特表 2022-514568 免疫系のモジュレーションのための生物工学的スキャフォールドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-14

(54)【発明の名称】免疫系のモジュレーションのための生物工学的スキャフォールドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20220204BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/58 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220204BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220204BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/27 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 31/395 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/30 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20220204BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220204BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P37/02

A61K9/06

A61K47/36

A61K47/42

A61K47/34

A61K47/32

A61K47/10

A61K47/56

A61K47/58

A61K47/59

A61K47/61

A61K47/62

A61K47/60

A61K47/64

A61K35/28

A61P3/10

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/06

A61P25/00

A61P1/04

A61P29/00

A61P13/12

A61P21/04

A61P9/00

A61P7/06

A61P37/08

A61K38/20

A61K38/27

A61K38/22

A61K38/19

A61K38/18

A61K31/395

A61K38/30

A61K38/17

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021535040

(86)(22)【出願日】2019-12-12

(85)【翻訳文提出日】2021-08-16

(86)【国際出願番号】 US2019066086

(87)【国際公開番号】W WO2020131582

(87)【国際公開日】2020-06-25

(31)【優先権主張番号】62/780,727

(32)【優先日】2018-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/798,100

(32)【優先日】2019-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(71)【出願人】

【識別番号】514291680

【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】シャー， ニサーグ ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】マオ， アンジェロ エス．

(72)【発明者】

【氏名】カー， マシュー ディー．

(72)【発明者】

【氏名】ムーニー， デイビッド ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】スカデン， デイビッド ティー．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076BB11

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC04

4C076CC07

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4C087ZA68

4C087ZA81

4C087ZA89

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4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZC35

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、対象において免疫系をモジュレートする組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、Ｔ細胞の欠損および／または調節不全と関連する疾患を処置および／または予防する手段を提供する。上記組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において免疫系をモジュレートするための組成物であって、
多孔性スキャフォールドと、
スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、かつ前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む、組成物。

【請求項2】

前記増殖因子が、スキャフォールドの体積を基準として、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

対象において免疫系をモジュレートするための組成物であって、
多孔性スキャフォールドと、
スキャフォールドの体積を基準として、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、かつ前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む、組成物。

【請求項4】

前記スキャフォールドが、ヒドロゲルを含む、請求項１～３に記載の組成物。

【請求項5】

前記スキャフォールドが、クリオゲルを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記スキャフォールドが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギネートまたはアルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リシン）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記スキャフォールドが、アルギネート、アルギネート誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記スキャフォールドが、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記スキャフォールドが、約１μｍ～１００μｍの直径を有する細孔を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記スキャフォールドが、マクロ細孔を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記マクロ細孔が、約５０μｍ～８０μｍの直径を有する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記スキャフォールドが、異なるサイズのマクロ細孔を含む、請求項１０または１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記スキャフォールドが、注射可能である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記スキャフォールドが、メタクリル化アルギネート（ＭＡ－アルギネート）を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記スキャフォールドが、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記スキャフォールドが、クリックヒドロゲルまたはクリッククリオゲルを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記スキャフォールドが、クリックアルギネート、クリックゼラチン、またはクリックヒアルロン酸を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記スキャフォールドが、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズおよびバルクヒドロゲルを含み、前記ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズが、前記スキャフォールドを対象に投与した後、前記バルクヒドロゲルポリマースキャフォールドよりも少なくとも１０％急速に分解される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズが、酸化アルギネートを含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記細胞が、幹細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記幹細胞が、造血幹細胞である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記細胞が、前駆細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

前記組織または前記器官が、骨組織または造血系組織を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記組織または前記器官が、前記組成物を前記対象に投与してから約７～２１日後に形成される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

前記組織または前記器官が、前記組成物を前記対象に投与してから約１４日後に形成される、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記細胞が、間質細胞である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

前記スキャフォールドが、約１００μｍ^３～約１０ｃｍ^３のサイズである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

前記スキャフォールドが、約１０ｍｍ^３～約１００ｍｍ^３のサイズである、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記スキャフォールドが、約３０ｍｍ^３のサイズである、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

前記増殖因子が、形質転換増殖因子タンパク質ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属するタンパク質を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記増殖因子が、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、増殖分化因子（ＧＤＦ）－１、ＧＤＧ－２、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－６、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－９、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記増殖因子が、ＢＭＰ－２を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記増殖因子が、ＴＧＦ－β１を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。

【請求項34】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約５００ｎｇで存在する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約２５０ｎｇで存在する、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約２００ｎｇで存在する、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

前記増殖因子が、約２００ｎｇで存在する、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

前記増殖因子が、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記増殖因子が、約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記増殖因子が、前記増殖因子が前記スキャフォールドに組み込まれた後少なくとも１２日間、その生体活性を保持する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

前記Ｔ細胞前駆細胞が、Ｔ細胞へと分化することができる、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

前記Ｔ細胞が、Ｔｒｅｇを含む、請求項４１または４２に記載の組成物。

【請求項44】

前記分化因子が、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

前記Ｎｏｔｃｈ受容体が、Ｎｏｔｃｈ－１受容体、Ｎｏｔｃｈ－２受容体、Ｎｏｔｃｈ－３受容体、Ｎｏｔｃｈ－４受容体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

前記分化因子が、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４４または４５に記載の組成物。

【請求項47】

前記分化因子が、前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記分化因子が、クリックケミストリーを利用して前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項４７に記載の組成物。

【請求項49】

前記分化因子が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）ケミストリー、ＮＨＳおよびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）ケミストリー、アビジン－ビオチン反応、アジドおよびジベンゾシクロオクチンケミストリー、テトラジンおよびトランスシクロオクテンケミストリー、テトラジンおよびノルボルネンケミストリー、またはジスルフィドケミストリーを利用して、前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項４７または４８に記載の組成物。

【請求項50】

前記分化因子が、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇの量で存在する、請求項１～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記分化因子が、スキャフォールド当たり約１μｇ～約１００μｇの量で存在する、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

前記分化因子が、スキャフォールド当たり１μｇ～約１０μｇの量で存在する、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

前記分化因子が、スキャフォールド当たり約６μｇで存在する、請求項５２に記載の組成物。

【請求項54】

前記分化因子が、前記分化因子が前記スキャフォールドに組み込まれた後少なくとも約３ヶ月間、その生体活性を保持する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

前記動員される細胞が、移植細胞である、請求項１～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項56】

前記動員される細胞が、移植細胞ではない、請求項１～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

前記動員される細胞が、自家である、請求項５５に記載の組成物。

【請求項58】

前記動員される細胞が、同種である、請求項５５に記載の組成物。

【請求項59】

前記動員される細胞が、異種である、請求項５５に記載の組成物。

【請求項60】

前記分化した細胞が、前記スキャフォールドから遊走することができる、請求項１～５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

前記分化した細胞が、前記組成物を対象に投与した後に、前記対象における組織にホーミングすることができる、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記細胞の前記スキャフォールドへの前記動員を促進することができる、ホーミング因子をさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

前記ホーミング因子が、間質細胞由来因子（ＳＤＦ－１）を含む、請求項６２に記載の組成物。

【請求項64】

対象において免疫系をモジュレートする方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物を投与し、それによって、前記対象において前記免疫系をモジュレートするステップを含む、方法。

【請求項65】

対象において免疫過剰反応性を低減させる方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象において免疫過剰反応性を低減させるステップを含む、方法。

【請求項66】

移植を受ける対象においてドナーキメラ化を増加させる方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象においてドナーキメラ化を増加させるステップを含む、方法。

【請求項67】

対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進するための方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進するステップを含む、方法。

【請求項68】

前記対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記組成物が、前記対象への前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の投与と同時またはその後に、前記対象に投与される、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５～約５０×１０^６個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、前記対象に投与される、請求項６８または６９に記載の方法。

【請求項71】

前記対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５～約１×１０^６個の造血幹細胞または造血前駆細胞が、前記対象に投与される、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記対象においてＴ細胞の再構成を増強させる、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

Ｔ細胞新生を増強させる、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記増強されたＴ細胞新生が、増強されたＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）によって特徴付けられる、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記対象においてＴ細胞多様性を増強させる、請求項６４～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記Ｔ細胞多様性が、増強されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーによって特徴付けられる、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞のレベルを増加させる、請求項６４～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記対象が、免疫系の欠陥を有するヒトである、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記対象が、免疫老化に起因して免疫系の欠陥を有する、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記対象が、３０歳を上回る、４０歳を上回る、５０歳を上回る、６０歳を上回る、７０歳を上回る、または８０歳を上回る、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記対象が、先天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する、請求項７８～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記対象が、後天性免疫不全を有する、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

対象において免疫過剰反応性を低減させる方法であって、前記対象に、
多孔性スキャフォールドと、
前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む組成物を投与し、
それによって、前記対象において免疫過剰反応性を低減させるステップを含む、方法。

【請求項84】

移植を受ける対象においてドナーキメラ化を増加させる方法であって、前記対象に、
多孔性スキャフォールドと、
前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む組成物を投与し、それによって、前記対象においてドナーキメラ化を増加させるステップを含む、方法。

【請求項85】

対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進するための方法であって、前記対象に、
多孔性スキャフォールドと、
前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む組成物を投与し、それによって、前記対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成をもたらすステップを含む、方法。

【請求項86】

免疫系の欠陥を有するヒトの免疫系をモジュレートする方法であって、前記ヒトに、
多孔性スキャフォールドと、
前記スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、前記スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、
前記動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、分化因子と
を含む組成物を投与し、それによって、前記ヒトの免疫系をモジュレートするステップを含み、
前記ヒトが、免疫老化、先天性免疫不全、または後天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する、
方法。

【請求項87】

前記スキャフォールドが、ヒドロゲルを含む、請求項８３～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記スキャフォールドが、クリオゲルを含む、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記スキャフォールドが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギネートまたはアルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リシン）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項８３～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記スキャフォールドが、アルギネート、アルギネート誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記スキャフォールドが、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記スキャフォールドが、マクロ細孔を含む、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記マクロ細孔が、約１μｍ～約１００μｍの直径を有する、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記マクロ細孔が、約５０μｍ～８０μｍの直径を有する、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記スキャフォールドが、異なるサイズのマクロ細孔を含む、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記スキャフォールドが、注射可能である、請求項８３～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記スキャフォールドが、メタクリル化アルギネート（ＭＡ－アルギネート）を含む、請求項８３～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記スキャフォールドが、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体を含む、請求項８３～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記スキャフォールドが、クリックヒドロゲルまたはクリッククリオゲルを含む、請求項８３～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記スキャフォールドが、クリックアルギネート、クリックゼラチン、またはクリックヒアルロン酸を含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記スキャフォールドが、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズおよびバルクヒドロゲルを含み、前記ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズが、対象に投与した後、前記バルクヒドロゲルよりも少なくとも１０％急速に分解される、請求項８３～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズが、酸化アルギネートを含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、請求項８３～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、組換え造血幹細胞、組換え造血前駆細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記細胞が、造血骨髄細胞、動態化末梢血細胞、組換え造血骨髄細胞、組換え動態化末梢血細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８３～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記組織または前記器官が、骨組織または造血系組織を含む、請求項８３～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記組織または前記器官が、前記組成物を前記対象に投与してから約７～２１日後に形成される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記組織または前記器官が、前記組成物を前記対象に投与してから約１４日後に形成される、請求項８３～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

少なくとも２つの組成物が、前記対象に投与される、請求項１０７または１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記組成物が、類似のサイズのものである、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記細胞が、間質細胞である、請求項８３～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記スキャフォールドが、約１００μｍ^３～約１０ｃｍ^３のサイズである、請求項８３～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記スキャフォールドが、約１０ｍｍ^３～約１００ｍｍ^３のサイズである、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記スキャフォールドが、約３０ｍｍ^３のサイズである、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記増殖因子が、形質転換増殖因子タンパク質ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属するタンパク質を含む、請求項８３～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記増殖因子が、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、増殖分化因子（ＧＤＦ）－１、ＧＤＧ－２、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－６、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－９、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記増殖因子が、ＢＭＰ－２を含む、請求項１１５または１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記増殖因子が、ＴＧＦ－β１を含む、請求項１１５または１１６に記載の方法。

【請求項119】

前記増殖因子が、前記増殖因子が前記スキャフォールドに組み込まれた後少なくとも１２日間、その生体活性を保持する、請求項８３～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記Ｔ細胞前駆細胞が、Ｔ細胞へと分化することができる、請求項８３～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記リンパ球が、Ｔｒｅｇを含む、請求項１１９または１２０に記載の方法。

【請求項123】

前記分化因子が、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する、請求項８３～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記Ｎｏｔｃｈ受容体が、Ｎｏｔｃｈ－１受容体、Ｎｏｔｃｈ－２受容体、Ｎｏｔｃｈ－３受容体、Ｎｏｔｃｈ－４受容体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記分化因子が、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１２３または１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記分化因子が、前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項８３～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記分化因子が、クリックケミストリーを利用して前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記分化因子が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）ケミストリー、アビジン－ビオチン反応、アジドおよびジベンゾシクロオクチンケミストリー、テトラジンおよびトランスシクロオクテンケミストリー、テトラジンおよびノルボルネンケミストリー、またはジスルフィドケミストリーを利用して、前記スキャフォールドに共有結合により連結されている、請求項１２６または１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記分化因子が、前記分化因子が前記スキャフォールドに組み込まれた後少なくとも約３ヶ月間、その生体活性を保持する、請求項８３～１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記動員される細胞が、移植細胞である、請求項８３～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記動員される細胞が、移植細胞ではない、請求項８３～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記動員される細胞が、自家である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項133】

前記動員される細胞が、同種である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項134】

前記動員される細胞が、異種である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項135】

前記分化した細胞が、前記スキャフォールドから遊走することができる、請求項８３～１３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

前記分化した細胞が、前記組成物を対象に投与した後に、前記対象における組織にホーミングすることができる、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記組成物が、前記細胞の前記スキャフォールドへの前記動員を促進することができるホーミング因子をさらに含む、請求項８３～１３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

前記ホーミング因子が、間質細胞由来因子（ＳＤＦ－１）を含む、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

前記増殖因子が、約１ｎｇ～約１０００μｇで存在する、請求項８３～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記増殖因子が、約１ｎｇ～約１０００ｎｇで存在する、請求項８３～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約５００ｎｇで存在する、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約２５０ｎｇで存在する、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記増殖因子が、約５ｎｇ～約２００ｎｇで存在する、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

前記増殖因子が、約２００ｎｇで存在する、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

前記増殖因子が、スキャフォールドの体積を基準として、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項８３～１４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

前記増殖因子が、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項１４５に記載の組成物。

【請求項147】

前記増殖因子が、約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する、請求項１４６に記載の組成物。

【請求項148】

前記対象の体重１キログラム当たり約５×１０^５～約５０×１０^６個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、前記対象に投与される、請求項８３～１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記対象の体重１キログラム当たり約５×１０^５個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、前記対象に投与される、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記造血細胞が、造血幹細胞、造血前駆細胞、組換え造血幹細胞、組換え造血前駆細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４８または１４９に記載の方法。

【請求項151】

前記造血細胞が、造血骨髄細胞、動態化末梢血細胞、組換え造血骨髄細胞、組換え動態化末梢血細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４８または１４９に記載の方法。

【請求項152】

前記対象において自己免疫を低減させる、請求項８３および８７～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項153】

自己免疫疾患を予防または処置する、請求項８３および８７～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記自己免疫疾患が、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、脈管炎、悪性貧血、セリアック病、およびアレルギーからなる群から選択される疾患である、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を軽減する、請求項８３、８４、および８７～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

前記ＧＶＨＤが、前記対象への造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と関連している、請求項１５５に記載の方法。

【請求項157】

前記組成物が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と同時またはその後に投与される、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記ＧＶＨＤが、固形臓器移植と関連している、請求項１５７に記載の方法。

【請求項159】

前記組成物が、前記移植の前に対象に投与される、請求項１５８に記載の方法。

【請求項160】

前記ＧＶＨＤが、急性ＧＶＨＤである、請求項１５５～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記ＧＶＨＤが、慢性ＧＶＨＤである、請求項１５５～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

ＧＶＨＤ関連の罹患率、ＧＶＨＤ関連の死亡率、またはＧＶＨＤ関連の長期生存率の低下を軽減する、請求項１５５～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記移植が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である、請求項８４および８７～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

前記ドナーキメラ化の増加が、Ｔ細胞キメラ化を含む、請求項８４、８７～１５１、および１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含む、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記バランスの取れたＴ細胞再構成が、末梢血において約０．９～約２．５の恒常性ＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比によって特徴付けられる、請求項８５および８７～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記ヒトが、免疫老化に起因して免疫系の欠陥を有する、請求項８６～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記ヒトが、３０歳を上回る、４０歳を上回る、５０歳を上回る、６０歳を上回る、７０歳を上回る、または８０歳を上回る、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

前記ヒトが、先天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する、請求項８６～１５１、１６７、および１６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記ヒトが、後天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する、請求項８６～１５１および１６７～１６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞のレベルを増加させる、請求項８３～１７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項172】

前記組成物が、注射によって投与される、請求項８３～１７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項173】

前記注射が、皮下注射である、請求項１７２に記載の方法。

【請求項174】

ニードルと、
請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物を含む、リザーバと、
プランジャーと
を備える、シリンジ。

【請求項175】

請求項１～６３のいずれか一項に記載の組成物と、
前記組成物を投与するための説明書と
を含む、キット。

【請求項176】

前記対象に、骨髄から血液への幹細胞または前駆細胞の移動を誘導するのに有効な量の幹細胞動態化剤または前駆細胞動態化剤を投与するステップをさらに含む、請求項８３～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項177】

前記幹細胞動態化剤または前記前駆細胞動態化剤が、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサフォル、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポチエン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項178】

前記幹細胞動態化剤または前記前駆細胞動態化剤が、前記組成物の投与の前、同時、または後に投与される、請求項１７６または１７７に記載の方法。

【請求項179】

前記対象に、治療有効量の電磁放射線を投与するステップをさらに含む、請求項１７６～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／７８０，７２７号および２０１９年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／７９８，１００号の利益を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＨＬ１２９９０３、ＥＢ０１５４９８、ＥＢ０１４７０３、およびＥＢ０２３２８７のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者における長期免疫不全は、生命を脅かす血液または骨髄の疾患、例えば、多発性骨髄腫および白血病を管理する際の最も重大な障害の１つのままとなっている。移植の前に、レシピエントは、罹患細胞を破壊するための状態調節の細胞毒性放射線および化学療法レジメンを受ける。状態調節プロセスの副作用は、獲得免疫系のＴ細胞およびＢ細胞の破壊の結果としての重篤なリンパ球減少症である。ＴおよびＢ細胞数の劇的な低減ならびにその多様性の低減によって特徴付けられる重大な移植後免疫不全は、１～２年間継続し得る。免疫不全に関連する重篤な日和見感染（約３０％）、がん再発（急性骨髄性白血病については５０％を上回る）、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（約４０％）は、最も一般的な併発症であり、ＨＳＣＴを受けた患者における罹患率および死亡率の原因である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ＨＳＣＴ後の免疫系の再構成を改善するのに有用である新規な組成物および方法が必要とされている。また、ＨＳＣＴと関連するリスクを低減させ、患者の予後を改善することができる組成物および方法も、必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の要旨
対象の免疫系をモジュレートするための新規な組成物および方法が、本明細書において開示される。本明細書に開示される組成物および方法は、Ｔ細胞の欠損および／または調節不全と関連する疾患を処置および／または予防する手段を提供する。

【0006】

したがって、一態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートするための組成物を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む。一実施形態では、増殖因子は、スキャフォールドの体積を基準として、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。

【0007】

別の態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートするための組成物を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールドの体積を基準として約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む。

【0008】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、ヒドロゲルを含む。一実施形態では、スキャフォールドは、クリオゲルを含む。別の実施形態では、スキャフォールドは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギネートまたはアルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リシン）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、アルギネート、アルギネート誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。なお別の実施形態では、スキャフォールドは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。

【0009】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、約１μｍ～１００μｍの直径を有する細孔を含む。一実施形態では、スキャフォールドは、マクロ細孔を含む。別の実施形態では、マクロ細孔は、約５０μｍ～８０μｍの直径を有する。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、異なるサイズのマクロ細孔を含む。

【0010】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、注射可能である。

【0011】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、メタクリル化アルギネート（ＭＡ－アルギネート）を含む。

【0012】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体を含む。

【0013】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、クリックヒドロゲルまたはクリッククリオゲルを含む。一実施形態では、スキャフォールドは、クリックアルギネート、クリックゼラチン、またはクリックヒアルロン酸を含む。

【0014】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズおよびバルクヒドロゲルを含み、ここで、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズは、スキャフォールドを対象に投与した後、バルクヒドロゲルポリマースキャフォールドよりも少なくとも１０％急速に分解される。一実施形態では、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズは、酸化アルギネートを含む。

【0015】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、幹細胞である。一実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞である。

【0016】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、前駆細胞である。

【0017】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、組織または器官は、骨組織または造血組織を含む。一実施形態では、組織または器官は、組成物を対象に投与してから約７～２１日後に形成される。別の実施形態では、組織または器官は、組成物を対象に投与してから約１４日後に形成される。

【0018】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、細胞は、間質細胞である。

【0019】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、約１００μｍ^３～約１０ｃｍ^３のサイズである。一実施形態では、スキャフォールドは、約１０ｍｍ^３～約１００ｍｍ^３のサイズである。別の実施形態では、スキャフォールドは、約３０ｍｍ^３のサイズである。

【0020】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、形質転換増殖因子タンパク質ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属するタンパク質を含む。一実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、増殖分化因子（ＧＤＦ）－１、ＧＤＧ－２、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－６、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－９、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む。別の実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ－２を含む。さらに別の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－β１を含む。

【0021】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約５００ｎｇで存在する。一実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約２５０ｎｇで存在する。別の実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約２００ｎｇで存在する。さらに別の実施形態では、増殖因子は、約２００ｎｇで存在する。なお別の実施形態では、増殖因子は、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。なお別の実施形態では、増殖因子は、約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。

【0022】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、増殖因子がスキャフォールドに組み込まれた後少なくとも１２日間、その生体活性を保持する。

【0023】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、Ｔ細胞前駆細胞は、Ｔ細胞に分化することができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ_ｒｅｇを含む。

【0024】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、分化因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈ－１受容体、Ｎｏｔｃｈ－２受容体、Ｎｏｔｃｈ－３受容体、Ｎｏｔｃｈ－４受容体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、分化因子は、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0025】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、分化因子は、スキャフォールドに共有結合により連結されている。一実施形態では、分化因子は、クリックケミストリーを利用してスキャフォールドに共有結合により連結されている。別の実施形態では、分化因子は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）ケミストリー、ＮＨＳおよびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）ケミストリー、アビジン－ビオチン反応、アジドおよびジベンゾシクロオクチンケミストリー、テトラジンおよびトランスシクロオクテンケミストリー、テトラジンおよびノルボルネンケミストリー、またはジスルフィドケミストリーを利用して、スキャフォールドに共有結合により連結されている。

【0026】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇの量で存在する。一実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり約１μｇ～約１００μｇの量で存在する。別の実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり１μｇ～約１０μｇの量で存在する。さらに別の実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり約６μｇで存在する。

【0027】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、分子因子は、分化因子がスキャフォールドに組み込まれた後少なくとも約３ヶ月間、その生体活性を保持する。

【0028】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、動員される細胞は、移植細胞である。一実施形態では、動員される細胞は、自家である。別の実施形態では、動員される細胞は、同種である。さらに別の実施形態では、動員される細胞は、異種である。

【0029】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、動員される細胞は、移植細胞ではない。

【0030】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、分化した細胞は、スキャフォールドから遊走することができる。一実施形態では、分化した細胞は、組成物を対象に投与した後に、対象における組織にホーミングすることができる。

【0031】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、組成物は、細胞のスキャフォールドへの動員を促進することができるホーミング因子をさらに含む。一実施形態では、ホーミング因子は、間質細胞由来因子（ＳＤＦ－１）を含む。

【0032】

一態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートする方法であって、本発明の前述の組成物を投与し、それによって対象において免疫系をモジュレートすることによる、方法を提供する。

【0033】

別の態様では、本発明は、対象において免疫過剰反応性を低減させる方法であって、本発明の前述の組成物を投与し、それによって対象において免疫過剰反応性を低減させることによる、方法を提供する。

【0034】

さらに別の態様では、本発明は、移植を受ける対象においてドナーキメラ化を増加させる方法であって、本発明の前述の組成物を投与し、それによって対象においてドナーキメラ化を増加させることによる、方法を提供する。

【0035】

なおも別の態様では、本発明は、対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進する方法であって、本発明の前述の組成物を投与し、それによって対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進することによる、方法を提供する。

【0036】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、組成物は、対象への前記造血幹細胞または造血前駆細胞の投与と同時またはその後に、対象に投与される。別の実施形態では、対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５～約５０×１０^６個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、対象に投与される。さらに別の実施形態では、対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５～約１×１０^６個の造血幹細胞または造血前駆細胞が、対象に投与される。

【0037】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、方法は、対象においてＴ細胞の再構成を増強させる。一実施形態では、方法は、Ｔ細胞新生を増強させる。別の実施形態では、増強されたＴ細胞新生は、増強されたＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）によって特徴付けられる。

【0038】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、方法は、対象においてＴ細胞多様性を増強させる。一実施形態では、Ｔ細胞多様性は、増強されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーによって特徴付けられる。

【0039】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、方法は、制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞のレベルを増加させる。

【0040】

上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態では、対象は、免疫系の欠陥を有するヒトである。一実施形態では、対象は、免疫老化に起因して免疫系の欠陥を有する。別の実施形態では、対象は、３０歳を上回る、４０歳を上回る、５０歳を上回る、６０歳を上回る、７０歳を上回る、または８０歳を上回る。一実施形態では、対象は、先天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。さらに別の実施形態では、対象は、後天性免疫不全を有する。

【0041】

別の態様では、本発明は、対象において免疫過剰反応性を低減させる方法であって、対象に、組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含み、それによって、対象において免疫過剰反応性を低減させる。

【0042】

なおも別の態様では、本発明は、移植を受ける対象においてドナーキメラ化を増加させる方法であって、対象に、組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含み、それによって、対象においてドナーキメラ化を増加させる。

【0043】

さらに別の態様では、本発明は、対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成を促進するための方法であって、対象に、組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含み、それによって対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成をもたらす。

【0044】

なおも別の態様では、本発明は、免疫系の欠陥を有するヒトの免疫系をモジュレートする方法であって、ヒトに、組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含み、それによって、ヒトの免疫系をモジュレートし、ここで、ヒトは、免疫老化、先天性免疫不全、または後天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。

【0045】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、ヒドロゲルを含む。一実施形態では、スキャフォールドは、クリオゲルを含む。別の実施形態では、スキャフォールドは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギネートまたはアルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リシン）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、アルギネート、アルギネート誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーまたはコポリマーを含む。

【0046】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、細孔を含む。一実施形態では、細孔は、約１μｍ～約１００μｍの直径を有する。別の実施形態では、細孔は、約５０μｍ～８０μｍの直径を有する。さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、異なるサイズの細孔を含む。

【0047】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、注射可能である。一実施形態では、スキャフォールドは、メタクリル化アルギネート（ＭＡ－アルギネート）を含む。別の実施形態では、スキャフォールドは、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体を含む。

【0048】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、クリックヒドロゲルまたはクリッククリオゲルを含む。一実施形態では、スキャフォールドは、クリックアルギネート、クリックゲル化、またはクリックヒアルロン酸を含む。

【0049】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズおよびバルクヒドロゲルを含み、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズは、対象に投与した後、バルクヒドロゲルよりも少なくとも１０％急速に分解される。一実施形態では、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズは、酸化アルギネートを含む。

【0050】

上記の態様の様々な実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞である。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞、造血前駆細胞、組換え造血幹細胞、組換え造血前駆細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、細胞は、造血骨髄細胞、動態化末梢血細胞、組換え造血骨髄細胞、組換え動態化末梢血細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0051】

上記の態様の様々な実施形態では、組織または器官は、骨組織または造血組織を含む。一実施形態では、組織または器官は、組成物を対象に投与してから約７～２１日後に形成される。別の実施形態では、組織または器官は、組成物を対象に投与してから約１４日後に形成される。さらに別の実施形態では、少なくとも２つの組成物が、対象に投与される。なおも別の実施形態では、組成物は、類似のサイズのものである。

【0052】

上記の態様の様々な実施形態では、細胞は、間質細胞である。

【0053】

上記の態様の様々な実施形態では、スキャフォールドは、約１００μｍ^３～約１０ｃｍ^３のサイズである。一実施形態では、スキャフォールドは、約１０ｍｍ^３～約１００ｍｍ^３のサイズである。別の実施形態では、スキャフォールドは、約３０ｍｍ^３のサイズである。

【0054】

上記の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、形質転換増殖因子タンパク質ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属するタンパク質を含む。一実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、増殖分化因子（ＧＤＦ）－１、ＧＤＧ－２、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－６、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－９、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む。別の実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ－２を含む。さらに別の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－β１を含む。

【0055】

上記の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、増殖因子がスキャフォールドに組み込まれた後少なくとも１２日間、その生体活性を保持する。

【0056】

上記の態様の様々な実施形態では、Ｔ細胞前駆細胞は、Ｔ細胞へと分化することができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ_ｒｅｇを含む。

【0057】

上記の態様の様々な実施形態では、分化因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈ－１受容体、Ｎｏｔｃｈ－２受容体、Ｎｏｔｃｈ－３受容体、Ｎｏｔｃｈ－４受容体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、分化因子は、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0058】

上記の態様の様々な実施形態では、分化因子は、前記スキャフォールドに共有結合により連結されている。一実施形態では、分化因子は、クリックケミストリーを利用して前記スキャフォールドに共有結合により連結されている。別の実施形態では、分化因子は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）ケミストリー、アビジン－ビオチン反応、アジドおよびジベンゾシクロオクチンケミストリー、テトラジンおよびトランスシクロオクテンケミストリー、テトラジンおよびノルボルネンケミストリー、またはジスルフィドケミストリーを利用して、スキャフォールドに共有結合により連結されている。

【0059】

上記の態様の様々な実施形態では、分化因子は、分化因子がスキャフォールドに組み込まれた後少なくとも約３ヶ月間、その生体活性を保持する。

【0060】

上記の態様の様々な実施形態では、動員される細胞は、移植細胞である。一実施形態では、動員される細胞は、自家である。別の実施形態では、動員される細胞は、同種である。さらに別の実施形態では、動員される細胞は、異種である。

【0061】

上記の態様の様々な実施形態では、動員される細胞は、移植細胞ではない。

【0062】

上記の態様の様々な実施形態では、分化した細胞は、スキャフォールドから遊走することができる。一実施形態では、分化した細胞は、組成物を対象に投与した後に、対象における組織にホーミングすることができる。

【0063】

上記の態様の様々な実施形態では、組成物は、細胞のスキャフォールドへの動員を促進することができるホーミング因子をさらに含む。一実施形態では、ホーミング因子は、間質細胞由来因子（ＳＤＦ－１）を含む。

