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特表2022-514574ｐＭＨＣ占有率のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-14
(54)【発明の名称】ｐＭＨＣ占有率のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 14/74 20060101AFI20220204BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220204BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220204BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220204BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220204BHJP
【ＦＩ】
C07K14/74 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/04
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021535105
(86)(22)【出願日】2019-12-18
(85)【翻訳文提出日】2021-07-14
(86)【国際出願番号】 US2019067211
(87)【国際公開番号】W WO2020132087
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】62/781,377
(32)【優先日】2018-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518399586
【氏名又は名称】エムビーエル インターナショナル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】クレイマン， イーデン
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QR48
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA54
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045FA51
(57)【要約】
本開示は、異なる核酸分子でバーコード化されたｐＭＨＣ多量体種、および生体試料中の抗原応答性およびＴＣＲ結合力の両方を決定し、かつ対応するＴ細胞トランスクリプトーム、Ｔ細胞プロテオーム、Ｔ細胞エピゲノム、またはＴＣＲ遺伝子座を配列決定するためのその使用について記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）バーコード化多量体であって、少なくとも１つの調節可能なｐＭＨＣ実体を含み、前記ｐＭＨＣ実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも１つのｐＭＨＣ分子と、
１骨格分子あたり少なくとも１つの核酸分子と、を含み、
前記核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）バーコード化多量体。
【請求項2】
前記核酸分子が、ｐＭＨＣバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第２のストレッチと、を含む、請求項１に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項3】
ＮＧＳに使用するための、請求項２に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項4】
前記骨格分子がストレプトアビジンである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項5】
前記多量体が、１骨格分子あたり少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｐＭＨＣ実体を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項6】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－ｐＭＨＣ結合力の監視に使用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項7】
前記ストレプトアビジンが前記少なくとも１つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされ、それにより、１ストレプトアビジンあたり少なくとも４つのＭＨＣ単量体を提供する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項8】
前記ストレプトアビジンが前記少なくとも１つの核酸分子に非共有結合的にコンジュゲートされており、前記核酸分子がビオチン化されており、前記少なくとも１つのビオチン化核酸分子と前記ストレプトアビジンがある比率で複合体形成されており、前記比率が、１ストレプトアビジン：１オリゴ、
１ストレプトアビジン：２オリゴ、および
１ストレプトアビジン：３オリゴからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項9】
ＨＰＬＣ精製プロセスによって産生される、請求項１に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項10】
前記ストレプトアビジンが前記少なくとも１つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされており、前記核酸分子がバーコードおよび少なくとも１つのビオチン結合部位を含み、前記結合部位が、ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項11】
前記少なくとも１つの核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル領域、中央バーコード領域、任意にＵＭＩ、または任意に少なくとも１０個の連続したアデニンの３’ポリ－Ａテール領域を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項12】
前記核酸の３’末端テールのうちの前記少なくとも１つが標的オリゴ配列に対して相補的な任意の配列で構成されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項13】
前記少なくとも１つの核酸分子が、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のｐＭＨＣ多量体の複数のサブセットを含む組成物であって、ｐＭＨＣ多量体の各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【請求項15】
特異的ＭＨＣ分子を対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、ａ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の複数のｐＭＨＣ多量体分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くの粒子を含まず、かつ１つ以上のｐＭＨＣ多量体分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）各液滴中にＴ細胞ｃＤＮＡライブラリおよびｐＭＨＣバーコードライブラリを生成することと、
ｄ）前記Ｔ細胞ｍＲＮＡライブラリおよび前記ＭＣＨバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を前記対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。
【請求項16】
前記ベイト配列が３’ポリ－（ｄＴ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
多量体ｐＭＨＣであって、骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣ。
【請求項18】
前記骨格に連結された第１のタイプの核酸分子を含み、前記第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、請求項１７に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項19】
前記骨格に連結された第１および第２のタイプの核酸分子を含み、前記第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第２のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記２つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、前記２つのタイプの前記核酸分子の各々のＵＭＩ配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある、請求項１７に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項20】
前記核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項21】
前記核酸分子が、前記ＴＣＲ定常遺伝子の５’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項22】
前記ＴＣＲ定常遺伝子が、ＴＣＲα定常遺伝子、ＴＣＲβ定常１遺伝子、またはＴＣＲβ定常２遺伝子である、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の多量体ＭＨＣ。
【請求項23】
前記核酸分子の５’末端および／または３’末端が前記骨格分子に連結されている、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の多量体ＭＨＣ。
【請求項24】
前記核酸分子が、前記バーコード領域に隣接した一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の多量体ＭＨＣ。
【請求項25】
少なくとも１つの核酸分子が、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の多量体ＭＨＣ。
【請求項26】
請求項１７～２５のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【請求項27】
特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結する方法であって、ａ）請求項１７～２５のいずれか１項に記載の１つ以上の多量体ｐＭＨＣを提供することと、
ｂ）前記多量体ｐＭＨＣ分子をＴ細胞と接触させることと、
ｃ）前記多量体ＭＨＣ分子に結合したＴ細胞を前記多量体ＭＨＣ分子に結合していないＴ細胞から分離することと、
ｄ）前記分離されたＴ細胞を溶解することと、
ｅ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｆ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的ｐＭＨＣ分子を前記対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
【請求項28】
前記ステップｃ）がＦＡＣＳ選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記多量体ｐＭＨＣ分子が直接または間接的に蛍光標識される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項30】
バーコード化ｐＭＨＣ分子に結合した前記Ｔ細胞が単一の収集管内でバルク選別される、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
バーコード化ｐＭＨＣ分子に結合した同族Ｔ細胞が単一細胞として個々のプレートウェルに選別される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
多量体ｐＭＨＣであって、骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣ。
【請求項33】
前記核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、ＵＭＩ、および３’鋳型スイッチオリゴ配列を含む、請求項３２に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項34】
前記鋳型スイッチオリゴ配列が３つのリボグアノシンの３’ストレッチを含む、請求項３２または３３に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項35】
前記少なくとも１つの核酸分子が、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣ。
【請求項36】
請求項３２～３５のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ｐＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【請求項37】
特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ相補的配列に連結する方法であって、ａ）請求項３２～３５のいずれか１項に記載の複数の多量体ｐＭＨＣ分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くのビーズを含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｄ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
【請求項38】
前記ビーズが、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ビーズが２つのオリゴにコンジュゲートされており、第１のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、第２のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、前記２つのオリゴの前記中央細胞バーコードが同じ配列を有する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項40】
前記ＤＮＡライブラリ生成ステップｃ）が、ＭＭＬＶ逆転写酵素を使用したＴＣＲ ｍＲＮＡの逆転写を含む、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記ＰＣＲハンドルが前記バーコード配列のライブラリ調製を可能にする、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項42】
前記ＰＣＲハンドルがｉ７アダプター配列を有し得る、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項43】
前記バーコード領域が少なくとも４つのヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項44】
前記ｐＭＨＣ分子が、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して、ＭＨＣ重鎖を介して、またはＭＨＣ軽鎖（β２Ｍ）を介して前記骨格に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項45】
前記ＭＨＣ分子がストレプトアビジン－ビオチン結合を介して前記骨格に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項46】
前記多量体ｐＭＨＣが少なくとも１つのＭＨＣ分子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項47】
前記少なくとも１つの核酸分子が化学修飾をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項48】
前記少なくとも１つの核酸分子の５’末端または３’末端がスペーサーを介してアミノ基に結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項49】
前記スペーサーが６炭素スペーサーまたは１２炭素スペーサーであり得る、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項50】
前記少なくとも１つの核酸分子が５’末端および／または３’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項51】
前記少なくとも１つの核酸分子と前記骨格分子との間の連結が前記核酸分子の誘導性解離を可能にする、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項52】
前記少なくとも１つの核酸分子が共有結合または非共有結合を介して前記骨格分子に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項53】
前記共有結合がチオエーテルである、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項54】
前記少なくとも１つの核酸分子が誘導的に切断可能な結合を介して前記骨格分子に連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項55】
前記誘導的に切断可能な結合が光切断可能であるか、またはジスルフィド結合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項56】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ単量体である、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項57】
前記ＭＨＣ分子がペプチドと複合体形成されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項58】
前記ＭＨＣ分子がビオチン化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項59】
前記骨格が、蛍光標識、Ｈｉｓタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される１つ以上の標識をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項60】
前記骨格が前記蛍光標識に直接コンジュゲートされている、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項61】
前記蛍光標識がフルオロフォアタグ付けオリゴである、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項62】
前記フルオロフォアタグ付けオリゴが前記骨格に連結された前記核酸分子に対して相補的である、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項63】
前記骨格がフルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項64】
前記フルオロフォアが、蛍光タンパク質、蛍光色素、または量子ドットである、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項65】
前記少なくとも１つの核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工ヌクレオチド、ＰＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される核酸分子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項66】
前記多量体ｐＭＨＣが同族Ｔ細胞に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項67】
前記多量体ｐＭＨＣがフローサイトメトリー用途と適合性がある、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項68】
前記フローサイトメトリー用途が単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項69】
前記多量体ｐＭＨＣがＮＧＳベースの用途と適合性がある、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項70】
前記ＮＧＳベースの用途が液滴ベースの単一細胞配列決定である、先行請求項のいずれか１項に記載の多量体ｐＭＨＣまたは方法。
【請求項71】
試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、ａ）請求項１～１３、１７～２５、３２～３５、および４１～７０のいずれか１項に記載の１つ以上の多量体ｐＭＨＣを提供することと、
ｂ）前記多量体ｐＭＨＣ分子を前記試料と接触させることと、
ｃ）前記多量体ｐＭＨＣ分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記ＭＨＣ分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記１つ以上のＭＨＣ分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。
【請求項72】
