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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(54)【発明の名称】合成マイクロＲＮＡミミック
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220209BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220209BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220209BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220209BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20220209BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220209BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220209BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/6851 Z
A61P7/00
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021536098
(86)(22)【出願日】2019-12-19
(85)【翻訳文提出日】2021-08-16
(86)【国際出願番号】 FI2019050906
(87)【国際公開番号】W WO2020128163
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】20186118
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521268107
【氏名又は名称】アールネイティブズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＮａｔｉｖｅｓ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】トゥルネン，ミッコ ペトリ
(72)【発明者】
【氏名】トゥルネン，ティーア アンニカ
(72)【発明者】
【氏名】ユラ－ヘルットゥアラ，セッポ
(72)【発明者】
【氏名】ライティネン，ピア
(72)【発明者】
【氏名】ヴァーナネン，マリ－アンナ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS36
4B065AA91X
4B065AA93
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA00
4B065CA23
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA24
4C084MA02
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZA36
(57)【要約】
本発明は心臓血管疾患の処置に関する。特に、本発明は、処置および診断適用における使用を包含する、さまざまな適用における、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦＤ）および／または低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）の遺伝子発現調節における使用のためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子に関する。ＶＥＧＦＡは、成長期の個体および成熟個体の両方において広範な機能を有する。ＶＥＧＦＡは、よく知られる血管新生の重要な調節因子であり、癌の発症および転移にも関与する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補配列との配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項2】
シード配列がＧＡＵＧＵＧＵ、ＵＡＣＡＵＡＣ、またはＵＧＵＡＵＧＵＧを含む、請求項１に記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項3】
前記核酸分子が１４～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１または２に記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項4】
前記核酸分子が、標的遺伝子のプロモーター領域または３’ＵＴＲに結合する、請求項１～３のいずれかに記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項5】
標的遺伝子が、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤまたはＨＩＦ１Ａである、請求項４に記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項6】
標的遺伝子がＶＥＧＦＡである、請求項５に記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項7】
心臓血管疾患の処置に使用するためのものである、請求項１～６のいずれかに記載の合成ｍｉＲＮＡ分子。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載される合成ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つ、および担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項9】
担体または賦形剤が、医療処置適用に適当な薬学的に許容しうる担体または賦形剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
心臓血管疾患の処置に使用するためのものである、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～７のいずれかに記載される合成ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１つを含む組換え発現ベクター。
【請求項12】
請求項１１に記載される組換え発現ベクターを含む細胞。
【請求項13】
請求項１～７のいずれかに記載される合成ｍｉＲＮＡ分子を投与することを含む、ヒトにおいて標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項14】
標的遺伝子の発現を増加させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
方法が、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡの少なくとも１つを有効量で対象に投与することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
対象が心臓血管疾患のリスクを有するまたは心臓血管疾患を患っているかを決定するための、以下のステップを含む方法：（Ａ）心臓血管疾患が疑われる個体のサンプルを提供し；
（Ｂ）場合により、前記サンプルからＲＮＡを抽出し；
（Ｃ）ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定する；ここで、対照サンプルと比較して低いｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルは、心臓血管疾患が存在することまたは心臓血管疾患の素因があることを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は心臓血管疾患の処置に関する。特に、本発明は、処置および診断適用における使用を包含する、さまざまな適用における、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦＤ）および／または低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）の遺伝子発現調節における使用のためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子に関する。ＶＥＧＦＡは、成長期の個体および成熟個体の両方において広範な機能を有する。ＶＥＧＦＡは、よく知られる血管新生の重要な調節因子であり、癌の発症および転移にも関与する。
【背景技術】
【0002】
心臓血管疾患（ＣＶＤ）は世界的に上位の死因の１つであり、死亡数は、人口の高齢化および平均余命の延長により、将来増加すると予測される（Top 10 causes of death, WHO, 2017）。ＣＶＤは、心臓および血管が関与する広範な疾患群を包含し、したがって、基礎となる病因のメカニズムは、疾患によってさまざまである。しかしながら、多くの心臓血管疾患が、徐々に進行するかまたは急性の血管閉塞という、共通の基礎的特徴を示す。血管が閉塞すると、組織への酸素供給が障害され、組織は生存のため間に合うように低酸素条件に適応せざるを得なくなる。しかしながら、この適応のプロセスは、血管新生による新たな側副血管の成長を伴い、それには長い生理学的時間を要する。
【0003】
血管新生は高度に調節されたプロセスであり、盛んに研究されているものの、その調節メカニズムは未だ完全には理解されていない。すべての生きた細胞は、低酸素のような新たな環境条件に、生存を確保しうる適切な遺伝子のセットを転写することによって適応する。遺伝子発現は高度に制御されたイベントであり、転写および転写後レベルで調節メカニズムがはたらく。酸素供給が不足する場合に、細胞においてアップレギュレートされる最も重要な遺伝子の１つは、ＶＥＧＦＡである。この遺伝子は高度に複雑な調節を有することが報告されている。低酸素条件下の組織においてＶＥＧＦＡがアップレギュレートされると、それは血管新生、脈管形成および内皮細胞増殖を促進する。ＶＥＧＦＡタンパク質が細胞外に分泌され、その作用を仲介する２つの異なる受容体ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に作用するパラクリンおよびオートクリン作用を示すことが知られている。ＶＥＧＦＡ遺伝子発現調節の不均衡は、虚血性または悪性疾患の原因となり、また、生理学的および病理学的血管新生の両方に関わる。例えば、癌において、ＶＥＧＦＡアップレギュレーションは予後不良に関連付けられている。血管新生の局所的調節を可能にしうる新たな治療法を開発するために、ＶＥＧＦＡの転写調節メカニズムの解明が必要とされている。
【0004】
ＶＥＧＦＡは、転写および転写後の多くの異なるレベルで調節されることが知られている。第一に、異なる転写物バリアントの異なるスプライシングによって、多様なアイソフォームが生じる。第二に、転写後レベルにおいて、ＶＥＧＦＡメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性は、低酸素といったエフェクターによって、安定化および脱安定化タンパク質の結合を介して調節される。第三に、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、古典的な代謝産物相互作用性のリボスイッチではなく、その安定性を調節するタンパク質と結合後にコンフォメーション変化を受けるタンパク質依存性リボスイッチとしてはたらくことが最近発見された。第四に、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの翻訳は、塩基対形成メカニズムによって３’ＵＴＲを標的とし遺伝子サイレンシングを誘導するｍｉＲＮＡによって高度に制御される。これらの異なるレベルの調節は、ＶＥＧＦＡバリアントの発現の微細な調整において協働する。
【0005】
ＶＥＧＦＤは、構造的に関連するタンパク質のＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーのもう１つのメンバーで、強力な血管新生性サイトカインである。これは内皮細胞増殖を促進し、リンパ管新生を促進し、血管透過性にも影響しうる。
【0006】
ＨＩＦ－１αとしても知られるＨＩＦ１Ａは、ＨＩＦ１Ａ遺伝子によってコードされる、ヘテロ二量体転写因子の低酸素誘導因子１（ＨＩＦ－１）のサブユニットである。これは、低酸素に対する細胞および発生反応のマスター転写調節因子であると考えられる。低酸素または遺伝子変異によるＨＩＦ１Ａの調節不全および過剰発現は、癌生物学および他の多くの病理生理学に、特に脈管化および血管新生、エネルギー代謝、細胞生存ならびに腫瘍浸潤の領域のものに、大きく関係付けられている。
【0007】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）は、それが標的とする遺伝子のタンパク質発現に、転写物切断または翻訳阻害により影響する、内因性の、典型的にはヌクレオチド数が１９～２２である、ノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムにコードされる短鎖ＲＮＡ群で、多くはタンパク質コーディング遺伝子（ホスト遺伝子）のイントロンまたはエクソン領域内にコードされる。ホスト遺伝子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるとき、それにコードされるｍｉＲＮＡが同じ傾向にしたがうという、ｍｉＲＮＡとそのホスト遺伝子の間の機能的関連性を示す証拠が増えつつある。さらに、ｍｉＲＮＡは複雑な生合成を有する：これはまず、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）によって転写されて一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を生じる。次いで、高度に保存されたＤｒｏｓｈａタンパク質がＤＧＣＲ８と複合して、核内のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをプロセシングして、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンを生じる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、RanGTP・exportin・cargo複合体によって核の孔複合体を通って細胞質に運び出される。細胞質への運び出しにより、１つは核内でＤｒｏｓｈａによるものであり、２つ目は細胞質内でＤｉｃｅｒ酵素によってなされるという、２つのｍｉＲＮＡプロセシングステップの区分けが確立される。核からの運び出しの後、細胞質ＲＮＡｓｅ ＩＩＩであるＤｉｃｅｒが第２のプロセシングステップ（‘dicing’）に参与して、約２２ヌクレオチドの長さのｍｉＲＮＡ二本鎖を生じる。Ｄｉｃｅｒは高度に保存されたタンパク質であり、ほとんどすべての真核細胞生物に見られる。Ｄｉｃｅｒによる切断産物のｍｉＲＮＡ二本鎖構造は、ｍｉＲＮＡ－５ｐ鎖と－３ｐ鎖によって構成され、細胞において長くは持続しない。５ｐ鎖はフォワード（５’－３’）位に、３ｐ鎖（５ｐ鎖に対しほぼ相補的である）はリバース位に存在する。通常、ｍｉＲＮＡd二本鎖は、ＲＩＳＣ複合体（Ｄｉｃｅｒ、ＴＲＢＰおよびＡｇｏ２タンパク質によって形成される）に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体はｍｉＲＮＡを認識し、それを巻き戻し、パッセンジャー鎖を分解しながらガイドｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）を選択する。
【0008】
この「鎖バイアス」選択理論は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡの熱力学的安定性プロファイルの分析の後に提唱された。しかしながら、最近のデータは、ｍｉＲＮＡの鎖選択は組織依存的であるかもしれないことを示唆している。さらに、かなりの割合のｍｉＲＮＡ姉妹鎖対が同等のレベルで発現されることが報告されており、これは、鎖選択バイアスが確定的でないことを示している。同じヘアピン前駆体からの２つの成熟ｍｉＲＮＡは、異なる標的遺伝子セットを有するようであり、細胞活動の調節に対し異なる寄与を示しうる。
【0009】
成熟ｍｉＲＮＡは主に、細胞質中のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を配列相補性によって標的とする、転写後ネガティブ調節因子であると考えられる。ｍｉＲＮＡ転写後遺伝子調節機能の標準的な見方は、標的ｍＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合が、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する、というものである。標的ｍＲＮＡに対する相補性の高いｍｉＲＮＡの領域は、５’末端の２～８ヌクレオチドからなり、「シード」領域として知られる。
【0010】
しかしながら、ｍｉＲＮＡが転写後遺伝子サイレンシングを誘導するというこの標準的な見方は不完全であることの証拠が増えつつあり、ｍｉＲＮＡはさらなる作用を有するかもしれない。１つの理由は、細胞の成熟ｍｉＲＮＡの大部分が核と細胞質の両方に存在し、いくつかのｍｉＲＮＡはｍｉＲ－２１またはｍｉＲ－２９ｂのように明確な核濃縮を示しさえするという事実にある。
【0011】
哺乳動物細胞の核におけるｍｉＲＮＡの遺伝子調節機能を示す証拠が増えつつある。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）といった短鎖ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）が、特定の遺伝子プロモーターにおいて転写を抑制するかまたは活性化するというエピジェネティックな変化を実際に誘導しうることが示されている。ｓＲＮＡによって調節される遺伝子発現がｓＲＮＡとプロモーター配列の間の配列相補性によって仲介されることを示す証拠が存在する。さらに、ｓＲＮＡは、転写と共役した選択的スプライシングイベントを調節することが報告されている。
【0012】
利用可能なデータは、ｓＲＮＡによりガイドされる転写制御のタンパク質エフェクターの詳細を示すが、ｍｉＲＮＡといったｓＲＮＡがその核標的を特定する配列認識メカニズムは未だ解明されていない。ｓＲＮＡゲノム配列認識の１つの考えられる説明は、ヒトゲノムにおいて２方向の転写が見られることにありうる。ヒトゲノムは、センスおよびアンチセンスの両方向に転写されて、多くのゲノムのプロモーター領域に位置するノンコーディングセンスおよびアンチセンス転写物を生じる。ｍｉＲＮＡは転写レベルで３つのメカニズムで作用しうると考えられる：ｉ）前記プロモーター関連のノンコーディング転写物と相互作用する；ｉｉ）一本鎖ＤＮＡと相互作用してＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを形成する；ｉｉｉ）二本鎖ＤＮＡと相互作用して、ＲＮＡ＊ＤＮＡ：ＤＮＡ三本鎖を形成する
【0013】
文献ＫＲ２０１５００９５３４９には、マイクロＲＮＡの制御を介して神経系疾患を予防または治療するための医薬組成物が開示されている。神経系疾患の診断または予後として使用可能なマーカーおよびその使用も開示されている。文献ＷＯ２０１６１７０３４８Ａ２には、標的遺伝子の発現をアップレギュレートするのに有用なオリゴヌクレオチド、例えば短い活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、およびそのようなオリゴヌクレオチドを含む処置用組成物が開示されている。オリゴヌクレオチドおよび処置用組成物を使用する方法も提供されている。文献ＷＯ２０１５０２３９７５Ａ１は、標的化された様式で遺伝子発現を増加する方法に関する。いくつかの態様において、標的化された様式でタンパク質および／またはＲＮＡレベルを転写後変更するのに有用な方法および組成物が提供される。文献はまた、ＲＮＡを分解（例えばエキソヌクレアーゼ仲介分解）から保護するのに有用な方法および組成物を提供する。
【0014】
組織低酸素およびそれに続く血管新生は、心臓血管疾患および癌において２つの相対する視点から理解することができる。ある状況において、新たな血管の増殖は組織の生存を保証することができる。しかしながら、それは腫瘍において悪性細胞の増殖および移動を促進することができる。血管新生を調節すること、およびその局部的な促進または阻害が可能であることは、例えば血液酸素供給の低下に関連する心臓血管疾患の治療法として使用できる。心筋梗塞または末梢虚血といった多くの疾患が、ＶＥＧＦＡのような血管新生因子の量の調節によって治療されうる。ＶＥＧＦＡのダウンレギュレーションのための方法はいくつかあるが（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡ）、ＶＥＧＦＡアップレギュレーションのための現在唯一の方法は、さまざまなベクター（改変ウイルス、非ウイルスベクター等）を用いる伝統的な遺伝子送達である。伝統的な遺伝子送達には、いくつかの欠点がある：送達効率が通常低く、ベクターおよび導入遺伝子が免疫学的反応を引き起こし得、典型的には遺伝子の１つのアイソフォームだけが送達されて異なるアイソフォームの天然のバランスが崩され、ベクターはその導入遺伝子をクロマチンにおいてランダムな部位に一体化し得、腫瘍形成を引き起こす可能性がある。しかしながら、ＶＥＧＦＡ療法の開発に多大な努力が払われているにも関わらず、一律に効果的なＶＥＧＦＡ処置は開発されていない。
【発明の概要】
【0015】
