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特表2022-515267フリードライヒ運動失調症を患う患者における処置及び治療応答の予測
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(54)【発明の名称】フリードライヒ運動失調症を患う患者における処置及び治療応答の予測
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20220209BHJP
A61K 31/335 20060101ALI20220209BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20220209BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20220209BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220209BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220209BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20220209BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220209BHJP
G01N 33/52 20060101ALI20220209BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K31/335
A61K31/19
A61K31/7076
A61P43/00 105
A61P25/28
A61P9/04
C12Q1/02
G01N33/52 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021537092
(86)(22)【出願日】2019-12-27
(85)【翻訳文提出日】2021-06-24
(86)【国際出願番号】 EP2019087060
(87)【国際公開番号】W WO2020136233
(87)【国際公開日】2020-07-02
(31)【優先権主張番号】18306863.4
(32)【優先日】2018-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(71)【出願人】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(71)【出願人】
【識別番号】515028470
【氏名又は名称】フォンダシオン・イマジネ
【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ローティグ，アン・アニエス
(72)【発明者】
【氏名】ミュニ，アーノルド
(72)【発明者】
【氏名】プティ，フロリアーヌ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
2G045BB20
2G045CA17
2G045CA20
2G045DB11
2G045GC10
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ89
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC541
4C084ZC542
4C086AA01
4C086AA02
4C086CA01
4C086EA18
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA15
4C086ZA36
4C086ZB21
4C086ZC41
4C086ZC54
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA02
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA15
4C206ZA36
4C206ZB21
4C206ZC41
4C206ZC54
(57)【要約】
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、鉄硫黄複合体（ＩＳＣ）構築に関与する、ミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている、ＦＸＮ遺伝子内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされる。フラタキシン欠損症は、異常なＩＳＣ含有タンパク質、すなわち、呼吸鎖複合体Ｉ～ＩＩＩ及びアコニターゼをもたらし、患者の脳及び心臓における鉄の蓄積が起こる。ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡ線維芽細胞が、鉄の取り込みを制限することができず、大量の細胞質内における鉄の蓄積を誘発し、ミトコンドリアにおいてはより低い程度で蓄積を誘発することを示す。本発明者らはまた、増加したトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）定常状態レベル及び膜へのＴｆＲ１の蓄積を観察し、本発明者らはこれを、パルミトイル化による翻訳後修飾が損なわれていること、並びに、遅延したトランスフェリンの再循環に起因するとした。最後に、本発明者らは、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素ＡがＴｆＲ１のパルミトイル化を改善させ、よって、フリードライヒ運動失調症を有する患者の処置のための候補分子を代表することを示した。したがって、本発明は、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法、並びに、ＦＲＤＡを患う患者が治療応答を達成するであろうかどうかを予測する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬剤の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者におけるフリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法。
【請求項2】
前記薬物が、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素Ａからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項3】
ｉ）ある量の鉄を含む培地中で培養された被験者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞内総鉄含量を測定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で測定された鉄含量を、所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）における含量測定値と所定の基準値との間の差が検出される場合、被験者は応答を達成するであろうか否かを結論付ける工程を含む、被験者が、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬物を用いて応答を達成するであろうかどうかを決定する方法。
【請求項4】
前記薬物が、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素Ａからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項5】
末梢血単核細胞が、総鉄含量を測定する前に０時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４０時間培養される、請求項１記載の方法。
【請求項6】
所定の基準値が、処置前の患者から得られた末梢血単核細胞の総鉄含量である、請求項３記載の方法。
【請求項7】
総鉄含量が、前記の所定の基準値より低い場合（典型的には、０．５；１；２；３；４；５；６；７；８；９；又は１０倍以上）、患者は、薬物を用いて応答を達成するであろうと結論付けられる、請求項６記載の方法。
【請求項8】
所定の基準値が、処置前に患者から得られ、薬物の存在下で培養された末梢血単核細胞の総鉄含量である、請求項３記載の方法。
【請求項9】
総鉄含量が、所定の基準値より高い場合（典型的には、０．５；１；２；３；４；５；６；７；８；９；又は１０倍以上）、患者は、薬物を用いて応答を達成しないであろうと結論付けられる、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
本発明は、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法、並びに、ＦＲＤＡを患う患者が治療応答を達成するであろうかどうかを予測する方法に関する。
本発明は、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法、並びに、ＦＲＤＡを患う患者が治療応答を達成するであろうかどうかを予測する方法に関する。
【0002】
発明の背景：
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、進行的な歩行及び四肢の運動失調、脚の腱反射の消失、構音障害、並びに下肢の錐体路の衰弱によって特徴付けられる、頻繁に起こる常染色体劣性変性疾患（出生数５０，０００人あたり１人）である。肥大型心筋症は、大半のフリードライヒ運動失調症患者に観察される。該疾患を引き起こす遺伝子であるＦＸＮは、２１０アミノ酸のミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている。ＦＲＤＡは主に、突然変異対立遺伝子の９８％を占める、フラタキシン遺伝子の第一イントロン内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされ、その結果、フラタキシン定常状態レベルは低下する。フラタキシンは、鉄硫黄複合体（ＩＳＣ）構築の第一工程に関与し、ここでは［２Ｆｅ－２Ｓ］クラスターがＩｓｕ１足場タンパク質上に構築される。この第一の工程には、硫黄の還元を可能とする、フェレドキシン還元酵素を含む、他の５つのタンパク質が関与している。しかし、フラタキシン欠損症の結果は、依然として不完全にしか解明されていない。実際に、ミトコンドリア呼吸鎖の欠損が、損なわれた複合体Ｉ～ＩＩＩの鉄硫黄複合体の構築の原因とされているが（Rotig et al., 1997）、多くの他の特色、すなわち、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加を伴う細胞質を犠牲にしたミトコンドリア内の鉄蓄積（Vaubel and Isaya, 2013）、細胞内鉄代謝の調節不全（Martelli and Puccio, 2014）、ＳＩＲＴ３阻害によって媒介されるミトコンドリアタンパク質の過剰アセチル化（Wagner et al., 2012）、及び増加したスフィンゴ脂質合成（Chen et al., 2016a）は依然として説明されていない。近年、パルミトイル化によるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）の調節の新規な機序、及び大脳基底核における鉄蓄積に起因する不均一な容態である、脳の鉄蓄積を伴う神経変性疾患（ＮＢＩＡ）におけるその変化が報告された（Drecourt et al., 2018）。しかしながら、ＦＲＤＡにおける類似の機序の存在はこれまで調査されてこなかった。
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、進行的な歩行及び四肢の運動失調、脚の腱反射の消失、構音障害、並びに下肢の錐体路の衰弱によって特徴付けられる、頻繁に起こる常染色体劣性変性疾患（出生数５０，０００人あたり１人）である。肥大型心筋症は、大半のフリードライヒ運動失調症患者に観察される。該疾患を引き起こす遺伝子であるＦＸＮは、２１０アミノ酸のミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている。ＦＲＤＡは主に、突然変異対立遺伝子の９８％を占める、フラタキシン遺伝子の第一イントロン内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされ、その結果、フラタキシン定常状態レベルは低下する。フラタキシンは、鉄硫黄複合体（ＩＳＣ）構築の第一工程に関与し、ここでは［２Ｆｅ－２Ｓ］クラスターがＩｓｕ１足場タンパク質上に構築される。この第一の工程には、硫黄の還元を可能とする、フェレドキシン還元酵素を含む、他の５つのタンパク質が関与している。しかし、フラタキシン欠損症の結果は、依然として不完全にしか解明されていない。実際に、ミトコンドリア呼吸鎖の欠損が、損なわれた複合体Ｉ～ＩＩＩの鉄硫黄複合体の構築の原因とされているが（Rotig et al., 1997）、多くの他の特色、すなわち、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加を伴う細胞質を犠牲にしたミトコンドリア内の鉄蓄積（Vaubel and Isaya, 2013）、細胞内鉄代謝の調節不全（Martelli and Puccio, 2014）、ＳＩＲＴ３阻害によって媒介されるミトコンドリアタンパク質の過剰アセチル化（Wagner et al., 2012）、及び増加したスフィンゴ脂質合成（Chen et al., 2016a）は依然として説明されていない。近年、パルミトイル化によるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）の調節の新規な機序、及び大脳基底核における鉄蓄積に起因する不均一な容態である、脳の鉄蓄積を伴う神経変性疾患（ＮＢＩＡ）におけるその変化が報告された（Drecourt et al., 2018）。しかしながら、ＦＲＤＡにおける類似の機序の存在はこれまで調査されてこなかった。
【0003】
発明の概要：
特許請求の範囲によって定義されるように、本発明は、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法、並びに、ＦＲＤＡを患う患者が治療応答を達成するであろうかどうかを予測する方法に関する。
特許請求の範囲によって定義されるように、本発明は、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法、並びに、ＦＲＤＡを患う患者が治療応答を達成するであろうかどうかを予測する方法に関する。
【0004】
発明の詳細な説明：
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、鉄硫黄複合体（ＩＳＣ）構築に関与する、ミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている、ＦＸＮ遺伝子内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされる。フラタキシン欠損症は、異常なＩＳＣ含有タンパク質、すなわち、呼吸鎖複合体Ｉ～ＩＩＩ及びアコニターゼをもたらし、患者の脳及び心臓における鉄の蓄積が起こる。ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡの線維芽細胞が、鉄の取り込みを制限することができず、大量の細胞質内における鉄の蓄積を誘発し、ミトコンドリアにおいてはより低い程度で蓄積を誘発することを示す。本発明者らはまた、増加したトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）定常状態レベル及び膜へのＴｆＲ１の蓄積を観察し、本発明者らはこれを、パルミトイル化による翻訳後修飾が損なわれていること、並びに、遅延したトランスフェリンの再循環に起因するとした。最後に、本発明者らは、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素ＡがＴｆＲ１のパルミトイル化を改善させ、よって、フリードライヒ運動失調症を有する患者の処置のための候補分子を代表することを示した。
