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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(54)【発明の名称】サイトカイン及び足場タンパク質を含む融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220209BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220209BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220209BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220209BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20220209BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20220209BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20220209BHJP
C07K 14/545 20060101ALI20220209BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220209BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220209BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220209BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220209BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C07K14/195
C07K14/52
C07K14/54
C07K14/545
C07K19/00
C12P21/02 C
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
G01N33/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021535663
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(85)【翻訳文提出日】2021-08-17
(86)【国際出願番号】 EP2019086696
(87)【国際公開番号】W WO2020127983
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】18215463.3
(32)【優先日】2018-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509333933
【氏名又は名称】フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー
(71)【出願人】
【識別番号】509333922
【氏名又は名称】フリエ・ウニベルシテイト・ブリユツセル
(71)【出願人】
【識別番号】518384906
【氏名又は名称】ルクセンブルク インスティテュート オブ ヘルス（エルアイエイチ）
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＸＥＭＢＯＵＲＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ（ＬＩＨ）
【住所又は居所原語表記】８４ Ｖａｌ Ｆｌｅｕｒｉ，Ｌ－１５２６ ＬＵＸＥＭＢＯＵＲＧ（ＬＵ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ステヤエルト，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】パルドン，エルス
(72)【発明者】
【氏名】ボールケーニヒ，アレクサンドル
(72)【発明者】
【氏名】カリチュク，バレンティーナ
(72)【発明者】
【氏名】ブランケン，ビム
(72)【発明者】
【氏名】ウチャンスキー，トマシュ
(72)【発明者】
【氏名】シェビニェ，アンディ
(72)【発明者】
【氏名】シュパコブスカ，マルティーナ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA36
2G045FA40
4B064AG01
4B064AG04
4B064CA02
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA13
4B065AA26X
4B065AA72X
4B065AA99Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA03
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、構造生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規融合タンパク質、高分子の三次元構造解析、例えばＸ線結晶構造解析及び高分解能クライオＥＭにおけるこれらの使用及び方法、並びに構造に基づくドラッグデザイン及びスクリーニングにおけるこれらの使用に関する。さらにより具体的には、本発明は、サイトカイン及び足場タンパク質の機能的融合タンパク質であって、足場が、サイトカインのトポロジーを中断して、その受容体結合及び活性化能を保持する剛性融合タンパク質を形成するフォールディングされたタンパク質である、機能的融合タンパク質に関する。より具体的には、ケモカイン及びインターロイキンに基づく機能的融合タンパク質、並びにこれらの産生及び使用が本明細書に開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
足場タンパク質と融合したサイトカインを含む機能的融合タンパク質であって、前記足場タンパク質は、少なくとも２つ以上の直接融合又はリンカーによって作製された融合を介して前記サイトカインのβストランド含有ドメインの露出したβターンにおける１つ以上のアクセス可能な部位で前記サイトカインのトポロジーを遮断する少なくとも５０アミノ酸のフォールディングされたタンパク質である、機能的融合タンパク質。
【請求項2】
サイトカインがケモカインであり、足場タンパク質が、ケモカインコアドメインの露出したβターンにおける１つ以上のアクセス可能な部位でケモカインコアドメインのトポロジーを遮断する、請求項１に記載の機能的融合タンパク質。
【請求項3】
ケモカインコアドメインが、Ｎ末端ループ、３つのβストランドを含むβシート、及びＣ末端ヘリックスを含み、足場タンパク質が、ケモカインコアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続する露出したβターンに挿入されている、請求項２に記載の機能的融合タンパク質。
【請求項4】
サイトカインがインターロイキンであり、足場タンパク質が、βバレルコアモチーフの露出したβターンにおける１つ以上のアクセス可能な部位でインターロイキンβバレルコアモチーフのトポロジーを遮断する、請求項１に記載の機能的融合タンパク質。
【請求項5】
インターロイキンがＩＬ－１ファミリーのインターロイキンである、請求項４に記載の機能的融合タンパク質。
【請求項6】
足場タンパク質が循環置換されたタンパク質である、請求項１～５のいずれかに記載の機能的融合タンパク質。
【請求項7】
足場タンパク質が、少なくとも３０ｋＤａの総分子質量を有する、請求項１～６のいずれかに記載の機能的融合タンパク質。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項10】
大腸菌における発現のための、酵母、ファージ、細菌、又はウイルスにおける表面ディスプレイのための、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞。
【請求項12】
融合タンパク質及びサイトカイン受容体が同時発現されている、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
（ｉ）請求項１～７のいずれかに記載の融合タンパク質、及び（ｉｉ）受容体タンパク質
を含む複合体であって、
受容体タンパク質が、融合タンパク質のサイトカインに結合している、複合体。
【請求項14】
受容体が、融合タンパク質に結合すると活性化される、請求項１３に記載の複合体。
【請求項15】
リガンド／受容体複合体の三次元構造を決定する方法であって、（ｉ）受容体タンパク質が、融合タンパク質のサイトカイン部分に結合している、請求項１～７のいずれかに記載の融合タンパク質及び受容体を提供して複合体を形成するステップ、又は請求項１３若しくは１４に記載の複合体を提供するステップ；
（ｉｉ）構造解析のために適した条件下で複合体をディスプレイするステップ
を含み、
リガンド／受容体複合体の３Ｄ構造が高分解能で決定される、方法。
【請求項16】
サイトカイン／受容体複合体の構造解析のための、請求項１～７のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項８に記載の核酸分子、請求項９又は１０に記載のベクター、請求項１１又は１２に記載の宿主細胞、請求項１３又は１４に記載の複合体の使用。
【請求項17】
構造解析が、単粒子クライオ－ＥＭ又は結晶構造解析を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項18】
請求項３に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）ケモカインコアドメインのトポロジーを遮断することなく、ケモカインタンパク質配列を遮断するためにアクセス可能なβターンを有するケモカイン及び足場タンパク質を選択するステップ；
（ｉｉ）以下をコードする遺伝子融合構築物を設計するステップ：
ａ）コアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３の間で中断されたケモカインのタンパク質配列、
ｂ）循環置換された足場タンパク質を得るためにＮ末端及びＣ末端が融合された足場タンパク質、
ｃ）元のＮ末端又はＣ末端とは異なる、ループ又はターンなどのアクセス可能な部位でそのアミノ酸配列が遮断されているｂ）の循環置換された足場タンパク質
ｄ）循環置換された足場タンパク質の最もＮ末端側で遮断された部位のアミノ酸に融合された、βストランドβ２のＣ末端側のケモカインの中断された部位のアミノ酸、及び循環置換された足場タンパク質の中断された部位の最もＣ末端側のアミノ酸に融合された、βストランドβ３のＮ末端側のケモカインの中断された部位のアミノ酸；
（ｉｉｉ）遺伝子融合構築物を発現系に導入して融合タンパク質を得るステップであって、ケモカインが循環置換された足場タンパク質にそのコアドメインの２つの部位で融合されているステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、構造生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規融合タンパク質、高分子の三次元構造解析、例えばＸ線結晶構造解析及び高分解能クライオ－ＥＭにおけるこれらの使用及び方法、並びに構造に基づくドラッグデザイン及びスクリーニングにおけるこれらの使用に関する。さらにより具体的には、本発明は、サイトカイン及び足場タンパク質の機能的融合タンパク質であって、足場が、サイトカインのトポロジーを遮断して、その受容体結合及び活性化能を保持する剛性融合タンパク質を形成するフォールディングされたタンパク質である、機能的融合タンパク質に関する。より具体的には、ケモカイン及びインターロイキンに基づく機能的融合タンパク質、並びにこれらの産生及び使用が、本明細書に開示される。
【背景技術】
【0002】
ある特定の立体構造状態における多くのタンパク質及び複合体の３Ｄ構造解析は依然として難しい。高分子Ｘ線結晶構造解析は、本質的にいくつかの欠点、例えば高品質の精製タンパク質が予め必要であること、比較的大量のタンパク質が必要であること、及び回折品質の結晶を調製することを有する。抗体断片又は他のタンパク質の形態での結晶化シャペロンを適用することは、標的の立体構造不均一性を最小限にすることによって秩序正しい結晶を得るのを容易にすることが証明されている。加えて、シャペロンは、最初の、モデルに基づく位相情報を、提供することができる（Ｋｏｉｄｅ，２００９）。さらに、単粒子クライオ電子顕微鏡（クライオ－ＥＭ）が最近、原子分解能での高分子複合体の構造解析のための代替の多目的の技術として開発されている（Ｎｏｇａｌｅｓ，２０１６）。データ解析のための機器及び方法は、着実に改善しているが、３Ｄ再構成に関する最高に達成可能な解決策は、主に、所定の試料の均一性、及び各個々の粒子の配向パラメーターを高精度となるよう繰り返し精密化する能力に、依存する。特定の領域を気水界面又は基質支持体に優先的に接着させるという高分子の表面特性による優先的な粒子の配向性は、クライオ－ＥＭにおいて繰り返し起こる問題となっている。このため、本態様においても同様に、本発明者らはなおも、これらのハードルを克服するための次世代シャペロンなどのツールを探索中である。
【0003】
サイトカインは、ピコモル濃度又はナノモル濃度で細胞シグナル伝達分子として作用して、炎症を調節し、細胞の活動、例えば遊走、成長、生存、及び分化をモジュレートする小さいタンパク質（５～２０ｋＤａ）のクラスである。サイトカインは、非常に大きく多様な群の炎症促進性又は抗炎症性因子であり、これらの構造の相同性又はこれらの受容体の相同性に基づいてファミリーに分類されている。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、ホルモン、又は増殖因子を含み得る。インターロイキン（ＩＬ）は、細胞の増殖、成熟、遊走、及び接着を含む複雑な免疫調節機能を有し、免疫細胞の分化及び活性化において重要な役割を果たすサイトカインの群を形成する。ＩＬはまた、炎症促進性作用及び抗炎症作用も有し得、宿主の免疫系と感染性の生物との間の持続的な競合により、進化するように常に圧力を受けている。このため、ＩＬは有意な進化を起こし、これによってオルソログタンパク質の間でアミノ酸がほとんど保存されず、遺伝子ファミリーの組織を複雑にする。しかし、共通の構造モチーフの結晶構造解析データ及び同定は、ＩＬ１様サイトカイン、クラスＩヘリカルサイトカイン（ＩＬ４様、γ鎖及びＩＬ６／１２様）、クラスＩＩヘリカルサイトカイン（ＩＬ１０様及びＩＬ２８様）、及び他のＩＬサブファミリーとは構造的に無関係であり、システインノットフォールドを構成するＩＬ１７Ｆを伴うＩＬ１７様サイトカインをコードする遺伝子を含む４つの主要な群への分類をもたらした。
【0004】
ケモカインは、その一般的機能が細胞遊走を誘導することであるサイトカインファミリー内の分泌型の小さい球状タンパク質の群である。サイトカイン又はケモカインリガンドがそのコグネート受容体に結合すると、受容体の活性化をもたらし、次にこれは、様々な細胞機能、例えば細胞接着、ファゴサイトーシス、サイトカイン分泌、細胞活性化、細胞増殖、細胞生存及び細胞死、アポトーシス、血管新生、並びに増殖を調節するシグナル伝達事象のカスケードを誘発する。
【0005】
ケモカインは、細胞表面及び細胞外基質上で勾配状に蓄積し、遊走する細胞上のケモカイン受容体によって方向に関するシグナルとして解釈される。ほとんどのケモカイン受容体は、ケモカインの結合に応答してＧαｉ依存的細胞内経路を活性化する７回膜貫通（７ＴＭ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。一部のケモカイン受容体は、他の機序を介してケモカインを輸送又は除去し、したがって異型ケモカイン受容体（ＡＣＫＲ）と呼ばれる。これらの「走化性サイトカイン」は、体全体の位置への白血球の化学誘引及び免疫細胞の移動に関係している。ケモカイン系は、多くの疾患領域、例えば炎症性の病態、例えば喘息、アテローム性動脈硬化症、及びリウマチ性関節炎に関係しており、自己免疫疾患にも関係している。サイトカイン及びケモカインは、細菌性髄膜炎、脳の膿瘍、ライム病による神経ボレリア症、及びＨＩＶ脳炎を含む様々な種類の炎症性神経変性疾患における神経炎症及び神経変性の媒介において重要な役割を果たす（総説に関しては、Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい）。したがって、その系を理解することは、適切な治療標的の選択及び起因する特異性にとって極めて重要である。
【0006】
ケモカインは、約７～１２ｋＤａの小さいタンパク質であり、成熟リガンドのアミノ末端付近のシステイン残基の特徴的なパターンに基づいて４つのサブファミリーに分類されている（ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ、及びＣ）。ケモカインは全て、相同な三次構造を示し、細胞表面グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）並びにケモカイン受容体と、異なるオリゴマー化状態で相互作用する。今日まで、約４５個のヒトケモカイン及び２２個のケモカイン受容体が知られており、同じサブファミリー内のケモカインはしばしば、同じクラスの複数の受容体に結合する。ケモカインは二量体型で出現するが、ケモカイン受容体に結合して活性化するのはそれらの単量体型である。受容体結合及び活性化の２部位モデルは、受容体活性化にとって必須であるケモカインのＮ末端、及び受容体結合を媒介するケモカインコアドメインを含む。天然のケモカインは、異なる受容体特異性を有し、公知のケモカインのバリアントは、これらの受容体の異なる立体構造状態を規定し、異なるシグナル伝達及び応答をもたらすことが示された。これにより一部のケモカインは、所定の受容体のアゴニストとして作用するが、他方はアンタゴニスト又はインバースアゴニストとして作用し得る。この認識及び活性化機構を完全に理解するためには、インタクト受容体と複合体を形成したケモカイン又はバリアントの高分解能の構造が必要である。例えば、アゴニスト及びアンタゴニストとして知られるいくつかのＣＣＬ５（又はＲＡＮＴＥＳ）バリアントの構造研究が、ＨＩＶに対する保護における抗菌剤としてのそれらの可能性に関して試験中である（Ｋｕｆａｒｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ケモカインのいくつかの構造は公知であり、可溶性複合体として再現される、より扱いやすいＧＰＣＲに関して、構造が解明されている（β２－アドレナリン受容体、ロドプシン）。しかし、ケモカイン／受容体複合体及び相互作用における構造の洞察はなおも限定的であり、膜貫通タンパク質としての受容体の立体構造上の可撓性により難しい問題を生じる。結晶構造は、低分子と複合体を形成したケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５ ＧＰＣＲ、及びアンタゴニストケモカインバリアント５Ｐ７－ＣＣＬ５と複合体を形成したＣＣＲ５、ウイルスアンタゴニストケモカインｖＭＩＰ－ＩＩと複合体を形成したＣＸＣＲ４、並びにヒトＣＸ３ＣＬ１と複合体を形成したウイルス受容体ＵＳ２８に関して決定されている。その上、Ｇ－タンパク質及びβアレスチンと複合体を形成したＧＰＣＲの利用可能な結晶構造では、互いを比較した場合に受容体の立体構造に明白な顕著な差は認められず、それらのドラッガビリティを評価するためにはリガンド－受容体対における新規洞察が必須であることを示している（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１５）。放射線分解フットプリント、ジスルフィドトラッピング、及び突然変異誘発などの構造情報を解明する代替法が、例えばＡＣＫＲ３：ＣＸＣＬ１２及びＡＣＫＲ３：低分子複合体の構造をマッピングするために適用されている（Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このような技術は、相同な受容体におけるＸ線結晶構造解析では解明できないことが明らかになったダイナミック領域の、分子モデリングを用いた組込みをもたらし、受容体：ケモカイン及び受容体：低分子複合体の構築に関する既存の知識を拡大するための完全でまとまった実験的により促進されるモデルを生成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｋｏｉｄｅ，２００９
【非特許文献2】Ｎｏｇａｌｅｓ，２０１６
【非特許文献3】Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３
【非特許文献4】Ｋｕｆａｒｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５
【非特許文献5】Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１５
【非特許文献6】Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかし、ＧＰＣＲ並びに他のケモカイン、インターロイキン、又は「サイトカイン受容体」全体におけるリガンドによって誘導された立体構造変化の新規経路を探索し、新規機序を発見するためには、それらのリガンド、リガンドアナログ、又はバリアントとのこのような複合体のＸ線結晶構造解析又はクライオ－ＥＭ解析を容易にするための汎用プロトタイプのシャペロンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
（発明の要旨）
本出願は、新規機能的融合タンパク質の設計及び生成、並びにこれらの使用、例えば構造解析における次世代シャペロンとしてのこれらの役割に関する。本明細書に記載される融合タンパク質は、サイトカインリガンドを剛性融合タンパク質へと拡大させると、ある特定の立体構造状態でのリガンド／受容体複合体の構造解析を容易にすることができるという知見に基づいている。実際に、本開示は、サイトカインスーパーファミリーが配列類似性を共有し、構造の相同性、及びこれらの相互的受容体系において一部の無秩序を示すが、機能的類似性を示さないという仮定に基づいて融合タンパク質を提供する。サイトカインはその構造に従って分類されることから、汎用融合スキームを設計する場合、サイトカインのサブグループ内の構造エレメントにおける類似性から出発することができる。インターロイキンは、サイトカインのサブグループであり、例えばＩＬ－１スーパーファミリーは、ループ領域において有意な可撓性を有する保存されたβバレル疎水性コアモチーフを有する、３回回転対称性パターンで配置される逆平行βストランドを含む保存されたシグナチャーのβトレホイルのフォールドをとる。ケモカインは、非常に類似の基本的な三次構造を示す別のサブグループのサイトカインであり、ケモカインコアドメインは、少なくとも３個のβストランドを有するβシートを含む。前記サブファミリーが構造的に保存されていることにより、サイトキニン（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）は理想的には、リガンド／受容体複合体の構造解析における次世代シャペロンとしての汎用アプローチ及びプロトタイプを提供する。三次構造は、露出したターン又はループを介してそれらのβストランドの相互接続を提供する二次β構造（βシート又はβバレル）を含む保存されたコアを有するこれらのサブファミリー、例えば本明細書において互換的に使用される「ＩＬ－１受容体型インターロイキン」、又は「ＩＬ－１ファミリー」、及びケモカインにおいて相同であることから、露出し、足場タンパク質との融合のためにアクセス可能であるそれらのコアドメインにおける物理的位置を、一般的にサイトカイン／受容体複合体内のβストランドドメイン含有サイトカインの構造解析のためのリガンド組込みシャペロンを形成するための例として適用することができる。インターロイキン－１又はケモカインリガンドは、ＭｅｇａＫｉｎｅ（商標）として公知の剛性の、より大きいリガンドを構築するために使用され、意外にも拡大されたリガンド融合タンパク質はその受容体結合及び活性化能を保持した。これらの新規機能的融合タンパク質は、異なる立体構造状態におけるＧＰＣＲなどの受容体を捕捉するための及びそれらの構造解析を容易にするための新規経路を提供する。足場タンパク質をサイトカインコアドメイン内に、そのフォールディング又は機能性を妨害することなくこれがサイトカインのこのコアドメインのトポロジーを遮断するように、剛性をもたせて挿入することによって形成された新規融合は、構造に基づく新薬発見における新規アプローチを可能にする。得られた機能的融合タンパク質は、（ケモカイン及びＩＬ－１βに関して実証されるように）前記サイトカインと足場タンパク質との間の遺伝子融合の発現を介して得られ、足場又はそれらの断片が、サイトカインコアドメインのトポロジー内に挿入するように設計される。意外にも、得られた新規融合タンパク質は、それらの融合領域での高い剛性によって特徴付けられ、意外にもそれらの典型的なフォールド及び機能性を保持することが示され、すなわちそれらは結合親和性を保持し、その上サイトカイン受容体が結合すると活性化能を示した。実際に、露出したβターンのアクセス可能な部位でのサイトカインのその保存されたコアドメインと足場タンパク質との間で形成される遺伝子融合は、受容体結合を妨害しない又は変更しないように当業者によって選択される。このように、本発明は、サイトカインの保存されたコアドメイン、例えばケモカインコアドメイン内の露出したβターン又はβループにおける、すなわちβストランドβ２とβストランドβ３の間、又はＩＬ－１βバレルコアモチーフ、すなわち、βストランドβ６とβストランドβ７の間の完全に選択された部位を有することによって、新規かつ一意的なタイプの機能的融合タンパク質を提供し、設計することが容易ではないフォールディングされた足場タンパク質との剛性非可撓性融合を可能にする。融合タンパク質は、これによって、質量を増大させ、構造特色を供給することによって、ケモカインリガンド／受容体複合体の高分解能クライオ－ＥＭ及びＸ線結晶構造解析を容易にするための新規ツールを提供する。このため、サイトカイン、特にケモカイン又はそれらのバリアントリガンド、又はインターロイキン、ＩＬ－１、又はこれらのバリアントとその受容体との可能性がある任意の複合体の構造解析のためのこれらの次世代シャペロンの設計及び生成は、立体構造状態を変更することなく高分解能の構造を得るために目的の複合体に対して質量を加え、及び／又は規定の特色を加える拡大されたリガンドを可能にする。したがって実際に、融合タンパク質は、構造解析における、同様に構造に基づくドラッグデザイン及びスクリーニングにおけるツールとして有用であり、新規生物製剤及び低分子作用剤の発見及び開発にとっての付加価値となる。
本出願は、新規機能的融合タンパク質の設計及び生成、並びにこれらの使用、例えば構造解析における次世代シャペロンとしてのこれらの役割に関する。本明細書に記載される融合タンパク質は、サイトカインリガンドを剛性融合タンパク質へと拡大させると、ある特定の立体構造状態でのリガンド／受容体複合体の構造解析を容易にすることができるという知見に基づいている。実際に、本開示は、サイトカインスーパーファミリーが配列類似性を共有し、構造の相同性、及びこれらの相互的受容体系において一部の無秩序を示すが、機能的類似性を示さないという仮定に基づいて融合タンパク質を提供する。サイトカインはその構造に従って分類されることから、汎用融合スキームを設計する場合、サイトカインのサブグループ内の構造エレメントにおける類似性から出発することができる。インターロイキンは、サイトカインのサブグループであり、例えばＩＬ－１スーパーファミリーは、ループ領域において有意な可撓性を有する保存されたβバレル疎水性コアモチーフを有する、３回回転対称性パターンで配置される逆平行βストランドを含む保存されたシグナチャーのβトレホイルのフォールドをとる。ケモカインは、非常に類似の基本的な三次構造を示す別のサブグループのサイトカインであり、ケモカインコアドメインは、少なくとも３個のβストランドを有するβシートを含む。前記サブファミリーが構造的に保存されていることにより、サイトキニン（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）は理想的には、リガンド／受容体複合体の構造解析における次世代シャペロンとしての汎用アプローチ及びプロトタイプを提供する。三次構造は、露出したターン又はループを介してそれらのβストランドの相互接続を提供する二次β構造（βシート又はβバレル）を含む保存されたコアを有するこれらのサブファミリー、例えば本明細書において互換的に使用される「ＩＬ－１受容体型インターロイキン」、又は「ＩＬ－１ファミリー」、及びケモカインにおいて相同であることから、露出し、足場タンパク質との融合のためにアクセス可能であるそれらのコアドメインにおける物理的位置を、一般的にサイトカイン／受容体複合体内のβストランドドメイン含有サイトカインの構造解析のためのリガンド組込みシャペロンを形成するための例として適用することができる。インターロイキン－１又はケモカインリガンドは、ＭｅｇａＫｉｎｅ（商標）として公知の剛性の、より大きいリガンドを構築するために使用され、意外にも拡大されたリガンド融合タンパク質はその受容体結合及び活性化能を保持した。これらの新規機能的融合タンパク質は、異なる立体構造状態におけるＧＰＣＲなどの受容体を捕捉するための及びそれらの構造解析を容易にするための新規経路を提供する。足場タンパク質をサイトカインコアドメイン内に、そのフォールディング又は機能性を妨害することなくこれがサイトカインのこのコアドメインのトポロジーを遮断するように、剛性をもたせて挿入することによって形成された新規融合は、構造に基づく新薬発見における新規アプローチを可能にする。得られた機能的融合タンパク質は、（ケモカイン及びＩＬ－１βに関して実証されるように）前記サイトカインと足場タンパク質との間の遺伝子融合の発現を介して得られ、足場又はそれらの断片が、サイトカインコアドメインのトポロジー内に挿入するように設計される。意外にも、得られた新規融合タンパク質は、それらの融合領域での高い剛性によって特徴付けられ、意外にもそれらの典型的なフォールド及び機能性を保持することが示され、すなわちそれらは結合親和性を保持し、その上サイトカイン受容体が結合すると活性化能を示した。実際に、露出したβターンのアクセス可能な部位でのサイトカインのその保存されたコアドメインと足場タンパク質との間で形成される遺伝子融合は、受容体結合を妨害しない又は変更しないように当業者によって選択される。このように、本発明は、サイトカインの保存されたコアドメイン、例えばケモカインコアドメイン内の露出したβターン又はβループにおける、すなわちβストランドβ２とβストランドβ３の間、又はＩＬ－１βバレルコアモチーフ、すなわち、βストランドβ６とβストランドβ７の間の完全に選択された部位を有することによって、新規かつ一意的なタイプの機能的融合タンパク質を提供し、設計することが容易ではないフォールディングされた足場タンパク質との剛性非可撓性融合を可能にする。融合タンパク質は、これによって、質量を増大させ、構造特色を供給することによって、ケモカインリガンド／受容体複合体の高分解能クライオ－ＥＭ及びＸ線結晶構造解析を容易にするための新規ツールを提供する。このため、サイトカイン、特にケモカイン又はそれらのバリアントリガンド、又はインターロイキン、ＩＬ－１、又はこれらのバリアントとその受容体との可能性がある任意の複合体の構造解析のためのこれらの次世代シャペロンの設計及び生成は、立体構造状態を変更することなく高分解能の構造を得るために目的の複合体に対して質量を加え、及び／又は規定の特色を加える拡大されたリガンドを可能にする。したがって実際に、融合タンパク質は、構造解析における、同様に構造に基づくドラッグデザイン及びスクリーニングにおけるツールとして有用であり、新規生物製剤及び低分子作用剤の発見及び開発にとっての付加価値となる。
【0010】
本発明の第１の態様は、足場又は融合パートナー形成タンパク質に接続された機能的サイトカインを含む新規融合タンパク質であって、前記足場タンパク質が少なくとも５０アミノ酸のフォールディングされたタンパク質であり、前記サイトカインのアクセス可能な、したがって表面に露出している１つ以上のアミノ酸位置でサイトカインに結合され、これによって前記サイトカインのトポロジーの遮断をもたらす、新規融合タンパク質に関する。前記融合タンパク質は、それが機能的である、すなわちそれが前記足場タンパク質に融合されていないサイトカインリガンドと比較して、そのサイトカイン機能性を保持しているという点においてさらに特徴付けられる。別の実施形態は、本発明の融合タンパク質であって、足場タンパク質とサイトカインタンパク質との融合がサイトカインの一次トポロジーの遮断をもたらし、別のタンパク質に融合されていないサイトカインリガンドのフォールディングと比較して、サイトカインタンパク質のフォールディング及び典型的な三次構造を保持することを可能にする、融合タンパク質を開示する。より具体的には、アクセス可能なアミノ酸位置は、保存されたサイトカインのβストランド構造を相互接続するベータターン（βターン）又はβループの露出した領域に存在する。
【0011】
本発明の特定の実施形態では、融合は、直接融合、又はリンカー若しくはリンカーペプチドによって作製された融合であり得、前記融合部位は、剛性非可撓性融合タンパク質をもたらすように完全に設計されている。好ましくは、リンカーは、５、４、３個、又はより好ましくは２個のアミノ酸残基を含み、さらにより好ましくは１つのアミノ酸残基を含む、又は直接の融合（リンカーなし）であり得る。
【0012】
ケモカインコアドメインの表面上の１つ以上のアクセス可能な又は露出した部位でサイトカイン又はケモカインコアドメインに結合された足場タンパク質との前記融合タンパク質は、前記アクセス可能な又は露出した部位が受容体結合及び受容体活性化に関与する又は関係する領域に存在せず、受容体との結合及び／又は活性化におけるそのサイトカイン機能性を保持するという点においてさらに特徴付けられる。
【0013】
本発明の一実施形態は、新規融合タンパク質であって、前記サイトカインが足場又は融合パートナー形成タンパク質に接続された機能的ケモカインであり、前記足場タンパク質が前記ドメインの表面上でアクセス可能な、したがって露出している１つ以上のアミノ酸位置でケモカインのコアドメインに結合され、これによって前記ケモカインのトポロジーの遮断が起こる、新規融合タンパク質に関する。前記融合タンパク質は、前記足場タンパク質に融合されていないケモカインリガンドと比較して、そのケモカイン機能性を保持しているという点においてさらに特徴付けられる。別の実施形態は、本発明の融合タンパク質であって、足場タンパク質とケモカインコアドメインとの融合が、ケモカインコアドメインの一次トポロジーの遮断をもたらし、別のタンパク質に融合されていないケモカインリガンドのフォールディングと比較して前記ケモカインコアドメインのフォールディング及び典型的な三次構造を保持することを可能にする、融合タンパク質を開示する。一実施形態では、前記融合タンパク質は、Ｎ末端ループ、３つのβストランドを含有するβシート、及びＣ末端ヘリックスを有するケモカインコアドメインを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質の前記ケモカインコアドメインにおける露出した領域は、具体的には、βストランドβ２及びβストランドβ３を接続するβターンに関する。このため、足場タンパク質は、これらの２つのβストランドの間のβターンに存在するアクセス可能な部位でコアドメイン内に挿入される。
【0014】
