特表2022-514573転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-14
(54)【発明の名称】転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20220204BHJP
A61K 31/585 20060101ALI20220204BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20220204BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220204BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220204BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220204BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220204BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20220204BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220204BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K31/585
A61K31/704
A61K31/7088
A61K31/7105
A61P35/04
A61K48/00
C12N9/14 ZNA
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021535057
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(85)【翻訳文提出日】2021-08-03
(86)【国際出願番号】 EP2019086633
(87)【国際公開番号】W WO2020127943
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】18214978.1
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515160921
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート バーゼル
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】アセト，二コラ
(72)【発明者】
【氏名】グカウンテラ，ソフィア
【テーマコード（参考）】
4B050
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050DD11
4B050LL01
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA13
4C086EA16
4C086EA19
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、血流中のＣＴＣクラスターの存在によって定義されるがん患者における転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関する。特定の実施形態では、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼは強心配糖体であり、ジギトキシン、ウアバイン、コンバラトキシン、プロシラリジン、ラナトシドＣ、ギトホルメート、ペルボシド、ストロファンチジン、メチルジゴキシン、デスラノシド、ブファリン、ジゴキシン及びジゴキシゲニンから選択される。本発明はさらに、ＣＴＣクラスターの形成及び維持に関する遺伝子の発現を阻害する核酸剤の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんの転移の予防又は治療に使用するための、特に血流中のＣＴＣクラスターの存在を特徴とするがんに使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項2】
前記阻害剤は、強心配糖体である、請求項１に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項3】
強心配糖体は、カルデノリド及びブファジエノリドから選択される、請求項２に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項4】
強心配糖体は、ジギトキシン、ウアバイン、コンバラトキシン、プロシラリジン、ラナトシドＣ、ギトホルメート、ペルボシド、ストロファンチジン、メチルジゴキシン、デスラノシド、ブファリン、ジゴキシン及びジゴキシゲニンから選択される、請求項２に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項5】
強心配糖体は、ジゴキシン、ジギトキシン及びウアバインから選択され、特に強心配糖体は、ジゴキシンである、請求項２～４のいずれか一項に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項6】
強心配糖体は、ジゴキシンであり、ジゴキシンの１日用量は、０．１２５ｍｇ～０．２５ｍｇである、請求項５に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項7】
強心配糖体は、ジゴキシンであり、ジゴキシン血清レベルは、０．７０ｎｇ／ｍｌ～１．０ｎｇ／ｍｌの間に調整される、請求項５に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項8】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、ＣＴＣクラスターの破壊に有効である、請求項１～７のいずれか一項に記載の転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項9】
がんに関連する静脈血栓塞栓症の予防及び治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項10】
前記がんは、乳がん又は前立腺がんである、請求項１～９のいずれか一項に記載の、がんの転移の予防又は治療、又はがんに関連する静脈血栓塞栓症の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤。
【請求項11】
がん患者における転移性がんの治療又は予防に使用するため、又は静脈血栓塞栓症の予防及び治療に使用するための、－ ＣＬＤＮ３
－ ＣＬＤＮ４、及び
－ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、又はその構成サブユニットのアイソフォームのいずれか
から選択されるタンパク質をコードする標的核酸配列の発現をダウンレギュレート又は阻害することができる阻害剤の核酸配列を含むか、又はそれからなる核酸分子。
【請求項12】
前記阻害剤の核酸配列は、－ 前記標的核酸配列に含まれるエキソン、
－ 前記標的核酸配列に含まれるイントロン、
－ 前記標的核酸配列の発現を調節するプロモーター領域、及び／又は
－ 前記標的核酸配列の発現を制御する補助配列、
の配列又は部分配列と特異的にハイブリダイズすることができる、請求項１１に記載の転移性がんの治療又は予防に使用するための核酸分子。
【請求項13】
前記阻害剤の核酸配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１１又は１２に記載の転移性がんの治療又は予防に使用するための核酸分子。
【請求項14】
前記阻害剤の核酸配列は、ヌクレオシド類似体を含むか、又はそれからなる、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の転移性がんの治療又は予防に使用するための核酸分子。
【請求項15】
前記がんは、乳がん又は前立腺がんである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の、がん患者における転移性がんの治療又は予防に使用するための、又は静脈血栓塞栓症の予防及び治療に使用するための核酸分子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関するものである。
【0002】
本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された欧州特許出願第１８２１４９７８．１号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
通常、骨、肺、肝臓、及び脳へのがんの転移拡散は、がん関連の死亡の大部分を占めている。上皮がんの転移は、一連の連続した工程：血流への血管内侵入をもたらす原発腫瘍内の個々の細胞の上皮間葉移行（ＥＭＴ）、血流内のそのような循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の生存、そして最後に、遠隔部位でのそれらの血管外遊出を含み、間葉上皮移行（ＭＥＴ）が上皮転移性の沈着として増殖に至ると考えられている。
【0004】
循環腫瘍細胞は、がん性腫瘍から出発して、播種転移に向かう途中で血流に入る細胞である（Ａｌｉｘ－Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓｅｔら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９、１１０－１１８、２０１３）。ＣＴＣの分析は、転移プロセスの基本的な特徴を解明し、標的となるがんの脆弱性を特定することを可能にすると期待されている。血流に入ると、ＣＴＣは生き残るために、原発腫瘍からの接着シグナルの喪失、並びに循環器系の適切な高せん断力を克服する必要がある。乳がんでは、クラスターを形成するＣＴＣの能力は、単独のＣＴＣと比較した場合、転移傾向の増加につながっている（Ａｃｅｔｏら；Ｃｅｌｌ １５８、１１１０－１１２２，２０１４）。
【0005】
ＣＴＣは、単独のＣＴＣ及びＣＴＣクラスターとしてがん患者の血液中に見られ（Ｆｉｄｌｅｒ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９、２２３－２２７ １９７３；Ｌｉｏｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６、８８９－８９４ １９７６）、後者のクラスターはより高い転移を播種する能力を特徴とする（Ａｃｅｔｏら、Ｃｅｌｌ １５８、１１１０－１１２２，２０１４）。しかし、何が転移の可能性を高めるのか、及び何がクラスター化ＣＴＣの脆弱性であるかは未知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ａｌｉｘ－Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓｅｔら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９、１１０－１１８、２０１３
【非特許文献2】Ａｃｅｔｏら；Ｃｅｌｌ １５８、１１１０－１１２２，２０１４
【非特許文献3】Ｆｉｄｌｅｒ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９、２２３－２２７ １９７３
【非特許文献4】Ｌｉｏｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６、８８９－８９４ １９７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の最新技術に基づいて、本発明の目的は、がん患者における転移を予防及び治療するための手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
この目的は、本明細書の特許請求の範囲によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1-1】図１は、ヒトの単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化解析を示す図である。Ａ）ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲの細胞表面発現について、生ＣＴＣを染色し（Ａｌｅｘａ４８８又はＦＩＴＣ結合）、汚染白血球を識別するためにＣＤ４５に対する抗体で対比染色を行った。Ｂ）主成分分析であり、主に、単独ＣＴＣ（三角）と比較してより不均一であるＣＴＣクラスター（丸）を用いて、元の患者に基づくＣＴＣを分離した。
【図1-2】図１は、ヒトの単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化解析を示す図である。Ｃ）ＮＥＳスコアであり、ｉ－ｃｉｓＴａｒｇｅｔを用いて同定されたＣＴＣクラスターの低メチル化領域（ｎ＝１３０５）及び単独のＣＴＣの低メチル化領域（ｎ＝２０４２）における転写因子結合部位（ＴＦＢＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を表す。Ｄ）ＣＴＣクラスターの低メチル化領域に位置する１６６個の遺伝子について、遺伝子オントロジー（ＧＯ）のエンリッチメント解析を行った（ｐ＝＜０．０５）。
【図2】図２は、マウス異種移植片側の単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化解析結果を示す図である。Ａ）ＮＥＳスコアであり、ｉ－ｃｉｓＴａｒｇｅｔを用いて同定した、ＣＴＣクラスターの低メチル化領域（ｎ＝９０９）及び単独ＣＴＣの低メチル化領域（ｎ＝５２１）における転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の濃縮を表す。Ｂ）ＴＦＢＳの非常に小さなサブセットしか、単独ＣＴＣ（ｎ＝１３）又はＣＴＣクラスター（ｎ＝９）のいずれかで優先的に低メチル化されない。
【図3-1】図３は、乳がん患者から単離された単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＲＮＡシーケンス解析結果を示す図である。Ａ）ＣＴＣクラスター関連モジュールで同定された転写産物のネットワーク解析、Ｂ）遺伝子制御ネットワーク解析であり、低メチル化結合部位も示すＴＦのＳＩＮ３Ａ、ＯＣＴ４、及びＣＢＦＢに転写因子が依存していることを示している。
【図3-2】図３は、乳がん患者から単離された単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＲＮＡシーケンス解析結果を示す図である。Ｃ）異種移植片由来のＣＴＣクラスターのＲＮＡシーケンス分析であり、ＳＩＮ３Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＯＲＡ、ＦＯＸＯ１、ＢＨＬＨＥ４０などの有意に低メチル化された結合部位を持つ患者のＣＴＣクラスターのＴＦに濃縮されることがわかった遺伝子に加えて示される。Ｄ）ＣＴＣクラスターの低メチル化領域に位置する遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント分析。
【図3-3】図３は、乳がん患者から単離された単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＲＮＡシーケンス解析結果を示す図である。Ｅ）単独ＣＴＣの転写因子標的遺伝子分析であり、ｃ－ＭＹＣ及びＥ２Ｆ４の活性がさらに確認された。
【図4-1】図４は、ＣＴＣクラスターを解離するＦＤＡ承認の化合物のスクリーニングを示す。Ａ）左のパネル：Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＴＭＲＭで染色された安定状態の「ろ過未処理」及び４０μＭでろ過処理されたＢＲ１６細胞の代表的な画像。画像はハイコンテントスクリーニング顕微鏡で撮影された。右のパネル：Ｃｏｌｏｍｂｕｓ画像データ分析システムを使用して決定されたとおり、核の近接性（それぞれの左のパネル画像から導出）に基づく単独及びクラスター化されたＣＴＣの輪郭の代表的な画像。棒グラフは、ろ過未処理のＢＲ１６細胞とろ過処理のＢＲ１６細胞の平均クラスターサイズ（μｍ２単位の面積）と生存率（％）を示す（ｎ＝３；ＮＳ：有意ではない；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4-2】図４は、ＣＴＣクラスターを解離するＦＤＡ承認の化合物のスクリーニングを示す。Ｂ）上部パネル：プロットは、４つの異なる濃度：５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭの３９個のクラスター標的化合物のそれぞれで処理されたＢＲ１６細胞の平均クラスターサイズを示す。クラスター標的化合物には、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（ｎ＝６）、ＨＤＡＣ（ｎ＝２）、ヌクレオチド生合成（ｎ＝５）、キナーゼ（ｎ＝４）、ＧＰＣＲ（ｎ＝２）、コレステロール生合成（ｎ＝１）及び核外輸送（ｎ＝１）、並びにチューブリン（ｎ＝９）及びＤＮＡ結合（ｎ＝８）化合物及び抗生物質（ｎ＝１）を含む。未処理又は未処理及び４０μＭろ過処理のＢＲ１６細胞は、比較のための対照として示されている。２回の独立した測定値の平均値が示される。下のパネル：示される濃度のクラスター標的化合物で治療されたＢＲ１６細胞の核数、平均ＴＭＲＭ強度、及び生存率％を示すヒートマップ。
【図5】図５は、ＢＲ１６及びＢＲｘ５０細胞株を５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、及び１ｎＭの濃度のジギトキシン、ウアバイン八水和物、及びリゴサチブで１７日間インビトロ治療した場合の、未処理又は未処理及び更なる４０μＭのろ過処理の細胞と比較したクラスターサイズ、核数、ＴＭＲＭ強度及び生存率％の減少に対する効果を示す。
【図6】図６は、ＣＴＣ由来細胞株のジギトキシン及びウアバインでの治療の効果を示す。（Ａ）ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４のダブルノックアウト（ＫＯ）を伴うＢＲ１６細胞上のＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４及びＧＡＰＤＨのウエスタンブロット。ＫＯ＝ノックアウト（Ｂ）対照ＢＲ１６細胞と比較した、ＣＬＤＮ３／４ダブルＫＯのＢＲ１６細胞の平均クラスターサイズ（μｍ２単位の面積）の減少を示すプロット。スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。
