特表 2022-514465 第ＩＸ因子を発現するレンチウイルスベクターの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-14

(54)【発明の名称】第ＩＸ因子を発現するレンチウイルスベクターの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220204BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/90 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/16 20060101ALI20220204BHJP

   C12N 15/14 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220204BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/11 Z

C12N15/85 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

C12N15/90 Z

C12N15/867 Z

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/16

C12N15/14

A61K38/48 100

A61K48/00

A61P7/04

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021531954

(86)(22)【出願日】2019-12-05

(85)【翻訳文提出日】2021-07-19

(86)【国際出願番号】 US2019064711

(87)【国際公開番号】W WO2020118069

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】62/776,393

(32)【優先日】2018-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】トンヤオ・リウ

(72)【発明者】

【氏名】スザンナ・パタロヨ－ホワイト

(72)【発明者】

【氏名】ダグラス・ドレイガー

(72)【発明者】

【氏名】アレッシオ・カントーレ

(72)【発明者】

【氏名】ルイージ・ナルディーニ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC10

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA53

(57)【要約】

本開示は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクター、およびこのようなレンチウイルスベクターを使用する方法を提供する。本明細書に開示される肝臓標的化レンチウイルスベクターは、遺伝子療法のために使用することができ、ここで、レンチウイルス遺伝子送達は、小児（例えば、新生児）または成人対象の標的化細胞（例えば、肝細胞）のゲノムの中への、導入遺伝子発現カセットの安定した組入れを可能にし、低いレンチウイルスベクター用量でのＦＩＸ発現の向上を達成する。本開示は、血友病（例えば、血友病Ｂ）などの出血障害を処置する方法であって、ＦＩＸ活性配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む肝臓標的化レンチウイルスベクターを低い投薬量でそれを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターの有効用量を該対象に投与することを含み、該レンチウイルスベクターを、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を含むＣＤ４７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージし、該有効用量は、該レンチウイルスベクターと同じＦＩＸ活性を誘導するのに必要な該対照レンチウイルスベクターの対照用量と比較して低下する、前記方法。

【請求項2】

対照レンチウイルスベクターは、該対照レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり１９個の分子のＣＤ４７を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

レンチウイルスベクターは、該レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

有効用量は、約５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

対象は、投与後の以下の特性：
（ａ）対照レンチウイルスベクターと比較して、レンチウイルスベクターのマクロファージへの形質導入の低下；
（ｂ）対照レンチウイルスベクターと比較して、レンチウイルスベクターへのアロ特異的免疫応答の低下；
（ｃ）投与の少なくとも３週間後における正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも３０％のＦＩＸ活性；
（ｄ）肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方におけるレンチウイルスベクターの組織特異的発現；および
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれかの組合せ
のうちの１つまたはそれ以上を示す、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

アロ特異的免疫応答は、レンチウイルスベクターに応答したサイトカインの放出を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

サイトカインは、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＣＰ－１、およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現レベルの低下を示す、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現レベルの低下を示す、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１の発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１の発現レベルの低下を示す、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％のＦＩＸ活性を示す、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約１５０％のＦＩＸ活性を示す、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

レンチウイルスベクターの投与の２４時間後～４８時間後における血漿ＦＩＸ活性は、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与した対象と比較して増加する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

血漿ＦＩＸ活性は、投与後に、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

対象は、レンチウイルスベクターの投与後に、該対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、該肝臓、脾臓、または該肝臓と該脾臓の両方への該レンチウイルスベクターの局在化の増加を示す、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の該肝臓、脾臓、または該肝臓と該脾臓の両方において、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍多い該レンチウイルスベクターのベクターコピー数（ＶＣＮ）によって特徴付けられる、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の該肝臓、脾臓、または該肝臓と該脾臓の両方において、少なくとも１０倍多い該レンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の該肝臓、脾臓、または該肝臓と該脾臓の両方において、少なくとも５０倍多い該レンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項19】

局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の該肝臓、脾臓、または該肝臓と該脾臓の両方において、少なくとも１００倍多い該レンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

ヒトＣＤ４７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも約７０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９６％、少なくとも９７％、少なくとも約９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉポリペプチドを含まない、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））と比較して高濃度のＣＤ４７を発現する宿主細胞において生成される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満の、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを、該対象に投与することを含み、該レンチウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記方法。

【請求項26】

ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

用量は、約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇまたは約１×１０^８ＴＵ／ｋｇである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

用量は、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

用量は、１×１０^８～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、６×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

用量は、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０^９～２×１０^９ＴＵ／ｋｇである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

用量は、１×１０^１０～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０^１０～１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０^１０～１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０^１０～１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^１０～１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

用量は、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

レンチウイルスベクターは静脈内注射を通して投与される、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

対象は小児対象である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

対象は成人対象である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

対象は青年対象である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

レンチウイルスベクターは、組織特異的プロモーターを含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、またはその任意の組合せを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

標的肝臓細胞は肝細胞である、請求項４７または４８に記載の方法。

【請求項50】

単離された核酸分子は肝細胞のゲノムに安定して組み入れられる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

レンチウイルスベクターは、スプライスドナー部位を含む、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

レンチウイルスベクターは、スプライスアクセプター部位を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

レンチウイルスベクターは、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｒｅｖ配列、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、またはその任意の組合せを含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

ｇａｇ配列は、全長またはトランケーションされたｇａｇ配列である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

レンチウイルスベクターは、エンハンサー、マイクロＲＮＡに対する標的配列、転写後調節エレメント、パッケージングシグナル、ポリＡ配列、イントロン配列、またはその任意の組合せを含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

レンチウイルスベクターの用量は、一度に投与されるかまたは少なくとも２つの部分用量に分割される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

レンチウイルスベクターの用量は、少なくとも２回反復される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

シグナルペプチドをコードする核酸配列は、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；
（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；
（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；
（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；
（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；または
（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４
に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

プロペプチドをコードする核酸配列は、
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；
（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；
（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；
（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；
（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または
（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８
に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、異種アミノ酸配列をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

異種アミノ酸配列は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、ＣＴＰペプチド配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、または組合せである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

異種アミノ酸配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に連結されるか、または該アミノ酸配列の２つのアミノ酸の間に挿入される、請求項６２または６３に記載の方法。

【請求項65】

異種部分は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、またはその任意の組合せに対応するアミノ酸のすぐ下流で、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中に挿入される、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８ＬバリアントＦＩＸポリペプチドである、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

レンチウイルスベクターは、宿主細胞中で生成される、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

宿主細胞はＣＤ４７を発現する、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

宿主細胞は、ＣＤ４７を過剰発現するように改変される、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

宿主細胞は、ＭＨＣ－Ｉを発現しない、請求項６７～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

宿主細胞は、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－である、請求項６７～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

宿主細胞は、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項６９～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

（ｉ）組織特異的プロモーターを含むヌクレオチド配列、および（ｉｉ）配列番号１に示されるような核酸配列を含むレンチウイルスベクターであって、該組織特異的プロモーターが、肝臓細胞の核酸配列の発現を駆動する、前記レンチウイルスベクター。

【請求項74】

（ｉ）スプライスドナー部位；
（ｉｉ）スプライスアクセプター部位；
（ｉｉｉ）ｇａｇ配列；
（ｉｖ）Ｒｅｖ応答エレメント；
（ｖ）エンハンサー；
（ｖｉ）転写後調節エレメントを含むヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対する配列同一性に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列；および
（ｖｉｉｉ）マイクロＲＮＡに対する標的配列を含むレンチウイルスベクター。

【請求項75】

核酸配列は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項７３または７４に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項76】

ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項77】

レンチウイルスベクターの表面は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルのＣＤ４７タンパク質を含む、請求項７４～７６のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項78】

レンチウイルスベクターの表面は、ＭＨＣ－Ｉを含まない、請求項７７に記載のレンチウイルスベクター。

【請求項79】

それを必要とする対象において血友病を処置する方法であって、請求項７３～７８のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターの有効用量を該対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項80】

有効用量は、約５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９未満ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

有効用量は、約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇである、請求項７９または８０に記載の方法。

【請求項82】

有効用量は、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である、請求項７９または８０に記載の方法。

【請求項83】

有効用量は、１×１０^８～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、６×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである、請求項７９または８０に記載の方法。

【請求項84】

有効用量は、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０^９～２×１０^９ＴＵ／ｋｇである、請求項７９または８０に記載の方法。

【請求項85】

有効用量は、１×１０^１０～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０^１０～１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０^１０～１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０^１０～１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^１０～１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである、請求項７９または８０に記載の方法。

【請求項86】

有効用量は、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである、請求項７９～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される、請求項７９～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される、請求項７９～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

対象は小児対象である、請求項７９～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

対象は成人対象である、請求項７９～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含む核酸配列。

【請求項92】

請求項９１に記載の核酸配列を含むベクター。

【請求項93】

組織特異的プロモーターを含む、請求項９２に記載のベクター。

【請求項94】

組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する、請求項９３に記載のベクター。

【請求項95】

標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、またはその任意の組合せを含む、請求項９４に記載のベクター。

【請求項96】

標的肝臓細胞は肝細胞である、請求項９４または９５に記載のベクター。

【請求項97】

スプライスドナー部位を含む、請求項９４～９６のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項98】

スプライスアクセプター部位を含む、請求項９４～９７のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項99】

ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｒｅｖ配列、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、またはその任意の組合せを含む、請求項９４～９８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項100】

ｇａｇ配列は、全長またはトランケーションされたｇａｇ配列である、請求項９９に記載のベクター。

【請求項101】

エンハンサー、マイクロＲＮＡに対する標的配列、転写後調節エレメント、パッケージングシグナル、ポリＡ配列、イントロン配列、またはその任意の組合せを含む、請求項９２～１００のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項102】

請求項９１に記載の核酸配列または請求項９２～１０１のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項103】

哺乳動物細胞である、請求項１０２に記載の細胞。

【請求項104】

ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、およびＣＡＰ細胞である、請求項１０２に記載の細胞。

【請求項105】

ヒト細胞である、請求項１０２または１０３に記載の細胞。

【請求項106】

ＣＤ４７タンパク質を発現する、請求項１０２～１０５のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項107】

ＣＤ４７を過剰発現するように改変される、請求項１０６に記載の細胞。

【請求項108】

細胞の表面に、ＣＤ４７を過剰発現するように改変されていない対照細胞と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む、請求項１０７に記載の細胞。

【請求項109】

ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である、請求項１０６～１０８のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項110】

ＭＨＣ－Ｉを発現しない、請求項１０２～１０９のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項111】

好適な条件下で、請求項１０２～１１０のいずれか１項に記載の細胞を培養することを含む、レンチウイルスベクターを生成する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７７６，３９３号に対する優先権の利益を主張し、その内容全体は参照によって本明細書に組み入れる。

【0002】

電子的に提出された配列表への参照
電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＳＡ９－４６８ＴＷ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：２８，４７０バイト；作成日：２０１９年１２月２日）の配列表の内容は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる。

【背景技術】

【0003】

血液凝固経路は、血小板の表面の第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）および第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の酵素複合体（Ｘａｓｅ複合体）の形成を一部含む。ＦＩＸａは、その補因子ＦＶＩＩＩａ無しで比較的弱い触媒活性を有するセリンプロテアーゼである。Ｘａｓｅ複合体は第Ｘ因子（ＦＸ）を第Ｘａ因子（ＦＸａ）に切断し、それは次に第Ｖａ因子（ＦＶａ）と相互作用してプロトロンビンを切断してトロンビンを生成する。血友病Ｂは、ＦＩＸ活性の欠損をもたらすＦＩＸ遺伝子における突然変異および／または欠失によって引き起こされる出血障害である。

【0004】

血友病では、ある特定の血漿血液凝固因子の欠如によって、血液凝固が妨害される。血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界中で最も一般的な遺伝性出血障害のうちの１つである。血友病Ｂは、第ＩＸ因子タンパク質の合成低下または活性が低下した不完全分子のうちのいずれかに起因する第ＩＸ因子の欠損によって引き起こされる。血友病Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで血液凝固活性の低下を生じ、罹患した個体の一生を通じて広範な医療監視を必要とする。有効な予防法もなく、再発性関節血症によって、進行性の障害をもたらす関節症の発症および生活の質の低下がもたらされる（非特許文献１）。

【0005】

血友病Ｂの治療は、不足している凝固因子を、第ＩＸ因子が高濃度で濃縮された外的因子濃縮物で置き換えることによって行われる。しかしながら、血液からこのような濃縮物を生成することには、技術的困難が伴う。したがって、現在の置き換え療法の困難さおよび制限を克服するＦＩＸ療法に対する当技術分野における需要が存在する。遺伝子療法は、有効なアプローチとして、標的化細胞のゲノムの中へのＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む導入遺伝子発現カセットの安定した組入れによって、血友病Ｂの持続的処置を表す。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｇｉａｎｇｒａｎｄｅ Ｐ．、Ｅ×ｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２００５年；６：１５１７～２４頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターの有効用量を対象に投与することを含み、レンチウイルスベクターを、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を含むＣＤ４７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージし、有効用量は、レンチウイルスベクターと同じＦＩＸ活性を誘導するのに必要な対照レンチウイルスベクターの対照用量と比較して低下する、方法を提供する。

【0008】

一部の実施形態では、対照レンチウイルスベクターは、対照レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり１９個の分子のＣＤ４７を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。

【0009】

一部の実施形態では、有効用量は、約５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0010】

一部の実施形態では、対象は、投与後の以下の特性：（ａ）対照レンチウイルスベクターと比較して、レンチウイルスベクターのマクロファージへの形質導入の低下；（ｂ）対照レンチウイルスベクターと比較して、レンチウイルスベクターへのアロ特異的免疫応答の低下；（ｃ）投与の少なくとも３週間後における正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも３０％のＦＩＸ活性；（ｄ）肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方におけるレンチウイルスベクターの組織特異的発現；および（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれかの組合せのうちの１つまたはそれ以上を示す。

【0011】

一部の実施形態では、アロ特異的免疫応答は、レンチウイルスベクターに応答したサイトカインの放出を含む。一部の実施形態では、サイトカインは、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＣＰ－１、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現レベルの低下を示す。一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現レベルの低下を示す。一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＣＰ－１の発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＣＰ－１の発現レベルの低下を示す。

【0012】

一部の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％のＦＩＸ活性を示す。一部の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約１５０％のＦＩＸ活性を示す。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与の２４時間後～４８時間後における血漿ＦＩＸ活性は、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与した対象と比較して増加する。一部の実施形態では、血漿ＦＩＸ活性は、投与後に、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する。

【0013】

一部の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与後に、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示す。一部の実施形態では、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍多いレンチウイルスベクターのベクターコピー数（ＶＣＮ）によって特徴付けられる。一部の実施形態では、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも１０倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。一部の実施形態では、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも５０倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。一部の実施形態では、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも１００倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。

【0014】

一部の実施形態では、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である。一部の実施形態では、ヒトＣＤ４７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも約７０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９６％、少なくとも９７％、少なくとも約９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））と比較して高濃度のＣＤ４７を発現する宿主細胞において生成される。

【0015】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。

【0016】

本開示は、それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満の、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを、対象に投与することを含み、レンチウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、方法も提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0017】

一部の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、用量は、１×１０^８～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、６×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０^９～２×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、１×１０^１０～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０^１０～１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０^１０～１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０^１０～１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^１０～１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0018】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される。一部の実施形態では、対象は、小児対象である。一部の実施形態では、対象は、成人対象である。

【0019】

一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、肝細胞のゲノムに安定して組み入れられる。

【0021】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、スプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、スプライスアクセプター部位を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｒｅｖ配列、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ｇａｇ配列は、全長またはトランケーションされたｇａｇ配列である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、エンハンサー、マイクロＲＮＡに対する標的配列、転写後調節エレメント、パッケージングシグナル、ポリＡ配列、イントロン配列、またはその任意の組合せを含む。

