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▶ バイオファーマ トランスレーションズインスティテュート デッサウ フォルシュングス ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-16
(54)【発明の名称】酵素特性が改善したトリプシン変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 9/64 20060101AFI20220208BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20220208BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20220208BHJP
C07K 1/00 20060101ALI20220208BHJP
【ＦＩ】
C12N9/64 Z ZNA
C12N15/10 200Z
C12N15/57
C07K1/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021536366
(86)(22)【出願日】2019-12-19
(85)【翻訳文提出日】2021-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2019086425
(87)【国際公開番号】W WO2020127808
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】18214031.9
(32)【優先日】2018-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521269953
【氏名又は名称】バイオファーマ トランスレーションズインスティテュート デッサウ フォルシュングス ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＳＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥＳＳＡＵ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳ ＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ヴァルトナー、レネ
(72)【発明者】
【氏名】ベーメ、マルクス
(72)【発明者】
【氏名】ボルドゥサ、フランク
(72)【発明者】
【氏名】シモン、アンドレアス ハンス
(72)【発明者】
【氏名】リヒター、トーマス
【テーマコード（参考）】
4B050
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD11
4B050LL05
4H045AA20
4H045DA76
4H045FA51
(57)【要約】
本発明は酵素特性が改善したトリプシン変異体に関し、特に、求核性基質に対する親和性の増加をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置および／または加水分解活性の低下をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む変異トリプシンに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
求核性基質に対する親和性の増加をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置および／または加水分解活性の低下をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む変異トリプシン。
【請求項2】
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、好ましくはさらにＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；またはＨ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換
を含む、請求項１に記載の変異トリプシン。
【請求項3】
４０位のアミノ酸が芳香族、好ましくはＦまたはＹである、請求項１または２に記載の変異トリプシン。
【請求項4】
５５位のアミノ酸が低分子脂肪族極性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｓ、またはＴである、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項5】
９６位のアミノ酸が酸性極性アミノ酸、好ましくはＥまたはＰである、請求項１～４のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項6】
９７位のアミノ酸が好ましくはＨ、Ｄ、またはＦである、請求項１～５のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項7】
９９位のアミノ酸が芳香族アミノ酸、好ましくはＦ、Ｙ、ＷまたはＭである、請求項１～６のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項8】
１４３位のアミノ酸が好ましくはＶ、Ｄ、ＥまたはＴである、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項9】
１５１位のアミノ酸が好ましくはＤ、Ａ、Ｔ、またはＹである、請求項１～８のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項10】
１９０位のアミノ酸が低分子脂肪族アミノ酸、好ましくはＡまたはＶである、請求項１～９のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項11】
１９２位のアミノ酸が低分子脂肪族または芳香族アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｆ、またはＷである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項12】
２１４位のアミノ酸が低分子脂肪族アミノ酸、好ましくはＧまたはＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項13】
２１９位のアミノ酸が極性アミノ酸、好ましくはＱまたはＰである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項14】
２２１位のアミノ酸が極性アミノ酸、好ましくはＱまたはＴである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項15】
Ｋ６０およびＤ１８９位の両方に追加のアミノ酸置換と、Ｙ３９またはＹ５９位に少なくとももう１つのアミノ酸置換とを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項16】
Ｙ３９位およびＹ５９位が置換された、請求項１５に記載の変異トリプシン。
【請求項17】
Ｋ６０位がＥまたはＤで置換された、請求項１５または１６に記載の変異トリプシン。
【請求項18】
Ｄ１８９位がＫ、ＨまたはＲで置換された、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項19】
Ｙ３９位がＫ、ＨまたはＲで置換された、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項20】
Ｙ５９位がＫ、ＨまたはＲで置換された、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項21】
追加のアミノ酸置換Ｋ６０Ｅ、Ｄ１８９Ｋ、Ｎ１４３Ｈ、およびＥ１５１Ｈをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項22】
Ｋ６０およびＤ１８９位の両方に追加のアミノ酸置換と、Ｎ１４３位またはＥ１５１位にヒスチジンによる少なくとももう１つのアミノ酸置換とを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項23】
Ｋ６０がＥまたはＤで置換された、請求項２２に記載の変異トリプシン。
【請求項24】
Ｄ１８９がＫ、ＨまたはＲで置換された、請求項２２に記載の変異トリプシン。
【請求項25】
追加のアミノ酸置換Ｙ３９Ｈ、Ｙ５９Ｈ、Ｋ６０Ｅ、およびＤ１８９Ｋをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の変異トリプシン。
【請求項26】
第１酵素がトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であり、第２酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１であるか、または第１酵素がトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であり、第２酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであるか、または第１酵素がトリプシリガーゼＩＩであり、第２酵素がトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であるか、または第１酵素がトリプシリガーゼＩＩであり、第２酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１であるか、または第１酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであり、第２酵素がトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であるか、または第１酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであり、第２酵素がトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１である２つの異なる認識配列に対する直交二重修飾のための２つの異なるトリプシン酵素の使用。
【請求項27】
ａ）直交二重修飾のための基質を準備する工程、ｂ）第１認識配列を認識する第１トリプシン酵素を用いて基質を修飾する工程、
ｃ）第２認識配列を認識する第２トリプシン酵素を用いて基質を修飾する工程
を含む、基質の直交二重修飾のための方法。
【請求項28】
第１または第２トリプシン酵素がトリプシリガーゼＩＩ、トリプシン変異体Ａ２Ｃ８、トリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１、トリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄを含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は酵素特性が改善したトリプシン変異体に関する。
【背景技術】
【0002】
共有結合修飾を有するポリペプチド、および特異的共有結合修飾をポリペプチドに導入する方法を提供することに対する需要が高い。
概して位置特異的ではないかまたはポリペプチドの全体的な修飾をもたらす様々な純化学的な方法に加えて、ポリペプチドの部位特異的修飾のための分子生物学的および酵素的方法、または化学的および酵素的方法の組み合わせも存在する。
概して位置特異的ではないかまたはポリペプチドの全体的な修飾をもたらす様々な純化学的な方法に加えて、ポリペプチドの部位特異的修飾のための分子生物学的および酵素的方法、または化学的および酵素的方法の組み合わせも存在する。
【0003】
ポリペプチドの部位特異的修飾は、対応するポリペプチドを遺伝子レベルにおいて事前に操作しなければ例外的な場合にのみ起こり得る。例えば、その後の酵素触媒修飾のための認識配列は遺伝子レベルでポリペプチド配列に組み込まれ、これは位置特異的修飾のために用いられ得る（導入された標識の位置は認識配列の位置によって決定される）。
【0004】
部位特異的な様式でのポリペプチドの単一修飾のほか、起源が１つだけの酵素を利用することによるこれらの直交二重修飾は、現在の技術を適用して達成することができない新規なものである。直交二重修飾の文脈において、「直交」という用語は、有意な交差反応性を伴わない同一起源の２つの異なる生体触媒を用いた２つの様々な認識配列に対するポリペプチドの修飾を指す。ポリペプチドを修飾するための酵素的方法は、部位指向変異誘発による対応する認識配列の導入後の特定のアミノ酸配列または官能基の認識などの酵素の固有特性を用いる。位置特異性はそれぞれの酵素の高い基質特異性によって生じる。このように修飾された各ポリペプチドが認識配列を１つしか有さないという事実は、コンセンサス配列内では通常１つのアミノ酸のみが修飾されるため、方法に位置および官能基選択的性質を付与する。
【0005】
タンパク質分解酵素はポリペプチドの修飾に有用な酵素となり得る。トリプシンは塩基性アミノ酸残基のカルボキシ末端を特異的に切断するセリンタンパク質分解酵素である。活性部位はＳｅｒ１９５、Ａｓｐ１０２およびＨｉｓ５７（触媒三残基）からなる。Ｓｅｒ１９５は切断される基質とアシル酵素中間体を形成するため、タンパク質分解酵素反応性に有意に関与する。このアシル酵素中間体は水（ペプチド加水分解）、アミン（ペプチドアミノ分解）、アルコールおよびチオール（ペプチド（チオ）エステル化）などの様々な求核剤によって攻撃され得る。よって、共有結合アシル酵素中間体を形成することにより、セリンタンパク質分解酵素であるトリプシンは速度論的に制御されたアシル転移についてのすべての要件を満たす。
【0006】
ペプチド切断とは対照的に、ペプチド結合リンケージは２基質反応である。アシル供与体は酵素のＳ結合部位において結合する一方で、アシル受容体はＳ’結合領域と相互作用する。
【0007】
安定したアミド結合を介したポリペプチドのＣ末端修飾はアミド基転移反応に基づくものである。標識されるポリペプチドのＣ末端領域はトリプシン変異体とアシル酵素中間体を形成し、次いでこれは標識されたアシル受容体によって求核的に攻撃され得る。