代替の実施形態は、融合タンパク質であって、前記サイトカインがインターロイキン、好ましくは「ＩＬ－１ファミリー」インターロイキンであり、前記足場タンパク質が、前記βバレルコアモチーフの露出したβターンにおける１つ以上のアクセス可能な部位で、インターロイキンβバレルコアモチーフのトポロジーを遮断する、融合タンパク質に関する。特定の実施形態では、融合タンパク質の前記保存されたβバレルコアモチーフにおける露出した領域は、具体的には、βストランドβ６及びβストランドβ７を接続するβターンに関する。このため、足場タンパク質は、これらの２つのβストランドの間のβターンに存在するアクセス可能な部位でコアモチーフ内に挿入される。
【0015】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質を生成するために使用される足場タンパク質は、循環置換（circularly permutated）されたタンパク質であり、より具体的には循環置換は、前記足場タンパク質のＮ末端及びＣ末端の間で作製することができる。ある特定の実施形態では、循環置換された足場タンパク質は、前記足場タンパク質の別のアクセス可能な部位で切断され、ケモカインコアドメインのアクセス可能な部位に融合するための部位を提供する。本発明の別の実施形態は、足場タンパク質の総分子量が少なくとも３０ｋＤａである融合タンパク質に関する。
【0016】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される任意の融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。あるいは、一実施形態では、少なくともプロモーター、融合タンパク質をコードする前記核酸分子、及び転写終止シグナルを含有する３’末端領域を有するキメラ遺伝子が提供される。別の実施形態は、前記融合タンパク質をコードする、又は前記融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットに関する。さらなる実施形態は、本発明の融合タンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態では、前記ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、又は本明細書に提示する代替宿主における発現にとって適しており、かつ酵母、ファージ、細菌、又はウイルス（表面）ディスプレイにとって適している。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質を含む宿主細胞が開示される。あるいは、前記融合タンパク質、及び融合タンパク質のサイトカイン部分に結合することが可能なサイトカイン又はケモカイン受容体が同時発現される宿主細胞。
【0017】
本発明の別の態様は、前記融合タンパク質及びサイトカイン受容体を含む複合体に関する。より具体的には、融合タンパク質のサイトカイン部分、又は特に融合タンパク質のケモカイン若しくはインターロイキン部分に結合することが可能であるケモカイン又はインターロイキン受容体、及び前記受容体タンパク質が前記融合タンパク質に特異的に結合している前記融合タンパク質を含む複合体に関する。より詳しくは、前記受容体タンパク質は、前記融合タンパク質のサイトカイン部分又はあるいはケモカイン若しくはインターロイキン部分に結合し、さらにより詳しくは、融合タンパク質の公知の受容体結合領域に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される複合体は、活性化受容体であって、前記受容体がそのサイトカイン受容体結合領域、又は具体的にはそのケモカイン若しくはインターロイキン受容体結合領域で融合タンパク質に結合すると活性化された、活性化受容体を含む。
【0018】
本発明の別の態様は、サイトカイン受容体複合体の三次元構造を決定する方法であって、
（ｉ）本発明の融合タンパク質、及びサイトカイン受容体（例えば、ケモカイン／インターロイキン受容体）を提供して複合体を形成させるステップであって、前記受容体タンパク質が融合タンパク質のサイトカイン（例えば、それぞれ融合タンパク質のケモカイン又はインターロイキン）に特異的に結合するステップ、又はあるいは本発明の複合体を提供するステップ；並びに
（ｉｉ）前記混合物又は複合体を、構造解析のために適した条件でディスプレイするステップ
を含み、前記リガンド／受容体複合体の３Ｄ構造が前記構造解析を通して高分解能で決定される方法に関する。
（ｉ）本発明の融合タンパク質、及びサイトカイン受容体（例えば、ケモカイン／インターロイキン受容体）を提供して複合体を形成させるステップであって、前記受容体タンパク質が融合タンパク質のサイトカイン（例えば、それぞれ融合タンパク質のケモカイン又はインターロイキン）に特異的に結合するステップ、又はあるいは本発明の複合体を提供するステップ；並びに
（ｉｉ）前記混合物又は複合体を、構造解析のために適した条件でディスプレイするステップ
を含み、前記リガンド／受容体複合体の３Ｄ構造が前記構造解析を通して高分解能で決定される方法に関する。
【0019】
別の態様は、本明細書に記載される機能的融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ．サイトカインスーパーファミリー、例えばケモカイン又はインターロイキン様リガンド、及び３Ｄ構造が少なくとも１０ｋＤａのフォールディングされたタンパク質を明らかにする足場タンパク質を選択するステップであって、サイトカインが、保存されたサイトカインコアドメインの一次トポロジーを遮断することなくアミノ酸配列の遮断のために露出したβループ又はβターンにおけるアクセス可能な部位を有するステップ、
ｂ．核酸配列がタンパク質配列をコードするように設計された遺伝子融合構築物を設計するステップであって、
（ｉ）サイトカインリガンドのタンパク質配列が、表面に露出したβループ又はβターンであるその保存されたコアドメイン構造の２つのβストランドの間の部位に対応するアミノ酸位置で遮断され、
（ｉｉ）サイトカインの最もＮ末端側で遮断されたアミノ酸部位（最もＮ末端側のβストランドのＣ末端）が、足場タンパク質の最もＮ末端側で遮断された部位に融合され、サイトカインの最もＣ末端側で遮断された部位（最もＣ末端側のβストランドのＮ末端）が足場タンパク質の最もＣ末端側で遮断された部位に融合される
ステップ、
ｃ．前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが、そのコアドメインの２つ以上の部位で足場タンパク質に融合されるステップ
を含む方法に関する。
ａ．サイトカインスーパーファミリー、例えばケモカイン又はインターロイキン様リガンド、及び３Ｄ構造が少なくとも１０ｋＤａのフォールディングされたタンパク質を明らかにする足場タンパク質を選択するステップであって、サイトカインが、保存されたサイトカインコアドメインの一次トポロジーを遮断することなくアミノ酸配列の遮断のために露出したβループ又はβターンにおけるアクセス可能な部位を有するステップ、
ｂ．核酸配列がタンパク質配列をコードするように設計された遺伝子融合構築物を設計するステップであって、
（ｉ）サイトカインリガンドのタンパク質配列が、表面に露出したβループ又はβターンであるその保存されたコアドメイン構造の２つのβストランドの間の部位に対応するアミノ酸位置で遮断され、
（ｉｉ）サイトカインの最もＮ末端側で遮断されたアミノ酸部位（最もＮ末端側のβストランドのＣ末端）が、足場タンパク質の最もＮ末端側で遮断された部位に融合され、サイトカインの最もＣ末端側で遮断された部位（最もＣ末端側のβストランドのＮ末端）が足場タンパク質の最もＣ末端側で遮断された部位に融合される
ステップ、
ｃ．前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが、そのコアドメインの２つ以上の部位で足場タンパク質に融合されるステップ
を含む方法に関する。
【0020】
代替の実施形態は、本明細書に記載される融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ．ケモカイン又は足場タンパク質の一次トポロジーを遮断することなく、融合タンパク質のタンパク質配列を作成するために遮断される、それらの三次構造にアクセス可能なループ又はターンを有するケモカイン及びフォールディングされた足場タンパク質を選択するステップ、
ｂ．核酸配列がタンパク質配列をコードするように設計された遺伝子融合構築物を設計するステップであって、
（ｉ）ケモカインのタンパク質配列が、コアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応するアミノ酸で遮断され、
（ｉｉ）足場タンパク質が少なくとも１０ｋＤａであり、そのＮ末端及びＣ末端で融合されて循環置換された足場タンパク質を得、
（ｉｉｉ）ｉｉ）の循環置換された足場タンパク質が、ステップｉｉ）で融合されたアミノ酸を含有しない露出したβループ又はβターンに対応するアクセス可能な部位でそのアミノ酸配列がさらに遮断され、
（ｉｖ）βストランドβ２のＣ末端側のケモカインの遮断された部位が、最もＮ末端側で遮断されたアミノ酸部位、すなわち循環置換された足場タンパク質のＮ末端に融合され、βストランドβ３のＮ末端側のケモカインの遮断された部位が、最もＣ末端側で遮断されたアミノ酸残基、すなわち循環置換された足場タンパク質のＣ末端に融合される
ステップ、
ｃ．前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが、そのコアドメインの２つ以上の部位で循環置換された足場タンパク質に融合されるステップ
を含む方法に関する。
ａ．ケモカイン又は足場タンパク質の一次トポロジーを遮断することなく、融合タンパク質のタンパク質配列を作成するために遮断される、それらの三次構造にアクセス可能なループ又はターンを有するケモカイン及びフォールディングされた足場タンパク質を選択するステップ、
ｂ．核酸配列がタンパク質配列をコードするように設計された遺伝子融合構築物を設計するステップであって、
（ｉ）ケモカインのタンパク質配列が、コアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応するアミノ酸で遮断され、
（ｉｉ）足場タンパク質が少なくとも１０ｋＤａであり、そのＮ末端及びＣ末端で融合されて循環置換された足場タンパク質を得、
（ｉｉｉ）ｉｉ）の循環置換された足場タンパク質が、ステップｉｉ）で融合されたアミノ酸を含有しない露出したβループ又はβターンに対応するアクセス可能な部位でそのアミノ酸配列がさらに遮断され、
（ｉｖ）βストランドβ２のＣ末端側のケモカインの遮断された部位が、最もＮ末端側で遮断されたアミノ酸部位、すなわち循環置換された足場タンパク質のＮ末端に融合され、βストランドβ３のＮ末端側のケモカインの遮断された部位が、最もＣ末端側で遮断されたアミノ酸残基、すなわち循環置換された足場タンパク質のＣ末端に融合される
ステップ、
ｃ．前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが、そのコアドメインの２つ以上の部位で循環置換された足場タンパク質に融合されるステップ
を含む方法に関する。
【0021】
別の態様は、サイトカインリガンド／受容体タンパク質の構造解析のための、本発明の融合タンパク質の使用、又は核酸分子、ベクター、宿主細胞、若しくは複合体の使用に関する。特に、前記サイトカイン受容体（又はケモカイン／インターロイキン／・・・－受容体）タンパク質が、前記融合タンパク質に結合したタンパク質である融合タンパク質の使用に関する。具体的には、一実施形態は、単粒子クライオ－ＥＭ又は結晶構造解析を含む構造解析における融合タンパク質の使用に関する。
【0022】
記載される図面は、概略的なものに過ぎず、非限定的である。図面では、要素のいくつかの大きさは誇張されている場合があり、例示目的のために尺度通りに描かれていない場合がある。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】図１は、剛性ケモカインキメラタンパク質と比較した可撓性融合タンパク質を示す図面である。（Ａ）１つの直接融合又はリンカーのみを用いた、ケモカインドメインと足場タンパク質とのＮ末端又はＣ末端での可撓性融合体又はリンカー。（Ｂ）ケモカインドメインを足場に接続する少なくとも２つの直接融合又はリンカーを介して、ケモカインドメインが足場タンパク質に融合されている、ケモカインドメインと足場タンパク質との剛性融合体。
【図2】図２は、ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、足場タンパク質の循環置換されたバリアントから構築されたケモカイン融合タンパク質の操作原理を示す図面である。このスキームは、ケモカインが、ケモカインドメインを足場に接続する２つのペプチド結合又は２つのショートリンカーを介して、いかにして大型足場タンパク質にグラフトされ得るかを示す。はさみは、どの露出したターンが、ケモカイン及び足場において切断されなければならないかを示す。破線は、ケモカイン及び足場の残りの部分が、ケモカインキメラタンパク質を構築するために、ペプチド結合及びショートペプチドリンカーの使用によって、どのように連結されなければならないかを示す。
【図3】図３は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントから構築された５０ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質のモデル１を示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ、配列番号３）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。Ｃ末端タグは６×Ｈｉｓを含み、ＥＰＥＡは、破線で下線を付されている。
【図4】図４は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントから構築された５０ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質のモデル２を示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ、配列番号４）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。Ｃ末端タグは６×Ｈｉｓを含み、ＥＰＥＡは、破線で下線を付されている。
【図5】図５は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントから構築された５０ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質のモデル３を示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカイン融合タンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ、配列番号５）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。Ｃ末端タグは６×Ｈｉｓを含み、ＥＰＥＡは、破線で下線を付されている。
【図6】図６は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントから構築された５０ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質のモデル４を示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカイン融合タンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ、配列番号６）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。Ｃ末端タグは６×Ｈｉｓを含み、ＥＰＥＡは、破線で下線を付されている。
【図7】図７は、足場タンパク質ＨｏｐＱをケモカインに接続するリンカーペプチドの組成及び長さの最適化のための酵母ディスプレイベクターを示す図面である。（Ａ）ディスプレイベクターの概略図。ＬＳ：酵母における細胞外分泌を指示する酵母α因子の操作された分泌シグナルであるａｐｐＳ４（Ｒａｋｅｓｔｒａｗら、２００９）。Ｎ：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインの、βストランドβ２までのＮ末端部分（配列番号１の１～４３）；ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）；６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ３からの６Ｐ４－ＣＣＬ５Ｃ末端（配列番号１の４７～６９）；Ａｇａ１ｐタンパク質へのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質の接着サブユニットである、ディスプレイされたタンパク質Ａｇａ２ｐに接続する可撓性リンカー（Ｃｈａｏら、２００６）；ＡＣＰ：ディスプレイされたケモカイン融合タンパク質の直交標識のための、その発現レベルを観察するための、アシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、２００５）。（Ｂ）ディスプレイされたケモカイン融合タンパク質の配列多様性（配列番号２５～２８）：通常の字体のＡｐｐＳ４リーダー配列、可変長（１又は２アミノ酸）及び混合組成のショートペプチドリンカーである（Ｘ）１～２のランダムリンカーを有する、太字で示されているＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ；斜体の可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されているＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されているＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ。（Ｃ）可変長（１及び２アミノ酸）及び混合組成のショートペプチドリンカーを導入するための２つのフォワードＰＣＲプライマー（配列番号２９、配列番号３０）及び２つのリバースＰＣＲプライマー（配列番号３１、配列番号３２）の等モル混合物を用いることによって、合計１７６４００ＡＡ配列バリアントをコードするケモカイン融合タンパク質配列の４つのプール（それぞれ、ライブラリの２５％を表す）が生成された。
【図8】図８は、酵母ディスプレイ及び二次元フローサイトメトリーによる、ケモカイン融合タンパク質の連続ラウンドの選択を示す図面である。足場タンパク質ＨｏｐＱをケモカインＣＣＬ５に接続するリンカーペプチドの組成及び長さを最適化するために、酵母ディスプレイ及びフローサイトメトリーによって選択を行った。各ドットは、異なる長さ及び組成を有するリンカーを介してＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱをコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された別個のＥＢＹ１００酵母細胞の２つの蛍光シグナルを表す。酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル（Ｙ軸）を測定した。ディスプレイされたＭｅｇａｋｉｎｅがフォールディングされたＣＣＬ５部分を含むかどうかを測定するために、これらの細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（Ｘ軸）で補足的に染色した。ラウンド１では、ライブラリを０．２５ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体と共にインキュベートした。Ｍｅｇａｋｉｎｅ発現（ＰＥチャネル）及び抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（６４７ｎｍチャネル）について高蛍光をディスプレイする２０００００個の酵母細胞を選別した。ラウンド２では、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体を用いて濃縮ライブラリをインキュベートした。Ｍｅｇａｋｉｎｅ発現（ＰＥチャネル）及び抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）（６４７ｎｍチャネル）について最も高い蛍光をディスプレイする２００００個の酵母細胞を選別し、配列解析に供した。
【図9】図９は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の異なるリンカーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、二次元フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ（それぞれ、Ａ～Ｄ、モデル１～４、配列番号７～１０）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱをディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｅ、配列番号１１）として使用した。この実験では、非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞を、陰性対照として含めた（Ｆ）。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で等しく直交染色した。
【図10】図１０は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の、異なるリンカーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。単一パラメータのヒストグラムは、Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ（バージョン１～４、配列番号７～１０）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換されたＥＢＹ１００酵母細胞の、陽性対照のＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（配列番号１１）及び陰性対照の非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞と比較した相対蛍光強度を示す。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色した。モデル１、２、３、４は、実際のクローン及び融合タンパク質を指す。
【図11-1】図１１は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント１及び２の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル１及び２（配列番号７及び配列番号８）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合の平均蛍光強度を示す。モデル１、２は、実際のクローンを指す。
【図11-2】図１１は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント１及び２の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル１及び２（配列番号７及び配列番号８）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合の平均蛍光強度を示す。モデル１、２は、実際のクローンを指す。
【図11-3】図１１は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント１及び２の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル１及び２（配列番号７及び配列番号８）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合の平均蛍光強度を示す。モデル１、２は、実際のクローンを指す。
【図12-1】図１２は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント３及び４の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル３及び４（配列番号９及び配列番号１０）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示し、ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の平均蛍光強度を示す。モデル３、４は、実際のクローンを指す。
【図12-2】図１２は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント３及び４の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル３及び４（配列番号９及び配列番号１０）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示し、ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の平均蛍光強度を示す。モデル３、４は、実際のクローンを指す。
【図12-3】図１２は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質バリアント３及び４の機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル３及び４（配列番号９及び配列番号１０）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光の平均蛍光強度（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示し、ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の平均蛍光強度を示す。モデル３、４は、実際のクローンを指す。
【図13-1】図１３は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされた抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としての抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（配列番号１１）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光（抗原結合キメラタンパク質ディスプレイレベル）の平均蛍光強度を示し、ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の平均蛍光強度を示す。
【図13-2】図１３は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされた抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としての抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（配列番号１１）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＰＥ／ＣｏＡ－５４７蛍光（抗原結合キメラタンパク質ディスプレイレベル）の平均蛍光強度を示し、ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の平均蛍光強度を示す。
【図14】図１４は、４つの異なるキメラケモカインの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）への結合の、フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰ融合体としてのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ融合タンパク質モデル１～４（配列番号７～１０）及び陰性対照抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（配列番号１１）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光（ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合）の計算された平均蛍光強度のチャート表示。酵母クローンを誘導し、５つの異なる濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体（それぞれ、１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。
【図15】図１５は、ディスプレイされたケモカイン融合タンパク質が、酵母膜から溶出され得ることを示す図面である。（Ａ）酵母膜上にディスプレイされ、１ｍＭ ＤＴＴを使用して溶出されるケモカイン融合タンパク質の概略図。（Ｂ）４つの異なるバリアント及び対照としての抗原結合キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱの１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの溶出画分。一次マウス抗ｃＭＹＣ抗体及びヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用した同じゲルのウェスタンブロット分析。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱについての約５０ｋＤａの分子質量を、分子質量マーカー（矢印）によって確認した。
【図16】図１６は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００から分泌される４つの異なる組換えケモカイン融合タンパク質バリアントの発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を示す図面である。Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃＨｏｐＱモデル１～４（配列番号１２～１５）を、酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列に融合されたＳ．セレビシアエＥＢＹ１００において発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。（Ａ）５００ｍＭのイミダゾールで溶出させ、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードしたＩＭＡＣ精製融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ。（Ｂ）一次マウス抗Ｈｉｓ抗体及びヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用した同じゲルのウェスタンブロット分析。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱについての約５０ｋＤａの分子質量を、分子質量マーカー（左線：Ｍ）によって確認した。
【図17】図１７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＫ６の周辺質中の４つの異なる組換えケモカイン融合タンパク質バリアントの発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を示す図面である。Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱモデル１～４（配列番号３～６）を大腸菌の周辺質中に発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。（Ａ）ＩＭＡＣ後に５００ｍＭのイミダゾールで溶出させ、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした、大腸菌周辺質抽出物及び精製タンパク質からの融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱの試料。（Ｂ）一次マウス抗Ｈｉｓ抗体及びヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用した同じゲルのウェスタンブロット分析。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱについての約５０ｋＤａの分子質量を、分子質量マーカー（右線：Ｍ）によって確認した。
【図18】図１８は、Ｍｋ６Ｐ４ｃ－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４融合タンパク質バリアントの、ケモカイン受容体ＣＣＲ５に対する生物学的活性を示す図面である。大腸菌の周辺質中で産生された、異なる希釈でのケモカイン融合タンパク質バリアント（Ａ）、及びＮｉ－ＮＴＡ精製後のケモカイン融合タンパク質バリアント（Ｂ）によって誘導されたＣＣＲ５へのｍｉｎｉＧｉの動員を、ＮａｎｏＬｕｃ相補性アッセイを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で観察した。ＨＥＫ２９３Ｔで産生され、１００倍希釈された組換え可溶性６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインを陽性対照として使用した。結果は、未処理試料に対する発光の増加倍率として表される。大腸菌の周辺質中で産生された異なる希釈でのケモカイン融合タンパク質バリアント（Ｃ）及びＮｉ－ＮＴＡ精製後のケモカイン融合タンパク質バリアント（Ｄ）によって誘導されたＣＣＲ５へのβ－アレスチン－１の動員を、ＮａｎｏＬｕｃ相補性アッセイを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で観察した。ＨＥＫ２９３Ｔ中で産生され、１００倍希釈された組換え可溶性６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインを陽性対照として使用した。結果は、未処理試料に対する発光の増加倍率として表される。
【図19】図１９は、ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントから構築された５０ｋＤのＣＸＣＬ１２融合タンパク質のモデルを示す図面である。（Ａ）ＣＸＣＬ１２（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、ＣＸＣＬ１２（上、配列番号２２）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたＣＸＣＬ１２ケモカイン融合タンパク質のアミノ酸配列（ＭｋＣＸＣＬ１２
ｃ７ＨｏｐＱ、配列番号２３）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、通常の字体である。Ｃ末端タグは６×Ｈｉｓを含み、ＥＰＥＡは、点線で下線を付されている。