【0064】

上記の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、約１ｎｇ～約１０００μｇで存在する。一実施形態では、増殖因子は、約１ｎｇ～約１０００ｎｇで存在する。別の実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約５００ｎｇで存在する。さらに別の実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約２５０ｎｇで存在する。なお別の実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約２００ｎｇで存在する。なお別の実施形態では、増殖因子は、約２００ｎｇで存在する。

【0065】

上記の態様の様々な実施形態では、増殖因子は、スキャフォールドの体積を基準として、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。一実施形態では、増殖因子は、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。別の実施形態では、増殖因子は、約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在する。

【0066】

上記の態様の様々な実施形態では、対象の体重１キログラム当たり約５×１０^５～約５０×１０^６個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、対象に投与される。一実施形態では、対象の体重１キログラム当たり約５×１０^５個の造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、対象に投与される。別の実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞、造血前駆細胞、組換え造血幹細胞、組換え造血前駆細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、造血細胞は、造血骨髄細胞、動態化末梢血細胞、組換え造血骨髄細胞、組換え動態化末梢血細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0067】

上記の態様の様々な実施形態では、方法は、対象において自己免疫を低減させる。

【0068】

上記の態様の様々な実施形態では、方法は、自己免疫疾患を予防または処置する。一実施形態では、自己免疫疾患は、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、脈管炎、悪性貧血、セリアック病、およびアレルギーからなる群から選択される疾患である。

【0069】

上記の態様の様々な実施形態では、方法は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を軽減する。一実施形態では、ＧＶＨＤは、対象への造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と関連している。別の実施形態では、組成物は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と同時またはその後に投与される。さらに別の実施形態では、ＧＶＨＤは、固形臓器移植と関連している。さらに別の実施形態では、組成物は、移植の前に対象に投与される。なお別の実施形態では、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤである。一実施形態では、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤである。別の実施形態では、方法は、ＧＶＨＤ関連の罹患率、ＧＶＨＤ関連の死亡率、またはＧＶＨＤ関連の長期生存率の低下を軽減する。

【0070】

上記の態様の様々な実施形態では、移植は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。

【0071】

上記の態様の様々な実施形態では、ドナーキメラ化の増加は、Ｔ細胞キメラ化を含む。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはＴ_ｒｅｇ細胞を含む。

【0072】

上記の態様の様々な実施形態では、バランスの取れたＴ細胞再構成は、末梢血において約０．９～約２．５の恒常性ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋Ｔ細胞比によって特徴付けられる。

【0073】

上記の態様の様々な実施形態では、ヒトは、免疫老化に起因して免疫系の欠陥を有する。一実施形態では、ヒトは、３０歳を上回る、４０歳を上回る、５０歳を上回る、６０歳を上回る、７０歳を上回る、または８０歳を上回る。

【0074】

上記の態様の様々な実施形態では、ヒトは、先天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。

【0075】

上記の態様の様々な実施形態では、ヒトは、後天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。

【0076】

上記の態様の様々な実施形態では、方法は、制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞のレベルを増加させる。

【0077】

上記の態様の様々な実施形態では、組成物は、注射によって投与される。一実施形態では、注射は、皮下注射である。

【0078】

本発明のなおもさらなる態様では、本発明は、シリンジを提供する。シリンジは、ニードル、上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態の組成物を含むリザーバ、およびプランジャーを含む。

【0079】

本発明のなおもさらなる態様では、本発明は、キットを提供する。キットは、上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態の組成物、および組成物を投与するための説明書を含む。

【0080】

上記の態様の様々な実施形態では、方法は、対象に、骨髄から血液への幹細胞または前駆細胞の移動を誘導するのに有効な量の幹細胞動態化剤または前駆細胞動態化剤を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、幹細胞動態化剤または前駆細胞動態化剤は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサフォル、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポチエン、またはこれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、幹細胞動態化剤または前駆細胞動態化剤は、組成物の投与の前、同時、または後に投与される。さらに別の実施形態では、方法は、対象に、治療有効量の電磁放射線を投与するステップをさらに含む。

【0081】

本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および図面から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0082】

図１Ａ～１Ｅ、１Ｊ、および１Ｍは、アルギネート－ＰＥＧ－ＤＬＬ４に基づく骨髄クリオゲル（ＢＭＣ）がＤＬＬ４およびＢＭＰ－２を提示し、共通リンパ球前駆体（ＣＬＰ）を優先的に増大させることを示す。図１Ｆ～１Ｉ、１Ｋおよび１Ｌは、ＢＭＣ生体活性の広範囲の特徴付けを示す。

【0083】

【図1A】図１Ａは、共有結合により架橋結合したＢＭＣの製作についての概略図である。

【0084】

【図1B】図１Ｂは、ＢＭＣの代表的な横断的走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。スケールバー、１ｍｍ。

【0085】

【図1C】図１Ｃは、ＢＭＣの横断面内の細孔の形状および構造の代表的なＳＥＭである。スケールバー＝２００μｍ。

【0086】

【図1D】図１Ｄは、封入されたＢＭＰ－２および共有結合により係留されたＤＬＬ４の放出カイネティクスを示す（群当たりｎ＝５）。

【0087】

【図1E】図１Ｅは、メタクリレートリンカーを用いた修飾の前後のＤＬＬ４の結合カイネティクスを測定する表面プラズモン共鳴を示す。

【0088】

【図1F】図１Ｆは、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１前骨芽細胞においてアルカリホスファターゼ酵素活性を使用して測定したプールされた放出されたＢＭＰ－２の生体活性を、ＢＭＣに組み込まれることがないＢＭＰ－２（ネイティブなＢＭＰ－２）およびＢＭＰ－２が添加されていない培地（成長培地）と比較して示す。

【0089】

【図1G】図１Ｇは、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１前骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ酵素活性を使用した放出後に別々の時間間隔で数量化したＢＭＰ－２の生体活性を示す。

【0090】

【図1H】図１Ｈは、比色定量アッセイを使用して測定したノッチリガンドＤＬＬ－４のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体活性を示す。

【0091】

【図1I】図１Ｉは、二重ＢＭＣ（上の行）およびブランクＢＭＣ（下の行）についての異なる時間間隔でのＣＨＯ－Ｋ１＋２ｘＨＳ４－ＵＡＳ－Ｈ２Ｂ－Ｃｉｔｒｉｎｅ－２ｘＨＳ４ ｃＨ１＋ｈＮＥＣＤ－Ｇａｌ４ｅｓｎ ｃ９ノッチ－レポーター細胞株におけるシトリン発現の代表的な蛍光顕微鏡画像を示す。

【0092】

【図1J】図１Ｊは、単離されたマウス造血幹細胞・前駆細胞およびヒト造血幹細胞・前駆細胞のＣＬＰへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化をポリマー骨格上のメタクリレート基の官能化の程度に応じて示す（ｎ＝５）。

【0093】

【図1K】図１Ｋおよび１Ｌは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間培養した後のマウス造血細胞（図１Ｋ）およびヒト造血細胞（図１Ｌ）の増大倍率および生存能力を示す。

【図1L】図１Ｋおよび１Ｌは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間培養した後のマウス造血細胞（図１Ｋ）およびヒト造血細胞（図１Ｌ）の増大倍率および生存能力を示す。

【0094】

図１Ｆ～１Ｉ、１Ｋおよび１Ｌにおけるデータは、ｎ＝５の平均±ｓ．ｄ．であり、３回の独立した実験からの代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【0095】

【図1M】図１Ｍは、成長培地、ブランク、単一因子ＢＭＣおよび二重因子ＢＭＣにおいて数量化されたＬｉｎ^－共通リンパ系および骨髄系マウス前駆細胞の割合を示す。

【0096】

図１Ｂおよび１Ｃにおける画像および細孔サイズ数量化は、１０回の独立した反復実験の代表である。図１Ｄ、１Ｊおよび１Ｍにおけるデータは、５回の３３７回の実験的反復実験の平均±ｓ．ｄ．を示し、３回の独立した実験の代表である。別個の試料を個別にアッセイした。

【0097】

図２Ｂ～２Ｋは、ＢＭＣのｉｎ ｖｉｖｏにおける配置および宿主への組込みを示す。図２Ａ、２Ｌ、および３Ｂ～３Ｆは、ＢＭＣの広範なｉｎ ｖｉｖｏ特徴付けを示す。

【0098】

【図2A】図２Ａは、移植に使用するための系列枯渇前および系列枯渇後の骨髄細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す（５回の独立した実験）。

【0099】

【図2B】図２Ｂは、Ｌ－ＴＢＩ、ＨＳＣＴの投与およびＢＭＣの同時注射のスケジュールを示す。Ｂ６マウスに、１０００ｃＧｙ（１線量）を用いて照射処置し、その後、系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ後４８時間以内に５×１０^５個を移植した。

【0100】

【図2C】図２Ｃは、ＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４の種々の組合せをＢＭＣに含めて送達した後の時間に応じたｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢＭＣ小結節の体積を示す。

【0101】

【図2D】図２Ｄは、ＢＭＣ（赤色）内で同定されたドナーＧＦＰ＋細胞（緑色）の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0102】

【図2E-F】図２Ｅおよび２Ｆは、骨殻（緑色の矢印）および造血組織（黄色の矢印）を有する、注射の３週間後の二重機能化ＢＭＣの代表的なマイクロコンピュータ断層撮影法（ｍｉｃｒｏＣＴ、スケールバー＝１ｍｍ）画像化（図２Ｅ）および組織学的検査（スケールバー＝１ｍｍ）（図２Ｆ）を示す。

【0103】

【図2G】図２Ｇは、注射後種々の時点での皮下組織におけるＢＭＣ（青色）の画像を示す。

【0104】

【図2H-I】図２Ｈおよび２Ｉは、移植後１０日目、３０日目、４０日目および９０日目の、血管が同定された（青色の矢印）ＢＭＣの組織学的Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色切片（図２Ｈ）およびこれらの切片内の血管密度の数量化（図２Ｉ）を示す。

【0105】

【図2J】図２Ｊおよび２Ｋは、移植後１０日目、２０日目、４０日目、６０日目および９０日目の、アルギネートが同定された（赤色の糸様染色）ＢＭＣの組織学的Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色切片（図２Ｊ）およびこれらの切片内のアルギネートの接近可能領域の数量化（図２Ｋ）を示す。

【図2K】図２Ｊおよび２Ｋは、移植後１０日目、２０日目、４０日目、６０日目および９０日目の、アルギネートが同定された（赤色の糸様染色）ＢＭＣの組織学的Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色切片（図２Ｊ）およびこれらの切片内のアルギネートの接近可能領域の数量化（図２Ｋ）を示す。

【0106】

【図2L】図２Ｌは、移植後所定の時間間隔で皮下組織から抽出されたＢＭＣの端の画像を示す。ＢＭＣのコラーゲンとの境界（青色－緑色）および細胞との境界（黒色）が同定され、一部の切片では、Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色（１０×対物レンズ拡大率）を使用したアルギネート（赤色）が観察される。

【0107】

図２Ｃのデータは、５回の実験的反復実験の平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。図２Ｄ～２Ｇ、および２Ｊの画像は、４つの独立した試料の代表である。図２Ｉおよび２Ｋのデータは、８つの試料からの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎｓ、有意でない、チューキー事後検定を伴うＡＮＯＶＡ）。別個の試料を個別にアッセイした。図２Ｌのデータは、ｎ＝５の平均±ｓ．ｄ．であり、２回の独立した実験からの代表である。

【0108】

図３Ａ、および３Ｇ～３Ｐは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるドナー細胞のＢＭＣへの動員および胸腺前駆体の播種の増強を示す。

【0109】

【図3A】図３Ａは、ＢＭＰ－２とＤＬＬ－４の組合せを含有するＢＭＣおよびブランクＢＭＣにおけるドナー由来ＧＦＰ＋細胞の総数および型を示す。

【0110】

【図3B】図３Ｂは、移植後２８日目の骨髄およびＢＭＣ（二重およびＢＭＰ－２のみ）の代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す。ドナーＧＦＰ、骨髄系、ＨＳＣ、リンパ系予備刺激された多分化能前駆体（ＬＭＰＰ）、ＣＬＰおよび骨髄系前駆体が同定される。

【0111】

【図3C】図３Ｃは、ＢＭＣおよび内在性骨髄における宿主間葉系間質細胞ならびに代表的なフローサイトメトリープロットを示す。Ｓｃａ－１^＋前駆体がＣＤ４５^－細胞の画分として表されている。ＣＤ４４発現細胞、ＣＤ７３発現細胞、ＣＤ２９発現細胞、ＣＤ１０５発現細胞およびＣＤ１０６発現細胞がＳｃａ－１^＋前駆体の画分として表されている。

【0112】

【図3D】図３Ｄは、皮下注射後２０日目の骨およびＢＭＣにおける骨アルカリホスファターゼ（ｂＡＬＰ）およびＯｉｌ－ｒｅｄ－Ｏ（ＯＲＯ）の数量化を示す（ｎ＝６～７）。

【0113】

【図3E】図３Ｅは、移植後１０日目、３５日目および７０日目の移植のみのマウスおよび二重ＢＭＣで処置したマウス由来の骨髄細胞を使用したコロニー形成単位アッセイを示す。

【0114】

【図3F】図３Ｆは、回収されたＢＭＣにおけるホーミング因子ＳＤＦ－１αおよびリンパ球前駆体を支持するサイトカインＩＬ－７の濃度を示す。ＢＭＰ－２ ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウス、および二重ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウスを分析し、同じ群の骨髄におけるサイトカイン濃度と比較した。

【0115】

図３Ｃ～３Ｆのデータは、それぞれｎ＝４、ｎ＝７、ｎ＝４およびｎ＝４の平均±ｓ．ｄ．であり、２回の独立した実験からの代表である。図３Ｂのデータは、ｎ＝１０からであり、２回の独立した実験からの代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【0116】

【図3G】図３Ｇは、ＢＭＰ－２ＢＭＣおよび二重因子ＢＭＣにおけるドナーＧＦＰ＋ＣＬＰの絶対数およびＬｙ６Ｄ－ＣＬＰのパーセンテージを示す。

【0117】

【図3H】図３Ｈは、ＨＳＣＴ後のマウスから回収されたＢＭＣを亜致死量で照射したマウスに外科的移植するための実験構成の概略図を示す。

【0118】

【図3I】図３Ｉは、ＢＭＣの外科的移植の２０日後に胸腺において数量化されたダブルポジティブ（ＤＰ）、シングルポジティブ（ＳＰ）ＣＤ４＋およびＳＰ ＣＤ８＋細胞を示す。

【0119】

【図3J】図３Ｊは、移植後の多数の時点における最も低い細胞用量を用いたＢＭＣ処置と比較した系列枯渇移植された細胞用量に応じて数量化された初期Ｔ系列前駆体（ＥＴＰ；ＣＤ４４＋ＣＤ２５－ｃ－ｋｉｔ＋）の総数と、代表的なＦＡＣＳプロットを示す（各時点で５回の実験的反復実験、２回の独立した実験）。

【0120】

【図3K-M】図３Ｋ～３Ｐは、移植後の多数の時点における、異なる処置条件にわたって比較した初期Ｔ系列前駆体（ＥＴＰ；ＣＤ４４＋ＣＤ２５－ｃ－ｋｉｔ＋）、ＤＮ２（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＮ３（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８胸腺細胞サブセットの総数を示す。

【図3N-O】図３Ｋ～３Ｐは、移植後の多数の時点における、異なる処置条件にわたって比較した初期Ｔ系列前駆体（ＥＴＰ；ＣＤ４４＋ＣＤ２５－ｃ－ｋｉｔ＋）、ＤＮ２（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＮ３（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８胸腺細胞サブセットの総数を示す。

【図3P】図３Ｋ～３Ｐは、移植後の多数の時点における、異なる処置条件にわたって比較した初期Ｔ系列前駆体（ＥＴＰ；ＣＤ４４＋ＣＤ２５－ｃ－ｋｉｔ＋）、ＤＮ２（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＮ３（ＣＤ４４＋ＣＤ２５－）、ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８胸腺細胞サブセットの総数を示す。

【0121】

図３Ａ、３Ｇ、および３Ｋ～３Ｐに関しては、マウスに、５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ ３７５（１×１０００ｃＧｙ）後４８時間以内に移植した。図３Ｈおよび３Ｉでは、最初のマウスのセットには、５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ後４８時間以内に移植した。その後のマウスのセットはＳＬ ＴＢＩ（１×５００ｃＧｙ）を受け、その後の細胞移植は伴わなかった。図３Ｊでは、マウスに、５×１０^４個～５×１０^５個の系列枯渇ＧＦＰ細胞を移植した。図３Ａでは、全群を移植のみの対照と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。図３Ａのデータは、群当たり１０匹のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である。図３Ｇ、および３Ｉ～３Ｐのデータは、図３Ｉ～３Ｐの各時点での群当たり５匹のマウスからの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である。比較は、図３Ｊでは最も低い細胞用量群に対するものであり、図３Ｉ～３Ｐでは移植のみの群に対するものであった（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜３８５ ０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。別個の試料を個別にアッセイした。

【0122】

図３Ｑ～３Ｔは、移植後の胸腺の細胞充実性および重量の広範な特徴付けを示す。Ｂ６マウスに、１×１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩ線量を照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ後４８時間以内に移植し、図に記載されている通り処置した。

【0123】

【図3Q】図３Ｑは、移植の３２日後および４２日後に数量化された総胸腺細胞を示す。

【0124】

【図3R】図３Ｒは、ＨＳＣＴの１２日後から４２日後の間に数量化された胸腺の重量を示す。

【0125】

【図3S】図３Ｓは、ＨＳＣＴの２２日後に数量化したｍＴＥＣ、ｃＴＥＣ、線維芽細胞および内皮細胞を示す。

【0126】

【図3T】図３Ｔは、ＨＳＣＴの２２日後の、異なる処置条件にわたって比較した初期Ｔ系列前駆体（ＥＴＰ；ＣＤ４４^＋ＣＤ２５^－ｃ－ｋｉｔ^＋）、ＤＮ２（ＣＤ４４^＋ＣＤ２５^－）、ＤＮ３（ＣＤ４４^＋ＣＤ２５^－）、ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８胸腺細胞サブセットの総数を示す。

【0127】

ＢＭＣなし（移植のみ）のＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２ ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウス、および二重ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウスの胸腺を回収し、秤量し、照射処置していないマウスと比較した。図３Ｑ、３Ｓ、および３Ｔにおける全群を移植のみの対照と比較する。ＨＳＣＴの１０日後、ＢＭＣを外植し、５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを照射したＢ６マウスの第２のセットの皮下ポケットに外科的に入れた。値は絶対数として表されている。図３Ｑ～３Ｔのデータは、各時点における群当たり５匹のマウスからの平均±ｓ．ｄ．を表し、少なくとも２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【0128】

図４Ａ、および４Ｄ～４Ｌは、ＢＭＣによって媒介されるＴ細胞再構成の増強を示す。図４Ｂ、４Ｃ、４Ｍ、および４Ｎは、ＨＳＣＴ後の血液細胞分析の広範な特徴付けを示す。

【0129】

【図4A】図４Ａは、ＨＳＣＴ後のマウスの末梢血におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の合計を示す。Ｂ６マウスに１×１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩ線量を照射した。マウスにその後、５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ後４８時間以内に移植し、図に示されている通り処置した。

【0130】

【図4B】図４Ｂは、５回の独立した実験からの、ＧＦＰ＋ドナー造血幹細胞および前駆細胞を移植したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＨＳＣＴ後の免疫細胞再構成を測定するための代表的なＦＡＣＳゲーティング戦略を示す

【0131】

【図4C】図４Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢ細胞および骨髄細胞の再構成を示す。Ｂ６マウスに、１×１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩ線量を照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞をＬ－ＴＢＩ後４８時間以内に移植した。ＢＭＣなし（移植のみ）のＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２ ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウス、および二重ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウスの末梢血を分析し、測定された数を放射線前の免疫細胞濃度と比較した。

【0132】

【図4D】図４Ｄ～４Ｆは、血液（図４Ｄ）、脾臓（図４Ｅ）および骨髄（図４Ｆ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の比の回復の測定を、時間に応じて示す。図４Ａにおけるものと同様に同じ群との比較に関して照射処置していないマウスを伴う。図４Ａおよび４Ｄ～４Ｆでは、ＢＭＣなし（移植のみ）で処置したＨＳＣＴ後のマウス、ボーラスＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４注射で処置したＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２を含有するＢＭＣ（ＢＭＰ－２ ＢＭＣ）で処置したＨＳＣＴ後のマウス、またはＢＭＰ－２およびＤＬＬ４を含有するＢＭＣ（二重ＢＭＣ）で処置したＨＳＣＴ後のマウスを分析した。

【図4E-F】図４Ｄ～４Ｆは、血液（図４Ｄ）、脾臓（図４Ｅ）および骨髄（図４Ｆ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の比の回復の測定を、時間に応じて示す。図４Ａにおけるものと同様に同じ群との比較に関して照射処置していないマウスを伴う。図４Ａおよび４Ｄ～４Ｆでは、ＢＭＣなし（移植のみ）で処置したＨＳＣＴ後のマウス、ボーラスＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４注射で処置したＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２を含有するＢＭＣ（ＢＭＰ－２ ＢＭＣ）で処置したＨＳＣＴ後のマウス、またはＢＭＰ－２およびＤＬＬ４を含有するＢＭＣ（二重ＢＭＣ）で処置したＨＳＣＴ後のマウスを分析した。

【0133】

【図4G-H】図４Ｇ～４Ｌでは、Ｂ６マウスに５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇骨髄細胞を放射線後４８時間以内に移植した。移植の２８日後に二重ＢＭＣを用いた処置を行ったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウス、および二重ＢＭＣを用いた処置を行わなかったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウスの脾臓におけるＤＰ胸腺細胞（図４Ｇ）ＳＰ４胸腺細胞（図４Ｈ）およびＳＰ８胸腺細胞（図４Ｉ）ならびに末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ｊ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｋ）およびＢ細胞（図４Ｌ）の総数。図４Ａ、４Ｄ～４Ｆのデータは、各時点について群当たりｎ＝８のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、少なくとも３回の独立した実験の代表である。図４Ｇ～４Ｌのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【図4I-J】図４Ｇ～４Ｌでは、Ｂ６マウスに５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇骨髄細胞を放射線後４８時間以内に移植した。移植の２８日後に二重ＢＭＣを用いた処置を行ったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウス、および二重ＢＭＣを用いた処置を行わなかったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウスの脾臓におけるＤＰ胸腺細胞（図４Ｇ）ＳＰ４胸腺細胞（図４Ｈ）およびＳＰ８胸腺細胞（図４Ｉ）ならびに末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ｊ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｋ）およびＢ細胞（図４Ｌ）の総数。図４Ａ、４Ｄ～４Ｆのデータは、各時点について群当たりｎ＝８のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、少なくとも３回の独立した実験の代表である。図４Ｇ～４Ｌのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【図4K-L】図４Ｇ～４Ｌでは、Ｂ６マウスに５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇骨髄細胞を放射線後４８時間以内に移植した。移植の２８日後に二重ＢＭＣを用いた処置を行ったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウス、および二重ＢＭＣを用いた処置を行わなかったＳＬ－ＴＢＩ ｓｙｎ－ＨＳＣＴマウスの脾臓におけるＤＰ胸腺細胞（図４Ｇ）ＳＰ４胸腺細胞（図４Ｈ）およびＳＰ８胸腺細胞（図４Ｉ）ならびに末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ｊ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｋ）およびＢ細胞（図４Ｌ）の総数。図４Ａ、４Ｄ～４Ｆのデータは、各時点について群当たりｎ＝８のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、少なくとも３回の独立した実験の代表である。図４Ｇ～４Ｌのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表し、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【0134】

【図4M】図４Ｍは、ＢＭで処置したマウスおよび移植のみのマウスにおける移植後２８日目の胸腺細胞（ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８）および脾細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂ２２０＋）におけるドナーおよび宿主キメラ化のＨＳＣＴ後の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0135】

【図4N】図４Ｎは、移植の２８日後に亜致死的に照射処置したマウスにおける宿主キメラ化（ＣＤ４５．２）およびドナーキメラ化（ＣＤ４５．１）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。

【0136】

図４Ｍおよび４Ｎでは、Ｂ６マウスに５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを照射し、その後、５×１０^５個の系列枯渇骨髄細胞を放射線後４８時間以内に移植した。１つの群はＢＭＣで処置した。図４Ｃのデータは、各時点における群当たり５匹のマウスからの平均±ｓ．ｄ．を表す。図４Ｃ、４Ｍ、および４Ｎのデータは、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【0137】

図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ～５Ｇ、５Ｉ、５Ｊ、および５Ｌ～５Ｐは、ＮＳＧ－ＢＬＴマウスおよび同種ＨＳＣＴ後のマウスにおけるＴ細胞の再構成の増強およびＧＶＨＤの軽減を示す。図５Ｈ、５Ｋ、および５Ｑは、ＢＭＣにより生成されたＴ細胞および培養により生成されたＴ細胞前駆体の広範なフローサイトメトリー特徴付けを示す。

【0138】

【図5A-B】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｄは、例示的なフローサイトメトリープロットを伴う、７５日目のヒト化ＮＳＧ－ＢＬＴマウスにおける、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比（図５Ｄ）でのＣＤ３＋Ｔ細胞の再構成（図５Ａ）およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の再構成（図５Ｂ）を示す。

【0139】

【図5C】図５Ｃは、ＮＳＧ－ＢＬＴマウスにおける血液細胞分析の広範な特徴付けを示す。図５Ｃは、移植後の２つの時点での、ＢＭＣ処置を行ったまたは行っていないＮＳＧ－ＢＬＴマウスの骨髄から数量化されたプレＢ ＣＦＵを示す。データは、ｎ＝４の平均±ｓ．ｄ．であり、１つの実験における単一のドナーに由来するものである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【図5D】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｄは、例示的なフローサイトメトリープロットを伴う、７５日目のヒト化ＮＳＧ－ＢＬＴマウスにおける、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比（図５Ｄ）でのＣＤ３＋Ｔ細胞の再構成（図５Ａ）およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の再構成（図５Ｂ）を示す。

【0140】

【図5E】図５Ｅは、７５日目の例示的なフローサイトメトリープロットである。

【0141】

【図5F】図５Ｆおよび５Ｇは、ＮＳＧ－ＢＬＴマウスの生存率（群当たりｎ＝１０）（図５Ｆ）ならびにＮＳＧ－ＢＬＴマウスの胸腺および脾臓におけるヒト制御性Ｔ細胞の再構成（図５Ｇ）を示す。

【図5G】図５Ｆおよび５Ｇは、ＮＳＧ－ＢＬＴマウスの生存率（群当たりｎ＝１０）（図５Ｆ）ならびにＮＳＧ－ＢＬＴマウスの胸腺および脾臓におけるヒト制御性Ｔ細胞の再構成（図５Ｇ）を示す。

【0142】

図５Ａ、５Ｂ、および５Ｄ～５Ｇでは、異種ヒト化ＢＬＴ（骨髄－肝臓－胸腺）マウスを生成し、以前に記載されている通り使用した（Brainard, D.M. et al., Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of virology 83, 7305-7321 (2009)）。同じ供給源由来のヒトドナー組織を有する、ＢＭＣなし（ＮＳＧ－ＢＬＴ）のマウスおよび二重ＢＭＣ（ＮＳＧ－ＢＬＴ＋二重ＢＭＣ）のマウスを分析した。

【0143】

【図5H】図５Ｈは、ＣＤ４^＋細胞の中でのＦｏｘＰ３^＋細胞ならびに胸腺および脾臓におけるＴ_ｒｅｇ細胞を同定するために使用したアイソタイプの代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す（３回の独立した実験）。

【0144】

【図5I-J】図５Ｉおよび５Ｊは、同種移植したＢａｌｂ／ｃマウスの胸腺および脾臓におけるドナー由来の制御性Ｔ細胞の生存率（図５Ｉ）および再構成（図５Ｊ）を示す。図５Ｉおよび５Ｊでは、ＢＡＬＢ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ｃＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせた。放射線後４８時間以内に、マウスに同種ＧＦＰ ５×１０^５個の系列枯渇ＧＦＰ ＢＭ細胞＋１０^６個のＧＦＰ脾細胞を移植した。１つの群は同時に二重ＢＭＣで処置した。

【0145】

【図5K】図５Ｋは、ＯＰ９－ＤＬ１細胞と共培養した１４日後の選別されたＨＳＣ（Ｌｉｎ－ｃｋｉｔ^＋Ｓｃａ－１^＋）およびＣＤ４４／ＣＤ２５発現Ｔ細胞前駆体の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す（２回の独立した実験）。

【0146】

【図5L】図５Ｌ～５Ｐは、ＢＭＣまたはＯＰ９－ＤＬ１由来プロＴ細胞を用いて処置したマウスにおけるＴ細胞再構成の比較を示す。Ｂａｌｂ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせ、ＯＰ９－ＤＬ１培養物由来の同種ＧＦＰ Ｔ細胞前駆体５×１０^６個＋同系ＨＳＣ １０^３個または二重ＢＭＣ＋系列枯渇同種ＧＦＰ ＢＭ細胞５×１０^５個のいずれかを与えた。移植を受けたマウス４２４における移植の２８日後の胸腺のＤＰ胸腺細胞（図５Ｌ）およびＳＰ４胸腺細胞（図５Ｍ）およびＳＰ８胸腺細胞（図５Ｎ）ならびに脾臓における末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図５Ｏ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｐ）の総数。ａ～ｄのデータは、４２５試験の開始時のｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、３匹のドナーの代表である。

【図5M-N】図５Ｌ～５Ｐは、ＢＭＣまたはＯＰ９－ＤＬ１由来プロＴ細胞を用いて処置したマウスにおけるＴ細胞再構成の比較を示す。Ｂａｌｂ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせ、ＯＰ９－ＤＬ１培養物由来の同種ＧＦＰ Ｔ細胞前駆体５×１０^６個＋同系ＨＳＣ １０^３個または二重ＢＭＣ＋系列枯渇同種ＧＦＰ ＢＭ細胞５×１０^５個のいずれかを与えた。移植を受けたマウス４２４における移植の２８日後の胸腺のＤＰ胸腺細胞（図５Ｌ）およびＳＰ４胸腺細胞（図５Ｍ）およびＳＰ８胸腺細胞（図５Ｎ）ならびに脾臓における末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図５Ｏ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｐ）の総数。ａ～ｄのデータは、４２５試験の開始時のｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、３匹のドナーの代表である。

【図5O-P】図５Ｌ～５Ｐは、ＢＭＣまたはＯＰ９－ＤＬ１由来プロＴ細胞を用いて処置したマウスにおけるＴ細胞再構成の比較を示す。Ｂａｌｂ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせ、ＯＰ９－ＤＬ１培養物由来の同種ＧＦＰ Ｔ細胞前駆体５×１０^６個＋同系ＨＳＣ １０^３個または二重ＢＭＣ＋系列枯渇同種ＧＦＰ ＢＭ細胞５×１０^５個のいずれかを与えた。移植を受けたマウス４２４における移植の２８日後の胸腺のＤＰ胸腺細胞（図５Ｌ）およびＳＰ４胸腺細胞（図５Ｍ）およびＳＰ８胸腺細胞（図５Ｎ）ならびに脾臓における末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞（図５Ｏ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｐ）の総数。ａ～ｄのデータは、４２５試験の開始時のｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、３匹のドナーの代表である。