したがって、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的として転写後レベルでカノニカルに作用することが知られているが、新規な調節メカニズムは、ｍｉＲＮＡがそれと配列類似性のある遺伝子プロモーターと相互作用しうることを示している。本発明者は、低酸素においてアップレギュレートされる、ＶＥＧＦＡプロモーター内に推定結合部位を有するマウスｍｉＲＮＡ（ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃまたはｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－１）の機能を調べた。ｍｉＲＮＡ－４６６ｃはｍｉＲＮＡファミリーＭＩＰＦ００００２０８に属し、このファミリーは以下のｍｉＲＮＡをも含む：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ａ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－１、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－３、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｅ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｆ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｋ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－５、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－６、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－７、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－８およびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３。
【0016】
ｍｉＲ－４６６ｃのヘアピンミミック（ｍｉＲ－４６６ｃ ３ｐ ｍｉｍ）、一本鎖３ｐミミック（ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－３ｐ）、および３ｐ鎖および５ｐ鎖がアニーリングされたものを含む該ｍｉＲＮＡの二本鎖構造のトランスフェクションによる本研究において得られた結果は、ヒト内皮細胞において鎖バイアス選択が存在しうることを示す。さらに、本発明者は、トランスフェクションに異なる種類のミミックを使用したときに、ＶＥＧＦＡ調節における明らかな差を見ることができた。本発明者は、ヘアピンミミックのｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ ｍｉｍがＶＥＧＦＡを強力にアップレギュレートでき、それ以外のミミックはＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルのわずかな変化しか誘導しないか変化を全く誘導しないことを、これまでで初めて示すものである。
【0017】
したがって、本発明は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの合成ミミックがヒトＶＥＧＦＡのｍＲＮＡレベルを、過去にマウスＶｅｇｆａ ｍＲＮＡで観察されたのとは異なる様式で調節できることを示す。ｍｉＲ－４６６ｃにより標的とされるプロモーターを特定するために行われたバイオインフォマティック分析に基づくと、ｍｉＲ－４６６ｃによる同様の調節メカニズムは、ＶＥＧＦＤおよびＨＩＦＡ ｍＲＮＡにも示される。本発明者は、２つのマイクロＲＮＡ、すなわちｈｓａ－ｍｉＲ－２９７およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐが、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃとの特に高い配列類似性を示すことを見出した。該マウスｍｉＲＮＡとヒトｍｉＲＮＡの高い類似性によって、ヒトｍｉＲＮＡカウンターパートが同様の標的を持つこと、およびヒト細胞にトランスフェクトされたマウスｍｉＲＮＡはヒトＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤおよびＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルを調節できることが合理的に推測される。
【0018】
本発明の利点は、大量のｍｉＲＮＡをレンチウイルスによって生産できるということである。ＲＮＡは、物理的または化学的方法によって標的細胞に送達される合成品であることもできる（例えば、改変されていないまたは化学的に改変されているＲＮＡオリゴ）。さらに、ＲＮＡは、短いＲＮＡを運ぶ天然に存在するナノ粒子である細胞外ベシクルによって標的細胞および組織に送達することができる。プロデューサー細胞におけるＲＮＡ発現および超音波処理またはエレクトロポレーションによるＲＮＡ導入を包含するさまざまな方法で、エキソソームにＲＮＡを搭載することができる。
【0019】
本発明の課題は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補配列との配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡ分子を提供することである。本発明のもう１つの課題は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補配列との配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡ分子、および担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供することである。本発明の少なくとも１つの合成ｍｉＲＮＡ分子を含む組換え発現ベクターも、本発明の一側面である。前記組換え発現ベクターを含む細胞も、本発明の一側面である。
【0020】
配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補配列との配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡ分子を投与することを含む、ヒトにおいて標的タンパク質の発現を調節する方法も、本発明の一側面である。
【0021】
本発明の他の一側面は、対象が心臓血管疾患のリスクを有するまたは心臓血管疾患を患っているかを決定するための、以下のステップを含む方法である：
（Ａ）心臓血管疾患が疑われる個体のサンプルを提供し；
（Ｂ）場合により、前記サンプルからＲＮＡを抽出し；
（Ｃ）ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定する；ここで、対照サンプルと比較して低いｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルは、心臓血管疾患が存在することまたは心臓血管疾患の素因があることを示す。
（Ａ）心臓血管疾患が疑われる個体のサンプルを提供し；
（Ｂ）場合により、前記サンプルからＲＮＡを抽出し；
（Ｃ）ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定する；ここで、対照サンプルと比較して低いｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－５４７－３ｐの発現レベルは、心臓血管疾患が存在することまたは心臓血管疾患の素因があることを示す。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図2】図２は、マウスＶｅｇｆａプロモーター上のｓｈＲＮＡおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ標的部位を示す。図は、マウスＶｅｇｆａプロモーター上で、以前に転写型遺伝子活性化のために用いられたｓｈＲＮＡ－４５１の標的部位と、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの予測標的部位との間の距離が近いことを示している。
【図4】図４は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの除去は、低酸素に応答するＶｅｇｆａ誘導を消失させることを示す。Ａ．低酸素は、マウス内皮細胞（Ｃ１６６）においてｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ発現を誘導する。このアップレギュレーションは、細胞ゲノムからＣＲＩＳＰＲによってｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを除去した後には見られなかった。Ｂ．ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ除去は、Ｓｆｍｂｔ ｍＲＮＡ発現を低下させる。Ｃ．ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃをゲノムから除去すると、Ｖｅｇｆａは低酸素時にアップレギュレートされなかった。Ｄ．ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃのレンチウイルストランスダクション（ＬＶ－４６６）により、Ｖｅｇｆａ発現は増加するが、低酸素時のＶｅｇｆａ誘導は回復されない。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果は、酸素が正常な状態に対して計算され、Ａｃｔｂ発現に対して正規化される。ｎ＝３、平均＋ＳＤ。
【図5】マウスｍｉＲ－４６６ｃヘアピンミミックのｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ ｍｉｍのトランスフェクションは、ヒト細胞株Ｅａ．ｈｙ９２６においてＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルを有意に低下したが、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐミミックのトランスフェクションは、陰性対照トランスフェクションと比較して有意な効果を示さなかった。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果は、陰性対照サンプルに対して、ｌｏｇ２のfold changeで計算した。結果は、ｎ＝３、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。Ｐ値＊＜０．０５。
【図6】図６は、マウス一本鎖ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐミミック（ｍｉＲ－４６６ ３ｐ）および二本鎖ミミック（４６６Ｃ ｄｕｐｌｅｘ）のトランスフェクションが、ヒト細胞株ＡＲＰＥ－１９においてＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルを、陰性対照トランスフェクションと比較して有意に低下したことを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果は、陰性対照サンプルに対して、ｌｏｇ２のfold changeで計算した。結果は、ｎ＝３、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。Ｐ値＊＜０．０５。
【図7】図７は、ＡＲＰＥ－１９細胞においてＬＶ－ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６のトランスダクションの５日後にＶＥＧＦＡ発現が増加することを示す。結果は、ｎ＝３、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。Ｐ値＊＜０．０５。
【図8】図８は、マウスｍｉＲ－４６６ｃヘアピンミミックのｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ ｍｉｍおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐミミックのトランスフェクションは、ヒト細胞株ＡＲＰＥ－１９においてＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルを有意に上昇することを示す。ｑＰＣＲの結果は、陰性対照サンプルに対して、ｌｏｇ２のfold changeで計算した。結果は、ｎ＝３、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。Ｐ値＊＜０．０５。
【図9】図９は、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐのシード配列とスクランブルヌクレオチド（５ｐ ｆｕｓｉｏｎ）またはジヌクレオチド反復（５ｐ ｒｅｐｅａｔ）のいずれかとを含む合成５ｐ ｆｕｓｉｏｎおよび５ｐ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡは、いずれも、ＡＲＰＥ－１９細胞においてＶＥＧＦＡ発現を２倍増加することを示す。結果は、ｎ＝６、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。
【図10】図１０は、マウス一本鎖ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ（ｓｓＲＮＡ－４６６ ３ｐ）および二本鎖ミミック（４６６ｃ ｄｕｐｌｅｘ）のトランスフェクションは、ヒトＡＲＰＥ－１９細胞においてＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルを変化しないが、一本鎖ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐのトランスフェクションは、陰性対照トランスフェクションとの比較でＶＥＧＦＡのアップレギュレーションを誘導したことを示す。ｑＰＣＲの結果は、陰性対照サンプルに対して、ｌｏｇ２のfold changeで計算した。結果は、ｎ＝３、平均±ＳＤで表す。結果は、ＡＣＴＢ発現に対して正規化。Ｐ値＊＜０．０５。
【図11】図１１は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６がＶｅｇｆａ転写を制御する経路の仮説を示す。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃは、Ｓｔｍｂｔ２遺伝子のイントロン１０内にコードされる。ｍｉＲＮＡが転写され、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒ酵素複合体によるｍｉＲＮＡ成熟化のカノニカル経路においてプロセシングされる。成熟型のｍｉＲＮＡは、Ｖｅｇｆａ転写を、そのプロモーター領域と相互作用することによって調節しうる。この相互作用は、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）または活性化（ＴＧＡ）をもたらすエピジェネティックな変化を誘導しうる。成熟型のｍｉＲＮＡは、Ｖｅｇｆａ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的として細胞質レベルで作用して、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を誘導することも可能である。
【図12】図１２は、２Ａ－ＥＧＦＰを伴うS. pyogenes由来Ｃａｓ９、およびｓｇＲＮＡのためのクローニングバックボーンのプラスミドマップを示す［p5p-Cas9(BB)-2A-GFP (PX458) (#48138, Addgene)］。
【発明を実施するための形態】
【0023】
配列表
配列番号１：マウスＶＥＧＦＡプロモーターヌクレオチド配列
配列番号２：ヒトＶＥＧＦＡプロモーターヌクレオチド配列
配列番号３：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４８７７）
配列番号４：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４８７８）
配列番号５：配列全体にカスタムＧＵ反復を含む合成ＲＮＡ（Ｒｅｐｅａｔ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号６：ＲＮＡ標的の存在しないスクランブル配列をシードに組み合わせたものを含む、ＧＵ反復を有する合成ＲＮＡ（カスタム融合：ｆｕｓｉｏｎ－ｍｉＲ４６６ｃ－５ｐ）
配列番号７：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃのレンチウイルスベクター過剰発現用クローニングオリゴ：フォワードクローニングプライマー
配列番号８：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃのレンチウイルスベクター過剰発現用クローニングオリゴ：リバースクローニングプライマー
配列番号９：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ １ａ ｍｉＲ－４６６ １ ｇＲＮＡ Ｔ
配列番号１０：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ １ｂ ｍｉＲ－４６６ １ ｇＲＮＡ Ｂ
配列番号１１：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ ２ａ ｍｉＲ－４６６ ２ ｇＲＮＡ Ｔ
配列番号１２：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ ２ｂ ｍｉＲ－４６６ ２ ｇＲＮＡ Ｂ
配列番号１３：ＣＲＩＳＰＲ欠失検出ＰＣＲプライマー：４６６ｄｅｌフォワードプライマー
配列番号１４：ＣＲＩＳＰＲ欠失検出ＰＣＲプライマー：４６６ｄｅｌリバースプライマー
配列番号１５：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７配列（ＭＩＭＡＴ０００４４５０）
配列番号１６：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ配列（ＭＩＭＡＴ０００３２３９）
配列番号１７：配列全体にＧＵ反復のみを含む合成ＲＮＡ（Ｒｅｐｅａｔ ｏｎｌｙ ｍｉＲ－４６６ｃ）
配列番号１８：カスタムＧＵ反復シードおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ配列を含む合成ＲＮＡ（Ｓｅｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号１９：ＲＮＡ標的が存在しないカスタムスクランブル配列シードおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ配列を含む合成ＲＮＡ（Ｓｅｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号２０：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９フォワードプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２１：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９リバースプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２２：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９フォワードプライマー（ＬＶベクターと１５ｂｐ相同）
配列番号２３：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９リバースプライマー（ＬＶベクターと１５ｂｐ相同）
配列番号２４：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のフォワードプライマー
配列番号２５：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のリバースプライマー
配列番号２６：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101フォワードプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２７：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101リバースプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２８：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101フォワードプライマー（ＬＶベクターと２０ｂｐ相同）
配列番号２９：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101リバースプライマー（ＬＶベクターと２０ｂｐ相同）
配列番号３０：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のフォワードプライマー
配列番号３１：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のリバースプライマー
配列番号３２：クローン化されたLV.CD9.Ago2 ｃＤＮＡ
配列番号３３：クローン化されたhTSG101.Ago2 ｃＤＮＡ
配列番号１：マウスＶＥＧＦＡプロモーターヌクレオチド配列
配列番号２：ヒトＶＥＧＦＡプロモーターヌクレオチド配列
配列番号３：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４８７７）
配列番号４：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４８７８）
配列番号５：配列全体にカスタムＧＵ反復を含む合成ＲＮＡ（Ｒｅｐｅａｔ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号６：ＲＮＡ標的の存在しないスクランブル配列をシードに組み合わせたものを含む、ＧＵ反復を有する合成ＲＮＡ（カスタム融合：ｆｕｓｉｏｎ－ｍｉＲ４６６ｃ－５ｐ）
配列番号７：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃのレンチウイルスベクター過剰発現用クローニングオリゴ：フォワードクローニングプライマー