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、鉄硫黄複合体（ＩＳＣ）構築に関与する、ミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている、ＦＸＮ遺伝子内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされる。フラタキシン欠損症は、異常なＩＳＣ含有タンパク質、すなわち、呼吸鎖複合体Ｉ～ＩＩＩ及びアコニターゼをもたらし、患者の脳及び心臓における鉄の蓄積が起こる。ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡの線維芽細胞が、鉄の取り込みを制限することができず、大量の細胞質内における鉄の蓄積を誘発し、ミトコンドリアにおいてはより低い程度で蓄積を誘発することを示す。本発明者らはまた、増加したトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）定常状態レベル及び膜へのＴｆＲ１の蓄積を観察し、本発明者らはこれを、パルミトイル化による翻訳後修飾が損なわれていること、並びに、遅延したトランスフェリンの再循環に起因するとした。最後に、本発明者らは、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素ＡがＴｆＲ１のパルミトイル化を改善させ、よって、フリードライヒ運動失調症を有する患者の処置のための候補分子を代表することを示した。
【0005】
処置法：
したがって、本発明の第一の目的は、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬剤の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法に関する。
したがって、本発明の第一の目的は、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬剤の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を処置する方法に関する。
【0006】
本明細書において使用する「フリードライヒ運動失調症」すなわち「ＦＲＤＡ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、進行的な歩行及び四肢の運動失調、脚の腱反射の消失、構音障害、並びに下肢の錐体路の衰弱によって特徴付けられる、頻繁に起こる常染色体劣性変性疾患（出生数５０，０００人あたり１人）を指す。肥大型心筋症は、大半のフリードライヒ運動失調症患者に観察される。該疾患を引き起こす遺伝子であるＦＸＮは、２１０アミノ酸のミトコンドリアタンパク質であるフラタキシンをコードしている。ＦＲＤＡは主に、突然変異対立遺伝子の９８％を占める、フラタキシン遺伝子の第一イントロン内のＧＡＡ反復配列伸長によって引き起こされ、その結果、フラタキシン定常状態レベルは低下する。
【0007】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、予防的又は防止的処置、並びに、治癒的な処置又は疾患修飾的な処置（疾患を罹患するリスクのある又は疾患を罹患したと疑われる患者の処置、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態に罹患していると診断されている患者の処置を含む）の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有しているか又は最終的に障害に罹患する可能性がある被験者に、障害若しくは再発している障害の発症を予防、治癒、遅延するために、その重症度を低減するために、又はその１つ以上の症状を寛解するために、あるいは、このような処置を行なわない場合に予想される生存期間を超えるように被験者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に患者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は（部分的に又は全体的に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、長期間（数か月又は数年間）にわたり患者を寛解状態に保つために、病気の処置中に患者の維持のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与する）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の所定の基準［例えば疾患の顕現など］に到達した場合の処置）を使用し得る。
【0008】
いくつかの実施態様では、前記薬物は、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素Ａからなる群より選択される。
【0009】
いくつかの実施態様では、前記薬物は、アーテスネートである。本明細書において使用する「アーテスネート」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、（３Ｒ，５ａＳ，６Ｒ，８ａＳ，９Ｒ，１０Ｓ，１２Ｒ，１２ａＲ）－デカヒドロ－３，６，９－トリメチル－３，１２－エポキシ－１２Ｈ－ピラノ［４，３－ｊ］－１，２－ベンゾジオキセピン－１０－オール、コハク酸水素を指す。該用語は、アーテスネートの個々のいずれかのエナンチオマーを包含する。特に、該用語は、たった１つのエナンチオマー、又はエナンチオマーのラセミ混合物若しくは非ラセミ混合物を指し得る。該用語はまた、アーテスネートの多形及び水和物も含む。該用語はまた、アーテスネートの塩及びエステルも含む。該用語はまた、アーテスネートのプロドラッグ、並びに該プロドラッグのエナンチオマー、ラセミ混合物、非ラセミ混合物、多形、水和物、塩、及びエステルも含む。
【0010】
本明細書において使用する「ジクロロ酢酸」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、式ＣＨＣｌ２ＣＯＯＨで示される化合物として言及される。該用語はまた、ジクロロエタノール酸、ビクロロ酢酸、ＤＣＡ、ＢＣＡ、すなわちジクロロ酢酸、ビクロロ酢酸としても知られている。
【0011】
本明細書において使用する「補酵素Ａ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、脂肪酸の合成及び酸化、並びにクエン酸回路におけるピルビン酸の酸化におけるその役割について特に知られている、補酵素を指す。ＩＵＰＡＣ名は、［［２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ］－５－（６－アミノプリン－９－イル）－４－ヒドロキシ－３－ホスホノオキシオキソラン－２－イル］メトキシ－ヒドロキシホスホリル］［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２，２－ジメチル－４－オキソ－４－［［３－オキソ－３－（２－スルファニルエチルアミノ）プロピル］アミノ］ブチル］リン酸水素である。
【0012】
上記のような薬物の「治療有効量」によって、治療効果をもたらすに十分な量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されるだろうことが理解されるだろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置される障害及び障害の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成、被験者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知である同様な要因をはじめとする、様々な要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは十分に当分野の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、１日あたり成人１人あたり０．０１mg～１，０００mgまでの幅広い範囲にわたって変動し得る。典型的には、該組成物は、処置される被験者への症候による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mg～約５００mgの活性成分、好ましくは１mg～約１００mgの活性成分を含有している。有効量の薬物は、通常、１日あたり体重１kgあたり０．０００２mg/kg～約２０mg/kg、特に１日あたり体重１kgあたり約０．００１mg/kg～７mg/kgの用量レベルで供給される。
【0013】
本発明によると、前記薬物は、医薬組成物の形で被験者に投与される。典型的には、該薬物は、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。該薬物は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、又はカルシウム、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいだろう。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。直接的な注射のためのより濃縮された、又は高度に濃縮された液剤の調製も考えられ、ここでは極めて迅速に浸透し、高濃度の活性薬剤が送達される、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。製剤化時に、該液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。該製剤は、様々な剤形で、例えば上記のタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水性液剤での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。
【0014】
治療応答を予測するための方法：
本発明のさらなる目的は、ｉ）ある量の鉄を含む培地中で培養された被験者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞内総鉄含量を測定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で測定された鉄含量を、所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）における含量測定値と所定の基準値との間の差が検出される場合、被験者は応答を達成するであろうか否かを結論付ける工程を含む、被験者が、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬物を用いて応答を達成するであろうかどうかを決定する方法に関する。
本発明のさらなる目的は、ｉ）ある量の鉄を含む培地中で培養された被験者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞内総鉄含量を測定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で測定された鉄含量を、所定の基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）における含量測定値と所定の基準値との間の差が検出される場合、被験者は応答を達成するであろうか否かを結論付ける工程を含む、被験者が、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させることのできる薬物を用いて応答を達成するであろうかどうかを決定する方法に関する。
【0015】
したがって、前記方法は、非応答者から応答者を識別するのに特に適している。本明細書において使用する本開示の脈絡における「応答者」という用語は、応答を達成するであろう患者を指す。例えば、歩行及び／又は四肢の運動失調の低減、脚の腱反射の改善、構音障害及び／又は下肢の錐体路の衰弱の低減、並びに、心機能の改善は、患者が応答を達成する特徴を示す。典型的には、応答者又は非応答者としての患者の特徴付けは、標準又はトレーニングセットと参照することによって行なわれ得る。標準は、応答者若しくは非応答者であることが知られている患者のプロファイルであり得るか、又は代替的には、数値であり得る。このような所定の標準は、印刷されたリスト若しくは図、コンピューターソフトウェアプログラム、又は他の媒体などの任意の適切な形態で提供され得る。患者が非応答者であると結論付けられる場合、医師は、任意のさらなる有害な副作用を回避するために治療を中止する決断をすることができる。
【0016】
本発明の方法は、細胞の総鉄含量の減少に関する、患者のより早期の応答を検出するのに特に適している。それ故、総鉄含量の測定は、処置による成功（すなわち応答）の確率を評価する代理マーカーを示す。したがって、本発明の方法は、一旦患者が薬物で処置されると（例えば、処置の１、２、３、４、又は５サイクル後に）行なわれる。
【0017】
いくつかの実施態様では、前記薬物は、アーテスネート、ジクロロ酢酸、及び補酵素Ａからなる群より選択される。
【0018】
本明細書において使用する「ＰＢＭＣ」又は「末梢血単核細胞」又は本明細書において使用する「未分画ＰＢＭＣ」という用語は、完全ＰＢＭＣ、すなわち、所与の亜集団について濃縮されていない丸い核を有する白血球集団を指す。臍帯血単核細胞はさらにこの定義に含まれる。典型的には、本発明によるＰＢＭＣ試料は、接着ＰＢＭＣ（実質的に９０％を超える単球からなる）又は非接着ＰＢＭＣ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、及び樹状前駆細胞を含有している）のみを含有するような選択工程にかけられていない。それ故、本発明によるＰＢＭＣ試料は、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞）、単球、及びその前駆細胞を含有している。典型的には、これらの細胞は、血液層を分離する、親水性多糖であるフィコールを使用して全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは、血漿層の下にセルリングを形成している。さらに、ＰＢＭＣは、優先的に赤血球を溶解するであろう、低浸透圧溶解緩衝液を使用して全血から抽出することができる。
【0019】
ＰＢＭＣの増殖、生存、及び分化に適した任意の培養培地を使用し得る。典型的には、それは、栄養分（炭素源、アミノ酸源）、ｐＨ緩衝液及び塩を含有している基礎培地からなり、これに、ヒト又は他の起源の血清及び／又は増殖因子及び／又は抗生物質が補充されてもよい。典型的には、基礎培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ、又はＡＩＭ－Ｖ培地であり得、それらは全て、市販されている標準培地である。
【0020】
典型的には、培養培地中の鉄源は、クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）によってもたらされる。ＦＡＣは、内在する輸送体又はエンドサイトーシス経路を介して、適時、細胞内に浸透する、可溶形の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）である。
【0021】
いくつかの実施態様では、総鉄含量は、当技術分野において公知である任意の方法によって測定される。典型的には、総鉄含量は、（Barbeito et al., Mol Neurodegener. 2010 Nov 10;5:50）から変更されたフェロジンに基づいた鉄アッセイを使用して測定される。
【0022】
典型的には、ＰＭＢＣは、総鉄含量を測定する前に１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；３１；３２；３３；３４；３５；３６；３７；３８；３９；４０；４１；４２；４３；４４；４５；４６；４７；４８；４９；又は５０時間培養し、特に、ＰＭＢＣは、総鉄含量を測定する前に０、８、１６、２４、３２、４０時間培養する。
【0023】