【0022】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、一度に投与されるか、または少なくとも２つの部分用量に分割される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、少なくとも２回繰り返される。

【0023】

一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；またｈ（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0024】

一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、異種アミノ酸配列をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、ＣＴＰペプチド配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、または組合せである。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に連結されるか、またはアミノ酸配列の２つのアミノ酸の間に挿入される。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、またはその任意の組合せに対応するアミノ酸のすぐ下流のＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中に挿入される。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８ＬバリアントＦＩＸポリペプチドである。

【0025】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、宿主細胞内で生成される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７を発現する。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７を過剰発現するように改変される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ－１を発現しない。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

【0026】

本開示は、（ｉ）組織特異的プロモーターを含むヌクレオチド配列、および（ｉｉ）配列番号１に示されるような核酸配列を含むレンチウイルスベクターであって、組織特異的プロモーターが、肝臓細胞の核酸配列の発現を駆動する、レンチウイルスベクターも提供する。

【0027】

本開示は、（ｉ）スプライスドナー部位；（ｉｉ）スプライスアクセプター部位；（ｉｉｉ）ｇａｇ配列；（ｉｖ）Ｒｅｖ応答エレメント；（ｖ）エンハンサー；（ｖｉ）転写後調節エレメントを含むヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対する配列同一性に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列、および（ｖｉｉｉ）マイクロＲＮＡに対する標的配列を含むレンチウイルスベクターも提供する。

【0028】

一部の実施形態では、核酸配列は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルのＣＤ４７タンパク質を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、ＭＨＣ－Ｉを含まない。

【0030】

本開示は、それを必要とする対象において血友病を処置する方法であって、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの有効用量を対象に投与することを含む、方法にも関する。一部の実施形態では、有効用量は、約５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、有効用量は、約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効用量は、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、有効用量は、１×１０^８～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^８～１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、２×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、３×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、４×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、５×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、６×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、７×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、８×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、９×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、２．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、３．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、４×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０^１０～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効用量は、１×１０^９～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、１×１０^９～３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、および１×１０^９～２×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効用量は、１×１０^１０～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．１×１０^１０～１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．２×１０^１０～１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、１．３×１０^１０～１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^１０～１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、有効用量は、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0031】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される。一部の実施形態では、対象は、小児対象である。一部の実施形態では、対象は、成人対象である。

【0032】

一部の実施形態では、配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列。本開示は、本明細書に開示される核酸配列を含むベクターにも関する。一部の実施形態では、ベクターは、組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。

【0033】

一部の実施形態では、ベクターは、スプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、ベクターは、スプライスアクセプター部位を含む。一部の実施形態では、ベクターは、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｒｅｖ配列、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ｇａｇ配列は、全長またはトランケーションされたｇａｇ配列である。一部の実施形態では、ベクターは、エンハンサー、マイクロＲＮＡに対する標的配列、転写後調節エレメント、パッケージングシグナル、ポリＡ配列、イントロン配列、またはその任意の組合せを含む。

【0034】

本開示は、本明細書に開示される核酸配列またはベクターを含む細胞にも関する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、およびＣＡＰ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４７タンパク質を発現する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４７を過剰発現するように改変される。一部の実施形態では、細胞は、細胞の表面に、ＣＤ４７を過剰発現するように改変されていない対照細胞と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である。一部の実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉを発現しない。

【0035】

本開示は、好適な条件下で本明細書に開示される細胞を培養することを含む、レンチウイルスベクターを生成する方法にも関する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むレンチウイルスベクター（「ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌ」）のベクターマップを示す図である。

【図2】図２Ａ～２Ｂは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを８週齢で投与した後のＨｅｍＢマウスに関する血漿ＦＩＸ活性のグラフ図を示す図である。図２Ａは、３Ｅ９、７．５Ｅ９、２Ｅ１０、または６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量で尾静脈注射を通してＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを投与した血漿ＦＩＸ活性を示し、図２Ｂは、対応する用量応答曲線を示す。エラーバーは、標準偏差を表す（図２Ｂ）。

【図3】図３Ａ～３Ｂは、７．５Ｅ９（丸）、２Ｅ１０（四角）、または６Ｅ１０（三角）ＴＵ／ｋｇの用量で尾静脈注射を通してＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを投与した８週齢のＨｅｍＢマウスに関する６カ月までの様々な時点における血漿ＦＩＸ活性（図３Ａ）および血漿ＦＩＸ抗原（図３Ｂ）のグラフ図を示す図である。エラーバーは、標準偏差を表す（図３Ａ～３Ｂ）。

【図4A】新生期、青年期、または成体期において、６カ月までの様々な時点での持続性ＦＩＸ発現（図４Ａ）および同様の用量でのＬＶ－ＦＩＸ用量応答（図４Ｂ）のグラフ図を示す図である。ＨｅｍＢマウスに、７．５Ｅ９、２Ｅ１０、もしくは６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量のＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを静脈内注射により８週齢（四角）もしくは２日齢（丸）で投与するか；または示すように、ＨｅｍＢマウスに、３Ｅ９、７．５Ｅ９、もしくは２Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量のＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを静脈内注射により２週齢（三角）で投与した（図４Ａ）。８週齢（四角）、２週齢（三角）、および２日齢（丸）のＨｅｍＢマウスにおいて、図４Ａで試験した様々な用量でのＦＩＸ活性によって用量応答を測定した。エラーバーは、標準偏差を表す（図４Ａ～４Ｂ）。

【図4B】新生期、青年期、または成体期において、６カ月までの様々な時点での持続性ＦＩＸ発現（図４Ａ）および同様の用量でのＬＶ－ＦＩＸ用量応答（図４Ｂ）のグラフ図を示す図である。ＨｅｍＢマウスに、７．５Ｅ９、２Ｅ１０、もしくは６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量のＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを静脈内注射により８週齢（四角）もしくは２日齢（丸）で投与するか；または示すように、ＨｅｍＢマウスに、３Ｅ９、７．５Ｅ９、もしくは２Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量のＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを静脈内注射により２週齢（三角）で投与した（図４Ａ）。８週齢（四角）、２週齢（三角）、および２日齢（丸）のＨｅｍＢマウスにおいて、図４Ａで試験した様々な用量でのＦＩＸ活性によって用量応答を測定した。エラーバーは、標準偏差を表す（図４Ａ～４Ｂ）。

【図5】対照レンチウイルスベクター（ＬＶ；黒い丸）または高表面レベルのＣＤ４７を有するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７ｈｉ ＬＶ；灰色の丸）の投与後のＮＯＤマウスのマクロファージにおけるレンチウイルスベクターのベクターコピー数（ＶＣＮ）を示すプロットを示す図であり、マクロファージ中に存在するレンチウイルスベクター分子の数を決定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＶＣＮデータを対照として示す。エラーバーは、標準偏差を表す。

【図6-1】図６Ａ～６Ｃは、対照レンチウイルスベクター（ＬＶ－ＦＩＸ；＃１、＃２、および＃３）、高表面レベルのＣＤ４７を有するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７ｈｉ ＬＶ－ＦＩＸ；＃４、＃５、および＃６）中にパッケージングされたＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクター、またはビヒクル対照（＃７）の投与後のブタオザルにおける血漿ＦＩＸ活性（図６Ａ）、血漿ＦＩＸ抗原（図６Ｂ）、およびＦＩＸ機能（ＡＰＴＴ時間で表す；図６Ｃ）のグラフ図を示す図である。

【図6-2】図６－１の続き。

【図7】図７Ａ～７Ｂは、血漿ＦＩＸ活性（図７Ａ）および血漿ＦＩＸ抗原（ＦＩＧ．７Ｂ）によって表すように、Ｅ９ＴＵ／ｋｇの用量で投与した、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを含むＣＤ４７^ｈｉｇｈレンチウイルスベクターの投与後のブタオザルにおける定常状態のレンチウイルスベクターに媒介されるＦＩＸ発現のグラフ図を示す図である。エラーバーは、標準偏差を表す（図７Ａ～７Ｂ）。

【図8-1】図８Ａ～８Ｄは、ビヒクル（白い丸）、対照レンチウイルスベクター（ＬＶ；黒い丸）または高表面レベルのＣＤ４７を有するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７ｈｉ ＬＶ；灰色の丸）（このレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを含む）の投与後のブタオザルにおけるＡＬＴレベル（図８Ａ）、ＡＳＴレベル（図８Ｂ）、リンパレベル（図８Ｃ）、および体温（図８Ｄ）のグラフ図を示す図である。

【図8-2】図８－１の続き。

【図9-1】図９Ａ～９Ｃは、ビヒクル（黒い丸）、対照レンチウイルスベクター（ＬＶ；黒い四角）または高表面レベルのＣＤ４７を有するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７ｈｉ ＬＶ；塗りつぶしなしの四角）（このレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを含む）の投与後のブタオザルにおけるＭＩＰ－１ａ（９Ａ）、ＭＩＰ－１ｂ（９Ｂ）、およびＭＣＰ－１（９Ｃ）の発現レベルのグラフ図を示す図である。

【図9-2】図９－１の続き。

【図10】ビヒクル（三角）、対照レンチウイルスベクター（逆三角）またはＣＤ４７ｈｉ（ＬＶ；丸）のブタオザルへの投与後の、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターの組織特異的分布（ＶＣＮによって表す）を示す散布図を示す図である。各データセットは、個々のブタオザルを表す。

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、血漿ＦＩＸ活性（図１１Ａ）および血漿ＦＩＸ抗原（図１１Ｂ）によって表すように、２．５ Ｅ９ＴＵ／ｋｇの用量で投与した、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを含むＣＤ４７^ｈｉｇｈレンチウイルスベクターの投与後のブタオザルにおける定常状態のレンチウイルスベクターに媒介されるＦＩＸ発現のグラフ図を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本開示は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含むレンチウイルスベクター、およびこれを使用する方法について記載する。したがって、一部の態様では、本開示は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの投与を含む遺伝子療法に関する。特定の態様では、本開示は、血友病（例えば、血友病Ｂ）などの出血障害を処置する方法であって、肝臓（例えば、肝細胞）を標的にしたコドン最適化ＦＩＸ核酸配列を含むレンチウイルスベクターを対象に投与することを含む方法に関する。本開示は、標的化細胞のゲノムの中へのＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む導入遺伝子発現カセットの安定した組入れをもたらす遺伝子療法アプローチを通して、当技術分野の重要な必要性を満たす。

【0038】

このシステムは、レンチウイルスベクターを５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）以下、例えば、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ以下、または約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ以下、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ以下の少なくとも１用量で対象に投与した場合、標的化細胞（例えば、肝細胞）におけるＦＩＸ活性を有するポリペプチドの増加した長期発現を実証する。

【0039】

本開示の例示的な構築物は、付随する図面および配列表に例示される。

【0040】

明細書および請求項の明確な理解を提供するために、以下の定義を下に提供する。

【0041】

Ｉ．定義
用語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の実体とは、その実体の１つまたはそれ以上を指す点に留意する：例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。このように、用語「ａ」（または、「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用することができる。

【0042】

本明細書で、用語「約」は、概ね、だいたい、前後またはほぼを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と一緒に使用されるとき、それは、示される数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、明記される値の上下の数値を上下（高低）１０％の分散によって変更するために、本明細書で使用される。

【0043】

本開示のための用語「単離された」は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生体物質（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体）を指す。例えば、植物または動物に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する隣接核酸から分離される同じポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。精製の特定のレベルは要求されていない。宿主細胞において発現される組換えで生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されたか、分画されたか、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えのポリペプチドと同様に、本開示において単離されたと考えられる。

【0044】

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形、または、一本鎖形もしくは二本鎖ヘリックスの形の任意のそのリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次および二次構造だけを指し、それをいかなる特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡおよび染色体に見出される、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論では、本明細書で、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同性の配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配列だけを与える通常の慣例によって配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡが限定されずに含まれる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の核酸を含む。

【0045】

本明細書で使用されるように、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に一般的に翻訳されないが、それはコード領域の一部であると考えることができるが、いずれの隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなども、コード領域の一部でない。コード領域の境界は、生じるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンによって一般的に決定される。２つ以上のコード領域が、例えば単一のベクターの上の単一のポリヌクレオチド構築物に、または例えば別個の（異なる）ベクターの上の別個のポリヌクレオチド構築物に存在することができる。その結果、次に、単一のベクターは単一のコード領域だけを含有することができるか、２つ以上のコード領域を含むことができる。

【0046】

哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、粗い小胞体を越えた成長しているタンパク質鎖の移行が開始されると成熟したタンパク質から切断される、分泌シグナルペプチドに関連している。当業者は、シグナルペプチドがポリペプチドのＮ末端に一般的に融合していること、および、完全なまたは「完全長の」ポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌された、または「成熟した」形態を生成することを知っている。ある特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、またはそれと作動可能に関連するポリペプチドの分泌を方向付ける能力を保持するその配列の機能的誘導体。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。

【0047】

用語「ＦＩＸ活性を有するポリペプチド」は、本明細書で使用されるように、凝固因子ＩＸに関連する１つまたはそれ以上の活性を有するポリペプチドを指す。ＦＩＸを含む凝固系の機能を調査するために、いくつかの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを判定するためにも使用される）、フィブリノーゲン試験（しばしばクラウス方法による）、血小板数、血小板機能試験（しばしばＰＦＡ－１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に異常が修正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子検査（例えば、Ｖ因子ライデン、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。

【0048】

ａＰＴＴ試験は、「内因性」（接触活性化経路とも呼ばれる）および一般的な凝固経路の効能を測定する性能指示器である。この試験は、市販されている組換え凝固因子、例えば、ＦＩＸの凝固活性を測定するために一般的に使用される。それは、外因性の経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と一緒に使用される。

【0049】

ＲＯＴＥＭ（登録商標）分析は、止血の完全なカイネティクス：凝固時間、クロット形成、クロットの安定性および溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリーにおける異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線溶またはこれらの相互作用に影響する多くの因子に依存する。このアッセイは、二次性の止血の完全な像を提供することができる。

【0050】

用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。

【0051】

用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写の開始部位の上流に位置する。

【0052】

本明細書で使用されるように、用語「遺伝子調節領域」または「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。コード領域が真核細胞における発現を意図している場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列はコード配列の３’側に通常位置する。

【0053】

遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のコード領域と作動可能に関連するプロモーターおよび／または他の発現（例えば、転写または翻訳）制御エレメントを含むことができる。作動可能な関連では、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような方法で１つまたはそれ以上の調節領域と関連する。例えば、コード領域およびプロモーターは、プロモーター機能の誘導がコード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、およびプロモーターとコード領域の間の連結の性質が遺伝子産物の発現を方向付けるプロモーターの能力に干渉しないか、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に関連する」。プロモーター以外の他の発現制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終止シグナルも、遺伝子産物発現を方向付けるためにコード領域に作動可能に関連することができる。

【0054】

「転写制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を可能にするＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａと一緒の前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子から誘導されるもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ－グロビン、ならびに真核生物細胞における遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が含まれる。さらなる適する転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導可能プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。

【0055】

同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにピコルナウイルスから誘導されるエレメント（特に、リボソーム内部進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれる。

【0056】

本明細書で使用される用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成する過程を指す。それは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または他の任意のＲＮＡ生成物へのポリヌクレオチドの転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を限定されずに含む。発現は、「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡであっても、または転写物から翻訳されるポリペプチドであってもよい。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、またはタンパク分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。本明細書で使用される用語「収量」は、遺伝子の発現によって生成されるポリペプチドの量を指す。

