細胞におけるドロシグラニュラムピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)およびドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) LMG15126、L.ラムノサスGG(L.rhamnosus GG)、L.カゼイ(L.casei) AMBR2、L.サケイ(L. sakei) AMBR8および黄色ブドウ球菌(S. aureus)によるTLR2/TLR1とTLR2/TLR6の両方の活性化を調査した。ドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)は主にTLR2/TLR6ヘテロダイマーを活性化した。これは、ドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) LMG15126を含む他のすべてのテスト条件と比較して有意に高かった(p <0.0001)。TLR2/6を介した腸機能などの他の粘膜表面における細菌の多くのバリア強化効果があるため、これは重要な作用である。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)によるTLR2/TLR1の刺激は著しく低かったが、ドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)によるTLR2/TLR1の活性化は、テストした乳酸桿菌(lactobacilli)と比較して依然として有意に高く(p <0.05)、ドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) LMG15126および黄色ブドウ球菌(S. aureus)はこの受容体のより高い活性化を誘導した( p <0.0001)。
後者は、TLR2/TLR1の最も顕著な活性化を誘導した。テストした乳酸桿菌(lactobacilli)は、TLR2/TLR6とTLR2/TLR1のどちらも強力な誘導を誘導しないようにみえた(図12)。
【0098】
上皮バリアに対する黄色ブドウ球菌(S. aureus)の有害な影響に加えて、この病原性共生生物が気道細胞に高い炎症反応を誘発することも知られている。したがって、次に、黄色ブドウ球菌(S.aureus)によって誘発される炎症を軽減するドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)の能力を調査することを目的とした。Calu-3細胞におけるIL-8、TNF-α、およびIL-1 βの誘導は、単培養および共培養の細菌株について評価された(図13a~c)。炎症性サイトカインの発現は、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)と比較して黄色ブドウ球菌(S.aureus)によるCalu-3細胞の刺激により、有意に高かった(図13a~c)。ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)によりテストしたサイトカインの誘導は、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) LMG15126と同程度だった。興味深いことに、黄色ブドウ球菌(S.aureus)単独の誘導と比較して、黄色ブドウ球菌(S. aureus)をドロシグラニュラム ピグラム (D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)と共培養した場合、 IL-8(図13a)とIL-1β(図13c)の両方の発現が有意に減少したため、黄色ブドウ球菌(S.aureus)によって誘導された炎症に対して抗炎症効果を発揮するようにみえた。TNF-αの発現に関しては、有意差は見られなかった。
【0099】
最後に、黄色ブドウ球菌(S. aureus)ATCC29213の観察される病原性が、ガレリア(Galleria)でのドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)との同時注射によって部分的に阻害されるかどうかを調査することもまた目的とした。したがって、黄色ブドウ球菌(S.aureus)単独の注射との比較において、細菌共培養物の注射後の幼虫の生存をテストした。結果は図13dに示される。黄色ブドウ球菌(S.aureus)をドロシグラニュラムピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)との共培養で注射した場合、幼虫の生存率はより良好だった。テストされた濃度103 CFUの黄色ブドウ球菌(S. aureus)単独では、感染後144時間で20%の生存率が得られたが、前記共培養が注射されたときの生存率は60%だった。102 CFU黄色ブドウ球菌(S.aureus)の濃度では、50%が単培養で生存したが、これはドロシグラニュラム (Dolosigranulum)単離株との共培養では70%だった。これらの結果は、ドロシグラニュラム ピグラム(D. pigrum) AMBR11 (またはLMG P-31124)が黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対して抗菌および抗炎症効果を有する可能性があり、潜在的なURTプロバイオティクスとしての使用に非常に興味深いものである、という先の結果であることを確認している。
【0100】
参考文献
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【0101】
図面の用語
inverse Simpson 逆シンプソン
richness 豊かさ
diversity 多様性
anterior nares 前鼻孔
nasopharynx 鼻咽頭
maxillary sinus 上顎洞
ethmoid sinus 篩骨洞
location 場所
healthy 健康
case 症例
presence in CRS samples CRSサンプルでの存在
Dolosigranulum ドロシグラニュラム
presence in CON samples CONサンプルでの存在
fisher exact test フィッシャーの正確確率検定
mean relative abundance in CRS samples CRSサンプル中の平均相対存在量
mean relative abundance in CON samples CONサンプル中の平均相対存在量
welch t-test ウェルチのt検定
all_subjects 全ての被験者
predictor 予測変数
age 年齢
gender 性別
smoking 喫煙
allergies アレルギー
antibiotics 抗生物質
periostin ペリオスチン
steroids ステロイド
asthma 喘息
IFNgamma IFNガンマ
infectious 感染症
significant 有意さ
FALSE 偽陽性
TRUE 陽性
type of predictor 予測変数のタイプ
characteristic 特性
endotype エンドタイプ
phenotype 表現型
value 値
cluster クラスター
percentage 割合
Controls 対照
absence 不存在
presence 存在
Streptococcus ストレプトコッカス
Gemella ゲメラ
Granulicatella グラニュリカテラ
Moraxella モラクセラ
Corynebacterium コリネバクテリウム
Haemophilus ヘモフィルス
Actinobacillus アクチノバチルス
Vellonella ベイロネラ
Neisseria ナイセリア
Alloprevotella アロプレボテラ
Staphylococcus スタフィロコッカス
HD-Ratio HD比
Mean Relative Abundance 平均相対存在量
Study 研究
NP Carriage NP保因
OME Microbiome OME マイクロバイオーム
Phylum 門
Actinobacteria アクチノバクテリア
Bacteroidetes バクテロイデス
Firmicutes ファーミキューテス
Probacteria プロテオバクテリア
host_scientific_name 宿主学名
rel_abundance 相対存在量
Relative abundance 相対存在量
milk 母乳
nasal cavity 鼻腔
oral cavity 口腔
skin 皮膚
stool 便
vagina 膣
% adhesion to primary nasal epithellalcells 初代鼻上皮細胞への接着%
L. rhamnosus L.ラムノサス
D. pigrum ドロシグラニュラム ピグラム
CRS nasal polyps CRS鼻ポリープ
Healthy controls 健康な対照
% adhesion to THP1 cells THP1細胞への接着%
fold change 倍率変化
medium 培地
S. aureus 黄色ブドウ球菌
Relative TER% 相対TER%
time(h) 時間(時間)
L.casei L.カゼイ
time 時間
lactic acid 乳酸
L-lactic acid L乳酸
D-lactic acid D乳酸
stimulation 刺激
cells 細胞
significance against cells 細胞に対する有意性
significance against S. aureus 黄色ブドウ球菌に対する有意性
Percent survival 生存率
Hours p.i. 感染後時間
【0102】
(寄託書)
【表A-1】
【表A-2】
【表A-3】
【表A-4】
【表B-1】
【表B-2】
【表B-3】
【表B-4】
【表C-1】
【表C-2】

【表C-3】
【表C-4】
【表D-1】
【表D-2】
【表D-3】
【表D-4】

図1
図2
図3
図4
図5-1】
図5-2】
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
【配列表】
2022514407000001.app
【国際調査報告】