いくつかの実施態様では、所定の基準値は閾値である。試験の関数及びベネフィット／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度及び特異度を得るように、閾値は決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（及びまた閾値）は、実験データに基づいた受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、リファレンス群における総鉄含量を決定した後、試験される予定の試料において測定されたレベルの免疫マーカーの統計学的処理のためのアルゴリズム分析を使用し、これにより、試料の分類について有意性を有する分類標準物質を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は、受信者動作特性（receiver operator characteristic）曲線であり、これは、受信者操作特性（receiver operation characteristic）曲線としても知られている。それは主に、生化学的臨床診断試験のために使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）及び偽の陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する総合的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法を用いて感度と特異度の間の関係を明らかとする。一連の様々なカットオフ値（閾値又は臨界値、すなわち、診断試験の正常な結果と異常な結果との間の境界値）が、一連の感度及び特異度の数値を計算するための連続変数として設定される。次いで、曲線を描くために、感度は縦軸座標として使用され、特異度は横軸座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が高くなればなるほど、診断の正確度は高くなる。ＲＯＣ曲線上では、座標図の左上端に最も近い点は、高い感度と高い特異度の数値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０～０．５である。ＡＵＣが０．５を上回る場合、ＡＵＣが１に近づくほど、診断結果はより良好となる。ＡＵＣが０．５～０．７である場合、正確度は低い。ＡＵＣが０．７～０．９である場合、正確度は中程度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、正確度は極めて高い。このアルゴリズム法は、好ましくはコンピューターを用いて実施される。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描写のために使用し得る：例えば、ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医学統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ－ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ ＳＴＡＴ ＶＩ０．０（ダイナミック・マイクロシステムズ社、シルバースプリング、メリーランド州、米国）など。
【0024】
いくつかの実施態様では、所定の基準値は、処置前に患者から得られたＰＢＭＣの総鉄含量である。該実施態様では、総鉄含量が、前記の所定の基準値より低い場合（典型的には、０．５；１；２；３；４；５；６；７；８；９；又は１０倍以上）、患者は、薬物を用いた応答を達成するであろうと結論付けられる。逆に、総鉄含量が、所定の基準値とほぼ同じである場合（又はそれより高い場合）、患者は、薬物を用いた応答を達成しないであろうと結論付けられる。
【0025】
いくつかの実施態様では、所定の基準値は、処置前に患者から得られ、薬物の存在下で培養された、ＰＢＭＣの総鉄含量である。該実施態様では、総鉄含量が、所定の基準値より高い場合（典型的には、０．５；１；２；３；４；５；６；７；８；９；又は１０倍以上）、患者は薬物を用いた応答を達成しないであろうと結論付けられる。逆に、総鉄含量が、所定の基準値とほぼ同じである場合（又はそれより低い場合）、患者は、薬物を用いた応答を達成するであろうと結論付けられる。
【0026】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1A】ＦＲＤＡ線維芽細胞の特徴付け。Ａ．ＧＡＡ反復配列伸長を有する５人の患者（Ｐ１～５）及び対照（Ｃ１～３）の線維芽細胞における、フラタキシン、並びに鉄恒常性及び抗酸化剤による防御に関与するタンパク質のウェスタンブロット分析。フラタキシン、フェリチン、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）、ＩＲＰ２、ＳＯＤ１、及びＦＢＸＬ５は還元条件で試験され、ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びフェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）は非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。Ｂ．通常培地（＋ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、－クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ））又は高い鉄培地（－ＦＢＳ、＋１００μMのＦＡＣ）中の、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＭｉｔｏＳＯＸを使用したフローサイトメトリーによる、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の測定。データは、対照及び患者におけるＭｉｔｏＳｏｘ陽性細胞の比率を示す。Ｃ．通常の培地（＋ＦＢＳ、－ＦＡＣ）中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の完全線維芽細胞又はミトコンドリア抽出物（Ｄ）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。Ｅ．細胞内総鉄含量に対する、ミトコンドリア内鉄含量の比率。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値をＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。
【図1B】ＦＲＤＡ線維芽細胞の特徴付け。Ａ．ＧＡＡ反復配列伸長を有する５人の患者（Ｐ１～５）及び対照（Ｃ１～３）の線維芽細胞における、フラタキシン、並びに鉄恒常性及び抗酸化剤による防御に関与するタンパク質のウェスタンブロット分析。フラタキシン、フェリチン、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）、ＩＲＰ２、ＳＯＤ１、及びＦＢＸＬ５は還元条件で試験され、ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びフェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）は非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。Ｂ．通常培地（＋ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、－クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ））又は高い鉄培地（－ＦＢＳ、＋１００μMのＦＡＣ）中の、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＭｉｔｏＳＯＸを使用したフローサイトメトリーによる、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の測定。データは、対照及び患者におけるＭｉｔｏＳｏｘ陽性細胞の比率を示す。Ｃ．通常の培地（＋ＦＢＳ、－ＦＡＣ）中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の完全線維芽細胞又はミトコンドリア抽出物（Ｄ）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。Ｅ．細胞内総鉄含量に対する、ミトコンドリア内鉄含量の比率。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値をＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。
【図1C】ＦＲＤＡ線維芽細胞の特徴付け。Ａ．ＧＡＡ反復配列伸長を有する５人の患者（Ｐ１～５）及び対照（Ｃ１～３）の線維芽細胞における、フラタキシン、並びに鉄恒常性及び抗酸化剤による防御に関与するタンパク質のウェスタンブロット分析。フラタキシン、フェリチン、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）、ＩＲＰ２、ＳＯＤ１、及びＦＢＸＬ５は還元条件で試験され、ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びフェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）は非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。Ｂ．通常培地（＋ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、－クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ））又は高い鉄培地（－ＦＢＳ、＋１００μMのＦＡＣ）中の、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＭｉｔｏＳＯＸを使用したフローサイトメトリーによる、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の測定。データは、対照及び患者におけるＭｉｔｏＳｏｘ陽性細胞の比率を示す。Ｃ．通常の培地（＋ＦＢＳ、－ＦＡＣ）中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の完全線維芽細胞又はミトコンドリア抽出物（Ｄ）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。Ｅ．細胞内総鉄含量に対する、ミトコンドリア内鉄含量の比率。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値をＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。
【図1D】ＦＲＤＡ線維芽細胞の特徴付け。Ａ．ＧＡＡ反復配列伸長を有する５人の患者（Ｐ１～５）及び対照（Ｃ１～３）の線維芽細胞における、フラタキシン、並びに鉄恒常性及び抗酸化剤による防御に関与するタンパク質のウェスタンブロット分析。フラタキシン、フェリチン、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）、ＩＲＰ２、ＳＯＤ１、及びＦＢＸＬ５は還元条件で試験され、ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びフェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）は非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。Ｂ．通常培地（＋ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、－クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ））又は高い鉄培地（－ＦＢＳ、＋１００μMのＦＡＣ）中の、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＭｉｔｏＳＯＸを使用したフローサイトメトリーによる、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の測定。データは、対照及び患者におけるＭｉｔｏＳｏｘ陽性細胞の比率を示す。Ｃ．通常の培地（＋ＦＢＳ、－ＦＡＣ）中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の完全線維芽細胞又はミトコンドリア抽出物（Ｄ）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。Ｅ．細胞内総鉄含量に対する、ミトコンドリア内鉄含量の比率。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値をＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。
【図1E】ＦＲＤＡ線維芽細胞の特徴付け。Ａ．ＧＡＡ反復配列伸長を有する５人の患者（Ｐ１～５）及び対照（Ｃ１～３）の線維芽細胞における、フラタキシン、並びに鉄恒常性及び抗酸化剤による防御に関与するタンパク質のウェスタンブロット分析。フラタキシン、フェリチン、ＩＲＰ１（鉄調節タンパク質１）、ＩＲＰ２、ＳＯＤ１、及びＦＢＸＬ５は還元条件で試験され、ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びフェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）は非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。Ｂ．通常培地（＋ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、－クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ））又は高い鉄培地（－ＦＢＳ、＋１００μMのＦＡＣ）中の、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＭｉｔｏＳＯＸを使用したフローサイトメトリーによる、ミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）の測定。データは、対照及び患者におけるＭｉｔｏＳｏｘ陽性細胞の比率を示す。Ｃ．通常の培地（＋ＦＢＳ、－ＦＡＣ）中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の完全線維芽細胞又はミトコンドリア抽出物（Ｄ）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。Ｅ．細胞内総鉄含量に対する、ミトコンドリア内鉄含量の比率。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値をＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。
【図2A】ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性の調節。ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照及びＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄恒常性の転写後調節。ＴｆＲ１（ＴＦＲＣ、Ａ）及びフェリチン（ＦＴＨ、Ｂ）のｍＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって定量し、ＧＵＳＢｍＲＮＡに対する比として表現した。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。試料と対照との間の有意なばらつきは、ホルム・サイダック法を用いた多重比較のための２次元分散分析を使用して全く推定されなかった。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。対応のないｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意でなない。Ｄ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びＦＢＸＬ５は、ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験され；フェリチン及びＳＯＤ２は、還元条件で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。
【図2B】ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性の調節。ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照及びＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄恒常性の転写後調節。ＴｆＲ１（ＴＦＲＣ、Ａ）及びフェリチン（ＦＴＨ、Ｂ）のｍＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって定量し、ＧＵＳＢｍＲＮＡに対する比として表現した。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。試料と対照との間の有意なばらつきは、ホルム・サイダック法を用いた多重比較のための２次元分散分析を使用して全く推定されなかった。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。対応のないｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意でなない。Ｄ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びＦＢＸＬ５は、ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験され；フェリチン及びＳＯＤ２は、還元条件で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。
