特表 2022-514954 キルスイッチを有するドナーＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-16

(54)【発明の名称】キルスイッチを有するドナーＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20220208BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220208BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220208BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220208BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220208BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220208BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220208BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220208BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220208BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20220208BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20220208BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/113 130Z

C12N5/10

C12N15/09 110

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K35/17 Z

A61K35/12

A61K35/28

A61K45/00

A61K31/365

A61K31/519

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021536370

(86)(22)【出願日】2019-12-23

(85)【翻訳文提出日】2021-08-12

(86)【国際出願番号】 US2019068239

(87)【国際公開番号】W WO2020139800

(87)【国際公開日】2020-07-02

(31)【優先権主張番号】62/784,494

(32)【優先日】2018-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500501443

【氏名又は名称】シーエスエル・ベーリング・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ミン・ヤン

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・ウォルター・アルマ

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・フィリップ・サイモンズ

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・エス・バートレット

(72)【発明者】

【氏名】チー－リン・リー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA19

4C084AA22

4C084NA05

4C084NA06

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC202

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA17

4C086CB09

4C086GA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA06

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA06

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

開示した方法は、一般にＴ細胞治療の副反応を防止する、処置する、抑制する、制御するまたはそうでなければ軽減する工程を対象とし、Ｔ細胞治療は、免疫再構築を加速し、移植片対悪性効果を誘導し、および／または腫瘍細胞を標的化するように設計する。いくつかの実施形態では、本開示は、第１の核酸配列に作動可能に連結する第１の発現制御配列を含む発現ベクターを提供し、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、該第１の核酸配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、該ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、前記発現ベクター。

【請求項2】

ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１に記載の発現ベクター。

【請求項3】

ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１に記載の発現ベクター。

【請求項4】

ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの核酸配列を有する、請求項１に記載の発現ベクター。

【請求項5】

第１の発現制御配列はＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項6】

ＰｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋプロモーター、変異型７ｓｋプロモーター、Ｈ１プロモーター、またはＥＦ１ａプロモーターである、請求項５に記載の発現ベクター。

【請求項7】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項8】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項9】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項10】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項11】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項12】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列を有する、請求項６に記載の発現ベクター。

【請求項13】

第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、該第１の核酸配列は、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、該ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９０％配列同一性を有する、前記発現ベクター。

【請求項14】

ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１３に記載の発現ベクター。

【請求項15】

ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する、請求項１３に記載の発現ベクター。

【請求項16】

ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれかの核酸配列を有する、請求項１３に記載の発現ベクター。

【請求項17】

第１の発現制御配列はＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項18】

ＰｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋプロモーター、変異型７ｓｋプロモーター、Ｈ１プロモーター、またはＥＦ１ａプロモーターである、請求項１７に記載の発現ベクター。

【請求項19】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項20】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項21】

７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項22】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項23】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項24】

変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。

【請求項25】

請求項１～２４に記載の発現ベクターのいずれか１つによって形質導入した宿主細胞であって、該宿主細胞は形質導入後に実質的にＨＰＲＴを欠損する、前記宿主細胞。

【請求項26】

Ｔ細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

Ｔ細胞は、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアント、およびガンマデルタＴ細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。

【請求項28】

リンパ球である、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項29】

請求項２５～２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む医薬組成物であって、該宿主細胞は薬学的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化されている、前記医薬組成物。

【請求項30】

ＨＰＲＴを欠損した細胞を生成する方法であって：
請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによって宿主細胞の集団を形質導入する工程；および
形質導入した宿主細胞の集団を少なくともプリン類似体と接触させることによってＨＰＲＴを欠損した細胞を正に選択する工程
を含む前記方法。

【請求項31】

プリン類似体は、６ＴＧおよび６－メルカプトプリンからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：
ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、前記工程；
実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；
造血幹細胞（ＨＳＣ）移植片を患者に投与する工程；
ＨＳＣ移植片の投与後、治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程；および
場合により、副反応が生じた場合、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与する工程
を含む前記方法。

【請求項33】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはミコフェノール酸（ＭＰＡ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

プリン類似体は６－チオグアニン（６ＴＧ）である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

正の選択は、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体およびアロプリノールと接触させる工程を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：
ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、前記工程；
実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；および
ＨＳＣ移植片の投与と同時にまたはＨＳＣ移植片の投与後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程
を含む前記方法。

【請求項43】

１またはそれ以上の用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

正の選択は、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

その処置を必要とする患者において血液のがんを処置する方法であって：
ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、前記工程；
実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；
ＨＳＣ移植片を患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導する工程；および
残存病変または疾患再発の検出後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程
を含む前記方法。

【請求項54】

少なくとも１用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与し、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制する工程をさらに含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む、請求項５３～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：
ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルをドナーサンプル内のリンパ球にトランスフェクトすることによって生成される、前記工程；
実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；
ＨＳＣ移植片を患者に投与する工程；
ＨＳＣ移植片の投与後、治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程
を含む前記方法。

【請求項65】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質をさらに含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

１またはそれ以上の用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む、請求項６４～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む、請求項６４～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項82】

送達ビヒクルはナノカプセルである、請求項６４に記載の方法。

【請求項83】

送達ビヒクルは、１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである、請求項６４に記載の方法。

【請求項84】

その処置を必要とする患者において血液のがんを処置する方法であって：
ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルをドナーサンプル内のリンパ球にトランスフェクトすることによって生成される、前記工程；
実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；
ＨＳＣ移植片を患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導する工程；および
残存病変または疾患再発の検出後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程
を含む前記方法。

【請求項85】

少なくとも１用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与し、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制する工程をさらに含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。

【請求項87】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項95】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質をさらに含む、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である、請求項９９に記載の方法。

【請求項102】

送達ビヒクルはナノカプセルである、請求項８４～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

送達ビヒクルは、１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである、請求項８４～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

ＨＰＲＴを欠損したリンパ球によって患者を処置する方法であって：
（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離する工程；
（ｂ）単離したリンパ球を請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによって形質導入する工程；
（ｃ）形質導入し単離したリンパ球を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供する工程；
（ｄ）造血幹細胞移植後に治療有効量の改変したリンパ球の調製物を患者に投与する工程；
（ｅ）場合により、患者において移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の発生後にジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与する工程
を含む前記方法。

【請求項105】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤はプリン類似体を含む、請求項１０４または１０５に記載の方法。

【請求項107】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

ＨＰＲＴを欠損したリンパ球によって患者を処置する方法であって：
（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離する工程；
（ｂ）単離したリンパ球を、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルと接触させ、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を提供する工程；
（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供する工程；
（ｄ）造血幹細胞移植後に治療有効量の改変したリンパ球の調製物を患者に投与する工程；および
（ｅ）場合により、患者において移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の発生後にジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与する工程
を含む前記方法。

【請求項110】

ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤はプリン類似体を含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。

【請求項112】

プリン類似体は６ＴＧである、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む、請求項１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む、請求項１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質をさらに含む、請求項１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項119】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項121】

送達ビヒクルはナノカプセルである、請求項１０９～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

送達ビヒクルは、１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである、請求項１０９～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、該改変したリンパ球の調製物は：
（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；
（ｂ）単離したリンパ球を請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターによって形質導入すること；および
（ｃ）形質導入し単離したリンパ球を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供すること
によって生成される前記使用。

【請求項124】

造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、該改変したリンパ球の調製物は：
（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；
（ｂ）単離したリンパ球を、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルと接触させ、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を提供すること；および
（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供すること
によって生成される、前記使用。

【請求項125】

医薬組成物であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の発現ベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、前記医薬組成物。

【請求項126】

キットであって、
（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡ；および
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を含む、前記キット。

【請求項127】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される、請求項１２６に記載のキット。

【請求項128】

ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１２６または１２７に記載のキット。

【請求項129】

ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９８％配列同一性を有する、請求項１２６または１２７に記載のキット。

【請求項130】

キットであって：
（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つを含むガイドＲＮＡ；および
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を含む、前記キット。

【請求項131】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される、請求項１３０に記載のキット。

【請求項132】

ナノカプセルであって、
（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡ；および
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を含む、前記ナノカプセル。

【請求項133】

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される、請求項１３２に記載のナノカプセル。

【請求項134】

ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１３２または１３３に記載のナノカプセル。

【請求項135】

ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９８％配列同一性を有する、請求項１３２または１３３に記載のナノカプセル。

【請求項136】

少なくとも１つの標的化部分を含む、請求項１３２～１３５のいずれか一項に記載のナノカプセル。

【請求項137】

ポリマーシェルを含む、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載のナノカプセル。

【請求項138】

ポリマーナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性のモノマー、およびクロスリンカーを含む、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載のナノカプセル。

【請求項139】

請求項１３２～１３８のいずれか一項に記載のナノカプセルをトランスフェクトされた宿主細胞。

【請求項140】

造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、該改変したリンパ球の調製物は：
（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；
（ｂ）単離したリンパ球を請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載のナノカプセルと接触させること；および
（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供すること
によって生成される、前記使用。

【請求項141】

請求項１～２６の発現ベクターのいずれか１つをカプセル化しているナノカプセル。

【請求項142】

ポリマーシェルを含む、請求項１４１に記載のナノカプセル。

【請求項143】

ポリマーナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性のモノマー、およびクロスリンカーを含む、請求項１４１に記載のナノカプセル。

【請求項144】

第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、該第１の核酸配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、該ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有し、ここで該発現ベクターは発現のための別の導入遺伝子を含まない、前記発現ベクター。

【請求項145】

第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、該第１の核酸配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、該ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有し、ここで、該ｓｈＲＮＡをコードする該第１の核酸配列は、発現のための唯一の配列である、前記発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本開示は、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる、２０１８年１２月２３日に出願された米国仮出願第６２／７８４，４９４号の出願日の利点を主張する。

【0002】

本開示は、一般に、遺伝子治療、特に、造血幹細胞および／またはリンパ球、例えば発現ベクターによって形質導入したＴ細胞に関する。本開示は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによる遺伝子編集にも関する。

【背景技術】

【0003】

同種異系造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）は、鎌状赤血球症のような血液悪性腫瘍および血液細胞の遺伝性疾患のための根治療法である。ａｌｌｏ－ＨＳＣＴに関連するチャレンジは、ドナー細胞の適切な供給源の同定を含む。適合する血縁ドナー（ＭＲＤ）および適合する非血縁ドナー（ＭＵＤ）は、関連するリスクのより低いＨＳＣの供給源を提供するが、これらのドナーの利用可能性は、ほとんどみんながすぐにドナーを得られるハプロタイプ一致のドナー（典型的には親または兄弟）の利用可能性と比較して著しく低減される。しかしながら、ａｌｌｏ－ＨＳＣＴのためのハプロタイプ一致のドナーの使用に関連する合併症があり、最も重要なのは移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生の可能性であり、これはａｌｌｏ－ＨＳＣＴの成功への障害となったままである。ａｌｌｏ－ＨＳＣＴを受ける患者のおよそ半数が処置を必要とするＧｖＨＤを発生し、患者の１０％より多くがそのために死亡し得ると考えられる。ＧｖＨＤは、胃腸管、皮膚、粘膜、肝臓および肺を含む複数の臓器系が関与する不均一な症状を示す。免疫抑制剤は、ＧｖＨＤを防止および低減するための中心戦略として寄与してきた。近年、コルチコステロイドによるＧｖＨＤの標準的な処置は、多くの患者がステロイド難治性疾患を発症するため、成功が非常に限定されている。急性および慢性ＧｖＨＤの処置における最良の第二選択および第三選択アプローチを含む明確なコンセンサスはない（非特許文献１を参照）。

【0004】

ＧｖＨＤ発生のリスクを低減するため、ハプロタイプ一致の移植は、Ｔ細胞を枯渇させることが多い。しかしながら、ドナーＴ細胞の欠如は、移植レシピエントを免疫無防備状態にし、移植した患者において致死性の感染症の割合の増加をもたらし得る。さらに、より近年の研究では、ドナーＴ細胞の存在が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞生着に必要な期間の延長（２年まで）のためのＴ細胞免疫を提供することに加え、ドナー細胞生着を著しく改善し、それによりＨＳＣＴを繰り返す潜在的必要性を減らすことを示している。

【0005】

ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ悪性腫瘍設定では、ドナーＴ細胞の存在によって与えられる利点は、抗腫瘍活性、または移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果（移植片対白血病－ＧＶＬとしても公知）を含む。ＨＳＣＴ後の再発後の疾患の緩和をもたらすドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）の最初の報告は、１９９０年の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する患者においてである。ＤＬＩの前に、ＨＳＣＴ後に再発する患者はその疾患に屈してしまったようであり、わずかな患者しか２回目の移植を受けなかった。ＣＭＬにおける成功の後、次にＤＬＩは急性白血病および骨髄腫のような他の血液の悪性腫瘍に利用された。したがって、重要なチャレンジは、ＧＶＴ効果の適切なバランスに関連し、ＧＶＴ効果は、持続的な緩和を可能にする要因であるが、ＧｖＨＤに関連する毒性の要因でもある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｊａｍｉｌ，Ｍ．Ｏ．＆Ｍｉｎｅｉｓｈｉ，Ｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ（２０１５年）１０１：４５２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ヒト幹細胞を改変する遺伝子治療戦略は、多くのヒトの疾患の治療にかなり有望である。ドナーＴ細胞の積極的な貢献を同時に維持しながらＧｖＨＤを最小にするアプローチが開発されるまで、ａｌｌｏ－ＨＳＣＴの最大の治療可能性は実現しないであろうと考えられる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示の第１の態様には、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する、発現ベクターがある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの核酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、第１の発現制御配列はＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋプロモーター、変異型７ｓｋプロモーター、Ｈ１プロモーター、またはＥＦ１ａプロモーターである。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列を含む。

【0010】

本開示の第２の態様には、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９０％配列同一性を有する、発現ベクターがある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号８、９、１０、および１１のいずれか１つの核酸配列を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、第１の発現制御配列はＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩＩプロモーターは７ｓｋプロモーター、変異型７ｓｋプロモーター、Ｈ１プロモーター、またはＥＦ１ａプロモーターである。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９７％配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、変異型７ｓｋプロモーターは配列番号１５の核酸配列を含む。

【0012】

本開示の第３の態様には、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターによって形質導入した宿主細胞であって、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する、宿主細胞がある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターによる形質導入後に実質的にＨＰＲＴを欠損する。いくつかの実施形態では、宿主細胞はリンパ球、例えばＴ細胞である。

【0013】

本開示の第４の態様には、宿主細胞を含む医薬組成物であって、宿主細胞は薬学的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化され、宿主細胞は、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターによって形質導入されており、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、医薬組成物がある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターによる形質導入後に実質的にＨＰＲＴを欠損する。いくつかの実施形態では、宿主細胞はリンパ球、例えばＴ細胞である。

【0014】

本開示の第５の態様には、実質的にＨＰＲＴを欠損した細胞を生成する方法であって：発現ベクターによって宿主細胞の集団を形質導入する工程、および形質導入した宿主細胞の集団を少なくともプリン類似体と接触させることによってＨＰＲＴを欠損した細胞を正に選択する工程を含む方法がある。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６－チオグアニン（６ＴＧ）および６－メルカプトプリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0015】

本開示の第６の態様には、副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、工程；実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；ＨＳＣ移植片を患者に投与する工程、ＨＳＣ移植片の投与後、治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程；および、場合により、副反応が生じた場合、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与する工程を含む方法がある。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはミコフェノール酸（ＭＰＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。

【0017】

いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

【0018】

本開示の第７の態様には、副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、工程；実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；およびＨＳＣ移植片の投与と同時にまたはＨＳＣ移植片の投与後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程を含む方法がある。いくつかの実施形態では、方法は、１またはそれ以上の用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

【0020】

本開示の第８の態様には、その処置を必要とする患者において血液のがんを処置する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、発現ベクターによってドナーサンプル内のリンパ球を形質導入することによって生成される、工程；実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；ＨＳＣ移植片を患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導する工程；および残存病変または疾患再発の検出後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程を含む方法がある。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与し、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

【0022】

本開示の第９の態様には、副反応を軽減しながら、その処置を必要とする患者にリンパ球輸注の利点を提供する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルをドナーサンプル内のリンパ球にトランスフェクトすることによって生成される、工程；実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；ＨＳＣ移植片を患者に投与する工程；ＨＳＣ移植片の投与後、治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程；および、場合により、副反応が生じた場合、ＭＴＸを投与する工程を含む方法がある。

【0023】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有するガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルはナノカプセルである。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである。

【0024】

いくつかの実施形態では、方法は、１またはそれ以上の用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

【0026】

本開示の第十の態様には、その処置を必要とする患者において血液のがんを処置する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成する工程であって、実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球は、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルをドナーサンプル内のリンパ球にトランスフェクトすることによって生成される、工程；実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択し、改変したリンパ球の集団を提供する工程；ＨＳＣ移植片を患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導する工程；および残存病変または疾患再発の検出後に治療有効量の改変したリンパ球の集団を患者に投与する工程を含む方法がある。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有するガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ナノカプセルである。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである。

【0028】

いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与し、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成した実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をプリン類似体とアロプリノールの両方と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、複数用量の改変したリンパ球が患者に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球の総投与量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約７３０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

【0029】

本開示の第１１の態様には、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損したリンパ球によって患者を処置する方法であって：（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離する工程；（ｂ）単離したリンパ球を発現ベクターによって形質導入する工程；（ｃ）形質導入し、単離したリンパ球を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供する工程；（ｄ）造血幹細胞移植後に治療有効量の改変したリンパ球の調製物を患者に投与する工程；および（ｅ）場合により、患者において移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の発生後にメトトレキサートまたはミコフェノール酸を投与する工程を含む方法がある。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤は、プリン類似体を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。

【0031】

本開示の第１２の態様には、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球によって患者を処置する方法であって：（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離する工程；（ｂ）単離したリンパ球を、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルと接触させ、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を提供する工程；（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供する工程；（ｄ）造血幹細胞移植後に治療有効量の改変したリンパ球の調製物を患者に投与する工程；および（ｅ）場合により、患者において移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の発生後にジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与する工程を含む方法がある。

【0032】

いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤はＭＴＸまたはＭＰＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤は、プリン類似体を含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、６ＴＧの量は約１～約１５μｇ／ｍＬの間の範囲である。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分は、配列番号２５～３９からなる群から選択される核酸配列を標的化するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分はＣａｓタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ａタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質はＣａｓ１２ｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルはナノカプセルである。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは１つまたはそれ以上の標的化部分を含むナノカプセルである。

【0034】

本開示の第１３の態様には、造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、改変したリンパ球の調製物は：（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；（ｂ）単離したリンパ球を発現ベクターによって形質導入すること；および（ｃ）形質導入し、単離したリンパ球を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供することによって生成される、使用がある。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、および５～１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0035】

本開示の第１４の態様には、造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、改変したリンパ球の調製物は：（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；（ｂ）単離したリンパ球を、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させた成分を含む送達ビヒクルと接触させ、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を提供すること；および（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供することによって生成される、使用がある。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルはナノカプセルである。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有するｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質、またはＣａｓ１２ｂタンパク質）を含む。

【0036】

本開示の第１５の態様には、医薬組成物であって、（ｉ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含むレンチウイルス発現ベクターであって、第１の核酸配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここでｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、レンチウイルス発現ベクター；ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物がある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれかの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。

【0037】

本開示の第１６の態様には、キットであって、（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するガイドＲＮＡ；および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を含む、キットがある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１２ｂである。

【0038】

本開示の第１７の態様には、ナノカプセルであって、（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡ；および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を含む、ナノカプセルがある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは少なくとも１つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルはポリマーシェルを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性のモノマー、およびクロスリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、イミダゾール基を有するモノマーを含まない。

【0039】

本開示の第１８の態様には、ナノカプセルをトランスフェクトされた宿主細胞であって、ナノカプセルは、（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡ；および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を含む、宿主細胞がある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９７％配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２５～３９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは少なくとも１つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルはポリマーシェルを含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性のモノマー、およびクロスリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、イミダゾール基を有するモノマーを含まない。

【0040】

本開示の第１９の態様には、造血幹細胞移植後に、その処置を必要とする対象にリンパ球輸注の利点を提供するための改変したリンパ球の調製物の使用であって、改変したリンパ球の調製物は：（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離すること；（ｂ）単離したリンパ球をナノカプセルと接触させることによって生成し、ナノカプセルは、（ｉ）配列番号２５～３９のいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡ；および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を含み；ならびに（ｃ）ＨＰＲＴを欠損したリンパ球の集団を、ＨＰＲＴを欠損したリンパ球を正に選択する薬剤に曝露し、改変したリンパ球の調製物を提供することによって生成される、使用がある。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは配列番号２５～３９のいずれか１つの配列を含む。

【0041】

本開示の第２０の態様には、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターを含むナノカプセルであって、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する、ナノカプセルがある。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、少なくとも１つの標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、ポリマーシェルを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性のモノマー、およびクロスリンカーを含む。

【0042】

他の「オフスイッチ」法と比較して、本開示の方法に従って処置した造血幹細胞（ＨＳＣ）（Ｔ細胞を含む）は、「自殺遺伝子」を発現する必要がない。むしろ、本開示の方法は、血液の細胞に望ましくない効果を引き起こさない内在性遺伝子のノックダウンまたはノックアウト、および全体的に優れた結果を提供する。出願者は、本明細書に記載の方法に従って、遺伝子改変した細胞、ＨＳＣ（またはリンパ球）の集団の所与のｅｘ ｖｉｖｏでの６ＴＧケモセレクションは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ））を投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の定量的除去を可能にする対象への投与のために提供されることを提出する。さらに、本開示の方法に記載の処置は、「キルスイッチ」が組み込まれていない治療より、ドナーＴ細胞の潜在的な高用量およびより積極的な治療を提供する。さらに、改変したＴ細胞の数を調節するためのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤の使用は、ＧｖＨＤを処置する既存の方法と臨床的に両立でき、すなわち、ＭＴＸは、本開示の改変したＴ細胞を受けない患者においてＧｖＨＤ症候群の緩和を助けるために使用される。

【0043】

出願者は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子によって形質導入したドナーリンパ球と比較して、本開示の方法に記載の処置は、細胞の除去をもたらし、および将来的な輸注の可能性を除外する免疫原性を含む制限を軽減する（Ｚｈｏｕ Ｘ、Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＫ、“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｔ－Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ－９ ｇｅｎｅ、”Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１６年１１月；４４（１１）：１０１３～１０１９頁参照、その開示を参照によってその全体を本明細書に組み入れる）ことをさらに提出する。また、出願者は、本方法が、ＨＳＶ－ｔｋドナーリンパ球の望まないクリアランスをもたらさない、ＧｖＨＤ以外の同時臨床条件のためのガンシクロビルの使用を可能にすることを提出する（例えば、ガンシクロビルは、近年記載した方法が利用される場合、ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ設定に一般的であるコントロールＣＭＶ感染症に投与する工程から除外されない）。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】Ｔ細胞を、ＨＰＲＴをノックダウンするように適合させた発現ベクターまたはＨＰＲＴをノックアウトするように構成されたペイロード（例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡ）を含むナノカプセルに接触させる一般的な方法を示す図である。図は、改変したＴ細胞を用いた処置の副反応が観察されるイベントでのような、キルスイッチが活性化されることをさらに図解している。

【図2】ｓｈ７３４の二次構造および理論的一次ＤＩＣＥＲ切断部位（矢印）を示す図である（配列番号１も参照）。二次構造は、約－３０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌのＭＦＥ値を有する。

