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▶ エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(54)【発明の名称】リポソームを含む製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7028 20060101AFI20220209BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220209BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220209BHJP
A61P 29/02 20060101ALI20220209BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20220209BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220209BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220209BHJP
A61P 9/02 20060101ALI20220209BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220209BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220209BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220209BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20220209BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220209BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220209BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220209BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220209BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220209BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220209BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220209BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220209BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220209BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220209BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220209BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7028
A61P31/12
A61P31/04
A61P29/02
A61P39/02
A61P29/00
A61P7/02
A61P9/02
A61P13/12
A61P11/00
A61P1/16
A61P9/04
A61P9/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P17/06
A61P3/10
A61P3/06
A61P19/08
A61K9/127
A61K47/34
A61K47/24
A61K47/10
A61K47/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021520242
(86)(22)【出願日】2019-12-13
(85)【翻訳文提出日】2021-04-12
(86)【国際出願番号】 JP2019048842
(87)【国際公開番号】W WO2020129826
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】62/780,642
(32)【優先日】2018-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506137147
【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100080953
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 克郎
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】石原 比呂之
(72)【発明者】
【氏名】畑 桂
(72)【発明者】
【氏名】武藤 洋樹
(72)【発明者】
【氏名】ハード，ジェフ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076CC03
4C076CC05
4C076CC11
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC21
4C076CC32
4C076CC35
4C076DD09A
4C076DD37S
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23
4C076FF16
4C076FF43
4C076FF51
4C076FF61
4C076FF68
4C076GG41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA05
4C086GA13
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086NA05
4C086ZA07
4C086ZA08
4C086ZA36
4C086ZA38
4C086ZA43
4C086ZA54
4C086ZA59
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZA96
4C086ZB11
4C086ZB15
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZC33
4C086ZC35
4C086ZC37
4C086ZC42
(57)【要約】
リポソームを含む製剤であって、リポソームは、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、製剤。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リポソームを含む製剤であって、前記リポソームが、前記リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、製剤。
【請求項2】
前記薬学的に許容される塩が四ナトリウム塩である、請求項１に記載の製剤。
【請求項3】
前記リポソームが、前記リポソームを基準として、１．０～２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０～２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項4】
前記ＰＥＧ化リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］である、請求項１に記載の製剤。
【請求項5】
前記リポソームが、前記リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、請求項４に記載の製剤。
【請求項6】
前記リポソームが、前記リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、請求項４に記載の製剤。
【請求項7】
前記リポソームが、前記リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、請求項４に記載の製剤。
【請求項8】
前記リポソームが、前記リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、請求項４に記載の製剤。
【請求項9】
前記リポソームがさらにホスファチジルコリンを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項10】
前記ホスファチジルコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである、請求項９に記載の製剤。
【請求項11】
前記リポソームがさらに酸化防止剤を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項12】
前記酸化防止剤がブチル化ヒドロキシアニソールである、請求項１１に記載の製剤。
【請求項13】
前記リポソームがさらに、前記リポソームを基準として、０～１０ｍｏｌ％のステロールを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項14】
前記ステロールがコレステロールである、請求項１３に記載の製剤。
【請求項15】
前記リポソームがステロールを含まない、請求項１３に記載の製剤。
【請求項16】
前記リポソームが、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したときに、１００～１２０ｎｍの間の平均粒径を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項17】
前記リポソームが０．２０以下の多分散指数を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項18】
リポソームを含む製剤を製造するための方法であって、前記リポソームの使用される全ての成分を基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質と、溶媒とを含む溶液を調製することと、
前記溶液から前記溶媒を蒸発させて、薄膜を形成することと、
前記薄膜を緩衝溶液中に分散させて、液体分散体を形成することと、
前記液体分散体をフィルタから押出して、前記製剤を形成することと
を含む、方法。
【請求項19】
前記溶液がさらにホスファチジルコリン及び酸化防止剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記溶媒がクロロホルム及びメタノールの組合せである、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記分散ステップが音波処理により実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記方法がさらに、前記押出ステップで形成された製剤のｐＨを６．２～６．８に調整することを含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