配列番号８：ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃのレンチウイルスベクター過剰発現用クローニングオリゴ：リバースクローニングプライマー
配列番号９：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ １ａ ｍｉＲ－４６６ １ ｇＲＮＡ Ｔ
配列番号１０：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ １ｂ ｍｉＲ－４６６ １ ｇＲＮＡ Ｂ
配列番号１１：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ ２ａ ｍｉＲ－４６６ ２ ｇＲＮＡ Ｔ
配列番号１２：ＣＲＩＳＰＲ ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失のガイドオリゴ：Ｍ－ｍｉＲ－４６６ ２ｂ ｍｉＲ－４６６ ２ ｇＲＮＡ Ｂ
配列番号１３：ＣＲＩＳＰＲ欠失検出ＰＣＲプライマー：４６６ｄｅｌフォワードプライマー
配列番号１４：ＣＲＩＳＰＲ欠失検出ＰＣＲプライマー：４６６ｄｅｌリバースプライマー
配列番号１５：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７配列（ＭＩＭＡＴ０００４４５０）
配列番号１６：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ配列（ＭＩＭＡＴ０００３２３９）
配列番号１７：配列全体にＧＵ反復のみを含む合成ＲＮＡ（Ｒｅｐｅａｔ ｏｎｌｙ ｍｉＲ－４６６ｃ）
配列番号１８：カスタムＧＵ反復シードおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ配列を含む合成ＲＮＡ（Ｓｅｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号１９：ＲＮＡ標的が存在しないカスタムスクランブル配列シードおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ配列を含む合成ＲＮＡ（Ｓｅｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ）
配列番号２０：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９フォワードプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２１：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９リバースプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２２：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９フォワードプライマー（ＬＶベクターと１５ｂｐ相同）
配列番号２３：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するｈＣＤ９リバースプライマー（ＬＶベクターと１５ｂｐ相同）
配列番号２４：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のフォワードプライマー
配列番号２５：ヒトLV.CD9.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のリバースプライマー
配列番号２６：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101フォワードプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２７：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101リバースプライマー（コザックあり、終止コドンなし）
配列番号２８：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101フォワードプライマー（ＬＶベクターと２０ｂｐ相同）
配列番号２９：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するhTSG101リバースプライマー（ＬＶベクターと２０ｂｐ相同）
配列番号３０：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のフォワードプライマー
配列番号３１：hTSG101.hAgo2のクローニングに関するHA.FLAG.hAgo2のリバースプライマー
配列番号３２：クローン化されたLV.CD9.Ago2 ｃＤＮＡ
配列番号３３：クローン化されたhTSG101.Ago2 ｃＤＮＡ
【0024】
本開示の詳細な説明
用語「ｍｉＲＮＡ」は、その通常の意味および現在理解される意味にしたがって使用され、ＲＮＡに基づく遺伝子調節に関与する真核生物に見られるマイクロＲＮＡ分子をいう。用語「ｍｉＲＮＡ」は、別の意味が示されない限り、その前駆体から切り出された後のプロセシングされたＲＮＡをいう。用語「ｍｉＲＮＡ」は一般に一本鎖分子をさすが、いくつかの特定の態様においては、本発明において提供される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域または別の核酸に対して、部分的に相補的（鎖の長さにわたって１０～５０％の相補性）、実質的に相補的（鎖の長さにわたって５０％超で１００％未満の相補性）または完全に相補的な、領域または追加の鎖をも含みうる。したがって、核酸は、分子を構成する特定の配列の相補もしくは自己相補鎖または「相補体」を１つ以上含む分子を包含しうる。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは、相補性が１００％までの自己相補的領域を有しうる。本発明のｍｉＲＮＡは、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃファミリーＭＩＰＦ００００２０８のメンバー、すなわちｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ａ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－１、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－３、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－１、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｅ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｆ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｋ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－５、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－６、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－７、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－８およびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３を包含する。さらに、本発明のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７およびｈｓａ－ｍｉＲ５７４－３ｐを包含する。
用語「ｍｉＲＮＡ」は、その通常の意味および現在理解される意味にしたがって使用され、ＲＮＡに基づく遺伝子調節に関与する真核生物に見られるマイクロＲＮＡ分子をいう。用語「ｍｉＲＮＡ」は、別の意味が示されない限り、その前駆体から切り出された後のプロセシングされたＲＮＡをいう。用語「ｍｉＲＮＡ」は一般に一本鎖分子をさすが、いくつかの特定の態様においては、本発明において提供される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域または別の核酸に対して、部分的に相補的（鎖の長さにわたって１０～５０％の相補性）、実質的に相補的（鎖の長さにわたって５０％超で１００％未満の相補性）または完全に相補的な、領域または追加の鎖をも含みうる。したがって、核酸は、分子を構成する特定の配列の相補もしくは自己相補鎖または「相補体」を１つ以上含む分子を包含しうる。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは、相補性が１００％までの自己相補的領域を有しうる。本発明のｍｉＲＮＡは、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃファミリーＭＩＰＦ００００２０８のメンバー、すなわちｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ａ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－１、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－３、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－１、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｅ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｆ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｋ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－２、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－５、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－６、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－７、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｂ－８およびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３を包含する。さらに、本発明のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７およびｈｓａ－ｍｉＲ５７４－３ｐを包含する。
【0025】
文脈における「５’に相補的」なる表現は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物とストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることが可能であることを意味する。本発明の文脈において標的アンチセンスＲＮＡ転写物の記載に用いられる場合の用語「アンチセンス」とは、配列が、遺伝子のコーティング鎖の配列に相補的であることを意味する。ＤＮＡ中のチミジンはＲＮＡにおいてウリジンに置き換えられること、この違いは用語「アンチセンス」または「相補性」の理解を変更するものではないことを理解すべきである。
【0026】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡとの結合によって遺伝子発現を調節する。文脈における「シード配列」または「シード領域」とは、多くはｍｉＲＮＡ５’末端から２～８番目の位置に位置する、ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡに結合するために必須の保存されたヘプタメトリカル配列である。ｍｉＲＮＡとその標的のｍＲＮＡの塩基対形成が、完全にはマッチしないとしても、「シード配列」は完全に相補的でなければならない。本発明のシード配列は、例えば、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐシード配列のＧＡＵＧＵＧＵ、またはｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐシード配列のＵＡＣＡＵＡＣ、またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐシード配列のＵＧＵＡＵＧＵＧでありうる。
【0027】
遺伝子の「コード鎖」は、ＴがｍＲＮＡではＵに置き換えられることを除いては、生成されるｍＲＮＡと同じ塩基配列を有する。したがって、遺伝子の「鋳型鎖」は、生成されるｍＲＮＡと相補的であり、それに対しアンチパラレルである。
【0028】
本書において用いられる用語「転写開始部位」（ＴＳＳ）とは、転写開始の位置に対応するまたは該位置をマークする、遺伝子の鋳型鎖上のヌクレオチドを意味する。ＴＳＳは、遺伝子の鋳型鎖のプロモーター領域内に位置しうる。
【0029】
本書において用いられる用語「転写終止部位」は、限定されないが以下のような特徴の少なくとも１つを有する、遺伝子の鋳型鎖上の１つ以上のヌクレオチドでありうる領域を意味する：標的転写物の少なくとも１つの終止コドンをコードする領域、標的転写物の３’ＵＴＲに先行する配列をコードする領域、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を解離する領域、スプライス部位またはスプライス部位の前の部分をコードする領域、および標的転写物の転写が終結する鋳型鎖上の領域。
【0030】
本書において用いられる用語「転写因子」とは、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を、例えば転写の活性化または抑制によって調節する、ＤＮＡ結合タンパク質をさす。いくつかの転写因子は、単独で転写調節作用を示し、他のいくつかの転写因子は他のタンパク質と協力して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下に転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に転写因子は、標的遺伝子の調節領域中の特定のコンセンサス配列との類似性の高い１つまたは複数の特定の標的配列に結合する。転写因子は、単独で、または他の分子と複合して、標的遺伝子の転写を調節しうる。本発明において、ｍｉＲＮＡは、転写因子を標的遺伝子プロモーターに動員することによって作用することができる。動員される転写因子の例は、クロマチン調節転写因子および他の転写因子、例えばＣＲＥＢ２／ＡＴＦ４、ｐ３００、ＹＹ１、ＧＡＴＡ４、ＣＲＴＣ、ＳＵＺ１２、ＰＯＵ２Ｆ７、ＥＺＨ２およびＳｐ１である。
【0031】
用語「タンパク質発現」とは、検出可能レベルのアミノ酸配列またはタンパク質が発現されるように核酸配列が翻訳を受けるプロセスをいう。
【0032】
本書において用いられる用語「低下」、「抑制」、「サイレンシング」および「阻害」は互換的に用いられ、標的配列の産物の発現レベルの、野生型生物における正常発現レベルと比較したダウンレギュレーションをいう。「ＲＮＡレベルの低下」または「タンパク質量の低下」とは、野生型発現レベルと比較して統計学的に有意な量の発現低下、例えば少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の低下を意図する。
【0033】
本書において用いられる用語「増加する」および「アップレギュレートする」は互換的に用いられ、標的配列の産物の発現レベルの、野生型生物における正常発現レベルと比較したアップレギュレーションをいう。「ＲＮＡレベルを増加する」または「タンパク質量を増加する」とは、野生型発現レベルと比較して統計学的に有意な量の発現増加、例えば少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増加を意図する。
【0034】
用語「組換え体」とは一般に、インビトロで操作された分子、またはそのような分子の複製もしくは発現産物をいう。
【0035】
ＲＮＡ分子は、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされうる。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しているが必ずしもその必要はなく、かつ、遺伝子と１つ以上の調節配列（例えばプロモーター）が、適当な分子（例えば転写活性化タンパク質である「転写因子」、または転写アクチベータードメインを含むタンパク質）が調節配列に結合したときに遺伝子発現を可能にするように連結されることを意味する。
【0036】
本書において用いられる用語「ベクター」とは、１つ以上の細胞種のトランスダクション／トランスフェクションのためにデザインされた核酸コンストラクトをいう。ベクターは例えば、挿入したヌクレオチドの単離、増幅および複製のためにデザインされた「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列発現のためにデザインされた「発現ベクター」、組換えウイルスまたはウイルス様粒子の作製をもたらすようにデザインされた「ウイルスベクター」、または属するベクターの種類が１つよりも多い「シャトルベクター」でありうる。用語「複製」とは、ベクターの複製を意味する。
【0037】
用語「発現ベクター」は、本書において用語「プラスミド」および「ベクター」と互換的に用いられ、所望のコーディング配列、および作動可能に連結されるコーディング配列（例えば、ある産物をコードする挿入配列）が特定の宿主細胞において発現するのに必要な適当な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子をいう。用語「プラスミド」は、所定の細胞において自律複製が可能な染色体外環状ＤＮＡをいう。いくつかの特定の態様において、プラスミドは細菌中での増幅および発現用にデザインされる。
【0038】
したがって、いくつかの態様は、本書に記載されるｍｉＲＮＡまたはその断片をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列および適当なプロモーター領域を含む、プラスミド、ベクター、転写および発現カセットの形態の核酸コンストラクトを提供する。適当な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の所望の配列を含む適当なベクターが、選択または構成されうる。ベクターは、プラスミド、細胞外ベシクル（天然または改変）、ファージ（例えばファージまたはファージミド）もしくはウイルス（例えばレンチウイルス、アデノウィルス、ＡＡＶ）、または他の適当なベクターでありうる。ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター（例えばレンチウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス等に由来するもの）、バクテリオファージ、コスミド、および人工染色体を含むが、それに限定されない。いくつかの態様において、ベクターは、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するための発現（または発現コンストラクト）でありうる。ベクターおよびそれを標的細胞に導入する方法は、当分野で知られている［例えばSambrook et al., 1989参照］。
【0039】
シードが対応するプロモーターの例は、ＶＥＧＦＡプロモーター、ＶＥＧＦＤプロモーターおよびＨＩＦ１Ａプロモーターを含むが、それに限定されない。
【0040】
一態様において、ＤＮＡ分子は組換え発現ベクターに作動可能に連結される。さらなる態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。一態様において、本発明により開示されるコンストラクトは、レンチウイルスバックボーン、すなわちレンチウイルスベクター中にあるので、活性レンチウイルス粒子の生成が可能であり、したがってトランスフェクション効率の低い細胞においても効果的な発現が可能である。他のいくつかの態様においては、本発明により開示される合成ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃは、レンチウイルスベースのベクター等のような、細胞中での発現を可能にする他のベクター中にクローン化される。
【0041】
本書において用いられる用語「誘導体」は、天然の分子の化学的に修飾または改変された形態をいい、用語「ミミック」または「アナログ」は、天然の分子または基と構造的に類似してもしなくてもよいが同様の機能を有する分子をいう。本書において用いられる用語「基」は通常、より大きい化学構造または分子構造のより小さい化学成分または分子成分をいう。本発明の最も好ましい側面は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐのシード配列ＧＡＵＧＵＧＵおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐのシード配列ＵＡＣＡＵＡＣを含むｍｉＲＮＡミミックである。さらなる側面において、ｍｉＲＮＡは、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ、またはその成熟配列を含むｍｉＲＮＡミミックである。
【0042】
用語「短い」とは、１５０ヌクレオチド以下である単一のヌクレオチドの長さをいう。核酸分子は合成物である。用語「合成物」とは、核酸分子が単離されており、配列（全長配列）および／または化学構造において、例えば内因性前駆体ｍｉＲＮＡ分子のような天然の核酸分子と同一ではないことを意味する。いくつかの態様において、本発明の核酸は、天然の核酸の配列と同一である全長配列を持つものではないが、そのような分子は天然の配列の全部または一部を含みうる。しかしながら、細胞に投与される合成核酸は、その構造または配列が、成熟ｍｉＲＮＡ配列のような非合成または天然の核酸と同じになるように、細胞中で後から修飾または改変されうることが企図される。例えば、合成核酸は、前駆体ｍｉＲＮＡの配列とは異なる配列を有しうるが、その配列は細胞に導入されると内因性のプロセシングされたｍｉＲＮＡと同じになるように改変されうる。本発明の「合成核酸」は、核酸が天然核酸の化学構造または配列を持つものではないことを意味すると理解される。したがって、用語「合成ｍｉＲＮＡ」は、細胞中または生理学的条件下で天然のｍｉＲＮＡのように機能する「合成核酸」をさすと理解されうる。