【図3】ｓｈ６１６についての二次ＲＮＡ構造および最小自由エネルギー（ｄＧ）を示す図である（配列番号５も参照）。

【図4】ｓｈ２１１についての二次ＲＮＡ構造および最小自由エネルギー（ｄＧ）を示す図である（配列番号６も参照）。

【図5】ｓｈ７３４の改変バージョン（ｓｈ７３４．１）を示す図である（配列番号７も参照）。二次構造は、約－３６．１６ｋｃａｌ／ｍｏｌのＭＦＥ値を有する。

【図6】人工ｍｉＲＮＡ７３４（１１１ｎｔ）の新規設計図を示す図である。５’および３’ＤＲＯＳＨＡ標的部位ならびに５’および３’ＤＩＣＥＲ切断部位は二次構造中の矢印で示されている（配列番号８も参照）。

【図7】人工ｍｉＲＮＡ２１１（１１１ｎｔ）の新規設計図を示す図である（配列番号９も参照）。

【図8】天然のｍｉＲＮＡ １６－２構造に由来する第３世代のｍｉＲＮＡスキャフォールドである、ｍｉＲＮＡ－３Ｇ骨格に包埋しているｓｈ７３４を示す図である（配列番号１１も参照）。

【図9】天然のｍｉＲＮＡ １６－２構造に由来する第３世代のｍｉＲＮＡスキャフォールドである、ｍｉＲＮＡ－３Ｇ骨格に包埋しているｓｈ２１１を示す図である（配列番号１０も参照）。

【図10】ヒト７ｓｋプロモーター突然変異を示す図である。ＴＡＴＡボックス（高く薄いボックス）と比べて７ｓｋプロモーターでのシス遠位配列エンハンサー（ＤＳＥ）および近位配列エンハンサー（ＰＳＥ）エレメント（長く広いボックス）中に導入された突然変異（矢印）および欠失が図解されている。これらの突然変異および他の物は、Ｂｏｙｄ，Ｄ．Ｃ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｒｓｔｅｒ，Ｔ．＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｅｎｓｕｒｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ７ＳＫ Ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５３、６７７～６９０頁（１９９５）により記載されており、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み込む。

【図11】改変したＴ細胞を調製しその改変したＴ細胞をそれを必要とする患者に投与する工程を説明するフローチャートである。

【図12A】６ＴＧを用いた改変した細胞の首尾よくいったｅｘ ｖｉｖｏ選択および増殖（ＬＶ形質導入によるＨＰＲＴノックダウンまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ナノカプセルによるノックアウト）を描いている図である。これら最初の予備実験はＫ５６２細胞において実施した（ヒト不死化骨髄性白血病株）（ｒｓｈ７－ＧＦＰ＝ＨＰＲＴをノックダウンする短鎖ヘアピンからＨＰＲＴ／ＧＦＰレンチウイルスベクター；ナノＲＮＰ－ＨＰＲＴ＝ＨＰＲＴをノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質ナノカプセル）。図１２Ａは、ＭＯＩ＝５（感染効率）＝５でｓｈＨＰＲＴ－ＧＦＰベクターを用いて形質導入されたＫ５６２細胞は、６ＴＧを用いてｅｘ－ｖｉｖｏ選択して、１０日でｓｈＨＰＲＴを保有する９５％を超える細胞の状態に到達することができることを図示している。

【図12B】６ＴＧを用いた改変した細胞の首尾よくいったｅｘ ｖｉｖｏ選択および増殖（ＬＶ形質導入によるＨＰＲＴノックダウンまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ナノカプセルによるノックアウト）を描いている図である。これら最初の予備実験はＫ５６２細胞において実施した（ヒト不死化骨髄性白血病株）（ｒｓｈ７－ＧＦＰ＝ＨＰＲＴをノックダウンする短鎖ヘアピンからＨＰＲＴ／ＧＦＰレンチウイルスベクター；ナノＲＮＰ－ＨＰＲＴ＝ＨＰＲＴをノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質ナノカプセル）。図１２Ｂは、ＨＰＲＴノックアウト細胞もＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰナノカプセルにより、６００ｎＭまたは９００ｎＭの６ＴＧ下１０日で全集団中９５％よりも高く到達できることを図示している。これらのデータは、６ＴＧケモセレクション（ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を通じて高含量の遺伝子改変細胞を生成する実現可能性を示唆している。

【図13A】ＣＥＭ細胞に対する６ＴＧを用いた正の選択（ｅｘ ｖｉｖｏ）の効果を示す図である。

【図13B】ＣＥＭ細胞のＨＰＲＴノックアウト集団が６ＴＧの処理下で３日目から１７目まで増加したことを示す図である。

【図14A】Ｋ５６２細胞に対するＭＴＸを用いた負の選択の効果を示す図である。

【図14B】Ｋ５６２細胞に対するＭＴＸを用いた負の選択の効果を示す図である。

【図15A】ＣＥＭ細胞に対するＭＴＸまたはＭＰＡを用いた負の選択の効果を示す図である。

【図15B】ＣＥＭ細胞に対するＭＴＸまたはＭＰＡを用いた負の選択の効果を示す図である。

【図16】Ｋ５６２細胞に対するＭＴＸを用いた負の選択の効果を示す図である。

【図17】デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の合成のための新規経路を示す図である。

【図18】６ＴＧの存在下でのＨＰＲＴ欠損細胞の選択を示す図である。

【図19】改変したＴ細胞を調製し、患者の免疫系が少なくとも部分的に再構成されるように、幹細胞移植に続いてその改変したＴ細胞を患者に投与する工程を説明するフローチャートである。

【図20】改変したＴ細胞を調製し、改変したＴ細胞がＧＶＭ効果を誘導するのを支援するように、幹細胞移植に続いてその改変したＴ細胞を患者に投与する工程を説明するフローチャートである。

【図21】改変したＴ細胞を調製し（ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ－Ｔ細胞）、その改変したＴ細胞をそれを必要とする患者に投与する工程を説明するフローチャートである。

【図22】ＨＰＲＴの相対的な発現レベルを示し、その時点でＨＰＲＴ欠損細胞をプリン類似体で選び出すカットオフをさらに示す図である。

【図23】オンターゲットおよびオフターゲット効果について試験された種々のガイドＲＮＡを図示する表を詳細に説明する図である。

【図24】ＨＰＲＴノックアウトジャーカット細胞における発光対６ＴＧ濃度を描くグラフを提供する図である。

【図25】ＨＰＲＴノックアウトおよび野生型ジャーカット細胞のウェスタンブロットを提供する図であり、アクチンがタンパク質対照として使用された。

【図26】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対ＨＰＲＴノックアウト生存優位性のグラフを詳細に説明する図であり、グラフは生存細胞の割合対時間を提供している。

【図27】ＧＦＰ対ＨＰＲＴノックアウト細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）からのデータを提供する図である。

【図28】野生型ジャーカット細胞についてのメトトレキサート（ＭＴＸ）用量応答の決定を詳細に説明するグラフを提供する図であり、グラフは生細胞の割合を示している。

【図29】ＨＰＲＴノックアウトおよび野生型ジャーカット細胞についてのメトトレキサート用量応答の決定を示すグラフを提供する図であり、グラフは用量応答対メトトレキサート濃度の変化を示している。

【図30A】レンチウイルスベクターＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵｂＣ／ＧＦＰを用いて形質導入されたＨＰＲＴノックダウンジャーカットＴ細胞に応じたＦＡＣＳデータを提供する図である。

【図30B】レンチウイルスベクターＴＬ２０ｃｗ－ＵｂＣ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４を用いて形質導入されたＨＰＲＴノックダウンジャーカットＴ細胞に応じたＦＡＣＳデータを提供する図である。

【図31】レンチウイルスベクターＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵｂＣ／ＧＦＰまたはＴＬ２０ｃｗ－ＵｂＣ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４を用いて形質導入されたＨＰＲＴノックダウンＣＥＭ細胞を用いた６ＴＧ選択を図示するグラフを提供する図である。

【図32】本開示のいくつかの実施形態に従ってレンチウイルスベクター内に含まれるエレメントを示す図である。図は、他のエレメントに対するある特定のエレメントの相対的な配向をさらに示している。例えば、７ｓｋ駆動ｓｈ７３４エレメントを、ＵｂＣ駆動ＧＦＰと比べて同じ方向にまたは反対方向に向けてもよい。さらに、図は、７ｓｋ駆動ｓｈ７３４エレメントを、他のベクターエレメントの上流にまたは下流、例えば、ＵｂＣ駆動ＧＦＰの上流または下流に置くことがあることを図示している。

【図33】４つのベクターのうちの１つを用いた形質導入後のＧＦＰを発現する細胞の割合のグラフを提供する図である。

【0045】

配列リスト
本明細書に添付の核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定のように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字省略、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。配列リストは、参照により本明細書に組み入れる、２０１９年１２月１９日に作成された「Ｃａｌｉｍｍｕｎｅ－０７２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名の、２６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された。

【発明を実施するための形態】

【0046】

定義
反対に明確に指示しない限り、１つより多くの工程または行為を含む本明細書で主張する任意の方法では、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が引用される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

【0047】

本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、複数の参照を含む。同様に、単語「または（ｏｒ）」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。

【0048】

明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、１つまたはそれ以上の要素のリストを参照して、句「少なくとも１つ」は、要素のリストのいずれか１つまたはそれ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、特に要素のリスト内に列挙された各および全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストの要素のいずれかの組合せを除外しないと理解されるべきである。この定義は、要素が、場合により、句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に同定された要素以外を、特に同定したそれらの要素に関連してもしなくても表し得ることも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（および場合により、Ｂ以外の要素を含む）少なくとも１つ、場合により１つより多くのＡを含む、；別の実施形態では、Ａが存在しない（および場合により、Ａ以外の要素を含む）少なくとも１つ、場合により１つより多くのＢを含む、；さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、場合により１つより多くのＡを含む、および少なくとも１つ、場合により１つより多くのＢを含む（および場合により、他の要素を含む）；等を指すことができる。

【0049】

本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」等は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。特に、各用語は、「少なくとも以下」を意味する開かれた用語であると解釈されるものであり、さらなる特徴、制限、態様等を除外しないとも解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを含むデバイスを意味する。同様に、句：「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程および方法は特定の順序で本明細書に概説されるが、当業者は工程および方法の順序は変わり得ることを認識するであろう。

【0050】

明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、「または」は、上記の「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」もしくは「および／または」は、包括的である、すなわち少なくとも１つの包括であるが、いくつかの要素または要素のリストの１つより多く、ならびに、場合により、さらなるリストにない項目も含むと解釈されるべきである。「の１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「の厳密に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」のような反対に明確に指定した用語のみ、または特許請求の範囲で使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、いくつかの要素または要素のリストの厳密に１つの要素の包括を指す。一般に、本明細書で使用する場合、用語「または」は、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「の１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、「の１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」または「の厳密に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」のような排他的な用語によって先行される場合、排他的な代替物（すなわち「１つまたはその他であるが両方ではない」）を示すとだけ解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「基本的に～からなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。

【0051】

本明細書で使用する場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」または「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、組成物、製剤、または特定の薬剤を、本明細書に記載のものを含む、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）に提供することを意味する。

【0052】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃａｓタンパク質」は、Ｃａｓタンパク質、またはその断片を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配列の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ））関連ヌクレアーゼとも呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝要素（ウイルス、転移性要素および接合性プラスミド）に対する保護を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動要素に対する配列相補性、および標的侵入核酸を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へと転写およびプロセシングされる。Ｃａｓタンパク質は、限定はされないが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９オルソログによってコードされるＣａｓ９様タンパク質、Ｃａｓ９様合成タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃｐｆ１オルソログによってコードされるタンパク質、Ｃｐｆ１様合成タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、ならびにこれらのバリアントおよび改変を含む。Ｃａｓタンパク質のさらなる例としては、限定はされないが、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１３ｃを含む。Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１３ｃ。

【0053】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。本明細書で規定する場合、「クラス２型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、エフェクター複合体（例えばＣａｓ９）として単一のタンパク質で機能するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。本明細書で規定する場合、「クラス２タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、そのｃａｓ遺伝子の中でもＣａｓ９遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。「クラス２タイプＩＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、ｃａｓ９遺伝子およびＣｓｎ２遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。「クラス２タイプＩＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、ｃａｓ９遺伝子およびｃａｓ４遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。「クラス２タイプＩＩ－Ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、Ｃａｓ９遺伝子を含むが、Ｃｓｎ２遺伝子もＣａｓ４遺伝子も含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。「クラス２タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、そのｃａｓ遺伝子にｃａｓ１２遺伝子（Ｃａｓ１２ａ、１２ｂまたは１２ｃ遺伝子）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。「クラス２タイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、そのＣａｓ遺伝子にＣａｓ１３遺伝子（Ｃａｓ１３ａ、１３ｂまたは１３ｃ遺伝子）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを指す。各野生型Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上の同種ポリヌクレオチド（もっとも典型的にはＲＮＡ）と相互作用し、核タンパク質複合体（最も典型的にはリボ核タンパク質複合体）を形成する。さらなるＣａｓタンパク質は、Ｈａｆｔら、”Ａ Ｇｕｉｌｄ ｏｆ ４５ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ Ｅｘｉｓｔ ｉｎ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅｓ、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、２００５年、１１月；１（６）：ｅ６０によって記載される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は改変Ｃａｓタンパク質、例えば本明細書で同定したＣａｓタンパク質のいずれかの改変バリアントである。

【0054】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９タンパク質」は、標的ポリヌクレオチドに相補性な配列を持つＣＲＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によってガイドされるわずかなエンドヌクレアーゼ活性（例えば、ポリヌクレオチド内でホスホジエステル結合を切断する）を示し得る酵素（野生型または組換え）を指す。Ｃａｓ９ポリペプチドは、当技術分野で公知であり、例えば、細菌および古細菌のような原核生物起源を含む、様々な生物起源のいずれかからのＣａｓ９ポリペプチドを含む。細菌のＣａｓ９は、放線菌門（例えば、アクチノマイセス・ネスルンディ）Ｃａｓ９、アクウィフェクス門Ｃａｓ９、バクテロイデス門Ｃａｓ９、クラミジア門Ｃａｓ９、緑色非硫黄細菌門Ｃａｓ９、シアノバクテリアＣａｓ９、エルシミクロビウム門Ｃａｓ９、フィブロバクター門Ｃａｓ９、ファーミキューラス門Ｃａｓ９（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９、リステリア・イノキュアＣａｓ９、ストレプトコッカス・アガラクチアＣａｓ９、ストレプトコッカス・ミュータンスＣａｓ９、およびエンテロコッカス・フェシウムＣａｓ９）、フソバクテリウム門Ｃａｓ９、プロテオバクテリア（例えば、髄膜炎菌、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクターラリ）Ｃａｓ９、スピロヘータ（例えば、トレポネーマ・デンティコラ）Ｃａｓ９等を含む。古細菌のＣａｓ９は、ユリ古細菌門Ｃａｓ９（例えば、メタノコッカス・マリパルディスＣａｓ９）等を含む。様々なＣａｓ９および関連ポリペプチドが公知であり、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：４６７～４７７頁、Ｍａｋａｒｏｖａら（２０１１年）Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ ６：３８、Ｈａｆｔら（２００５年）ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉ：ｅ６０ ａｎｄ Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら（２０１３年）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６～７３７頁；Ｋ．Ｍａｋａｒｏｖａら、Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．（２０１５年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．１３：７２２～７３６頁；およびＢ．Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．（２０１５年）Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９～７７１頁に概説されている。

【0055】

他のＣａｓ９ポリペプチドは、フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダＣａｓ９、パスツレラ・マルトシダＣａｓ９、マイコプラズマ・ガリセプティカムＦ系統Ｃａｓ９、ニトラチフラクター・サルスギニスＤＳＭ１６５１１系統Ｃａｓ９、パルビバクラム・ラバメンティボランスＣａｓ９、ロゼブリア・インテスティナリスＣａｓ９、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｃａｓ９、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＣａｓ９、アゾスピリルム属Ｂ５１０ Ｃａｓ９、スファエロカエタ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）・グロブス バディ系統ｃａｓ９、フラボバクテリウム・カラムナーレＣａｓ９、フラヴィコラ・タフェンシスＣａｓ９、バクテロイデス・コプロフィルスＣａｓ９、マイコプラズマ・モービレＣａｓ９、ラクトバチルス・ファルシミニスＣａｓ９、ストレプトコッカス・パステウリアヌスＣａｓ９、ラクトバチルス・ジョンソニイＣａｓ９、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）・シュディンテルメディウスＣａｓ９、フィリファクター・アロキスＣａｓ９、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９、レジオネラ・ニューモフィラパリス系統Ｃａｓ９、ステレラ・ウォズワーセンシスＣａｓ９、およびコリネバクター・ジフテリアＣａｓ９を含む。用語「Ｃａｓ９」は、Ｃａｓ９の任意のアイソフォームを含む、任意のＣａｓ９ファミリーのＣａｓ９ポリペプチドを含む。本明細書に具体的に記載または提供するものを超えた、様々なＣａｓ９ホモログ、オルソログ、およびバリアントのアミノ酸配列は、当業者に公知であり、一般に利用可能であり、当業者の範囲内であり、したがって本開示の精神および範囲内である。

【0056】

本明細書で使用する場合、用語「Ｃａｓ１２」または「Ｃａｓ１２タンパク質」は、限定はされないが、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅのようなＣａｓ１２タンパク質を含む任意のＣａｓ１２タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、機能性Ｃａｓ１２タンパク質、特にアシダミノコッカス属ＢＶ３Ｌ６株（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ：Ｕ２ＵＭＱ６；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎａｍｅ：ＣＳ１２Ａ＿ＡＣＩＳＢ）からのＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１タンパク質またはフランシセラ・ツラレンシス（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ：Ａ０Ｑ７Ｑ２；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎａｍｅ：ＣＳ１２Ａ＿ＦＲＡＴＮ）からのＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％（または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、天然に見出されるタンパク質と実質的に同一であるＣａｓ１２ポリペプチド、または天然に見出されるＣａｓ１２タンパク質と少なくとも８５％配列同一性（または少なくとも９０％配列同一性、または少なくとも９５％配列同一性、または少なくとも９６％配列同一性、または少なくとも９７％配列同一性、または少なくとも９８％配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性）を有し、実質的に同じ生物活性を有するＣａｓ１２ポリペプチドであり得る。Ｃａｓ１２ａタンパク質の例としては、限定はされないが、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａまたはＬｂ４Ｃａｓ１２ａが挙げられ；Ｃａｓ１２ａは、好ましくはＬｂＣａｓ１２ａである。Ｃａｓ１２ｂタンパク質の例としては、限定はされないが、ＡａｃＣａｓ１２ｂ、Ａａｃ２Ｃａｓ１２ｂ、ＡｋＣａｓ１２ｂ、ＡｍＣａｓ１２ｂ、ＡｈＣａｓ１２ｂ、ＡｃＣａｓ１２ｂが挙げられる。

【0057】

本明細書で使用する場合、句「有効量」は、研究者、獣医、医師または他の医療従事者によって考えられる、組織、システム、動物、またはヒトの診断、生物または医学的応答を誘発するであろう本明細書に記載の組成物または製剤の量を指す。

【0058】

本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」は、ＲＮＡ、および、いくつかの実施形態では、続いてタンパク質を発現することができるベクター内の１つまたはそれ以上の遺伝子配列を指す。発現カセットは、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つの目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター、少なくとも１つの目的の遺伝子、および発現のための分子（例えばＲＮＡｉ）をコードする少なくとも１つのさらなる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡへと転写され、必要な場合、タンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換した細胞（例えば、形質導入した幹細胞）において活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物活性のための適切な区画へと転位置されるように、ベクター内で位置的および順に方向付けされる。いくつかの実施形態では、カセットは、ベクターへの挿入が容易になるように適合させたその３’端および５’端を有し、例えば、各端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。

【0059】

本明細書で使用する場合、用語「機能性核酸」は、タンパク質をコードする転写物と直接相互作用することによってタンパク質の発現を減らす能力を有する分子を指す。ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアンチセンス核酸は、例示的な機能性核酸を構成する。

【0060】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、生物機能と関連する任意のＤＮＡのセグメントを広く指す。遺伝子は、限定はされないが、コード配列、プロモーター領域、シス調節配列、調節タンパク質の特異的認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、所望のパラメーターを持つように設計されたＤＮＡセグメント、またはこれらの組合せを含む配列を包含する。

【0061】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子サイレンシング」は、下方調節、ノックダウン、分解、阻害、抑制、抑圧、防止、または遺伝子、転写物および／またはポリペプチド産物の発現の低下を記載することを意味する。遺伝子サイレンシングおよび干渉は、ｍＲＮＡ転写物のポリペプチドへの翻訳の防止も記載する。いくつかの実施形態では、翻訳は、ｍＲＮＡ転写物の分解またはｍＲＮＡ翻訳の遮断によって防止、阻害され、または低下する。

【0062】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子発現」は、それにより生物学的に活性なポリペプチドがＤＮＡ配列から産生される細胞のプロセスを指す。

【0063】

本明細書で使用する場合、用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクターを標的に向け、特定の標的核酸を切断することができるＲＮＡ分子を指す。

【0064】

本明細書で使用する場合、用語「造血細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」または「造血細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」は、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯静脈血移植、または任意の他の多能性造血幹細胞の起源を指す。同様に、用語「幹細胞移植」または「移植」は、薬学的に許容される担体と接触している（例えば懸濁している）幹細胞を含む組成物を指す。カテーテルを通して、そのような組成物を対象に投与することができる。

【0065】

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本開示の方法を使用して改変される細胞を指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターが発現される哺乳動物細胞である。好適な哺乳動物宿主細胞としては、限定はされないが、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、アカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞または幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣｆ２Ｔｈ細胞を含む。特定の実施形態では、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血前駆細胞／幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞）、単球、マクロファージ、末梢血単核細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞のような造血細胞である。本開示の発現ベクターによって形質導入する造血細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、および／または単球／マクロファージ）は、同種、自家または適合した兄弟由来であり得る。造血前駆細胞／幹細胞は、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４陽性であり、患者の骨髄または末梢血から単離される。単離したＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞（および／または本明細書に記載の他の造血細胞）は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように発現ベクターによって形質導入する。

【0066】

本明細書で使用する場合、用語「ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ」または「ＨＰＲＴ」は、ＨＰＲＴ１遺伝子（例えば、配列番号１２を参照）によってコードされるプリン代謝に関与する酵素を指す。ＨＰＲＴ１は、Ｘ染色体に位置し、したがって男性では単一コピーで存在する。ＨＰＲＴ１は、５－ホスホリボシル１－ピロリン酸からプリンへと５－ホスホリボシル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｂｏｓｙｌ）基を転移することにより、ヒポキサンチンのイノシン一リン酸への変換、およびグアニンのグアノシン一リン酸への変換を触媒するトランスフェラーゼをコードする。酵素は、主に、新しいプリン合成での使用のため、分解したＤＮＡからのプリンの再利用に機能する。

【0067】

本明細書で使用する場合、用語「インデル」は、挿入および欠失の混合により名付けられた変異を指す。それは、違いが、元々、配列挿入により、または配列欠失により引き起こされたか分からない場合、２つのアレル間の長さの違いを指す。挿入／欠失のヌクレオチドの数が３で割り切れず、タンパク質コード領域で生じる場合、それはフレームシフト変異（フレームシフト変異は、一般に、異なるアミノ酸をコードする変異後のコドンのリーディングを引き起こす）でもある。

