特表 2022-515341 サイトカイニンに応答する植物のＮＩＮ遺伝子の遺伝子改変方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-18

(54)【発明の名称】サイトカイニンに応答する植物のＮＩＮ遺伝子の遺伝子改変方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20220210BHJP

   A01H 6/46 20180101ALN20220210BHJP

   A01H 6/74 20180101ALN20220210BHJP

   A01H 6/78 20180101ALN20220210BHJP

   A01H 6/82 20180101ALN20220210BHJP

   A01H 6/36 20180101ALN20220210BHJP

   C12N 15/82 20060101ALN20220210BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220210BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A ZNA

A01H6/46

A01H6/74

A01H6/78

A01H6/82

A01H6/36

C12N15/82 Z

C12N15/09 100

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021532420

(86)(22)【出願日】2019-12-05

(85)【翻訳文提出日】2021-08-04

(86)【国際出願番号】 EP2019083770

(87)【国際公開番号】W WO2020115181

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】62/776,325

(32)【優先日】2018-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515131390

【氏名又は名称】ヴァーヘニンゲン ユニバーシテイト

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ギューツ，ルネ

(72)【発明者】

【氏名】リュー，ジェユウ

(72)【発明者】

【氏名】ルッテン，ルーク

(72)【発明者】

【氏名】クリコヴァ，オルガ

(72)【発明者】

【氏名】ビッセリング，トン

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AA03

2B030CA14

2B030CA17

2B030CA19

(57)【要約】

本開示の態様は、ＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）およびＮＩＮ－ＬＩＫＥ ＰＲＯＴＥＩＮ（ＮＬＰ）を含む遺伝子改変植物に関し、当該遺伝子改変植物は、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質が、適切なシグナル伝達時に根の根粒形成を誘導することができるように、サイトカイニンに応答するように遺伝子改変されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物またはその一部が、１個以上の遺伝子改変を有さない野生型（ＷＴ）植物と比較して、サイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）タンパク質またはＮＩＮ様タンパク質（ＮＬＰタンパク質）の活性を増加させる、１個以上の遺伝子改変を含み、
前記植物または前記その一部が、前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子改変植物。

【請求項2】

前記１個以上の遺伝子改変が、前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質をコードする前記核酸に作動可能に連結された、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、または２４個以上のサイトカイニン応答エレメントの付加を含む、請求項１に記載の遺伝子改変植物。

【請求項3】

前記サイトカイニン応答エレメントの少なくとも１つが、Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位である、請求項２に記載の遺伝子改変植物。

【請求項4】

前記サイトカイニン応答エレメントが、互いに１００ヌクレオチド以内、９０ヌクレオチド以内、８６ヌクレオチド以内、８０ヌクレオチド以内、７０ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内である、請求項２に記載の遺伝子改変植物。

【請求項5】

前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質をコードする前記核酸が、前記サイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されているプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項6】

前記プロモーターおよび前記サイトカイニン応答エレメントが、互いに１１０，０００ヌクレオチド以内、１０５，０００ヌクレオチド以内、１００，０００ヌクレオチド以内、９５，０００ヌクレオチド以内、９０，０００ヌクレオチド以内、８５，０００ヌクレオチド以内、８０，０００ヌクレオチド以内、７５，０００ヌクレオチド以内、７０，０００ヌクレオチド以内、６５，０００ヌクレオチド以内、６０，０００ヌクレオチド以内、５５，０００ヌクレオチド以内、５０，０００ヌクレオチド以内、４５，０００ヌクレオチド以内、４２，０００ヌクレオチド以内、４０，０００ヌクレオチド以内、３５，０００ヌクレオチド以内、３０，０００ヌクレオチド以内、２５，０００ヌクレオチド以内、２０，０００ヌクレオチド以内、１５，０００ヌクレオチド以内、１０，０００ヌクレオチド以内、９，０００ヌクレオチド以内、８，０００ヌクレオチド以内、７，０００ヌクレオチド以内、６，０００ヌクレオチド以内、５，０００ヌクレオチド以内、４，０００ヌクレオチド以内、３，０００ヌクレオチド以内、２，０００ヌクレオチド以内、１，０００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、または１００ヌクレオチド以内である、請求項５に記載の遺伝子改変植物。

【請求項7】

前記核酸が、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質、または基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項8】

前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質をコードする前記核酸が内因性である、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項9】

前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質をコードする前記核酸が異種由来である、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項10】

前記プロモーターが内因性である、請求項５～９のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項11】

前記プロモーターが異種由来である、請求項５～９のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項12】

根内鞘細胞層、根内皮細胞層（すなわち、内皮の細胞層）、根皮層細胞層（すなわち、皮層の細胞層）、および／または根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）における、サイトカイニンシグナル伝達または前記サイトカイニンシグナル伝達経路の誘導が、根粒器官形成を誘導する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項13】

前記核酸に作動可能に連結された１つ以上のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントをさらに含み、
根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるＣＹＣＬＯＰＳ発現が、根粒菌感染を誘導する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項14】

前記遺伝子改変植物が単子葉植物であり、
前記遺伝子改変植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、オートムギおよびライムギからなる群より選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項15】

前記遺伝子改変植物が、リンゴ、ナシ、プラム、アプリコット、モモ、アーモンド、クルミ、チェリー、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、アカフサスグリ、クロフサスグリ、メロン、キュウリ、パンプキン、スクワッシュ、ブドウ、麻、ホップ、カバ、ブナ、ナツメ、キャッサバ、ポプラ、クリ、シトラス、ジャガイモ、トマト、サツマイモ、Ｔｒｅｍａ属、およびＪａｔｒｏｐｈａ属からなる群より選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物の生産方法であって、以下を含む、方法：
（ａ）前記１個以上の遺伝子改変を植物細胞、組織、または他の外植片に導入すること；
（ｂ）前記植物細胞、組織、または他の外植片を遺伝子改変プラントレットに再生すること；および、
（ｃ）前記遺伝子改変プラントレットを、形質転換されていないＷＴ植物と比較してサイトカイニンシグナル伝達に応答して前記ＮＩＮタンパク質または前記ＮＬＰタンパク質の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を有する遺伝子改変植物に育てること。

【請求項17】

工程（ｂ）の前に、前記植物細胞、組織、または他の外植片をスクリーニングまたは選択すること；
工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、プラントレットをスクリーニングまたは選択すること；または、
工程（ｃ）の後に、植物をスクリーニングまたは選択すること；
によって、前記１個以上の遺伝子改変の成功した導入を確認することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

形質転換が、粒子衝撃（すなわち、バイオリスティック、遺伝子銃）、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、根粒菌が媒介する形質転換、およびプロトプラストのトランスフェクションまたは形質転換からなる群より選択される形質転換方法を使用して行われる、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記遺伝子改変がベクターを用いて導入される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記ベクターが、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、当該プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のサイトカイニン応答エレメントと、を含み、
前記プロモーターおよび前記１つ以上のサイトカイニン応答エレメントが、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結された前記ＮＩＮ遺伝子の前記転写開始部位を介して前記ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含む前記ＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーターからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ベクターが、内因性ＮＩＮタンパク質または内因性ＮＬＰタンパク質に作動可能に連結された核ゲノム配列を標的とする１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含み、
前記核ゲノム配列が、１つ以上のサイトカイニン応答エレメント、３Ｃ領域、およびＣＥ領域からなる群より選択されるシス調節性エレメントを導入するために、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントによって編集される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