【図2C】ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性の調節。ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照及びＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄恒常性の転写後調節。ＴｆＲ１（ＴＦＲＣ、Ａ）及びフェリチン（ＦＴＨ、Ｂ）のｍＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって定量し、ＧＵＳＢｍＲＮＡに対する比として表現した。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。試料と対照との間の有意なばらつきは、ホルム・サイダック法を用いた多重比較のための２次元分散分析を使用して全く推定されなかった。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。対応のないｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意でなない。Ｄ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びＦＢＸＬ５は、ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験され；フェリチン及びＳＯＤ２は、還元条件で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。
【図2D】ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性の調節。ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照及びＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄恒常性の転写後調節。ＴｆＲ１（ＴＦＲＣ、Ａ）及びフェリチン（ＦＴＨ、Ｂ）のｍＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって定量し、ＧＵＳＢｍＲＮＡに対する比として表現した。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。試料と対照との間の有意なばらつきは、ホルム・サイダック法を用いた多重比較のための２次元分散分析を使用して全く推定されなかった。対応のないサンプルのｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。対応のないｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意でなない。Ｄ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２及びＦＢＸＬ５は、ウシ胎児血清非含有のＤＭＥＭ培地中で低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）で試験され；フェリチン及びＳＯＤ２は、還元条件で試験された。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として使用された。
【図3A】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１の蓄積、及び不完全なＴｆの再循環。Ａ．対照の線維芽細胞（Ｃ１は３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。スチューデントｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。ホルム・サイダック多重比較検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。
【図3B】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１の蓄積、及び不完全なＴｆの再循環。Ａ．対照の線維芽細胞（Ｃ１は３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。スチューデントｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。ホルム・サイダック多重比較検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。
【図3C】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１の蓄積、及び不完全なＴｆの再循環。Ａ．対照の線維芽細胞（Ｃ１は３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡの線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。スチューデントｔ検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。Ｃ．Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。ホルム・サイダック多重比較検定を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。
【図4A】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１のパルミトイル化。Ａ．対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞を、ＤＭＳＯのみ（左上パネル）又は２５μMのＣｏＡを用いて７２時間（右上パネル）、５mMのジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を用いて７２時間（左下パネル）、２５μMのアーテスネートを用いて４８時間（右下パネル）処置し、ＴｆＲ１タンパク質を、マウス抗ＴｆＲ１抗体を用いて免疫沈降させて、パルミトイル化アッセイを行なった。各条件において、上パネルは、パルミトイル化ＴｆＲ１レベル（ＩＢ：ビオチン）及び免疫沈降した量のＴｆＲ１（ＩＢ：ＴｆＲ１）を示す。投入ＴｆＲ１は、各条件のためのローディング対照として使用される。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：イムノブロット。Ｂ．２５μMのＣｏＡの存在下又は非存在下において、通常のＤＭＥＭ培地中で７２時間増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた多重比較のための２元分散分析を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。Ｃ．未処置（－ＤＣＡ）又は５mMのＤＣＡを用いて７２時間処置された（＋ＤＣＡ）、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞のミトコンドリアにおける、ＰＤＨ－Ｅ２、リポイル化ＰＤＨ－Ｅ２（ＰＤＨ－Ｅ２－ＬＡ）、及びリポイル化α－ＫＧＤＨ（α－ＫＧＤＨ－ＬＡ）の定常状態レベル。線維芽細胞のミトコンドリアを、リポ酸に対する抗体（ＰＤＨ－Ｅ２及びα－ＫＧＤＨに結合するリポ酸を検出する）を用いてのイムノブロットによって分析した。ポリンは、ローディング対照として使用された。
【図4B】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１のパルミトイル化。Ａ．対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞を、ＤＭＳＯのみ（左上パネル）又は２５μMのＣｏＡを用いて７２時間（右上パネル）、５mMのジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を用いて７２時間（左下パネル）、２５μMのアーテスネートを用いて４８時間（右下パネル）処置し、ＴｆＲ１タンパク質を、マウス抗ＴｆＲ１抗体を用いて免疫沈降させて、パルミトイル化アッセイを行なった。各条件において、上パネルは、パルミトイル化ＴｆＲ１レベル（ＩＢ：ビオチン）及び免疫沈降した量のＴｆＲ１（ＩＢ：ＴｆＲ１）を示す。投入ＴｆＲ１は、各条件のためのローディング対照として使用される。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：イムノブロット。Ｂ．２５μMのＣｏＡの存在下又は非存在下において、通常のＤＭＥＭ培地中で７２時間増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた多重比較のための２元分散分析を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。Ｃ．未処置（－ＤＣＡ）又は５mMのＤＣＡを用いて７２時間処置された（＋ＤＣＡ）、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞のミトコンドリアにおける、ＰＤＨ－Ｅ２、リポイル化ＰＤＨ－Ｅ２（ＰＤＨ－Ｅ２－ＬＡ）、及びリポイル化α－ＫＧＤＨ（α－ＫＧＤＨ－ＬＡ）の定常状態レベル。線維芽細胞のミトコンドリアを、リポ酸に対する抗体（ＰＤＨ－Ｅ２及びα－ＫＧＤＨに結合するリポ酸を検出する）を用いてのイムノブロットによって分析した。ポリンは、ローディング対照として使用された。
【図4C】ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１のパルミトイル化。Ａ．対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞を、ＤＭＳＯのみ（左上パネル）又は２５μMのＣｏＡを用いて７２時間（右上パネル）、５mMのジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を用いて７２時間（左下パネル）、２５μMのアーテスネートを用いて４８時間（右下パネル）処置し、ＴｆＲ１タンパク質を、マウス抗ＴｆＲ１抗体を用いて免疫沈降させて、パルミトイル化アッセイを行なった。各条件において、上パネルは、パルミトイル化ＴｆＲ１レベル（ＩＢ：ビオチン）及び免疫沈降した量のＴｆＲ１（ＩＢ：ＴｆＲ１）を示す。投入ＴｆＲ１は、各条件のためのローディング対照として使用される。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：イムノブロット。Ｂ．２５μMのＣｏＡの存在下又は非存在下において、通常のＤＭＥＭ培地中で７２時間増殖させた、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた多重比較のための２元分散分析を使用して、患者の数値を、対照値の平均値と比較した。＊＊＊は＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。Ｃ．未処置（－ＤＣＡ）又は５mMのＤＣＡを用いて７２時間処置された（＋ＤＣＡ）、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞のミトコンドリアにおける、ＰＤＨ－Ｅ２、リポイル化ＰＤＨ－Ｅ２（ＰＤＨ－Ｅ２－ＬＡ）、及びリポイル化α－ＫＧＤＨ（α－ＫＧＤＨ－ＬＡ）の定常状態レベル。線維芽細胞のミトコンドリアを、リポ酸に対する抗体（ＰＤＨ－Ｅ２及びα－ＫＧＤＨに結合するリポ酸を検出する）を用いてのイムノブロットによって分析した。ポリンは、ローディング対照として使用された。
【図5A】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１の蓄積を減少させ、Ｔｆの再循環を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートの補充された又は補充されていない対照の線維芽細胞（Ｃ１は、３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｃ．トランスフェリンの再循環。Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。Ｄ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を、Ｂ、Ｃ及びＤにおいて使用した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。
【図5B】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１の蓄積を減少させ、Ｔｆの再循環を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートの補充された又は補充されていない対照の線維芽細胞（Ｃ１は、３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｃ．トランスフェリンの再循環。Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。Ｄ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を、Ｂ、Ｃ及びＤにおいて使用した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。
【図5C】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１の蓄積を減少させ、Ｔｆの再循環を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートの補充された又は補充されていない対照の線維芽細胞（Ｃ１は、３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｃ．トランスフェリンの再循環。Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。Ｄ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を、Ｂ、Ｃ及びＤにおいて使用した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。
【図5D】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１の蓄積を減少させ、Ｔｆの再循環を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートの補充された又は補充されていない対照の線維芽細胞（Ｃ１は、３つの対照の代表である）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）における、ＴｆＲ１標識の例。細胞分析は、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。尺度バー、１０μm。Ｂ．ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の少なくとも２０，０００個の線維芽細胞上の膜に結合したＴｆＲ１シグナルの定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｃ．トランスフェリンの再循環。Ｔｆ－ＲＥＤ初期染色に対する比率としての、対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ患者（Ｐ１～５）の線維芽細胞において４０分間追跡した、Ｔｆ－ＲＥＤシグナルの相対平均蛍光強度。分析された細胞数は、３回の独立した実験において２０を超える。データは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差である。Ｄ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を、Ｂ、Ｃ及びＤにおいて使用した。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．５、＜０．０１、及び＜０．００１のｐ値に相当する。ｎｓ：有意ではない。