【0068】

本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ １型、およびＨＩＶ ２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体；羊の脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こす、ビスナ・マエディ、ヤギの免疫不全、関節炎、および脳症を引き起こす、ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血、および脳症を引き起こす、ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こす、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシのリンパ節腫大、リンパ球増加症、および中枢神経系感染症を引き起こす可能性のある、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびに類人霊長類に免疫不全および脳症を生き起こす、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。

【0069】

本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルス由来の核酸の任意の形態を示すために使用され、形質導入により細胞へと遺伝物質を移行するために使用される。用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのようなレンチウイルスベクターの核酸、これらの核酸のカプセル化形態、およびウイルスベクター核酸がパッケージされたウイルス粒子を包含する。

【0070】

本明細書で使用する場合、用語「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）」または「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」は、遺伝子発現へのＲＮＡｉの効果に関して使用する場合、遺伝子発現のレベルが阻害され、実質的に同じ条件だがＲＮＡｉの非存在下で調べた場合に通常観察されるレベル以下まで低減されることを意味する。

【0071】

本明細書で使用する場合、用語「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）」または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は、内在性遺伝子の発現の部分的または完全な抑制を指す。これは、一般に、遺伝子の一部を欠失することにより、または一部を第２の配列と置き換えることによって達成されるが、終始コドンの導入、重要なアミノ酸の変異、イントロンジャンクションの除去等のような遺伝子への他の改変によっても引き起こされる。したがって、「ノックアウト」構築物は、細胞に導入する場合、細胞において内在性ＤＮＡによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の発現の抑制（部分的または完全）をもたらす、ＤＮＡ構築物のような核酸配列である。いくつかの実施形態では、「ノックアウト」は、点変異、挿入、欠失、フレームシフト、またはミスセンス変異のような変異を含む。

【0072】

本明細書で使用する場合、用語「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、感染標的（例えば、細胞）に対する因子（例えば、ファージまたはより一般的には、ウイルス、細菌）の比率を意味する。例えば、ウイルス粒子を接種した細胞の群を参照する場合、感染多重度またはＭＯＩは、指定した空間に存在する標的細胞の数に対するウイルス粒子の数の比である。

【0073】

本明細書で使用する場合、用語「ミニ細胞」は、二分裂の間に、ＤＮＡ分離を伴う細胞分裂の調整の障害によって生じる、無核形態の細菌細胞を指す。ミニ細胞は、特定の状況で、およびミニ細胞とは対照的に自然発生的に生成および放出される他の小胞とは異なり、特定の遺伝子再編成またはエピソーム遺伝子発現によらない。本開示のミニ細胞は、二分裂の間に、ＤＮＡ分離を伴う細胞分裂の調整の障害によって生じる、無核形態の大腸菌または他の細菌細胞である。原核生物の染色体複製は、中間細胞隔膜形成を含む、正常な二分裂と関連する。大腸菌では、例えば、ｍｉｎＣＤのようなｍｉｎ遺伝子の変異は、細胞分裂中に細胞極において隔膜形成の阻害を除去し、正常な娘細胞および無核ミニ細胞の産生をもたらし得る。ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９９２年；Ｒａｓｋｉｎ ＆ ｄｅ Ｂｏｅｒ、１９９９年；Ｈｕ ＆ Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓ、１９９９年；Ｈａｒｒｙ、２００１年を参照。ミニ細胞は、特定の状況で、およびミニ細胞とは対照的に自然発生的に生成および放出される他の小胞とは異なり、特定の遺伝子再編成またはエピソーム遺伝子発現によらない。本開示を実施するため、ミニ細胞は無傷の細胞壁（「無傷のミニ細胞」）を持つことが望ましい。ｍｉｎオペロン変異に加えて、無核ミニ細胞は、隔膜形成に影響する他の遺伝子再編成または変異の範囲、例えば枯草菌のｄｉｖＩＶＢ１においても生成される。Ｒｅｅｖｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｔｔ、１９７５年；Ｌｅｖｉｎら、１９９２年を参照。ミニ細胞は、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現のレベルの攪乱後にも形成される。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は、極分裂およびミニ細胞の産生をもたらす。同様に、染色体の無いミニ細胞は、染色体分離における欠損、例えば、枯草菌のｓｍｃ変異（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９８年）、枯草菌のｓｐｏＯＪ欠失（Ｉｒｅｔｏｎら、１９９４年）、大腸菌のｍｕｋＢ変異（Ｈｉｒａｇａら、１９８９年）、および大腸菌のｐａｒＣ変異（Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｄ’Ａｒｉ、１９９２年）から生じ得る。遺伝子産物はトランスに供給される。高コピー数プラスミドから過剰発現される場合、例えば、ＣａｆＡは細胞分裂の割合を増加および／または複製後の染色体分配を阻害し（Ｏｋａｄａら、１９９４年）、連鎖する細胞および無核ミニ細胞の形成をもたらし得る（Ｗａｃｈｉら、１９８９年；Ｏｋａｄａら、１９９３年）。ミニ細胞は、グラム陽性またはグラム陰性起源の任意の細菌細胞から調製される。

【0074】

本明細書で使用する場合、用語「変異」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のような配列の、天然、野生型、標準またはそれぞれの配列の参照バージョン、すなわち非変異配列からの変化を指す。変異遺伝子は、変異遺伝子産物をもたらし得る。変異遺伝子産物は、非変異遺伝子産物と１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なる。いくつかの実施形態では、変異遺伝子産物をもたらす変異遺伝子は、相当する非変異ヌクレオチド配列と約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。

【0075】

本明細書で使用する場合、用語「ナノカプセル」は、１つまたはそれ以上の成分、例えば１つもしくはそれ以上のタンパク質および／または１つもしくはそれ以上の核酸をカプセル化するシェル、例えばポリマーシェルを有するナノ粒子を指す。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、約２００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約１～２００ｎｍの間、または約５～約２００ｎｍの間、または約１０～約１５０ｎｍの間、または１５～１００ｎｍ、または約１５～約１５０ｎｍの間、または約２０～約１２５ｎｍの間、または約５０～約１００ｎｍの間、または約５０～約７５ｎｍの間の平均直径を有する。他の実施形態では、ナノカプセルは、約１０ｎｍ～約２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、約２５ｎｍ～約３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約３５ｎｍ、約３５ｎｍ～約４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約４５ｎｍ、約４５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約５５ｎｍ、約５５ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約６５ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約７５ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約８５ｎｍ～約９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約９５ｎｍ、約９５ｎｍ～約１００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約１１０ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、約１時間、または約２時間、または約３時間、または約４時間、または約５時間、または約６時間、または約１２時間、または約１日、または約２日、または約１週間、または約１か月で分解されるように設計される。いくつかの実施形態では、ナノカプセルの表面は、約１～約１５ミリボルト（ｍＶ）の間の電荷（例えば標準的なリン酸溶液中で測定される）を有し得る。他の実施形態では、ナノカプセルの表面は、約１～約１０ｍＶの間の荷電を有し得る。

【0076】

本明細書で使用する場合、用語「正に荷電したモノマー」または「陽イオン性モノマー」は、実効正電荷、すなわち＋１、＋２、＋３を有するモノマーを指す。いくつかの実施形態では、正に荷電したモノマーは、正に荷電した基を含むモノマーである。本明細書で使用する場合、用語「負に荷電したモノマー」または「陰イオン性モノマー」は、実効負電荷、すなわち－１、－２、－３を有するモノマーを指す。いくつかの実施形態では、負に荷電したモノマーは、負に荷電した基を含むモノマーである。本明細書で使用する場合、用語「中性のモノマー」は、実効中性電荷を有するモノマーを指す。

【0077】

本明細書で使用する場合、用語「ポリマー」は、ホモポリマー、コポリマー、相互侵入ポリマー網目、およびオリゴマーの包括であると規定される。したがって、用語ポリマーは、用語ホモポリマー、コポリマー、相互侵入ポリマー網目等と、本明細書で交換可能に使用される。用語「ホモポリマー」は、単一種のモノマー由来のポリマーと規定される。用語「コポリマー」は、２つのモノマー種の共重合によって得られるコポリマー、３つのモノマー種から得られたコポリマー（「ターポリマー」）、４つのモノマー種から得られたコポリマー（「クウォーターポリマー」）等を含む、１つより多くの種のモノマー由来のポリマーと規定される。用語「コポリマー」は、ランダムコポリマー、交互コポリマー、グラフトコポリマー、およびブロックコポリマーの包括であるとさらに規定される。その用語が一般に使用されるように、コポリマーは、相互侵入ポリマー網目を含む。用語「ランダムコポリマー」は、鎖における任意の所与の部位での所与のモノマー単位を見出す可能性が隣接する単位の性質に依存しない、巨大分子を含むコポリマーとして規定される。ランダムコポリマーでは、モノマー単位の配列分布は、ベルヌーイ統計学に従う。用語「交互コポリマー」は、交互配列に２種のモノマー単位を含む巨大分子を含むコポリマーと規定される。

【0078】

本明細書で使用する場合、用語「クロスリンカー」は、２つまたはそれ以上の分子鎖、ドメイン、または他の部分の間の連結（例えば、分子内連結または分子間連結）を提供する結合または部分を指す。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、連結された分子を形成する分子鎖間の連結を形成する分子である。

【0079】

本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結した」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、エンハンサーまたは転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列の間の機能性結合を指し、ここで、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が発現制御配列に結合すると、発現制御配列は第２の配列に相当する核酸の転写および／または翻訳に影響する。

【0080】

本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを開始および転写する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞で作動するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０ベース上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域を含む。

【0081】

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、一般的に、安全、非毒性、および生物学的ではなく、または望ましくないものではない、医薬製剤の調製に有用である担体または賦形剤を指し、獣医用途ならびにヒト医薬用途に許容される担体または賦形剤を含む。

【0082】

本明細書で使用する場合、用語「レトロウイルス」は、宿主細胞ゲノムにインテグレートされるｃＤＮＡコピーへと、レトロウイルス逆転写酵素によって逆転写されるＲＮＡゲノムを有するウイルスを指す。レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを作製すル方法は、当技術分野で公知である。簡潔に言うと、レトロウイルスベクターを構築するため、目的の遺伝子をコードする核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムへと挿入され、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するため、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を持たないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３３：１５３～１５９頁、１９８３年）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドがこの細胞株へと導入されると、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングさせ、次いでそれらは培養培地へと分泌される。組換えレトロウイルスを含有する培地は、次いで回収され、場合により濃縮され、遺伝子移入に使用される。

【0083】

本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」は、約１０ヌクレオチド～数十ヌクレオチドから構成される短い二本鎖ＲＮＡを指し、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を誘導し、すなわち標的ｍＲＮＡの分解を誘導または標的ｍＲＮＡの切断により標的遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）は、多くの真核生物で保存された、遺伝子発現の転写後阻害の方法であり、標的遺伝子のｍＲＮＡに相同な配列を有するセンスＲＮＡおよびそれに対して相補性な配列を有するアンチセンスＲＮＡから構成される二本鎖ＲＮＡが細胞等に導入され、それにより標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を選択的に誘導することができ、または標的遺伝子の発現を阻害することができる現象を指す。ＲＮＡｉは、細胞に存在する短い（すなわち約３０ヌクレオチドより短い）二本鎖ＲＮＡ分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６～８１１頁、１９９８年）。ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、ｓｉＲＮＡの配列に相補性なヌクレオチド配列を有する標的遺伝子のｍＲＮＡの発現が阻害されるであろう。

【0084】

本明細書で使用する場合、用語「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、アンチセンス領域、ループ部分およびセンス領域を含むＲＮＡ分子を指し、ここで、センス領域はアンチセンス領域と塩基対を形成して二重ステムを形成する相補性なヌクレオチドを有する。転写後プロセシングの後、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである酵素によって媒介される切断イベントにより、低分子ヘアピンＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡへと変換される。本明細書で使用する場合、句「転写後プロセシング」は、転写後に起こり、例えば酵素および／またはＤｒｏｓｈａによって媒介されるｍＲＮＡプロセシングを指す。

【0085】

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト、マウスまたは霊長類のような哺乳動物を指す。典型的には、哺乳動物はヒト（ホモサピエンス）である。

【0086】

本明細書で使用する場合、用語「実質的にＨＰＲＴを欠損した」は、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルが少なくとも約５０％減少した細胞、例えば宿主細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約５５％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約６０％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約６５％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約７０％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約７５％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約８０％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約８５％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約９０％減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約９５％減少する。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約４０％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約３５％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約３０％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約２５％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約２０％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約１５％である。他の実施形態では、残りのＨＰＲＴ遺伝子発現は最大約１０％である。

【0087】

本明細書で使用する場合、用語「形質導入する」または「形質導入」は、トランスフェクションよりも感染の手段によるウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子の送達を指す。例えば、レトロウイルスベクター（細胞への核酸の導入のための発現ベクターとして使用する改変レトロウイルス）によって運ばれる抗ＨＰＲＴ遺伝子は、感染およびプロウイルスのインテグレーションによって細胞へと形質導入される。したがって、「形質導入遺伝子」は、レトロウイルスまたはベクター感染およびプロウイルスインテグレーションによって細胞へと導入された遺伝子である。ウイルスベクター（例えば、「形質導入するベクター」）は、遺伝子を「標的細胞」または宿主細胞へと形質導入する。

【0088】

本明細書で使用する場合、用語「トランスフェクション」は、非ウイルス方法によって細胞へと裸のＤＮＡを導入する方法を指す。

【0089】

本明細書で使用する場合、用語「形質導入」は、ウイルスベクターを使用する細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入を指す。

【0090】

本明細書で使用する場合、特定の条件に関して、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置する（ｔｒｅａｔ）」は、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状の完全または部分的な防止の観点では予防であり、および／または疾患および／または疾患に起因する有害事象の部分的または完全な治癒の観点では治療であり得る。本明細書で使用する場合、「処置」は、対象、特にヒトにおける疾患または障害の任意の処置を包含し、：（ａ）疾患に罹りやすいがまだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患または障害が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患または障害を阻害すること、すなわちその発生を停止させること；および（ｃ）疾患または障害を軽減または緩和すること、すなわち疾患もしくは障害の回帰を引き起こすおよび／または１つまたはそれ以上の疾患もしくは障害の症状を軽減することを含む。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患、障害または症状の非存在下でも、薬理学的な効果を提供するための薬剤の送達または治療の投与も包含し得る。用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、いくつかの実施形態で使用され、宿主における、好ましくは哺乳動物対象における、より好ましくはヒトにおける疾患または障害を軽減する本開示の化合物の投与を指す。したがって、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は：特に宿主が疾患に罹りやすいがまだ疾患を有すると診断されていない場合、宿主において障害が生じるのを防止すること；障害を阻害すること；および／または障害を緩和または後退させることを含み得る。本開示の方法が障害の防止を対象とする限り、用語「防止する」は、疾患状態が完全に阻止されることを必要としないことが理解される。むしろ、本明細書で使用する場合、用語防止するは、疾患の発症前に本開示の化合物の投与を行うことができるように、障害に感受性のある集団を同定する当業者の能力を指す。用語は、疾患状態が完全に避けられなければならないことを意味しない。

【0091】

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、別の核酸分子の細胞への侵入、例えば移行、輸送等を媒介することができる核酸分子を指す。移行する核酸は、通常、ベクター核酸分子に連結される、例えばベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、自立複製を導く配列を含んでよく、または宿主細胞ＤＮＡへのインテグレーションを可能にするのに十分な配列を含んでよい。当業者には明らかであるように、ウイルスベクターは、核酸に加えて、移行する核酸の侵入を媒介する様々なウイルス成分を含み得る。多くのベクターが当技術分野で公知であり、限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。ウイルスベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）等が挙げられる。

【0092】

発現ベクター
本開示は、いくつかの実施形態では、発現のための少なくとも１つの核酸配列を含む発現ベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンする、またはそうでなければＨＰＲＴ遺伝子発現の減少をもたらすように設計した因子をコードする第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現は８０％またはそれ以上低下する。

【0093】

いくつかの実施形態では、本開示は、第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、第１の核酸配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する、発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２、５、６、および７のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡは、発現ベクターにおける発現のための唯一の導入遺伝子である。

【0094】

いくつかの実施形態では、基本的に発現のための導入遺伝子として第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列からなる発現ベクターであって、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、発現ベクターを提供する。特に、いくつかの実施形態では、基本的に発現のための唯一の導入遺伝子としての第１の核酸配列からなる発現ベクターであって、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、発現ベクターを提供する。

【0095】

さらなる態様では、導入遺伝子として第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含む発現ベクターであって、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有し、ここで、第１の核酸配列は発現のための要素のみである、発現ベクターを提供する。特に、いくつかの実施形態では、発現のための唯一の導入遺伝子として第１の核酸配列を含む発現ベクターであって、第１の核酸配列はヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここで、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、および７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有する、発現ベクターを提供する。

【0096】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは自己不活性化レンチウイルスベクターである。他の実施形態では、発現ベクターはレトロウイルスベクターである。レンチウイルスゲノムは、通常、５’長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）および３’ＬＴＲへと組織される。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域へと分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーター要素を含有する。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分け、Ｒ領域の転写された配列は、ウイルスＲＮＡの５’端と３’端の両方に見られる。例えば、”ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、（２０００年））；Ｏ Ｎａｒａｙａｎ ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（１９８９年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：１６１７～１６３９頁；Ｆｉｅｌｄｓら（１９９０年）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．；Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ，Ｂｌａｍｅｒ Ｕ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｇａｇｅ Ｆ Ｈ，Ｖｅｒｍａ Ｉ Ｍ．（１９９８年）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．７２（１０）：８１５０ ７、および米国特許第６，０１３，５１６号を参照。ＨＳＣに感染させるために使用されたレンチウイルスベクターの例は、以下の論文に記載され、その各々がその全体を参照により本明細書に組み入れる：Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、Ｖｏｌ．１０：１４７９～１４８９頁、１９９９年；Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９６：２９８８～２９９３頁、１９９９年；Ｕｃｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５：１１９３９～１１９４４頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２８３：６８２～６８６頁、１９９９年；およびＳｕｔｔｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．７２：５７８１～５７８８頁、１９９８年。

【0097】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは改変レンチウイルスであり、したがって、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる。いくつかの実施形態では、改変レンチウイルスゲノムは、ウイルス複製に必要なレンチウイルスタンパク質の遺伝子を欠損し、したがって、標的細胞における複製のような望まない複製を防止する。いくつかの実施形態では、改変ゲノムの複製のために必要なタンパク質は、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスの産生の間に、パッケージング細胞株においてトランスに提供される。

【0098】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスの５’および３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）からの配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列、ならびにレンチウイルスからの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。

【0099】

レンチウイルス発現ベクターのさらなる成分（ならびにそのようなベクターを合成および／または産生する方法）は、米国特許出願公開第２０１８／０１１２２２０号に開示され、その開示は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、配列番号１６の骨格と少なくとも９０％同一性を有するＴＬ２０ｃ骨格を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、配列番号１６の骨格と少なくとも９５％同一性を有するＴＬ２０ｃ骨格を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、配列番号１７の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ＷＰＲＥ要素またはＲｅｖ応答要素の少なくとも１つを含む（例えば、それぞれ配列番号１８および１９を参照）。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書で検討したレンチウイルスベクターは、インテグレーションを生じるものであっても、インテグレーションを生じるものでなくてもよい（インテグレーション欠損レンチウイルスとも呼ばれる）。本明細書で使用する場合、用語「インテグレーション欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」は、宿主細胞のゲノムへとウイルスゲノムをインテグレートする能力を欠損するインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。いくつかの出願では、インテグレーションを生じるレンチウイルスベクターの使用は、インテグレーションを生じるレンチウイルスによって誘導される挿入変異の可能性を避けることができる。インテグレーション欠損レンチウイルスベクターは、典型的には、レンチウイルスのインテグラーゼ遺伝子を変異することにより、またはＬＴＲの結合配列を改変することにより生成される（例えば、Ｓａｒｋｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、６：４３０～４３７頁（２００８年）を参照）。レンチウイルスインテグラーゼは、ＨＩＶ－１ Ｐｏｌ領域によってコードされ、その領域は、逆転写、核内移行、およびウイルス粒子アセンブリーを含む他の重要な活性をコードするので、欠失させることができない。インテグラーゼタンパク質を変更するｐｏｌにおける変異は、以下の２つのクラスの１つに分類される：インテグラーゼ活性にのみ選択的に影響するもの（クラスＩ）；または多面的な効果を有するもの（クラスＩＩ）。Ｎ末端およびＣ末端に渡る変異、ならびにインテグラーゼタンパク質の触媒コア領域は、粒子形成および逆転写を含む複数の機能に影響するクラスＩＩ変異を生成する。クラスＩ変異は、触媒活性、ＤＮＡ結合、線状エピソームプロセシングおよびインテグラーゼの多量体化へのそれらの影響を制限する。最も一般的なクラスＩ変異部位は、Ｄ６４、Ｄ１１６、およびＥ１５２を含む、インテグラーゼの触媒コアにおける三つ組の残基である。各変異は、ＮＩＬＶの導入遺伝子発現を維持しながら、通常の、インテグレーションを生じるベクターより最高４ｌｏｇ低いインテグレーションの頻度でインテグレーションを効果的に阻害することが示された。インテグレーションを阻害する別の代替方法は、それぞれ５’および３’ＬＴＲの末端で、Ｕ３領域の１２塩基対領域内またはＵ５領域の１１塩基対領域内のインテグラーゼＤＮＡ結合部位（ＬＴＲａｔｔ部位）に変異を導入することである。これらの配列は、インテグラーゼ媒介末端プロセシング後に曝露される保存された末端ＣＡジヌクレオチドを含む。保存されたＣＡ／ＴＧジヌクレオチドにおける単一または二重変異は、インテグレーション頻度の最大３～４ｌｏｇの減少をもたらす；しかしながら、効果的なウイルス形質導入のための全ての他の必要な機能を保持する。

【0101】

いくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」は、ＡＡＶベクターゲノムを含有するＡＡＶウイルス粒子を意味する（それは、順に、本明細書で言及する第１および第２の発現カセットを含む）。全ての血清型のＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ－１からＡＡＶ－９、より好ましくはＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、およびこれらの組合せを含むことを意味する。異なる血清型の組合せから生じるＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターと呼ばれる。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、およびＡＡＶ－６、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ－５ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－２逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ－５ベクターである。また本開示によって検討するのは、自然発生のウイルスタンパク質、例えば１つまたはそれ以上のキャプシドタンパク質のバリアントを含むＡＡＶベクターである。

【0102】

ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンをもたらす成分
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするように設計した因子をコードする核酸配列は、ＲＮＡ干渉因子（ＲＮＡｉ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ因子は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはこれらのハイブリッドである。