１つ以上の遺伝子編集コンポーネントが、前記核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体；ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（前記ＴＡＬＥＮタンパク質は前記核ゲノム配列を標的とする）；ＺＦＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（前記ＺＦＮタンパク質は前記核ゲノム配列を標的とする）；オリゴヌクレオチドドナー（ＯＤＮ）（前記ＯＤＮは前記核ゲノム配列を標的とする）；およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードする配列および標的配列を含むベクター（前記標的配列は前記核ゲノム配列を標的とする）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントが、根粒形成するマメ科植物種に由来し、
前記根粒形成するマメ科植物種が、ピーナッツ、キマメ、ヒヨコマメ、ダイズ、ハッショウマメ、マメ、エンドウマメ、アズキマメ、サヤインゲン、クローバー、ルピナス、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、およびＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａからなる群より選択される、請求項２０または２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１８年１２月６日に出願された米国仮出願第６２／７７６，３２５号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

〔ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の発行〕
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する以下の提出の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：
配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７９４５４２０００５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１９年１１月２５日、サイズ：３，８０２ＫＢ）。

【0003】

〔技術分野〕
本開示は、遺伝子改変植物に関する。特に、本開示は、ＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）およびＮＩＮ－ＬＩＫＥ ＰＲＯＴＥＩＮ（ＮＬＰ）遺伝子を有する植物に関するものであり、当該遺伝子改変植物は、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質が、適切なシグナル伝達時に根の根粒形成を誘導することができるように、サイトカイニンに応答するように遺伝子改変されている。

【0004】

〔背景〕
マメ科植物、Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ属、およびアクチノリザル植物などの根粒形成植物種は、窒素固定細菌と共生関係を形成するように進化してきた。それらは根粒と呼ばれる特殊な器官を形成して、これらの細菌を収容する。根粒は、細菌に最適な環境を提供し、窒素を固定して、それを植物に提供する。今度は、植物が細菌に炭水化物および他の資源を提供する。根粒形成の最初の段階は、例えば、細菌によって産生されるリポ－キトオリゴ糖（根粒菌の場合にはＮｏｄ因子としても知られる）の検出による、共生細菌の存在の認識である。このような共生シグナルの認識は、根粒器官形成を誘導し、細菌感染を可能にする。

【0005】

遺伝子スクリーニングにより、根粒器官形成過程に関与する遺伝子が同定されている。これらのうちの主なものは、転写因子ＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）であり、これはマメ科植物およびＣａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａのような複数の植物種にわたる根粒器官形成において重要な役割を有することが示されている（Clavijo et al., New Phytol. 208: 887-903 (2015)）。ＮＩＮの本質的な役割は長い間知られていたが、ｎｉｎ変異体植物を補完する試みは一貫して失敗している。これは、文献中の多くの例によって証明されている。Ｃｌａｖｉｊｏらは、２１７５ｂｐのＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮプロモーターを使用し、「残念ながら、ＰｒｏＭｔＮＩＮ：ＭｔＮＩＮコンストラクトでさえ、感染のためにＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのｎｉｎ変異体を補完することは不可能であった」（Clavijo et al., New Phytol. 208: 887-903 (2015)；ｐｇ．８９８からの引用）と報告した。Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓのｄａｐｈｎｅ変異体の特性評価において、Ｙｏｒｏらは「ＮＩＮは根粒発生における重要な転写因子であるが、根粒器官形成に必要な機能的ＮＩＮプロモーター領域は、まだ解明されていない」と述べ、「根粒形成ではなく、ＩＴ形成のみが、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのｎｉｎ－９変異体において、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓベースのコンストラクト、ＰｒｏＮＩＮ（～４ｋｂ）：：ＮＩＮ：：ＴｅｒＮＩＮの導入によって救済された。」（Yoro et al., Plant Physiol. 165:747-758 (2014)；ｐｇ．７５６からの引用）と意見を述べた。最後に、Ｖｅｒｎｉｅらは、２．１８ｋｂのＭｔＮＩＮプロモーターを使用したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＮＩＮの発現が、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのｎｉｎヌル変異体を部分的に補完することのみが可能であり、これを形質転換した場合、接種後、非常に少ない数の非機能性の根粒を長時間（５０日）産生することを見出した（Vernie et al., The Plant Cell, 27:3410-3424 (2015)）。

【0006】

マメ科ｎｉｎ変異体植物を補完できない、このことは、ＮＩＮ調節の重要なコンポーネントおよび根粒器官形成過程との統合が知られていなかったために、器官形成におけるＮＩＮ関与の正確なメカニズムが未だ解明されていないことを意味している。さらに重要なことに、ＮＩＮは根粒器官形成におけるキープレーヤーであるので、成功した根粒の工学方法はＮＩＮを組み込むことを必要とする。過去２０年間にわたってｎｉｎ変異体を補完できなかったことは、根粒の工学戦略を開発する上で大きな障害となってきた。根粒形成をうまく行うためには、ｎｉｎ変異体を補完する能力、およびその能力に付随するＮＩＮ調節の知識が必要であろう。ＮＩＮコード配列と組み合わせることによりｎｉｎ変異体の完全な補完が可能になる、ＮＩＮ調節領域を同定する明らかな必要性がある。

【0007】

〔概要〕
これらの必要性を満たすために、本開示は、ＮＩＮコード配列と作動可能に連結された調節領域へのサイトカイニン応答性エレメントの導入により、マメ科植物のｎｉｎ変異体を完全に補完する手段を提供する。本開示はさらに、内因性または異種由来であり得るＮＩＮまたはＮＬＰコード配列と作動可能に連結された植物にサイトカイニン応答性エレメントを導入する手段を提供する。

【0008】

本開示の一態様は遺伝子改変植物を含み、植物またはその一部が、１個以上の遺伝子改変を有さない野生型（ＷＴ）植物と比較して、サイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）タンパク質またはＮＩＮ様タンパク質（ＮＬＰタンパク質）の活性を増加させる、１個以上の遺伝子改変を含み、植物またはその一部は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上のサイトカイニン応答エレメントの付加である１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらに別の実施形態は、Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位であるサイトカイニン応答エレメントの少なくとも１つを含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６１３または配列番号６１４の配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５または配列番号６２６の群から選択される配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。

【0009】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、サイトカイニン応答エレメントが、互いに１００ヌクレオチド以内、９０ヌクレオチド以内、８６ヌクレオチド以内、８０ヌクレオチド以内、７０ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、または６ヌクレオチド以内である。本態様のさらなる実施形態において、サイトカイニン応答エレメントは、互いに１１ヌクレオチド以内である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は、サイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結されている。本態様のさらなる実施形態において、プロモーターおよびサイトカイニン応答エレメントは、互いに６０，０００ヌクレオチド以内、５５，０００ヌクレオチド以内、５０，０００ヌクレオチド以内、４５，０００ヌクレオチド以内、４２，０００ヌクレオチド以内、４０，０００ヌクレオチド以内、３５，０００ヌクレオチド以内、３０，０００ヌクレオチド以内、２５，０００ヌクレオチド以内、２０，０００ヌクレオチド以内、１５，０００ヌクレオチド以内、１０，０００ヌクレオチド以内、９，０００ヌクレオチド以内、８，０００ヌクレオチド以内、７，０００ヌクレオチド以内、６，０００ヌクレオチド以内、５，０００ヌクレオチド以内、４，０００ヌクレオチド以内、３，０００ヌクレオチド以内、２，０００ヌクレオチド以内、１，０００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、または１００ヌクレオチド以内である。