【0043】
特定のいくつかの態様において、本発明の方法および／または組成物における核酸は、特に合成ｍｉＲＮＡであり、非合成のｍｉＲＮＡではない（すなわち、「合成」とみなされるｍｉＲＮＡではない）。しかしながら、他のいくつかの態様においては、本発明は特に、合成ｍｉＲＮＡではなく非合成ｍｉＲＮＡを伴う。
【0044】
合成ｍｉＲＮＡの使用に関して記載する任意の態様は、非合成のｍｉＲＮＡに関しても当てはめることができ、その逆も可能である。
【0045】
本発明の合成ポリヌクレオチドは、非翻訳領域を含む。遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。５’ＵＴＲは転写開始部位に始まり開始コドンまで続くが、開始コドンを含むものではない。一方、３’ＵＴＲは終止コドン直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性および翻訳に関してＵＴＲが果たす調節作用についての証拠は増えつつある。
【0046】
用語「単離」とは、本発明の核酸分子が、（配列または構造に関して）異なる不要の核酸分子から、単離された核酸の集団の相同性が少なくとも約９０％となるように、および、他のポリヌクレオチド分子に関して相同性が少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９または１００％となりうるように、最初に分離されることを意味する。本発明の多くの態様において、核酸は、それが細胞中の内因性核酸とは隔てられてインビトロで合成されていることによって、単離される。しかしながら、単離された核酸は、後から混ぜ合わされまたは一緒にプールされうることが理解されうる。
【0047】
本書において用いられる用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性をいう。いくつかの態様において、複数のポリマー分子の配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同じまたは同様であるならば、ポリマー分子は、互いに「相同」であり、互いにある程度の配列同一性を有するとみなされる。用語「相同」とは、必ず少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較をいう。本発明において、２つのポリヌクレオチド配列は、それがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチにおいて少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％であるならば、相同であるとみなされる。いくつかの態様において、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意的に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド未満の長さのポリヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも４～５個の一意的に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。本発明において、２つのタンパク質配列は、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、タンパク質の同一性が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％であるならば、相同であるとみなされる。
【0048】
「～を調節するようにｍｉＲＮＡを標的化する」なる表現は、本発明の核酸が、選択されたｍｉＲＮＡを調節するように使用されうることを意味する。いくつかの態様において、調節は、細胞または生物に標的ｍｉＲＮＡを効果的に提供する、標的ｍｉＲＮＡに対応する合成または非合成のｍｉＲＮＡによって達成される（正の調節）。他のいくつかの態様においては、調節は、細胞または生物において標的ｍｉＲＮＡを効果的に阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤によって達成される（負の調節）。
【0049】
いくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡは、その相補的領域の５’末端に、リン酸および／またはヒドロキシル基が別の化学基で置き換えられているヌクレオチドを有する（「置換デザイン」と称される）。いくつかの場合、リン酸基が置換され、他のいくつかの場合、ヒドロキシル基が置換されている。いくつかの特定の態様において、置換基はビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２Ｏ－Ｍｅ（２酸素－メチル）、ＤＭＴＯ（酸素を伴う４，４’－ジメトキシトリチル）、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンであり、他の置換基も当業者に知られており、同様に用いられうる。このデザイン要素はｍｉＲＮＡ阻害剤でも用いられうる。
【0050】
他のいくつかの態様は、相補的領域の最初または最後の１～６残基において１つ以上の糖修飾を有する合成ｍｉＲＮＡに関する（「糖置換デザイン」と称される）。いくつかの場合、相補的領域の最初の１、２、３、４、５、６個もしくより多くの残基またはその中に誘導可能な任意の範囲に、１つ以上の糖修飾がある。他のいくつかの場合、相補的領域の最後の１、２、３、４、５、６個もしくはより多くの残基またはその中に誘導可能な任意の範囲に、１つ以上の糖修飾がある。用語「最初」および「最後」は、領域の５’末端から３’末端への残基の並びに関するものであると理解されうる。特定のいくつかの態様において、糖修飾は２’Ｏ－Ｍｅ修飾である。他のいくつかの態様において、相補的領域の最初または最後の２～４残基、または相補的領域の最初または最後の４～６残基に、１つ以上の糖修飾がある。このデザイン要素は、ｍｉＲＮＡ阻害剤にも用いられうる。したがって、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、このデザイン要素、および／または前記の５’末端におけるヌクレオチド上の置換基を有しうる。
【0051】
本発明の他のいくつかの態様において、相補的領域の３’末端の最後の１～５残基の１つ以上のヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ領域の対応するヌクレオチドに対して相補的でない（「非相補性」）合成ｍｉＲＮＡが存在する（「非相補性デザイン」と称される）。非相補性は、相補的ｍｉＲＮＡの最後の１、２、３、４および／または５残基に存在しうる。いくつかの態様において、相補的領域の少なくとも２ヌクレオチドに対して非相補性が存在しうる。本発明のｍｉＲＮＡは１つ以上の置換、糖修飾、または非相補性デザインを有することが意図される。いくつかの場合、合成ＲＮＡ分子はその２つを有し、他のいくつかの場合、分子は３デザインのすべてを有する。ｍｉＲＮＡ領域および相補的領域は、同じまたは別個のポリヌクレオチド上に存在しうる。同じポリヌクレオチドにそれが含まれる場合、ｍｉＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチドであるとみなされうる。異なる領域が別個のポリヌクレオチドに存在する態様では、合成ｍｉＲＮＡは２つのポリヌクレオチドからなるとみなされうる。ＲＮＡ分子が単一のポリヌクレオチドであるとき、ｍｉＲＮＡ領域と相補的領域の間にリンカー領域が存在する。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ領域と相補的領域の結合の結果として、単一のポリヌクレオチドはヘアピンループ構造を形成することが可能である。リンカーはヘアピンループを構成する。いくつかの態様において、リンカー領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０残基またはその中に誘導可能な任意の範囲の長さである、少なくとも該長さである、または最長で該長さであることが意図される。いくつかの態様において、リンカーは３～３０残基の間（この上限および下限を含む）の長さである。
【0052】
用語「天然の」とは、人間の介入なしに生体に見られるものをいうと理解されうる。これは、天然に生じる野生型または変異型の分子をさしうる。いくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡ分子は、天然ｍｉＲＮＡ分子の配列を有するものではない。他のいくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡ分子の配列を有しうるが、とりわけ当該配列に特に関係しない部分における、分子の化学構造（非配列化学構造）は、該配列を有する天然ｍｉＲＮＡ分子の化学構造とは異なる。いくつかの場合、合成ｍｉＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡに見られない配列および非配列の両方の化学構造を有する。さらに、合成分子の配列は、どのｍｉＲＮＡが効果的に提供または抑制されるかを特定し得、内因性ｍｉＲＮＡは「対応するｍｉＲＮＡ」と称されうる。本発明において使用することのできる対応するｍｉＲＮＡ配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号１５および配列番号１６を包含するが、それに限定されない。
【0053】
いくつかの態様において、１７～１３０残基の長さの合成ｍｉＲＮＡが存在する。より好ましくは、長さは１４～３０残基である。本発明は、少なくとも、または最長で、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９もしくは１３０残基の長さまたはその中で誘導可能な任意の範囲の、合成ｍｉＲＮＡ分子に関する。
【0054】
いくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡは、ａ）５’から３’の配列が成熟ｍｉＲＮＡ配列と同じである「ｍｉＲＮＡ領域」、およびｂ）５’から３’の配列がｍｉＲＮＡ配列に対し６０％～１００％相補的である「相補的領域」を有する。いくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡもまた、前記に定義したように単離される。用語「ｍｉＲＮＡ領域」とは、天然の成熟ｍｉＲＮＡ配列の配列全体に対する同一性が少なくとも９０％である合成ｍｉＲＮＡの領域をいう。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ領域は、天然ｍｉＲＮＡの配列に対する同一性が下記の値であるか、少なくとも下記の値である：９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％。用語「相補的領域」とは、ｍｉＲＮＡ領域が同一である天然の成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して、６０％相補的である、または少なくとも６０％相補的である合成ｍｉＲＮＡの領域をいう。相補的領域は、相補性が下記の値のものである、または少なくとも下記の値のものである：６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９もしくは１００％またはその中で誘導可能な任意の範囲。単一のポリヌクレオチド配列において、ｍｉＲＮＡ領域と相補的領域の間の化学的結合の結果としてヘアピンループ構造が存在する。他のいくつかの態様においては、相補的領域は、ｍｉＲＮＡ領域とは異なる核酸分子に存在し、その場合、相補的領域は相補鎖に、ｍｉＲＮＡ領域はアクティブ鎖にある。
【0055】
本発明のいくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡは１つ以上のデザイン要素を含む。デザイン要素は、下記のものを包含するが、それに限定されない：ｉ）相補的領域の５’末端のヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルへの置換基；ii）相補的領域の最初または最後の１～６残基における１つ以上の糖修飾；またはiii）相補的領域の３’末端の最後の１～５残基における１つ以上のヌクレオチドとｍｉＲＮＡ領域の対応するヌクレオチドの間の非相補性。
【0056】
薬剤を「提供する」という表現は、薬剤を患者に「投与する」ことを包含して用いられると理解されうる。
【0057】
本書において用いられる用語「有効量」とは、本発明の分子の、それが投与される細胞または組織において所望の生理学的変化をもたらすのに必要な量として定義される。本書において用いられる用語「処置有効量」とは、疾患または状態に関して所望の効果を達成する本発明の分子の量として定義される。当業者は、多くの場合に分子は治癒を提供しないことがあっても、少なくとも１つの症状の軽減または改善といった部分的利益を提供しうることを容易に認識する。いくつかの態様において、何らかの利益を有する生理学的変化も、処置に有効とみなされる。したがって、いくつかの態様において、生理学的変化を提供する分子の量は、「有効量」または「処置有効量」であるとみなされる。
【0058】
本書において用いられる用語「薬学的に許容しうる溶媒和物」とは、適当な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適当な溶媒は、投与される用量で生理学的に忍容されうるものである。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水またはその混合物を含む溶液からの、結晶化、再結晶化または沈殿によって調製されうる。適当な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二および三水和物）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジル等である。溶媒が水である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
【0059】
本書において用いられる用語「薬学的に許容しうる担体」は、医薬、例えばヒトへの投与に適当な医薬の調製における使用のために許容されうる１つ以上の溶媒、緩衝剤、溶液、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延化剤等を包含しうる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野においてよく知られている。補足的な活性成分も、組成物中に組み合わせることができる。
【0060】
ｍｉＲＮＡの核機能について、Turunenら（Circ Res 105(6):604-609）は、生物学的ｍｉＲＮＡの合成カウンターパートである短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、マウスＶｅｇｆａ遺伝子プロモーターを標的化するとき、Ｖｅｇｆａ発現を活性化または抑制することができることを見出した。誘導される転写遺伝子活性化（ＴＧＡ）および転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）は、標的化される配列に依存した。Ｖｅｇｆａプロモーターを標的とするｓｈＲＮＡは、転写因子の誘因をもたらし、インビトロおよびインビボの両方でエピジェネティックな変化を誘導した。
【0061】
本発明者はまた、ＶｅｇｆａプロモーターのｓｈＲＮＡ仲介転写活性化が、後肢虚血および心筋梗塞のマウスモデルにおいて治療的改善を提供することを示した。この知見は、ｓｈＲＮＡが、構造の類似する内因性ｍｉＲＮＡを模倣することによって機能しうることを示した。
【0062】
鋳型鎖上の標的配列の位置は、標的配列の５’末端の位置によって特定される。標的配列の５’末端は、転写開始部位（ＴＳＳ）コアの任意の位置であってよく、標的配列は、ＴＳＳコアの位置１～位置５００１から選択される任意の位置で始まりうる。本書における参照のために、標的配列の５’最末端がＴＳＳコアの位置１～位置２０００までであるとき、標的配列はＴＳＳの上流とみなされ、標的配列の５’最末端がＴＳＳコアの位置２００２～５０００であるとき、標的配列はＴＳＳの下流とみなされる。標的配列の５’最末端がヌクレオチド２００１にあるとき、標的配列はＴＳＳの中心配列とみなされ、ＴＳＳの上流でも下流でもない。さらなる参照のために、例えば、標的配列の５’末端がＴＳＳコアの位置１６００にあるとき、すなわちＴＳＳコアの１６００番目のヌクレオチドであるとき、標的配列はＴＳＳコアの位置１６００に始まり、ＴＳＳの上流であるとみなされる。
【0063】
いくつかの態様において、標的配列は、鋳型鎖のＴＳＳコア内に位置する。本書において用いられる用語「ＴＳＳコア」または「ＴＳＳコア配列」は、ＴＳＳ（転写開始部位）の２０００ヌクレオチド上流と２０００ヌクレオチド下流の間の領域をいう。したがって、ＴＳＳコアは４００１ヌクレオチドを含み、ＴＳＳはＴＳＳコア配列の５’末端から２００１番目の位置に位置する。
【0064】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの３０００ヌクレオチド上流と３０００ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0065】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの２０００ヌクレオチド上流と２０００ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0066】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの１０００ヌクレオチド上流と１０００ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0067】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの５００ヌクレオチド上流と５００ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0068】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの２５０ヌクレオチド上流と２５０ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0069】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの１００ヌクレオチド上流と１００ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0070】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの１０ヌクレオチド上流と１０ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0071】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの５ヌクレオチド上流と５ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0072】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳの１ヌクレオチド上流と１ヌクレオチド下流の間に位置する。
【0073】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳコア中、ＴＳＳの上流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの上流２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満または５ヌクレオチド未満に位置しうる。
【0074】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳコア中、ＴＳＳの下流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの下流２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満または５ヌクレオチド未満に位置しうる。
【0075】
いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳを挟む±５０ヌクレオチドに位置する。いくつかの態様において、標的配列は実質的に、ＴＳＳコアのＴＳＳとオーバーラップする。いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳで始まりまたは終わってオーバーラップする。いくつかの態様において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳと、上流または下流方向１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチドでオーバーラップする。
【0076】
鋳型鎖上の標的配列の位置は、標的配列の５’末端の位置によって特定される。標的配列の５’末端は、ＴＳＳコアの任意の位置であってよく、標的配列は、ＴＳＳコアの位置１～４００１０から選択される任意の位置で始まりうる。本書における参照のために、標的配列の５’最末端がＴＳＳコアの位置１～位置２０００までであるとき、標的配列はＴＳＳの上流とみなされ、標的配列の５’最末端がＴＳＳコアの位置２００２～４００１にあるとき、標的配列はＴＳＳの下流とみなされる。標的配列の５’最末端がヌクレオチド２００１にあるとき、標的配列はＴＳＳの中心配列とみなされ、ＴＳＳの上流でも下流でもない。さらなる参照のために、例えば、標的配列の５’末端がＴＳＳコアの位置１６００にあるとき、すなわちＴＳＳコアの１６００番目のヌクレオチドであるとき、標的配列はＴＳＳコアの位置１６００に始まり、ＴＳＳの上流であるとみなされる。