【図7】図７は、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤による治療は自然転移の形成を抑制することを示す；（Ａ）実験の概略図；（Ｂ）プロットは、２０ｎＭのジギトキシン又はウアバインで前治療したＢＲ１６細胞の尾静脈注射時の０日（左）及び１日（右）の総生物発光光束（Ｆｌｕｘ）を示す。ｎ＝５；スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５。ＮＳ＝有意でない。エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。（Ｃ）２０ｎＭのジギトキシン又はウアバインで前治療したＢＲ１６細胞の尾静脈注射時の７２日間にわたる転移増殖曲線。ｎ＝５；スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳ＝有意でないエラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。（Ｄ）実験の概略図。（Ｅ）プロットは、ウアバインで治療したＢＲ１６異種移植片の血液中に検出された自然発生的な単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターの割合（％）を示す。ｎ＝１１（対照）、ｎ＝５（ウアバイン）、スチューデントのｔ検定による＊＊＊Ｐ＜０．００１、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。（Ｆ）プロットは、ウアバインで治療したＢＲ１６異種移植片の転移指数を示す。ｎ＝１１（対照）、ｎ＝５（ウアバイン）；スチューデントのｔ検定による＊＊Ｐ＜０．０１、ＮＳ＝有意でない。エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。（Ｇ）対照及びウアバイン治療のＮＳＧマウスの脳及び肝臓で測定された生物発光シグナルの代表的な画像。
【図8】図８は、ジギトキシン及びウアバインによる治療は転移形成を減少させることを示す。（Ａ）プロットは、ジギトキシン又はウアバインを用いてインビトロで治療された、ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞を用いた注射における０日（左）又は１日（右）でのＮＳＧマウスの肺で検出されたＫｉ６７陽性のがん細胞の割合を示す。がん細胞は、パンサイトケラチン染色によって同定される；各条件についてｎ＝４匹のマウス。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｂ）プロットは、ジギトキシン又はウアバインを用いてインビトロで治療された、ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞を注射した０日（左）又は１日（右）にＮＳＧマウスの肺で検出されたカスパーゼ３陽性のがん細胞の割合を示す。がん細胞は、パンサイトケラチン染色によって同定される；各条件についてｎ＝４匹のマウス。スチューデントのｔ検定による＊Ｐ＜０．０５。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｃ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＢＲ１６異種移植片の原発腫瘍から放出された総生物発光光束を示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｄ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＢＲ１６異種移植片の血液１ｍＬあたりに検出された単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの両方を含むＣＴＣの総数を示す。対照についてはｎ＝５、ウアバインについてはｎ＝５。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｅ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＬＭ２異種移植片の血液で検出された自然生成した単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのパーセント（％）を示す。対照についてはｎ＝１１、ウアバインについてはｎ＝８。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｆ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＬＭ２異種移植片の原発腫瘍から放出された総生物発光光束を示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｇ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＬＭ２異種移植片の血液１ｍＬあたりに検出された単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの両方を含むＣＴＣの総数を示す。対照についてはｎ＝１１、ウアバインについてはｎ＝８。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＮＳ＝有意でない。（Ｈ）プロットは、ビヒクル（対照）又はウアバインで治療されたＬＭ２異種移植片の転移指数を示す。対照についてはｎ＝１９、ウアバインについてはｎ＝８。スチューデントのｔ検定による＊＊Ｐ＜０．０１。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図10】プロットは、ビヒクル（対照）又はジゴキシン（２ｍｇ／ｋｇ）で治療したＢＲ１６異種移植片の経時的な腫瘍成長率を示す。有意な差は観察されない（いずれもＰ＞０．０５）。
【図11】プロットは、ビヒクル（対照）又はジゴキシン（２ｍｇ／ｋｇ）で治療したＢＲ１６異種移植片における単独ＣＴＣ、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－好中球クラスター（単独ＣＴＣ－ＷＢＣ及びＣＴＣクラスター－ＷＢＣとして表される）の数を示す。ジゴキシンの治療により、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－好中球クラスターの数が明らかに減少する。
【図12】プロットは、ビヒクル（対照）又はジゴキシン（２ｍｇ／ｋｇ）で治療されたＢＲ１６異種移植片の転移指数を示す。ジゴキシンを用いた治療により、転移が抑制される。
【図13】プロットは、ビヒクル（対照）又はジゴキシン（２ｍｇ／ｋｇ）で治療したＬＭ２異種移植片の経時的な腫瘍成長率を示す。有意な差は観察されない（いずれもＰ＞０．０５）。
【図15】プロットは、ビヒクル（対照）又はジゴキシン（２ｍｇ／ｋｇ）で治療されたＬＭ２異種移植片のＣＴＣ倍率変化を示す。ジゴキシンによる治療は、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ好中球クラスターの形成を減少させる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
発明の概要
本発明者らは、ゲノム全域規模での単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化の状況をプロファイルし、これは個々のがん患者及びヒトＣＴＣ由来の異種移植片内で一致した。彼らは驚くべきことに、幹細胞性関連転写因子が、ＣＴＣクラスターでのみ活性なＯＣＴ４中心のネットワークを調整し、同時にＣＴＣクラスターがＳＩＮ３Ａ依存性の細胞周期進行プログラムの活性化を示すことを発見した。この発見は、クラスターを形成するＣＴＣの能力が、それらのＤＮＡメチル化パターンに直接影響を及ぼし、転移の播種に有利な幹細胞性及び細胞周期進行のシグナルの増強をもたらすことを示している。
本発明者らは、ゲノム全域規模での単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化の状況をプロファイルし、これは個々のがん患者及びヒトＣＴＣ由来の異種移植片内で一致した。彼らは驚くべきことに、幹細胞性関連転写因子が、ＣＴＣクラスターでのみ活性なＯＣＴ４中心のネットワークを調整し、同時にＣＴＣクラスターがＳＩＮ３Ａ依存性の細胞周期進行プログラムの活性化を示すことを発見した。この発見は、クラスターを形成するＣＴＣの能力が、それらのＤＮＡメチル化パターンに直接影響を及ぼし、転移の播種に有利な幹細胞性及び細胞周期進行のシグナルの増強をもたらすことを示している。
【0011】
本発明者らは、それらの細胞生存能力を変えることなく、ＣＴＣクラスターを特異的に破壊する薬物を同定した。単独細胞へのクラスターの破壊により、重要な部位でＤＮＡメチル化が回復し、クラスター関連幹細胞性及び細胞周期のプログラムが停止され、転移性播種能力の大幅な低下をもたらす。
【0012】
本発明の第１の態様は、がん患者の転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関する。
【0013】
本発明の第２の態様は、以下から選択されるタンパク質：
－ ＣＬＤＮ３
－ ＣＬＤＮ４、及び
－ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、又はその構成サブユニットアイソフォームのいずれか
をコードする標的核酸配列の核酸媒介性の治療的ダウンレギュレーション又は阻害の発現に関する。
－ ＣＬＤＮ３
－ ＣＬＤＮ４、及び
－ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、又はその構成サブユニットアイソフォームのいずれか
をコードする標的核酸配列の核酸媒介性の治療的ダウンレギュレーション又は阻害の発現に関する。
【0014】
本発明の第３の態様は、がん患者の静脈血栓塞栓症の予防及び治療における本発明に従うＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤又は核酸分子の使用に関する。
【0015】
用語と定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。以下に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、記載されている定義が優先するものとする。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。以下に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、記載されている定義が優先するものとする。
【0016】
本明細書で使用されるとおり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の類似の形態、及びそれらの文法的な同等なものは、意味において同等であり、かつオープンエンドであり、これらの単語のいずれか一つに続く項目は、そのような項目の完全な一覧であることを意味するものではなく、一覧の項目のみに限定されることを意味するものでないことを意図している。例えば、構成要素Ａ、Ｂ、及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものは、構成要素Ａ、Ｂ、及びＣからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）（すなわち、それらのみを含有する）ことができるか、又は構成要素Ａ、Ｂ、及びＣだけでなく、１つ又は複数の他の構成要素も含むことができる。したがって、「含む」及びその類似の形態、並びにそれらの文法的な同等なものは、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図され、理解される。
【0017】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限と、言及された範囲内の他のいずれの言及の又は中間の値との間の各中間値は、本開示に包含され、言及の範囲においていずれの特定の限界は除外される。言及の範囲が一方又は両方の限界を含む場合、含まれた限界のいずれか又は両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。
【0018】
「約（ａｂｏｕｔ）」に関して、本明細書における値又はパラメータは、その値又はパラメータ自体に向けられた変動を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」を示す記述には、「Ｘ」の記述を含む。
【0019】
添付の特許請求の範囲を含み本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「又は（ｏｒ）」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
【0020】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子的、遺伝的及び生化学的な方法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）及び化学的方法に使用される。
【0021】
本明細書の文脈において「ハイブリッド又はハイブリダイズする配列を形成することができる」という用語は、哺乳動物細胞のサイトゾル内に存在する条件下で、それらの標的配列に選択的に結合することができる配列に関する。そのようなハイブリダイズする配列は、標的配列に対して連続的に逆相補的であることが可能であるか、又はギャップ、ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）又は更なる不一致（ｎｏｎ－ｍａｔｃｈ）ヌクレオチドを含むことができる。ハイブリッドを形成できる配列の最小の長さは、その組成に依存し、Ｃ又はＧのヌクレオチドは、Ａ又はＴ／Ｕのヌクレオチドよりも結合エネルギーに大きく寄与し、かつ骨格化学に依存する。
【0022】
本明細書の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸類似体のビルディングブロック、塩基対形成に基づいて、ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することができるオリゴマーに関する。この文脈における「ヌクレオチド」という用語は、古典的なリボヌクレオチド構成ブロックであるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン及びデオキシシチジンを含む。それはさらに、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシンユニット、グリシンのアルファ－炭素に結合した核酸塩基を有する）などの核酸の類似体、又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡビルディングブロック）を含む。本明細書で「ハイブリダイズする配列」に言及する場合はいつでも、そのようなハイブリダイズする配列は、上記のヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成され得る。
【0023】
「遺伝子」という用語は、転写及び翻訳された後に特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列を使用して、それらが結合する遺伝子のより大きな断片又は完全長のコーディング配列を同定することができる。より大きな断片の配列を単離する方法は、当業者に知られている。
【0024】
「遺伝子発現」又は代替的に「遺伝子産物」という用語は、遺伝子が転写及び翻訳される場合に生成される核酸（ＲＮＡ）又はアミノ酸（例えば、ペプチド又はポリペプチド）のプロセス及びその産物を指す。
【0025】
本明細書で使用されるとおり、「発現」は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、発現には真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【0026】
本明細書の文脈における「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡに本質的に相補的であり、かつそれにハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。このようなＲＮＡに対するアンチセンス作用は、ＲＮＡの生物学的作用の調節、特定の阻害又は抑制をもたらす。ＲＮＡがｍＲＮＡの場合、得られる遺伝子産物の発現は阻害又は抑制される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体及び／又はそれらの混合物からなることができる。当業者は、所与の標的に対する理論的に最適なアンチセンス配列を計算するための様々な商業的及び非商業的な供給元を知っている。最適化は、核酸塩基の配列の観点及び骨格（リボ、デオキシリボ、類似体）の組成の観点の両方で行うことができる。一般に固相合成によって合成される実際の物理的オリゴヌクレオチドの配送のための多くの供給元が存在する。
【0027】
本明細書の文脈における「ｓｉＲＮＡ」（低分子／短鎖干渉ＲＮＡ）という用語は、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスにおけるｓｉＲＮＡの配列に相補的、又はそれにハイブリダイズする核酸配列を含む遺伝子の発現を干渉する（言い換えれば、発現を阻害又は防止する）ことができるＲＮＡ分子に関する。ｓｉＲＮＡという用語は、一本鎖ｓｉＲＮＡと二本鎖ｓｉＲＮＡの両方を包含することを意味する。ｓｉＲＮＡは通常１７～２４個のヌクレオチドの長さを特徴としている。二本鎖ｓｉＲＮＡは、より長い二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）から誘導することができる。一般的な理論によれば、より長いｄｓＲＮＡはエンドリボヌクレアーゼ（ダイサーと呼ばれる）によって切断され、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。核タンパク質複合体（ＲＩＳＣと呼ばれる）では、二本鎖ｓｉＲＮＡが巻き戻されて一本鎖ｓｉＲＮＡが形成される。ＲＮＡ干渉は、相補的な配列を持つｍＲＮＡ分子へのｓｉＲＮＡ分子の結合を介して機能することが多く、ｍＲＮＡの分解をもたらす。ＲＮＡ干渉は、細胞核内のプレｍＲＮＡ（未成熟でスプライシングされていないｍＲＮＡ）のイントロン配列にｓｉＲＮＡ分子が結合し、プレｍＲＮＡの分解を引き起こすことによっても可能である。