【0057】

「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、付着しているセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントを付着させることができるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製の自律的な単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下での複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで核酸を細胞に導入するためのウイルス性のビヒクルと非ウイルス性のビヒクルの両方を含む。例えばプラスミド、改変された真核生物ウイルスまたは改変された細菌ウイルスを含めて、当技術分野で多数のベクターが公知であり、使用される。適するベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、相補的な粘着末端を有する選択されたベクターに適当なポリヌクレオチド断片をライゲーションすることによって達成することができる。

【0058】

ベクターを組み込んだ細胞の選択または同定を可能にする選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように、ベクターを工学的に操作することができる。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現は、ベクター上に含有される他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当技術分野で公知であり、使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下のものが含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；および、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など。当技術分野で公知であり、使用されるレポーターの例には、以下のものが含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカーは、レポーターであると考えることもできる。

【0059】

用語「選択可能なマーカー」は、マーカー遺伝子の作用、すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性、比色マーカー、酵素、蛍光性マーカーなどに基づいて選択することができる、同定用因子、通常、抗生物質または化学物質耐性遺伝子を指し、ここで、この作用は、目的の核酸の継承を追跡するために、および／または目的の核酸を継承した細胞もしくは生物体を同定するために使用される。当技術分野で公知であり、使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下のものが含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；および、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など。

【0060】

用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の作用に基づいて同定することができる、同定用因子をコードする核酸を指し、ここで、この作用は、目的の核酸の継承を追跡するために、目的の核酸を継承した細胞もしくは生物体を同定するために、および／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定するために使用される。当技術分野で公知であり、使用されるレポーター遺伝子の例には、以下のものが含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカー遺伝子は、レポーター遺伝子と考えることもできる。

【0061】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然の遺伝子から完全に誘導することができるか、天然に見出される異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントで構成されるか、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を方向付けることができることを理解する。ほとんどの細胞型においてほとんどのときに遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特異的細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発達または細胞分化の特異的段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「発達特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導されて、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導可能なプロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されているとは限らないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。

【0062】

プロモーター配列は転写開始部位がその３’末端に一般的に結合し、上流（５’方向）に伸長してバックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列の中には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって都合良く規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の役割を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。

【0063】

用語「プラスミド」は、細胞の中心的代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である遺伝子をしばしば有する染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意の供給源から誘導される一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状またはスーパーコイル状の、自己複製配列、ゲノム組入れ配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよく、そこでは、適当な３’非翻訳配列とともに選択される遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である特異な構築物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結されているか組み換えられている。

【0064】

「クローニングベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの、逐次的に複製し、複製開始点を含む単位長の核酸である「レプリコン」を指し、付着しているセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントをそれに対して付着させることができる。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えば細菌における複製、および別の細胞型、例えば真核細胞における発現が可能である。クローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために使用することができる１つまたはそれ以上の配列、および／または目的の核酸配列の挿入のための１つまたはそれ以上の多重クローニング部位を一般的に含む。

【0065】

用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上記の調節領域との作動可能な関係に置かれる。

【0066】

ベクターは、当技術分野で周知である方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって宿主細胞に導入される。「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用されるように、複製欠陥ハイブリッドウイルス粒子を指す。一部の文脈では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクター粒子および封入されたレンチウイルスゲノムを指す。一部の文脈では、レンチウイルスベクターは、その任意の改変を含むレンチウイルスゲノムを指す。

【0067】

本明細書で使用されるように、「培養」、「培養すること」および「培養すること」は、細胞の増殖もしくは分裂を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件の下で細胞をインキュベートすること、または細胞を生存状態に維持することを意味する。本明細書で使用されるように、「培養された細胞」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した細胞を意味する。

【0068】

本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するものであり、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結される単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、具体的長さの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すために使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断または天然に存在しないアミノ酸による改変を限定されずに含む、ポリペプチドの発現後の改変の生成物も指すものである。ポリペプチドは天然の生物供給源から誘導することができるか、または組換え技術で生成することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学的合成を含む任意の方法で生成することができる。

【0069】

用語「アミノ酸」には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。非伝統的なアミノ酸も本開示の範囲内であり、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１～３３６頁（１９９１）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２頁（１９８９）および上記のＥｌｌｍａｎらの手法を使用することができる。簡潔には、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することと、続くＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を含む。非伝統的アミノ酸の導入は、当技術分野で公知のペプチド化学を使用して達成することもできる。本明細書で使用されるように、用語「極性アミノ酸」は、ゼロ総電荷を有するが、それらの側鎖の異なる部分にノンゼロ部分電荷を有するアミノ酸を含む（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。本明細書で使用されるように、用語「荷電アミノ酸」は、それらの側鎖にノンゼロ総電荷を有することができるアミノ酸を含む（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。

【0070】

ポリペプチドの断片またはバリアントおよび任意のその組合せも本開示に含まれる。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子を指す場合の用語「断片」または「バリアント」は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃバリアントへのＦｃＲｎ結合親和性、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの凝固活性）の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の場所で議論される特異的抗体断片に加えてタンパク分解性断片ならびに欠失断片が含まれるが、天然に存在する完全長ポリペプチド（または、成熟したポリペプチド）は含まれない。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントには、上記の断片、およびアミノ酸の置換、欠失または挿入のために変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然に存在するもの、または天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。

【0071】

「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されている。したがって、ポリペプチドの中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられる場合、その置換は保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸のひもは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似しているひもで保存的に置き換えることができる。

【0072】

当技術分野で公知であるように、用語「同一性パーセント」は、配列の比較で判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野で、「同一性」は、そのような配列のひもの間の一致によって判定される、場合によってポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、以下に記載されるものを非限定的に含む、公知の方法によって容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、パートＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）。同一性を判定する好ましい方法は、試験する配列の間で最高の一致を与えるように設計される。同一性を判定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁（１９９０））およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１５ ＵＳＡ）などの、配列分析ソフトウェアを使用して実行することができる。

【0073】

本出願の文脈の範囲内で、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、特に明記しない限り、分析の結果は参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書で使用されるように、「デフォルト値」は、最初に初期化されるときにソフトウェアと一緒に当初ロードする任意のセットの値またはパラメータを意味する。

【0074】

「融合」または「キメラ」タンパク質は、それが本来は天然に連結していない第２のアミノ酸配列に連結している第１のアミノ酸配列を含む。別個のタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドの中に一緒に持ってくることができるか、または、同じタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド、例えば、本開示のＦＩＸドメインのＩｇ Ｆｃドメインとの融合における新しい配置に置くことができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって作製される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列に関連付けられた第２のアミノ酸配列をさらに含むことができる。

【0075】

本明細書で使用されるように、用語「挿入部位」は、異種部分を挿入することができる位置のすぐ上流にある、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体の中の位置を指す。「挿入部位」は番号で規定され、この番号は、特に指定しない限り、挿入位置のすぐＮ末端側にある、挿入部位が対応するヒトＦＩＸ Ｒ３３８Ｌバリアント（配列番号１１～１２）の中のアミノ酸の番号である。

【0076】

本明細書で使用される「アミノ酸のすぐ下流」というフレーズは、アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」というフレーズは、アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。

【0077】

本明細書で使用されるように、用語「挿入された」、「挿入される」、「に挿入される」または文法的に関連した用語は、天然の成熟したヒトＦＩＸの類似した位置に対する、組換えＦＩＸポリペプチドの中の異種部分の位置を指す。本明細書で使用されるように、これらの用語は、天然の成熟ヒトＦＩＸに対する組換えＦＩＸポリペプチドの特徴を指し、組換えＦＩＸポリペプチドが作製されたいかなる方法またはプロセスを示しも、暗示も、意味もしない。

【0078】

本明細書で使用されるように、用語「半減期」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が動物の循環および／または他の組織から消去されるのに必要とされる時間で表すことができる。所与のポリペプチドの消去曲線が時間の関数として構築される場合、曲線は、通常迅速なα相およびより長いβ相による二相性である。α相は、一般的に脈管内と脈管外の空間の間の投与されたＦｃポリペプチドの平衡化を表し、一部、ポリペプチドのサイズによって判定される。β相は、脈管内空間におけるポリペプチドの異化作用を一般的に表す。一部の実施形態では、ＦＩＸおよびＦＩＸを含むキメラタンパク質は一相性であり、したがってアルファ相を有さず、単一のベータ相だけである。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で使用される用語半減期は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。

【0079】

本明細書で使用される用語「連結される」は、共有結合または非共有結合で第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ連結される第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列は第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に直接的に連結または並置させることができるか、あるいは、介在配列で第１の配列を第２の配列に共有結合させることができる。用語「連結される」は、Ｃ末端またはＮ末端での第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列への融合を意味するだけでなく、第１のアミノ酸配列（または、第２のアミノ酸配列）全体の第２のアミノ酸配列の（または、第１のアミノ酸配列それぞれの）任意の２つのアミノ酸の中への挿入も含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結することができる。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）または任意の化学部分（ポリペプチドおよびポリヌクレオチド鎖の場合）であってよい。用語「連結される」は、ハイフン（－）によっても示される。

【0080】

本明細書で使用されるように、用語「と会合した」は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖の間で形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、用語「と会合した」は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち（：）によって示すことができる。別の実施形態では、それは、ペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基の上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって会合し、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用した２３９および２４２に対応する位置（２２６または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）で２つのジスルフィド結合によって会合している。共有結合の例には、限定されずに、ペプチド結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、不可知な結合、ベント結合、双極子結合、パイバックボンド、二重結合、三重結合、四重結合、５重結合、６重結合、コンジュゲーション、超共役、芳香族性、多座性または反結合が含まれる。非共有結合の非限定的な例には、イオン結合（例えば、カチオン－パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合または対称性の水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力または化学的極性が含まれる。

【0081】

本明細書で使用される用語「単量体－二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いと会合する第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、ここで、第１の鎖は凝固因子、例えばＦＩＸ、および第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、凝固因子無しの第２のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、それからなる。したがって、単量体－二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子だけを有する単量体態様および２つのＦｃ領域を有する二量体態様を含むハイブリッドである。

【0082】

本明細書で使用されるように、止血は、出血もしくは大出血の停止もしくは鈍化；または、血管もしくは身体部分を通しての血流の停止もしくは鈍化を意味する。

【0083】

止血障害は、本明細書で使用されるように、フィブリン凝塊を形成する能力の障害または欠損による、自然発生的なまたは外傷の結果としての出血傾向によって特徴付けられる、遺伝的に継承したかまたは後天性の状態を意味する。そのような障害の例には、血友病が含まれる。３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損、軽度の出血傾向）である。他の止血障害には、例えば、フォン・ウィルブラント病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、ＧＰＩｂの欠陥または欠損であるベルナール－スリエ症候群が含まれる。ｖＷＦの受容体ＧＰＩｂが欠損し、一次凝塊形成（一次止血）の喪失および出血傾向の増加、ならびにＧｌａｎｚｍａｎおよびＮａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）につながることがある。肝不全（急性および慢性の形態）では、肝臓による凝固因子の生成が不十分であり、これは、出血リスクを増加させることがある。

【0084】

本開示の単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターは、予防的に使用することができる。本明細書で使用されるように、用語「予防的治療」は、出血エピソードの前の分子の投与を指す。一実施形態では、全身止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、受けようとしている。例えば、本開示のレンチウイルスベクターは、予防薬として手術の前後に投与することができる。本開示のレンチウイルスベクターは、急性出血エピソードを制御するために、手術中に、または後に投与することができる。手術には、これらに限定されないが、肝移植、肝臓切除、歯科処置または幹細胞移植が含まれ得る。

【0085】

本開示のレンチウイルスベクターは、要求に応じた治療のためにも使用される。用語「要求に応じた治療」は、出血エピソードの症状に応答した、または出血を引き起こす可能性のある活動の前の、本明細書で開示されたレンチウイルスベクターの投与を指す。一態様では、要求に応じた治療は、損傷の後など出血が開始するとき、または手術の前など出血が予想されるときに対象に与えることができる。別の態様では、要求に応じた治療は、接触競技などの出血のリスクを増加させる活動の前に与えることができる。

【0086】

本明細書で使用されるように、用語「急性出血」は、根底にある原因に関係なしに出血エピソードを指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、ＦＩＸ欠損）、血小板障害または凝固因子に対する抗体の発達による耐性を有してもよい。

【0087】

本明細書で使用されるように、治療する、治療、治療することは、例えば疾患または状態の重症度の低減；疾患経過期間の低減；疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の改善；疾患または状態を必ずしも治癒せず、疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の予防もなしに、疾患または状態を有する対象に有益な作用を提供することを指す。一実施形態では、用語「治療すること」または「治療」は、本開示のレンチウイルスベクターを投与することによって、対象において、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬのＦＩＸトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、治療することまたは治療は、ＦＩＸトラフレベルを約１から約２０ＩＵ／ｄＬ、約２から約２０ＩＵ／ｄＬ、約３から約２０ＩＵ／ｄＬ、約４から約２０ＩＵ／ｄＬ、約５から約２０ＩＵ／ｄＬ、約６から約２０ＩＵ／ｄＬ、約７から約２０ＩＵ／ｄＬ、約８から約２０ＩＵ／ｄＬ、約９から約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０から約２０ＩＵ／ｄＬの間で維持することを意味する。疾患または状態の処置または処置することは、対象におけるＦＩＸ活性を、非血友病対象におけるＦＩＸ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％と同等のレベルに維持することを含むこともできる。一実施形態では、用語「処置すること」または「処置」は、本開示のレンチウイルスベクターを投与することによって、対象において少なくとも約３０ＩＵ／ｄＬ、４０ＩＵ／ｄＬ、５０ＩＵ／ｄＬ、６０ＩＵ／ｄＬ、７０ＩＵ／ｄＬ、８０ＩＵ／ｄＬ、９０ＩＵ／ｄＬ、１００ＩＵ／ｄＬ、１１０ＩＵ／ｄＬ、１２０ＩＵ／ｄＬ、１３０ＩＵ／ｄＬ、１４０ＩＵ／ｄＬまたは１５０ＩＵ／ｄＬのＦＩＸトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、処置することまたは処置は、約１０～約２０ＩＵ／ｄＬ、約２０～約２３ＩＵ／ｄＬ、約３０～約４０ＩＵ／ｄＬ、約４０～約５０ＩＵ／ｄＬ、約５０～約６０ＩＵ／ｄＬ、約６０～約７０ＩＵ／ｄＬ、約７０～約８０ＩＵ／ｄＬ、約８０～約９０ＩＵ／ｄＬ、約９０～約１００ＩＵ／ｄＬ、約１１０～約１２０ＩＵ／ｄＬ、約１２０～約１３０ＩＵ／ｄＬ、約１３０～約１４０ＩＵ／ｄＬまたは約１４０～約１５０ＩＵ／ｄＬのＦＩＸトラフレベルを維持することを意味する。疾患または状態の処置または処置することは、対象におけるＦＩＸ活性を、非血友病対象におけるＦＩＸ活性の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％または１５０％と同等のレベルに維持することを含むこともできる。処置のために必要とされる最小限のトラフレベルは、１つまたはそれ以上の公知の方法によって測定することができ、各個人のために調整する（増加または低下させる）ことができる。

【0088】

本明細書で使用されるように、「投与すること」は、薬学的に許容されるＦＩＸをコードする核酸分子、ＦＩＸポリペプチド、または本開示のＦＩＸをコードする核酸分子を含むベクターを、薬学的に許容される経路を通して対象に与えることを意味する。投与経路は静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入であってよい。さらなる投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻および肺投与が含まれる。核酸分子、ポリペプチドおよびベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一環として投与することができる。