【0077】
本発明者の知見にしたがって、内因性ｍｉＲＮＡは、Ｖｅｇｆａ調節において、合成ｓｈＲＮＡと同様の機能を発揮しうるとの仮説が立てられた。それを調べるために、低酸素マウス内皮細胞の核および細胞質分画に由来するｍｉＲＮＡの次世代シーケンシングを行った。結果は、多くのｍｉＲＮＡが実際に、低酸素に応答して核に局在することを示した。本発明者は次いで、バイオインフォマティック分析を用いて、核に濃縮されたｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃはマウスＶｅｇｆａプロモーター内に推定結合部位を有することを確認することができた（図２）。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃは、Scm-like with four mbt domains 2（Ｓｆｍｂｔ２）遺伝子のイントロン領域、特にイントロン１０中の、齧歯類特異的ｍｉＲＮＡクラスター中にコードされる（図１）。
【0078】
Ｓｆｍｂｔ２遺伝子は、関心のｍｉＲＮＡと同様に、低酸素に応答し、低酸素処理の２４時間後に有意にアップレギュレートされることが観察された（図４）。得られたデータは、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃは、低酸素時のＶｅｇｆａ発現の微細な調整において、そのプロモーターを標的とすることによって協働しうることを示唆する。
【0079】
バイオインフォマティック分析において、ｍｍｕ－ｍｉＲ４６６ｃの推定標的部位は、先にＶｅｇｆａ遺伝子活性化のために用いられたｓｈＲＮＡの結合部位に驚くほど近いことが観察された（図２に例）。ｍｉＲＮＡとプロモーター配列の間の相互作用の可能なメカニズムを調べるために、標的化ＲＮＡのシーケンシングを行った。結果は、Ｃ１６６内皮細胞においてマウスＶｅｇｆａプロモーター上にアンチセンスＲＮＡ転写物を確認した。このプロモーター関連のノンコーディング転写物は、ＶｅｇｆａプロモーターにおけるｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの標的であると考えられる。
【0080】
ｍｉＲＮＡが広範な生物において確認されることは、ｍｉＲＮＡ調節メカニズムが進化的に保存されることを示唆し、多く特定のｍｉＲＮＡが、例えば齧歯類とヒトの間で保存されていることが示されている。また、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの相同ｍｉＲＮＡが、ヒトゲノム中に存在するかも知れない。本発明者は、同様のカウンターパートの探索においてヒトゲノムをスキャンしたとき、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃとの配列類似性が特に高い２つのマイクロＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７およびｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ）を見出した（図３）。マウスｍｉＲＮＡとヒトｍｉＲＮＡの間の高い類似性のために、ヒトｍｉＲＮＡカウンターパートは同様の標的を有すること、およびヒト細胞にトランスフェクトされたマウスｍｉＲＮＡはヒトＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤおよびＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡレベルを調節できること、を合理的に推測することができる。
【0081】
得られたデータは、マイクロＲＮＡは、Ｖｅｇｆａのプロモーター関連のノンコーディング転写物および３’ＵＴＲ領域を標的として、転写および転写後の両方のレベルで作用している可能性を示唆する。このことは、ｍｉＲＮＡが、低酸素条件における厳密に制御されたＶｅｇｆａ発現の微細な調整において作用するという仮説を支持しうる。
【0082】
本プロジェクトにおいて、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの作用メカニズムをさらに調べるために、本発明者は、異なる２つの実験を行った：Ｉ）本発明者は、合成ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃミミックをヒト内皮細胞株Ｅａ．ｈｙ９２６およびヒト上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９にトランスフェクトし、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルに対する効果を観察した。II）次に、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの機能を調べるために、本発明者は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツールを用いて、安定なｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失マウス細胞株を作製した。
【0083】
本プロジェクトで試験したｍｉＲＮＡ（ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ）は、低酸素に応答するマウスＶｅｇｆａ発現を厳密に制御することを本発明者が予め観察したものである。ｍｉＲＮＡ調節メカニズムが生物間で高度に進化的保存されていること、およびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃに類似するヒトのｍｉＲＮＡカウンターパートが存在することから、本発明者は、合成ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃミミックがヒト細胞株においてＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルをどのように調節するかを調べた。
【0084】
本発明者は、ヒト内皮細胞株Ｅａ．ｈｙ９２６をｍｉＲ－４６６ｃのヘアピンミミック（ｍｉＲ－４６６ｃ ３ｐ ｍｉｍ）でトランスフェクトした後、（詳細は実施例を参照されたいが）ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルが有意にダウンレギュレートされることを見出した。同様のダウンレギュレーション効果は、一本鎖３ｐミミック（ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－３ｐ）、および３ｐ鎖と５ｐ鎖がアニーリングされたものを含むこのｍｉＲＮＡの二本鎖構造をトランスフェクトしたときにも観察された。この結果は、ヒト内皮細胞株において鎖バイアス選択が存在し得、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの３ｐ鎖がＶＥＧＦＡダウンレギュレーションに機能的でありうることを示唆する。
【0085】
さらに、本発明者は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの合成ミミックをヒト上皮細胞株において試験することによって、異なる種類のミミックの間に、ＶＥＧＦＡ調節性能の明らかな差を見ることができた。ヘアピンミミック（ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ／５ｐ ｍｉｍ）はＶＥＧＦＡを強くアップレギュレートすることができたが、それ以外のミミックはＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルにおいてわずかな変化しか誘導しなかったか、または変化を全く誘導しなかった。この観察されたミミック性能の大差は、ヘアピンミミック構造によって説明することができた。ヘアピン構造は天然の内因性ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃに、より類似し得、細胞内でのプロセシングおよびｍｉＲＮＡプロセシング複合体の活性化を必要とするが、それ以外のミミックの一本鎖または二本鎖形態は、すでにより成熟した形態であり、したがって、必ずしも適正なプロセシング経路に入らない可能性がある。
【0086】
マウスｍｉＲ－４６６ｃミミックを用いての結果により、ｍｉＲ－４６６ｃはヒトＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルを調節できること、およびさらに、ヒト細胞は非成熟形態のマウスｍｉＲＮＡを機能的な成熟鎖を生じるようにプロセシングできる可能性があることが示された。さらに、ｍｉＲ－４６６ｃは、試験した異なる上皮および内皮のヒト細胞株において、相対する調節効果を示すようである。これは、ｓｈＲＮＡを異なる細胞株において試験したところＶｅｇｆａレベルに対する効果が異なっていたという、本発明者が先に得ていた結果と一致する。本発明者は先に、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃは、マウス内皮細胞において低酸素下のＶｅｇｆａ発現誘導のために必要であるが、ヒト内皮細胞においてはダウンレギュレーション効果を有するらしいことを見出していた。したがって、ＶＥＧＦＡレベルに対するｍｉＲ－４６６ｃ合成ミミックの効果は、試験する細胞の種類に依存するようである。試験したヒト内皮細胞株において見られた強いＶＥＧＦＡダウンレギュレーション効果は、将来、抗血管新生治療法として研究されうる。
【0087】
したがって、前記データは、哺乳動物細胞において遺伝子発現を調節するためのｍｉＲＮＡの能力を確証する。この結果は有望であり、ｍｉＲＮＡの核機能および遺伝子調節作用を示す証拠は増えつつある。ＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびタンパク質に先立つ、地球上で最初期の生命形態であったことが提唱されている。本願において提供されるｍｉＲＮＡおよび短鎖ノンコーディングＲＮＡは反復ジヌクレオチド配列を多く含むことを認識することは有意義である。最初期形態のＲＮＡは、わずか２つの異なるヌクレオチドを含んで、その配列のバリエーションは最小限であったろう。ＤＮＡはまだ存在しなかったので、可変のＤＮＡコーディング配列は必要がなかった。したがって、本発明者は、本書において提供される反復配列を含む単鎖ＲＮＡは、太古の生物学からの調節分子でありうることを提案する。
【0088】
本発明が目的とするものの一つは、対象において少なくとも１つの細胞による不十分な量のＶＥＧＦＡポリペプチドによって引き起こされる障害を処置する方法であって、前記細胞に対するＶＥＧＦＡポリペプチドの少なくとも１つの活性を増加させるために、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を有効量で前記対象に投与することを含む方法である。
【0089】
本発明の他の一側面は、対象において少なくとも１つの細胞によるＶＥＧＦＡポリペプチドの産生を増加することによって創傷治癒を向上する方法であって、前記細胞に対するＶＥＧＦＡポリペプチドの少なくとも１つの活性を増加させ、それによって、持続的または頓挫のＶＥＧＦＡ仲介創傷治癒の発生を増加するために、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を有効量で前記対象に投与することを含む方法である。
【0090】
本発明の他の一側面は、組織において血管新生を増加する方法であって、前記組織に対するＶＥＧＦＡポリペプチドの少なくとも１つの活性を増加させるために、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を有効量で前記組織に投与することを含む方法である。
【0091】
本書において「血管新生」とは、血管構造の増殖またはリモデリングとして定義される。血管新生は、ＭＲＩ、血管造影および組織化学を包含するインビボおよびインビトロの方法によって診断または決定することができる。
【0092】
本発明の好ましい一側面は、ＶＥＧＦＡポリペプチドの産生不足によって引き起こされる、血管新生に関連する障害を処置する方法である。より好ましい側面において、血管新生は血管発生である。より一層好ましい側面において、前記障害は、注射線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、放射線誘発肺線維症、ブレオマイシン肺、サルコイドーシス、珪肺症、肺線維症、家族性肺線維症、非特異性間質性肺炎、自己免疫疾患、腎臓移植線維症、心臓移植線維症、肝臓移植線維症、瘢痕化、糸球体腎炎、肝硬変、全身性硬化症、または増殖性硝子体網膜症からなる群から選択される線維性障害である。
【0093】
本発明のより好ましい一側面は、ＶＥＧＦＡポリペプチドの量が少なすぎることによって引き起こされる、心臓血管疾患である障害を処置する方法である。前記心臓血管疾患は、心臓疾患、心筋虚血、心不全および末梢血管疾患からなる群から選択することができる。
【0094】
「心臓疾患」は、急性および／または慢性の心機能不全をいう。心臓疾患は、心臓収縮機能の低下にしばしば関連し、心筋への血流の観察可能な低下（例えば冠動脈疾患の結果としてのもの）に関連しうる。心臓疾患の現れには心筋虚血が包含され、これは、狭心症、心臓発作および／またはうっ血性心不全をもたらしうる。
【0095】
「心筋虚血」は、典型的には（例えば冠動脈疾患の結果として）心筋への血液供給が不十分であるために、心臓の筋肉が十分なレベルの酸素および栄養物を受け取ることのできない状態である。
【0096】
「心不全」とは、心臓が身体に、代謝要求に見合う十分な血流を提供しない状態として臨床的に定義される。症状には、息切れ、疲労、衰弱、下肢の腫脹、および運動耐容能低下が含まれる。心不全患者は身体検査において、高い心拍数および呼吸数、ラッセル音（肺に液体が存在することを示す）、浮腫、頸静脈拡張、そして多くの場合に心臓肥大を示す傾向がある。重篤な心不全の患者は死亡率が高く、典型的には５０％の患者が、その状態の発症から２年以内に死亡する。いくつかの場合、心不全は、本書および従来技術に記載されるように、心筋梗塞および進行性慢性心不全か急性低拍出状態のいずれかを典型的にはもたらす重篤な冠動脈疾患（「ＣＡＤ」）に関連する。他のいくつかの場合、心不全は、重篤な冠動脈疾患に関連しない拡張型心筋症に関連する。
【0097】
「末梢血管疾患」とは、末梢の（すなわち心臓でない）血管系および／またはそれにより供給を受ける組織の、急性または慢性機能不全をいう。心臓疾患と同様、末梢血管疾患も典型的には、該血管系により供給を受ける組織への血流が不十分である結果として起こり、この血液不足は、例えば虚血、または重篤な場合には組織細胞死をもたらしうる。末梢血管疾患の側面は、末梢閉塞性動脈疾患（ＰＡＯＤ）および末梢筋虚血を包含するが、それに限定されない。末梢血管疾患の症状はしばしば、患者の四肢、特に脚に現れる。
【0098】
本発明の他の一側面は、組織における出血を減少する方法であって、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対する同一性が少なくとも８０％であるｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を、前記組織に対するＶＥＧＦＡポリペプチドの活性を高めるために有効量で前記組織に投与することを含む方法である。
【0099】
本発明の他の一側面は、組織における内皮細胞増殖を増加する方法であって、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対する同一性が少なくとも８０％であるｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を、前記組織に対するＶＥＧＦポリペプチドの活性を高めるために有効量で前記組織に投与することを含む方法である。
【0100】
本発明の他の一側面は、組織における創傷治癒を高める方法であって、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の少なくとも１つの配列に対する同一性が少なくとも８０％であるｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ組成物を、前記組織に対するＶＥＧＦポリペプチドの活性を高めるために有効量で前記組織に投与することを含む方法である。
【0101】
本発明の一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列に対する同一性が少なくとも８０％である合成オリゴヌクレオチドである。特に、合成オリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６のｍｉＲＮＡに対する同一性が少なくとも８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【0102】
本発明の他の一側面は、心臓血管疾患の診断方法であって、
（ａ）心臓血管疾患を患うことが疑われる個体からのサンプルを提供し；
（ｂ）該サンプルにおける配列番号１５および配列番号１６から選択される少なくとも１つの配列の発現レベルを測定する
ステップを含み；
ここで、配列番号１５および配列番号１６から選択される少なくとも１つの配列の発現レベルが、対照サンプルと比較して高いまたは低いことは、心臓疾患があること、または心臓血管疾患があるかもしくはそれに罹る傾向があることを示す、
方法である。
（ａ）心臓血管疾患を患うことが疑われる個体からのサンプルを提供し；
（ｂ）該サンプルにおける配列番号１５および配列番号１６から選択される少なくとも１つの配列の発現レベルを測定する
ステップを含み；
ここで、配列番号１５および配列番号１６から選択される少なくとも１つの配列の発現レベルが、対照サンプルと比較して高いまたは低いことは、心臓疾患があること、または心臓血管疾患があるかもしくはそれに罹る傾向があることを示す、
方法である。
【0103】
本発明の好ましい一側面は、上記に開示した、一本鎖である合成核酸分子である。本発明の他の好ましい一側面は、上記に開示した、少なくとも部分的に二本鎖である合成核酸分子である。本発明の好ましい一側面は、上記に開示した、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子から選択される合成核酸分子である。本発明の他の好ましい一側面は、上記に開示した、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドアナログを含む合成核酸分子である。本発明のより好ましい一側面において、該改変は、核酸塩基改変、糖改変、糖間結合改変、バックボーン改変、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0104】
本発明の他の一側面は、対象において心筋梗塞または慢性心不全を処置する方法であって、
（ａ）の処置を必要とする対象を特定および選択すること；および
（ｂ）選択した対象に、マイクロＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃまたはｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐを処置有効量で投与すること；ここで、ｍｉＲ－４６６ｃは、配列番号５、配列番号６、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号５、配列番号６、配列番号３または配列番号４に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含み、ｍｉＲ－２９７は、配列番号１５のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号１５に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含み、ｍｉＲ－５７４－３ｐは、配列番号１６のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号１６に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含む、
を含む方法である。
（ａ）の処置を必要とする対象を特定および選択すること；および
（ｂ）選択した対象に、マイクロＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃまたはｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐを処置有効量で投与すること；ここで、ｍｉＲ－４６６ｃは、配列番号５、配列番号６、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号５、配列番号６、配列番号３または配列番号４に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含み、ｍｉＲ－２９７は、配列番号１５のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号１５に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含み、ｍｉＲ－５７４－３ｐは、配列番号１６のヌクレオチド１～８と１００％同一である領域を含んで、配列番号１６に対する同一性少なくとも８０％で少なくとも１８、１９または２０個のヌクレオチドを含む、
を含む方法である。
【0105】
本発明の一側面は、必要とする対象において心筋梗塞、心臓リモデリングまたは心不全を治療または予防する方法であって、対象の心臓細胞における配列番号３、４、５、６、１５もしくは１６のｍｉＲＮＡまたはそのホモログの１つ以上の発現または活性を調節することを含む方法である。
【0106】
本発明の一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列に対する配列同一性が少なくとも８０％である合成ｍｉＲＮＡ分子である。