前記試料が、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記試料が哺乳動物から得られる、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項74】
前記方法が、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む、請求項１～７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
前記増幅がＰＣＲである、請求項１～７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項76】
前記核酸分子のバーコード領域の検出が、前記バーコード領域の配列決定またはｑＰＣＲによる前記バーコード領域の検出を含む、請求項１～７５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，３７７号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，３７７号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
同族細胞および結合タンパク質／ペプチドのハイスループット配列決定を可能にするバーコード化抗体およびバーコード化ｐＭＨＣ多量体が最近開発されている１～４。バーコード化ＭＨＣ多量体は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ結合事象のハイスループット多重化ＮＧＳベースのスクリーニングを可能にし、この情報をトランスクリプトームデータ、プロテオームデータ、およびＴＣＲ配列データと潜在的に単一細胞レベルで組み合わせる能力を有する。最近の実例は、バーコード化ｐＭＨＣ多量体の実現可能性および有用性を実証している１、４、５。しかしながら、１つの制限は、現在の技術が、１ストレプトアビジンあたりのｐＭＨＣ単量体負荷を微調整してＴＣＲ－ｐＭＨＣ活性を測定することができないことである。ＴＣＲ－ｐＭＨＣ活性を評価することができるバーコード化ｐＭＨＣ多量体が必要性とされている。化学的コンジュゲーションを回避し、かつＭＨＣ単量体試薬を節約するバーコード化ｐＭＨＣ多量体を産生するための費用効率の高い方法も必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｂｅｎｔｚｅｎ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ－Ｉ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６．３４（１０）：ｐ．１０３７－１０４５．
【非特許文献2】Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（９）：ｐ．８６５－８６８．
【非特許文献3】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７．３５（１０）：ｐ．９３６－９３９．
【非特許文献4】Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８．
【非特許文献5】Ｄａｈｏｔｒｅ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ－Ｂａｒｃｏｄｅｄ ｐＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１９．９１（４）：ｐ．２６９５－２７００．
【発明の概要】
【0004】
ＴＣＲ－ｐＭＨＣ結合力評価と並行してＴ細胞オミクス分析を組み合わせるためのプラットフォームとして使用され得る共有結合的にコンジュゲートされたバーコード化ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートおよび非共有結合的にコンジュゲートされたバーコード化ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート（図１）の両方を産生する組成物および方法が本明細書に提供される。
一態様では、本開示は、ストレプトアビジン分子に非共有結合した少なくとも１つのビオチン化ｐＭＨＣ分子と、同じ骨格分子に共有結合または非共有結合した少なくとも１つの核酸分子であって、核酸が中央バーコード領域を有し得る、少なくとも１つの核酸分子とからなる、骨格（例えば、ストレプトアビジン）占有率の異なるバーコード化ｐＭＨＣ多量体種を提供する。
一態様では、本開示は、ストレプトアビジン分子に非共有結合した少なくとも１つのビオチン化ｐＭＨＣ分子と、同じ骨格分子に共有結合または非共有結合した少なくとも１つの核酸分子であって、核酸が中央バーコード領域を有し得る、少なくとも１つの核酸分子とからなる、骨格（例えば、ストレプトアビジン）占有率の異なるバーコード化ｐＭＨＣ多量体種を提供する。
【0005】
別の態様では、本開示は、所望のストレプトアビジン占有率を得るためにＨＰＬＣ精製を使用してストレプトアビジンをビオチン化オリゴでバーコード化することを提供する。
【0006】
別の態様では、本開示は、共有結合的連結（例えば、チオエーテル結合またはビス－アリールヒドラゾンコンジュゲート結合）を使用してストレプトアビジンを１ストレプトアビジンあたり少なくとも１つのオリゴでバーコード化することを提供する。
【0007】
一態様では、本開示は、中央バーコード領域およびポリ－Ａテールを含む少なくとも１つの核酸分子でバーコード化されたｐＭＨＣ多量体を提供する。
【0008】
別の態様では、本開示は、中央バーコード領域およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子でバーコード化されたｐＭＨＣ多量体を提供する。
【0009】
別の態様では、本開示は、中央バーコード領域および鋳型スイッチオリゴ配列を含む少なくとも１つの核酸分子でバーコード化されたｐＭＨＣ多量体を提供する。
【0010】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるバーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製または使用するための方法を提供する。
【0011】
一態様では、本開示は、ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）バーコード化多量体であって、
少なくとも１つの調節可能なｐＭＨＣ実体を含み、前述のｐＭＨＣ実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも１つのｐＭＨＣ分子と、
１骨格分子あたり少なくとも１つの核酸分子と、を含み、
前述の核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）バーコード化多量体を提供する。
少なくとも１つの調節可能なｐＭＨＣ実体を含み、前述のｐＭＨＣ実体が、
骨格分子によって連結された少なくとも１つのｐＭＨＣ分子と、
１骨格分子あたり少なくとも１つの核酸分子と、を含み、
前述の核酸分子が共有結合的または非共有結合的に連結されたコンジュゲートを含む、ペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）バーコード化多量体を提供する。
【0012】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、核酸分子は、
ｐＭＨＣバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第２のストレッチと、を含む。
ｐＭＨＣバーコード化ヌクレオチドの中央ストレッチと、
標的オリゴに対する相補性を有するヌクレオチドの第２のストレッチと、を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ＮＧＳに使用される。
【0014】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、骨格分子は、ストレプトアビジンである。
【0015】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、多量体は、１骨格分子あたり少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｐＭＨＣ実体を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－ｐＭＨＣ結合力を監視するために使用される。
【0017】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも１つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされ、それにより、１ストレプトアビジンあたり少なくとも４つのＭＨＣ単量体を提供する。
【0018】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも１つの核酸分子に非共有結合的にコンジュゲートされており、この核酸分子はビオチン化されており、少なくとも１つのビオチン化核酸分子とストレプトアビジンはある比率で複合体形成されており、この比率は、１ストレプトアビジン：１オリゴ、１ストレプトアビジン：２オリゴ、および１ストレプトアビジン：３オリゴからなる群から選択される。
【0019】
いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ＨＰＬＣ精製プロセスによって産生される。
【0020】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、少なくとも１つの核酸分子に共有結合的にコンジュゲートされており、この核酸分子はバーコードおよび少なくとも１つのビオチン結合部位を含み、この結合部位は、
ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む。
ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化ポリマー、ビオチン化フルオロフォア、切断可能なビオチン化オリゴ、またはビオチン化薬剤を含む。
【0021】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、５’ＰＣＲハンドル領域、中央バーコード領域、任意にＵＭＩ、または任意に少なくとも１０個の連続したアデニンの３’ポリ－Ａテール領域を含む。
【0022】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、核酸の３’末端テールのうちの少なくとも１つは、標的オリゴ配列に対して相補的な任意の配列で構成されている。
【0023】
本ｐＭＨＣ多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【0024】
別の態様では、本開示は、前述のｐＭＨＣ多量体のうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、ｐＭＨＣ多量体の各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
【0025】
別の態様では、本開示は、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、
ａ）複数の前述のｐＭＨＣ多量体分子のうちのいずれかと、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くの粒子を含まず、かつ１つ以上のｐＭＨＣ多量体分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
ｃ）各液滴中にＴ細胞ｃＤＮＡライブラリおよびｐＭＨＣバーコードライブラリを生成することと、
ｄ）Ｔ細胞ｍＲＮＡライブラリおよびＭＣＨバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法を提供する。
ａ）複数の前述のｐＭＨＣ多量体分子のうちのいずれかと、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびベイト配列を含む結合標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くの粒子を含まず、かつ１つ以上のｐＭＨＣ多量体分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
ｃ）各液滴中にＴ細胞ｃＤＮＡライブラリおよびｐＭＨＣバーコードライブラリを生成することと、
ｄ）Ｔ細胞ｍＲＮＡライブラリおよびＭＣＨバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法を提供する。
【0026】
本方法のいくつかの実施形態では、ベイト配列は、３’ポリ－（ｄＴ）である。
【0027】
別の態様では、本開示は、多量体ｐＭＨＣであって、
骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣを提供する。
骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣを提供する。
【0028】
いくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、骨格に連結された第１のタイプの核酸分子を含み、第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、骨格に連結された第１および第２のタイプの核酸分子を含み、
第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
第２のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
２つのタイプの核酸分子のバーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、２つのタイプの核酸分子の各々のＵＭＩ配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある。
第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
第２のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
２つのタイプの核酸分子のバーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、２つのタイプの核酸分子の各々のＵＭＩ配列がランダムであり、それ故に、互いに異なる可能性があるが、それらがそれぞれの核酸の同じ領域に位置する可能性がある。
【0030】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、核酸分子は、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含む。
【0031】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、核酸分子は、ＴＣＲ定常遺伝子の５’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
【0032】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常遺伝子は、ＴＣＲα定常遺伝子、ＴＣＲβ定常１遺伝子、またはＴＣＲβ定常２遺伝子である。
【0033】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、核酸分子の５’末端および／または３’末端は、骨格分子に連結されている。
【0034】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、核酸分子は、バーコード領域に隣接した一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。
【0035】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【0036】
別の態様では、本開示は、前述のｐＭＨＣ多量体のうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
【0037】
別の態様では、本開示は、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結する方法であって、
ａ）前述の多量体ｐＭＨＣのうちのいずれかのうちの１つ以上を提供することと、
ｂ）前述の多量体ｐＭＨＣ分子をＴ細胞と接触させることと、
ｃ）多量体ＭＨＣ分子に結合したＴ細胞を多量体ＭＨＣ分子に結合していないＴ細胞から分離することと、
ｄ）分離されたＴ細胞を溶解することと、
ｅ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびにｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｆ）ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
ａ）前述の多量体ｐＭＨＣのうちのいずれかのうちの１つ以上を提供することと、
ｂ）前述の多量体ｐＭＨＣ分子をＴ細胞と接触させることと、
ｃ）多量体ＭＨＣ分子に結合したＴ細胞を多量体ＭＨＣ分子に結合していないＴ細胞から分離することと、
ｄ）分離されたＴ細胞を溶解することと、
ｅ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびにｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｆ）ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
【0038】
前述の方法のいくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ＦＡＣＳ選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される。
【0039】
前述の方法のいくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣ分子は、直接または間接的に蛍光標識される。
【0040】
前述の方法のいくつかの実施形態では、バーコード化ｐＭＨＣ分子に結合したＴ細胞は、単一の収集管内でバルク選別される。
【0041】
前述の方法のいくつかの実施形態では、バーコード化ｐＭＨＣ分子に結合した同族Ｔ細胞は、単一細胞として個々のプレートウェルに選別される。
【0042】
別の態様では、本開示は、多量体ｐＭＨＣであって、
骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
前述の骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前述の核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣを提供する。
骨格分子によって連結された１つ以上のｐＭＨＣ分子と、
前述の骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前述の核酸分子が、増幅されるように設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体ｐＭＨＣを提供する。
【0043】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、核酸分子は、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、ＵＭＩ、および３’鋳型スイッチオリゴ配列を含む。
【0044】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、鋳型スイッチオリゴ配列は、３つのリボグアノシンの３’ストレッチを含む。
【0045】
本多量体ｐＭＨＣのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、約１０～２００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【0046】
別の態様では、本開示は、前述の多量体ｐＭＨＣのうちのいずれかの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ｐＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物を提供する。
【0047】
別の態様では、本開示は、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ相補的配列に連結する方法であって、
ａ）複数の前述の多量体ｐＭＨＣ分子のうちのいずれかと、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くのビーズを含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
ｃ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびにｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｄ）ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
ａ）複数の前述の多量体ｐＭＨＣ分子のうちのいずれかと、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くのビーズを含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を試験試料から形成することと、
ｃ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびにｐＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｄ）ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ｐＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法を提供する。