【0089】

本明細書で使用されるように、「それを必要とする対象」というフレーズは、例えば止血を向上させるために、本開示の核酸分子、ポリペプチドまたはベクターの投与から利益を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。一実施形態では、対象には、これらに限定されないが、血友病の個体が含まれる。別の実施形態では、対象には、これらに限定されないが、ＦＩＸ阻害物質を発生させ、したがってバイパス療法を必要とする個体が含まれる。対象は、成人または未成年（例えば、１２歳未満）である。一部の実施形態では、対象は、女性である。他の実施形態では、対象は、男性である。

【0090】

本明細書で使用されるように、用語「凝固因子」は、対象において出血エピソードを予防するかその期間を短くする、天然に存在するかまたは組換えで生成される分子またはその類似体を指す。言い換えると、それは、凝固促進活性を有する、すなわち、血液の凝集または凝固を引き起こす不溶性フィブリンのメッシュへのフィブリノーゲンの変換の役割を担う分子を意味する。「活性化可能な凝固因子」は、活性型に変換することが可能である不活性型（例えば、その酵素前駆体の形態）にある凝固因子である。

【0091】

本明細書で使用されるように、凝固活性は、フィブリン凝塊の形成を完了させる、および／または大出血もしくは出血エピソードの重症度、期間もしくは頻度を低減する生化学反応のカスケードに参加する能力を意味する。

【0092】

本明細書で使用されるように、用語「異種」または「外因性」は、所与の場面、例えば細胞またはポリペプチドにおいて通常は見出されない分子を指す。外因性または異種分子を細胞に導入することができ、例えばトランスフェクションまたは遺伝子操作の他の形態による細胞の操作の後にだけ存在するか、または異種アミノ酸配列が、それが天然に見出されないタンパク質に存在することができる。

【0093】

本明細書で使用されるように、用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与のポリヌクレオチド配列と一緒に天然に存在しないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＩＸの半減期を延長することが可能なポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＦＩＸの流体力学半径を増加させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、その生物活性にも機能（例えば、その凝血促進活性）にも有意に影響を与えることなく、ＦＩＸの１つまたはそれ以上の薬物動態学的特性を向上させるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＦＩＸは、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにリンカーによって連結または接続される。異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド部分の非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域またはその一部、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合小分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、ＦｃＲｎに結合する完全Ｆｃ領域またはその部分）、単鎖Ｆｃ領域（ＳｃＦｃ領域、例えば、ＵＳ２００８／０２６０７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３またはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載のもの）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、ペプチドおよびとりわけ５０％未満から５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６～４０アミノ酸の短いポリペプチド、またはその２つ以上の組合せが含まれる。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、非ポリペプチド部分に連結される。非ポリペプチド部分の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合小分子、ポリシアル酸（ＰＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体または任意のその組合せが含まれる。

【0094】

本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、天然のＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体結合によって形成されるものと規定される。天然のＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモダイマーを形成する。対照的に、本明細書で使用されるように、用語「遺伝子融合Ｆｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は、単一のポリペプチド鎖の中で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続した遺伝子配列にコードされる）Ｆｃドメインで構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。

【0095】

一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４としたときの、ＩｇＧの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域から始まり抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含む。

【0096】

Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプにより、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含むことができる。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の増加、血清中半減期の増加（Ｃａｐｏｎら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５頁を参照のこと）、ならびに新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体への結合性を含むいくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に与える（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）、これらは参照により本明細書に完全に組み入れる。

【0097】

本明細書で使用されるように、ヌクレオチド配列に関する用語「最適化される」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指し、ここで、ポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列の特性を強化するように突然変異している。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを増加させるために、翻訳レベルを増加させるために、定常状態のｍＲＮＡレベルを増加させるために、基本転写因子などの調節タンパク質の結合性を増減するために、スプライシングを増減するために、または、ポリヌクレオチド配列によって生成されるポリペプチドの収量を増加させるために実行される。それを最適化するためにポリヌクレオチド配列に加えることができる変更の例には、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含有量最適化、反復配列の除去、冨ＡＴエレメントの除去、潜在性スプライス部位の除去、転写または翻訳を抑圧するシス作用性エレメントの除去、ポリＴまたはポリＡ配列を加えるか除去すること、転写開始部位の周囲にコザックコンセンサス配列などの転写を強化する配列を加えること、ステムループ構造を形成するかもしれない配列の除去、不安定化配列の除去、および２つ以上のその組合せが含まれる。

【0098】

ＩＩ．ＦＩＸレンチウイルス遺伝子療法
出血障害、特に血友病のための可能な処置として、体細胞遺伝子療法が探求された。遺伝子療法は、ＦＩＸをコードするベクターの単回投与の後のＦＩＸの連続的内因性生成を通して血友病を治療するその能力のために、血友病のための特に魅力的な治療法である。血友病Ｂは、その臨床症状が機能的ＦＩＸの発現低下に起因しているため、遺伝子置き換えアプローチに非常に適している。

【0099】

レンチウイルスベクターは、組入れを通して導入遺伝子発現を持続するそれらの大きな包容力および能力のために、遺伝子送達ビヒクルとして注目を集めている。レンチウイルスベクターは多数のｅｘ－ｖｉｖｏ細胞療法臨床プログラムで評価され、有望な効能および安全性プロファイルをもたらしている。

【0100】

本開示は、それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターの有効用量を対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、対照レンチウイルスベクター、例えば、高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を有さない、すなわち、表面ＣＤ４７タンパク質発現が正常（天然に存在する）レベルであるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を含むレンチウイルス粒子の中にパッケージされる。一部の実施形態では、有効用量は、レンチウイルスベクターと同じＦＩＸ活性を誘導するのに必要な対照レンチウイルスベクターの対照用量と比較して低減される。

【0101】

本開示の他の態様は、それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、５×１０^１０形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）未満の、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを、対象に投与することを含み、レンチウイルスベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、方法を提供する。

【0102】

一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターと比較して、投与後のレンチウイルスベクターのマクロファージ形質導入の低下を示す。一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターと比較して、投与後のレンチウイルスベクターへのアロ特異的免疫応答の低下を示す。一部の実施形態では、対象は、投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも３０％のＦＩＸ活性を示す。一部の実施形態では、対象は、投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方におけるレンチウイルスベクターの組織特異的発現を示す。

【0103】

一部の実施形態では、アロ特異的応答は、投与されたレンチウイルスベクターに応答したサイトカインの放出を含む。一部の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のサイトカインの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のアロ特異的応答に関連するサイトカインの発現の低下を示す。一部の実施形態では、サイトカインは、炎症性サイトカインである。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＣＰ－１、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロンガンマ、およびその任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ａの発現レベルの低下を示す。ある特定の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＩＰ－１ｂの発現レベルの低下を示す。ある特定の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＭＣＰ－１の発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＭＣＰ－１の発現レベルの低下を示す。ある特定の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のＩＬ－２の発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のＩＬ－２の発現レベルの低下を示す。ある特定の実施形態では、対象は、対照レンチウイルスベクターの投与後のインターフェロンガンマの発現と比較して、レンチウイルスベクターの投与後のインターフェロンガンマの発現レベルの低下を示す。

【0104】

一部の実施形態では、サイトカインの発現は、対照レンチウイルスベクターの投与後のサイトカインの発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低下する。ある特定の実施形態では、サイトカインの発現は、レンチウイルスベクターの投与後に検出不能である。ある特定の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与後に、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＣＰ－１、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロンガンマ、およびその任意の組合せからなる群から選択されるサイトカインの検出不能な発現しか有さない。

【0105】

一部の実施形態では、対象は、投与前の血漿ＦＩＸ活性と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の血漿ＦＩＸ活性の増加を示す。一部の実施形態では、増加は、投与の少なくとも１日後、少なくとも約２日後、少なくとも約３日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、少なくとも約６週間後、少なくとも約７週間後、または少なくとも約８週間後に観察される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与の約１２時間後～約６０時間後、約１２時間後～約４８時間後、約１２時間後～約３６時間後、約１２時間後～約２４時間後、約２４時間後～約６０時間後、約２４時間後～約４８時間後、約２４時間後～約３６時間後、約３６時間後～約６０時間後、約３６時間後～約４８時間後、または約４８時間後～約６０時間後の血漿ＦＩＸ活性は、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与された対象と比較して増加する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの投与後のＦＩＸ活性は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも１週間後、２週間後、または３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、または少なくとも約３００％である。ある特定の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約１５０％のＦＩＸ活性を示す。ある特定の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約２００％のＦＩＸ活性を示す。ある特定の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与の少なくとも３週間後に、正常なＦＩＸ活性と比較して、少なくとも約２２５％のＦＩＸ活性を示す。

【0106】

一部の実施形態では、血漿ＦＩＸ活性は、投与後に、対照レンチウイルスベクターの対照用量を投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する。

【0107】

一部の実施形態では、投与後に、レンチウイルスベクターは、対象の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方に特異的に局在化し、ここで、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、対象の身体の別の器官よりも高濃度のレンチウイルスベクターが見られる。一部の実施形態では、対象の身体の他の器官は、精巣、リンパ節、筋肉、胸腺、腎臓、肺、心臓、前頭皮質、視床、尾状核、丘、小脳、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、レンチウイルスベクターの投与後に、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示す。レンチウイルスベクターの局在化は、当技術分野で公知の任意の方法および／またはユニットを使用して、測定するおよび／または発現させることができる。一部の実施形態では、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、または少なくとも約５００倍多いレンチウイルスベクターのベクターコピー数（ＶＣＮ）によって特徴付けられる。

【0108】

ある特定の実施形態では、対象は、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示し、局在化の増加は、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、少なくとも１０倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、対象は、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示し、増加した局在化は、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して少なくとも５０倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、対象は、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示し、ここで、増加した局在化は、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して少なくとも１００倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、対象は、肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方へのレンチウイルスベクターの局在化の増加を示し、増加した局在化は、レンチウイルスベクターの投与後の肝臓、脾臓、または肝臓と脾臓の両方において、対象の肝臓および脾臓以外の器官と比較して少なくとも１５０倍多いレンチウイルスベクターのＶＣＮによって特徴付けられる。

【0109】

Ａ．免疫応答阻害
一部の実施形態では、レンチウイルスベクター、例えばレンチウイルス粒子は、ヒト対象への投与の後にレンチウイルスベクターへの免疫応答を抑制する１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に含有する。本開示のある特定の態様は、レンチウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを対象に投与する方法に関し、ここで、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７をその表面に含有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、１つまたはそれ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己のマーカー」タンパク質であり、それはヒト細胞の上で遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７およびマクロファージによって発現されるＳＩＲＰαの相互作用を通して、内在性細胞のマクロファージ誘導食作用を抑制する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトマクロファージによって標的にされ、破壊される可能性は低い。

【0110】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、その表面に高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＣＤ４７をコードする異種ポリヌクレオチドが発現される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、ＣＤ４７をコードする異種ポリヌクレオチドが発現される。

【0111】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、それが、ＣＤ４７の高い発現レベルを有する細胞系において生成されるため、高レベルのＣＤ４７タンパク質を有する。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ細胞で生成され、ここで、細胞は、細胞膜の上にＣＤ４７の高い発現を有する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成され、ここで、ＨＥＫ２９３Ｔは、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＤ４７の発現に対して増加したＣＤ４７の発現を有するように改変される。一部の実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、内因性ＣＤ４７を過剰発現するように改変される。一部の実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、異種ＣＤ４７発現ベクターによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入することによって改変される。一部の実施形態では、異種ＣＤ４７発現ベクターは、レトロウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、γーレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、異種ＣＤ４７発現ベクターは、レンチウイルスベクターによって交差パッケージされることが不可能である。

【0112】

ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする対象において血友病を予防または処置する方法であって、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターの有効用量を対象に投与することを含み、レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりも高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を含み、有効用量は、レンチウイルスベクターと同じＦＩＸ活性を誘導するのに必要な対照レンチウイルスベクターの対照用量と比較して低下する、方法に関する。いかなる機序にも拘束される訳ではないが、レンチウイルスベクターの表面でのＣＤ４７発現は、対象の免疫系による分解および／もしくは除去からレンチウイルスベクターを保護するならびにレンチウイルスベクターに対する免疫応答を阻止するおよび／もしくは低下させると考えられる。

【0113】

一部の実施形態では、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１７６８．１）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも約７０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９６％、少なくとも９７％、少なくとも約９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＣＤ４７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0114】

一部の実施形態では、ＣＤ４７は、レンチウイルスベクターによって発現される。他の実施形態では、ＣＤ４７は、レンチウイルスベクターによって発現されない。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、宿主細胞において発現され、ここで、宿主細胞は、ＣＤ４７を発現するように改変される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７を過剰発現するように改変される。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））と比較して高濃度のＣＤ４７を発現する宿主細胞において生成される。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４７を過剰発現するよう改変されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成される。

【0115】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、対照レンチウイルスベクターよりも高レベルの表面ＣＤ４７タンパク質発現を含む。ある特定の実施形態では、対照レンチウイルスベクターは、１μｍ^２当たり１９個の分子を生成することが知られている（例えば、Ｓｏｓａｌｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：１６０８０頁（２０１６）の図Ｓ１（ｄ）を参照のこと）ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される。一部の実施形態では、対照レンチウイルスベクターは、対照レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり２０個未満の分子のＣＤ４７を含む。

【0116】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約２倍～少なくとも約１００倍、少なくとも約２倍～少なくとも約７５倍、少なくとも約２倍～少なくとも約５０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約４０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約３０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約２０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約１００倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約７５倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約５０倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約４０倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約３０倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約２０倍、少なくとも約２０倍～少なくとも約１００倍、少なくとも約２０倍～少なくとも約７５倍、少なくとも約２０倍～少なくとも約５０倍、少なくとも約２０倍～少なくとも約４０倍、または少なくとも約２０倍～少なくとも約３０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約１０倍～少なくとも約３０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍多い、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。

【0117】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約１０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約１５倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約２０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約２５倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターの表面におけるよりも、少なくとも約３０倍多いＣＤ４７タンパク質を含む。

【0118】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、１μｍ^２当たり少なくとも２０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約７０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約８０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約８５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約９０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約９５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約１００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約１２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約１５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約１７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約２００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、１μｍ^２当たり少なくとも約２２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約２５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約２７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約３７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約４７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約５７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約６７５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約７００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約７２５個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約７５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約８００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約８５０個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約９００個の分子、１μｍ^２当たり少なくとも約９５０個の分子、または１μｍ^２当たり少なくとも約１０００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。

【0119】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に、１μｍ^２当たり少なくとも約４００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約４５０個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約５００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約６００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約７００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約８００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約９００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの表面に１μｍ^２当たり少なくとも約１０００個の分子のＣＤ４７タンパク質を含む。

【0120】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、得られるレンチウイルスベクターの免疫原性を低減するようにさらに改変された宿主細胞において発現される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、表面に曝露された主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）をほとんど有しないか有しない。表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉは、感染を示すタンパク質断片などの、細胞内からの「非自己」タンパク質のペプチド断片を提示し、細胞に対する免疫応答を促進する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞で生成され、ここで、細胞は、細胞膜上に低減された表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉ^－（または、「ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ」、「ＭＨＣ－１^ｎｅｇ」または「ＭＨＣ陰性」）細胞において生成され、ここで、細胞は表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを有さない。

【0121】

ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して生成することができる。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ＭＨＣにおいて１つまたはそれ以上のタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を中断させることによって生成される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ；Ｅｎｓｅｍｂｌ ＥＮＳＧ０００００１６６７１０；ＮＣＢＩタンパク質受託番号第ＡＢＢ０１００３号）をコードする遺伝子の発現を中断させることによって生成される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子の発現を持続的に中断させることによって生成される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子の発現を遮断することによって生成される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子に突然変異を導入することによって生成され、ここで、突然変異はＢ２Ｍをコードする遺伝子の発現の損失をもたらす。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子をノックアウトすることによって生成される。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－またはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを遮断または低減するためにＨＥＣＫ ２９３Ｔ細胞を改変することによって生成される。未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを有する。例えば、Ｄｅｌｌｇｒｅｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（８）：ｅ０１３５３８５（２０１５）を参照のこと。