【図20】図２０は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたｃ１ＹｇｊＫバリアントから構築された９４ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質であるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１のモデルを示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼをコードする循環置換されたバリアント１遺伝子（下、ＰＤＢ ３Ｗ ７Ｓ、配列番号３６、ｃ１ＹｇｊＫ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１、配列番号３８）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。２アミノ酸ペプチドリンカーは、下線を付されている。ｃ１ＹｇｊＫに由来する配列は、その間にある。
【図21】図２１は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたｃ１ＹｇｊＫバリアントから構築された９４ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質であるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ２のモデルを示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼをコードする循環置換されたバリアント１遺伝子（下、ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ、配列番号３６、ｃ１ＹｇｊＫ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ２、配列番号３９）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。１アミノ酸ペプチドリンカーは、下線を付されている。ｃ１ＹｇｊＫに由来する配列は、その間にある。
【図22】図２２は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたｃ１ＹｇｊＫバリアントから構築された９４ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質であるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ３のモデルを示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼをコードする循環置換されたバリアント１遺伝子（下、ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ、配列番号３６、ｃ１ＹｇｊＫ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ３、配列番号４０）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ｃ１ＹｇｊＫに由来する配列は、その間にある。
【図23】図２３は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたｃ２ＹｇｊＫバリアントから構築された９４ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質であるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１のモデルを示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼをコードする循環置換されたバリアントＢ遺伝子（下、ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ、配列番号３７、ｃ２ＹｇｊＫ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１、配列番号４１）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。２アミノ酸ペプチドリンカーは、下線を付されている。ｃ２ＹｇｊＫに由来する配列は、その間にある。
【図24】図２４は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたｃ２ＹｇｊＫバリアントから構築された９４ｋＤの６Ｐ４－ＣＣＬ５融合タンパク質であるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ３のモデルを示す図面である。（Ａ）ケモカイン６Ｐ４－ＣＣＬ５（上）と、大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼの循環置換されたバリアント（下）との、ケモカインを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌のＹｇｊＫグリコシダーゼをコードする循環置換されたバリアント２遺伝子（下、ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ、配列番号３７、ｃ２ＹｇｊＫ）が、６Ｐ４－ＣＣＬ５（上、ＰＤＢ ５ＵＩＷ、配列番号１）のβストランドβ２とβストランドβ３とを接続するβターン（βターンβ２－β３）に挿入された。（Ｃ）得られたケモカインキメラタンパク質のアミノ酸配列（Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ３、配列番号４２）。ケモカインに由来する配列は、太字で示されている。ｃ２ＹｇｊＫに由来する配列は、その間にある。
【図25-1】図２５は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の異なるリンカー及びトポロジーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、二次元フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で等しく直交染色した。
【図25-2】図２５は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の異なるリンカー及びトポロジーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、二次元フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で等しく直交染色した。
【図25-3】図２５は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の異なるリンカー及びトポロジーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、二次元フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で等しく直交染色した。
【図25-4】図２５は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上の異なるリンカー及びトポロジーを有する４つの異なるケモカイン融合タンパク質のディスプレイの、二次元フローサイトメトリーによる定性分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたケモカイン融合タンパク質Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。形質転換酵母細胞及び非形質転換酵母細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で等しく直交染色した。
【図26-1】図２６は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ融合タンパク質バリアントの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＣｏＡ－５４７蛍光（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合を示す。
【図26-2】図２６は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ融合タンパク質バリアントの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＣｏＡ－５４７蛍光（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合を示す。
【図26-3】図２６は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ融合タンパク質バリアントの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＣｏＡ－５４７蛍光（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合を示す。
【図26-4】図２６は、ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上にディスプレイされたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ融合タンパク質バリアントの機能性のフローサイトメトリー分析を示す図面である。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３（それぞれ、Ａ～Ｃ、配列番号４３～４５）並びにＡｇａ２ｐ及びＡＣＰに融合されたＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３（それぞれ、Ｄ～Ｅ、配列番号４６～４７）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換された個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット表示。ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０）をディスプレイする酵母細胞を、陽性対照（Ｆ、配列番号１１）として使用した。ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ（Ｇ、配列番号１１）及び非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（Ｈ）をディスプレイする酵母細胞を、この実験の陰性対照として含めた。酵母クローンを誘導し、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してＣｏＡ－５４７（２μＭ）で直交染色し、８０ｎｇ／ｍＬの濃度でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体と共にインキュベートした。ｙ軸は、相対ＣｏＡ－５４７蛍光（Ｍｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル）を示す。ｘ軸は、相対Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒト蛍光ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体結合を示す。
【図27】図２７は、ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターンに挿入された、足場タンパク質の循環置換されたバリアントから構築されたインターロイキン融合タンパク質の操作原理を示す図面である。このスキームは、インターロイキンが、ケモカインドメインを足場に接続する２つのペプチド結合又は２つのショートリンカーを介して、いかにして大型足場タンパク質にグラフトされ得るかを示す。はさみは、どの露出したターンが、インターロイキン及び足場において切断されなければならないかを示す。破線は、インターロイキン及び足場の残りの部分が、インターロイキンキメラタンパク質を構築するために、ペプチド結合及びショートペプチドリンカーの使用によって、どのように連結されなければならないかを示す。
【図28】図２８は、ＩＬ－１ＲＩＩ及びＩＬ－１ＲＡｃＰのエクトドメインに結合しているＩＬ－１βの結晶構造を示す図面である。ＩＬ－１β・ＩＬ－１ＲＩ・ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体は、縦軸を中心に９０°回転している２つの図で提示される。ＩＬ－１ＲＩＩ及びＩＬ－１ＲＡｃＰは表面として示され、ＩＬ－１βはリボン構造として示されている。Βシートβ６及びΒシートβ７を接続するβターンは、矢印で強調表示されている。
【図29】図２９は、ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたＨｏｐＱバリアントから構築された５８ｋＤのＩＬ－１β融合タンパク質であるＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ１のモデルを示す図面である。（Ａ）ヒトＩＬ－１βインターロイキン（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、インターロイキンを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、ＩＬ－１βインターロイキン（上、ＰＤＢ ３Ｏ４Ｏ、配列番号４８）のβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターン（βターンβ６－β７）に挿入された。（Ｃ）得られたインターロイキンキメラタンパク質のアミノ酸配列（ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ１、配列番号４９）。インターロイキンに由来する配列は、太字で示されている。２アミノ酸ペプチドリンカーは、下線を付されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。
【図30】図３０は、ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたＨｏｐＱバリアントから構築された５８ｋＤのＩＬ－１β融合タンパク質であるＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ２のモデルを示す図面である。（Ａ）ヒトＩＬ－１βインターロイキン（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、インターロイキンを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、ＩＬ－１βインターロイキン（上、ＰＤＢ ３Ｏ４Ｏ、配列番号４８）のβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターン（βターンβ６－β７）に挿入された。（Ｃ）得られたインターロイキンキメラタンパク質のアミノ酸配列（ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ２、配列番号５０）。インターロイキンに由来する配列は、太字で示されている。１アミノ酸ペプチドリンカーは、下線を付されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。
【図31】図３１は、ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターンに挿入された、循環置換されたＨｏｐＱバリアントから構築された５８ｋＤのＩＬ－１β融合タンパク質であるＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ３のモデルを示す図面である。（Ａ）ヒトＩＬ－１βインターロイキン（上）と、Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインの循環置換されたバリアント（下）との、インターロイキンを足場に接続する２つのペプチド結合又はリンカーを介した融合によって作製されるケモカイン融合タンパク質のモデル。（Ｂ）Ｈ．ピロリのＨｏｐＱの接着ドメインをコードする循環置換された遺伝子（下、ＰＤＢ ５ＬＰ２、配列番号２、ｃ７ＨｏｐＱ）が、ＩＬ－１βインターロイキン（上、ＰＤＢ ３Ｏ４Ｏ、配列番号４８）のβストランドβ６とβストランドβ７とを接続するβターン（βターンβ６－β７）に挿入された。（Ｃ）得られたインターロイキンキメラタンパク質のアミノ酸配列（ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ３、配列番号５１）。インターロイキンに由来する配列は、太字で示されている。ＨｏｐＱに由来する配列は、その間にある。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明を、特定の実施形態に関して及び特定の図面を参照して説明するが、本発明は、これらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。特許請求の範囲におけるいかなる引用符号も、この範囲を制限すると解釈してはならない。当然、必ずしも全ての態様又は利点が本発明の任意の特定の実施形態に従って達成され得るとは限らないことが理解される。このため、例えば当業者は、本発明が、本明細書に教示若しくは提案され得る他の態様又は利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示される１つの利点若しくは利点の群を達成若しくは最適化するように具体化又は実施され得ることを認識する。
【0025】
本発明は、構成及び操作方法の両方に関して、この特色及び利点と共に添付の図面と共に読むと、以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。本発明の態様及び利点は、以下に記載される実施形態を参照することから明らかであり、明確となる。本明細書を通して「一実施形態」又は「実施形態」との言及は、実施形態に関連して記載される特定の特色、構造、又は特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書を通して様々な場所での「一実施形態では」又は「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照しているわけではないが、同じ実施形態を参照していてもよい。同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本発明の様々な特色が時に、本開示を合理化する目的で、及び１つ以上の様々な本発明の態様の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図面、又はこの説明にまとめられることも認識すべきである。しかし、本開示の方法は、特許請求される本発明が各々の特許請求の範囲において明白に列挙されている特色より多くの特色を必要とするという意図の反映であると解釈してはならない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前述の開示の実施形態の全ての特色より少ない中にある。
【0026】
定義
単数形の名詞を指す場合に、不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの」、「１つの（ａｎ）」、「この」を使用する場合、これは別のものが具体的に述べられていない限りこの名詞の複数を含む。用語「含む」が本明細書の説明及び特許請求の範囲に使用されている場合、これは他の要素又はステップを除外しない。さらに、説明及び特許請求の範囲における第１、第２、第３等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的に又は時系列で記載するためではない。このように使用される用語は、適切な条件下で互換的であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は説明される以外の他の順序での操作が可能であると理解すべきである。以下の用語又は定義は、本発明の理解を単に助けるために提供される。本明細書において特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者に対する意味と同じ意味を有する。医師は、当技術分野の定義及び用語に関して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を特に参照されたい。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるより狭い範囲を有すると解釈すべきではない。
単数形の名詞を指す場合に、不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの」、「１つの（ａｎ）」、「この」を使用する場合、これは別のものが具体的に述べられていない限りこの名詞の複数を含む。用語「含む」が本明細書の説明及び特許請求の範囲に使用されている場合、これは他の要素又はステップを除外しない。さらに、説明及び特許請求の範囲における第１、第２、第３等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的に又は時系列で記載するためではない。このように使用される用語は、適切な条件下で互換的であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は説明される以外の他の順序での操作が可能であると理解すべきである。以下の用語又は定義は、本発明の理解を単に助けるために提供される。本明細書において特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者に対する意味と同じ意味を有する。医師は、当技術分野の定義及び用語に関して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を特に参照されたい。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるより狭い範囲を有すると解釈すべきではない。
【0027】
本明細書で使用される「約」は、量、期間等などの測定可能な値を指す場合に使用される場合、明記された値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、及びなおさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、このような変動は本開示の方法を実施するために適切である。本明細書で使用される場合の「類似の」は、似ている、同様の、同等の、対応する等と互換的であり、同じ又は共通の特徴を有することを意味し、及び／又は定量可能な様式で同等の結果を、すなわち最大で２０％、１０％、より好ましくは５％、又はさらにより好ましくは１％若しくはこれ未満の変動で示すことを意味する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。このように、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びにＲＮＡを含む。この用語はまた、公知のタイプの修飾、例えばメチル化、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上とアナログとの「キャップ」置換も含む。「核酸構築物」とは、天然で共に見出されない１つ以上の機能的単位を含むように構築されている核酸配列を意味する。例としては、環状、線状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージからのＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノム等が挙げられる。
【0029】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれるとｍＲＮＡに転写される、及び／又はポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡを含み得るがこれらに限定されず、またある特定の状況下ではイントロンが同様に存在していてもよい。
【0030】
本明細書で使用される場合、「遺伝子のプロモーター領域」は、コード配列に作動可能に連結され、適切な誘導条件下におそらく置かれた場合に、前記コード配列の転写を促進するために十分である機能的なＤＮＡ配列単位を指す。「作動可能に連結された」とは、このように記載された構成要素がこれらの意図される様式でこれらが機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」プロモーター配列は、コード配列の発現が、プロモーター配列と適合性の条件下で達成されるようにライゲーションされている。「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、遺伝子のプロモーター領域並びにコード配列の両方を含む。これは、ゲノム配列（可能性があるイントロンを含む）並びにプロモーター配列に作動可能に連結されたスプライシングされたメッセンジャーに由来するｃＤＮＡの両方を指す。用語「ターミネーター」又は「転写終止シグナル」は、一次転写物の３’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写の終止をシグナル伝達する転写単位の末端のＤＮＡ配列である制御配列を包含する。ターミネーターは、天然の遺伝子、多様な他の植物遺伝子、又はＴ－ＤＮＡに由来し得る。付加されるターミネーターは、例えば、ノパリンシンターゼ若しくはオクトピンシンターゼ遺伝子に由来し得る、又はあるいは別の植物遺伝子、又は次いで好ましくは任意の他の真核細胞遺伝子に由来し得る。
【0031】
「遺伝子構築物」、「キメラ遺伝子」、「キメラ構築物」、又は「キメラ遺伝子構築物」は、プロモーター又は調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結され、又は会合し、それによって調節核酸配列が、会合する核酸コード配列の転写又は発現を調節することができる組換え核酸配列を意味する。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出される会合する核酸配列に作動可能に連結されていない。特に、用語「遺伝子融合構築物」は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示される本発明の融合タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡをコードする遺伝子構築物を指す。
【0032】
用語「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」又は「遺伝子移入ベクター」は、本明細書で使用される場合、これが連結されている別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指すと意図され、プラスドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージ、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、若しくはバキュロウイルスベクター、又は人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）を含むがこれらに限定されない任意の適したタイプを含む当業者に公知の任意のベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド並びにウイルスベクターを含み、一般的に所望のコード配列、及び特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な適切なＤＮＡ配列を含有する。発現ベクターは、これらが導入されている宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、宿主細胞において機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、これによって宿主ゲノムと共に複製する。適したベクターは、望ましければ及び特定の宿主生物（例えば、細菌細胞、酵母細胞）に従って、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター配列等を有する。クローニングベクターは一般的に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現にとって必要な機能的配列を欠如し得る。原核細胞にトランスフェクトするために使用される発現ベクターの構築もまた当技術分野で周知であり、このように標準的な技術を介して達成することができる（例えば、当技術分野の定義及び用語に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を参照されたい。
【0033】
「宿主細胞」は、原核細胞又は真核細胞のいずれかであり得る。細胞は、一過性又は安定にトランスフェクトされ得る。発現ベクターの原核細胞及び真核細胞へのこのようなトランスフェクションは、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、又はリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、又はウイルス媒介トランスフェクションを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の技術を介して達成することができる。全ての標準的な技術に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を参照されたい。本発明の文脈における組換え宿主細胞は、本発明の単離されたＤＮＡ分子、核酸分子、又は発現構築物又はベクターを含有するように遺伝子改変されている細胞である。ＤＮＡは、形質転換、リポフェクション、電気穿孔、又はウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されない特定のタイプの細胞にとって適切である当技術分野で公知の任意の手段によって導入することができる。本発明のキメラタンパク質の発現を可能にすることが可能なＤＮＡ構築物は、クローニング、ハイブリダイゼーションスクリーニング、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当技術分野で公知の技術によって容易に調製することができる。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための標準的な技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を伴う酵素反応のための標準的な技術、並びに様々な分子技術は、当業者に公知であり、一般的に使用される技術である。複数の標準的な技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｗｕ （ｅｄ．） （１９９３）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に記載されている。本発明と共に使用され得る代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明と共に使用するために適した細菌宿主細胞としては、エシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）の細胞、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）の細胞、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）の細胞、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐｐ．）の細胞、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）の細胞、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．）の細胞、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）の細胞、及びサルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の細胞が挙げられる。本発明と共に使用するために適した動物宿主細胞としては、昆虫細胞及び哺乳動物細胞（最も特にチャイニーズハムスターに由来する細胞（例えば、ＣＨＯ）、及びヒト細胞系、例えばＨｅＬａが挙げられる。本発明と共に使用するために適した酵母宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピチア・パストオリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ヤロウィア（Ｙａｒｏｗｉａ）、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等内の属種が挙げられる。サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）は、最も一般的に使用される酵母宿主であり、簡便な真菌宿主である。宿主細胞は、浮遊液又はフラスコ培養物、組織培養物、器官培養物等として提供され得る。あるいは、宿主細胞はまた、トランスジェニック動物でもあり得る。
【0034】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」は、本明細書においてさらに互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマー並びにこれらのバリアント及び合成アナログを指す。このように、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば対応する天然に存在するアミノ酸の化学アナログ、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーであるアミノ酸ポリマーに当てはまる。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、及びアセチル化も含む。アミノ酸配列及び修飾に基づいて、ポリペプチドの原子又は分子量又は重量は、（キロ）ダルトン（ｋＤａ）で表記される。「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を使用して、すなわち組換え又は合成ポリヌクレオチドの発現を通して作製されたポリペプチドを意味する。キメラポリペプチド又はこの生物活性部分が組換えによって産生される場合、これはまた、好ましくは培養培地を実質的に含まず、すなわちタンパク質調製物の体積の培養培地は約２０％未満を表し、より好ましくは約１０％未満を表し、最も好ましくは約５％未満を表す。「単離された」とは、これが天然の状態で通常伴う構成要素を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたポリペプチド」は、天然に存在する状態でこれに隣接する分子から精製されているポリペプチド、例えば前記ポリペプチドに隣接する産生宿主に存在する分子から除去されている本明細書に開示される融合タンパク質を指す。単離されたキメラは、アミノ酸の化学合成によって生成することができ、又は組換え体の産生によって生成することができる。「異種タンパク質」という表現は、タンパク質が、タンパク質をディスプレイ又は発現するために使用される同じ属種又は系統に由来しないことを意味し得る。
【0035】