【0147】

図５Ｇおよび５Ｊのデータは、ｎ＝７のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。図５Ｉのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。図５Ｇ、５Ｉ、および５Ｊのデータは、２回の独立した実験の代表である。図５Ｌ～５Ｐのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、２回の独立した実験の代表である。別個の試料を個別にアッセイした（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）４２９）。

【0148】

【図5Q】図５Ｑは、ｃｋｉｔ、および胸腺におけるＥＴＰを同定するために使用したアイソタイプの代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す。

【0149】

図６Ａ～６Ｈは、Ｔ細胞出力の定量的分析、免疫レパートリーおよびマウスにおける再生Ｔ細胞を用いたワクチン接種を示す。

【0150】

【図6A-B】図６Ａおよび６Ｂは、マウスにおける（ａ）単離された胸腺（図６Ａ）および脾臓（図６Ｂ）のシグナルジョイントＴ細胞受容体切除サークル（ｓｊＴＲＥＣ）分析を示す。

【0151】

【図6C】図６Ｃは、ＢＭＣおよび移植マウスにおける配列決定されたＣＤＲ３ベータ鎖のＶおよびＪセグメントによって分析されたＴ細胞の抗原受容体の多様性を示す。各棒は単一のクローンを表す。プロットはマウスにおけるＴ細胞の深さ（棒の長さ）および多様性（棒の数）を提示する。試料を各群についてマウス５匹からプールし、複合データが表されている。

【0152】

【図6D】図６Ｄは、ワクチン接種による抗原特異的ドナーＴ細胞応答の分析のスケジュールを示す。

【0153】

【図6E】図６Ｅおよび６Ｆは、ｓｙｎ－ＨＳＣＴ（図６Ｅ）およびアロＨＳＣＴ（図６Ｆ）後にワクチン接種したマウスにおいて数え上げられたＳＩＩＮＦＥＫＬ－四量体^＋ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。

【図6F】図６Ｅおよび６Ｆは、ｓｙｎ－ＨＳＣＴ（図６Ｅ）およびアロＨＳＣＴ（図６Ｆ）後にワクチン接種したマウスにおいて数え上げられたＳＩＩＮＦＥＫＬ－四量体^＋ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。

【0154】

【図6G】図６Ｇおよび６Ｈは、ＨＳＣＴ後２２日目および４２日目に、４４０のＯＰ９－ＤＬ１Ｔ細胞前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）群および二重のＢＭＣ処置群の脾細胞を刺激し、表面マーカーおよび細胞内サイトカインについて、ＣＤ４５．１に特異的な抗体、ＣＤ４に特異的な抗体、ＩＦＮ－γに特異的な抗体およびＴＮＦ－αに特異的な抗体を使用して染色したことを示す。細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋ドナー細胞に対してゲーティングし、ＩＦＮ－γ陽性細胞およびＴＮＦ－α陽性細胞について分析した。図６Ａ～６Ｃおよび６Ｅでは、Ｂ６レシピエントに１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩおよび５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞を受けさせた。ＢＭＣなし（移植のみ）のＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２ ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウス、および二重ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウスを分析し、移植もワクチンを受けていない照射処置していないマウスと比較した。図６Ｂでは、ｓｊＴＲＥＣを１０^５個のＣＤ４^＋脾細胞に対して正規化する。図６Ｆ～６Ｈでは、Ｂａｌｂ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせ、ＯＰ９－ＤＬ１培養物由来の同種ＧＦＰ Ｔ細胞前駆体５×１０^６個＋同系ＨＳＣ １０^３個または二重ＢＭＣ＋系列枯渇同種ＧＦＰ ＢＭ細胞５×１０^５個のいずれかを与えた。図６Ａおよび６Ｂのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、図６Ｅおよび６Ｆのデータは、ｎ＝５のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、図６Ｇおよび６Ｈのデータは、ｎ＝７のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。全ての実験は、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【図6H】図６Ｇおよび６Ｈは、ＨＳＣＴ後２２日目および４２日目に、４４０のＯＰ９－ＤＬ１Ｔ細胞前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）群および二重のＢＭＣ処置群の脾細胞を刺激し、表面マーカーおよび細胞内サイトカインについて、ＣＤ４５．１に特異的な抗体、ＣＤ４に特異的な抗体、ＩＦＮ－γに特異的な抗体およびＴＮＦ－αに特異的な抗体を使用して染色したことを示す。細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋ドナー細胞に対してゲーティングし、ＩＦＮ－γ陽性細胞およびＴＮＦ－α陽性細胞について分析した。図６Ａ～６Ｃおよび６Ｅでは、Ｂ６レシピエントに１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩおよび５×１０^５個の系列枯渇同系ＧＦＰ ＢＭ細胞を受けさせた。ＢＭＣなし（移植のみ）のＨＳＣＴ後のマウス、ＢＭＰ－２ ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウス、および二重ＢＭＣを用いて処置したＨＳＣＴ後のマウスを分析し、移植もワクチンを受けていない照射処置していないマウスと比較した。図６Ｂでは、ｓｊＴＲＥＣを１０^５個のＣＤ４^＋脾細胞に対して正規化する。図６Ｆ～６Ｈでは、Ｂａｌｂ／ｃＪレシピエントマウスに８５０ＧｙのＬ－ＴＢＩを受けさせ、ＯＰ９－ＤＬ１培養物由来の同種ＧＦＰ Ｔ細胞前駆体５×１０^６個＋同系ＨＳＣ １０^３個または二重ＢＭＣ＋系列枯渇同種ＧＦＰ ＢＭ細胞５×１０^５個のいずれかを与えた。図６Ａおよび６Ｂのデータは、ｎ＝１０のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、図６Ｅおよび６Ｆのデータは、ｎ＝５のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、図６Ｇおよび６Ｈのデータは、ｎ＝７のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。全ての実験は、２回の独立した実験の代表である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、チューキー事後検定を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【発明を実施するための形態】

【0155】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解することができるように、ある特定の用語を、最初に定義する。

【0156】

本明細書に別途定義されない限り、本発明と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。用語の意味および趣旨は、明確であるべきだが、しかしながら、潜在的曖昧さがある場合には、本明細書に提供される定義が、任意の辞書または外部の定義よりも優先される。

【0157】

本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」という用語、ならびに類似の参照物の使用は、本明細書において別途示されるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方（すなわち、１つまたは複数）を含むと解釈されるものとする。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、および「含む（containing）」という用語は、別途示されない限り、拡張可能であると解釈されるものとする（すなわち、「含むが限定されない」ことを意味する）。本明細書における値の範囲に関する記述は、本明細書に別途示されない限り、単純に、列挙されたかまたはその範囲内に入るそれぞれの別個の値を個別に参照する簡略化された方法としての機能を果たすことを意図し、それぞれの別個の値は、それが個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0158】

「約」または「およそ」という用語は、通常、所与の値または範囲の５％以内、またはより好ましくは１％以内を意味する。

【0159】

一般に、「処置」または「処置すること」という用語は、疾患、疾患の症状、または疾患の素因を治癒（cure）、治癒（heal）、軽減、解放、変更、治療、緩和、改善、または影響する目的での、患者への治療剤の付与もしくは投与、または患者に由来する単離された組織もしくは細胞系への治療剤の付与もしくは投与として定義され、前記患者は、疾患、疾患の症状、または疾患の素因を有する。したがって、処置することには、抑制すること、阻害すること、予防すること、処置すること、またはこれらの組合せが含まれ得る。処置することとは、とりわけ、持続的な進行までの時間を長引かせること、寛解を早めること、寛解を誘導すること、寛解を増大させること、回復を加速させること、代替的な治療法の有効性を増加させるかもしくはそれに対する耐性を減少させること、またはこれらの組合せを指す。「抑制すること」または「阻害すること」とは、とりわけ、症状の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの回数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の期間を長引かせること、症状の重症度を低減させること、急性エピソードの重症度を低減させること、症状の数を低減させること、疾患関連症状の発生を低減させること、症状の持続期間を低減させること、症状を緩和すること、続発性症状を低減させること、二次感染を低減させること、患者の生存期間を延長すること、またはこれらの組合せを指す。一実施形態では、症状は、原発性であるが、別の実施形態では、症状は続発性である。「原発性」とは、障害、例えば、糖尿病の直接的な結果である症状を指し、一方で続発性とは、一次的原因に由来するかまたはその結果である症状を指す。症状は、疾患または病態の任意の顕在化であり得る。

【0160】

したがって、本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」という用語は、本明細書に記載される組成物の任意の投与を含み、（ｉ）疾患の素因があり得るが疾患の病理もしくは症候を経験しておらず、それを示してもいない対象において、疾患が発生するのを予防すること、（ｉｉ）疾患の病理もしくは症候を経験しているか、もしくはそれを示している対象において、疾患を阻害すること（すなわち、病理および／もしくは症候のさらなる発達を停止させること）、または（ｉｉｉ）疾患の病理もしくは症候を経験しているか、もしくはそれを示している対象において、疾患を緩和すること（すなわち、病理および／もしくは症候を逆転させること）が含まれる。

【0161】

疾患または障害の「処置」、「予防」、または「緩和」は、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防すること、そのような疾患または障害と関連する状態の進行、悪化または増悪、その症状の進行または重症度を逆転、軽減、緩和、阻害、遅延、または停止させることである。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。

【0162】

処置の有効性は、障害を診断するための任意の公知の方法と関連して判定される。障害の１つまたは複数の症状の軽減は、組成物が臨床上の有益性を付与することを示す。上記の治療方法のうちのいずれかを、例えば、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトを含む、任意の好適な対象に適用することができる。

【0163】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明のヒドロゲルまたは埋込み可能な薬物送達デバイスを投与することにより利益を得ることができる任意の対象を含む。「対象」という用語は、動物、例えば、脊椎動物、両生類、魚類、哺乳動物、非ヒト動物が含まれ、ヒトおよび霊長類、例えば、チンパンジー、サルなどが含まれる。本発明の一実施形態では、対象は、ヒトである。

【0164】

「対象」という用語には、生産用家畜、例えば、畜牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ロバ、ラクダ、バッファロー、ウサギ、ニワトリ、七面鳥、カモ、ガチョウ、およびハチ、ならびに家庭のペット、例えば、イヌ、ネコ、飼育されている鳥、および観賞魚、ならびに同様にいわゆる試験動物、例えば、ハムスター、モルモット、ラット、およびマウスも含まれる。

【0165】

ＩＩ．免疫系をモジュレートするための組成物
本発明は、対象の免疫系をモジュレートする組成物および方法を特徴とする。本発明の組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールドに細胞を動員するおよび／または組織もしくは器官の形成を誘導するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む。

【0166】

本発明の組成物および方法は、先行技術に優る利点を提供する。例えば、本発明の組成物および方法は、胸腺のＴ細胞前駆体シーディング、Ｔ細胞新生、およびＴ細胞受容体レパートリーの広範化を増強させる。さらに、本発明の組成物および方法は、同種ＨＳＣＴ後のドナーＣＤ４＋制御性Ｔ細胞生成および生存期間の改善を促進する。Ｔ細胞前駆体の養子移入と比較して、本発明の組成物および方法は、ドナーキメラ化、Ｔ細胞生成を増加させ、刺激に対してより強力な抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する。本発明の組成物は、Ｔ細胞再生およびＨＳＣＴにおけるＧＶＨＤの軽減に対する、投与が容易な既製のアプローチを表し得る。

【0167】

ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法はまた、当該技術分野において教示されるものと比較して、有意に低減されたレベルの増殖因子、例えば、１ｎｇ～約１０００μｇの増殖因子、または１ｎｇ～約１０００ｎｇの増殖因子の使用から生じる毒性を低減する。加えて、本発明の組成物および方法は、驚くほど増強された活性を呈し、それによって、低減された数の細胞を移植した際にも同等の有効性が可能である。

【0168】

スキャフォールド
本発明の組成物は、スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドを含む。スキャフォールドは、１つまたは複数の生体材料を含み得る。好ましくは、生体材料は、非毒性である、かつ／または非免疫原性である、生体適合性材料である。本明細書で使用される場合、「生体適合性材料」は、対象の生体組織内に埋め込まれるかまたはそれに隣接して配置された場合に、経時的に有意な免疫応答も有害な組織反応も、例えば、毒性反応も有意な刺激も誘導しない、任意の材料を指す。

【0169】

スキャフォールドは、非生体分解性または生体分解性である生体材料を含み得る。ある特定の実施形態では、生体材料は、非生体分解性材料であってもよい。例示的な非生体分解性材料としては、金属、プラスチックポリマー、またはシルクポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、生体分解性材料を含む。生体分解性材料は、物理的もしくは化学的作用、例えば、水和のレベル、熱、酸化、もしくはイオン交換、または付近の細胞もしくは存在細胞による細胞作用、例えば、酵素、ペプチド、もしくは他の化合物の同化によって、分解され得る。ある特定の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、非分解性材料および分解性材料の両方を含み得る。

【0170】

一部の実施形態では、スキャフォールド組成物は、温度、ｐＨ、水和状態、および細孔性、架橋密度、種類、およびケミストリー、または主鎖連結の分解に対する感受性からなる群から選択される、物理的パラメーターに基づいて、所定の速度で分解され得る。あるいは、スキャフォールド組成物は、化学的ポリマー比に基づいて、所定の速度で分解される。例えば、単にラクチドから構成される高分子量ポリマーは、数年間の期間、例えば、１～２年間にわたって分解され、一方でラクチドとグリコリドの５０：５０混合物から構成される低分子量ポリマーは、数週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、または１０週間のうちに分解される。高分子量高グルロン酸アルギネートから構成されるカルシウム架橋ゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、数ヶ月間（１ヶ月間、２ヶ月間、４ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、１０ヶ月間、または１２ヶ月間）から数年間（１年間、２年間、または５年間）で分解され、一方で低分子量アルギネートおよび／または部分的に酸化されたアルギネートから構成されるゲルは、数週間のうちに分解されるであろう。

【0171】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物またはタンパク質（例えば、増殖因子、分化因子、およびホーミング因子）は、共有結合または非共有結合により、スキャフォールド組成物に連結または結合される。様々な実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物またはタンパク質は、スキャフォールド組成物の構造または細孔に組み込まれるか、またはその中に存在する。

【0172】

一部の実施形態では、スキャフォールドは、改変された、例えば、酸化または還元された、生体材料を含む。改変、例えば、酸化の程度は、約１％～約１００％で変動し得る。本明細書で使用される場合、改変の程度は、官能基で改変された生体材料上の部位のモルパーセンテージを意味する。例えば、改変の程度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。例示的な改変された生体材料、例えば、ヒドロゲルとしては、還元アルギネート、酸化アルギネート、ＭＡ－アルギネート（メタクリル化アルギネート）、またはＭＡ－ゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0173】

本発明においてスキャフォールドとして使用するのに好適な例示的な生体材料としては、グリコサミノグリカン、シルク、フィブリン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリｅ－カルポラクトン（carpolactone）（ＰＣＬ）、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンフマレート（ＰＰＦ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリヒドロキシ酪酸、加水分解ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸、ポリエチレンアミン、アルギン酸のエステル；ペクチニン酸；およびアルギネート、完全もしくは部分酸化アルギネート、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キトサン、カルボキシメチルキトサン、キチン、プルラン、ジェラン、キサンタン、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、コンドロイチン硫酸、カチオン性グアー、カチオン性デンプン、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、生体材料は、アルギネート、完全または部分酸化アルギネート、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

【0174】

本発明のスキャフォールドは、外部表面を含み得る。代替として、または追加として、スキャフォールドは、内部表面を含み得る。本発明のスキャフォールドの外部表面または内部表面は、固形であっても多孔性であってもよい。スキャフォールドの細孔サイズは、直径が約１０ｎｍ未満、約１００ｎｍ～２０μｍ、または約２０μｍを上回る、例えば、最大１０００μｍであり得る。例えば、細孔は、ナノ細孔性、マイクロ細孔性、またはマクロ細孔性であり得る。例えば、ナノ細孔の直径は、約１０ｎｍ未満であり、マイクロ細孔の直径は、約１００ｎｍ～２０μｍの範囲であり、マクロ細孔の直径は、約２０μｍを上回る、例えば、約５０μｍを上回る、例えば、約１００μｍを上回る、例えば、約４００μｍを上回る、例えば、６００μｍを上回るか、または８００μｍを上回る。一部の実施形態では、細孔の直径は、約５０μｍ～約８０μｍである。

【0175】

一部の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、様々な幾何形状（例えば、ディスク、ビーズ、ペレット）、ニッチ、平面層（例えば、薄シート）で組織化されている。例えば、直径が約０．１～２００ミリメートル、例えば、５、１０、２０、４０、または５０ミリメートルのディスクが、皮下に埋め込まれてもよい。ディスクは、０．１～１０ミリメートル、例えば、１、２、または５ミリメートルの厚さを有し得る。ディスクは、患者への投与のために容易に圧縮または凍結乾燥される。皮下投与のための例示的なディスクは、以下の寸法を有する：８ミリメートルの直径および１ミリメートルの厚さ。

【0176】

一部の実施形態では、スキャフォールドは、複数の構成要素および／またはコンパートメントを含み得る。ある特定の実施形態では、複数コンパートメントのデバイスは、同様にまたは異なってドープされたゲルまたは他のスキャフォールド材料の連続した層を標的部位に付与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでアセンブルされる。例えば、デバイスは、ニードルを使用して、前に注射した材料の中心に次の内部層を順に注射し、それによって同心回転楕円体を形成することによって、形成される。ある特定の実施形態では、材料を前に注射した層の異なる位置に注射することによって、非同心コンパートメントが、形成される。複数ヘッドの注射デバイスは、コンパートメントを並行かつ同時に押出成形する。層は、医薬組成物が異なってドープされた類似または異なる生体材料から作製される。あるいは、コンパートメントは、その親水性／疎水性特徴またはそれぞれのコンパートメント内の二次相互作用に基づいて、自己組織化される。ある特定の実施形態では、複数構成要素のスキャフォールドは、必要に応じて、層のそれぞれが異なる物理的性質、例えば、ポリマーのパーセンテージ、ポリマーの架橋のパーセンテージ、ヒドロゲルの化学組成、細孔寸法、細孔性、および細孔アーキテクチャ、剛性、靭性、延性、粘弾性、中に組み込まれる増殖因子、分化因子、および／もしくはホーミング因子、ならびに／または中に組み込まれる任意の他の組成物によって特徴付けられる、複数の同心層に構築される。

【0177】

ヒドロゲルおよびクリオゲルスキャフォールド
ある特定の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、１つまたは複数のヒドロゲルを含む。ヒドロゲルは、架橋したポリマー鎖のネットワークを含むポリマーゲルである。ヒドロゲルは、通常、親水性であるポリマー鎖を含む組成物である。ヒドロゲルのネットワーク構造は、それらが有意な量の水を吸収することを可能にしている。一部のヒドロゲルは、高度に伸縮性かつ弾性であり、その他には、粘弾性のものがある。ヒドロゲルは、水が分散媒であるコロイドゲルとして見いだされることもある。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、その有意な含水量に起因して、高度に吸収性の（９９％を上回る水（体積／体積）を含有し得る）天然ポリマーまたは天然組織と極めて似た程度の可撓性を有する合成ポリマーである。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、適切なせん断応力が印加されると、変形可能なヒドロゲルが劇的かつ可逆的に圧縮され（最大でその体積の９５％）、注射可能なマクロ細孔が事前形成されたスキャフォールドが得られる特性を有し得る。ヒドロゲルは、治療適用に、例えば、治療剤、例えば、小分子、細胞、および生物製剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのビヒクルとして、使用されている。ヒドロゲルは、一般に多糖類、例えば、アルギネートから産生されている。多糖類は、それらの特性および結果として得られるヒドロゲルの特性をモジュレートするように化学的に操作されていてもよい。

【0178】

本発明のヒドロゲルは、多孔性であっても非多孔性であってもよい。好ましくは、本発明の組成物は、多孔性ヒドロゲルから形成される。例えば、ヒドロゲルは、細孔の直径が約１０ｎｍ未満であるナノ細孔性であってもよく、細孔の直径が好ましくは約１００ｎｍ～２０μｍであるマイクロ細孔性であってもよく、または細孔の直径が約２０μｍを上回る、より好ましくは約１００μｍを上回る、さらにより好ましくは約４００μｍを上回る、マクロ細孔性であってもよい。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、直径が約５０～８０μｍの細孔を有するマクロ細孔性である。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、直径が約４００～５００μｍの整列した細孔を有するマクロ細孔性である。多孔性ヒドロゲル製品を調製する方法は、当該技術分野において公知である。（例えば、米国特許第６，５１１，６５０号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。

【0179】

ヒドロゲルは、いくつかの異なる剛性、半剛性、可撓性、ゲル状の自己アセンブルする液晶または流体組成物、例えば、ペプチドポリマー、多糖類、合成ポリマー、ヒドロゲル材料、セラミック（例えば、リン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイト）、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、金属、および金属合金から構築され得る。組成物は、当該技術分野において公知の方法、例えば、射出成形、事前形成構造体の凍結乾燥、印刷、自己アセンブリ、位相反転、溶媒流延、溶融加工、ガス発泡、繊維形成／加工、粒子浸出、またはこれらの組合せを使用して、ヒドロゲルにアセンブルされる。アセンブルされたデバイスは、次いで、処置しようとする個体の身体に埋め込まれるかまたは投与される。

【0180】

ヒドロゲルを含む組成物は、いくつかの方法で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてアセンブルすることができる。ヒドロゲルは、ゲル化材料から作製されるが、これは、その非ゲル化形態で身体に導入され、ｉｎ ｓｉｔｕでゲル化する。組成物の成分を、アセンブルが生じる部位に送達する例示的な方法としては、ニードルもしくは他の押出ツールによる注射、スプレー、ペイント、または組織部位における蒸着方法、例えば、カニューレによって挿入されるアプリケーションデバイスを使用した送達が挙げられる。一部の実施形態では、非ゲル化または未形成のヒドロゲル材料は、身体への導入前または導入されている間に、少なくとも１つの医薬組成物と混合される。結果として生じるｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｓｉｔｕでアセンブルされたデバイス、例えば、ヒドロゲルは、少なくとも１つの医薬組成物の混合物を含有する。

【0181】

ヒドロゲルのｉｎ ｓｉｔｕアセンブリは、ポリマーの自発的結合の結果として、または相乗的もしくは化学的に触媒される重合により生じ得る。相乗的または化学的触媒は、アセンブリ部位またはその付近におけるいくつかの内因的要因もしくは条件、例えば、身体の場合は体温、イオン、もしくはｐＨによって開始されるか、または操作者によってアセンブリ部位に提供される外的要因もしくは条件、例えば、非ゲル化材料が導入された後にそこに誘導される光子、熱、電気、音、もしくは他の照射によって開始される。エネルギーは、放射線ビームによって、または熱もしくは光伝導体、例えば、ワイヤもしくは光ファイバケーブルもしくは超音波トランスデューサーによって、ヒドロゲル材料に誘導される。あるいは、例えば、ニードルを通過することによって、かかっていたせん断応力が解放された後に再架橋するせん断減粘性材料、例えば、両親媒体が、使用される。

【0182】

一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ｅｘ ｖｉｖｏでアセンブルされてもよい。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、注射可能である。例えば、ヒドロゲルは、マクロ細孔性スキャフォールドとして、体外で作製される。身体に注射する際、細孔が潰されてゲルが非常に小さくなり、ニードルを通るように適合することが可能となる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１２／１４９３５８号、およびBencherif et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109.48:19590-5を参照されたく、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0183】

ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方におけるヒドロゲルデバイスのアセンブリに好適なヒドロゲルは、当該技術分野において周知であり、例えば、Lee et al., 2001, Chem. Rev. 7:1869-1879に記載されている。自己アセンブリによるアセンブリのための両親媒性ペプチドのアプローチは、例えば、Hartgerink et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5133-5138に記載されている。せん断減粘後の可逆的ゲル化のための方法は、Lee et al., 2003, Adv. Mat. 15:1828-1832において例証されている。

【0184】

ある特定の実施形態では、例示的なヒドロゲルは、ポリマー、ナノ粒子、ポリペプチド、および細胞を含む、材料の封入と適合性のある材料から構成される。例示的なヒドロゲルは、アルギネート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－アクリレート、アガロース、ヒアルロン酸、または合成タンパク質（例えば、コラーゲンもしくは操作されたタンパク質（すなわち、自己アセンブリペプチドベースヒドロゲル））から製造される。例えば、市販入手可能なヒドロゲルとしては、ＢＤ（商標）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）が挙げられる。ＢＤ（商標）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）ペプチドヒドロゲルは、細胞培養のための既定の３次元（３Ｄ）微小環境を作るために使用される合成マトリックスである。

【0185】

一部の実施形態では、ヒドロゲルは、全体または部分的に生体分解性の生体適合性ポリマーマトリックスである。ヒドロゲルを形成することができる材料の例としては、アルギネートおよびアルギネート誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、天然および合成多糖類、ポリアミノ酸、例えば、ポリペプチド、特に、ポリ（リシン）、ポリエステル、例えば、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ－イプシロン．－カプロラクトン、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、特に、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、改変されたスチレンポリマー、例えば、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（ビニルピロリドン）、ならびにグラフトコポリマーを含む上記のもののコポリマーが挙げられる。合成ポリマーおよび天然に存在するポリマー、例えば、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、およびラミニンリッチゲルを含むがこれらに限定されないものもまた、使用することができる。「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、化学反応によって類似の化合物から導出される化合物を指す。例えば、酸化反応によってアルギネートから導出される酸化アルギネートは、アルギネートの誘導体である。

【0186】

埋込み可能な組成物は、回転楕円体、立方体、多面体、柱体、円筒形、桿状体、ディスク、または他の幾何形状を含むがこれらに限定されない、実質的にあらゆる規則的または不規則な形状を有し得る。したがって、一部の実施形態では、インプラントは、約０．５～約１０ｍｍの直径および約０．５～約１０ｃｍの長さの円筒形態のものである。好ましくは、その直径は、約１～約５ｍｍであり、その長さは約１～約５ｃｍである。

【0187】

一部の実施形態では、本発明の組成物は、球状形態のものである。組成物が球状形態である場合、その直径は、一部の実施形態では、約０．５～約５０ｍｍの直径の範囲に及び得る。一部の実施形態では、球状インプラントの直径は、約５～約３０ｍｍである。例示的な実施形態では、直径は、約１０～約２５ｍｍである。

【0188】

ある特定の実施形態では、スキャフォールドは、クリックヒドロゲルおよび／またはクリッククリオゲルを含む。クリックヒドロゲルまたはクリオゲルは、ヒドロゲルまたはクリオゲルポリマー間の架橋が、ポリマー間でのクリック反応によって促進される、ゲルである。それぞれのポリマーは、クリック反応において有用なさらなる官能基のうちの１つを含み得る。クリック反応における官能基対の高い特異性レベルを考慮して、クリックケミストリーによるヒドロゲルデバイスの形成よりも前またはそれと同時に、活性化合物を、事前形成したデバイスに添加することができる。クリックヒドロゲルを形成するために使用することができるクリック反応の非限定的な例としては、銅Ｉに触媒されるアジド－アルキン環化付加、歪み促進型アシズ（assize）－アルキン環化付加、チオール－エン光カップリング、ディールズ－アルダー反応、逆電子要求ディールズ－アルダー反応、テトラゾール－アルケン光クリック反応、オキシム反応、チオール－マイケル付加、およびアルデヒド－ヒドラジドカップリングが挙げられる。クリックヒドロゲルの非限定的な態様は、Jiang et al., 2014, Biomaterials, 35:4969-4985に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0189】

様々な実施形態では、クリックアルギネートが利用される（例えば、２０１５年１０月８日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ２０１５／１５４０７８号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0190】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲル（例えば、クリオゲル）系により、細胞（例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）の浸潤および輸送）のための空間を作りながら、１つまたは複数の薬剤（例えば、増殖因子、例えば、ＢＭＰ－２、および／または分化因子、例えば、ＤＬＬ－４を送達することができる。一部の実施形態では、本発明によるヒドロゲル系により、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞増強／動員因子として作用するＢＭＰ－２、ならびに造血幹細胞および／または造血前駆細胞のＴ細胞系統指定を促進する分化因子としてのＤＬＬ－４を送達する。

【0191】

一部の実施形態では、クリオゲル組成物、例えば、ＭＡ－アルギネートから形成されたものは、局所ニッチ、例えば、Ｔ系統指定を増強させるための特定のニッチを作り出すことによって、送達プラットフォームとしての機能を果たし得る。一部の実施形態では、クリオゲルは、細胞、例えば、動員される幹細胞または前駆細胞、ならびに本発明の様々な例示的な薬剤、例えば、増殖因子および／または分化因子の遭遇を制御することができる局所ニッチを作り出す。ある特定の実施形態では、細胞および本発明の例示的な薬剤は、小さな体積に局在化され、細胞および薬剤の接触を、空間および時間において定量的に制御することができる。

【0192】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲル（例えば、クリオゲル）は、増殖因子および分化因子の両方の送達を空間および時間的に調整するように操作することができ、可能性として、動員される細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞の分化および／または指定を調節することによって、全体的な免疫モジュレーション機能を増強させることができる。ある特定の実施形態では、細胞および増殖因子／分化因子は、小さな体積に局在化され、空間および時間的な因子の送達を、定量的に制御することができる。増殖／分化因子は、局所的に放出され、全身送達される薬剤、例えば、増殖因子とは対照的に、全身作用はほとんど想定されない。

【0193】

クリオゲルまたはヒドロゲルが作製されるポリマー組成物の例は、本開示全体を通じて記載されており、これには、アルギネート、ヒアルロン酸、ゼラチン、ヘパリン、デキストラン、カロブガム、ＰＥＧ、ＰＥＧ－コ－ＰＧＡおよびＰＥＧ－ペプチドコンジュゲートを含むＰＥＧ誘導体が挙げられる。これらの技法は、任意の生体適合性ポリマー、例えば、コラーゲン、キトサン、カルボキシメチルセルロース、プルラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、またはポリ（アクリル酸）（ＰＡＡｃ）に適用することができる。例えば、特定の実施形態では、組成物は、アルギネートに基づくヒドロゲル／クリオゲルを含む。別の例では、スキャフォールドは、ゼラチンベースのヒドロゲル／クリオゲルを含む。

【0194】

クリオゲルは、凍結向性（cryotropic）ゲル化（または凍結ゲル化）技法を使用して産生される高度に多孔性の相互接続した構造体を有する材料のクラスである。クリオゲルはまた、高度に多孔性の構造を有する。典型的には、活性化合物は、クリオゲルの細孔／壁構造の凍結形成後に、クリオゲルデバイスに添加される。クリオゲルは、高い細孔性、例えば、ポリマー架橋の高い密度によって特徴付けられる薄い細孔壁に少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の細孔によって特徴付けられる。本明細書で使用される場合、「細孔性」という用語は、スキャフォールドの体積に対する細孔の体積のパーセンテージを指す。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。クリオゲルの壁部は、典型的に、緻密かつ高度に架橋しており、それによって、恒久的な変形も実質的な構造損傷もなしにニードルを通じて対象内に圧縮して入れることが可能である。