【0103】

ＲＮＡｉ
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列を含む。ＲＮＡ干渉は、複合の多段階な酵素方法、例えば配列特異的二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む方法によって、相同転写物の分解を誘発することによる遺伝子発現の転写後サイレンシングのアプローチである。ＲＮＡｉ経路の簡単なモデルは、２ステップに基づき、それぞれリボヌクレアーゼ酵素を含む。第１のステップでは、トリガーＲＮＡ（ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ一次転写物のいずれか）は、ＲＮａｓｅＩＩ酵素ＤＩＣＥＲおよびＤｒｏｓｈａにより、短い、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へとプロセシングされる。第２のステップでは、ｓｉＲＮＡは、エフェクター複合体ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされる。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣアセンブリー中にほどかれ、一本鎖ＲＮＡがｍＲＮＡ標的とハイブリダイズする。遺伝子サイレンシングは、ＲＮａｓｅＨ酵素Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ｓｌｉｃｅｒ）による標的ｍＲＮＡの酵素分解の結果であると考えられる。ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ二重鎖がミスマッチを含有する場合、ｍＲＮＡは切断されない。むしろ、遺伝子サイレンシングは翻訳阻害の結果である。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ因子は、阻害またはサイレンシング核酸である。本明細書で使用する場合、「サイレンシング核酸」は、特定の配列と相互作用し、遺伝子発現を阻害することができる任意のポリヌクレオチドを指す。サイレンシング核酸の例としては、ＲＮＡ二重鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス配列をコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡザイム、またはリボザイムが挙げられる。当業者は、遺伝子発現の阻害が、必ずしも特定の列挙した配列からの遺伝子発現である必要はなく、例えば特定の配列によって制御される配列からの遺伝子発現であり得ることを認識するであろう。

【0105】

干渉ＲＮＡを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、干渉ＲＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、１つの鎖はセンス鎖であり、他の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は自己相補性である（すなわち、各鎖は他の鎖のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含む；例えばアンチセンス鎖およびセンス鎖が二重または二本鎖構造を形成する場合）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその部分（すなわち、望まない遺伝子）のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉ＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、自己相補性センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結される。干渉ＲＮＡは、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称の二重鎖、ヘアピン、または非対称のヘアピン二次構造によるポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子またはその部分のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を有する。干渉ＲＮＡは、２つまたはそれ以上のループ構造ならびに自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は標的核酸分子またはその部分のヌクレオチド配列に相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングされ、ＲＮＡ干渉を媒介することができる活性なｓｉＲＮＡ分子を生成することができる。

【0106】

いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域およびループ領域を有する自己相補性ＲＮＡ分子をコードする。発現される場合、そのようなＲＮＡ分子は、望ましい「ヘアピン」構造を形成し、本明細書で「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ループ領域は通常約２～約１０ヌクレオチド長の間である（ほんの一例として、配列番号２０参照）。他の実施形態では、ループ領域は約６～約９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス領域およびアンチセンス領域は約１５～約３０ヌクレオチド長の間である。転写後プロセシングの後、低分子ヘアピンＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである酵素ＤＩＣＥＲによって媒介される切断イベントによってｓｉＲＮＡへと変換される。次いで、ｓｉＲＮＡは、それと相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することができる。さらなる詳細は、それらの開示がその全体を本明細書に参照により組み入れる、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０～５５３頁、（２００２年）；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、５００～５０５頁、（２００２年）；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４９７～５００頁、（２００２年）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８～９５８頁、（２００２年）；Ｐａｕｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０、５０５～５０８頁、（２００２年）；Ｓｕｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ、９９（６）、５５１５～５５２０頁、（２００２年）；およびＹｕら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ９９：６０４７～６０５２頁、（２００２年）に記載される。

【0107】

ｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する（本明細書では、「ｓｈ７３４」と呼ばれる）。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の核酸配列を有する。

【0108】

いくつかの実施形態では、配列番号１の核酸配列は、改変される。いくつかの実施形態では、改変は：（ｉ）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２ループ配列（例えば、ＣＣＵＧＡＣＣＣＡ）（配列番号２１）の組み込み；（ｉｉ）２または３つのヌクレオチド（例えばＴＡ）を有するスペーサーのような５’～３’ヌクレオチドスペーサーの付加；（ｉｉｉ）１つまたはそれ以上のヌクレオチド（例えばＧ）の付加のような５’開始の改変；および／または（ｉｖ）２つのヌクレオチド５’および３’のステムおよびループへの付加（例えば５’Ａおよび３’Ｔ）。一般に、第１世代のｓｈＲＮＡは、低分子ＲＮＡの不均一な混合物へとプロセシングされ、前駆体転写物の蓄積がｉｎ ｖｉｖｏでの配列依存的および非依存的両方の非特異的オフターゲット効果を誘導することが示された。したがって、ＤＩＣＥＲプロセシングおよび特異性の現行の理解に基づき、ｓｈ７３４の構造およびＤＩＣＥＲプロセシング能力および有効性を最適化するであろう設計に設計規則が適用された（Ｇｕ，Ｓ．、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｌ．Ｊｉｎ、Ｙ．Ｈｕａｎｇ、Ｆ．Ｚｈａｎｇ、Ｍ．Ｃ．Ｂａｓｓｉｋ、Ｍ．Ｋａｍｐｍａｎｎ、ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｋａｙ．２０１４年．Ｗｅａｋ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｅｅｄ ａｎｄ ３’ｒｅｇｉｏｎｓ ｒｅｄｕｃｅ ＲＮＡｉ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｉ／ｓｈＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：１２１６９～１２１７６頁も参照）。

【0109】

いくつかの実施形態では、配列番号１の核酸配列は、２つのヌクレオチド５’および３’（例えば、それぞれＧおよびＣ）をヘアピンループ（配列番号２０）に付加し、それによりガイド鎖を約１９ヌクレオチド長から約２１ヌクレオチド長に伸長し、ループをｈｓａ－ｍｉＲ－２２ループＣＣＵＧＡＣＣＣＡ（配列番号２１）と置き換えることによって改変し、配列番号２のヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号２の配列を有する。配列番号２によってコードされるｓｈＲＮＡは、配列番号１と比較して、ＨＰＲＴの同様のノックダウンを達成すると考えられる。同様に、配列番号２によってコードされるｓｈＲＮＡの発現によるＨＰＲＴのノックダウンを通して実質的にＨＰＲＴを欠損した細胞は、チオグアニン類似体（例えば、６ＴＧ）を使用する選択を可能にすると考えられる。

【0110】

いくつかの実施形態では、ベクター内に存在するＲＮＡｉは、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有する核酸分子のような核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、ベクター内に存在するＲＮＡｉは、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する核酸分子のような核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有する核酸分子は、宿主細胞の細胞質に見出される。

【0111】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有する少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有する少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３または配列番号４の核酸配列を有する少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

【0112】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では、「ｓｈＨＰＲＴ６１６」と呼ばれる）。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号５の配列を有する（図３も参照）。

【0113】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では、「ｓｈＨＰＲＴ２１１」と呼ばれる）。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号６の配列を有する（図４も参照）。

【0114】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する（本明細書では、「ｓｈＨＰＲＴ７３４．１」と呼ばれる）（図５も参照）。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。よりさらなる実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号７の配列を有する（図５も参照）。

【0115】

マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、それらの標的遺伝子の発現を転写後に調節する非コードＲＮＡの群である。これらの一本鎖分子は、細胞質でのそれらの翻訳を防ぐようにそれらの標的ｍＲＮＡの３’未翻訳領域（ＵＴＲ）に結合する他のタンパク質とｍｉＲＮＡ媒介サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）複合体を形成する。

【0116】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ二次構造に埋め込まれる（「マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ」）。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡ核酸配列は、マイクロＲＮＡ二次構造に埋め込まれる。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、ＨＰＲＴ内のコード配列を標的化し、ＨＰＲＴ発現のノックダウンを達成し、これは付随する経路の飽和、および細胞毒性またはオフターゲット効果なくＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡの利用と等価であると考えられる。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、新規の人工マイクロＲＮＡ ｓｈＲＮＡである。そのような新規のマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡの産生は、その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｆａｎｇ，Ｗ．＆Ｂａｒｔｅｌ，Ｄａｖｉｄ Ｐ．Ｔｈｅ Ｍｅｎｕ ｏｆ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ Ｄｅｆｉｎｅ Ｐｒｉｍａｒｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０、１３１～１４５頁に記載される。

【0117】

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号８の配列を有する（「ｍｉＲＮＡ７３４－Ｄｅｎｏｖｏ」）（図６も参照）。配列番号８のＲＮＡ形態は、配列番号２２を有する。

【0118】

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、配列番号９の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ２１１－Ｄｅｎｏｖｏ」）（図７も参照）。配列番号９のＲＮＡ形態は、配列番号２３を有する。

【0119】

他の実施形態では、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡは、第三世代ｍｉＲＮＡ足場改変ｍｉＲＮＡ１６－２である（以降「ｍｉＲＮＡ－３Ｇ」）（例えば、図８および図９を参照）。そのようなｍｉＲＮＡ－３Ｇ分子の合成は、その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｃｕｅｌｌａｒ，Ｔ．Ｌ．＆Ｈａｌｅｙ，Ｂ．“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｒｓｔ，ｓｅｃｏｎｄ，ａｎｄ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈａｉｒｐｉｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ、”ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、２５～３３頁（２０１６年）に記載される。

【0120】

いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の配列と少なくとも９６％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の配列と少なくとも９８％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の配列と少なくとも９９％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１０の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ２１１－３Ｇ」）（図９も参照）。

【0121】

いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ－３Ｇは、配列番号１１の核酸配列を有する（「ｍｉＲＮＡ７３４－３Ｇ」）（図８も参照）。

【0122】

いくつかの実施形態では、ｓｈ７３４ｓｈＲＮＡは、１７ヌクレオチド塩基対ステムおよび４ヌクレオチドループを有するｍｉＲＮＡ－４５１（配列番号２４を参照）構造を模倣するように適合される（ｍｉＲ－４５１は薬物輸送タンパク質Ｐ糖タンパク質を調節する）。特に、この構造は、ＤＩＣＥＲによるプロセシングを必要としない。ｐｒｅ－４５１ ｍＲＮＡ構造は、Ａｇｏ２により、続いてポリ（Ａ）特異的リボヌクレアーゼ（ＰＡＲＮ）により切断され、成熟ｍｉＲＮＡ－４５１構造模倣体を生成すると考えられる。Ａｇｏ－ｓｈＲＮＡは内在性ｍｉＲ－４５１の構造を模倣し、ＤＩＣＥＲ非依存性である利点を有し得る。これは、可変３’－５’エキソヌクレアーゼ活性による、パッセンジャーローディングのオフターゲット効果を制限すると考えられる（成熟２３～２６ｎｔ）（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｅ．，ａｎｄ Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ．２０１７年．ＤＩＣＥＲ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５：１０３６９～１０３７９頁を参照）。単一ＲＮＡｉ活性ガイドのオフターゲット効果の効果的な減少、細胞性ＲＮＡｉ ＤＩＣＥＲ機構の飽和がないことを含む、ｓｈＲＮＡの代替のＤＩＣＥＲ非依存的プロセシングを利用する利点が存在するとも考えられ、より短いＲＮＡ二重鎖は生来のＲＩＧ－Ｉ応答を誘発しにくいようである。

【0123】

ＲＮＡｉの代替物
ＲＮＡｉの組み込みの代替物として、いくつかの実施形態では、発現ベクターは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列を含み得る。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、タンパク質の転写または翻訳を干渉する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡを標的化し、その複製および／または転写を干渉する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡの未成熟な一本鎖である前駆体ｍＲＮＡ）、およびｍＲＮＡを含むＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳の部位への移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を産生するＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関与するまたはＲＮＡによって促進される触媒活性に影響し得る。そのような干渉の全効果は、標的タンパク質発現を調節する、低下させる、または阻害することである。

【0124】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、エキソンスキッピング因子またはエキソンスキッピング導入遺伝子をコードする核酸配列を組み込む。本明細書で使用する場合、句「エキソンスキッピング導入遺伝子」または「エキソンスキッピング因子」は、エキソンスキッピングを生成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする任意の核酸を指す。「エキソンスキッピング」は、タンパク質産生の間にｐｒｅ－ｍＲＮＡレベルでスキップおよび除去されるエキソンを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン内のスプライス部位または調節要素と干渉し得ると考えられる。これは、遺伝子変異の存在にもかかわらず、トランケートした、部分的に機能性のタンパク質をもたらし得る。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であってよく、ｐｒｅ－メッセンジャーＲＮＡの変異部位へと結合し、エキソンスキッピングを誘導することができる。

【0125】

エキソンスキッピング導入遺伝子は、エキソンスキッピングを生じ得る因子をコードし、そのような因子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン内のスプライス部位または調節要素と干渉し、遺伝子変異の存在にもかかわらず、トランケートした、部分的に機能性のタンパク質をもたらし得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変異特異的であってよく、ｐｒｅ－メッセンジャーＲＮＡの変異部位へと結合し、エキソンスキッピングを誘導することができる。エキソンスキッピングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知であり、一般に、ＡＯＮと呼ばれる。そのようなＡＯＮは、低分子核ＲＮＡ（「ｓｎＲＮＡ」）を含み、それは、核に限定され、スプライシングまたは他のＲＮＡプロセシング反応に関与する、低分子ＲＮＡ分子のクラスである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例、それを設計する方法、および関連する産生方法が、例えば、その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１５０２２５７１８号、第２０１５０１５２４１５号、第２０１５０１４０６３９号、第２０１５００５７３３０号、第２０１５００４５４１５号、第２０１４０３５００７６号、第２０１４０３５００６７号、および第２０１４０３２９７６２号に開示される。

【0126】

いくつかの実施形態では、本開示の発現ベクターは、ＨＰＲＴの発現中にエキソンスキッピングをもたらす、またはＨＰＲＴ重複変異（例えば、エキソン４における重複変異）をもたらすエキソンスキッピング因子をコードする核酸を含む（その開示がその全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｂａｂａ Ｓら Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＰＲＴ１ ｃａｕｓｉｎｇ ａ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１７年１月 ２；３６（１）：１～６頁を参照）。

【0127】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴは、スプライソソームトランススプライシングによって、改変した変異配列で置き換えられ、したがってＨＰＲＴを促進することができる。いくつかの実施形態では、これは（１）標的ＲＮＡにおいてコード配列を置き換える変異コード領域、（２）５’または３’スプライス部位、および／または（３）結合ドメイン、すなわち標的ＨＰＲＴ ＲＮＡに相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を必要とする。いくつかの実施形態では、３つ全ての要素が必要である。

【0128】

プロモーター
開示された発現ベクター内に組み込まれた核酸配列のそれぞれの発現を駆動するのに種々のプロモーターが使用される。例えば、ＲＮＡｉ（例えば、抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡ）をコードする第１の核酸配列は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌ ＩＩプロモーターの１つから選択される第１のプロモーターから発現される。同様に、別の例によって、ＨＰＲＴを下方調節するミクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌ ＩＩプロモーターの１つから選択される第１のプロモーターから発現される。一部の実施形態では、プロモーターは、当業者に公知である構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターでもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターはＨＩＶ ＬＴＲの少なくとも一部（例えば、ＴＡＲ）を含む。

【0129】

適切なプロモーターの非限定的例は、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを含むがこれらに限定されない。「ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」または「ポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター」とは、細胞中その天然の状況において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと会合するもしくは相互作用してその作動可能に連結した遺伝子を転写する任意の無脊椎動物プロモーター、脊椎動物プロモーター、もしくは哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、霊長類、サル、等のプロモーター、または選択された宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと相互作用して作動可能に連結した核酸配列を転写する、天然であれ操作されたものであれ、その任意の変異体のことを意味する。本開示の発現ベクターでの使用に適したＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＵ６、マウスＵ６、およびヒトＨ１他を含むがこれらに限定されない。

【0130】

ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、Ｅｆ１アルファ、ＣＭＶ、およびユビキチンを含むがこれらに限定されない。他の特定のｐｏｌ ＩＩプロモーターは、アンキリンプロモーター（Ｓａｂａｔｉｎｏ ＤＥ，ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ．（２４）：１３２９４～９頁（２０００））、スペクトリンプロモーター（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＰＧ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４（１０）：６０６２～７３頁、（２０００））、トランスフェリン受容体プロモーター（Ｍａｒｚｉａｌｉ Ｇ，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２１（５２）：７９３３～４４頁、（２００２））、バンド３／アニオントランスポータープロモーター（Ｆｒａｚａｒ ＴＦ，ら、ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１４）：４７５３～６３頁、（２００３））、バンド４．１プロモーター（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＰＲ，ら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５５（２）：３２１～４４頁、（１９８４））、ＢｃＩ－Ｘｌプロモーター（Ｔｉａｎ Ｃ，ら、Ｂｌｏｏｄ １５；１０１（６）：２２３５～４２頁（２００３））、ＥＫＬＦプロモーター（Ｘｕｅ Ｌ，ら、Ｂｌｏｏｄ．１０３（１１）：４０７８～８３頁（２００４））．Ｅｐｕｂ ２００４年２月５日）、ＡＤＤ２プロモーター（Ｙｅｎｅｒｅｌ ＭＮ，ら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．３３（７）：７５８～６６頁（２００５））、ＤＹＲＫ３プロモーター（Ｚｈａｎｇ Ｄ，ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８５（１）：１１７～３０頁（２００５））、ＳＯＣＳプロモーター（Ｓａｒｎａ ＭＫ，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２（２１）：３２２１～３０頁（２００３））、ＬＡＦプロモーター（Ｔｏ ＭＤ，ら、ｂｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ｌ；１１５（４）：５６８～７４頁、（２００５））、ＰＳＭＡプロモーター（Ｚｅｎｇ Ｈ，ら、ＪＡｎｄｒｏｌ（２）：２１５～２１頁、（２００５））、ＰＳＡプロモーター（Ｌｉ ＨＷ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３４（４）：１２８７～９１頁、（２００５））、プロバシンプロモーター（Ｚｈａｎｇ Ｊ，ら、１４５（ｌ）：１３４～４８頁、（２００４））．Ｅｐｕｂ ２００３年９月１８日）、ＥＬＡＭ－Ｉプロモーター／Ｅ－セレクチン（Ｗａｌｔｏｎ Ｔ，ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（３Ａ）：１３５７～６０頁、（１９９８））、シナプシンプロモーター（Ｔｈｉｅｌ Ｇ，ら、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ．，８８（８）：３４３１～５頁（１９８８））、ウィルブランド因子プロモーター（Ｊａｈｒｏｕｄｉ Ｎ，Ｌｙｎｃｈ ＤＣ．ＭｏＩ Ｃｅｌｌ－５ｚｏ／．１４（２）：９９９～１００８頁、（１９９４））、ＦＬＴｌ（Ｎｉｃｋｌｉｎ ＳＡ，ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３８（ｌ）：６５～７０頁、（２００１））、Ｔａｕプロモーター（Ｓａｄｏｔ Ｅ，ら、ＪＭｏＩ Ｂｉｏｌ．２５６（５）：８０５～１２頁、（１９９６））、チロシナーゼプロモーター（Ｌｉｌｌｅｈａｍｍｅｒ Ｔ，ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００５））、パンダープロモーター（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ ＢＲ，ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００５））、神経特異的エノラーゼプロモーター（Ｌｅｖｙ ＹＳ，ら、ＪＭｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１～３２頁、（２００３））、ｈＴＥＲＴプロモーター（Ｉｔｏ Ｈ，ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６（６）：６８５～９８頁、（２００５））、ＨＲＥ応答エレメント（Ｃｈａｄｄｅｒｔｏｎ Ｎ，ら、ＩｎｔＪＲａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．６２（ｌ）：２Ｕ～２２頁、（２００５））、ｌｃｋプロモーター（Ｚｈａｎｇ ＤＪ，ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４（１１）：６７２５～３１頁、（２００５））、ＭＨＣＩＩプロモーター（Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ ＢＲ，ら、Ｂｌｏｏｄ．１０１（７）：２５５１～６頁、（２００３）， Ｅｐｕｂ ２００２年１１月２１日）、およびＣＤｌ Ｉｃプロモーター（Ｌｏｐｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃ，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７２（４６）：２９１２０～６頁（１９９７））を含むがこれらに限定されない。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された薬剤の発現を駆動するプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された薬剤の発現を駆動するプロモーターは、７ｓｋプロモーター（例えば、７ＳＫヒト７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）である。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、アクセションＡＹ５７８６８５（ホモサピエンス細胞株ＨＥＫ－２９３ ７ＳＫ ＲＮＡプロモーター領域、完全配列、アクセションＡＹ５７８６８５）により提供される核酸配列を有する。

【0132】

いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４の配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１４に示される核酸配列を有する。

【0133】

いくつかの実施形態では、利用される７ｓｋプロモーターは、７ｓｋプロモーターと比べて少なくとも１つの突然変異および／または欠失をその核酸配列に含む。適切な７ｓｋプロモーター突然変異はＢｏｙｄ，Ｄ．Ｃ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｒｓｔｅｒ，Ｔ．＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｅｎｓｕｒｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ７ＳＫ Ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５３、６７７～６９０頁（１９９５）に記載されており、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、ｓｈ７３４を含む、プロモーター駆動トランス遺伝子の発現レベルを調節するため７ｓｋプロモーター中に機能的突然変異または欠失をシス調節エレメントで作成する。記載される突然変異を使用して、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターにより駆動されるｓｈ７３４発現レベル間の相関性を確立し、６ＴＧ療法の存在下で安定した選択を受ける機能性ならびに長期の安定性および安全性を導入する。７ｓｋプロモーター突然変異の位置は図１０に描かれている。

【0134】

いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、７ｓｋプロモーターは、配列番号１５に示される核酸配列を有する。

【0135】

他の実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。使用し得る組織特異的プロモーターのいくつかの非限定的例は、ｌｃｋ（例えば、Ｇａｒｖｉｎら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３０５８～３０６４頁、（１９８８）およびＴａｋａｄｅｒａら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２１７３～２１８０頁、（１９８９）参照）、ミオゲニン（Ｙｅｅら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７：１２７７～１２８９頁（１９９３））、およびｔｈｙｌ（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅ １１３：２０７～２１４頁、（１９９２））を含む。

【0136】

プロモーターに作動可能に連結した核酸配列の組合せの非限定的例は以下の表に示されている。

【0137】

【表1】

【0138】

ベクターの産生
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴをノックダウンするように適合された核酸配列を含むカッセットのような発現カセットは、レンチウイルス発現ベクターのような発現ベクター中に挿入されて、発現のための少なくとも１つのトランス遺伝子を有するベクターが提供される。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ｐＴＬ２０ｃ、ｐＴＬ２０ｄ、ＦＧ、ｐＲＲＬ、ｐＣＬ２０、ｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏ、ｐＬＫＯ．１、ｐＬＫＯ．３Ｇ、Ｔｅｔ－ｐＬＫＯ－ｐｕｒｏ、ｐＳｉｃｏ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＶＵＴ－ｔＴＲ－ＫＲＡＢ、ｐＬＬ３．７、ｐＬＢ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ＥＦ．ＣＭＶ．ＲＦＰ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ－ｐｕｒｏ、ｐＬＯＶＥ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ｐＬＸ３０１、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２０、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、Ｔｅｔ－ｐＬＫＯ－ｎｅｏ、ｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＣＷ５７．１、ｐＬｉｏｎＩＩ、ｐＳＬＩＫ－Ｈｙｇｒｏ、およびｐＩｎｄｕｃｅｒ１０－ｍｉｒ－ＲＵＰ－ＰｈｅＳからなる群から選択し得る。他の実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、ｌｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎ ＨＰＶ５６９ベクター、ｌｅｎｔｉｇｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターから選択し得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ｐＴＬ２０ｃ、ｐＴＬ２０ｄ、ＦＧ、ｐＲＲＬおよびｐＣＬ２０からなる群から選択し得る。さらに他の実施形態では、レンチウイルス発現ベクターはｐＴＬ２０ｃである。

【0139】

いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を含む。さらに他の実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を含む。さらなる実施形態では、発現カセットは、配列番号１３の核酸配列を有する。