【0028】
本明細書の文脈における「ｓｈＲＮＡ」（小ヘアピンＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用できるタイトなヘアピンターンを備えた人工ＲＮＡ分子に関する。
【0029】
本明細書の文脈における「ｓｇＲＮＡ」（シングルガイドＲＮＡ）という用語は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）メカニズムを介して遺伝子発現の配列特異的抑制が可能なＲＮＡ分子に関する。
【0030】
本明細書の文脈における「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）という用語は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する小さなノンコーディングＲＮＡ分子（約２２個のヌクレオチドを含む）に関する。
【0031】
本明細書の文脈における「阻害剤」という用語は、標的分子の生理学的機能、活性又は合成を有意に減少又は完全に無効にすることができる化合物に関する。抽象レベルでは、阻害には、標的物の生合成の干渉、酵素－基質結合の防止（標的は基質又は酵素である）、リガンド－受容体相互作用の防止などを包含する。
【0032】
本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）を「治療する」又はその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を改善すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つを遅らせるか、阻止するか、又は減らすこと）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、患者が認識できない可能性があるものを含む、少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、物理的（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれか、又はその両方で、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価するための方法は、特に以下に記載されていない限り、当技術分野で一般に知られている。
【0033】
本明細書の文脈において、「転移の予防又は治療」という用語は、治療前には存在しなかった新しい転移の形成を阻害するプロセスに関する。これには、循環中のがん細胞の生存率の低下、血流からのがん細胞の血管外遊出の阻害、及び血管外漏出部位での播種プロセスの阻害が含まれるが、これらに限定されない。
【0034】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、がん患者の転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関する。いずれのがん患者、特に転移のリスクが高い病期にあるがん患者は、ＣＴＣの存在によって媒介されるか、又はそれを伴う転移性疾患を発症するリスクがあると見なされ得る。
本発明の第１の態様は、がん患者の転移の予防又は治療において使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関する。いずれのがん患者、特に転移のリスクが高い病期にあるがん患者は、ＣＴＣの存在によって媒介されるか、又はそれを伴う転移性疾患を発症するリスクがあると見なされ得る。
【0035】
特定の実施形態では、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、血流中のＣＴＣクラスターの存在を特徴とするがんの治療のために提供される。そのような実施形態では、ＣＴＣの存在は、本発明に従う治療の一基準となる。
【0036】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼは、細胞内のイオン及び浸透圧のバランスを維持する重要なエネルギー消費ポンプとして機能する、全ての高等真核生物に見られる膜貫通型タンパク質複合体である。これは、ナトリウムを細胞の外へポンプし、カリウムを細胞内にポンプする酵素（ＥＣ ３．６．３．９）である。両方のイオンは、電気化学的勾配に逆らって動的にポンプされ、ＡＴＰの形でエネルギーを消費する。
【0037】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼはサブユニットで構成されており、それはアンチセンス又は他の核酸を介した介入（ＣＲＩＳＰＲなど）によって標的化され得る。サブユニットはアルファアイソフォーム：ＡＴＰ１Ａ１（α１）、ＡＴＰ１Ａ２（α２）、ＡＴＰ１Ａ３（α３）、及びＡＴＰ１Ａ４（α４）、及びベータアイソフォーム：ＡＴＰ１Ｂ１（β１）、ＡＴＰ１Ｂ２（β２）、ＡＴＰ１Ｂ３（β３）、及びＡＴＰ１Ｂ４（β４）である。介入は、任意のサブユニットを特異的に標的とすることも、共通の配列内容に基づいてサブユニットの組み合わせを標的とすることも、同一のｍＲＮＡ配列トラクトに基づいてアルファ及び／又はベータのサブユニットの全てのアイソフォームを標的とすることもできる。
【0038】
本発明の特定の文脈では、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼの阻害剤は、標的の酵素機能、すなわちナトリウムイオン及びカリウムイオンのポンピングを有意に減少又は無効にする。
【0039】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼの阻害剤の例として、科学的化合物の様々な群が知られている。ある群には、天然に存在する阻害剤及び合成阻害剤を含む、十分に研究された強心配糖体を含む。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤の他の例は、アンドロステン及びアンドロステンのアザヘテロシクリル誘導体、特にイスタロキシム（ＣＡＳ ２０３７３７－９３－３）などのステロイド性Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤である。
【0040】
特定の実施形態では、本発明に従う阻害剤は、新しい転移の形成を減少又は防止する。特定の実施形態では、本発明に従う阻害剤は、すでに存在する転移の治療において有用である。特定の実施形態では、本発明に従う阻害剤は、転移の予防及び治療の両方において活性である。
【0041】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明に従う転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤がＣＴＣクラスターを破壊し、ＣＴＣクラスターと比較して、転移の形成の可能性を有意に減少する単独のＣＴＣをもたらす。血流中にＣＴＣクラスターを有する及び／又はＣＴＣクラスターのリスクが高いがん患者は、本発明の阻害剤から最も利益を受けることが期待される。転移はＣＴＣクラスターの存在に関連し、かつこれは全ての状況では関連しないため、ＣＴＣクラスターの検出が可能であり、本明細書に開示される治療は、原発腫瘍から遠隔転移を発症するリスクがあると疑われるがん患者にとって有益である。
【0042】
特定の実施形態では、該阻害剤（又は以下にさらに記載されるような核酸剤）は、乳がん又は前立腺がんで使用するために提供される。
【0043】
通常、乳がん及び前立腺がんの患者は、ＣＴＣクラスターの発生率が最も高い。しかしながら、全てのがんの種類において、ＣＴＣクラスターが検出されており、したがって、本発明のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、全般にがん患者に有益であると期待される。
【0044】
血流中の「ＣＴＣクラスターの存在」という用語は、血流中のどこかにＣＴＣクラスターを有するがん患者に関する。特に、大きなＣＴＣクラスターは、ＣＴＣクラスターが血管の毛細血管床に直ちに留まるため、末梢血試料で検出するのが難しい場合がある。したがって、末梢血試料に検出可能なＣＴＣクラスターがないことは、血流の全ての場所にＣＴＣクラスターがないことを必ずしも示すものではない。したがって、当業者は、ＣＴＣクラスターを検出するための採血の位置は、ＣＴＣクラスターを放出している原発腫瘍又は転移の位置に応じて選択されなければならないことを認識している。
【0045】
血液試料中のＣＴＣクラスターを検出及び／又は単離するための知られている方法には、細胞密度、サイズ、誘電特性、又は機械的可塑性の違いを利用する物理的特性に基づく方法が含まれる。例えば、サイズ選択に基づく方法では、他の血液細胞に比べてＣＴＣ（及びＣＴＣクラスター）のサイズが大きいことを利用している。サイズに基づく検出／単離の方法の非限定的な例には、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘデバイスの使用がある（Ｘｕら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１３８０３２，２０１５）。別の方法には、Ｓｈｉｍらによって公開された方法がある（Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ２０１３、７（１）：１１８０７ ｄｏｉ：１０．１０６３／１．４７７４３０４）。特定の実施形態では、ＣＴＣを検出するためのデバイスは、国際特許出願第２０１５／０７７６０３号／米国特許出願第２０１６／２７９６３７（Ａ１）号、又は国際特許出願第２０１８／００５６４７（Ａ１）号／米国特許出願第２０１９／１６０４６４（Ａ１）号に開示されるとおりマイクロ流体デバイスである。特定の実施形態では、デバイスは、米国特許出願第２０１４／２７１９９０（Ａ１）号に開示されるとおりのマイクロ流体デバイスである。本明細書に引用されている特許文書はいずれも、参照により完全に組み込まれている。
【0046】
がん患者におけるＣＴＣクラスターの検出／単離のための他の既知の方法は、抗体に基づく方法である。使用される抗体は、主に血液又は間質細胞には存在しない上皮細胞表面マーカーに特異的である。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（ＰＬｏＳ １ ４月１２日， ２０１７年；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７５４１４）も参照。
【0047】
本明細書の文脈において、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）という用語は、がん性腫瘍から出発し、血流に入り、播種転移に向かう細胞に関する。ＣＴＣは、原発腫瘍及び確立された転移に由来することが可能である。したがって、本発明の阻害剤は、がん患者がすでに確立した転移を有するかどうかに関係なく、がん患者の治療に有用である。
【0048】
本明細書の文脈において、「ＣＴＣクラスター」という用語は、一般的には２～５０個のＣＴＣを含む循環腫瘍細胞の凝集体に関する（Ａｃｅｔｏら、Ｃｅｌｌ ２０１４ 同上）。
【0049】
本明細書で使用されるとおり「がん」という用語は、肺がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、腎がん、直腸がん、肝臓がん、脳がん、食道がん、子宮がん、胆嚢がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、前立腺がん、皮膚がん、及び造血腫瘍を含む癌；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；及びメラノーマ、セミノーマ、奇形癌、骨肉腫、色素性異種皮膚癌、角膜癌、甲状腺濾胞癌及びカポシ肉腫を含む他の腫瘍、特に前立腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、胃がん、腎がん又は子宮がんであり得る。
【0050】
特定の実施形態では、転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、乳がん又は前立腺がんを有するがん患者のためのものである。
【0051】
特定の実施形態では、がんは固形がんである。固形がんは、嚢胞又は液体領域を含有しない腫瘍を特徴とする。
【0052】
特定の実施形態では、転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は強心配糖体である。
【0053】
本明細書の文脈において、「強心配糖体」という用語は、ステロイド部分、該ステロイドのＣ－１７に共有結合しているラクトン部分、及び該ステロイドのＣ－３にグリコシド結合を介して共有結合している配糖体（グリコシド）部分を含む有機化合物に関する。ステロイド部分及びラクトン部分は強心配糖体のアグリコンステロイド核を形成する。一部の強心配糖体は、配糖体部分のないアグリコンである。強心配糖体の２つのクラスが知られ、これらはアグリコンのラクトン部分によって識別されている。カルデノリドはラクトン部分として不飽和ブチロラクトン環を有し、ブファジエノリドはラクトン部分としてα－ピロン環を有する。
【0054】
強心配糖体は、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤であり、カリウムに結合して細胞内にそれを移動するリン酸化Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼの細胞外部分に結合する。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼのアルファサブユニットの脱リン酸化を誘導する細胞外カリウムは、強心配糖体の作用を低減させる。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼを阻害すると、Ｎａ＋が細胞内で増加する。Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体は、カルシウムを細胞の外にポンプし、ナトリウムを細胞内にポンプして、濃度勾配を下げる。細胞内へのナトリウムの濃度勾配が減少すると、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体が機能する能力が低減され、細胞内カルシウムレベルが上昇する結果となる。心臓では、これにより心筋の収縮性が高まり、心臓の迷走神経緊張が増加する。強心配糖体は、心臓に対して特徴的な陽性変力作用を発揮する（心筋収縮の強さを増加させる）。
【0055】
特定の実施形態では、強心配糖体は、カルデノリド及びブファジエノリドから選択される。
【0056】
特定の実施形態では、強心配糖体は、ジギトキシン、ウアバイン、コンバラトキシン、プロシラリジン、ラナトシドＣ、ギトホルメート、ペルボシド、ストロファンチジン、メチルジゴキシン、デスラノシド、ブファリン、ジゴキシン及びジゴキシゲニンから選択される。
【0057】
ジギトキシン（ＣＡＳ ７１－６３－６）は、キツネノテブクロの植物の葉に自然に存在する強心配糖体である（ジギタリス仕様）。ジギトキシンは、うっ血性心不全の治療に一般的に使用されている。
【化1】
【0058】
ウアバイン（ｇ－ストロファンチン、（ＣＡＳ ６３０－６０－４））は、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼを阻害することによって作用する強心配糖体であり、主に低血圧及び心不整脈の治療に使用される。
【化2】
【0059】
コンバラトキシン（ＣＡＳ ５０８－７５－８）は、カルデノリドの群の強心配糖体であり、スズラン（Ｃｏｎｖａｌｌａｒｉａ ｍａｊａｌｉｓ）に自然に存在している。コンバラトキシンはジギトキシンの約５倍の効力があり、主に心不整脈の治療に使用される。
【0060】
プロシラリジン（ＣＡＳ ４６６－０６－８）は、ブファノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【0061】
ラナトシド（ＣＡＳ １７５７５－２２－３）Ｃは、カルデノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【0062】
ギトホルマート（ＣＡＳ １０１７６－３９－３）は、ブファノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。ギトホルメートは、天然に存在する強心配糖体であるギトキシンの誘導体である。
【0063】
ペルボシド（ＣＡＳ Ｎｏ． １１８２－８７－２）は、ブファノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【0064】
ストロファンチジンは、カルデノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。ストロファンチジンは、ウアバインの類似体であるｋ－ストロファンチンのアグリコンである。
【化3】
【0065】
ジゴキシンは、カルデノリドのクラスの天然に存在する強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【化4】
【0066】
ジゴキシゲニン（ＣＡＳ １６７２－４６－４）は、カルデノリドのクラスの強心配糖体である。ジゴキシゲニンはジゴキシンのアグリコンである。
【0067】
メチルジゴキシン（Ｍｅｔｉｌｄｉｇｏｘｉｎ）（ＣＡＳ ３０６８５－４３－９）（メチルジゴキシン（ｍｅｔｈｙｌｄｉｇｏｘｉｎ）とも呼ばれる）は、カルデノリドのクラスの強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【0068】
デスラノシド（ＣＡＳ １７５９８－６５－１）は、カルデノリドのクラスの天然に存在する強心配糖体であり、主にうっ血性心不全及び心不整脈の治療に使用される。
【0069】
ブファリン（ＣＡＳ ４６５－２１－４）は、ブファジエノリドのクラスの天然に存在する強心配糖体である。
【0070】
特定の実施形態では、強心配糖体は、ジゴキシン、ジギトキシン、及びウアバインから選択される。
【0071】
特定の実施形態では、強心配糖体はジゴキシンである。
【0072】
特定の実施形態では、心筋配糖体はジギトキシンである。
【0073】
特定の実施形態では、強心配糖体はウアバインである。
【0074】
特定の実施形態では、転移の予防又は治療に使用するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、ＣＴＣクラスターの破壊に使用するためのものである。
【0075】
本発明の第２の態様は、転移性がんの治療又は予防に使用するための、以下：