【0195】

様々な実施形態では、細孔壁部は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％（重量／体積）のポリマーを含む。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。他の実施形態では、細孔壁部は、約１０～４０％のポリマーを含む。一部の実施形態では、約０．５～４％（重量／体積）のポリマー濃度（凍結ゲル化前）が使用され、濃度は、凍結ゲル化が完了すると実質的に増加する。クリオゲルのゲル化の非限定的な態様および凍結ゲル化後のポリマー濃度の増加は、Beduer et al., 2015 Advanced Healthcare Materials 4.2: 301-312において考察されており、この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0196】

ある特定の実施形態では、凍結ゲル化は、重合－架橋反応が疑似凍結反応溶液において行われる技法である。凍結ゲル化技法の非限定的な例は、２０１４年８月１４日に公開された米国特許出願公開第２０１４０２２７３２７号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。相分離によって得られる従来的なマクロ細孔性ヒドロゲルと比較したクリオゲルの利点は、その高い可逆的変形性である。クリオゲルは、極めて柔らかいが、その形状を変形と再形成が可能である。ある特定の実施形態では、クリオゲルは、非常に頑丈であり得、高レベルの変形、例えば、伸張およびねじれに耐えることができ、またその溶媒内容物を排出するために機械力下において圧搾することもできる。アルギネートクリオゲルの改善された変形特性は、反応系の非凍結液体チャネルの高い架橋密度に起因する。

【0197】

凍結ゲル化プロセスにおいて、マクロモノマー（例えば、メタクリル化アルギネート）溶液の凍結中に、マクロモノマーおよび開始剤系（例えば、ＡＰＳ／ＴＥＭＥＤ）が、氷の結晶間のチャネル内の氷濃縮物から排出され、その結果、反応はこれらの非凍結液体チャネルにおいてのみ生じることになる。重合後、および氷が溶けた後、多孔性材料が産生され、その微細構造は、形成された氷の負の複製物である。氷の結晶は、ポロゲンとして作用する。所望される細孔サイズは、部分的には、凍結ゲル化プロセスの温度を変更することによって、達成される。例えば、凍結ゲル化プロセスは、典型的に、溶液を、－２０℃で急速に凍結させることによって行われる。この温度を、例えば、－８０℃まで低下させることにより、より多くの氷の結晶が得られ、より小さな細孔が生じるであろう。一部の実施形態では、クリオゲルは、少なくともメタクリル化（ＭＡ）－アルギネートおよびＭＡ－ＰＥＧの低温重合によって産生される。一部の実施形態では、クリオゲルは、少なくともＭＡ－アルギネート、増殖因子、分化因子、およびＭＡ－ＰＥＧの低温重合によって産生される。

【0198】

一部の実施形態では、本発明はまた、ゼラチンスキャフォールド、例えば、ゼラチンヒドロゲル、例えば、ゼラチンクリオゲルも特徴とし、これらは、生体材料に基づく治療法のための細胞反応性プラットフォームである。ゼラチンは、部分的加水分解によってコラーゲンから導出されるポリペプチドの混合物である。これらのゼラチンスキャフォールドは、他の種類のスキャフォールドおよびヒドロゲル／クリオゲルとは異なる利点を有する。例えば、本発明のゼラチンスキャフォールドは、細胞の結合、増殖、および生存を支持し、細胞によって、例えば、酵素、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、組換えマトリックスメタロプロテイナーゼ－２および－９）の作用によって分解される。

【0199】

ある特定の実施形態では、事前に作製されたゼラチンクリオゲルは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、またはウマ）に皮下注射されると、急速にそのおよそ元々の形状を取り（「形状記憶」）、注射後の有害な宿主免疫応答（例えば、免疫拒絶）をほとんど誘起しないかまたは誘起しない。

【0200】

一部の実施形態では、ヒドロゲル（例えば、クリオゲル）は、改変されたポリマーを含み、例えば、ポリマー分子の部位は、メタクリル酸基（メタクリレート（ＭＡ））またはアクリル酸基（アクリレート）で改変されている。例示的な改変されたヒドロゲル／クリオゲルは、ＭＡ－アルギネート（メタクリル化アルギネート）またはＭＡ－ゼラチンである。ＭＡ－アルギネートまたはＭＡ－ゼラチンの場合、５０％が、アルギネートまたはゼラチンのメタクリル化の程度に相当する。これは、１つおきの反復単位が、メタクリル化基を含むことを意味する。メタクリル化の程度は、約１％～約１００％で変動し得る。好ましくは、メタクリル化の程度は、約１％～約９０％で変動する。

【0201】

ある特定の実施形態では、ポリマーはまた、メタクリル化基の代わりにアクリル化基で改変されていてもよい。そのため、産物は、アクリル化ポリマーと称されるであろう。メタクリル化（またはアクリル化）の程度は、ほとんどのポリマーについて変動し得る。しかしながら、一部のポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、１００％の化学的改変であっても、その水溶性特性を維持する。架橋後、ポリマーは、通常、ほぼ完全なメタクリレート基変換に達し、およそ１００％の架橋効率を示す。本明細書で使用される場合、「架橋効率」という用語は、共有結合により連結されているマクロモノマーのパーセンテージを指す。例えば、ヒドロゲル中のポリマーは、５０～１００％が架橋している（共有結合）。架橋の程度は、ヒドロゲルの耐久性と相関する。したがって、改変されたポリマーの架橋のレベルが高いこと（９０～１００％）が、望ましい。

【0202】

例えば、高度に架橋したヒドロゲル／クリオゲルポリマー組成物は、少なくとも約５０％のポリマー架橋（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％、列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される）によって特徴付けられる。高いレベルの架橋は、構造に機械的堅牢性を与える。好ましくは、架橋のパーセンテージは、約１００％未満である。組成物は、フリーラジカル重合プロセスおよび凍結ゲル化プロセスを使用して形成される。例えば、クリオゲルは、メタクリル化ゼラチン、メタクリル化アルギネート、またはメタクリル化ヒアルロン酸の低温重合によって形成される。一部の実施形態では、クリオゲルは、約１．５％（重量／体積）またはそれ未満（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、またはそれ未満、列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される）の濃度のメタクリル化ゼラチンのマクロモノマーまたはメタクリル化アルギネートのマクロモノマーを含む。一部の実施形態では、メタクリル化ゼラチンまたはアルギネートマクロモノマー濃度は、約１％（重量／体積）である。

【0203】

ある特定の実施形態では、クリオゲルは、少なくとも約７５％（体積／体積）の細孔、例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（体積／体積）、またはそれよりも多い細孔を含む。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。一部の実施形態では、細孔は、相互接続されている。相互接続性がなければ、水がゲル内に捕捉されてしまうため、相互接続性は、ヒドロゲルおよび／またはクリオゲルの機能に重要である。細孔の相互接続性は、構造の内外への水（および他の組成物、例えば、細胞および化合物）の通過を可能にする。ある特定の実施形態では、完全に水和した状態では、ヒドロゲル（例えば、クリオゲル）は、少なくとも約９０％の水（水の体積／スキャフォールドの体積）（例えば、約９０～９９％、少なくとも約９２％、９５％、９７％、９９％、またはそれよりも多い）を含む。例えば、クリオゲルの体積のうちの少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９７％、９９％、またはそれよりも多い）は、細孔に含まれる液体（例えば、水）からできている。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。ある特定の実施形態では、圧縮または脱水されたヒドロゲルにおいて、その水の最大約５０％、６０％、７０％が、不在であり、例えば、クリオゲルは、約２５％未満（例えば、約２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ未満）の水を含む。

【0204】

ある特定の実施形態では、本発明のクリオゲルは、細胞が通るのに十分に大きい細孔を含む。例えば、クリオゲルは、直径が約２０～５００μｍ、例えば、約２０～３０μｍ、約３０～１５０μｍ、約５０～５００μｍ、約５０～４５０μｍ、約１００～４００μｍ、約２００～５００μｍの細孔を含む。一部の実施形態では、水和した細孔サイズは、約１～５００μｍ（例えば、約１０～４００μｍ、約２０～３００μｍ、約５０～２５０μｍ）である。ある特定の実施形態では、クリオゲルは、直径が約５０～８０μｍの細孔を含む。

【0205】

一部の実施形態では、注射可能なヒドロゲルまたはクリオゲルは、アミノ、ビニル、アルデヒド、チオール、シラン、カルボキシル、アジド、またはアルキンからなる群から選択される官能基の付加によって、さらに官能化される。代替として、または追加として、クリオゲルは、さらなる架橋剤（例えば、複数アームのポリマー、塩、アルデヒドなど）の付加によってさらに官能化される。溶媒は、水溶性であってもよく、特に、酸性またはアルカリ性であってもよい。水溶性溶媒は、水混和性溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ジオキサンなど）を含み得る。

【0206】

クリオゲルについては、低温架橋が鋳型において生じ得、クリオゲル（注射され得る）は、分解可能であり得る。細孔サイズは、使用される主溶媒の選択、ポロゲンの組み込み、適用される凍結温度および速度、架橋条件（例えば、ポリマー濃度）によって、ならびに使用されるポリマーの種類および分子量によっても制御することができる。クリオゲルの形状は、鋳型によって決定され得、したがって、製造者によって所望される任意の形状を取ることができ、例えば、様々なサイズおよび形状（ディスク、円筒、正方形、ストリングなど）が、低温重合によって調製される。

【0207】

注射可能なクリオゲルは、マイクロメートル規模からセンチメートル規模で調製することができる。例示的な体積は、数百μｍ^３（例えば、約１００～５００μｍ^３）～約１０ｃｍ^３で変動する。ある特定の実施形態では、例示的なスキャフォールド組成物は、約１００μｍ^３～１００ｍｍ^３のサイズである。様々な実施形態では、スキャフォールドは、約１０ｍｍ^３～約１００ｍｍ^３のサイズである。ある特定の実施形態では、スキャフォールドは、約３０ｍｍ^３のサイズである。

【0208】

一部の実施形態では、クリオゲルは、水和され、化合物がロードされ、シリンジまたは他の送達装置にロードされる。例えば、シリンジは、事前充填され、使用まで冷蔵保管される。別の例では、クリオゲルは、脱水され、例えば、凍結乾燥され、必要に応じて化合物（例えば、増殖因子または分化因子）がゲルにロードされ、乾燥状態または冷蔵で保管される。投与の前に、クリオゲルをロードしたシリンジまたは装置を、送達しようとする化合物を含有する溶液と接触させてもよい。例えば、クリオゲルが事前ロードされたシリンジのバレルに、生理学的に適合性のある溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を充填する。あるいは、クリオゲルを、所望される解剖学的部位に投与し、続いて、必要に応じて他の成分、例えば、増殖因子および／もしくは分化因子を含有する生理学的に適合性のある溶液、または本明細書に開示される１つもしくは複数の化合物と一緒に、投与してもよい。クリオゲルは、次いで、再水和され、ｉｎ ｓｉｔｕにおいてその形状完全性を取り戻す。ある特定の実施形態では、クリオゲルの設置後に投与されるＰＢＳまたは他の生理学的溶液の体積は、一般に、クリオゲル自体の体積の約１０倍である。

【0209】

クリオゲルはまた、圧縮したときに、クリオゲル組成物が、構造完全性および形状記憶特性を維持するという利点も有する。例えば、クリオゲルは、中空のニードルによって注射可能である。例えば、クリオゲルは、ニードル（例えば、例えば、１．６５ｍｍの内径を有する１６ゲージ（Ｇ）のニードル）を通過した後、そのおよそ元々の幾何形状に戻る。他の例示的なニードルサイズは、１６ゲージ、１８ゲージ、２０ゲージ、２２ゲージ、２４ゲージ、２６ゲージ、２８ゲージ、３０ゲージ、３２ゲージ、または３４ゲージのニードルである。注射可能なクリオゲルは、中空構造体、例えば、超微細ニードル、例えば、１８～３０Ｇのニードルを通過するように設計されている。ある特定の実施形態では、クリオゲルは、ニードルを通過した後、短い期間、例えば、約１０秒未満、約５秒未満、約２秒未満、または約１秒未満で、そのおよそ元々の幾何形状に戻る。

【0210】

クリオゲルは、任意の好適な注射デバイスを使用して、対象に注射され得る。例えば、クリオゲルは、シリンジを使用してニードルを通じて注射され得る。シリンジには、プランジャー、ニードル、および本発明の組成物を含むリザーバが含まれ得る。注射可能なクリオゲルはまた、カテーテル、カニューレ、またはステントを使用して、対象に注射されてもよい。

【0211】

注射可能なクリオゲルは、ロッド、正方形、ディスク、球体、立方体、ファイバ、泡沫体の形態で、所望される形状に鋳型成形され得る。一部の事例では、クリオゲルは、ディスク、円筒形、正方形、長方形、またはストリングの形状である。例えば、クリオゲル組成物は、約１００μｍ^３～１０ｃｍ^３のサイズ、例えば、１０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３のサイズである。例えば、クリオゲル組成物は、約１ｍｍの直径～約５０ｍｍの直径（例えば、約５ｍｍ）である。必要に応じて、クリオゲルの厚さは、約０．２ｍｍ～約５０ｍｍ（例えば、約２ｍｍ）である。

【0212】

３つの例示的なクリオゲル材料系が、以下に記載されている。

【0213】

ａ）メタクリル化ゼラチンクリオゲル（ＣｒｙｏＧｅＩＭＡ）－メタクリル化ゼラチンを利用した例示的なクリオゲルおよび結果は、２０１４年８月１４日に公開された米国特許出願公開第２０１４－０２２７３２７号に詳細に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0214】

ｂ）メタクリル化アルギネートクリオゲル（ＣｒｙｏＭＡアルギネート）－メタクリル化アルギネートを利用した例示的なクリオゲルおよび結果は、２０１４年８月１４日に公開された米国特許出願公開第２０１４－０２２７３２７号に記載されており、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0215】

ｃ）ラポナイトナノ板片を用いたクリックアルギネートクリオゲル（ＣｒｙｏＣｌｉｃｋ）－基材は、クリックアルギネートである（２０１５年１０月８日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ２０１５／１５４０７８号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の例では、基材は、ラポナイト（化粧品など多数の消費者向け製品に使用される市販入手可能なシリケートクレイ）を含有する。ラポナイトは、大きな表面積および高い負電荷密度を有し、これにより、静電相互作用によって様々なタンパク質および他の生物学的に活性な分子上の正に荷電した部分に吸着することが可能となっており、それによって、薬物ロードが可能である。低濃度の薬物を有する環境に置かれると、吸着された薬物は、持続様式でラポナイトから放出される。この系は、基材単独と比較して、様々な薬剤、例えば、増殖因子のより柔軟なアレイの放出を可能にする。

【0216】

本主題の様々な実施形態は、細孔形成スキャフォールド組成物を含む送達ビヒクルを含む。例えば、細孔（例えば、マクロ細孔）は、ヒドロゲルを対象に注射した後、ヒドロゲル内にｉｎ ｓｉｔｕで形成される。周囲のヒドロゲル（バルクヒドロゲル）内の犠牲ポロゲンヒドロゲルの分解によってｉｎ ｓｉｔｕで形成される細孔は、細胞の動員および輸送、ならびに本発明の任意の組成物または薬剤、例えば、増殖因子、例えば、ＢＭＰ－２、分化因子、またはホーミング因子、またはこれらの任意の組合せの放出を促進する。一部の実施形態では、犠牲ポロゲンヒドロゲル、バルクヒドロゲル、または犠牲ポロゲンヒドロゲルおよびバルクヒドロゲルの両方は、本発明の任意の組成物または薬剤、例えば、増殖因子、分化因子、および／もしくはホーミング因子、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

【0217】

様々な実施形態では、細孔形成組成物は、レシピエント動物、例えば、哺乳動物対象の身体に存在する場合、経時的にマクロ細孔性となる。例えば、細孔形成組成物は、犠牲ポロゲンヒドロゲルおよびバルクヒドロゲルを含み得、ここで、犠牲ポロゲンヒドロゲルは、バルクヒドロゲルよりも少なくとも約１０％急速に（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％急速に）分解される。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。犠牲ポロゲンヒドロゲルは、分解されて、その場所にマクロ細孔が残り得る。ある特定の実施形態では、マクロ細孔は、相互接続された開口マクロ細孔である。一部の実施形態では、犠牲ポロゲンヒドロゲルは、（ｉ）水中への可溶性が高い（低い可溶性インデックスを含む）、（ｉｉ）２００５年６月２日に公開された米国特許出願公開第２００５－０１１９７６２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロテアーゼに媒介される分解モチーフに架橋している、（ｉｉｉ）長いバルクヒドロゲルポリマーのものと比較してより急速に分解する短いポリマーを含む、（ｉｖ）（例えば、酸化によって）バルクヒドロゲルよりも加水分解により分解可能となるように改変されている、かつ／または（ｖ）バルクヒドロゲルと比較して酵素分解性が高いため、バルクヒドロゲルよりも急速に分解され得る。

【0218】

様々な実施形態では、スキャフォールドは、重合後に、１つまたは複数の活性化合物がロードされる（例えば、含浸される）。ある特定の実施形態では、デバイスまたはスキャフォールドポリマー形成材料は、重合前に、１つまたは複数の活性化合物と混合される。一部の実施形態では、デバイスまたはスキャフォールドポリマー形成材料は、重合前に、１つまたは複数の活性化合物と混合され、次いで、重合後に、同じものをさらにか、または１つもしくは複数の追加の活性化合物がロードされる。

【0219】

一部の実施形態では、組成物またはスキャフォールドの細孔サイズまたは総細孔体積は、デバイスまたはスキャフォールドからの化合物の放出に影響を及ぼすように選択される。例示的な細孔性（例えば、ナノ細孔性、マイクロ細孔性、およびマクロ細孔性スキャフォールドおよびデバイス）ならびに総細孔体積（例えば、スキャフォールドの体積の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、またはそれよりも多い）は、本明細書に記載されている。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。細孔サイズおよび総細孔体積の増加により、組織、例えば、骨髄またはその付近に送達することができる化合物の量が増加する。一部の実施形態では、細孔サイズまたは総細孔体積は、活性成分が組成物またはスキャフォールドから出る速度を増加させるように選択される。様々な実施形態では、活性成分は、例えば、細孔腔から拡散され得る活性成分と比較して長期間にわたる活性成分のスキャフォールドまたはデバイスからの継続的な放出を達成するために、ヒドロゲルまたはクリオゲルのスキャフォールド材料に組み込まれ得る。

【0220】

細孔性は、細胞のデバイスおよびスキャフォールドへの動員、ならびにデバイスおよびスキャフォールドからの物質の放出に影響を及ぼす。細孔は、例えば、ナノ細孔性、マイクロ細孔性、またはマクロ細孔性であり得る。例えば、ナノ細孔の直径は、約１０ｎｍ未満である。マイクロ細孔は、直径が約１００ｎｍ～約２０μｍの範囲である。マクロ細孔は、直径が約２０μｍを上回る（例えば、約１００μｍを上回るかまたは約４００μｍを上回る）。例示的なマクロ細孔サイズとしては、約５０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約５５０μｍ、および約６００μｍの直径が挙げられる。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。マクロ細孔は、真核生物細胞が、組成物の内外に移動することを可能にするサイズのものである。１つの例では、マクロ細孔性組成物は、直径が約４００μｍ～約５００μｍの細孔を有する。好ましい細孔サイズは、用途に依存する。ある特定の実施形態では、細孔は、約５０μｍ～約８０μｍの直径を有する。

【0221】

様々な実施形態では、組成物は、１つの層またはコンパートメントが作製され、１つまたは複数の化合物が含浸またはコーティングされる、１段階で製造される。例示的な生体活性組成物は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、１つの層またはコンパートメントが作製され、１つまたは複数の化合物が含浸またはコーティングされ、続いて、第２、第３、第４、またはそれよりも多い層の構築が行われ、続いてそれに１つまたは複数の化合物の含浸またはコーティングが順に行われる、２つまたはそれよりも多い（３つ、４つ、５つ、６つ、．．．．１０個、またはそれよりも多い）段階で製造される。一部の実施形態では、それぞれの層またはコンパートメントは、その他のものと同一であるか、または生体活性組成物の数もしくは混合物によって、ならびに異なる化学的、物理的、および生物学的特性によって、互いに区別される。ポリマーは、分子量、分解の速度、およびスキャフォールド形成の方法を制御することによって、特定の適用のために製剤化することができる。カップリング反応を使用して、生体活性剤、例えば、分化因子をポリマー骨格に共有結合により結合させることができる。

【0222】

一部の実施形態では、１つまたは複数の化合物は、表面吸収、物理的拘束、例えば、相変化を使用してスキャフォールド材料に物質を捕捉することを含む、公知の方法を使用して、スキャフォールド組成物に付加される。例えば、増殖因子は、水相または液相にある間にスキャフォールド組成物と混合され、環境条件（例えば、ｐＨ、温度、イオン濃度）の変化後に、液体が、ゲル化または固化し、それによって、生体活性物質を捕捉する。一部の実施形態では、例えば、アルキル化またはアクリル化剤を使用した共有結合によるカップリングを使用して、定義される構成におけるスキャフォールド上での化合物の安定な長期提示が提供される。そのような物質の共有結合によるカップリングのための例示的な試薬は、以下の表に提供される。

【表1】

【0223】

アルギネートスキャフォールド
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、アルギネートヒドロゲルを含む。アルギネートは、分子量、分解の速度、およびスキャフォールド形成の方法を制御することによって、特定の適用のために製剤化することができる多目的な多糖類に基づくポリマーである。アルギネートポリマーは、（１－４）－結合型β－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ単位）モノマーおよびα Ｌ－グルロン酸（Ｇ単位）モノマーという２つの異なるモノマー単位から構成され、これは、ポリマー鎖に沿って均等かつ連続的な分布で変動し得る。アルギネートポリマーは、二価カチオン（例えば、Ｃａ^＋２、Ｍｇ^＋２、Ｂａ^＋２）に対して強い親和性を有する多価電解質系であり、これらの分子に曝露されると、安定なヒドロゲルを形成する。Martinsen A., et al., 1989, Biotech. & Bioeng., 33: 79-89を参照されたい）。例えば、カルシウム架橋アルギネートヒドロゲルは、歯科適用、創傷被覆、軟骨細胞移植に、および他の細胞型のマトリックスとして、有用である。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｇ単位は、カルシウム架橋を使用して優先的に架橋され、一方でクリック反応に基づく架橋は、Ｇ単位またはＭ単位に対してより無差別である（すなわち、ＧおよびＭ両方の単位が、クリックケミストリーによって架橋され得る）と考えられている。アルギネートスキャフォールドおよびそれを作製するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、２０１７年５月４日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０７５０５５ Ａ１号を参照されたく、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0224】

本発明の文脈において有用なアルギネートポリマーは、約２０ｋＤａ～約５００ｋＤａ、例えば、約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約７０ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約１５０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ～約３００ｋＤａ、約２３０ｋＤａ～約４００ｋＤａ、約３００ｋＤａ～約４５０ｋＤａ、または約３２０ｋＤａ～約５００ｋＤａの平均分子量を有し得る。１つの例では、本発明において有用なアルギネートポリマーは、約３２ｋＤａの平均分子量を有し得る。別の例では、本発明において有用なアルギネートポリマーは、約２６５ｋＤａの平均分子量を有し得る。一部の実施形態では、アルギネートポリマーは、約１０００ｋＤａ未満、例えば、約９００ｋＤａ未満、約８００ｋＤａ未満、約７００ｋＤａ未満、約６００ｋＤａ未満、約５００ｋＤａ未満、約４００ｋＤａ未満、約３００ｋＤａ未満、約２００ｋＤａ未満、約１００ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約４０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、または約２５ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、アルギネートポリマーは、約１０００ｋＤａ、例えば、約９００ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、または約２５ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、アルギネートポリマーの分子量は、約２０ｋＤａである。

【0225】

カップリング反応を使用して、生体活性剤、例えば、原子、化学基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、糖、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体を、ポリマー骨格に共有結合により結合させることができる。

【0226】

「アルギネートポリマー」という用語と互換可能に使用される「アルギネート」という用語には、改変されていないアルギネートまたは改変されたアルギネートが含まれる。改変されたアルギネートとしては、酸化アルギネート（例えば、１つもしくは複数のアルゴキサレート（algoxalate）モノマー単位を含む）および／または還元アルギネート（例えば、１つもしくは複数のアルゴキシノール（algoxinol）モノマー単位を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、酸化アルギネートは、１つもしくは複数のアルデヒド基を含むアルギネート、または１つもしくは複数のカルボキシレート基を含むアルギネートを含む。他の実施形態では、酸化アルギネートは、例えば、１つまたは複数のアルゴキサレート単位を含む、高度酸化アルギネートを含む。酸化アルギネートはまた、比較的少数のアルデヒド基（例えば、モル基準で１５％未満、例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％のアルデヒド基または酸化）も含み得る。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。「アルギネート」または「アルギネートポリマー」という用語はまた、アルギネート、例えば、改変されていないアルギネート、酸化アルギネートもしくは還元アルギネート、またはメタクリル化アルギネートもしくはアクリル化アルギネートも含み得る。アルギネートはまた、任意の数のアルギン酸誘導体（例えば、カルシウム、ナトリウム、もしくはカリウム塩、またはプロピレングリコールアルギネート）を指し得る。例えば、国際公開第ＷＯ１９９８０１２２２８Ａ１号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0227】

ヒアルロン酸
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒアルロン酸ヒドロゲルを含む。ヒアルロン酸（ＨＡ、コンジュゲート塩基ヒアルロネート）は、結合組織、上皮組織、および神経組織全体に広く分布しているアニオン性非硫化グリコサミノグリカンである。細胞外マトリックスの主要な成分の１つであるヒアルロン酸は、細胞増殖および遊走に有意に寄与する。天然のヒアルロン酸は、関節軟骨、筋肉結合組織、および皮膚の重要な成分である。

【0228】

ヒアルロン酸は、Ｄ－グルクロン酸およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンがβ－（１→４）およびβ－（１→３）のグリコシド結合で交互に連結されたものから構成される二糖類のポリマーである。ヒアルロン酸は、２５，０００個の二糖類リピートの長さであり得る。ヒアルロン酸のポリマーは、サイズが５，０００～２０，０００，０００Ｄａの範囲に及び得る。ヒアルロン酸は、シリコンも含み得る。

【0229】

ヒアルロン酸は、その構成成分である二糖類の立体化学に部分的に起因して、エネルギー的に安定である。それぞれの糖分子上の嵩高い基は、立体的に好ましい位置にあるが、より小さな水素は、あまり好ましくない軸位置にある。

【0230】

ヒアルロン酸は、多くの哺乳動物、例えば、ヒトに存在する、ヒアルロニダーゼと称される酵素のファミリーによって分解され得る。ヒアルロン酸はまた、非酵素反応によっても分解され得る。これらとしては、酸およびアルカリ加水分解、超音波破壊、熱分解、ならびに酸化剤による分解が挙げられる。

【0231】

その高い生体適合性および組織の細胞外マトリックスにおけるその共通した存在に起因して、ヒアルロン酸は、組織操作研究において、生体材料スキャフォールドとして、ヒドロゲル、例えば、クリオゲルを形成するために使用される。ヒアルロン酸ヒドロゲルは、架橋を通じて形成される。ヒアルロン酸は、治療用分子を宿主に送達するための所望される形状に、ヒドロゲル、例えば、クリオゲルを形成することができる。ヒアルロン酸は、本組成物における使用のために、チオール、メタクリレート、ヘキサデシルアミド、およびチラミンを結合させることによって、架橋され得る。ヒアルロン酸はまた、ホルムアルデヒドまたはジビニルスルホンと直接的に架橋させることもできる。

【0232】

「ヒアルロン酸」という用語は、改変されていないヒアルロン酸または改変されたヒアルロン酸を含む。改変されたヒアルロン酸としては、酸化ヒアルロン酸および／または還元ヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。「ヒアルロン酸」または「ヒアルロン酸ポリマー」という用語はまた、ヒアルロン酸、例えば、改変されていないヒアルロン酸、酸化ヒアルロン酸もしくは還元ヒアルロン酸、またはメタクリル化ヒアルロン酸もしくはアクリル化ヒアルロン酸も含み得る。ヒアルロン酸はまた、任意の数のヒアルロン酸誘導体も指し得る。

【0233】

多孔性および細孔形成スキャフォールド
本発明のスキャフォールドは、非多孔性であってもよく、多孔性であってもよい。ある特定の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、多孔性である。スキャフォールド組成物の細孔性は、デバイスを通る細胞の遊走に影響を及ぼす。細孔は、ナノ細孔性、マイクロ細孔性、またはマクロ細孔性であり得る。例えば、ナノ細孔の直径は、約１０ｎｍ未満である。マイクロ細孔は、直径が約１００ｎｍ～約２０μｍの範囲である。マクロ細孔は、直径が約２０μｍを上回る（例えば、約１００μｍを上回るかまたは約４００μｍを上回る）。例示的なマクロ細孔サイズとしては、約５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、および６００μｍの直径が挙げられる。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。マクロ細孔は、真核生物細胞が、組成物の内外に移動することを可能にするサイズのものである。ある特定の実施形態では、マクロ細孔性組成物は、直径が４００μｍ～約５００μｍの細孔を有する。細孔のサイズは、異なる目的で調節され得る。例えば、細胞動員および細胞放出については、細孔直径は、５０μｍを上回り得る。ある特定の実施形態では、マクロ細孔性組成物は、直径が約５０μｍ～約８０μｍの細孔を有する。

【0234】

一部の実施形態では、スキャフォールドは、対象に投与する前に、細孔を含む。一部の実施形態では、スキャフォールドは、細孔形成スキャフォールド組成物を含む。細孔形成スキャフォールドおよび細孔形成スキャフォールドを作製するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１４／００７９７５２Ａ１号を参照されたく、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、細孔形成スキャフォールドは、最初から多孔性ではないが、レシピエント動物、例えば、哺乳動物対象の身体に存在している間に経時的にマクロ細孔性となる。ある特定の実施形態では、細孔形成スキャフォールドは、ヒドロゲルスキャフォールドである。細孔は、異なる時点で、例えば、投与から、すなわち、対象の身体に存在してから、約１２時間後、または１、３、５、７、もしくは１０日後またはそれよりも後に、形成され得る。