【図6A】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない高い鉄条件（１００μMのＦＡＣ）中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を使用した。＊＊＊は、ｐ＜０．００１に相当する。Ｂ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２、及びＦＢＸＬ５は、４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件で（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）試験され、ＩＲＰ１、ＩＰＲ２、及びフェリチンは、還元条件で試験された。
【図6B】アーテスネートによる処置は、ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄恒常性を改善させる。Ａ．４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない高い鉄条件（１００μMのＦＡＣ）中で増殖させた線維芽細胞における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用した鉄定量。エラーバーは、標準誤差を示す（ｎ＝３）。ホルム・シダック多重比較検定を用いた２元分散分析を使用した。＊＊＊は、ｐ＜０．００１に相当する。Ｂ．鉄恒常性に関与するタンパク質の定常状態レベル。ＴｆＲ１、ＳＯＤ２、及びＦＢＸＬ５は、４８時間かけて２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない通常のＤＭＥＭ培地中で増殖させた対照（Ｃ１～３）及びＦＲＤＡ線維芽細胞（Ｐ１～５）において、非還元条件で（１２％アクリルアミド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）無し、熱変性無し）試験され、ＩＲＰ１、ＩＰＲ２、及びフェリチンは、還元条件で試験された。
【図7A】ＦＲＤＡ ＰＢＭＣにおける鉄含量。Ａ．高い鉄培地（１００μMのＦＡＣ）中で増殖させたＰＢＭＣ中の鉄含量の測定。鉄含量は、対照（Ｃ４～７）、ＦＸＮ ＧＡＡ伸長のヘテロ接合型保有者（保有者１～３）、及びＦＲＤＡ ＰＢＭＣ（Ｐ１、Ｐ６～Ｐ１４）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用して、８時間毎に４０時間測定された。Ｂ．２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない高い鉄培地（１００μMのＦＡＣ）中４０時間増殖させたＰＢＭＣ中の鉄含量。Ｃ８～９は対照であり、保有者４～５はＦＸＮ ＧＡＡ伸長のヘテロ接合型保有者であり、Ｐ１５～１６は、複合ヘテロ接合型ＦＸＮ ＧＡＡ伸長を有するＦＲＤＡ患者である。
【図7B】ＦＲＤＡ ＰＢＭＣにおける鉄含量。Ａ．高い鉄培地（１００μMのＦＡＣ）中で増殖させたＰＢＭＣ中の鉄含量の測定。鉄含量は、対照（Ｃ４～７）、ＦＸＮ ＧＡＡ伸長のヘテロ接合型保有者（保有者１～３）、及びＦＲＤＡ ＰＢＭＣ（Ｐ１、Ｐ６～Ｐ１４）における、フェロジンに基づいた比色アッセイを使用して、８時間毎に４０時間測定された。Ｂ．２５μMのアーテスネートを含むか又は含まない高い鉄培地（１００μMのＦＡＣ）中４０時間増殖させたＰＢＭＣ中の鉄含量。Ｃ８～９は対照であり、保有者４～５はＦＸＮ ＧＡＡ伸長のヘテロ接合型保有者であり、Ｐ１５～１６は、複合ヘテロ接合型ＦＸＮ ＧＡＡ伸長を有するＦＲＤＡ患者である。
【0028】
実施例：
方法：
診断及び研究の試験のためのインフォームドコンセントが、ヘルシンキ宣言プロトコールに従って全ての被験者から得られ、パリの地域施設内審査委員会によって承認された。
方法：
診断及び研究の試験のためのインフォームドコンセントが、ヘルシンキ宣言プロトコールに従って全ての被験者から得られ、パリの地域施設内審査委員会によって承認された。
【0029】
患者
患者は、フラタキシン遺伝子の第一イントロン内にＧＡＡ反復配列伸長を保有していた。
患者は、フラタキシン遺伝子の第一イントロン内にＧＡＡ反復配列伸長を保有していた。
【0030】
【表1】
【0031】
細胞培養液
皮膚線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２mMのＬ－グルタミン、２．５mMのピルビン酸、１００μg/mlのストレプトマイシン、１００U/mlのペニシリンの補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ライフテクノロジーズ社）培地中で３７℃で増殖させた。クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を用いての処置のために、８０％集密度の細胞を、無血清ＤＭＥＭ（すなわちトランスフェリン非含有）中、１００μMのＦＡＣと共に又は伴わずに７２時間インキュベートした。薬物による処置のために、８０％集密度の細胞を、ＤＭＳＯ中２５μMのアーテスネート（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で４８時間、２５μMのＣｏＡ（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で７２時間、５mMのＤＣＡ（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で７２時間インキュベートした。
皮膚線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２mMのＬ－グルタミン、２．５mMのピルビン酸、１００μg/mlのストレプトマイシン、１００U/mlのペニシリンの補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ライフテクノロジーズ社）培地中で３７℃で増殖させた。クエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を用いての処置のために、８０％集密度の細胞を、無血清ＤＭＥＭ（すなわちトランスフェリン非含有）中、１００μMのＦＡＣと共に又は伴わずに７２時間インキュベートした。薬物による処置のために、８０％集密度の細胞を、ＤＭＳＯ中２５μMのアーテスネート（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で４８時間、２５μMのＣｏＡ（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で７２時間、５mMのＤＣＡ（シグマ社）の補充されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で７２時間インキュベートした。
【0032】
ＰＢＭＣの単離及び培養
ＰＢＭＣを、フィコール（ＧＥヘルスケア社）を使用した密度遠心分離によって８mlの血液試料から単離し、様々な時間をかけて、１００μMのＦＡＣを用いて処置する前に、通常のＤＭＥＭ中で２時間増殖させた。
ＰＢＭＣを、フィコール（ＧＥヘルスケア社）を使用した密度遠心分離によって８mlの血液試料から単離し、様々な時間をかけて、１００μMのＦＡＣを用いて処置する前に、通常のＤＭＥＭ中で２時間増殖させた。
【0033】
ウェスタンブロット
還元性の細胞溶解緩衝液（２μMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、９５℃で５分間かけて変性）又は非還元性の細胞溶解緩衝液（ＤＴＴ無し、熱変性無し）中で培養された皮膚線維芽細胞を、氷上で掻把によって収集した。ウェスタンブロット分析は、２０μgの完全細胞タンパク質抽出物又はミトコンドリアの濃縮された画分に対して、１２％アクリルアミドゲル又は４～１５％のゲル勾配で行なわれた。免疫検出は、５％又は１％ミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社）を含むＰＢＳ中、以下の抗体を使用して行なわれた：ウサギ抗ＳＯＤ１抗体（アブカム社、ａｂ１６８３１）、ウサギ抗ＳＯＤ２抗体（アブカム社、ａｂ１３５３３）、マウス抗ＴｆＲ１抗体（インビトロジェン社、１３－６８００）、ウサギ抗ＴｆＲ１抗体（アブカム社、１０８９８５）、ウサギ抗フェリチン抗体（アブカム社、ａｂ７５９７３）、ウサギ抗ＩＲＰ１抗体（アブカム社、ａｂ１２６５９５）、ウサギ抗ＩＲＰ２抗体（アブカム社、ａｂ８０３３９）、ウサギ抗ＦＢＸＬ５抗体（アブカム社、ａｂ１４０１７５）、ウサギ抗ＦＤＸＲ抗体（アブカム社、２０４３１０）、ウサギ抗ＦＸＮ抗体（プロテインテック社、１４１４７－１－ＡＰ）、ウサギ抗ＰＤＨ Ｅ２サブユニット抗体（アブカム社、ａｂ１７２６１７）、ウサギ抗リポ酸抗体（アブカム社、ａｂ５８７２４）、ヤギ抗ビオチン抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、３１８５２）、マウス抗ＶＤＡＣ/ポリン抗体（アブカム社、ａｂ１４７３４）。
還元性の細胞溶解緩衝液（２μMのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、９５℃で５分間かけて変性）又は非還元性の細胞溶解緩衝液（ＤＴＴ無し、熱変性無し）中で培養された皮膚線維芽細胞を、氷上で掻把によって収集した。ウェスタンブロット分析は、２０μgの完全細胞タンパク質抽出物又はミトコンドリアの濃縮された画分に対して、１２％アクリルアミドゲル又は４～１５％のゲル勾配で行なわれた。免疫検出は、５％又は１％ミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社）を含むＰＢＳ中、以下の抗体を使用して行なわれた：ウサギ抗ＳＯＤ１抗体（アブカム社、ａｂ１６８３１）、ウサギ抗ＳＯＤ２抗体（アブカム社、ａｂ１３５３３）、マウス抗ＴｆＲ１抗体（インビトロジェン社、１３－６８００）、ウサギ抗ＴｆＲ１抗体（アブカム社、１０８９８５）、ウサギ抗フェリチン抗体（アブカム社、ａｂ７５９７３）、ウサギ抗ＩＲＰ１抗体（アブカム社、ａｂ１２６５９５）、ウサギ抗ＩＲＰ２抗体（アブカム社、ａｂ８０３３９）、ウサギ抗ＦＢＸＬ５抗体（アブカム社、ａｂ１４０１７５）、ウサギ抗ＦＤＸＲ抗体（アブカム社、２０４３１０）、ウサギ抗ＦＸＮ抗体（プロテインテック社、１４１４７－１－ＡＰ）、ウサギ抗ＰＤＨ Ｅ２サブユニット抗体（アブカム社、ａｂ１７２６１７）、ウサギ抗リポ酸抗体（アブカム社、ａｂ５８７２４）、ヤギ抗ビオチン抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、３１８５２）、マウス抗ＶＤＡＣ/ポリン抗体（アブカム社、ａｂ１４７３４）。
【0034】
マウス抗ＡＴＰ５ａ（アブカム社、ａｂ１４７４８）、マウス抗ビンキュリン抗体（アブカム社、ａｂ１３０００７）、ウサギ抗ＴＦＡＭ抗体（プロテインテック社、１９９９８－１－ＡＰ）、ウサギＡＴＰ８（プロテインテック社、２６７２３－１－ＡＰ）、及びマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ａｂ８２４５）。ブロットを、蛍光二次抗体（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ/６８０ＬＴヤギ抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ（ＬＩ－ＣＯＲ社））又は電気化学発光法に基づいた検出の前に（SuperSignal West Dura、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（アブカム社）、ヤギ抗マウスＩｇＧＨＲＰ（アブカム社）、又はロバ抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰ（サンタクルツ社））と共にインキュベートした。Image Studio Lite v5.2（ＬＩ－ＣＯＲバイオサイエンシーズ社）を使用したオデッセイ近赤外蛍光イメージングシステム、又はImage Lab v3.0（バイオラッド社）を使用したＣＤＤカメラのいずれかを用いて、シグナルを取得した。
【0035】
ＭｉｔｏＳＯＸ
ミトコンドリアスーパーオキシドは、（Mukhopadhyay et al., 2007）から改作されたフローサイトメトリーアッセイによって定量された。線維芽細胞に、１０μMのＭｉｔｏＳｏｘ Ｒｅｄを２０分かけて補充し、トリプシン処理し、新たな培地（通常の培地又はＦＡＣを含むＤＭＥＭ）を用いて中和した。フローサイトメトリーを、ガリオス（ベックマンコールター社）を使用して行なった。ＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄを４８８nmにおいて励起した。データは、カルーザソフトウェア（ベックマンコールター社）で少なくとも２０，０００個の細胞の前方散乱光、側方散乱光、５８０nm（ＦＬ２）チャネルにおいて収集された。細胞片を、分析のために除外した。ＭｉｔｏＳＯＸ蛍光の平均強度のヒストグラムは、ＦＬ２チャネルに示された。
ミトコンドリアスーパーオキシドは、（Mukhopadhyay et al., 2007）から改作されたフローサイトメトリーアッセイによって定量された。線維芽細胞に、１０μMのＭｉｔｏＳｏｘ Ｒｅｄを２０分かけて補充し、トリプシン処理し、新たな培地（通常の培地又はＦＡＣを含むＤＭＥＭ）を用いて中和した。フローサイトメトリーを、ガリオス（ベックマンコールター社）を使用して行なった。ＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄを４８８nmにおいて励起した。データは、カルーザソフトウェア（ベックマンコールター社）で少なくとも２０，０００個の細胞の前方散乱光、側方散乱光、５８０nm（ＦＬ２）チャネルにおいて収集された。細胞片を、分析のために除外した。ＭｉｔｏＳＯＸ蛍光の平均強度のヒストグラムは、ＦＬ２チャネルに示された。
【0036】
ＴＦＲＣ及びＦＴＨの転写物の定量
全ＲＮＡが、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（キアゲン社）、及びＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット（キアゲン社）により処理されたデオキシリボヌクレアーゼを使用して抽出された。全ＲＮＡの濃度及び純度は、－８０℃で保存する前に、Ｎａｎｏｄｒｏｐ－８０００分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して評価された。その後、ｍＲＮＡは、ランダムプライミングを使用して、製造業者の説明書に従って、High-Capacity RNA-to-cDNAキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、２μgの完全なＲＮＡから逆転写された。定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を、ＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲシステム（バイオラッド社）を使用したデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて実施した。ＴＦＲＣ及びＦＴＨ ｃＤＮＡを、特異的なプライマーを使用して増幅した。β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ、ＮＭ＿０００１８１．３）を、標準化のために使用した。データは、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ分析ソフトウェア（バイオラッド社）を使用したＱＸ２００ドロップレットリーダーで分析された。ＴＦＲＣ及びＦＴＨの発現レベルは、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子の平均コピー数に対して標準化された。
全ＲＮＡが、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（キアゲン社）、及びＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット（キアゲン社）により処理されたデオキシリボヌクレアーゼを使用して抽出された。全ＲＮＡの濃度及び純度は、－８０℃で保存する前に、Ｎａｎｏｄｒｏｐ－８０００分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して評価された。その後、ｍＲＮＡは、ランダムプライミングを使用して、製造業者の説明書に従って、High-Capacity RNA-to-cDNAキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、２μgの完全なＲＮＡから逆転写された。定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を、ＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲシステム（バイオラッド社）を使用したデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて実施した。ＴＦＲＣ及びＦＴＨ ｃＤＮＡを、特異的なプライマーを使用して増幅した。β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ、ＮＭ＿０００１８１．３）を、標準化のために使用した。データは、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ分析ソフトウェア（バイオラッド社）を使用したＱＸ２００ドロップレットリーダーで分析された。ＴＦＲＣ及びＦＴＨの発現レベルは、ＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子の平均コピー数に対して標準化された。