【0010】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループ（orthogroup）タンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、および配列番号２３６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質であり、配列番号２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮｉＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、および配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ＮＩＮタンパク質であり、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。

【0011】

本態様のさらに別の実施形態は、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質、または基部の（basal）ＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる。本態様のさらなる実施形態は、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＮＬＰ４オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１または配列番号６６２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質を含む。

【0012】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は、内因性である。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、内因性であるプロモーターを含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるプロモーターを含む。

【0013】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、根内鞘細胞層、根内皮細胞層（すなわち、内皮の細胞層）、根皮層細胞層（すなわち、皮層の細胞層）、および／または根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるサイトカイニンシグナル伝達、またはサイトカイニンシグナル伝達経路の誘導が根粒器官形成を誘導する。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、核酸に作動可能に連結された１つ以上のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントをさらに含む。本態様のさらなる実施形態は、根粒菌感染を誘導する根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるＣＹＣＬＯＰＳ発現を含む。

【0014】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらなる実施形態において、遺伝子改変植物は単子葉植物である。本態様のさらなる実施形態は、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、オートムギ、またはライムギのグループから選択される遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、前述した実施形態のいずれかと組み合わせることができ、リンゴ、ナシ、プラム、アプリコット、モモ、アーモンド、クルミ、チェリー、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、アカフサスグリ、カシス、メロン、キュウリ、パンプキン、スクワッシュ、ブドウ、麻、ホップ、カバ、ブナ、ナツメ、キャッサバ、ポプラ、クリ、シトラス、ジャガイモ、トマト、サツマイモ、Ｔｒｅｍａ属、およびＪａｔｒｏｐｈａ属の群から選択される遺伝子改変植物をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＷＴ植物はマメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しないか、または両方がマメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しない。

【0015】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、植物部分に関して、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物の遺伝子改変植物部分を含み、当該植物部分は、葉、茎、根、塊茎、花、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）、果実、細胞、またはその一部であり、遺伝子改変植物部分は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、植物部分が果実、塊茎、穀粒（kernel）、または穀粒（grain）であることを含む。本態様のさらに別の実施形態は、花粉粒または胚珠に関して前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの植物の遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠を含み、遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物から産生された遺伝子改変プロトプラストを含み、遺伝子改変プロトプラストは、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物由来のプロトプラストまたは細胞から生産された遺伝子改変組織培養物を含み、細胞またはプロトプラストは、葉、葉肉細胞、葯、めしべ、茎、葉柄、根、根端、塊茎、果実、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）花、子葉、胚軸、胚、または分裂組織細胞の群から選択される植物部分から作製され、遺伝子改変組織培養物は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、１個以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変組織培養物から再生された、遺伝子改変植物を含む。遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変植物種子を含む。本態様のさらなる実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する植物を生産する植物の種子を含む。

【0016】

本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する前述した実施形態のいずれかの遺伝子改変植物の生産方法を含む。この生産方法は、（ａ）１個以上の遺伝子改変を植物細胞、組織、または他の外植片に導入する工程と、（ｂ）遺伝子改変プラントレットを、植物細胞、組織、または他の外植片を遺伝子改変プラントレット（plantlet）に再生する工程と、（ｃ）形質転換されていないＷＴ植物と比較してサイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を有する遺伝子改変植物に育てる工程と、を含む。本態様のさらなる実施形態は、工程（ｂ）の前に、植物細胞、組織、または他の外植片をスクリーニングまたは選択すること、工程（ｂ）と（ｃ）との間に、プラントレットをスクリーニングまたは選択すること、または工程（ｃ）の後に、植物をスクリーニングまたは選択することによって、１個以上の遺伝子改変の成功した導入を確認することをさらに包含する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、形質転換は、粒子衝撃（すなわち、バイオリスティック、遺伝子銃）、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、根粒菌が媒介する形質転換、またはプロトプラストのトランスフェクションもしくは形質転換の群から選択される形質転換方法を使用して行われる。

【0017】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、および当該プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含むベクターを包含する。本態様のさらに別の実施形態は、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックスを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックスを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックスに作動可能に連結された最小プロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックスに作動可能に連結された最小プロモーターの群から選択される、プロモーターおよび１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態において、ベクターは、内因性のＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質に作動可能に連結された核ゲノム配列を標的とする、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上のサイトカイニン応答エレメント、３Ｃ領域、またはＣＥ領域の群から選択されるシス調節性エレメントを導入するために、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントによって編集される核ゲノム配列を含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含むベクターを有する前述した態様のいずれかと組み合わせることができ、核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体；ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＴＡＬＥＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）；ＺＦＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＺＦＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）；オリゴヌクレオチドドナー（ＯＤＮ）（ＯＤＮは核ゲノム配列を標的とする）；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードする配列および標的配列を含むベクター（標的配列は核ゲノム配列を標的とする）の群から選択される１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。

【0018】

本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成するマメ科植物種に由来する、ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックス、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ピーナッツ、キマメ、ヒヨコマメ、ダイズ、ハッショウマメ、マメ、エンドウマメ、アズキマメ、サヤインゲン、クローバー、ルピナス、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、およびＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの群から選択される、根粒形成するマメ科植物種を含む。本態様のさらなる実施形態は、根粒形成するマメ科植物種に由来する、ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ結合ボックス、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含むベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述した態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１または配列番号６１２の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、および配列番号６２６の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。

【0019】

本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述した態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、および配列番号２３６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、および配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列



番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質であり、且つ配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１または配列番号６６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質を含む。

【0020】

本開示のさらなる態様は、遺伝子改変された植物を有する前述した実施形態のいずれかの遺伝子改変植物を栽培する方法を含み、当該方法は、遺伝子改変実生苗（seedling）、遺伝子改変プラントレット、遺伝子改変挿し木、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、または遺伝子改変種子を土壌中に植え付けて、遺伝子改変植物を生産する、あるいは遺伝子改変実生苗、遺伝子改変プラントレット、または遺伝子改変挿し木を、土壌中で育てられた台木（root stock）もしくは第２の植物に接合して、遺伝子改変植物を生産する工程；収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を栽培する工程；および、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を収穫する工程、を含む。

【0021】

本開示の一態様は遺伝子改変された植物を含み、植物またはその一部は、１個以上の遺伝子改変を有さない野生型（ＷＴ）植物と比較して、サイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）タンパク質またはＮＩＮ様タンパク質（ＮＬＰタンパク質）の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を含み、植物またはその一部は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された、１個以上、２個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上のサイトカイニン応答エレメントの付加である１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらに別の実施形態は、Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲ（ＲＲ））結合部位であるサイトカイニン応答エレメントの少なくとも１つを含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６１３または配列番号６１４の配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、または配列番号６８６の配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、配列番号６２６、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５または配列番号６８６の群から選択される配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。