【0048】
本方法のいくつかの実施形態では、ビーズは、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される。
【0049】
本方法のいくつかの実施形態では、ビーズは、２つのオリゴにコンジュゲートされており、第１のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、第２のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、２つのオリゴの中央細胞バーコードが同じ配列を有する。
【0050】
本方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリ生成ステップｃ）は、ＭＭＬＶ逆転写酵素を使用したＴＣＲ ｍＲＮＡの逆転写を含む。
【0051】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＣＲハンドルは、バーコード配列のライブラリ調製を可能にする。
【0052】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＣＲハンドルは、ｉ７アダプター配列を有し得る。
【0053】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、バーコード領域は、少なくとも４つのヌクレオチドを含む。
【0054】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ分子は、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して、ＭＨＣ重鎖を介して、またはＭＨＣ軽鎖（β２Ｍ）を介して骨格に連結されている。
【0055】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して骨格に連結されている。
【0056】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、少なくとも１つのＭＨＣ分子を含む。
【0057】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、化学修飾をさらに含む。
【0058】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子の５’末端または３’末端は、スペーサーを介してアミノ基に結合している。
【0059】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、６炭素スペーサーまたは１２炭素スペーサーであり得る。
【0060】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、５’末端および／または３’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む。
【0061】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子と骨格分子との間の連結は、核酸分子の誘導性解離を可能にする。
【0062】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、共有結合または非共有結合を介して骨格分子に連結されている。
【0063】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、共有結合は、チオエーテルである。
【0064】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、
少なくとも１つの核酸分子は、誘導的に切断可能な結合を介して骨格分子に連結されている。
少なくとも１つの核酸分子は、誘導的に切断可能な結合を介して骨格分子に連結されている。
【0065】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導的に切断可能な結合は、光切断可能であるか、またはジスルフィド結合を含む。
【0066】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ単量体である。
【0067】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ペプチドと複合体形成されている。
【0068】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ビオチン化されている。
【0069】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、蛍光標識、Ｈｉｓタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される１つ以上の標識をさらに含む。
【0070】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、蛍光標識に直接コンジュゲートされている。
【0071】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、蛍光標識は、フルオロフォアタグ付けオリゴである。
【0072】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フルオロフォアタグ付けオリゴは、骨格に連結された核酸分子に対して相補的である。
【0073】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、骨格は、フルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される。
【0074】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フルオロフォアは、蛍光タンパク質、蛍光色素、または量子ドットである。
【0075】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工ヌクレオチド、ＰＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される核酸分子を含む。
【0076】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、同族Ｔ細胞に結合する。
【0077】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、フローサイトメトリー用途と適合性がある。
【0078】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、フローサイトメトリー用途は、単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。
【0079】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多量体ｐＭＨＣは、ＮＧＳベースの用途と適合性がある。
【0080】
前述の多量体ｐＭＨＣおよび方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＮＧＳベースの用途は、液滴ベースの単一細胞配列決定である。
【0081】
別の態様では、本開示は、試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
ａ）前述の多量体ｐＭＨＣのうちのいずれかのうちの１つ以上を提供することと、
ｂ）前述の多量体ｐＭＨＣ分子を前述の試料と接触させることと、
ｃ）多量体ｐＭＨＣ分子の前述の抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、ＭＨＣ分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前述の結合が、骨格分子を介して１つ以上のＭＨＣ分子に連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅することによって検出される、方法を提供する。
ａ）前述の多量体ｐＭＨＣのうちのいずれかのうちの１つ以上を提供することと、
ｂ）前述の多量体ｐＭＨＣ分子を前述の試料と接触させることと、
ｃ）多量体ｐＭＨＣ分子の前述の抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、ＭＨＣ分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前述の結合が、骨格分子を介して１つ以上のＭＨＣ分子に連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅することによって検出される、方法を提供する。
【0082】
本方法のいくつかの実施形態では、試料は、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される。
【0083】
本方法のいくつかの実施形態では、試料は、哺乳動物から得られる。
【0084】
本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む。
【0085】
本方法のいくつかの実施形態では、増幅は、ＰＣＲである。
本方法のいくつかの実施形態では、核酸分子のバーコード領域の検出は、バーコード領域の配列決定またはｑＰＣＲによるバーコード領域の検出を含む。
本方法のいくつかの実施形態では、核酸分子のバーコード領域の検出は、バーコード領域の配列決定またはｑＰＣＲによるバーコード領域の検出を含む。
【図面の簡単な説明】
【0086】
【図1】バーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製するためのストレプトアビジンへのコンジュゲーションのための修飾オリゴの一般構造を描写する。紫色の棒はオリゴを表し、緑色の星は５’修飾を表す。以下は、共有結合的コンジュゲーションに使用されるオリゴの配列である。オリゴの５’末端は、１２炭素スペーサーを有するアミノ基である。６炭素スペーサーを使用することもできる。チオール基またはビオチン基を含むが、これらに限定されない、アミノ基の代わりに、代替のオリゴ修飾を使用することができる。５’ビオチン基をストレプトアビジンへの非共有結合的連結に使用することができる。これらのオリゴ修飾をオリゴの３’末端に組み込むこともできる。ＰＣＲハンドルは、バーコード配列のライブラリ調製を可能にする。この具体的な事例では、ＰＣＲハンドルは、ｉ７アダプター配列である。四量体バーコード配列はＰＣＲハンドルの後に続き、所与のｐＭＨＣ複合体に対応する配列である。この配列では、ｐＭＨＣバーコードは、最大４０９６個の四量体バーコード可能性を可能にする６つのヌクレオチドで作製されている。より長いｐＭＨＣバーコード配列を使用して、スループットを増加させることができる。オリゴの３’末端には、標的配列、この場合では、ポリ（ｄＴ）ＶＮに結合することができるポリ－Ａテールがある。このオリゴの場合、２５個のアデニンが使用されるが、より長いアデニンストレッチを使用することができる。ポリ－Ａテールの５’末端にあるＢヌクレオチド（Ｇ、Ｃ、またはＴ）は、ポリ（ｄＴ）ＶＮ配列の２番目から最後の３’ヌクレオチドにあるＶ（Ｇ、Ｃ、またはＡ）ヌクレオチドへの結合を可能にする。ベイト配列のＮヌクレオチド（任意の塩基）がＣである場合、それは描写したオリゴ配列に相補的に結合する。オリゴの３’末端にある任意のホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基は、エキソヌクレアーゼ活性からの保護を提供する。修飾塩基を任意の位置に配置することができる。
【図2】バーコード化オリゴとストレプトアビジンとの間のジスルフィド架橋でのそれらのコンジュゲーションを示す。示される実施例では、コンジュゲーションを、Ｓｏｌｕｌｉｎｋタンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションキット（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行うことができる。ストレプトアビジン（この場合、プロザイム製）をスクシンイミジル－６－ヒドラジノ－ニコチンアミド（Ｓ－ＨｙＮｉｃ）で修飾する。５’－アミノ修飾オリゴをスクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド類似体（Ｓ－ＳＳ－４ＦＢ）で修飾する。修飾ストレプトアビジンおよび修飾オリゴを組み合わせて、バーコード化ストレプトアビジンを産生する。代替の方法論には、介在する光切断可能なリンカー（描写せず）を用いてオリゴをストレプトアビジンにコンジュゲートすることが含まれる。
【図3】ＤＮＡバーコード化オリゴが変性条件下でストレプトアビジンから解離することを示す。介在するジスルフィド架橋でストレプトアビジンにコンジュゲートされた６６ｍｅｒのオリゴを、ＳＹＢＲ安全アガロースゲル（レーン１ａ）上で泳動させる。過剰なオリゴを１００ｂｐ未満のラダーバンドで示している。レーン２ａでは、レーン１ａと同じ量のバーコード化ストレプトアビジンをベータ－メルカプトエタノールと２０分間インキュベートした後に、ゲル上に装填する。バーコード化ストレプトアビジンを表すバンドが著しく減弱している。同じゲルをクマシーブルーで染色して、タンパク質を可視化した。レーン１ｂでは、バーコード化ストレプトアビジンが明らかである一方で、レーン２ｂにおけるタンパク質の大半はゲルの上部にシフトされている。オリゴの負電荷なしで、裸の（ｂａｒｅ）ストレプトアビジンははるかにより遅く移動する。
【図4】バーコード化ストレプトアビジンがビオチンに結合する能力を保持することを示す。等量のバーコード化ストレプトアビジンを、ビオチン磁気ビーズ（レーン１ａ）またはストレプトアビジン磁気ビーズ（レーン２ａ）のいずれかとインキュベートした。同等量のビオチン磁気ビーズまたはストレプトアビジン磁気ビーズをこの実験に使用した。試料を磁気分離機に供して、結合したバーコード化ストレプトアビジンと結合していないバーコード化ストレプトアビジンを分離した。いずれかの反応由来の全ての結合していない画分を回収し、ＳＹＢＲ安全アガロースゲル上で泳動させた。同じゲルをクマシーブルーで染色して、タンパク質を可視化した（レーン１ｂおよび２ｂ）。バーコード化ストレプトアビジンの枯渇（レーン１ａおよび１ｂ）は、ビオチン結合を示す。ビオチンおよびストレプトアビジン磁性ビーズの両方をＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から購入した。
【図5】バーコード化ｐＭＨＣ多量体バリアントを示す。一番左のバーコード化ｐＭＨＣ多量体は、共有結合的コンジュゲーションに由来するストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートで構成されており、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体を使用して、確立された技術に従って四量体化する６。この共有結合的コンジュゲーションは、チオエーテル結合形成を含むが、これに限定されない、多くのコンジュゲーション化学に由来し得る。 全ての他のコンジュゲートは、ビオチン化オリゴとストレプトアビジンとの間の非共有結合的連結を利用する。左から２番目のバーコード化ｐＭＨＣ多量体は、１：１の比率で精製されたストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート（１ｂ）で構成されており、その後、これをｐＭＨＣ三量体化する。左から３番目のバーコード化ｐＭＨＣ多量体は、１：２の比率で精製されたストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート（２ｂ）で構成されており、その後、これをｐＭＨＣ二量体化する。一番右のバーコード化ｐＭＨＣ多量体は、１：３の比率で精製されたストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートで構成されており、その後、これをｐＭＨＣ単量体と組み合わせて、１：１のストレプトアビジン：単量体モル比を得る。異なる色で色付けしたオリゴは、各多量体種の異なるバーコード配列を表す。下部の三角形は、各多量体化コンジュゲートの予測ＴＣＲ－ｐＭＨＣ結合力を描写し、ここで、４つの単量体＞３つの単量体＞２つの単量体＞１つの単量体である。
【図6A-C】図６は、バーコード化ｐＭＨＣ多量体検出の方法論を描写する４つのパネル（図６Ａ～図６Ｄ）を含む。図６Ａでは、フルオロフォア含有ストレプトアビジン（例えば、ＰＥ－ストレプトアビジン）を、オリゴへのさらなるコンジュゲーションの開始点として使用する。図６Ｂでは、コンジュゲートされたオリゴに対して相補的なフルオロフォアタグ付けオリゴを、ｐＭＨＣバーコード化オリゴにアニーリングする。このアニーリングオリゴの長さは変化し得る。図６Ｃでは、フルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体を使用して、バーコード化ｐＭＨＣ多量体を検出する。使用するフルオロフォアの化学種には、蛍光色素および量子ドットが含まれ得るが、これらに限定されない。オリゴが非共有結合的に連結されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体種もこれらの方法を使用して検出することができる。図６Ｄは、異なるｐＭＨＣ多量体種（同じペプチドを含む）を、抗ストレプトアビジン抗体を含む異なる蛍光色素で別個に標識する可能性を図解する。図６Ａ～図６Ｃ中の３つの蛍光標識技法のうちのいずれも適用することができる。このようにして、異なるＴＣＲを、フローサイトメトリーを使用して、この特定のｐＭＨＣタンパク質複合体に対するそれらの結合力についてスクリーニングすることができる。この特定の状況では、４単量体ｐＭＨＣ多量体（四量体）は、共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを必要とせず、非共有結合しているオリゴを利用するｐＭＨＣ多量体種は、必要とされるものが全て、オリゴがビオチン結合部位（複数可）をブロックするためのものである場合、異なるオリゴバーコード配列を必要としない。図１４に概説されるように、他のビオチン化分子を理論的に使用して、ビオチン結合部位をブロックすることができる。
【図6D】図６は、バーコード化ｐＭＨＣ多量体検出の方法論を描写する４つのパネル（図６Ａ～図６Ｄ）を含む。図６Ａでは、フルオロフォア含有ストレプトアビジン（例えば、ＰＥ－ストレプトアビジン）を、オリゴへのさらなるコンジュゲーションの開始点として使用する。図６Ｂでは、コンジュゲートされたオリゴに対して相補的なフルオロフォアタグ付けオリゴを、ｐＭＨＣバーコード化オリゴにアニーリングする。このアニーリングオリゴの長さは変化し得る。図６Ｃでは、フルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体を使用して、バーコード化ｐＭＨＣ多量体を検出する。使用するフルオロフォアの化学種には、蛍光色素および量子ドットが含まれ得るが、これらに限定されない。オリゴが非共有結合的に連結されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体種もこれらの方法を使用して検出することができる。図６Ｄは、異なるｐＭＨＣ多量体種（同じペプチドを含む）を、抗ストレプトアビジン抗体を含む異なる蛍光色素で別個に標識する可能性を図解する。図６Ａ～図６Ｃ中の３つの蛍光標識技法のうちのいずれも適用することができる。このようにして、異なるＴＣＲを、フローサイトメトリーを使用して、この特定のｐＭＨＣタンパク質複合体に対するそれらの結合力についてスクリーニングすることができる。この特定の状況では、４単量体ｐＭＨＣ多量体（四量体）は、共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを必要とせず、非共有結合しているオリゴを利用するｐＭＨＣ多量体種は、必要とされるものが全て、オリゴがビオチン結合部位（複数可）をブロックするためのものである場合、異なるオリゴバーコード配列を必要としない。図１４に概説されるように、他のビオチン化分子を理論的に使用して、ビオチン結合部位をブロックすることができる。
【図7】免疫エピトープ結合力監視のためのバーコード化ｐＭＨＣ多量体を使用した応用例を図解する。腫瘍由来変異遺伝子コードタンパク質は、ＴＣＲ配列決定研究のためにペプチドタイリングされる。この描写では、その同じ変異タンパク質由来の２つの重複するペプチドアミノ酸配列（数字で描写している）は、示されるように、ビオチン化ＭＨＣ（同じＭＨＣ対立遺伝子）と個別に複合体形成され、その後、バーコード化ストレプトアビジンコンジュゲートと複合体形成される。ｐＭＨＣにかかわらず、全てのコンジュゲートタイプのオリゴ配列は、それらを区別する一意のバーコード配列を含むであろう（ストレプトアビジンに結合した色付けした線で表している）。バーコード化ｐＭＨＣ多量体を試料と一緒に混合する。ＴＣＲアルファおよびベータ配列を単一細胞ＲＮＡ配列決定により得て、同族ｐＭＨＣ多量体型と対にする。一例として、これらのコンジュゲートを使用した１つの研究は、緑色ペプチド－ＭＨＣ複合体または赤色ペプチド－ＭＨＣ複合体が相互に結合したＴＣＲ配列に対してより高い結合力を有するかを決定することができる。
【図8】バーコード化ｐＭＨＣ多量体免疫エピトープ結合力監視の別の応用例を図解する。この仮説上の実施例では、バイアルは、１：１、１：２、または１：３のストレプトアビジン：オリゴ比で構成されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体種の定義された混合物を含み、これは、それぞれ、１：３、１：２、および１：１のストレプトアビジン：ｐＭＨＣ単量体モル比として定義することもできる。コンジュゲート種のオリゴは、それらを区別する一意のバーコード配列を含む（異なる色で色づけした配列）。ＴＣＲ－ｐＭＨＣ結合力が腫瘍微小環境内で減弱するといわれている７ため、これらのバーコード化ｐＭＨＣ多量体コンジュゲート種が、治療の過程、例えば、免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）療法中にＴＣＲ結合力の増加または減少を実証することができるであろうと予測される。提供される実施例では、１つおよび２つのｐＭＨＣ単量体を含む多量体のより高いリードカウントによって証明されるように、同族ｐＭＨＣ複合体でのＩＣＢ処理後のＴ細胞の結合力は増加する。