【0107】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号３に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0108】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号４に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0109】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号５に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0110】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号１５に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0111】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号１６に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0112】
本発明の好ましい一側面によると、合成ｍｉＲＮＡ分子は配列番号６に対し少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0113】
本発明のより好ましい一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列に対する配列同一性が少なくとも８５％である合成ｍｉＲＮＡ分子である。
【0114】
本発明のより好ましい一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列に対する配列同一性が少なくとも９０％である合成ｍｉＲＮＡ分子である。
【0115】
本発明のより好ましい一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列に対する配列同一性が少なくとも９５％である合成ｍｉＲＮＡ分子である。
【0116】
本発明のより好ましい一側面は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５もしくは配列番号１６またはその相補的配列を含む核酸配列を有する合成ｍｉＲＮＡ分子である。
【0117】
本発明の他の一側面は、前記に開示した合成ｍｉＲＮＡ分子であり、ここで、前記核酸分子は１４～３０ヌクレオチドの長さである。本発明の他の一側面は、前記に開示した合成ｍｉＲＮＡ分子であり、ここで、シード配列はＧＡＵＧＵＧＵまたはＵＡＣＡＵＡＣまたはＵＧＵＡＵＧＵＧを含む。最も好ましいシード配列はＧＡＵＧＵＧＵを含む。本発明の他の一側面は、本発明の合成ｍｉＲＮＡ分子であり、ここで、前記核酸分子は標的遺伝子のプロモーター領域または３’ＵＴＲに結合する。本発明の好ましい一態様は、本発明の合成ｍｉＲＮＡ分子であり、ここで、標的遺伝子はＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤまたはＨＩＦ１Ａである。最も好ましい態様において、合成ｍｉＲＮＡ分子の標的遺伝子はＶＥＧＦＡである。
【0118】
より好ましい態様において、本発明の合成ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドアナログを含む。他の好ましい一態様において、合成ｍｉＲＮＡ分子は、心臓血管疾患の処置における使用のためのものである。
【0119】
本発明の一側面は、少なくとも１つの本発明の合成ｍｉＲＮＡ分子および担体または賦形剤を含む医薬組成物である。より好ましい側面において、前記医薬組成物の担体または賦形剤は、医療処置適用のために適当なものである。本発明のより好ましい態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容しうる添加剤をさらに含む。最も好ましい態様において、医薬組成物は、心臓血管疾患の処置における使用のためのものである。
【0120】
本発明の一側面は、本発明の少なくとも１つの合成ｍｉＲＮＡ分子を含む組換え発現ベクターである。本発明の他の一側面は、前記組換え発現ベクターを含む細胞である。
【0121】
本発明の一側面は、ヒトにおいて標的タンパク質の発現を調節する方法であって、それを必要とする対象に本発明の合成ｍｉＲＮＡ分子を投与することを含む方法である。本発明のより好ましい側面は、この方法であって、標的タンパク質の発現を増加する方法である。本発明のより好ましい側面によると、標的タンパク質の発現は少なくとも３０％増加する。本発明の最も好ましい態様において、標的タンパク質は少なくとも５０％増加する。
【0122】
他の好ましい一態様において、前記方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６に対する配列同一性が少なくとも８０％である少なくとも１つの合成ｍｉＲＮＡを有効量で対象に投与することを含む。より好ましい態様において、投与するｍｉＲＮＡは、前記配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、投与するｍｉＲＮＡは、前記配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、投与するｍｉＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号３、配列番号４、配列番号１５または配列番号１６の配列を含む。
【0123】
本発明の他の一側面は、対象に心臓血管疾患のリスクがあるまたは対象が心臓血管疾患に罹っているかを決定する方法であって、
（Ａ）心臓血管疾患が疑われる個体のサンプルを提供し：
（Ｂ）場合により、前記サンプルからＲＮＡを抽出し：
（Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲによりｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐの発現レベルを測定する
ステップを含み、ここで、；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐの発現レベルが対照サンプルと比較して低いことは、心臓血管疾患があること、または心臓血管疾患に罹る傾向があることを示す、方法である。
（Ａ）心臓血管疾患が疑われる個体のサンプルを提供し：
（Ｂ）場合により、前記サンプルからＲＮＡを抽出し：
（Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲによりｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐの発現レベルを測定する
ステップを含み、ここで、；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７またはｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐの発現レベルが対照サンプルと比較して低いことは、心臓血管疾患があること、または心臓血管疾患に罹る傾向があることを示す、方法である。
【実施例】
【0124】
細胞培養
マウスＣ１６６（卵黄嚢由来マウス内皮細胞株、ATCC: CRL-2581）細胞、ヒトＥＡ．ｈｙ９２６（体細胞ハイブリッド内皮細胞、ATCC: CRL-2922）およびヒトＡＲＰＥ－１９（網膜上皮細胞、ATCC: CRL-2302）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich）中に、通常の条件（３７℃、５％ＣＯ２）下に維持した。
マウスＣ１６６（卵黄嚢由来マウス内皮細胞株、ATCC: CRL-2581）細胞、ヒトＥＡ．ｈｙ９２６（体細胞ハイブリッド内皮細胞、ATCC: CRL-2922）およびヒトＡＲＰＥ－１９（網膜上皮細胞、ATCC: CRL-2302）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich）中に、通常の条件（３７℃、５％ＣＯ２）下に維持した。
【0125】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクトされたＣ１６６細胞を、細胞ソーティング直後に２０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ中に、通常の条件（３７℃、５％ＣＯ２）下に維持した。
【0126】
Ｃ１６６細胞株を用いて行ったＣ１６６細胞株低酸素実験の間、細胞を通常の培地中で、低酸素条件（１％Ｏ２、５％ＣＯ２）下に培養した。
【0127】
レンチウイルスｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ発現ベクターの作製
第三世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのLV-PGK-GFP-U6-RNAベクターをｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの過剰発現のために使用した。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを、ゲノムコンテキストにおけるヘアピン（全部で２５５ｂｐのフラグメント）としてクローニングプライマー（配列番号７および８）を用いるＰＣＲクローニングによってベクター中にクローン化した。対照として、ＧＦＰのみをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を使用した。ベクターを標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって２９３Ｔ細胞中に調製した。
第三世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのLV-PGK-GFP-U6-RNAベクターをｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの過剰発現のために使用した。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを、ゲノムコンテキストにおけるヘアピン（全部で２５５ｂｐのフラグメント）としてクローニングプライマー（配列番号７および８）を用いるＰＣＲクローニングによってベクター中にクローン化した。対照として、ＧＦＰのみをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を使用した。ベクターを標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって２９３Ｔ細胞中に調製した。
【0128】
ｍｉＲＮＡミミックの作製
内因性ｍｉＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐに対して、およびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの合成バージョンに対して、ｍｉＲＮＡミミックを作製した（融合ミミックおよび反復ミミック）（配列番号３～６）。所望のｍｉＲＮＡ配列をDharmaconに提示し、Dharmaconにおいて、ＥＰ２２６１３３４Ａ２に開示されるようなmiRIDIANマイクロＲＮＡミミック用のプロトコルにしたがってミミックが作製された。
内因性ｍｉＲＮＡであるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐに対して、およびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの合成バージョンに対して、ｍｉＲＮＡミミックを作製した（融合ミミックおよび反復ミミック）（配列番号３～６）。所望のｍｉＲＮＡ配列をDharmaconに提示し、Dharmaconにおいて、ＥＰ２２６１３３４Ａ２に開示されるようなmiRIDIANマイクロＲＮＡミミック用のプロトコルにしたがってミミックが作製された。
【0129】
レンチウイルスのトランスダクション
第三世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのLV-PGK-GFP-U6-RNAベクターをｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの過剰発現のために使用した。対照として、ＧＦＰのみをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を使用した。ベクターを標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって２９３Ｔ細胞中に調製した。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ－４６６）をＣ１６６細胞に導入した。細胞にＭＯＩ１０で導入し、導入の５日後にサンプルを採取した。
第三世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのLV-PGK-GFP-U6-RNAベクターをｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃの過剰発現のために使用した。対照として、ＧＦＰのみをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を使用した。ベクターを標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法によって２９３Ｔ細胞中に調製した。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ－４６６）をＣ１６６細胞に導入した。細胞にＭＯＩ１０で導入し、導入の５日後にサンプルを採取した。
【0130】
ｍｉＲ－４６６ｃ合成ミミックのトランスフェクション
ｍｉＲＮＡミミックのヒト細胞株へのトランスフェクションのために、至適トランスフェクション効率を見出し、細胞死の割合を低下するために、本発明者は、ヒト網膜上皮ＡＲＰＥ－１９細胞への異なる比のトランスフェクション試薬／蛍光ｓｉＲＮＡを試験した。７．５μｌのMirus TransIT-TKO（登録商標）試薬および３０ｐｍｏｌの蛍光ｓｉＲＮＡ（cat# AM4620, Ambion）を用いた場合に、最高の効率（９９．８３％）が達成され、それを後に、ヒトＥＡ．ｈｙ９２６細胞へのミミックのトランスフェクションのためにも用いた。
ｍｉＲＮＡミミックのヒト細胞株へのトランスフェクションのために、至適トランスフェクション効率を見出し、細胞死の割合を低下するために、本発明者は、ヒト網膜上皮ＡＲＰＥ－１９細胞への異なる比のトランスフェクション試薬／蛍光ｓｉＲＮＡを試験した。７．５μｌのMirus TransIT-TKO（登録商標）試薬および３０ｐｍｏｌの蛍光ｓｉＲＮＡ（cat# AM4620, Ambion）を用いた場合に、最高の効率（９９．８３％）が達成され、それを後に、ヒトＥＡ．ｈｙ９２６細胞へのミミックのトランスフェクションのためにも用いた。
【0131】
ｍｉＲＮＡミミックのトランスフェクションのために、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞およびＡＲＰＥ－１９細胞を、それぞれ７．５×１０４細胞／ウェルおよび１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、全量３０ｐｍｏｌ／ウェルの合成４６６ｃ－マイクロＲＮＡミミックまたは陰性対照ｓｉＲＮＡ（cat# AM4611, Ambion）で細胞をトランスフェクトした。１つのウェルにつき、ｍｉＲＮＡミミックを、２５０μｌの無血清ＤＭＥＭで希釈した７．５μｌのMirus TransIT-TKO（登録商標）試薬と組み合わせ、室温で１５～３０分間インキュベートした。３つの異なる種類のミミックを試験した：ｉ）細胞プロセシング後に３ｐまたは５ｐ鎖のみを生じるようにデザインされ化学的に修飾されたヘアピン構造ミミック（ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ／５ｐ ｍｉｍ；Dharmacon）；ii）３ｐおよび５ｐの一本鎖ミミック（ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－３ｐ／５ｐ ｍｉｍ；IDT）；iii）ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ ３ｐおよび５ｐ鎖がアニーリングされたものからなる二本鎖構造ミミック（ｄｕｐｌｅｘ）。
【0132】
陰性対照トランスフェクションのために、陰性対照ｓｉＲＮＡ（cat# AM4611, Ambion）を用いた。次いで、トランスフェクションの４８時間後に、ＴＲＩ試薬（Molecular Research Center）を製造者の指示にしたがって使用して、全ＲＮＡ抽出を行った。
【0133】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成および定量ＲＴ－ＰＣＲ
遺伝子発現分析のために、全ＲＮＡをミミック処理細胞およびＴＳＢ処理細胞からＴＲＩ試薬（Molecular Research Center）を製造者の指示にしたがって使用して抽出し、DNAse I, RNAse-freeキット（cat. #EN0523, Thermofisher Scientific）で処理した。得られたｍＲＮＡを、RevertAid RT逆転写キット（cat. #K1691, ThermoFisher Scientific）を製造者のプロトコルにしたがって使用して逆転写した。ＥＡ．ｈｙ９２６およびＡＲＰＥ１９サンプルにおける発現の分析のために、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて、ＶＥＧＦＡおよびＡＣＴＢ定量を行った（ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ ＩＤ：４６４８９６＿ｍａｔ；ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ ＩＤ：４６３７７１＿ｍａｔ；ＶＥＧＦＡ ＩＤ：Ｈｓ００１７３６２６＿ｍ１；ＡＣＴＢ ＩＤ：Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１；Life Technologies）。Ｃ１６６サンプルにおける発現の分析のために、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて、ＶｅｇｆａおよびＡｃｔｂ定量を行った（Ｖｅｇｆａ ＩＤ：Ｍｍ００４３７３０６＿ｍ１；Ａｃｔｂ ＩＤ：Ｍｍ＿００６０７９３９＿ｓ１；Life Technologies）。ｍｉＲＮＡコピーの絶対数を決定するために、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対応する一本鎖合成ＲＮＡ分子の標準曲線を作製した。Ｖｅｇｆａ、Ｓｆｍｂｔ２、Ｙｙ１およびＨｉｆ１αの発現分析のために、Transcriptor First Strand ｃＤＮＡ合成キット（Roche）を用いてｃＤＮＡを合成し、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて定量を行った（Ｖｅｇｆａ ＩＤ：Ｍｍ００４３７３０６＿ｍ１；Ｓｆｍｂｔ２ ＩＤ：Ｍｍ００６１６７８３＿ｍ１；Ｙｙ１ ＩＤ：Ｍｍ００４５６３９２＿ｍ１；Ｈｉｆ１α ＩＤ：Ｍｍ０１１９８３７６＿ｍ１；内因性対照Ａｃｔｂ ＩＤ：Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１；Life Technologies）。
遺伝子発現分析のために、全ＲＮＡをミミック処理細胞およびＴＳＢ処理細胞からＴＲＩ試薬（Molecular Research Center）を製造者の指示にしたがって使用して抽出し、DNAse I, RNAse-freeキット（cat. #EN0523, Thermofisher Scientific）で処理した。得られたｍＲＮＡを、RevertAid RT逆転写キット（cat. #K1691, ThermoFisher Scientific）を製造者のプロトコルにしたがって使用して逆転写した。ＥＡ．ｈｙ９２６およびＡＲＰＥ１９サンプルにおける発現の分析のために、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて、ＶＥＧＦＡおよびＡＣＴＢ定量を行った（ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ ＩＤ：４６４８９６＿ｍａｔ；ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ ＩＤ：４６３７７１＿ｍａｔ；ＶＥＧＦＡ ＩＤ：Ｈｓ００１７３６２６＿ｍ１；ＡＣＴＢ ＩＤ：Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１；Life Technologies）。Ｃ１６６サンプルにおける発現の分析のために、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて、ＶｅｇｆａおよびＡｃｔｂ定量を行った（Ｖｅｇｆａ ＩＤ：Ｍｍ００４３７３０６＿ｍ１；Ａｃｔｂ ＩＤ：Ｍｍ＿００６０７９３９＿ｓ１；Life Technologies）。ｍｉＲＮＡコピーの絶対数を決定するために、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対応する一本鎖合成ＲＮＡ分子の標準曲線を作製した。Ｖｅｇｆａ、Ｓｆｍｂｔ２、Ｙｙ１およびＨｉｆ１αの発現分析のために、Transcriptor First Strand ｃＤＮＡ合成キット（Roche）を用いてｃＤＮＡを合成し、TaqMan遺伝子発現アッセイを用いて定量を行った（Ｖｅｇｆａ ＩＤ：Ｍｍ００４３７３０６＿ｍ１；Ｓｆｍｂｔ２ ＩＤ：Ｍｍ００６１６７８３＿ｍ１；Ｙｙ１ ＩＤ：Ｍｍ００４５６３９２＿ｍ１；Ｈｉｆ１α ＩＤ：Ｍｍ０１１９８３７６＿ｍ１；内因性対照Ａｃｔｂ ＩＤ：Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１；Life Technologies）。
【0134】
データ分析
すべての分析を、Prism 5（GraphPad Software）を用いて行った。データを、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて比較した。有意性レベルをＰ＜０．０５に設定した。データを、平均±ＳＤとして示した。生物学的に独立した実験の数およびＰ値を、本文または図面の説明文において示す。