【0037】
鉄含量及びイメージングフローサイトメトリー（イメージストリーム）
線維芽細胞を、ウシ胎児血清非含有ＤＭＥＭ培地（すなわちトランスフェリン非含有）中で１時間かけて欠乏状態とし、トリプシンのように細胞表面に位置するＴｆＲ１を破壊することなくそれらを収集するために５mMのＥＤＴＡで処理し、その後、ＴｆＲ１の内部移行を回避するために抗ＴｆＲ１抗体を用いて４℃で標識した。この条件では、膜に結合したＴｆＲ１のみが定量される。細胞選別は、生細胞の選択を可能とする、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。
線維芽細胞を、ウシ胎児血清非含有ＤＭＥＭ培地（すなわちトランスフェリン非含有）中で１時間かけて欠乏状態とし、トリプシンのように細胞表面に位置するＴｆＲ１を破壊することなくそれらを収集するために５mMのＥＤＴＡで処理し、その後、ＴｆＲ１の内部移行を回避するために抗ＴｆＲ１抗体を用いて４℃で標識した。この条件では、膜に結合したＴｆＲ１のみが定量される。細胞選別は、生細胞の選択を可能とする、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。
【0038】
総鉄含量を、（Barbeito et al., 2010）から変更されたフェロジンに基づいた鉄アッセイを使用して測定した。イメージングフローサイトメトリーのために、線維芽細胞を、ウシ胎児血清非含有ＤＭＥＭ培地中で１時間かけて欠乏状態とし、トリプシンのように細胞表面に位置するＴｆＲ１を破壊することなくそれらを収集するために５mMのＥＤＴＡで処理し、冷ＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＴｆＲ１の内部移行を回避するために抗ＴｆＲ１抗体（Ａ２４）（Moura et al., 2004）を用いて氷上で１時間かけて標識した。この条件では、膜に結合したＴｆＲ１のみが定量される。二次染色を、氷上で３０分間、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス抗体（ライフテクノロジーズ社）を使用して行なった。細胞を洗浄し、全容量５０μl中で５分間かけてヘキストを用いて染色し、直接取得を行った。細胞分析は、生細胞の選択を可能とする、ヘキスト陽性シグナルに基づいた。試料を、フローサイトメトリーと、詳細な細胞イメージング及び機能的研究とを合わせたイメージストリームＩＳＸ ｍｋＩＩ（アムニス社、ミリポア、シアトル、ＷＡ州）にかけ、全ての取得のために４０倍の拡大率を使用した。データを、ＩＮＳＰＩＲＥソフトウェア（アムニス社）を使用して取得し、ＩＤＥＡＳ（商標）ソフトウェア（バージョン６．２アムニス社）を使用して少なくとも２０，０００個の事象に対して分析した。スペクトル補正を、単一に染色された試料を使用して行なった。特別なマスクが、ＴｆＲ１の膜局在化の分析のために設計された。このマスクは、完全な明視野マスクから５ピクセル減退したものと、１ピクセル膨張した明視野マスクの結果であり、その結果、ドーナツ様のマスクが得られた。結果は、平均ピクセル強度値として表現され、これは、表面積に対して標準化された強度である。
【0039】
共焦点顕微鏡
Ｔｆの再循環のために、線維芽細胞を、実験の２４時間前に、マイクロスライドガラス底（ＩＢＩＤＩ社）上に３０％の集密度で広げた。その後、細胞を、ウシ胎児血清非含有ＤＭＥＭ培地中で１時間欠乏状態とし、３７℃で３０分間かけてＴｆ－ＲＥＤ（１２．５μg/mL）を添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、スピニングディスク式共焦点顕微鏡（ツァイス顕微鏡）を使用したライブイメージング取得のために通常の培地中でインキュベートした。スライドを、５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーションチャンバーに入れた。少なくとも２０個の細胞が、６３倍の油浸対物レンズを使用した条件によって、Ｚｅｎソフトウェアを使用して、４０分間の間に、１分あたりの細胞の写真で取得された。核領域（ＮＲ）は、Ｉｃｙソフトウェアｖ１．９を使用して規定された。各ＮＲを２倍拡大して、関心対象の核周囲領域（ＰＮＲＯＩ）を作成した。その後、ＰＮＲＯＩマスクを、定量的な平均蛍光粒子強度を得るために、スポット検出器プラグインによってＲＥＤチャネルに適用した。少なくとも８ピクセルサイズの粒子のみが考慮された。平均強度値は、表面積に対して標準化された。データは、０分の時点におけるＴｆ初期シグナルに対する比率で表現された。
Ｔｆの再循環のために、線維芽細胞を、実験の２４時間前に、マイクロスライドガラス底（ＩＢＩＤＩ社）上に３０％の集密度で広げた。その後、細胞を、ウシ胎児血清非含有ＤＭＥＭ培地中で１時間欠乏状態とし、３７℃で３０分間かけてＴｆ－ＲＥＤ（１２．５μg/mL）を添加した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、スピニングディスク式共焦点顕微鏡（ツァイス顕微鏡）を使用したライブイメージング取得のために通常の培地中でインキュベートした。スライドを、５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーションチャンバーに入れた。少なくとも２０個の細胞が、６３倍の油浸対物レンズを使用した条件によって、Ｚｅｎソフトウェアを使用して、４０分間の間に、１分あたりの細胞の写真で取得された。核領域（ＮＲ）は、Ｉｃｙソフトウェアｖ１．９を使用して規定された。各ＮＲを２倍拡大して、関心対象の核周囲領域（ＰＮＲＯＩ）を作成した。その後、ＰＮＲＯＩマスクを、定量的な平均蛍光粒子強度を得るために、スポット検出器プラグインによってＲＥＤチャネルに適用した。少なくとも８ピクセルサイズの粒子のみが考慮された。平均強度値は、表面積に対して標準化された。データは、０分の時点におけるＴｆ初期シグナルに対する比率で表現された。
【0040】
パルミトイル化アッセイ
培養された皮膚線維芽細胞のＴｆＲ１パルミトイル化は、（Ba et al., 2012）から変更された。簡潔に言えば、細胞を氷上のＤＴＴ非含有細胞溶解緩衝液中で溶解し、内因性ＴｆＲ１を、プロテインＧ磁気ビーズ（バイオラッド社）と共に、マウス抗ＴｆＲ１抗体（ライフテクノロジーズ社、１３６８９０）を用いて一晩かけて免疫沈降させた。ＰＢＳで洗浄した後、ビーズを連続的に、５０mMのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）と共に室温で２時間、１Ｍのヒドロキシルアミン及び５０mMのＨＰＤＰ－ビオチン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と共に暗闇で２時間インキュベートした。試料を１２％のアクリルアミドゲルに流し、ビオチンで標識されたＴｆＲ１レベルは、ＣＣＤカメラ（バイオラッド社）及びＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアｖ３．０（バイオラッド社）によるＣｈｅｍｉｄｏｃ技術を使用して、非還元条件でイムノブロットによって決定された。
培養された皮膚線維芽細胞のＴｆＲ１パルミトイル化は、（Ba et al., 2012）から変更された。簡潔に言えば、細胞を氷上のＤＴＴ非含有細胞溶解緩衝液中で溶解し、内因性ＴｆＲ１を、プロテインＧ磁気ビーズ（バイオラッド社）と共に、マウス抗ＴｆＲ１抗体（ライフテクノロジーズ社、１３６８９０）を用いて一晩かけて免疫沈降させた。ＰＢＳで洗浄した後、ビーズを連続的に、５０mMのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）と共に室温で２時間、１Ｍのヒドロキシルアミン及び５０mMのＨＰＤＰ－ビオチン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と共に暗闇で２時間インキュベートした。試料を１２％のアクリルアミドゲルに流し、ビオチンで標識されたＴｆＲ１レベルは、ＣＣＤカメラ（バイオラッド社）及びＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアｖ３．０（バイオラッド社）によるＣｈｅｍｉｄｏｃ技術を使用して、非還元条件でイムノブロットによって決定された。
【0041】
ミトコンドリア単離
ミトコンドリアは、分画遠心分離によって、Ｍｉｔｏ単離緩衝液（３２０mMのスクロース、１０mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ中のプロテアーゼ阻害剤混合液と共に）中で（Metodiev et al., 2009）に記載のように単離された。ミトコンドリアは、タンパク質分析のためにＭｉｔｏ単離緩衝液に再懸濁されたか、又は鉄定量のために乾燥ペレットで保存された。
ミトコンドリアは、分画遠心分離によって、Ｍｉｔｏ単離緩衝液（３２０mMのスクロース、１０mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ中のプロテアーゼ阻害剤混合液と共に）中で（Metodiev et al., 2009）に記載のように単離された。ミトコンドリアは、タンパク質分析のためにＭｉｔｏ単離緩衝液に再懸濁されたか、又は鉄定量のために乾燥ペレットで保存された。
【0042】
統計
全ての統計分析は、ホルム・シダック法を用いた多重比較のための、両側の対応のないｔ検定又は一元分散分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０（グラフパッドソフトウェア）を用いて行なわれた。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０５、＜０．０１、及び＜０．００１のＰ値に相当する。ｎｓ：非有意。
全ての統計分析は、ホルム・シダック法を用いた多重比較のための、両側の対応のないｔ検定又は一元分散分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０（グラフパッドソフトウェア）を用いて行なわれた。＊、＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、＜０．０５、＜０．０１、及び＜０．００１のＰ値に相当する。ｎｓ：非有意。
【0043】
結果
ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるフラタキシン、ＴｆＲ１及びＩＲＰの特徴付け
ＦＲＤＡ患者の培養された皮膚線維芽細胞中のフラタキシン定常状態レベルは、対照値の３０～６８％まで減少した（ＧＡＡ反復配列伸長＞２．１ｋｂ、図１Ａ）。フェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）定常状態レベルも減少し、このことは、ＦＲＤＡ線維芽細胞における２つのタンパク質の同時調節を示唆する（図１Ａ）。
ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるフラタキシン、ＴｆＲ１及びＩＲＰの特徴付け
ＦＲＤＡ患者の培養された皮膚線維芽細胞中のフラタキシン定常状態レベルは、対照値の３０～６８％まで減少した（ＧＡＡ反復配列伸長＞２．１ｋｂ、図１Ａ）。フェレドキシン還元酵素（ＦＤＸＲ）定常状態レベルも減少し、このことは、ＦＲＤＡ線維芽細胞における２つのタンパク質の同時調節を示唆する（図１Ａ）。
【0044】
細胞内の鉄は主に、ＴｆＲ１により媒介されるエンドサイトーシスによる、トランスフェリンに結合した鉄の取り込みによって移入される。細胞内の鉄の恒常性は、鉄調節タンパク質１～２（ＩＲＰ１～２）の関与する転写後機序によって調節される。ＩＲＰは、転写後レベルでいくつかの鉄に関連した遺伝子、特にＴｆＲ１及びフェリチンを調節する。ＦＲＤＡ線維芽細胞のウェスタンブロット分析は、ＴｆＲ１（１．６倍の増加）、ＩＲＰ１及びＩＲＰ２（それぞれ２．２倍及び２．４倍、図１Ａ）の増加した定常状態レベルを示し、ミトコンドリア鉄硫黄複合体機構の破壊後に以前に報告されているような鉄欠乏状態を模倣することを示した（Muhlenhoff et al., 2015）。逆説的に、フェリチンの定常状態レベルも、ＦＲＤＡ線維芽細胞において増加し（２．１倍）、これは、上昇したＴｆＲ１及びＩＲＰ１～２と矛盾し、細胞内の鉄の過剰負荷を示唆する。不安定な鉄プールを反映する鉄センサータンパク質である、Ｆ－ｂｏｘ／ロイシンリッチリピートタンパク質５（ＦＢＸＬ５）も同様に増加し、これもまた細胞質内の鉄の過剰負荷を支持する。一貫して、細胞質内スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１は増加し（２３２％の平均増加）、このことは、細胞質内の鉄の過剰負荷におそらく関連した細胞質内ストレスを示唆する（図１Ｃ）。ミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ２は、２倍の増加を示し、ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるミトコンドリアへの鉄の過剰負荷によっておそらくトリガーされた、重度の酸化ストレスを反映する（図１Ａ）。一貫して、ミトコンドリア活性酸素種の２．５倍の増加が、ＭｉｔｏＳＯＸを使用してＦＲＤＡ線維芽細胞においてフローサイトメトリーによって検出された（図１Ｂ）。
【0045】
ＦＲＤＡ線維芽細胞は、鉄の取り込みを調節できなかった。
上昇したフェリチン及びＦＢＸＬ５の定常状態レベルは、（Barbeito et al., 2010）から変更されたフェロジンに基づいた鉄アッセイを使用して、ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄含量を評価することを促した。基礎条件では、細胞内総鉄は、対照と比較してＦＲＤＡ線維芽細胞において３～４倍高かったが（図１Ｃ）、ミトコンドリア抽出物における鉄含量は、対照と比較してＦＲＤＡにおいてたった２倍高いだけであった（図１Ｄ）。ミトコンドリア内の鉄は、対照における総鉄の主に１～１．５％を占めたが、ＦＲＤＡ線維芽細胞においては僅か０．６～０．８％であった（図１Ｅ）。したがって、ＦＲＤＡ線維芽細胞は主に、細胞質内に鉄を蓄積し、ミトコンドリアにおいてはより程度が低く、このことは、細胞内総鉄は、ＦＲＤＡ線維芽細胞内の実際のミトコンドリア内の鉄プールを反映しないことを示唆する。
上昇したフェリチン及びＦＢＸＬ５の定常状態レベルは、（Barbeito et al., 2010）から変更されたフェロジンに基づいた鉄アッセイを使用して、ＦＲＤＡ線維芽細胞における鉄含量を評価することを促した。基礎条件では、細胞内総鉄は、対照と比較してＦＲＤＡ線維芽細胞において３～４倍高かったが（図１Ｃ）、ミトコンドリア抽出物における鉄含量は、対照と比較してＦＲＤＡにおいてたった２倍高いだけであった（図１Ｄ）。ミトコンドリア内の鉄は、対照における総鉄の主に１～１．５％を占めたが、ＦＲＤＡ線維芽細胞においては僅か０．６～０．８％であった（図１Ｅ）。したがって、ＦＲＤＡ線維芽細胞は主に、細胞質内に鉄を蓄積し、ミトコンドリアにおいてはより程度が低く、このことは、細胞内総鉄は、ＦＲＤＡ線維芽細胞内の実際のミトコンドリア内の鉄プールを反映しないことを示唆する。
【0046】