【図9】ＮＧＳによる検出のための非共有結合バーコード化ｐＭＨＣ多量体の生成を描写する。ビオチン化オリゴ（ｐＭＨＣ多量体特異的バーコードを含む）をストレプトアビジン（またはストレプトアビジン－フルオロフォアコンジュゲート）と０．５～１．０：１のオリゴ：ストレプトアビジン比で混合する。１：１のストレプトアビジン：オリゴコンジュゲートをＨＰＬＣにより精製し、これにより、未反応ストレプトアビジン、未反応ビオチン化オリゴ、および異なるストレプトアビジン：オリゴ比のコンジュゲートを除去する。その後、コンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で多量体化する。最終生成物は、各ストレプトアビジンが１つのオリゴおよび３つのｐＭＨＣ単量体を有するバーコード化ｐＭＨＣ三量体である。１：２および１：３のストレプトアビジン：オリゴ比からなるコンジュゲートを作製する際にも同じ概念を使用する。
【図10】異なる単量体比のバーコード化ｐＭＨＣ多量体が、十分高い濃度で使用した場合、かつ中程度の結合力のＴＣＲを検出した場合、Ｔ細胞を同様に検出することができることを示す。ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、ビオチン化オリゴをストレプトアビジンに１：１または１：２のストレプトアビジン：オリゴ比で連結することによって製造した。ストレプトアビジンのみを対照として使用し、これは、図の下部の説明文に描写したように、１ストレプトアビジン（四量体）あたり４つのｐＭＨＣ単量体を有した。１：１のストレプトアビジン：オリゴコンジュゲートが３つの単量体を含んだ一方で、１：２のストレプトアビジン：オリゴコンジュゲートは２つの単量体を含んだ。この実験のために、全てのバーコード化コンジュゲートのオリゴを同じ６９ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成した。左の３つの列は、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドと複合体形成し、その後、１つのオリゴを有するストレプトアビジンまたは２つのオリゴを有するストレプトアビジンのいずれかのストレプトアビジンで多量体化したＨＬＡ－Ａ＊１１：０１ ＭＨＣ Ｉを使用した多量体染色を描写する。中央の３つの列は、ＥＢＶ ３９９－４０８ペプチドと複合体形成したＨＬＡ－Ａ＊１１：０１ ＭＨＣ Ｉを使用した多量体染色を描写する。右の３つの列は、ＥＢＶ ４１６－４２４ペプチドと複合体形成したＨＬＡ－Ａ＊１１：０１ ＭＨＣ Ｉを使用した多量体染色を描写する。各染色に使用したストレプトアビジンの量を行の一番左側に示している。多量体陽性染色パーセントを各ボックス内に示している。事前にペプチドで増殖させた細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、生／死色素、ならびに非フルオロフォアバーコード化ｐＭＨＣ多量体（または四量体）での染色のために利用した。二次染色を、ｐＭＨＣ多量体を検出することができるように、抗ストレプトアビジン－ＰＥで構成した。フローサイトメトリゲート説明文を図の上部に示す。
【図11】異なるオリゴおよび単量体比率のバーコード化ｐＭＨＣ多量体がｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力を区別することができることを図解する。ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、共有結合（チオエーテル結合）を介してオリゴをストレプトアビジンに共有結合的に連結するか、または様々なストレプトアビジン：オリゴ比でビオチン化オリゴをストレプトアビジンに連結するかのいずれかによって製造した。この実験のために、全てのコンジュゲートのオリゴを同じ４６ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成した。共有結合コンジュゲートは、４つ全てのビオチン結合部位が利用可能な１つのオリゴにコンジュゲートされた１つのストレプトアビジン分子を示す。１ｂコンジュゲートは、３つのビオチン結合部位が残っている１つのビオチン化オリゴに連結された１つのストレプトアビジンを示す。２ｂコンジュゲートは、２つのビオチン結合部位が残っている２つのビオチン化オリゴに連結された１つのストレプトアビジンを示す。３ｂコンジュゲートは、１つのビオチン結合部位が残っている３つのビオチン化オリゴに連結された１つのストレプトアビジンを示す。Ｈ－２Ｋｂビオチン化単量体（ＭＢＬＩ）を、高親和性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは低親和性ＳＩＩＶＦＥＫＬペプチドのいずれかと複合体形成した８。この場合の親和性は、ＭＨＣとのペプチド相互作用ではなく、ｐＭＨＣ複合体とトランスジェニックＯＴ－Ｉ ＴＣＲとの間の相互作用強度を指す。この場合の結合力は、複数のｐＭＨＣがＴＣＲ結合評価に関与する場合の組み合わせた親和性を指す。 ｐＭＨＣ分子をストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートと複合体形成して、バーコード化ｐＭＨＣ多量体を生成した。ＯＴ－Ｉ脾細胞を、様々なストレプトアビジン量（１番目の行０．２５ｕｇ、２番目の行０．１ｕｇ、３番目の行０．０２５ｕｇ）の様々なバーコード化Ｈ－２Ｋｂバーコード化ｐＭＨＣ多量体種で染色した。共有結合コンジュゲートを、１つのストレプトアビジンに対して４つの単量体のモル比を使用してｐＭＨＣ四量体化した。１ｂコンジュゲートを、１つのストレプトアビジンに対して３つの単量体のモル比を使用してｐＭＨＣ三量体化した。２ｂコンジュゲートを、１つのストレプトアビジンに対して２つの単量体のモル比を使用してｐＭＨＣ二量体化した。３ｂコンジュゲートを、１つのストレプトアビジンに対して１つの単量体のモル比を使用してｐＭＨＣコンジュゲートした。細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、生／死色素、およびそれぞれの非フルオロフォアバーコード化ｐＭＨＣ多量体種で同時に染色した。二次染色を、ｐＭＨＣ多量体を検出するために、抗ストレプトアビジン－ＰＥで構成した。フローサイトメトリゲート説明文を図の上部に示す。ｐＭＨＣ多量体陽性染色パーセントを、低強度、中程度の強度、または高強度のいずれかで各ボックス内に示している。
【図12】ｐＭＨＣ対ＴＣＲ結合力を区別するためにｐＭＨＣ占有率の異なるバーコード化ｐＭＨＣ多量体を使用した仮説上の実験結果を図解する。仮説上の実験環境下でＯＴ－Ｉ脾細胞（左側）と混合したＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＳＩＩＶＦＥＫＬペプチド由来バーコード化ｐＭＨＣ多量体を描写している。各多量体種の比率を実験目標に基づいて調整することができる。あるいは、細胞のアリコートを、ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＳＩＩＶＦＥＫＬバーコード化ｐＭＨＣ多量体のいずれかと別個にインキュベートすることができる。各多量体種は、それ自体を他の多量体種と区別するために一意のバーコード配列を有するであろう。ＦＡＣＳ選別を、液滴ベースの単一細胞配列決定または他の単一細胞配列決定プラットフォーム（中央）の前に使用することができる。予測バーコードリード頻度を右側に示している。この場合、高親和性／結合力ＳＩＩＮＦＥＫＬベースのｐＭＨＣバーコードリードが全ての単量体種で優位になる一方で、低親和性／結合力ＳＩＩＶＦＥＫＬベースのｐＭＨＣバーコードリードは、４つの単量体種でのみ現れる可能性が高い。この特定の状況では、ペプチド毎に４つの単量体ベースのｐＭＨＣ多量体種のみの使用（ＳＩＩＮＦＥＫＬ対ＳＩＩＶＦＥＫＬ）が、どのｐＭＨＣ複合体がこの特定のＴＣＲに対してより高い結合力を有するものであるかを決定するのに十分であろう。しかしながら、結合力分散がよりわずかであり、かつ異なるＴＣＲが関与する場合、ｐＭＨＣバーコード化種の使用により結合力の違いが明らかになる可能性がある。
【図13】バーコード化ｐＭＨＣ多量体を直接コンジュゲートされたフルオロフォアを用いて生成することができることを示す。ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、チオエーテル結合を介してオリゴストレプトアビジンを共有結合的に連結する（Ｃｏｖ）か、またはビオチン化オリゴをストレプトアビジンに１：１のストレプトアビジン：オリゴ比で連結する（１ｂ）かのいずれかによって製造した。加えて、ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを含むフルオロフォア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）を製造した。この場合、ＡＦ６４７を最初にストレプトアビジンに直接コンジュゲートし、その後、オリゴをストレプトアビジンに直接コンジュゲートした。この実験のために、コンジュゲートを同じ６９ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成した。共有結合コンジュゲートは、４つ全てのビオチン結合部位が利用可能な１つのオリゴにコンジュゲートされた１つのストレプトアビジン分子を示す。１ｂコンジュゲートは、３つのビオチン結合部位が残っている１つのビオチン化オリゴにコンジュゲートされた１つのストレプトアビジンを示す。コンジュゲートを、指示した比率で、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１単量体を含むビオチン化ＣＭＶ ｐｐ６５ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドまたは陰性対照ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１単量体（ＭＢＬＩ）のいずれかで多量体化した。ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）で事前に増殖させたヒトＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＰＢＭＣをコンジュゲートでの染色に使用した。細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、生／死色素、およびバーコード化ｐＭＨＣ多量体で染色した。中央列の試料を、対照としてＭＢＬＩから市販されているＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＰＥ四量体で染色した。フルオロフォアを欠くコンジュゲートを含む試料を、抗ＳＡ－ＰＥで二次的に染色した。フローサイトメトリゲート説明文を図の上部に示す。ｐＭＨＣ多量体陽性染色パーセントを各ボックス内に示している。
【図14】バーコード化ｐＭＨＣ多量体種を作製するための代替方法を示す。描写した全てのコンジュゲート種は、共有結合的連結（例えば、チオエーテル結合）を介して１ストレプトアビジンあたり１つのオリゴを有する。実際の実験環境下では、各コンジュゲート種（４、３、２、または１つの単量体（複数可））は、異なる色で描写した一意のバーコード配列を有するであろう。ビオチン化ペプチド、ビオチン化タンパク質、ビオチン化脂質、ビオチン化フルオロフォア、ビオチン化ポリマー、または切断可能なビオチン化オリゴ（全ての可能性を紫色で包括的に描写している）を、ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートと最適化比率でインキュベートし、ＨＰＬＣ精製して、所望のビオチン結合占有率にする。その後、これらの精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で多量体化し、これにより、１ストレプトアビジンあたり完全なビオチン結合部位占有率がもたらされる。下部の三角形は、各多量体化コンジュゲートの予測ＴＣＲ－ｐＭＨＣ結合力を描写し、ここで、４つの単量体＞３つの単量体＞２つの単量体＞１つの単量体である。
【図15】免疫エピトープ優性分析のためのバルクｐＭＨＣ多量体バーコード配列決定を描写する。この実施形態では、バーコード化ｐＭＨＣ多量体（異なる色で色付けした線を有する星）を、磁気ビーズ分離またはＦＡＣＳなどの濃縮を使用してまたは使用せずに、細胞から定量する。示される実施例では、５つの異なるｇｐ１００ペプチドが別個のバーコード化ｐＭＨＣ多量体に作製されており、ここで、各ｇｐ１００ペプチド／ＭＨＣ複合体が一意の多量体バーコード（異なる色で表している）と会合している。バーコード化ｐＭＨＣ多量体は、共有結合的に連結されたオリゴまたは非共有結合的に連結されたオリゴのいずれかを利用することができる。オリゴはライブラリ調製および配列決定のために処理されるであろう。小さいバーコード化オリゴライブラリ（例えば、８以下）を必要とする用途の場合、配列決定を使用することなく、ｐＭＨＣ多量体バーコード定量を確認することができる。ｐＭＨＣ多量体の領域に対して相補的な蛍光標識オリゴを事前にアニーリングした後に、細胞とインキュベートすることができる。各バーコード化ｐＭＨＣ多量体タイプを別個のフルオロフォア含有オリゴにアニーリングした後に、細胞とインキュベートし、その後、フローサイトメトリーを行う。例えば、ｇｐ１００＃１ペプチドおよび関連オリゴ配列を含むｐＭＨＣ多量体を相補的ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－オリゴに事前にアニーリングし、ｇｐ１００＃２ペプチドおよび関連オリゴ配列を含むｐＭＨＣ多量体を相補的ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２－オリゴに事前にアニールするといった具合である。
【図16】ＮＧＳベースの単一細胞配列決定プラットフォームを有するバーコード化ｐＭＨＣ多量体の使用を図解する。標的細胞に結合したバーコード化ｐＭＨＣ多量体（この実施例では共有結合オリゴ）を単一液滴中に捕捉する。大半の個々の液滴が、標的オリゴを含有する粒子に加えて、１つのＴ細胞／バーコード化ｐＭＨＣ複合体を含む。この実施例では、バーコード化オリゴはポリ－Ａを含有する。オリゴおよびＴ細胞ｍＲＮＡの両方をさらなるライブラリ調製のために逆転写する。任意に、オリゴとストレプトアビジンとの間の切断可能な結合（ＵＶまたはジスルフィド）を、オリゴのストレプトアビジンへのコンジュゲーション中に導入することができる。具体的には、ジスルフィド結合は、溶解緩衝液の還元環境のため、液滴中で解離する。
【図17A-B】図１７は、ＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体リードを特異的に配列決定するためのＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す８つのパネル（図１７Ａ～図１７Ｈ）を含む。バルク配列決定および液滴ベースのＮＧＳプラットフォームにおけるオリゴ設計の代替案は、ｐＭＨＣ複合体の同一性も維持しながら所望の内因性ｍＲＮＡ転写物を標的とするオリゴを有することである。対応するｐＭＨＣ同一性に加えて、ＴＣＲクローン性または単一細胞ＴＣＲレパートリーを特異的に調べるためのバーコード化ｐＭＨＣ多量体の様々な設計を描写している。これらの設計は、ｐＭＨＣバーコードに加えてＴＣＲ転写物を１リードで配列決定することを可能にする。ＰＣＲハンドルは、ＰＣＲプライマーが増幅のために結合する領域を伴う。バーコード（ＢＣ）は、ｐＭＨＣ複合体を特定するヌクレオチド配列を表す。ＴＣＲ相補的配列（ＴＣＲ相補的）は、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的である。ＴＣＲ相補的配列は、逆転写中のプライマーとしての役割を果たす。 図１７Ａでは、バーコード化オリゴがストレプトアビジンに共有結合的に連結されて、バーコード化四量体を作製している。このバーコード化四量体は、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に対して相補的な３’配列を含む。ＴＣＲβ定常遺伝子オリゴ配列は、５’末端（それぞれのＪ遺伝子に最も近い）にある２つの定常遺伝子間に有意な配列類似性があるため、ＴＣＲβ定常１遺伝子およびＴＣＲβ定常２遺伝子の両方に対して相補的である。その後、精製したバーコード化ストレプトアビジンコンジュゲートをｐＭＨＣで四量体化する。一意の分子識別子（ＵＭＩ）も下流ＰＣＲ重複除去のために四量体バーコードに隣接して配置することができ、それ故に、より正確なｐＭＨＣ結合定量を行うことができる。ＴＣＲβを標的とするオリゴのみを使用して、ＴＣＲクローン性を研究することができる。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを単独で使用することができる（描写せず）。 図１７Ｂでは、Ａ由来の精製ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とする共有結合オリゴを含むようにさらに修飾する。この構築物は、完全なＴＣＲα／β配列を得るための単一細胞配列決定プラットフォームに好適であろう（図１７Ｄ～Ｈについても同じ）。その後、この二重オリゴストレプトアビジンコンジュゲートを四量体化する。 図１７Ｃでは、ＴＣＲβを標的とするビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。 図１７Ｄでは、Ｃ由来の精製ＴＣＲβコンジュゲートを、ＴＣＲαを標的とするビオチン化オリゴを非共有結合することによってさらに修飾し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。 図１７Ｅでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含み、かつ両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。所望のコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。この代替オリゴ設計は、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むであろう。 図１７Ｆでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。正しいサイズのストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で２回三量体化し、それにより、１オリゴあたり合計６つのｐＭＨＣ単量体を得た。図１７Ｅと同様に、この設計を、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むようにさらに増強することができる。 図１７Ｇでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のオリゴをストレプトアビジンに共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で四量体化する。図１７Ｅおよび図１７Ｆと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。 図１７Ｈでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。図１７Ｅ～Ｇと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。
【図17C-D】図１７は、ＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体リードを特異的に配列決定するためのＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す８つのパネル（図１７Ａ～図１７Ｈ）を含む。バルク配列決定および液滴ベースのＮＧＳプラットフォームにおけるオリゴ設計の代替案は、ｐＭＨＣ複合体の同一性も維持しながら所望の内因性ｍＲＮＡ転写物を標的とするオリゴを有することである。対応するｐＭＨＣ同一性に加えて、ＴＣＲクローン性または単一細胞ＴＣＲレパートリーを特異的に調べるためのバーコード化ｐＭＨＣ多量体の様々な設計を描写している。これらの設計は、ｐＭＨＣバーコードに加えてＴＣＲ転写物を１リードで配列決定することを可能にする。ＰＣＲハンドルは、ＰＣＲプライマーが増幅のために結合する領域を伴う。バーコード（ＢＣ）は、ｐＭＨＣ複合体を特定するヌクレオチド配列を表す。ＴＣＲ相補的配列（ＴＣＲ相補的）は、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的である。ＴＣＲ相補的配列は、逆転写中のプライマーとしての役割を果たす。 図１７Ａでは、バーコード化オリゴがストレプトアビジンに共有結合的に連結されて、バーコード化四量体を作製している。このバーコード化四量体は、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に対して相補的な３’配列を含む。ＴＣＲβ定常遺伝子オリゴ配列は、５’末端（それぞれのＪ遺伝子に最も近い）にある２つの定常遺伝子間に有意な配列類似性があるため、ＴＣＲβ定常１遺伝子およびＴＣＲβ定常２遺伝子の両方に対して相補的である。その後、精製したバーコード化ストレプトアビジンコンジュゲートをｐＭＨＣで四量体化する。一意の分子識別子（ＵＭＩ）も下流ＰＣＲ重複除去のために四量体バーコードに隣接して配置することができ、それ故に、より正確なｐＭＨＣ結合定量を行うことができる。ＴＣＲβを標的とするオリゴのみを使用して、ＴＣＲクローン性を研究することができる。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを単独で使用することができる（描写せず）。 図１７Ｂでは、Ａ由来の精製ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とする共有結合オリゴを含むようにさらに修飾する。この構築物は、完全なＴＣＲα／β配列を得るための単一細胞配列決定プラットフォームに好適であろう（図１７Ｄ～Ｈについても同じ）。その後、この二重オリゴストレプトアビジンコンジュゲートを四量体化する。 図１７Ｃでは、ＴＣＲβを標的とするビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。 図１７Ｄでは、Ｃ由来の精製ＴＣＲβコンジュゲートを、ＴＣＲαを標的とするビオチン化オリゴを非共有結合することによってさらに修飾し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。 図１７Ｅでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含み、かつ両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。所望のコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。この代替オリゴ設計は、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むであろう。 図１７Ｆでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。正しいサイズのストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で２回三量体化し、それにより、１オリゴあたり合計６つのｐＭＨＣ単量体を得た。図１７Ｅと同様に、この設計を、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むようにさらに増強することができる。 図１７Ｇでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のオリゴをストレプトアビジンに共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で四量体化する。図１７Ｅおよび図１７Ｆと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。 図１７Ｈでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。図１７Ｅ～Ｇと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。