－ ＣＬＤＮ３
－ ＣＬＤＮ４、及び
－ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、又はその構成サブユニットアイソフォームのいずれか
から選択されるタンパク質をコードする標的核酸配列の発現をダウンレギュレートすることができる、又は阻害することができる阻害剤の核酸配列を含むか、又はそれからなる核酸分子に関する。
－ ＣＬＤＮ３
－ ＣＬＤＮ４、及び
－ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、又はその構成サブユニットアイソフォームのいずれか
から選択されるタンパク質をコードする標的核酸配列の発現をダウンレギュレートすることができる、又は阻害することができる阻害剤の核酸配列を含むか、又はそれからなる核酸分子に関する。
【0076】
実施例で提供されているデータは、これらのタンパク質の機能発現のいずれかの抑制がＣＴＣ形成の有意な抑制につながり、それが次いでがん患者の臨床転帰の改善に関連していることを示している。
【0077】
クローディン３（ＣＬＤＮ３；Ｅｎｔｒｅｚコード１３６５）及びクローディン４（ＣＬＤＮ４；Ｅｎｔｒｅｚコード１３６４）は密着結合の構成要素であり、細胞間相互作用を促進する。
【0078】
一般に、ＣＴＣクラスターの形成及び転移の促進に関係する遺伝子標的のアンチセンス標的化と、ＣＲＩＳＰＲ又は類似のアプローチとの両方が考えられる。
【0079】
特定の実施形態では、阻害剤の核酸配列は、
－ 前記標的核酸配列に含まれるエキソン、
－ 前記標的核酸配列に含まれるイントロン、
－ 前記標的核酸配列の発現を調節するプロモーター領域、及び／又は
－ 前記標的核酸配列の発現を制御する補助配列、
の配列又は部分配列と特異的にハイブリダイズすることができる。
－ 前記標的核酸配列に含まれるエキソン、
－ 前記標的核酸配列に含まれるイントロン、
－ 前記標的核酸配列の発現を調節するプロモーター領域、及び／又は
－ 前記標的核酸配列の発現を制御する補助配列、
の配列又は部分配列と特異的にハイブリダイズすることができる。
【0080】
特定の実施形態では、阻害剤の核酸配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。
【0081】
特定の実施形態では、阻害剤の核酸配列は、ヌクレオシド類似体を含むか、又はそれからなる。
【0082】
上記のとおり阻害剤の核酸配列と標的核酸配列のエキソン、イントロン、プロモーター又は補助配列とのハイブリダイゼーションは、標的核酸配列の転写又は翻訳の減少又は阻害をもたらす。採用されるメカニズムは、例えばＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、翻訳の阻害、又はプロモーター又はエンハンサー領域の遮断による、ｍＲＮＡの分解であり得る。
【0083】
特定の実施形態では、補助配列はエンハンサー配列である。エンハンサー配列は、ＤＮＡの短い（５０～１５００ｂｐ）領域であり、それは活性化因子による結合によって、標的核酸配列の転写が起こる可能性を高めることができる。阻害剤の核酸配列は、エンハンサー配列の活性を低下させるであろう。
【0084】
特定の実施形態では、補助配列は、長鎖ノンコーディングＲＮＡ配列である。長鎖ノンコーディングＲＮＡは、２００個のヌクレオチドより長い転写物であり、これはタンパク質に翻訳されないが、標的核酸配列の転写又は翻訳を制御する。
【0085】
特定の実施形態では、前記阻害剤の核酸配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、前記阻害剤の核酸配列は、ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、前記阻害剤の核酸配列は、ｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、前記阻害剤の核酸配列は、ｓｇＲＮＡである。特定の実施形態では、前記阻害剤の核酸配列は、ｍｉＲＮＡである。
【0086】
特定の実施形態では、阻害剤の核酸配列は、ヌクレオシド類似体を含むか、又はそれからなる。
【0087】
当業者は、標的配列に関する公開データベースに含まれる遺伝情報に基づいて適切なアンチセンス配列を選択することができる。
【0088】
ＣＴＣクラスターは、単独の循環腫瘍細胞と比較して、転移性播種の可能性が高い。したがって、ＣＴＣクラスターを単独ＣＴＣになるように破壊するための、本発明のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤及び該阻害剤の核酸配列は、がん患者の予防及び治療に有利である。
【0089】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に従うＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤、又はがん患者の静脈血栓塞栓症の予防及び治療に使用するための本発明の第２の態様に従う核酸分子に関する。
【0090】
がん患者におけるＣＴＣの存在は、静脈血栓塞栓症のリスク増加と関連している。理論に拘束されることを望まないが、これはおそらく、血液循環中の凝固因子又は組織因子及び／又は血小板及び内皮細胞などの他の細胞型とのＣＴＣクラスター相互作用を介した凝固の活性化によるものである（Ｂｙｓｔｒｉｃｋｙら、以下の重要な書評：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １１４：３３－４２、２０１７）。
【0091】
本発明のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤及び該阻害剤の核酸配列は、ＣＴＣクラスターサイズを有意に減少させ、したがって、がん患者における静脈血栓塞栓症の発生率を減少させることもできる。
【0092】
本発明の第１の態様のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤に関する全ての実施形態はまた、本発明の第３の態様にも関連する。
【0093】
本発明の別の態様は、上記で概説したがん治療用の薬剤の製造における上記で特徴付けられたＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤の使用に関する。あるいは、本発明は、がん治療のための方法に関する。そのような方法において、本明細書に記載の化合物の有効量（記載されたとおりの剤形又は配合を含む）は、それを必要とする対象に投与され、それによってがんを治療するか、又は転移の拡散若しくは再発を予防する。
【0094】
医薬組成物及び投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【0095】
特定の実施形態では、本発明及び任意のその態様及び実施形態に従うＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、経鼻、口腔内、直腸、経皮又は経口の投与など、経腸投与のための剤形として、又は吸入形態又は坐剤として製剤化される。あるいは、皮下、静脈内、肝内又は筋肉内注射の形態などの非経口投与を使用することができる。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【0096】
本発明の特定の実施形態では、本発明の化合物は、一般的には、薬剤の投与量を容易に制御可能にし、かつ患者に的確かつ容易に扱える製品を与える医薬品の投与の形態に製剤化される。
【0097】
本発明の化合物の局所使用に関する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、又は噴霧可能な製剤（例えば、エアロゾルなどによる送達のための製剤）などの局所投与に適した方法で製剤化され、これは、当業者に知られている可溶化剤、安定剤、強壮剤、緩衝剤、及び保存剤の１つ又は複数とともに活性成分を含む。
【0098】
該医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与のために製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐薬を含むがこれらに限定されない）、又は液体形態（溶液、懸濁液又は乳濁液を含むがこれらに限定されない）に構成することができる。
【0099】
本発明の化合物の投与計画は、特定の薬剤の薬力学的特性とその投与方法及び投与経路、投与対象者の種族、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質と程度、同時治療の種類、治療の頻度、投与経路、患者の腎機能及び肝機能、及び所望の効果などの既知の要因によって異なるだろう。特定の実施形態では、本発明の化合物を１日１回投与してもよいし、又は１日の総投与量を１日２回、３回、又は４回に分けて投与してもよい。
【0100】
本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の医薬操作を行うことができ、及び／又は従来の不活性な希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びにアジュバント、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、及び緩衝剤などを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解、又は凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌ． Ｌａｃｈｍａｎ ｅｔら、 Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４版，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照。
【0101】
本発明は、以下の実施例及び図面によってさらに説明され、そこから更なる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0102】
ゲノム全域の低メチル化と高メチル化との両方を含む異常なＤＮＡメチル化パターンは、数種類のヒトのがんに関連している（Ｋｌｕｔｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７６、３４４６－３４５０、２０１６；Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ １、２３９－２５９、２００９；Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１、５４００－５４１３、２００２；Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ７、２１－３３、２００６）。一般に、これらのがん関連エピジェネティック修飾は、別個のゲノム領域に影響を与え、ＣｐＧアイランドでは高メチル化がより頻繁であるのに対し、低メチル化は制御要素及び反復要素に有利であるようである（Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｍ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１、５４００－５４１３，２００２）。それでもなお、両方の修飾は、隣接する遺伝子の発現を変化させ、がんの表現型に寄与する能力を有する（Ｋｌｕｔｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７６、３４４６－３４５０、２０１６；Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ １、２３９－２５９，２００９）。制御要素に関して、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）におけるＤＮＡメチル化の損失により、活性である転写因子（ＴＦ）ネットワーク、又は後の段階、例えば、分化した細胞からの人工多能性幹細胞の誘導中（Ｌｅｅら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５、５６１９、２０１４）又はがんの進行中での活性化のために準備されるネットワークを示すことができる。しかし、乳がん患者のＤＮＡメチロームを形成する力について、及び別個のＤＮＡメチル化パターンがＣＴＣの転移能を決定するかどうかについては未知である。
【0103】
乳がん患者の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化パターン
本発明者らは、単独及びクラスター化したヒト乳房ＣＴＣの利用可能なＴＦＢＳによって活性な転写因子ネットワークを同定しようとし、ゲノム全域の単独細胞分解ＤＮＡメチル化分析（重亜硫酸塩シーケンシング）を通じて、個々の液体生検内でマッチさせた。この目的のために、進行性転移性乳がんの４人の患者から血液試料を採取し（表１）、操作されていない血液試料からのＣＴＣのサイズに基づく、抗原非依存的な濃縮を可能にするマイクロ流体デバイスであるＰａｒｓｏｒｔｉｘ（Ｘｕら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０、ｅ０１３８０３２、２０１５）で処理した。捕捉時に、生ＣＴＣをＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ（Ａｌｅｘａ４８８又はＦＩＴＣ結合）の細胞表面発現について染色し、ＣＤ４５に対する抗体で対比染色して汚染白血球を同定した（図１ａ）。染色の検証時に、次いで、合計１８個のマーカー陽性単独ＣＴＣと２４個のマーカー陽性ＣＴＣクラスター（患者あたり５±２．５８個の単独ＣＴＣと６±４．２４個のＣＴＣクラスターの平均）を、単独細胞全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシングのために、個別にマイクロマニピュレーションし（ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ）、溶解緩衝液に堆積させた（Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １０、１３８６－１３９７、２０１５；Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９、８０８－８２２、２０１６）。
本発明者らは、単独及びクラスター化したヒト乳房ＣＴＣの利用可能なＴＦＢＳによって活性な転写因子ネットワークを同定しようとし、ゲノム全域の単独細胞分解ＤＮＡメチル化分析（重亜硫酸塩シーケンシング）を通じて、個々の液体生検内でマッチさせた。この目的のために、進行性転移性乳がんの４人の患者から血液試料を採取し（表１）、操作されていない血液試料からのＣＴＣのサイズに基づく、抗原非依存的な濃縮を可能にするマイクロ流体デバイスであるＰａｒｓｏｒｔｉｘ（Ｘｕら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０、ｅ０１３８０３２、２０１５）で処理した。捕捉時に、生ＣＴＣをＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ（Ａｌｅｘａ４８８又はＦＩＴＣ結合）の細胞表面発現について染色し、ＣＤ４５に対する抗体で対比染色して汚染白血球を同定した（図１ａ）。染色の検証時に、次いで、合計１８個のマーカー陽性単独ＣＴＣと２４個のマーカー陽性ＣＴＣクラスター（患者あたり５±２．５８個の単独ＣＴＣと６±４．２４個のＣＴＣクラスターの平均）を、単独細胞全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシングのために、個別にマイクロマニピュレーションし（ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ）、溶解緩衝液に堆積させた（Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １０、１３８６－１３９７、２０１５；Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９、８０８－８２２、２０１６）。
【0104】
【表1】
【0105】
主成分分析（ＰＣＡ）は、主に単独ＣＴＣと比較してより不均一であるＣＴＣクラスターと、元の患者のＣＴＣを分離した（図１ｂ）。単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの間のメチル化差異領域（ＤＭＲ）を同定するために、各群の少なくとも２つの異なる試料間で共通する５ｋｂウィンドウでのメチル化を評価し、単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの間で≧８０％メチル化の差異を有する３３４７個のＤＭＲを同定した。これらのうち、１３０５個のＤＭＲは、ＣＴＣクラスターで低メチル化され、２０４２個は単独ＣＴＣで低メチル化されていた。ＤＭＲは、共調節配列のシス制御特性を予測する統合ゲノミクス法であるｉ－ｃｉｓＴａｒｇｅｔを使用して分析した（Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０、ｅ１１４，２０１２）。ＣＴＣクラスターの低メチル化ＤＭＲ内で、ＯＣＴ４及びＳＴＡＴ３などの幹細胞性関連ＴＦを含むいくつかのＴＦＢＳの有意な濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が見られた（図１ｃ）。対照的に、単独ＣＴＣの低メチル化ＤＭＲは、ＭＥＦ２Ｃ及びＳＯＸ１８などのＴＦのＴＦＢＳにおいて濃縮されていた（図１ｃ）。ＣＴＣクラスターの低メチル化領域に関連する特定の遺伝子を同定するために、ＧＲＥＡＴ（ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｔｏｏｌ）（ＭｃＬｅａｎら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８， ４９５－５０１，２０１０）を使用した。基底プラス５０ｋｂの最大伸長の関連規則を使用して、この分析により、接着接合、ＮＭＤＡ受容体活性、脂質輸送などの細胞間結合及び膜受容体活性、並びに及びＮＫ細胞の活性化と白血球アポトーシスを含む免疫応答を含むプロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリーに関連する１６６個の遺伝子を明らかにした（図１ｄ及び表２）。並行アプローチとして、グローバルなＤＮＡメチル化の差異がＴＦＢＳで評価され（Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９、８０８－８２２、２０１６）、ＯＣＴ４結合部位がＣＴＣクラスターで一貫して低メチル化されることがわかった（表３）。また、ＳＯＸ２及びＥＳＲＲＢなどの多能性に関連する他のＴＦの結合部位も低メチル化されており、並びにＳＩＮ３Ａなどの細胞周期進行に関連するＴＦの結合部位も低メチル化されていた（表３）。一方、単独ＣＴＣでは、この方法では、ｃ－ＭＹＣ及びＥ２Ｆ４を含むいくつかのＴＦのＴＦＢＳでの低メチル化が観察された（表３）。まとめると、これらの結果から、ＣＴＣクラスターが利用可能な幹細胞関連のＯＣＴ４中心のＴＦネットワークと細胞周期進行関連のＳＩＮ３Ａ中心のＴＦネットワークを示し、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の生物学と並行して、これより、これらのネットワークが同時に自己再生及び増殖を制御することを示唆している（Ｎｉｗａ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４、６３５－６４６、２００７；Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ １３２、１０４９－１０６１、２００８；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６、３６９－３８１、２０１０）。これとは異なって、単独ＣＴＣは、ｃ－ＭＹＣ中心のネットワークを特徴とするように見え、これは、様々ながんで一般的に濃縮されるが、しかしコアの多能性ネットワークからはほとんど独立しており、代謝に関連する遺伝子の制御により多く関与している（Ｋｉｍら、 Ｃｅｌｌ １３２、１０４９－１０６１、２００８；Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ１４３、３１３－３２４、２０１０）。