【0140】

いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１７の核酸配列を有する。

【0141】

いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９０％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９７％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９８％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の配列と少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、配列番号１６の核酸配列を有するＴＬ２０ウイルス骨格を含む。

【0142】

１つまたはそれ以上の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、発現ベクター中の、他のベクターエレメントに対して異なる配向で挿入される（例えば、図３２間の７ｓｋプロモーターの配向を比較されたい）。例えば、７ｓｋ駆動ｓｈ７３４エレメントを、実施例に記載されるＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなトランス遺伝子と比べた場合、同じ方向にまたは反対方向に向けてもよい。さらに他の実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、発現ベクター中の異なる位置に、すなわち、他のベクターエレメントの上流にまたは下流に、例えば、ＵｂＣ駆動ＧＦＰの上流にまたは下流に挿入してもよい。他のベクターエレメントに対して７ｓｋ発現カセットの異なる位置および／または配向はｓｈ７３４の発現を増強し得ると考えられる。

【0143】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのような、他のベクターエレメントに対して上流に位置している。

【0144】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのような、他のベクターエレメントに対して下流に位置している。

【0145】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットとＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントは同じ方向に向けられている。

【0146】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットとＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントは反対方向に向けられている。

【0147】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対してフォワード方向に向けられている。

【0148】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対してリバーズ方向に向けられている。

【0149】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対して上流に位置しておりフォワード方向に向けられている。

【0150】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対して上流に位置しておりリバーズ方向に向けられている。

【0151】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対して下流に位置しておりフォワード方向に向けられている。

【0152】

いくつかの実施形態では、７ｓｋ／ｓｈ７３４発現カセットは、ＵｂＣ駆動ＧＦＰのようなその他のベクターエレメントに対して下流に位置しておりリバーズ方向に向けられている。

【0153】

ＨＰＲＴを下方調節するまたはＨＰＲＴをノックアウトする薬剤の非ウイルス送達
いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするように設計された薬剤（ＲＮＡｉを含む発現構築物を含む）は、他の非ウイルス送達ビヒクルであるナノカプセルを通じて送達される。この方法を通じた該薬剤の送達は、発現されたＲＮＡｉまたは発現ベクター由来の他の薬剤によってＨＰＲＴの下方調節を実現する代替案を表す。本明細書にさらに記載されているように、アンチセンスＲＮＡ、エキソンスキッピングのために設計されたオリゴヌクレオチド、またはナノカプセルを使用する遺伝子編集機構を送達することが可能である。

【0154】

一般に、ナノカプセルは、高分子膜またはコーティングに取り囲まれている貯蔵場所または空洞に活性分子が閉じ込められている典型的なコアシェル構造を示す小胞系である。いくつかの実施形態では、典型的なナノカプセルの殻はポリマー膜またはコーティングで作られている。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは生分解性または生体浸食性ポリマー物質に由来しており、すなわち、ナノカプセルは生分解性および／または浸食性ポリマーナノカプセルである。例えば、ノックダウンおよび／またはノックアウトのための成分は、ポリ乳酸－ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）のような１つまたはそれ以上の生分解性ポリマーを含むナノカプセル内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、２つの異なる正に荷電したモノマー、少なくとも１つの中性モノマー、およびクロスリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、酵素的に分解可能なナノカプセルである。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、単一タンパク質コアおよびペプチドにより架橋された薄いポリマー殻からなる。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、それがプロテアーゼにより特異的に認識可能であり切断されることが可能であるように選択してもよい。いくつかの実施形態では、切断可能なクロスリンカーは、プロテアーゼまた別の酵素の基質となるペプチド配列または構造を含む。

【0155】

ナノカプセルの例は、米国特許出願第９，７８２，３５７号に記載されるナノカプセル；米国特許出願公開第２０１７／０３５４６１３号、および米国特許出願公開第２０１５／００７１９９９号に記載されるナノカプセル；ならびに国際公開第２０１６／０８５８０８号および国際公開第２０１７／２０５５４１号に記載されるナノカプセルを含むがこれらに限定されない。前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、前述の刊行物に記載されるナノカプセルは、ノックダウンおよび／またはノックアウトのための成分、例えば、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを輸送するおよび／またはカプセル化するように改変してもよい。他の適切なナノカプセル、その合成方法、および／またはカプセル化方法は、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６８２号にさらに開示されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトを実現するための成分を輸送するおよび／またはカプセル化するように改変してもよいさらに他の適切なナノカプセルは、国際公開第２０１３／１３８７８３号、国際公開第２０１３／０３３７１７号、および国際公開第２０１４／０９３９６６号に記載されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0156】

いくつかの実施形態では、ナノカプセルは特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３４造血幹細胞および前駆細胞）をｉｎ ｖｉｖｏで標的にするように適合される。例えば、ナノカプセルは、ポリマーナノカプセルに結合された１つまたはそれ以上の標的化部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的化部分は特定の細胞型までポリマーナノカプセルを送達し、細胞型は、免疫細胞、血液細胞、心細胞、肺細胞、視覚細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞、中枢神経系の細胞、末梢神経系の細胞、がん細胞、ウイルスが感染した細胞、幹細胞、皮膚細胞、腸管細胞、および／または聴細胞を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、標的化部分は抗体である。

【0157】

いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、少なくとも１つの標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、２つ～６つの間の標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は抗体である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ１１７、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３５、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９６、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、およびＣＤ９マーカーのいずれか１つを標的にする。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４９ａ－ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、およびＳｔｒｏ－１マーカーを含む、ヒト間葉系幹細胞ＣＤマーカーのいずれか１つを標的にする。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９０、およびＣＤ４９を含むヒト造血幹細胞のいずれか１つを標的にする。

【0158】

該ナノカプセルに適したペイロードは、ＨＰＲＴを標的にする合成オリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびＡｇｏ－ｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードを、Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＰｏｌ ＩＩ駆動プロモーターカセットで発現してもよい。

【0159】

他の実施形態では、ＨＰＲＴを下方調節するための薬剤をバイオナノカプセル内で製剤化してもよく、バイオナノカプセルは遺伝子操作された微生物により産生されるナノサイズカプセルである。いくつかの実施形態では、バイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原粒子（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）粒子）のようなウイルスタンパク質由来または改変ウイルスタンパク質由来粒子である。他の実施形態では、バイオナノカプセルは、脂質二重膜およびウイルス表面抗原粒子のようなウイルスタンパク質由来または改変ウイルスタンパク質由来粒子を含むナノサイズカプセルである。該粒子は、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞のような真核細胞から精製することができる。カプセルのサイズは、約１０ｎｍ～約５００ｎｍの間の範囲でもよい。他の実施形態では、カプセルのサイズは、約２０ｎｍ～約２５０ｎｍの間の範囲でもよい。さらに他の実施形態では、カプセルのサイズは、約８０ｎｍ～約１５０ｎｍの間の範囲でもよい。

【0160】

アンチセンスＲＮＡ
アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）は、細胞内で転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖に相補的な一本鎖ＲＮＡである。いかなる特定の理論にも縛られたくはないが、アンチセンスＲＮＡは細胞中に導入されて、相補的ｍＲＮＡと塩基対合し翻訳機構を物理的に妨害することにより相補的ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられる。別の言い方をすれば、アンチセンスＲＮＡは、特定のｍＲＮＡとの相補的な関係を示す一本鎖ＲＮＡ分子である。

【0161】

アンチセンスＲＮＡは、遺伝子制御のために利用されて、タンパク質合成のために使用されるｍＲＮＡを特異的に標的化する。アンチセンスＲＮＡは、相補的ｍＲＮＡと物理的に対になって結合し、したがって、ｍＲＮＡが翻訳機構において処理される能力を阻害する。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート改変アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用して、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡのコード領域内の配列を標的化する。これらのオリゴヌクレオチドは、上記のように、標的に向けられたナノ粒子を使用して、特定の細胞集団および解剖学的部位に送達することができる。

【0162】

エキソンスキッピング
本明細書に記述されているように、エキソンスキッピングを利用して、ＨＰＲＴ遺伝子内に欠損を作り出しＨＰＲＴ欠損をもたらしてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（改変したオリゴヌクレオチドを含む）をナノカプセルによって送達してもよく、オリゴヌクレオチドは、スプライシングされていないＨＰＲＴ ｍＲＮＡを標的化し、活性に必要なイントロンの早期終結またはスキッピングを媒介するように設計される。ＨＰＲＴ重複突然変異、例えば、エキソン４での重複突然変異（Ｂａｂａ Ｓ，ら、「Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＰＲＴ１ ｃａｕｓｉｎｇ ａ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１７年１月２日；３６（１）：１～６頁参照）を導入すればＨＰＲＴタンパク質のスプライシングエラーおよび機能的不活化を引き起こすことができると考えられる。スプライソソームトランススプライシングにより、ＨＰＲＴを改変した突然変異配列で置き換えるのは、ＨＰＲＴをノックダウンするための潜在的治療戦略である。これは、（１）標的ＲＮＡ中のコード配列を置き換える突然変異コード領域、（２）５’または３’スプライス部位、および（３）標的ＲＮＡに相補的である結合ドメイン、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を必要とすると考えられる。

【0163】

オリゴヌクレオチドを、それがヌクレアーゼ抵抗であるように構造的に改変してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、改変した骨格または非天然ヌクレオシド間連鎖を有する。改変した骨格を有する該オリゴヌクレオチドは、骨格にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび骨格にリン原子がないオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのヌクレオシド間骨格にリン原子がない改変したオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると見なすことができる。他の実施形態では、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連鎖の両方、すなわち、骨格が新規の基で置き換えられるように改変される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つの該オリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが明らかにされているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格を含有するアミドで置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。改変したオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の置換された糖部分も含有し得る。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）改変物または置換物も含み得る。ある特定の核酸塩基は、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増やすために特に有用である。これらは、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンを限定せずに含む。５－メチルシトシン置換物は、核酸二重鎖安定性を約０．６～約１．２℃増加することが明らかにされており、より詳しくは、２’－Ｏ－メトキシエチル糖改変物と組み合わせた場合、現在好ましい塩基置換物である。

【0164】

ＨＰＲＴをノックアウトするための遺伝子編集
本開示は、ＨＰＲＴのノックアウト用の組成物も提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集手法を使用してＨＰＲＴをノックアウトしてもよい。例えば、単離された細胞を、ＨＰＲＴ標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰでまたはＨＰＲＴ標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰで処理してもよい。本明細書で提供される「リボ核タンパク質複合体」とは、核タンパク質およびリボ核酸を含む複合体または粒子のことである。本明細書で提供される「核タンパク質」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合することができるタンパク質のことである。核タンパク質がリボ核酸に結合する場合、それは「リボ核タンパク質」と呼ばれる。リボ核タンパク質とリボ核酸の間の相互作用は、直接的、例えば、共有結合による、または間接的、例えば、非共有結合（例えば、静電気相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（Ｐｉ効果）、疎水性相互作用および同類のもの）によるでもよい。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質は、リボ核酸に非共有結合しているＲＮＡ結合モチーフを含む。例えば、ＲＮＡ結合モチーフ中の正に荷電した芳香族アミノ酸残基（例えば、リジン残基）は、ＲＮＡの陰性核酸リン酸骨格と静電気相互作用を形成し、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。リボ核タンパク質の非限定的例は、リボソーム、テロメラーゼ、ＲＮＡｓｅＰ、ｈｎＲＮＰ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）および核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）を含む。リボ核タンパク質は酵素でもよい。実施形態では、リボ核タンパク質はエンドヌクレアーゼである。したがって、いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体はエンドヌクレアーゼおよびリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質１２ａである。

【0165】

いくつかの実施形態では、リボ核酸はガイドＲＮＡである（例えば、配列番号２５～３９参照）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９はリボ核酸に結合しており、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９でありリボ核酸はガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質１２ａはリボ核酸に結合しており、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａでありリボ核酸はガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質１２ｂはリボ核酸に結合しており、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ｂでありリボ核酸はガイドＲＮＡである。したがって、ガイドＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）は、核タンパク質に結合することができるリボヌクレオチド配列を含み、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは１つまたはそれ以上のＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは標的部位に相補的であるヌクレオチド配列を含む。相補的ヌクレオチド配列は、標的部位へのリボ核タンパク質複合体の結合を媒介し、それによって、リボ核タンパク質複合体の配列特異性を提供し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは標的核酸に相補的である。

【0166】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば、配列番号２５～３９のガイドＲＮＡのうちのいずれか）は標的核酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約５０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約５５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約６０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約６５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの相補体は、標的核酸の約９９％の配列同一性を有する。

【0167】

本明細書で提供される標的核酸配列は、細胞により発現される核酸配列である。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は外来性核酸配列である。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は内在性核酸配列である。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は細胞遺伝子の一部を形成する。したがって、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞遺伝子またはその断片に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的核酸配列に約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞遺伝子の配列に約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは細胞遺伝子配列に結合する。

【0168】

いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子内の配列（配列番号１２）を標的化するｇＲＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集に必要なｇＲＮＡおよび別の成分はナノカプセル内で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトＸ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置にある配列を標的化するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置を有する配列を標的化するｇＲＮＡを含み、標的化された配列は約１４～約２８連続塩基対に及ぶ長さを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置を有する配列を標的化するｇＲＮＡを含み、標的化された配列は約１５～約２６連続塩基対に及ぶ長さを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置を有する配列を標的化するｇＲＮＡを含み、標的化された配列は約１６～約２４連続塩基対に及ぶ長さを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置を有する配列を標的化するｇＲＮＡを含み、標的化された配列は約１７～約２２連続塩基対に及ぶ長さを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置を有する配列を標的化するｇＲＮＡを含み、標的化された配列は約１８～約２２連続塩基対に及ぶ長さを有する。

【0169】

いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９６％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９８％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物はナノカプセルであり、ｇＲＮＡおよび遺伝子編集のための別の成分（例えば、Ｃａｓタンパク質）はナノカプセル内に含まれる。

【0170】

いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９６％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９７％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９８％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置に位置する標的配列と少なくとも９９％配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置の標的配列の相補体は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置の標的配列の相補体は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置の標的配列の相補体は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ染色体内の約１３４４６０１４５～約１３４５００６６８に及ぶ位置の標的配列の相補体は、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９９％同一性を有する。

【0172】

宿主細胞
本開示は、本開示の新規の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。「宿主細胞」または「標的細胞」とは、本開示の組成物、例えば、発現ベクターまたはナノカプセルを使用して形質転換される（すなわち、形質導入されるまたはトランスフェクトされる）ことになる細胞を意味する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＰＲＴをノックダウンするよう適合された核酸をコードする発現ベクターでの形質導入後、実質的にＨＰＲＴ欠損になる。他の実施形態では、宿主細胞は、ＨＰＲＴのノックアウトを実現するように設計された成分を含むナノカプセルでのトランスフェクション後、実質的にＨＰＲＴ欠損になる。ＨＰＲＴをノックダウンする発現ベクターで宿主細胞を形質導入するまたはＨＰＲＴをノックアウトするナノカプセルで宿主細胞をトランスフェクトする方法は、同時係属中の米国特許出願第１６／０３８，６４３号に記載されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は単離されるおよび／または精製される。

【0173】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発現ベクターを発現することができる哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、アカゲザル細胞）、ヒト前駆細胞または幹細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｄ１７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣｆ２Ｔｈ細胞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血前駆細胞／幹細胞（例えば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞）、単球、マクロファージ、末梢血単核球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、または樹状細胞のような造血細胞である。

【0174】

本開示の発現ベクターで形質導入されるまたはナノカプセルでトラスフェクトされる造血細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球および／または単球／マクロファージ）は、同種異系間の、自己の、または適合兄弟姉妹由来が可能である。造血前駆細胞／幹細胞は、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４陽性であり、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。単離されたＣＤ３４陽性造血前駆細胞／幹細胞（および／または本明細書に記載される他の造血細胞）は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現ベクターで形質導入される。

【0175】

いくつかの実施形態では、改変した宿主細胞は薬学的に許容される担体と組み合わされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（例えば、静脈内投与のための無菌非発熱性等張溶液；その場合、１リットルのＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａは、１４０ｍＥｑナトリウム、５ｍＥｑカリウム、３ｍＥｑマグネシウム、９８ｍＥｑ塩化物、２７ｍＥｑアセテート、および２３ｍＥｑグルコン酸のイオン濃度を有する）で製剤化される。他の実施形態では、宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、約８％と約１０％の間のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液である、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａの溶液で製剤化される。いくつかの実施形態では、約２×１０^７個未満の宿主細胞／形質導入された宿主細胞が、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ ＡおよびＤＭＳＯを含む１ｍＬあたりの製剤に存在する。

【0176】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示に従った発現ベクターでの形質導入後に実質的にＨＰＲＴ欠損になる。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子発現のレベルは少なくとも約８０％低減される。２０％またはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現を有する細胞は、６ＴＧのようなプリン類似体に感受性であり、プリン類似体を用いたその選択を可能にすると考えられる（例えば、図２２参照）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号３または配列番号４の少なくとも１つと少なくとも９０％同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号３または配列番号４の少なくとも１つと少なくとも９５％同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号３または配列番号４の少なくとも１つを含む核酸分子を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、宿主細胞の形質導入は、本開示の発現ベクターおよび形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物に宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることにより増やしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物、すなわち、１つまたはそれ以上の化合物の非存在下でプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性と比べて１つまたはそれ以上の化合物に接触させた細胞においてプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性を増やす１つまたはそれ以上の化合物である。いくつかの実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、またはその類似体もしくは誘導体を含むがこれらに限定されない、プロスタグランジンＥＰ受容体リガンドである。他の実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、レトロネクチン（組換えヒトフィブロネクチン断片の６３ｋＤ断片、Ｔａｋａｒａより入手可能）；Ｌｅｎｔｉｂｏｏｓｔ（膜シーリングポロクサマー、Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能）、硫酸プロタミン、シクロスポリンＨ、およびラパマイシンを含むがこれらに限定されない。さらに他の実施形態では、形質導入効率を増やす１つまたはそれ以上の化合物は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマーＦ１２７）を含む。

【0178】

医薬組成物
本開示は、本明細書で開示される１つまたはそれ以上の発現ベクターおよび／または非ウイルス送達ビヒクル（例えば、ナノカプセル）を含む、医薬組成物を含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される発現ベクターおよび／または非ウイルス送達ビヒクルの少なくとも１つの有効量ならびに薬学的に許容される担体を含む。例えば、ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効量の発現ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。有効量は、当業者であれば、対象の身体サイズ、体重、年齢、健康、性別、民族性、およびウイルス力価のような要因に基づいて容易に決定することができる。

【0179】

本開示の別の態様では、（ａ）ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクター；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物がある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は乳濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はミセル内で製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はポリマー内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はリポソーム内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はミニセルまたはナノカプセル内にカプセル化される。

【0180】

本開示の別の態様では、（ａ）それぞれのナノカプセルが適合されたノックアウトＨＰＲＴへのペイロード（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ１２ａタンパク質および／または配列番号２５～３９のうちのいずれか１つのｇＲＮＡのようなｇＲＮＡ）を含む、ナノカプセルの集団；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物がある。いくつかの実施形態では、ナノカプセルはポリマーナノカプセルである。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、特定の型の細胞へのリボ核タンパク質またはリボ核タンパク質複合体の送達を促進する少なくとも１つの標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは浸食性または生分解性である。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、ｐＨ感受性クロスリンカーを含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍの間の範囲であるサイズを有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約２００ナノメートル（ｎｍ）未満またはこれに等しい平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約１～２００ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約５～約２００ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約１０～約１５０ｎｍ、または１５～１００ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約１５～約１５０ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約２０～約１２５ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約５０～約１００ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーナノカプセルは、約５０～約７５ｎｍの間の平均径を有する。いくつかの実施形態では、ナノカプセルの表面は約１～約１５ミリボルト（ｍＶ）の間の電荷（例えば標準リン酸塩溶液において測定される）を有し得る。他の実施形態では、ナノカプセルの表面は約１～約１０ｍＶの間の電荷を有し得る。

【0182】

語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性の、または他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物のことである。例えば、発現ベクターは薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、溶剤、バッファー、溶液、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤ならびにヒトへの投与に適した医薬品のような医薬品を製剤化する際の使用に適した同類のものを含む。製薬担体と一緒の化合物の製剤化のための方法は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、（第１７版．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１９８５年）；およびＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１１版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、２００５年）に記載されており；前記文献のそれぞれの開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0183】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される発現ベクター、ナノカプセル、または組成物のいずれでも、投与されたサイレンシング核酸が約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を達成するのを可能にするいかなる濃度で含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１重量％～約９９．９重量％までの量で発現ベクターを含んでもよい。任意の医薬組成物内での包含に適した薬学的に許容される担体は、水、緩衝水、例えば、通常生理食塩水のような生理食塩水またはハンクスもしくはアール平衡溶液のような平衡生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、等を含む。医薬組成物を、静脈内、筋肉内または皮下投与のような非経口投与用に製剤化してもよい。非経口投与用の医薬組成物は、薬学的に許容される無菌水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液または乳濁液ならびに無菌注射液または分散液への復元用の無菌粉末を含んでもよい。適切な水溶性および非水溶性担体、溶剤、希釈剤またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、等のような）、カルボキシメチルセルロースおよびその混合物、植物油（オリーブオイルのような）、注射可能な有機エステル類（例えば、オレイン酸エチル）を含む。

【0184】

医薬組成物は経口投与用に製剤化される。経口投与用の固体剤形は、例えば、錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒を含んでいてもよい。該固体剤形では、組成物は、クエン酸ナトリウムおよび／もしくはリン酸二カルシウムのような少なくとも１つの薬学的に許容される担体ならびに／またはデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸のような充填剤もしくは延長剤；カルボキシルメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアのような結合剤；グリセリンのような保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；アセチルアルコール、グリセリンモノステアレートのような湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤（ａｂｓｏｒｂａｎｔｓ）；ならびに／またはタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤を含んでいてもよい。経口投与用の液体剤形は、例えば、薬学的に許容される乳濁液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含んでいてもよい。液体剤は、水もしくは他の溶剤のような不活性希釈液、可溶化剤ならびに／またはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（例えば、綿実油、トウモロコシ油、胚芽油、ひまし油、オリーブオイル、ゴマ油のような）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物のような乳濁液を含んでいてもよい。

【0185】

医薬組成物は、その送達を増強する浸透増強剤を含んでいてもよい。浸透増強剤は、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、ジカプリン酸（ｄｉｃａｐｒａｔｅ）、レクリネート（ｒｅｃｌｉｎｅａｔｅ）、モノオレイン、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１－モノカプレート、モノおよびジ－グリセリドのような脂肪酸ならびにそれらの生理的に許容される塩を含んでいてもよい。組成物は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸塩、ホモバニリン酸塩）のようなキレート剤をさらに含んでいてもよい。

【0186】

医薬組成物は、本明細書で開示される発現ベクターのいずれかをカプセル化形態で含んでもよい。例えば、発現ベクターは、ポリ乳酸－ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）のような生分解性ポリマーによりカプセル化される、またはリポソームにカプセル化されるもしくはミクロ乳濁液内に分散される。リポソームは、例えば、リポフェクチンまたはリポフェクタミンでもよい。別の例では、組成物は、無核細菌ミニ細胞中にまたはこの上に本明細書で開示される発現ベクターを含んでいてもよい（Ｇｉａｃａｌｏｎｅら、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００６年、８（１０）：１６２４～３３頁）。本明細書で開示される発現ベクターはナノ粒子と組み合わせてもよい。