【0022】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、サイトカイニン応答エレメントが、互いに１００ヌクレオチド以内、９０ヌクレオチド以内、８６ヌクレオチド以内、８０ヌクレオチド以内、７０ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内である。本態様のさらなる実施形態において、サイトカイニン応答エレメントは、互いに１１ヌクレオチド以内である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は、サイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結されている。本態様のさらなる実施形態において、プロモーターおよびサイトカイニン応答エレメントは、互いに１１０，０００ヌクレオチド以内、１０５，０００ヌクレオチド以内、１００，０００ヌクレオチド以内、９５，０００ヌクレオチド以内、９０，０００ヌクレオチド以内、８５，０００ヌクレオチド以内、８０，０００ヌクレオチド以内、７５，０００ヌクレオチド以内、７０，０００ヌクレオチド以内、６５，０００ヌクレオチド以内、６０，０００ヌクレオチド以内、５５，０００ヌクレオチド以内、５０，０００ヌクレオチド以内、４５，０００ヌクレオチド以内、４２，０００ヌクレオチド以内、４０，０００ヌクレオチド以内、３５，０００ヌクレオチド以内、３０，０００ヌクレオチド以内、２５，０００ヌクレオチド以内、２０，０００ヌクレオチド以内、１５，０００ヌクレオチド以内、１０，０００ヌクレオチド以内、９，０００ヌクレオチド以内、８，０００ヌクレオチド以内、７，０００ヌクレオチド以内、６，０００ヌクレオチド以内、５，０００ヌクレオチド以内、４，０００ヌクレオチド以内、３，０００ヌクレオチド以内、２，０００ヌクレオチド以内、１，０００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内である。

【0023】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２または配列番号６９３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮｉＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）、配列番号６８７（すなわち、ＡｇｌＮＩＮ；Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、配列番号６８８（すなわち、ＣｇｌＮＩＮ；Ｃａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａ）、配列番号６８９（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．１；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９０（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．２；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９１（すなわち、ＤｔｒＮＩＮ；Ｄｉｓｃａｒｉａ ｔｒｉｎｅｒｖｉｓ）、配列番号６９２（すなわち、ＤｄｒＮＩＮ；Ｄｒｙａｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）または配列番号６９３（すなわち、ＰｔｒＮＩＮ；Ｐｕｒｓｈｉａ ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。

【0024】

本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質、または基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１または配列番号６６２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質を含む。

【0025】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は内因性である。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、内因性であるプロモーターを含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるプロモーターを含む。

【0026】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、根内鞘細胞層、根内皮細胞層（すなわち、内皮の細胞層）、根皮層細胞層（すなわち、皮層の細胞層）、および／または根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるサイトカイニンシグナル伝達またはサイトカイニンシグナル伝達経路の誘導が、根粒器官形成を誘導する。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、核酸に作動可能に連結された１つ以上のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントをさらに含む。本態様のさらなる実施形態は、根粒菌感染を誘導する根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるＣＹＣＬＯＰＳ発現を含む。

【0027】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらなる実施形態において、遺伝子改変植物は単子葉植物である。本態様のさらなる実施形態は、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、オートムギ、またはライムギの群から選択される遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、前述した実施形態のいずれかと組み合わせることができ、リンゴ、ナシ、プラム、アプリコット、モモ、アーモンド、クルミ、チェリー、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、アカフサスグリ、カシス、メロン、キュウリ、パンプキン、スクワッシュ、ブドウ、麻、ホップ、カバ、ブナ、ナツメ、キャッサバ、ポプラ、クリ、シトラス、ジャガイモ、トマト、サツマイモ、Ｔｒｅｍａ属、およびＪａｔｒｏｐｈａ属の群から選択される遺伝子改変植物をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＷＴ植物は、マメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しない、または両方がマメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しない。

【0028】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、植物部分に関して前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物の遺伝子改変植物部分を含み、当該植物部分は、葉、茎、根、塊茎、花、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）、果実、細胞、またはその一部であり、遺伝子改変植物部分は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、果実、塊茎、穀粒（kernel）、または穀粒（grain）である植物部分を含む。本態様のさらに別の実施形態は、花粉粒または胚珠に関して前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの植物の遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠を含み、遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変プロトプラストを含み、遺伝子改変プロトプラストは、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物に由来するプロトプラストまたは細胞から生産された遺伝子改変組織培養物を含み、細胞またはプロトプラストは、葉、葉肉細胞、葯、めしべ、茎、葉柄、根、根端、塊茎、果実、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）、花、子葉、胚軸、胚、または分裂組織細胞の群から選択される植物部分から生産され、遺伝子改変組織培養物は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、１個以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変組織培養物から再生された遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変植物種子を含む。本態様のさらなる実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する植物を生産する植物の種子を含む。

【0029】

本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物を生産する方法を包含し、（ａ）１個以上の遺伝子改変を植物細胞、組織、または他の外植片に導入する工程と、（ｂ）植物細胞、組織、または他の外植片を遺伝子改変プラントレットに再生する工程と、（ｃ）遺伝子改変プラントレットを、形質転換されていないＷＴ植物と比較してサイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を有する遺伝子改変植物に育てる工程と、を含む。本態様のさらなる実施形態は、工程（ｂ）の前に、植物細胞、組織、または他の外植片をスクリーニングまたは選択すること；工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、プラントレットをスクリーニングまたは選択すること；または工程（ｃ）の後に、植物をスクリーニングまたは選択することによって、１個以上の遺伝子改変の成功した導入を確認することをさらに包含する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、形質転換は、粒子衝撃（すなわち、バイオリスティック、遺伝子銃）、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、根粒菌が媒介する形質転換、またはプロトプラストのトランスフェクションもしくは形質転換の群から選択される形質転換方法を使用して行われる。

【0030】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、当該プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のサイトカイニン応答エレメメントと、を含むベクターを包含する。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターと、１つ以上のサイトカイニン応答エレメントと、を含み、プロモーターおよび１つ以上のサイトカイニン応答エレメントは、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位を介してＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーターの群から選択される。本態様のさらなる実施形態において、ベクターは、内因性のＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質に作動可能に連結された核ゲノム配列を標的とする１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上のサイトカイニン応答エレメント、３Ｃ領域、またはＣＥ領域の群から選択されるシス調節性エレメントを導入するために、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントによって編集される核ゲノム配列を含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含むベクターを有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体；ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＴＡＬＥＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）；ＺＦＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＺＦＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）；オリゴヌクレオチドドナー（ＯＤＮ）（ＯＤＮは核ゲノム配列を標的とする）；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードする配列および標的配列を含むベクター（標的配列は核ゲノム配列を標的とする）の群から選択される１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。

【0031】

本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成するマメ科植物種由来の、ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ピーナッツ、キマメ、ヒヨコマメ、ダイズ、ハッショウマメ、マメ、エンドウマメ、アズキマメ、サヤインゲン、クローバー、ルピナス、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、およびＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの群から選択される根粒形成するマメ科植物種を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ベクターは、根粒形成するマメ科植物種由来の、ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含み、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１、または配列番号６１２の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、または配列番号６２６の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成しない種に由来する１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態において、根粒形成しない種に由来する１つ以上のサイトカイニン応答エレメントは、配列番号６１３である。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成しないマメ科植物種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、または配列番号６８６の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。

【0032】

本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２または配列番号６９３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮまたはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、および配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）、配列番号６８７（すなわち、ＡｇｌＮＩＮ；Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、配列番号６８８（すなわち、ＣｇｌＮＩＮ；Ｃａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａ）、配列番号６８９（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．１；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９０（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．２；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９１（すなわち、ＤｔｒＮＩＮ；Ｄａｔｉｓｃａ ｔｒｉｎｅｒｖｉｓ）、配列番号６９２（すなわち、ＤｄｒＮＩＮ；Ｄｒｙａｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、または配列番号６９３（すなわち、ＰｔｒＮＩＮ；Ｐｕｒｓｈｉａ ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝的変化を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列



番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質であり、且つ配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１または配列番号６６２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。