[0001] 本開示は、リポソームを含む製剤に関する。
[0001] 本開示は、リポソームを含む製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
[0002] 「Ｅ５５６４」とも呼ばれるエリトランは、２つの糖部分及び４つの長鎖脂肪酸部分を含むリポ多糖類似体である。エリトランは、約１，４０１の分子量を有する。エリトランの調製方法は、米国特許第５，５３０，１１３号、同第５，６８１，８２４号、同第５，７５０，６６４号、同第５，９３５，９３８号、及び同第６，１８４，３６６号、並びに国際公開第９６／３９４１１号に記載されている。これらの文書は、参照によって本明細書中に援用される。報告によれば、ｐＨ及び溶液中の対イオンの濃度を制御することにより、様々なミセルの流体力学直径を有するエリトラン薬物製剤が達成されている。それは、本明細書中に参照によって援用される米国特許第６，９０６，０４２号において報告されている。
[0002] 「Ｅ５５６４」とも呼ばれるエリトランは、２つの糖部分及び４つの長鎖脂肪酸部分を含むリポ多糖類似体である。エリトランは、約１，４０１の分子量を有する。エリトランの調製方法は、米国特許第５，５３０，１１３号、同第５，６８１，８２４号、同第５，７５０，６６４号、同第５，９３５，９３８号、及び同第６，１８４，３６６号、並びに国際公開第９６／３９４１１号に記載されている。これらの文書は、参照によって本明細書中に援用される。報告によれば、ｐＨ及び溶液中の対イオンの濃度を制御することにより、様々なミセルの流体力学直径を有するエリトラン薬物製剤が達成されている。それは、本明細書中に参照によって援用される米国特許第６，９０６，０４２号において報告されている。
【0003】
[0003] エリトランは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アンタゴニストとして作用するリピドＡ類似体である。エリトランは以下の構造を有する：
【化1】
【0004】
[0004] リピドＡ類似体の活性は、リポタンパク質コレステロールとの相互作用によって変化されることが報告されている。これらのリポタンパク質は通常ヒト血清中に存在し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む。研究により、血漿リポタンパク質プロファイルの変化は、親油性薬物の効力及び薬力学プロファイルの両方を変化させ得ることが仮定されている。特に、研究により、エリトランのＨＤＬへの結合は、時間依存性の薬物活性の損失をもたらすことが確認された。参照によって本明細書中に援用されるDaniel P. Rossignol, et al., "Safety, Pharmacokinetics, Pharmacodynamics, and Plasma Lipoprotein Distribution of Eritoran (E5564) during Continuous Intravenous Infusion into Healthy Volunteers" Antimicrobial Agents&Chemotherapy, Sep. 2004, p. 3233-3240を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005] 本開示の目的の１つは、インビボ又はＨＤＬ（例えば、ヒトＨＤＬ）の存在下で、エリトラン自体又はミセル化エリトランよりも高い活性、好ましくは、インターロイキン－６（ＩＬ－６）生成阻害活性又はＴＮＦ－α生成阻害活性を有するエリトラン含有製剤を提供することである。本発明者らは、エリトラン及びＰＥＧ化リン脂質を含むリポソームが、インビボ又はＨＤＬ（例えば、ヒトＨＤＬ）の存在下で、より高い活性を有すること、そしてエリトラン及びＰＥＧ化リン脂質の量を調整することによって、リポソームがはるかにより高い活性を有することが可能になることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【0006】
[0006] 本開示は、以下の実施形態を提供する。
［１］リポソームを含む製剤であって、リポソームが、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、製剤。
［２］薬学的に許容される塩が四ナトリウム塩である、［１］に従う製剤。
［３］リポソームが、リポソームを基準として、１．０～２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０～２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］又は［２］に従う製剤。
［３－１］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－２］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－３］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－４］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［４］ＰＥＧ化リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］である、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［５］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［６］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［７］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［８］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［９］リポソームがさらにホスファチジルコリンを含む、［１］～［８］のいずれか１つに従う製剤。
［１０］ホスファチジルコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである、［９］に従う製剤。
［１１］リポソームがさらに酸化防止剤を含む、［１］～［１０］のいずれか１つに従う製剤。
［１２］酸化防止剤がブチル化ヒドロキシアニソールである、［１１］に従う製剤。
［１３］リポソームがさらに、リポソームを基準として、０～１０ｍｏｌ％のステロールを含む、［１］～［１２］のいずれか１つに従う製剤。
［１４］ステロールがコレステロールである、［１３］に従う製剤。
［１５］リポソームがステロールを含まない、［１３］に従う製剤。
［１６］リポソームが、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したときに、１００～１２０ｎｍの間の平均粒径を有する、［１］～［１５］のいずれか１つに従う製剤。
［１７］リポソームが０．２０以下の多分散指数を有する、［１］～［１６］のいずれか１つに従う製剤。
［１８］リポソームを含む製剤を製造するための方法であって、
リポソームの使用される全ての成分を基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質と、溶媒とを含む溶液を調製することと、
溶液から溶媒を蒸発させて、薄膜を形成することと、
薄膜を緩衝溶液中に分散させて、液体分散体を形成することと、
液体分散体をフィルタから押出して、製剤を形成することと
を含む、方法。
［１９］溶液がさらにホスファチジルコリン及び酸化防止剤を含む、［１８］に従う方法。
［２０］溶媒がクロロホルム及びメタノールの組合せである、［１８］又は［１９］に従う方法。
［２１］分散ステップが音波処理により実施される、［１８］～［２０］のいずれか１つに従う方法。
［２２］方法がさらに、押出ステップで形成された製剤のｐＨを６．２～６．８に調整することを含む、［１８］～［２１］のいずれか１つに従う方法。
［１］リポソームを含む製剤であって、リポソームが、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、製剤。
［２］薬学的に許容される塩が四ナトリウム塩である、［１］に従う製剤。
［３］リポソームが、リポソームを基準として、１．０～２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０～２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］又は［２］に従う製剤。
［３－１］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－２］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－３］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［３－４］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［４］ＰＥＧ化リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］である、［１］～［３］のいずれか１つに従う製剤。
［５］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［６］リポソームが、リポソームを基準として、１．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［７］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、１．０ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［８］リポソームが、リポソームを基準として、２．５ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、２．５ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］とを含む、［４］に従う製剤。
［９］リポソームがさらにホスファチジルコリンを含む、［１］～［８］のいずれか１つに従う製剤。
［１０］ホスファチジルコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである、［９］に従う製剤。
［１１］リポソームがさらに酸化防止剤を含む、［１］～［１０］のいずれか１つに従う製剤。
［１２］酸化防止剤がブチル化ヒドロキシアニソールである、［１１］に従う製剤。
［１３］リポソームがさらに、リポソームを基準として、０～１０ｍｏｌ％のステロールを含む、［１］～［１２］のいずれか１つに従う製剤。
［１４］ステロールがコレステロールである、［１３］に従う製剤。
［１５］リポソームがステロールを含まない、［１３］に従う製剤。
［１６］リポソームが、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したときに、１００～１２０ｎｍの間の平均粒径を有する、［１］～［１５］のいずれか１つに従う製剤。
［１７］リポソームが０．２０以下の多分散指数を有する、［１］～［１６］のいずれか１つに従う製剤。