【0106】
【表2】
【0107】
【表3】
【0108】
確立されたマウスモデルからの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及びＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化パターン
２種のヒト乳房ＣＴＣ由来細胞株（ＢＲ１６及びＢＲｘ５０）並びに乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１（肺転移性変異体、ＬＭ２と呼ばれる）を含む３種の独立したマウス異種移植モデルから自発的に生成したＧＦＰ標識された単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターを、所見の堅牢性を試験するために単離した（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５、２１６－２２０、２０１４；Ｍｉｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６、５１８－５２４、２００５）。この設定では、７１個の単独ＣＴＣと４７個のＣＴＣクラスター（表４）を個別にマイクロマニピュレーションし、単独細胞全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシングのプロセスを行った（Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １０、１３８６－１３９７、２０１５；Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９、８０８－８２２、２０１６）。患者のＣＴＣと同様に、異種移植ＣＴＣのＰＣＡ分析では、主に起源の細胞株に基づいて分離したが、なお患者のＣＴＣと比較して試料の全体的な均質性が高いことを示した。単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの間のメチル化の差異が７０％を超えるＤＭＲを評価したところ、合計１４３０個のＤＭＲが見つかり、そのうち、９０９個はＣＴＣクラスターで低メチル化され、５２１個は単独のＣＴＣで低メチル化されていた。ｉ－ｃｉｓＴａｒｇｅｔ分析を使用して、ＣＴＣクラスターで低メチル化された４０個のＴＦＢＳと、単独ＣＴＣで低メチル化された７４個のＴＦＢＳを同定した（図２ａ）。興味深いことに、患者のデータと一致して、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＴＡＴ３、ＲＥＸ１に属するものなどのＯＣＴ４中心のＴＦネットワークの結合部位と、ＳＩＮ３Ａの結合部位の両方が異種移植ＣＴＣクラスターで低メチル化されていた。一方、患者のＣＴＣとは対照的に、幹細胞関連のＴＦネットワークの利用可能性は、ＣＴＣのグローバルなＤＮＡメチル化プロファイルに影響を与えるよりむしろ、ＤＭＲでの局所的なＤＮＡメチル化リモデリングによって制御されているようであった。これは、単独ＣＴＣ（ｎ＝１３）又はＣＴＣクラスター（ｎ＝９）のいずれかで、ほんの一握りのＴＦＢＳしか優先的に低メチル化されないという発見によって裏付けられた（図２ｂ）。したがって、患者と異種移植片のＣＴＣの個別のＤＮＡメチル化プロファイルは、それらのクラスター化の状況を反映しているようである。また、乳がんでは、メチル化ダイナミクスとＣＴＣの表現型の特性との間の相互作用が発生し、ＣＴＣのクラスタリングが、幹細胞関連のプロセス及び細胞周期の進行を受けるエピジェネティックな素因に関連していることも示している。
２種のヒト乳房ＣＴＣ由来細胞株（ＢＲ１６及びＢＲｘ５０）並びに乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１（肺転移性変異体、ＬＭ２と呼ばれる）を含む３種の独立したマウス異種移植モデルから自発的に生成したＧＦＰ標識された単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターを、所見の堅牢性を試験するために単離した（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５、２１６－２２０、２０１４；Ｍｉｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６、５１８－５２４、２００５）。この設定では、７１個の単独ＣＴＣと４７個のＣＴＣクラスター（表４）を個別にマイクロマニピュレーションし、単独細胞全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシングのプロセスを行った（Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １０、１３８６－１３９７、２０１５；Ｆａｒｌｉｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９、８０８－８２２、２０１６）。患者のＣＴＣと同様に、異種移植ＣＴＣのＰＣＡ分析では、主に起源の細胞株に基づいて分離したが、なお患者のＣＴＣと比較して試料の全体的な均質性が高いことを示した。単独ＣＴＣとＣＴＣクラスターとの間のメチル化の差異が７０％を超えるＤＭＲを評価したところ、合計１４３０個のＤＭＲが見つかり、そのうち、９０９個はＣＴＣクラスターで低メチル化され、５２１個は単独のＣＴＣで低メチル化されていた。ｉ－ｃｉｓＴａｒｇｅｔ分析を使用して、ＣＴＣクラスターで低メチル化された４０個のＴＦＢＳと、単独ＣＴＣで低メチル化された７４個のＴＦＢＳを同定した（図２ａ）。興味深いことに、患者のデータと一致して、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＴＡＴ３、ＲＥＸ１に属するものなどのＯＣＴ４中心のＴＦネットワークの結合部位と、ＳＩＮ３Ａの結合部位の両方が異種移植ＣＴＣクラスターで低メチル化されていた。一方、患者のＣＴＣとは対照的に、幹細胞関連のＴＦネットワークの利用可能性は、ＣＴＣのグローバルなＤＮＡメチル化プロファイルに影響を与えるよりむしろ、ＤＭＲでの局所的なＤＮＡメチル化リモデリングによって制御されているようであった。これは、単独ＣＴＣ（ｎ＝１３）又はＣＴＣクラスター（ｎ＝９）のいずれかで、ほんの一握りのＴＦＢＳしか優先的に低メチル化されないという発見によって裏付けられた（図２ｂ）。したがって、患者と異種移植片のＣＴＣの個別のＤＮＡメチル化プロファイルは、それらのクラスター化の状況を反映しているようである。また、乳がんでは、メチル化ダイナミクスとＣＴＣの表現型の特性との間の相互作用が発生し、ＣＴＣのクラスタリングが、幹細胞関連のプロセス及び細胞周期の進行を受けるエピジェネティックな素因に関連していることも示している。
【0109】
【表4】
【0110】
幹細胞様関連転写因子ネットワーク
利用可能な幹細胞関連ＴＦネットワークもまた転写活性があるかどうかを特定するために、本発明者らは、個々の液体生検内でマッチされ、進行性転移疾患を有する６人の乳がん患者から単離された４８個の単独ＣＴＣ及び２４個のＣＴＣクラスター、及び３つの異種移植マウスモデルから単離された４９個の単独ＣＴＣ及び５４個のＣＴＣクラスターの単一細胞分解ＲＮＡシーケンス分析を行った（表４）。マウス及びヒトの胚性幹細胞及び胚性癌細胞において、分化した対応物とは対照的に一貫してアップレギュレーションされることが以前に示されている３３５個の遺伝子のセットをさらに調査した（Ｗｏｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２、３３３－３４４，２００８）。これらの３３５個の遺伝子のうち３０１個のサブセットがＣＴＣ試料で発現していることがわかった。これらの遺伝子を使用して、加重遺伝子共発現ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ：ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実行し、ヒト乳がん試料の４つの発現モジュール（青、灰色、ターコイズ、茶色）と異種移植ＣＴＣクラスターの４つの発現モジュール（緑、黄色、オレンジ、紫）を同定し、ＣＴＣにおけるモジュールと特性の関係（ｍｏｄｕｌｅ－ｔｒａｉｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を明らかにした。特に、患者のＣＴＣクラスターに濃縮された８５個の転写産物と異種移植片のＣＴＣクラスターに濃縮された１５３の転写産物が同定され（表５及び６）、患者と異種移植片のＣＴＣクラスター濃縮幹細胞関連転写産物との間に９０％の重複を有した。興味深いことに、患者のＣＴＣクラスターに濃縮した転写物、及び患者と異種移植片の間で重複する転写物は、ネットワーク分析によって判断されるとおり、主に細胞周期の進行に関与するが（図３ａ）、ＴＦ標的遺伝子分析では、とりわけ、有意に低メチル化された結合部位を有するＴＦであるＳＩＮ３Ａ、ＯＣＴ４及びＣＢＦＢの活性が確認された（図３ｂ）。同様に、異種移植片由来のＣＴＣクラスターでは、患者のＣＴＣクラスターに濃縮され検出された遺伝子に加えて、ＴＦ標的遺伝子解析により、ＳＩＮ３Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＯＲＡ、ＦＯＸＯ１及びＢＨＬＨＥ４０などの有意に低メチル化された結合部位を持つＴＦを含むＯＣＴ４の活性が強調された（図３ｃ）。単独ＣＴＣのＴＦ標的遺伝子分析により、とりわけ、ｃ－ＭＹＣ、並びにｐ５３及びＥ２Ｆ４などの活性がさらに確認された（図３ｅ）。まとめると、遺伝子発現データは、ＤＮＡメチル化分析で提案されたモデルをサポートし、ＣＴＣクラスターがＯＣＴ４中心の幹細胞関連ＴＦネットワークのために準備され、ＳＩＮ３Ａ依存性細胞周期進行プログラムの活性化を示すことを実証する。これらのプログラムの活性化は、ＣＴＣクラスターの転移増殖能力を決定する役割を果たしている。
利用可能な幹細胞関連ＴＦネットワークもまた転写活性があるかどうかを特定するために、本発明者らは、個々の液体生検内でマッチされ、進行性転移疾患を有する６人の乳がん患者から単離された４８個の単独ＣＴＣ及び２４個のＣＴＣクラスター、及び３つの異種移植マウスモデルから単離された４９個の単独ＣＴＣ及び５４個のＣＴＣクラスターの単一細胞分解ＲＮＡシーケンス分析を行った（表４）。マウス及びヒトの胚性幹細胞及び胚性癌細胞において、分化した対応物とは対照的に一貫してアップレギュレーションされることが以前に示されている３３５個の遺伝子のセットをさらに調査した（Ｗｏｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２、３３３－３４４，２００８）。これらの３３５個の遺伝子のうち３０１個のサブセットがＣＴＣ試料で発現していることがわかった。これらの遺伝子を使用して、加重遺伝子共発現ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ：ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実行し、ヒト乳がん試料の４つの発現モジュール（青、灰色、ターコイズ、茶色）と異種移植ＣＴＣクラスターの４つの発現モジュール（緑、黄色、オレンジ、紫）を同定し、ＣＴＣにおけるモジュールと特性の関係（ｍｏｄｕｌｅ－ｔｒａｉｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を明らかにした。特に、患者のＣＴＣクラスターに濃縮された８５個の転写産物と異種移植片のＣＴＣクラスターに濃縮された１５３の転写産物が同定され（表５及び６）、患者と異種移植片のＣＴＣクラスター濃縮幹細胞関連転写産物との間に９０％の重複を有した。興味深いことに、患者のＣＴＣクラスターに濃縮した転写物、及び患者と異種移植片の間で重複する転写物は、ネットワーク分析によって判断されるとおり、主に細胞周期の進行に関与するが（図３ａ）、ＴＦ標的遺伝子分析では、とりわけ、有意に低メチル化された結合部位を有するＴＦであるＳＩＮ３Ａ、ＯＣＴ４及びＣＢＦＢの活性が確認された（図３ｂ）。同様に、異種移植片由来のＣＴＣクラスターでは、患者のＣＴＣクラスターに濃縮され検出された遺伝子に加えて、ＴＦ標的遺伝子解析により、ＳＩＮ３Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＯＲＡ、ＦＯＸＯ１及びＢＨＬＨＥ４０などの有意に低メチル化された結合部位を持つＴＦを含むＯＣＴ４の活性が強調された（図３ｃ）。単独ＣＴＣのＴＦ標的遺伝子分析により、とりわけ、ｃ－ＭＹＣ、並びにｐ５３及びＥ２Ｆ４などの活性がさらに確認された（図３ｅ）。まとめると、遺伝子発現データは、ＤＮＡメチル化分析で提案されたモデルをサポートし、ＣＴＣクラスターがＯＣＴ４中心の幹細胞関連ＴＦネットワークのために準備され、ＳＩＮ３Ａ依存性細胞周期進行プログラムの活性化を示すことを実証する。これらのプログラムの活性化は、ＣＴＣクラスターの転移増殖能力を決定する役割を果たしている。
【0111】
ＣＴＣクラスターのＤＮＡメチル化パターンは、利用可能で活性な転写因子ネットワークを形成し、これは乳がん患者の単独ＣＴＣよりもＣＴＣクラスターの増殖に利点をもたらす。ＤＮＡメチロームを成形する力は、ＴＦＢＳでのグローバルな差異と、環境の手がかり及び表現型の特性への応答を媒介する局所的な事象の両方に関与する。環境刺激への応答でのＤＮＡメチロームを動的に成形する能力を利用することで、ＦＤＡ承認の化合物を転用することによる治療的な活用が可能である。
【0112】
【表5】
【0113】
【表6】
【0114】
ＣＴＣクラスターの解離
ＣＴＣクラスターの作用可能な脆弱性を特定し、クラスター化されたＣＴＣのエピジェネティック及び転写の機能が、クラスターの単独細胞への解離時に可逆的であるかどうかを試験するために、次の手順を実行した。第１に、正常な乳房（ＴＧＣＡ ＲＥＦ）、乳がん（ＴＣＧＡ ＲＥＦ）、単独ＣＴＣ、及びＣＴＣクラスターから得られた患者試料における全ての既知の細胞間結合（ＣＣＪ：ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）成分の発現を評価した（Ａｃｅｔｏら、Ｃｅｌｌ ２０１４）。乳がん細胞は、正常な乳房細胞と比較してＣＣＪレパートリーを部分的にしか減少させない傾向があるが、ＣＴＣは、おそらく運動性の増加の結果として、ＣＣＪ成分のごく一部しか発現しない。しかしなお、ＣＴＣクラスターは、単独ＣＴＣに比べて、より多くのＣＣＪを保持している。この分析により治療の機会に注目し、ＣＴＣクラスターが多細胞接着のために限られた数のＣＣＪ成分に依存し、それらを解離することを目的としたアプローチにより、より多くの様々なＣＣＪを発現する正常組織を救うことができることを示している。この目的のために、２４８６個のＦＤＡ承認の化合物を、ヒト乳房ＣＴＣ由来細胞のクラスターを解離する能力について評価した。クラスターの解離は、ハイコンテントスクリーニング顕微鏡を使用して評価し、個々の化合物で治療した細胞を、それぞれ陰性及び陽性対照である安定状態のクラスター化ＢＲ１６細胞及び４０μｍろ過したＢＲ１６の単独細胞懸濁液と比較した（図４ａ）。興味深いことに、ろ過時の平均クラスターサイズの大幅な減少は、生存率に影響を与えなかったが、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩（ＴＭＲＭ）強度で測定されるとおり、ミトコンドリア膜電位が低下した（図４ａ）。２４８６個のＦＤＡ承認化合物の大部分では、低酸素状態で５μＭ濃度を２日間使用した場合、ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞での検出可能な細胞生存率の減少も検出できず（＞７０％生存率）、また検出可能な平均クラスターサイズ（＞４５０μｍ２）の減少も観察されなかった。しかし、生存率を損なうことなく平均クラスターサイズを大幅に縮小した３９個の化合物を同定した。これらの化合物には、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（ｎ＝６）、ＨＤＡＣ（ｎ＝２）、ヌクレオチド生合成（ｎ＝５）、キナーゼ（ｎ＝４）、ＧＰＣＲ（ｎ＝２）、コレステロール生合成（ｎ＝１）、核外輸送（ｎ＝１）、チューブリン（ｎ＝９）、及びＤＮＡ結合化合物（ｎ＝８）と抗生物質（ｎ＝１）の阻害剤が含まれた。化合物濃度を１μＭ、０．５μＭ、及び０．１μＭに減らすと、ＢＲ１６及びＢＲｘ５０のヒトＣＴＣ由来細胞の平均クラスターサイズが同時に増加する結果となった（図４ｂ）。クラスターサイズへの作用に伴い、化合物濃度の低下を有し、検出された核の数、ミトコンドリア膜電位、及び両方の細胞株の全体的な生存率の増加が観察され、これはクラスターサイズがＣＴＣの全体的な適合性及び増殖能力と相関していることを示している（図４ｂ）。これらの条件下で、６つの化合物、すなわち、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤のジギトキシン及びウアバイン八水和物、チューブリン結合薬剤ポドフィロックス（ポドフィロトキシンとしても知られる）、コルヒチン及び硫酸ビンクリスチン、及びチューブリン結合剤及びデュアルキナーゼ阻害剤のリゴサチブは、試験された最低濃度（０．１μＭ）でさえ、ＢＲ１６及びＢｒｘ５０のＣＴＣ細胞株の平均クラスターサイズの有意な減少を一貫してもたらした（図４ｂ）。