【図17E-F】図１７は、ＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体リードを特異的に配列決定するためのＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す８つのパネル（図１７Ａ～図１７Ｈ）を含む。バルク配列決定および液滴ベースのＮＧＳプラットフォームにおけるオリゴ設計の代替案は、ｐＭＨＣ複合体の同一性も維持しながら所望の内因性ｍＲＮＡ転写物を標的とするオリゴを有することである。対応するｐＭＨＣ同一性に加えて、ＴＣＲクローン性または単一細胞ＴＣＲレパートリーを特異的に調べるためのバーコード化ｐＭＨＣ多量体の様々な設計を描写している。これらの設計は、ｐＭＨＣバーコードに加えてＴＣＲ転写物を１リードで配列決定することを可能にする。ＰＣＲハンドルは、ＰＣＲプライマーが増幅のために結合する領域を伴う。バーコード（ＢＣ）は、ｐＭＨＣ複合体を特定するヌクレオチド配列を表す。ＴＣＲ相補的配列（ＴＣＲ相補的）は、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的である。ＴＣＲ相補的配列は、逆転写中のプライマーとしての役割を果たす。 図１７Ａでは、バーコード化オリゴがストレプトアビジンに共有結合的に連結されて、バーコード化四量体を作製している。このバーコード化四量体は、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に対して相補的な３’配列を含む。ＴＣＲβ定常遺伝子オリゴ配列は、５’末端（それぞれのＪ遺伝子に最も近い）にある２つの定常遺伝子間に有意な配列類似性があるため、ＴＣＲβ定常１遺伝子およびＴＣＲβ定常２遺伝子の両方に対して相補的である。その後、精製したバーコード化ストレプトアビジンコンジュゲートをｐＭＨＣで四量体化する。一意の分子識別子（ＵＭＩ）も下流ＰＣＲ重複除去のために四量体バーコードに隣接して配置することができ、それ故に、より正確なｐＭＨＣ結合定量を行うことができる。ＴＣＲβを標的とするオリゴのみを使用して、ＴＣＲクローン性を研究することができる。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを単独で使用することができる（描写せず）。 図１７Ｂでは、Ａ由来の精製ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とする共有結合オリゴを含むようにさらに修飾する。この構築物は、完全なＴＣＲα／β配列を得るための単一細胞配列決定プラットフォームに好適であろう（図１７Ｄ～Ｈについても同じ）。その後、この二重オリゴストレプトアビジンコンジュゲートを四量体化する。 図１７Ｃでは、ＴＣＲβを標的とするビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。 図１７Ｄでは、Ｃ由来の精製ＴＣＲβコンジュゲートを、ＴＣＲαを標的とするビオチン化オリゴを非共有結合することによってさらに修飾し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。 図１７Ｅでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含み、かつ両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。所望のコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。この代替オリゴ設計は、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むであろう。 図１７Ｆでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。正しいサイズのストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で２回三量体化し、それにより、１オリゴあたり合計６つのｐＭＨＣ単量体を得た。図１７Ｅと同様に、この設計を、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むようにさらに増強することができる。 図１７Ｇでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のオリゴをストレプトアビジンに共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で四量体化する。図１７Ｅおよび図１７Ｆと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。 図１７Ｈでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。図１７Ｅ～Ｇと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。
【図17G-H】図１７は、ＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体リードを特異的に配列決定するためのＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す８つのパネル（図１７Ａ～図１７Ｈ）を含む。バルク配列決定および液滴ベースのＮＧＳプラットフォームにおけるオリゴ設計の代替案は、ｐＭＨＣ複合体の同一性も維持しながら所望の内因性ｍＲＮＡ転写物を標的とするオリゴを有することである。対応するｐＭＨＣ同一性に加えて、ＴＣＲクローン性または単一細胞ＴＣＲレパートリーを特異的に調べるためのバーコード化ｐＭＨＣ多量体の様々な設計を描写している。これらの設計は、ｐＭＨＣバーコードに加えてＴＣＲ転写物を１リードで配列決定することを可能にする。ＰＣＲハンドルは、ＰＣＲプライマーが増幅のために結合する領域を伴う。バーコード（ＢＣ）は、ｐＭＨＣ複合体を特定するヌクレオチド配列を表す。ＴＣＲ相補的配列（ＴＣＲ相補的）は、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的である。ＴＣＲ相補的配列は、逆転写中のプライマーとしての役割を果たす。 図１７Ａでは、バーコード化オリゴがストレプトアビジンに共有結合的に連結されて、バーコード化四量体を作製している。このバーコード化四量体は、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に対して相補的な３’配列を含む。ＴＣＲβ定常遺伝子オリゴ配列は、５’末端（それぞれのＪ遺伝子に最も近い）にある２つの定常遺伝子間に有意な配列類似性があるため、ＴＣＲβ定常１遺伝子およびＴＣＲβ定常２遺伝子の両方に対して相補的である。その後、精製したバーコード化ストレプトアビジンコンジュゲートをｐＭＨＣで四量体化する。一意の分子識別子（ＵＭＩ）も下流ＰＣＲ重複除去のために四量体バーコードに隣接して配置することができ、それ故に、より正確なｐＭＨＣ結合定量を行うことができる。ＴＣＲβを標的とするオリゴのみを使用して、ＴＣＲクローン性を研究することができる。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを単独で使用することができる（描写せず）。 図１７Ｂでは、Ａ由来の精製ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とする共有結合オリゴを含むようにさらに修飾する。この構築物は、完全なＴＣＲα／β配列を得るための単一細胞配列決定プラットフォームに好適であろう（図１７Ｄ～Ｈについても同じ）。その後、この二重オリゴストレプトアビジンコンジュゲートを四量体化する。 図１７Ｃでは、ＴＣＲβを標的とするビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。 図１７Ｄでは、Ｃ由来の精製ＴＣＲβコンジュゲートを、ＴＣＲαを標的とするビオチン化オリゴを非共有結合することによってさらに修飾し、精製し、その後、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。 図１７Ｅでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含み、かつ両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。所望のコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で二量体化する。この代替オリゴ設計は、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むであろう。 図１７Ｆでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む両末端をビオチン化した単一のオリゴを使用する。正しいサイズのストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートを精製し、ビオチン化ｐＭＨＣ単量体で２回三量体化し、それにより、１オリゴあたり合計６つのｐＭＨＣ単量体を得た。図１７Ｅと同様に、この設計を、二分間に切断可能な（ＵＶまたはジスルフィド）結合を含むようにさらに増強することができる。 図１７Ｇでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のオリゴをストレプトアビジンに共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で四量体化する。図１７Ｅおよび図１７Ｆと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。 図１７Ｈでは、ＴＣＲβ標的配列およびＴＣＲα標的配列の両方を含む単一のビオチン化オリゴをストレプトアビジンに非共有結合する。精製したコンジュゲートをビオチン化ｐＭＨＣ単量体で三量体化する。図１７Ｅ～Ｇと同様に、このコンジュゲートは切断可能な結合を含み得る。
【図18A】図１８は、ＦＡＣＳ選別単一細胞ＴＣＲクローン性または対形成ＴＣＲα／β配列決定で使用したＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す。図解のために、いくつかの設計のみを示しているが、前の図からのいずれのバーコード化ｐＭＨＣ多量体設計も潜在的に使用することができる。 ＴＣＲβ定常遺伝子を標的とするオリゴを含むバーコード化四量体を左側に描写している。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを使用することができるか、またはそれらの両方を前述の図に記載の設計と一緒に使用することができる。これらの相補的ＴＣＲα／βオリゴ配列は、内因性ＴＣＲα／β ｍＲＮＡ転写物の逆転写プライマーとしての役割を果たす。細胞選別用途においてＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を用いるために、蛍光を図６に記載されるように組み込むことができる。Ｔ細胞を最初に単一細胞選別し、ウェル内で逆転写した後、クローン性試験のために単一管内でバルク処理する。Ｔ細胞番号１は、バーコード配列番号１を含むバーコード化ｐＭＨＣ多量体によって結合されており、Ｔ細胞番号２は、バーコード配列番号２を含むバーコード化ｐＭＨＣ多量体によって結合されている。右側に、バーコード化ｐＭＨＣ多量体は、前述の図に記載されるように、ＴＣＲα標的配列およびβ標的配列の両方を有する。Ｔ細胞を単一細胞選別し、個々のプレートウェル、この場合、９６ウェルプレート内で処理する。クローン性研究により、研究者が所与のｐＭＨＣ複合体のＴＣＲ使用の幅を理解することが可能になる。ＴＣＲαバーコード化オリゴおよびＴＣＲβバーコード化オリゴの両方を使用する場合のバルク配列決定の欠点は、ＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができないことである。この難題を克服するために、Ｔ細胞を右側に示すように処理することができ、これにより、ＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列の対形成が可能になる。 ライブラリ調製戦略を以下に記載し、前述の図から発展させる： ｉ）単一選別Ｔ細胞を逆転写し、その後、バルク処理する。ＲＮａｓｅ処理後に、架橋アダプターをライゲートする。架橋アダプターは、全ての逆転写遺伝子に共通である。その後のＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｉ）単一選別細胞をＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって逆転写する。ＳＭＡＲＴｅｒ第１鎖合成およびＲＴ鋳型スイッチにより、５’－ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが得られる。バルクにおけるその後のＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｉｉ）単一細胞選別Ｔ細胞を溶解し、ウェル内ＲＴ、ウェル内ＲＮａｓｅ処理、その後、ウェル内架橋アダプターライゲーションに供する。架橋アダプター上流配列は全てのウェルに共通であるが、全てのウェルはＴＣＲ配列に最も近い部位で一意の細胞バーコードを有する架橋アダプターを受け取る。この方法論の主な利点は、同じ細胞由来のＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができ、これにより、個々のＴ細胞の完全なＴＣＲ配列を確認することができるようになることである。ライゲートした転写物を、共通プライマーを使用してその後のＰＣＲ増幅のためにプールして、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｖ）単一選別Ｔ細胞を溶解し、ウェル内ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供する。ＳＭＡＲＴｅｒ第１鎖合成およびＲＴ鋳型スイッチにより、５’－ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが得られる。各ウェルを個別にバーコード化するために、ウェル内ＰＣＲ増幅を、ＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡ結合配列の上流に一意の細胞バーコード配列を有するＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡオリゴに対して相補的なフォワードプライマーを使用して実行する。これにより、転写物を個々のウェルから区別する。フォワードプライマーの５’末端で、共通のプライミング部位（すなわちｉ５配列）が試料プールを可能にする。共通のプライマーを使用してプールしたＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。ｉｉｉと同様に、この方法論の主な利点は、同じ細胞由来のＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができることである。
【図18B】図１８は、ＦＡＣＳ選別単一細胞ＴＣＲクローン性または対形成ＴＣＲα／β配列決定で使用したＴＣＲ遺伝子座を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を示す。図解のために、いくつかの設計のみを示しているが、前の図からのいずれのバーコード化ｐＭＨＣ多量体設計も潜在的に使用することができる。 ＴＣＲβ定常遺伝子を標的とするオリゴを含むバーコード化四量体を左側に描写している。あるいは、ＴＣＲα定常遺伝子を標的とするオリゴを使用することができるか、またはそれらの両方を前述の図に記載の設計と一緒に使用することができる。これらの相補的ＴＣＲα／βオリゴ配列は、内因性ＴＣＲα／β ｍＲＮＡ転写物の逆転写プライマーとしての役割を果たす。細胞選別用途においてＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を用いるために、蛍光を図６に記載されるように組み込むことができる。Ｔ細胞を最初に単一細胞選別し、ウェル内で逆転写した後、クローン性試験のために単一管内でバルク処理する。Ｔ細胞番号１は、バーコード配列番号１を含むバーコード化ｐＭＨＣ多量体によって結合されており、Ｔ細胞番号２は、バーコード配列番号２を含むバーコード化ｐＭＨＣ多量体によって結合されている。右側に、バーコード化ｐＭＨＣ多量体は、前述の図に記載されるように、ＴＣＲα標的配列およびβ標的配列の両方を有する。Ｔ細胞を単一細胞選別し、個々のプレートウェル、この場合、９６ウェルプレート内で処理する。クローン性研究により、研究者が所与のｐＭＨＣ複合体のＴＣＲ使用の幅を理解することが可能になる。ＴＣＲαバーコード化オリゴおよびＴＣＲβバーコード化オリゴの両方を使用する場合のバルク配列決定の欠点は、ＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができないことである。この難題を克服するために、Ｔ細胞を右側に示すように処理することができ、これにより、ＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列の対形成が可能になる。 ライブラリ調製戦略を以下に記載し、前述の図から発展させる： ｉ）単一選別Ｔ細胞を逆転写し、その後、バルク処理する。ＲＮａｓｅ処理後に、架橋アダプターをライゲートする。架橋アダプターは、全ての逆転写遺伝子に共通である。その後のＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｉ）単一選別細胞をＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって逆転写する。ＳＭＡＲＴｅｒ第１鎖合成およびＲＴ鋳型スイッチにより、５’－ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが得られる。バルクにおけるその後のＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｉｉ）単一細胞選別Ｔ細胞を溶解し、ウェル内ＲＴ、ウェル内ＲＮａｓｅ処理、その後、ウェル内架橋アダプターライゲーションに供する。架橋アダプター上流配列は全てのウェルに共通であるが、全てのウェルはＴＣＲ配列に最も近い部位で一意の細胞バーコードを有する架橋アダプターを受け取る。この方法論の主な利点は、同じ細胞由来のＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができ、これにより、個々のＴ細胞の完全なＴＣＲ配列を確認することができるようになることである。ライゲートした転写物を、共通プライマーを使用してその後のＰＣＲ増幅のためにプールして、最終的なライブラリ調製がもたらされる。 ｉｖ）単一選別Ｔ細胞を溶解し、ウェル内ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供する。ＳＭＡＲＴｅｒ第１鎖合成およびＲＴ鋳型スイッチにより、５’－ＲＡＣＥ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡが得られる。各ウェルを個別にバーコード化するために、ウェル内ＰＣＲ増幅を、ＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡ結合配列の上流に一意の細胞バーコード配列を有するＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡオリゴに対して相補的なフォワードプライマーを使用して実行する。これにより、転写物を個々のウェルから区別する。フォワードプライマーの５’末端で、共通のプライミング部位（すなわちｉ５配列）が試料プールを可能にする。共通のプライマーを使用してプールしたＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。ｉｉｉと同様に、この方法論の主な利点は、同じ細胞由来のＴＣＲα配列とＴＣＲβ配列を対にすることができることである。