【0008】
特許文献１には、トリプシン変異体Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ／Ｎ１４３Ｈ／Ｅ１５１Ｈ（トリプシリガーゼＩ）が記載されており、これは、制限部位－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－を有するペプチドのＰ２‘位において亜鉛イオンにより誘導されたヒスチジン側鎖を認識し、亜鉛の存在下でアミノ酸チロシンとアルギニンとの間の認識配列－ＹＲＨ－を特異的に加水分解する。
【0009】
ＥＰ１８２０５２１２では、Ｋ６０およびＤ１８９位の両方におけるアミノ酸置換とＹ３９またはＹ５９位における少なくとももう１つのアミノ酸置換とを含むトリプシン変異体が記載されている。記載されている好ましいトリプシン変異体はＹ３９Ｈ／Ｙ５９Ｈ／Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ（トリプシリガーゼＩＩ）である。ＥＰ１８２０５２１２は、標的ポリペプチドと、Ｘａａが任意のアミノ酸である認識部位Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｘａａ－Ｈｉｓを含む制限部位ペプチドとを含むポリペプチドの使用にさらに関連しており、ＥＰ１８２０５２１２に記載のように、前記制限部位ペプチドは、変異トリプシンの基質としての前記標的ポリペプチドのＣ末端におけるアミノ酸Ｔｙｒによって標的ポリペプチドと重複する。さらに、Ｃ末端アミド基転移標的ポリペプチドを調製するための方法およびＮ末端アシル基転移標的ポリペプチドを調製するための方法が提供されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第２００６／０１５８７９Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
これらのトリプシン変異体に鑑み、アミド基転移反応の脱アシル化工程内で加水分解よりもペプチドアミノ分解を指向し、かつ金属イオンの影響を受けない、改善した合成特性を有する変異体を提供する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の発明者らは、求核性基質に対する親和性の増加をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置および／または加水分解活性の低下をもたらす少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むトリプシン変異体を見出した。
【0013】
好ましい実施形態では、トリプシン変異体は、Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、好ましくはさらにＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含むか；またはＨ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換
のいずれかを含む。
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換；または
Ｈ４０、Ａ５５、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含むグループ１から選択される少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換、およびＲ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２を含むグループ２のうちの少なくとも３つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換
のいずれかを含む。
【0014】
本発明は、２つの異なる認識配列に対する直交二重修飾のための２つの異なるトリプシン酵素の使用と、２つの異なるトリプシン変異体を用いた基質の直交二重修飾のための方法とにさらに言及している。
【0015】
好ましい実施形態では、２つの異なる認識配列に対する直交二重修飾のための２つの異なるトリプシン酵素の使用は、第１酵素としてトリプシン変異体Ａ２Ｃ８および第２酵素としてトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１を用いるか、または第１酵素はトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であり第２酵素はトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであるか、または第１酵素はトリプシリガーゼＩＩであり第２酵素はトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であるか、または第１酵素はトリプシリガーゼＩＩであり第２酵素はトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１であるか、または第１酵素はトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであり第２酵素はトリプシン変異体Ａ２Ｃ８であるか、または第１酵素はトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄであり第２酵素はトリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１である。
【0016】
好ましい実施形態では、基質の直交二重修飾のための方法は、ａ）直交二重修飾のための基質を準備する工程、ｂ）第１認識配列を認識する第１トリプシン変異体を用いて基質を修飾する工程、ｃ）第２認識配列を認識する第２トリプシン変異体を用いて基質を修飾する工程を含む。好ましくは、第１または第２トリプシン変異体はトリプシリガーゼＩＩ、トリプシン変異体Ａ２Ｃ８、トリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１、トリプシン変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄを含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】トリプシリガーゼＩならびに改善した変異体２Ｇ１０、１Ｃ１１およびハイブリッド変異体によって触媒されるアミド基転移反応についての生成物形成の時間的経過。反応条件：１５μＭ Ｂｚ－ＡＡＹＲＨＡＡＧ－ＯＨ（アシル供与体）、３０μＭ Ｈ－ＲＨＡＫ－ＯＨ（アシル受容体）、０．５～２．１μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃。ＵＰＬＣ分析：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｃ１８カラム、勾配５～４０％アセトニトリル、４分、２５４ｎｍで検出。
【図2】トリプシリガーゼＩＩライブラリからのファージディスプレイ選択およびスクリーニングの際に同定された選ばれた変異体の基質特異性データ。１００μＭアシル供与体（Ｂｚ－ＰＧＧＸａａＸａａＸａａＸａａＡＧ－ＯＨ）；２００μＭアシル受容体（Ｈ－ＸａａＸａａＸａａＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨ）；１～５μＭ酵素変異体；１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、Ｔ＝３０℃。ＵＰＬＣ分析：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｃ１８カラム、勾配５～６０％アセトニトリル、５分、３６０ｎｍで検出；（ｋ＿（ｃａｔ，ＡＬ）＾ａｐｐ）：アミノ分解反応の見かけの回転率。Ｘａａ位でのアシル供与体／アシル受容体ペアのアミノ酸のバリエーションはｙ軸に示されており、例えば、ＹＲＡＨはアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨに関連し、対応するアシル受容体はＨ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨである。
【図3】変異体Ａ２Ｃ８、Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ、Ａ２Ｃ８＿Ｈ５９ＹおよびＡ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙによって触媒されるアミド基転移反応についての生成物形成の時間的経過。反応条件：１００μＭ Ｂｚ ＰＧＧＹＲＫＫＡＧ－ＯＨ（アシル供与体）、２００μＭ Ｈ－ＲＫＫＡＫ－ＯＨ（アシル受容体）、１μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃。ＵＰＬＣ分析：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｃ１８カラム、勾配５～４０％アセトニトリル、４分、２５４ｎｍで検出。
【図4】トリプシリガーゼＩＩライブラリからのファージディスプレイ選択およびスクリーニングの際に同定された選ばれた変異体の基質特異性データ。１００μＭアシル供与体（Ｂｚ－ＰＧＧＸａａＸａａＸａａＸａａＡＧ－ＯＨ）；２００μＭアシル受容体（Ｈ－ＸａａＸａａＸａａＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨ）；１～５μＭ酵素変異体；１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、Ｔ＝３０℃；ＵＰＬＣ分析：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｃ１８カラム、勾配５～６０％アセトニトリル、５分、３６０ｎｍで検出；（ｋ＿（ｃａｔ，ＡＬ）＾ａｐｐ）：アミノ分解反応の見かけの回転率。Ｘａａ位におけるアシル供与体／アシル受容体ペアのアミノ酸のバリエーションはｙ軸に示されており、例えば、ＹＲＡＨはアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨに関連し、対応するアシル受容体はＨ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨである。
【図5】様々なペプチド基質に相関して変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄおよび野生型トリプシンによって触媒されるアミド基転移反応についての生成物形成の時間的経過。反応条件：１００μＭアシル供与体（Ｂｚ ＰＧＧＸａａＸａａＸａａＨＡＧ－ＯＨ）；２００μＭアシル受容体（Ｈ－ＸａａＸａａＸａａＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨ）；１０μＭトリプシン変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄまたは２．５ｎＭアニオン性ラットトリプシンＩＩ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃。ＵＰＬＣ分析：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ、Ｃ１８カラム、勾配５～６０％アセトニトリル、５分、３６０ｎｍで検出。
【図6】２つのトリプシリガーゼＩＩ変異体の基質特異性におけるバリエーションを利用することによるＦａｂフラグメントの二重修飾。トラスツズマブのＨＥＲ２特異的Ｆａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、重鎖（配列番号２）および抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、軽鎖（配列番号３））を用い、それぞれの認識配列を遺伝子導入した。Ａ）配列ＲＲＫＨを認識するトリプシリガーゼＩＩ変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄをカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）含有求核剤の結合のための第１工程で用いた。Ｂ）第２工程では、ＹＲＡＨ配列を認識するトリプシリガーゼＩＩ変異体Ａ２Ｃ８を、メルタンシン（ＤＭ１）に共有結合した求核剤による修飾のために用いた。ＬＣ－ＭＳによる分析。第１および第２修飾工程のための修飾および非修飾Ｆａｂフラグメント種の量をそれぞれＭＳスペクトルＡおよびＢに示す。ＭＳスペクトルＡ）ピーク１：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿Ｒ－ＯＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ（Ｍｃａｌｃ．＝５０１１６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０１１８Ｄａ）、ピーク２：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ（Ｍｃａｌｃ．＝５０６６６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０６６６Ｄａ）、ピーク３：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＡＨ（Ｍｃａｌｃ．＝５１０９５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５１０９７Ｄａ）。ＭＳスペクトルＢ）ピーク１：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿Ｙ－ＯＨ（Ｍｃａｌｃ．＝４９４１７Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝４９４１７Ｄａ）、ピーク２：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿Ｒ－ＯＨ／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）（Ｍｃａｌｃ．＝５０００６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５００００Ｄａ）、ピーク３：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）（Ｍｃａｌｃ．＝５０５５５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０５５６Ｄａ）、ピーク４：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）（Ｍｃａｌｃ．＝５０９８５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０９８７Ｄａ）、ピーク５：抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＡＨ（Ｍｃａｌｃ．＝５１０９５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５１０９５Ｄａ）。反応条件第１工程：１００μＭ Ｆａｂ；２０００μＭ ＲＫＨＡＫ（ＣＦ）－ＯＨ；５μＭ Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄ；１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃、Ｔ＝１８０分。反応条件第２工程：５０μＭ Ｆａｂ；１０００μＭ ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－ＯＨ；５μＭ Ａ２Ｃ８；１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃、Ｔ＝４０分。