細胞内鉄は、低い鉄条件（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）無し、すなわちトランスフェリンに結合した鉄がない）、又はクエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）によってもたらされる高い鉄条件のいずれかにおいて定量された。ＦＡＣは、内在輸送体又はエンドサイトーシス経路を介して適時、細胞内に浸透する、可溶形の非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）である。低い鉄条件（ＦＡＣもなければＦＢＳもない）では、ＦＲＤＡ線維芽細胞は、対照と比較して２～４倍高い鉄含量を示した（図２Ａ）。しかしながら、ＦＡＣと共に３日間インキュベートした後、ＦＲＤＡ線維芽細胞は、大きな細胞内鉄増加（３２～４２倍の変化）を示したが、対照線維芽細胞は１０倍の増加を示した（図２Ａ）。これは、呼吸鎖の欠損に起因しなかった。なぜなら、二対立遺伝子ＳＵＲＦ１突然変異を有する患者における細胞内鉄レベルは、同じ条件で増殖させた対照と類似していたからである（図２Ａ）。これらのデータは、培養されたＦＲＤＡ線維芽細胞が、鉄取り込みを調節することができず、高い鉄条件で増殖された場合に大きな鉄の過剰負荷を示すことを示唆した。
【0047】
鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）は、細胞内鉄含量のセンサーである。細胞質内鉄が増加すると、ＩＲＰ１はアコニターゼに変換され、一方、ＩＲＰ２は鉄結合タンパク質ＦＢＸＬ５によってユビキチン化及びプロテアソームによる分解に標的化される。減少したＩＲＰ１～２は、ＴｆＲ１をダウンレギュレートし、鉄の取り込みを制限し、一方、フェリチンはアップレギュレートされ、細胞質内への鉄の貯蔵が可能となる。ＦＲＤＡ線維芽細胞の大きな鉄過剰負荷を考慮して、本発明者らは、鉄恒常性の転写後調節を調べた。低い鉄条件（－ＦＡＣ）又は高い鉄条件（＋ＦＡＣ）のいずれかで３日間増殖させた線維芽細胞中の、ＴｆＲ１（ＴＦＲＣ）及びＨ－フェリチン（ＦＴＨ）のｍＲＮＡを、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量した。ＴＦＲＣｍＲＮＡレベルは、低い鉄条件（－ＦＡＣ）で増殖させた対照及びＦＲＤＡの線維芽細胞において類似し、高い鉄条件で減少し、このことは、ＴＦＲＣ転写物の正常なダウンレギュレーションを示唆する（図２Ｂ）。フェリチンｍＲＮＡは、高い鉄条件で増殖させた対照及びＦＲＤＡの線維芽細胞において同時に増加した（図２Ｃ）。これらの結果は、ＦＲＤＡの線維芽細胞におけるＴｆＲ１及びフェリチンの効率的な転写後調節を示唆する。
【0048】
一貫して、ウェスタンブロット分析は、高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させた対照細胞において、低いレベルのＴｆＲ１が、鉄が蓄積するのを防ぎ、Ｈ－フェリチン及びＬ－フェリチンのレベルも増加し、これにより鉄の貯蔵が可能となったことを示した（図２Ｄ）。細胞内鉄の増加は、高いレベルのＳＯＤ１～２によって示されるように、強力な細胞質内及びミトコンドリア内の活性酸素種の過剰産生を誘発した。これらの条件では（＋ＦＡＣ）、ＦＲＤＡ線維芽細胞は、高い定常状態のフェリチンレベルにも関わらず、ＴｆＲ１含量をダウンレギュレートできず、増加さえした。類似の結果が、ＦＢＸＬ５を用いて観察された（図２Ｄ）。鉄の過剰負荷の脈絡において、ＴｆＲ１及びフェリチンが合わせて増加することは逆説的である。なぜなら、貯蔵された鉄は、ＴｆＲ１レベル及び金属の移入をダウンレギュレートするはずだからである。この結果は、ＴｆＲ１が、ＦＲＤＡ線維芽細胞においてＩＲＰの調節を回避するようであることを示唆する。ＴｆＲ１の転写後調節が影響を受けないことを思い出すと、これらの結果は、ＮＢＩＡにおいて以前に記載されているように（Drecourt et al., 2018）、ＦＲＤＡにおけるＴｆＲ１の異常な翻訳後調節を示唆する。
【0049】
ＴｆＲ１は、ＦＲＤＡ線維芽細胞の細胞表面に蓄積する。
本発明者らは、ＴｆＲ１の増加した定常状態レベルが、ＮＢＩＡにおいて観察されているような、ＦＲＤＡにおける膜へのＴｆＲ１の蓄積に関連している可能性があると仮説を立てた。ＴｆＲ１の量は、フローサイトメトリーと詳細な細胞イメージング及び機能的研究とを合わせた、アムニス社のイメージストリーム（Ｘ）マークＩＩを使用した次世代イメージングフローサイトメトリーを使用した免疫蛍光によって定量された。この分析は、対照と比較して、ＦＲＤＡ線維芽細胞の細胞表面において増加した量のＴｆＲ１を示した（図３Ａ）。ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、基礎条件で増殖させた２０，０００個を超える線維芽細胞におけるＴｆＲ１の定量は、患者におけるＴｆＲ１シグナルの有意な増加を明らかとした（図３Ｂ）。これらの結果は、鉄の過剰負荷及び正しい転写後のダウンレギュレーションにも関わらず、ＦＲＤＡの線維芽細胞は、細胞膜においてＴｆＲ１を蓄積し、それらが鉄の取り込みを調節するのを妨害することを示す。
本発明者らは、ＴｆＲ１の増加した定常状態レベルが、ＮＢＩＡにおいて観察されているような、ＦＲＤＡにおける膜へのＴｆＲ１の蓄積に関連している可能性があると仮説を立てた。ＴｆＲ１の量は、フローサイトメトリーと詳細な細胞イメージング及び機能的研究とを合わせた、アムニス社のイメージストリーム（Ｘ）マークＩＩを使用した次世代イメージングフローサイトメトリーを使用した免疫蛍光によって定量された。この分析は、対照と比較して、ＦＲＤＡ線維芽細胞の細胞表面において増加した量のＴｆＲ１を示した（図３Ａ）。ＩＤＥＡＳソフトウェア（アムニス社）を使用した、基礎条件で増殖させた２０，０００個を超える線維芽細胞におけるＴｆＲ１の定量は、患者におけるＴｆＲ１シグナルの有意な増加を明らかとした（図３Ｂ）。これらの結果は、鉄の過剰負荷及び正しい転写後のダウンレギュレーションにも関わらず、ＦＲＤＡの線維芽細胞は、細胞膜においてＴｆＲ１を蓄積し、それらが鉄の取り込みを調節するのを妨害することを示す。
【0050】
ＦＲＤＡの線維芽細胞における遅延したトランスフェリンの再循環
スピニングディスク方式共焦点顕微鏡を使用して、患者及び対照の線維芽細胞におけるトランスフェリン（Ｔｆ）－Ａｌｅｘａ５５５の染色の核周囲の免疫蛍光強度を評価した。Ｔｆ－Ａｌｅｘａ５５５のパルスチェイスのＴ０の時点において、Ｔｆの染色は、患者及び対照の細胞において類似していた。対照の線維芽細胞は、Ｔｆ再循環に起因するＴｆ染色の急速な減少を示した（図３Ｃ）。対照的に、Ｔｆ再循環は、ＦＲＤＡの線維芽細胞において有意に遅延していた。なぜなら、核の周囲に集合した特定のシグナルは、Ｔｆ－Ａｌｅｘａ５５５の１０分間のインキュベート後に減少できず、さらにそれより後に遅延したからである（図３Ｃ）。
スピニングディスク方式共焦点顕微鏡を使用して、患者及び対照の線維芽細胞におけるトランスフェリン（Ｔｆ）－Ａｌｅｘａ５５５の染色の核周囲の免疫蛍光強度を評価した。Ｔｆ－Ａｌｅｘａ５５５のパルスチェイスのＴ０の時点において、Ｔｆの染色は、患者及び対照の細胞において類似していた。対照の線維芽細胞は、Ｔｆ再循環に起因するＴｆ染色の急速な減少を示した（図３Ｃ）。対照的に、Ｔｆ再循環は、ＦＲＤＡの線維芽細胞において有意に遅延していた。なぜなら、核の周囲に集合した特定のシグナルは、Ｔｆ－Ａｌｅｘａ５５５の１０分間のインキュベート後に減少できず、さらにそれより後に遅延したからである（図３Ｃ）。
【0051】
ＦＲＤＡの線維芽細胞におけるＴｆＲ１のパルミトイル化
ＴｆＲ１は、チオエステル結合を介したＣｙｓ６２及びＣｙｓ６７へのＳ－アシル基の共有結合による付着によって翻訳後修飾され、パルミテートは主な脂肪酸ドナーである。減少したパルミトイル化は、ＴｆＲ１のエンドサイトーシス及び鉄の取り込みを増加させることが以前に示されている（Alvarez et al., 1990）。さらに、ＮＢＩＡ線維芽細胞において近年、不完全なＴｆＲ１のパルミトイル化が報告され、ここでは鉄の恒常性も変化している（Drecourt et al., 2018）。ＦＲＤＡ患者の培養細胞を研究することにより、ＴｆＲ１のパルミトイル化の、対照値の僅か１６～２２％までの劇的な減少が判明し、このことは、フラタキシンの欠損が、依然として不明な理由から、ＴｆＲ１のパルミトイル化に深刻な影響を及ぼすことを示唆する（図４Ａ）。アセチル－補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、パルミトイルトランスフェラーゼのためのアセチル基の唯一のドナーである。本発明者らは、ＣｏＡ生合成に関与する２つのＮＢＩＡ遺伝子（ＰＡＮＫ２及びＣＲＡＴ）において二対立遺伝子の突然変異を有する培養線維芽細胞にＣｏＡを添加することにより、ＴｆＲ１のパルミトイル化は増加したことを以前に報告し、このことは、損なわれたＣｏＡの生合成が二次的にＴｆＲ１のパルミトイル化を変化させることを示唆する（Drecourt et al., 2018）。細胞は、細胞外源からＣｏＡを得ることができる。なぜなら、ＣｏＡは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼによって細胞外で加水分解されることができ、これにより、膜透過性の４’－ホスホパンテテインを産生し、細胞内でＣｏＡに変換されることができるからである（Srinivasan et al., 2015）。培養細胞に２５μMのＣｏＡを７２時間かけて補充することにより、ＦＲＤＡ線維芽細胞においてＴｆＲ１のパルミトイル化は増加し（２．１倍から３．２倍の増加、図４Ａ）、このことはフラタキシンの欠損が、ＣｏＡプールを制限し、二次的にＴｆＲ１のパルミトイル化に影響を及ぼすことを示唆する。ＣｏＡの補充はまた、ＦＲＤＡの線維芽細胞におけるＴｆＲ１の定常状態レベルを減少させた（図４Ａ）。さらに、対照とは異なって、高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させ、２５μMのＣｏＡを７２時間かけて補充されたＦＲＤＡ線維芽細胞は、細胞内鉄含量の１．６倍～２．４倍の減少を示した（図４Ｂ）。このことは、フラタキシンの欠損と、ＣｏＡの利用可能性と、ＴｆＲ１のパルミトイル化と、鉄の恒常性との間の直接的な関連を示唆する。
ＴｆＲ１は、チオエステル結合を介したＣｙｓ６２及びＣｙｓ６７へのＳ－アシル基の共有結合による付着によって翻訳後修飾され、パルミテートは主な脂肪酸ドナーである。減少したパルミトイル化は、ＴｆＲ１のエンドサイトーシス及び鉄の取り込みを増加させることが以前に示されている（Alvarez et al., 1990）。さらに、ＮＢＩＡ線維芽細胞において近年、不完全なＴｆＲ１のパルミトイル化が報告され、ここでは鉄の恒常性も変化している（Drecourt et al., 2018）。ＦＲＤＡ患者の培養細胞を研究することにより、ＴｆＲ１のパルミトイル化の、対照値の僅か１６～２２％までの劇的な減少が判明し、このことは、フラタキシンの欠損が、依然として不明な理由から、ＴｆＲ１のパルミトイル化に深刻な影響を及ぼすことを示唆する（図４Ａ）。アセチル－補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、パルミトイルトランスフェラーゼのためのアセチル基の唯一のドナーである。本発明者らは、ＣｏＡ生合成に関与する２つのＮＢＩＡ遺伝子（ＰＡＮＫ２及びＣＲＡＴ）において二対立遺伝子の突然変異を有する培養線維芽細胞にＣｏＡを添加することにより、ＴｆＲ１のパルミトイル化は増加したことを以前に報告し、このことは、損なわれたＣｏＡの生合成が二次的にＴｆＲ１のパルミトイル化を変化させることを示唆する（Drecourt et al., 2018）。細胞は、細胞外源からＣｏＡを得ることができる。なぜなら、ＣｏＡは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼによって細胞外で加水分解されることができ、これにより、膜透過性の４’－ホスホパンテテインを産生し、細胞内でＣｏＡに変換されることができるからである（Srinivasan et al., 2015）。培養細胞に２５μMのＣｏＡを７２時間かけて補充することにより、ＦＲＤＡ線維芽細胞においてＴｆＲ１のパルミトイル化は増加し（２．１倍から３．２倍の増加、図４Ａ）、このことはフラタキシンの欠損が、ＣｏＡプールを制限し、二次的にＴｆＲ１のパルミトイル化に影響を及ぼすことを示唆する。ＣｏＡの補充はまた、ＦＲＤＡの線維芽細胞におけるＴｆＲ１の定常状態レベルを減少させた（図４Ａ）。さらに、対照とは異なって、高い鉄条件（＋ＦＡＣ）で増殖させ、２５μMのＣｏＡを７２時間かけて補充されたＦＲＤＡ線維芽細胞は、細胞内鉄含量の１．６倍～２．４倍の減少を示した（図４Ｂ）。このことは、フラタキシンの欠損と、ＣｏＡの利用可能性と、ＴｆＲ１のパルミトイル化と、鉄の恒常性との間の直接的な関連を示唆する。
【0052】
ＦＲＤＡ線維芽細胞において損なわれたＴｆＲ１のパルミトイル化は、不完全なピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）のリポイル化に関連している
リポ酸シンターゼ（ＬＩＡＳ）は［４Ｆｅｓ－４Ｓ］クラスター含有タンパク質であり、リポ酸（ＬＡ）合成の重要な酵素である。ＬＡは、３つのピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）サブユニットとの１つである、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＤＬＡＴ又はＰＤＨ－Ｅ２）をはじめとする、いくつかのミトコンドリアタンパク質の補因子である。鉄硫黄複合体の生合成に関与する様々な遺伝子（ＮＦＵ１、ＩＢＡ５７、ＩＳＣＡ２及びＦＤＸ１Ｌ）において二対立遺伝子の突然変異を有する患者の培養された線維芽細胞は、ＤＬＡＴ及び他のミトコンドリアタンパク質の損なわれたリポイル化、並びに減少したＰＤＨ活性を示す（Lebigot et al., 2017）。
リポ酸シンターゼ（ＬＩＡＳ）は［４Ｆｅｓ－４Ｓ］クラスター含有タンパク質であり、リポ酸（ＬＡ）合成の重要な酵素である。ＬＡは、３つのピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）サブユニットとの１つである、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＤＬＡＴ又はＰＤＨ－Ｅ２）をはじめとする、いくつかのミトコンドリアタンパク質の補因子である。鉄硫黄複合体の生合成に関与する様々な遺伝子（ＮＦＵ１、ＩＢＡ５７、ＩＳＣＡ２及びＦＤＸ１Ｌ）において二対立遺伝子の突然変異を有する患者の培養された線維芽細胞は、ＤＬＡＴ及び他のミトコンドリアタンパク質の損なわれたリポイル化、並びに減少したＰＤＨ活性を示す（Lebigot et al., 2017）。
【0053】
さらに、マウスにおけるＦＸＮの欠損（Martelli et al., 2015）及びＨｅＬａ細胞におけるＦＸＮのノックダウンにより、ＰＤＨ及びα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α－ＫＧＤＨ、Tong et al. 2018）の非常に不完全なリポイル化が起こった。本発明者らはまた、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＰＤＨ－Ｅ２及びα－ＫＧＤＨの変化したリポイル化、並びにＰＤＨ－Ｅ２サブユニットの減少した定常状態レベルを観察した（図４Ｃ）。ＣｏＡの補充がＴｆＲ１のパルミトイル化を改善したことを考えると、本発明者らは、フラタキシンの欠損が、不完全なＰＤＨのリポイル化を介してＴｆＲ１のパルミトイル化に影響を及ぼし得るという仮説を立てた。なぜなら特に、アセチルＣｏＡは、主に、ミトコンドリア内のＰＤＨ複合体によるピルビン酸の酸化的脱炭酸によって産生されるからである。ＰＤＨ複合体を不活化するＰＤＨキナーゼ（ＰＤＨＫ）の阻害剤であるジクロロ酢酸（ＤＣＡ）は、ピルビン酸の酸化及びアセチルＣｏＡのプールを増加させることが知られている。ＦＲＤＡ線維芽細胞に５mMのＤＣＡを７２時間かけて補充することにより、ＣｏＡとちょうど同じようにＴｆＲ１のパルミトイル化は有意に増加し（図４Ａ）、このことは、減少したＰＤＨの活性が実際に、ＴｆＲ１のパルミトイル化のために利用可能なＣｏＡのプールに影響を及ぼすことを実証する。ＤＣＡはまた、ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１の定常状態レベルを有意に減少させた（図４Ａ）。さらに、ＤＣＡの補充は、完全に又は部分的に、ＦＲＤＡ線維芽細胞において、ＰＤＨ－Ｅ２の定常状態レベルを救出し、ＰＤＨ及びα－ＫＧＤＨのリポイル化を変化させた。なぜなら、おそらくリポ酸の前駆体であるオクタン酸は、脂肪酸の酸化を通して合成されるからである。
【0054】
アーテスネートは、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１のパルミトイル化、Ｔｆの再循環、及び鉄の過剰負荷を救出する
アーテスネートは、ＴｆＲ１のパルミトイル化により細胞内の鉄の恒常性を変化させ、膜のＴｆＲ１を減少させることが知られている（Ba et al., 2012）。２５μMのアーテスネートを４８時間かけて培養培地に加えることにより、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１のパルミトイル化は対照の８０％まで増強され、ＴｆＲ１の定常状態レベルは有意に減少した（図４Ａ）。イメージングフローサイトメトリーは、アーテスネートが、ＦＲＤＡ線維芽細胞における膜のＴｆＲ１を有意に減少させ（１５～３０％の減少）、一方、それは対照細胞においては僅かに増加した（１．１倍から１．３倍、図５Ａ及び５Ｂ）ことを示した。