［１８］リポソームを含む製剤を製造するための方法であって、
リポソームの使用される全ての成分を基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質と、溶媒とを含む溶液を調製することと、
溶液から溶媒を蒸発させて、薄膜を形成することと、
薄膜を緩衝溶液中に分散させて、液体分散体を形成することと、
液体分散体をフィルタから押出して、製剤を形成することと
を含む、方法。
［１９］溶液がさらにホスファチジルコリン及び酸化防止剤を含む、［１８］に従う方法。
［２０］溶媒がクロロホルム及びメタノールの組合せである、［１８］又は［１９］に従う方法。
［２１］分散ステップが音波処理により実施される、［１８］～［２０］のいずれか１つに従う方法。
［２２］方法がさらに、押出ステップで形成された製剤のｐＨを６．２～６．８に調整することを含む、［１８］～［２１］のいずれか１つに従う方法。
【0007】
[0007] 本開示はさらに、以下の実施形態を提供する。
［Ａ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害において使用するため、ＴＬＲ４二量体化の阻害において使用するため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害において使用するため、ＩＬ－６生成の阻害において使用するため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤。
［Ｂ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための方法であって、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う有効量の製剤を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
［Ｃ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤の使用。
［Ｄ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための薬剤の製造における、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤の使用。
［Ａ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害において使用するため、ＴＬＲ４二量体化の阻害において使用するため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害において使用するため、ＩＬ－６生成の阻害において使用するため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤。
［Ｂ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための方法であって、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う有効量の製剤を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
［Ｃ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤の使用。
［Ｄ］リポ多糖のＴＬＲ４への結合の阻害のため、ＴＬＲ４二量体化の阻害のため、ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害のため、ＩＬ－６生成の阻害のため、ＴＬＲ４の活性化若しくはＩＬ－６の生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防のため、ＴＮＦ－α生成の阻害において使用するため、又はＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患の処置若しくは予防において使用するための薬剤の製造における、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに従う製剤の使用。
【0008】
[0008] 実施形態［Ａ］～［Ｄ］に関しては、以下の＜製剤＞セクションに記載される特徴が参照され得る。
【0009】
[0009] 本開示に従って、インビボ又はＨＤＬ（例えば、ヒトＨＤＬ）の存在下で、エリトラン自体又はミセル化エリトランよりも高い活性、好ましくは、ＩＬ－６生成阻害活性又はＴＮＦ－α生成阻害活性を有するエリトラン含有製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
図面の簡単な説明
【図1】[0010]実施例１～４の製剤のインビボのＩＬ－６生成阻害活性を示す。
【図2-1】[0010]希釈実施例１、１１及び１３の製剤のインビボのＩＬ－６生成阻害活性を示す。
【図2-2】[0010]希釈実施例１～４の製剤のインビボのＩＬ－６生成阻害活性を示す。
【図2-3】[0010]希釈実施例５及び６の製剤のインビボのＩＬ－６生成阻害活性を示す。
【図3】[0010]ヒトＨＤＬの存在下でミセル化エリトラン及び実施例１～４の製剤のＴＮＦ－α生成阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
詳細な説明
＜定義＞
[0011] 本明細書で使用される場合、冠詞「a」及び「an」は、他に記載されない限り、「１つ又は複数」又は「少なくとも１つ」を意味する。
＜定義＞
[0011] 本明細書で使用される場合、冠詞「a」及び「an」は、他に記載されない限り、「１つ又は複数」又は「少なくとも１つ」を意味する。
【0012】
＜製剤＞
[0012] 一実施形態はリポソームを含む製剤に関し、リポソームは、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む。より少量のエリトラン又はその薬学的に許容される塩を含むリポソームは、インビボ又はＨＤＬ（例えば、ヒトＨＤＬ）の存在下で、より高い活性を有することが見出された。
[0012] 一実施形態はリポソームを含む製剤に関し、リポソームは、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質とを含む。より少量のエリトラン又はその薬学的に許容される塩を含むリポソームは、インビボ又はＨＤＬ（例えば、ヒトＨＤＬ）の存在下で、より高い活性を有することが見出された。
【0013】
[0013] 本製剤は、リポソームに加えて、脂質二重層ディスクを含み得る。本製剤は、リポソームに加えて、脂質二重層を含み得る。本製剤は、リポソームに加えて、脂質二重層ディスク及び脂質二重層を含み得る。本明細書で使用される場合、脂質二重層は、リポソームも脂質二重層ディスクも形成しない。
【0014】
[0014] リポソームは、エリトラン又はその薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。薬学的に許容される塩の例としては、アルカリ金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム又はカリウム塩、及びアルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム又はマグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。エリトランの薬学的に許容される塩は、好ましくはナトリウム塩、例えば四ナトリウム塩である。
【0015】
[0015] リポソーム中に含有されるエリトラン又はその薬学的に許容される塩の量は、リポソームを基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％、好ましくは１．０～２．５ｍｏｌ％である。エリトラン又はその薬学的に許容される塩の量を上記の範囲内に、又は上記の点まで調整することによって、製剤ははるかにより高い活性を有することが可能になる。
【0016】
[0016] リポソームはＰＥＧ化リン脂質を含む。ＰＥＧ化リン脂質は、リン脂質に共有結合されたポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）部分を有する。ＰＥＧ基の分子量は、好ましくは約５００～約５，０００、より好ましくは約１，０００～約３，０００、さらにより好ましくは約２，０００である。ＰＥＧ化リン脂質は、好ましくは、１４～１８個の炭素原子を有するアシル基、より好ましくは１８個の炭素原子を有するアシル基を有する。ＰＥＧ化リン脂質の例としては、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＰＥＧ化リン脂質は、単独で又は組み合わせて使用され得る。ＰＥＧ化リン脂質は、好ましくは、以下の構造を有するＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である：
【化2】
【0017】
[0017] リポソーム中に含有されるＰＥＧ化リン脂質の量は、リポソームを基準として、０．５～３．０ｍｏｌ％、好ましくは１．０～２．５ｍｏｌ％である。ＰＥＧ化リン脂質の量を上記の範囲内に又は上記の点まで調整することによって、製剤ははるかにより高い活性を有することが可能になる。
【0018】
[0018] 好ましくは、リポソーム中のエリトラン又はその薬学的に許容される塩及びＰＥＧ化リン脂質の量は、リポソームを基準としてそれぞれ、１．０ｍｏｌ％及び１．０ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％及び２．５ｍｏｌ％、２．５ｍｏｌ％及び１．０ｍｏｌ％、又は２．５ｍｏｌ％及び２．５ｍｏｌ％である。
【0019】
[0019] リポソームはさらに、ホスファチジルコリンを含み得る。ホスファチジルコリンの例としては、大豆ＰＣ、卵ＰＣ、ジエライドイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（同義語１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）（ＤＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、及びジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのホスファチジルコリンは、単独で又は組み合わせて使用され得る。ホスファチジルコリンは、好ましくは、以下の構造を有するＤＳＰＣである：
【化3】
【0020】
[0020] 「大豆－ＰＣ」という用語は、様々な一不飽和、二不飽和、三不飽和及び飽和脂肪酸を含むホスファチジルコリン組成物を指す。通常、大豆－ＰＣは、約１２重量％～約３３重量％の量のパルミチン酸、約３重量％～約８重量％の量のステアリン酸、約４重量％～約２２重量％の量のオレイン酸、約６０重量％～約６６重量％の量のリノール酸、及び約５重量％～約８重量％の量のリノレン酸を含む。
【0021】
[0021] 「卵－ＰＣ」という用語は、様々な飽和及び不飽和脂肪酸を含むホスファチジルコリン組成物を指す。通常、卵－ＰＣは、約３４重量％の量のパルミチン酸、約１０重量％の量のステアリン酸、約３１重量％の量のオレイン酸、及び約１８重量％の量のリノール酸を含む。