【0187】

安定した産生細胞株
本開示の別の態様には、ウイルス力価を生成するための安定な産生細胞株があり、安定な産生細胞株はＧＰＲ、ＧＰＲＧ、ＧＰＲＴ、ＧＰＲＧＴ、またはＧＰＲＴ－Ｇパッキング細胞株のうちの１つに由来する。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株はＧＰＲＴ－Ｇ細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、安定な産生細胞株は、（ａ）少なくとも抗ＨＰＲＴ ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を組換えプラスミド中にクローニングすることにより発現ベクターを合成する（すなわち、合成されたベクターは本明細書に記載されるベクターのうちいずれか１つでよい）；（ｂ）合成されたベクターからＤＮＡ断片を作成する；（ｃ）（ｉ）合成されたベクターから生成されたＤＮＡ断片から、および（ｉｉ）抗生物質耐性カセットプラスミド由来のＤＮＡ断片からコンカテマーアレイを形成する；（ｄ）パッキング細胞株の１つに形成されたコンカテマーアレイをトランスフェクトする；ならびに（ｅ）安定な産生細胞株を単離することにより、生成される。安定な産生細胞株を形成する追加の方法は、２０１６年５月１２日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３１９５９に開示されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0188】

キット
いくつかの実施形態には、本明細書に記載される発現ベクターを含むキットまたは発現ベクターを含む組成物がある。キットは容器を含んでいてよく、容器は、発現ベクターまたは組成物を経口または非経口剤形で含むビンでもよく、それぞれの剤形は単位用量の発現ベクターを含む。キットは、本明細書に記載される方法に従った対象の処置を指示するラベルまたは同類のものを含んでいてもよい。同様に、他の実施形態には、本明細書に記載されるＨＰＲＴをノックアウトするよう適合されたペイロードを含むナノカプセルの集団を含む組成物を含むキットがある。

【0189】

いくつかの実施形態では、キットは追加の活性剤を含んでいてもよい。追加の活性剤を、ベクターまたはベクターを含む組成物を収納する容器から離れている容器に収納してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、プリン類似体（例えば、６ＴＧ）の１つまたはそれ以上の用量、ならびに、場合により、条件付けおよび／またはケモセレクションのためにプリン類似体を投与するための説明書を含んでいてもよい（それらの工程は本明細書にさらに記載されている）。他の実施形態では、キットはＭＴＸまたはＭＰＡの１つまたはそれ以上の用量、および、場合により、本明細書に記載される負の選択のためにＭＴＸまたはＭＰＡを投与するための説明書を含んでいてもよい。

【0190】

実質的にＨＰＲＴ欠損のリンパ球（「改変したリンパ球」）の製造
本開示の一態様には、ＨＰＲＴ欠損リンパ球、例えば、Ｔ細胞（本明細書では「改変したリンパ球」または「改変したＴ細胞」とも呼ばれる）を産生する方法がある。図１１に関連して、宿主細胞、すなわち、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）は先ずドナーから収集される（工程１１０）。造血幹細胞（ＨＳＣ）もドナーから収集される実施形態では、リンパ球、例えば、Ｔ細胞を、ＨＳＣ移植片が収集されたのと同じドナーからまたは異なるドナーから収集してもよい。これらの実施形態では、細胞を、ＨＳＣ移植片用の細胞と同時にまたは異なる時間に収集してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は同じ動員された末梢血ＨＳＣ収穫から収集される。いくつかの実施形態では、これは、ＣＤ３４陰性画分（ＣＤ３４－陽性細胞はドナー移植片についての標準治療により収集された）または前駆体Ｔ細胞移植片が想定されている場合にはＣＤ３４－陽性ＨＳＣ移植片の一部が可能であると考えられる。

【0191】

当業者であれば、細胞をいかなる手段によって収集してもよいことを認識する。例えば、細胞を、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、または単に簡単な静脈採血を通じて収集してもよい。ＨＳＣ移植片が改変のための細胞と同時に収集される実施形態では、ＨＳＣ移植片は、収集されたリンパ球、例えば、Ｔ細胞の操作および試験のための時間を与えられるように凍結保存される。Ｔ細胞の非限定的例は、ＴヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を含む。

【0192】

細胞の収集に続いて、リンパ球、例えば、Ｔ細胞は単離される（工程１２０）。リンパ球、例えば、Ｔ細胞を、当業者に公知である任意の手段によって収集された細胞の凝集体から単離してもよい。例えば、ＣＤ３＋細胞を、ＣＤ３ミクロビーズおよびＭＡＣＳ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって、収集された細胞から単離してもよい。ＣＤ３マーカーはすべてのＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞受容体に関連すると考えられている。ヒト末梢血リンパ球の約７０～約８０％および胸腺細胞の約６５～８５％がＣＤ３＋であると考えられている。いくつかの実施形態では、ＣＤ３＋細胞はＣＤ３ミクロビーズで磁気的に標識されている。次に、細胞懸濁液は、ＭＡＣＳ分離器の磁場に置かれているＭＡＣＳカラム上にロードされる。磁気的に標識されているＣＤ３＋細胞はカラム上に保持される。非標識細胞は貫流し、この細胞画分はＣＤ３＋細胞が枯渇している。磁場からカラムを取り除いた後、磁気的に保持されたＣＤ３＋細胞は正に選択された細胞画分として溶出させることができる。

【0193】

代わりに、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、ＩＢＡ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＤ６２Ｌ Ｆａｂ Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ単離キットによって、収集された細胞から単離される。ヒトＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の単離は正の選択により実施される。ＰＢＭＣは磁気ＣＤ６２Ｌ Ｆａｂ Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓで標識される。標識された細胞は強力な磁石に単離され、そこで細胞は磁石側の管壁のほうに移動する。このＣＤ６２Ｌ陽性細胞画分は収集され、細胞は強力な磁石にビオチンを添加することによりすべての標識試薬から遊離される。磁気Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓは管壁のほうに移動し、標識のない細胞は上澄みに残る。ビオチンは洗浄することにより取り除く。得られた細胞製剤はＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞が高度に濃縮されており、純度は９０％を超える。枯渇工程もカラムも必要としない。

【0194】

代わりの実施形態では、リンパ球、例えば、Ｔ細胞は工程１２０では単離されず、むしろ工程１１０で収集された細胞の凝集体がそれに続く改変に使用される。いくつかの実施形態では、細胞の凝集体をそれに続く改変に使用してもよいが、いくつかの例では、改変の方法は、細胞の全凝集体内の特定の細胞集団に対して特異的であってもよい。これは、いくつかの方法、例えば、標的化遺伝子ベクター送達により、または、例えば、ＨＰＲＴに対するｓｈＲＮＡの発現を特定の細胞型、すなわち、Ｔ細胞に向けることにより、遺伝子改変を特定の細胞型に向けることで実行できると考えられる。

【0195】

Ｔ細胞の単離に続いて、Ｔ細胞はＨＰＲＴ活性を減らす（工程１３０）、すなわち、ＨＰＲＴ遺伝子の発現を減らすように処理される。例えば、Ｔ細胞を、約５０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約４５％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約４０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約３５％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約３０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約２５％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約２０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約１５％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、約１０％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現、または約５％もしくはそれよりも少ない残りのＨＰＲＴ遺伝子発現を有するように処理してもよい。

【0196】

リンパ球、例えば、Ｔ細胞は、いくつかの方法に従って改変される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、本明細書に記載されるようなＨＰＲＴ遺伝子に向けられたｓｈＲＮＡをコードする発現ベクター、例えば、レンチウイルスベクターでの形質導入により改変してもよい。例えば、発現ベクターは、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡであって、配列番号２、５、６、および７のうちのいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含んでいてもよい。別の例として、発現ベクターは、ＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡであって、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれかの配列と少なくとも９０％同一性を有するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した第１の発現制御配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターはナノカプセル内にカプセル化される。

【0197】

代わりに、リンパ球、例えば、Ｔ細胞を、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合されたペイロードを含むナノカプセルでのトランスフェクションにより改変してもよく、すなわち、遺伝子編集手法を使用してＨＰＲＴをノックアウトしてもよい。例えば、Ｔ細胞を、本明細書に記載される、ＨＰＲＴ標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｂ ＲＮＰで処理してもよい。いくつかの実施形態では、ナノカプセルは、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％配列同一性を有するｇＲＮＡを含んでいてもよい。他の実施形態では、ナノカプセルは、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有するｇＲＮＡを含んでいてもよい。

【0198】

Ｔ細胞が工程１３０で改変された後、ＨＰＲＴ欠損Ｔ細胞の集団が選び出されるおよび／または増殖される（工程１４０）。いくつかの実施形態では、培養により、生着能力が増強された細胞（例えば、中央記憶またはＴ幹細胞表現型）が同時に選び出され増殖される。いくつかの実施形態では、培養期間は１４日未満である。いくつかの実施形態では、培養期間は７日未満である。

【0199】

いくつかの実施形態では、細胞を選び出し増殖する工程は、ＨＰＲＴ欠損（または実質的にＨＰＲＴ欠損）リンパ球、例えば、Ｔ細胞の集団を、グアノシン類似体代謝拮抗物質（６－チオグアニン（６ＴＧ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、またはアザチオプリン（ＡＺＡ）のような）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処理することを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球、例えば、Ｔ細胞は６－チオグアニン（「６ＴＧ」）の存在下で培養され、したがって、工程１３０で改変されなかった細胞を殺傷する。６ＴＧは、細胞においてｄＧＴＰ生合成を妨害することができるグアニン類似体である。チオ－ｄＧは複製中グアニンの代わりにＤＮＡ中に取り込むことができ、取り込まれるとメチル化されることが多い。このメチル化は適切なミスマッチＤＮＡ修復を妨害することができ、細胞周期停止をもたらすおよび／またはアポトーシスを開始することができる。６ＴＧは、急速に分裂する細胞に対するその毒性のせいで、ある特定の種類の悪性腫瘍を持つ患者を処置するために臨床的に使用されてきた。６ＴＧの存在下では、ＨＰＲＴは細胞においてＤＮＡおよびＲＮＡ中への６ＴＧの組込みを担当する酵素であり、適切なポリヌクレオチド合成および代謝を遮断する（図１８参照）。一方、サルベージ経路はＨＰＲＴ欠損細胞において遮断される（図１８参照）。したがって、細胞はプリン合成に新規の経路を使用する（図１７参照）。しかし、ＨＰＲＴ野生型細胞では、細胞はサルベージ経路を使用し、６ＴＧはＨＰＲＴの存在下で６ＴＧＭＰに変換される。６ＴＧＭＰはリン酸化によりチオグアニン二リン酸塩（ＴＧＤＰ）およびチオグアニン三リン酸塩（ＴＧＴＰ）に変換される。同時に、酵素リボヌクレオチド還元酵素によってデオキシリボシル類似体が形成される。６ＴＧが高度に細胞傷害性であることを考慮すると、６ＴＧは、機能的ＨＰＲＴ酵素と一緒に細胞を殺傷する選択剤として使用することができる。

【0200】

次に、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞はプリン類似体にｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。ノックダウン手法では、細胞中にまだ残りのＨＰＲＴが存在している場合があり、ＨＰＲＴノックダウン細胞は一定範囲のプリン類似体を許容することができるが高投与量／量では殺傷されると考えられる。この状況では、ｅｘ ｖｉｖｏ選択に使用されるプリン類似体の濃度は約１５μＭ～約２００ｎＭまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ選択に使用されるプリン類似体の濃度は約１０μＭ～約５０ｎＭまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ選択に使用されるプリン類似体の濃度は約５μＭ～約５０ｎＭまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、濃度は約２．５μＭ～約１０ｎＭまでの範囲に及ぶ。他の実施形態では、濃度は約２μＭ～約５ｎＭまでの範囲に及ぶ。さらに他の実施形態では、濃度は約１μＭ～約１ｎＭまでの範囲に及ぶ。

【0201】

ＨＰＲＴのノックアウト手法では、ＨＰＲＴをＨＰＲＴノックアウト細胞から完全に取り除くまたはほぼ完全に取り除いてもよく、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞はプリン類似体に対して高度に許容的になると考えられる。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ選択に使用されるプリン類似体の濃度はこの場合では約２００μＭ～約５ｎＭまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ選択に使用されるプリン類似体の濃度はこの場合では約１００μＭ～約２０ｎＭまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、濃度は約８０μＭ～約１０ｎＭまでの範囲に及ぶ。他の実施形態では、濃度は約６０μＭ～約１０ｎＭまでの範囲に及ぶ。さらに他の実施形態では、濃度は約４０μＭ～約２０ｎＭまでの範囲に及ぶ。

【0202】

他の実施形態では、細胞の改変（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトを通じて）は、ＨＰＲＴ欠損細胞についてのｅｘ ｖｉｖｏ選択が必要ではない、すなわち、６ＴＧまたは他の同様の化合物での選択が必要ではないほど十分効率的であってよい。

【0203】

いくつかの実施形態では、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞は、プリン類似体におよびキサンチン酸化酵素（ＸＯ）の阻害剤であるアロプリノールの両方に接触させる。ＸＯを阻害することにより、さらに利用可能になった６ＴＧがＨＰＲＴにより代謝されることになる。６ＴＧがＨＰＲＴにより代謝されると、６ＴＧは細胞にとって有毒な代謝物である６ＴＧＮを形成する（６ＴＧＮは一リン酸塩（６ＴＧＭＰ）、二リン酸塩（６ＴＧＤＰ）および三リン酸塩（６ＴＧＴＰ）を包含する）（図１４参照）。（例えば、Ｃｕｒｋｏｖｉｃら、Ｌｏｗ ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ ｄｏｓｅｓ ａｒｅ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３年８月；６９（８）：１５２１～３１頁；Ｇａｒｄｉｎｅｒら、Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ ｍｉｇｈｔ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ ａｎｄ ６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ ｂｙ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ ａｎ ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｒａｔｉｏ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１１年１月；２６（１）：４９～５４頁；Ｓｅｉｎｅｎら、Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ ａｎｄ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｐｉｖｏｔａｌ ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｃｒｏｈｎｓ Ｃｏｌｉｔｉｓ．２０１３年１１月；７（１０）：８１２～９頁；およびＷａｌｌら、Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ ｆｏｒ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１８年２月；３８（２）：２５９～２７０頁参照。前記文献のそれぞれの開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。）

【0204】

いくつかの実施形態では、アロプリノールは、プリン類似体の導入に先立って生成されたＨＰＲＴ欠損細胞に導入される。他の実施形態では、アロプリノールは、プリン類似体の導入と同時に生成されたＨＰＲＴ欠損細胞に導入される。さらに他の実施形態では、アロプリノールは、プリン類似体の導入に続いて生成されたＨＰＲＴ欠損細胞に導入される。

【0205】

選択と増殖に続いて、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞生成物は試験される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞生成物は標準的遊離試験（例えば、活性、マイコプラズマ、生存率、安定性、表現型、等；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ４巻 ２０１７年３月 ９２～１０１頁参照、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に従って試験される。

【0206】

他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞生成物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、ＭＴＸまたはＭＰＡ）に対する感受性について試験される。ＭＴＸとＭＰＡの両方を含むジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、プリンの新規合成を阻害するが、異なる作用機序を有すると考えられている。例えば、ＭＴＸは、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）合成に関与する酵素である、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を競合的に阻害すると考えられている。ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸の活性なテトラヒドロ葉酸への変換を触媒する。葉酸は、ＤＮＡ合成に必要なヌクレオシドチミジンの新規合成に必要とされる。その上、葉酸塩はプリンおよびピリミジン塩基生合成にとって不可欠なので、合成は阻害されることになる。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）は、イノシン－５’－一リン酸（ＩＭＰ）からグアノシン－５’－一リン酸（ＧＭＰ）の新規合成に不可欠な酵素である、イノシン－５’－一リン酸デハイドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）の強力で可逆的で非競合的な阻害剤である。

【0207】

したがって、ＭＴＸまたはＭＰＡの両方を含む、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チミジレート、およびタンパク質の合成を阻害する。ＭＴＸまたはＭＰＡは、ＤＨＦＲを阻害することにより新規の経路を遮断する。ＨＰＲＴ－／－細胞では、サルベージも新規の経路も機能的ではなく、プリン合成をもたらさず、したがって、細胞は死滅する。しかし、ＨＰＲＴ野生型細胞は、機能的なサルベージ経路を持ち、そのプリン合成が行われ、細胞は生存する。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は実質的にＨＰＲＴ欠損である。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約７０％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約７５％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約８０％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約８５％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約９０％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。さらに他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約９５％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。さらに他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞集団の少なくとも約９７％はＭＴＸまたはＭＰＡに対して感受性である。

【0208】

いくつかの実施形態では、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）（ＩＭＰＤＨ阻害剤）；ＶＸ－４９７（ＩＭＰＤＨ阻害剤）（Ｊａｉｎ Ｊ、ＶＸ－４９７：ａ ｎｏｖｅｌ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＩＭＰＤＨ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００１年５月；９０（５）：６２５～３７頁参照）；ロメテレキソール（ＤＤＡＴＨＦ、ＬＹ２４９５４３）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；チオフェン類似体（ＬＹ２５４１５５）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、フラン類似体（ＬＹ２２２３０６）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｈａｂｅｃｋら、Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｌｕｔａｍａｔｅｄ Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ Ｅｘｈｉｂｉｔｓ Ｔｉｇｈｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４、１０２１～２０２６頁、１９９４年２月参照）；ＤＡＣＴＨＦ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｃｈｅｎｇら、Ｄｅｓｉｇｎ、ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ １０－ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ－ＤＤＡＣＴＨＦ、１０－ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ－５－ＤＡＣＴＨＦ、ａｎｄ １０－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－ＤＤＡＣＴＨＦ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＧＡＲ Ｔｆａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｕｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ；Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００５年５月１６日；１３（１０）：３５７７～８５頁参照）；ＡＧ２０３４（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｂｏｒｉｔｚｋｉら、ＡＧ２０３４：ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．１９９６年；１４（３）：２９５～３０３頁参照）；ＬＹ３０９８８７（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（（２Ｓ）－２－［［５－［２－［（６Ｒ）－２－アミノ－４－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロ－１Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル］エチル］チオフェン－２－カルボニル］アミノ］ペンタン二酸）；アルムタ（ＬＹ２３１５１４）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｓｈｉｈら、ＬＹ２３１５１４、ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｌａｔｅ－ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９７年３月１５日；５７（６）：１１１６～２３頁参照）；ｄｍＡＭＴ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、ＡＧ２００９（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；フォロデシン（Ｉｍｍｕｃｉｌｌｉｎ Ｈ、ＢＣＸ－１７７７；ｔｒａｄｅ ｎａｍｅｓ Ｍｕｎｄｅｓｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｄｏｓｉｎｅ）（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）（Ｋｉｃｓｋａら、Ｉｍｍｕｃｉｌｌｉｎ Ｈ、ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ－ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（Ｔ－ｃｅｌｌｓ）、ＰＮＡＳ ２００１年４月１０日．９８（８）４５９３～４５９８頁参照）；およびイムシリン－Ｇ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）を含むがこれらに限定されない代替薬剤をＭＴＸまたはＭＰＡの代わりに使用してもよい。

【0209】

工程１１０から１４０までに従って産生される改変したＴ細胞のＭＴＸまたはＭＰＡに対する感受性を考慮すると、本明細書に記載されるように、ＭＴＸまたはＭＰＡ（または別のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤）を使用してＨＰＲＴ欠損細胞を選択的に取り除いてもよい。いくつかの実施形態では、ＭＴＸまたはＭＰＡの類似体または誘導体をＭＴＸまたはＭＰＡの代わりに使用してもよい。ＭＴＸの誘導体は米国特許出願第５，９５８，９２８号および国際公開第２００７／０９８０８９号に記載されており、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0210】

処置の方法
いくつかの実施形態では、工程１１０から１４０までに従って製造される改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は患者に投与される（工程１５０）。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞、（または本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞もしくはＴＣＲ Ｔ細胞）は単回投与（例えば、単回ボーラス、または一定期間にわたる投与、例えば、約１～４時間もしくはそれよりも長い時間にわたる輸注）で患者に提供される。他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の複数回投与が行われる。改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の複数の用量が投与される場合、それぞれの用量は同じでも異なっていてもよい（例えば、漸増用量、漸減用量）。

【0211】

いくつかの実施形態では、改変したＴ細胞の投与の量は、対象の体重のＣＤ３陽性Ｔ細胞含有量／ｋｇに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、改変したＴ細胞の全用量は、約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約７３０×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の実施形態では、改変したＴ細胞の全用量は、約１×１０^６／ｋｇ体重～約５００×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。さらに他の実施形態では、改変したＴ細胞の全用量は、約１×１０^６／ｋｇ体重～約４００×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。さらなる実施形態では、改変したＴ細胞の全用量は、約１×１０^６／ｋｇ体重～約３００×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。さらなる実施形態では、改変したＴ細胞の全用量は、約１×１０^６／ｋｇ体重～約２００×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。

【0212】

複数用量が提供される場合、投与頻度は約１週間～約３６週間の範囲に及んでもよい。同様に、複数用量が提供される場合、改変したＴ細胞の各用量は約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約２４０×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の実施形態では、改変したＴ細胞の各用量は約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約１８０×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の実施形態では、改変したＴ細胞の各用量は約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約１４０×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の実施形態では、改変したＴ細胞の各用量は約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約１００×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の実施形態では、改変したＴ細胞の各用量は約０．１×１０^６／ｋｇ体重～約６０×１０^６／ｋｇ体重の範囲に及ぶ。他の投与戦略は、Ｇｏｚｄｚｉｋ Ｊら、により記載されており（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ＳＣＴ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１５年１月；５０（１）：５１～５頁）、前記特許文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0213】

改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞を単独でまたは全体治療戦略の一部として投与してもよい。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植の約２～約４週間後のようなＨＳＣ移植に続いて投与される。例えば、いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞はＨＳＣ移植の執行後に投与されて、移植後免疫欠損を防止するまたは軽減する一助となる。改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、短期間（例えば、約３～約９か月）免疫再構築および／または保護を提供し得ると考えられる。別の例として、および他の実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞はがん治療の一部として投与されて、移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）効果または移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を誘導する一助となる。さらなる例として、改変したＴ細胞は、ＨＰＲＴ欠損でありがん処置戦略の一部として投与されるＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ改変Ｔ細胞である。これらの処置手段のそれぞれに従った改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の投与は、本明細書にさらに詳細に記載されている。当然のことながら、当業者であれば、いかなる基礎疾患のための他の処置も、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の投与に先立って、これに続いて、またはこれと同時に起きてもよいことを認識している。

【0214】

リンパ球、例えば、Ｔ細胞の患者への投与により、本明細書に列挙する副作用を含む望ましくない副作用がもたらされる場合がある。例えば、患者を改変したＴ細胞を含むリンパ球で処置した（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトによって）後に、移植片対宿主病が起こる場合がある。本開示のいくつかの態様では、工程１５０での改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の投与に続いて、患者は、ＧｖＨＤを含むがこれに限定されないいかなる副作用の発生についてもモニターされる。万一ＧｖＨＤ（またはＧｖＨＤの症状）のような何らかの副作用が生じた場合、副作用、例えば、ＧｖＨＤを抑制する、低減する、制御する、または他の方法で軽減しようとして、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の少なくとも一部を取り除くために工程１６０でＭＴＸまたはＭＰＡが患者に投与され（ｉｎ ｖｉｖｏ）る。いくつかの実施形態では、ＭＴＸまたはＭＰＡは単回用量で投与される。他の実施形態では、複数用量のＭＴＸおよび／またはＭＰＡが投与される。