【0033】

本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する、前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物を栽培する方法を含み、当該方法は、遺伝子改変実生苗、遺伝子改変プラントレット、遺伝子改変挿し木、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、または遺伝子改変種子を土壌中に植え付けて、遺伝子改変植物を生産する工程、あるいは遺伝子改変実生苗、遺伝子改変プラントレット、または遺伝子改変挿し木を、土壌中で育てられた台木もしくは第２の植物に接合して、遺伝子改変植物を生産する工程；収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を栽培する工程；並びに、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を収穫する工程、を含む。

【0034】

〔図面の簡単な説明〕
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を伴うこの特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料の納付によって、特許庁が提供する。

【0035】

図１Ａ～１Ｉは、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様（ＦＮ８１１３）変異体根の表現型およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（根粒菌）ＲＣＲ２０１１．ｐＨＣ６０株を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７野生型（ＷＴ）根の表現型を示す。図１Ａは、Ａ１７ ＷＴ根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す。図１Ｂは、Ａ１７ ＷＴ根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す。図１Ｄは、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す。図１Ｅは、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す。図１Ａ～１Ｂと図１Ｄ～１Ｅとの比較は、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（図１Ｄ～１Ｅ）がＷＴ（図１Ａ～１Ｂ）と比較して過剰な数の感染糸を有することを示す。図１Ｃおよび図１Ｆは、接種後７日（ｄｐｉ）のＷＴ（図１Ｃ；スケールバー １０μｍ）およびヨウ化プロピジウムを用いて染色したｄａｐｈｎｅ様変異体根（図１Ｆ；スケールバー １０μｍ）の共焦点画像を示し、細菌コロニー（矢頭）および感染糸（矢印）がｄａｐｈｎｅ様変異根およびＷＴ根において同等であることを示す。図１Ｇは、トルイジンブルーを用いて染色した接種後３週（ｗｐｉ）のｄａｐｈｎｅ様変異体根の縦断面図を示し、感染糸（矢印）が皮層細胞層に到達できることがあり、いくらか細胞分裂が誘導されることを示している（矢頭）（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；矢印は感染糸を示す；矢頭は細胞分裂を示す）。図１Ｈは、ＮＩＮ遺伝子（太い灰色の矢印）開始コドン（細い黒い矢印上の「ＡＴＧ」）の４１２０ｂｐ上流に２．４９ＭＢの第２染色体挿入部分（矢印の間に示される側面配列は、配列番号６３３および配列番号６３４である）を有する、ｄａｐｈｎｅ様変異体におけるＮＩＮ遺伝子座の配置図を示す。第５染色体配列は、左から右へ、配列番号６３２、配列番号６３５、および配列番号６３６である。図１Ａ～１Ｇに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。図１Ｉは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した接種後１４日（ｄｐｉ）の根における、共焦点画像からのデータの平均±ＳＤを示す（これらの根の代表的な画像を図１Ｃおよび１Ｆに示す）。

【0036】

図２Ａ～２Ｍは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮ、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮ、またはコンストラクトＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス（cyclops））：ＮＩＮを導入することによって、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根における感染過程の部分的な補完を示す。図２Ａは、トルイジンブルーを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換されたｎｉｎ－１変異体根の縦断面を示し、皮層細胞層に到達することができる感染糸（矢印）を示す（スケールバー ５０μｍ；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；矢印は感染糸を示す）。図２Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、過剰な感染糸形成（スケールバー ２ｍｍ）を表す。図２Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、過剰な感染糸形成（スケールバー ２ｍｍ）を表す。図２Ｄは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮ根を用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛（スケールバー １０μｍ）中で開始された感染糸形成（長い白線）を表す。図２Ｅは、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛（スケールバー ２ｍｍ）を表す。図２Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換されたｎｉｎ－１根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛（スケールバー ２ｍｍ）を表す。図２Ｇは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮ根を用いて形状質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛の内側の細菌カールコロニー（緻密な白色形状）を表すが、感染糸の形成は示さない（スケールバー １０μｍ）。図２Ｈは、空のベクターを用いて形質転換した、感染糸を有さないｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す（スケールバー ２ｍｍ）。図２Ｉは、空のベクターを用いて形質転換した、感染糸を有さないｎｉｎ－１変異体根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す（スケールバー ２ｍｍ）。図２Ｊは、ヨウ化プロピジウムで染色した、空ベクターを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、細菌コロニーのない過剰な根毛のカールを表す（スケールバー １０μｍ）。図２Ｋは、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス）：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛を表す（スケールバー ２ｍｍ）。図２Ｌは、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス）：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛を表す（スケールバー ２ｍｍ）。図２Ｍは、ヨウ化プロピジウムで染色した、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス（cyclops））：ＮＩＮ根を用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛の内側に細菌カールコロニー（緻密な白色形状）を表すが、感染糸形成は示さない（スケールバー １０μｍ）。図２Ａ～２Ｍは、ＧＦＰを恒常的に発現するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１．ｐＨＣ６０を４ｗｐｉ接種で収集した根の画像を示す。図２Ａ～２Ｍに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0037】

図３は、８種のマメ科植物種由来の、ＮＩＮ遺伝子開始コドンから２ｋｂ下流、およびＮＩＮ ５’上流領域を含むゲノムＤＮＡ配列のｍＶＩＳＴＡアラインメントを示す。ｘ軸は、ＫｂにおけるＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮ開始コドンからの距離（右から左に走る）を提供し、一方、ｙ軸は、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ配列に対する保存レベルの割合（各マメ科植物種について、下から上に走る）を提供する。ピークは、５０％～１００％の比率でのＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａとの配列同一性のレベルを示し、５０％未満の同一性は記録しなかった。ＮＩＮ開始コドンから２ｋｂ下流の配列を、「ＡＴＧ」と表示された細い黒矢印の右側に描き、５’非コード上流ＤＮＡ配列を、細い黒矢印の左側に描く。２つの濃い灰色の長方形は３つの保存領域（３Ｃ領域；左）および－５ｋｂプロモーター領域（右）の位置を示し、灰色の垂直矢印は、－５ｋｂプロモーター領域内のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の位置を示す。

【0038】

図４Ａおよび図４Ｂは、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮ ５’上流領域におけるエレメントの概略図の代表を示し、実験は、サイトカイニン応答エレメント包含（ＣＥ）領域が根粒器官形成に必須であることをを証明する結果となる。図４Ａは、ＮＩＮコード配列開始部位の－１５Ｋｂ～－２０Ｋｂ上流に位置するボックスとしてＮＩＮ ５’上流領域に存在する３Ｃ領域を示す（ＮＩＮ遺伝子＝太い灰色の矢印；開始コドン＝細い黒い矢印上の「ＡＴＧ」）。３Ｃ領域の中央領域は、１Ｋｂ ＣＥ領域であり、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と名付けられた３つの部分またはドメインに分割される４７２ｂｐの保存領域を含む（灰色のボックスで示す）。図４Ａはまた、ｄａｐｈｎｅ様変異体における挿入の位置およびＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の位置を示し、ＮＩＮコード配列開始部位の－２．２Ｋｂと－５Ｋｂ上流の間に位置する標識矢印として示されている。図４Ｂは、空のベクターを用いて形質転換したＡ１７ ＷＴ Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ根（一番上のバー）と、空のベクターまたはＮＩＮ ５’上流領域の異なる部分によって駆動されるＮＩＮ遺伝子を保有するコンストラクトを用いて形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根と、に形成された根粒の数を示す（下部６つのバー；各バーは使用された特異的コンストラクトで標識される）。試験したすべての根に対する根粒形成根の比率（「根粒形成根／トランスジェニック根」と標識した矢印で示す）をグラフの左側に提供する。グラフは、根粒形成根当りの根粒の数を示し、データは平均±ＳＤであり、根粒の数を、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ２０１１．ｐＨＣ６０株を用いて４ｗｐｉで計数した。