アーテスネートは、ＴｆＲ１のパルミトイル化により細胞内の鉄の恒常性を変化させ、膜のＴｆＲ１を減少させることが知られている（Ba et al., 2012）。２５μMのアーテスネートを４８時間かけて培養培地に加えることにより、ＦＲＤＡ線維芽細胞における、ＴｆＲ１のパルミトイル化は対照の８０％まで増強され、ＴｆＲ１の定常状態レベルは有意に減少した（図４Ａ）。イメージングフローサイトメトリーは、アーテスネートが、ＦＲＤＡ線維芽細胞における膜のＴｆＲ１を有意に減少させ（１５～３０％の減少）、一方、それは対照細胞においては僅かに増加した（１．１倍から１．３倍、図５Ａ及び５Ｂ）ことを示した。
【0055】
トランスフェリンの再循環に対するアーテスネートの効果を調べるために、ＦＲＤＡ細胞及び対照細胞における、Ｔｆ－Ａｌｅｘａ５５５染色の免疫蛍光強度を記録した。アーテスネートは、ＦＲＤＡ線維芽細胞において対照値までＴｆシグナルを迅速に減少させ、遅延したＴｆの再循環を完全に救出し、核周囲のＴｆ染色は消失した（図５Ｃ）。一貫して、鉄の過剰負荷は、基礎条件で増殖させたＦＲＤＡ線維芽細胞へのアーテスネートの補充から４８時間後に、初期の細胞内鉄含量の６２～７９％まで低下した（図５Ｄ）。アーテスネートで処置された対照細胞は、Ｔｆ再循環の僅かな遅延、及び軽度であるが有意でない鉄含量の増加を示すことが注記されるべきである（図５Ｃ及び５Ｄ）。２５μMのアーテスネートを、高い鉄条件（１００μMのＦＡＣ）で増殖させたＦＲＤＡ培養線維芽細胞に添加することにより、細胞内鉄含量は７１～７９％減少し、鉄の取り込み及び取扱いを調節する患者の細胞の能力の壮大な救出を示す（図６Ａ）。特に、アーテスネートはまた、高い鉄条件で増殖させた対照細胞の鉄含量も減少させた（図６Ａ）。
【0056】
ウェスタンブロット分析は、ＦＲＤＡ線維芽細胞へのアーテスネートの補充が、ＴｆＲ１を減少させ、これはアーテスネート非含有培地中の対照値の１３６％に達したことを確認した（図６Ｂ）。さらに、フェリチン及びＦＢＸＬ５の定常状態レベルは、対照値に戻り、これは減少した鉄含量と平行し、これはおそらく、減少したＳＯＤ２によって示唆されるように活性酸素種の産生を減少させた。ＩＲＰ１～２は、アーテスネートによる処置によって修飾されなかった。対照細胞では、アーテスネートによる処置によるＴｆＲ１の僅かな増加はおそらく、僅かであるが有意でないＴｆＲ１のパルミトイル化の減少から起こり得る。それにも関わらず、フェリチン、ＦＢＸＬ５は修飾されなかった。
【0057】
アーテスネートは、ＦＲＤＡ患者の末梢血単核細胞における鉄の過剰負荷を低減する
患者及び対照における、高い鉄条件で４０時間増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞内総鉄含量を定量した。２４時間後、ＦＲＤＡ患者のＰＢＭＣの鉄含量は、対照よりもはるかに高く、最終的に４０時間後に２倍になった（図７Ａ）。このことは、ＰＢＭＣもまた、高い鉄条件において鉄の取り込みを調節することができないことを示唆した。３つのヘテロ接合型保有者のＰＢＭＣの鉄含量は、高い鉄培地中で４０時間インキュベートした後でさえ、対照値と類似していた。２５μMのアーテスネートをＰＢＭＣ培養培地に添加することにより、ＦＲＤＡのＰＢＭＣ及び対照のＰＢＭＣの両方において鉄含量は２倍減少した（図７Ｂ）。
患者及び対照における、高い鉄条件で４０時間増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞内総鉄含量を定量した。２４時間後、ＦＲＤＡ患者のＰＢＭＣの鉄含量は、対照よりもはるかに高く、最終的に４０時間後に２倍になった（図７Ａ）。このことは、ＰＢＭＣもまた、高い鉄条件において鉄の取り込みを調節することができないことを示唆した。３つのヘテロ接合型保有者のＰＢＭＣの鉄含量は、高い鉄培地中で４０時間インキュベートした後でさえ、対照値と類似していた。２５μMのアーテスネートをＰＢＭＣ培養培地に添加することにより、ＦＲＤＡのＰＢＭＣ及び対照のＰＢＭＣの両方において鉄含量は２倍減少した（図７Ｂ）。
【0058】
考察：
ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡ患者の培養線維芽細胞において、攪乱された細胞内鉄の恒常性、及び不完全なトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）のパルミトイル化を報告する。細胞質区画及びミトコンドリア区画の両方が、大量の鉄を異常に蓄積していることが判明した。本発明者らはまた、リポ酸シンターゼにおける損なわれた鉄硫黄複合体の構築のために、ＰＤＨ複合体のリポイル化が不完全であったことを観察した。ＰＤＨ複合体の不完全なリポイル化は、次にアセチルＣｏＡのプールを劇的に減少させ、ＴｆＲ１のパルミトイル化の二次的異常を引き起こした。これにより、膜へのＴｆＲ１の蓄積が起こり、ＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄の取り込みの調節及びＴｆの再循環を妨げた。最後に、本発明者らは、アーテスネートが、ＦＲＤＡ線維芽細胞において、ＴｆＲ１のパルミトイル化を改善させ、膜のＴｆＲ１を減少させ、Ｔｆ再循環及び鉄の過剰負荷を救出したことを示す。同様に、ジクロロ酢酸及びＣｏＡもまたＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させた。
ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡ患者の培養線維芽細胞において、攪乱された細胞内鉄の恒常性、及び不完全なトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）のパルミトイル化を報告する。細胞質区画及びミトコンドリア区画の両方が、大量の鉄を異常に蓄積していることが判明した。本発明者らはまた、リポ酸シンターゼにおける損なわれた鉄硫黄複合体の構築のために、ＰＤＨ複合体のリポイル化が不完全であったことを観察した。ＰＤＨ複合体の不完全なリポイル化は、次にアセチルＣｏＡのプールを劇的に減少させ、ＴｆＲ１のパルミトイル化の二次的異常を引き起こした。これにより、膜へのＴｆＲ１の蓄積が起こり、ＦＲＤＡ線維芽細胞の鉄の取り込みの調節及びＴｆの再循環を妨げた。最後に、本発明者らは、アーテスネートが、ＦＲＤＡ線維芽細胞において、ＴｆＲ１のパルミトイル化を改善させ、膜のＴｆＲ１を減少させ、Ｔｆ再循環及び鉄の過剰負荷を救出したことを示す。同様に、ジクロロ酢酸及びＣｏＡもまたＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させた。
【0059】
フリードライヒ運動失調症における鉄の調節不全は、昔から認識され、細胞質内の鉄の欠乏と共に、ミトコンドリアにおける鉄の蓄積を特色とすると一般的に考えられている。ここで、本発明者らは、鉄が大量に細胞質内に蓄積し、ミトコンドリアにはより少ない程度で蓄積することを示す。増加したフェリチン及びＦＢＸＬ５の定常状態レベルは、鉄の蓄積に平行し、上昇したＳＯＤ１～２は、おそらく鉄の過剰負荷に関連した、増加した活性酸素種の産生を示唆した。細胞質内の鉄含量は、以前に滅多に評価されたことはなく、本発明者らの知る限りでは、フラタキシン欠損症の様々な細胞及び動物モデルにおいて正式に定量されていない。いわれていたようなミトコンドリアを犠牲にした細胞質内の鉄の欠乏は、細胞質内の定量を行なわずに主に、ミトコンドリアにおける鉄の過剰負荷に基づいていたが（Babcock et al., 1997; Puccio et al., 2001）、増加したＴｆＲ１及び減少したフェリチンの定常状態レベルは、鉄応答性エレメントに結合しているＩＲＰ１の活性化に関連していた（Martelli et al., 2015; Telot et al., 2018; Whitnall et al., 2012）。驚くべきことには、本発明者らの研究において、本発明者らは、蓄積している鉄は、ミトコンドリア内よりも細胞質内の方が比較的より多いことを発見した。増加したレベルのフェリチンがＦＲＤＡ患者の心臓（Ramirez et al., 2012）及びＭＣＫ条件付フラタキシンノックアウトマウスの筋肉（Whitnall et al., 2012）に認められることを心に銘記すべきであり、このことは、鉄の蓄積が組織間で変動することを示唆する。
【0060】
細胞内の鉄恒常性は主に、ＴｆＲ１ｍＲＮＡの減少を可能とし、よって、高い鉄条件における鉄の取り込みを制限する、転写後機序によって調節される。鉄調節タンパク質／鉄応答エレメントによるこの転写後調節は、ＦＲＤＡ線維芽細胞において正常に機能した。なぜなら、ＴＦＲＣ転写物は、高い鉄条件における鉄の取り込みを制限するために効率的にダウンレギュレートされたからである。それ故、ＦＲＤＡ線維芽細胞において増加したＴｆＲ１定常状態レベル及び膜へのＴｆＲ１の蓄積は、別のレベルの調節、すなわち、以前にＮＢＩＡにおいて報告されているようなＴｆＲ１の翻訳後調節を指し示した（Drecourt et al., 2018）。
【0061】
ＴｆＲ１は、Ｓ－アシル化、特にパルミトイル化によって翻訳後修飾される。なぜなら、パルミテート（Ｃ１６：０）は、Ｓ－アシル化タンパク質に対する主な脂質ドナーであるからである。ＴｆＲ１のパルミトイル化レベルは、細胞内の鉄を制御することが知られている。なぜなら、ＴｆＲ１のパルミトイル化の主要な部位であるＣｙｓ６２及びＣｙｓ６７の突然変異は、増加したＴｆＲ１の内部移行及び鉄の過剰負荷を引き起こしたからである。ここで、本発明者らは、ＦＲＤＡ線維芽細胞における不完全なＴｆＲ１のパルミトイル化、並びに続く膜及び細胞質内におけるＴｆＲ１の蓄積のエビデンスを提供する。パルミトイル化によるＴｆＲ１の翻訳後調節は、細胞内鉄含量を迅速に調節するので、本発明者らは、この調節系が、ＦＲＤＡにおいて損なわれ、少なくとも部分的には、疾患の機序の原因となるという仮説を立てる。本発明者らは以前に、不完全なＴｆＲ１のパルミトイル化は、ＮＢＩＡにおけるＰＡＮＫ２及びＣＲＡＴの突然変異に関連した障害されたＣｏＡ合成に起因するとした（Drecourt et al., 2018）。ＰＡＮＫ２及びＣＲＡＴは、ＣｏＡ合成に直接関与しているので、ＦＲＤＡ培養線維芽細胞へのＣｏＡの補充後の増加したＴｆＲ１パルミトイル化及び減少した鉄含量は、フラタキシンの欠損が、ＣｏＡ／アセチル－ＣｏＡのプールの二次的減少を誘発することを強く示唆する。鉄硫黄複合体の生合成機構の他の欠陥として、フラタキシンの欠損は、ミトコンドリアのリポ酸合成酵素をはじめとする、様々な細胞内タンパク質に影響を及ぼし、結果として、ピルビン酸脱水素酵素及びαケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの少なくともジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（ＤＬＡＴ）サブユニットのリポイル化は減少する（Lebigot et al., 2017; Martelli et al., 2015; Tong et al., 2018）。アセチル－ＣｏＡは主に、ピルビン酸の脱炭酸によってミトコンドリア内で産生され、ＣｏＡプールは、不完全なＤＬＡＴリポイル化のために、ＦＲＤＡ線維芽細胞において減少すると予想される。ジクロロ酢酸によるピルビン酸デヒドロキナーゼの抑制後に増加したＴｆＲ１のパルミトイル化は、この仮説を支持する。
【0062】
ＦＲＤＡ線維芽細胞はまた、遅延したＴｆの再循環によって示される、不完全なエンドソーム回路網を示した。障害されたエンドソーム再循環により、本発明者らは、鉄の過剰負荷が、増加した膜のＴｆＲ１の量だけでなく、コーティングされていない小胞内に貯蔵された細胞質内の鉄の放出が損なわれていることから生じ得るという仮説を立てる。パルミトイル化は、タンパク質の親油性を増加させ、その輸送、安定性、及び細胞内分布を調節することが知られている。多くのエンドソーム再循環タンパク質がパルミトイル化されているので、他の依然として決定されていないエンドソームタンパク質の改変されたパルミトイル化が、ＴｆＲ１の再循環を変化させ得、鉄の過剰負荷の原因となり得る可能性がある。
【0063】
ＦＲＤＡ線維芽細胞におけるＴｆＲ１の異常なパルミトイル化の同定は、疾患の病態生理に対してさらなるレベルの複雑性を与える。一方、それは、フラタキシン欠損症の様々な臨床結果の解明を助ける。なぜなら、鉄硫黄複合体含有タンパク質の時間経過及び／又は組織特異的発現は、実際に臓器における発症を制御し得、なぜ呼吸鎖の欠損症が、ＦＲＤＡ患者の心臓に見られるのに、筋肉又は線維芽細胞に見られないかを説明する（Rotig et al., 1997）。細胞内鉄含量に影響を及ぼすことが知られている（Jeong et al., 2015）アセチルＣｏＡ又はＳＩＲＴ３の抑制（Wagner et al., 2012）のための様々な組織必要条件もまた、ＦＲＤＡの組織特異的発現の原因であり得る。これを支持して、呼吸鎖の欠損は、７週令のフラタキシン欠損マウスの心臓において観察され、一方、鉄の過剰負荷は、３週間後に出現した（Puccio et al., 2001）。
【0064】
フラタキシン欠損の他の結果もまた、ミトコンドリアのアセチルＣｏＡプールを二次的に減少させる原因となり得る。ＩＳＣＵの欠損について示されているように（Tong et al., 2018）、ミトコンドリアのアコニターゼ活性の低下した組織は、クエン酸を蓄積し、これは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを活性化し、それ故、マロニルＣｏＡの形成を誘導することによってアセチルＣｏＡプールを低下させる。マウスにおいて報告されたＳＩＲＴ３デアセチラーゼの抑制は、それらの活性を減少させることが知られているいくつかのミトコンドリアタンパク質の過剰アセチル化を誘発する（Wagner et al., 2012）。ＳＩＲＴ３の主な標的の１つであるミトコンドリアアセチルＣｏＡシンセターゼ２の過剰アセチル化は、アセチルＣｏＡ合成を低下させ得る。同じ方針で、鉄の蓄積は、スフィンゴ脂質及びパルミトイルＣｏＡの合成、並びにアシルＣｏＡの消費を増加させ得、次いで、ＴｆＲ１のパルミトイル化に必要とされるパルミトイルＣｏＡ及びアシル－ＣｏＡプールを低下させる（Chen et al., 2016a）。実際に、ＰＡＮＫ２の突然変異に関連した損なわれたＣｏＡの生合成の場合と同じように（Siudeja et al., 2011）、フラタキシンの欠乏は、全体的なヒストンのアセチル化を減少させる（Tong et al., 2018）。
【0065】
最後に、本発明者らはまた、アーテスネート、ＣｏＡ及びジクロロ酢酸が、ＴｆＲ１のパルミトイル化を有意に誘導し、ＴｆＲ１の定常状態レベル及び膜へのＴｆＲ１の蓄積を減少させたことを示す。アーテスネートは、Ｔｆの再循環を救出し、ＦＲＤＡ線維芽細胞が鉄の取り込みを調節する能力を回復させた。アーテスネートは、強力な抗癌特性を有する。なぜなら、それは癌細胞にとって毒性である、鉄の欠乏を誘発するからである（Lai et al., 2013）。それは、熱帯熱マラリア原虫によって引き起こされたマラリアを処置するためにも使用される。その安全性プロファイル及び薬物動態は、神経変性疾患において評価されていないが、数百万人の被験者が、アルテミシニンの投与を受け、非常に僅かな副作用を伴った（Efferth and Kaina, 2010）。本発明者らのデータは、ＦＲＤＡにおいて可能性ある治療アプローチとして、ＴｆＲ１のパルミトイル化を増加させるこの化合物及び他の薬物が考察されるべきであることを示唆する。なぜなら、特に鉄により媒介される毒性は、ＦＲＤＡのショウジョウバエモデルにおける神経変性の原因であることが示されているからである（Chen et al., 2016b）。ＦＲＤＡ患者のＰＢＭＣは、ＦＲＤＡ－ｉＰＳＣ心筋細胞において観察されているような、高い鉄条件における鉄の取り込みを調節することができなかったので（Lee et al., 2014）、本発明者らは、鉄の恒常性及びＴｆＲ１の免疫蛍光のインビボでのモニタリングが、ＦＲＤＡ患者における将来の臨床試験をモニタリングするための有用な早期の評価項目として捉えることができると考える。
【0066】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によりここに組み入れられる。
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によりここに組み入れられる。
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【国際調査報告】