【図19】架橋アダプターを使用したクローン性研究のためのＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体ライブラリ調製を図解する。図１８（ｉ）に記載されるように、同族Ｔ細胞によって結合されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体を最初に単一細胞選別し、逆転写し、その後、バルク処理する。ディスプレイのために、ＴＣＲβ由来の転写物およびＴＣＲα由来の転写物の両方を示しているが、クローン性研究に使用する必要があるのは１つのみである。図６に記載のフルオロフォア追跡戦略の使用がＦＡＣＳ選別に必要である。ウェル内ＲＴ後に、ＲＮａｓｅ処理、その後、架橋アダプターのライゲーションが続く。バルク配列決定のための架橋アダプター（ｉ５配列）は全ての細胞において同一であり、新たに逆転写されたＴＣＲ転写物の３’末端へのライゲーションに必要な５’ホスフェートを架橋アダプターの下部オリゴ上に含む。架橋アダプターは、非ライゲーション鎖の３’末端に６つのランダムヌクレオチドも含み、アダプター結合の安定性を増強する９。ライゲーション後、共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。
【図20】ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用したバルク配列決定のためのＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体ライブラリ調製を図解する。図１８（ｉｉ）に記載されるように、同族Ｔ細胞によって結合されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体を最初に単一細胞選別し、逆転写し、その後、バルク処理する。ディスプレイのために、ＴＣＲβ由来の転写物およびＴＣＲα由来の転写物の両方を示しているが、クローン性研究に使用する必要があるのは１つのみである。図６に記載のフルオロフォア追跡戦略の使用がＦＡＣＳ選別に必要である。ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ酵素でのウェル内ＲＴは、鋳型スイッチによりＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡオリゴ配列を新たに逆転写された転写物の３’末端に付加する。鋳型スイッチ後、共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、最終的なライブラリ調製がもたらされる。
【図21】架橋アダプターを使用した単一細胞対形成ＴＣＲα／β配列決定のためのＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体ライブラリ調製を図解する。図１８（ｉｉｉ）に記載されるように、同族Ｔ細胞によって結合されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体を個々のウェルに単一細胞選別する。図６に記載のフルオロフォア追跡戦略の使用がＦＡＣＳに必要である。選別した細胞を溶解し、ウェル内ＲＴ、ウェル内ＲＮａｓｅ処理、その後、ウェル内架橋アダプターライゲーションに供する（単純化のために、ライゲーションステップでは単一のＴＣＲ転写物のみを示している）。各ウェルの架橋アダプター（例えば、ｉ５配列）は、ＴＣＲα配列／β配列の対形成を可能にする一意の細胞バーコードを含む。この図解では、００００１は、この特定のウェルの細胞バーコードを表す。架橋アダプターのライゲーション鎖上の５’ホスフェートは、新たに逆転写されたＴＣＲ転写物の３’末端へのライゲーションを可能にする。架橋アダプターは、非ライゲーション鎖の３’末端に６つのランダムヌクレオチドも含み、アダプター結合の安定性を増強する。ライゲーション後、試料を、共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅のためにプールして、最終的なライブラリ調製がもたらされる。
【図22】ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ酵素を使用した単一細胞配列決定のためのＴＣＲを標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体ライブラリ調製を図解する。図１８（ｉｖ）に記載されるように、同族Ｔ細胞によって結合されたバーコード化ｐＭＨＣ多量体を個々のウェルに単一細胞選別する。図６に記載のフルオロフォア追跡戦略の使用がＦＡＣＳに必要である。選別した単一細胞を溶解し、鋳型スイッチによりＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡオリゴ配列を新たに逆転写された転写物の３’末端に付加するＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でのウェル内ＲＴに供する。その後、ウェル内ＰＣＲ増幅（単純化のために、単一のＴＣＲ転写物のみを示している）を、ＳＭＡＲＴｅｒＩＩＡ結合配列、ならびに（全てのウェルに一意の）細胞バーコード配列および５’末端に共通のｉ５配列の両方を含むフォワードプライマーを使用して行う。この図解では、細胞バーコードを００００１で表す。全てのウェルに一意の細胞バーコードを含むフォワードプライマーの使用により、ＴＣＲα配列／β配列の対形成が可能になる。試料をさらなるＰＣＲ増幅のためにプールして、最終的なライブラリ調製がもたらされる。
【図23】液滴ベースの単一細胞ＴＣＲα／β単一細胞配列決定のためのスイッチオリゴを含むバーコード化ｐＭＨＣ多量体を図解する２つのパネル（図２３Ａ～図２３Ｂ）を含む。図２３Ａは、スイッチ配列を含む共有結合的に連結されたオリゴを有するｐＭＨＣ多量体である。図２３Ｂは、スイッチ配列を含む非共有結合的に連結されたオリゴを有するｐＭＨＣ多量体である。このタイプのｐＭＨＣ多量体の追加の設計には、図５および図１０に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。
【図24】ＰＣＲハンドル、細胞バーコード（ＢＣ）、およびＴＣＲ定常遺伝子相補的配列で構成されたオリゴにコンジュゲートした液滴ベースの配列決定ビーズ（ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、または溶解性ビーズを含むが、これらに限定されない）の使用を描写する。単純化のために、１つの液滴のみを図解する。各ビーズは、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβを標的とするリゴ配列を含むことができる。ＴＣＲαタイプのオリゴおよびＴＣＲβタイプのオリゴの両方を使用する場合、これらはいずれも所与のビーズについて同じ細胞バーコードを含む。ＴＣＲαオリゴおよび／またはＴＣＲβオリゴは、光切断可能な結合またはジスルフィド結合を含むが、これらに限定されない、いくつかの手段のうちの１つによって解離可能であり得る。加えて、各オリゴは、ＰＣＲ重複除去のためにＵＭＩを含むことができる。
【0087】
単一ビーズおよび単一細胞を有する単一液滴（この場合、バーコード化四量体陽性Ｔ細胞を表示する）は、ゲルビーズオリゴ、Ｔ細胞ｍＲＮＡ、ならびに四量体陽性Ｔ細胞結合バーコード化オリゴの両方を放出する溶解試薬を含有する。ｐＭＨＣ四量体結合オリゴを切断可能な結合によって解離するように作製することもできる。逆転写により、ビーズオリゴの３’末端に三重デオキシシチジンストレッチとともにＴＣＲ ｍＲＮＡ転写物由来のＴＣＲ Ｖ（Ｄ）Ｊ配列が付加される（単純化のために、単一の逆転写遺伝子のみを液滴の下に描写している）。このデオキシシチジンストレッチは、鋳型スイッチのためにスイッチオリゴに結合する。その後の第２鎖合成およびＰＣＲ増幅により、ライブラリ調製が完了する。
【発明を実施するための形態】
【0088】
本開示は、単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むが、これに限定されない、フローサイトメトリー用途、およびＮＧＳベースの用途、ならびに多重分析物分析および単一細胞分析を含む他のプラットフォームと適合性のあるバーコード化ｐＭＨＣ多量体の生成について記載する。本開示は、共有結合的オリゴ結合および非共有結合的オリゴ結合の両方によるバーコード化ｐＭＨＣ多量体の生成、ならびにｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力評価におけるこれらの多量体の組み合わせについても記載する。本開示は、ＴＣＲ配列およびｐＭＨＣ多量体バーコードの同時処理による配列決定ライブラリ調製を単純化するＴＣＲα／β定常遺伝子を標的とする新たなｐＭＨＣ多量体バーコード化アプローチについても記載する。様々な塩基修飾の使用を含むバーコード化オリゴ長および／または配列は不変ではなく、変化し得る。
【0089】
本開示は、ｐＭＨＣ多量体、いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ四量体のための少なくとも２つのオリゴバーコード化戦略について記載する。第１は、特異的ｐＭＨＣを、ＴＣＲ配列を含む対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結するバーコード化ポリ－Ａテールオリゴを使用する。第２のバーコード化アプローチは、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子座を標的とするストレプトアビジンにコンジュゲートされたオリゴを使用し、それにより、両方のオリゴが四量体バーコードを有する。重要なことに、ＴＣＲαオリゴおよびＴＣＲβオリゴの両方が同時に使用される場合、それらは所与の四量体について同じ四量体バーコード化情報を含むであろう。このアプローチにより、全ての逆転写ＴＣＲ配列が四量体バーコード配列を含むようになり、別個のライブラリ調製の必要性を打ち消す。
【0090】
ＭＨＣタンパク質
本開示の組成物および方法で提供され、かつ使用されるＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣタンパク質が元来含んでいるペプチドを別のペプチドと交換することが望ましい、当該技術分野で既知の任意の好適なＭＨＣ分子であり得る。一般に、それらは、（α－β－Ｐ）ｎを有し、式中、ｎは、少なくとも２、例えば、２～１０、例えば、４である。αは、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のα鎖である。βは、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のβ鎖としてまたはＭＨＣクラスＩタンパク質のβ２マイクログロブリンとして本明細書で定義されるβ鎖である。Ｐは、ペプチド抗原である。
本開示の組成物および方法で提供され、かつ使用されるＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣタンパク質が元来含んでいるペプチドを別のペプチドと交換することが望ましい、当該技術分野で既知の任意の好適なＭＨＣ分子であり得る。一般に、それらは、（α－β－Ｐ）ｎを有し、式中、ｎは、少なくとも２、例えば、２～１０、例えば、４である。αは、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のα鎖である。βは、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質のβ鎖としてまたはＭＨＣクラスＩタンパク質のβ２マイクログロブリンとして本明細書で定義されるβ鎖である。Ｐは、ペプチド抗原である。
【0091】
ＭＨＣタンパク質は、任意の哺乳動物または鳥類種、例えば、霊長類種、特に、ヒト、げっ歯類（マウス、ラット、およびハムスターを含む）、ウサギ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどに由来し得る。例えば、ＭＨＣタンパク質は、ヒトＨＬＡタンパク質またはマウスＨ－２タンパク質に由来し得る。ＨＬＡタンパク質には、クラスＩＩサブユニットＨＬＡ－ＤＰα、ＨＬＡ－ＤＰβ、ＨＬＡ－ＤＱα、ＨＬＡ－ＤＱβ、ＨＬＡ－ＤＲα、およびＨＬＡ－ＤＲβ、ならびにクラスＩタンパク質ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびβ２－マイクログロブリンが含まれる。Ｈ－２タンパク質には、クラスＩサブユニットＨ－２Ｋ、Ｈ－２Ｄ、Ｈ－２Ｌ、ならびにクラスＩＩサブユニットＩ－Ａα、Ｉ－Ａβ、Ｉ－Ｅα、およびＩ－Ｅβ、ならびにβ２－マイクログロブリンが含まれる。いくつかの代表的なＭＨＣタンパク質の配列は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ７２４－８１５で見つけることができる。本発明での使用に好適なＭＨＣタンパク質サブユニットは、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失によって当該技術分野で知られているように調製される、通常は膜結合型のタンパク質の可溶性形態である。
【0092】
クラスＩタンパク質の場合、可溶性形態には、α１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインが含まれる。可溶性クラスＩＩサブユニットには、αサブユニットの場合にα１ドメインおよびα２ドメイン、ならびにβサブユニットの場合にβ１ドメインおよびβ２ドメインが含まれる。
【0093】
αサブユニットとβサブユニットが別個に産生され、インビトロで会合させて、安定したヘテロ二本鎖複合体を形成することができ、またはこれらの両方のサブユニットを単一細胞で発現させてもよい。ＭＨＣサブユニットを産生するための方法は、当該技術分野で既知である。
【0094】
ＭＨＣ－ペプチド複合体を調製するために、サブユニットを抗原ペプチドと組み合わせ、インビトロで折り畳んで、鎖内ジスルフィド結合ドメインを有する安定したヘテロ二量体複合体を形成することができる。ペプチドは、最初の折り畳み反応に含まれてもよく、または後のステップで空のヘテロ二量体に添加されてもよい。本発明の方法では、これは、退出ペプチドとなる。サブユニットとペプチドとの折り畳みおよび会合を可能にする条件は、当該技術分野で既知である。一例として、ほぼ等モル量の可溶性化αサブユニットとβサブユニットが尿素溶液中で混合され得る。再折り畳みが、尿素を含まない緩衝溶液中に希釈または透析することによって開始される。ペプチドが約ｐＨ５～５．５で約１～３日間にわたって空のクラスＩＩヘテロ二量体に装填され、その後、中和、濃縮、および緩衝液交換が行われ得る。しかしながら、特定の折り畳み条件は、本発明の実施に重要ではない。
【0095】
単量体複合体（α－β－Ｐ）（本明細書では単量体）は、多量体化され得る。結果として生じる多量体は、長期間にわたって安定しているであろう。好ましくは、多量体は、当該技術分野で知られているように（例えば、米国特許第５，６３５，３６３号に記載されているように）、αまたはβサブユニット上の特定の結合部位を介して単量体を多価実体に結合することによって形成され得る。ＭＨＣタンパク質は、それらの単量体形態または多量体形態のいずれかで、ビーズまたは任意の他の支持体にコンジュゲートされる場合もある。
【0096】
多くの場合、多量体複合体は、免疫染色または当該技術分野で既知の他の方法で使用される場合、直接検出可能になるように標識されるか、または当該技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載されるように、複合体に特異的に結合する二次標識免疫薬剤と併用される。例えば、標識は、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＵＶ（商標）３９５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４８０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１（ＢＶ４２１）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（商標）５１５、ＡＰＣ－Ｒ７００、またはＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０であり得る。いくつかの実施形態では、多量体複合体は、別の部分に特異的に結合することができる部分によって標識される。例えば、標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、またはリガンドであり得る。目的とする他の標識には、染料、酵素、化学発光剤、粒子、放射性同位体、または他の直接もしくは間接的に検出可能な薬剤が含まれ得る。
【0097】
本明細書に開示される組成物は、任意の好適なＭＨＣタンパク質を含み得る。例示的なＭＨＣタンパク質および本明細書に開示されるペプチドには、Ｈ－２ Ｋｂ単量体、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１単量体、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２単量体、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１四量体、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２四量体、およびＨ－２ Ｋｂ四量体が含まれる。しかしながら、例えば、ＭＨＣ対立遺伝子に対するペプチドの親和性を予測するための既知の技法に従って適切な退出ペプチドを選択する際に、任意のＭＨＣ対立遺伝子が本明細書の組成物および方法に使用され得る。
【0098】
定義：
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【0099】
「アミノ酸」という用語は、天然であるか合成であるかにかかわらず、アミノ官能基および酸官能基の両方を含み、かつ天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれることができる全ての分子を包含するよう意図されている。例示的なアミノ酸には、天然に存在するアミノ酸、その類似体、誘導体、および同族体、バリアント側鎖を有するアミノ酸類似体、ならびに前述のうちのいずれかのうちのいずれかの全ての立体異性体が含まれる。
【0100】
「に由来する」という語句は、非再配置可変領域および／または非再配列可変領域遺伝子セグメント「に由来する」再配置可変領域遺伝子に関して使用される場合、再配置可変領域遺伝子の配列を、可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配置された一組の非再配置可変領域遺伝子セグメントまで遡る能力を指す（該当する場合、スプライスの相違および体細胞変異を説明する）。例えば、体細胞変異を受けた再配置可変領域遺伝子は、依然として非再配置可変領域遺伝子セグメントに由来する。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座が普遍的軽鎖または重鎖遺伝子座で置き換えられる場合、「に由来する」という用語は、配列が体細胞変異を受けた可能性があるにもかかわらず、配列の起源を前述の再配置遺伝子座まで遡る能力を示す。
【0101】
「ＰＣＲハンドル」とは、本明細書に記載のバーコード領域のＰＣＲ増幅を可能にする、全てのプライマーと同一の定常配列を指す。
【0102】
「バーコード化領域」という用語は、一意のヌクレオチド配列を含む領域を指す。このヌクレオチド配列の最小長は、一意に標識されなければならない総ＭＨＣ多量体総数に依存する。例えば、４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列は、最大２５６個のＭＨＣ多量体を一意に標識することができる２５６個の異なる配列を有し得る。６ヌクレオチド長のヌクレオチド配列は、最大４０９６個のＭＨＣ多量体を一意に標識することができる４０９６個の異なる配列を有し得る。より長い四量体配列を使用して、スループットを増加させることができる。
【0103】
「相補的」という用語は、２つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基が、第１の領域に対して逆平行の第２の核酸領域の残基（残基がチミンまたはウラシルである場合）と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基が、第１の鎖に対して逆平行の第２の核酸鎖の残基（残基がグアニンである場合）と塩基対合することができることが知られている。２つの領域が逆平行様式で配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域に対して相補的である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１の部分と第２の部分が逆平行様式で配置されたときに、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【0104】
実施形態１．多量体主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）であって、
骨格分子によって連結された１つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格分子に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、標的オリゴに対する相補性を示す配列を有する核酸の第２のストレッチと、を含む、多量体主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）。
骨格分子によって連結された１つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格分子に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、標的オリゴに対する相補性を示す配列を有する核酸の第２のストレッチと、を含む、多量体主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）。