【0039】

図５Ａ～５Ｄは、サイトカイニン応答エレメント包含（ＣＥ）領域（より大きな３Ｃ領域の第２領域または中間領域に対応する）および８つのマメ科植物種のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の保存された部分のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。図５Ａ～５Ｃは、８つのマメ科植物種；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号６６３）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（配列番号６６４）、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号６６５）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（配列番号６６６）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（配列番号６６７）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（配列番号６６８）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（配列番号６６９）、およびＡｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（配列番号６７０）のＣＥ領域の保存された部分（すなわち、隣接領域なし）のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。ＣＥ領域の保存された部分は、約１０の推定Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位（配列番号６１３、太字）、および１つのＡＰ２結合エレメント（配列番号６３１、図５Ｂの黒いボックスで囲まれている）を含む。ＣＥ領域の保存された部分は、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と名付けられた３つのドメインに分割され、その範囲および境界は、アラインメントの下の黒い矢印およびアラインメントを通る垂直な黒い線によって示される。図５Ａは、ドメインＤ１の全ておよびドメインＤ２の一部を含む、ＣＥ領域の保存された部分の５’部分のアラインメントを示す。図５Ｂは、ドメインＤ２の一部およびドメインＤ３の一部を含む、ＣＥ領域の保存された部分の中心部分のアラインメントを示す。図５Ｃは、ドメインＤ３の一部を含むＣＥ領域の保存された部分の３’部分のアラインメントを示す。図５Ｄは、８つのマメ科植物種；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号６７１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（配列番号６７２）、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号６７３）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（配列番号６７４）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（配列番号６７５）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（配列番号６７６）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（配列番号６７７）、およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（配列番号６７８）のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。破線で囲んだ２つのボックスは、ＣＹＣ－ボックスといわれる、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント（ＣＹＣＬＯＰＳ応答シスエレメントまたはＣＹＣ－ＲＥともいわれる）内にある、アラインメントの上方に黒い矢印で表されている必須シスエレメントの回文配列を示す。

【0040】

図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0041】

図７Ａおよび図７Ｂは、ＰｒｏｎｉｆＨ：ＧＦＰレポーターを有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉを接種した場合に、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮトランスジェニックｎｉｎ－１根の根粒において、ｎｉｆＨ発現が誘導されることを示す。図７Ａは、４ｗｐｉトランスジェニック根粒の共焦点画像を示し、これは、固定区域（ＦＸ）において、ｎｉｆＨ（明るい灰色）のスイッチが入ることを示す（ＩＦ＝感染区域；スケールバー ２００μｍ）。図７Ｂは、固定区域においてスイッチが入ったｎｉｆＨを示す、図７Ａの拡大画像を示す（Ｓ＝共生；スケールバー ５０μｍ）。図７Ａ～７Ｂに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0042】

図８Ａ～８Ｂは、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様における水の対照（water control）と比較して、サイトカイニン誘導に応答した相対的なＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。図８Ａは、サイトカイニン誘導のための１０－７Ｍベンジルアミノプリン（ＢＡＰ；標識「１０^－７ ＢＡＰ」によって示される）または対照として水（標識「Ｈ_２Ｏ」によって示される）を１６時間適用した後の、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様におけるＮＩＮの相対発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。図８Ｂは、サイトカイニン誘導のための１０－７Ｍ ＢＡＰまたは対照としての水を１６時間適用した後の、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様におけるＮＦ－ＹＡ１の相対発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。図８Ａ～８Ｂは、ＳＥＭを表示するエラーバーを用いて３つの生物学的レプリケートの平均を示す。

【0043】

図９Ａ～９Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ１／Ｄ２／Ｄ３）－５ｋｂ}：ＮＩＮコンストラクトを用いて形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根の表現型を示す。図９Ａは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ１）－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された、接種されたｎｉｎ－１根の縦断面を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；感染糸を矢印で示す）。図９Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ２）－５ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換した、接種されたｎｉｎ－１根の縦断面を示す（ＩＦ＝感染区域；ＦＸ＝固定区域；Ｍ＝分裂組織；スケールバー ２００μＭ）。図９Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ３）－５ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換した、ｎｉｎ－１の根粒の断面を示す（ＩＦ＝感染区域；ＦＸ＝固定区域；スケールバー ２００μｍ）。図９Ａ～９Ｃの断面は、トルイジンブルーを用いて染色する。図９Ａ～９Ｃに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0044】

図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0045】

図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0046】

図１２Ａおよび１２Ｂは、非接種Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根におけるＣＲＥ１およびＲＲ１ ＲＮＡの局在を示す。図１２Ａは、非接種根におけるＣＲＥ１のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示し、ハイブリダイゼーションシグナルは、暗い点として描かれ、矢頭で示される（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；ｖｂ＝維管束）。図１２Ｂは、非接種根におけるＲＲ１のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示し、ハイブリダイゼーションシグナルは、暗い点として示され、矢頭で示される（スケールバー５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；ｖｂ＝維管束）。図１２Ａ～１２Ｂに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【0047】

図１３は、根粒原基開始中のＮＩＮ機能のモデルを示す。根毛のカールにおいて、細菌コロニーが灰色の点として示されており、根毛の軸において、感染糸が明るい灰色の線として示されている（根毛が細胞の表皮から垂直な突起として示されている）。注釈：「－２．２Ｋｂ」および「－５Ｋｂ」は、ＮＩＮ ５’上流領域部分を示す（ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。

【0048】

〔詳細な説明〕
以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどを説明する。しかしながら、そのような説明は本開示の範囲に対する限定として意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。

【0049】

＜遺伝子改変植物および種子＞
本開示の一態様は遺伝子改変植物を含み、植物またはその一部は、１個以上の遺伝子改変を有さない野生型（ＷＴ）植物と比較して、サイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＯＤＵＬＥ ＩＮＣＥＰＴＩＯＮ（ＮＩＮ）タンパク質またはＮＩＮ様タンパク質（ＮＬＰタンパク質）の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を含み、植物またはその一部は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は１個以上の遺伝子改変を含み、当該１個以上の遺伝子改変は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、または２４個以上のサイトカイニン応答エレメントの付加である。本態様のさらに別の実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された８個以上、１６個以上、または２４個以上のサイトカイニン応答エレメントである１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらに別の実施形態は、Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位であるサイトカイニン応答エレメントの少なくとも１つを含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６１３または配列番号６１４の配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、または配列番号６８６の配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、配列番号６２６、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５または配列番号６８６の群から選択される配列を有するＢ型サイトカイニンシグナル伝達ＲＲ結合部位の少なくとも１つを含む。本態様のさらなる実施形態は、タンデムに配向されているか、または逆に配向されているサイトカイニン応答エレメントを含む。