【0235】

ある特定の実施形態では、細孔形成スキャフォールドは、第１のヒドロゲルおよび第２のヒドロゲルを含み、ここで、第１のヒドロゲルは、第２のヒドロゲルよりも少なくとも約１０％急速に（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約２倍急速に、または少なくとも約５倍急速に）分解される。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。ある特定の実施形態では、第１のヒドロゲルは、分解されてその場所に細孔を残すポロゲンを含む。例えば、第１のヒドロゲルは、ポロゲンであり、分解後にｉｎ ｓｉｔｕで得られる細孔は、最初のポロゲンのサイズの２５％以内、例えば、最初のポロゲンのサイズの２０％以内、１５％以内、または１０％以内である。好ましくは、結果として得られる細孔は、最初のポロゲンのサイズの５％以内である。列挙された値の中間の値および範囲は、本発明の一部であることが意図される。第１のヒドロゲルは、その物理的、化学的、および／または生物学的特性の違いに起因して、第２のヒドロゲルよりも急速に分解され得る。ある特定の実施形態では、第１のヒドロゲルは、水中への可溶性が高い（低い溶解度インデックスを含む）ため、第２のヒドロゲルよりも急速に分解される。ある特定の実施形態では、第１のヒドロゲルは、米国特許公開第ＵＳ２００５／０１１９７６２Ａ１号に記載されるプロテアーゼに媒介される分解モチーフに架橋しているため、より急速に分解され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0236】

ある特定の実施形態では、第１のヒドロゲル組成物（ポロゲン）を形成するために使用されるポリマーの分子質量は、およそ５０キロダルトン（ｋＤａ）であり、第２のヒドロゲル組成物（バルク）を形成するために使用されるポリマーの分子質量は、およそ２５０ｋＤａである。短いポリマー（例えば、ポロゲンのもの）は、長いポリマー（例えば、バルク組成物のもの）と比較して、より急速に分解される。ある特定の実施形態では、組成物は、糖基の存在（例えば、アルギネート組成物のおよそ３～１０％の糖）に基づいて、より加水分解で分解可能となるように改変される。ある特定の実施形態では、ポロゲンヒドロゲルは、分解に対してより感受性となるように、化学的に改変され、例えば、酸化されている。一部の実施形態では、ポロゲンヒドロゲルは、バルクヒドロゲルと比較して、より酵素分解可能である。複合（第１および第２のヒドロゲル）組成物は、例えば、組成物に曝露され、ポロゲンヒドロゲルを分解する酵素を含有する体液に、浸透性である。一部の実施形態では、第２のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルの周囲に架橋され、すなわち、ポロゲン（第１のヒドロゲル）は、バルク（第２の）ヒドロゲルに完全に物理的に捕捉される。

【0237】

本明細書に開示されるクリック試薬は、バルクヒドロゲルまたはポロゲンヒドロゲルにおいて提供され得る。例示的な実施形態では、クリック試薬、例えば、ポリマーまたはナノ粒子は、バルクヒドロゲルにおいて提供される。

【0238】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲルマイクロビーズ（「ポロゲン」）が形成される。ポロゲンは、非分解性であるか、またはポロゲンと比較して遅い速度で分解されるかのいずれかである、「バルク」ヒドロゲルに封入される。ヒドロゲルの形成またはｉｎ ｖｉｖｏで所望される部位への注射の直後の複合材料は、細孔が欠如している。続いて、ポロゲン分解によりｉｎ ｓｉｔｕにおける細孔の形成が生じる。細孔のサイズおよび分布は、ポロゲン形成およびバルクヒドロゲルを形成するポリマーとの混合の間、制御される。

【0239】

一部の実施形態では、細孔形成スキャフォールドにおいて利用されるポリマーは、天然に存在するか、または合成で作製される。１つの例では、ポロゲンおよびバルクの両方のヒドロゲルは、アルギネートから形成される。

【0240】

ある特定の実施形態では、ポロゲン形成に好適なアルギネートポリマーは、５，０００～５００，０００ダルトンの分子量を有する。ポリマーは、必要に応じて、急速な分解を促進するために、さらに改変される（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化によって（Bouhadir et al., 2001, Biotech. Prog. 17:945-950、参照により本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、ポリマーは、同軸気流を有するネブライザーを通じた二価カチオン浴（例えば、Ｃａ^２＋またはＢａ^２＋）への押出によって架橋されて、ヒドロゲルマイクロビーズが形成される。より高い気流速度により、より低いポロゲン直径が得られる。

【0241】

一部の実施形態では、ポロゲンヒドロゲルマイクロビーズは、酸化アルギネートを含有する。例えば、ポロゲンヒドロゲルは、約１～５０％（重量／体積）の酸化アルギネートを含有し得る。例示的な実施形態では、ポロゲンヒドロゲルは、約１～１０％の酸化アルギネートを含有し得る。一実施形態では、ポロゲンヒドロゲルは、約７．５％の酸化アルギネートを含有する。

【0242】

ある特定の実施形態では、ポロゲンを形成するために使用される二価イオンの濃度は、約５～約５００ｍＭで変動し得、ポリマーの濃度は、約１重量％～約５重量％／体積である。しかしながら、バルク相よりも有意に小さいポロゲンを産生するいずれの方法も、好適である。ポロゲンケミストリーは、宿主タンパク質および／もしくは細胞と相互作用するか、または宿主タンパク質および／もしくは細胞との相互作用を阻害するポロゲンを産生するように、さらに操作することができる。

【0243】

バルクヒドロゲルの形成に好適なアルギネートポリマーは、約５，０００～約５００，０００Ｄａの分子量を有する。ポリマーは、バルクヒドロゲルがポロゲンよりも緩徐に分解される限り、分解を促進するようにさらに改変してもよい（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化によって）。ポリマーはまた、細胞応答を制御するための生物学的合図を提示するように、改変されてもよい（例えば、インテグリン結合接着ペプチド、例えば、ＲＧＤ）。また、ポロゲンまたはバルクヒドロゲルのいずれも、細胞応答をさらに制御するための生体活性因子、例えば、オリゴヌクレオチド、増殖因子、または薬物を封入し得る。バルクヒドロゲルを形成するために使用される二価イオンの濃度は、約５～約５００ｍＭで変動し得、ポリマーの濃度は、約１重量％～約５重量％／体積である。バルクポリマーの弾性係数は、その目的で、例えば、幹細胞または前駆細胞を動員するために、調整される。

【0244】

本明細書に記載されるヒドロゲルを生成することに関する方法としては、以下が挙げられる。Bouhadir et al., 1999, Polymer, 40: 3575-84（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、過ヨウ素酸ナトリウムによるアルギネートの酸化について記載しており、反応を特徴付けている。Bouhadir et al., 2001, Biotechnol. Prog., 17: 945-50（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、アルギネートジアルデヒドを形成するための高分子量アルギネートの酸化（アルギネートジアルデヒドは、アルギネート中の糖のうちのある特定のパーセント、例えば、５％が、酸化されてアルデヒドを形成する、高分子量（Ｍ_ｗ）アルギネートである）、およびヒドロゲルが急速に分解するようにするための適用について記載している。Kong et al., 2002, Polymer, 43: 6239-46（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、グルロン酸（ＧＡ）リッチアルギネートの重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を、ＧＡ含量を実質的に低減することなく低減させるためのガンマ線照射の使用について記載している（例えば、ガンマ線照射は、マンヌロン酸、アルギネートのＭＡブロックを選択的に攻撃する）。アルギネートは、ＧＡブロックおよびＭＡブロックから構成され、アルギネートに剛性（弾性係数）を提供するのはＧＡブロックである。Kong et al., 2002, Polymer, 43: 6239-46（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、高Ｍ_ｗのＧＡリッチアルギネートと、照射した低Ｍ_ｗの高ＧＡアルギネートの二成分の組合せが、カルシウムと架橋して剛性ヒドロゲルを形成するが、これは、同じ全体重量濃度の高Ｍ_ｗのＧＡリッチアルギネートのみから作製されたヒドロゲルよりも急速に分解され、また低い溶液粘度を有することを示している。Alsberg et al., 2003, J Dent Res, 82(11): 903-8（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、照射した低Ｍ_ｗのＧＡリッチアルギネートから作製されたヒドロゲルの分解プロファイルについて、骨組織操作における適用とともに記載している。Kong et al., 2004, Adv. Mater, 16(21): 1917-21（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ガンマ照射手技および酸化反応を組み合わせることによるヒドロゲルの分解プロファイルの制御、ならびに軟骨操作への適用について記載している。

【0245】

水素生体材料の分解を制御するための技法は、当該技術分野において周知である。例えば、Lutolf MP et al., 2003, Nat Biotechnol., 21: 513-8（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、哺乳動物酵素（ＭＭＰ）により分解するように操作されたポリ（エチレングリコール）に基づく材料について記載している。Bryant SJ et al., 2007, Biomaterials, 28(19): 2978-86（米国特許第７，１９２，６９３号Ｂ２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、マクロ規模の細孔を有するヒドロゲルを産生するための方法について記載している。細孔鋳型（例えば、ポリ－メチルメタクリレートビーズ）を、バルクヒドロゲル内に封入し、次いで、アセトンおよびメタノールを使用して、バルクヒドロゲルはインタクトなまま残しながら、ポロゲンを抽出する。Silva et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 105(38): 14347-52（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２００８／００４４９００号）は、アルギネートスポンジからの内皮前駆細胞の展開について記載している。スポンジは、アルギネートヒドロゲルを形成し、次いでそれを凍結乾燥させることによって（氷の結晶が細孔を形成する）、作製される。Ali et al., 2009, Nat Mater（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、樹状細胞を動員し、抗腫瘍応答を誘起するようにそれらをプログラムするための多孔性スキャフォールドの使用について記載している。Huebsch et al., 2010, Nat Mater, 9: 518-26（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、封入された間質幹細胞の分化を制御するためのヒドロゲル弾性係数の使用について記載している。

【0246】

一部の実施形態では、スキャフォールド組成物は、相互接続された開口マクロ細孔を含む。代替として、または追加として、スキャフォールド組成物は、細孔形成スキャフォールド組成物を含む。ある特定の実施形態では、細孔形成スキャフォールド組成物は、犠牲ポロゲンヒドロゲルおよびバルクヒドロゲルを含み得、ここで、細孔形成スキャフォールド組成物は、マクロ細孔が欠如している。例えば、犠牲ポロゲンヒドロゲルは、前記細孔形成スキャフォールドを対象に投与した後に、バルクヒドロゲルよりも少なくとも１０％急速に分解され、その場所にマクロ細孔が残り得る。一部の実施形態では、犠牲ポロゲンヒドロゲルは、分解されて前記マクロ細孔を形成するポロゲンの形態にある。例えば、マクロ細孔は、例えば、約１０～４００μｍの直径を有する細孔を含み得る。

【0247】

増殖因子
本発明の組成物は、増殖因子を含み得る。「増殖因子」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の成長、増殖、治癒、および／または細胞分化を刺激することができる薬剤を指す。ある特定の実施形態では、増殖因子は、ポリペプチドである。増殖因子ポリペプチドは、典型的に、シグナル伝達分子として作用する。ある特定の実施形態では、増殖因子ポリペプチドは、サイトカインである。

【0248】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、組成物を対象に投与した後に、細胞をスキャフォールドに動員することができる。動員される細胞は、自家であり得る。例えば、動員される細胞は、対象に由来する間質細胞であり得る。ある特定の実施形態では、自家細胞は、対象の幹細胞（例えば、臍帯幹細胞）であり得る。動員される細胞はまた、同系、同種、または異種であってもよい。本明細書で使用される場合、「同系」という用語は、遺伝子的に同一であるか、または移植を許容するのに十分に同一であり、かつ免疫学的に適合性があることを指す。例えば、同系細胞としては、一卵性の双子から得られた移植細胞を挙げることができる。本明細書で使用される場合、「同種」という用語は、遺伝子的には類似でないが、同じ種の個体に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、異なる種に由来し、したがって、遺伝子的に異なる細胞を指す。

【0249】

例えば、動員される細胞は、移植におけるドナー細胞であり得る。ある特定の実施形態では、移植は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。本明細書で使用される場合、ＨＳＣＴは、通常、骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する複能性造血幹細胞または造血前駆細胞の移植を指す。ＨＳＣＴは、自家（患者自身の幹細胞もしくは前駆細胞が使用される）、同種（ドナーに由来する幹細胞もしくは前駆細胞）、同系（一卵性の双子に由来）、または異種（異なる種に由来する）であり得る。

【0250】

本発明の増殖因子は、投与された組成物の内部またはその周囲の組織または器官の形成を誘導し得る。ある特定の実施形態では、組織または器官は、骨組織または造血組織である。組織形成は、組成物のスキャフォールドに制限され得る。

【0251】

ポリペプチド（例えば、増殖因子ポリペプチド）を組み込む方法は、当該技術分野において公知である。米国特許第８，７２８，４５６号、同第８，０６７，２３７号、および同第１０，０４５，９４７号、米国特許公開第ＵＳ２０１４００７９７５２号、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１３６８３７号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。増殖因子ポリペプチドの放出は、制御することができる。ポリペプチド（例えば、増殖因子ポリペプチド）の制御放出の方法は、当該技術分野において公知である。米国特許第８，７２８，４５６号、同第８，０６７，２３７号、同第１０，０４５，９４６号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、増殖因子（例えば、ＢＭＰ－２）は、長期間、例えば、７～３０日間またはそれよりも長い期間にわたって放出され得る。増殖因子の制御放出は、スキャフォールド内の組織または器官の形成のタイミングに影響を及ぼし得る。ある特定の例では、増殖因子の放出は、本発明の組成物の皮下注射後１～２週間以内の機能的活性骨結節または組織の形成を目標として制御される。

【0252】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、長期間にわたってその生体活性を保持する。「生体活性」という用語は、本明細書で使用される場合、薬剤、例えば、増殖因子の有益または有害な作用を指す。増殖因子の生体活性は、任意の適切な手段によって測定することができる。例えば、ＢＭＰ－２の生体活性は、骨結節もしくは組織の形成を誘導する、および／またはスキャフォールドに細胞を動員するその能力によって、測定することができる。ある特定の例では、増殖因子は、増殖因子をスキャフォールドに組み込んだ後、少なくとも１０日間、１２日間、１４日間、２０日間、または３０日間、その生体活性を保持する。

【0253】

例示的な増殖因子としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポチエン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ－１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ－２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、およびインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0254】

一部の実施形態では、増殖因子は、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属するタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、構造的に関連する細胞制御性タンパク質の大きな群である。ＴＧＦ－βスーパーファミリーには、以下の４つの主要なサブファミリーが含まれる：ＴＧＦ－βサブファミリー、骨形成タンパク質および増殖分化因子、活性化およびインヒビンサブファミリー、ならびに様々な多様なメンバーを含む群。ＴＧＦ－βスーパーファミリーに由来するタンパク質は、２つの鎖が単一のジスルフィド結合によって連結されているホモまたはヘテロ二量体として活性である。ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、保存された細胞表面セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼ受容体ファミリーと相互作用し、ＳＭＡＤと称される保存されたタンパク質ファミリーを使用して、細胞内シグナルを生成する。ＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質は、基本的な生物学的プロセスの制御、例えば、増殖、発達、組織恒常性、および免疫系の制御において、重要な役割を果たす。

【0255】

例示的なＴＧＦ－βスーパーファミリータンパク質としては、ＡＭＨ、ＡＲＴＮ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ３Ａ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＮＦ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＭＳＴＮ、ＮＯＤＡＬ、ＮＲＴＮ、ＰＳＰＮ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３およびＴＧＦ－β４が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ２である。

【0256】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。本明細書で使用される場合、ＢＭＰは、サイトカインおよびメタボロゲンとしても知られている増殖因子の群に属するタンパク質である。ＢＭＰは、骨および軟骨の形成を誘導し、重要な形態形成シグナルの群を構成し、身体全体の組織アーキテクチャを統合し得る。ＢＭＰシグナル伝達の不在または欠損は、疾患または障害における重要な因子であり得る。

【0257】

ある特定の実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ－２である。ＢＭＰ－２は、骨および軟骨の発生において重要な役割を果たす。ＢＭＰ－２は、様々な細胞型において骨芽細胞の分化を強力に誘導することができる。

【0258】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－βサブファミリータンパク質を含む。本明細書で使用される場合、ＴＧＦ－βサブファミリータンパク質またはＴＧＦ－βは、４つの異なるアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、およびＴＧＦ－β４）を含む多機能性サイトカインである。活性化ＴＧＦ－βは、他の因子と複合体を形成して、１型および２型受容体サブユニットから構成されるＴＧＦ－β受容体と結合するセリン／スレオニンキナーゼ複合体を形成する。ＴＧＦ－βの結合後、２型受容体キナーゼは、シグナル伝達カスケードを活性化する１型受容体キナーゼをリン酸化および活性化する。これは、異なる下流基質および制御性タンパク質の活性化をもたらし、多数の免疫細胞の分化、走化性、増殖、および活性化において機能する異なる標的遺伝子の転写を誘導する。

【0259】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－β１を含む。ＴＧＦ－β１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からの、制御機能を有する誘導Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）および炎症促進性サイトカインを分泌するＴ_ｈ１７細胞の両方の誘導において役割を果たす。ＴＧＦ－β１単独では、Ｆｏｘｐ３の発現および活性化されたヘルパーＴ細胞からのＴｒｅｇ分化に関与する。

【0260】

増殖因子（例えば、ＢＭＰ－２またはＴＧＦ－β１）は、内因的供給源から単離することができるか、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。内因性増殖因子ポリペプチドは、健常なヒト組織から単離され得る。合成増殖因子ポリペプチドは、鋳型ＤＮＡの宿主生物または細胞、例えば、哺乳動物またはヒト細胞系へのトランスフェクションまたは形質転換の後に、ｉｎ ｖｉｖｏで合成される。あるいは、合成増殖因子ポリペプチドは、無細胞翻訳または当該技術分野において認識されている他の方法、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)によってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0261】

ある特定の実施形態では、増殖因子（例えば、ＢＭＰ－２またはＴＧＦ－β１）ポリペプチドは、組換えであってもよい。一部の実施形態では、増殖因子ポリペプチドは、哺乳動物増殖因子ポリペプチドのヒト化誘導体である。増殖因子ポリペプチドが導出される例示的な哺乳動物種としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、サル、または霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、増殖因子は、組換えヒトタンパク質である。一部の実施形態では、増殖因子は、組換えネズミ（マウス）タンパク質である。一部の実施形態では、増殖因子は、組換えマウスタンパク質のヒト化誘導体である。

【0262】

ある特定の実施形態では、増殖因子ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質安定性を増加させるように改変されていてもよい。ある特定の実施形態では、増殖因子ポリペプチドは、免疫原性が高くまたは低くなるように操作されていてもよい。「免疫原性（immunogenic）」および「免疫原性（immunogenicity）」という用語は、特定の物質、例えば、タンパク質、抗原、またはエピトープが、ヒトまたは他の動物の身体において免疫応答を引き起こす能力を指す。

【0263】

ある特定の実施形態では、増殖因子は、スキャフォールド当たり約０．００１ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌ、またはスキャフォールド当たり約０．００１～約１００ｎｍｏｌ、またはスキャフォールド当たり約０．００１ｎｍｏｌ～約１ｎｍｏｌで存在し得る。

【0264】

一部の実施形態では、増殖因子は、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～１０００マイクログラムで存在し得る。例えば、増殖因子は、約１μｇ～約１０００μｇ、約１μｇ～５００μｇ、約１μｇ～約２００μｇ、約１μｇ～約１００μｇ、約１μｇ～約５０μｇ、または約１μｇ～１０μｇの量で存在し得る。

【0265】

ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ナノグラム量の増殖因子（例えば、約１ｎｇ～約１０００ｎｇのＢＭＰ－２）を含む。例えば、増殖因子は、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、約１０ｎｇ～約２００ｎｇ、約２５ｎｇ～約２００ｎｇ、約５０ｎｇ～２００ｎｇ、約１００ｎｇ～２００ｎｇ、および約２００ｎｇの量で存在し得る。ナノグラム量の増殖因子はまた、制御様式で放出される。ナノグラム量の増殖因子および／または制御放出は、高用量の増殖因子を使用し準最適な放出動態を有する他の送達系と比較して、本発明の組成物および方法の毒性の低減に寄与し得る。

【0266】

様々な実施形態では、スキャフォールドに存在する増殖因子の量は、スキャフォールドのサイズに応じて変動し得る。例えば、増殖因子は、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位の増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３、または約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0267】

一部の実施形態では、増殖因子の量は、約３００ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０μｇ／ｍｍ^３、例えば、約４００ｎｇ／ｍｍ^３～約３００μｇ／ｍｍ^３、約５００ｎｇ／ｍｍ^３～約２００μｇ／ｍｍ^３、約１μｇ／ｍｍ^３～約１００μｇ／ｍｍ^３、約５μｇ／ｍｍ^３～約５０μｇ／ｍｍ^３、約１０μｇ／ｍｍ^３～約２５μｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0268】

分化因子
本発明の組成物は、分化因子を含み得る。本明細書で使用される場合、分化因子は、細胞、例えば、動員された細胞の分化を誘導することができる薬剤である。ある特定の実施形態では、分化因子は、ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「分化」、「細胞分化」、「細胞の分化」、または他の類似の用語は、細胞が１つの細胞型から別のものへと変化するプロセスを指す。ある特定の実施形態では、細胞は、より特化した種類へ、例えば、幹細胞または前駆細胞からＴ細胞前駆細胞へと変化する。分化は、単純な接合子から複雑な組織および細胞型の系へと変化しながら、多細胞生物の発生中に多数回生じる。成体幹細胞は組織修復中および正常な細胞代謝回転中に分裂し、完全に分化した娘細胞を作るため、分化は、成体期においても継続される。分化は、細胞のサイズ、形状、膜電位、代謝活性、およびシグナルに対する応答性を変化させ得る。これらの変化は、遺伝子発現における高度に制御される改変に起因し得る。

【0269】

分裂中の細胞には、細胞が他の細胞型へと分化する能力である細胞分化能が、複数レベル存在する。より高い分化能は、多数の細胞型が導出され得ることを示す。胎盤組織を含むすべての細胞型へと分化することができる細胞は、全能性として知られている。成体生物のすべての細胞型へと分化することができる細胞は、多能性として知られている。哺乳動物、例えば、ヒトの場合、多能性細胞には、胚性幹細胞および成体多能性細胞が含まれ得る。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の転写因子、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、およびＫＩＦ４の発現の誘導によって、線維芽細胞から作製され得る。複能性細胞は、複数の異なるが緊密に関連する細胞型へと分化することができるものである。小能性細胞は、複能性よりもさらに限定されるが、依然としていくつかの緊密に関連する細胞型へと分化することができる。最後に、単能性細胞は、１つの細胞型にしか分化することができないが、自己再生が可能である。

【0270】

ある特定の実施形態では、本発明の分化因子は、幹細胞または前駆細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞前駆細胞」という用語は、最終的にＴリンパ球（Ｔ細胞）へと分化することができる前駆細胞を指す。「リンパ球」という用語は、本明細書で使用される場合、脊椎動物（例えば、ヒト）の免疫系における白血球のサブタイプの１つを指す。リンパ球としては、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞が挙げられる。リンパ球は、幹細胞が骨髄内でいくつかの種類の血液細胞へと分化するプロセスである造血発生中の、別個のリンパ球型へと分化する前の、リンパ系共通前駆体を起源とする。

【0271】

一部の実施形態では、Ｔ細胞前駆細胞は、リンパ系共通前駆細胞を含む。「リンパ系共通前駆細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ系統細胞、Ｂ系統細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ球が生じる、最初期のリンパ系前駆細胞を指す。様々な実施形態では、Ｔ細胞前駆細胞は、Ｔ細胞コンピテントリンパ系共通前駆細胞を含む。「Ｔ細胞コンピテントリンパ系共通前駆細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ系統前駆細胞へと分化するリンパ系共通前駆細胞を指す。Ｔ細胞コンピテントリンパ系共通前駆細胞は、通常、バイオマーカーＬｙ６Ｄの欠如によって特徴付けられる。本発明の組成物は、骨髄の重要な特徴を模倣し、幹細胞または前駆細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する、異所性ニッチを作製し得る。

【0272】

ある特定の実施形態では、リンパ球には、Ｔ細胞が含まれる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。本明細書で使用される場合、ナイーブＴ細胞は、骨髄において分化したＴ細胞である。ナイーブＴ細胞には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）が含まれ得る。

【0273】

ある特定の実施形態では、分化因子は、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する。ある特定の実施形態では、分化因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を通じて、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、多数の多細胞生物に存在する高度に保存された細胞シグナル伝達系である。哺乳動物は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４と称される４つの異なるＮｏｔｃｈ受容体を有する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、リンパ系共通前駆細胞からのＴ細胞系統分化において重要な役割を果たす。ある特定の実施形態では、分化因子は、１つまたは複数のＮｏｔｃｈ受容体に結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化する。ある特定の実施形態では、分化因子は、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、分化因子の１つまたは複数のＮｏｔｃｈ受容体への結合により、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路が活性化され、Ｔ細胞系統分化が誘導される。

【0274】

ある特定の実施形態では、分化因子は、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）である。ＤＬＬ－４は、ショウジョウバエＤｅｌｔａタンパク質のホモログであるタンパク質である。Ｄｅｌｔａタンパク質ファミリーには、ＤＳＬドメイン、ＥＧＦリピート、および膜貫通ドメインによって特徴付けられるＮｏｔｃｈリガンドが含まれる。

【0275】

ある特定の実施形態では、分化因子ポリペプチドは、内因的供給源から単離されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される。内因性分化因子ポリペプチドは、健常なヒト組織から単離され得る。合成分化因子ポリペプチドは、鋳型ＤＮＡの宿主生物または細胞、例えば、哺乳動物または培養ヒト細胞系へのトランスフェクションまたは形質転換の後に、ｉｎ ｖｉｖｏで合成される。あるいは、合成分化因子ポリペプチドは、無細胞翻訳または当該技術分野において認識されている他の方法、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)によってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0276】

ある特定の実施形態では、分化因子ポリペプチドは、組換えであってもよい。一部の実施形態では、分化因子ポリペプチドは、哺乳動物分化因子ポリペプチドのヒト化誘導体である。分化因子ポリペプチドが導出される例示的な哺乳動物種としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、サル、または霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、分化因子は、組換えヒトタンパク質である。一部の実施形態では、分化因子は、組換えネズミ（マウス）タンパク質である。一部の実施形態では、分化因子は、組換えマウスタンパク質のヒト化誘導体である。

【0277】

ある特定の実施形態では、分化因子ポリペプチドは、所望される活性を達成するように、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質安定性を増加させるように改変されていてもよい。ある特定の実施形態では、分化因子ポリペプチドは、免疫原性が高くまたは低くなるように操作されていてもよい。

【0278】

ある特定の実施形態では、分化因子（例えば、ＤＬＬ－４）は、本発明のスキャフォールドに共有結合により連結されていてもよい。例えば、スキャフォールド材料から放出されるのではなく、分化因子は、ポリマー骨格に共有結合により結合され、組成物の対象への埋込み後に形成される組成物内に保持されてもよい。分化因子をスキャフォールド材料に共有結合により結合またはカップリングさせることにより、そのような分化因子は、組成物を対象に投与した後に形成されるスキャフォールド内に保持されることになり、したがって、本明細書に企図されるように、幹細胞または前駆細胞の分化を促進するために利用可能となるであろう。ある特定の実施形態では、分化因子は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびｌ－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）ケミストリーを利用して、スキャフォールド材料にコンジュゲートされる。分化因子を共有結合により結合またはカップリングさせる当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができ、これらは限定されない。"Bioconjugate Techniques Bioconjugate Techniques (Third Addition)", Greg T. Hermanson, Academic , Greg T. Hermanson, Academic Press, 2013 Press, 2013を参照されたい。一部の実施形態では、分化因子は、クリックケミストリーを利用してスキャフォールドに共有結合により連結されていてもよい。分化因子を共有結合により結合またはカップリングさせる方法としては、アビジン－ビオチン反応、アジドおよびジベンゾシクロオクチン（dibenzocycloocytne）ケミストリー、テトラジンおよびトランスシクロオクテンケミストリー、テトラジンおよびノルボルネンケミストリー、またはジスルフィド結合が挙げられるが、これらに限定されない。

【0279】

ある特定の実施形態では、本発明の分化因子（例えば、ＤＬＬ－４）は、テザー（例えば、ＰＥＧ、ＰＥＧ_２ｋ）およびメタクリレート基（ＭＡ）をさらに含む。ある特定の実施形態では、分化因子は、メタクリル化ＤＬＬ－４－ＰＥＧ_２ｋである。

【0280】

ある特定の実施形態では、共有結合による連結は、スキャフォールドに動員された細胞に分化シグナルを提供するために、スキャフォールド内に分化因子を保持する。例えば、総分化因子のうちの１％未満が、スキャフォールドの外部で検出される。分化因子の生体活性は、スキャフォールドに組み込んだ後、長期間、例えば、少なくとも３ヶ月間、保持され得る。分化因子の生体活性は、任意の適切な方法、例えば、ＤＬＬ－４については比色分析アッセイによって、測定することができる。

【0281】

ある特定の実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり約０．０１ｎｍｏｌ～１０００ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ～１００ｎｍｏｌ、または約１ｎｍｏｌ～１０ｎｍｏｌで存在し得る。

【0282】

一部の実施形態では、分化因子は、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～１０００マイクログラムで存在し得る。例えば、分化因子は、約１０ｎｇ～約５００μｇ、約５０ｎｇ～約２５０μｇ、約１００ｎｇ～約２００μｇ、約１μｇ～約１００μｇ、約１μｇ～約５０μｇ、約１μｇ～約２５μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約２μｇ～約１０μｇ、または約６μｇで存在し得る。

【0283】

様々な実施形態では、スキャフォールドに存在する分化因子の量は、スキャフォールドのサイズに応じて変動し得る。例えば、分化因子は、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位の分化因子の量の比）～約３５０μｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００μｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０μｇ／ｍｍ^３、約１０ｎｇ／ｍｍ^３～約２００μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１００μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約５０μｇ／ｍｍ^３、または約０．１μｇ／ｍｍ^３～約２０μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１０μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約５μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～０．５μｇ／ｍｍ^３、または約０．２μｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0284】

ある特定の実施形態では、ＤＬＬ－４は、スキャフォールド当たり約６μｇで存在し得る。

【0285】

ホーミング因子
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ホーミング因子をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「ホーミング因子」という用語は、細胞、例えば、幹細胞または前駆細胞の指向移動を誘導することができる薬剤を指す。ある特定の実施形態では、本発明のホーミング因子は、付近の応答性細胞において指向型走化性を誘導することができるシグナル伝達タンパク質である。様々な実施形態では、ホーミング因子は、サイトカインおよび／またはケモカインである。

【0286】

ある特定の実施形態では、そのようなホーミング因子を本発明の組成物に含めることにより、細胞（例えば、移植幹細胞および／または前駆細胞）の、対象に投与されたスキャフォールド組成物へのホーミングが促進される。ある特定の態様では、そのようなホーミング因子は、細胞（例えば、移植幹細胞または前駆細胞）の、対象に投与されたスキャフォールド組成物への浸潤を促進する。一部の実施形態では、ホーミング因子は、間質細胞由来因子（ＳＤＦ－１）を含む。ある特定の実施形態では、ホーミング因子は、材料に封入されている。ある特定の実施形態では、ホーミング因子は、長期間（例えば、約７～３０日間またはそれよりも長い期間、約１７～１８日間）にわたって、材料から放出される。