【0122】

一部の実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉ^－ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり、ここで、細胞は、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを有さない。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^－細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、１％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－１しか有さない。一部の実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを有するよう改変される。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、５％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－１しか有さない。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、４％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－１しか有さない。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、３％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－１しか有さない。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞は、未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、２％未満の表面に曝露されたＭＨＣ－１しか有さない。

【0123】

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含み、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを欠いている脂質コートを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系において生成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^－ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系において生成される。

【0124】

別の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの投与および／またはＦＩＸタンパク質導入遺伝子の以降の発現は、対象において免疫応答を誘導しない。一部の実施形態では、免疫応答は、ＦＩＸに対する抗体の発達を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、サイトカイン分泌を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞とＴ細胞の両方の活性化を含む。一部の実施形態では、免疫応答は阻害性免疫応答であり、ここで、対象における免疫応答は、免疫応答を起こさなかった対象におけるＦＩＸの活性と比較して、ＦＩＸタンパク質の活性を低減する。ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与によるＦＩＸタンパク質の発現は、ＦＩＸタンパク質または単離された核酸分子もしくはレンチウイルスベクターから発現されるＦＩＸタンパク質に対する阻害性免疫応答を阻止する。

【0125】

Ｂ．投与
本開示のレンチウイルスベクター、レンチウイルスベクター粒子、およびその使用方法は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））において生成される対照レンチウイルスベクターよりもレンチウイルスベクターの少ない用量を使用する血友病の予防および／または処置を可能にする。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターと同じＦＩＸ活性を誘導するのに必要な対照レンチウイルスベクターの対照用量と比較して低減される用量で有効である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、対照レンチウイルスベクターの対照用量の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％である。一部の実施形態では、用量は、対照レンチウイルスベクターの対照用量の少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％である。一部の実施形態では、用量は、対照レンチウイルスベクターの対照用量の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％である。一部の実施形態では、用量は、対照レンチウイルスベクターの対照用量の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。

【0126】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約５．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または約１．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0127】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約９．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇまたは約１．０×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0128】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約９．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^８ＴＵ／ｋｇまたは約１．０×１０^８ＴＵ／ｋｇである。

【0129】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約５．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約４．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約３．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約２．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、約１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、または約１．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0130】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約９．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約９．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約８．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約７．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約６．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約５．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約４．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約２．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、約１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満または約１．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0131】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約９．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約９．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約８．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約７．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約６．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約５．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約４．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約３．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約２．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、約１．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満または約１．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0132】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^９～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^９～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^９～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^９～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５×１０^９～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0133】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２×１０^９、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約２×１０^８、または約１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇである。

【0134】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または約１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～約１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0135】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、または約１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、４×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、６×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0136】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約２×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、６×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0137】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単一用量または複数用量で投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、一度に投与されるか、または複数の部分用量、例えば、２つの部分用量、３つの部分用量、４つの部分用量、５つの部分用量、６つの部分用量もしくは６を超える部分用量に分割される。一部の実施形態では、１を超えるレンチウイルスベクターが投与される。

【0138】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回または少なくとも１０回投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１週間に１回、約２週間に１回、約３週間に１回、または約４週間に１回投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、約１０日に１回、約１４日に１回、約２週間に１回、約１５日に１回、約３週間に１回、約２０日に１回、約４週間に１回、約１カ月に１回、約１カ月に２回、約５週間に１回、約６週間に１回、約７週間に１回、約８週間に１回、約２カ月に１回、約９週間に１回、約１０週間に１回、約１１週間に１回、約１２週間に１回、約３カ月に１回、約１３週間に１回、約１４週間に１回、約１５週間に１回、約１６週間に１回、約４カ月に１回、約１７週間に１回、約１８週間に１回、約１９週間に１回、約２０週間に１回、約５カ月に１回、約２１週間に１回、約２２週間に１回、約２３週間に１回、約２４週間に１回、約２５週間に１回、約２６週間に１回、約６カ月に１回投与される。

【0139】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの第１の用量が投与され、導入遺伝子の発現について対象がモニターされ、第２に用量は、対象が所定の閾値未満である導入遺伝子の発現を有する場合に、対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１００％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約３％未満、または約１％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約５０％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約２５％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約１０％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約５％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約４％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約３％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約２％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。一部の実施形態では、約１％未満の標的細胞が導入遺伝子を発現する場合に、レンチウイルスベクターの第２（第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０）の用量が対象に投与される。

【0140】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を通して投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非静脈内注射を通して（例えば、皮下または皮内に）投与される。

【0141】

一部の実施形態では、対象は小児対象であるが、他の態様では、対象は成人対象である。一部の実施形態では、対象は、男性である。他の実施形態では、対象は、女性である。

【0142】

本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、出血凝固障害、出血性関節症、筋肉ブリード、口ブリード、出血、筋肉への出血、口出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血、および腸腰筋鞘における出血からなる群から選択される出血性疾患または障害の処置への治療的に有益だろう遺伝子療法アプローチを使用して、哺乳動物、例えばヒト患者において、ｉｎ ｖｉｖｏで低いまたは低減した投薬量（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０^９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０^８ＴＵ／ｋｇ以下）で使用することができる。一実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病である。別の実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病Ａである。

【0143】

一部の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの低い用量（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０^９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０^８ＴＵ／ｋｇ以下）により、患者に投与される前にｉｎ ｖｉｔｒｏで処理される。ある特定の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇにより、患者に投与される前にｉｎ ｖｉｔｒｏで処理される。さらに別の実施形態では、患者からの細胞（例えば、肝細胞）は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの低い用量（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０^９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０^８ＴＵ／ｋｇ以下）により、患者に投与される前にｅｘ ｖｉｖｏで処理される。

【0144】

一部の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの投与（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇ以下、１０^９ＴＵ／ｋｇ以下、または１０^８ＴＵ／ｋｇ以下で投与される）後の血漿ＦＩＸ活性は、生理的に正常な循環ＦＩＸレベルと比較して少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％増加する。

【0145】

一実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後の血漿ＦＩＸ活性は、生理的に正常な循環ＦＩＸレベルと比較して少なくとも約３，０００％～約５，０００％増加する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの投与の２１日後、血漿ＦＩＸ活性は、配列番号８または配列番号９を含む参照核酸分子を含む対応するレンチウイルスベクターを投与した対象と比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍増加する。

【0146】

本開示は、それを必要とする対象において止血障害（例えば、血友病Ａなどの出血障害）を処置、予防または改善する方法であって、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、レンチウイルスベクターは、５×１０^１０以下のＴＵ／ｋｇ、１０^９以下のＴＵ／ｋｇ、または１０^８以下のＴＵ／ｋｇの少なくとも１用量で投与される、方法も提供する。

【0147】

本開示のレンチウイルスベクターによる処置、改善および予防は、バイパス療法であってよい。バイパス療法を受ける対象は、凝固因子、例えばＦＩＸへの阻害物質が既に生じているか、または凝固因子阻害物質を生じやすくてもよい。

【0148】

本開示のレンチウイルスベクターは、フィブリンクロットの形成を促進することによって、止血障害を処置または予防する。本開示の核酸分子によってコードされるＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、凝固カスケードのメンバーを活性化することができる。凝固因子は、外因性の経路、内因性の経路または両方における参加者であってよい。

【0149】

本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸで治療できることが知られている止血障害を処置するために使用することができる。本開示の方法を使用して処置できる止血障害には、限定されずに、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンウィルブラント病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、ならびにフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏症または構造的な異常、出血性関節症、筋肉ブリード、口ブリード、出血、筋肉への出血、口出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、腹膜後隙における出血および腸腰筋鞘における出血が含まれる。

【0150】

一部の実施形態では、止血障害は、遺伝性の障害である。一実施形態では、対象は、血友病Ａを有する。他の実施形態では、止血障害は、ＦＩＸの欠乏症の結果である。他の実施形態では、止血障害は、欠陥のあるＦＩＸ凝固因子の結果であってよい。

【0151】

別の実施形態では、止血障害は、後天性の障害であってよい。後天性の障害は、根底にある二次性の疾患または状態から生じることができる。無関係な状態は、一例として、しかし限定されずに、がん、自己免疫性疾患または妊娠であってよい。後天性の障害は、高齢から、または根底にある二次性の障害を処置するための医薬品（例えば、がん化学療法）から生じることができる。

【0152】

本開示は、止血障害または止血障害の獲得をもたらす二次性の疾患もしくは状態を有しない対象を処置する方法にも関する。したがって、本開示は、全身止血剤を必要とする対象を処置する方法であって、本開示のレンチウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む方法に関する。例えば、一実施形態では、全身止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または受けようとしている。本開示のレンチウイルスベクターは、予防薬として手術の前後に投与することができる。

【0153】

本開示のレンチウイルスベクターは、急性出血症状を制御するために、手術中に、または術後に投与することができる。手術には、肝移植、肝臓切除または幹細胞移植を限定されずに含めることができる。

【0154】

別の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血障害を有していない急性出血症状を有する対象を処置するために使用することができる。急性出血症状は、重度の外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、裂傷銃撃または無制御の出血をもたらす任意の他の外傷事象から生じることができる。

【0155】

レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象を予防的に処置するために使用することができる。レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象で急性出血症状を処置するために使用することもできる。

【0156】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血を促進する少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与される。止血を促進する前記他の薬剤は、実証された凝固活性を有する治療薬である。一例として、しかし限定されずに、止血剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンまたはフィブリノーゲン、または前のいずれかの活性型を含むことができる。凝固因子または止血剤は、抗線維素溶解薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸を含むこともできる。

【0157】

本開示の一実施形態では、組成物（例えば、レンチウイルスベクター）は、対象に投与されたときにＦＩＸが活性化可能な形態で存在するものである。そのような活性化可能な分子は、対象への投与の後に凝固部位においてｉｎ ｖｉｖｏで活性化させることができる。

【0158】

本開示のレンチウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内に、または任意の粘膜表面を通して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸、経膣により、または肺経路を通して投与することができる。レンチウイルスベクターは、所望の部位へのベクターの徐放を可能にするバイオポリマー固体支持体の中に植え込むか、またはそれに連結させることができる。

【0159】

一実施形態では、レンチウイルスベクターの投与経路は、非経口である。用語非経口は、本明細書で使用されるように、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。非経口投与の静脈内形態が好ましい。投与のすべてのこれらの形態は本開示の範囲内にあると明らかに予想されるが、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のためには、投与のための形態は注射用溶液になるだろう。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法では、レンチウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位に直接的に送達され、それによって、治療剤への患部組織の曝露を増加させることができる。

【0160】

Ｃ．レンチウイルスベクター
本開示のある特定の態様は、レンチウイルスベクターが第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、レンチウイルスベクター、レンチウイルスベクター粒子、および／またはその使用方法に関する。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトのＦＩＸである。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトのＦＩＸのバリアントである。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトのＦＩＸのＲ３３８Ｌバリアントである。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、Ｐａｄｕａバリアントである。

【0161】

一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ＦＩＸを含む単量体－二量体ハイブリッド分子である。本明細書で使用される用語「単量体－二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いに会合する第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、ここで、第１の鎖は、ＦＩＸおよび第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、ＦＩＸを含まない第２のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。よって、単量体－二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子のみを有する単量体の態様、および２つのＦｃ領域を有する二量体の態様を含むハイブリッドである。

【0162】

Ｃ．１．ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0163】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して同一である。

【0164】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0165】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0166】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0167】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0168】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0169】

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１３９～１３８６に対して同一である。

【0170】

ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0171】

ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、プロペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0172】

Ｃ．１．ａ．異種部分
一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド分子は、少なくとも１つの異種部分をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、異種部分は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合され、ここで、ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。一部の実施形態では、異種部分は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチド内の１つまたはそれ以上の部位に挿入され、ここで、ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。一部の実施形態では、異種部分は、異種ポリペプチドである。ある特定の態様では、異種部分は、ＸＴＥＮである。一部の態様では、異種部分は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中の１つまたはそれ以上の部位に挿入された少なくとも１つのＸＴＥＮを含む。他の態様では、異種部分は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中に挿入された、半減期延長部分（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長部分）である。一部の実施形態では、異種部分は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０２４０６０号（参照によってその全体として本明細書に組み入れる）に開示された挿入部位で、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中に挿入される。ある特定の実施形態では、異種部分は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、またはその任意の組合せに対応するアミノ酸のすぐ下流で、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの中に挿入される。

【0173】

一部の実施形態では、異種部分は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、Ｆｃ、およびアルブミン、またはその断片）である。一部の実施形態では、異種部分は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合した、ＦｃＲｎ結合パートナーである。

【0174】

異種部分（例えば、半減期延長部分）の非限定例には、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ＦｃＲｎ結合パートナー、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、ペプチドおよびとりわけ５０％未満から５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６～４０アミノ酸の短いポリペプチドが含まれる。

【0175】

ある特定の態様では、異種部分は、本開示のレンチウイルスベクターから産生されるＦＩＸ活性を有するポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を増加させる。他の態様では、異種部分は、本開示のレンチウイルスベクターから産生されるＦＩＸ活性を有するポリペプチドの可視化または局在化を促進する。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの可視化および／または局在化は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはその組合せである。他の態様では、異種部分は、本開示のレンチウイルスベクターから産生されるＦＩＸ活性を有するポリペプチドの安定性を増加させる。本明細書で使用されるように、用語「安定性」は、環境条件（例えば、温度上昇または低下）に応じて、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの１つまたはそれ以上の物理特性の維持についての当技術分野で認識される尺度を指す。ある特定の態様では、物理特性は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの共有結合による構造の維持（例えば、タンパク質分解、望ましくない酸化または脱アミド化のないこと）である。他の態様では、物理特性は、正確にフォールディングされた状態のＦＩＸ活性を有するポリペプチドの存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集または沈殿のないこと）でもある。

【0176】

ある特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質の半減期を増加させる異種部分は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、ＣＴＰペプチド配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、または組合せのような異種ポリペプチドを限定されずに含む。他の関連する態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの部分の任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのような非ポリペプチド部分に対する結合部位を含む。

【0177】

ある特定の態様では、本開示のＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、それぞれ同じかまたは異なる分子である、１、２、３またはそれより多い異種部分を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＸＴＥＮをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＸＴＥＮをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列および１つまたはそれ以上のＦｃドメインを含む。特定の一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されたＸＴＥＮをコードするヌクレオチド配列およびＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合したＦｃをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0178】

Ｃ．１．ａ．ｉ．ＸＴＥＮ
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ＸＴＥＮである。本明細書で使用されるように、「ＸＴＥＮ配列」は、低分子親水性アミノ酸で主に構成され、生理的条件下では二次構造または三次構造をとる程度が低いかまたはそれをとらない、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する伸長したポリペプチドを指す。融合タンパク質パートナーとして、ＸＴＥＮは、融合タンパク質を作成するために、本開示のＦＩＸ配列に連結される場合、ある特定の所望の薬物動態特性、物理化学特性および薬剤学的特性を付与する担体として作用する。このような所望の特性には、これらに限定されないが、薬物動態パラメータおよび溶解特性の強化が含まれる。本明細書で使用されるように、「ＸＴＥＮ」は、軽鎖または重鎖の単鎖抗体またはＦｃ断片のような抗体または抗体断片を特異的に除外する。

【0179】

ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＸＴＥＮまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、ＸＴＥＮをコードするヌクレオチド配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入され、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。ある特定の態様では、異種部分のうちの２つは、ＸＴＥＮ配列である。一部の態様では、異種部分のうちの３つは、ＸＴＥＮ配列である。一部の態様では、異種部分のうちの４つは、ＸＴＥＮ配列である。一部の態様では、異種部分のうちの５つは、ＸＴＥＮ配列である。一部の態様では、異種部分のうちの６つまたはそれ以上は、ＸＴＥＮ配列である。