タンパク質の「ホモログ」、「複数のホモログ」は、当該の非改変タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有し、これらが由来する非改変タンパク質と類似の生物学的及び機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及び酵素を包含する。本明細書で使用される場合の用語「アミノ酸同一性」は、比較ウィンドウにわたってアミノ酸毎に基づいて配列が同一である程度を指す。このように、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較するステップ、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ、同様に本明細書において１文字表記で示される残基）が両方の配列に存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を生じるステップ、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で除算するステップ、及び結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得るステップによって計算される。本明細書で使用される「置換」又は「突然変異」は、親タンパク質又はこの断片のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較してそれぞれ、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドが異なるアミノ酸又はヌクレオチドと交換されていることに起因する。タンパク質又はこの断片は、タンパク質の活性に実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有し得ると理解される。
【0036】
用語「野生型」は、天然に存在する起源から単離されている遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、このように遺伝子の任意に設計された「正常」又は「野生型」の形態である。これに対し、用語「改変された」、「突然変異体」、又は「バリアント」は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列において改変、翻訳後修飾、及び／又は機能的特性（すなわち変更された特徴）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体を単離することができることに注目されたい。これらは、これらが野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較して変更された特徴を有するという事実によって同定される。あるいは、バリアントはまた、合成分子を含み得、例えばケモカインリガンドバリアントは、構造及び／又は機能が天然のケモカインと類似であり得るが、低分子、又は人の手で作られた合成ペプチド若しくはタンパク質に関係し得る。異なる機能的特性を有する前記バリアントは、当業者に公知であるように、他の機能の差の中でもスーパーアゴニスト、スーパーアンタゴニストに関係し得る。
【0037】
「タンパク質ドメイン」は、タンパク質における別個の機能的及び／又は構造的単位である。通常、タンパク質ドメインは、特定の機能又は相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に寄与する。ドメインは、類似のドメインが異なる機能を有するタンパク質において見出され得る、多様な生物学的状況で存在し得る。タンパク質の二次構造エレメント（ＳＳＥ）は典型的には、タンパク質がその三次元三次構造へとフォールディングされる前の中間体として自然発生的に形成する。タンパク質の２つの最も一般的な二次構造エレメントは、アルファヘリックス及びベータ（β）シートであるが、βターン及びオメガループも同様に存在する。ベータバレルは、ねじれ及びコイルを形成して第一鎖が最後の鎖に結合される（水素結合）閉鎖したトロイダル構造を形成するタンデムリピートで構成されるベータ－シートである。多くのベータ－バレル中のベータストランドは、逆平行に配置される。ベータシートは、少なくとも２つ又は３つの骨格水素結合によって側面が結合されているベータシート（βストランドとも呼ばれる）からなり、一般的にねじれたひだ状のシートを形成する。βストランドは、拡大された立体構造の骨格を有する典型的に３～１０アミノ酸長の一連のポリペプチド鎖である。βターンは、ポリペプチド鎖の方向の変化を引き起こす、タンパク質におけるあるタイプの非通常の二次構造である。ベータターン（βターン、βターン、βベンド、タイトターン、リバースターン、又はβループ（本明細書においてループとも呼ぶ）は、タンパク質及びポリペプチドにおいて非常に一般的なモチーフであり、主にβストランドを接続する役割を果たす。
【0038】
用語「タンパク質の循環置換」又は「循環置換されたタンパク質」は、野生型タンパク質配列と比較してそのアミノ酸配列におけるアミノ酸の順序が変化しており、この結果異なる結合力を有するが全体的に類似の三次元（３Ｄ）形状を有するタンパク質構造を有するタンパク質を指す。タンパク質の循環置換は、野生型タンパク質の第１の部分（Ｎ末端に隣接する）の配列が、例えばＢｌｉｖｅｎ ａｎｄ Ｐｒｌｉｃ（２０１２）に記載されるように、得られた循環置換されたタンパク質の第２の部分（そのＣ末端付近）の配列に関連するという意味において、円順列の数学的概念と類似である。タンパク質の循環置換は、この野生型タンパク質と比較して、タンパク質配列の遺伝子操作又は人工の操作を通して得られ、それによって野生型タンパク質のＮ末端及びＣ末端が「接続され」、タンパク質配列が別の部位で遮断され、前記タンパク質の新規Ｎ末端及びＣ末端を作製する。本発明の循環置換された足場タンパク質は、野生型タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端が接続され、前記足場タンパク質のアクセス可能な又は露出した部位（優先的にβターン又はループ）で配列が切断又は遮断された結果であり、これによって循環置換された足場タンパク質のフォールディングが保持され、又は野生型タンパク質のフォールディングと比較して類似である。前記循環置換された足場タンパク質におけるＮ末端及びＣ末端の前記接続は、ペプチド結合連結の結果、又はペプチドリンカーの導入の結果、又は野生型タンパク質の後にペプチド結合又は残りのアミノ酸が続く場合には元のＮ末端及びＣ末端付近の一連のペプチドが欠失した結果であり得る。
【0039】
用語「融合された」は、本明細書で使用される場合、及び「接続された」、「コンジュゲートされた」、「ライゲーションされた」と互換的に使用される場合、特に例えば組換えＤＮＡ技術による「遺伝子融合」、並びに安定な共有結合をもたらす「化学的及び／又は酵素的コンジュゲーション」を指す。
【0040】
用語「キメラポリペプチド」、「キメラタンパク質」、「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、又は「天然に存在しないタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、同じタンパク質に由来してもしなくてもよい少なくとも２つの個別の及び別個のポリペプチド構成要素を含むタンパク質を指す。用語はまた、これが人の手で作られたことを意味する天然に存在しない分子も指す。用語「融合された」及び他の文法学的同等物、例えば「共有結合された」、「接続された」、「結合された」、「ライゲーションされた」、「コンジュゲートされた」は、キメラポリペプチド（本明細書において定義される）に言及する場合、２つ以上のポリペプチド構成要素を連結するための任意の化学的又は組換え機構を指す。２つ以上のポリペプチド構成要素の融合は、配列の直接融合であり得、又は例えば介在するアミノ酸配列若しくはリンカー配列、若しくは化学的リンカーによる間接的融合であり得る。２つのポリペプチドの融合、又はサイトカイン、例えばケモカインと、本明細書に記載される足場タンパク質との融合はまた、化学的連結によって得られた非共有結合融合も指し得る。例えば、ケモカインコアドメインのβ２βストランドのＣ末端及びβ３β鎖のＮ末端の両方を、その露出した又はアクセス可能な部位で一部又は全長の（循環置換された）足場タンパク質に連結又は融合された相補的化学単位又は結合ポケットに結合することが可能である化学単位に連結することができる。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質複合体」又は「複合体」は、これによって高分子の少なくとも１つがタンパク質である２つ以上の関連する高分子の群を指す。タンパク質複合体は、本明細書で使用される場合、典型的に生理的条件下で形成され得る高分子の会合を指す。タンパク質複合体の個々のメンバーは非共有結合相互作用によって連結される。タンパク質複合体は、タンパク質のみの非共有結合相互作用であり得、これによりタンパク質－タンパク質複合体；例えば、２つのタンパク質、３つのタンパク質、４つのタンパク質等の非共有結合相互作用と呼ばれ得る。より具体的には、融合タンパク質とサイトカイン受容体の複合体、又はサイトカイン若しくはケモカインを含むリガンドタンパク質（例えば、融合タンパク質）と、その特異的に結合した相互作用剤、例えばサイトカイン若しくはケモカインリガンドに結合することが可能なサイトカイン若しくはケモカイン受容体との複合体であり得る。このケモカイン受容体相互作用領域（そのＮ末端）によって、前記ケモカインリガンド、ケモカイン受容体に結合することが公知であるケモカイン受容体に結合したケモカインに基づく融合タンパク質のタンパク質複合体は、本明細書で使用される形成された複合体である。あるいは、そのＩＬ－１受容体によって結合されたインターロイキン－１型のリガンドに基づく融合タンパク質のタンパク質複合体は、本明細書で使用される複合体であり得る。例えば、これはサイトカインリガンド受容体と、融合タンパク質の一部であるサイトカイン相互作用部位との間の構造及び相互作用を解明することが目的である３Ｄ構造解析において使用される。より具体的には、ケモカイン及びケモカイン受容体の相互作用又は結合部位は、それらの中で構造解析される。融合タンパク質の完全な構造が決定されるか否かはあまり関係がない。タンパク質複合体は多量体であり得ると理解される。タンパク質複合体アセンブリは、ホモ多量体又はヘテロ多量体複合体の形成をもたらし得る。その上、相互作用は安定又は一過性であり得る。用語「多量体」、「多量体複合体」、又は「多量体タンパク質」は、複数の同一の又は異種ポリペプチド単量体を含む。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」は、互換的に使用され、定量的及び定性的決定の両方を含む。
【0043】
用語「適した条件」は、環境要因、例えば中でも温度、運動、他の構成要素、及び／又は「緩衝条件」を指し、「緩衝条件」は、具体的にはアッセイが実施される溶液の組成を指す。前記組成物は、当業者が最適なアッセイ成績を得るために適格性を承知している緩衝溶液及び／又は溶質、例えばｐＨ緩衝物質、水、食塩水、生理的塩溶液、グリセロール、保存剤等を含む。
【0044】
「結合する」は、直接的又は間接的である任意の相互作用を意味する。直接の相互作用は、結合パートナー間の接触を意味する。間接的相互作用は、相互作用パートナーが２つより多くの分子の複合体において相互作用する任意の相互作用を意味する。相互作用は、１つ以上の架橋分子の助けを借りて完全に間接的であり得る、又は１つ以上の分子の追加の相互作用によって安定化されるパートナー間の直接接触がなおも存在する部分的に間接的であり得る。一般的に、結合ドメインは、免疫グロブリンに基づく若しくは免疫グロブリン様であり得る、又は微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、一本鎖逆平行コイルドコイルタンパク質、若しくはリピートモチーフタンパク質を含むがこれらに限定されないタンパク質に存在するドメインに基づくことができる。結合はまた、ケモカイン及びケモカイン受容体相互作用に関して、リガンドとこの受容体の相互作用を含む。用語「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、特異的標的を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しない又は結合しない結合ドメインを意味する。ケモカインの場合、これは、ケモカイン受容体に特異的に結合するためのリガンドであることが公知であり、このためこの受容体に対する結合は特異的である。しかし、多くの場合、１つのサブファミリーのケモカインは、同じファミリーの受容体に結合することができ、このため特異的結合は、別のケモカイン受容体との結合を除外しない。したがって、特異的結合は、排他的結合を意味しない。しかし、特異的結合は、このようなリガンド又は逆のこのような受容体が、１つ又は少数のケモカイン受容体又は逆のリガンドに対してある特定の親和性又は優先性の増加を有することを意味する。用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、一般的に標的タンパク質とリガンドの平衡をこれらの結合によって形成される複合体の存在へとシフトさせるように、リガンド（本明細書においてさらに定義される）が標的タンパク質に結合する程度を指す。このように、例えば受容体及びリガンドを相対的に等しい濃度で組み合わせる場合、得られた複合体の高濃度に向かって平衡をシフトさせるように、高親和性のリガンドが受容体に結合する。
【0045】
アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えばＸ線結晶構造解析及び多次元核磁気共鳴を含む。タンパク質の「立体構造」、又は「立体構造状態」という用語は、一般的にタンパク質が任意の瞬間的時間でとり得る構造の範囲を指す。当業者は、立体構造又は立体構造状態の決定因子が、タンパク質のアミノ酸配列（改変アミノ酸を含む）及びタンパク質周囲の環境において反映されるタンパク質の一次構造を含むことを認識する。タンパク質の立体構造又は立体構造状態はまた、タンパク質の二次構造（例えば、中でもαヘリックス、βシート、βバレル）、三次構造（例えば、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）、及び四次構造（例えば、ポリペプチド鎖と他のタンパク質サブユニットとの相互作用）などの構造特徴にも関する。ポリペプチド鎖に対する翻訳後及び他の改変、例えば中でもリガンド結合、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、又は疎水性基の結合は、タンパク質の立体構造に影響を及ぼし得る。さらに、環境的要因、例えば中でも周囲の溶液のｐＨ、塩濃度、イオン強度、及び浸透圧、並びに中でも他のタンパク質及び補因子との相互作用は、タンパク質の立体構造に影響を及ぼし得る。タンパク質の立体構造状態は、活性若しくは別の分子に対する結合に関する機能的アッセイ、又は物理的方法、例えば他の方法の中でもＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ、若しくはスピンラベリングによって決定され得る。タンパク質の立体構造及び立体構造状態に関する全般的考察に関しては、Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ Ｉ： Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０，ａｎｄ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３を参照されたい。
【0046】
最後に、本発明の文脈における用語「機能的融合タンパク質」又は「立体構造選択的融合タンパク質」は、任意選択的に立体構造選択的にそのサイトカイン、又は特にインターロイキン若しくはケモカイン受容体タンパク質に対する結合において機能的である、及び／又はこの受容体の活性化／不活化において機能的である（リガンド：アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストの公知の特色に応じて）融合タンパク質を指す。標的タンパク質の特定の立体構造に選択的に結合する結合ドメインは、標的がとり得る他の立体構造よりも立体構造のサブセットの中で標的に対してより高い親和性で結合する結合ドメインを指す。当業者は、標的の特定の立体構造に選択的に結合する結合ドメインが、この特定の立体構造における標的を安定化させる又は保持することを認識する。例えば、活性状態立体構造に選択的な結合ドメインは、活性な立体構造状態の標的に優先的に結合し、不活性な立体構造状態の標的には結合しない又はより低い程度に結合し、このように、前記活性な立体構造状態に関してより高い親和性を有する、又はこの逆である。用語「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「優先的に結合する」、及びこれらの文法学的等価物は、本明細書において互換的に使用される。用語「立体構造特異的」又は「立体構造選択的」もまた、本明細書において互換的に使用される。
【0047】
詳細な説明
剛性をもたせて融合したサイトカイン含有機能的融合タンパク質の設計に関する新規概念を本明細書に提示する。新規融合タンパク質は、サイトカインと足場タンパク質との間の融合の生成を起源とし、足場タンパク質は、前記サイトカインがその典型的なフォールドのままであり、非融合サイトカインリガンドと比較して類似の様式でそのコグネート受容体に特異的に結合するように機能するように、サイトカインのトポロジーを遮断するフォールディングされたタンパク質である。新規融合タンパク質は、本明細書において、保存された二次βストランドに基づくコアドメイン又はモチーフを有するサイトカイン、例えばケモカインサイトカイン又はインターロイキン（ＩＬ－１）ファミリーを起源とする融合として実証される。本明細書において互換的に使用される前記「βストランドコアドメイン含有」又は「βストランド含有ドメイン」サイトカインの遮断、足場タンパク質の挿入によるそれらのアミノ酸配列は、サイトカインタンパク質のトポロジーの変更をもたらすが、これは意外にも、その典型的なフォールドのままであり、非融合サイトカインリガンドと比較して類似の様式でその受容体に特異的に結合するように機能する。典型的にそれらの天然の状態では結合されていないポリペプチド構成要素の古典的な接合は、それらのそれぞれのアミノ（Ｎ－）及びカルボキシ（Ｃ－）末端を直接又はペプチド結合を通して結合させ、単一の連続したポリペプチドを形成することによって実施される。これらの融合はしばしば、可撓性リンカーを介して作製される、又は少なくとも可撓性な様式で接続され、このことは、融合パートナーが互いに対して安定な位置又は立体構造にないことを意味する。図１Ａに示されるように、Ｎ末端及びＣ末端を介してタンパク質を連結することにより、単純な線形の連結、融合は容易であるが、不安定で分解を受けやすく、したがって一部の例では非機能的リガンドタンパク質をもたらす。他方で、２つ以上のタンパク質の一次トポロジーにおいて１つ以上の融合点又は接続を有する本明細書に提示される剛性キメラ／融合タンパク質は、少なくとも１つの非可撓性融合点を保有する（図１Ｂ）。本発明は、固有に、その融合パートナーである足場タンパク質に対するサイトカインタンパク質の回転又は屈曲がいくつかの融合の作製を介して禁止される、サイトカインリガンドタンパク質を含む。同じキメラ内のいくつかの融合の存在を通して、本発明の新規キメラの剛性の改善が得られ、これは、そのサイトカインドメインのフォールディング並びにその受容体に結合する機能を保持することができる融合を可能にするように融合部位を完全に設計した結果である。タンパク質の剛性は実際に、タンパク質、この場合は新規キメラの（三次）構造に固有である。剛性の増加は、公知のタンパク質フォールドのトポロジーを変更することによって得られることが示されている（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって本発明の融合タンパク質において作製された融合の剛性は、融合したサイトカインリガンドが特異的に結合するサイトカイン受容体を「方向付ける」又は「固定する」ために十分に強い剛性を提供するが、たいていの場合、剛性は標的又は抗原そのものの剛性よりはなおも低い。しかし、本発明の剛性融合タンパク質がなおもその受容体結合及び活性化機能性を維持しているという事実は、一次トポロジーの遮断がドメイン又はタンパク質フォールディングの変化をもたらし、三次トポロジー及び受容体結合又は活性化に影響を及ぼし得ることから、意外な知見である。当業者は、このような融合を設計するために構造情報を使用することができるが、細胞に外部から導入された新規核酸構築物から翻訳された融合タンパク質の実際のフォールディングは、なおも予測不能である。本明細書において、一次トポロジーのこの遮断は、受容体結合又は活性化に影響を及ぼさないことが実証されており、このことは、サイトカイン受容体の構造生物学及び新薬発見を伴う分野、本明細書において具体的に示されるケモカイン及びＩＬ受容体の分野において新しい道を切り開く。本発明は、タンパク質の非共有結合を可能にするために、一意的な次世代融合技術を提供すること、並びに高い親和性及び／又は立体構造選択的なケモカイン／ＩＬ受容体結合能を提供することの新規組合せに関する。この新規タイプの融合タンパク質は、サイトカインファミリーのタイプ、例えばケモカイン若しくはケモカインバリアント、及びＩＬ若しくはＩＬ－１受容体型インターロイキン、又は融合タンパク質を生成するために使用される足場タンパク質のタイプに応じて、いくつかの貴重な応用において役立つ。利点は多数あり、構造生物学において使用が容易であり、ＧＰＣＲなどの７回膜貫通タンパク質などの扱いにくいタンパク質に関するクライオ－ＥＭ及びＸ線結晶構造解析を容易にする。剛性シャペロンツールが今では利用可能であり、改善されたより堅固な治療及び診断分子を、例えば新規化合物の構造に基づくドラッグデザイン及び構造に基づくスクリーニングなどによって開発するためにこれらのツールを使用することも完全にインプリメンテーションされていることから、この次世代融合技術を使用することによって、ＧＰＣＲ及びＩＬ受容体複合体の構造生物学における大きい前進を予見することができる。実際に、サイトカイン受容体の立体構造選択的認識に使用する場合、これらのツールは機能的立体構造、例えば活性な立体構造の、より具体的には、アゴニスト、部分アゴニスト、又はバイアスアゴニスト立体構造の受容体を安定化する結合様式で同様に応用可能である。サイトカインリガンド又はリガンドバリアントに応じて、本発明の融合タンパク質のさらなる応用は、経路選択的アゴニストのスクリーニングを可能にするためにドラッガブルなシグナル伝達性の立体構造を特異的に安定化することが記載される特定のサイトカイン（ケモカイン又はＩＬ）リガンドに基づいて見出される。生物工学におけるこのような技術の急速な進歩により、本発明は、新規タンパク質治療薬の作製及び現在のタンパク質薬物の性能の改善に影響を及ぼすことが予見可能である。
剛性をもたせて融合したサイトカイン含有機能的融合タンパク質の設計に関する新規概念を本明細書に提示する。新規融合タンパク質は、サイトカインと足場タンパク質との間の融合の生成を起源とし、足場タンパク質は、前記サイトカインがその典型的なフォールドのままであり、非融合サイトカインリガンドと比較して類似の様式でそのコグネート受容体に特異的に結合するように機能するように、サイトカインのトポロジーを遮断するフォールディングされたタンパク質である。新規融合タンパク質は、本明細書において、保存された二次βストランドに基づくコアドメイン又はモチーフを有するサイトカイン、例えばケモカインサイトカイン又はインターロイキン（ＩＬ－１）ファミリーを起源とする融合として実証される。本明細書において互換的に使用される前記「βストランドコアドメイン含有」又は「βストランド含有ドメイン」サイトカインの遮断、足場タンパク質の挿入によるそれらのアミノ酸配列は、サイトカインタンパク質のトポロジーの変更をもたらすが、これは意外にも、その典型的なフォールドのままであり、非融合サイトカインリガンドと比較して類似の様式でその受容体に特異的に結合するように機能する。典型的にそれらの天然の状態では結合されていないポリペプチド構成要素の古典的な接合は、それらのそれぞれのアミノ（Ｎ－）及びカルボキシ（Ｃ－）末端を直接又はペプチド結合を通して結合させ、単一の連続したポリペプチドを形成することによって実施される。これらの融合はしばしば、可撓性リンカーを介して作製される、又は少なくとも可撓性な様式で接続され、このことは、融合パートナーが互いに対して安定な位置又は立体構造にないことを意味する。図１Ａに示されるように、Ｎ末端及びＣ末端を介してタンパク質を連結することにより、単純な線形の連結、融合は容易であるが、不安定で分解を受けやすく、したがって一部の例では非機能的リガンドタンパク質をもたらす。他方で、２つ以上のタンパク質の一次トポロジーにおいて１つ以上の融合点又は接続を有する本明細書に提示される剛性キメラ／融合タンパク質は、少なくとも１つの非可撓性融合点を保有する（図１Ｂ）。本発明は、固有に、その融合パートナーである足場タンパク質に対するサイトカインタンパク質の回転又は屈曲がいくつかの融合の作製を介して禁止される、サイトカインリガンドタンパク質を含む。同じキメラ内のいくつかの融合の存在を通して、本発明の新規キメラの剛性の改善が得られ、これは、そのサイトカインドメインのフォールディング並びにその受容体に結合する機能を保持することができる融合を可能にするように融合部位を完全に設計した結果である。タンパク質の剛性は実際に、タンパク質、この場合は新規キメラの（三次）構造に固有である。剛性の増加は、公知のタンパク質フォールドのトポロジーを変更することによって得られることが示されている（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって本発明の融合タンパク質において作製された融合の剛性は、融合したサイトカインリガンドが特異的に結合するサイトカイン受容体を「方向付ける」又は「固定する」ために十分に強い剛性を提供するが、たいていの場合、剛性は標的又は抗原そのものの剛性よりはなおも低い。しかし、本発明の剛性融合タンパク質がなおもその受容体結合及び活性化機能性を維持しているという事実は、一次トポロジーの遮断がドメイン又はタンパク質フォールディングの変化をもたらし、三次トポロジー及び受容体結合又は活性化に影響を及ぼし得ることから、意外な知見である。当業者は、このような融合を設計するために構造情報を使用することができるが、細胞に外部から導入された新規核酸構築物から翻訳された融合タンパク質の実際のフォールディングは、なおも予測不能である。本明細書において、一次トポロジーのこの遮断は、受容体結合又は活性化に影響を及ぼさないことが実証されており、このことは、サイトカイン受容体の構造生物学及び新薬発見を伴う分野、本明細書において具体的に示されるケモカイン及びＩＬ受容体の分野において新しい道を切り開く。本発明は、タンパク質の非共有結合を可能にするために、一意的な次世代融合技術を提供すること、並びに高い親和性及び／又は立体構造選択的なケモカイン／ＩＬ受容体結合能を提供することの新規組合せに関する。この新規タイプの融合タンパク質は、サイトカインファミリーのタイプ、例えばケモカイン若しくはケモカインバリアント、及びＩＬ若しくはＩＬ－１受容体型インターロイキン、又は融合タンパク質を生成するために使用される足場タンパク質のタイプに応じて、いくつかの貴重な応用において役立つ。利点は多数あり、構造生物学において使用が容易であり、ＧＰＣＲなどの７回膜貫通タンパク質などの扱いにくいタンパク質に関するクライオ－ＥＭ及びＸ線結晶構造解析を容易にする。剛性シャペロンツールが今では利用可能であり、改善されたより堅固な治療及び診断分子を、例えば新規化合物の構造に基づくドラッグデザイン及び構造に基づくスクリーニングなどによって開発するためにこれらのツールを使用することも完全にインプリメンテーションされていることから、この次世代融合技術を使用することによって、ＧＰＣＲ及びＩＬ受容体複合体の構造生物学における大きい前進を予見することができる。実際に、サイトカイン受容体の立体構造選択的認識に使用する場合、これらのツールは機能的立体構造、例えば活性な立体構造の、より具体的には、アゴニスト、部分アゴニスト、又はバイアスアゴニスト立体構造の受容体を安定化する結合様式で同様に応用可能である。サイトカインリガンド又はリガンドバリアントに応じて、本発明の融合タンパク質のさらなる応用は、経路選択的アゴニストのスクリーニングを可能にするためにドラッガブルなシグナル伝達性の立体構造を特異的に安定化することが記載される特定のサイトカイン（ケモカイン又はＩＬ）リガンドに基づいて見出される。生物工学におけるこのような技術の急速な進歩により、本発明は、新規タンパク質治療薬の作製及び現在のタンパク質薬物の性能の改善に影響を及ぼすことが予見可能である。
【0048】
第一の態様では、本発明は、足場タンパク質に融合されているサイトカインを含む機能的融合タンパク質であって、前記足場タンパク質が、これが前記サイトカイン構造フォールドにおいてアクセス可能な少なくとも１つ以上のアミノ酸部位での融合を介して前記サイトカインのトポロジーを遮断するようにサイトカインタンパク質に接続されている、機能的融合タンパク質に関する。前記融合タンパク質は、これが前記足場タンパク質に融合されていないその天然の形態又は野生型形態のサイトカインリガンドと比較して、類似の様式でその受容体結合機能性を保持するという点において「機能的」である。一実施形態では、前記融合タンパク質は立体構造選択的結合ドメインである。サイトカインは非常に多様なリガンドスーパーファミリーを含み、好ましいサイトカインスーパーファミリーは、βストランドに基づく又はβストランドを含有する保存されたコアドメイン又はモチーフを有し、これらのβストランドを相互接続するβターン又はループに存在するこれらの露出した領域でアクセス可能なアミノ酸部位を明らかにするスーパーファミリーである。新規融合は、この機能性を保持するために受容体結合を障害しないように、サイトカインの受容体結合部位から十分に遠いアクセス可能な部位を含むべきである。サイトカインが比較的小さいタンパク質であるという事実は、このような機能的融合を設計する際の複雑さを増大させ、したがって本明細書に提示されるように驚くべき解決策を提供し、当業者はこれらのβストランドに基づくサイトカインの保存されたコアドメインの露出したターンに存在するアクセス可能な部位を誘導することが可能となる。
【0049】
第一の実施形態では、本発明は、足場タンパク質に融合されたケモカインスーパーファミリーに属するサイトカインを含む融合タンパク質であって、前記足場タンパク質が、少なくとも５０アミノ酸のフォールディングされたタンパク質であり、これが前記ケモカインコアドメインのフォールドのその露出したβターンにおいてアクセス可能な少なくとも１つ以上のアミノ酸部位での融合を介して前記コアドメインのトポロジーを遮断するように、ケモカインコアドメインに接続されている、融合タンパク質に関する。前記融合タンパク質は、これが前記足場タンパク質に融合されていないその天然又は野生型のケモカインと比較して類似の様式でその受容体結合機能性を保持するという点においてさらに特徴付けられる。このため、一実施形態では、前記融合タンパク質は、立体構造選択的結合ドメインである。
【0050】
ケモカインタンパク質リガンドは、成熟タンパク質のＮ末端に対して近位のシステイン残基の特徴的なパターンに従って、Ｘが任意のアミノ酸である４つのサブファミリー、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、及びＣＸ３Ｃに分類されている。しかし、全てのケモカインの基本的な三次構造又は構築は、無秩序なＮ末端「シグナル伝達ドメイン」の後に構造化「コアドメイン」を含有し、これはＮ－ループ、３本鎖βシート、及びＣ末端ヘリックスを含有する（図２）。
【0051】
各サブファミリーにおいて、多くのケモカインは、複数の受容体に結合し、いくつかの受容体は多くのケモカインに結合する。ケモカインは、二量体を形成することが知られており、異なるサブファミリー間の異なる二量体化モチーフが、当初、受容体の特異性を定義すると仮定された。しかし、機能的アッセイにより単量体が実際に受容体に結合して活性化することが実証されたものの、グルコサミノグリカンとの結合にとって肝要であるのはむしろオリゴマー化であるように思われる。一般的に、ケモカインコアドメインは、ケモカイン受容体のＮ末端と相互作用部位又はケモカイン認識部位（ＣＲＳ１）を形成するが、ケモカインのＮ末端は、受容体の受容体－リガンド結合ポケット（ケモカイン認識部位２、ＣＲＳ２）と相互作用する。第一の相互作用はケモカインコアドメイン（ＣＲＳ１）に対してＮ末端の受容体の結合であり、これは、ケモカインＮ末端シグナル伝達ドメインを正確に配置することができ、ＣＲＳ２ ＴＭポケットとのこの相互作用を可能にする。複数の構造研究が、受容体結合及び活性化を少なくとも部分的に分離することができることを示している。しかし、インタクト受容体との立体構造特異的複合体に関するさらに高分解能の構造解析が必要である。これまでのところ、これは、膜貫通受容体の性質により、したがってほとんどの場合ＮＭＲアプローチを使用するより扱いやすい可溶性複合体の解析の限界により、極めて難しかった。
【0052】
受容体におけるスルホチロシンの構造における役割は、確立されており、これは、ケモカインのβ２－β３ヘアピン又はループにおける相同な塩基残基との塩架橋形成を可能にする。ケモカインと受容体との境界面は、コアドメインのβシートのＮループ及びβ２－β３鎖を伴うと考えられている。ＣＲＳ１結合時の構造の再構成が複合体によって異なるという事実により、認識及び活性化機構を単純化することはできないが、より良好な構造決定ツールが必要であるという点を強調する。実際に、複数の改変ケモカインがまた、疾患における特異的受容体の役割を解明するために適用されており、サイトカイン及びより詳しくはケモカインの分野におけるリガンドの薬理学は、受容体に対して高い親和性を保持するが、適応した機能的転帰、例えばアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、又はスーパーアゴニスト／アンタゴニスト特色をもたらすわずかな操作により利益が得られることを示している。実際に、一般的なプロトタイプのシャペロン、例えば本明細書に提示する融合タンパク質は、ケモカインリガンド／受容体相互作用及び活性化機構の特色をプロファイリングするための解決策を提供する。ナノボディなどのシャペロンタンパク質は、膜受容体立体構造の安定化を助けることが公知であるが（Ｍａｎｇｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、これらのタイプのシャペロンは、受容体がある特定の立体構造のある特定のリガンドのみに結合する立体構造となるように、受容体を強制するものではない。その上、新規ケモカイン融合タンパク質はまた、インタクト受容体のある特定の受容体立体構造状態の薬物スクリーニングにおいて利点も提供し得る。これまでインタクト受容体（ＣＸＣＲ４／ｖＭＩＰ－ＩＩ，ＵＳ２８／ＣＸ３ＣＬ１）を使用して決定されているケモカイン／受容体複合体構造は非常に少数であり、近年ではＣＣＲ５受容体とタンパク質阻害剤の複合体、例えば５Ｐ７－ＣＣＬ５は、ＨＩＶ阻害に至るケモカイン－受容体シグナル伝達において新しい洞察を提供している。後者は、５Ｐ７－ＣＣＬ５のそのＮループ、β１ストランド、及び３０ｓループが受容体との主な相互作用部位であることから、リガンド５Ｐ７－ＣＣＬ５が、本明細書で上記の２部位モデルからは正確に予測できない様式でＣＣＲ５と相互作用したことを実証している。これまで、例えばリガンド（ＣＸＣＬ８／ＣＸＣＲ１ペプチド； ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４スルホペプチド、ＣＣＬ１１／ＣＣＲ３ペプチド）と共に受容体のＮ末端ペプチドを使用して、より多くの構造データが得られているが、構造の天然の状況に関する部分的な一面を得ているに過ぎないというリスクがある。