【発明を実施するための形態】
【0018】
発明の理解を容易にするために、発明に関連して用いられる用語の簡単な説明を提供しておく。本開示はＳｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｊ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７（１９６７）１５７－１６２の用語を用いて、ペプチド基質上の様々なアミノ酸残基および対応するタンパク質分解酵素の活性部位内の個々の結合部位の位置を記載している。
【0019】
上のＳｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｊ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ａ．により提案された用語によれば、ペプチド基質のアミノ酸残基は「Ｐ」という文字によって指定される。切断されるペプチド結合（「切断部位」または「認識部位」）のＮ末端側の基質のアミノ酸はＰｎ．．．Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１と指定され、切断部位から最も遠いアミノ酸残基がＰｎとなる。切断部位のＣ末端側のペプチド基質のアミノ酸残基はＰ１｀、Ｐ２｀、Ｐ３｀、．．．Ｐｎ｀と指定され、切断部位から最も遠いアミノ酸残基がＰｎ｀となる。したがって、切断される結合（「切断部位」または「認識部位」）はＰ１－Ｐ１｀結合である。
【0020】
エンドペプチダーゼ（例えばトリプシンのような）の基質のアミノ酸の一般式は次のとおりである：
Ｐｎ－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｐ１｀－Ｐ２｀－Ｐ３｀Ｐｎ｀
エンドペプチダーゼの基質結合部位の名称はペプチド基質のアミノ酸残基の名称と類似する。しかしながら、エンドペプチダーゼの結合サブ部位は「Ｓ」という文字で指定され、１を超えるアミノ酸残基を含み得る。切断部位のＮ末端部位のアミノ酸についての基質結合部位はＳｎ．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１と標識付けされる。切断部位のカルボキシ側のアミノ酸についての基質結合サブ部位はＳ１｀、Ｓ２｀、Ｓ３’、．．．Ｓｎ｀と指定される。したがって、エンドペプチダーゼでは、Ｓ１｀サブ部位がペプチド基質のＰ１｀基および入ってくる求核剤と相互作用する。
Ｐｎ－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｐ１｀－Ｐ２｀－Ｐ３｀Ｐｎ｀
エンドペプチダーゼの基質結合部位の名称はペプチド基質のアミノ酸残基の名称と類似する。しかしながら、エンドペプチダーゼの結合サブ部位は「Ｓ」という文字で指定され、１を超えるアミノ酸残基を含み得る。切断部位のＮ末端部位のアミノ酸についての基質結合部位はＳｎ．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１と標識付けされる。切断部位のカルボキシ側のアミノ酸についての基質結合サブ部位はＳ１｀、Ｓ２｀、Ｓ３’、．．．Ｓｎ｀と指定される。したがって、エンドペプチダーゼでは、Ｓ１｀サブ部位がペプチド基質のＰ１｀基および入ってくる求核剤と相互作用する。
【0021】
エンドペプチダーゼの基質結合部位を記載するための一般式は次のとおりである：
Ｓｎ－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ１｀－Ｓ２｀－Ｓ３｀－Ｓｎ｀
Ｓ１結合部位は、本発明に係るトリプシン変異体の場合はアミノ酸Ｔｙｒである、ペプチド基質のうちの末位から２番目のアミノ酸Ｐ１の側鎖に結合する。Ｓ１｀結合部位は本件ではＡｒｇであるＰ１｀の側鎖と相互作用する。同様に、Ｓ２｀結合部位はＰ２’位においてＸａａ残基の側鎖と相互作用する。
Ｓｎ－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ１｀－Ｓ２｀－Ｓ３｀－Ｓｎ｀
Ｓ１結合部位は、本発明に係るトリプシン変異体の場合はアミノ酸Ｔｙｒである、ペプチド基質のうちの末位から２番目のアミノ酸Ｐ１の側鎖に結合する。Ｓ１｀結合部位は本件ではＡｒｇであるＰ１｀の側鎖と相互作用する。同様に、Ｓ２｀結合部位はＰ２’位においてＸａａ残基の側鎖と相互作用する。
【0022】
「変異体」という用語は未変性のポリペプチド配列とはある程度異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、変異体アミノ酸配列は対応する親トリプシン配列と少なくとも約８０％の相同性を有することになり、好ましくは、そのような対応する親トリプシン配列と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性になるであろう。アミノ酸配列変異体は未変性のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置において置換、欠失、および／または挿入を有する。好ましくは、配列相同性は少なくとも９６％または９７％であろう。
【0023】
「相同性」は、最も高いパーセント相同性を達成すべく、必要に応じて配列を整列させギャップを導入した後にアミノ酸配列変異体内の一致する残基のパーセンテージとして規定される。整列のための方法およびコンピュータプログラムは当技術分野においては周知である。そのようなコンピュータプログラムの１つはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が著した「Ａｌｉｇｎ２」であり、これは１９９１年１２月１０日にワシントンＤＣ２０５５９の米国著作権局にユーザー文書と共に提出された。
【0024】
変異トリプシン
本発明の第１の態様は、配列番号１において与えられたトリプシン配列の２３、３８、７８、７９、８１、１２３、１３１、１７２、１７４、１９２、１９６および１９８位にそれぞれ対応するキモトリプシン命名法に係るＨ４０、Ａ５５、Ｒ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含む群から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む変異トリプシンを提供する。
本発明の第１の態様は、配列番号１において与えられたトリプシン配列の２３、３８、７８、７９、８１、１２３、１３１、１７２、１７４、１９２、１９６および１９８位にそれぞれ対応するキモトリプシン命名法に係るＨ４０、Ａ５５、Ｒ９６、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｎ１４３、Ｅ１５１、Ｓ１９０、Ｑ１９２、Ｓ２１４、Ｇ２１９、Ａ２２１を含む群から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む変異トリプシンを提供する。
【0025】
当業者であれば、例えば、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．およびＳｈｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ．３，（１９７１），ｐｐ．３２３－３７３に記載のいわゆるキモトリプシン命名法に馴染みがあり、位置がキモトリプシン命名法に従って付与された変異体トリプシンの位置を配列番号１のトリプシン配列のうちの対応位置と整列させることに問題はないであろう。
【0026】
好ましい実施形態では変異トリプシンは、Ｋ６０およびＤ１８９位の両方に追加のアミノ酸置換と、Ｙ３９またはＹ５９位に少なくとももう１つのアミノ酸置換とを含む。
キモトリプシン命名法に係る３９位は配列番号１において付与されるラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の２２位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る３９位は配列番号１において付与されるラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の２２位に対応する。
【0027】
キモトリプシン命名法に係る５９位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の４２位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る６０位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の４３位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る６０位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の４３位に対応する。
【0028】
キモトリプシン命名法に係る１８９位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１７１位に対応する。
当業者であればキモトリプシン命名法を参照して位置を表すことに慣れているため、以下では、具体的な配列位置、例えば、Ｋ６０位または単に６０位への言及はキモトリプシン命名法に係る位置にのみ基づいている。
当業者であればキモトリプシン命名法を参照して位置を表すことに慣れているため、以下では、具体的な配列位置、例えば、Ｋ６０位または単に６０位への言及はキモトリプシン命名法に係る位置にのみ基づいている。
【0029】
さらに好ましい実施形態では、変異トリプシンはキモトリプシン命名法に係るＫ６０およびＤ１８９位の両方に追加のアミノ酸置換と、Ｎ１４３位またはＥ１５１位にヒスチジンによる少なくとももう１つのアミノ酸置換とを含み、これらは配列番号１において与えられる配列の４３、１７１、１２３、および１３１位とそれぞれ対応する。
【0030】
キモトリプシン命名法に係る６０位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の４３位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る１４３位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１２３位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る１４３位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１２３位に対応する。
【0031】
キモトリプシン命名法に係る１５１位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１３１位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る１８９位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１７１位に対応する。
キモトリプシン命名法に係る１８９位は配列番号１において付与されるラットからの成熟陰イオン性ラットトリプシンＩＩの配列の１７１位に対応する。
【0032】
トリプシン酵素における関連する変異部位を特定するためおよび改善した特性を有する変異体を提供するために、発明者らはトリプシン変異体Ｋ６０Ｅ／Ｎ１４３Ｈ／Ｅ１５１Ｈ／Ｄ１８９Ｋ（トリプシリガーゼＩ）に基づく２つの独立した酵素ライブラリから開始した。
【0033】
ライブラリＡの作製のために、アミノ酸のＨ４０、Ａ５５、Ｋ９７、Ｌ９９、Ｓ１９０およびＱ１９２位をランダム化し、ライブラリＢについてはＤ９５、Ｒ９６、Ｌ９９、Ｓ２１４、Ｇ２１９およびＡ２２１位をランダム化した。ファージディスプレイによる選択とそれに続くＥＬＩＳＡベースのスクリーニングにより、合成可能性に関して最良の変異体としては、ライブラリＡではトリプシリガーゼＩ変異体２Ｇ１０およびライブラリＢでは変異体１Ｃ１１が得られた。
【0034】
これら２つの変異体の酵素的速度解析（表１および図１を参照されたい）は合成可能性の最適化には様々な原因があることを示した。変異体２Ｇ１０（トリプシリガーゼＩ＋Ｈ４０Ｐ、Ａ５５Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｌ９９Ｆ、Ｓ１９０Ｓ、Ｑ１９２Ｅ）は、初期の酵素トリプシリガーゼＩと比較して、求核性ＲＨ基質に対して非常に高い親和性を示し、これにより、水との競合において求核剤として優先的に組み込まれ、よって、望ましくない加水分解ではなくアミノ分解（＝望ましい生成物形成）をもたらす。