【0050】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、サイトカイニン応答エレメントは、互いに、１００ヌクレオチド以内、９５ヌクレオチド以内、９０ヌクレオチド以内、８５ヌクレオチド以内、８０ヌクレオチド以内、７５ヌクレオチド以内、７０ヌクレオチド以内、６５ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、５９ヌクレオチド以内、５８ヌクレオチド以内、５７ヌクレオチド以内、５６ヌクレオチド以内、５５ヌクレオチド以内、５４ヌクレオチド以内、５３ヌクレオチド以内、５２ヌクレオチド以内、５１ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、４９ヌクレオチド以内、４８ヌクレオチド以内、４７ヌクレオチド以内、４６ヌクレオチド以内、４５ヌクレオチド以内、４４ヌクレオチド以内、４３ヌクレオチド以内、４２ヌクレオチド以内、４１ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、３９ヌクレオチド以内、３８ヌクレオチド以内、３７ヌクレオチド以内、３６ヌクレオチド以内、３５ヌクレオチド以内、３４ヌクレオチド以内、３３ヌクレオチド以内、３２ヌクレオチド以内、３１ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２９ヌクレオチド以内、２８ヌクレオチド以内、２７ヌクレオチド以内、２６ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２４ヌクレオチド以内、２３ヌクレオチド以内、２２ヌクレオチド以内、２１ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内である。本態様のさらなる実施形態において、サイトカイニン応答エレメントは、互いに、１１ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は、サイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されているプロモーターに作動可能に連結されている。本態様のさらなる実施形態において、プロモーターおよびサイトカイニン応答エレメントは、互いに、１１０，０００ヌクレオチド以内、１０９，０００ヌクレオチド以内、１０８，０００ヌクレオチド以内、１０７，０００ヌクレオチド以内、１０６，０００ヌクレオチド以内、１０５，０００ヌクレオチド以内、１０４，０００ヌクレオチド以内、１０３，０００ヌクレオチド以内、１０２，０００ヌクレオチド以内、１０１，０００ヌクレオチド以内、１００，０００ヌクレオチド以内、９９，０００ヌクレオチド以内、９８，０００ヌクレオチド以内、９７，０００ヌクレオチド以内、９６，０００ヌクレオチド以内、９５，０００ヌクレオチド以内、９４，０００ヌクレオチド以内、９３，０００ヌクレオチド以内、９２，０００ヌクレオチド以内、９１，０００ヌクレオチド以内、９０，０００ヌクレオチド以内、８９，０００ヌクレオチド以内、８８，０００ヌクレオチド以内、８７，０００ヌクレオチド以内、８６，０００ヌクレオチド以内、８５，０００ヌクレオチド以内、８４，０００ヌクレオチド以内、８３，０００ヌクレオチド以内、８２，０００ヌクレオチド以内、８１，０００ヌクレオチド以内、８０，０００ヌクレオチド以内、７９，０００ヌクレオチド以内、７８，０００ヌクレオチド以内、７７，０００ヌクレオチド以内、７６，０００ヌクレオチド以内、７５，０００ヌクレオチド以内、７４，０００ヌクレオチド以内、７３，０００ヌクレオチド以内、７２，０００ヌクレオチド以内、７１，０００ヌクレオチド以内、７０，０００ヌクレオチド以内、６９，０００ヌクレオチド以内、６８，０００ヌクレオチド以内、６７，０００ヌクレオチド以内、６６，０００ヌクレオチド以内、６５，０００ヌクレオチド以内、６４，０００ヌクレオチド以内、６３，０００ヌクレオチド以内、６２，０００ヌクレオチド以内、６１，０００ヌクレオチド以内、６０，０００ヌクレオチド以内、５９，０００ヌクレオチド以内、５８，０００ヌクレオチド以内、５７，０００ヌクレオチド以内、５６，０００ヌクレオチド以内、５５，０００ヌクレオチド以内、５４，０００ヌクレオチド以内、５３，０００ヌクレオチド以内、５２，０００ヌクレオチド以内、５１，０００ヌクレオチド以内、５０，０００ヌクレオチド以内、４９，０００ヌクレオチド以内、４８，０００ヌクレオチド以内、４７，０００ヌクレオチド以内、４６，０００ヌクレオチド以内、４５，０００ヌクレオチド以内、４４，０００ヌクレオチド以内、４３，０００ヌクレオチド以内、４２，０００ヌクレオチド以内、４１，０００ヌクレオチド以内、４０，０００ヌクレオチド以内、３９，０００ヌクレオチド以内、３８，０００ヌクレオチド以内、３７，０００ヌクレオチド以内、３６，０００ヌクレオチド以内、３５，０００ヌクレオチド以内、３４，０００ヌクレオチド以内、３３，０００ヌクレオチド以内、３２，０００ヌクレオチド以内、３１，０００ヌクレオチド以内、３０，０００ヌクレオチド以内、２９，０００ヌクレオチド以内、２８，０００ヌクレオチド以内、２７，０００ヌクレオチド以内、２６，０００ヌクレオチド以内、２５，０００ヌクレオチド以内、２４，０００ヌクレオチド以内、２３，０００ヌクレオチド以内、２２，０００ヌクレオチド以内、２１，０００ヌクレオチド以内、２０，０００ヌクレオチド以内、１９，０００ヌクレオチド以内、１８，０００ヌクレオチド以内、１７，０００ヌクレオチド以内、１６，０００ヌクレオチド以内、１５，０００ヌクレオチド以内、１４，０００ヌクレオチド以内、１３，０００ヌクレオチド以内、１２，０００ヌクレオチド以内、１１，０００ヌクレオチド以内、１０，０００ヌクレオチド以内、９，０００ヌクレオチド以内、８，０００ヌクレオチド以内、７，０００ヌクレオチド以内、６，０００ヌクレオチド以内、５，０００ヌクレオチド以内、４，０００ヌクレオチド以内、３，０００ヌクレオチド以内、２，０００ヌクレオチド以内、１，０００ヌクレオチド以内、９００ヌクレオチド以内、８００ヌクレオチド以内、７００ヌクレオチド以内、６００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、または１００ヌクレオチド以内である。本態様のさらに別の実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸の上流に位置するサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、５’上流に位置する遺伝子のコード配列の末端と、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸の転写開始部位または翻訳開始部位と、の間に位置するサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸内（すなわち、転写された遺伝子配列内）に位置するサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸の１つ以上のイントロン内に位置するサイトカイニン応答エレメントを含む。

【0051】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態は、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、または配列番号６９３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質でり、且つ配列番号：２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号：７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ；ＮＩＮの切断型）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；ＮＩＮの切断型）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ；ＮＩＮの切断型）、配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）、配列番号６８７（すなわち、ＡｇｌＮＩＮ；Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、配列番号６８８（すなわち、ＣｇｌＮＩＮ；Ｃａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａ）、配列番号６８９（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．１；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９０（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．２；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９１（すなわち、ＤｔｒＮＩＮ；Ｄｉｓｃａｒｉａ ｔｒｉｎｅｒｖｉｓ）、配列番号６９２（すなわち、ＤｄｒＮＩＮ；Ｄｒｙａｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、または配列番号６９３（すなわち、ＰｔｒＮＩＮ；Ｐｕｒｓｈｉａ ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様の別の実施形態は、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくともの７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくともの７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。

【0052】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態は、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質、または基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、または配列番号６６２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質を含む。

【0053】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は内因性である。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述した態様のいずれかと組み合わせることができ、内因性であるプロモーターを含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターに作動可能に連結されたＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、異種由来であるプロモーターを含む。

【0054】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、根内鞘細胞層、内皮細胞層（すなわち、内皮の細胞層）、皮層細胞層（すなわち、皮層の細胞層）、および／または表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるサイトカイニンシグナル伝達またはサイトカイニンシグナル伝達経路の誘導は、根粒器官形成を誘導する。本態様のさらなる実施形態は、微生物によって外因的に適用または分泌されるサイトカイニン類似物質によって誘導される、サイトカイニンシグナル伝達経路を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態は、核酸に作動可能に連結された１つ以上のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントをさらに含む。本開示のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントは、図５Ｄに示されるとおり、完全なＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントまたは必須のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント（ＣＹＣ－ボックス）であり得る。本態様のさらなる実施形態は、根粒菌感染を誘導する根表皮細胞層（すなわち、表皮の細胞層）におけるＣＹＣＬＯＰＳ発現を含む。