【0287】

ある特定の実施形態では、ホーミング因子は、長期間にわたってその生体活性を保持する。増殖因子の生体活性は、任意の適切な手段によって測定することができる。ある特定の例では、ホーミング因子は、ホーミング因子をスキャフォールドに組み込んだ後、少なくとも１０日間、１２日間、１４日間、２０日間、または３０日間、その生体活性を保持する。

【0288】

一部の実施形態では、ホーミング因子は、スキャフォールド当たり約０．０１ｎｍｏｌ～１０００ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌ～１００ｎｍｏｌ、または約１ｎｍｏｌ～１０ｎｍｏｌで存在し得る。

【0289】

一部の実施形態では、ホーミング因子は、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～１０００マイクログラムで存在し得る。例えば、ホーミング因子は、約１０ｎｇ～約５００μｇ、約５０ｎｇ～約２５０μｇ、約１００ｎｇ～約２００μｇ、約１μｇ～約１００μｇ、約１μｇ～約５０μｇ、約１μｇ～約２５μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約２μｇ～約１０μｇ、または約６μｇで存在し得る。

【0290】

様々な実施形態では、スキャフォールドに存在する分化因子の量は、スキャフォールドのサイズに応じて変動し得る。例えば、分化因子は、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位の分化因子の量の比）～約３５０μｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００μｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０μｇ／ｍｍ^３、約１０ｎｇ／ｍｍ^３～約２００μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１００μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約５０μｇ／ｍｍ^３、または約０．１μｇ／ｍｍ^３～約２０μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１０μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約５μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～約１μｇ／ｍｍ^３、約０．１μｇ／ｍｍ^３～０．５μｇ／ｍｍ^３、または約０．２μｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0291】

例示的なスキャフォールド組成物
本発明は、対象において免疫系をモジュレートするためのスキャフォールド組成物を提供する。本発明の組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールドでの組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む。

【0292】

一態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートするための組成物であって、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球Ｔ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、組成物を提供する。例えば、増殖因子は、約１ｎｇ～約５００μｇ、約１ｎｇ～約２００μｇ、約１ｎｇ～約１００μｇ、約１ｎｇ～約５０μｇ、または約１ｎｇ～１０μｇの量で存在し得る。

【0293】

別の態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートするための組成物であって、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球Ｔ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、組成物を提供する。さらに特定の実施形態では、増殖因子は、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇで存在する。

【0294】

なおもさらなる態様では、本発明は、対象において免疫系をモジュレートするための組成物であって、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールドの体積を基準として約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、組成物を対象とする。様々な実施形態では、増殖因子は、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３、約６ｎｇ／ｍｍ^３～約１０ｎｇ／ｍｍ^３、または約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～約７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0295】

組成物は、増殖因子を制御様式で放出するように設計され得る。低減された量の増殖因子および／または制御放出により、先行技術よりも優れた利点、例えば、高レベルの増殖因子、例えば、ＢＭＰ－２の使用および準最適な放出動態と関連する毒性の低減が提供される。

【0296】

様々な実施形態では、増殖因子は、骨形成タンパク質、例えば、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１４、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ－２である。ある特定の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－β、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはこれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ－β１を含む。

【0297】

本発明による組成物の多孔性スキャフォールドは、任意の生体適合性および生体分解性スキャフォールドであり得る。ある特定の実施形態では、多孔性スキャフォールドは、ヒドロゲルまたはクリオゲルを含む。様々な実施形態では、ヒドロゲルまたはクリオゲルは、アルギネートもしくはアルギネート誘導体、ゲル化もしくはゼラチン誘導体、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体を含む。

【0298】

ある特定の実施形態では、本発明の分化因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合するポリペプチドを含む。様々な実施形態では、分化因子は、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ－１）、Ｄｅｌｔａ様２（ＤＬＬ－２）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様３（ＤＬＬ－３）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ－４）、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、分化因子は、ＤＬＬ－４を含む。ある特定の実施形態では、分化因子は、多孔性スキャフォールドに共有結合により連結されている。

【0299】

特定の実施形態では、本発明の組成物は、アルギネートもしくはアルギネート誘導体、例えば、メタクリル化アルギネート、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体を含む注射可能なクリオゲルと、骨形成タンパク質、例えば、ＢＭＰ－２である増殖因子と、Ｄｅｌｔａ様ファミリータンパク質、例えば、ＤＬＬ－４である分化因子とを含む。増殖因子は、スキャフォールド当たり約２００ｎｇ、または約６．５ｎｇ／ｍｍ^３～７．０ｎｇ／ｍｍ^３で存在し得る。

【0300】

ＩＩＩ．免疫系をモジュレートする方法
本発明は、対象の免疫系をモジュレートする方法を特徴とする。本発明のある特定の実施形態では、対象の免疫系をモジュレートする方法は、対象に、本発明の１つまたは複数の組成物を投与するステップを含む。組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む。特定の実施形態では、組成物は、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む。

【0301】

ある特定の実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。

【0302】

ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞である。本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、他の種類の細胞に分化することができ、分裂して同じ種類の幹細胞をさらに産生することができる、生物学的細胞を指す。幹細胞としては、芽細胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞および様々な組織において見いだされる成体幹細胞が挙げられる。成体の生物において、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復系として機能し、成体組織を再補充する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、胎生幹細胞、羊水幹細胞、臍帯幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞である。造血幹細胞は、骨髄およびリンパ球系統の両方の血液細胞を含む、他の血液細胞を生じる幹細胞である。

【0303】

本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、特定の種類の細胞へと分化することができる生物学的細胞を指す。前駆細胞は、一般に、幹細胞よりも分化した状態である。典型的には、前駆細胞は、限られた回数しか分裂できない。

【0304】

ある特定の実施形態では、前駆細胞は、芽球細胞、例えば、胸腺細胞、リンパ芽球、骨髄球、または骨髄前駆細胞である。ある特定の実施形態では、前駆細胞は、Ｔ細胞前駆細胞へと分化することができる細胞である。ある特定の実施形態では、リンパ球には、Ｔ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞が含まれる。

【0305】

ある特定の実施形態では、動態化される細胞は、造血骨髄細胞、または動員末梢血細胞である。

【0306】

ある特定の実施形態では、細胞は、組換え細胞であってもよい。「組換え細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子改変が導入されている細胞を指す。遺伝子改変は、染色体レベルであっても染色体外であってもよい。「染色体レベルの遺伝子改変」とは、細胞のゲノムにおける遺伝子改変、例えば、細胞の染色体における挿入、欠失、および／または置換を指す。染色体外遺伝子改変は、細胞のゲノムに位置しない遺伝子改変を指す。例えば、タンパク質コーディング遺伝子を含むプラスミドが、細胞に導入され得る。プラスミドは、複製し、親細胞から子孫細胞へ伝達され得る。

【0307】

様々な実施形態では、遺伝子改変により、遺伝子が細胞に導入される。導入された遺伝子は、細胞の欠陥のある遺伝子の機能を補い得る。例えば、細胞は、突然変異体欠陥遺伝子を含み得る。遺伝子改変により、野生型機能性遺伝子を細胞に導入して、遺伝子の機能を回復させることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変は、ある特定の遺伝子の発現を増加または減少させ得る。例えば、遺伝子改変により、ある遺伝子に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を導入して、遺伝子の発現を阻害してもよい。

【0308】

細胞を遺伝子改変する方法は、当該技術分野において一般に公知であり、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)に記載される方法があり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0309】

ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、ゲノム編集としても知られる遺伝子編集によって導入することができる。遺伝子編集は、当業者に生物のＤＮＡを変化させる能力を与える技術の群である。これらの技術は、遺伝子材料を、ゲノム内の特定の位置において付加、除去、または変更することを可能にする。遺伝子編集技術としては、メガヌクレアーゼ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が挙げられるが、これらに限定されない。クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文反構造の繰り返しおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質系の短縮形であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、特に、ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ９は、他の既存のゲノム編集方法よりも高速で安価でより正確かつより効率的である。

【0310】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象が移植を受けた後に、対象の免疫系をモジュレートする方法を特徴とする。例えば、対象は、造血幹細胞移植を受け得る。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、造血幹細胞移植と同時またはその後に、対象に投与される。

【0311】

ある特定の実施形態では、少なくとも２つの組成物が、対象に投与される。組成物は、類似のサイズのものであり得る。

【0312】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、年齢が３０歳を上回るヒトの免疫応答をモジュレートする。例えば、ヒトは、４０歳を上回ってもよく、５０歳を上回ってもよく、６０歳を上回ってもよく、７０歳を上回ってもよく、８０歳を上回ってもよい。

【0313】

一部の実施形態では、本発明の１つまたは複数の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）は、幹細胞動態化技法と併用して投与され得る。幹細胞動態化は、ある特定の細胞動態化剤を使用して、骨髄から血液中への幹細胞の移動を引き起こすプロセスであり、例えば、Hopman and DiPersio, Advances in Stem Cell Mobilization, Blood Rev., 2014, 28(1): 31-40に記載されており、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような技法はまた、前駆細胞の動態化にも使用され得る。

【0314】

したがって、ある特定の実施形態では、対象には、骨髄から血液中への幹細胞／前駆細胞の移動を誘導するのに有効な量で、幹細胞および／または前駆細胞動態化剤が投与される。放出された幹細胞および／または前駆細胞は、続いて、本発明の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）に動員されて、Ｔ細胞前駆細胞へと分化する。幹細胞および／または前駆細胞動態化剤は、組成物（例えば、骨髄クリオゲル）の投与の前、同時、または後に投与され得る。

【0315】

様々な実施形態では、本発明の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）は、対象に、幹細胞および／または前駆細胞動態化剤と併用して投与され得る。特定の実施形態では、対象は、高齢のヒトであり、例えば、ヒトは、３０歳を上回ってもよく、４０歳を上回ってもよく、５０歳を上回ってもよく、６０歳を上回ってもよく、７０歳を上回ってもよく、または８０歳を上回ってもよい。幹細胞および／または前駆細胞動態化剤は、対象自身の幹細胞および／または前駆細胞を骨髄から動態化することができ、そのためこれらの細胞は、本発明の組成物にホーミングし、それによって、他の状態調節または幹細胞移植をともなうことなく、対象においてＴ細胞の生成を増強することができる。

【0316】

ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）は、対象に、幹細胞および／または前駆細胞動態化技法ならびに幹細胞移植と併用して投与され得る。移植は、自家、同種、または異種であり得る。

【0317】

一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞型の末梢血流への動態化、その産生を刺激することができ、かつ／または機能を改善することができる、治療有効量の１つまたは複数の細胞動態化剤が、投与される。薬剤は、経口、直腸内、静脈内、筋肉内、皮下、またはエアロゾルを含む、任意の所望される投与経路を通じて提供され得る。ある細胞型の末梢血流への動態化、その産生を刺激することができ、かつ／または機能を改善することができる薬剤の一部の非限定的な実施形態としては、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサフォル、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポチエンなどが挙げられる。天然に存在する増殖因子に加えて、増殖因子アナログおよび増殖因子誘導体、例えば、融合タンパク質も同様に使用することができる。一部の実施形態では、方法は、治療有効量のＧ－ＣＳＦおよび治療有効量の電磁放射線の投与を含む。一部の実施形態では、方法は、治療有効量のプレリキサフォルおよび治療有効量の電磁放射線の組合せを投与するステップを含む。一部の実施形態では、治療有効量の電磁放射線は、一部の実施形態では造血幹細胞動態化剤であり得る別の薬剤と組み合わされる。一部の実施形態では、治療有効量の電磁放射線は、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、プレリキサフォル、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポチエン、または別の薬剤のうちの２つまたはそれよりも多い組合せと組み合わされる。

【0318】

細胞の動員およびＴ細胞前駆細胞への分化
一態様では、本発明は、細胞をスキャフォールドに動員し、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導するための方法を特徴とする。具体的には、方法は、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む１つまたは複数の本発明の組成物を、投与するステップを含む。特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、例えば、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。別の特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。なおも別の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。

【0319】

ある特定の実施形態では、増殖因子および／またはホーミング因子は、細胞を本発明のスキャフォールドに動員するように機能する。組成物の分化因子、および必要に応じて増殖因子は、続いて、細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する。

【0320】

一部の実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。

【0321】

ある特定の実施形態では、増殖因子（例えば、ＢＭＰ－２）および／またはホーミング因子（例えば、ＳＤＦ－１）は、Ｔ細胞前駆細胞へと分化することができる幹細胞または前駆細胞を動員する。分化因子（例えば、ＤＬＬ－４）は、幹細胞または前駆細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する。ある特定の実施形態では、リンパ球には、ナイーブＴ細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、リンパ球には、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および／または制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）が含まれる。

【0322】

ある特定の実施形態では、動員される細胞は、移植細胞である。移植細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、自家であり得る。例えば、移植細胞は、対象自身の臍帯幹細胞または処置、例えば、放射線処置の前に対象から得られた幹細胞であり得る。移植細胞は、同系、例えば、対象の一卵性の双子から得られた造血幹細胞または前駆細胞であり得る。移植細胞はまた、同種、例えば、同じ種のドナーから得られた造血幹細胞または前駆細胞であり得る。移植細胞はまた、異種、例えば、異なる種から得られた造血幹細胞または前駆細胞であり得る。

【0323】

ある特定の実施形態では、細胞は、対象に由来する骨髄間質細胞であり得る。間質細胞は、器官、例えば、骨髄の結合組織細胞を指す。間質細胞は、その器官（例えば、骨髄）の実質細胞の機能を補助する。骨髄間質細胞は、ＤＬＬ－４を産生し、これは、Ｔ細胞コンピテントリンパ系共通前駆細胞を生成するのに重要な機能的環境を提供する。増殖因子（例えば、ＢＭＰ－２）はまた、間質細胞の骨系統分化を促進し得る。

【0324】

ある特定の実施形態では、動員される細胞は、幹細胞でも前駆細胞でもない細胞であってもよい。

【0325】

免疫過剰反応性の低減
一態様では、本発明は、対象の免疫過剰反応性を低減させる方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量（例えば、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ）で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0326】

別の態様では、本発明は、対象の免疫過剰反応性を低減させる方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0327】

別の態様では、本発明は、対象の免疫過剰反応性を低減させる方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0328】

一部の実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。

【0329】

免疫系は、正常な生理学的条件下において、免疫恒常性のバランスを維持することができる、緊密に制御されるネットワークである。通常、外来抗原でチャレンジされると、恒常性を回復させることを目的とする特定の適切な応答が、開始される。しかしながら、特定の状況下では、このバランスが維持されず、免疫応答は、過少反応または過剰反応のいずれかとなる。免疫応答が過剰反応すると、これは、自己免疫疾患、アレルギー、および／またはＧＶＨＤなどの状態をもたらし得る。

【0330】

ある特定の実施形態では、本発明は、対象において制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）のレベルを増加させる方法を特徴とする。サプレッサーＴ細胞としても知られるＴ_ｒｅｇ細胞は、免疫系をモジュレートする、自己抗原に対する耐容性を維持する、ならびに自己免疫疾患を予防および／または処置する、Ｔ細胞の部分集団である。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、免疫抑制性であり、一般に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、バイオマーカーＣＤ４、ＦＯＸＰ３、およびＣＤ２５を発現する。いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明の方法によるＴ_ｒｅｇ細胞のレベルの増加は、免疫過剰反応性の低減をもたらすと考えられる。

【0331】

自己免疫疾患
特定の態様では、本発明は、自己免疫疾患を予防および／または処置する方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量（例えば、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ）で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、対象の免疫系が対象自身の組織を攻撃および／または損傷する疾患、障害、または疾病を指す。例示的な自己免疫疾患としては、１型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、脈管炎、悪性貧血、およびセリアック病が挙げられるが、これらに限定されない。

【0332】

ある特定の実施形態では、対象は、Ｔ_ｒｅｇ細胞が欠損しており、自己免疫疾患を生じる。対象には、本発明の組成物および造血幹細胞または前駆細胞が投与され得る。造血幹細胞または前駆細胞は、対象から得られてもよい。本発明の組成物は、造血幹細胞のＴ_ｒｅｇ細胞への分化を誘導するための増殖因子（例えば、ＴＧＦ－βファミリータンパク質）を含み得る。

【0333】

アレルギー
ある特定の実施形態では、本発明は、アレルギーを予防および／または処置する方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量（例えば、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ）で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を特徴とする。

【0334】

アレルギー疾患としても知られるアレルギーは、環境内の典型的には無害の物質に対する免疫系の過感受性によって引き起こされるいくつかの状態である。いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明の方法によるＴ_ｒｅｇ細胞のレベルの増加により、アレルギーを予防および／または処置することができる。

【0335】

ＧＶＨＤ
別の態様では、本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連する症状を軽減する方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量（例えば、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ）で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。ＧＶＨＤは、遺伝子的に異なるドナーから移植組織を受容した後の医学状態である。ＧＶＨＤは、一般に、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植と関連する。ＧＶＨＤはまた、他の形態の移植組織、例えば、固形臓器移植にも生じる。

【0336】

ある特定の実施形態では、ＧＶＨＤは、造血幹細胞移植と関連する。ある特定の実施形態では、ＧＶＨＤは、固形体臓器移植と関連する。

【0337】

ある特定の実施形態では、本発明は、Ｔ_ｒｅｇ細胞のレベルを増加させる方法を特徴とする。ある特定の実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞は、移植された造血幹細胞（例えば、ドナー造血幹細胞）から分化する。いずれの理論によって束縛されることを望むものではないが、造血幹細胞移植におけるドナーＴ_ｒｅｇ細胞の増強は、ドナーＴ_ｒｅｇ細胞がＧＶＨＤ抑制において重要な役割を果たすことを考慮すると、造血幹細胞移植を受ける対象においてＧＶＨＤ症状の軽減に寄与する可能性が高い。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の自家Ｔ_ｒｅｇ細胞のレベルを増加させる方法を特徴とする。

【0338】

移植を受ける対象におけるドナーキメラ化の増強
別の態様では、本発明は、移植を受ける対象においてドナーキメラ化を増強させる方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、例えば、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。別の特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。なおも別の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。

【0339】

一部の実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。

【0340】

ドナーキメラ化は、通常、対象が造血幹細胞移植を受けるときに生じる。「キメラ化」という用語は、本明細書で使用される場合、非宿主起源のリンパ球造血細胞の存在を指す。全または完全キメラ化は、一般に、ドナーリンパ球造血による宿主の完全な置換えを指す。混合キメラ化は、所与の細胞コンパートメント、例えば、リンパ球内のドナーおよびレシピエント両方の細胞の存在を示す。低いレベルのドナーキメラ化は、同種造血幹細胞または前駆細胞移植におけるＴ細胞生成の欠損と関連することが多く、これは、患者を、感染作用物質に感受性にし、ＧＶＨＤに寄与し得る。

【0341】

バランスの取れたＴ細胞再構成
別の態様では、本発明は、対象においてバランスの取れたＴ細胞再構成をもたらす方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、例えば、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。別の特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。なおも別の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。

【0342】

一部の実施形態では、対象には、造血幹細胞または前駆細胞がさらに投与される。本発明の組成物は、造血幹細胞または前駆細胞の投与と同時またはその後に、投与され得る。

【0343】

「バランスの取れたＴ細胞再構成」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋の比が、ある特定の期間、例えば、３０日以内に、正常な範囲内となることによって特徴付けられる、Ｔ細胞の再構成を指す。例えば、ＣＤ４^＋細胞の再構成は、通常、ＨＳＣＴレシピエントにおいて、遅い。本発明の方法は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の再構成を加速させ、バランスの取れたＴ細胞再構成をもたらすことができる。

【0344】

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、複数の障害の治癒的処置であるが、同種ＨＳＣＴは、Ｔ細胞の欠損および調節不全によって制限を受ける。同種ＨＳＣＴを受ける対象において、通常、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の回復は遅く、末梢血において約０．９～約２．５である正常なＣＤ４／ＣＤ８比の逆転が生じる。比は、他の組織または器官では異なり得る。

【0345】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋比を、正常な範囲に安定させるが、ＨＳＣＴのみを受ける対象におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞コンパートメントは、完全には再構成されない。ある特定の実施形態では、バランスの取れたＴ細胞再構成は、恒常性ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋比が造血幹細胞移植および本発明の組成物の投与後３０日以内に正常な範囲となることによって特徴付けられる。

【0346】

本発明によるある特定の実施形態では、対象、例えば、ヒトは、造血幹細胞移植において、対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５～約５０×１０^６個の造血幹細胞または前駆細胞を受容する。ある特定の実施形態では、対象は、対象の体重１キログラム当たり約１×１０^５個の造血幹細胞を受容する。

【0347】

本発明の方法は、造血幹細胞またはＴ細胞前駆体注入を単独で受容する（すなわち、本発明の組成物の処置を受けない）対象と比較して、類似またはより良好な治癒および／または治療的作用をもたらす。例えば、本発明の組成物での処置は、例えば、Ｔ細胞前駆体注入単独と比べて低い用量で使用した場合でさえも、胸腺および末梢におけるより多数のＴ細胞前駆体および機能性Ｔ細胞をもたらし得る。一部の実施形態では、類似またはより良好な治癒および／または治療的作用が、ＨＳＣＴ単独で使用される造血幹細胞または前駆細胞の１０パーセント（１０％）未満を、本発明の組成物と組み合わせて対象に投与した場合に達成され得る。

【0348】

様々な実施形態では、バランスの取れたＴ細胞再構成はまた、増強されたＴ細胞新生によっても特徴付けられる。「新生」という用語は、本明細書で使用される場合、新しい細胞の生成を指す。様々な実施形態では、増強されたＴ細胞新生は、増強されたＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法を使用したＴ細胞新生は、ベースラインまたは正常な数のＴＲＥＣを達成する。「ベースラインの数のＴＲＥＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が対象の免疫系を損傷する任意の処置を受ける前の対象のＴＲＥＣ数を指す。「正常な数のＴＲＥＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫系に欠陥がない個体のＴＲＥＣの数を指す。正常な数のＴＲＥＣは、ある特定の範囲内であり得る。ある特定の実施形態では、ＴＲＥＣは、末梢血細胞におけるＴＲＥＣを概算することによって、ヒトにおいて定量的かつ非侵襲的な様式で評価することができる。

【0349】

抗原特異的Ｔ細胞応答
別の態様では、本発明は、対象において抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与し、対象に、抗原を含むワクチンを投与し、それによって対象において抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することによる、方法を提供する。特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、例えば、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。別の特定の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。なおも別の実施形態では、対象には、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が投与される。

【0350】

一部の実施形態では、方法は、対象に、造血幹細胞または造血前駆細胞を投与するステップをさらに含む。

【0351】

ある特定の実施形態では、対象は、免疫系の欠陥を有する。本明細書で使用される場合、「免疫系の欠陥」という用語は、感染性疾患およびがんと闘う免疫系の能力に欠陥があるか、またはそれが完全に不在である状態を指す。免疫系の欠陥の多くの事例は、対象の免疫系に影響を及ぼす外来因子に起因する後天的（「続発的」）なものである。これらの外来因子の例としては、ＨＩＶ感染、年齢、および環境因子、例えば、栄養が挙げられる。ある特定の実施形態では、一部の薬物、例えば、ステロイドによる免疫抑制は、副作用または処置の意図される目的のいずれかであり得る。そのような使用の例としては、（ｉ）抗拒絶措置として臓器移植手術におけるもの、および（ｉｉ）自己免疫疾患におけるものなど過剰反応性免疫系を患う患者におけるものが挙げられる。ある特定の実施形態では、がんの一部の治療法、例えば、放射線療法および／または化学療法は、免疫系の欠陥を引き起こす。対象が免疫系の欠陥を有する状態は、「免疫不全」と称される場合がある。

【0352】

ある特定の実施形態では、対象は、造血幹細胞移植を受けている。ある特定の実施形態では、対象は、血液または骨髄のがん、例えば、骨髄腫または白血病を有する。対象は、腫瘍細胞を破壊するための状態調節の細胞毒性放射線および／または化学療法レジメンを受け得、それが、獲得免疫系のＴ細胞およびＢ細胞の破壊に起因する重篤なリンパ球減少症をもたらす。

【0353】

ある特定の実施形態では、抗原特異的応答を誘導する方法は、対象に、本発明の組成物および抗原を含むワクチンを投与するステップを含む。

【0354】

免疫欠陥対象における免疫系のモジュレーション
一態様では、本発明は、免疫欠陥対象において免疫系をモジュレートする方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量（例えば、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ）で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の本発明の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0355】

別の態様では、本発明は、免疫欠陥対象において免疫系をモジュレートする方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0356】

なおも別の態様では、本発明は、免疫欠陥対象において免疫系をモジュレートする方法であって、対象に、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位での増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む、１つまたは複数の組成物を投与することによってそれを行う、方法を提供する。

【0357】

一部の実施形態では、対象には、造血幹細胞または前駆細胞がさらに投与される。

【0358】

ある特定の実施形態では、放出された幹細胞および／または前駆細胞が本発明の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）に動員されるように、対象には、幹細胞および／または前駆細胞動態化剤がさらに投与される。幹細胞／前駆細胞動態化剤は、本発明の組成物（例えば、骨髄クリオゲル）の投与の前、同時、または後に投与され得る。

【0359】

一部の実施形態では、免疫系の欠陥は、免疫老化によって引き起こされる。「免疫老化」という用語は、本明細書で使用される場合、自然な年齢の進行によってもたらされる免疫系の悪化を指す。これには、感染に応答する宿主の能力、および特にワクチン接種による長期免疫記憶の発達の両方が関与する。免疫老化は、高齢集団において多数の病理学的に有意な健康上の問題をもたらす、多因子状態である。免疫老化は、造血幹細胞の自己複製能力の低減と関連する。免疫老化を有する対象は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の低減、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）多様性の抗原認識レパートリーの縮小、および／または抗原刺激に応答した増殖の減損を示し得る。免疫老化は、若齢、例えば、ヒトにおける３０歳でも生じ得る。

【0360】

一部の実施形態では、対象は、先天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。本明細書で使用される場合、「原発性免疫不全」としても知られる「先天性免疫不全」は、免疫系の主要な構成要素のうちの１つまたは複数における欠損、不在、または欠陥を指す。これらの障害は、遺伝子的に決定され、典型的には、乳児期または小児期に、高頻度、慢性、または日和見の感染症として現れる。分類は、欠損、不在、または欠陥のある免疫系の主要な構成要素に基づく。診断は、試験、例えば、差次的ＷＢＣ数、絶対リンパ球数、定量的免疫グロブリン（Ｉｇ）測定、および抗体力価で確認される。処置は、通常、感染を管理および予防するための予防的抗生物質からなる。原発性免疫不全障害における予後は、変動的であり、具体的な障害に依存する。

【0361】

例示的な先天性免疫不全障害としては、先天性Ｂ細胞免疫不全、例えば、ブルトン無ガンマグロブリン血症、選択的ＩｇＡ欠損、分類不能型免疫不全、先天性Ｔ細胞免疫不全、例えば、ディジョージ症候群、常染色体優性高免疫グロブリンＥ症候群、ＩＬ－１２受容体欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ＩＰＥＸ症候群（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）、先天性混合免疫不全、例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ、バブルボーイ病、グランツマン－リニカー症候群、無リンパ球症）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、高ＩｇＭ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、先天性好中球および食細胞障害、例えば、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、１型白血球接着不全症、チェディアック－ヒガシ症候群、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、重症先天性好中球減少症、先天性補体欠損症、例えば、末端補体欠損症、Ｃ３欠損症が挙げられるが、これらに限定されない。

【0362】

ある特定の実施形態では、対象は、後天性免疫不全に起因して免疫系の欠陥を有する。本明細書で使用される場合、「後天性免疫不全」という用語は、対象の免疫系に影響を及ぼす外来因子に起因する免疫不全を指す。続発性免疫不全としても知られる後天性免疫不全は、様々な免疫抑制剤、例えば、栄養失調、加齢、特定の医薬または処置（例えば、化学療法（細胞毒性剤）、疾患改変抗リウマチ薬、臓器移植後の免疫抑制薬、グルココルチコイド、放射線療法）、ならびに環境毒素、例えば、水銀および他の重金属、殺虫剤、ならびに石油化学製品、例えば、スチレン、ジクロロベンゼン、キシレン、およびエチルフェノールにより生じ得る。医薬については、「免疫抑制」という用語は、一般に、免疫系の機能を減少させる有益な作用および可能性のある有害作用の両方を指すが、「免疫不全」という用語は、一般に、感染の危険性の増加という有害作用のみを指す。

【0363】

多くの特定の疾患は、直接的または間接的に免疫抑制を引き起こす。これには、多数の種類のがん、特に、骨髄および血液細胞のもの（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）、ならびにある特定の慢性感染症が含まれる。免疫不全はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の特徴でもある。ＨＩＶは、少数のＴヘルパー細胞に直接的に感染し、また、他の免疫系応答を間接的に損傷させる。貧血、甲状腺機能低下症、糖尿病、および低血糖症を含むがこれらに限定されない、様々なホルモンおよび代謝障害もまた、免疫不全を引き起こし得る。喫煙、アルコール中毒、および薬物乱用もまた、免疫応答を低下させる。

【0364】

いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明の組成物および方法によって提供されるバランスの取れたＴ細胞再構成および抗原特異的Ｔ細胞応答は、免疫系の欠陥を有する対象の免疫系をモジュレートすることができる。

【0365】

ＩＶ．キット
本明細書に記載される組成物のいずれも、キットに含めることができる。非限定的な例では、キットには、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が含まれる。特定の実施形態では、キットには、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００ｎｇ、例えば、約５ｎｇ～約５００ｎｇ、約５ｎｇ～約２５０ｎｇ、約５ｎｇ～約２００ｎｇ、または約２００ｎｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のＴ細胞前駆細胞への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が含まれる。別の特定の実施形態では、キットには、多孔性スキャフォールドと、スキャフォールド当たり約１ｎｇ～約１０００μｇ、例えば、約１ｎｇ～約５００μｇ、約５μｇ～約２５０μｇ、または約１０μｇ～約１００μｇ、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が含まれる。なおも別の実施形態では、キットには、多孔性スキャフォールドと、約０．０３ｎｇ／ｍｍ^３（スキャフォールドの体積に対する重量単位の増殖因子の量の比）～約３５０ｎｇ／ｍｍ^３、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｍ^３～約３００ｎｇ／ｍｍ^３、約０．５ｎｇ／ｍｍ^３～約２５０ｎｇ／ｍｍ^３、約１ｎｇ／ｍｍ^３～約２００ｎｇ／ｍｍ^３、約２ｎｇ／ｍｍ^３～約１５０ｎｇ／ｍｍ^３、約３ｎｇ／ｍｍ^３～約１００ｎｇ／ｍｍ^３、約４ｎｇ／ｍｍ^３～約５０ｎｇ／ｍｍ^３、または約５ｎｇ／ｍｍ^３～２５ｎｇ／ｍｍ^３など、かつスキャフォールド内の組織または器官の形成を誘導し、スキャフォールドに細胞を動員するのに有効な量で存在する、増殖因子と、動員された細胞のリンパ球への分化を誘導する分化因子とを含む組成物が、含まれる。

【0366】

一部の実施形態では、キットには、本明細書の他の箇所に記載される組成物が含まれる。

【0367】

特定の実施形態では、キットは、組成物を投与するためのシリンジまたは代替的な注射デバイスを含む。具体的な実施形態では、事前充填シリンジまたは注射デバイスには、組成物が事前充填される。