【0022】
[0022] リポソーム中に含有されるホスファチジルコリンの量は、リポソームを基準として、好ましくは８６～９８ｍｏｌ％、より好ましくは８９～９７ｍｏｌ％、さらにより好ましくは９２～９６ｍｏｌ％である。
【0023】
[0023] リポソームはさらに酸化防止剤を含み得る。酸化防止剤の例としては、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、システイナート塩酸塩（cysteinate hydrochloride）、ジチオン酸ナトリウム、グルタミン酸モノナトリウム、グルタチオン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール、コハク酸水素アルファトコフェロール、及びエチレンジアミン四酢酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酸化防止剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。酸化防止剤は、好ましくはＢＨＡである。
【0024】
[0024] リポソーム中に含有される酸化防止剤の量は、リポソームを基準として、好ましくは０．０２～０．１２ｍｏｌ％、より好ましくは０．０４～０．１０ｍｏｌ％、さらにより好ましくは０．０６～０．０８ｍｏｌ％である。
【0025】
[0025] リポソームはさらにステロールを含み得る。ステロールの例としては、コレステロール、カンプエステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、及びエルゴステロールが挙げられるが、これらに限定されない。これらのステロールは、単独で又は組み合わせて使用され得る。ステロールは、好ましくは、以下の構造を有するコレステロールである：
【化4】
【0026】
[0026] リポソーム中に含有されるステロールの量は、リポソームを基準として、好ましくは０～３０ｍｏｌ％、より好ましくは０～１０ｍｏｌ％、さらにより好ましくは０～６ｍｏｌ％、最も好ましくは０％である。ステロールの量を低減することによって、製剤ははるかにより高い活性を有することが可能になる。
【0027】
[0027] 好ましくは、リポソームは、エリトラン又はその薬学的に許容される塩、ＰＥＧ化リン脂質、ホスファチジルコリン及び酸化防止剤だけからなる。より好ましくは、リポソームは、エリトラン又はその薬学的に許容される塩、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］、ジステアロイルホスファチジルコリン及びブチル化ヒドロキシアニソールだけからなる。これらの成分の使用によって、製剤ははるかにより高い活性を有することが可能になる。リポソームがその内部空間に水及び緩衝液などの材料を含み得ることは、当業者により理解されるであろう。
【0028】
[0028] 上記のリポソームの成分及びその量は、脂質二重層ディスク及び脂質二重層に適用することができる。
【0029】
[0029] 製剤はさらに、任意選択的な成分を含み得る。任意選択的な成分の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリアクリル酸などの薬学的に許容される賦形剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸エチル、及びヒドロキシ安息香酸プロピルなどの保存剤；無機酸及び有機酸及び塩基などのｐＨ調整剤；甘味剤；並びに香味剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0030】
[0030] リポソームの平均粒径は一般的に知られている方法によって適切に調整され得るが、リポソームは、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したときに、好ましくは８０～１４０ｎｍの間、より好ましくは１００～１２０ｎｍの間の平均粒径（Ｚ－ａｖｅ）を有する。
【0031】
[0031] リポソームは、好ましくは０．２０以下、より好ましくは０．１０以下、さらにより好ましくは０．０５以下の多分散指数（ＰｄＩ）を有する。ＰｄＩの下限は特に制限されないが、例えば、０．０１である。
【0032】
[0032] 製剤は、リポ多糖（ＬＰＳ）のＴＬＲ４への結合を阻害するために使用され得る。製剤は、ＴＬＲ４二量体化を阻害するために使用され得る。製剤は、ＴＬＲ４シグナル伝達を阻害するために使用され得る。製剤は、ＩＬ－６生成を阻害するために使用され得る。
【0033】
[0033] 製剤は、ＴＬＲ４の活性化又はＩＬ－６の生成によって媒介される疾患を処置又は予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、セプシス；エボラウィルス疾患；マールブルグウィルス疾患；疼痛；内毒血症を含むがこれに限定されない敗血症；発熱、全身性炎症、播種性血管内凝固、低血圧、急性腎不全、急性呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝細胞破壊及び／又は心不全の随伴症状を有する、グラム陰性菌血症から生じる内毒血症；並びにエンドトキシンショックを含むがこれに限定されない種々の形態の敗血性ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【0034】
[0034] 製剤は、ＴＮＦ－α生成を阻害するために使用され得る。製剤は、ＴＮＦ－αの生成によって媒介される疾患を処置又は予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、セプシス；エボラウィルス疾患；マールブルグウィルス疾患；疼痛；関節リウマチ；乾癬；糖尿病；高脂血症、原発性高脂血症、高コレステロール血症、家族性複合型高脂血症、高リポ蛋白血症、低リポ蛋白血症及び高トリグリセリド血症を含むがこれらに限定されない脂質異常症；並びに骨粗鬆症が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
[0035] 製剤の適切な用量及び投与は、対象の年齢、体重及び健康状態、処置又は予防すべき疾患、投与経路などに応じて当業者によって決定され得る。
【0036】
[0036] 製剤は、好ましくは非経口的に投与され、より好ましくは静脈内に投与される。
【0037】
[0037] 製剤の剤形は注射液又は点滴液であり得る。
【0038】
[0038] 投与すべき注射製剤のエリトランベースの量は、１用量あたり０．００１～２０ｍｇエリトラン／ｋｇ体重、好ましくは、１用量あたり０．０１～１０ｍｇエリトラン／ｋｇ体重であり得る。注射製剤は、１日に１～６回、好ましくは１日に１～３回投与され得る。注射製剤は、１～１０日間、好ましくは１～５日間にわたって投与され得る。
【0039】
[0039] 投与すべき点滴製剤のエリトランベースの量は、０．００１～１０ｍｇエリトラン／ｋｇ体重／時間、好ましくは０．００３～５ｍｇエリトラン／ｋｇ体重／時間であり得る。点滴製剤は、０．５～６時間／日、好ましくは１～３時間／日で投与され得る。点滴製剤は、１～１０日間、好ましくは１～５日間にわたって投与され得る。
【0040】
[0040] 「対象」という用語は、処置又は予防の対象である動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ウマ、キリン、カモノハシ、霊長類、例えば、ヒト、サル、チンパンジー及び類人猿などが挙げられるが、これらに限定されない。対象は、好ましくはヒトである。
【0041】
＜製造方法＞
[0041] 一実施形態は、上記で定義されるリポソームを含む製剤の製造方法に関する。具体的には、本方法は、
リポソームの使用される全ての成分を基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質と、溶媒とを含む溶液を調製することと、
溶液から溶媒を蒸発させて、薄膜を形成することと、
薄膜を緩衝溶液中に分散させて、液体分散体を形成することと、
液体分散体をフィルタから押出して、製剤を形成することと
を含む。
[0041] 一実施形態は、上記で定義されるリポソームを含む製剤の製造方法に関する。具体的には、本方法は、
リポソームの使用される全ての成分を基準として、０．７～３．０ｍｏｌ％のエリトラン又はその薬学的に許容される塩と、０．５～３．０ｍｏｌ％のＰＥＧ化リン脂質と、溶媒とを含む溶液を調製することと、
溶液から溶媒を蒸発させて、薄膜を形成することと、
薄膜を緩衝溶液中に分散させて、液体分散体を形成することと、
液体分散体をフィルタから押出して、製剤を形成することと
を含む。
【0042】
[0042] 調製ステップで使用されるリポソームの成分及びその量に関しては、上記の＜製剤＞セクションで記載されるリポソームの成分及びその量を参照することができる。
【0043】
[0043] 溶媒がリポソームの成分を溶解させる限り、任意の溶媒を調製ステップにおいて使用することができる。溶媒の例としては、クロロホルム及びジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素、並びにメタノール及びエタノールなどのアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、好ましくは、クロロホルム及びメタノールの組合せである。
【0044】
[0044] 分散ステップは、好ましくは、音波処理によって実施される。緩衝溶液は、好ましくは、スクロースなどの糖類を含む。緩衝溶液の温度は、好ましくは５０～９０℃、より好ましくは６０～８０℃である。
【0045】
[0045] 押出ステップで使用されるフィルタは、好ましくは、積み重ねられた２つ以上のフィルタ部材を含む。フィルタ部材の数は、好ましくは２～６、より好ましくは３～５、さらにより好ましくは４である。フィルタ部材は、好ましくは、それぞれ異なる細孔サイズを有する。フィルタ部材の細孔サイズは、好ましくは０．０５～１．５μｍ、より好ましくは０．０８～１．０μｍ、さらにより好ましくは０．１～０．８μｍである。フィルタ部材の数が４である場合、各フィルタ部材の細孔サイズは、好ましくはそれぞれ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ及び０．８μｍである。押出ステップにおけるろ過は、好ましくは２回以上、より好ましくは３～７回、さらにより好ましくは４～６回実施される。
【0046】
[0046] 本方法はさらに、押出ステップで形成される製剤のｐＨを好ましくは６．２～６．８、より好ましくは６．４～６．６に調整することを含み得る。ｐＨは、ＮａＯＨ及びＫＯＨなどのアルカリ金属水酸化物、又はＨＣｌなどの無機酸を用いて調整され得る。そのｐＨが調整された製剤は、滅菌フィルタによって滅菌され得る。
【実施例】
【0047】
実施例
＜製剤の調製＞
（材料）