【0053】
別の実施形態は、前記サイトカインがインターロイキンである新規融合タンパク質であって、前記足場タンパク質が、前記βバレルコアモチーフの露出したβターンにおける１つ以上のアクセス可能な部位でインターロイキンβバレルコアモチーフのトポロジーを遮断する、新規融合タンパク質に関する。より具体的には、前記サイトカインがＩＬ－１受容体インターロイキンである融合タンパク質に関する。サイトカインのインターロイキン（ＩＬ－１）スーパーファミリーは、自然免疫及び適応免疫の重要な調節因子であり、感染症、炎症、損傷、及びストレスに対する宿主防御において重要な役割を果たしている。「ＩＬ－１受容体型インターロイキン」スーパーファミリー又は「ＩＬ－１ファミリー」インターロイキンは、本明細書において互換的に使用され、インターロイキンＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６、ＩＬ３６Ｂ、及びＩＬ－３７を含む。これらのサイトカインは、起源、受容体構造、及びシグナル伝達経路によって互いに関連する。ＩＬ－１スーパーファミリーインターロイキンの受容体は、類似の構造を共有し、それらのエクトドメインにおける３つのＩｇ様ドメイン、及び同様にＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体において見出される細胞内Ｔｏｌｌ／ＩＬ－１Ｒ（ＴＩＲ）ドメインを含む。サイトカインシグナル伝達の開始は、２つの受容体、すなわち一次特異的受容体及び一部の場合で共有され得る補助受容体を必要とする。一次受容体は、特異的サイトカイン結合に関与するが、補助受容体はこれ自身サイトカインには結合しないが、サイトカイン及び一次受容体からの予めアセンブルされたバイナリ複合体と会合する。サイトカインがこのそれぞれの受容体に結合すると、シグナル伝達性の三次複合体を形成し、２つの受容体のＴＩＲドメインの二量体化をもたらす。これは、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及び活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）を活性化することによって細胞内シグナル伝達を開始する。シグナル伝達は、シクロオキシゲナーゼ２型の誘導などの炎症応答、接着分子の発現の増加、及び酸化窒素の合成を誘導する。
【0054】
ＩＬ－１スーパーファミリーのいくつかのインターロイキンサイトカインの三次元構造は決定されており、これらのサイトカインは、限定的な配列類似性を有するが、３回回転対称性パターンで整列する１２個の逆平行βストランドを含む保存されたシグナチャーであるβトレホイルのフォールドをとることを実証している。βバレルコアモチーフには、各々のサイトカイン構造において様々な量のヘリックスが充填されている。ヒトサイトカインの各々のＣα原子を重ね合わせると、ループ領域において有意な可撓性を有する保存された疎水性コアが明らかとなる。表面残基及びβストランドの間のループは、全体的な安定性にとって重要ではないように思われ、サイトカインの間で有意に異なり、それらの低い配列類似性と一貫し、それらのそれぞれの受容体（特異的ループを伴う）によるそれらの一意的認識を部分的に説明する。例えば、ヒトＩＬ－１８は、マウスＩＬ－１８と約６５％の配列同一性を共有するが、ヒトＩＬ－１α及びヒトＩＬ－１βに対してはそれぞれ、１５％及び１８％の同一性を共有するに過ぎない。それにもかかわらず、ＩＬ－１８は、その三次元構造において他のＩＬ－１サイトカインと顕著な類似性を示す。このため、このＩＬ－１様受容体インターロイキンは、一部が受容体認識に関係し、他方が新規拡大融合リガンドを得るために本明細書に提示されるフォールディングされた足場タンパク質との接続に関係し得る、可撓性βターン又はループによって相互接続されるβストランドに基づく保存された構造コアドメインを有するサイトカイン内のスーパーファミリーの第二の例を提供する。
【0055】
一実施形態は、サイトカイン融合タンパク質であって、βストランドに基づく保存されたコアドメインが、足場タンパク質がコアドメインのそのトポロジーを「遮断する」ように足場タンパク質に融合されている、サイトカイン融合タンパク質を提供する。一般的に、タンパク質の「トポロジー」は、三次元空間における互いに関する規則的な二次構造の配向を指す。タンパク質フォールドは、主にポリペプチド鎖のトポロジーによって定義される（Ｏｒｅｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。このため、最も根本的なレベルでは、「一次トポロジー」は、二次構造エレメント（ＳＳＥ）の配列として定義され、これはタンパク質フォールド認識モチーフに関与し、したがって二次及び三次タンパク質／ドメインのフォールディングに関与する。このため、タンパク質の構造に関して、真の又は一次トポロジーは、すなわちタンパク質鎖のＮ末端及びＣ末端を保持することができることを考えればＳＳＥの配列であり、単純に考えれば、トポロジーは、タンパク質フォールドがいずれであれ変化しない。そうすればタンパク質フォールドは、タンパク質の一次及び三次構造と同様に三次トポロジーとして記載される（同様に、Ｍａｒｔｉｎ，２０００を参照されたい）。
【0056】
具体的には、本明細書で提示される場合、本発明のケモカイン機能的融合タンパク質のケモカインコアドメインは、したがって露出したβターン又はループのアクセス可能な部位でケモカインコアドメインのβ２とβ３βストランドの間で足場タンパク質融合を導入することによって、この一次トポロジーが遮断されるが、これによってその３Ｄフォールディングを保持することができ、意外にも前記ケモカインはまたその三次構造を保持し、その機能的受容体結合能を保持することが可能であった。同様に、ＩＬ－１様受容体インターロイキンＩＬ－１βは、本明細書に提示されるフォールディングされた足場タンパク質の挿入によって保存されたコアの２つのβストランドの間の露出したβターンで一次トポロジーが遮断されている、保存されたβバレルコアモチーフを有し、特に結合能が保持されることによって、正確にフォールディングされた又は機能的な融合タンパク質を提供する。
【0057】
「足場タンパク質」は、別のタンパク質、特に本明細書に記載されるサイトカイン又はケモカインとの融合を可能にする構造又はフォールドを有する任意のタイプのタンパク質を指す。タンパク質フォールディングの古典的な原理は、タンパク質が正確な三次元立体構造をとるために必要な全ての情報がそのアミノ酸配列によって提供され、様々な分子相互作用によって共に保持される特定のフォールディングされたタンパク質をもたらすことである。本明細書における足場として有用であるためには、足場タンパク質は別個の三次元立体構造にフォールディングされなければならない。このため、前記足場タンパク質は、本明細書において「フォールディングされた」タンパク質として定義され、よりショートペプチドの場合、これらが非常に可撓性で、フォールディングされた構造を提供しないことが一般的に公知であることから、これらのアミノ酸の長さは最小限に限定される。このため、本明細書において使用される新規機能的融合タンパク質において使用される足場タンパク質は、ペプチド又は非常に小さいポリペプチドとは固有に異なり、例えば４０アミノ酸未満で構成される足場タンパク質は、Ｍｅｇａｋｉｎｅとして融合するために適した足場タンパク質ではないと考えられる。このため、本明細書で定義される「足場タンパク質」は、少なくとも２００アミノ酸、又は１５０アミノ酸、又は少なくとも１００アミノ酸、又は少なくとも５０アミノ酸、又はより好ましくは少なくとも４０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも９アミノ酸のフォールディングされたタンパク質である。リンカー又はペプチド、具体的には８アミノ酸未満のリンカーは、本発明の目的のための足場タンパク質として適していない。さらに、このような「足場」、「接合部」、又は「融合パートナー」タンパク質は、好ましくはその三次構造に少なくとも１つの露出した領域を有し、サイトカイン又はケモカインの融合点として切断するための少なくとも１つのアクセス可能な部位を提供する。足場ポリペプチドを使用してサイトカイン又はケモカインコアドメインと共にアセンブルすると、これによってドック構成の融合タンパク質をもたらし、質量を増加させ、対称性を提供し、及び／又は等価の受容体の特異的立体構造を誘導する拡大されたリガンドを提供し、及び／又は受容体に対する機能性を改善する又は増大させる。このように、使用される足場タンパク質のタイプに応じて、得られた融合タンパク質の異なる目的が予見される。足場タンパク質のタイプ及び性質は、これが任意のタンパク質であり得るという点で無関係であり、この構造、サイズ、機能、又は存在に応じて、本発明の融合タンパク質と同様に前記サイトカイン又はケモカインコアドメインに融合された足場タンパク質は、異なる応用分野において有用である。足場タンパク質の構造は、最終的なキメラ構造に影響を及ぼし、このため当業者は、足場タンパク質に関する公知の構造情報を実装し、足場を選択する場合には妥当な予測を考慮に入れなければならない。足場タンパク質の例は、本出願の実施例に提供され、中でも酵素、膜タンパク質、受容体、アダプタータンパク質、シャペロン、転写因子、核タンパク質、抗原結合タンパク質そのもの、例えばナノボディである非制限的な数のフォールディングされたタンパク質を足場タンパク質として適用し、本発明の融合タンパク質を作製してもよい。好ましい実施形態では、前記フォールディングされた足場タンパク質の３Ｄ構造は公知であり、又は当業者によって予測することができ、このためサイトカイン又はその保存されたコアドメインを融合するためのアクセス可能な部位は、前記当業者によって決定され得る。
【0058】
新規キメラ又は融合タンパク質は、接合部がキメラタンパク質構造内において可撓性で、緩く、弱い連結／領域であることを回避するために一意的に融合される。２つのポリペプチドを連結又は融合する簡便な手段は、これらを古典的に公知の様式で第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子から融合タンパク質として発現させることによる。しかし、本発明の組換え核酸分子では、前記足場によるサイトカイン又はその保存されたコアドメインのトポロジーの遮断はまた、前記融合タンパク質が発現される遺伝子融合の設計においても反映される。このため、一実施形態では、融合タンパク質は、サイトカイン、又は具体的にはケモカイン若しくはＩＬをコードする遺伝子の一部、及び足場タンパク質をコードする遺伝子の一部を組み換えることによって形成されたキメラ遺伝子によってコードされ、前記コードされた足場タンパク質は、コードされたサイトカイン、又は具体的には前記ケモカイン若しくはＩＬの保存されたコアドメインの一次トポロジーを、少なくとも２つ以上の直接融合を介して、又はコードされるペプチドリンカーによって作製された融合を介してその露出したβターンにおける前記ドメインの１つ以上のアクセス可能な部位で遮断する。このため、融合されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記タンパク質間で、剛性非可撓性連結、接続、又は融合を提供する融合タンパク質を提供するように、断片化され、組み換えられる。新規キメラは、サイトカイン又は保存されたコアドメインの一次トポロジーが遮断されるように、足場タンパク質をサイトカイン又は具体的には保存されたケモカイン若しくはＩＬコアドメインと融合させることによって作製され、このことは、サイトカインコアドメインのアミノ酸配列が、アクセス可能な部位で遮断されて足場タンパク質のアクセス可能なアミノ酸に連結され、したがって、配列がおそらく遮断されることを意味する。接合部は、分子内で作製され、言い換えれば、アミノ酸配列の内部で作製される（実施例及び図面を参照されたい）。このため、本発明の組換え融合は、Ｎ末端又はＣ末端で単に融合したのみならず、少なくとも１つの内部融合部位を含むキメラをもたらし、部位は直接融合され、又はリンカーペプチドを介して融合される。循環置換された足場を適用して融合タンパク質を産生する場合、前記足場タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端及びＣ末端を接続し、この後その三次構造におけるアクセス可能な部位に対応する足場タンパク質の配列内の別の部位でアミノ酸配列の切断又は分離を行い、サイトカイン又はケモカイン／ＩＬ部分のアミノ酸配列に融合することによって変化する。循環置換を得るための前記Ｎ末端及びＣ末端接続は、直接融合を通して、リンカーペプチドを通して、又はさらにはＮ末端及びＣ末端付近の領域の短い欠失後の末端のペプチド結合を介して行われ得る。
【0059】
用語「アクセス可能な部位」、「融合部位」、又は「融合点」、又は「接続部位」、又は「露出した部位」は、本明細書において互換的に使用され、全て、構造的にアクセス可能な、好ましくはタンパク質の表面上の位置にある又は表面に露出している、より好ましくはβターン又はループの露出した領域であるタンパク質配列のアミノ酸部位を指す。当業者は、本明細書に提供される開示からサイトカインのこれらの部位を誘導することができる。サイトカイン、例えばケモカイン若しくはＩＬの受容体結合又は活性化部位は、しばしばこのような露出した領域に関係し、例えばケモカインの無秩序なＮ末端シグナル伝達ドメイン若しくはＮループ、又はＩＬ－１のβストランド４とβストランド５の間のβターンに関係する。しかし、ケモカインを足場タンパク質に融合するためのこれらの部位の遮断は、受容体結合又は活性化能の喪失をもたらし得、これは本発明の融合タンパク質にとって適切ではなく、したがってアクセス可能な融合部位として本明細書に適用されないと意図される。このため、本明細書に定義される「ループ」又は「ベータターン」としての「アクセス可能な部位」、及び「露出した領域」は、受容体部位又は領域ではないこれらの部位及び領域、又は受容体結合部位を（例えば立体的に）妨害しない部位及び領域を意味する。前記結合部位は、標的化受容体に関して異なり得るが、一般的にケモカインのＮ末端シグナル伝達ドメイン及びＮループ、並びにＩＬ－１型受容体インターロイキンのβ４とβ５の間の対応するβターンを伴う。タンパク質のＮ末端又はＣ末端は、ほとんどの場合、タンパク質３Ｄ構造の「緩い」末端でもあり、したがって表面からアクセス可能である。これらは、受容体結合又は活性化が、このような末端が遊離であることを必要としている場合を除き、及びサイトカイン／ケモカインコアドメインにおける少なくとも１つの他のアクセス可能な部位が融合のために使用され、この後者のアクセス可能な部位の融合が新規キメラに対して剛性を提供することから、このアクセス可能な部位での遮断／挿入をもたらし、トポロジーを遮断する条件下では、本発明のキメラにおけるアクセス可能な部位として考えることができる。したがってアクセス可能な部位は、タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端部位を含み得るが、キメラはＮ末端又はＣ末端で構成されるアクセス可能な部位からの融合のみに基づくことはできない。ケモカイン／ＩＬコアドメインの少なくとも１つ以上の部位は、公知の従来のドメインフォールドのトポロジーの遮断をもたらすように、足場タンパク質との融合のために使用される。このため、一実施形態では、少なくとも１つのアクセス可能な部位は、少なくとも１つが１つである場合、前記ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端部位ではなく、前記ドメインのＮ末端又はＣ末端部位を含まない。特定の実施形態では、少なくとも１つの部位は、前記ドメインのＮ末端又はＣ末端アミノ酸ではない。別の実施形態では、アクセス可能な部位は、少なくとも１つ以上の部位が足場タンパク質との融合のために使用される場合、保存されたコアドメインのＮ末端又はＣ末端部位であり得る。足場タンパク質は、その三次構造から同様に目に見えるアクセス可能な部位を介して融合され、一実施形態では、前記少なくとも１つの部位は足場タンパク質のＮ末端又はＣ末端ではなく、代替の実施形態では、少なくとも１つの部位は前記フォールディングされた足場のＮ末端又はＣ末端である。
【0060】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、前記保存されたコアドメインの露出した領域における遮断部で融合された前記足場タンパク質のＮ末端断片、及び前記保存されたコアドメインの付近のＣ末端端部で融合された前記足場タンパク質のＣ末端断片を含む。
【0061】
本発明の一部の実施形態では、融合は直接融合であり得、又はリンカーペプチドによって作製された融合であり得、前記融合部位は、剛性非可撓性融合タンパク質をもたらすように完全に設計されている。選択されたアクセス可能な部位の位置に加えて、リンカーペプチドの長さ及びタイプは、得られた融合タンパク質の剛性及びおそらく機能性に寄与する。本発明の文脈において、融合タンパク質を構成するポリペプチドは、ペプチド結合を介した接続によって互いに直接融合され、又は間接的に結合され、間接的結合はショートペプチドリンカーを介した接続を通して２つのポリペプチドをアセンブルする。好ましい「リンカー分子」、「リンカー」又は「短いポリペプチドリンカー」は、アクセス可能な部位で融合の接合部に対して所望の剛性を提供するために、最大で１０アミノ酸長のペプチドであり、より好ましくは４アミノ酸長、典型的にはわずか３アミノ酸長、好ましくは２つのみ、又はさらに好ましくは１つのみのアミノ酸長のペプチドである。適したリンカー配列の非制限的な例を実施例の章に記載し、これは無作為化が可能であり、リンカーは構造ドメイン間の固定された距離を維持するように、並びに融合パートナーがその独立した機能（例えば、受容体結合）を維持するように首尾よく選択されている。剛性リンカーの使用に関する実施形態では、これらは一般的に、αヘリックス構造をとることによって、又は複数のプロリン残基を含有することによって、一意的な立体構造を示すことが公知である。多くの状況下では、これらは機能的ドメインを可撓性リンカーより効率的に分離し、好ましくはわずか１～４アミノ酸の短い長さで同様に適切であり得る。
【0062】
代替の実施形態では、融合タンパク質は、ｉ）サイトカイン（例えば、ケモカイン又はＩＬ）のＮ末端アミノ酸配列、ｉｉ）機能的な足場タンパク質、及びｉｉｉ）ｉ）の前記Ｎ末端アミノ酸配列を欠如するサイトカイン（例えばケモカイン又はＩＬ）配列を含む剛性融合タンパク質であって、ｉ）及びｉｉｉ）がｉｉ）の前記足場タンパク質に連結されている剛性融合タンパク質として記載される。好ましい実施形態では、前記剛性融合タンパク質は、ケモカインＮ末端シグナル伝達ドメインに対応するＮ末端アミノ酸配列を含み、この後に、足場タンパク質又は循環置換された足場タンパク質のアミノ酸配列に融合されたβシートの第１の２つのβストランドを含有するケモカインコアドメインの一部が続き、これはこの配列が遮断されており、露出した表面ループ又はターンにおけるある部位に対応するアクセス可能な部位で融合され、最終的にコアドメインのβ３鎖及び前記ドメインのＣ末端ヘリックスを含有するケモカインの残りの部分に融合される。このため、足場タンパク質のケモカインタンパク質配列への挿入は、ケモカインコアドメインのこのβ２－β３ターン又はループにおけるアクセス可能な部位に対応する１つの遮断されたアミノ酸配列部位で得られ、これはまた、ケモカインの構造用語では４０ｓループとも呼ばれる。
【0063】
一実施形態では、ケモカインコアドメインのアクセス可能な部位は、ドメインフォールドの露出した領域に存在する。前記露出した領域は、主にタンパク質の表面上で、構造の縁部に位置するあまり固定されていない一連のアミノ酸として同定される。好ましくは、露出した領域は、タンパク質構造のループ又はβターンとして存在する。ケモカインコアドメインの「露出した領域」の最も単純な同定は、露出したループ、好ましくはβシート３Ｄ構造の縁部に位置する露出したループであるβターンでる。３本鎖βシート構造の場合、可能性は、３０ｓループとも呼ばれるβ１－β２ターン若しくはループ、又は４０ｓループとも呼ばれるβ２－β３ターン若しくはループを含む。ある特定のケモカイン受容体複合体では、３０ｓループは、受容体結合を伴うことが知られており、したがって４０ｓループと比較して足場の融合時に遮断するためにあまり好ましくない。
【0064】
別の実施形態では、足場タンパク質は循環置換を有する。好ましい実施形態では、足場タンパク質の前記循環置換は、足場タンパク質のＮ末端及び／若しくはＣ末端に存在し、又は最も好ましくは足場タンパク質のＮ末端とＣ末端の間に存在する。別の実施形態は、少なくとも２つの逆平行βストランドを含む足場タンパク質を提供する。
【0065】
一実施形態では、融合タンパク質（２つのペプチド結合又は２つの短いリンカーを有する）は、その構造の露出した領域に対応するその配列におけるその切断されたアクセス可能な部位（前記露出した又はアクセス可能な部位はＮ末端又はＣ末端ではない）での循環置換された足場タンパク質との融合を通して、β２－β３ターンに対応するこの配列における切断されたアクセス可能な部位でのサイトカイン又はケモカインコアドメイン一次トポロジーの遮断を介してサイトカイン又はケモカインコアドメインを足場に接続することによって得られる。このため、足場タンパク質の循環置換がＮ末端及びＣ末端に存在する特定の実施形態では（図２の場合）、足場タンパク質配列は、全体としてのサイトカイン又はケモカイン断片との組換えによって融合され得る（図７の場合）。特定の実施形態では、前記融合タンパク質は、好ましくはアクセス可能なＮ末端端部付近のサイトカイン又はケモカイン内に位置するシステイン残基によって形成される強化性のジスルフィド架橋の追加の生成を通してその剛性を増加させる。
【0066】
本発明のさらなる態様は、足場タンパク質に融合されたサイトカイン、例えばケモカイン又はＩＬコアドメインを含むサイトカインを含む新規機能的融合タンパク質であって、前記足場タンパク質が、前記サイトカインケモカイン／ＩＬの保存されたコアドメインのトポロジーを遮断し、足場タンパク質の総質量又は分子量が少なくとも３０ｋＤａであり、標的、例えばリガンドの受容体に対する融合の結合によって質量及び構造特性を増大させることが、前記キメラに非共有結合した場合に標的の三次元構造解析を可能にするために有意かつ十分である、新規機能的融合タンパク質に関する。別の実施形態では、足場タンパク質の総質量又は分子量は、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも６０ｋＤａである。この特定のサイズ又は質量の増加は、画像におけるシグナル対ノイズ比を減少させるように影響を及ぼす。次に、キメラは、クライオ－ＥＭ及びＸ線結晶構造解析を使用して十分に高い分解能に達するために小さいタンパク質又は結晶化することが難しいタンパク質の正確な画像位置合わせのための適切な特色を提供することによって構造ガイドを提供する。
【0067】
本発明のさらなる態様は、本発明の前記融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。前記核酸分子は、前記サイトカイン、ケモカイン、又はインターロイキン、及び前記足場タンパク質、及び／又はこの断片のコード配列を含み、前記ドメインの遮断されたトポロジーは、前記ドメイン配列が足場タンパク質配列（又は循環置換された配列若しくはこの断片）の挿入を含有するという事実によって反映され、これによってＮ末端サイトカイン、ケモカイン、又はＩＬ断片及びＣ末端サイトカイン、ケモカイン、又はＩＬの保存されたコアドメイン断片は、前記核酸分子内の足場タンパク質配列又はこの断片によって分離される。別の実施形態では、少なくともプロモーター、融合タンパク質をコードする前記核酸分子、及び転写終止シグナルを含有する３’末端領域を有するキメラ遺伝子が記載される。別の実施形態は、本発明の前記融合タンパク質をコードする、又は前記融合タンパク質をコードする核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含む発現カセットに関する。前記発現カセットは、ある特定の実施形態では、受容体若しくは抗体、又はあるいは標的若しくは相互作用パートナーの最も適切な結合体に関して選択するために大きいセットのサイトカイン融合、例えばケモカイン又はインターロイキン融合を含有するライブラリとして汎用フォーマットで適用される。さらなる実施形態は、本発明の融合タンパク質をコードする前記発現カセット又は核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態では、大腸菌における発現のためのベクターは、それらの標的の存在下又は非存在下で融合タンパク質を産生し、これらを精製することを可能にする。代替の実施形態は、本発明の融合タンパク質、又は本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子若しくは発現カセット、若しくはベクターを含む宿主細胞に関する。特定の実施形態では、前記宿主細胞はさらに、標的タンパク質、又は例えば融合タンパク質のサイトカイン、例えばケモカイン又はＩＬに特異的に結合する受容体を同時発現する。別の実施形態は、リガンドスクリーニング、薬物スクリーニング、タンパク質捕捉及び精製、又は生物物理学試験のための、前記宿主細胞、又はこの単離された膜調製物、又はこれらから単離されたタンパク質の使用を開示する。本発明は、汎用（ｇｅｎｅｒｉｃ）融合ベクターにおけるハイスループットクローニングのための選択肢をさらに包含する。前記汎用ベクターは、前記ベクターが酵母、ファージ、細菌、又はウイルスにおける表面ディスプレイにとって特に適している追加の実施形態において記載されている。さらに、前記ベクターは、異なるリガンドの大きいセット、特に例えば異なるリンカーを有するこのような汎用ベクター、又は発現カセットを含む免疫ライブラリの選択及びスクリーニングにおいて応用を有する。このため、特定の受容体に関して新規融合タンパク質をスクリーニングするために構築された前記ライブラリにおける示差的配列は、リンカー配列の差、又はあるいは他の領域における差によって提供される。
【0068】
一実施形態では、本発明のベクターは、細胞の集団の細胞外表面でサイトカイン融合タンパク質のコレクションをディスプレイすることを伴う方法において使用するために適している。表面ディスプレイ法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，（２００５；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，１１０５－１６）において再検討されており、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、（バクテリオ）ファージディスプレイを含む。好ましくは、細胞の集団は酵母細胞である。異なる酵母表面ディスプレイ法は全て、そのタンパク質をコードするプラスミドを有する酵母細胞の細胞外表面にライブラリによってコードされる各々の融合タンパク質を強固に連結する手段を提供する。今日まで記載されたほとんどの酵母ディスプレイ法は、酵母サッカロマイセス・セレビジエを使用するが、他の酵母種、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）もまた使用することができる。より具体的には、一部の実施形態では、酵母株は、サッカロマイセス、ピチア、ハンゼヌラ、シゾサッカロマイセス、クルイベロマイセス、ヤロウィア、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群から選択される属種に由来する。一部の実施形態では、酵母種は、Ｓ．セレビジエ、Ｐ．パストリス、Ｈ．ポリモルファ、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｙ．リポリチカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、及びＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群から選択される。ほとんどの酵母発現融合タンパク質は、細胞表面タンパク質の表面発現において重要な役割を果たし、酵母の生存にとって必須であるＧＰＩ（グリコシル－ホスファチジル－イノシトール）アンカータンパク質に基づく。１つのこのようなタンパク質であるアルファ－アグルチニンは、ＡＧＡ１によってコードされるコアサブユニットからなり、ジスルフィド架橋を通してＡＧＡ２によってコードされる小さい結合サブユニットに連結される。核酸ライブラリによってコードされるタンパク質は、ＡＧＡ１のＮ末端領域又はＡＧＡ２のＣ末端領域若しくはＮ末端領域に導入され得る。いずれの融合パターンも、酵母細胞表面上のポリペプチドのディスプレイをもたらす。
【0069】
本明細書に開示されるベクターは、原核宿主細胞がタンパク質を表面にディスプレイするためにも適し得る。この目的にとって適した原核細胞は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０号に開示されるＢ．リケニホルミス４１ Ｐ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、他の株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）も適している。これらの例は制限的ではなく、例示的である。宿主細胞が原核細胞である場合、適した細胞表面タンパク質の例は、適した細菌外膜タンパク質を含む。このような外膜タンパク質としては、線毛及び鞭毛、リポタンパク質、氷核形成タンパク質、及びオートトランスポーターが挙げられる。異種タンパク質ディスプレイのために使用される例示的な細菌タンパク質としては、ＬａｍＢ（Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，５（１１）：３０２９－３７（１９８６））、ＯｍｐＡ（Ｆｒｅｕｄｌ，Ｇｅｎｅ，８２（２）：２２９－３６（１９８９））、及びインチミン（Ｗｅｎｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４（３０）：２１０３７－４３，（１９９９））が挙げられる。追加の例示的な外膜タンパク質としては、ＦｌｉＣ、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）、ＯｐｒＦ、ＯｐｒＩ、ＰｈｏＥ、ＭｉｓＬ、及びサイトリシンが挙げられるがこれらに限定されない。表面ディスプレイのために使用されている細菌膜タンパク質の網羅的なリストが、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１（１）：４５－５２（２００３），Ｊｏｓｅ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６９（６）：６０７－１４（２００６）、及びＤａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１７（４）：４７４－８０（２００７）に詳細に記載されている。
【0070】
さらに、詳細なスクリーニング選択を可能にするために、ＦＡＣＳ及びパニングの後にそれぞれ、ベクターを酵母及び／又はファージディスプレイに適用することができる。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の分解力と組み合わせた酵母細胞上のサイトカイン又はケモカイン融合タンパク質のディスプレイは、好ましい選択方法を提供する。酵母ディスプレイでは、各々のサイトカイン又はケモカイン融合タンパク質は、例えば、単一の細胞の表面上に約５０，０００コピーでＡｇａ２ｐタンパク質に対する融合としてディスプレイされる。ＦＡＣＳによる選択の場合、異なる蛍光色素による標識が、選択手順を決定する。融合タンパク質をディスプレイする酵母ライブラリを次に、使用される蛍光タンパク質の混合物によって染色することができる。次いで２色ＦＡＣＳを使用して、特定の酵母細胞上にディスプレイされた各々の融合タンパク質の特性を解析し、個別の細胞集団を解明することができる。目的のタンパク質、例えば受容体又は抗体の結合にとって非常に適した融合タンパク質をディスプレイする酵母細胞は結合し、これを２色ＦＡＣＳにおける対角線に沿って選別することができる。このような選択方法のためのベクターの使用は、融合タンパク質のスクリーニングが一過性のタンパク質－タンパク質相互作用又は立体構造選択的結合状態を例えば具体的に標的化する場合、最も好ましい。同様に、ファージディスプレイのためのベクターを適用し、バクテリオファージ上の融合タンパク質をディスプレイするために使用し、この後パニングを行う。ディスプレイは、例えば同じ汎用ベクター内で、サイトカイン又はケモカイン融合タンパク質のファージコートタンパク質ＩＩＩとの融合によってＭ１３粒子上で行うことができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２０００；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ．５６９９：３７１－３７８）。特定の立体構造に特異的に結合する融合タンパク質及び／又は一過性のタンパク質－タンパク質相互作用を選択する場合、例えば相互作用するプロモーターの１つのみを固相に固定する。次に、ファージ上にディスプレイされた融合タンパク質のパニングによる生物選択を、残りの可溶性プロモーターの過剰量の存在下で行う。任意選択により、固相に固定された架橋された複合体又はタンパク質のパニングラウンドから開始することができる。
【0071】
本発明の別の態様は、前記融合タンパク質、及び受容体タンパク質を含む複合体であって、前記受容体タンパク質がサイトカイン、例えば他のタイプのサイトカインの中でもケモカイン又はインターロイキン及びこれらのコグネート受容体に特異的に結合する、複合体に関する。より詳しくは、一実施形態は、前記受容体タンパク質が前記融合タンパク質のサイトカイン部分に結合しているタンパク質複合体に関する。一実施形態は、本明細書に記載される複合体であって、前記融合タンパク質のサイトカイン又はケモカイン又はＩＬが立体構造選択的リガンドである複合体を開示する。より詳しくは、融合タンパク質のサイトカイン又はケモカイン又はＩＬ部分が機能的立体構造の受容体タンパク質を安定化する複合体が開示される。より詳しくは、前記機能的立体構造は、アゴニスト立体構造を伴い得て、部分的アゴニスト立体構造を伴い得て、又は中でもバイアスアゴニスト立体構造を伴い得る。あるいは、融合タンパク質のサイトカイン又はケモカイン又はＩＬが機能的立体構造の受容体タンパク質を安定化する、前記機能的立体構造が不活性な立体構造である、又は前記機能的立体構造がインバースアゴニスト立体構造を伴う、本発明の複合体が開示される。別の実施形態は、受容体が融合タンパク質に結合すると活性化される、前記サイトカイン融合タンパク質、又はこの受容体との複合体におけるケモカイン若しくはＩＬ融合タンパク質に関する。本明細書において既に記載したように、ケモカイン及び／又はＩＬ受容体を含む複数のサイトカイン受容体は、活性化状態を獲得するためにいくつかの境界部がリガンドに結合することを必要とする。
【0072】
本発明の別の実施形態は、本発明に従うサイトカイン機能的融合タンパク質を産生する方法であって、（ａ）本発明のベクター、発現カセット、キメラ遺伝子、又は核酸配列を含む宿主を、融合タンパク質の発現を助ける条件下で培養するステップ、及び（ｂ）任意選択により、発現されたポリペプチドを回収するステップを含む方法に関する。
【0073】