【0105】
実施形態２．前記少なくとも１つの核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル領域、中央バーコード領域、および３’ポリ－Ａテール領域を含み、任意に、前記少なくとも１つの核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル領域、中央バーコード領域、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、および３’ポリ－Ａテール領域を含む、実施形態１に記載の多量体ＭＨＣ。
【0106】
実施形態３．前記ポリ－Ａテールが少なくとも１０個の連続するアデニンを含む、実施形態１または２に記載の多量体ＭＨＣ。
【0107】
実施形態４．前記標的オリゴの一致ヌクレオチドがＣ、Ｇ、またはＡである場合、前記ポリ－Ａテールの５’末端の前記ヌクレオチドが、Ｇ、Ｃ、またはＴである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0108】
実施形態５．前記少なくとも１つの核酸分子が少なくとも１０ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも１つの核酸分子が１０～２００ヌクレオチド長である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0109】
実施形態６．実施形態１～５のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【0110】
実施形態７．特異的ＭＨＣ分子を対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結する方法であって、
ａ）実施形態１～５のいずれか１つに記載の複数のＭＨＣ多量体分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、および３’ポリ－（ｄＴ）を含む相補的標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くの粒子を含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）各液滴中にＴ細胞ｃＤＮＡライブラリおよびＭＨＣバーコードライブラリを生成することと、
ｄ）前記Ｔ細胞ｍＲＮＡライブラリおよび前記ＭＣＨバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を前記対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。
ａ）実施形態１～５のいずれか１つに記載の複数のＭＨＣ多量体分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、および３’ポリ－（ｄＴ）を含む相補的標的オリゴに連結された粒子とを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くの粒子を含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）各液滴中にＴ細胞ｃＤＮＡライブラリおよびＭＨＣバーコードライブラリを生成することと、
ｄ）前記Ｔ細胞ｍＲＮＡライブラリおよび前記ＭＣＨバーコードライブラリの両方を配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を前記対応するＴ細胞トランスクリプトームに連結することと、を含む、方法。
【0111】
実施形態８．多量体ＭＨＣであって、
骨格分子によって連結された１つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体ＭＨＣ。
骨格分子によって連結された１つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、ＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、多量体ＭＨＣ。
【0112】
実施形態９．前記骨格に連結された第１のタイプの核酸分子を含み、前記第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含む、実施形態８に記載の多量体ＭＨＣ。
【0113】
実施形態１０．前記骨格に連結された第１および第２のタイプの核酸分子を含み、
前記第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第２のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記２つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、各タイプの前記核酸分子がＵＭＩをさらに含み、前記第１のタイプの核酸分子のＵＭＩ配列が前記第２のタイプの核酸分子のＵＭＩ配列とは異なる、実施形態８に記載の多量体ＭＨＣ。
前記第１のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記第２のタイプの核酸分子が、中央バーコード領域と、ＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的なヌクレオチド配列と、を含み、
前記２つのタイプの前記核酸分子の前記バーコード領域が同じ配列を有し、
任意に、各タイプの前記核酸分子がＵＭＩをさらに含み、前記第１のタイプの核酸分子のＵＭＩ配列が前記第２のタイプの核酸分子のＵＭＩ配列とは異なる、実施形態８に記載の多量体ＭＨＣ。
【0114】
実施形態１１．前記核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含む、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0115】
実施形態１２．前記核酸分子が、前記ＴＣＲ定常遺伝子の５’末端に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0116】
実施形態１３．前記ＴＣＲ定常遺伝子が、ＴＣＲα定常遺伝子、ＴＣＲβ定常１遺伝子、またはＴＣＲβ定常２遺伝子である、実施形態８～１２のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0117】
実施形態１４．前記核酸分子の５’末端および／または３’末端が前記骨格分子に連結されている、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0118】
実施形態１５．前記核酸分子が、前記バーコード領域に隣接した一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む、実施形態８～１４のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0119】
実施形態１６．前記少なくとも１つの核酸分子が少なくとも１０ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも１つの核酸分子が１０～２００ヌクレオチド長である、実施形態８～１５のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0120】
実施形態１７．実施形態８～１６のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【0121】
実施形態１８．特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結する方法であって、
ａ）実施形態８～１６のいずれか１つに記載の１つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
ｂ）前記多量体ＭＨＣ分子をＴ細胞と接触させることと、
ｃ）前記多量体ＭＨＣ分子に結合したＴ細胞を前記多量体ＭＨＣ分子に結合しないＴ細胞から分離することと、
ｄ）前記分離されたＴ細胞を溶解することと、
ｅ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｆ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的ＭＨＣ分子を前記対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
ａ）実施形態８～１６のいずれか１つに記載の１つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
ｂ）前記多量体ＭＨＣ分子をＴ細胞と接触させることと、
ｃ）前記多量体ＭＨＣ分子に結合したＴ細胞を前記多量体ＭＨＣ分子に結合しないＴ細胞から分離することと、
ｄ）前記分離されたＴ細胞を溶解することと、
ｅ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｆ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、前記特異的ＭＨＣ分子を前記対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
【0122】
実施形態１９．前記ステップｃ）がＦＡＣＳ選別または磁気ビーズベースの分離によって達成される、実施形態１８に記載の方法。
【0123】
実施形態２０．前記多量体ＭＨＣ分子が直接または間接的に蛍光標識される、実施形態１８または１９に記載の方法。
【0124】
実施形態２１．バーコード化ＭＨＣ分子に結合した前記Ｔ細胞が単一の収集管内でバルク選別される、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載の方法。
【0125】
実施形態２２．バーコード化ＭＨＣ分子に結合した同族Ｔ細胞が単一細胞として個々のプレートウェルに選別される、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0126】
実施形態２３．多量体ＭＨＣであって、
骨格分子によって連結された２つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体ＭＨＣ。
骨格分子によって連結された２つ以上のＭＨＣ分子と、
前記骨格に連結された少なくとも１つの核酸分子と、を含み、前記核酸分子が、核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）と、鋳型スイッチオリゴ配列と、を含む、多量体ＭＨＣ。
【0127】
実施形態２４．前記核酸分子が、５’ＰＣＲハンドル、中央バーコード領域、ＵＭＩ、および３’鋳型スイッチオリゴ配列を含む、実施形態２３に記載の多量体ＭＨＣ。
【0128】
実施形態２５．前記鋳型スイッチオリゴ配列が３つのリボグアノシンの３’ストレッチを含む、実施形態２３または２４に記載の多量体ＭＨＣ。
【0129】
実施形態２６．前記少なくとも１つの核酸分子が少なくとも１０ヌクレオチド長であり、任意に、前記少なくとも１つの核酸分子が１０～２００ヌクレオチド長である、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣ。
【0130】
実施形態２７．実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣの複数のサブセットを含む組成物であって、多量体ＭＨＣの各サブセットが異なるペプチドに結合し、対応するバーコード領域配列を有する、組成物。
【0131】
実施形態２８．特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結する方法であって、
ａ）実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の複数の多量体ＭＨＣ分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くのビーズを含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｄ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
ａ）実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の複数の多量体ＭＨＣ分子と、Ｔ細胞と、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含むオリゴにコンジュゲートされたビーズとを含む試験試料を形成することと、
ｂ）各液滴が１つより多くのビーズを含まず、かつ１つ以上の多量体ＭＨＣ分子に結合した１つのＴ細胞を含むように、液滴を前記試験試料から形成することと、
ｃ）ＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡ分子が、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子配列、ならびに前記ＭＨＣバーコードを含む、生成することと、
ｄ）前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、それにより、特異的ＭＨＣ分子を対応するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列に連結することと、を含む、方法。
【0132】
実施形態２９．前記ビーズが、ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、および溶解性ビーズから選択される、実施形態２８に記載の方法。
【0133】
実施形態３０．前記ビーズが２つのオリゴにコンジュゲートされており、第１のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲα定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、第２のオリゴが、５’ＰＣＲハンドル、中央細胞バーコード、ＵＭＩ、およびＴＣＲβ定常遺伝子に対して相補的な３’ヌクレオチド配列を含み、前記２つのオリゴの前記中央細胞バーコードが同じ配列を有する、実施形態２８または２９に記載の方法。
【0134】
実施形態３１．前記ＤＮＡライブラリ生成ステップｃ）が、ＭＭＬＶ逆転写酵素を使用したＴＣＲ ｍＲＮＡの逆転写を含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
実施形態３２．前記ＰＣＲハンドルが前記バーコード配列のライブラリ調製を可能にする、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0136】
実施形態３３．前記ＰＣＲハンドルがｉ７アダプター配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0137】
実施形態３４．前記バーコード領域が少なくとも４つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0138】
実施形態３５．前記バーコード領域が６つのヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0139】
実施形態３６．前記骨格分子が、多糖、グルカン、デキストラン、ストレプトアビジン、およびストレプトマー多量体からなる群から選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0140】
実施形態３７．前記ＭＨＣ分子が、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して、ＭＨＣ重鎖を介して、またはＭＨＣ軽鎖（β２Ｍ）を介して前記骨格に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0141】
実施形態３８．前記ＭＨＣ分子がストレプトアビジン－ビオチン結合を介して前記骨格に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0142】
実施形態３９．前記多量体ＭＨＣが少なくとも４つのＭＨＣ分子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0143】
実施形態４０．前記少なくとも１つの核酸分子が化学修飾をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0144】
実施形態４１．前記少なくとも１つの核酸分子の５’末端または３’末端がスペーサーを介してアミノ基に結合している、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0145】
実施形態４２．前記スペーサーが６炭素スペーサーまたは１２炭素スペーサーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0146】
実施形態４３．前記少なくとも１つの核酸分子が５’末端および／または３’末端にホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0147】
実施形態４４．前記少なくとも１つの核酸分子と前記骨格分子との間の連結が前記核酸分子の誘導性解離を可能にする、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0148】
実施形態４５．前記少なくとも１つの核酸分子がジスルフィド架橋を介して前記骨格分子に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0149】
実施形態４６．前記ジスルフィド架橋が、スクシンイミジル－６－ヒドラジノ－ニコチンアミド（Ｓ－ＨｙＮｉｃ）修飾骨格分子を、５’－アミノ修飾されたスクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド類似体（Ｓ－ＳＳ－４ＦＢ）修飾核酸分子と組み合わせることによって形成される、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0150】
実施形態４７．前記少なくとも１つの核酸分子が光切断可能な連結を介して前記骨格分子に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0151】
実施形態４８．前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ単量体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0152】
実施形態４９．前記ＭＨＣ分子がペプチドと複合体形成されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0153】
実施形態５０．前記ＭＨＣ分子がビオチン化されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0154】
実施形態５１．前記骨格が、蛍光標識、Ｈｉｓタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される１つ以上の標識をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0155】
実施形態５２．前記骨格が前記蛍光標識に直接コンジュゲートされている、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0156】
実施形態５３．前記蛍光標識が４ＦＢで修飾され、Ｓ－ＨｙＮｉｃ修飾骨格にコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0157】
実施形態５４．前記蛍光標識がフルオロフォアタグ付けオリゴである、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0158】
実施形態５５．前記フルオロフォア標識オリゴが５’アミノ修飾または３’アミノ修飾を有し、４ＦＢでさらに修飾され、Ｓ－ＨｙＮｉｃ修飾骨格にコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0159】
実施形態５６．前記フルオロフォアタグ付けオリゴが前記骨格に連結された前記核酸分子に対して相補的である、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0160】
実施形態５７．前記フルオロフォアタグ付けオリゴが１０ヌクレオチド長である、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0161】
実施形態５８．前記骨格がフルオロフォア標識抗ストレプトアビジン抗体で標識される、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0162】
実施形態５９．前記フルオロフォアが、蛍光色素または量子ドットである、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0163】
実施形態６０．前記少なくとも１つの核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工ヌクレオチド、ＰＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される核酸分子を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0164】
実施形態６１．前記多量体ＭＨＣが同族Ｔ細胞に結合する、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0165】
実施形態６２．前記多量体ＭＨＣがフローサイトメトリー用途と適合性がある、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0166】
実施形態６３．前記フローサイトメトリー用途が単一細胞またはバルク細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0167】