[0047] 表示される供給源からの以下の材料を実施例において使用した：エリトラン（Eisai Co., Ltd.から）；コレステロール（Ｃｈｏｌ、Wako Pure Chemical（Wako）から）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Nippon Pure Chemicalから）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、Genzymeから）；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ、Wakoから）；クロロホルム（Wakoから）；メタノール（Wakoから）；スクロース（Wakoから）；無水ＮａＨ2ＰＯ4（Wakoから）；１Ｎ－ＨＣｌ（Wakoから）；１Ｎ－ＮａＯＨ（KANTO Chemicalから）、及びMilli-Q Gradient A10（Merck Millipore）により精製された水。
＜製剤の調製＞
（材料）
[0047] 表示される供給源からの以下の材料を実施例において使用した：エリトラン（Eisai Co., Ltd.から）；コレステロール（Ｃｈｏｌ、Wako Pure Chemical（Wako）から）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Nippon Pure Chemicalから）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、Genzymeから）；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ、Wakoから）；クロロホルム（Wakoから）；メタノール（Wakoから）；スクロース（Wakoから）；無水ＮａＨ2ＰＯ4（Wakoから）；１Ｎ－ＨＣｌ（Wakoから）；１Ｎ－ＮａＯＨ（KANTO Chemicalから）、及びMilli-Q Gradient A10（Merck Millipore）により精製された水。
【0048】
（装置）
[0048] 表示される供給源からの以下の装置を実施例において使用した：天秤：METTLER AT250及びPG503；ｐＨメーター：HORIBA pH/ION METER D-53；ロータリーエバポレーター：EYELA N-1000；デジタルウォーターバス：EYELA SB-1000；真空ポンプ：SATO VACUUM MACHINERY Oil Rotary Vacuum Pump SW-100。
[0048] 表示される供給源からの以下の装置を実施例において使用した：天秤：METTLER AT250及びPG503；ｐＨメーター：HORIBA pH/ION METER D-53；ロータリーエバポレーター：EYELA N-1000；デジタルウォーターバス：EYELA SB-1000；真空ポンプ：SATO VACUUM MACHINERY Oil Rotary Vacuum Pump SW-100。
【0049】
実施例１
[0049] 表１に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0049] 表１に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0050】
【表1】
【0051】
[0050] 実施例１では以下の試薬を使用した。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
４０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
２．５ｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、６０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
９０ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、３０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
５００ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、２０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
４ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
４０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
２．５ｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、６０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
９０ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、３０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
５００ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、２０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
４ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
【0052】
（１）薄膜の調製
[0051] 表１に示される製剤を調製するために、１．７５ｍＬのエリトラン溶液、３．３７ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．５５ｍＬのコレステロール溶液、０．５６ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び６０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
[0051] 表１に示される製剤を調製するために、１．７５ｍＬのエリトラン溶液、３．３７ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．５５ｍＬのコレステロール溶液、０．５６ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び６０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
【0053】
（２）液体分散体の調製
[0052] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
[0052] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
【0054】
（３）製剤の調製
[0053] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
[0053] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
【0055】
実施例２
[0054] 表２に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0054] 表２に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0056】
【表2】
【0057】
[0055] 実施例２では以下の試薬を使用した。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
【0058】
（１）薄膜の調製
[0056] 表２に示される製剤を調製するために、６．７ｍｇのエリトラン、３６８．３ｍｇのＤＳＰＣ、１１．９ｍｇのコレステロール、及び３４．９ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を５０ｍＬの丸底フラスコに秤量した。８ｍＬのクロロホルム及び３ｍＬのメタノールを添加し、フラスコを穏やかに振とうさせた。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、４０μＬのＢＨＡ溶液を添加した。ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
[0056] 表２に示される製剤を調製するために、６．７ｍｇのエリトラン、３６８．３ｍｇのＤＳＰＣ、１１．９ｍｇのコレステロール、及び３４．９ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を５０ｍＬの丸底フラスコに秤量した。８ｍＬのクロロホルム及び３ｍＬのメタノールを添加し、フラスコを穏やかに振とうさせた。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、４０μＬのＢＨＡ溶液を添加した。ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
【0059】
（２）液体分散体の調製
[0057] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
[0057] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
【0060】
（３）製剤の調製
[0058] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
[0058] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
【0061】
実施例３
[0059] 表３に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0059] 表３に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0062】
【表3】
【0063】
[0060] 実施例３では以下の試薬を使用した。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
６０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
１．２ｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、５０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
５０ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、２５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
４５０ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、２０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
４ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
６０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
１．２ｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、５０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