【0035】
その逆は変異体１Ｃ１１（トリプシリガーゼＩ＋Ｒ９６Ｖ、Ｌ９９Ｆ、Ｓ２１４Ｇ、Ｇ２１９Ｓ、Ａ２２１Ｇ）であり、これはトリプシリガーゼＩと比較して２０分の１に低下した加水分解活性を示し、これにより、アミノ分解と加水分解との関係はアミノ分解側に大きくシフトする。求核剤に対する親和性の改善はこの変異体については示すことができなかった。
【0036】
方法および材料
ＵＰＬＣ分析
ペプチドおよび反応の分析はＲＰ－Ｃ１８カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ １３０、Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて０．５ｍｌ／分の流速で実施した。用いた移動相は、それぞれ、（Ａ）０．０５％ＴＦＡを含む水および（Ｂ）０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。分析には２つの方法を適用した：
方法Ｉ：５分間でＢが５～４０％になる線形勾配、２５４ｎｍで検出。
ＵＰＬＣ分析
ペプチドおよび反応の分析はＲＰ－Ｃ１８カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ １３０、Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて０．５ｍｌ／分の流速で実施した。用いた移動相は、それぞれ、（Ａ）０．０５％ＴＦＡを含む水および（Ｂ）０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。分析には２つの方法を適用した：
方法Ｉ：５分間でＢが５～４０％になる線形勾配、２５４ｎｍで検出。
【0037】
方法ＩＩ：５分間でＢが５～６０％になる線形勾配、３６０ｎｍで検出。
生成物および抽出物の量は積分したピーク面積から算出した。
質量分析法
質量分析（ＭＳ）法はＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）ＺＱ（商標）ＭＳ検出器に接続したＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを備えたＬＣ－ＭＳによって実施した。ＬＣ分離はＲＰ－Ｃ８カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）、Ｃ８、３．５μＭ、２．１ｘ１００ｍｍ）を用いて０．３ｍｌ／分の流速で実施した。用いた移動相は、それぞれ、（Ａ）０．１％ＴＦＡを含む水および（Ｂ）０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。分離のために、１０分間でＢが５～９５％になる線形勾配を適用し、２２０ｎｍで検出した。
生成物および抽出物の量は積分したピーク面積から算出した。
質量分析法
質量分析（ＭＳ）法はＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）ＺＱ（商標）ＭＳ検出器に接続したＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを備えたＬＣ－ＭＳによって実施した。ＬＣ分離はＲＰ－Ｃ８カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）、Ｃ８、３．５μＭ、２．１ｘ１００ｍｍ）を用いて０．３ｍｌ／分の流速で実施した。用いた移動相は、それぞれ、（Ａ）０．１％ＴＦＡを含む水および（Ｂ）０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである。分離のために、１０分間でＢが５～９５％になる線形勾配を適用し、２２０ｎｍで検出した。
【0038】
トリプシン変異体の発現および精製
すべての記載したトリプシン変異体の組換え産生のために、対応する遺伝子を、ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＰＩＣＺαＡ発現ベクターにサブクローニングした。ベクターをコードする遺伝子で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換し、続いて、２５μｇ／ｍｌゼオシンを含むＬＢ低塩（５ｇ／ｌ酵母エキス；１０ｇ／ｌトリプトン；５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）寒天プレートに細胞を播種した。３７℃で一晩培養後に単一のコロニーを選び、２５μｇ／ｍｌゼオシンを含む液体ＬＢ低塩培地に移した。連続的に振とうさせながら細胞を３７℃で一晩培養した。５０００ｘｇで５分間の遠心分離により細胞を回収した後、標準的なプロトコルに従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドはＳａｃＩ消化によって直線化した。続いて、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ－３３細胞をエレクトロポレーションにより直線化プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍｌゼオシンを含むＹＰＤＳ（１０ｇ／ｌ酵母エキス；２０ｇ／ｌペプトン；２０ｇ／ｌデキストロース；１Ｍソルビトール）寒天プレートに播種した。これらのプレートを３０℃で３日間培養した。トリプシン変異体の発現のために、単一のコロニーを選び、２％デキストロースを含む緩衝化最小培地（１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０；１．３４％酵母ニトロゲンベース）に移した。３０℃で４８時間の培養および継続的な振とう後、４０００ｘｇで５分間細胞を回収した。その後、細胞ペレットを緩衝化最小培地に再懸濁し、１％（ｖ／ｖ）メタノールの添加によりタンパク質産生を誘導した一方で、トリプシン変異体は上清へ分泌させた。タンパク質の産生は１％（ｖ／ｖ）メタノールを毎日添加し継続的に振とうしながら３０℃で５日間培養することによって実施した。５日後、５０００ｘｇで２０分間遠心分離することにより細胞を上清から分離した。分泌したトリプシン変異体の単離のために、カチオン交換クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階精製を実施した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いて、２０ｍｌ ＨｉＰｒｅｐ（商標）ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０）で平衡化した。上清を１容量の結合緩衝液で希釈し、カラムに充填した。１０カラム容量の結合緩衝液による洗浄工程後、タンパク質を溶出緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で溶出し、タンパク質含有フラクションを２８０ｎｍにおける吸収によって検出した。プールしたタンパク質含有フラクションを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）を用いて約１ｍｌの容量まで濃縮した。続いて、濃縮したタンパク質溶液を、緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単量体酵素種（約２４ｋＤａ）の２８０ｎｍにおける吸収ピークに関連するタンパク質含有フラクションはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。純度が９０％を超えるフラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）で濃縮した。タンパク質濃度は２８０ｎｍにおける吸収および変異体の対応する吸光係数によって決定した。トリプシン変異体の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はＬＣ－ＭＳによって確認した。
すべての記載したトリプシン変異体の組換え産生のために、対応する遺伝子を、ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＰＩＣＺαＡ発現ベクターにサブクローニングした。ベクターをコードする遺伝子で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換し、続いて、２５μｇ／ｍｌゼオシンを含むＬＢ低塩（５ｇ／ｌ酵母エキス；１０ｇ／ｌトリプトン；５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）寒天プレートに細胞を播種した。３７℃で一晩培養後に単一のコロニーを選び、２５μｇ／ｍｌゼオシンを含む液体ＬＢ低塩培地に移した。連続的に振とうさせながら細胞を３７℃で一晩培養した。５０００ｘｇで５分間の遠心分離により細胞を回収した後、標準的なプロトコルに従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドはＳａｃＩ消化によって直線化した。続いて、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ－３３細胞をエレクトロポレーションにより直線化プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍｌゼオシンを含むＹＰＤＳ（１０ｇ／ｌ酵母エキス；２０ｇ／ｌペプトン；２０ｇ／ｌデキストロース；１Ｍソルビトール）寒天プレートに播種した。これらのプレートを３０℃で３日間培養した。トリプシン変異体の発現のために、単一のコロニーを選び、２％デキストロースを含む緩衝化最小培地（１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０；１．３４％酵母ニトロゲンベース）に移した。３０℃で４８時間の培養および継続的な振とう後、４０００ｘｇで５分間細胞を回収した。その後、細胞ペレットを緩衝化最小培地に再懸濁し、１％（ｖ／ｖ）メタノールの添加によりタンパク質産生を誘導した一方で、トリプシン変異体は上清へ分泌させた。タンパク質の産生は１％（ｖ／ｖ）メタノールを毎日添加し継続的に振とうしながら３０℃で５日間培養することによって実施した。５日後、５０００ｘｇで２０分間遠心分離することにより細胞を上清から分離した。分泌したトリプシン変異体の単離のために、カチオン交換クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階精製を実施した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いて、２０ｍｌ ＨｉＰｒｅｐ（商標）ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０）で平衡化した。上清を１容量の結合緩衝液で希釈し、カラムに充填した。１０カラム容量の結合緩衝液による洗浄工程後、タンパク質を溶出緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で溶出し、タンパク質含有フラクションを２８０ｎｍにおける吸収によって検出した。プールしたタンパク質含有フラクションを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）を用いて約１ｍｌの容量まで濃縮した。続いて、濃縮したタンパク質溶液を、緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単量体酵素種（約２４ｋＤａ）の２８０ｎｍにおける吸収ピークに関連するタンパク質含有フラクションはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。純度が９０％を超えるフラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）で濃縮した。タンパク質濃度は２８０ｎｍにおける吸収および変異体の対応する吸光係数によって決定した。トリプシン変異体の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はＬＣ－ＭＳによって確認した。
【0039】
Ｆａｂフラグメントの発現および精製
Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメント抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨの組換え産生のために、対応する遺伝子配列（配列番号６４）を標準的な方法によってｐＡＳＫ－ＩＢＡ７Ｐｌｕｓ発現ベクターにサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ（５ｇ／ｌ酵母エキス；１０ｇ／ｌトリプトン；１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）寒天プレートに播種した。３７℃で一晩培養後、単一のコロニーを選び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地に移した。Ｆａｂフラグメントの発現のために、継続的に振とうしながらこの前培養物を３７℃で一晩培養し、その後１００μｇ／ｍｌアンピシリン（０．１のＯＤ６００ｎｍから開始）を含むＬＢ培地における主培養物の播種に用いた。培養物が０．８～１のＯＤ６００ｎｍに達すると、０．２μｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンの添加によってタンパク質産生を誘導した。継続的に振とうしながら３０℃で４時間培養後、５０００ｘｇで２０分間の遠心分離により細胞を回収した。ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＡＥＢＳＦ）に再懸濁した。超音波処理（８×１０秒、３０％振幅）によって細胞を破壊し、２００００ｘｇで３５分間の超遠心分離により細胞片を除去した。Ｆａｂフラグメントの単離のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階精製を実施した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いて、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）で平衡化した。カラムに上清を充填した後、１０カラム容量の結合緩衝液を用いて洗浄工程を実施した。溶出は１０カラム容量の溶出緩衝液（１００グリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７）を用いて実施し、収集したフラクションは直ちに２０％（ｖ／ｖ）中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０）で中和した。タンパク質含有フラクションは２８０ｎｍにおける吸収によって検出した。プールしたタンパク質含有フラクションを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）を用いて約１ｍｌの容量まで濃縮した。続いて、濃縮したタンパク質溶液を、緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単量体Ｆａｂ種（約５０ｋＤａ）の２８０ｎｍにおける吸収ピークに関連するフラクションはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。純度が９０％を超えるフラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）で濃縮した。最終的なタンパク質濃度は２８０ｎｍにおける吸収および変異体の対応する吸光係数によって決定した。Ｆａｂフラグメントの同一性はＬＣ－ＭＳによって確認した。
Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメント抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨの組換え産生のために、対応する遺伝子配列（配列番号６４）を標準的な方法によってｐＡＳＫ－ＩＢＡ７Ｐｌｕｓ発現ベクターにサブクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ（５ｇ／ｌ酵母エキス；１０ｇ／ｌトリプトン；１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）寒天プレートに播種した。３７℃で一晩培養後、単一のコロニーを選び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地に移した。Ｆａｂフラグメントの発現のために、継続的に振とうしながらこの前培養物を３７℃で一晩培養し、その後１００μｇ／ｍｌアンピシリン（０．１のＯＤ６００ｎｍから開始）を含むＬＢ培地における主培養物の播種に用いた。培養物が０．８～１のＯＤ６００ｎｍに達すると、０．２μｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンの添加によってタンパク質産生を誘導した。継続的に振とうしながら３０℃で４時間培養後、５０００ｘｇで２０分間の遠心分離により細胞を回収した。ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＡＥＢＳＦ）に再懸濁した。超音波処理（８×１０秒、３０％振幅）によって細胞を破壊し、２００００ｘｇで３５分間の超遠心分離により細胞片を除去した。Ｆａｂフラグメントの単離のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階精製を実施した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いて、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）で平衡化した。カラムに上清を充填した後、１０カラム容量の結合緩衝液を用いて洗浄工程を実施した。溶出は１０カラム容量の溶出緩衝液（１００グリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７）を用いて実施し、収集したフラクションは直ちに２０％（ｖ／ｖ）中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０）で中和した。タンパク質含有フラクションは２８０ｎｍにおける吸収によって検出した。プールしたタンパク質含有フラクションを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）を用いて約１ｍｌの容量まで濃縮した。続いて、濃縮したタンパク質溶液を、緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単量体Ｆａｂ種（約５０ｋＤａ）の２８０ｎｍにおける吸収ピークに関連するフラクションはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定した。純度が９０％を超えるフラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）で濃縮した。最終的なタンパク質濃度は２８０ｎｍにおける吸収および変異体の対応する吸光係数によって決定した。Ｆａｂフラグメントの同一性はＬＣ－ＭＳによって確認した。
【0040】
ペプチド合成
ペプチド合成用のすべての試薬および界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）はドイツのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）において市販の最も高品質なものを購入した。ペプチド合成用のすべてのアミノ酸および構成要素（Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）、Ｌｙｓ（ｉｖＤＤＥ））はドイツのマルクトレドヴィッツにあるＩＲＩＳ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨにて購入した。ＤＭ１は米国のサンディエゴにあるＣｏｎｃｏｒｔｉｓ（登録商標）にて購入した。
ペプチド合成用のすべての試薬および界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）はドイツのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）において市販の最も高品質なものを購入した。ペプチド合成用のすべてのアミノ酸および構成要素（Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）、Ｌｙｓ（ｉｖＤＤＥ））はドイツのマルクトレドヴィッツにあるＩＲＩＳ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨにて購入した。ＤＭ１は米国のサンディエゴにあるＣｏｎｃｏｒｔｉｓ（登録商標）にて購入した。
【0041】
ペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって記載されているようにＦｍｏｃ／保護基手法を用いた標準的な手順で合成した。最終的なペプチド配列によると第１アミノ酸はクロロトリチル樹脂にカップリングした。以下では、ＤＭＦ中で２０％ピペリジンを用いることによってＦｍｏｃ切断を実施した。さらなるカップリングのために、アミノ酸は（（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ）を用いて活性化させた。樹脂からの最終的な切り出しおよび側鎖保護基の脱保護は９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％水を用いて行った。溶媒を蒸発させた後、油性の残部を水／ＡＣＮに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ／Ｈｉｔａｃｈｉ－ＨＰＬＣ、Ｖｙｄａｃ－Ｃ１８、５～８０％ＡＣＮ、３０／６０分）で精製した。凍結乾燥後、ペプチドの生成物含有フラクションが結晶性の粉末として得られた。生成物の同一性および純度はＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、ＢＥＨ１３０）およびＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００）によって実証された。すべてのペプチドの純度は９８％を超えていた。
【0042】
メルタンシン（ＤＭ１）官能化ペプチドＨ－ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－ＯＨを合成するために、構成要素Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）を用いた。ＲＫＫＡＫ（ｉｖＤｄｅ）ペプチドの合成後、ＤＭＦ中の２％ヒドラジンを用いて、完全に保護されたペプチドからリジンの保護基を除去した。その後、リジン側鎖を、ＤＭＦ中の１．１当量の４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジルで官能化した。最終工程では、ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ）は、緩衝化リン酸緩衝液／ＡＣＮシステム（ｐＨ７．４）を用いて、マイケル付加を介してメルタンシンにカップリングさせた。
【0043】
樹脂からの最終的な切り出しおよび側鎖保護基の脱保護やＨ－ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－Ｈの精製を上記のように行った。生成物は２つの種の異性体混合物として得られた。生成物の同一性および純度はＵＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳによって実証された。Ｈ－ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－ＯＨの純度は９９％を超えていた。
【0044】
トリプシリガーゼＩＩおよび改善したトリプシリガーゼＩＩ変異体によって触媒されるモデルアミド基転移反応
モデルアミド基転移反応は、１５～２５０μＭアシル供与体、２当量の対応するアシル受容体、様々な濃度のトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、±０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。アシル供与体およびアシル受容体はＰ１’～Ｐ３’位に同一のアミノ酸、例えば、Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ＋Ｈ－ＲＡＨＡＫ－ＯＨまたはＢｚ－ＰＧＧＹＲＫＫＡＧ＋Ｈ－ＲＫＫＡＫ－ＯＨを有していた。バリエーションが示されている。アシル受容体は末端リジンの側鎖に２，４－ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）、例えば、Ｈ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨまたはＨ－ＲＫＫＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨを有することがあった。反応は酵素の添加により開始した。生成物形成の時間的経過を記録するためおよび／または反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を最大で４時間までの異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。反応混合物の組成は、アシル受容体内の２，４－ジニトロフェニル基の非存在（方法Ｉ）または存在（方法ＩＩ）に応じて、方法ＩまたはＩＩを用いたＵＰＣＬによって分析した（実施例１を参照されたい）。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
モデルアミド基転移反応は、１５～２５０μＭアシル供与体、２当量の対応するアシル受容体、様々な濃度のトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、±０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。アシル供与体およびアシル受容体はＰ１’～Ｐ３’位に同一のアミノ酸、例えば、Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ＋Ｈ－ＲＡＨＡＫ－ＯＨまたはＢｚ－ＰＧＧＹＲＫＫＡＧ＋Ｈ－ＲＫＫＡＫ－ＯＨを有していた。バリエーションが示されている。アシル受容体は末端リジンの側鎖に２，４－ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）、例えば、Ｈ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨまたはＨ－ＲＫＫＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨを有することがあった。反応は酵素の添加により開始した。生成物形成の時間的経過を記録するためおよび／または反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を最大で４時間までの異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。反応混合物の組成は、アシル受容体内の２，４－ジニトロフェニル基の非存在（方法Ｉ）または存在（方法ＩＩ）に応じて、方法ＩまたはＩＩを用いたＵＰＣＬによって分析した（実施例１を参照されたい）。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
【0045】
トリプシリガーゼＩＩおよび改善したトリプシリガーゼＩＩ変異体によって触媒される加水分解反応の回転率の決定