【0215】

本開示の改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は（ｅｘ ｖｉｖｏで選び出され患者または哺乳動物対象に投与された後は）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（ＭＴＸまたはＭＰＡの両方を含む）に対するその感受性を考慮すると、調節可能な「オン」／「オフ」スイッチとしての役目を果たし得ると考えられる。調節可能なスイッチは、万一何らかの副作用が起きた場合には、患者へのＭＴＸの投与を通じて、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の少なくとも一部をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に殺傷することにより、免疫系再構成の調節を可能にする。この調節可能なスイッチは、副作用が低減されたまたは他の方法で軽減された後に免疫系再構成をさらに可能にするためＭＴＸ投与に続いて患者に改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞をさらに投与することによりさらに調節される。同様に、調節可能なスイッチは、万一何らかの副作用が起きた場合には、ＭＴＸの投与を通じて、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の少なくとも一部をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に殺傷することにより、移植片対悪性腫瘍効果の調節を可能にする。その上、ＧＶＭ効果は、副作用が低減されるまたは他の方法で軽減された後、それに続いて改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞のさらなるアリコートを患者に投与することにより微調整される。この同じ原理がＣＡＲ－Ｔ細胞療法またはＴＣＲ改変Ｔ細胞を用いた療法に当てはまり、再び、ＭＴＸ投与を通じてＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ改変Ｔ細胞に選択的にスイッチをオン／オフすることができる。これを考慮して、当業者であれば、患者の処置を監督しているいかなる医療従事者も、副作用を寄せ付けないまたは許容できるもしくは受け入れられる範囲内にとどめておきながら、免疫系再構成および／またはＧＶＭ効果のバランスを保つことができることを認識する。上記により、有害作用を軽減しながら患者処置が増強される。

【0216】

いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約１００ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約９０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約８０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約７０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約６０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約５０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約４０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約３０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約２ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約１０ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約８ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２．５ｍｇ／ｍ^２／輸注～約７．５ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約５ｍｇ／ｍ^２／輸注である。さらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約７．５ｍｇ／ｍ^２／輸注である。

【0217】

いくつかの実施形態では、２回と６回の間の輸注が行われ、輸注はそれぞれが同じ投与量または異なる投与量（例えば、漸増投与量、漸減投与量、等）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、投与は１週間単位で、または２ヶ月単位で行ってもよい。

【0218】

さらに他の実施形態では、少なくともいくつかの改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞、および免疫系を再構成する、がんを標的化する、またはＧＶＭ効果を誘導することに対するその付随する効果を保存しながら、制御されない副作用、例えば、ＧｖＨＤを解消するように、投与されるＭＴＸの量は滴定される。これに関して、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の利点の少なくともいくらかは、副作用、例えば、ＧｖＨＤを寛解しながらそれでも認識されると考えられる。いくつかの実施形態では、追加の改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＭＴＸでの処置に続いて、すなわち、副作用、例えば、ＧｖＨＤの解消、抑制、または制御に続いて、投与される。

【0219】

いくつかの実施形態では、対象は、ＨＳＣ移植後に副作用を制御するまたは防止するように、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の投与に先立ってＭＴＸの用量を受ける。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の投与に先立ってＭＴＸでの既存の処置は停止され、次に、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞での処置に続いて副作用が発生すると、同じまたは異なる投与量で（および同じまたは異なる投薬スケジュールを使用して）再開される。これに関して、当業者であれば、必要に応じておよび医療産業で公知である標準治療と整合するようにＭＴＸを投与することができる。

【0220】

追加の処置戦略
図１９は、症状の発生時にＧｖＨＤを低減する、抑制する、または制御する１つの方法を図示している。最初、細胞を工程２１０でドナーから収集する。細胞は、移植用のＨＳＣを提供したのと同じドナーから（工程２６０参照）または異なるドナーから収集してもよい。次に、リンパ球は収集した細胞から単離し（工程２２０）、リンパ球がＨＰＲＴ欠損になるように処理する（工程２３０）（すなわち、ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトによって）。単離された細胞を処理する方法は本明細書に示されている。実質的にＨＰＲＴ欠損である改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の集団に到達するため、本明細書に記載されるように、処理された細胞は正に選択され増殖される（工程２４０）。次に、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は後の使用のために保管される。ＨＳＣ移植片を受けこと（工程２６０）に先立って、患者は標準治療（工程２５０）（例えば、高線量移植前放射線、化学療法、および／もしくはプリン類似体を用いた処置；または低線量移植前放射線、化学療法、および／もしくはプリン類似体を用いた処置）により骨髄破壊的移植前治療で処置される。いくつかの実施形態では、患者は、移植前処置での処置に続いて約２４～約９６時間の間でＨＳＣ移植片を用いて処置される（工程２６０）。

【0221】

図２０は、症状の発生時にＧｖＨＤを低減する、抑制する、または制御する１つの方法を図示している。最初、細胞を工程３１０でドナーから収集する。細胞を、移植用のＨＳＣを提供したのと同じドナーから（工程３３５参照）または異なるドナーから収集してもよい。次に、リンパ球は収集した細胞から単離し（工程３２０）、リンパ球がＨＰＲＴ欠損になる（工程３３０）ように処理する。単離された細胞を処理する方法は本明細書に示されている。実質的にＨＰＲＴ欠損である改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞の集団に到達するため、本明細書に記載されるように、処理された細胞は選び出され増殖される（工程３４０）。次に、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は後の使用のために保管される。がん、例えば、血液がんに罹っている患者は、がんの提示およびステージ分類の時期に患者にとって利用可能である標準治療（例えば、放射線および／またはバイオ医薬品を含む化学療法）に従って処置してもよい（工程３１５）。患者はＨＳＣ移植の候補者であってもよく、そうである場合には、移植前処置（工程３２５）が実施される（例えば、高線量移植前放射線または化学療法により）。悪性腫瘍では、いくつかの実施形態において、血液系を完璧に、またはできる限り完璧近くまで「一掃し」、したがって、できる限り多くの悪性腫瘍細胞を死滅させることを望むと考えられている。該移植前処置の目標は、がん細胞を集中的に処置し、それによってがん再発の可能性を少なくし、免疫系を不活化して幹細胞移植片拒絶の可能性を低減し、ドナー細胞が骨髄まで進むのを可能にすることである。いくつかの実施形態では、前処置は、シクロホスファミド、シタラビン（ＡｒａＣ）、エトポシド、メルファラン、ブスルファン、または高線量全身照射のうちの１つもしくはそれ以上の投与を含む。次に、患者はアロジェニックＨＳＣ移植片で処置される（工程３３５）。いくつかの実施形態では、アロジェニックＨＳＣ移植片は、少なくとも部分的なＧＶＭ、ＧＶＴ、またはＧＶＬ効果を誘導する。移植に続いて、患者は、残存または再発疾患についてモニターされる（工程３５０）。万一該残存または再発疾患が現れたら、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞（工程３４０で産生する）は、ＧＶＭ、ＧＶＴ、またはＧＶＴ効果が誘導されるように、患者に投与される（工程３６０）。改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、いくつかの投与の経過の間に単回投与で注入してもよい。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植後約１日～約２１日の間に投与される。いくつかの実施形態では、改変したＴ細胞は、ＨＳＣ移植後約１日～約１４日の間に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植後約１日～約７日の間に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植後約２日～約４日の間に投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球、例えば、Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植と同時にまたはＨＳＣ移植の数時間以内（例えば、ＨＳＣ移植１、２、３、または４時間後）に投与される。

【0222】

本開示の別の態様では、改変ＣＡＲ Ｔ細胞であって、ＨＰＲＴ欠損である改変ＣＡＲ Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することによりがんに罹った患者を処置する方法が開示される。図２１は、がんに罹った患者を処置し、それに続いていかなる有害な副作用でも低減する、抑制する、または制御する１つの方法を図示する。最初、細胞を工程４１０でドナーから収集する。次に、リンパ球を収集した細胞から単離し（工程４２０）、改変して、ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。

【実施例1】

【0223】

６ＴＧ選択を用いたＨＰＲＴノックダウン対ノックアウト
Ｋ５６２細胞は、０日目に（０）、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された核酸配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入する（ＭＯＩ＝１／２／５）；またはＨＰＲＴをノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを含むナノカプセルでトランスフェクトされた（１００ｎｇ／５×１０^４細胞）。６ＴＧを３日目から１４日目までずっと培地中に添加した。培地は３～４日ごとに新しくした。ＧＦＰはフロー機械上で分析し、ＩｎＤｅｌ％はＴ７Ｅ１アッセイを用いて分析した。図１２Ａは、形質導入されたＫ５６２細胞のＧＦＰ＋集団は６ＴＧの処理下で３日目から１４日目まで増加し、ＧＦＰ＋集団は処理なしでほぼ一定していたことを図示している。図１２Ｂは、Ｋ５６２細胞のＨＰＲＴノックアウト集団は６ＴＧの処理下で３日目から１４日目まで増加し、さらに高投与量（９００ｎＭ）の６ＴＧは投与量３００／６００ｎＭの６ＴＧと比べた場合もっと迅速な選択がもたらされたことを図示している。６ＴＧ選択過程は、３日目から１４日目まで、６ＴＧの３００ｎＭという同じ濃度でＨＰＲＴノックダウン細胞（ＭＯＩ＝１）と比べた場合ＨＰＲＴノックアウト細胞上でもっと迅速に起きたことに注目するべきである。ノックダウンとノックアウトの間の違いは、ノックアウト手法によるＨＰＲＴの完全除去と比べた場合のＲＮＡｉノックダウン手法によるあるレベルの残りのＨＰＲＴにより説明することができた（図２２も参照）。したがって、ＨＰＲＴノックアウト細胞は、６ＴＧに対してはるかに高い許容度を有すると考えられ、ＨＰＲＴノックダウン細胞と比べて６ＴＧのもっと高い投与量（９００ｎＭ）ではるかに迅速に成長すると考えられた。

【0224】

ＣＥＭ細胞は、０日目に、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された核酸および緑色蛍光タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質導入されたまたはＨＰＲＴに向けてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを含むナノカプセルでトランスフェクトされた。６ＴＧを３日目から１７日目まで培地中に添加した。培地は３～４日ごとに新しくした。ＧＦＰをフロー機械上で分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイにより分析した。図１３Ａは、形質導入されたＫ５６２細胞のＧＦＰ＋集団は６ＴＧの処理下で３日目から１７日目まで増加し、ＧＦＰ＋集団は処理なしでほぼ一定していたことを図示している。図１３Ｂは、ＣＥＭ細胞のＨＰＲＴノックアウト集団は６ＴＧの処理下で３日目から１７日目まで増加し、さらに高投与量（９００ｎＭ）の６ＴＧは投与量３００／６００ｎＭの６ＴＧと比べた場合もっと迅速な選択がもたらされたことを示している。６ＴＧ選択過程は、３日目から１７日目まで、６ＴＧの同じ濃度でＨＰＲＴノックダウン細胞（ＭＯＩ＝１）よりむしろＨＰＲＴノックアウト細胞上でもっと迅速に起きたことに注目するべきである。

【実施例2】

【0225】

ＭＴＸまたはＭＰＡを用いた負の選択
形質導入されたまたはトランスフェクトされたＫ５６２細胞（実施例１のＫ５６２細胞のような）は０日目から１４日目までＭＴＸありまたはなしで培養された。培地は３～４日ごとに新しくした。ＧＦＰをフロー機械上で分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイにより分析した。図１４Ａは、形質導入されたＫ５６２細胞のＧＦＰ集団が０．３μＭのＭＴＸの処理下で減少したことを示している。一方、細胞の集団はＭＴＸなしでは一定していた。図１４Ｂは、トラスフェクトされたＫ５６２細胞が、ＨＰＲＴノックダウン集団と比べた場合、０．３μＭのＭＴＸを用いた処理下ではより速いペースで除去されたことを示している。

【0226】

形質導入されたまたはトランスフェクトされたＣＥＭ細胞（実施例１のＣＥＭ細胞のような）は０日目から１４日目までＭＴＸありまたはなしで培養された。培地は３～４日ごとに新しくした。ＧＦＰをフロー機械上で分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイにより分析した。図１５Ａは、形質導入されたＫ５６２のＧＦＰ集団が１μＭのＭＰＡまたは０．３μＭのＭＴＸまたは１０μＭのＭＰＡの処理下で減少し、細胞の集団は非処理の群については一定していたことを示している。図１５Ｂは、ＣＥＭ細胞のＨＰＲＴノックアウト集団が、１μＭのＭＰＡまたは０．３μＭのＭＴＸまたは１０μＭのＭＰＡの処理下ではより速いペースで除去されたことを示している。

【実施例3】

【0227】

Ｋ５６２細胞についてのＭＴＸを用いた負の選択
Ｋ５６２細胞は、（ｉ）希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ－ＧＦＰウイルススープ、（ｉｉ）希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ－Ｕｂｃ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４ウイルススープ（ＧＦＰおよびＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡを順次にコードしているウイルススープ）；または（ｉｉｉ）希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵＢＣ／ＧＦＰウイルススープ（ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡおよびＧＦＰを順次にコードするウイルススープ）を用いて形質導入された（図１６参照）。Ｋ５６２細胞は、希釈係数１０２４でもＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵＢＣ／ＧＦＰウイルススープにより形質導入された（ＨＰＲＴをノックダウンするように設計されたｓｈＲＮＡをコードしている核酸をコードするウイルススープ）（図１６にも示されている）。形質導入の３日後、すべての細胞は０．３μＭのＭＴＸ３を含有する培地を用いて培養された。図１６に示されるように、９０％よりも大きいＧＦＰ＋集団から開始して、ＧＦＰまたはＧＦＰ－ｓｈ７３４形質導入細胞はＧＦＰ＋集団に低減を示さず、ｓｈ７３４－ＧＦＰ形質導入細胞はＧＦＰ＋集団の選択解除を示した（高希釈（１０２４）と低希釈（１６）レベルの両方で）。ｓｈ７３４－ＧＦＰ形質導入細胞およびＧＦＰ－ｓｈ７３４形質導入細胞についてベクターコピー数（ＶＣＮ）あたり相対的なｓｈ７３４発現を測定した。結果によれば、メトトレキサートは、ｓｈ７３４高発現レンチウイルスベクター（ＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵＢＣ／ＧＦＰ）で形質導入した細胞のみを選択解除することができ、ｓｈ７３４低発現レンチウイルスベクター（ＴＬ２０ｃｗ－ＵＢＣ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４）では選択解除できないことが示唆された。この実施例により、異なるベクター設計が（同じｓｈＲＮＡを有するベクターでさえ）ｓｈＲＮＡヘアピンの発現に影響を与え、形質導入細胞をＭＴＸでの処理により選択できるかどうかを判定するのに使用できることが実証された。

【実施例4】

【0228】

改変したＴ細胞のトランスフェクション／形質導入、選択および増殖
一次ヒトＴ細胞精製は、大量のバッフィーパック（オーストラリア赤十字血液サービス）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用して実施し、下流適用のために十分な数のＴ細胞を濃縮させた。残りの細胞を、アロ抗原に応答したＴ細胞増殖の評価のような将来のＴ細胞機能分析のために凍結保存した。精製されたＴ細胞は、固定化された抗ＣＤ３および組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２を用いて（現在公開されているプロトコールＲＥＦにより）４８時間ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激され、続いてＨＰＲＴ遺伝子の改変のために、レンチウイルスで形質導入されたまたはＤＮＡ含有ナノ粒子でトランスフェクトされた。これらの改変したＴ細胞は培養され（２～３日間）、続いてｒｈＩＬ－２の存在下で最長１４日間さらに増殖させた。培養条件を通じてずっと、蛍光トレーサ（例えば、ＧＦＰ）の検出、ならびにＨＰＲＴ遺伝子発現レベルの検出のための定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定した場合の、遺伝子改変を首尾よく受けた細胞の割合の評価のためにサンプルが収集された。

【0229】

遺伝子改変後１４日目に、遺伝子改変されたＴ細胞の選択は６－チオグアニン（６ＴＧ）を使用して実施し、すべての非改変Ｔ細胞の負の選択に必要な用量を評価した。６ＴＧ用量の滴定により、この選択法に対する潜在的なドナー依存的感受性およびプリン類似体に対する既知のＴＰＭＴ遺伝子型依存的感受性にこれがどのように関係している可能性があるのかの評価も可能になる。６ＴＧ用量滴定の調査は、ｓｈＲＮＡ発現のレベルに基づいて用量ウィンドウ変動性の可能性を評価するのにも役立つ。選択に続いて、種々のサイトカインの組合せ（ＩＬ－２／ＩＬ－７／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１）を選択して改変したＴ細胞を増殖させた。増殖させたＴ細胞集団は最終的に、メトトレキサートの使用による「キルスイッチ」活性化に対する感受性について試験された。

【実施例5】

【0230】

改変した一次ヒトＴ細胞の機能的評価
改変したＴ細胞の機能的な能力を、遺伝子改変および培養条件の潜在的な重要性を理解するためｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して評価した。培養物内のＴ細胞サブタイプ割合は、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞サブタイプ、メモリーＴ細胞サブタイプ、調節性Ｔ細胞、等の評価を含め、ならびにＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＣＤ２７／ＣＤ２８／ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ／ＣＤ５６／ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ１２７またはＦｏｘＰ３およびＣＤ４４のような細胞表面Ｔ細胞マーカーを含めて、表現型が決定された。長期にわたる培養条件の結果としてのＴ細胞消耗の潜在的展開もフローサイトメトリーを使用して評価した。ウイルスペプチドに反応する遺伝子改変Ｔ細胞の機能的能力を、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン放出アッセイを使用して評価した。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のようなウイルス由来のウイルスペプチドへのこの機能的応答は特に関連があると考えられる。なぜならば、これらは免疫抑制という文脈で再活性化された主要なウイルスであり、臨床中の患者と関連しているからである。

【0231】

最後に、ドナー改変したＴ細胞培養物のそれぞれを、凍結保存された（および遺伝子型を決定された）ハプロタイプ一致のドナーＰＢＭＣに対するアロ反応性についてｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイを使用して評価した。これは、移植という文脈において潜在的なアロ反応性を模倣して測定するように設計されている。遺伝子改変したＴ細胞プール内での調節性Ｔ細胞の区画の機能的能力もこの文脈において潜在的に評価できると考えられる。

【実施例6】

【0232】

メトトレキサート投与後に「残存」遺伝子改変したＴ細胞集団の表現型および機能的特徴付け
キルスイッチ誘導およびＧｖＨＤまたはＣＲＳのような状態の解消後にレシピエント内に存在する残りの遺伝子改変した細胞について理解する能力とは、増殖し適切な数で適切な機能を持って再構成する遺伝子改変細胞の能力である。したがって、ドナー細胞枯渇についての最小閾値レベル続いて適切な拡張性および機能活性を理解するのは重要である。第三者により実施される臨床試験は、キルスイッチ活性化により２時間以内にドナーＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで＞９９％枯渇したこと、ならびにＧｖＨＤおよびＣＲＳの症状の解消が２４～４８時間以内に起こったことを明らかにした。さらに、レシピエントにおいて残っている＜１％の改変した細胞は、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの再活性化をもたらすことなく再増殖することができる。キルスイッチの活性化により活発に増殖しているドナーアロ反応性Ｔ細胞が優先的に死亡し、したがって、ＧｖＨＤ／ＣＲＳの再発をもたらす可能性のあるＴ細胞レパートリーが枯渇するという仮説。再増殖した細胞のｅｘ ｖｉｖｏ分析により、残りのレパートリーがウイルス抗原を認識してこれに応答できることが明らかにされており、レシピエントが免疫無防備状態にはならないことを示している。さらに、これらの試験でのレシピエントは１００日まで無疾患のままであり、この限定された追跡調査期間を過ぎてからのデータはまだ入手できていない。最後に、ドナー細胞関連合併症のせいでこれらの細胞の枯渇が後になって必要になる場合には、残存／再増殖した集団が第２の経過でキルスイッチ誘導に依然として感受性であるのか否かが判定される。

【実施例7】

【0233】

マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実証実験研究
ＧｖＨＤ－抵抗性とＧｖＨＤ－感受性ヒト化ＮＳＧマウスの両方での改変したＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ挙動および特性を調べるために動物研究を行った。最初の研究は、Ｔ細胞生着および改変したＴ細胞におけるＭＴＸ誘導「キルスイッチ」機能を評価することを目標とした。これらの研究は、ＧｖＨＤ抵抗性マウスにおいて行われた。続く研究は、ＧｖＨＤのマウスモデルを確立し、「キルスイッチ」を試験する臨床的関連ｉｎ ｖｉｖｏ設定を提供することを目標とした。Ｔ細胞用量、分布および機能を明確に理解し、併せてＭＴＸ応答性を理解して、ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＯＣ研究を、白血病チャレンジを受けるＧｖＨＤ感受性マウスにおいて行った。改変したＴ細胞は、ＧＶＴ応答を開始する能力を維持しながらＭＴＸ「キルスイッチ」の引き金を引いてＧｖＨＤを最小限に抑えることにより操作することができることが明らかになった。

【実施例8】

【0234】

Ｔ細胞用量、生着、分布、生存およびメトトレキサート感受性を理解する
維持された生着に最適なＴ細胞用量を確立するために、ＭＨＣ ＫＯ ＮＳＧマウス（ＧｖＨＤ抵抗性）に異なる用量の改変したＴ細胞を移植した。異なる時点で、リンパおよび非リンパ器官でのＴ細胞の分布を分析した。

【0235】

本明細書に言及される通りに決定された最適Ｔ細胞用量を使用して（ｉ）、マウスを生着に続く２４～４８時間異なる用量のメトトレキサートを用いて処置した。リンパおよび非リンパ器官における残りのＴ細胞の数は、改変したＴ細胞がどれくらいの速度で取り除かれるのかを理解するように設計された分析時間経過で決定した。

【0236】

改変したＴ細胞移植片の寿命およびこれらＴ細胞のＭＴＸ感受性を経時的に調べるための並行研究を開始した。改変したＴ細胞の最適用量を受けたマウスは６ヶ月に達し、次にＭＴＸ誘導「キルスイッチ」の引き金を引いた。リンパおよび非リンパ器官における残りのＴ細胞の数は、以前に決められた最適分析時間に決定された。遅発性急性または慢性ＧｖＨＤでは場合に応じて、改変したＴ細胞が、後の時点で引き金が引かれたときにどれほどよくＭＴＸ「キルスイッチ」に応答できたかが示された。

【実施例9】

【0237】

ＧｖＨＤマウスモデルの確立および特徴付けならびに改変したＴ細胞移植片の分析
ＧｖＨＤを開始するため、放射線条件付けＮＳＧマウスに、前処理後２～２４時間以内に最適用量の改変したＴ細胞を移植した。発表文献から、ＧｖＨＤは約２５日目までにこれらのマウスで発症し（身体姿勢、活動性、毛皮と皮膚の状態および体重減少がモニターされた）、疾患エンドポイントに約５５日目までに到達した（ＧｖＨＤの臨床症状を抱えたまま、＞２０％の体重減少）。万一疾患進行が著しく遅くなるまたは急速になる場合は、最適用量よりもそれぞれもっと高いまたはもっと低いＴ細胞用量を試験することができるであろう（文献に基づけばおおよそ１０^６～１０^７個のＴ細胞）。

【0238】

Ｔ細胞用量および疾患動態学を最適化して、Ｔ細胞生着を時間経過解析で調べた。異なる器官のＴ細胞播種はＧｖＨＤの構成でありこれは本発明者等のモデルで調べた。時間経過解析時点は、観察されるＧｖＨＤの発症および重症度により決定された。