５０ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、２５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
４５０ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、２０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
４ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
【0064】
（１）薄膜の調製
[0061] 表３に示される製剤を調製するために、１．１７ｍＬのエリトラン溶液、１２．１３ｍＬのＤＳＰＣ溶液、５．８ｍＬのコレステロール溶液、０．６２ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４００μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
[0061] 表３に示される製剤を調製するために、１．１７ｍＬのエリトラン溶液、１２．１３ｍＬのＤＳＰＣ溶液、５．８ｍＬのコレステロール溶液、０．６２ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４００μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
【0065】
（２）液体分散体の調製
[0062] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
[0062] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
【0066】
（３）製剤の調製
[0063] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
[0063] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
【0067】
実施例４
[0064] 表４に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0064] 表４に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0068】
【表4】
【0069】
[0065] 実施例４では以下の試薬を使用した。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
５０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
６００ｍｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
２５ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムを添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
８０ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
５０ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
６００ｍｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
２５ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムを添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
８０ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
【0070】
（１）薄膜の調製
[0066] 表４に示される製剤を調製するために、１．４０ｍＬのエリトラン溶液、２．３８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．８６ｍＬのコレステロール溶液、０．７０ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
[0066] 表４に示される製剤を調製するために、１．４０ｍＬのエリトラン溶液、２．３８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．８６ｍＬのコレステロール溶液、０．７０ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
【0071】
（２）液体分散体の調製
[0067] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
[0067] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する丸底フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
【0072】
（３）製剤の調製
[0068] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
[0068] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
【0073】
実施例５～８
[0069] 表５及び６に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0069] 表５及び６に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0074】
【表5】
【0075】
【表6】
【0076】
[0070] 実施例５～８では以下の試薬を使用した。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
５ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
７５０ｍｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、５０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
４５ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムを添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
６５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
（１）０．１Ｎ－ＮａＯＨ
１ｍＬの１Ｎ－ＮａＯＨを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（２）０．１Ｎ－ＨＣｌ
１ｍＬの１Ｎ－ＨＣｌを１０ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（３）スクロース緩衝溶液
２０ｇのスクロースを２００ｍＬのガラスビーカー内に秤量し、約１８０ｍＬの精製水を添加した。次に、２４ｍｇのＮａＨ2ＰＯ4を添加し、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び０．１Ｎ－ＨＣｌを添加することによってｐＨ値を６．５に調整した。溶液を２００ｍＬのメスフラスコに入れてから、精製水で容積を調整した。
（４）クロロホルム／メタノール混合物
５０ｍＬのクロロホルム及び１００ｍＬのメタノールをガラスボトル内で混合した。
（５）エリトラン溶液
５ｍｇのエリトランをガラスボトルに秤量し、５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらエリトランを完全に溶解させた。
（６）ＤＳＰＣ溶液
７５０ｍｇのＤＳＰＣをガラスボトルに秤量し、５０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＣを完全に溶解させた。
（７）コレステロール溶液
４５ｍｇのコレステロールをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムを添加した。振とうさせながらコレステロールを完全に溶解させた。
（８）ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液
６５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００をガラスボトルに秤量し、５ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を完全に溶解させた。
（９）ＢＨＡ溶液
６ｍｇのＢＨＡをガラスボトルに秤量し、１０ｍＬのクロロホルム／メタノール混合物を添加した。振とうさせながらＢＨＡを完全に溶解させた。
【0077】
（１）薄膜の調製
[0071] 表５に示される実施例５の製剤を調製するために、１．３９ｍＬのエリトラン溶液、１０．０ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．０７ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表５に示される実施例６の製剤を調製するために、１．３９ｍＬのエリトラン溶液、４．９８ｍＬのコレステロール溶液、６．８４ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．０７ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表６に示される実施例７の製剤を調製するために、０．３５ｍＬのエリトラン溶液、１．２５ｍＬのコレステロール溶液、１２．１８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、０．５４ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び５０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表６に示される実施例８の製剤を調製するために、０．３５ｍＬのエリトラン溶液、１．２５ｍＬのコレステロール溶液、１１．９８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．３４ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び５０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより各フラスコの溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