【0368】

キットには、本発明の組成物を対象に投与するための試薬または説明書がさらに含まれてもよい。それは、１つまたは複数の試薬も含み得る。

【0369】

キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされてもよい。キットの容器手段には、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれ、その中に、構成要素が配置され、好ましくは、好適にアリコートされ得る。キット内に１つを上回る構成要素が存在する場合、キットはまた、一般に、追加の構成要素が別個に配置され得る第２、第３、またはその他の追加の容器を含むことになる。キットは、滅菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈剤を格納するための第２の容器手段も含み得る。しかしながら、様々な組合せの構成要素が、１つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットはまた、典型的に、本発明の組成物、例えば、免疫系をモジュレートするための組成物を格納するための手段、および任意の他の試薬容器を、商用販売のための緊密に封止した状態で含むであろう。

【0370】

キットの構成要素が、１つおよび／または複数の溶液中で提供される場合、その溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が、特に好ましい。しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が、別の容器手段で提供され得ることも想定される。

【0371】

本発明を、以下の実施例によってさらに例証するが、これらは、制限と解釈されるものではない。本明細書に引用されている全ての引用資料、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、および技術は、引用中に明示的に言及されていない場合であっても、参照により本出願に組み込まれる。引用資料および本出願の記述に矛盾がある場合には、本出願における記述が優先されるものとする。

【0372】

節および表の見出しは、制限することを意図するものではない。

【実施例】

【0373】

要約
同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、多数の障害に対する治癒的処置であるが、Ｔ細胞の欠陥および調節不全によりその有用性が限定される。本明細書では骨髄におけるＴ細胞リンパ球新生の特色を模倣するバイオマテリアルに基づくスキャフォールドを報告する。骨髄クリオゲル（ＢＭＣ）は、骨形成タンパク質－２を放出して間質細胞を動員し、ノッチリガンドデルタ様リガンド－４を提示してマウスおよびヒト造血前駆細胞のＴ細胞系列特異化を容易にする。マウスにおいてＨＳＣＴ時にＢＭＣを皮下注射することにより、胸腺によるＴ細胞前駆体の播種、Ｔ細胞新生およびＴ細胞受容体レパートリーの多様化が増強された。末梢性Ｔ細胞再構成がマウスＨＳＣＴでは約６倍およびヒト異種ＨＳＣＴでは約２倍に増加した。さらに、ＢＭＣにより、ドナーＣＤ４＋制御性Ｔ細胞生成が促進され、同種ＨＳＣＴ後の生存が改善された。Ｔ細胞前駆体の養子移入と比較して、ＢＭＣにより、ドナーキメラ化、Ｔ細胞生成およびワクチン接種に対する抗原特異的Ｔ細胞応答が増加した。ＢＭＣにより、ＨＳＣＴにおいてＴ細胞再生を増強し、移植片対宿主病を軽減するための既製の手法を提供することができる。

【0374】

緒言
Ｔ細胞は、生命のために重要な抗原特異的免疫の重要なヘルパー、エフェクターかつ制御性細胞である。Ｔ細胞の数の減少および機能的欠陥は、先天性免疫不全から自己免疫性のおよび免疫サーベイランスが損なわれた障害までにわたる疾患に原因として関係づけられる（Goronzy, J.J. & Weyand, C.M. Successful and maladaptive T cell aging. Immunity 46, 364-378 (2017)；Liston, A., Enders, A. & Siggs, O.M. Unravelling the association of partial T-cell 883 immunodeficiency and immune dysregulation. Nature Reviews Immunology 8, 545-558 884(2008)）。同種ＨＳＣＴでは、Ｔ細胞生成に顕著な欠陥が存在し、これは、患者を感染因子にかかりやすくし、また、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に寄与し得る（Blazar, B.R., Murphy, W.J. & Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology 12, 443-458 (2012)）。これらの併発症は致死的になり得、ＨＳＣＴが治癒的になる可能性がある状況でのその使用を限定し得る。ナイーブなヘルパーおよびエフェクターＴ細胞サブセットのバランスの取れた再構成は、Ｔ細胞受容体レパートリーの修復と一緒に、重要なまだ対処されていない臨床的必要のままである（Krenger, W., Blazar, B.R. & Hollander, G.A. Thymic T-cell development in allogeneic stem cell transplantation. Blood 117, 6768-6776 (2011)）。

【0375】

移植された造血細胞からの新しいＴ細胞再生には、骨髄および十分な胸腺機能から生じる（Chaudhry, M.S., Velardi, E., Dudakov, J.A. & Brink, M.R. Thymus: the next (re) generation. Immunological reviews 271, 56-71 (2016)）Ｔ細胞前駆体の十分なプールの利用可能性が必要である（Zlotoff, D.A. et al. Delivery of progenitors to the thymus limits T-lineage reconstitution after bone marrow transplantation. Blood 118, 1962-1970 (2011)）。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞生成の増強に関する臨床的標準は現在のところ存在しないが、大多数の試みは、サイトカインの使用およびＴ細胞リンパ球新生の骨髄後相からの細胞に基づく治療に焦点が当てられてきた。しかし、臨床試験において、Ｔ細胞増大サイトカインＩＬ－７およびＩＬ－２（Mohtashami, M., Shukla, S., Zandstra, P. & Zuniga-Pflucker, J.C. in Synthetic Immunology 95-120 (Springer, 2016)）が主に成熟Ｔ細胞サブセットにおいて増加し（Perales, M.-A. et al. Recombinant human interleukin-7 (CYT107) promotes T-cell recovery after allogeneic stem cell transplantation. Blood 120, 4882-4891 (2012)）、また、ＩＬ－２が毒性によってさらに限定された（Skrombolas, D. & Frelinger, J.G. Challenges and developing solutions for increasing the benefits of IL-2 treatment in tumor therapy. Expert review of clinical immunology 10, 207-217 (2014)）。対照的に、ＩＬ－２２の投与により、前臨床マウス試験における初期の胸腺細胞回復が増強されることが示されている（Dudakov, J.A. et al. Interleukin-22 drives endogenous thymic regeneration in mice. Science 336, 91-95 (2012)。あるいは、一般に遭遇した病原体からの抗原特異的Ｔ細胞による保護をもたらすために、養子ドナーＴ細胞注入が使用されているが（Cobbold, M. et al. Adoptive transfer of cytomegalovirus-specific CTL to stem cell transplant patients after selection by HLA-peptide tetramers. Journal of Experimental Medicine 202, 379-386 (2005)；Rooney, C.M. et al. Infusion of cytotoxic T cells for the prevention and treatment of Epstein-Barr virus-induced lymphoma in allogeneic transplant recipients. Blood 92, 1549-1555 (1998)）、それには、一過性の応答、ＧＶＨＤのリスクの増大、およびＴ細胞疲弊が伴っている。上記の戦略は全て、胸腺依存性Ｔ細胞生成を促進するためのＴ細胞前駆体の十分なプールの利用可能性によって限定されている。Ｔ細胞前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をｅｘ－ｖｉｖｏにおいてノッチシグナル伝達の活性化によって頑強に生成することができ、これらの細胞をＨＳＣＴと同時投与することにより、胸腺リンパ球新生および胸腺アーキテクチャが、サイトカインの外因的な同時投与を伴わずに改善される（Zakrzewski, J.L. et al. Tumor immunotherapy across MHC barriers using allogeneic T-cell precursors. Nature biotechnology 26, 453 (2008)；Van Coppernolle, S. et al. Functionally mature CD4 and CD8 TCRαβ cells are generated in OP9-DL1 cultures from human CD34+ hematopoietic cells. The Journal of Immunology 183, 4859-4870 (2009)；Awong, G. et al. Human proT-cells generated in vitro facilitate hematopoietic stem cell-derived T-lymphopoiesis in vivo and restore thymic architecture. Blood 122, 4210-4219 (2013)）。しかし、十分な前駆体を生成するためのｅｘ－ｖｉｖｏ細胞培養は労力を要するものであり、ドナー細胞の胸腺リンパ球新生の一過性の増強しか実証されていない。したがって、この手法の広範にわたる臨床的変換は複雑になる可能性が高い。

【0376】

広範に適用可能な技術を開発することを探求して、ノッチシグナル伝達が活性化されるとナイーブなＴリンパ球に分化する能力を有し、胸腺リンパ球新生の主要な供給源である、胸腺移行前の骨髄に存在する共通リンパ球前駆体（ＣＬＰ）に焦点があてられた（Love, P.E. & Bhandoola, A. Signal integration and crosstalk during thymocyte migration and emigration. Nature Reviews Immunology 11, 469 (2011)；Radtke, F., MacDonald, H.R. & Tacchini-Cottier, F. Regulation of innate and adaptive immunity by Notch. Nature Reviews Immunology 13, 427 (2013)；Serwold, T., Ehrlich, L.I.R. & Weissman, I.L. Reductive isolation from bone marrow and blood implicates common lymphoid progenitors as the major source of thymopoiesis. Blood 113, 807-815 (2009)）。Ｔ細胞系列特異化を増強する骨髄ニッチの間質成分は、デルタ様リガンド－４（ＤＬＬ－４）を産生する、オステオカルシンを発現する骨髄間質細胞からなり、これにより、Ｔ細胞コンピテントＣＬＰを生成するために極めて重要な機能的な微小環境がもたらされる（Vionnie, W. et al. Specific bone cells produce DLL4 to generate thymus-seeding progenitors from bone marrow. Journal of Experimental Medicine, jem. 20141843 (2015)）。これらの間質細胞はプレコンディショニングのプロセスによって損傷を受け、これはＴ細胞系列指令機能に影響を及ぼす可能性が高い。さらに、ＡＩＤＳ患者での臨床経験により、成人の胸腺が、以前の機能障害および萎縮にもかかわらず細胞組成およびＴ細胞新生を著しく改善する能力を有することが示されている（Smith, K.Y. et al. Thymic size and lymphocyte restration in patients with human immunodeficiency virus infection after 48 weeks of zidovudine, lamivudine, and ritonavir therapy. The Journal of infectious diseases 181, 141-147 (2000)。これらの以前の所見により、骨髄におけるＴ細胞リンパ球新生の特定の生物学的態様に基づくニッチの開発が支持された。

【0377】

ネイティブな胸腺に移動するＴ細胞前駆体のｉｎ ｖｉｖｏにおける産生を助長し、それにより、宿主により駆動される選択を受けさせてより多くのバランスの取れた広範な免疫レパートリーを創出するために、Ｔ細胞リンパ球新生骨髄ニッチを工学的に作製することができることが仮定される。この仮説を試験するために、注射可能な、バイオマテリアルに基づくクリオゲル（ＢＭＣ）スキャフォールドを創出した。ＢＭＣスキャフォールドは、骨髄ニッチ内で提示される分子シグナルを組み込むことによりｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞発生を促進する。ＢＭＣは、細胞浸潤を可能にする、マクロ多孔性のヒドロゲルに基づくスキャフォールドを含む。ＢＭＣは、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を放出して、宿主間質細胞の動員およびそれらの骨系列分化を容易にし、生体活性ノッチリガンドＤＬＬ－４を予め定義された密度で浸潤性造血細胞に提示する。これらのＴ系列キューにより、マウスにおける同系（ｓｙｎ）および同種（ａｌｌｏ）ＨＳＣＴ後の胸腺による前駆体の播種が増強され、ドナーＴ細胞再構成が可能になった。ＢＭＣにより再構成されたＴ細胞は機能的であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーは多様であり、また、ＧＶＨＤの誘導が減少した。

【0378】

（実施例１）
生体活性マクロ多孔性骨髄クリオゲル（ＢＭＣ）はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて造血前駆体を前駆体Ｔ細胞に分化させる
スキャフォールドに基づくアルギネート－ＰＥＧ ＢＭＣは、５０～８０μｍの径の細孔と相互接続したマクロ多孔性ヒドロゲルである（図１Ａ～１Ｃ）。造血前駆細胞におけるＴ細胞系列プログラムを促進するために、ＤＬＬ－４をポリマー骨格に組み込んだ（Radtke, F., MacDonald, H.R. & Tacchini-Cottier, F. Regulation of innate and adaptive immunity by Notch. Nature Reviews Immunology 13, 427 (2013)）。新規骨形成を可能にするために（Wozney, J.M. et al. Novel regulators of bone formation： molecular clones and activities. Science 242, 1528-1534 (1988)）、低温重合の前に、その後ｉｎ ｖｉｖｏにおいて可溶性形態で放出させるためにＢＭＰ－２を反応混合物に添加した。これらのクリオゲルは、単にタンパク質の徐放性のために設計された以前のクリオゲルとは異なり、固定化されたキュー（ＤＬＬ－４）および可溶性キュー（ＢＭＰ－２）の両方を提示する（Koshy, S.T., Zhang, D.K., Grolman, J.M., Stafford, A.G. & Mooney, D.J. Injectable nanocomposite cryogels for versatile protein drug delivery. Acta biomaterialia 65, 36-43 (2018)）。

【0379】

この研究では、ＢＭＣは、骨および造血組織の成長をさらに支持する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＭＰ－２放出（封入効率９０％）では、負荷量の約５％の最初のバーストが示され、次いで、持続的に放出された（図１Ｄ）。負荷されたＤＬＬ４の総量の１％未満が上清中で検出され、修飾されたＤＬＬ－４は修飾されていないタンパク質と同様の結合カイネティクスを有した（図１Ｅ）。プールされた放出試料において、放出されたＢＭＰ－２の生体活性が、新しく再構成されたＢＭＰ－２と比べて９０％よりも大きく保持された（図１Ｆ）。ＢＭＰ－２の生体活性は、放出の３日目の９５％から１２日目の約８５％までにわたり、これにより、放出されたＢＭＰ－２が高度に活性であることが確認された（図１Ｇ）。ＤＬＬ－４の最も高いｉｎ ｖｉｔｒｏ生体活性は、初期の時点、０日目および１０日目に見いだされた（図１Ｈおよび１Ｉ）。生体活性はその後の時点では低下したが、それでもなお３ヶ月後にベースラインを上回っていた。ＢＭＣの、ノッチシグナル伝達を介して造血前駆体マウスおよびヒト細胞の分化を誘導する能力を測定するために、マウス由来の一次系列を枯渇させた骨髄細胞および臍帯血由来ヒトＣＤ３４＋造血細胞をＢＭＣ中で培養した（図１Ｊ）。

【0380】

ゲル当たりおよそ６μｇのＭＡ－ＤＬＬ４に対応する、ポリマー骨格上のＭＡ－ＣＯＯＨ基をＭＡ－ＤＬＬ４を用いて１％官能化で飽和させた共通リンパ球前駆体の増大、およびこの条件をさらなる評価のために選択した。分析した実験条件（図１Ｋおよび１Ｌ）のいずれにおいても全体的なヒトまたはマウス細胞の増大倍率および生存可能数に有意差はなかった。しかし、リンパ球前駆細胞の画分は、ＤＬＬ－４をＢＭＣに、単独で、またはＢＭＰ－２と組み合わせて組み込んだ場合にのみ増強された（図１Ｍ）。

【0381】

（実施例２）
ＢＭＣはｉｎ ｖｉｖｏにおいて造血組織の特色を有する骨小結節を形成する
次に、ＢＭＣを、ＨＳＣＴのマウスモデルにおいて宿主および移植された細胞の輸送を誘導する能力について分析した。致死的全身照射（Ｌ－ＴＢＩ）後、マウスに、ドナーマウス骨髄から単離した系列枯渇造血細胞（５×１０^４個；約９３％系列枯渇、図２Ａ）を静脈内に移植し、ＢＭＣ（細胞を伴わない）を同時に背側側腹部の皮下組織に注射した（図２Ｂ）。ＢＭＣへの細胞浸潤を肉眼で数量化するために、各皮下小結節のサイズを６週間の期間にわたって測定した（図２Ｃ）。ＢＭＰ－２を伴うＢＭＣでは、移植の１０日後までに小結節のサイズが最初の体積のおよそ３倍に急速に増大し、ドナー造血細胞が実質的に浸潤し（図２Ｄ）、およそ２週間の期間にわたって局所的な骨小結節が形成された（図２Ｅおよび２Ｆ）。特に、骨形成には血管化が伴い、ＤＬＬ－４は接近可能なままであり、また、骨はＢＭＣスキャフォールドに制限され、これにより、異所性部位においてこのプロセスにわたってＢＭＣによってもたらされる調節が実証される（図２Ｇ～２Ｌ）。

【0382】

ＢＭＣの内面の層状骨の領域付近の骨小結節において造血組織が目に見えた（図２Ｆ）。ＢＭＣに浸潤する毛細血管ネットワークは移植の２日後という早期に認められ（図２Ｇ）、数量化を１０日目に開始した。組織形態計測を使用して、ＢＭＣ内の血管密度を移植の３ヶ月後まで多数の時間間隔で評価した（図２Ｆ）。血管は、１０日目までおよそ２５血管／ｍｍ^２で存在した（図２Ｉ）。血管の密度は７０血管／ｍｍ^２まで増加し、３０日目の後は一定であった。ＢＭＣにおけるアルギネート／ＤＬＬ－４の分布および接近可能性を数量化するために、Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色を使用した組織形態計測分析を実施した。最も早い時点の１０日目にはアルギネートのおよそ８５％が接近可能であり、これは９０日目までに２５％まで徐々に低下した（図２Ｉ～２Ｋ）。アルギネートはいずれの時点でもＢＭＣ内の任意の特定の領域に隔離されなかった。

【0383】

（実施例３）
ＢＭＣは宿主間質細胞および移植された造血細胞を動員し、増大させる
移植後の様々な時点でのＢＭＣにおける移植された造血細胞の浸潤および細胞組成を評価した。ドナーＧＦＰ^＋細胞はＢＭＰ－２を含めた場合には増大したが、ＤＬＬ－４単独の存在下では増大しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。ＢＭＣに存在する間質細胞とネイティブな骨髄は同様であることが見いだされ、ＢＭＣで処置したマウスと無処置のマウスでネイティブな骨髄における造血細胞の生着に差異はなく、ＢＭＣおよびネイティブな骨髄におけるＳＤＦ－１αおよびインターロイキン－７濃度は同様であった（図３Ｃ～３Ｇ）。

【0384】

ＢＭＣに存在する間質細胞を、一般にはマウス間葉系間質細胞に関連する免疫表現マーカー（Ｓｃａ－１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６）を使用して同定し、移植を受けた４６９マウスの骨髄と比較した（図３Ｃ）。Ｓｃａ－１^＋間質サブセットはＢＭＣにおいて骨髄と比べて多少増加したが、これらの間質サブセットの全体的な再増殖カイネティクスは２つの組織で同様であった。ＢＭＰ－２を含有するＢＭＣでは、骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）はネイティブな骨と同等であった（図３Ｄ）。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（ＯＲＯ）を使用して脂肪組織を数量化し、ＢＭＣではネイティブな骨全体と比べて少ないことが見いだされた。ＢＭＰ－２を含有するＢＭＣではＢＭＰ－２を伴わないＢＭＣと比べて数量化されたＯＲＯが多かった（図３Ｄ）。ＢＭＣが、内在性骨髄における移植された細胞の生着に影響を及ぼすかどうかを測定するために、３つの時点でコロニー形成アッセイを行った（図３Ｅ）。二重ＢＭＣを用いてまたは用いずに処置したマウスの骨髄由来の細胞から生じるＣＦＵの総数または型に差異は認められなかった。回収されたＢＭＣにおけるホーミング因子間質細胞由来因子－１アルファ（ＳＤＦ－１α）およびサイトカインであるインターロイキン－７（ＩＬ－７）を支持するリンパ球前駆体（（Brainard, D.M. et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of virology 83, 7305-7321 (2009)）の濃度も同じマウス由来の照射処置した骨髄と同等かまたはそれよりも高かった（図２Ｆ）。ＢＭＣにおいてＥＴＰ、ＤＮ２およびＤＮ３様細胞は検出されなかった。

【0385】

後の時点（移植後＞５日）で、ＢＭＣにおけるより原始的なドナー造血細胞（ＨＳＣ）およびリンパ系予備刺激された多分化能前駆体（ＬＭＰＰ）を数量化した。１４日目に、単一因子ＢＭＰ－２または二重因子ＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４を含有するＢＭＣにおいて６百万個から７百万個の間の総ＧＦＰ^＋細胞が数量化された。両群において細胞の８０％よりも多くがＣＤ１１ｂ^＋骨髄細胞であった。しかし、移植されたドナー細胞におけるＣＬＰ画分は二重因子ＢＭＣ内でのみ増大し、その結果、移植の２週間後にはＢＭＰ－２のみを伴うＢＭＣと比べて約１００倍の増加がもたらされた（図３Ａ）。移植の６週間後、ＣＬＰは二重因子ＢＭＣでは約１０倍多く、そのうちのそれぞれおよそ３０％および７０％がＴ細胞コンピテントＬｙ６Ｄ^－サブセット内にあった（図３Ｇ）。

【0386】

骨髄由来の前駆体Ｔ細胞は胸腺に移動してナイーブなＴ細胞に分化する。ＢＭＣ由来の細胞が胸腺に移動するかどうかを直接評価するために、二重因子ＢＭＣを幹細胞治療と協調させて、致死的に照射処置したマウスの最初のセットに送達した（図３Ｈおよび３Ｉ）。次いで、１０日目にこれらのマウスから二重ＢＭＣを外植し、亜致死的に照射処置したレシピエントの背側側腹部の皮下に外科的に移植した。ＢＭＣ移植後２０日目に、これらのマウスの胸腺におけるドナーＧＦＰ^＋および宿主細胞を数量化した。ＢＭＣを移植したレシピエントマウスの胸腺におけるＧＦＰ^＋ＤＰ、ＳＰ ＣＤ４^＋およびＳＰ ＣＤ８^＋細胞を数量化し、Ｔ細胞前駆細胞のＢＭＣから胸腺への移動が確認された。別の試験では、二重ＢＭＣ処置の結果、胸腺におけるＥＴＰの数に関して、ＢＭＣを伴わずに投与された移植細胞用量での１０倍の増加と比較してより大きな増強がもたらされた（図３Ｊ）。二重ＢＭＣはまた、経時的な胸腺細胞サブセットの生成に関してＢＭＣ内に入れた因子のボーラス送達、およびＢＭＰ－２のみのＢＭＣよりも有意に優れた（図３Ｋ～３Ｐ）。

【0387】

胸腺におけるＴ細胞前駆体の播種に対する細胞用量の影響を分析するために、初期胸腺前駆体（ＥＴＰ）サブセットをＬ－ＴＢＩ後に移植のための漸増用量の系列枯渇細胞で（５×１０^４～５×１０^５個の細胞）数量化した。この用量範囲でＥＴＰの用量依存的増強が見いだされた（図３Ａおよび３Ｈ）。二重機能化ＢＭＣを最も低い細胞用量（５×１０^４個の細胞）で投与した場合、胸腺におけるＥＴＰが最も高い細胞用量を用いた移植のみの群と比べて５倍に増加した。二重ＢＭＣによる処置ではＥＴＰが最初に増強され（１２日目および４２日目に３倍）、その後の時点ではＤＮ２、ＤＮ３、ＤＰおよびＳＰ胸腺細胞サブセットの増加が認められた（図３Ｉ～３Ｎおよび図５Ｑ）。１２日目から４２日目の間、二重ＢＭＣ処置からのマウスの胸腺細胞充実性および体重は移植のみの群からのマウスよりも有意に高かった。ＨＳＣＴ後２２日目に、胸腺の間質サブセット（ｍＴＥＣ、ｃＴＥＣ、線維芽細胞および内皮細胞；図３Ｓおよび３Ｔ）の数に有意差はなかった。

【0388】

（実施例４）
ＢＭＣはＨＳＣＴ後のＴ細胞再生を増強し、ＧＶＨＤを軽減する
二重機能化ＢＭＣで処置したマウスの末梢血では、移植のおよそ４週間後にＴ細胞再構成の加速が観察されたが、Ｂ細胞にも骨髄細胞再構成にも有意差は観察されなかった（図４Ａ～４Ｃ）。血液、脾臓および骨髄中のＴ細胞サブセットの分析により、二重機能化ＢＭＣを有するマウスでは、移植の３０日後に脾臓および骨髄においておよび移植の４０日後に末梢血において恒常性ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋Ｔ細胞比が回復したことが示された（図４Ｄ～４Ｆ）。亜致死量の全身照射後にＨＳＣＴの状況でＢＭＣ処置を使用した場合（ＳＬ－ＴＢＩ）、Ｔ細胞再構成が増強された（図４Ｇ～４Ｎ）。移植後２８日目には、ＢＭＣで処置したマウスでは移植だけ受けたマウスと比べて、ドナーキメラ化およびＤＰドナー胸腺細胞の絶対数がそれぞれ１．５倍および２倍であった（図４Ｇ）。ＢＭＣで処置したマウスでは移植だけ受けたマウスよりも多くのドナーキメラ化およびドナー由来の単一の陽性ＣＤ４^＋胸腺細胞の絶対数（それぞれ２倍および３倍）ならびに単一の陽性ＣＤ８^＋胸腺細胞（それぞれ１．７倍および１５倍）も認められた（図４Ｈおよび４Ｉ）。末梢では、ドナーキメラ化がＣＤ４^＋Ｔ細胞（３．５倍）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（２．５倍）において高かった。キメラ化またはＢ細胞の絶対数に差異は観察されなかった。

【0389】

次に、確立された異種ＮＳＧ－ＢＬＴマウスモデルを使用してヒトＴ細胞再構成の速度を測定した（Brainard, D.M. et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of virology 83, 7305-7321 (2009)）。ＢＭＣで処置したＮＳＧ－ＢＬＴマウスでは、Ｔ細胞再構成の最初の速度の初期の増強、およびＢ細胞再構成の速度の多少の一過性の低下が認められ（図５Ａおよび５Ｂ）、ＢＭＣで処置したＮＳＧ－ＢＬＴマウスの骨髄におけるプレＢ細胞ＣＦＵが一過性に少なかった（図５Ｃ）。末梢性ＣＤ４^＋：ＣＤ８^＋Ｔ細胞比は、ＢＭＣで処置したマウスでは移植後５０日目から６０日目の間に安定化されたが、一方、対照ＮＳＧ－ＢＬＴにおけるＣＤ４^＋区画は十分には再構成されなかった（図５Ｄ）。著しいことに、Ｔ細胞再構成の速度の増強によりＧＶＨＤ関連死の率は加速されなかった。その代わりに、二重機能化ＢＭＣを受けたＮＳＧ－ＢＬＴマウスはＮＳＧ－ＢＬＴマウスよりも長く生存した（図５Ｆ）。このモデルにおいて、ＢＭＣで処置したＮＳＧ－ＢＬＴマウスでは、移植の５０日後に、ＢＭＣで処置したマウスの胸腺および脾臓におけるＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）が２倍であった（図５Ｇおよび５Ｈ）。ＢＭＣを受けた同種ＭＨＣ不適合ＨＳＣＴマウスモデルにおいて同様の生存の増強が観察され（図５Ｉ）、また、このモデルにおいて、移植の１５日後にドナー由来ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ_ｒｅｇがＢＭＣで処置したマウスの胸腺および脾臓においてそれぞれ５倍および４倍であった（図５Ｊ）。

【0390】

次に、本発明のＢＭＣ処置を、ＯＰ９－ＤＬ１フィーダー細胞を使用してｅｘ ｖｉｖｏで生成したダブルネガティブ（ＤＮ）２およびダブルネガティブ（ＤＮ）３前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）から主になる（＞９０％）広範に試験されているＴ細胞前駆体注入手法と比較した（図５Ｋ）。ＨＳＣＴ後２８日目に、ドナーキメラ化は、ＢＭＣで処置したマウスにおいて、ＤＰ、ＳＰ４およびＳＰ８胸腺細胞集団で有意に高かった（図５Ｌ～５Ｎ）。脾臓では、ドナーキメラ化がＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方について多く、また、ＢＭＣによる処置ではドナーＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数が多いことが見いだされた（図５Ｏおよび５Ｐ）。

【0391】

（実施例５）
ＢＭＣは再生Ｔ細胞の多様性および機能を増強する
Ｔ細胞受容体の多様性（ＴＣＲ多様性）を胸腺における遺伝子セグメントの確率論的な体細胞組換えによって生じさせた。二重ＢＭＣで処置したマウスでは、移植の約６週間後まで胸腺細胞充実性および胸腺の重量が移植のみの対照よりも有意に高かった（図３Ｑおよび３Ｒ）。胸腺の細胞充実性の増大により、同系移植における再生Ｔ細胞の機能性および多様性も増強されるかどうかを特徴付けるために、ＴＣＲ切除サークル（ＴＲＥＣ）を数量化した。ＴＲＥＣは、ＴＣＲ再編成のシグネチャーである。ＴＣＲレパートリー分析も行った。移植の１ヶ月後の二重ＢＭＣで処置したマウスの胸腺におけるＴＲＥＣ数は照射処置していない対照マウスにおけるＴＲＥＣ数と同様であり、どちらも移植のみのマウスおよびＢＭＰ－２ ＢＭＣで処置したマウスにおけるものよりも多かった（図６Ａ）。脾臓では、同じ群において照射処置していない対照と比較して全体的に少ない数のＴＲＥＣが認められたが、二重ＢＭＣで処置したマウスはそれでも、移植のみの群および単一因子ＢＭＰ－２ ＢＭＣ群と比べてより多くのＴＲＥＣ計数を有した（図６Ｂ）。ＣＤＲ３ベータ鎖におけるＴＣＲ ＶおよびＪセグメントの多様性を、ＢＭＣで処置し、移植を受けたマウスにおいてＨＳＣＴの３０日後に、存在するＴ細胞クローンの数、ならびに各クローンの相対的な存在量を考慮に入れるシンプソン指標（ＳＩ）を使用して評価した。二重機能性ＢＭＣを有するマウスのＳＩは、照射処置していない対照マウスのＳＩの４０％であったが、一方、移植単独またはＢＭＰ－２ ＢＭＣを投与したマウスのＳＩはより低かった（それぞれ１６％および８％）（図６Ｃ）。ＨＳＣＴでは、広範なＴＣＲレパートリーを有するナイーブなＴ細胞の欠如が免疫学的併発症および日和見感染症のリスクの増大に関連付けられた（Douek, D.C. et al. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. The Lancet 355, 1875-1881 1076(2000)）。二重ＢＭＣで処置したマウスの胸腺および末梢においてより多数のＴＲＥＣが回収されたことは、胸腺リンパ球新生の増強を反映する。二重ＢＭＣで処置したマウスでは比較的高頻度の特異的ＴＣＲクローンも観察されたが、全体的な多様性がより大きいことにより、より多くのバランスの取れた胸腺由来の再構成が示唆された。