加水分解反応は様々な濃度のアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨ（トリプシリガーゼＩＩについては０～５０００μＭ、変異体Ａ２Ｃ８については０～１５００μＭ）、２μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。トリプシリガーゼＩＩの場合、反応は１００μＭ ＺｎＣｌ２の存在下で実施した。反応は酵素の添加により開始した。反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を３０分以内の異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。方法Ｉを用いるＵＰＣＬによって反応混合物の組成を分析した（実施例１を参照されたい）。アシル供与体および加水分解生成物に存在するＮ末端ベンゾイル基（Ｂｚ－）のＵＶ吸収が２５４ｎｍにおいて検出された。加水分解反応の回転率（ｋｃａｔ、ＨＬ）を決定するために、加水分解反応についての初期の回転率を対応するアシル供与体濃度に対してプロットし、ミカエリスメンテン式にフィッティングした。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
加水分解反応は様々な濃度のアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨ（トリプシリガーゼＩＩについては０～５０００μＭ、変異体Ａ２Ｃ８については０～１５００μＭ）、２μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。トリプシリガーゼＩＩの場合、反応は１００μＭ ＺｎＣｌ２の存在下で実施した。反応は酵素の添加により開始した。反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を３０分以内の異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。方法Ｉを用いるＵＰＣＬによって反応混合物の組成を分析した（実施例１を参照されたい）。アシル供与体および加水分解生成物に存在するＮ末端ベンゾイル基（Ｂｚ－）のＵＶ吸収が２５４ｎｍにおいて検出された。加水分解反応の回転率（ｋｃａｔ、ＨＬ）を決定するために、加水分解反応についての初期の回転率を対応するアシル供与体濃度に対してプロットし、ミカエリスメンテン式にフィッティングした。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
【0046】
求核性ペプチドのＫＭ値の決定
トリプシリガーゼＩＩについては、求核性ペプチド（アシル受容体）のＫＭ値の測定は、その強い亜鉛イオン依存性により、亜鉛イオンの存在下または非存在下で実施した。変異体Ａ２Ｃ８の場合、亜鉛イオンの非存在下で測定を実施した。トリプシリガーゼＩＩおよび変異体Ａ２Ｃ８によるアミド基転移反応は、２５０μＭのアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨ、様々な濃度のアシル受容体Ｈ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨ（亜鉛イオンの非存在下ではトリプシリガーゼＩＩについては０～５０００μＭ、亜鉛イオンの存在下ではトリプシリガーゼＩＩについては０～１５００μＭ、変異体Ａ２Ｃ８については０～１０００μＭ）、０．２～１．５μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、±０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。反応は酵素の添加により開始した。反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を３０分以内の異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。反応混合物の組成は方法ＩＩを用いてＵＰＣＬによって分析した（実施例１を参照されたい）。アシル受容体およびアミノ分解生成物に存在する２，４－ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）のＵＶ吸収が３６０ｎｍにおいて検出された。求核性ペプチドのＫＭ値を決定するために、アミノ分解反応の初期の回転率を対応するアシル受容体濃度に対してプロットし、ミカエリスメンテン式にフィッティングした。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
トリプシリガーゼＩＩについては、求核性ペプチド（アシル受容体）のＫＭ値の測定は、その強い亜鉛イオン依存性により、亜鉛イオンの存在下または非存在下で実施した。変異体Ａ２Ｃ８の場合、亜鉛イオンの非存在下で測定を実施した。トリプシリガーゼＩＩおよび変異体Ａ２Ｃ８によるアミド基転移反応は、２５０μＭのアシル供与体Ｂｚ－ＰＧＧＹＲＡＨＡＧ－ＯＨ、様々な濃度のアシル受容体Ｈ－ＲＡＨＡＫ（ＤＮＰ）－ＯＨ（亜鉛イオンの非存在下ではトリプシリガーゼＩＩについては０～５０００μＭ、亜鉛イオンの存在下ではトリプシリガーゼＩＩについては０～１５００μＭ、変異体Ａ２Ｃ８については０～１０００μＭ）、０．２～１．５μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、±０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む溶液中において３０℃で実施した。反応は酵素の添加により開始した。反応の速度論的評価のために、いくつかの一定分量の反応混合物を３０分以内の異なる時点で２５％（ｖ／ｖ）酢酸でクエンチした。反応混合物の組成は方法ＩＩを用いてＵＰＣＬによって分析した（実施例１を参照されたい）。アシル受容体およびアミノ分解生成物に存在する２，４－ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）のＵＶ吸収が３６０ｎｍにおいて検出された。求核性ペプチドのＫＭ値を決定するために、アミノ分解反応の初期の回転率を対応するアシル受容体濃度に対してプロットし、ミカエリスメンテン式にフィッティングした。測定は２回実施し、誤差は５％未満であった。
【0047】
Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメントの直交二重修飾
Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメントの二重修飾のために、２つの直交認識配列をそれぞれ重鎖および軽鎖の対応するＣ末端に結合させた。これは２つの異なる官能基の酵素媒介接合を可能にするために行われた。配列番号２に示されているように、軽鎖は短いペプチドスペーサー（ＬＳＰＧＧ）によってＣ末端において伸長され、変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄの認識配列（ＲＲＫＨ）を含むアミノ酸配列ＲＲＫＨＡＧが続いている。重鎖のＣ末端は短いペプチドスペーサー（ＡＤＫＰＧＧ）によって伸長され、アミノ酸配列ＹＲＡＨＡＧが続き、これは、変異体Ａ２Ｃ８の認識配列（ＹＲＡＨ）および任意の精製または検出目的のためのｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含む。２つの直交認識配列を含むＨｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメント（ａＨｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ－ＨＣ＿ＹＲＡＨ）の二重修飾は、第１工程で軽鎖に蛍光色素（５（６）－カルボキシフルオレセイン）を結合し、第２工程で重鎖に細胞毒性化合物メルタンシン（ＤＭ１）を結合する２段階修飾反応によって実施した（図６）。
Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメントの二重修飾のために、２つの直交認識配列をそれぞれ重鎖および軽鎖の対応するＣ末端に結合させた。これは２つの異なる官能基の酵素媒介接合を可能にするために行われた。配列番号２に示されているように、軽鎖は短いペプチドスペーサー（ＬＳＰＧＧ）によってＣ末端において伸長され、変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄの認識配列（ＲＲＫＨ）を含むアミノ酸配列ＲＲＫＨＡＧが続いている。重鎖のＣ末端は短いペプチドスペーサー（ＡＤＫＰＧＧ）によって伸長され、アミノ酸配列ＹＲＡＨＡＧが続き、これは、変異体Ａ２Ｃ８の認識配列（ＹＲＡＨ）および任意の精製または検出目的のためのｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含む。２つの直交認識配列を含むＨｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメント（ａＨｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ－ＨＣ＿ＹＲＡＨ）の二重修飾は、第１工程で軽鎖に蛍光色素（５（６）－カルボキシフルオレセイン）を結合し、第２工程で重鎖に細胞毒性化合物メルタンシン（ＤＭ１）を結合する２段階修飾反応によって実施した（図６）。
【0048】
軽鎖の修飾のためのアミド基転移反応は１００μＭ ａＨｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、２０００μＭ Ｈ－ＲＫＨＡＫ（ＣＦ）－ＯＨ、５μＭ Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中で実施した。酵素の添加により反応を開始し、３０℃で１８０分間培養した。続いて、酵素および残るカルボキシフルオレセイン含有求核剤（Ｈ－ＲＫＨＡＫ（ＣＦ）－ＯＨ）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって除去した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いて、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）で平衡化した。反応混合物を塗布した後、１０カラム容量の結合緩衝液でカラムを洗浄した。続いて、結合したＦａｂフラグメント種を１０カラム容量の溶出緩衝液（１００グリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７）で溶出し、集めたフラクションを１／５容量の中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０）で直ちに中和した。タンパク質含有フラクションをプールし、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ装置（ＮＭＷＬ：１０ｋＤａ、ミリポア）を用いて緩衝液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌに交換した。
【0049】
重鎖の第２修飾反応は、５０μＭの単一修飾ａＨｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、１０００μＭ Ｈ－ＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－ＯＨ、５μＭ Ａ２Ｃ８、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中で実施した。酵素の添加により反応を開始し、３０℃で４０分間培養した。続いて、酵素および残るＤＭ１含有求核剤（Ｈ－ＲＫＨＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）－ＯＨ）を上記のようにＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって除去した。第１および第２修飾工程毎の修飾および非修飾Ｆａｂフラグメント種の割合をＬＣ－ＭＳにより分析した（実施例１を参照されたい）。第１修飾工程後、Ｆａｂフラグメントの最大で９０％までが軽鎖においてカルボキシフルオレセインのみで修飾されていた（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、図６スペクトルＡピーク３、Ｍｃａｌｃ．＝５１０９５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５１０９７Ｄａ）。さらに、未消費のＦａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、図６スペクトルＡピーク２、Ｍｃａｌｃ．＝５０６６６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０６６６Ｄａ）および軽鎖において加水分解された認識配列を有するＦａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿Ｒ－ＯＨ／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、図６スペクトルＡピーク１、Ｍｃａｌｃ．＝５０１１６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０１１８Ｄａ）に対応する２つの微量な副生成物を特定することができた。重鎖における認識配列に対する修飾は観察されなかった。
【0050】