実施形態６４．多量体ＭＨＣがＮＧＳベースの用途と適合性がある、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0168】
実施形態６５．前記ＮＧＳベースの用途が液滴ベースの単一細胞配列決定である、先行実施形態のいずれか１つに記載の多量体ＭＨＣまたは方法。
【0169】
実施形態６６．試料中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
ａ）実施形態１～５、８～１６、２３～２６、および３２～６５のいずれか１つに記載の１つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
ｂ）前記多量体ＭＨＣ分子を前記試料と接触させることと、
ｃ）前記多量体ＭＨＣ分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記ＭＨＣ分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記１つ以上のＭＨＣ分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。
ａ）実施形態１～５、８～１６、２３～２６、および３２～６５のいずれか１つに記載の１つ以上の多量体主要組織適合性複合体を提供することと、
ｂ）前記多量体ＭＨＣ分子を前記試料と接触させることと、
ｃ）前記多量体ＭＨＣ分子の前記抗原応答性細胞への結合を検出し、それにより、前記ＭＨＣ分子中に存在する抗原に応答して細胞を検出することと、を含み、前記結合が、前記骨格分子を介して前記１つ以上のＭＨＣ分子に連結された前記核酸分子の前記バーコード領域を増幅することによって検出される、方法。
【0170】
実施形態６７．前記試料が、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、体液、髄液、および唾液からなる群から選択される、実施形態６６に記載の方法。
【0171】
実施形態６８．前記試料が哺乳動物から得られる、実施形態６６または６７に記載の方法。
【0172】
実施形態６９．前記方法が、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、磁気ビーズベースの選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム付着、およびゲル濾過からなる群から選択される方法による細胞選択をさらに含む、実施形態６６～６８のいずれか１つに記載の方法。
【0173】
実施形態７０．前記増幅がＰＣＲである、実施形態６６～６９のいずれか１つに記載の方法。
【0174】
実施形態７１．前記核酸分子のバーコード領域の検出が、前記バーコード領域の配列決定またはｑＰＣＲによる前記バーコード領域の検出を含む、実施形態６６～７０のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【0175】
本発明がここで一般的に記載されているが、本発明のある特定の態様および実施形態を例証するためのみに含まれており、本発明を限定するようには意図されていない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【0176】
実施例１：バーコード化ｐＭＨＣの構築および実験的検証
多量体種
以下は、任意の配列からなるオリゴの共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を説明する。共有結合的コンジュゲーションの場合、オリゴ（例えば、図１中）をチオエーテル結合の形成によりストレプトアビジンにコンジュゲートするが、他の化学反応および結合形成を用いることができる。この特定の事例では、共有結合的連結により、オリゴおよびストレプトアビジンの両方が共通のヘテロ二官能性リンカーに架橋されて、ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートがもたらされる（図５）。ストレプトアビジンに非共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを、ビオチン化オリゴをストレプトアビジンと最適比率で混合し、所望のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート種のＨＰＬＣ精製によって得ることができる（図５および図９）。その後、共有結合および非共有結合由来のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート種をｐＭＨＣ多量体化に供することができる（図５）。これらのｐＭＨＣ多量体種を、（図１１に記載されるように）ｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力研究のために異なる組み合わせで使用することができる。加えて、１ストレプトアビジンあたり３単量体と４単量体との間の差異がＴＣＲ検出に影響を及ぼさないように標的ｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力が十分に高いことが知られている場合、単一サブタイプのｐＭＨＣ多量体（例えば、ｐＭＨＣ三量体のみ）をバルクまたは単一細胞配列決定プラットフォームで単独で使用することができる。非共有結合由来のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートのみを使用する利点は、化学的コンジュゲーションなしで済ませ、かつ１ストレプトアビジンあたりより少ない単量体の使用によるコスト削減である。
多量体種
以下は、任意の配列からなるオリゴの共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を説明する。共有結合的コンジュゲーションの場合、オリゴ（例えば、図１中）をチオエーテル結合の形成によりストレプトアビジンにコンジュゲートするが、他の化学反応および結合形成を用いることができる。この特定の事例では、共有結合的連結により、オリゴおよびストレプトアビジンの両方が共通のヘテロ二官能性リンカーに架橋されて、ストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートがもたらされる（図５）。ストレプトアビジンに非共有結合的にコンジュゲートされたオリゴを、ビオチン化オリゴをストレプトアビジンと最適比率で混合し、所望のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート種のＨＰＬＣ精製によって得ることができる（図５および図９）。その後、共有結合および非共有結合由来のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲート種をｐＭＨＣ多量体化に供することができる（図５）。これらのｐＭＨＣ多量体種を、（図１１に記載されるように）ｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力研究のために異なる組み合わせで使用することができる。加えて、１ストレプトアビジンあたり３単量体と４単量体との間の差異がＴＣＲ検出に影響を及ぼさないように標的ｐＭＨＣ－ＴＣＲ結合力が十分に高いことが知られている場合、単一サブタイプのｐＭＨＣ多量体（例えば、ｐＭＨＣ三量体のみ）をバルクまたは単一細胞配列決定プラットフォームで単独で使用することができる。非共有結合由来のストレプトアビジン－オリゴコンジュゲートのみを使用する利点は、化学的コンジュゲーションなしで済ませ、かつ１ストレプトアビジンあたりより少ない単量体の使用によるコスト削減である。
【0177】
別の例として、補足的Ｓ－ＳＳ－４ＦＢを補足したＳｏｌｕｌｉｎｋタンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションキットを使用することができる。ストレプトアビジンを最初にＳ－ＨｙＮｉｃで修飾した。５’アミノ修飾オリゴをＳ－ＳＳ－４ＦＢで修飾した。その後、修飾オリゴと修飾ストレプトアビジンを組み合わせて、直接バーコード化ストレプトアビジンを生成した（図２）。バーコード化オリゴをタンパク質にコンジュゲートし、かつ光切断可能な連結を含むが、これに限定されない誘導性バーコード化オリゴ解離を可能にする代替のコンジュゲーション化学アプローチおよび材料供給業者を使用することができる。オリゴをストレプトアビジンから、この場合は還元条件下で、一時的に解離する能力（図３）、ならびにビオチンに結合するバーコード化ストレプトアビジンの能力（図４）を実験で検証した。
【0178】
実施例２：バーコード化四量体のフルオロフォアベースの追跡
単一細胞およびバルク細胞選別用途で使用するために、バーコード化四量体を様々なフルオロフォアタグ付け戦略（図図６Ａ～図図６Ｃ）と組み合わせることができる。
単一細胞およびバルク細胞選別用途で使用するために、バーコード化四量体を様々なフルオロフォアタグ付け戦略（図図６Ａ～図図６Ｃ）と組み合わせることができる。
【0179】
実施例３：ＴＣＲ標的バーコード化四量体
記載のコンジュゲーション化学と同じコンジュゲーション化学を使用して、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ定常遺伝子を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製することができる（図１７）。本開示は、ＴＣＲ配列を取得し、かつｐＭＨＣ情報を一致させることのみに関心を示す科学者の利益になる。この方法の主な利点は、逆転写ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列の両方がｐＭＨＣ多量体バーコードを含むため、１回のライブラリ調製しか必要とされないことである。したがって、単数の配列決定リードは、ＴＣＲ配列およびｐＭＨＣ同一性情報の両方を含む。これは、ポリ－Ａテールまたは他の捕捉配列ベースのライブラリ調製法と対照的であり、それにより、より小さいｐＭＨＣバーコード／抗体バーコードライブラリが別個に処理され、後に配列決定の時点でｍＲＮＡ由来のライブラリと組み合わせられる１～４。単一またはバルク細胞選別で使用するために、本開示に記載のＴＣＲ標的四量体をフルオロフォア検出と組み合わせることができる（図６Ａ～図６Ｃ）。単一細胞選別により、ＴＣＲクローン性研究（図１８～図２０）、ならびにＴＣＲαおよびＴＣＲβ対形成配列の選別した起始細胞への潜在的な連結（図１８、図２１、図２２）が可能になる。
記載のコンジュゲーション化学と同じコンジュゲーション化学を使用して、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ定常遺伝子を標的とするバーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製することができる（図１７）。本開示は、ＴＣＲ配列を取得し、かつｐＭＨＣ情報を一致させることのみに関心を示す科学者の利益になる。この方法の主な利点は、逆転写ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列の両方がｐＭＨＣ多量体バーコードを含むため、１回のライブラリ調製しか必要とされないことである。したがって、単数の配列決定リードは、ＴＣＲ配列およびｐＭＨＣ同一性情報の両方を含む。これは、ポリ－Ａテールまたは他の捕捉配列ベースのライブラリ調製法と対照的であり、それにより、より小さいｐＭＨＣバーコード／抗体バーコードライブラリが別個に処理され、後に配列決定の時点でｍＲＮＡ由来のライブラリと組み合わせられる１～４。単一またはバルク細胞選別で使用するために、本開示に記載のＴＣＲ標的四量体をフルオロフォア検出と組み合わせることができる（図６Ａ～図６Ｃ）。単一細胞選別により、ＴＣＲクローン性研究（図１８～図２０）、ならびにＴＣＲαおよびＴＣＲβ対形成配列の選別した起始細胞への潜在的な連結（図１８、図２１、図２２）が可能になる。
【0180】
実施例４：カスタムＴＣＲ液滴ベースの配列決定
別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体コンジュゲートオリゴが、ｐＭＨＣ多量体バーコード配列およびＰＣＲハンドル配列に加えて、鋳型スイッチオリゴ配列を含むように、バーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製することができる（図２３）。これを行うための鍵は、スイッチオリゴ配列がＭＭＬＶ逆転写酵素によって付加されたデオキシシチジンに結合するために３つのリボグアノシンの３’ストレッチを含むことである。このシナリオでは、液滴ベースのビーズ（ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、または溶解性ビーズを含むが、これらに限定されない）を、典型的な細胞バーコードおよびＰＣＲハンドル配列を有するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ定常遺伝子相補性オリゴにカスタムコンジュゲートするであろう。ＰＣＲ重複除去のためにＵＭＩをオリゴ配列のうちのいずれかに含めることができる。ＴＣＲαおよびＴＣＲβの両方を標的とするオリゴを有するビーズは、所与のビーズについて同じバーコードを含むであろう。ビーズおよびｐＭＨＣ多量体陽性Ｔ細胞の両方を含む単一の液滴内で、ＭＭＬＶ逆転写酵素による逆転写は、ＴＣＲ ｍＲＮＡ由来のＶ（Ｄ）Ｊ配列を有するビーズベースのオリゴを伸長し、ｐＭＨＣ多量体バーコードおよびＰＣＲハンドルを有する鋳型スイッチオリゴ配列も含むであろう。その後の第２鎖合成およびＰＣＲ増幅により、配列決定のためのライブラリ調製が完了するであろう。ビーズオリゴおよびｐＭＨＣマリンターバーコード化／鋳型スイッチオリゴの両方のオリゴ配列、長さ、および修飾（ロック核酸塩基の使用を含むが、これに限定されない）を変化させることができる。この実施形態は、他の逆転写酵素誘導体と適合性があり得る。
別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体コンジュゲートオリゴが、ｐＭＨＣ多量体バーコード配列およびＰＣＲハンドル配列に加えて、鋳型スイッチオリゴ配列を含むように、バーコード化ｐＭＨＣ多量体を作製することができる（図２３）。これを行うための鍵は、スイッチオリゴ配列がＭＭＬＶ逆転写酵素によって付加されたデオキシシチジンに結合するために３つのリボグアノシンの３’ストレッチを含むことである。このシナリオでは、液滴ベースのビーズ（ヒドロゲルビーズ、硬質ビーズ、または溶解性ビーズを含むが、これらに限定されない）を、典型的な細胞バーコードおよびＰＣＲハンドル配列を有するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ定常遺伝子相補性オリゴにカスタムコンジュゲートするであろう。ＰＣＲ重複除去のためにＵＭＩをオリゴ配列のうちのいずれかに含めることができる。ＴＣＲαおよびＴＣＲβの両方を標的とするオリゴを有するビーズは、所与のビーズについて同じバーコードを含むであろう。ビーズおよびｐＭＨＣ多量体陽性Ｔ細胞の両方を含む単一の液滴内で、ＭＭＬＶ逆転写酵素による逆転写は、ＴＣＲ ｍＲＮＡ由来のＶ（Ｄ）Ｊ配列を有するビーズベースのオリゴを伸長し、ｐＭＨＣ多量体バーコードおよびＰＣＲハンドルを有する鋳型スイッチオリゴ配列も含むであろう。その後の第２鎖合成およびＰＣＲ増幅により、配列決定のためのライブラリ調製が完了するであろう。ビーズオリゴおよびｐＭＨＣマリンターバーコード化／鋳型スイッチオリゴの両方のオリゴ配列、長さ、および修飾（ロック核酸塩基の使用を含むが、これに限定されない）を変化させることができる。この実施形態は、他の逆転写酵素誘導体と適合性があり得る。
【0181】
このシステムは、いくつかの主要な利点を有する。１つは、ＴＣＲ配列およびｐＭＨＣバーコード配列のみを取得し、全トランスクリプトームの配列決定の必要性を打ち消すことである。別の利点は、四量体バーコード配列およびＴＣＲ配列の両方が同じ転写物上にあるため、１回のライブラリ調製しか必要とされないことである。別の利点は、ＴＣＲαビーズオリゴおよびＴＣＲβビーズオリゴの両方を使用する場合、これらの両方が各液滴内の一意の細胞バーコード配列により自動的に対形成されることである。最後に、ｐＭＨＣ多量体陽性Ｔ細胞のみが、２つのＰＣＲハンドルのうちの１つを含む鋳型スイッチ／ｐＭＨＣ多量体バーコード化オリゴを有するため、ｐＭＨＣ多量体陽性Ｔ細胞のみが配列決定ライブラリに寄与する。
【0182】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるいずれの定義も含む本出願が優先される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるいずれの定義も含む本出願が優先される。
【0183】
１．Ｂｅｎｔｚｅｎ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ－Ｉ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６．３４（１０）：ｐ．１０３７－１０４５．
２．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（９）：ｐ．８６５－８６８．
３．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７．３５（１０）：ｐ．９３６－９３９．
４．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８．
５．Ｄａｈｏｔｒｅ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ－Ｂａｒｃｏｄｅｄ ｐＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１９．９１（４）：ｐ．２６９５－２７００．
６．Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，ＭＨＣ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｔｏ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．１１５：ｐ．１７ ３ １－１７ ３ ４４．
７．Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｍ．ＡＡＩ ２０１９，Ａｂｓｔｒａｃｔ １９４．５８．
８．Ｋｒｕｍｍｅｙ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｗ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｒｏｂｕｓｔ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．１９６（６）：ｐ．２８３８－４６．
９．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ－ＤＮＡ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ ｓｔｒａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｍｅｔｈｏｄ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２０１３．２３（４）：ｐ．７０５－１５．
２．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．１４（９）：ｐ．８６５－８６８．
３．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７．３５（１０）：ｐ．９３６－９３９．
４．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８．
５．Ｄａｈｏｔｒｅ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ－Ｂａｒｃｏｄｅｄ ｐＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１９．９１（４）：ｐ．２６９５－２７００．
６．Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，ＭＨＣ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｔｏ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．１１５：ｐ．１７ ３ １－１７ ３ ４４．
７．Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｍ．ＡＡＩ ２０１９，Ａｂｓｔｒａｃｔ １９４．５８．
８．Ｋｒｕｍｍｅｙ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｗ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｒｏｂｕｓｔ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．１９６（６）：ｐ．２８３８－４６．
９．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ－ＤＮＡ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ ｓｔｒａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｍｅｔｈｏｄ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２０１３．２３（４）：ｐ．７０５－１５．
【0184】
等価物
当業者であれば、本明細書に記載の本発明に包含される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
当業者であれば、本明細書に記載の本発明に包含される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A-B】
【図17C-D】
【図17E-F】
【図17G-H】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【国際調査報告】