【0180】

一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０超から約３０００個のアミノ酸残基、３０超から約２５００個の残基、４０超から約２０００個の残基、５０超から約１５００個の残基、６０超から約１０００個の残基、７０超から約９００個の残基、８０超から約８００個の残基、９０超から約７００個の残基、１００超から約６００個の残基、１１０超から約５００個の残基、または１２０超から約４００個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが、４２個のアミノ酸より長く、１４４個のアミノ酸より短い、アミノ酸配列を含む。

【0181】

ＸＴＥＮ配列は、５から１４個（例えば、９から１４個）のアミノ酸残基のうちの１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、そのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４から６種のアミノ酸（例えば、５種類のアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照のこと。

【0182】

本開示に従って使用することができるＸＴＥＮ配列の例は、そのそれぞれを参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、同第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、同第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号、同第ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２号、同第ＷＯ２０１５／０２３８９１号、または同第ＷＯ２０１７／０２４０６０号に開示されている。

【0183】

Ｃ．１．ａ．ｉｉ．Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、Ｆｃ領域（例えば、ＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片である。ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、Ｆｃ領域（例えば、ＦｃＲｎ結合パートナー）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用されるように、特に明記しない限り、Ｆｃドメイン、そのバリアント、または断片を含む機能的な新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合パートナーである。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎレセプターが特異的に結合し、その結果、これらに限定されないが、アルブミンを含むＦｃＲｎ結合パートナーをＦｃＲｎレセプターによって能動輸送できる任意の分子である。よって、用語Ｆｃは、機能的であるＩｇＧ Ｆｃの任意のバリアントを含む。ＦｃＲｎレセプターに結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（参照によってその全体として本明細書に組み入れるＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９頁（１９９４））。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ－ＦｃＲｎ接触はすべて、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとして、これらに限定されないが、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられる。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を含むかまたは含まない免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。融合タンパク質においてＦｃ領域の所望の特性、例えば、半減期、例えばｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加を維持する、Ｆｃ断片、バリアント、または誘導体も含まれる。無数の突然変異体、断片、バリアント、および誘導体が、例えば、そのすべてを参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／０６９１６４Ａ２号、同第ＷＯ２０１２／００６６２３Ａ２号、同第ＷＯ２０１２／００６６３５Ａ２号、または同第ＷＯ２０１２／００６６３３Ａ２号に記載されている。

【0184】

１つまたはそれ以上のＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合されるか、またはその両方である。一部の実施形態では、Ｆｃドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に融合している。一部の実施形態では、Ｆｃドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に融合している。一部の実施形態では、Ｆｃドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるかまたはＸＴＥＮをコードするヌクレオチド配列のＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合している、ＸＴＥＮのような別の異種部分をコードするヌクレオチド配列に融合している。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、第２のＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。発現した第２のＦｃドメインは、例えば、１つまたはそれ以上の共有結合を介して、第１のＦｃドメインと会合することができる。

【0185】

Ｃ．１．ａ．ｉｉｉ．アルブミン
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、またはアルブミン結合小分子、またはそのバリアント、誘導体、もしくは断片である。ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、アルブミンポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。完全長形態では６０９個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分を担っており、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用されるように、用語「アルブミン」は、完全長アルブミンまたはその機能性断片、バリアント、誘導体、もしくはアナログを含む。アルブミンまたはその断片もしくはバリアントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１ Ａ１号、同第２００８／０００４２０６ Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３ Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７ Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３７５１ Ａ１号、またはＰＣＴ特許出願公開第２００８／０３３４１３ Ａ２号、同第２００９／０５８３２２ Ａ１号、もしくは同第２００７／０２１４９４ Ａ２号に開示されている。

【0186】

アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、細菌のアルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンに結合することができるアルブミン結合抗体断片を限定することなく損なう可能性がある。Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７８：１９０～１９４頁（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １１：２０６～２１３頁（２００２）に開示されているように、連鎖球菌タンパク質Ｇからのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例として、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００２年、２７７：３５０３５～３５０４３頁（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体断片の例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ９：３１９～３２６頁（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５６：３０３～３１７頁（２００７）、およびＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｃｉ．、２１：２８３～２８８頁（２００８）に開示されている。

【0187】

ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、アルブミンに結合することができる非ポリペプチド小分子、そのバリアント、または誘導体（例えば、アルブミン結合小分子）に対する結合部位をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。このようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６～２２９２頁（２００９）に開示されている２－（３－マレイミドプロパンアミド）－６－（４－（４－ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。

【0188】

一部の実施形態では、発現したポリペプチドにおけるアルブミン結合ポリペプチド配列は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接している。一部の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１６）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号１７）である。

【0189】

Ｃ．１．ａ．ｉｖ．ＣＴＰ
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、ＣＴＰまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。１つまたはそれ以上のＣＴＰペプチドの組換えタンパク質への挿入は、そのタンパク質の半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。例示的なＣＴＰペプチドとして、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号１８）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１９）が挙げられる。例えば、参照によって組み入れる、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１Ａ１号を参照のこと。一部の実施形態では、発現したポリペプチドにおけるＣＴＰ配列は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接している。一部の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１６）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号１７）である。

【0190】

Ｃ．１．ａ．ｖ．ＰＡＳ
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ＰＡＳペプチドである。ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、ＰＡＳペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。「ＰＡＳペプチド」または「ＰＡＳ配列」は、本明細書で使用されるように、アラニン残基およびセリン残基を主に含むかまたはアラニン残基、セリン残基、およびプロリン残基を主に含むアミノ酸配列であって、生理的条件下でランダムコイル立体配座を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、融合タンパク質において異種部分の一部として使用することができるアラニン、セリン、およびプロリンを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。ただし、ＰＡＳ配列における微量成分として、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が付加される場合、アミノ酸ポリマーがランダムコイル立体配座を形成できる。「微量成分」は、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ＰＡＳ配列に、ある特定の程度まで、例えば、アミノ酸のうちの最大約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、最大約１０％、最大約９％、最大約８％、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち、約２％、または約１％を付加できることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。生理的条件下では、ＰＡＳペプチドは、ランダムコイル立体配座を形成し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性の増加を媒介することができる。

【0191】

ＰＡＳペプチドの非限定例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号２０）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号２１）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号２２）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号２３）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号２４）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号２５）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号２６）またはその任意のバリアント、誘導体、断片、もしくは組合せを含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１号から公知である。欧州で発効された特許ＥＰ２１７３８９０。

【0192】

一部の実施形態では、発現したポリペプチドにおけるＰＡＳ配列は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接している。一部の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１６）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号１７）である。

【0193】

Ｃ．１．ａ．ｖｉ．ＨＡＰ
一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。ある特定の態様では、本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の中に挿入されるか、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドのＣ末端をコードするヌクレオチド配列の部分に融合するか、またはその両方である、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、得られる融合ポリペプチドは、凝固促進活性を有する。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、１２０個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、１６０個のアミノ酸、１８０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、４００個のアミノ酸、４５０個のアミノ酸、または５００個のアミノ酸長を有するグリシン反復配列を含む。ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定例として、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ）_ｎ、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎまたはＳ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）が挙げられる。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０：２７３～２８４頁（２００７）を参照のこと。

【0194】

Ｃ．２．調節エレメント
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、遺伝子発現制御エレメントを含む。遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター、例えば構成的または誘導可能なプロモーターであってよい。哺乳動物の構成的プロモーターとして、これらに限定されないが、以下の遺伝子に関するプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスからのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。

【0195】

他の構成的プロモーターも使用され得る。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとして、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で誘導されて、転写および翻訳を促進する。他の誘導性が使用され得る。

【0196】

一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例として、これらに限定されないが、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：４６９７頁に記載される。Ｆ８プロモーターは、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１８２８～１１８３８に記載される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの組織特異的プロモーター、すなわち、特定の組織または細胞型におけるＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を調節するだろうプロモーターを含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの中の組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、ＥＴプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ第ＡＹ６６１２６５号；Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３頁（２００５）も参照のこと）、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。

【0197】

１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して、発現レベルをさらに高めて、治療効能を達成することができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独でまたは１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上の複製を含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２０７６５～２０７７３頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３９５～４０４頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３４：５７７～５８４頁；Ｉｌｌら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３～Ｓ３０頁）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。

【0198】

他の好適なベクターおよび遺伝子調節エレメントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れるＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、もしくは同第７，１７９，９０３号に記載される。

【0199】

一般に、発現制御配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、所望によりエンハンサー配列または上流の活性化因子配列を場合により含む。

【0200】

レンチウイルスベクターはすべての肝臓細胞型を形質導入させることができるので、異なる細胞型における導入遺伝子（例えば、ＦＩＸ）の発現は、レンチウイルスベクターの中の異なるプロモーターを使用して制御することができる。したがって、レンチウイルスベクターは、異なる組織または細胞型、例えば、異なる肝組織または細胞型におけるＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御するだろう特異的プロモーターを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓内皮組織におけるＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御するだろう内皮特異的プロモーター、または、肝細胞におけるＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御する肝細胞特異的プロモーター、または両方を含むことができる。

【0201】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓以外の組織におけるＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御する１つの組織特異的プロモーターまたは複数の組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、標的細胞または標的組織のゲノム、例えば、肝細胞のゲノムまたは肝臓の内皮細胞のゲノムに安定して組み入れられる。

【0202】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのスプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのスプライスアクセプター部位を含む。

【0203】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｒｅｖ配列、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、またはその任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、全長ｇａｇ配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トランケーションされたｇａｇ配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、全長ｐｏｌ配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トランケーションされたｐｏｌ配列を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、全長ｒｅｖ配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トランケーションされたｒｅｖ配列を含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、全長ＲＲＥ配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トランケーションされたＲＲＥ配列を含む。

【0204】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、エンハンサー、プロモーター、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する標的配列、転写後調節エレメント、パッケージングシグナル、ポリＡ配列、イントロン配列、またはその任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞においてヌクレオチド配列の発現を促進するエンハンサーを含む。

【0205】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの中に、例えばＦＩＸ導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含ませることが有益である。したがって、本開示は、ＦＩＸヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、さもなければレンチウイルスベクターの中に挿入される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つより多いコピーは、システムの効果を増加させることができる。

【0206】

異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含まれる。例えば、１つより多い導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つより多いｍｉＲＮＡ標的配列の制御下の導入遺伝子を有することができる。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦に並ぶことができるが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットは、アンチセンス配向でレンチウイルスベクターの中に挿入することもできる。アンチセンス配向は、さもなければ生成細胞に毒性である可能性のある遺伝子生成物の発現を回避するための、ウイルス粒子の生成において役立つことができる。

【0207】

他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じかまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。しかし、ある特定の他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含ませるかどうか（および、その数）の選択は、意図される組織標的、要求される発現レベルなどのようなパラメータによって導かれる。

【0208】

一実施形態では、標的配列は、骨髄関連の前駆体において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的は、リンパまたは赤血球系統における頑強な導入遺伝子発現に依存する遺伝子療法適用にも好適である可能性がある。ｍｉＲ－２２３標的は、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。

【0209】

別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔ ａｇｇａａａｃａｃｔ ａｃａ（配列番号２７））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、または少なくとも６コピーのｍｉＲ－１４２標的配列を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、４コピーのｍｉＲ－１４２標的配列を含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補配列、例えばｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）または「１４２－３ｐＴ」は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み入れられ、導入遺伝子コード転写物をｍｉＲＮＡ媒介下方制御に対して感受性にする。この方法により、造血系統抗原提示細胞（ＡＰＣ）において導入遺伝子発現を阻止することができ、一方、非造血細胞では維持される（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６年）。この戦略は、ストリンジェントな転写後調節を導入遺伝子発現に課すことができ、したがって、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性の除去を阻止し、および／または抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を誘導し、および導入遺伝子によってコードされる抗原への頑強な免疫寛容を媒介する。

【0210】

一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５～１６５頁は、ｍｉＲ－１８１、すなわち、マウス骨髄の中のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡを開示する（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それは、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられていることも開示する。

【0211】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに完全または部分的に相補的である。用語「完全に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して一部だけ相補的であり、それによって、部分的に相補的な配列はｍｉＲＮＡによってなお認識されることを意味する。言い換えると、本開示との関連で、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識すること、およびそのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低減を達成することにおいて有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載され、これらは参照により完全に本明細書に組み入れる。

【0212】

他の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中のＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌ（配列番号１）を含むレンチウイルスベクターを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

【0213】

Ｃ．３．レンチウイルスベクター
レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジヤギレンチウイルス群、および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの開発は、Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら（１９９９）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：４８１～４９６頁にレビューされている。遺伝子療法のために好適なレンチウイルスベクターの設計および使用は、例えば、米国特許第６，２０７，４５５号および同第６，６１５，７８２号に記載されている。レンチウイルスの例には、限定されずに、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２偽型、ＨＩＶ－１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスが含まれる。

【0214】

本開示のレンチウイルスベクターの概略図は、図１に提示される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、「第三世代」レンチウイルスベクターである。本明細書で使用されるように、用語「第三世代」レンチウイルスベクターは、第二世代ベクターシステムの特徴を有し、機能的ｔａｔ遺伝子をさらに欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えばｔａｔ遺伝子が欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。一般的に、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物の上で提供される。例えば、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～８４７１頁を参照のこと。本明細書で使用されるように、「第二世代」レンチウイルスベクターシステムは、機能的アクセサリー遺伝子を欠いているレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆが欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１～８７５頁を参照のこと。本明細書で使用されるように、「パッケージングシステム」は、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス構築物のセットを指す。一般的に、パッケージングシステムの構築物は、パッケージング細胞に最終的に組み込まれる。

【0215】

一部の実施形態では、本開示の第三世代レンチウイルスベクターは、自己不活性化レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ．Ｇ偽型レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための哺乳動物特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、哺乳動物特異的プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための肝細胞特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、肝細胞特異的プロモーターは、強化されたトランスチレチンプロモーターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子生成物への免疫応答を低減するために、ｍｉＲ－１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中へｍｉＲ－１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことは、所望の導入遺伝子発現プロファイルを可能にする。例えば、ｍｉＲ－１４２のための１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことは、血管内および血管外の造血系における導入遺伝子発現を抑制することができるが、導入遺伝子発現は非造血細胞において維持される。本開示のレンチウイルスベクターシステムで処置した腫瘍傾向のあるマウスでは、いかなる発がんも検出されていない。Ｂｒｏｗｎら（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：４１４４～５２頁、Ｂｒｏｗｎら（２００６）Ｎａｔ．Ｎｅｄ．１２：５８５～９１頁、およびＣａｎｔｏｒｅら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７（２７７）：２７７ｒａ２８を参照のこと。

【0216】

本開示のレンチウイルスベクターは、本明細書に記載されるＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、発現制御配列に作動可能に連結される。本明細書で使用されるように、２つの核酸配列は、それらが、各構成成分核酸配列がその機能を保持することを可能にするような方法で共有結合するとき、作動可能に連結される。コード配列および遺伝子発現制御配列は、それらが、コード配列の発現もしくは転写および／または翻訳を遺伝子発現制御配列の影響下または制御下に置くような方法で共有結合するとき、作動可能に連結すると言われる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合、作動可能に連結すると言われる。したがって、遺伝子発現配列は、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、遺伝子発現配列がそのコード核酸配列の転写を実行することが可能ならば、コード核酸配列に作動可能に連結されているだろう。

【0217】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入することが可能な組換えレンチウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞（例えば、肝細胞）に形質導入することが可能な組換えレンチウイルスのベクターである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスで見出される３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを一般的に有し、これらには２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が隣接する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造的な（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役目をする。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要なすべての他のシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶにおける）を含む追加の遺伝子を有する。