より特定の実施形態は、本明細書に記載されるケモカイン融合タンパク質を産生する方法であって、（ａ）３Ｄ構造が、一次トポロジーを遮断することなく、露出した領域におけるアクセス可能な部位をアミノ酸配列の遮断のためのループ又はターンとして明らかにする、ケモカインリガンド及び足場タンパク質を選択するステップ；（ｂ）遺伝子融合構築物を設計するステップであって、核酸配列が、以下の核酸配列分子：
１．ケモカイン配列の遮断が、ケモカインタンパク質のその保存されたコアドメイン構造のβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応する位置に存在する、
２．その５’及び３’核酸配列末端を融合することによる挿入のための足場配列（全体として）、又は前記足場タンパク質のこの配列の代替の遮断された部位を融合することによる挿入のための足場タンパク質が、ループ又はβターンなどの前記足場のアクセス可能な部位に存在する、
３．ケモカインの３’末端の最も５’の遮断された配列（βストランドβ２のＣ末端側のアミノ酸残基に対応する）が、足場タンパク質の最も５’の（遮断された）部位の５’開始部分に融合され、ケモカインの最もＣ末端側で遮断された部位の５’開始部分（βストランドβ３のＮ末端側のアミノ酸残基に対応する）が、足場タンパク質の最もＣ末端側で遮断された部位の３’末端に融合されている、
核酸配列分子によってコードされるタンパク質配列をコードするように設計されている、ステップ；
（ｃ）前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して、融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが足場タンパク質に対してそのコアドメインの２つ以上の部位で融合されているステップ
を含む方法に関する。
１．ケモカイン配列の遮断が、ケモカインタンパク質のその保存されたコアドメイン構造のβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応する位置に存在する、
２．その５’及び３’核酸配列末端を融合することによる挿入のための足場配列（全体として）、又は前記足場タンパク質のこの配列の代替の遮断された部位を融合することによる挿入のための足場タンパク質が、ループ又はβターンなどの前記足場のアクセス可能な部位に存在する、
３．ケモカインの３’末端の最も５’の遮断された配列（βストランドβ２のＣ末端側のアミノ酸残基に対応する）が、足場タンパク質の最も５’の（遮断された）部位の５’開始部分に融合され、ケモカインの最もＣ末端側で遮断された部位の５’開始部分（βストランドβ３のＮ末端側のアミノ酸残基に対応する）が、足場タンパク質の最もＣ末端側で遮断された部位の３’末端に融合されている、
核酸配列分子によってコードされるタンパク質配列をコードするように設計されている、ステップ；
（ｃ）前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して、融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインが足場タンパク質に対してそのコアドメインの２つ以上の部位で融合されているステップ
を含む方法に関する。
【0074】
代替の実施形態は、本明細書に記載される融合タンパク質を産生又は精製する方法であって、（ａ）ケモカインの一次トポロジー及び／又は足場タンパク質の一次トポロジーを遮断することなく、融合タンパク質を作製するために遮断することができる、それらの三次構造におけるアクセス可能なループ又はターンを有するケモカインリガンド及び足場タンパク質を選択するステップ、（ｂ）遺伝子融合構築物を設計するステップであって、核酸配列が発現宿主におけるタンパク質をコードするように設計されており：
１．ケモカインのタンパク質配列が、コアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応するアミノ酸で遮断され、
２．足場タンパク質のそのＮ末端及びＣ末端が融合されて、循環置換された足場タンパク質が得られ、
３．２．の循環置換された足場タンパク質が、ステップ２において融合されたアミノ酸とは異なる遮断部位である、その三次配列の露出したループ又はターンにおけるアクセス可能な部位に対応するそのアミノ酸配列において遮断されている、
４．ケモカインのＮ末端部分のＣ末端端部（すなわち、βストランドβ２のＣ末端側のケモカインの遮断された部位）が、循環置換された足場タンパク質のＮ末端に融合され、ケモカインのＣ末端部分のＮ末端開始部分（すなわち、βストランドβ３のＮ末端側のケモカインの遮断された部位）が、循環置換された足場タンパク質のＣ末端に融合される、ステップ、
（ｃ）前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して、融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインがそのコアドメインの２つ以上の部位で循環置換された足場タンパク質に融合されているステップ
を含む方法を開示する。
１．ケモカインのタンパク質配列が、コアドメインのβストランドβ２とβストランドβ３の間のアクセス可能な部位に対応するアミノ酸で遮断され、
２．足場タンパク質のそのＮ末端及びＣ末端が融合されて、循環置換された足場タンパク質が得られ、
３．２．の循環置換された足場タンパク質が、ステップ２において融合されたアミノ酸とは異なる遮断部位である、その三次配列の露出したループ又はターンにおけるアクセス可能な部位に対応するそのアミノ酸配列において遮断されている、
４．ケモカインのＮ末端部分のＣ末端端部（すなわち、βストランドβ２のＣ末端側のケモカインの遮断された部位）が、循環置換された足場タンパク質のＮ末端に融合され、ケモカインのＣ末端部分のＮ末端開始部分（すなわち、βストランドβ３のＮ末端側のケモカインの遮断された部位）が、循環置換された足場タンパク質のＣ末端に融合される、ステップ、
（ｃ）前記遺伝子融合構築物を発現系に導入して、融合タンパク質を得るステップであって、前記ケモカインがそのコアドメインの２つ以上の部位で循環置換された足場タンパク質に融合されているステップ
を含む方法を開示する。
【0075】
別の態様は、本発明のサイトカイン機能的融合タンパク質の使用、又はそのコグネート受容体タンパク質の構造解析における核酸分子、キメラ遺伝子、発現カセット、ベクター、若しくは複合体の使用に関する。特に、受容体タンパク質の構造解析におけるβストランド－コアドメインに基づくサイトカイン融合タンパク質の使用であって、前記受容体タンパク質が、前記融合タンパク質の前記サイトカイン部分に特異的に結合したタンパク質である使用に関する。「構造を解析する」又は「構造解析」は、本明細書で使用される場合、タンパク質の原子又は原子座標の配置を決定することを指し、しばしば生物物理的方法、例えばＸ線結晶構造解析又はクライオ電子顕微鏡（クライオ－ＥＭ）によって行われる。具体的には、実施形態は、単粒子クライオ－ＥＭ又は結晶構造解析を含む構造解析における使用に関する。構造生物学における本発明のこのようなサイトカイン融合タンパク質の使用により、主な利点は、結晶構造解析の補助として作用することであり、すなわち結晶の接点としての役割を果たし、対称性を増加させ、さらにクライオ－ＥＭにおける剛性ツールとして適用することができることであり、これは膜受容体などの扱いにくいタンパク質の大きい構造を解明するために、今日対処されるサイズの障壁を低減させるために、同様に対称性を増加させるために、及び前記サイトカイン又はケモカイン融合タンパク質との複合体における受容体の特異的立体構造状態を安定化及び可視化するために非常に貴重である。
【0076】
構造決定のためのクライオ－ＥＭの使用は、Ｘ線結晶構造解析などの従来のアプローチに対していくつかの利点を有する。特に、クライオ－ＥＭは、純度、均一性、及び品質に関して解析される試料に対する要件があまり厳密ではない。重要なことに、クライオ－ＥＭは、構造決定にとって適した結晶を形成しない標的に適用することができる。精製又は非精製タンパク質の懸濁液を、単独又は他のタンパク質様分子との複合体、例えば本発明のサイトカイン融合タンパク質又は非タンパク質様分子、例えば核酸との複合体で、クライオ－ＥＭによるイメージングのためにカーボングリッドに適用することができる。コーティングされたグリッドは通常、液体エタン中で瞬間凍結され、懸濁液中の粒子を凍結水和状態で保存する。より大きい粒子は、凍結固定によってガラス質にされ得る。ガラス質にした試料を、低温ウルトラミクロトームにおいて薄切片（典型的に厚さ４０～２００ｎｍ）に切断し、切片をイメージングのために電子顕微鏡グリッド上に置くことができる。画像から得られたデータの品質を、パラレルイルミネーション及び良好な顕微鏡の軸合わせを使用することによって改善し、約３．３Åもの高い分解能を得ることができる。そのような高い分解能では、完全な原子構造の最初のモデル構築が可能である。しかし、選択された又は近縁の標的タンパク質及び選択された異種タンパク質又は近縁のホモログに関する原子分解能での構造データが、制約付きの比較モデリングに関して利用可能である場合、より低い分解能のイメージングで十分である。データの品質をさらに改善するために、顕微鏡を、イメージングのために使用される同じ条件下で記録されたカーボンフィルム画像のフーリエ変換において１／３Å－１を超える目に見えるコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）のリングが明らかとなるように注意深く軸合わせすることができる。次に、ＣＴＦＦＩＮＤなどのソフトウェアを使用して各顕微鏡写真のデフォーカス値を決定することができる。
【0077】
さらに、本明細書においてリガンド／受容体複合体の三次元構造を決定する方法であって、（ｉ）本発明に従う融合タンパク質を提供するステップ、及び受容体を提供して複合体を形成するステップであって、前記受容体タンパク質が本発明の融合タンパク質のサイトカイン部分に結合するステップ、又は本明細書において上記の複合体を提供するステップ；（ｉｉ）前記複合体を構造解析にとって適した条件でディスプレイするステップであって、前記タンパク質複合体の３Ｄ構造が高分解能で決定されるステップ、を含む方法が開示される。
【0078】
特定の実施形態では、前記構造解析は、Ｘ線結晶構造解析を介して行われる。別の実施形態では、前記３Ｄ解析は、クライオ－ＥＭを含む。より具体的には、クライオ－ＥＭ解析の方法論は、本明細書において以下に記載される。試料（例えば、目的の受容体との複合体における選択される融合タンパク質）を、ブロッティングの前に、選択した最も成績がよい放電グリッド（炭素コーティングした銅グリッド、Ｃ－Ｆｌａｔ、１．２／１．３ ２００－メッシュ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；金Ｒ１．２／１．３ ３００メッシュＵｌｔｒａＡｕＦｏｉｌグリッド：Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ；等）に適用し、次いで液体エタン（Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ （ＦＥＩ）、又は選択した他のプランジャー）中で急速凍結する。単グリッドのデータを、選択した検出器（一例として、Ｆａｌｃｏｎ ３ＥＣ直接検出器）を備えた３００ｋＶ電子顕微鏡（一例として、選択した補助位相板を有するＫｒｉｏｓ ３００ｋＶ）で収集する。顕微鏡写真は、予想されるリガンド／受容体複合体のサイズにとって適した適切な倍率で、電子計測モードで収集される。収集した顕微鏡写真を、さらに画像処理する前に手作業でチェックする。選択したソフトウェア（一例としてＲＥＬＩＯＮ、ＳＰＨＩＲＥパッケージ）によってドリフト補正、試料微動、線量の重み付け、ＣＴＦフィッティング及び位相シフト推定を適用する。選択したソフトウェアにより粒子を採取し、それらを２Ｄ分類のために使用する。２Ｄクラスを手作業で検分し、偽陽性を除去する。データ収集設定に従って粒子をビンに分類する。適切なローパスフィルターを適用することによって最初の３Ｄ参照モデルを生成し、複数の３Ｄクラス（一例として６個）を生成する。３Ｄ精密化のために元の粒子を使用する（必要であればソフトマスクを使用する）。フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３基準を使用して再構成の分解能を推定する。局所分解能を、ＳｃｉｐｉｏｎにおけるＭｏｎｏＲｅｓインプリメンテーションによって計算することができる。再構成されたクライオ－ＥＭマップを、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ及びＣｏｏｔソフトウェアを使用して分析することができる。設計モデルを最初に、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを使用してフィットさせ、選択したソフトウェア（ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ、ＰｙＭＯＬ、又はＣｏｏｔ）によって分析することができる。
【0079】
本発明の方法の別の利点は、従来のかたちでは高純度のタンパク質でのみ可能である構造解析が、サイトカイン融合タンパク質の使用のおかげで純度の要件に対してあまり厳格ではなくなるという点である。このようなサイトカインリガンド融合タンパク質、より詳しくはこのようなβストランドの保存されたコアドメインに基づくサイトカイン融合タンパク質、例えばケモカイン又はＩＬ－１融合タンパク質は、複合体混合物におけるその高親和性の結合部位を介して目的の受容体から具体的にフィルターで除去される。受容体タンパク質は、このようにして捕捉され、凍結され、クライオ－ＥＭを介して解析することができる。
【0080】
前記方法は、代替の実施形態では、受容体タンパク質が一過性のタンパク質－タンパク質複合体であり、又は一過性の特異的立体構造状態にある、３Ｄ解析にとっても適切である。加えて、前記融合タンパク質分子はまた、これらの構造解析を可能にするための標的として一過性のタンパク質－タンパク質相互作用を安定化するために受容体の三次元構造を決定する方法に適用することができる。
【0081】
別の実施形態は、同じ受容体タンパク質の異なる立体構造に結合する融合タンパク質のパネルに関して選択又はスクリーニングする方法であって、（ｉ）受容体タンパク質に結合する融合タンパク質のリガンドライブラリを設計するステップ、及び（ｉｉ）前記受容体タンパク質のいくつかの関連する立体構造状態に結合するタンパク質を含む融合タンパク質パネルを得るために表面酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、又はバクテリオファージを介して融合タンパク質を選択し、それによって例えばクライオ－ＥＭにおいて解析される受容体タンパク質のいくつかの立体構造を個別の画像にするステップを含む方法に関する。特異的な又はある特定の立体構造状態を得るために、本発明者らは、受容体が膜上にあり、前記細胞が実験の目的に従って処置又は操作され得る細胞に基づく系を利用することができる。
【0082】
別の実施形態では、本発明の前記方法及び前記融合タンパク質は、構造に基づくドラッグデザイン及び構造に基づく薬物スクリーニングのために使用される。構造に基づくドラッグデザインの繰り返しプロセスはしばしば、最適化されたリードがフェーズＩ臨床試験に入る前に複数のサイクルを通して進行する。最初のサイクルは、３つの基本的な方法：Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、又は相同性モデリングの１つによる受容体タンパク質又は核酸のクローニング、精製、及び構造決定を含む。コンピューターアルゴリズムを使用して、データベースからの化合物又は化合物の断片を、構造の選択された領域に配置する。受容体のある特定の構造の立体構造を固定又は安定化させるために、本発明の融合タンパク質を使用することができる。選択された化合物を、この標的部位とのこれらの立体的及び静電気的相互作用に基づいてスコア付け及びランク付けし、最善の化合物を、生化学アッセイによって試験する。第２のサイクルでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくともマイクロモル濃度の阻害を有する第１のサイクルからの有望なリードとの複合体における標的の構造決定は、効力を増加させるために最適化することができる化合物上の部位を明らかにする。同様に、この時点で、本発明の融合タンパク質は、これがある特定の立体構造状態における前記標的受容体タンパク質の構造解析を容易にすることにより作用し始める。追加のサイクルは、最適化されたリードの合成、新規標的：リード複合体の構造決定、及びリード化合物のさらなる最適化を含む。ドラッグデザインプロセスのいくつかのサイクル後、最適化された化合物は通常、結合の顕著な改善、及びしばしば標的の特異性の顕著な改善を示す。ライブラリのスクリーニングによりヒットが得られると、これはリードへとさらに開発され、構造活性相関解析のためにこの構造情報並びに医薬品化学が必須である。
【0083】
別の実施形態は、（立体構造選択的な）化合物を同定する方法であって、
ｉ）本発明の標的受容体タンパク質及び前記標的受容体タンパク質に特異的に結合する融合タンパク質を提供するステップ
ｉｉ）試験化合物を提供するステップ
ｉｉｉ）標的受容体タンパク質に対する試験化合物の選択的結合を評価するステップ
を含む方法に関する。
ｉ）本発明の標的受容体タンパク質及び前記標的受容体タンパク質に特異的に結合する融合タンパク質を提供するステップ
ｉｉ）試験化合物を提供するステップ
ｉｉｉ）標的受容体タンパク質に対する試験化合物の選択的結合を評価するステップ
を含む方法に関する。
【0084】
特に好ましい実施形態に従って、立体構造選択的化合物を同定する上記の方法は、リガンド結合アッセイ又は競合アッセイによって実施され、さらにより好ましくは放射リガンド結合又は競合アッセイによって実施される。最も好ましくは、立体構造選択的化合物を同定する上記の方法は、比較アッセイにおいて実施され、より具体的には、比較リガンド競合アッセイ、さらにより具体的には比較放射リガンド競合アッセイにおいて実施される。
【0085】
特定の実施形態、特定の構成並びに材料及び／又は分子を、本明細書において、本開示に従う操作された細胞及び方法に関して考察してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変化又は改変を行うことができることが理解される。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく説明するために提供され、本出願を制限すると考えるべきではない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【実施例】
【0086】
全般
サイトカイン及び足場タンパク質からなり、サイトカイン又はサイトカインの特定のサブファミリーのβストランドに基づく保存されたコアドメイン又はモチーフが、２つ若しくは３つのショートリンカーを介して又は２つ若しくは３つの直接結合を介して、足場タンパク質に接続されている、「Ｍｅｇａｋｉｎｅ（商標）」（Ｍｋ）とも呼ばれる新規のタイプの機能的剛性融合タンパク質を設計した。原理は、ケモカイン（具体的には、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１２による）、並びにインターロイキン、より具体的にはＩＬ－１型受容体インターロイキン、を含むサイトカインの２つのスーパーファミリーについて本明細書に例示されており、これらのスーパーファミリーはいずれも、かかるβストランドに基づく保存されたコアドメインを含むサイトカインを代表するものである。ケモカイン又はインターロイキンのその受容体への作用機序及び結合モードに応じて、これらの剛性融合タンパク質は、ケモカイン又はインターロイキン受容体の特定のかつ異なる立体構造状態に結合し、立体構造状態を固定する。これらの融合タンパク質は、事実上、拡大されたケモカイン又はインターロイキンリガンドを表し、ケモカイン又はインターロイキン複合体（例えば、その受容体との複合体）のタンパク質構造を決定するために有用であり、Ｘ線結晶学及びクライオ－ＥＭ用途を含むいくつかの用途に役立つ。Ｍｅｇａｋｉｎｅは、結合したコグネートサイトカイン受容体の立体構造的柔軟性を低下させ、結晶接触を形成しやすくする表面を伸長させることによって、並びにさらなる位相情報を提供することによって、次世代の結晶化シャペロンとして機能する。特定のＭｅｇａｋｉｎｅタンパク質をケモカイン又はインターロイキン特異的受容体と混合することによって、それらの特異的な結合相互作用は、「質量」付加をもたらし、受容体の特定の立体構造状態を固定する。
サイトカイン及び足場タンパク質からなり、サイトカイン又はサイトカインの特定のサブファミリーのβストランドに基づく保存されたコアドメイン又はモチーフが、２つ若しくは３つのショートリンカーを介して又は２つ若しくは３つの直接結合を介して、足場タンパク質に接続されている、「Ｍｅｇａｋｉｎｅ（商標）」（Ｍｋ）とも呼ばれる新規のタイプの機能的剛性融合タンパク質を設計した。原理は、ケモカイン（具体的には、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１２による）、並びにインターロイキン、より具体的にはＩＬ－１型受容体インターロイキン、を含むサイトカインの２つのスーパーファミリーについて本明細書に例示されており、これらのスーパーファミリーはいずれも、かかるβストランドに基づく保存されたコアドメインを含むサイトカインを代表するものである。ケモカイン又はインターロイキンのその受容体への作用機序及び結合モードに応じて、これらの剛性融合タンパク質は、ケモカイン又はインターロイキン受容体の特定のかつ異なる立体構造状態に結合し、立体構造状態を固定する。これらの融合タンパク質は、事実上、拡大されたケモカイン又はインターロイキンリガンドを表し、ケモカイン又はインターロイキン複合体（例えば、その受容体との複合体）のタンパク質構造を決定するために有用であり、Ｘ線結晶学及びクライオ－ＥＭ用途を含むいくつかの用途に役立つ。Ｍｅｇａｋｉｎｅは、結合したコグネートサイトカイン受容体の立体構造的柔軟性を低下させ、結晶接触を形成しやすくする表面を伸長させることによって、並びにさらなる位相情報を提供することによって、次世代の結晶化シャペロンとして機能する。特定のＭｅｇａｋｉｎｅタンパク質をケモカイン又はインターロイキン特異的受容体と混合することによって、それらの特異的な結合相互作用は、「質量」付加をもたらし、受容体の特定の立体構造状態を固定する。
【0087】
このアプローチの概念の証明として、フォールディングされた足場タンパク質として、ＨｏｐＱ（Ｈ．ピロリ、ＰＤＢ ５ＬＰ２由来の周辺質タンパク質）の接着ドメインをコードする遺伝子の循環置換されたバリアント（ｃ７ＨｏｐＱ）を、ケモカインＣＣＬ５バリアント６Ｐ４（スーパーアゴニスト）図２（実施例１）のケモカインコアドメイン及びケモカインＣＸＣＬ１２（図１９）（実施例７）のケモカインコアドメインのβストランド２（β２）とβストランド３（β３）との間のβターンに挿入した。代替的に、インターロイキンＩＬ－１β（図２７）のβバレルコアモチーフ又はドメインのβストランド６（β６）とβストランド７（β７）との間のβターンに、前記ｃ７ＨｏｐＱ足場を挿入した（実施例１０）。さらに、ＣＣＬ５ケモカインについては、より大きな足場タンパク質である大腸菌Ｙｇｊｋ（ＰＤＢコード３Ｗ７Ｓ；Ｋｕｒａｋａｖａら、２００８）を使用して代替のＭｅｇａｋｉｎｅを生成し、このために前記ＭｅｇａｋｉｎｅとＣＣＬ５６Ｐ４との融合体を試験するために２つの循環置換されたバリアント（Ｃ１Ｙｇｊｋ及びＣ２Ｙｇｊｋ）を設計した（実施例８）。
【0088】
構築物は、Ｍｏｄｅｌｌｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｌａｂ．ｏｒｇ／ｍｏｄｅｌｌｅｒ／）を使用して設計し、異なるショートリンカーを用いて異なる融合体を作製した。
【0089】
異なるリンカーを含む、異なるいくつかの融合タンパク質構築物の酵母表面ディスプレイを実行し（実施例６、８、１０）、これにより、サイトカインに基づくＭｅｇａｋｉｎｅに関する異なる構築物の全てが、サイトカインリガンド特異的モノクローナル抗体に結合することができることが実証された（実施例２、９、及び１１）。これらの融合タンパク質を、酵母（実施例３）及び大腸菌の周辺質中（実施例４）の分泌タンパク質として発現させた。さらに、実施例５では、細胞に基づくアッセイに適用される精製されたタンパク質又は周辺質抽出物が、ＣＣＲ５受容体を活性化可能であり、さらにいくつかの例では、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインアゴニスト自体について観察されるレベルまで活性化可能であることを示す。
【0090】
［実施例１］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の設計及び生成。
【0091】
剛性融合タンパク質「Ｍｅｇａｋｉｎｅ」を取得する概念の第１の証明として、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインと呼ばれる改良されたＣＣＬ５ケモカインを、図２に従って６Ｐ４－ＣＣＬ５を足場に接続する２つのペプチド結合を介して大型足場タンパク質にグラフトさせて、剛性Ｍｅｇａｋｉｎｅを構築した。
【0092】
本明細書に記載の５０ｋＤａのＭｅｇａｋｉｎｅは、図２～６に従って接続されたケモカインの一部及び足場タンパク質の一部から連結されたキメラポリペプチドである。ここで使用したケモカインは、配列番号１に示されるＣＣＲ５ ＧＰＣＲのスーパーアゴニストに改変された、ＣＣケモカインのサブファミリーに属する、天然のＣＣＬ５リガンドに由来する６Ｐ４－ＣＣＬ５である（６Ｐ４－ＣＣＬ５は、アンタゴニストＣＣＬ５－５Ｐ７；Ｚｈｅｎｇら、２０１７；ＰＤＢコード ＣＣＬ５－５Ｐ７：５ＵＩＷの類似体である）。６Ｐ４－ＣＣＬ５のβストランド２及びβストランド３を接続するβ－ターンは、足場タンパク質への融合のために遮断された。足場タンパク質は、ＨｏｐＱと呼ばれるヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７（ＰＤＢ ５ＬＰ２；配列番号２）のアドヘシンドメインである（Ｊａｖａｈｅｒｉら、２０１６）。ＨｏｐＱのＮ末端及びＣ末端は、その他の場合では、結晶構造の電子密度において完全には見えないループとして現れる、循環置換領域中の７つのアミノ酸（ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる）のトランケーション後に、接続された。このトランケーションされた融合体は、ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントを生成し、アミノ酸配列内の切断は、その配列の別の場所（つまり、該足場タンパク質の露出された領域におけるアクセス可能な部位に相当する位置）で行われた。機能的Ｍｅｇａｋｉｎｅ融合タンパク質バリアントを設計するために、Ｍｏｄｅｌｅｒソフトウェアを使用するインシリコ分子モデリング（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｌａｂ．ｏｒｇ／ｍｏｄｅｌｌｅｒ）及び特注のＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用した。その結果、４つの低自由エネルギーＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＨｏｐＱモデルが生成され、これらのモデルでは、全ての部分が、次に示される順序で、アミノ（Ｎ－）末端からカルボキシ（Ｃ－）末端へ、ペプチド結合によって互いに接続されていた：
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１（配列番号３）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号；配列番号２１）。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ２（配列番号４）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、Ｔｈｒの１アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９４～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３（配列番号５）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９２～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号）。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号６）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１（配列番号３）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号；配列番号２１）。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ２（配列番号４）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、Ｔｈｒの１アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９４～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３（配列番号５）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９２～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号）。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号６）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ。
【0093】
［実施例２］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の酵母ディスプレイ。
【0094】
４つのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３～６）が、良好にフォールディングされた機能的なタンパク質として発現され得ることを実証するために、このタンパク質を酵母の表面にディスプレイさせた（Ｂｏｄｅｒ、１９９７）。６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン部分の適切なフォールディングを、機能的６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインに結合する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体、参照番号５１５５０６；抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７）を用いて調べた。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントを酵母上でディスプレイするために、標準的な方法を使用して、いくつかのアクセサリーペプチド及びタンパク質に融合したＭｅｇａｋｉｎｅをコードするオープンリーディングフレームを構築した（配列番号７～１０）：酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ、２００９）、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント、可撓性ペプチドリンカー、ｇａ１ｐタンパク質へのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する、酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニット、ディスプレイされた融合タンパク質の直交蛍光染色のためのアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、２００５）、続いてｃＭｙｃタグ。このオープンリーディングフレームを、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下で、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ、２００６）に入れ、酵母株ＥＢＹ１００に導入した。
【0095】
このプラスミドを保有するＥＢＹ１００酵母細胞を増殖させ、高濃度ガラクトース培地中で一晩誘導して、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の発現と分泌を誘発した。ＡＣＰの直交染色のために、蛍光標識ＣｏＡ類似体（ＣｏＡ－５４７、２μＭ）及び触媒量のＳＦＰ合成酵素（１μＭ）の存在下で、細胞を１時間インキュベートした。ディスプレイされたＭｅｇａｋｉｎｅの機能性を分析するために、フローサイトメトリーによって、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光標識抗ＣＣＬ５モノクローナル抗体（抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７）によって認識されるその能力を調べた。したがって、ＥＢＹ１００酵母細胞を誘導し、ＣｏＡ５４７と直交蛍光染色して、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体のディスプレイを観察した。次いで、これらの直交染色された酵母細胞を、異なる濃度の抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７（１５、３１、６２、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で１時間インキュベートした。これらの実験において、誘導された酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供して、ＣｏＡ５４７蛍光レベルを、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１；ＭｅｇａＢｏｄｙは、Ｍｅｇａｋｉｎｅに類似しているが、ケモカインの代わりに、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｎｂ）が、足場タンパク質に融合されており、ここではＧＦＰ特異的ＮｂとしてＮｂ２０７を有する）をディスプレイする酵母細胞と比較することによって、各細胞のＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベルを測定し、同じ方法で直交染色した。次に、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７の結合を、酵母の表面におけるＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱの発現レベルと直線的に相関しているはずの６４７蛍光レベルを調べることによって分析した。実際、二次元フローサイトメトリー分析により、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７（高６４７蛍光レベル）が、顕著なＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル（高ＣｏＡ５４７蛍光レベル）を有する酵母細胞にのみ結合することが確認された（図９及び図１０～１４）。対照的に、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７は、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１）をディスプレイし、同じ方法で染色されている酵母細胞に結合しない。