【0239】

改変したＴ細胞がリンパ器官においてはっきり検出可能である場合、Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）機能性を分析する。Ｔ細胞は種々の刺激（例えば、ＰＭＡ、ＣＤ３／ＣＤ２８）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激され、表現型、増殖、サイトカイン産生およびｅｘ ｖｉｖｏ抗腫瘍細胞傷害性について分析した。Ｔ細胞を、潜在ウイルス再活性化に応答するその能力の基準として、ウイルスペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびＦＬＵ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ ＰｒｏＭｉｘ ＣＥＦペプチドプール）に応答するその能力について特に分析した。

【実施例10】

【0240】

ＧｖＨＤモデルにおけるメトトレキサート誘導「キルスイッチ」の活性化
ＮＳＧマウスに照射を行い、以前決定した最適条件によって改変したＴ細胞を移植した。ＧｖＨＤの急性または慢性期に、マウスには、最適用量を含む異なる用量のＭＴＸを投与した。末梢血中の改変したＴ細胞の割合を実験終了まで毎週決定した。マウスを発症中の進行性疾患から救済することができるかどうかを確かめるため、ＧｖＨＤ発症をモニターした。種々の器官中への改変したＴ細胞の浸潤を、ＧｖＨＤの重症度を全身レベルで理解するために定量化した。

【実施例11】

【0241】

ＧＶＴ／ＧｖＨＤマウスモデルにおける改変したＴ細胞ＰＯＣ
ＮＳＧマウスに照射を行い、以前決定した最適条件によって改変したＴ細胞を移植した。照射後２４時間以内に、マウスはＰ８１５ Ｈ２－Ｋｄ細胞株の用量を受けて白血病を確立した。Ｐ８１５細胞を、腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布および評価のためにＧＦＰを発現するよう前もって形質導入した。ＧｖＨＤの発症時、マウスは最適用量のＭＴＸを用いて処置され、疾患進行ならびに白血病負荷量を実験終了までモニターした。

【実施例12】

【0242】

ＨＰＲＴノックアウトガイドＲＮＡ
図２３および続く表は、オンターゲットおよびオフターゲット効果について調べられた種々のガイドＲＮＡを示している。「ＩＤＴ－４」（配列番号３６）は、本明細書に記載される実験のような残りのノックアウト実験のためのリードｇＲＮＡとして選ばれた。配列番号３９（「Ｎａｔ論文」）はＹｏｓｈｉｏｋａ，Ｓ．ら．（２０１６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｎｏ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｒｉｖｅｎ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、５、１８３４１頁から導かれており、前記文献の開示はこれにより参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

【0243】

【表2】

【実施例13】

【0244】

６－ＴＧに対するＨＰＲＴ標的ノックアウト抵抗性
方法
ジャーカット細胞には、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ；ＧＳ－４；ＩＤＴ－４と名付けられる）を含有するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をＣａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に電気穿孔した。ｔｒａｃｒＲＮＡを介してｇＲＮＡをトランスフェクトされたことが確かめられた細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して精製され、それに続いて７２時間培養された。次に、増加する濃度の６－チオグアニン（６－ＴＧ）を形質導入された培養細胞に投与して抵抗性を評価した。野生型（非改変）ジャーカット細胞を対照として使用した。

【0245】

結果
発光（ＡＴＰ検出）を使用して細胞生存率を評価した。ＩＤＴ－４改変細胞は、増加する用量の６－ＴＧ（１０μＭまで試験した）に対して抵抗性を示した。非改変ジャーカット細胞（野生型）は、６－ＴＧの濃度が増加するにしたがって細胞生存率の減少を示した（図２４参照）。

【0246】

非改変（ＷＴ）およびＩＤＴ－４改変ジャーカット細胞をウェスタンブロットを使用してＨＰＲＴタンパク質についても分析した（図２５参照）。非改変ジャーカット細胞（ＷＴ）は、ＨＰＲＴの検出可能なレベルを予測されるサイズ（２５ｋＤＡ）で示し、ＩＤＴ－４改変細胞は検出不可能なレベルのＨＰＲＴを有していた。アクチンタンパク質検出（下パネル）はタンパク質負荷対照として使用した。

【実施例14】

【0247】

長期細胞生存率／生存
方法
ＨＰＲＴノックアウトジャーカット細胞（ガイドＲＮＡ ＩＤＴ－４で改変されている；実施例１に記載されている通り；ＨＰＲＴ－／－と名付けられている）を、ＧＦＰを単独で（ＷＴ ＧＦＰ）発現するように改変されたジャーカット細胞と一緒におおよそ等しい割合で混合した。

【0248】

細胞は、培養物中のＧＦＰ＋細胞の割合を再評価する前に１８日間標準培養条件下で培養した。

【0249】

結果
１８日目の細胞のＧＦＰ割合は１日目と実質的に類似しており（図２６参照）、ＧＦＰ＋野生型細胞の開始割合に経時的に有意な変化はなく（図２７参照）、細胞がＨＰＲＴタンパク質欠損であることに生存優位性も生存不利性もないことを示していた。６－ＴＧ存在下での改変した細胞での生存優位性が活性なＨＰＲＴ酵素が存在しないせいであることをこれはさらに確証している。

【実施例15】

【0250】

ＨＰＲＴノックアウトジャーカット細胞－メトトレキサート感受性
方法および結果
（Ａ）ＭＴＸ用量応答
ジャーカット細胞（非改変、ＷＴ）を増加する濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて培養し、ＷＴ細胞を殺傷するのに必要なＭＴＸ投与量ウィンドウを決定した（図２８参照）。０．００６２５～０．０２５μＭの間のＭＴＸの用量範囲を、それに続くＨＰＲＴノックアウト（ＩＤＴ－４改変）ジャーカット細胞の評価のために選択した。

【0251】

（Ｂ）ＨＰＲＴノックアウトＭＴＸ用量応答
ＭＴＸに対するＨＰＲＴノックアウト（ＩＤＴ－４改変）ジャーカット細胞の用量応答を非改変ジャーカット細胞（ＷＴ）と比較して、ＭＴＸに対する感受性を判定した（図２９参照）。ＨＰＲＴノックアウト（ＩＤＴ－４改変）ジャーカット細胞は、５日間培養した場合の野生型細胞と比べて０．００６２５および０．０１２５μＭの濃度でＭＴＸに対する感受性が増加したことを示した。

【実施例16】

【0252】

ＨＰＲＴノックダウンジャーカット細胞
方法
ジャーカットＴ細胞は、レンチウイルスベクター（Ａ）ＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵｂＣ／ＧＦＰまたは（Ｂ）ＴＬ２０ｃｗ－ＵｂＣ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４を用いて改変した。ジャーカット細胞は、室温で９０分間２，５００ｒｐｍで遠心分離し、続いて３７℃で６０分間インキュベートすることにより、１ｍｌの無希釈ウイルス含有培地（ＶＣＭ）を８ｎｇ／ｍｌのポリブレンと一緒に使用してそれぞれのレンチウイルスベクターで形質導入した。次に、細胞は、フローサイトメトリーを使用して形質導入効率を決定する（ＧＦＰ陽性細胞）前に、形質導入およびＶＣＭの除去後４日間培養した。

【0253】

結果
ジャーカット細胞は、回転接種後４日目に高い形質導入効率を示し、ｓｈ７３４－ＧＦＰ（図３０Ａ参照）は４日目に７６．２％のＧＦＰ＋細胞を生じ、ＧＦＰ－ｓｈ７３４ウイルス（図３０Ｂ参照）は７７．２％のＧＦＰ＋細胞を生じた。改変したジャーカット細胞は３日間、６－ＴＧ選択（１０μＭ、６－ＴＧに対する野生型非改変ジャーカット細胞の感受性を評価して作成された以前のデータに基づいて）下に置いた。選択プロトコールにより、改変した細胞株のそれぞれについて８７％まで（図３０Ａ参照）および９０％（図３０Ｂ参照）ＧＦＰ＋細胞までの増加がもたらされ、非改変細胞の死亡およびｓｈ７３４含有細胞の増強された生存を示した。

【実施例17】

【0254】

ＨＰＲＴノックダウンＣＥＭ Ｔ細胞
方法
ＣＥＭ Ｔ細胞は、レンチウイルスベクターＴＬ２０ｃｗ－７ＳＫ／ｓｈ７３４－ＵｂＣ／ＧＦＰ（ｓｈ７３４－ＧＦＰ）およびＴＬ２０ｃｗ－ＵｂＣ／ＧＦＰ－７ＳＫ／ｓｈ７３４（ＧＦＰ－ｓｈ７３４）を用いて改変した。

【0255】

ＣＥＭ細胞は、室温で９０分間２，５００ｒｐｍで遠心分離し、続いて３７℃で６０分間インキュベートすることにより、１ｍｌの無希釈ウイルス含有培地（ＶＣＭ）を１０ｎｇ／ｍｌのポリブレンと一緒に用いて回転感染させた。ＧＦＰ＋細胞の割合は４日後にフローサイトメトリーにより決定した。形質導入効率は比較的低かった。

【0256】

改変したＣＥＭ細胞は、合計で１７日間の５μＭの６－ＴＧを用いた６－ＴＧ選択を受けさせた。ｓｈ７３４を含有する細胞は６－ＴＧにより首尾よく選択され、ｓｈ７３４－ＧＦＰの場合は２８．８％ＧＦＰ＋まで、ＧＦＰ－ｓｈ７３４の場合は４２．４％ＧＦＰ＋まで増加し、これらの細胞が非形質導入細胞よりも生存優位性を有することを示した（図３１参照）。

【実施例18】

【0257】

ベクター生成－ＨＰＲＴノックダウン
候補ベクターを、７ＳＫ／ｓｈ７３４を含む発現カセットをｐＴＬ２０ｃｗベクター中に挿入することにより調製した（例えば、図３２参照）。具体的には、以下の表に収載され短鎖ヘアピンを含むベクターが生成された。

【0258】

【表3】

【実施例19】

【0259】

形質導入／トランスフェクション
Ｋ５６２またはジャーカット細胞は、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計された核酸配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列を含むベクターで形質導入された（ＭＯＩ ０．１～５）；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＨＰＲＴへのｓｇＲＮＡ（１００ｎｇ／５×１０^４細胞）を含むナノカプセルでトランスフェクトされた。

【実施例20】

【0260】

ＨＰＲＴのノックダウンおよび６ＴＧ抵抗性
６－ＴＧストック溶液を、形質導入／トランスフェクション後３日目または４日目に、形質導入した／トランスフェクトしたＫ５６２またはジャーカット細胞を含有する培地中に添加した。６－ＴＧは、１４日目またはそれよりも長くまで最終濃度、例えば、Ｋ５６２細胞で３００ｎＭおよびジャーカット細胞で２．５μＭまで維持した。培地は３～４日ごとに新たにした。ＧＦＰはフロー機械で分析し、ＶＣＮはＶＣＮ ｄｄＰＣＲアッセイにより分析し、ＩｎＤｅｌ％はＴ７Ｅ１アッセイを用いて分析した。結果は図３３での以下の表に提供されている。

【0261】

【表4】

【0262】

追加の実施形態
第１の追加の実施形態には、リンパ球輸注の利点を、副反応を軽減しながらその処置を必要とする患者に提供する方法であって：ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成することと；ＨＰＲＴ欠損リンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；ＨＳＣ移植片を患者に投与し、ＨＳＣ移植片の投与に続いて改変したリンパ球の集団を患者に投与することと；場合により、副反応が生じた場合にはメトトレキサート（ＭＴＸ）を投与することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、処置を受ける患者は、感染と闘い、生着を支援し、疾患再発を防止するＴ細胞を受けるという利点を受ける。さらに、万一ＧｖＨＤが生じた場合には、Ｔ細胞は、１つまたはそれ以上の用量のＭＴＸの投与を通じて取り除かれてもよい。

【0263】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＨＰＲＴをノックアウトするように適合させたペイロード（例えば、配列番号２５～３９のうちのいずれか１つの配列を有するガイドＲＮＡを含むペイロード）を含むナノカプセルの集団を用いたリンパ球のトランスフェクションによりのような、ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトを通じて生成される。他の実施形態では、ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＲＮＡ干渉剤をコードする核酸配列（例えば、配列番号１、２、および５～１１のうちのいずれか１つの配列を有するｓｈＲＮＡをコードする核酸）を含む発現ベクターを用いたリンパ球の形質導入によりのような、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを通じて生成される。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体（例えば、６－チオグアニン（６ＴＧ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、またはアザチオプリン（ＡＺＡ））に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、正の選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体および第２の薬剤（例えば、アロプリノール）に接触させることを含む。いくつかの実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は単回ボーラスとして投与される。いくつかの実施形態では、改変したリンパ球は複数用量として投与される。いくつかの実施形態では、各用量は約０．１×１０^６個の細胞／ｋｇ～約２４０×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＸは場合により、ＧｖＨＤの診断時に投与される。いくつかの実施形態では、投与されるＭＴＸの量は約２ｍｇ／ｍ^２／輸注～約８ｍｇ／ｍ^２／輸注の範囲に及ぶ。いくつかの実施形態では、ＭＴＸは滴定された用量で投与される。

【0264】

本開示の方法は、プリンの再利用を促進する、酵素ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をコードする遺伝子の改変によってプリンサルベージ経路を利用すると考えられる。遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックダウンによってＨＰＲＴ発現を阻害すると、改変した細胞は生存を新規のプリン生合成経路にもっぱら依存するようになる。非改変細胞では、ＨＰＲＴを通じて変換されるプリン類似体６－チオグアニン（６ＴＧ）の送達は、最後に６－チオグアニンヌクレオチド（６ＴＧＮ）を蓄積させ、このヌクレオチドはＳ期中のＤＮＡ中への取り込みを含むいくつかの機序を介して細胞にとって有毒になる。遺伝子改変細胞においてＨＰＲＴ酵素を阻害し、それに続いて、種々の白血病ならびに重い炎症性疾患の処置において既に使用されている薬剤である６ＴＧを用いて処置すると、これらの細胞に非改変細胞よりも生存優位性を与え、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、および、潜在的にｉｎ ｖｉｖｏで改変した細胞を選択する機序を提供する。さらに、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた場合のように、これらのＨＰＲＴ酵素欠損細胞における新規のプリン生合成経路を阻害すると、細胞アポトーシスを生じ（非機能的でもあるプリンサルベージ経路のせいで）、それによって、別の承認された薬剤を改変した細胞において「キルスイッチ」誘導因子として使用することができる機序を提供する。

【0265】

第２の追加の実施形態には、造血幹細胞（「ＨＳＣ」）においてＨＰＲＴ発現を低減するまたは排除する成分を含む組成物がある。いくつかの実施形態では、ＨＳＣはリンパ球系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球系細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを実現する第１の成分を含む。他の実施形態では、組成物は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトを実現する第１の成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンするように適合させた薬剤（例えば、ＲＮＡ干渉剤（ＲＮＡｉ））をコードする第１の核酸を含むレンチウイルス発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ＨＳＣを標的化するように適合させたナノカプセルのようなナノカプセル内に組み込まれていてもよい。

【0266】

第３の追加の実施形態には、ＨＰＲＴのノックダウンを実現するＲＮＡｉをコードする核酸配列を含む発現ベクターがある。いくつかの実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、ＨＳＣのような選択可能な遺伝子改変された細胞を産生するのに適している。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで形質導入されたＨＳＣは、処置を必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ＨＰＲＴを標的化する低分子ヘアピン型リボ核酸分子（「ｓｈＲＮＡ」）をコードする。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有し、そこでは第１の核酸配列は、７ｓｋプロモーターまたはその突然変異したバリアントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有し、そこでは第１の核酸配列は、７ｓｋプロモーターまたはその突然変異したバリアントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有し、そこでは第１の核酸配列は、７ｓｋプロモーターまたはその突然変異したバリアントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号１の配列を有し、そこでは第１の核酸配列は、７ｓｋプロモーターまたはその突然変異したバリアントに作動可能に連結されている。

【0267】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の配列と少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号２の配列を有する。

【0268】

いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５、６、および７のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５、６、および７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５、６、および７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５、６、および７のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸配列は、配列番号５、６、および７のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0269】

いくつかの実施形態では、第１の核酸配列はＰｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ホモサピエンス細胞株ＨＥＫ－２９３ ７ｓｋ ＲＮＡプロモーターである（例えば、配列番号１４参照）。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号１４と比べてその核酸配列に単一の突然変異を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号１４と比べてその核酸配列に複数の突然変異を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号１４と比べてその核酸配列に欠失を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、配列番号１４と比べてその核酸配列に突然変異と欠失の両方を含む７ｓｋプロモーターである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１４の配列と少なくとも９５％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１４の配列と少なくとも９７％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１４の配列と少なくとも９８％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１４の配列と少なくとも９９％同一性を有するプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１４を有するプロモーターに作動可能に連結されている。

【0270】

第４の追加の実施形態には、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むレンチウイルス発現ベクターがある。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、配列番号８、９、１０、および１１のうちのいずれか１つの配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡをコードする核酸配列は、本明細書に記載されるプロモーターのいずれかを含む、Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＰｏｌ ＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。

【0271】

第５の追加の実施形態には、（ａ）ＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡをコードする第１の部分；および（ｂ）ＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡをコードする配列の発現を駆動する第１のプロモーターをコードする第２の部分を含むポリヌクレオチド配列がある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは（ｃ）中心ポリプリントラクトエレメントをコードする第３の部分；および（ｄ）Ｒｅｖ応答エレメントをコードする第４の部分をさらに含む（配列番号１９）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＷＰＲＥエレメント（例えば、配列番号１８を含むＷＰＲＥエレメント）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、インスレーターをさらに含む。

【0272】

第６の追加の実施形態には、発現ベクターで形質導入されているまたは、それぞれがＨＰＲＴ発現を低減するように設計されている薬剤（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンではＲＮＡｉ）を含むナノカプセルでトランスフェクトされているＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ）がある。いくつかの実施形態では、ＨＳＣはＴ細胞である。いくつかの実施形態では、形質導入されたＨＳＣは、その処置を必要とする対象に投与してもよい細胞療法製品を構成し、例えば、形質導入されたＨＳＣを用いて処置された患者は、感染と闘い、生着を支援し、疾患再発を防止する細胞（ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させることができるＴ細胞のような）を受けるという利点を受けた。

【0273】

第７の追加の実施形態には、発現ベクターのいずれか１つで形質導入された宿主細胞があり、宿主細胞はＨＰＲＴ欠損である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0274】

第８の追加の実施形態には、宿主細胞を含む医薬組成物があり、宿主細胞は薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に製剤化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞を発現ベクターで形質導入することにより導き出されるＨＰＲＴ欠損宿主細胞である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0275】

第９の追加の実施形態には、ＨＰＲＴ欠損細胞を生成する方法であって、宿主細胞の集団を発現ベクターで形質導入することと、形質導入された宿主細胞の集団を少なくともプリン類似体に接触させることによりＨＰＲＴ欠損細胞を正に選択することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、プリン類似体は、６ＴＧおよび６－メルカプトプリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0276】

第１０の追加の実施形態には、副反応を軽減しながらリンパ球輸注の利点をその処置を必要とする患者に提供する方法であって：ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成し、ここでＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ドナーサンプル内のリンパ球を発現ベクターで形質導入することにより生成することと、ＨＰＲＴ欠損リンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；ＨＳＣ移植片を患者に投与することと；治療有効量の改変したリンパ球の集団をＨＳＣ移植片の投与に続いて患者に投与することと；場合により、副反応が生じた場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を投与することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0277】

第１１の追加の実施形態には、副反応を軽減しながらリンパ球輸注の利点をその処置を必要とする患者に提供する方法であって：ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成し、ここでＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ドナーサンプル内のリンパ球を発現ベクターで形質導入することにより生成することと；ＨＰＲＴ欠損リンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；改変したリンパ球の集団をＨＳＣ移植片の投与と同時にまたはその後で患者に投与することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたはそれ以上の用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0278】

第１２の追加の実施形態には、その処置を必要とする患者において血液がんを処置する方法であって：ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成し、ここでＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ドナーサンプル内のリンパ球を発現ベクターで形質導入することにより生成することと；ＨＰＲＴ欠損リンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；ＨＳＣ移植片を患者に投与することにより少なくとも部分的移植片対悪性腫瘍効果を誘導することと；残存疾患または疾患再発の検出に続いて患者に改変したリンパ球の集団を投与することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１用量のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤を患者に投与して、ＧｖＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制することをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0279】

第１３の追加の実施形態には、患者をヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）欠損リンパ球で処置する方法であって、（ａ）ドナー対象からリンパ球を単離することと；（ｂ）単離したリンパ球を発現ベクターで形質導入することと；（ｃ）形質導入した単離されたリンパ球を、ＨＰＲＴ欠損リンパ球を正に選択する薬剤に曝露して改変したリンパ球の調製物を提供することと；（ｄ）治療有効量の改変したリンパ球の調製物を造血幹細胞の移植に続いて患者に投与することと；（ｅ）場合により、患者における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症に続いてメトトレキサートまたはミコフェノール酸を投与することとを含む方法がある。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含み、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ｓｈＲＮＡは配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する。

【0280】

第１４の追加の実施形態には、副反応を軽減しながらリンパ球輸注の利点をその処置を必要とする患者に提供する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成し、ここで実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球がドナーサンプル内のリンパ球をエンドヌクレアーゼおよびＨＰＲＴを標的化するｇＲＮＡを含む送達ビヒクルでトランスフェクトすることにより生成されることと：実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；患者にＨＳＣ移植片を投与することと；ＨＳＣ移植片の投与に続いて患者に治療有効量の改変したリンパ球の集団を投与することと；場合により、副反応が生じた場合にはＭＴＸを投与することとを含む方法がある。

【0281】

第１５の追加の実施形態には、副反応を軽減しながらリンパ球輸注の利点をその処置を必要とする患者に提供する方法であって：ドナーサンプルから実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球を生成し、ここで実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球が、ドナーサンプル内のリンパ球をＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ）およびＨＰＲＴ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含む送達ビヒクルでトランスフェクトすることにより生成されることと：実質的にＨＰＲＴを欠損したリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで正に選択して改変したリンパ球の集団を提供することと；患者にＨＳＣ移植片を投与することと；ＨＳＣ移植片の投与に続いて患者に治療有効量の改変したリンパ球の集団を投与することと；場合により、副反応が生じた場合にはＭＴＸを投与することとを含む方法がある。

【0282】

第１６の追加の実施形態には、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の発現制御配列を含む発現ベクターで形質導入されたリンパ球があり、第１の核酸配列はＨＰＲＴをノックダウンするｓｈＲＮＡをコードし、ここでｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列と少なくとも９７％同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２、５、６、７、８、９、１０、および１１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球は、発現ベクターを用いた形質導入に続いて実質的にＨＰＲＴ欠損になる。いくつかの実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。

【0283】

本明細書において言及されるおよび／または出願データシートに収載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、参照によりその全体を本明細書に組み込む。実施形態の態様は、必要な場合には、さらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変することができる。

【0284】

本開示はいくつかの例示的実施形態を参照して記載されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に収まる数多くの他の改変および実施形態を当業者であれば考案することができることは理解されるべきである。より詳しくは、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内で主題の組合せ配置の構成部品および／または配置において合理的な変動および改変が可能である。構成部品および／または配置における変動および改変に加えて、代替の使用も当業者には明らかである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

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【国際調査報告】