【0218】

ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合性部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なキャプシド形成（Ｐｓｉ部位）のために必要な配列は、５’ＬＴＲに隣接している。キャプシド形成（または、感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）のために必要な配列がウイルスゲノムから欠落している場合、シス欠陥はゲノムＲＮＡのキャプシド形成を阻止する。

【0219】

しかし、結果として生じる突然変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成を誘導することが可能なままである。本開示は、非分裂細胞に形質導入することが可能な組換えレンチウイルスベクターを生成する方法であって、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つまたはそれ以上のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。本明細書で下に開示されるように、ある特定の適用のために機能的ｔａｔ遺伝子を欠くベクターが望ましい。したがって、例えば、第１のベクターは、ウイルスのｇａｇおよびウイルスのｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、別のベクターは、ウイルスのｅｎｖをコードする核酸を提供してパッケージング細胞を生成することができる。本明細書でトランスファーベクターと特定される異種遺伝子をそのパッケージング細胞に提供するベクターを導入することは、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出する生成細胞を与える。

【0220】

ベクターおよび外来遺伝子の上記の構成により、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含むほとんどすべての好適なウイルスから導くことができる。一部の実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする広宿主性エンベロープタンパク質である。

【0221】

レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。他のｅｎｖ遺伝子、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）プロテインＧ（ＶＳＶ Ｇ）、肝炎ウイルスおよびインフルエンザのそれも使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスのｅｎｖ核酸配列は、本明細書の他の場所に記載される調節配列と作動可能に会合する。

【0222】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するベクターの能力を損なうことなしに、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失している。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。Ｕ３領域の欠失は、完全な欠失または部分的欠失であってもよい。

【0223】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＦＩＸ活性ヌクレオチド配列を有するポリペプチドを含む本開示のレンチウイルスベクターは、細胞の中で、（ａ）ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）異種ｅｎｖ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列にトランスフェクトすることができ；ここで、レンチウイルスベクターは、機能的ｔａｔ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、細胞は、ｒｅｖ遺伝子を含む第４のヌクレオチド配列でさらにトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘおよびｎｅｆ、またはその組合せから選択される機能的遺伝子を欠いている。

【0224】

ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ応答エレメント、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、またはその任意の組合せをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。

【0225】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはコードされるＦＩＸ活性を有するポリペプチドの標的化および／または活性を向上させる１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に含有する。１つまたはそれ以上のポリペプチドは、宿主細胞からのレンチウイルスベクターの出芽の間に組み入れることができる。レンチウイルスの生成の間、ウイルス粒子は生成宿主細胞から出芽する。出芽の過程で、ウイルス粒子は脂質コートを身につけ、それは宿主細胞の脂質膜に由来する。その結果、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面に前から存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。

【0226】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト対象への投与の後にレンチウイルスベクターへの免疫応答を抑制する１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、１つまたはそれ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己のマーカー」タンパク質であり、それはヒト細胞の上で遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７およびマクロファージによって発現されるＳＩＲＰαの相互作用を通して、内在性細胞のマクロファージ誘導食作用を抑制する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトマクロファージの標的にされ、破壊される可能性は低い。

【0227】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、その表面に高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７の高い発現レベルを有する細胞系において生成される。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ細胞で生成され、ここで、細胞は、細胞膜の上にＣＤ４７の高い発現を有する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７ｈｉｇｈ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成され、ここで、ＨＥＫ２９３Ｔは、細胞膜の上にＣＤ４７の高い発現を有する。一部の実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、未改変のＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較してＣＤ４７の増加した発現を有するように改変される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である。

【0228】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含むヒトＣＤ４７を含む。

【0229】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の表面発現をほとんど有しないか有しない。表面に発現されるＭＨＣ－Ｉは、感染を示すタンパク質断片などの、細胞内からの「非自己」タンパク質のペプチド断片を提示し、細胞に対する免疫応答を促進する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉｌｏｗ細胞で生成され、ここで、細胞は、細胞膜の上にＭＨＣ－Ｉの低減された発現を有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉ－（または、「ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ」、「ＭＨＣ－１^ｎｅｇ」または「ＭＨＣ陰性」）細胞において生成され、ここで、細胞は、ＭＨＣ－Ｉの発現を欠いている。

【0230】

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含み、ＭＨＣ－Ｉポリペプチドを欠いている脂質コートを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系において生成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系において生成される。レンチウイルスベクターの例は、米国特許第９，０５０，２６９号ならびに国際公開第ＷＯ９９３１２５１号、同第９７１２６２２号、同第９８１７８１５号、同第９８１７８１６号、および同第９８１８９３４号に開示され、それらは参照によってその全体として本明細書に組み入れる。

【0231】

ＩＩＩ．医薬組成物
本開示のレンチウイルスベクター、核酸分子、核酸分子によってコードされるポリペプチド、または宿主細胞を含有する組成物は、好適な薬学的に許容される担体を含有することができる。例えば、それらは、作用部位への送達のために設計された調製物への活性化合物のプロセシングを促進する、賦形剤および／または補助剤を含有することができる。

【0232】

一実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に開示される核酸分子、レンチウイルスベクター、ポリペプチド、または宿主細胞；および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

【0233】

医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回用量容器内に保存剤を加えた状態で供給することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤のような形態をとり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤のような製剤化剤を含有する場合がある。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、パイロジェンフリー水で構成される粉末形態である場合がある。

【0234】

一実施形態では、レンチウイルスベクターの投与経路は、非経口である。用語非経口は、本明細書で使用されるように、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。非経口投与の静脈内形態が好ましい。投与のすべてのこれらの形態は本開示の範囲内にあると明らかに予想されるが、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のためには、投与のための形態は注射用溶液になるだろう。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法では、レンチウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位に直接的に送達され、それによって、治療剤への患部組織の曝露を増加させることができる。

【0235】

非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。本開示では、薬学的に許容される担体には、これらに限定されないが、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％食塩水が含まれる。他の一般的非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、補液および栄養素補液、電解質補液、例えば、リンガーブドウ糖をベースにするものなどが含まれる。保存剤および他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。

【0236】

より詳細には、注射用に適する医薬組成物には、無菌の水性溶液（水溶性）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時使用調製物のための無菌の粉末が含まれる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過が存続する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保存条件下で安定であるべきであり、好ましくは細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。例えばレシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。

【0237】

微生物活動の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含ませることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。

【0238】

いずれの場合にも、無菌の注射溶液は、必要に応じて本明細書に列挙された成分の１つまたはその組合せと一緒に、適当な溶媒に必要な量で活性化合物（例えば、ポリペプチド自体または他の活性剤との組合せ）を組み込み、続いて濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルの中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分と前もって濾過滅菌したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥およびフリーズドライである。注射のための調製物は、加工されて、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充てんされ、当技術分野で公知の方法により、無菌条件下で密封される。さらに、調製物は、キットの形でパッケージして、販売することができる。このような製造品は、関連する組成物が、凝固障害を患っているか、またはその素因を有する対象を処置するために有益であることを示すラベルまたは添付文書を好ましくは有する。

【0239】

注射用デポー製剤は、ポリラクチド－ポリグリコリドのような生分解性ポリマー内の薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製することができる。薬物とポリマーとの比率、および用いられるポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリアンハイドライドである。注射用デポー製剤は、薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによっても調製することができる。

【0240】

医薬組成物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または停留浣腸として直腸投与のために製剤化することもできる。

【0241】

補足的な活性化合物を組成物中に組み込むことができる。一実施形態では、本開示の核酸分子は、凝固因子、またはそのバリアント、断片、アナログもしくは誘導体とともに製剤化される。例えば、凝固因子として、これらに限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子またはこれらのいずれかの組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）もしくは活性化形態が挙げられる。止血剤の凝固因子として、抗線溶薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。

【0242】

投与レジメンを調整して、最適な所望の応答をもたらすことができる。例えば、単回ボーラス投与を行うことも、経時的に、数回の分割投与を行うことも、または治療状況の緊急性によって示されるのに応じて、用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与のし易さおよび投薬量の均一化のために、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化するのが有益である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ． １９８０年）を参照のこと。

【0243】

上記の範囲内の中間の用量も、本開示の範囲内にあるものである。このような用量を毎日、隔日、毎週または実験的分析によって判定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な処置は、長期、例えば、少なくとも６カ月にわたる複数の投薬による投与を必要とする。

【0244】

本開示のレンチウイルスベクターは、異なる発達段階で対象に投与される。例えば、ヒトでは、異なる発達段階は、新生児（例えば、１カ月齢未満）、乳児（１カ月齢～２歳）、小児（２歳～１２歳）、青年（１２歳～１６歳）、または成人（１６歳より高い年齢）に分類される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ヒトの新生児に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、約１カ月齢未満のヒト対象に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ヒトの乳児に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、約１カ月齢～約２歳のヒト対象に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ヒトの小児に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、約２歳～約１２歳のヒト対象に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ヒトの青年に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、約１２歳～約１６歳のヒト対象に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ヒトの成人に投与される。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、約１６歳より高い年齢のヒト対象に投与される。当業者は、他の生物の発達段階を決定することができる。例えば、当業者は、２週齢のマウスが青年期であることを理解する。

【0245】

本開示のレンチウイルスベクターの投薬量および頻度は、当業者に公知の様々な要因に応じて変わる。

【0246】

本開示のレンチウイルスベクターは、場合により、処置（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態の処置で有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

【0247】

本明細書で使用されるように、補助療法と一緒のまたは組み合わせた本開示のレンチウイルスベクターの投与は、療法および開示されるポリペプチドの逐次的、同時、共存する、並行した、併存するまたは同時発生的投与または適用を意味する。当業者は、組み合わせた治療レジメンの様々な構成成分の投与または適用の時間は、処置の全体的効果を強化するために調整することができることを理解するであろう。当業者（例えば、医師）は、選択される補助療法および本明細書の教示に基づいて、不相応な実験なしで有効な併用療法レジメンを見極めることが容易にできるだろう。

【0248】

本開示のレンチウイルスベクターは、薬剤または複数の薬剤と（例えば、併用療法レジメンを提供するために）一緒にまたは組み合わせて使用することができることがさらに理解される。本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせることができる例示的な薬剤には、処置する特定の障害のための現在の医療標準に相当する薬剤が含まれる。このような薬剤は、性質が化学的または生物学的であってよい。用語「生物学的」または「生物学的薬剤」は、生体および／またはそれらの生成物から作製される、治療薬としての使用を目的にした任意の薬学的に活性な薬剤を指す。

【0249】

本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象によって異なることができるか、または当技術分野で公知であるものによって投与することができる。例えば、ＧＯＯＤＭＡＮ ＆ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １２３３～１２８７頁の、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版１９９６年）を参照のこと。別の実施形態では、医療標準と一致したこのような薬剤の量が、投与される。

【0250】

ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、免疫抑制剤、抗アレルギー剤、または抗炎症剤と一緒に投与される。これらの薬剤は、本明細書において処置される対象の免疫系を抑制するかまたは覆い隠す作用をする物質を一般に指す。これらの薬剤には、サイトカイン生成を抑制するか、自己抗原発現を下方制御もしくは抑制するか、またはＭＨＣ抗原を覆い隠す物質が含まれる。このような薬剤の例には、２－アミノ－６－アリール－５置換ピリミジン；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質副腎皮質ステロイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾン；抗インターフェロン－γ、－βまたは－α抗体、抗腫瘍壊死因子－α抗体、抗腫瘍壊死因子－β抗体、抗インターロイキン－２抗体および抗ＩＬ－２レセプター抗体を含むサイトカインまたはサイトカインレセプターアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ－１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種の抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ－Ｔ抗体；ＬＦＡ－３結合性ドメインを含有する可溶性ペプチド；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ－β；ストレプトドルナーゼ；ＦＫ５０６；ＲＳ－６１４４３；デオキシスペルグアリン；およびラパマイシンが含まれる。ある特定の実施形態では、薬剤は、抗ヒスタミン剤である。本明細書で使用される「抗ヒスタミン剤」は、ヒスタミンの生理作用と拮抗する薬剤である。抗ヒスタミン剤の例は、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、クロモリンナトリウム、アステミゾール、マレイン酸アザタジン、マレイン酸ブロフェニラミン、マレイン酸カルビノキサミン、塩酸セチリジン、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ｄ－マレイン酸ブロムフェニラミン、ｄ－マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリネート、塩酸ジフェンヒドラミン、コハク酸ドキシラミン、塩酸フェキソフェンダジン、塩酸テルフェナジン、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン、塩酸メクリジン、クエン酸トリペラナミン、塩酸トリペレナミンおよび塩酸トリプロリジンである。

【0251】

免疫抑制剤、抗アレルギー剤、または抗炎症剤を、レンチウイルスベクター投与レジメンに組み込むことができる。例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤の投与は、開示されるレンチウイルスベクターの投与の前に開始することができ、その後単回またはそれ以上の回数の投与を続けることができる。ある特定の実施形態では、免疫抑制または抗炎症性の薬剤は、レンチウイルスベクターの前投薬として投与される。

【0252】

以前に議論したように、本開示のレンチウイルスベクターは、凝固障害のｉｎ ｖｉｖｏ処置のための薬学的に有効な量で投与することができる。この点に関しては、本開示のレンチウイルスベクターは、投与を促進し、活性剤の安定性を促進するために製剤化することができることが理解される。好ましくは、本開示による医薬組成物は、生理的食塩水、無毒の緩衝液、保存剤などの薬学的に許容される、無毒の無菌の担体を含む。当然ながら、本開示の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単一のまたは複数の用量で投与することができる。

【0253】

活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含有することができる。

【0254】

好適な医薬担体の非限定例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤のいくつかの例として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤も含有することができる。

【0255】

一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、髄腔内投与、および硬膜下投与からなる群から選択される経路で投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与である場合がある。

【0256】

一部の実施形態では、組成物を使用して、それを必要とする対象における出血性疾患または状態を処置する。出血性疾患または状態は、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大出血、筋肉内への大出血、口腔大出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、頭蓋内大出血、腹腔内大出血、胸腔内大出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒内出血およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は、手術を受けることが予定されている。また他の実施形態では、処置は、予防的であるかまたは要求に応じるものである。

【0257】

凝固系の機能を調査するために、いくつかの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲを判定するためにも使用される）、フィブリノーゲン試験（しばしばクラウス方法による）、血小板数、血小板機能試験（しばしばＰＦＡ－１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に異常が修正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子検査（例えば、Ｖ因子ライデン、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。

【0258】

ａＰＴＴ試験は、「内因性」（接触活性化経路とも呼ばれる）および一般的な凝固経路の効能を測定する性能指示器である。この試験は、市販されている組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定するために一般的に使用される。それは、外因性の経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と一緒に使用される。

【0259】

ＲＯＴＥＭ（登録商標）分析は、止血の完全なカイネティクス：凝固時間、クロット形成、クロットの安定性および溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリーにおける異なるパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線溶またはこれらの相互作用に影響する多くの因子に依存する。このアッセイは、二次性の止血の完全な像を提供することができる。

【0260】

ＩＶ．核酸分子
本開示は、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子列も提供する。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0261】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して同一である。

【0262】

ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド１～８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～８４；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～８４；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド１～８４；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド１～８４；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド１～８４に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0263】

ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、プロペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、プロペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド８５～１３８；（ｉｖ）配列番号５のヌクレオチド８５～１３８；（ｖ）配列番号６のヌクレオチド８５～１３８；または（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド８５～１３８に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0264】

本開示は、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターも提供する。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、例えば、本明細書に開示される任意のレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0265】

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９１％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９２％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９３％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９４％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９６％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0266】

一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。ある特定の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は、肝細胞である。