【0392】

再生Ｔ細胞の抗原特異的に応答する能力を測定するために、同系移植をワクチン接種し、その後、移植の３０日後にモデルタンパク質オボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて攻撃した（図６Ｄ）。ＯＶＡエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）－四量体^＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、二重機能性ＢＭＣを受けたマウスにおいて、ＢＭＣを受けていない、またはＢＭＰ－２を伴うＢＭＣのみを受けた、移植を受けたマウスと比較して有意に高かった（図６Ｅ）。同様に、同種移植を受けた二重ＢＭＣで処置したマウスでは、ドナー抗原特異的Ｔ細胞応答が、プロＴ細胞治療手法の結果生じたものと比較しておよそ３倍であった（図６Ｆ）。ｅｘ ｖｉｖｏ刺激時のインターフェロン（ＩＦＮ）－γおよび腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の産生が、２２日目の時点でＢＭＣ処置およびＴ細胞前駆体処置群におけるドナーＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞について同等であったが、ＢＭＣ由来のＴ細胞で処置した群の有意に大きな分率ではこれらの因子が４２日目に生じたことが見いだされた（図６Ｇおよび６Ｈ）。ＨＳＣＴ後のＢＭＣで処置したマウスにおけるワクチン接種後のＣＤ８^＋Ｔ細胞の頑強な抗原特異的生成により、ＢＭＣ処置には、ＨＳＣＴ後のワクチン接種と組み合わせた使用の潜在性があることが示唆される。

【0393】

（実施例６）
材料および方法
以下の材料および方法を使用して本発明を行った。

【0394】

一般的な方法および統計値
動物試験のサンプルサイズは、追加的な統計学的推定の使用を伴わない以前の研究に基づくものであった（Brainard, D.M. et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of virology 83, 7305-7321 (2009)；Bencherif, S.A. et al. Injectable cryogel-based whole-cell cancer vaccines. Nature communications 6, 7556 (2015)；Palchaudhuri, R. et al. Non-genotoxic conditioning for hematopoietic stem cell 1066 transplantation using a hematopoietic-cell-specific internalizing immunotoxin. Nature biotechnology 34, 738 (2016)））。結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析した。ＡＮＯＶＡを使用した場合、群間の分散がバートレット検定によるものと同様であることが見いだされた。生存曲線をログランク（マンテル・コックス）検定を使用して解析した。英数字符号化を使用して、病理試料および血球計数を盲検化した。

【0395】

材料
グルロネート含有量が多いＵＰ ＬＶＧアルギン酸ナトリウムをＰｒｏＮｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから購入した；２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、２－アミノエチル メタクリル酸 塩酸塩（ＡＥＭＡ）およびアセトンをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＡＣＲＬ－ＰＥＧ－ＮＨ２（３．５ｋＤａ）および４ａｒｍ ＰＥＧアクリレート（１０ｋＤａ）をＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。

【0396】

骨髄クリオゲル（ＢＭＣ）製作
骨髄クリオゲルを、以前に記載された技法に従い、いくつかの改変を伴って作製した（Bencherif, S.A. et al. Injectable preformed scaffolds with shape-memory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 19590-19595 (2012)。アルギネートをＡＥＭＡと反応させることによってメタクリル化アルギネート（ＭＡ－アルギネート）を調製した。アルギン酸ナトリウムを１００ｍＭのＭＥＳ緩衝剤の緩衝液（０．６％（ｗｔ／ｖｏｌ）、ｐＨ約６．５）中に溶解させた。アルギネート骨格のカルボン酸基を活性化するためにＮＨＳおよびＥＤＣを混合物に添加し、その後、ＡＥＭＡを添加し（ＮＨＳ：ＥＤＣ：ＡＥＭＡのモル比＝１：１．３：１．１）、溶液を室温（ＲＴ）で２４時間にわたって撹拌した。混合物をアセトン中に沈殿させ、濾過し、真空オーブン中、ＲＴで終夜乾燥させた。脱イオン水中、ＭＡ－アルギネートの２．５ｗｔ％溶液および４ａｒｍ ＰＥＧアクリレートマクロモノマー（ＭＡ－アルギネート：４ａｒｍ ＰＥＧアクリレートのモル比＝４：１）を調製し、その後、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ））および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ））を添加することによってアルギネート－ＰＥＧ ＢＭＣを合成した。ＡＣＲＹＬ－ＰＥＧ－ＮＨ２をデルタ様リガンド４（ＤＬＬ－４）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とカルボジイミド化学を使用してコンジュゲートした（ＮＨＳ：ＥＤＣ：ＤＬＬ４のモル比＝１：１．３：１．１）。ＢＭＰ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をポリマー溶液に添加した後、低温重合を行った。全ての前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）溶液を４℃まで予冷して重合の速度を低下させた後、凍結した。プレポリマー溶液に開始剤を添加した後、溶液を予冷（－２０℃）テフロン（登録商標）の型に迅速に移した。終夜インキュベートした後、ゲルを解凍し、氷上でペトリ皿に収集した。

【0397】

走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のために、ＢＭＣを漸増濃度の新しく調製したエタノール溶液（３０、５０、７０、９０および１００％）中でそれぞれ２０分間インキュベートした。次いで、ＢＭＣをヘキサメチルジシラザン（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１０分間インキュベートし、デシケーター／真空チャンバー内で少なくとも１時間乾燥させた後、ＳＥＭのために封入した。乾燥ＢＭＣを、カーボンテープを使用して試料スタブに接着させ、スパッタコーターにおいて白金／パラジウムでコーティングした。試料を、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｓｕｐｒａ ５５ ＶＰ電界放出走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）での二次的な電子検出を使用して画像化した。

【0398】

生体分子放出の数量化
ＢＭＰ－２のストック濃度は製造者から分かっており、ＥＬＩＳＡを使用して検証した。ＢＭＰ－２の放出カイネティクス封入効率を決定するため、およびＤＬＬ－４の安定なコンジュゲーションを確認するために、ＢＭＣを、滅菌ＰＢＳ１ｍｌ中、３７℃で振とうしながらインキュベートした。培地を定期的に交換した。上清中に放出された作用物質をＥＬＩＳＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）によって検出した。試料を、放出培地中にそれ以上ＢＭＰ－２が検出可能でなくなるまで放出させた。その後、少なくとも１０００Ｕの酵素アルギネートリアーゼを使用してクリオゲルを消化した。消化産物をＢＭＰ－２についてＥＬＩＳＡを使用して分析した。クリオゲルおよび放出培地中のＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４の量を既知量の負荷したＢＭＰ－２およびＤＬＬ－４と比較して、封入効率を算出した。

【0399】

生体分子活性アッセイ
ＢＭＰ－２生体活性についてのアルカリホスファターゼ活性アッセイ

【0400】

ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４細胞を使用して、アルカリホスファターゼアッセイを以前に記載されている通り行った。Macdonald, M.L. et al. Tissue integration of growth factor-eluting layer-by-layer polyelectrolyte multilayer coated implants. Biomaterials 32, 1446-1453 (2011)。細胞を異なる実験条件下で培養した：（１）成長培地、（２）ＢＭＣから放出されたＢＭＰ－２を補充した分化培地、および（３）ネイティブなＢＭＰ－２。

【0401】

ＤＬＬ－４生体活性についてのノッチ活性化アッセイ

【0402】

ＤＬＬ－４の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこのモルフォゲンを不活性化し得る血清タンパク質に曝露した後のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体活性を数量化するために以前に特徴付けられたノッチレポーター細胞株、Ｍ．Ｅｌｏｗｉｔｚ（Ｃａｌｔｅｃｈ）からの好意の寄贈品であるＣＨＯ－Ｋ１＋２ｘＨＳ４－ＵＡＳ－Ｈ２Ｂ－Ｃｉｔｒｉｎｅ－２ｘＨＳ４ ｃＨ１＋ｈＮＥＣＤ－Ｇａｌ４ｅｓｎ ｃ９を使用した（Sprinzak, D. et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signaling states. Nature 465, 86 (2010)；Nandagopal, N. et al. Dynamic ligand discrimination in the Notch signaling pathway. Cell 172,869-880. e819 (2018)）。これらの細胞を、１０％Ｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン－０．２９２ｍｇ／ｍｌのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＡｌｐｈａ ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、５％ＣＯ_２の存在下、加湿雰囲気中、３７℃で成長させた。ＤＬＬ－４を伴うＢＭＣおよび伴わないＢＭＣの両方を９６ウェルプレート中、完全細胞培養培地を用い、細胞を伴わずにインキュベートした。所定の時間間隔で（最大３ヶ月）、ノッチレポーター細胞２万個をウェル中のＢＭＣの上に播種した。２４時間後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点システムを使用して共焦点顕微鏡法を実施した。ノッチリガンドＤＬＬ－４との結合に応答した比色定量出力を数量化し、スキャフォールド中のＤＬＬ－４生体活性の指標として使用した（図１Ｈ）。特に、視野内の各細胞の総ＹＦＰ蛍光（５０～１００；ゲル表面の８０％よりも多くを包含する視野４～５つ）を算出し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。ＹＦＰ蛍光の中央値を算出し、ＤＬＬ－４を伴わないＢＭＣに播種された細胞の蛍光の中央値で割り、報告した。

【0403】

表面プラズモン共鳴による親和性決定

【0404】

ノッチ１に対する野生型ＤＬＬ４およびＭＡ－ＤＬＬ４の解離定数を、以前に記載されている通りＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴によって決定した（Heliotis, M., Lavery, K., Ripamonti, U., Tsiridis, E. & Di Silvio, L. Transformation of a prefabricated hydroxyapatite/osteogenic protein-1 implant into a vascularised pedicled bone flap in the human chest. International journal of oral and maxillofacial surgery 35, 265-269 (2006)。簡単に述べると、ビオチン化組換えノッチ１を、ストレプトアビジンをコーティングしたセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。緩衝剤中漸増濃度の野生型メタクリル化ＤＬＬ４タンパク質を２０℃でチップに流した。結合相および解離相を毎分１０μｌでそれぞれ１２０秒間および６０秒間実施した。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して定常状態結合曲線を１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに当てはめてＫ_ｄを決定した。

【0405】

骨髄クリオゲル（ＢＭＣ）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養

【0406】

マウスＢＭ細胞を肢から回収した。粉砕した組織および細胞を７０ミクロンのメッシュを通して濾過した。細胞を２０ゲージの針を１回通過させることによって単一細胞懸濁液を調製した。血球計を使用して細胞を計数することによって総細胞充実性を決定した。ＢＭ細胞を、磁気選択（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって成熟免疫細胞（ＣＤ３－ε、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、ＣＤ１１ｂまたはＧｒ－１を発現する）を枯渇させた。細胞をＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅとコンジュゲートした系列抗体の混合物（ＣＤ３に対する抗体、ＮＫ１．１に対する抗体、Ｇｒ－１に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体、ＣＤ１９に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体およびＣＤ８に対する抗体）と一緒に、ならびにＳｃａ－１特異的抗体およびｃ－ｋｉｔ特異的抗体と一緒にインキュベートした。ＦａｃｓＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤ）を使用して造血細胞（Ｌｉｎ^－Ｓｃａ－１^ｈｉｃ－ｋｉｔ^ｈｉ）を単離した。選別された細胞は≧９５％純粋であった。ヒト臍帯血由来ＣＤ３４^＋細胞を購入し（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）、増大補充物（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して７日間増大させた。ＣＤ３４^＋細胞を正の選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。９６ウェルプレートにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ）を予めコーティングした。各ＢＭＣを９６ウェルプレートのウェルに個別に入れた。上記の通り単離したマウスまたはヒト細胞１万個を同じウェルに、体積２００μｌの、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質および抗真菌溶液（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンＢを含有する）を伴うＲＰＭＩ（Ｌ－グルタミンを伴う）１６４０中に添加した。マウス細胞に関しては、培地に１０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－７（ＩＬ－７；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充し、２日目、４日目および６日目に５０％培地交換ステップを伴った。ヒト細胞に関しては、培地に１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した。１週間の培養後、１ｍｇ／ｍｌのアルギネートリアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＢＭＣを消化することによって細胞を単離した。溶液を、７０ミクロンのフィルターを通過させ、細胞をＦＡＣＳ分析のために下記の通り処理した。

【0407】

ＢＭ移植および血液分析
全ての動物研究はＨａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたものであり、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ガイドラインおよび関連する倫理的規制に従った。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ－２^ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２^ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６（ＣＤ ４５．１^＋）、ＣＢｙＪ．Ｂ６－Ｔｇ（ＵＢＣ－ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／Ｊ（ＧＦＰ）およびＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は雌であり、実験の開始時に６週齢から８週齢の間であった。各実験内の全てのマウスの年齢を釣り合わせ、ランダム化は実施しなかった。動物脱落に関する予め確立した基準は、移植を受けたマウスに所望の細胞用量を注射できないこと、およびヒト化マウスにおける手術後併発症に起因する死亡であった。手順に関連しない健康上の懸念（例えば、不正咬合、重症皮膚炎）は脱落および安楽死の基準であった。

【0408】

移植モデル
全てのＴＢＩ実験を、Ｃｓ－１３７ γ－放射線源を用いて実施した。他で記載されている通り、改変を伴わずに、亜致死量のＴＢＩ（ＳＬ－ＴＢＩ、Ｂ６レシピエント）、１×５００ｃＧｙ＋５×１０^５個の系列枯渇骨髄細胞；同系ＨＳＣＴ（ｓｙｎ－ＨＳＣＴ、Ｂ６レシピエント）１×１０００ｃＧｙ＋５×１０^４～５×１０^５個（図に示されている）の系列枯渇ＧＦＰ ＢＭ細胞；ＧＶＨＤを伴う同種－ＨＳＣＴ（ＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣ不適合レシピエント）１×８５０ｃＧｙ＋５×１０^５個の系列枯渇ＧＦＰ ＢＭ細胞＋１×１０^６個のＧＦＰ脾細胞；ＧＶＨＤを伴わない同種－ＨＳＣＴ（ＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣ不適合レシピエント）１×８５０ｃＧｙ＋５×１０^５個の系列枯渇ＧＦＰ ＢＭ細胞または５×１０^６個のｉｎ ｖｉｔｒｏで生成したＧＦＰ Ｔ細胞前駆体＋１０^３個の同系ＨＳＣ。ヒト化ＢＬＴ（骨髄－肝臓－胸腺）マウス試験は、ＭＧＨ ａｎｄ Ｒａｇｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｇｒａｍにより、施設のＩＡＣＵＣによる承認を得て以前に記載されている通り行われた（Brainard, D.M. et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of virology 83, 7305-7321 (2009)）。移植または分析用のＢＭ細胞を、それぞれ全ての肢または１つの大腿骨を粉砕することによって回収し、上記の通り処理した。マウスに麻酔をかけている間に、滅菌ＰＢＳ０．２ｍｌ中に懸濁させた２つのＢＭＣの皮下注射を背側側腹部に１６ゲージの針によって受けさせた。脊椎の各側に１つのＢＭＣを注射し、後肢と前肢のおよそ中間に位置させた。皮下小結節のサイズを、カリパスを使用して小結節の長さ、幅および高さを測定することによって経時的に数量化した。マウスの全てのコホート（一般には１０匹のマウス／群）から段階的に採血した。白血球、ヘモグロビン、赤血球、血小板、およびヘマトクリットレベルをＣＢＣ分析（Ａｂａｘｉｓ ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５）によって数量化した。

【0409】

ＢＭＣ由来の細胞が胸腺に移動するかどうかを直接評価するために、二重因子ＢＭＣを幹細胞治療と協調させて、致死的に照射処置したマウスの最初のセットに送達した（Ｂ６レシピエントに、二重因子ＢＭＣと共に１０００ｃＧｙのＬ－ＴＢＩおよび５×１０^５個系列枯渇ＧＦＰ ＢＭ細胞を受けさせた。ＨＳＣＴの１０日後、二重因子ＢＭＣを外植し、４８時間前にいかなる追加的な細胞移植も伴わずに５００ｃＧｙのＳＬ－ＴＢＩを受けたＢ６マウスの第２のセットの皮下ポケットにすぐに外科的に移植した。外科手術の２０日後、マウスを屠殺し、これらのマウスにおける胸腺細胞を分析した。

【0410】

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
ＣＤ８－αに対する抗マウス抗体（５３－６．７）、ＣＤ３－εに対する抗マウス抗体（１４５－２Ｃ１１）、Ｂ２２０に対する抗マウス抗体（ＲＡ３－６Ｂ２）、ＣＤ１１ｂに対する抗マウス抗体（Ｍ１／７０）、ＣＤ２５に対する抗マウス抗体（ＰＣ６１）、ＣＤ１１７に対する抗マウス抗体（２Ｂ８）、Ｓｃａ－１に対する抗マウス抗体（Ｄ７）、ＣＤ１２７に対する抗マウス抗体（Ａ７Ｒ３４）、およびＣＤ４５に対する抗ヒト抗体（Ｈ１３０）、ＣＤ３に対する抗ヒト抗体（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ４に対する抗ヒト抗体（ＳＫ３）、ＣＤ１９に対する抗ヒト抗体（ＨＩＢ１９）、ＣＤ３４に対する抗ヒト抗体（５８１）、ＣＤ３８に対する抗ヒト抗体（ＨＢ－７）およびＣＤ７に対する抗ヒト抗体（ＣＤ７－６Ｂ７）、ＩＦＮ－γに対する抗ヒト抗体（ＸＭＧ１．１）、ＴＮＦ－αに対する抗ヒト抗体（ＭＰ６－ＸＴ２２）および対応するアイソタイプ抗体をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。抗ヒトＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８）をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＣＤ４４（ＩＭ７）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｈ－２Ｋ^ｂ ＯＶＡ）をＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。全ての細胞を前方散乱および側方散乱の特徴に基づいてゲーティングして、死細胞を含むデブリを限定した。抗体を製造者の提言に従って希釈した。細胞を蛍光マイナス１対照に基づいてゲーティングし、各マーカーについての細胞染色陽性の頻度を記録した。Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞を数量化するために、血液試料を、赤血球溶解させ抗ＣＤ４５抗体、抗Ｂ２２０抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞の絶対数を、フローサイトメトリー頻度およびＣＢＣ分析によって得られた白血球値を使用して算出した。分析は、血液細胞についてはＣＤ４５＋および間質細胞についてはＣＤ４５－ゲートの範囲内のドナー事象に基づくものであった。

【0411】

骨、脂肪の数量化および組織学的検査
安楽死後、ＢＭＣおよび組織を外植した。骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＬＰ）を使用して骨を数量化するために、ＢＭＣおよび大腿骨を粉砕し、ホモジナイズし、７０ミクロンのフィルターで濾した。その後、ＢＡＬＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってＢＡＬＰを数量化した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を脂質数量化のために使用した。回収したＢＭＣおよび骨を製造者のプロトコールに従って洗浄し、固定し、処理し、染色した。その後、ＢＭＣおよび骨を粉砕し、濾し、等体積に再懸濁させた後、吸光度を測定した（ＯＤ_４９２）。組織学的染色のために、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定した。ＰＦＡに固定した試料を、急速脱灰用ギ酸／塩酸混合物（Ｄｅｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＶＷＲ）を使用して約４時間にわたって部分的に脱灰し、パラフィンワックスに包埋した。試料の切片（５μｍ）を常套的なトリクローム染色、Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色またはＶｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色で染色した。

【0412】

胸腺Ｔ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）の数量化
ＴＲＥＣ数量化を以前に記載されている通り実施した（Warnke, P. et al. Growth and transplantation of a custom vascularised bone graft in a man. The Lancet 364, 766-770 (2004)）。簡単に述べると、ＢＭＣを注射した（条件づけ後３０日）、照射処置していないＣ５７ＢＬ／６マウス、移植を受けたマウス、および移植を受けたマウスから胸腺を回収した。総ＤＮＡを、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｓｔｏｒｍ ＢＢＸ２４機器（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ，Ｉｎｃ．）においてＴＲＩＺＯＬ、その後、組織ホモジナイゼーションを使用して抽出した。ＤＮＡをＵＶ－Ｖｉｓによって数量化し、試料当たり１μｇのＤＮＡをリアルタイムＰＣＲの入力として使用した。マウスｓｊＴＲＥＣプラスミドの標準曲線を使用して、試料当たりの単一ジョイントＴＲＥＣＳ（ｓｊＴＲＥＣ）の絶対数を算出した。

【0413】

ＴＣＲ分析
抽出されたリンパ球ＲＮＡを、ＵＶ－Ｖｉｓを使用して数量化した。各試料由来の等モル量のＲＮＡを配列決定およびバイオインフォマティクス解析のためにｉＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅに提出し、そこで試料が逆転写され、ベータＴＣＲ ＲＮＡを特異的に増幅するプライマーセットを使用して増幅された。配列決定の結果から、各試料について総リードおよび独特のＣＤＲ３の数の範囲がもたらされた。

【0414】

ワクチン接種および非特異的Ｔ細胞－刺激試験
移植の３０日後、動物を、オボアルブミン（ＯＶＡ）１００μｇ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、１００μｇおよびＧＭ－ＣＳＦ、１μｇを含有するボーラスワクチンを用いて免疫化した。１０日後に、動物をオボアルブミンの静脈内注射で攻撃した。１２日目に、ワクチン接種試験で安楽死させたマウスから脾臓を収集した。７０μｍの細胞濾過器で脾臓を機械的に破壊することによって脾細胞を単離した。回収された組織中の赤血球を溶解させ、白血球を分析のために調製した。非特異的刺激のために、細胞をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋イオノマイシン（２μＭ）と一緒に５時間インキュベートした。２時インキュベートした後にブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍＬ）を添加した。次いで、細胞を回収し、洗浄し、Ｔ細胞表面抗原に対する、蛍光色素とコンジュゲートした抗体を用いて染色した。その後、細胞を固定し、固定／透過処理溶液キット試薬（ＢＤ）を用いて透過処理し、ＩＦＮ－γ特異的抗体、ＴＮＦ－α特異的抗体を用いて染色した。

【0415】

考察
ここで、無細胞バイオマテリアルに基づくＢＭＣが、造血幹細胞移植後のＴ細胞リンパ球新生骨髄ニッチの重要な特色を模倣し、免疫コンピテントＴ細胞の再生を促進することが実証された。皮下投与されたＢＭＣはｉｎ ｖｉｖｏにおいて宿主脈管構造とのインターフェースとなって宿主デバイスインターフェースを形成し、系列指令キューをドナーにより動員された前駆細胞に提示した。ＢＭＰ－２により、動員された間葉細胞の骨系列分化が誘導され、迅速な血管新生が間接的に促進されることが十分に確立されている（Smadja, D.M. et al. Bone morphogenetic proteins 2 and 4 are selectively expressed by late outgrowth endothelial progenitor cells and promote neoangiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 28, 2137-2143 (2008)。この研究において、初期の血管新生、その後の、脈管構造の内在性骨髄において観察されるものと一致する密度までの成熟化が観察された（Lafage-Proust, M.-H. et al. Assessment of bone vascularization and its role in bone remodeling. BoneKEy reports 4 (2015)）。ＢＭＣ内で数量化された種々の造血前駆体集団および間質前駆体集団が見いだされたことは、造血が異所性骨小結節において生じるという以前の観察と一致する（Kuznetsov, S.A. et al. The interplay of osteogenesis and hematopoiesis: expression of a constitutively active PTH/PTHrP receptor in osteogenic cells perturbs the establishment of hematopoiesis in bone and of skeletal stem cells in the bone marrow. J Cell Biol 167, 1113-1122 (2004)）；Song, J. et al. An in vivo model to study and manipulate the hematopoietic stem cell niche. Blood 115, 2592-2600 (2010)）。生体活性ノッチリガンドＤＬＬ－４をポリマースキャフォールドに組み込むことにより、系列枯渇骨髄移植片を受けた対照と比べてＢＭＣにおけるＴ細胞前駆体の生成の初期の増強が促進され、胸腺前駆体数の有意な増加が導かれ、対照は同系ＨＳＣＴおよび同種ＨＳＣＴの確立されたモデルと一致した（Wils, E.-J. et al. Flt3 ligand expands lymphoid progenitors prior to recovery of thymopoiesis and accelerates T cell reconstitution after bone marrow transplantation. The Journal of Immunology 178, 3551-3557 (2007)；Maillard, I. et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood 107, 3511-3519 (2006)。この所見は、ＴＲＥＣの生成の増強、ＴＣＲレパートリーの複雑さの増大およびワクチン接種有効性の増大の観察によって裏付けられる。

【0416】

ＢＭＣ手法は、ＨＳＣＴ後のＴ細胞再生を促進する他の戦略とは概念的にかつ実際に別個のものであり、ＨＳＣＴにおける関連性は、この研究において前臨床試験によって裏付けられる。ＢＭＣ手法をＴ細胞前駆体注入と比べて１０分の１の用量で使用したところ、胸腺および末梢においてより多数のＴ細胞前駆体および機能的Ｔ細胞がもたらされた。ＢＭＣ処置はＨＳＣＴ時に投与することができるという点で他の方法とは異なる。対照的に、Ｔ細胞前駆体は、ドナー造血細胞から２～４週間にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで作製され、前臨床モデルにおいて複雑な細胞培養要件を有し、また、患者特異的である。ｅｘ－ｖｉｖｏ培養を必要とせずにｉｎ ｖｉｖｏにおいて移植されたＨＳＣに対するキューを促進するＴ細胞をもたらすことにより、ＢＭＣ手法は既製の製品になり得、細胞製造に必要な考慮すべき基盤が回避され（Garber, K.（Nature Publishing Group, 2018）、また、サイトカイン治療の活性が補完され得る。ＨＳＣＴ前により低い線量を使用した場合、ＢＭＣにより末梢におけるＴ細胞再構成が多少増強されたが、胸腺におけるドナー由来Ｔ細胞生成およびドナーＴ細胞キメラ化は有意に増加した。所見から、ＢＭＣの適用が低強度のＨＳＣＴの状況に関連することが示唆される。

【0417】

異種ＮＳＧ－ＢＬＴマウスにおけるヒトＴ細胞の再構成の増強は、Ｂ細胞再構成の多少の一過性の減少を伴い、これはプレＢ ＣＦＵの対応する減少と一致する。このヒト化マウスモデルがヒト免疫細胞に広範に許容されるので、重要なマウスサイトカインが、このモデルにおけるヒトＣＤ３４^＋細胞からのヒトＢ細胞の発生を含めた造血の誘導に関して非効率的であることも分かっている（（Jangalwe, S., Shultz, L.D., Mathew, A. & Brehm, M.A. Improved B cell development in humanized NOD-scid IL2Rγ null mice transgenically expressing human stem cell factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3． Immunity, inflammation and disease 4, 427-440 (2016)）。ＢＭＣを播種する移植された細胞の画分のノッチ活性化により、Ｂ細胞特異化を犠牲にしてＴ細胞特異化が増強される可能性が高い。しかし、Ｂ細胞産生の一過性の減少は多少であり、臨床的意義がある可能性は低い。

【0418】

骨小結節の形成は、スキャフォールドの幾何学的形状に制限され、これは、非ヒト霊長類（Ripamonti, U. Bone induction by recombinant human osteogenic protein-1 (hOP-1, BMP-7) in the primate Papio ursinus with expression of mRNA of gene products of the TGF-β superfamily. Journal of cellular and molecular medicine 9, 911-928 (2005)）およびヒト（Heliotis, M., Lavery, K., Ripamonti, U., Tsiridis, E. & Di Silvio, L. Transformation of a prefabricated hydroxyapatite/osteogenic protein-1 implant into a vascularised pedicled bone flap in the human chest. International journal of oral and maxillofacial surgery 35, 265-269 (2006)；Warnke, P. et al. Growth and transplantation of a custom vascularised bone graft in a man. The Lancet 364, 766-770 (2004)）を含めた多くの種において忍容性が良好であった、スキャフォールドにより誘導される骨形成に関する以前の報告と一致する。他のスキャフォールドに基づくシステムを用いた過去の臨床経験では、デバイスのサイズが種間で一定のままにすることができることが示されている（Hodi, S. (2012)）。ヒトでの使用のために必要になり得る、より大きな増殖因子用量を用いる場合であっても、このポリマーに基づくヒドロゲルシステムによってもたらされる徐放性により、ＢＭＰ－２を、現在診療所で使用されている、ボーラス放出として送達され、望ましくない副作用が付随している大きな用量よりも数桁少ない用量で使用することが可能になることが予測される（Carragee, E.J., Hurwitz, E.L. & Weiner, B.K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery： emerging safety concerns and lessons learned. The Spine Journal 11, 471-491 (2011)）。Ｔ細胞再生後、ＢＭＣは、多くの場合ＨＳＣＴに使用される他のデバイスと同様に容易に除去することができる、または再吸収されるように生分解性材料で作製することができる（Biffi, R. et al. Use of totally implantable central venous access ports for high-dose chemotherapy and peripheral blood stem cell transplantation: results of a monocentre series of patients. Annals of oncology 15, 296-300 (2004)）。

【0419】

同種ＨＳＣＴ後のＣＤ４^＋Ｔ細胞回復は通常は遅延し、正常なＣＤ４／ＣＤ８比の逆転が導かれる（Li, M.O. & Rudensky, A.Y. T cell receptor signalling in the control of regulatory T cell differentiation and function. Nature Reviews Immunology 16, 220 (2016)）。ＢＭＣで処置したマウスでは、ヒト化および同種移植を受けたマウスの胸腺および脾臓におけるＴ細胞のより多くのバランスの取れた再構成およびドナーＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の増強が認められた。ドナーＴ_ｒｅｇのＧＶＨＤ抑制における重要な役割を考慮すると（Hoffmann, P., Ermann, J., Edinger, M., Fathman, C.G. & Strober, S. Donor-type CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells suppress lethal acute graft-versus－host disease after allogeneic bone marrow transplantation. Journal of Experimental Medicine 196, 389-399 (2002)）、ドナーＴ_ｒｅｇ生成のＢＭＣ媒介性増強は、ＧＶＨＤ様病理の軽減に寄与し、潜在的にＴ_ｒｅｇ増大の重要な制御因子であるＴＧＦ－ベータファミリータンパク質によるＢＭＰ－２制御を通じてマウスの生存を増強した可能性が高い（（Wan, Y.Y. & Flavell, R.A. 'Yin-Yang' functions of transforming growth factor-β and T regulatorycells in immune regulation. Immunological reviews 220, 199-213 (2007)）。さらに、同種ＧＶＨＤモデルにおける時間経過は、既存のＴ委任または成熟Ｔ細胞に影響を及ぼすことに起因するＢＭＣの役割の少なくとも一部と一致する。

【0420】

要するに、これらの所見から、ＢＭＣは、ＨＳＣＴ後のＴ細胞再生を増強することができる投与しやすい既製システムであることが示唆される。ＢＭＣシステムをヒトの状況において同様に実施する場合、潜在的に治癒的なＨＳＣＴの臨床的適用を限定している免疫学的併発症および日和見感染症を抑止する手段になり得る。

【0421】

参照による組込み
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含めた本出願が支配する。

【0422】

等価物
常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を当業者は理解されよう、または確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E-F】

【図2G】

【図2H-I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K-M】

【図3N-O】

【図3P】

【図3Q】

【図3R】

【図3S】

【図3T】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E-F】

【図4G-H】

【図4I-J】

【図4K-L】

【図4M】

【図4N】

【図5A-B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I-J】

【図5K】

【図5L】

【図5M-N】

【図5O-P】

【図5Q】

【図6A-B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【国際調査報告】