[0071] 表５に示される実施例５の製剤を調製するために、１．３９ｍＬのエリトラン溶液、１０．０ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．０７ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表５に示される実施例６の製剤を調製するために、１．３９ｍＬのエリトラン溶液、４．９８ｍＬのコレステロール溶液、６．８４ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．０７ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び４０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表６に示される実施例７の製剤を調製するために、０．３５ｍＬのエリトラン溶液、１．２５ｍＬのコレステロール溶液、１２．１８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、０．５４ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び５０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
表６に示される実施例８の製剤を調製するために、０．３５ｍＬのエリトラン溶液、１．２５ｍＬのコレステロール溶液、１１．９８ｍＬのＤＳＰＣ溶液、１．３４ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液、及び５０μＬのＢＨＡ溶液を５０ｍＬの丸底フラスコ内で混合した。
成分の全てが完全に溶解したことを確認した後、ロータリーエバポレーターにより各フラスコの溶媒を除去して、成分から薄膜を作製した。丸底フラスコを一晩真空チャンバに入れて、残留溶媒を除去した。
【0078】
（２）液体分散体の調製
[0072] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する各フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
[0072] スクロース緩衝溶液を水浴中で７０℃に加熱し、５ｍＬの加熱スクロース緩衝溶液を、薄膜を含有する各フラスコに添加した。薄膜が完全に分散されるまで、混合物を超音波浴内で音波処理した。
【0079】
（３）製剤の調製
[0073] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
[0073] 細孔サイズ０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．８μｍのＰＣフィルタを積み重ねて押出器を構築し、循環水浴を７０℃に設定した。調整及び圧力逃し弁の付いたＮ2シリンダに押出器を取り付けた。押出器アセンブリを加熱させ、次に液体分散体をロードした。押出器を閉めて、液体分散体を７０℃に平衡化させた。Ｎ2シリンダラインを開き、定常流の液体分散体が出口ホースから流れるのが観察されるまで、Ｎ2圧力をゆっくり上昇させた。ろ過ステップをさらに４回繰り返した。５回目のろ過からのろ液を清浄なチューブに収集し、室温まで冷却した後、０．１Ｎ－ＮａＯＨ及び／又は０．１Ｎ－ＨＣｌを用いてろ液のｐＨ値を６．５に調整した。シリンジフィルタ（ポリプロピレンハウジングを有するWhatman PES Filter Media、細孔サイズ０．２μｍ）を用いてろ液を滅菌し、実験に使用するまで、凍結を回避するために冷蔵庫で保管した。このようにして得られた製剤は、動的光散乱分析により、リポソームを含むことが確認された。
【0080】
実施例９～２６
[0074] 表７に記載される成分を含む製剤を調製した。
[0074] 表７に記載される成分を含む製剤を調製した。
【0081】
【表7】
【0082】
[0075] 実施例９～２６の製剤は、実施例１とほぼ同じ手順で調製した。表７の製剤のエリトラン濃度は、約１ｍＭであった。エリトランを含まない製剤（実施例２４～２６）の総脂質濃度は、約１００ｍＭであった。
【0083】
＜動的光散乱分析＞
[0076] 動的光散乱（ＤＬＳ）によって実施例１～２６の製剤を分析し、平均粒径（Ｚ－ａｖｅ）及び多分散指数（ＰｄＩ）を決定した。ＤＬＳ分析のために以下の設定を使用した。
[0076] 動的光散乱（ＤＬＳ）によって実施例１～２６の製剤を分析し、平均粒径（Ｚ－ａｖｅ）及び多分散指数（ＰｄＩ）を決定した。ＤＬＳ分析のために以下の設定を使用した。
【0084】
（実験手順）
[0077] システム：Zetasizer Nano-ZS（Malvern Panalytical）
測定条件：
サンプルの反射率（Reflective Index）：１．４５
サンプルの吸着率（Adsorption Rate）：０．０１
分散媒体：Milli-Q水
分散媒体の反射率：１．３３０
分散媒体の粘度（ｃＰ）：１．００３１
測定温度：２０℃
プレインキュベーション時間：５分
測定時間：６０秒、３回
測定位置（距離）：４．６５ｍｍ
サンプル調製：
５ｍＬのMilli-Q水中に５０マイクロリットルのサンプル
[0077] システム：Zetasizer Nano-ZS（Malvern Panalytical）
測定条件：
サンプルの反射率（Reflective Index）：１．４５
サンプルの吸着率（Adsorption Rate）：０．０１
分散媒体：Milli-Q水
分散媒体の反射率：１．３３０
分散媒体の粘度（ｃＰ）：１．００３１
測定温度：２０℃
プレインキュベーション時間：５分
測定時間：６０秒、３回
測定位置（距離）：４．６５ｍｍ
サンプル調製：
５ｍＬのMilli-Q水中に５０マイクロリットルのサンプル
【0085】
（ＤＬＳ分析の結果）
[0078] 各製剤のＺ－ａｖｅ及びＰｄＩ値を表８に要約した。実施例１８～２０以外の製剤は１００ｎｍ以上のＺ－ａｖｅを有し、したがって、これらの製剤においてエリトラン含有リポソームが形成されていると考えられた。実施例１８～２２及び２６以外の製剤は０．２以下のＰｄＩを有し、したがって、これらの製剤において粒径分布は十分に制御されていると考えられた。実施例１８～２２のエリトランを含む製剤のＰｄＩ（すなわち、０．２超）は、エリトランの微粒子製剤として均一性に関する問題の可能性を示す。
[0078] 各製剤のＺ－ａｖｅ及びＰｄＩ値を表８に要約した。実施例１８～２０以外の製剤は１００ｎｍ以上のＺ－ａｖｅを有し、したがって、これらの製剤においてエリトラン含有リポソームが形成されていると考えられた。実施例１８～２２及び２６以外の製剤は０．２以下のＰｄＩを有し、したがって、これらの製剤において粒径分布は十分に制御されていると考えられた。実施例１８～２２のエリトランを含む製剤のＰｄＩ（すなわち、０．２超）は、エリトランの微粒子製剤として均一性に関する問題の可能性を示す。
【0086】
【表8】
【0087】
＜インビボ及びインビトロアッセイで使用されるミセル化エリトラン及びプラセボ＞
[0079] インビボ及びインビトロアッセイで使用されるミセル化エリトラン及びプラセボは、バイアル内で凍結乾燥粉末から調製した。ミセル化エリトランバイアルは、エリトラン（四ナトリウム４．０［Ｎａ］塩ベースで）７．４６ｍｇ、ラクトース一水和物、及びブチル化ヒドロキシアニソールを含有する。水酸化ナトリウム及びリン酸も適量でミセル化エリトランバイアル内に含有される。プラセボバイアルは、ラクトース一水和物を含有する。二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、及び水酸化ナトリウムも適量でプラセボバイアル内に含有される。各バイアルを３．０ｍｌの注射用滅菌水で再構成した（溶液は、２．３３ｍｇ／ｍｌ又は１．６６ｍＭである）。再構成したミセル化エリトランを、再構成したプラセボ溶液によって希釈して、適切な濃度を調製した。
[0079] インビボ及びインビトロアッセイで使用されるミセル化エリトラン及びプラセボは、バイアル内で凍結乾燥粉末から調製した。ミセル化エリトランバイアルは、エリトラン（四ナトリウム４．０［Ｎａ］塩ベースで）７．４６ｍｇ、ラクトース一水和物、及びブチル化ヒドロキシアニソールを含有する。水酸化ナトリウム及びリン酸も適量でミセル化エリトランバイアル内に含有される。プラセボバイアルは、ラクトース一水和物を含有する。二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、及び水酸化ナトリウムも適量でプラセボバイアル内に含有される。各バイアルを３．０ｍｌの注射用滅菌水で再構成した（溶液は、２．３３ｍｇ／ｍｌ又は１．６６ｍＭである）。再構成したミセル化エリトランを、再構成したプラセボ溶液によって希釈して、適切な濃度を調製した。
【0088】
＜実施例の製剤のインビボ効力＞
[0080] 実施例１～２６で調製された製剤のインビボ効力をマウス研究により調べた。体重約２０ｇ／マウスのＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ（Charles River Laboratories）雌マウスを、１群あたり４匹のマウスで使用した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ（０．５μｇ／頭、カタログ番号２０１、List Biological Laboratories, Inc.）の腹腔内投与の２時間前に、９．１ｍｇ／ｋｇのミセル化エリトラン又は実施例の製剤を動物に静脈内注射した。２つの群のマウスに、製剤の偽対照（mock control）及びミセル化エリトラン対照としてそれぞれ同じ体積のスクロース緩衝液及びプラセボを注射した。ＬＰＳ注射後２時間以内に、サイトカイン測定のために動物を捕獲し、血漿をEDTA/3Kチューブ（カタログ番号４９９３８８、Greiner Bio-One GmbH）に採取した（麻酔下で腹部静脈から）。以下の手順を除いてＥＬＩＳＡキットプロトコル（(Mouse IL-6 ELISA Set、カタログ番号５５５２４０；Reagent Set B pH9.5、カタログ番号５５０５３４、BD Biosciences）に従ってＩＬ－６サイトカインを測定した。コーティング緩衝液として炭酸－重炭酸緩衝液（５０ｍｌのMilli-Q水中に１キャップ、カタログ番号Ｃ３０４１－１００ＣＡＰ、Sigma-Aldrich Corporation）中に捕捉抗体を希釈した。各ステップにおいてプレートウォッシャー（ELx405 select、BioTek Instruments, Inc.）によりウェルをリン酸緩衝生理食塩水（カタログ番号Ｐ３５６３－１０ＰＡＫ、Sigma-Aldrich Corporation）で洗浄した。残存洗浄緩衝液を除去するために、各ステップにおいて上下を逆にして、プレートを４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した（HITACH CF16RXII；ローター：T5S32-0049）。吸光分光光度計を使用して、各ウェルの光学濃度を決定した（SpectraMax 190、Molecular Devices, LLC）。デュプリケートのウェルの光学濃度を平均し、SoftMax Pro 6.5.1（Build number 219831、Molecular Devices, LLC）を用いて、４パラメータロジスティック（４－ＰＬ）曲線適合による標準曲線を作成した。GraphPad Prism 7.02（GraphPad software, Inc.）により、プロット及び中央値が四分位範囲と共に提供された。結果の一部は図１に示され、さらなる結果は表９に示される。これらの結果は、ミセル化エリトランと比較して、エリトラン含有リポソームがＩＬ－６生成を阻害することを示す。