【0267】

Ｖ．組織特異的発現
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの中に、例えば最適化ＦＩＸ導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含ませることが有益である。したがって、本開示は、最適化ＦＩＸヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、さもなければレンチウイルスベクターの中に挿入される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つより多いコピーは、システムの効果を増加させることができる。

【0268】

異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含まれる。例えば、１つより多い導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つより多いｍｉＲＮＡ標的配列の制御下の導入遺伝子を有することができる。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦に並ぶことができるが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットは、アンチセンス配向でレンチウイルスベクターの中に挿入することもできる。アンチセンス配向は、さもなければ生成細胞に毒性であるかもしれない遺伝子生成物の発現を回避するための、ウイルス粒子の生成において役立つことができる。

【0269】

他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じかまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。しかし、ある特定の他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含ませるかどうか（および、その数）の選択は、意図される組織標的、要求される発現レベルなどの公知のパラメータによって導かれる。

【0270】

一実施形態では、標的配列は、骨髄関連の前駆体において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的は、リンパまたは赤血球系統における頑強な導入遺伝子発現に依存する遺伝子療法適用に好適である可能性もある。ｍｉＲ－２２３標的は、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。

【0271】

別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔ ａｇｇａａａｃａｃｔ ａｃａ（配列番号２７））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、４コピーのｍｉＲ－１４２標的配列を含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補配列、例えばｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み入れられ、導入遺伝子コード転写物をｍｉＲＮＡ媒介下方制御に対して感受性にする。この方法により、造血系統抗原提示細胞（ＡＰＣ）において導入遺伝子発現を阻止することができ、一方、非造血細胞では維持される（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６年）。この戦略は、ストリンジェントな転写後調節を導入遺伝子発現に課すことができ、したがって、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性の除去を阻止し、および／または抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を誘導し、および導入遺伝子によってコードされる抗原への頑強な免疫寛容を媒介する。

【0272】

一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５～１６５頁は、ｍｉＲ－１８１、すなわち、マウス骨髄の中のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡを開示する（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それは、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられていることも開示する。

【0273】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに完全または部分的に相補的である。用語「完全に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して一部だけ相補的であり、それによって、部分的に相補的な配列はｍｉＲＮＡによってなお認識されることを意味する。言い換えると、本開示との関連で、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識すること、およびそのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低減を達成することにおいて有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載され、これらは参照により完全に本明細書に組み入れる。

【0274】

ＶＩ．宿主細胞および作製する方法
本開示は、本開示の核酸分子またはレンチウイルスベクターを含む宿主細胞も提供する。本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターで宿主細胞をトランスフェクトおよび／または形質転換することを含む、レンチウイルスベクターを作製または生成することに関する。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞に変化をもたらすＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入を指すために、広い意味で使用される。

【0275】

「宿主細胞」は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターで形質転換された細胞を指す。本開示の宿主細胞は、好ましくは哺乳動物起源；最も好ましくはヒトまたはマウス起源である。当業者は、それらの目的に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞系として、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、およびＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。特定の一実施形態では、宿主細胞は：ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、ＣＡＰ細胞およびその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、昆虫起源のものである。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＳＦ９細胞である。宿主細胞系は、一般的には、商用サービスＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開された文献から利用可能である。

【0276】

本開示の核酸分子またはベクターの宿主細胞への導入は、当業者に周知の様々な技術によって達成することができる。これらには、これらに限定されないが、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトウイルスによる感染が含まれる。Ｒｉｄｇｗａｙ， Ａ． Ａ． Ｇ． 「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅ×ｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」 第２４．２章、４７０～４７２頁 Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ． １９８８年）を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションによる。形質転換された細胞は、軽鎖および重鎖を生成するのに適切な条件下で増殖し、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成に関してアッセイされる。例示的なアッセイ技術として、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。

【0277】

本開示の単離された核酸分子またはレンチウイルスベクターを含む宿主細胞は、適切な増殖培地中で増殖する。本明細書で使用されるように、用語「適切な成長培地」は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素は、炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含む。場合により、培地は、１つまたはそれ以上の選択因子を含有することができる。場合により、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有することができる。一実施形態では、培地は、実質的にＩｇＧを含有しない。増殖培地は、一般に、ＤＮＡ構築物を含有する細胞のために、例えば、薬物選択またはＤＮＡ構築物上で選択可能マーカーによって補足されるもしくはＤＮＡ構築物でコトランスフェクトされる必須栄養素の欠乏によって選択する。培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）内で増殖させる。一実施形態では、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）である。使用される特定の細胞系に適切な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。

【0278】

一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されるようにさらに改変される。例えば、宿主細胞は、本明細書に記載されるように、ＣＤ４７を過剰発現するように改変することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉを欠くように改変される。一部の実施形態では、宿主細胞は、未改変宿主細胞と比較して、表面に曝露されたＭＨＣ－Ｉが減少するように改変される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

【0279】

本開示のある特定の態様は、好適な条件下で本明細書に記載される宿主細胞を培養し、レンチウイルスベクターを単離することを含むレンチウイルスベクターを生成する方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、好適な条件下で本明細書に記載される宿主細胞を培養し、レンチウイルスベクターを単離することを含む、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターを生成する方法に関する。

【0280】

本明細書に記載の様々な態様、実施形態、および選択肢はすべて、いずれかおよびすべての変形形態で組み合わせることができる。

【0281】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願を、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み入れられることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み入れる。

【0282】

本開示について概ね説明してきたが、本明細書において提供される実施例を参照することによって、さらに深い理解を得ることができる。これらの実施例は、例示を目的とするに過ぎず、限定を意図するものではない。

【実施例1】

【0283】

成体ＨｅｍＢマウスにおけるＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌに媒介される長期ＦＩＸ発現および用量応答
Ｒ３３８Ｌ（「Ｐａｄｕａ」）置換を有するヒトＦＩＸバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌ；配列番号１）をレンチウイルスベクターの中にクローニングし、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを作成した（図１）。動物モデルにおけるＬＶ－ＦＩＸの用量応答プロファイルを決定するために、２９３Ｔ細胞において生成したＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを成体ＨｅｍＢマウスにおいて評価した。８週齢のＨｅｍＢマウスを３Ｅ９、７．５Ｅ９、２Ｅ１０、または６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量で（ｎ＝２～１０匹の動物／用量レベル）尾静脈注射を通して、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌで処置した。ＬＶ－ＦＩＸに媒介される血漿ＦＩＸ活性および抗原レベルをＦＩＸ色素源およびＥＬＩＳＡアッセイによってモニターした。各動物の定常状態のＦＩＸ血漿レベルを図２Ａに示し、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌ用量応答曲線を図２Ｂに示す。ＨｅｍＢマウスモデルでは、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌは、Ｌｏｇ－Ｌｏｇ用量応答プロファイルを実証し、１０～２００％の正常な循環ＦＩＸ活性を達成するために必要とされるＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌ用量レベルがＨｅｍＢマウスにおいて５Ｅ９～２Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの範囲であることが決定された。

【0284】

３つのより高い用量レベル群のＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌで処置した動物の長期ＦＩＸ発現プロファイルをＬＶ処置の後６カ月間モニターした。循環ＦＩＸ活性（図３Ａ）および抗原（図３Ｂ）のレベルをプロットした。すべての実験動物において、一致したレベルのＬＶに媒介されるＦＩＸ発現が観察され、研究期間内にＦＩＸ発現の損失は検出されず、このことにより、組み入れ遺伝子療法処置の長期安定性が実証された。さらに、ＦＩＸ活性のもの（図３Ｂ）と比較して、より低いパーセンテージの正常なＦＩＸ抗原レベルが観察され（図３Ａ）、このことは、ＦＩＸ導入遺伝子における機能的Ｒ３３８Ｌ突然変異の獲得の使用を反映する。

【実施例2】

【0285】

ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌは、成体および新生期の動物において同様の形質導入効率を有する。
レンチウイルスベクターは、長期にわたる導入遺伝子の発現を媒介するために宿主ゲノムの中に組み入れることができ、新生期の処置後のＡＡＶに媒介される導入遺伝子の発現が急速に失われるのとは異なり、レンチウイルスに媒介される導入遺伝子の発現は、ＬＶ－ＦＩＸで処置した成体動物においてだけでなく新生期の動物においても、持続的な導入遺伝子の発現プロファイルを維持することが期待される。新生期の処置後のレンチウイルスＦＩＸの形質導入効率および導入遺伝子の発現プロファイルを調査するために、２日齢のＨｅｍＢの仔を７．５Ｅ９、２Ｅ１０および６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの側頭静脈注射を通して、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌで処置した。成体段階での処置（８週で投与した）と比較して、全身投与したＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌは、各用量レベルでの６カ月の研究期間にわたり、持続的な同様レベルのＦＩＸ発現を媒介し、このことは、レンチウイルスＦＩＸの投与によって、成人患者と小児患者の両方を効率的に処置できることを示唆した。３Ｅ９、７．５Ｅ９、または２Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ用量の側頭静脈注射を通したＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌによる青年期のマウスの処置（２週で投与した）についても調査した。各用量レベルでのＦＩＸ発現のレベルは、８週または２日で処置を投与したマウスにおける相当する用量よりも高かった（ｎ＝６匹の動物／用量レベル／日（週）齢；図４Ａ）。
７．５Ｅ９、２Ｅ１０、および６Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ用量で側頭静脈注射を通して８週および２日で、ならびに３Ｅ９、７．５Ｅ９、または２Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ用量で２週で投与したＨｅｍＢマウスにおいて、ＦＩＸ活性を測定し、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの用量応答を決定した。図４Ａの長期データと一致して、２週で処置を投与したマウス（青年期のマウス）は、２日または８週で処置を投与したマウスと比較して、より高いＦＩＸ活性を示した（図４Ｂ）。

【実施例3】

【0286】

非ヒト霊長類におけるＣＤ４７ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの評価
レンチウイルスベクターの免疫特性をモジュレートするために、ヒトのＣＤ４７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系を作成した。高表面レベルのヒトＣＤ４７を有するレンチウイルスベクター粒子は、ＮＯＤマウス（ＮＯＤマウスはヒトＣＤ４７を認識することができる）において、より少ないクッパ－細胞の取り込みとより多い肝細胞への形質導入を示した。加えて、ＣＤ４７を過剰発現しない対照レンチウイルスベクターと比較して、より少ない高表面ヒトＣＤ４７発現を有するレンチウイルスベクター粒子しかマクロファージによって取り込まれなかった（図５）。

【0287】

ｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓への形質導入に関する高表面レベルのヒトＣＤ４７の効果をさらに評価するために、７．５Ｅ９ＴＵ／ｋｇ用量、ｎ＝３／処置群での静脈内投与後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８ＬをＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌと比較した。ブタオザルを使用して、処置後のＮＨＰにおけるレンチウイルスベクターの制約を回避した。

【0288】

レンチウイルスベクターによる処置後の循環ヒトＦＩＸレベルは、ヒトＦＩＸ特異的活性（図６Ａ）および抗原アッセイ（図６Ｂ）によって測定した。ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８は、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌと比較して、レンチウイルスベクターによる処置後に３倍高いヒトＦＩＸ発現を付与し、それぞれ、正常なＦＩＸ活性レベルの２００～３００％および５０～１５０％である（図６Ａ）。ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの使用は、ＬＶ－ＦＩＸを低下させ、レンチウイルスベクター処置に関連する急性毒性を低下させる可能性があるだろう。

【0289】

ヒトＦＩＸ発現レベルに加えて、処置した動物の恒常性もＡＰＴＴアッセイによってモニターした（図６Ｃ）。ビヒクル処置した動物のＡＰＴＴ時間は同じ範囲内のままであったが、ＬＶ－ＦＩＸ処置したすべての動物では有意に短いＡＰＴＴ時間が観察され（図６Ｃ）、このことは、レンチウイルスベクター処置によって得られたヒトＦＩＸタンパク質が機能的に活性であることを示す。

【実施例4】

【0290】

非ヒト霊長類におけるＣＤ４７ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの用量応答
ＮＨＰにおけるＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの用量応答プロファイルを決定するために、１．５Ｅ９および３Ｅ９ＴＵ／ｋｇ（ｎ＝３／用量レベル）の２つの低用量のＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを試験した。レンチウイルスベクターに媒介されるヒトＦＩＸ発現を、定常状態で循環したヒトのＦＩＸ特異的活性（図７Ａ）と抗原レベル（図７Ｂ）を分析することによってモニターした。

【0291】

ＨｅｍＢマウスにおいて観察された結果と一致して、ＮＨＰのＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌでも、ｌｏｇ／ｌｏｇ用量応答曲線を観察した。正常な循環ＦＩＸレベルの１０～１００％を達成するために必要とされるＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの用量範囲は、ＨｅｍＢマウスにおけるものよりも低い３．５～６Ｅ９ＴＵ／ｋｇである。治療用量範囲のシフトは、同じ用量レベルのＨｅｍＢマウスと比較して、ＮＨＰでは５～１０倍高いヒトＦＩＸ発現レベルによるものであり、これは、動物種の変化とヒトＣＤ４７の認識（ヒトＣＤ４７はＨｅｍＢマウスにおいて認識されない）を原因とするものだろう。

【0292】

ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌを投与した動物は、投与後のＡＬＴレベル（図８Ａ）、ＡＳＴレベル（図８Ｂ）、リンパレベル（図８Ｃ）および体温（図８Ｄ）によって示されるように、非常に穏やかな急性免疫応答を示した。ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの投与後に、ＬＶ対照ベクターと比較して、サイトカイン応答の低下が観察された（図９Ａ～９Ｃ）。対照ＬＶ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、およびＭＣＰ－１の投与後に、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、およびＭＣＰ－１の穏やかな増加が観察されたのに対し、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの投与後に、発現は低下し、一部の場合には検出不能であった。期待されたように、ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌは主として肝臓および脾臓に局在化し、肝臓と脾臓において、他の器官より１００倍を超えて多いベクターコピー数（ＶＣＮ）を有した（図１０）。これらのデータは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌが、アロ特異的免疫応答の低下を誘導し、それと共に食作用への耐性を増加させ、肝細胞への遺伝子移入を改善することを示唆する。

【実施例5】

【0293】

非ヒト霊長類におけるＣＤ４７ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌの用量応答についての追加試験
２．５Ｅ９ＴＵ／ｋｇの用量のＣＤ４７^ｈｉｇｈ ＬＶ－ｃｏＦＩＸ－１－Ｒ３３８Ｌで、静脈内投与によって、さらなるブタオザルを処置した。定常状態で循環したヒトＦＩＸ特異的活性（図１１Ａ）および抗原レベル（図１１Ｂ）を分析することによって、レンチウイルスベクターに媒介されるヒトＦＩＸ発現をモニターした。ＬＶ処置後に、定常状態の循環ヒトＦＩＸ活性は、正常の約３３％であり、循環ヒトＦＩＸ抗原量は７００ｎｇ／ｍＬであり、正常なＦＩＸ抗原レベルの１４％に相関した。

【0294】

特定の実施形態についての前記記載は、本開示の一般的性質を十分に明らかにしているため、他者が、過度な実験をすることなく、本開示の一般的概念から逸脱することなく、当技術分野の知識を適用することによって、このような特定の実施形態を容易に修正するおよび／またはそれに種々の応用を適用することができる。したがって、このような適応および修正は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに基づき、本開示の実施形態の意味および均等物の範囲内にあることが意図される。本明細書の表現法または用語法は説明を目的とするものであって限定を目的とするものではなく、その結果、本明細書の用語法または表現法は教示とガイダンスを考慮して当業者に解釈されるべきであることが理解されるべきである。

【0295】

本開示の他の実施形態は、本明細書および本明細書に開示された本開示の実施を考慮して当業者に明らかである。本明細書および実施例は例示として考慮されるに過ぎず、本開示の真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。

【0296】

本明細書で引用したすべての特許および刊行物は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【配列表】

2022514465000001.app

【国際調査報告】