【0096】
これらの実験から、４つのＭｋ６Ｐ４
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３～６）が、酵母の表面に、良好にフォールディングされた機能的なキメラタンパク質として発現され得ると結論づける。
【0097】
［実施例３］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の酵母発現及び精製。
【0098】
酵母の表面に機能的Ｍｅｇａｋｉｎｅをディスプレイすることができたため、ＥＢＹ１００細胞におけるこれらの５０ｋＤａ融合タンパク質を可溶性分泌タンパク質として発現させることに取り組み、それらを均質に精製し、特性を決定した。
【0099】
４つのＭｅｇａｋｉｎｅ、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３～６）を発現させるために、標準的な方法を使用して、いくつかのアクセサリーペプチド及びタンパク質に融合したＭｅｇａｋｉｎｅをコードするオープンリーディングフレームを構築した（配列番号１２～１５）：酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ、２００９）、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ、及び翻訳を終了させる終止コドン。このオープンリーディングフレームを、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下で、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ、２００６）に入れ、酵母株ＥＢＹ１００に導入した。このプラスミドを保有するＥＢＹ１００酵母細胞を増殖させ、高濃度ガラクトース培地中で一晩誘導して、Ｍｋ６Ｐ４
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４バリアント（配列番号１２～１５）の発現及び分泌を３０℃で誘発した。組換えＭｅｇａｋｉｎｅ融合タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ（ＮｉＮＴＡ）ＦＦ ５ｍＬプレパックドカラムで培地から回収した。次に、５００ｍＭのイミダゾールを適用することによって、タンパク質をＮｉＮＴＡ樹脂から溶出させ、１０ｋＤａのカットオフを有するＮＭＷＬ（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ、公称分子量制限）フィルターを使用して遠心分離によって濃縮した（図１５～１６）。
【0100】
これらの実験から、数種のＭｋ６Ｐ４
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３～６）が、良好にフォールディングされた機能的キメラタンパク質として発現され、従来の精製方法によって精製され得ると結論づける。
【0101】
［実施例４］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の細菌発現及び精製。
【0102】
酵母の表面に機能的Ｍｅｇａｋｉｎｅをディスプレイし、酵母で可溶性タンパク質として発現させることができたため、この５０ｋＤａの融合タンパク質を大腸菌の周辺質で発現させることに取り組み、均質に精製し、その特性を決定した。大腸菌の周辺質中にＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントタンパク質（配列番号３～６）を発現させるために、標準的な方法を使用して、足場が６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２（β２）及びβストランド３（β３）を接続するβ－ターンに挿入され得る６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｍｅｇａｋｉｎｅの発現を可能にするベクターを構築した。このベクターは、ｐＭＥＳｙ４（Ｐａｒｄｏｎ、２０１４）の誘導体であり、以下のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む：大腸菌の周辺質へのＭｅｇａｋｉｎｅの分泌を指示するＤｓｂＡリーダー配列、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２までのＮ末端、この例ではＨｏｐＱの循環置換されたバリアント（ｃ７ＨｏｐＱ）がクローニングされているマルチプルクローニング部位、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ３からのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、及びＥＰＥＡタグ、続いてＡｍｂｅｒ終止コドン。任意の他の好適な足場を、このベクターのマルチクローニング部位でクローニングすることができる。
【0103】
大腸菌の周辺質中にＭｅｇａｋｉｎｅを発現させ、この組換えタンパク質を均質に精製するために、標準的な方法を使用して、ＤｓｂＡリーダー配列がｐＬａｃプロモーターの転写制御下で大腸菌の周辺質中の４つのＨｉｓタグ付き及びＥＰＥＡタグ付きＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号１６～１９）の発現を指示するベクターを構築した。ＷＫ６細菌細胞（ＷＫ６はｓｕ－非抑制株である）を３７℃で３リットルの２×ＴＹ培地で増殖させ、細胞が対数増殖期に達したときにＩＰＴＧによって誘導した。Ｈｉｓタグ付き及びＥＰＥＡタグ付きＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号１６～１９）の周辺質発現を、２８℃で一晩続けた。遠心分離によって細胞を採取し、組換えＭｅｇａｋｉｎｅを、浸透圧ショックを用いて周辺質から放出した（Ｐａｒｄｏｎら、２０１４）。次いで、組換えＭｅｇａｋｉｎｅを遠心分離によって原形質から分離し、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍＬプレパックドカラムで、清澄化した上清から回収した。次に、５００ｍＭのイミダゾールを適用することによってタンパク質をＮｉＮＴＡ樹脂から溶出させ、１０ｋＤａのカットオフを有するＮＭＷＬ（公称分子量制限）フィルターを使用して遠心分離によって濃縮した（図１７）。発現させて均質に精製したＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号２０）を、機能実験の対照として使用した。
【0104】
これらの実験から、大腸菌中のいくつかのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３～６）が、良好にフォールディングされた機能的なキメラタンパク質として発現され、従来の精製方法によって精製され得ると結論づける。
【0105】
［実施例５］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターン（４０ｓループ）に挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の機能性を確認する細胞に基づくアッセイ。
【0106】
Ｃ７ＨｏｐＱ足場に提示されるときの６Ｐ４－ＣＣＬ５の機能性／適切なフォールディングの保存を、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ ＭｅｇａｋｉｎｅバリアントがＣＣＬ５のコグネート受容体であるＣＣＲ５を活性化する能力によって評価した。活性は、スプリットＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＮａｎｏＢｉＴ－Ｐｒｏｍｅｇａ）の相補性（Ｄｉｘｏｎ ＡＳら、２０１６、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．）に基づいて、アゴニスト刺激後のＣＣＲ５へのβ－アレスチン－１又はｍｉｎｉＧｉ（Ｇαサブユニットの操作されたＧＴＰａｓｅドメイン；Ｗａｎら、２０１８）の動員を観察する細胞に基づくアッセイにおいて評価した。
【0107】
５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ培養皿に播種し、２４時間後、１５Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（ＧＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧ）によって分離されてＳｍＢｉＴ（ＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ）（ナノルシフェラーゼサブユニットＩ）にＣ末端融合されたヒトＣＣＲ５をコードするｐＮＢｅ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びに１５Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーに続いてＬｇＢｉＴ（ナノルシフェラーゼサブユニットＩＩ、１～１５６残基）にＮ末端融合されたヒトβ－アレスチン－１又はｍｉｎｉＧｉをコードするｐＮＢｅ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共トランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の細胞を採取し、３７℃で２５分間、１００倍希釈されたＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ基質とインキュベートし、５×１０４細胞／ウェルで白色９６ウェルプレートに分配した。Ｍｅｇａｋｉｎｅ添加時のＣＣＲ５へのβ－アレスチン－１又はｍｉｎｉＧｉの動員を、ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ相補性を介して評価し、このようにしてＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定される触媒活性回復を評価した。非精製周辺質抽出物及び酵母ディスプレイから選択された精製Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号１６～１９）の活性を、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）において産生された非精製組換え可溶性６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン（配列番号３３）の活性と、ｐＩＲＥＳ－ピューロマイシンベクターを使用したＣＭＶプロモーターの依存性下で比較した。
【0108】
６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインは、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントが、濃度依存的にβ－アレスチン－１及びｍｉｎｉＧｉのＣＣＲ５への動員を誘導する能力によって実証されるように、ｃ７ＨｏｐＱ足場のそのβ２－β３接続βストランドへの挿入に際し、その機能性を保持する（図１８）。
【0109】
［実施例６］ インビボ選択による、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された他の５０ｋＤａ融合タンパク質の設計及び生成。
【0110】
Ｍｅｇａｋｉｎｅのフォールディングの能力、さらに安定性及び剛性は、ケモカインを足場に接続するポリペプチド結合の組成及び長さに依存し得るため、必要に応じて特定のＭｅｇａｋｉｎｅフォーマットの微調整のためにインビトロ進化技術を導入した。実施例１に記載のＭｅｇａｋｉｎｅから出発して、可変長及び混合アミノ酸組成の２つのショートペプチドが図２に従ってケモカインを足場に接続する同様の設計を有するＭｅｇａｋｉｎｅをコードする、インビボ選択に適したライブラリを構築した。
【0111】
本明細書に記載の５０ｋＤａのＭｅｇａｋｉｎｅは、図２及び図３に従って接続されたケモカインの一部及び足場タンパク質の一部から連結されたキメラポリペプチドである。ここで使用したケモカインは、配列番号１に示される、ＣＣＲ５ ＧＰＣＲのアゴニストである６Ｐ４－ＣＣＬ５である（６Ｐ４－ＣＣＬ５は、アンタゴニストＣＣＬ５５Ｐ７；Ｚｈｅｎｇら、２０１７；ＰＤＢコードＣＣＬ５５Ｐ７：５ＵＩＷの類似体である）。６Ｐ４－ＣＣＬ５のβストランド２及びβストランド３を接続するβ－ターンは、足場タンパク質への融合のために遮断された。足場タンパク質は、ＨｏｐＱと呼ばれるヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７（ＰＤＢ：５ＬＰ２；配列番号２）のアドヘシンドメインである（Ｊａｖａｈｅｒｉら、２０１６）。ＨｏｐＱのＮ末端及びＣ末端は、その他の場合では、結晶構造の電子密度において完全には見えないループとして現れる、循環置換領域中の７つのアミノ酸（ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる）のトランケーション後に、接続された。このトランケーションされた融合体は、ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントを生成し、アミノ酸配列内の切断は、その配列の別の場所（つまり、該足場タンパク質の露出された領域におけるアクセス可能な部位に相当する位置）で行われた。全ての部分が、次に示される順序で、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ペプチド結合によって互いに接続されていた：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、ランダムな組成を有する１アミノ酸又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９５～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８３残基）、ランダムな組成を有する１アミノ酸又は２アミノ酸のペプチドリンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）。
【0112】
ケモカインを酵母上の足場に接続するリンカーの組成及び長さが異なる実施例１～５に記載のＭｅｇａｋｉｎｅの機能的バリアントをディスプレイ及び選択するために、標準的な方法を使用して、図７に従って、いくつかのアクセサリーペプチド及びタンパク質に融合した様々なＭｅｇａｋｉｎｅをコードするオープンリーディングフレームのライブラリを構築した（配列番号２５～２８）。酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ、２００９）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４４）、ランダムな組成を有する１アミノ酸又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９５～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８３残基）、ランダムな組成を有する１アミノ酸又は２アミノ酸のペプチドリンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、可撓性（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質へのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する、酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニット、ディスプレイされた融合タンパク質の直交蛍光染色のためのアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、２００５）、続いてｃＭｙｃタグ。このオープンリーディングフレームを、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下で、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ、２００６）に入れ、Ｍｅｇａｋｉｎｅの１７６４００個の異なるバリアントをコードする酵母ディスプレイライブラリを構築した（図７を参照）。
【0113】
インビトロ選択のために、このライブラリを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞を増殖させ、高濃度ガラクトース培地中で一晩誘導した。誘導された細胞を、ＳＦＰ合成酵素（１μＭ）を使用してｃｏＡ－５４７（２μＭ）と直交染色し、０．２５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光標識抗ＣＣＬ５モノクローナル抗体（抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７）とインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメータＦＡＣＳ分析に供して、高レベルでＭｅｇａｋｉｎｅ発現をディスプレイし（高ＣｏＡ－５４７蛍光）、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７に結合する（高Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光）酵母細胞を同定した。高レベルの抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７結合をディスプレイする細胞を、酵母ディスプレイ及び２パラメータＦＡＣＳ分析（図８）による後続ラウンドの選択に供するために、高濃度グルコース培地中で選別及び増幅した。
【0114】
２ラウンドの選択後、ＣｏＡ－５４７及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７チャネル内の代表的ないくつかの高蛍光細胞を単一コロニーとして増殖させ、ＤＮＡ配列決定に供して、ケモカインを足場タンパク質に接続する代表的ないくつかのペプチドリンカーの配列を決定した。１－１、１－２、２－１及び２－２アミノ酸ショートリンカーバリアントを有する各種のリンカーについて２つの代表的クローンを表１に示す。
【0115】
【表1】
【0116】
このことは、ケモカインと足場タンパク質との間の異なるショートペプチド接続が、酵母ディスプレイを用いたインビボ選択によってＭｅｇａｋｉｎｅライブラリから選択され得、酵母細胞の表面に機能的ケモカインキメラタンパク質としてディスプレイされ得ることを実証する。
【0117】
［実施例７］ ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ７ＨｏｐＱ足場から構築された５０ｋＤａ融合タンパク質の細菌発現及び精製。
【0118】
剛性融合タンパク質「Ｍｅｇａｋｉｎｅ」を得る概念の第２の証明として、ＣＸＣケモカインのサブファミリーに属するＣＸＣＬ１２ケモカインを、図２に従ってＣＸＣＬ１２を足場に接続する２つのペプチド結合を介して大型足場タンパク質上にグラフトさせて、剛性Ｍｅｇａｋｉｎｅを構築した。
【0119】
本明細書に記載の５０ｋＤａのＭｅｇａｋｉｎｅは、図２及び図３に従って接続されたケモカインの一部及び足場タンパク質の一部から連結されたキメラポリペプチドである。ここで使用したケモカインは、配列番号２２（ＰＤＢコード：３ＨＰ３）に示される、ＣＸＣＲ４ ＧＰＣＲ及びＡＣＫＲ３ ＧＰＣＲに結合し、活性化する、ＳＤＦ－１とも呼ばれるＣＸＣＬ１２である。足場タンパク質を、ＣＸＣＬ１２のβストランド２及びβストランド３を接続するβ－ターンに挿入した。足場タンパク質は、ＨｏｐＱと呼ばれるヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７（ＰＤＢ ５ＬＰ２；配列番号２）のアドヘシンドメインである（Ｊａｖａｈｅｒｉら、２０１６）。ＨｏｐＱのＮ末端及びＣ末端は、その他の場合では、結晶構造の電子密度において完全には見えないループとして現れる、循環置換領域中の７つのアミノ酸（ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる）のトランケーション後に、接続された。このトランケーションされた融合体は、ｃ７ＨｏｐＱと呼ばれる、ＨｏｐＱの循環置換されたバリアントを生成し、アミノ酸配列内の切断は、その配列の別の場所（つまり、該足場タンパク質の露出された領域におけるアクセス可能な部位に相当する位置）で行われた。実施例１と同様に、全ての部分が以下のように接続される、低自由エネルギーのＭｋＣＸＣＬ１２
ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号２３）が生成された：ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号２２の１～４３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９２～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８４残基）、ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号２２の４５～６８）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号）。
【0120】
この５０ｋＤａ融合タンパク質を、大腸菌の周辺質中に発現させることに取り組み、均質に精製し、その特性を決定した。大腸菌の周辺質中でＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＣＸＣＬ１２
ｃ７ＨｏｐＱを発現させるために、標準的な方法を使用して、ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランド２（β２）及びβストランド３（β３）を接続するβターンに足場が挿入され得るＣＸＣＬ１２ Ｍｅｇａｋｉｎｅの発現を可能にするベクターを構築した。このベクターは、ｐＭＥＳｙ４（Ｐａｒｄｏｎ、２０１４）の誘導体であり、以下のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む：大腸菌の周辺質へのＭｅｇａｋｉｎｅの分泌を指示するＤｓｂＡリーダー配列、ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランドβ２までのＮ末端、この例ではＨｏｐＱの循環置換されたバリアント（ｃ７ＨｏｐＱ）がクローニングされているマルチプルクローニング部位、ＣＸＣＬ１２ケモカインのβストランドβ３からのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、及びＥＰＥＡタグ、続いてＡｍｂｅｒ終止コドン（配列番号２４）。任意の他の好適な足場を、このベクターのマルチクローニング部位でクローニングすることができる。ＭｋＣＸＣＬ１２
ｃ７ＨｏｐＱ発現は、実施例４に記載のとおりである。
【0121】
［実施例８］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたＹｇｊＫ足場から構築された９４ｋＤａ融合タンパク質の設計及び生成。
【0122】
ｃ７ＨｏｐＱ（実施例１～６）にグラフトされた６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインからの最初のＭｅｇａｋｉｎｅの成功した設計に基づいて、より大きな足場タンパク質に接続されたケモカインから構築される他のＭｅｇａｋｉｎｅ設計の開発も試みた。
【0123】
本明細書に記載の９４ｋＤａのＭｅｇａｋｉｎｅは、図２に従って接続されたケモカインの一部及び足場タンパク質の一部から連結されたキメラポリペプチドである。ここで使用したケモカインは、先の実施例で使用された、及び配列番号１に示される６Ｐ４－ＣＣＬ５である。６Ｐ４－ＣＣＬ５のβストランド２及びβストランド３を接続するβ－ターンは、足場タンパク質への融合のために遮断された。足場タンパク質は、ＹｇｊＫと呼ばれる大腸菌の８６ｋＤＡ周辺質タンパク質（ＰＤＢコード３Ｗ７Ｓ、配列番号３４）である（Ｋｕｒａｋａｖａら、２００８）。ＹｇｊＫの三次構造では、表面アクセス可能なβターンを有する２つの逆平行βストランドであるβターンＡ’Ｓ１－Ａ’Ｓ２及びβターンＮＳ６－ＮＳ７が同定された。トポロジーが（異なって）遮断される９４ｋＤａ ＭＷの別個のＭｅｇａｋｉｎｅを生成するために、これらの２つのβターンをトランケートし、追加の循環置換を導入して、２つの足場タンパク質を生成した：
ｃ１ＹｇｊＫ（配列番号３６）：ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３４の４６４～７６０残基）、ＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端とを接続して、足場タンパク質の循環置換体（circularly permutant）を作製するショートペプチドリンカー（配列番号３５）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３４の１～４６１残基）、
ｃ２ＹｇｊＫ（配列番号３７）：ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３４の１０５～７６０残基）、ＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端とを接続して、足場タンパク質の循環置換体を作製するショートペプチドリンカー（配列番号３５）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３４の１～１０２残基）。
ｃ１ＹｇｊＫ（配列番号３６）：ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３４の４６４～７６０残基）、ＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端とを接続して、足場タンパク質の循環置換体（circularly permutant）を作製するショートペプチドリンカー（配列番号３５）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３４の１～４６１残基）、
ｃ２ＹｇｊＫ（配列番号３７）：ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３４の１０５～７６０残基）、ＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端とを接続して、足場タンパク質の循環置換体を作製するショートペプチドリンカー（配列番号３５）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３４の１～１０２残基）。
【0124】
機能的Ｍｅｇａｋｉｎｅ融合タンパク質バリアントを設計するために、アクセス可能な結晶構造（ＰＤＢコードＣＣＬ５－５Ｐ７：５ＵＩＷ、ＰＤＢコードＹｇｊＫ：３Ｗ７Ｓ）を使用してインシリコ分子モデリングを実行した。その結果、３つのＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫモデル及び２つのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫモデルが生成され、これらのモデルでは、全ての部分が、次に示される順序で、アミノ（Ｎ－）末端からカルボキシ（Ｃ－）末端へ、ペプチド結合によって互いに接続されていた：
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ１（配列番号３８、図２０）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ２（配列番号３９、図２１）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ３（配列番号４０、図２２）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ１（配列番号４１、図２３）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３７）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ３（配列番号４２、図２４）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３７）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）。
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ１（配列番号３８、図２０）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ２（配列番号３９、図２１）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ３（配列番号４０、図２２）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３６）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ１（配列番号４１、図２３）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３７）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）、
Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ３（配列番号４２、図２４）：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド２までのＮ末端（配列番号１の１～４５）、ｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質（配列番号３７）、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランド３から末端までのＣ末端部分（配列番号１の４７～６９）。
【0125】
［実施例９］ ６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのβストランドβ２－β３接続βターンに挿入されたｃ１ＹｇｊＫ及びｃ２Ｙｇｊｋ足場から構築された９４ｋＤａ融合タンパク質の酵母ディスプレイ。
【0126】
これらの５つのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３バリアント及びＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３８～４２）が、正しくフォールディングされた機能的なタンパク質として発現され得ることを実証するために、これらのタンパク質を、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントについて実施されたように（実施例２）、酵母の表面にディスプレイした（Ｂｏｄｅｒ、１９９７）。６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン部分の適切なフォールディングを、機能的６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインに結合する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）抗体、参照番号５１５５０６；抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７）を用いて調べた。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３バリアント及びＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントを酵母上でディスプレイするために、標準的な方法を使用して、酵母ディスプレイのためのいくつかのアクセサリーペプチド及びタンパク質に融合したＭｅｇａｋｉｎｅをコードするオープンリーディングフレームを構築した（配列番号４３～４７）：酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ、２００９）、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫ又はＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント、可撓性ペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質へのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する、酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニット、ディスプレイされた融合タンパク質の直交蛍光染色のためのアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、２００５）、続いてｃＭｙｃタグ。このオープンリーディングフレームを、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下で、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ、２００６）に入れ、酵母株ＥＢＹ１００に導入した。
【0127】
このプラスミドを保有するＥＢＹ１００酵母細胞を増殖させ、高濃度ガラクトース培地中で一晩誘導して、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の発現及び分泌を誘発した。ＡＣＰの直交染色のために、蛍光標識ＣｏＡ類似体（ＣｏＡ－５４７、２μＭ）及び触媒量のＳＦＰ合成酵素（１μＭ）の存在下で、細胞を１時間インキュベートした。ディスプレイされたＭｅｇａｋｉｎｅの機能性を分析するために、フローサイトメトリーによって、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光標識抗ＣＣＬ５モノクローナル抗体（抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７）によって認識されるその能力を調べた。したがって、ＥＢＹ１００酵母細胞を誘導し、ＣｏＡ５４７と直交蛍光染色して、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体のディスプレイを観察した。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４（配列番号１０、実施例２）を示す酵母細胞を、追加の陽性対照として使用した。次いで、これらの直交染色された酵母細胞を、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７（８０ｎｇ／ｍＬの濃度）の存在下で１時間インキュベートした。これらの実験では、誘導酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供して、ＣｏＡ５４７蛍光レベルを、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１；ＭｅｇａＢｏｄｙは、Ｍｅｇａｋｉｎｅに類似しているが、ケモカインの代わりに、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｎｂ）が、足場タンパク質に融合されており、ここではＧＦＰ特異的ＮｂとしてＮｂ２０７を有する）をディスプレイする酵母細胞と比較することによって、各細胞のＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベルを測定し、同じ方法で直交染色した。実際、５つのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫバリアント全てについて、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の定量化されたディスプレイレベルは、およそ７０％であった（図２５）。