ＣＴＣクラスターの作用可能な脆弱性を特定し、クラスター化されたＣＴＣのエピジェネティック及び転写の機能が、クラスターの単独細胞への解離時に可逆的であるかどうかを試験するために、次の手順を実行した。第１に、正常な乳房（ＴＧＣＡ ＲＥＦ）、乳がん（ＴＣＧＡ ＲＥＦ）、単独ＣＴＣ、及びＣＴＣクラスターから得られた患者試料における全ての既知の細胞間結合（ＣＣＪ：ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）成分の発現を評価した（Ａｃｅｔｏら、Ｃｅｌｌ ２０１４）。乳がん細胞は、正常な乳房細胞と比較してＣＣＪレパートリーを部分的にしか減少させない傾向があるが、ＣＴＣは、おそらく運動性の増加の結果として、ＣＣＪ成分のごく一部しか発現しない。しかしなお、ＣＴＣクラスターは、単独ＣＴＣに比べて、より多くのＣＣＪを保持している。この分析により治療の機会に注目し、ＣＴＣクラスターが多細胞接着のために限られた数のＣＣＪ成分に依存し、それらを解離することを目的としたアプローチにより、より多くの様々なＣＣＪを発現する正常組織を救うことができることを示している。この目的のために、２４８６個のＦＤＡ承認の化合物を、ヒト乳房ＣＴＣ由来細胞のクラスターを解離する能力について評価した。クラスターの解離は、ハイコンテントスクリーニング顕微鏡を使用して評価し、個々の化合物で治療した細胞を、それぞれ陰性及び陽性対照である安定状態のクラスター化ＢＲ１６細胞及び４０μｍろ過したＢＲ１６の単独細胞懸濁液と比較した（図４ａ）。興味深いことに、ろ過時の平均クラスターサイズの大幅な減少は、生存率に影響を与えなかったが、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩（ＴＭＲＭ）強度で測定されるとおり、ミトコンドリア膜電位が低下した（図４ａ）。２４８６個のＦＤＡ承認化合物の大部分では、低酸素状態で５μＭ濃度を２日間使用した場合、ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞での検出可能な細胞生存率の減少も検出できず（＞７０％生存率）、また検出可能な平均クラスターサイズ（＞４５０μｍ２）の減少も観察されなかった。しかし、生存率を損なうことなく平均クラスターサイズを大幅に縮小した３９個の化合物を同定した。これらの化合物には、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（ｎ＝６）、ＨＤＡＣ（ｎ＝２）、ヌクレオチド生合成（ｎ＝５）、キナーゼ（ｎ＝４）、ＧＰＣＲ（ｎ＝２）、コレステロール生合成（ｎ＝１）、核外輸送（ｎ＝１）、チューブリン（ｎ＝９）、及びＤＮＡ結合化合物（ｎ＝８）と抗生物質（ｎ＝１）の阻害剤が含まれた。化合物濃度を１μＭ、０．５μＭ、及び０．１μＭに減らすと、ＢＲ１６及びＢＲｘ５０のヒトＣＴＣ由来細胞の平均クラスターサイズが同時に増加する結果となった（図４ｂ）。クラスターサイズへの作用に伴い、化合物濃度の低下を有し、検出された核の数、ミトコンドリア膜電位、及び両方の細胞株の全体的な生存率の増加が観察され、これはクラスターサイズがＣＴＣの全体的な適合性及び増殖能力と相関していることを示している（図４ｂ）。これらの条件下で、６つの化合物、すなわち、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤のジギトキシン及びウアバイン八水和物、チューブリン結合薬剤ポドフィロックス（ポドフィロトキシンとしても知られる）、コルヒチン及び硫酸ビンクリスチン、及びチューブリン結合剤及びデュアルキナーゼ阻害剤のリゴサチブは、試験された最低濃度（０．１μＭ）でさえ、ＢＲ１６及びＢｒｘ５０のＣＴＣ細胞株の平均クラスターサイズの有意な減少を一貫してもたらした（図４ｂ）。
【0115】
ＤＮＡメチル化に対するＣＴＣクラスター解離の作用
ＤＮＡメチル化パターン及び増殖シグネチャーに対するクラスタリングの作用を直接評価するために、ＢＲ１６及びＢＲｘ５０の細胞株を１７日間培養して、少なくとも４回の分裂が起こることを確認した。これにより、ＤＮＡメチル化のリモデリングが行われるのに適切な時間を与える。ＡＴＰアーゼ及びキナーゼの阻害剤の２０ｎＭの存在下での長期培養は、細胞増殖及び平均クラスターサイズの減少に最適であることがわかった（図５ａ）。そして三重の平均してｎ＝２０個の細胞において、ＷＧＢＳ及びＲＮＡシーケンシングのためにさらに処理した。
ＤＮＡメチル化パターン及び増殖シグネチャーに対するクラスタリングの作用を直接評価するために、ＢＲ１６及びＢＲｘ５０の細胞株を１７日間培養して、少なくとも４回の分裂が起こることを確認した。これにより、ＤＮＡメチル化のリモデリングが行われるのに適切な時間を与える。ＡＴＰアーゼ及びキナーゼの阻害剤の２０ｎＭの存在下での長期培養は、細胞増殖及び平均クラスターサイズの減少に最適であることがわかった（図５ａ）。そして三重の平均してｎ＝２０個の細胞において、ＷＧＢＳ及びＲＮＡシーケンシングのためにさらに処理した。
【0116】
これらの条件下では、両方のＣＴＣ由来細胞株について、患者及び異種移植片からのクラスター関連低メチル化ＤＭＲのサブセットが２０％以上のメチル化を回復する。興味深いことに、このメチル化の獲得は、幹細胞関連ＴＦの結合部位を含むＤＭＲで発生し、ＢＲ１６細胞株のウアバイン治療はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの結合部位に同時に影響を及ぼす。これは、患者由来のＣＴＣ株におけるＣＴＣクラスターの解離が、幹細胞関連ＴＦの結合部位への利用可能性を低下させるＤＮＡリモデリングにつながることを示している。
【0117】
【表7】
【0118】
ＣＬＤＮ３／ＣＬＤＮ４ノックアウト
本発明者らは、ＣＴＣ由来細胞における細胞間結合の破壊が、クラスター解離並びにＣＴＣクラスター関連ＤＭＲでのＤＮＡメチル化リモデリングをもたらすかどうかを評価した。この目的のために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ＣＴＣクラスターにおいて最も発現が高い強い結合タンパク質のうちの２つであるＢＲ１６ ＣＴＣ由来細胞のクローディン３（ＣＬＤＮ３）及びクローディン４（ＣＬＤＮ４）の両方を同時にノックアウトした。各遺伝子に２つの独立したｓｇＲＮＡを使用して、発明者らは、二重ＣＬＤＮ３／４ノックアウトを備えた３つのＢＲ１６株を生成し、これらはまた、平均ＣＴＣクラスターサイズの大幅な減少も示した（図１６Ｆ、Ｇ）。
本発明者らは、ＣＴＣ由来細胞における細胞間結合の破壊が、クラスター解離並びにＣＴＣクラスター関連ＤＭＲでのＤＮＡメチル化リモデリングをもたらすかどうかを評価した。この目的のために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ＣＴＣクラスターにおいて最も発現が高い強い結合タンパク質のうちの２つであるＢＲ１６ ＣＴＣ由来細胞のクローディン３（ＣＬＤＮ３）及びクローディン４（ＣＬＤＮ４）の両方を同時にノックアウトした。各遺伝子に２つの独立したｓｇＲＮＡを使用して、発明者らは、二重ＣＬＤＮ３／４ノックアウトを備えた３つのＢＲ１６株を生成し、これらはまた、平均ＣＴＣクラスターサイズの大幅な減少も示した（図１６Ｆ、Ｇ）。
【0119】
ＣＬＤＮ３／４ダブルノックアウト細胞の全ゲノム重亜硫酸塩シーケンシングは、単独細胞への解離時に、かつＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害時に発生した事象と同様に、多くのＣＴＣクラスター関連の低メチル化領域がメチル化を獲得したことを示した（図９Ｅ）。興味深いことに、より高いレベルのメチル化を獲得した領域のｉ－ｃｉｓ Ｔａｒｇｅｔ分析により、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＳＩＮ３Ａの結合部位の濃縮が明らかになり（図９Ｆ）、ＣＴＣクラスタリングが幹細胞及び増殖関連のＴＦの結合部位でのＤＮＡメチル化ダイナミクスに直接影響することをさらに示している。
【0120】
これらの結果から、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害が、細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加と、その結果としての細胞間結合形成の阻害を通じてＣＴＣクラスターの解離を引き起こし、重要な幹細胞関連及び増殖関連の結合部位でのＤＮＡメチル化リモデリングをもたらすことを示している。
【0121】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤による治療は、自然転移の形成を抑制する
ウアバイン及びジギトキシンがまたインビボでのＣＴＣクラスターの破壊も可能にするかどうかを試験するために、本発明者らは二重のアプローチを採用した。第１に、本発明者らは、ウアバイン及びジギトキシンによる１７日間のインビトロ治療が、治療された細胞の能力の低下につながり、未治療のマウスにおいて効率的に転移を播種するかどうかを試験した（図７Ａ）。この目的のために、治療時に、ＧＦＰ－ルシフェラーゼを安定して発現するＢＲ１６細胞をＮＳＧマウスの尾静脈に注射し、転移性病変を播種して増殖させる能力について、発光イメージングによって非侵襲的にモニターした。本発明者らは、ジギトキシン又はウアバインによる治療は、注射直後に肺組織に留まるＢＲ１６細胞の能力に影響を及ぼさなかったが（「０日」；図７Ｂを参照）、到達の初日の間に生存する能力の低下をもたらすことを、対照細胞と比較して切断型カスパーゼ３の発現の有意な増加によって確認されるとおり発見した（「１日」を参照；図７Ｂ及び８Ａ、Ｂ）。全体として、転移性播種の非常に初期の段階で生存の能力のこの差異は、注射後７２日の間に測定されたとおり、インビボでの更なる治療がないにもかかわらず、転移性増殖の遅延をもたらした（図７Ｃ）。
ウアバイン及びジギトキシンがまたインビボでのＣＴＣクラスターの破壊も可能にするかどうかを試験するために、本発明者らは二重のアプローチを採用した。第１に、本発明者らは、ウアバイン及びジギトキシンによる１７日間のインビトロ治療が、治療された細胞の能力の低下につながり、未治療のマウスにおいて効率的に転移を播種するかどうかを試験した（図７Ａ）。この目的のために、治療時に、ＧＦＰ－ルシフェラーゼを安定して発現するＢＲ１６細胞をＮＳＧマウスの尾静脈に注射し、転移性病変を播種して増殖させる能力について、発光イメージングによって非侵襲的にモニターした。本発明者らは、ジギトキシン又はウアバインによる治療は、注射直後に肺組織に留まるＢＲ１６細胞の能力に影響を及ぼさなかったが（「０日」；図７Ｂを参照）、到達の初日の間に生存する能力の低下をもたらすことを、対照細胞と比較して切断型カスパーゼ３の発現の有意な増加によって確認されるとおり発見した（「１日」を参照；図７Ｂ及び８Ａ、Ｂ）。全体として、転移性播種の非常に初期の段階で生存の能力のこの差異は、注射後７２日の間に測定されたとおり、インビボでの更なる治療がないにもかかわらず、転移性増殖の遅延をもたらした（図７Ｃ）。
【0122】
第２に、臨床設定をより厳密に模倣して、ＣＴＣクラスターの自発的形成及び原発腫瘍からの転移に対するＣＴＣクラスター解離戦略の作用を評価するために、本発明者らは、ＮＳＧマウスの乳腺脂肪パッドにＢＲ１６細胞を注射した。原発腫瘍形成の１４週間後、本発明者らは３週間毎日ウアバインを投与し、ＣＴＣ組成及び自発的転移病変の発生を評価した（図７Ｄ）。重要なことに、本発明者らは、ウアバイン治療が、原発腫瘍のサイズも、又は全体的なＣＴＣ数（図８Ｃ、Ｄ）も変えることなく、単独ＣＴＣの頻度を増加させながら（図７Ｅ）、自発的に生成されるＣＴＣクラスターの頻度を減少させることを観察した。ＣＴＣクラスターの頻度の減少に加えて、ウアバイン治療はまた、総転移負荷の顕著な抑制（８０．７倍）をもたらした（図７Ｆ、Ｇ）。同様に、自発的に転移するＬＭ２腫瘍を有するＮＳＧマウスにウアバイン治療を施す場合、本発明者らはまた、原発腫瘍のサイズも、また全体的なＣＴＣの数も変えることなく（図８Ｆ、Ｇ）、単独ＣＴＣの割合の増加及びＣＴＣクラスターの減少を観察し（図８Ｅ）、対照と比較して転移負荷の減少をもたらす（図８Ｈ）。
【0123】
ジゴキシン治療
ＢＲ１６の異種移植マウスでのジゴキシン治療では、腫瘍サイズに有意差は観察されなかった（図１０）。しかし、ジゴキシン治療により、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－好中球クラスターの数が明らかに減少し（図１１）、転移が抑制される結果となった（図１２）。
ＢＲ１６の異種移植マウスでのジゴキシン治療では、腫瘍サイズに有意差は観察されなかった（図１０）。しかし、ジゴキシン治療により、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－好中球クラスターの数が明らかに減少し（図１１）、転移が抑制される結果となった（図１２）。
【0124】
同様に、ＬＭ２の異種移植マウスでの治療では、腫瘍サイズに有意差は観察されなかった（図１３）。しかし、ジゴキシン治療は全生存期間を延長し（図１４）、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ好中球クラスターの形成を減少させた（図１５）。
【0125】
総合してこれらの結果から、インビボでのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ阻害が、ＣＴＣクラスターを自発的に放出する癌性病変の能力を抑制し、転移性播種能力の顕著な低下をもたらすことを示している。
【0126】
臨床試験
患者に毎日維持量のジゴキシンを投与する。ジゴキシンの１日量を、腎機能及び目標血清ジゴキシン濃度に応じて計算し、０．１２５ｍｇ及び０．２５ｍｇの錠剤の有効性に基づいて調整した治療計画において朝（午前１０時前）に適用した。平均ＣＴＣクラスターサイズの分析用の血液試料は、スクリーニング時、０日（最初の経口摂取の２時間後）、３日及び７日に採取した。７日又は１４日のジゴキシン血清レベルが０．７０ｎｇ／ｍｌ未満の場合、ジゴキシン血清レベルに応じて、ジゴキシンによる維持療法が最大３週間継続される。維持療法の３週目は、必要に応じて個々の用量調整が行われる。
患者に毎日維持量のジゴキシンを投与する。ジゴキシンの１日量を、腎機能及び目標血清ジゴキシン濃度に応じて計算し、０．１２５ｍｇ及び０．２５ｍｇの錠剤の有効性に基づいて調整した治療計画において朝（午前１０時前）に適用した。平均ＣＴＣクラスターサイズの分析用の血液試料は、スクリーニング時、０日（最初の経口摂取の２時間後）、３日及び７日に採取した。７日又は１４日のジゴキシン血清レベルが０．７０ｎｇ／ｍｌ未満の場合、ジゴキシン血清レベルに応じて、ジゴキシンによる維持療法が最大３週間継続される。維持療法の３週目は、必要に応じて個々の用量調整が行われる。
【0127】
材料と方法
細胞培養
ＣＴＣ由来細胞を、超低付着（ＵＬＡ）６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７１－ＣＯＲ）上で低酸素（５％酸素）下にて維持した。２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト上皮増殖因子（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号ＰＨＧ０３１３）、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト線維芽細胞増殖因子（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００－１８Ｂ）、１×Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１７５０４－０４４）及びの１×抗生物質－抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２４００６２）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５２４００－０２５）中に含有するＣＴＣ成長培地を３日ごとに添加した。継代のために、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒ遠心分離機（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７５００４５１５）を使用して、細胞を８００ｇで５分間遠沈した。続いて上清を吸引し、細胞を２ｍｌ／ウェルのＣＴＣ培地に再懸濁し、６ウェルのＵＬＡプレートに播種した。ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞を、本発明者の研究室で生成した。Ｂｒｘ５０のＣＴＣ由来細胞を、Ｈａｂｅｒ及びＭａｈｅｓｗａｒａｎの研究室（ＭＧＨ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、ハーバードメディカルスクール、マサチューセッツ州ボストン）から入手した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＬＭ２）細胞は、Ｊｏａｎ Ｍａｓｓａｇｕｅの研究室（ＭＳＫＣＣ、ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から寄贈され、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０５０００６４）及び１×抗生物質－抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２４００６２）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１１３３００５７）で継代した。継代のために、ＬＭ２細胞をＤ－ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０１６９）で１回洗浄し、０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５２０００５６）を使用して解離させた。
細胞培養