すべての分析を、Prism 5（GraphPad Software）を用いて行った。データを、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて比較した。有意性レベルをＰ＜０．０５に設定した。データを、平均±ＳＤとして示した。生物学的に独立した実験の数およびＰ値を、本文または図面の説明文において示す。
【実施例1】
【0135】
ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ除去は、低酸素内皮細胞におけるＶｅｇｆａ発現を消失させる
低酸素反応におけるＶｅｇｆａ調節におけるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６の役割を分析するために、ＣＲＩＳＰＲ仲介遺伝子編集を用いて、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ヘアピンを含むＳｆｍｂｔ２イントロン１０から９７ｂｐ領域を除去した。Ｖｅｇｆａ発現は低酸素時にアップレギュレートされることが知られている。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６の除去後、低酸素において通常観察されるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６発現の誘導は見られなかった（図４Ａ）。親遺伝子Ｓｆｍｂｔ２の発現も、もはや低酸素刺激に応答して誘導されなかった（図４Ｂ）。重要なことに、ｍｉＲＮＡを除去すると、低酸素に応答するＶｅｇｆａ発現のアップレギュレーションも消失した（図４Ｃ）。レンチウイルスのトランスダクションによってｍｉＲ－４６６レベルを回復させると、Ｖｅｇｆａレベルは酸素が正常な条件および低酸素条件の両方で等しく上昇したが、低酸素によるＶｅｇｆａ発現のさらなる誘導は見られなかった（図４Ｄ）。
低酸素反応におけるＶｅｇｆａ調節におけるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６の役割を分析するために、ＣＲＩＳＰＲ仲介遺伝子編集を用いて、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ヘアピンを含むＳｆｍｂｔ２イントロン１０から９７ｂｐ領域を除去した。Ｖｅｇｆａ発現は低酸素時にアップレギュレートされることが知られている。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６の除去後、低酸素において通常観察されるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６発現の誘導は見られなかった（図４Ａ）。親遺伝子Ｓｆｍｂｔ２の発現も、もはや低酸素刺激に応答して誘導されなかった（図４Ｂ）。重要なことに、ｍｉＲＮＡを除去すると、低酸素に応答するＶｅｇｆａ発現のアップレギュレーションも消失した（図４Ｃ）。レンチウイルスのトランスダクションによってｍｉＲ－４６６レベルを回復させると、Ｖｅｇｆａレベルは酸素が正常な条件および低酸素条件の両方で等しく上昇したが、低酸素によるＶｅｇｆａ発現のさらなる誘導は見られなかった（図４Ｄ）。
【実施例2】
【0136】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ欠失細胞株の作製
Ｓｆｍｂｔ２のイントロン１０からｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを除去するために、２つのガイドＲＮＡを別々の発現プラスミド中にクローン化し（pcDNA-H1-sgRNA、図９参照）、Nucleofector I（Amaxa）を用いて、ＧＦＰを同時発現するＣａｓ９プラスミド（PX458, cat. #48138, Addgene）と共にＣ１６６細胞に導入した。例えばＵＳ８６９７３５９Ｂ１に開示されるようにして、ＣＲＩＳＰＲをガイドオリゴ（配列番号９～１２）によって欠失サイドに導いた。ＧＦＰ陽性に基づいて、ソーティングＦＡＣＳ（BD FACSARIA III Cell Sorter）を用いて単一細胞を９６ウェルプレートのウェル中にソートして、クローン細胞集団を確立した。培養をＰＣＲによってジェノタイピングして所望の欠失を有する細胞を特定し、陽性クローンをサンガーシーケンシングによってさらに確認した。
Ｓｆｍｂｔ２のイントロン１０からｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃを除去するために、２つのガイドＲＮＡを別々の発現プラスミド中にクローン化し（pcDNA-H1-sgRNA、図９参照）、Nucleofector I（Amaxa）を用いて、ＧＦＰを同時発現するＣａｓ９プラスミド（PX458, cat. #48138, Addgene）と共にＣ１６６細胞に導入した。例えばＵＳ８６９７３５９Ｂ１に開示されるようにして、ＣＲＩＳＰＲをガイドオリゴ（配列番号９～１２）によって欠失サイドに導いた。ＧＦＰ陽性に基づいて、ソーティングＦＡＣＳ（BD FACSARIA III Cell Sorter）を用いて単一細胞を９６ウェルプレートのウェル中にソートして、クローン細胞集団を確立した。培養をＰＣＲによってジェノタイピングして所望の欠失を有する細胞を特定し、陽性クローンをサンガーシーケンシングによってさらに確認した。
【0137】
【表1】
【表2】
【実施例3】
【0138】
ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃはヒト細胞株においてＶＥＧＦＡを調節する
マウスｍｉＲ－４６６ｃがヒトＶＥＧＦＡのｍＲＮＡレベルにおいて何らかの作用を示しうるかを試験するために、本発明者は、ヒトＥａ．ｈｙ９２６およびＡＲＰＥ－１９細胞を合成ｍｉＲ－４６６ｃミミックでトランスフェクトした。
マウスｍｉＲ－４６６ｃがヒトＶＥＧＦＡのｍＲＮＡレベルにおいて何らかの作用を示しうるかを試験するために、本発明者は、ヒトＥａ．ｈｙ９２６およびＡＲＰＥ－１９細胞を合成ｍｉＲ－４６６ｃミミックでトランスフェクトした。
【0139】
ヘアピン形態ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐ ｍｉｍで処理したＥａ．ｈｙ９２６サンプルにおいて行ったｔ－スチューデント検定により、陰性対照トランスフェクションと比較して（陰性対照ｓｉＲＮＡ cat# AM4611, Ambion）、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルが有意に低下したことが示された（図５）。ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐミミックは、ＶＥＧＦＡを、およそ３倍のダウンレギュレーション（０．２９６ fold-change）を誘導することによってダウンレギュレートすることができた。一本鎖ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－３ｐミミックで細胞を処理した場合も、同じ効果が観察され、ＶＥＧＦＡを、陰性対照トランスフェクションと比較しておよそ１．４２倍のダウンレギュレーション（０．６９７ fold-change）を誘導することによってダウンレギュレートすることができた（図６）。
【0140】
一方、ヘアピンミミック５ｐ（ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐ ｍｉｍ）および一本鎖形態ミミック５ｐ（ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－５ｐ）を試験すると、いずれも、陰性対照サンプルと比較してＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルに影響を示さなかった（図５および図６）。
【0141】
本発明者は次に、一本鎖ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ ３ｐおよびｓｓＲＮＡ－４６６ｃ ５ｐミミックがアニーリングされたものからなる合成二本鎖形態のｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｃ（４６６ｃ ｄｕｐｌｅｘ）が、該鎖を別個に導入した場合に観察されるのと同様の機能を発揮しうるかを試験した。合成二本鎖形態をＥａ．ｈｙ９２６細胞に導入した場合は、ＶＥＧＦＡ発現は、陰性対照トランスフェクションと比較して１．５６倍（０．６４ fold-change）で、有意にダウンレギュレートされた（図６）。ＡＲＰＥ－１９細胞にｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６を発現するレンチウイルスベクターを導入した場合は、ＶＥＧＦＡ発現は、５日目の時点で対照と比較して増加した（図７）。ヘアピン形態ミミックｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐで処理したＡＲＰＥ－１９サンプルにおいて行ったｔ－スチューデント検定によると、陰性対照トランスフェクションと比較して、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡレベルは有意にアップレギュレートされた（図８）。合成５ｐ－ｆｕｓｉｏｎおよび５ｐ－ｒｅｐｅａｔのＲＮＡは、ＡＲＰＥ－１９細胞においてＶＥＧＦＡ発現を、ＮＴ対照と比較して２倍増加させた。ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐミミック（５ｐ ｍｉｍ）はＶＥＧＦＡ発現を３．６倍増加させた（図９）。ｍｉＲ－４６６ｃ－３ｐミミックおよびｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐは、陰性対照と比較して、ＶＥＧＦＡのｍＲＮＡレベルにおいて１．６２倍および２．４３倍の変化をそれぞれ誘導することができた。一本鎖ミミックに関しては、ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－５ｐのみが、陰性対照と比較して１．１８倍の変化というＶＥＧＦＡ発現のわずかなアップレギュレーションを誘導することができた。ｓｓＲＮＡ－４６６ｃ－３ｐおよび二本鎖構造は、ＶＥＧＦＡ発現において有意な変化を誘導しなかった（図１０）。
【実施例4】
【0142】
ｍｉＲＮＡ投与後の細胞生存性
細胞に対するｍｉＲＮＡの潜在的傷害性を調べるために、ｍｉＲＮＡミミックのトランスフェクション後の細胞生存性を評価した。ｍｉＲＮＡミミックが細胞の生存性または増殖における変化を誘導するかを調べるために、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存性を試験した。本試験に使用した配列は、配列番号１７～１９のもの、すなわちｒｅｐｅａｔ ｏｎｌｙ ｍｉＲ－４６６ｃ、ｓｅｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐおよびｓｅｅｄ-ｆｕｓｉｏｎ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐであった。いずれのミミックも、ＡＲＰＥ－１９細胞培養において細胞生存性を低下せず、したがってｍｉＲＮＡ投与後に傷害性は観察されなかった。Ｆｕｓｉｏｎ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐミミックおよびＲｅｐｅａｔ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐは、対照（市販の陰性対照ｓｉＲＮＡ）と比較して、むしろ細胞生存性を向上した。これらの結果（図１３）は、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐが細胞増殖を高め、再生力を示すことを示している。
細胞に対するｍｉＲＮＡの潜在的傷害性を調べるために、ｍｉＲＮＡミミックのトランスフェクション後の細胞生存性を評価した。ｍｉＲＮＡミミックが細胞の生存性または増殖における変化を誘導するかを調べるために、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存性を試験した。本試験に使用した配列は、配列番号１７～１９のもの、すなわちｒｅｐｅａｔ ｏｎｌｙ ｍｉＲ－４６６ｃ、ｓｅｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐおよびｓｅｅｄ-ｆｕｓｉｏｎ ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐであった。いずれのミミックも、ＡＲＰＥ－１９細胞培養において細胞生存性を低下せず、したがってｍｉＲＮＡ投与後に傷害性は観察されなかった。Ｆｕｓｉｏｎ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐミミックおよびＲｅｐｅａｔ－ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐは、対照（市販の陰性対照ｓｉＲＮＡ）と比較して、むしろ細胞生存性を向上した。これらの結果（図１３）は、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐが細胞増殖を高め、再生力を示すことを示している。
【0143】
実施例の「ｍｉＲＮＡ－４６６ｃ合成ミミックのトランスフェクション」に記載するようにして、ＡＲＰＥ－１９細胞をｍｉＲＮＡミミックでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後の細胞生存性を、比色ＭＴＴアッセイ（Biotium, cat # 30006）を製造者のプロトコルにしたがって使用して調べた。ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾル－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイは、生存細胞の量、および薬物投与後の増殖の違いを決定するための確立されたプロトコルである（Kumar et al, Cold Spring Harb Protoc. 2018 Jun 1;2018(6). doi: 10.1101/pdb.prot095505）。結果は、市販の陰性対照ｓｉＲＮＡ（Silencer（商標） Negative Control No. 1 siRNA, Thermo Fisher Scientific, cat # AM4611）でトランスフェクトした細胞との比較で計算する。
【実施例5】
【0144】
細胞外ベシクル中のｍｉＲＮＡパッケージング
細胞外ベシクル中のｍｉＲＮＡパッケージングを示す図を、図１４に示す。ｍｉＲＮＡは細胞外ベシクル（ＥＶ）といった送達ベヒクル内にパッケージングされたとき、より効果的に血液中を循環し標的組織に取り込まれる。送達ベヒクルはまた、ＲＮＡを、血液中に存在するエンドリボヌクレアーゼによる分解から保護する。ＥＶは、プロデューサー細胞株においてｍｉＲＮＡおよび改変ＥＶ融合タンパク質（ＦＰ）を過剰発現することによって改変することができる。融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（例えばＡｇｏ２由来）およびＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメイン（ＴＭＤ）（例えばＣＤ９またはＴＳＧ１０１タンパク質由来）が融合したものからなるので、ｍｉＲＮＡがＲＮＡ結合ドメインに結合し、それに連結されたＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメインが、ｍｉＲＮＡ－融合タンパク質複合体を、細胞内で生成されたＥＶへと導くことができる。治療用ｍｉＲＮＡをＥＶにパッケージングするために、融合タンパク質およびｍｉＲＮＡの両方をプロデューサー細胞株において過剰発現させる。これにより、各ＥＶ粒子内に搭載されるｍｉＲＮＡ量を増加し、より高濃度の治療用粒子を生成することができる。
細胞外ベシクル中のｍｉＲＮＡパッケージングを示す図を、図１４に示す。ｍｉＲＮＡは細胞外ベシクル（ＥＶ）といった送達ベヒクル内にパッケージングされたとき、より効果的に血液中を循環し標的組織に取り込まれる。送達ベヒクルはまた、ＲＮＡを、血液中に存在するエンドリボヌクレアーゼによる分解から保護する。ＥＶは、プロデューサー細胞株においてｍｉＲＮＡおよび改変ＥＶ融合タンパク質（ＦＰ）を過剰発現することによって改変することができる。融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（例えばＡｇｏ２由来）およびＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメイン（ＴＭＤ）（例えばＣＤ９またはＴＳＧ１０１タンパク質由来）が融合したものからなるので、ｍｉＲＮＡがＲＮＡ結合ドメインに結合し、それに連結されたＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメインが、ｍｉＲＮＡ－融合タンパク質複合体を、細胞内で生成されたＥＶへと導くことができる。治療用ｍｉＲＮＡをＥＶにパッケージングするために、融合タンパク質およびｍｉＲＮＡの両方をプロデューサー細胞株において過剰発現させる。これにより、各ＥＶ粒子内に搭載されるｍｉＲＮＡ量を増加し、より高濃度の治療用粒子を生成することができる。
【0145】
大量のｍｉＲＮＡ－ＥＶ薬剤を得るために、ｍｉＲＮＡおよびＥＶ融合タンパク質の過剰発現により改変したプロデューサー細胞株を、iCELLis Nanoバイオリアクター（Pall Corporation）中で増殖させる。（融合タンパク質作成は、Valkama et al. Gene Ther. 2018 Jan;25(1):39-46. doi: 10.1038/gt.2017.91. Epub 2017 Oct 5.に記載されるのと同様に行った。）これは、１つのバイオリアクターは４ｍ２の増殖面積および１Ｌの体積を有するために、細胞培養プレート上での生産よりも効率的である。ｍｉＲＮＡ－ＥＶを含む細胞培養培地を収集し、Nordin et al.（Methods Mol Biol. 2019;1953:287-299. doi: 10.1007/978-1-4939-9145-7_18）に記載されるようにしてＴＦＦ（培地の濃縮、ＰＢＳに対する透析）およびクロマトグラフィー（より精製されたＥＶ集団を得るためのサイズ排除カラム）によって精製した。
【実施例6】
【0146】
融合タンパク質発現
ｍｉＲＮＡを担体ＥＶに効率的にパッケージングするために、融合タンパク質コンストラクトを作製した。融合タンパク質は、ＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載を促進するためにＲＮＡ結合ドメイン（Ａｇｏ２）とＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメイン（ＣＤ９またはＴＳＧ１０１）が融合されたものを含んだ。トランスフェクトされた細胞におけるＲＢＤおよびＴＭＤの免疫蛍光染色を、細胞中の共局在化を分析するために行った。これらドメインの共局在化は、２つのドメインが細胞中で互いに融合されており、個別には発現されていないことを示す。蛍光顕微鏡画像において、Ａｇｏ２およびＣＤ９両方の染色を、細胞の細胞質中（ＤＡＰＩ染色された細胞核の外側）の同じ領域に観察することができる（右図のマージ、図１５ｄ）。これは、融合タンパク質が正しく産生されることを示す。
ｍｉＲＮＡを担体ＥＶに効率的にパッケージングするために、融合タンパク質コンストラクトを作製した。融合タンパク質は、ＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載を促進するためにＲＮＡ結合ドメイン（Ａｇｏ２）とＥＶ特異的膜貫通タンパク質ドメイン（ＣＤ９またはＴＳＧ１０１）が融合されたものを含んだ。トランスフェクトされた細胞におけるＲＢＤおよびＴＭＤの免疫蛍光染色を、細胞中の共局在化を分析するために行った。これらドメインの共局在化は、２つのドメインが細胞中で互いに融合されており、個別には発現されていないことを示す。蛍光顕微鏡画像において、Ａｇｏ２およびＣＤ９両方の染色を、細胞の細胞質中（ＤＡＰＩ染色された細胞核の外側）の同じ領域に観察することができる（右図のマージ、図１５ｄ）。これは、融合タンパク質が正しく産生されることを示す。
【0147】
融合タンパク質のクローニング
SnapGeneソフトウェア（TM1.1.3）によってデザインした融合組換えタンパク質（ヒトＬＶ．ＣＤ９．ｈＡｇｏ２およびｈＴＳＧ１０１．ｈＡｇｏ２）を、pLenti-hPGKバックボーン中に組み込んだ。融合タンパク質のクローニング用のプライマーは、それぞれ配列番号２０～３１のものであった。ヒトＡｇｏ２フラグメントを、Dr. Markus Hafner（Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation）から提供されたmCLOVER-NLS-AGO2プラスミドから増幅した。High-Capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems（商標）,4368814）を用いて、ＣＤ９フラグメントをＨＥＫ－２９３ｃＤＮＡから増幅し、ＴＳＧ１０１をＡＲＰＥ細胞株のｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ反応にCloneAmp HiFi PCR Premix（Takara Bio USA, 639298）を使用し、フラグメントの融合およびクローニングにIn-Fusion（登録商標）HDクローニングキット（Takara Bio USA, 638909）を製造者のプロトコルにしたがって使用した。