【0128】
次に、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７の結合を、酵母の表面におけるＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１／２ＹｇｊＫバリアントの発現レベルと直線的に相関しているはずの６４７蛍光レベルを調べることによって分析した。二次元フローサイトメトリー分析によって、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７（高６４７蛍光レベル）が、顕著なＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル（高ＣｏＡ５４７蛍光レベル）を有する酵母細胞にのみ結合することが確認された。Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１（配列番号４６）及びＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ３（配列番号４７）についての線形適合度が最大であり、これはおそらく抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７によって認識されるエピトープのアクセス可能性が最良であることによる（図２６）。対照的に、抗ＣＣＬ５－ｍＡｂ６４７は、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１、陰性対照としてのＧＦＰ特異的ＭｅｇａＢｏｄｙ）をディスプレイし、同じ方法で染色されている酵母細胞に結合しない。
【0129】
これらの実験から、２つの異なる融合足場を有する５つのＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１～Ｖ３及びＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１／Ｖ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号３８～４２）の全てが、酵母の表面に、良好にフォールディングされた機能的なキメラタンパク質として発現され得ると結論づける。
【0130】
［実施例１０］ ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６－β７接続βターンに挿入されたＨｏｐＱ足場から構築された５８ｋＤａ融合タンパク質の設計及び生成。
【0131】
ｃ７ＨｏｐＱ（実施例１～７）及びｃ１ＹｇｊＫ／ｃ２Ｙｇｊｋ（実施例８及び９）足場にグラフトされた６Ｐ４－ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１２ケモカインからの最初のＭｅｇａｋｉｎｅの成功した設計に基づいて、より大きな足場に接続された別のクラスのサイトカイン、特にインターロイキンから構築される他のＭｅｇａｋｉｎｅ設計の開発も試みた。
【0132】
本明細書に記載の５８ｋＤａのＭｅｇａｋｉｎｅは、図２７に従って接続されたインターロイキンの一部及び足場タンパク質の一部から連結されたキメラポリペプチドである。ここで使用したインターロイキンは、ＩＬ－１受容体Ｉ型（ＩＬ－１ＲＩ）及びＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡｃＰ）（ＰＤＢ ３Ｏ４Ｏ、Ｗａｎｇら、２０１０）を介してその効果を発揮するインターロイキンのサブファミリーに属するヒトＩＬ－１β（配列番号４８）である。機能的ＩＬ－１β・ＩＬ－１ＲＩ・ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体において、ＩＬ－１のβストランドβ６及びβストランドβ７を接続するβ－ターンは、溶媒に露出され、したがって、足場タンパク質融合のためにアクセス可能である（図２８）。足場タンパク質は、６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインに基づくＭｅｇａｋｉｎｅを生成するために使用したｃ７ＨｏｐＱ足場である（実施例１～６）。機能的ＭｋＩＬ－１βｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅ融合タンパク質バリアントを設計するために、アクセス可能な結晶構造を使用してインシリコ分子モデリング（ＰＤＢコードＩＬ－１β：３Ｏ４Ｏ、ＰＤＢコードＨｏｐＱ：５ＬＰ２）を実行した。その結果、３つのＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱモデルが生成され、これらのモデルでは、全ての部分が、次に示される順序で、アミノ（Ｎ－）末端からカルボキシ（Ｃ－）末端へ、ペプチド結合によって互いに接続されていた：
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１（配列番号４９、図２９）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）、
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ２（配列番号５０、図３０）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）、
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ３（配列番号５１、図３１）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）。
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１（配列番号４９、図２９）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙの２アミノ酸リンカー、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）、
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ２（配列番号５０、図３０）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、Ｇｌｙの１アミノ酸リンカー、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）、
ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ３（配列番号５１、図３１）：ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６までのＮ末端（配列番号４８の１～７３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号２の１９３～４１１残基）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号２の１８～１８５残基）、ヒトＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ７由来のＣ末端部分（配列番号４８の７８～１５３）。
【0133】
［実施例１１］ ＩＬ－１βインターロイキンのβストランドβ６－β７接続βターンに挿入されたＨｏｐＱ足場から構築された５８ｋＤａ融合タンパク質の酵母ディスプレイ。
【0134】
３つのＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（配列番号４９～５１）が、正しくフォールディングされた機能的なタンパク質として発現され得ることを実証するために、Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（実施例２）及びＭｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃＹｇｊｋＡ／Ｂ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント（実施例９）について実行されたように、これらのタンパク質の酵母表面ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ、１９９７）が必要である。ＩＬ－１βインターロイキン部分の適切なフォールディングは、機能的ＩＬ－１βインターロイキンに結合する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＩＬ－１β抗体（ＣＲＭ４６）、参照番号５１－７０１８－４２）を使用して調べることができる。ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ１～Ｖ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアントを酵母上でディスプレイするために、いくつかのアクセサリーペプチド及びタンパク質に融合したＭｅｇａｋｉｎｅ（配列番号５２～５４）をコードするオープンリーディングフレームを構築するための標準的な方法が使用される：酵母における細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ、２００９）、ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱ Ｍｅｇａｋｉｎｅバリアント、可撓性ペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質へのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する、酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニット、ディスプレイされた融合タンパク質の直交蛍光染色のためのアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、２００５）、続いてｃＭｙｃタグ。このオープンリーディングフレームを、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下で、ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ、２００６）にクローニングし、酵母株ＥＢＹ１００に導入する。このプラスミドを保有するＥＢＹ１００酵母細胞を増殖させ、高濃度ガラクトース培地中で一晩誘導して、ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の発現と分泌を誘発する。ＡＣＰの直交染色のために、先の実施例に示されるように、蛍光標識ＣｏＡ類似体（ＣｏＡ－５４７、２μＭ）及び触媒量のＳＦＰ合成酵素（１μＭ）の存在下で、細胞を１時間インキュベートする。ディスプレイされたＭｅｇａｋｉｎｅの機能性を分析するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光標識ＩＬ－１βモノクローナル抗体（抗ヒトＩＬ－１β抗体ＣＲＭ４６）によって認識されるその能力を、フローサイトメトリーによって観察する。したがって、ＥＢＹ１００酵母細胞を誘導し、ＣｏＡ５４７と直交蛍光染色して、ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体のディスプレイを観察する。ＩＬ－１βインターロイキン（配列番号５５）をディスプレイする酵母細胞は、追加の陽性対照を形成する。次に、これらの直交染色された酵母細胞を、抗ヒトＩＬ－１β抗体ＣＲＭ４６（８０ｎｇ／ｍＬの濃度）の存在下で１時間インキュベートする。これらの実験では、誘導酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供して、ＣｏＡ５４７蛍光レベルを、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１；ＭｅｇａＢｏｄｙは、Ｍｅｇａｋｉｎｅに類似しているが、インターロイキンの代わりに、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｎｂ）が、足場タンパク質に融合されており、ここではＧＦＰ特異的ＮｂとしてＮｂ２０７を有する）をディスプレイする酵母細胞と比較することによって、各細胞のＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベルを測定し、同じ方法で直交染色する。次に、抗ヒトＩＬ－１β抗体ＣＲＭ４６の結合を、酵母の表面におけるＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱバリアントの発現レベルと直線的に相関しているはずの６４７蛍光レベルを調べることによって分析し得る。二次元フローサイトメトリー分析により、抗ヒトＩＬ－１β抗体ＣＲＭ４６（高６４７蛍光レベル）が、顕著なＭｅｇａｋｉｎｅディスプレイレベル（高ＣｏＡ５４７蛍光レベル）を有する酵母細胞にのみ結合することが確認された。対照的に、抗ヒトＩＬ－１β抗体ＣＲＭ４６は、ＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７
ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体（配列番号１１）をディスプレイし、同じ方法で染色されている酵母細胞に結合しない。
【0135】
配列表
＞配列番号１：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン
＞配列番号２：ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７ ＨｏｐＱアドヘシンドメインタンパク質（ＰＤＢ ５ＬＰ２）
＞配列番号３：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
＞配列番号１：６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン
＞配列番号２：ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７ ＨｏｐＱアドヘシンドメインタンパク質（ＰＤＢ ５ＬＰ２）
＞配列番号３：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0136】
【化1】
【0137】
＞配列番号４：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ２ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、Ｔショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、Ｔショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0138】
【化2】
【0139】
＞配列番号５：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0140】
【化3】
【0141】
＞配列番号６：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ４ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0142】
【化4】
【0143】
＞配列番号７：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0144】
【化5】
【0145】
＞配列番号８：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ２＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
＞配列番号９：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
＞配列番号１０：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
＞配列番号１１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
＞配列番号９：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
＞配列番号１０：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
＞配列番号１１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0146】
【化6】
【0147】
＞配列番号１２：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ１酵母分泌タンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0148】
【化7】
【0149】
＞配列番号１３：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ２酵母分泌タンパク質配列
＞配列番号１４：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３酵母分泌タンパク質配列
＞配列番号１５：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４酵母分泌タンパク質配列
＞配列番号１６：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１タンパク質配列
（ＤｓｂＡリーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
＞配列番号１４：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３酵母分泌タンパク質配列
＞配列番号１５：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４酵母分泌タンパク質配列
＞配列番号１６：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１タンパク質配列
（ＤｓｂＡリーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ１、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0150】
【化8】
【0151】
＞配列番号１７：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱＶ２タンパク質配列
＞配列番号１８：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３タンパク質配列
＞配列番号１９：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４タンパク質配列
＞配列番号２０：ＤｓｂＡ＿ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ ＭｅｇａＢｏｄｙ
（ＤｓｂＡリーダー配列、太字で示されたＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
＞配列番号１８：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ３タンパク質配列
＞配列番号１９：ＤｓｂＡ＿Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱＶ４タンパク質配列
＞配列番号２０：ＤｓｂＡ＿ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ ＭｅｇａＢｏｄｙ
（ＤｓｂＡリーダー配列、太字で示されたＭｅｇａＢｏｄｙ ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグ）
【0152】
【化9】
【0153】
＞配列番号２１：親和性タグ（米国特許第９５１８０８４Ｂ２号）
＞配列番号２２：ＣＸＣＬ１２ケモカイン（ヒト）
＞配列番号２３：ＭｋＣＸＣＬ１２ ｃ７ＨｏｐＱタンパク質配列
（太字で示されたＣＸＣＬ、通常の字体のｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、点線で下線が付されたＥＰＥＡタグ）
＞配列番号２２：ＣＸＣＬ１２ケモカイン（ヒト）
＞配列番号２３：ＭｋＣＸＣＬ１２ ｃ７ＨｏｐＱタンパク質配列
（太字で示されたＣＸＣＬ、通常の字体のｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、点線で下線が付されたＥＰＥＡタグ）
【0154】
【化10】
【0155】
＞配列番号２４：ＤｓｂＡ－ＭｋＣＸＣＬ１２
ｃ７ＨｏｐＱタンパク質配列
（下線が付されたＤｓｂＡリーダー配列、ＭｋＣＸＣＬ１２ ｃ７ＨｏｐＱ：太字で示されたＣＸＣＬ１２、通常の字体のｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、点線で下線が付されたＥＰＥＡタグ）
（下線が付されたＤｓｂＡリーダー配列、ＭｋＣＸＣＬ１２ ｃ７ＨｏｐＱ：太字で示されたＣＸＣＬ１２、通常の字体のｃ７ＨｏｐＱ、６×Ｈｉｓタグ、点線で下線が付されたＥＰＥＡタグ）
【0156】
【化11】
【0157】
＞配列番号２５：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱランダムリンカー
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0158】
【化12】
【0159】
＞配列番号２６：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱランダムリンカー
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーであり、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーであり、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0160】
【化13】
【0161】
＞配列番号２７：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱランダムリンカー
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーであり、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーであり、Ｘは１ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0162】
【化14】
【0163】
＞配列番号２８：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱランダムリンカー
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱ ＹＤ１、ＸＸは２ＡＡでランダムな組成のショートペプチドリンカーである、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0164】
【化15】
【0165】
＞配列番号２９／３１：Ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ７ＨｏｐＱの酵母ディスプレイライブラリに１アミノ酸長のショートペプチドリンカーを導入するためのフォワード／リバースプライマー
＞配列番号３０／３２：Ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱの酵母ディスプレイライブラリーに２アミノ酸長のショートペプチドリンカーを導入するためのフォワード／リバースプライマー
＞配列番号３３：ＳＳ－６Ｐ４－ＣＣＬ５
哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）における産生のための組換え可溶性６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン（下線が付されたＳｅｑシグナル、６Ｐ４配列（配列番号１の）、ＣＣＬ５）
＞配列番号３０／３２：Ｍｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ７ＨｏｐＱの酵母ディスプレイライブラリーに２アミノ酸長のショートペプチドリンカーを導入するためのフォワード／リバースプライマー
＞配列番号３３：ＳＳ－６Ｐ４－ＣＣＬ５
哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）における産生のための組換え可溶性６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカイン（下線が付されたＳｅｑシグナル、６Ｐ４配列（配列番号１の）、ＣＣＬ５）
【0166】
【化16】
【0167】
＞配列番号３４：大腸菌Ｙｇｊｋタンパク質（ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ）
＞配列番号３５：ｃＹｇｊｋ循環置換リンカーペプチド
＞配列番号３６：ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ）（下線が付されたＹｇｊＫ配列、斜体の循環置換リンカー）
＞配列番号３５：ｃＹｇｊｋ循環置換リンカーペプチド
＞配列番号３６：ｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質（ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ）（下線が付されたＹｇｊＫ配列、斜体の循環置換リンカー）
【0168】
【化17】
【0169】
＞配列番号３７：ｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質（ＰＤＢ ３Ｗ７Ｓ）（下線が付されたＹｇｊＫ配列、斜体の循環置換リンカー）
【0170】
【化18】
【0171】
＞配列番号３８：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
【0172】
【化19】
【0173】
＞配列番号３９：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ２ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、Ｇショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、Ｇショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、Ｇショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、Ｇショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
【0174】
【化20】
【0175】
＞配列番号４０：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたｃ１ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
【0176】
【化21】
【0177】
＞配列番号４１：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
【0178】
【化22】
【0179】
＞配列番号４２：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
（６Ｐ４－ＣＣＬ５－ケモカインのＮ末端、下線が付されたｃ２ＹｇｊＫ足場タンパク質配列、太字の６Ｐ４－ＣＣＬ５ケモカインのＣ末端）
【0180】
【化23】
【0181】
＞配列番号４３：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ１＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0182】
【化24】
【0183】
＞配列番号４４：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ２＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ２、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ２、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0184】
【化25】
【0185】
＞配列番号４５：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ１ＹｇｊＫＶ３＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ１ＹｇｊＫＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0186】
【化26】
【0187】
＞配列番号４６：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ１＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0188】
【化27】
【0189】
＞配列番号４７：Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５
ｃ２ＹｇｊＫＶ３＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ Ｍｋ６Ｐ４－ＣＣＬ５ ｃ２ＹｇｊＫＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0190】
【化28】
【0191】
＞配列番号４８：ヒトＩＬ－１βの成熟形態
＞配列番号４９：ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
＞配列番号４９：ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、ＧＧショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、ＧＧショートペプチドリンカー、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
【0192】
【化29】
【0193】
＞配列番号５０：ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ２ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、Ｇショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、Ｇショートペプチドリンカー、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、Ｇショートペプチドリンカー、下線が付されたＨｏｐＱ配列、Ｇショートペプチドリンカー、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
【0194】
【化30】
【0195】
＞配列番号５１：ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ３ Ｍｅｇａｋｉｎｅ
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
（ＩＬ－１βインターロイキンのＮ末端、下線が付されたＨｏｐＱ配列、太字のＩＬ－１βインターロイキンのＣ末端）
【0196】
【化31】
【0197】
＞配列番号５２：ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ１＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ１、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0198】
【化32】
【0199】
＞配列番号５３：ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ２＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ２、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ２、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0200】
【化33】
【0201】
＞配列番号５４：ＭｋＩＬ－１β
ｃ７ＨｏｐＱＶ３＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＭｅｇａｋｉｎｅ ＭｋＩＬ－１β ｃ７ＨｏｐＱＶ３、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0202】
【化34】
【0203】
＞配列番号５５：ＩＬ－１β＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＩＬ－１β、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
（ａｐｐＳ４リーダー配列、太字で示されたＩＬ－１β、可撓性（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカー、下線が付されたＡｇａ２ｐタンパク質配列、二重下線が付されたＡＣＰ配列、ｃＭｙｃタグ）
【0204】
【化35】
【0205】
参考文献
【0206】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図25-3】
【図25-4】
【図26-1】
【図26-2】
【図26-3】
【図26-4】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】