[0080] 実施例１～２６で調製された製剤のインビボ効力をマウス研究により調べた。体重約２０ｇ／マウスのＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ（Charles River Laboratories）雌マウスを、１群あたり４匹のマウスで使用した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ（０．５μｇ／頭、カタログ番号２０１、List Biological Laboratories, Inc.）の腹腔内投与の２時間前に、９．１ｍｇ／ｋｇのミセル化エリトラン又は実施例の製剤を動物に静脈内注射した。２つの群のマウスに、製剤の偽対照（mock control）及びミセル化エリトラン対照としてそれぞれ同じ体積のスクロース緩衝液及びプラセボを注射した。ＬＰＳ注射後２時間以内に、サイトカイン測定のために動物を捕獲し、血漿をEDTA/3Kチューブ（カタログ番号４９９３８８、Greiner Bio-One GmbH）に採取した（麻酔下で腹部静脈から）。以下の手順を除いてＥＬＩＳＡキットプロトコル（(Mouse IL-6 ELISA Set、カタログ番号５５５２４０；Reagent Set B pH9.5、カタログ番号５５０５３４、BD Biosciences）に従ってＩＬ－６サイトカインを測定した。コーティング緩衝液として炭酸－重炭酸緩衝液（５０ｍｌのMilli-Q水中に１キャップ、カタログ番号Ｃ３０４１－１００ＣＡＰ、Sigma-Aldrich Corporation）中に捕捉抗体を希釈した。各ステップにおいてプレートウォッシャー（ELx405 select、BioTek Instruments, Inc.）によりウェルをリン酸緩衝生理食塩水（カタログ番号Ｐ３５６３－１０ＰＡＫ、Sigma-Aldrich Corporation）で洗浄した。残存洗浄緩衝液を除去するために、各ステップにおいて上下を逆にして、プレートを４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した（HITACH CF16RXII；ローター：T5S32-0049）。吸光分光光度計を使用して、各ウェルの光学濃度を決定した（SpectraMax 190、Molecular Devices, LLC）。デュプリケートのウェルの光学濃度を平均し、SoftMax Pro 6.5.1（Build number 219831、Molecular Devices, LLC）を用いて、４パラメータロジスティック（４－ＰＬ）曲線適合による標準曲線を作成した。GraphPad Prism 7.02（GraphPad software, Inc.）により、プロット及び中央値が四分位範囲と共に提供された。結果の一部は図１に示され、さらなる結果は表９に示される。これらの結果は、ミセル化エリトランと比較して、エリトラン含有リポソームがＩＬ－６生成を阻害することを示す。
【0089】
【表9】
【0090】
＜実施例の製剤のインビボスクリーニングアッセイ＞
[0082] 実施例１～２６において優れた製剤を絞り込むためのスクリーニングアッセイは、上記アッセイ（「実施例の製剤のインビボ効力」）のプロトコルを部分的に修正することによって研究した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳの腹腔内投与の２時間前に、同様に対照を用いて、スクロース緩衝液で希釈（８倍）した１．１３７５ｍｇ／ｋｇの実施例の製剤を同じ条件の動物に静脈内注射した。ＬＰＳ注射後２時間以内に、サイトカイン測定のために動物を捕獲し、血漿をEDTA/3Kチューブに採取した（麻酔下で腹部静脈から）。上記アッセイ（「実施例の製剤のインビボ効力」）の同じ手順を用いてＩＬ－６サイトカインを測定した。結果の一部は図２－１、２－２及び２－３に示される。
[0082] 実施例１～２６において優れた製剤を絞り込むためのスクリーニングアッセイは、上記アッセイ（「実施例の製剤のインビボ効力」）のプロトコルを部分的に修正することによって研究した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳの腹腔内投与の２時間前に、同様に対照を用いて、スクロース緩衝液で希釈（８倍）した１．１３７５ｍｇ／ｋｇの実施例の製剤を同じ条件の動物に静脈内注射した。ＬＰＳ注射後２時間以内に、サイトカイン測定のために動物を捕獲し、血漿をEDTA/3Kチューブに採取した（麻酔下で腹部静脈から）。上記アッセイ（「実施例の製剤のインビボ効力」）の同じ手順を用いてＩＬ－６サイトカインを測定した。結果の一部は図２－１、２－２及び２－３に示される。
【0091】
[0083] 図２－１は、希釈実施例１が、偽対照と比較して、７８．８％のＩＬ－６生成を阻害したことを示す（偽対照群及び希釈実施例１群におけるＩＬ－６濃度の中央値はそれぞれ２８５１．８ｐｇ／ｍｌ及び６０６．０ｐｇ／ｍｌであった；ラインは、四分位範囲と共に中央値を示す）。ＩＬ－６生成阻害活性は、希釈実施例１１及び希釈実施例１３では観察されなかった（希釈実施例１１群及び希釈実施例１３群におけるＩＬ－６濃度の中央値はそれぞれ３２０３．０ｐｇ／ｍｌ及び４１０４．６ｐｇ／ｍｌであった）。
【0092】
[0084] 図２－２及び２－３は、希釈実施例２群、希釈実施例３群、希釈実施例４群、及び希釈実施例５群についてもこの条件での阻害が観察されたことを示す（偽対照群、希釈実施例２群、希釈実施例３群、及び希釈実施例４群におけるＩＬ－６濃度の中央値はそれぞれ２６０５．８ｐｇ／ｍｌ、３９０．９ｐｇ／ｍｌ、３５７．８ｐｇ／ｍｌ、６２６．３ｐｇ／ｍｌであった）。希釈実施例５（実施例１のコレステロール変更製剤）も高いＩＬ－６生成阻害活性を示した（９６．７％、偽対照群及び実施例５群におけるＩＬ－６濃度の中央値はそれぞれ２８１２．１ｐｇ／ｍｌ及び９２．１ｐｇ／ｍｌであった）。
【0093】
[0085] 全ての希釈製剤の概要は、表１０に示される。
【0094】
【表10】
【0095】
＜ヒトＨＤＬ不活性化アッセイ＞
[0086] 以下のプロトコルにより、実施例の製剤について高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の影響を評価した。生理食塩水（カタログ番号３３１１４０１Ａ３１１１、Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.）を用いて製剤を５０μＭに希釈し、１ｍｇ／ｍｌのヒトＨＤＬ（カタログ番号ＬＰ３－５ＭＧ、Merck KGaA）と混合した。混合製剤を３７℃で１８時間インキュベートした。EDTA/2K試験菅（VENOJECT（登録商標）、カタログ番号ＶＰ－Ｈ１００Ｋ、TERUMO CORPORATION）により健康なヒト全血を調製した。混合製剤を、最終濃度で１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する４倍体積の全血と混合した。３７℃で３時間のインキュベーションの後、遠心分離（４℃において１，０００ｘｇで５分間）により上澄みを調製した。ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＳＴＡ００Ｃ、R&D Systems）によりＴＮＦ－αを測定した。添付の取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡアッセイを行った。各ステップにおいてプレートウォッシャー（ELx405 select、BioTek Instruments, Inc.）によりウェルを洗浄した。残存洗浄緩衝液を除去するために、各ステップにおいて上下を逆にして、プレートを４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した（HITACH CF16RXII；ローター：T5S32-0049）。吸光分光光度計を使用して、各ウェルの光学濃度を決定した（SpectraMax 190、Molecular Devices, LLC）。デュプリケートのウェルの光学濃度を平均し、SoftMax Pro 6.5.1（Build number 219831、Molecular Devices, LLC）を用いて、４パラメータロジスティック（４－ＰＬ）曲線適合による標準曲線を作成した。GraphPad Prism 7.02（GraphPad software, Inc.）により、プロット及び中央値が四分位範囲と共に提供された。結果は表１１及び図３に示される。これらの結果は、実施例１～４の製剤がヒトＨＤＬの存在下でもその活性を保持することを示す。
[0086] 以下のプロトコルにより、実施例の製剤について高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の影響を評価した。生理食塩水（カタログ番号３３１１４０１Ａ３１１１、Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.）を用いて製剤を５０μＭに希釈し、１ｍｇ／ｍｌのヒトＨＤＬ（カタログ番号ＬＰ３－５ＭＧ、Merck KGaA）と混合した。混合製剤を３７℃で１８時間インキュベートした。EDTA/2K試験菅（VENOJECT（登録商標）、カタログ番号ＶＰ－Ｈ１００Ｋ、TERUMO CORPORATION）により健康なヒト全血を調製した。混合製剤を、最終濃度で１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する４倍体積の全血と混合した。３７℃で３時間のインキュベーションの後、遠心分離（４℃において１，０００ｘｇで５分間）により上澄みを調製した。ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＳＴＡ００Ｃ、R&D Systems）によりＴＮＦ－αを測定した。添付の取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡアッセイを行った。各ステップにおいてプレートウォッシャー（ELx405 select、BioTek Instruments, Inc.）によりウェルを洗浄した。残存洗浄緩衝液を除去するために、各ステップにおいて上下を逆にして、プレートを４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した（HITACH CF16RXII；ローター：T5S32-0049）。吸光分光光度計を使用して、各ウェルの光学濃度を決定した（SpectraMax 190、Molecular Devices, LLC）。デュプリケートのウェルの光学濃度を平均し、SoftMax Pro 6.5.1（Build number 219831、Molecular Devices, LLC）を用いて、４パラメータロジスティック（４－ＰＬ）曲線適合による標準曲線を作成した。GraphPad Prism 7.02（GraphPad software, Inc.）により、プロット及び中央値が四分位範囲と共に提供された。結果は表１１及び図３に示される。これらの結果は、実施例１～４の製剤がヒトＨＤＬの存在下でもその活性を保持することを示す。
【0096】
【表11】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【国際調査報告】