第２修飾工程後、Ｆａｂフラグメントの最大で７５％までが軽鎖においてカルボキシフルオレセイン、重鎖においてＤＭ１で二重修飾されており（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）、図６スペクトルＢピーク４、Ｍｃａｌｃ．＝５０９８５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０９８７Ｄａ）、所望の構成を示していた。さらに、軽鎖においてカルボキシフルオレセイン、重鎖において全長認識配列を有する単一修飾Ｆａｂフラグメント（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿ＹＲＡＨ、図６スペクトルＢピーク５、Ｍｃａｌｃ．＝５１０９５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５１０９５Ｄａ）、重鎖においてＤＭ１、軽鎖において全長認識配列を有する単一修飾Ｆａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨ／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）、図６スペクトルＢピーク３、Ｍｃａｌｃ．＝５０５５５Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５０５５６Ｄａ）、重鎖においてＤＭ１、軽鎖において加水分解された認識配列を有する単一修飾Ｆａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿Ｒ－ＯＨ／ＨＣ＿ＹＲＫＫＡＫ（ＭＣＣ－ＤＭ１）、図６スペクトルＢピーク２、Ｍｃａｌｃ．＝５０００６Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝５００００Ｄａ）、軽鎖においてカルボキシフルオレセイン、重鎖において加水分解された認識配列を有する単一修飾Ｆａｂフラグメント（抗Ｈｅｒ２－Ｆａｂ－ＬＣ＿ＲＲＫＨＡＫ（ＣＦ）／ＨＣ＿Ｙ－ＯＨ、図６スペクトルＢピーク１、Ｍｃａｌｃ．＝４９４１７Ｄａ、Ｍｆｏｕｎｄ＝４９４１７Ｄａ）に対応する４つの微量な副生成物が検出された。この場合も、変異体Ａ２Ｃ８に関連し得る軽鎖のＣ末端における修飾は検出されなかった。
【実施例】
【0051】
実施例１
生成物収率ならびにアミノ分解
生成物収率ならびにアミノ分解
【0052】
【数1】
【0053】
および加水分解
【0054】
【数2】
【0055】
の見かけの回転率の測定は次の条件でのモデルアミド基転移反応により実施した：２５０μＭ Ｂｚ－ＡＡＹＲＨＡＡＧ－ＯＨ（アシル供与体）、５００μＭ Ｈ－ＲＨＡＫ－ＯＨ（アシル受容体）、５～１０μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃。アシル受容体についてのＫＭ値は、一定のアシル供与体濃度および様々なアシル受容体濃度でのアミノ分解の見かけの回転率の測定によって決定した。
【0056】
【表1】
【0057】
２Ｇ１０は、未変性のトリプシリガーゼと比較して（２２２μＭ）、アシル受容体に対して親和性が増加しており（２３μＭ）、１Ｃ１１はアシル受容体に対して親和性が低下していた（＞５０００μＭ）。改善した変異体はいずれも加水分解活性に対するアミノ分解活性の比率が有意に増加している（２Ｇ１０および１Ｃ１１については６倍および１３倍）。これは生成物収率の増加に反映される合成効率の改善と相関する。２Ｇ１０については、加水分解対アミノ分解比の改善はペプチド求核剤に対する親和性がより良好な結果である。これは、アミド基転移反応の脱アシル化工程におけるアシル・酵素・中間体に対する求核攻撃をめぐる水分子とペプチドの間の直接的な競合を伴う。１Ｃ１１については、加水分解対アミノ分解比の改善は加水分解活性が有意に低下した（３７分の１）結果であり、アミノ分解活性は３分の１に下がっている。２Ｇ１０および１Ｃ１１の変異を１つの変異体（ハイブリッド）において組み合わせて、異なる改善様式による合成効率に相乗効果があるかどうかを確認した。
【0058】
実施例２
これらの酵素速度論的所見に基づいて、これらの２つの変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１において同定された位置をハイブリッド変異体において組み合わせた。表２および図１に示されるように、変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１において特定された位置の組み合わせにより生じるハイブリッド変異体は両方の正の効果のメリットがある。
これらの酵素速度論的所見に基づいて、これらの２つの変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１において同定された位置をハイブリッド変異体において組み合わせた。表２および図１に示されるように、変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１において特定された位置の組み合わせにより生じるハイブリッド変異体は両方の正の効果のメリットがある。
【0059】
生成物収率ならびにアミノ分解
【0060】
【数3】
【0061】
および加水分解
【0062】
【数4】
【0063】
の見かけの回転率の測定は次の条件でのモデルアミド基転移反応により実施した：１５μＭ Ｂｚ－ＡＡＹＲＨＡＡＧ－ＯＨ（アシル供与体）、３０μＭ Ｈ－ＲＨＡＫ－ＯＨ（アシル受容体）、０．５～２．１μＭトリプシン変異体、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、Ｔ＝３０℃。
【0064】
【表2】
【0065】
ハイブリッド変異体は合成効率におけるさらなる改善を示し、これは、特に低基質濃度（１５μＭ）での有意に良好な加水分解対アミノ分解比の結果として生成物収率の改善に反映される。これは、未変性のトリプシリガーゼＩならびに改善した変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１よりも良好な合成特性を示すトリプシン変異体を生じる相乗効果があるという結論をもたらす。認識配列を変更した新規なトリプシン変異体を生成するために、トリプシリガーゼＩの合成効率を改善することが示されたアミノ酸位置を含む、トリプシリガーゼＩＩに基づく新規なトリプシンライブラリを設計した。このライブラリを、認識配列ＹＲＡＨおよびＹＲＫＨを有する２つの異なる基質を用いた改善している可能性のあるアミド基転移酵素の濃縮のためにファージディスプレイを介した選択に供した。
【0066】
実施例３
これらの調査に基づいて、これら２つの変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１の変異位置はトリプシン変異体Ｙ３９Ｈ／Ｙ５９Ｈ／Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ（トリプシリガーゼＩＩ）に基づく新規な酵素ライブラリにおいて組み合わされ、よってこのライブラリから得られる変異体が両方の正の効果のメリットを受け、したがって、さらに最適化されていることになる。これに応じて、４０、５５、９６、９７、１４３、１５１、１９０、１９２、２１４、２１９および２２１位はこのトリプシリガーゼＩＩライブラリではランダム化された一方で、変異Ｌ９９ＦはトリプシリガーゼＩライブラリＡおよびＢの両方に存在しているため固定化された。トリプシリガーゼＩにおける１４３および１５１位は亜鉛複合体の形成に関与しているため、認識配列ＹＲＨに対するヒスチジン特異性を伝達する。トリプシリガーゼＩＩでは、このヒスチジン特異性は３９および５９位にシフトし、認識配列ＹＲＡＨが生じる。よって、Ｐ２’位特異性に関与する可能性のある１４３位および１５１位はトリプシリガーゼＩＩライブラリにおけるランダム化に利用可能である。基質／求核剤に対する親和性を高める所望の効果に加えて、これは亜鉛複合体の形成に依存しない可能性ももたらし得、これは組換えタンパク質の用途指向的な修飾に関して望ましいことになる。ファージディスプレイとＥＬＩＳＡベースのスクリーニングとを用いて、表３および４に示すトリプシリガーゼＩＩ変異体が同定された。
これらの調査に基づいて、これら２つの変異体２Ｇ１０および１Ｃ１１の変異位置はトリプシン変異体Ｙ３９Ｈ／Ｙ５９Ｈ／Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ（トリプシリガーゼＩＩ）に基づく新規な酵素ライブラリにおいて組み合わされ、よってこのライブラリから得られる変異体が両方の正の効果のメリットを受け、したがって、さらに最適化されていることになる。これに応じて、４０、５５、９６、９７、１４３、１５１、１９０、１９２、２１４、２１９および２２１位はこのトリプシリガーゼＩＩライブラリではランダム化された一方で、変異Ｌ９９ＦはトリプシリガーゼＩライブラリＡおよびＢの両方に存在しているため固定化された。トリプシリガーゼＩにおける１４３および１５１位は亜鉛複合体の形成に関与しているため、認識配列ＹＲＨに対するヒスチジン特異性を伝達する。トリプシリガーゼＩＩでは、このヒスチジン特異性は３９および５９位にシフトし、認識配列ＹＲＡＨが生じる。よって、Ｐ２’位特異性に関与する可能性のある１４３位および１５１位はトリプシリガーゼＩＩライブラリにおけるランダム化に利用可能である。基質／求核剤に対する親和性を高める所望の効果に加えて、これは亜鉛複合体の形成に依存しない可能性ももたらし得、これは組換えタンパク質の用途指向的な修飾に関して望ましいことになる。ファージディスプレイとＥＬＩＳＡベースのスクリーニングとを用いて、表３および４に示すトリプシリガーゼＩＩ変異体が同定された。
【0067】
【表3】
【0068】
【表4】
【0069】
改善した生体触媒の同定のために、ファージディスプレイを介した４回目の選択の２つの変異体プールをＥＬＩＳＡベースのハイスループットスクリーニングに供した。ＹＲＡＨ基質またはＹＲＫＨ基質のいずれかで合成効率の増加を示す合計２６個のトリプシン変異体を同定することができた。２つの認識配列を明確に区別する変異体は同定されなかった。
【0070】
実施例４
ファージディスプレイ選択を介して同定された最も有望な変異体を、図２に示すように、基質特異性に関するさらなる特性決定に供した。
ファージディスプレイ選択を介して同定された最も有望な変異体を、図２に示すように、基質特異性に関するさらなる特性決定に供した。
【0071】
変異体Ａ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１はＹＲＫＫ基質配列に対して最も高い活性を示した。Ｐ３’位についての特異性において高フレキシビリティがすべての変異体で観察された。これは、最適化された変異体にとって亜鉛イオンは不要（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）であるという仮説をもたらす。さらに、変異体Ａ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１は、それらが認識配列の直交性ペアを有しているので、直交性の可能性がある生体触媒である。Ａ２Ｃ８はＬＲＫＨをアシル供与体として受容するが、これはＫ７Ｆ１１には当てはまらない。Ｋ７Ｆ１１はＷＲＡＨをアシル供与体として受容するが、これはＡ２Ｃ８には当てはまらない。
【0072】
最も有望な変異体Ａ２Ｃ８（トリプシリガーゼＩＩ＋Ｈ４０Ｆ、Ａ５５Ａ、Ｒ９６Ｅ、Ｋ９７Ｄ、Ｌ９９Ｆ、Ｎ１４３Ｅ、Ｅ１５１Ｙ、Ｓ１９０Ｖ、Ｑ１９２Ａ、Ｓ２１４Ｇ、Ｇ２１９Ｑ、Ａ２２１Ｔ）およびＫ７Ｆ１１（トリプシリガーゼＩＩ＋Ｈ４０Ｙ、Ａ５５Ａ、Ｒ９６Ｅ、Ｋ９７Ｅ、Ｌ９９Ｆ、Ｎ１４３Ｖ、Ｅ１５１Ｅ、Ｓ１９０Ａ、Ｑ１９２Ｖ、Ｓ２１４Ｇ、Ｇ２１９Ｐ、Ａ２２１Ｑ）について、金属イオンの依存性および合成効率に関するさらなる調査を実施した。
【0073】
トリプシリガーゼＩＩ、Ａ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１によって触媒されるアミド基転移反応の亜鉛依存性に関する結果を表５に示す。トリプシリガーゼＩＩならびに変異体Ａ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１に対して行われた速度論的測定の結果を表６に示す。
【0074】
【表5】
【0075】
未変性のトリプシリガーゼＩＩは亜鉛イオンへの強い依存性を示す。亜鉛イオンの非存在下ではアミノ分解反応の見かけの回転率は１２分の１に減少し、その結果、生成物収率は１８％から４％に低下する。この理由は、中心原子としての亜鉛イオンと、トリプシリガーゼＩＩの人工ヒスチジン（Ｈ３９およびＨ５９）およびペプチド局在ヒスチジンの間の複合体形成がないために求核剤に対する親和性が低いからである。Ａ２Ｃ８はＹＲＡＨおよびＹＲＫＨ配列を有する２つの基質を用いた場合には亜鉛イオンへの依存性を示さない一方、アミノ分解反応の見かけの回転率は亜鉛イオンがないことによるメリットがある。これはＹＲＫＫ基質について示されているようにＰ３’位におけるヒスチジンの置換を可能にし、これはアミノ分解反応の回転率ならびに生成物収率に対して向上した効果をさらに有する。Ｋ７Ｆ１１はＹＲＡＨ基質についてのみわずかな亜鉛イオン依存性を示す。亜鉛イオンの非存在下ではアミノ分解反応の回転率は２分の１に低下し、その結果、生成物収率が４３％から２６％に低下する。この依存性は、亜鉛イオンの非存在下においてより良好な合成性能をもたらすリジンとのＰ２’位におけるアラニンの置換によって無効化し得る。また、Ｋ７Ｆ１１はＰ３’ヒスチジンの置換を許容し、アミノ分解反応の見かけの回転率および生成物収率に対する効果の向上ももたらす。Ｋ７Ｆ１１およびＡ２Ｃ８の亜鉛依存性の欠如は、トリプシリガーゼＩＩの人工ヒスチジンは、ランダム化された位置において新規に導入された変異によって獲得される良好な合成特性に影響を与えることなく野生型トリプシンにおいて見られる未変性のアミノ酸へと逆変異させ得るという仮説をもたらす。
【0076】
【表6】
【0077】