ＣＴＣ由来細胞を、超低付着（ＵＬＡ）６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７１－ＣＯＲ）上で低酸素（５％酸素）下にて維持した。２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト上皮増殖因子（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号ＰＨＧ０３１３）、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト線維芽細胞増殖因子（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００－１８Ｂ）、１×Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１７５０４－０４４）及びの１×抗生物質－抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２４００６２）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５２４００－０２５）中に含有するＣＴＣ成長培地を３日ごとに添加した。継代のために、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒ遠心分離機（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７５００４５１５）を使用して、細胞を８００ｇで５分間遠沈した。続いて上清を吸引し、細胞を２ｍｌ／ウェルのＣＴＣ培地に再懸濁し、６ウェルのＵＬＡプレートに播種した。ＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞を、本発明者の研究室で生成した。Ｂｒｘ５０のＣＴＣ由来細胞を、Ｈａｂｅｒ及びＭａｈｅｓｗａｒａｎの研究室（ＭＧＨ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、ハーバードメディカルスクール、マサチューセッツ州ボストン）から入手した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＬＭ２）細胞は、Ｊｏａｎ Ｍａｓｓａｇｕｅの研究室（ＭＳＫＣＣ、ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から寄贈され、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０５０００６４）及び１×抗生物質－抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２４００６２）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１１３３００５７）で継代した。継代のために、ＬＭ２細胞をＤ－ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０１６９）で１回洗浄し、０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５２０００５６）を使用して解離させた。
【0128】
ＣＴＣの捕捉及び同定
ＣＴＣ分析用の血液検体は、スイス当局（ＥＫＮＺ、スイス北西部／中央部の倫理委員会）から倫理的承認を受けたプロトコルＥＫＮＺ ＢＡＳＥＣ２０１６－０００６７及びＥＫ３２１／１０に従って患者の同意を得た後、バーゼル大学病院から入手した。ＥＤＴＡバキュテナーにて、患者１人あたり平均７．５ｍｌの血液を採取した。採血から１時間以内に、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘ ＧＥＮ３Ｄ６．５細胞分離カセット（Ａｎｇｌｅ Ｅｕｒｏｐｅ）で血液を処理した。マウスの研究では、心臓穿刺によって血液を回収し、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘデバイスを介して１ｍｌの血液を同様に処理した。捕捉したＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ－ＡＦ４８８結合抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号ＣＳＴ５１９８）、ＨＥＲ２－ＡＦ４８８結合抗体（カタログ番号３２４４１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＥＧＦＲ－ＦＩＴＣ結合抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ１１４００）、及びＣＤ４５－ＢＶ６０５結合抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、 カタログ番号３０４０４２（抗ヒト）；カタログ番号１０３１４０（抗マウス））を用いてＰａｒｓｏｒｔｉｘカセットでさらに染色した。ＧＦＰ－ルシフェラーゼレポーターを安定して発現するがん細胞を有する他の全てのモデル（異種移植片）では、抗ＣＤ４５染色のみを実行し、一方、ＣＴＣをＧＦＰ発現に基づいて同定した。単独ＣＴＣ、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－ＷＢＣクラスターを含む捕捉したＣＴＣの数は、細胞がまだカセット内にある間に決定した。次に、ＣＴＣを、ＤＰＢＳ（番号１４１９０１６９、Ｇｉｂｃｏ）のカセットから、超低付着プレート（番号３４７１－ＣＯＲ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に放出した。代表的な画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳを使用するＬｅｉｃａ ＤＭＩ４０００蛍光顕微鏡で４０倍の倍率で撮影し、ＩｍａｇｅＪで分析した。
ＣＴＣ分析用の血液検体は、スイス当局（ＥＫＮＺ、スイス北西部／中央部の倫理委員会）から倫理的承認を受けたプロトコルＥＫＮＺ ＢＡＳＥＣ２０１６－０００６７及びＥＫ３２１／１０に従って患者の同意を得た後、バーゼル大学病院から入手した。ＥＤＴＡバキュテナーにて、患者１人あたり平均７．５ｍｌの血液を採取した。採血から１時間以内に、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘ ＧＥＮ３Ｄ６．５細胞分離カセット（Ａｎｇｌｅ Ｅｕｒｏｐｅ）で血液を処理した。マウスの研究では、心臓穿刺によって血液を回収し、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘデバイスを介して１ｍｌの血液を同様に処理した。捕捉したＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ－ＡＦ４８８結合抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号ＣＳＴ５１９８）、ＨＥＲ２－ＡＦ４８８結合抗体（カタログ番号３２４４１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＥＧＦＲ－ＦＩＴＣ結合抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ１１４００）、及びＣＤ４５－ＢＶ６０５結合抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、 カタログ番号３０４０４２（抗ヒト）；カタログ番号１０３１４０（抗マウス））を用いてＰａｒｓｏｒｔｉｘカセットでさらに染色した。ＧＦＰ－ルシフェラーゼレポーターを安定して発現するがん細胞を有する他の全てのモデル（異種移植片）では、抗ＣＤ４５染色のみを実行し、一方、ＣＴＣをＧＦＰ発現に基づいて同定した。単独ＣＴＣ、ＣＴＣクラスター及びＣＴＣ－ＷＢＣクラスターを含む捕捉したＣＴＣの数は、細胞がまだカセット内にある間に決定した。次に、ＣＴＣを、ＤＰＢＳ（番号１４１９０１６９、Ｇｉｂｃｏ）のカセットから、超低付着プレート（番号３４７１－ＣＯＲ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に放出した。代表的な画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳを使用するＬｅｉｃａ ＤＭＩ４０００蛍光顕微鏡で４０倍の倍率で撮影し、ＩｍａｇｅＪで分析した。
【0129】
ＣＴＣ－ＷＢＣクラスターでの白血球染色の差異
Ｐａｒｓｏｒｔｉｘマイクロ流体カセット内に捕捉した生ＣＴＣは、抗ビオチン－ＣＤ４５（カタログ番号１０３１０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（カタログ番号４０５２２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＬｙ－６Ｇ－ＡＦ５９４（カタログ番号１２７６３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び抗ＣＤ１１ｂ－ＡＦ６４７（クローンＭ１／７０、バーゼル大学のＲｏｘａｎｅ Ｔｕｓｓｉｗａｎｄ博士からの贈与）又は抗Ｆ４／８０－ＡＦ５９４（カタログ番号１２３１４０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ１１ｂ－ＡＦ６４７で検出した。さらに、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ由来のＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ－ＡＦ４８８（カタログ番号１１８２１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でマークした。次に、細胞をマイクロ流体システムから超低付着プレートに穏やかに放出し、すぐに画像化した（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ４００）。好中球（Ｌｙ－６Ｇ＋ＣＤ１１ｂｍｅｄ）、単球（Ｌｙ－６Ｇ－ＣＤ１１ｂｍｅｄ／ｈｉｇｈ）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋）を有するＣＴＣ－ＷＢＣクラスターの数を評価した。画像化の直後に、細胞をスライドガラス上で遠心分離（５００ｒｐｍ、３分）し、メタノールで１分間固定化した。短時間風乾した後、Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色キット（番号９９９０７１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してスライドを染色し、製造元の指示に従って、捕捉した細胞の核形態を視覚化した。
Ｐａｒｓｏｒｔｉｘマイクロ流体カセット内に捕捉した生ＣＴＣは、抗ビオチン－ＣＤ４５（カタログ番号１０３１０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（カタログ番号４０５２２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＬｙ－６Ｇ－ＡＦ５９４（カタログ番号１２７６３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び抗ＣＤ１１ｂ－ＡＦ６４７（クローンＭ１／７０、バーゼル大学のＲｏｘａｎｅ Ｔｕｓｓｉｗａｎｄ博士からの贈与）又は抗Ｆ４／８０－ＡＦ５９４（カタログ番号１２３１４０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ１１ｂ－ＡＦ６４７で検出した。さらに、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ由来のＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ－ＡＦ４８８（カタログ番号１１８２１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でマークした。次に、細胞をマイクロ流体システムから超低付着プレートに穏やかに放出し、すぐに画像化した（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ４００）。好中球（Ｌｙ－６Ｇ＋ＣＤ１１ｂｍｅｄ）、単球（Ｌｙ－６Ｇ－ＣＤ１１ｂｍｅｄ／ｈｉｇｈ）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋）を有するＣＴＣ－ＷＢＣクラスターの数を評価した。画像化の直後に、細胞をスライドガラス上で遠心分離（５００ｒｐｍ、３分）し、メタノールで１分間固定化した。短時間風乾した後、Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色キット（番号９９９０７１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してスライドを染色し、製造元の指示に従って、捕捉した細胞の核形態を視覚化した。
【0130】
腫瘍形成アッセイ
全てのマウス実験は、機関のガイドラインに従って実施した。
全てのマウス実験は、機関のガイドラインに従って実施した。
【0131】
尾静脈実験では、ＮＯＤ ＳＣＩＤ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎの研究室）に１００μｌのＤ－ＰＢＳに再懸濁した１×１０６個のＢＲ１６－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を注射し、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でモニターした。ＣＴＣ異種移植マウスモデルの単離では、１×１０６個のＬＭ２－ＧＦＰ、１×１０６個のＢＲｘ５０－ＧＦＰ、又は１×１０６個のＢＲ１６－ＧＦＰの細胞を、Ｄ－ＰＢＳ中の１００μｌの５０％Ｃｕｌｔｒｅｘ ＰａｔｈＣｌｅａｒ低増殖因子基底膜抽出物（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３５３３－０１０－０２）に再懸濁し、ＮＳＧマウスに同所的に注射した。採血は、ＬＭ２細胞では腫瘍発症後４～５週間、ＢＲ１６では腫瘍発症後５～６か月、ＢＲｘ５０細胞では腫瘍発症後６～７か月で実施した。
【0132】
単独細胞のマイクロマニピュレーション
濃縮したＣＴＣは、６ウェルの超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７１－ＣＯＲ）内の１ｍｌのＤ－ＰＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０１６９）中にＰａｒｓｏｒｔｉｘカセットから収集され、ＣＫＸ４１オリンパス倒立蛍光顕微鏡（ＡＶＩＳＯ ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ－ＡＬＳの一部）を使用して視覚化した。単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターは、無傷の細胞形態、ＡＦ４８８／ＦＩＴＣ陽性染色、及びＢＶ６０５欠損の染色に基づいて同定した。標的細胞は、ＡＶＩＳＯ ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒマイクロマニピュレーター（ＡＬＳ）で３０μＭのガラスキャピラリーを使用して個別にマイクロマニピュレーションし、ＷＧＢＳ用に１０μｌの２×消化緩衝液（ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ－ Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｄ５０２０）又はＲＮＡシーケンス用に１Ｕ／μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ２６９４）を補充した２μｌのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２１６）を含有する個々のＰＣＲチューブ（Ａｘｙｇｅｎ、カタログ番号３２１－０３２－５０１）に堆積させ、液体窒素で直ちにフラッシュ凍結した。
濃縮したＣＴＣは、６ウェルの超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７１－ＣＯＲ）内の１ｍｌのＤ－ＰＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０１６９）中にＰａｒｓｏｒｔｉｘカセットから収集され、ＣＫＸ４１オリンパス倒立蛍光顕微鏡（ＡＶＩＳＯ ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ－ＡＬＳの一部）を使用して視覚化した。単独ＣＴＣ及びＣＴＣクラスターは、無傷の細胞形態、ＡＦ４８８／ＦＩＴＣ陽性染色、及びＢＶ６０５欠損の染色に基づいて同定した。標的細胞は、ＡＶＩＳＯ ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒマイクロマニピュレーター（ＡＬＳ）で３０μＭのガラスキャピラリーを使用して個別にマイクロマニピュレーションし、ＷＧＢＳ用に１０μｌの２×消化緩衝液（ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ－ Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｄ５０２０）又はＲＮＡシーケンス用に１Ｕ／μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ２６９４）を補充した２μｌのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２１６）を含有する個々のＰＣＲチューブ（Ａｘｙｇｅｎ、カタログ番号３２１－０３２－５０１）に堆積させ、液体窒素で直ちにフラッシュ凍結した。
【0133】
単独細胞全ゲノムの重亜硫酸塩シーケンシング