SnapGeneソフトウェア（TM1.1.3）によってデザインした融合組換えタンパク質（ヒトＬＶ．ＣＤ９．ｈＡｇｏ２およびｈＴＳＧ１０１．ｈＡｇｏ２）を、pLenti-hPGKバックボーン中に組み込んだ。融合タンパク質のクローニング用のプライマーは、それぞれ配列番号２０～３１のものであった。ヒトＡｇｏ２フラグメントを、Dr. Markus Hafner（Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation）から提供されたmCLOVER-NLS-AGO2プラスミドから増幅した。High-Capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems（商標）,4368814）を用いて、ＣＤ９フラグメントをＨＥＫ－２９３ｃＤＮＡから増幅し、ＴＳＧ１０１をＡＲＰＥ細胞株のｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ反応にCloneAmp HiFi PCR Premix（Takara Bio USA, 639298）を使用し、フラグメントの融合およびクローニングにIn-Fusion（登録商標）HDクローニングキット（Takara Bio USA, 638909）を製造者のプロトコルにしたがって使用した。
【0148】
免疫蛍光
融合タンパク質の同時追跡のために、二重免疫蛍光染色法を用いた。ＨＥＫ－２９３細胞を６ウェルプレートにおいてカバースリップ上に培養し、TransIT（登録商標）トランスダクション試薬Mirusによって、作製したベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、７０～８０％のコンフルエンシーにて、細胞をＰＢＳで洗って死細胞およびデブリを除去し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）によって室温（ＲＴ）で１５分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗った。０．２５％Triton X-100によってＲＴで１５分間透過処理し、細胞をＰＢＳ－０．０５％Tween-20（ＰＢＳＴ）で５分間、３回洗った。非特異的結合部位をＰＢＳＴ中の１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（S-26-LITER, Merck Millipore）で、ＲＴで穏やかに震盪しながら３０分間ブロックした。一次および二次抗体を染色バッファー中に希釈した。融合タンパク質の同時の二重染色のために、２つの一次抗体（例えば一次抗ＣＤ９と一次抗Ａｇｏ２）および２つの二次抗体（Alexa Fluor-555とAlexa Fluor-488）を同じチューブ内で希釈し、混合した。細胞を一次抗体とＲＴで２時間、穏やかに反転させながらインキュベートし、次いでＰＢＳによりＲＴで５分間、３回洗った。二次染色のために、Alexa Fluor-555（抗ウサギ, 4413S, Cell signalling）およびAlexa Fluor-488（ヤギ抗マウス, 4408S, Cell signalling）を使用した。細胞を二次抗体とＲＴで１．５時間、穏やかに反転させながらインキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗い、カバースリップをＤＡＰＩを含むマウンティング培地（Vector Lab, H-1200）５０μｌと共に顕微鏡スライドに移し、ネイルポリッシュでシールした。LSM700共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM 700; Carl Zeiss Microscopy GmbH）を用いて共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行った。顕微鏡の構成は以下のとおりであった：対物レンズ：Plan-Apochromat 63X/1.40 oil M27。スタックモードでシーケンシャルスキャン（Ｚ方向０．５μｍ、およびスタックサイズ２０．５０μｍ）。励起：４０５ｎｍ（青：ＤＡＰＩ）、４８８ｎｍ（緑：Alexa Fluor-488）および５５５ｎｍ（赤：Alexa Fluor-555）。結果を図１５に示す。
融合タンパク質の同時追跡のために、二重免疫蛍光染色法を用いた。ＨＥＫ－２９３細胞を６ウェルプレートにおいてカバースリップ上に培養し、TransIT（登録商標）トランスダクション試薬Mirusによって、作製したベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、７０～８０％のコンフルエンシーにて、細胞をＰＢＳで洗って死細胞およびデブリを除去し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）によって室温（ＲＴ）で１５分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗った。０．２５％Triton X-100によってＲＴで１５分間透過処理し、細胞をＰＢＳ－０．０５％Tween-20（ＰＢＳＴ）で５分間、３回洗った。非特異的結合部位をＰＢＳＴ中の１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（S-26-LITER, Merck Millipore）で、ＲＴで穏やかに震盪しながら３０分間ブロックした。一次および二次抗体を染色バッファー中に希釈した。融合タンパク質の同時の二重染色のために、２つの一次抗体（例えば一次抗ＣＤ９と一次抗Ａｇｏ２）および２つの二次抗体（Alexa Fluor-555とAlexa Fluor-488）を同じチューブ内で希釈し、混合した。細胞を一次抗体とＲＴで２時間、穏やかに反転させながらインキュベートし、次いでＰＢＳによりＲＴで５分間、３回洗った。二次染色のために、Alexa Fluor-555（抗ウサギ, 4413S, Cell signalling）およびAlexa Fluor-488（ヤギ抗マウス, 4408S, Cell signalling）を使用した。細胞を二次抗体とＲＴで１．５時間、穏やかに反転させながらインキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗い、カバースリップをＤＡＰＩを含むマウンティング培地（Vector Lab, H-1200）５０μｌと共に顕微鏡スライドに移し、ネイルポリッシュでシールした。LSM700共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM 700; Carl Zeiss Microscopy GmbH）を用いて共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行った。顕微鏡の構成は以下のとおりであった：対物レンズ：Plan-Apochromat 63X/1.40 oil M27。スタックモードでシーケンシャルスキャン（Ｚ方向０．５μｍ、およびスタックサイズ２０．５０μｍ）。励起：４０５ｎｍ（青：ＤＡＰＩ）、４８８ｎｍ（緑：Alexa Fluor-488）および５５５ｎｍ（赤：Alexa Fluor-555）。結果を図１５に示す。
【実施例7】
【0149】
融合タンパク質のＲＮＡ搭載能
融合タンパク質によるＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載効率を、融合タンパク質およびｍｉＲ－４６６ｃ発現プラスミドでトランスフェクトしたプロデューサー細胞株から収集したＥＶからＲＮＡを単離し、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルをｑＰＣＲにより定量することによって評価した。実験の対照群は、融合タンパク質プラスミドの代わりにＧＦＰプラスミドでトランスフェクトし、それによってＥＶ中のｍｉＲ－４６６ｃのベースレベルを決定した。ＲＮＡを、各処理群について、ナノ粒子追跡分析（NanoSight NS300）によって評価される同数のＥＶ粒子から単離した。ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐのTaqmanマイクロＲＮＡアッセイによるｑＰＣＲにより、Ａｇｏ２およびＣＤ９からなる融合タンパク質は、Ａｇｏ２およびＴＳＧ１０１からなる融合タンパク質よりも効率的であることが示された（ｑＰＣＲ Ｃｔがそれぞれ２２．４および２３．８；ここで、より低いＣｔはより早期のｍｉＲＮＡ増殖を示し、したがって、サンプルが、より高いＣｔ値のサンプルよりも多くのｍｉＲＮＡを含むことを示す）。いずれの融合タンパク質のトランスフェクションも、対照群（Ｃｔ３３．３）と比較してＥＶ中のｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルを増加させることが示され、融合タンパク質発現がＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載を有意に増加させることが示された。Ａｇｏ２およびＣＤ９の融合タンパク質のトランスフェクションによるｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルは、対照群よりも１１Ｃｔ早く検出されたので、ＥＶ中のｍｉＲＮＡパッケージングが２０００倍増加したことが示された（ＤＮＡ量が各ＰＣＲサイクルにおいて２倍になるとした場合の理論計算）。したがって、融合タンパク質を用いてのｍｉＲＮＡ搭載は、より濃縮された治療レベルをもたらす（すなわち、同数のＥＶ粒子が、活性治療剤であるｍｉＲＮＡをより多く含む）。
融合タンパク質によるＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載効率を、融合タンパク質およびｍｉＲ－４６６ｃ発現プラスミドでトランスフェクトしたプロデューサー細胞株から収集したＥＶからＲＮＡを単離し、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルをｑＰＣＲにより定量することによって評価した。実験の対照群は、融合タンパク質プラスミドの代わりにＧＦＰプラスミドでトランスフェクトし、それによってＥＶ中のｍｉＲ－４６６ｃのベースレベルを決定した。ＲＮＡを、各処理群について、ナノ粒子追跡分析（NanoSight NS300）によって評価される同数のＥＶ粒子から単離した。ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐのTaqmanマイクロＲＮＡアッセイによるｑＰＣＲにより、Ａｇｏ２およびＣＤ９からなる融合タンパク質は、Ａｇｏ２およびＴＳＧ１０１からなる融合タンパク質よりも効率的であることが示された（ｑＰＣＲ Ｃｔがそれぞれ２２．４および２３．８；ここで、より低いＣｔはより早期のｍｉＲＮＡ増殖を示し、したがって、サンプルが、より高いＣｔ値のサンプルよりも多くのｍｉＲＮＡを含むことを示す）。いずれの融合タンパク質のトランスフェクションも、対照群（Ｃｔ３３．３）と比較してＥＶ中のｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルを増加させることが示され、融合タンパク質発現がＥＶへのｍｉＲＮＡ搭載を有意に増加させることが示された。Ａｇｏ２およびＣＤ９の融合タンパク質のトランスフェクションによるｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐレベルは、対照群よりも１１Ｃｔ早く検出されたので、ＥＶ中のｍｉＲＮＡパッケージングが２０００倍増加したことが示された（ＤＮＡ量が各ＰＣＲサイクルにおいて２倍になるとした場合の理論計算）。したがって、融合タンパク質を用いてのｍｉＲＮＡ搭載は、より濃縮された治療レベルをもたらす（すなわち、同数のＥＶ粒子が、活性治療剤であるｍｉＲＮＡをより多く含む）。
【0150】
融合タンパク質およびｍｉＲＮＡプラスミドのトランスフェクトおよびＥＶの単離
ＨＥＫ２９３細胞の馴化培地からのＥＶの単離のために、細胞を２％ＦＢＳを含む完全培地中で培養した。ＥＶ単離のために、１５ｃｍプレート中で細胞を培養した（播種密度４～４．５×１０６）。１５μｇの融合タンパク質プラスミドと１５μｇのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを、４５μｇのＰＥＩ試薬（Alfa Aesar, cat # 43896）を用いて同時トランスフェクトした。Longo et al（Methods Enzymol. 2013;529:227-40. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5）のＰＥＩトランスフェクションプロトコルを適合させ改変した。各ｍｉＲＮＡ群に対する陰性対照として、１５μｇのＬV－ＧＦＰ発現プラスミドと１５μｇのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを、４５μｇのＰＥＩを用いて同時トランスフェクトした。ＰＥＩトランスフェクションの４時間後に、培地を新鮮な完全培地と交換した。トランスフェクションの４８時間後に、馴化培地（プレートにつき１７ｍｌ）を収集し、死細胞およびデブリを除去するために３００ｇおよび２０００ｇで２回遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過し、濾過した馴化培地を、Amicon（登録商標）Ultra-15遠心分離フィルターデバイス（カットオフ１０ＫＤａ）によって５００μｌに濃縮した。qEVカラム（Izon Science）を製造者のプロトコルにしたがって使用して、ＥＶを精製した。フラクション７～１０をプールし（２ｍｌ）、さらなる実験のために－２０℃で保存した。この操作された粒子を、ナノ粒子追跡分析装置（NanoSight NS300）によって特徴付けた。
ＨＥＫ２９３細胞の馴化培地からのＥＶの単離のために、細胞を２％ＦＢＳを含む完全培地中で培養した。ＥＶ単離のために、１５ｃｍプレート中で細胞を培養した（播種密度４～４．５×１０６）。１５μｇの融合タンパク質プラスミドと１５μｇのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを、４５μｇのＰＥＩ試薬（Alfa Aesar, cat # 43896）を用いて同時トランスフェクトした。Longo et al（Methods Enzymol. 2013;529:227-40. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5）のＰＥＩトランスフェクションプロトコルを適合させ改変した。各ｍｉＲＮＡ群に対する陰性対照として、１５μｇのＬV－ＧＦＰ発現プラスミドと１５μｇのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを、４５μｇのＰＥＩを用いて同時トランスフェクトした。ＰＥＩトランスフェクションの４時間後に、培地を新鮮な完全培地と交換した。トランスフェクションの４８時間後に、馴化培地（プレートにつき１７ｍｌ）を収集し、死細胞およびデブリを除去するために３００ｇおよび２０００ｇで２回遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過し、濾過した馴化培地を、Amicon（登録商標）Ultra-15遠心分離フィルターデバイス（カットオフ１０ＫＤａ）によって５００μｌに濃縮した。qEVカラム（Izon Science）を製造者のプロトコルにしたがって使用して、ＥＶを精製した。フラクション７～１０をプールし（２ｍｌ）、さらなる実験のために－２０℃で保存した。この操作された粒子を、ナノ粒子追跡分析装置（NanoSight NS300）によって特徴付けた。
【0151】
ＥＶからのＲＮＡ単離
精製したエキソソームから全ＲＮＡを、TRIzol（TRIzol（登録商標）試薬; Invitrogen）およびイソプロパノール沈殿法によって単離した。簡潔に述べると、７５０μのTRIzol試薬を最大２００μｌのＥＶサンプルに加えた。この溶解サンプルに、ＲＮＡ沈殿効率を高めるために１μｌのGlycoBlue（AM9515, Invitrogen（商標））を加え、８０℃で５分間インキュベートした。フェノールステップおよび３相分離の後、ＲＮＡ沈殿のために、水相を５００μｌのイソプロパノールと混合し、－２０℃で一晩インキュベートした。ＲＮＡペレットを５μｌのＲＮａｓｅ不含有水で希釈し、５μｌの沈殿ＲＮＡをｍｉＲＮＡ特異的ｃＤＮＡ合成に使用した。候補ｍｉＲＮＡの逆転写反応およびｑＰＣＲのために、TaqManプローブ短鎖ＲＮＡアッセイキットを使用した。キット（Thermo Fisher Scientific Inc）の製造者のプロトコルにしたがって、候補ｍｉＲＮＡの特定の一本鎖ｃＤＮＡを合成した。反応のcycle threshold（Ｃｔ）値をfold changeに対してプロットした。Ｃｔ値は、対照では３３．３０５５１であり、ＦＰ１（Ａｇｏ２／ＣＤ９）では２２．４８９５８であり、ＦＰ２（Ａｇｏ２／ＴＳＧ１０１）では２８．３６９８１であった。
精製したエキソソームから全ＲＮＡを、TRIzol（TRIzol（登録商標）試薬; Invitrogen）およびイソプロパノール沈殿法によって単離した。簡潔に述べると、７５０μのTRIzol試薬を最大２００μｌのＥＶサンプルに加えた。この溶解サンプルに、ＲＮＡ沈殿効率を高めるために１μｌのGlycoBlue（AM9515, Invitrogen（商標））を加え、８０℃で５分間インキュベートした。フェノールステップおよび３相分離の後、ＲＮＡ沈殿のために、水相を５００μｌのイソプロパノールと混合し、－２０℃で一晩インキュベートした。ＲＮＡペレットを５μｌのＲＮａｓｅ不含有水で希釈し、５μｌの沈殿ＲＮＡをｍｉＲＮＡ特異的ｃＤＮＡ合成に使用した。候補ｍｉＲＮＡの逆転写反応およびｑＰＣＲのために、TaqManプローブ短鎖ＲＮＡアッセイキットを使用した。キット（Thermo Fisher Scientific Inc）の製造者のプロトコルにしたがって、候補ｍｉＲＮＡの特定の一本鎖ｃＤＮＡを合成した。反応のcycle threshold（Ｃｔ）値をfold changeに対してプロットした。Ｃｔ値は、対照では３３．３０５５１であり、ＦＰ１（Ａｇｏ２／ＣＤ９）では２２．４８９５８であり、ＦＰ２（Ａｇｏ２／ＴＳＧ１０１）では２８．３６９８１であった。
【実施例8】
【0152】
レシピエント細胞における、ＥＶに搭載されたｍｉＲＮＡ
融合タンパク質によってＥＶにパッケージングされたｍｉＲＮＡがレシピエント細胞に取り込まれるかを観察するために、レシピエント細胞におけるｍｉＲＮＡレベルを、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって可視化した（図１６）。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６が搭載されたＥＶを、ヒトレシピエント細胞株に投与した。これにより、ｍｉＲ－４６６ｃはヒトにおいて見られない（齧歯類に特異的である）ことから、バックグラウンドを無くすことができる。共焦点顕微鏡画像においてｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐが、図中に矢印で示されるように、染色されドットとして観察される。重要なことに、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐはレシピエント細胞の核内に観察される。本書に記載するｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの作用は、核のノンコーディング転写物を標的とするｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの核での働きに基づき、したがって、細胞への投与後の核における局在化は、ｍｉＲＮＡが細胞に取り込まれ、標的転写物と結合するために細胞質から核へと輸送されることを示す。
融合タンパク質によってＥＶにパッケージングされたｍｉＲＮＡがレシピエント細胞に取り込まれるかを観察するために、レシピエント細胞におけるｍｉＲＮＡレベルを、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって可視化した（図１６）。ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６が搭載されたＥＶを、ヒトレシピエント細胞株に投与した。これにより、ｍｉＲ－４６６ｃはヒトにおいて見られない（齧歯類に特異的である）ことから、バックグラウンドを無くすことができる。共焦点顕微鏡画像においてｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐが、図中に矢印で示されるように、染色されドットとして観察される。重要なことに、ｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐはレシピエント細胞の核内に観察される。本書に記載するｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの作用は、核のノンコーディング転写物を標的とするｍｉＲ－４６６ｃ－５ｐの核での働きに基づき、したがって、細胞への投与後の核における局在化は、ｍｉＲＮＡが細胞に取り込まれ、標的転写物と結合するために細胞質から核へと輸送されることを示す。
【0153】
ｍｉＲＮＡ ＦＩＳＨ
Ａｇｏ２およびＴＳＧ１０１が融合した融合タンパク質およびｍｉＲ－４６６ｃを発現するプロデューサー細胞から単離されたＥＶを、ＡＲＰＥ－１９細胞に投与した。ｍｉＲＮＡ ＦＩＳＨのために、Thermo Fisher Scientific ViewRNA（商標）miRNA ISH細胞アッセイキット（cat # QVCM0001）を、Thermo Fisher Scientific ViewRNA Cell Plusプローブセット（catalog # VM-06 (S-koko)）と共に、製造者のプロトコルにしたがって使用した（アッセイＩＤ: VM1-28918-VCP）。
Ａｇｏ２およびＴＳＧ１０１が融合した融合タンパク質およびｍｉＲ－４６６ｃを発現するプロデューサー細胞から単離されたＥＶを、ＡＲＰＥ－１９細胞に投与した。ｍｉＲＮＡ ＦＩＳＨのために、Thermo Fisher Scientific ViewRNA（商標）miRNA ISH細胞アッセイキット（cat # QVCM0001）を、Thermo Fisher Scientific ViewRNA Cell Plusプローブセット（catalog # VM-06 (S-koko)）と共に、製造者のプロトコルにしたがって使用した（アッセイＩＤ: VM1-28918-VCP）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】