アミド基転移酵素としての変異体Ａ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１の適合性を未変性のトリプシリガーゼＩＩと比較してさらに調査した。したがって、触媒されたアミド基転移反応についての酵素パラメータを、好ましい認識モチーフ（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｖｅ）を有するペプチド基質を用いたモデルアミド基転移反応によって決定した。さらに、モデルアミド基転移反応を高（２５０μＭ）および低（１５μＭ）基質濃度で実施して、新規な生体触媒が、治療用タンパク質の修飾にとって重要な要件である、低基質濃度でも所望の反応を効率的に触媒できるかどうかを確認した。高い基質濃度では、未変性のトリプシリガーゼＩＩはわずか０．９という低い加水分解対アミノ分解比を示し、これは１７％という中程度の生成物収率をもたらす。基質濃度を１５μＭまで低下させるとアミノ分解反応の見かけの回転率の有意な低下をもたらす一方で、脱アシル化工程は回転率が１０倍高い加水分解反応が支配的になり、生成物収率が３％と低くなる。改善した生体触媒、特に変異体Ａ２Ｃ８は合成効率の劇的な増加を示した。２５０μＭの基質濃度では、Ａ２Ｃ８は７０という優れた加水分解対アミノ分解比を有し最終的には６４．９％の生成物収率が得られ、これは、所与の反応条件（２倍過剰の求核剤）下で熱力学的に制限される理論的に到達可能な６７％の収率とほぼ一致する。低基質濃度であっても、脱アシル化工程内ではアミノ分解反応が明らかに優勢であり、加水分解反応よりも７倍高い見かけの回転率を示す。４６％の生成物収率に達しており、Ａ２Ｃ８は未変性のトリプシリガーゼＩＩよりも１４倍高い生成物収率を示す。求核性ペプチドに対する生体触媒の親和性を改善しかつ／またはその加水分解活性を減少させる変異を導入することによって、改善したアミド基転移活性が達成されると仮定した。したがって、未変性のトリプシリガーゼＩＩおよび変異体Ａ２Ｃ８両方のパラメータを説明する対応する実験データを測定した。これらのデータの要約は表７に示されており、求核性ペプチドに対する酵素のＫＭ値および求核性ペプチドの非存在下での加水分解の回転率を含む。
【0078】
求核性ペプチドに対する改善した親和性に関する仮説が未変性のトリプシリガーゼＩＩに既に当てはまっているという１つ目の指標は、トリプシリガーゼＩＩによって触媒されるアミド基転移反応の亜鉛依存性の研究において観察された。トリプシリガーゼＩＩは、亜鉛イオンが存在しないとアミノ分解反応の見かけの回転率の有意な低下および、より重要なことに、生成物収率が４分の１まで顕著に低下するため、亜鉛イオンへの強い依存性を有することが示された。上記のように、求核性ペプチドに対する酵素親和性の低下理由は、亜鉛イオンによって媒介されるトリプシリガーゼＩＩ（Ｈ３９およびＨ５９）の人工ヒスチジンとＰ３’位のペプチド局在ヒスチジンとの間の複合体形成の欠如である。
【0079】
トリプシリガーゼＩＩについての親和性に対するこの亜鉛依存性の影響は、亜鉛イオンの存在下または非存在下での求核性ペプチドに対するＫＭ値の測定によって確認された。亜鉛イオンの存在下では、求核性ペプチドに対するＫＭ値は１４３μＭである。亜鉛イオンの非存在下では、求核性ペプチドに対するＫＭ値は１６３０μＭまで１１倍増加する。同一の基質および反応条件を用いると、変異体Ａ２Ｃ８は亜鉛イオンの存在に関係なく５９．７％の生成物収率に達する。この向上したアミド基転移反応についての重要な要素は、求核性ペプチドに対するさらに改善した酵素親和性に基づいている。亜鉛イオンの非存在下では、Ａ２Ｃ８は求核性ペプチドに対するＫＭ値が１７．６μＭである。未変性のトリプシリガーゼＩＩと比較して、これは、亜鉛イオンの存在下または非存在下において求核性ペプチドに対する酵素親和性のそれぞれ８倍および９２倍の改善に対応している。
【0080】
Ａ２Ｃ８の向上したアミド基転移反応のさらなる重要な要素は、未変性のトリプシリガーゼＩＩと比較した、その低下した固有の加水分解活性による。求核性ペプチドの非存在下では、変異体Ａ２Ｃ８は加水分解反応の回転率が８６．６ｍｋａｔ／ｍｏｌである一方で、トリプシリガーゼＩＩの回転率は６０２．１ｍｋａｔ／ｍｏｌであると測定された。酵素の加水分解活性におけるこの７分の１の低下は、合成反応の生成物収率を決定する脱アシル化工程内で加水分解がアミノ分解と競合するので、重要なパラメータである。要約すると、我々は、Ａ２Ｃ８の向上したアミド基転移挙動が、求核性ペプチドに対する酵素親和性の改善および固有の加水分解活性の低下の原因であることを示した。
【0081】
Ａ２Ｃ８のこれらの２つの特徴は、我々の革新的アプローチにおいてトリプシリガーゼＩＩに導入された新規な変異に直接的に関連している。
【0082】
【表7】
【0083】
実施例５
革新的な選択によって導入されたＡ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１の変異の活性化効果を実証すべく、次の工程において、トリプシリガーゼＩＩに由来する変異Ｙ３９Ｈ、Ｙ５９Ｈ、Ｋ６０ＥおよびＤ１８９Ｋを野生型トリプシンに存在するアミノ酸残基へと徐々に逆変異させ、合成可能性を分析した。これらのデータは、トリプシリガーゼＩＩ（Ｙ３９Ｈ／Ｙ５９Ｈ／Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ）またはトリプシリガーゼＩ（Ｋ６０Ｅ／Ｎ１４３Ｈ／Ｅ１５１Ｈ／Ｄ１８９Ｋ）に起因する変異がない場合であっても、本特許によって保護されるべき位置が野生型トリプシンにおいてアミド基転移活性を誘導するのに十分であることを示した。
革新的な選択によって導入されたＡ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１の変異の活性化効果を実証すべく、次の工程において、トリプシリガーゼＩＩに由来する変異Ｙ３９Ｈ、Ｙ５９Ｈ、Ｋ６０ＥおよびＤ１８９Ｋを野生型トリプシンに存在するアミノ酸残基へと徐々に逆変異させ、合成可能性を分析した。これらのデータは、トリプシリガーゼＩＩ（Ｙ３９Ｈ／Ｙ５９Ｈ／Ｋ６０Ｅ／Ｄ１８９Ｋ）またはトリプシリガーゼＩ（Ｋ６０Ｅ／Ｎ１４３Ｈ／Ｅ１５１Ｈ／Ｄ１８９Ｋ）に起因する変異がない場合であっても、本特許によって保護されるべき位置が野生型トリプシンにおいてアミド基転移活性を誘導するのに十分であることを示した。
【0084】
第１工程として、Ａ２Ｃ８中の３９および５９位における人工ヒスチジンのチロシン（これらの位置において野生型トリプシンで見られ得る）への逆変異に対する影響をモデルアミド基転移反応によって調べた。３９または５９位に単一の逆変異を有する変異体（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９ＹおよびＡ２Ｃ８＿Ｈ５９Ｙ）ならびに３９および５９位の両方に変異を有する変異体（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ）を調査した（図３）。
【0085】
３９または５９位に単一の逆変異を有する変異体（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９ＹおよびＡ２Ｃ８＿Ｈ５９Ｙ）ならびに３９および５９位に変異を有する変異体（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ）は変異体Ａ２Ｃ８と同等の合成挙動を示した（図３を参照されたい）。これは、３９および５９位における野生型変異はＡ２Ｃ８の合成効率に影響を与えるものではなく、ランダム化された位置において新たに導入された変異によってＡ２Ｃ８の良好な合成特性が得られたことを示しているという結論をもたらす。
【0086】
同定された変異が野生型タンパク質分解酵素トリプシンをアミド基転移酵素へ変換するのに十分であるかどうかをさらに調査するために、さらに１８９および６０位における２つのトリプシリガーゼＩＩ関連変異を野生型アミノ酸まで逆変異させた。１８９および６０位における逆変異は単一の逆変異（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０ＫおよびＡ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄ）ならびに二重変異（Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄ）として変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙに導入した。第１工程では、１８９位がトリプシンのＳ１特異性に影響を与えることが公知であり、６０位がＳ１’特異性に影響を与えることが公知であるため、すべての変異体について基質特異性を調査した（図４）。
【0087】
変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ内の６０位における逆変異は基質のＰ１’位におけるフレキシビリティを高め、メチオニンまたはアラニンの受容も可能にする。変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄ内の１８９位における逆変異は基質のＰ１位におけるフレキシビリティを高め、アルギニンの受容も可能にし、これは野生型トリプシンの特異性と相関する。４つすべての逆変異を有する変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄは基質のＰ１’位におけるＡ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０ＫおよびＰ１位のＡ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｅのフレキシビリティを組み合わせた特異性プロファイルを示す。
【0088】
次いでアミノ分解反応についての見かけの回転率が最も高い３つの基質を変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄの合成挙動を調査するために用いた。図５に、様々なペプチド基質を用いた変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄによって触媒されるアミド基転移反応についての生成物形成の時間的経過を示す。
【0089】
図５に示すように、変異体Ａ２Ｃ８＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｅ６０Ｋ／Ｋ１８９Ｄは認識配列ＹＲＲＨ、ＹＭＫＨおよびＲＭＫＨを有する基質とのアミド基転移生成物の形成を効率的に触媒することが可能である。認識配列ＹＲＲＨを有する基質で観察し得る最も高い生成物収率は３８％であった。Ａ２Ｃ８は同等の条件では５９％の生成物収率に達する。野生型トリプシンについては生成物の形成はほとんど観察できなかった。これは、新規に導入した変異が野生型タンパク質分解酵素トリプシンをアミド基転移酵素に変換するのに十分であるという以前の仮説を裏付けている。
【0090】
これらの変異が求核性ペプチドに対する酵素親和性の改善および固有の加水分解活性の低下に関連しているため、求核性ペプチドに対する酵素親和性の改善に影響を及ぼしかつ／または固有の加水分解活性を低下させるアミノ酸交換の導入によってすべてのトリプシン種がアミド基転移酵素に概して変換され得ると結論付けることができた。
【0091】
実施例６
続いて、２つのトリプシリガーゼＩＩ変異体の基質特異性のバリエーションを利用してＦａｂフラグメントの二重修飾を調査した。
続いて、２つのトリプシリガーゼＩＩ変異体の基質特異性のバリエーションを利用してＦａｂフラグメントの二重修飾を調査した。
【0092】
興味深いことに、変異体Ｋ７Ｆ１１内の３９、５９、および１８９位におけるトリプシリガーゼＩＩ関連変異（変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄが得られる）の逆変異はＰ１位において交互（ａｌｔｅｒｎａｔｅｄ）の特異性を有するアミド基転移酵素をもたらす。
【0093】
Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄは認識配列ＲＲＫＨに対して特異的活性が高い一方で、少なくともＡ２Ｃ８およびＫ７Ｆ１１によって受容される芳香族または脂肪族置換はアミノ分解反応の見かけの回転率の有意な低下をもたらす。
【0094】
これは、変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄが、ＹＲＡＨのようなＡ２Ｃ８関連認識配列の存在下であっても、認識配列ＲＲＫＨを効率的に識別できることを意味する。
【0095】
２つの異なる修飾部位に対するタンパク質の直交二重修飾の可能性を実証すべく、Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂフラグメントの軽鎖のＣ末端にＲＲＫＨモチーフを、重鎖のＣ末端にＹＲＡＨモチーフを結合した（図６を参照されたい）。
【0096】
続いて、逐次的な二重修飾を実施した：
第１工程では、軽鎖を、変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄによって触媒される、カルボキシフルオレセイン含有求核剤で修飾した。質量分析による解析によって軽鎖のＣ末端にほぼ集中して修飾があることが明らかになった。酵素と残りの求核剤（ＲＫＨＡＫ（ＣＦ）－ＯＨ）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーで除去した。
第１工程では、軽鎖を、変異体Ｋ７Ｆ１１＿Ｈ３９Ｙ／Ｈ５９Ｙ／Ｋ１８９Ｄによって触媒される、カルボキシフルオレセイン含有求核剤で修飾した。質量分析による解析によって軽鎖のＣ末端にほぼ集中して修飾があることが明らかになった。酵素と残りの求核剤（ＲＫＨＡＫ（ＣＦ）－ＯＨ）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーで除去した。
【0097】
第２工程では、変異体Ａ２Ｃ８によって触媒されたＤＭ１含有求核剤で重鎖を修飾した。質量分析によって重鎖のＣ末端における集中的な修飾を確認することができた。二重標識されたＦａｂフラグメントの収率は質量分析によって推定されるように約７５％であった。
【0098】
直交二重修飾の文脈において、「直交」という用語は、有意な交差反応性を伴わない同一起源の２つの異なる生体触媒による２つの異なる認識配列に対するポリペプチドの修飾を指すが、認識配列のＮおよびＣ末端局在化を含む以下の修飾手法が可能であった（表８を参照されたい）。
【0099】
【表8】
【0100】
関連するトリプシリガーゼ変異体またはライブラリについての最も重要な鍵となるデータを以下の表９にまとめる：
【0101】
【表9-1】
【0102】
【表9-2】
【0103】
【表9-3】
【0104】
以下の配列が本明細書に開示される：
【0105】
【表10】
【0106】
さらに以下のポリペプチドが開示される：
【0107】
【表11-1】
【0108】
【表11-2】
【0109】
【表11-3】
【0110】
【表11-4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】