プロテイナーゼＫ消化と重亜硫酸塩処理は、ＥＺ ＤＮＡメチル化ダイレクトキット（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｄ５０２０）の製造元の指示に従って実行した。重亜硫酸塩処理したＤＮＡは、９μｌの溶出緩衝液を使用して溶出し、製造元の指示に従ってＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡメチル化キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＥＧＭＫ９１３９６）を使用してライブラリーを生成するために使用した。増幅のために、フェイルセーフ酵素（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＳＥ５１１００）を使用して１８サイクルを実行し、インデックスプライマーズキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＥＧＩＤＸ８１３１２）を使用してインデックスを導入した。ライブラリーの精製は、製造元の指示に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを１：１の比率で使用して実施した。ピペッティング工程時のＤＮＡ損失を回避するために、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤｅｃｋＷｏｒｋ低結合バリアピペットチップを使用した（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＣＬＳ４１３５－４Ｘ９６０ＥＡ）。ライブラリー濃度は、Ｑｕｂｉｔ ＤＳ ＤＮＡ ＨＳアッセイキットを製造元の指示に従って使用して推定した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｑ３２８５４）。
プロテイナーゼＫ消化と重亜硫酸塩処理は、ＥＺ ＤＮＡメチル化ダイレクトキット（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｄ５０２０）の製造元の指示に従って実行した。重亜硫酸塩処理したＤＮＡは、９μｌの溶出緩衝液を使用して溶出し、製造元の指示に従ってＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡメチル化キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＥＧＭＫ９１３９６）を使用してライブラリーを生成するために使用した。増幅のために、フェイルセーフ酵素（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＳＥ５１１００）を使用して１８サイクルを実行し、インデックスプライマーズキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＥＧＩＤＸ８１３１２）を使用してインデックスを導入した。ライブラリーの精製は、製造元の指示に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを１：１の比率で使用して実施した。ピペッティング工程時のＤＮＡ損失を回避するために、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤｅｃｋＷｏｒｋ低結合バリアピペットチップを使用した（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＣＬＳ４１３５－４Ｘ９６０ＥＡ）。ライブラリー濃度は、Ｑｕｂｉｔ ＤＳ ＤＮＡ ＨＳアッセイキットを製造元の指示に従って使用して推定した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｑ３２８５４）。
【0134】
ＲＮＡ配列ライブラリーの作成
Ｍａｃａｕｌａｙら（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１、 ２０８１－２１０３、２０１６）に従って、オリゴｄＴプライマーと結合したビーズ上にＲＮＡを捕捉した（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１、２０８１－２１０３、２０１６）。ｃＤＮＡは、ＰｉｃｅｌｌｉらのＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２プロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９、１７１－１８１、２０１４）に従って生成した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＣ－１３１－２００１）を製造元の指示に従って使用して、試料あたり０．２５ｎｇのｃＤＮＡから配列ライブラリーを生成し、インデックスを作成した。
Ｍａｃａｕｌａｙら（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１、 ２０８１－２１０３、２０１６）に従って、オリゴｄＴプライマーと結合したビーズ上にＲＮＡを捕捉した（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１、２０８１－２１０３、２０１６）。ｃＤＮＡは、ＰｉｃｅｌｌｉらのＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２プロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９、１７１－１８１、２０１４）に従って生成した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＣ－１３１－２００１）を製造元の指示に従って使用して、試料あたり０．２５ｎｇのｃＤＮＡから配列ライブラリーを生成し、インデックスを作成した。
【0135】
ＦＤＡ承認の化合物スクリーニング
２４８６個のＦＤＡ承認化合物を含むライブラリーは、Ｎｅｘｕｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ－ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈから購入した。各化合物を１５μＭ濃度のＣＴＣ培地を使用して再懸濁し、２０μｌを合計６４個の平底透明超低付着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７４）に二重にアリコートした。
２４８６個のＦＤＡ承認化合物を含むライブラリーは、Ｎｅｘｕｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ－ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈから購入した。各化合物を１５μＭ濃度のＣＴＣ培地を使用して再懸濁し、２０μｌを合計６４個の平底透明超低付着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７４）に二重にアリコートした。
【0136】
ＣＴＣ由来の細胞株のクラスターサイズを小さくするために、４０μｍのセルストレーナーを使用した（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１７５０）。５０００個のＣＴＣ由来細胞を含む４０μｌを、１５μＭの濃度で事前に分注したＦＤＡ承認化合物２０μｌを含む９６ウェル超低付着プレートにウェルごとに播種し、最終的な化合物濃度を５μＭにした。プレートを低酸素（５％酸素）で２日間インキュベートした後、２０μｌを４０μｌのＤ－ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０１６９）を含む９６ウェルの黒色／透明組織培養処理プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３２１９）に移し、最終濃度４μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３４５８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｈ２１４８６）、２μＭのＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｔ６６８）、及び４μＭのＴＯＴＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｔ３６０４）で３７°Ｃで１時間染色した。各プレートには、２つの陽性対照（未処理細胞）と２つの陰性対照（未処理及び４０μＭろ過細胞）を含んだ。Ｚファクターは、次の式を使用して個々のプレートごとに計算した。Ｚ’＝１－３（σｓ＋σｃ）／｜μｓ－μｃ｜３（σ：標準偏差、μ：平均、ｓ：陽性対照、ｃ：陰性対照）（Ｍａｒｔｉｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９，ｅ８８３３８，２０１４）で、範囲は、０．６２～０．９３７の間であった。プレートはＯｐｅｒｅｔｔａ ハイコンテントイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてスキャンし、Ｈａｒｍｏｎｙ ハイコンテントイメージングシステム及び解析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてクラスター分析を行った。
【0137】
エンリッチメントスコア
エンリッチメントスコア（ＥＳ）は、多くの対象物を含む試料内の特定の対象物の過剰出現又は過小出現を示す。正のＥＳは、分析された機能のセット内の他の特性と比較して、特定の特性が過剰出現されていることを示す（＝エンリッチメント（濃縮））。負のエンリッチメントスコアは、反対のことを示し、つまり、試料内の他の特性の値が予想されるよりも特性の存在が少ないことを示す。言い換えれば、ある転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の正のＥＳは、ＴＦＢＳが他のＴＦＢＳよりも高い程度で試料に出現していることを示す（＝エンリッチメント化）。エンリッチメントスコアは、特定のＥＳをデータセットの全ての対象物のエンリッチメントスコアの平均で割ることによって正規化して、正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を得るができる。エンリッチメントスコアの正規化は、遺伝子セットのサイズの差異、及び遺伝子セットと発現データセット間の相関の差異を説明し、したがって、正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）は、遺伝子セット全体で分析結果を比較するために使用することができる。該分析では、ＮＥＳスコアが３．０以上のＴＦＢＳのみが有意であると見なされる。
エンリッチメントスコア（ＥＳ）は、多くの対象物を含む試料内の特定の対象物の過剰出現又は過小出現を示す。正のＥＳは、分析された機能のセット内の他の特性と比較して、特定の特性が過剰出現されていることを示す（＝エンリッチメント（濃縮））。負のエンリッチメントスコアは、反対のことを示し、つまり、試料内の他の特性の値が予想されるよりも特性の存在が少ないことを示す。言い換えれば、ある転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の正のＥＳは、ＴＦＢＳが他のＴＦＢＳよりも高い程度で試料に出現していることを示す（＝エンリッチメント化）。エンリッチメントスコアは、特定のＥＳをデータセットの全ての対象物のエンリッチメントスコアの平均で割ることによって正規化して、正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を得るができる。エンリッチメントスコアの正規化は、遺伝子セットのサイズの差異、及び遺伝子セットと発現データセット間の相関の差異を説明し、したがって、正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）は、遺伝子セット全体で分析結果を比較するために使用することができる。該分析では、ＮＥＳスコアが３．０以上のＴＦＢＳのみが有意であると見なされる。
【0138】
ＢＲ１６でのＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９ ＣＬＤＮ３／４ダブルノックアウト
本発明者らは、ｐＬｅｎｔｉ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のレンチウイルス送達を使用して、ＧＦＰとともにＣａｓ９タンパク質を安定して発現するＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞株を生成した。次いで、ＢＲ１６－Ｃａｓ９－ＧＦＰ株において、本発明者らは、ＣＬＤＮ３又はＣＬＤＮ４のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡ配列を導入した。詳細には、ｓｇＲＮＡ配列はＧＰＰのＷｅｂポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎ）を使用して設計した。ＣＬＤＮ３を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（（センス）５’－ＣＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧ－３’（配列番号０１）及び（センス）５’－ＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＡ－３’；（配列番号０２））をベクターであるｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）でクローニングし、ＣＬＤＮ４を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（（センス）５’－ＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧ－３’（配列番号０３）及び（センス）５’－ＡＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＴ－３’；（配列番号０４））をベクターであるｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｂｌａｓｔでクローニングした。ベクターｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｂｌａｓｔは、プラスミドｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子を、ＭｌｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いてブラスチジン耐性遺伝子に置き換えることにより作成した。二重陽性クローンは、２週間のピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）の抗生物質選択に基づいて選択され、ＣＬＤＮ３／ＣＬＤＮ４ノックアウトはウエスタンブロットで検証された。
本発明者らは、ｐＬｅｎｔｉ－Ｃａｓ９－ＥＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のレンチウイルス送達を使用して、ＧＦＰとともにＣａｓ９タンパク質を安定して発現するＢＲ１６のＣＴＣ由来細胞株を生成した。次いで、ＢＲ１６－Ｃａｓ９－ＧＦＰ株において、本発明者らは、ＣＬＤＮ３又はＣＬＤＮ４のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡ配列を導入した。詳細には、ｓｇＲＮＡ配列はＧＰＰのＷｅｂポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎ）を使用して設計した。ＣＬＤＮ３を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（（センス）５’－ＣＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧ－３’（配列番号０１）及び（センス）５’－ＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＡ－３’；（配列番号０２））をベクターであるｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ）でクローニングし、ＣＬＤＮ４を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（（センス）５’－ＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧ－３’（配列番号０３）及び（センス）５’－ＡＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＴ－３’；（配列番号０４））をベクターであるｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｂｌａｓｔでクローニングした。ベクターｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｂｌａｓｔは、プラスミドｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子を、ＭｌｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いてブラスチジン耐性遺伝子に置き換えることにより作成した。二重陽性クローンは、２週間のピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）の抗生物質選択に基づいて選択され、ＣＬＤＮ３／ＣＬＤＮ４ノックアウトはウエスタンブロットで検証された。
【0139】
生存率分析
生存率分析はｓｕｒｖｉｖａｌ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ（ｖ２．４１－３）を用いて行った。カプラン・マイヤー曲線を作成し、ログランク検定を用いて群間の生存率の差の有意性を推定した。患者については、無増悪生存期間を、原発性腫瘍の診断から最初の再発までの期間と定義した。マウスモデルの解析では、死亡を解析のエンドポイントとして選択し、発明者らのマウスプロトコルガイドラインに従い、所与の動物を安楽死させなければならない時と定義した。
生存率分析はｓｕｒｖｉｖａｌ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ（ｖ２．４１－３）を用いて行った。カプラン・マイヤー曲線を作成し、ログランク検定を用いて群間の生存率の差の有意性を推定した。患者については、無増悪生存期間を、原発性腫瘍の診断から最初の再発までの期間と定義した。マウスモデルの解析では、死亡を解析のエンドポイントとして選択し、発明者らのマウスプロトコルガイドラインに従い、所与の動物を安楽死させなければならない時と定義した。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】