【0055】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらなる実施形態において、遺伝的改変植物は単子葉植物である。本態様のさらなる実施形態は、トウモロコシ（corn）（例えば、トウモロコシ（maize）、トウモロコシ（Zea mays））、イネ（例えば、インディカ米、ジャポニカ米、香り米、もち米、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、野生イネ（例えば、Ｚｉｚａｎｉａ属、Ｐｏｒｔｅｒｅｓｉａ属）、コムギ（例えば、一般的なコムギ、スペルト小麦、デュラム小麦、アインコルン、エンマー小麦、カムット小麦、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｅｌｔａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属）、オオムギ（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、キビ（例えば、シコクビエ、フォニオ、アワ、トウジンビエ、ヒエ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｍａｔｒｅｎｓｅ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌａｃｅｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ属、Ｅｃｈｉｎｏｃｌｏａ属）、テフ（例えば、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ ｔｅｆ）、オートムギ（例えば、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、ライコムギ（例えば、Ｘ Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ Ｗｉｔｔｍａｃｋ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｓｃｈｌａｎｓｔｅｄｔｅｎｓｅ Ｗｉｔｔｍ．、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｎｅｏｂｌａｒｉｎｇｈｅｍｉｉ Ａ．Ｃａｍｕｓ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｎｅｏｂｌａｒｉｎｇｈｅｍｉｉ Ａ．Ｃａｍｕｓ）、ライムギ（例えば、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｎｕｍ）またはサトウキビ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属）の群から選択される遺伝子改変植物を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態は、リンゴ（例えば、Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ、Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｐｙｒｕｓ ｍａｌｕｓ）、ナシ（例えば、Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｐｙｒｕｓ×ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ、Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ、Ｐｙｒｕｓ ｓｉｎｋｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐｙｒｕｓ ｐａｓｈｉａ、Ｐｙｒｕｓ属）、プラム（例えば、ミラベルプラム、グリーンゲージ、インシチチアスモモ、Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｐｒｕｎｕｓ ｓａｌｉｃｉｎａ、Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、アプリコット（例えば、Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ、Ｐｒｕｎｕｓ ｂｒｉｇａｎｔｉｎｅ、Ｐｒｕｎｕｓ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ）、モモ（例えば、Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、アーモンド（例えば、Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ、Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、クルミ（例えば、ペルシアグルミ、セイヨウクルミ、クロクルミ、Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ、Ｊｕｇｌａｎｓ ｎｉｇｒａ、Ｊｕｇｌａｎｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｊｕｇｌａｎｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、チェリー（例えば、Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ、Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ変種 ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ、Ｆｒａｇａｒｉａ ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ）、ラズベリー（例えば、ヨーロッパレッドラズベリー（European red rasberry）、クロミキイチゴ、Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ Ｌ．、Ｒｕｂｕｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｒｕｂｕｓ ｓｔｒｉｇｏｓｕｓ）、ブラックベリー（例えば、常緑のブラックベリー、ヒマラヤのブラックベリー、Ｒｕｂｕｓ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ｕｒｓｉｎｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ｌａｃｉｎｉａｔｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ａｒｇｕｔｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ｕｌｍｉｆｏｌｉｕｓ、Ｒｕｂｕｓ ａｌｌｅｇｈｅｎｉｅｎｓｉｓ、Ｒｕｂｕｓ亜属 Ｅｕｂａｔｕｓ節 Ｍｏｒｉｆｅｒｉ＆Ｕｒｓｉｎｉ）、アカフサスグリ（例えば、シロフサスグリ、Ｒｉｂｅｓ ｒｕｂｒｕｍ）、クロフサスグリ（例えば、カシス、Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）、グースベリー（例えば、Ｒｉｂｅｓ ｕｖａ－ｃｒｉｓｐａ、Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉ、Ｒｉｂｅｓ ｈｉｒｔｅｌｌｕｍ）、メロン（例えば、スイカ、冬瓜、カサバ、キャンタロープ、ハネジュー（honeydew）、マスクメロン、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ、Ｂｅｎｉｎｃａｓａ ｈｉｓｐｉｄａ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｉｎｏｄｏｒｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ）、キュウリ（例えば、スライシングキュウリ（slicing cucumbers）、ピックルキュウリ、セイヨウキュウリ（English cucumber）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、パンプキン（例えば、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）、スクワッシュ（例えば、ヘチマ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ａｒｇｙｒｏｓｐｅｒｍａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）、ブドウ（例えば、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ、Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ、Ｖｉｔｉｓ ｍｕｓｔａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｖｉｔｉｓ ｒｉｐａｒｉａ、Ｖｉｔｉｓ ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ）、麻（例えば、インド麻、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、ホップ（例えば、Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、カバ（例えば、Ｂｅｔｕｌａ属）、ブナ（例えば、Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ、Ｆａｇｕｓ ｇｒａｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｆａｇｕｓ属）、ナツメ（例えば、ベニナツメ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂｅ）、キャッサバ（例えば、マニオク、ユッカ、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ポプラ（例えば、雑種ポプラ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ属）、クリ（例えば、Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ、Ｃａｓｔａｎｅａ ｃｒｅｎａｔａ、Ｃａｓｔａｎｅａ ｄｅｎｔａｔａ、Ｃａｓｔａｎｅａ属）、スワンプオーク（swamp oak）（例えば、Ｃａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａ）、ローズガム（rose gum）（例えば、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、オーク（例えば、コルクガシ、Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｕｂｅｒ、Ｑｕｅｒｃｕｓ属）、シトラス（例えば、レモン、ライム、オレンジ、グレープフルーツ、ブンタン、シトロン、カラタチ、ベルガモット、ダイダイ、ブラッド・オレンジ、ウンシュウミカン、クレメンタイン、マンダリン、ユズ、フィンガーライム、コブミカン、キンカン、Ｃｉｔｒｕｓ ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ、Ｃｉｔｒｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｃｉｔｒｕｓ ｍａｘｉｍａ、Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌａｓｉｃａ、Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ、Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ、Ｃｉｔｒｕｓ×ｐａｒａｄｉｓｉ、Ｃｉｔｒｕｓ×ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ属）、ジャガイモ（例えば、ラセットポテト、黄ポテト、赤ポテト、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、サツマイモ（例えば、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、ヤム（例えば、Ｄｉａｓｃｏｒｅａ属、Ｏｘａｌｉｓ ｔｕｂｅｒｏｓａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｔｒｅｍａ属（例えば、Ｔｒｅｍａ ｃａｎｎａｂｉｎａ、Ｔｒｅｍａ ｃｕｂｅｎｓｅ、Ｔｒｅｍａ ｄｉｓｃｏｌｏｒ、Ｔｒｅｍａ ｄｏｍｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｍａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ、Ｔｒｅｍａ ｌａｍａｒｃｋｉａｎａ、Ｔｒｅｍａ ｍｉｃｒａｎｔｈａ、Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｒｅｍａ ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｍａ ｓｔｒｉｇｉｌｏｓａ、Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ）、およびＪａｔｒｏｐｈａ属（例えば、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）の群から選択される遺伝子改変植物をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、ＷＴ植物はマメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しないか、または両方がマメ科植物ではなく、窒素固定細菌との共生のための根粒を形成しない。

【0056】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物の遺伝子改変植物部分を含み、植物部分は、葉、茎、根、塊茎、花、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）、果実、細胞、またはその一部であり、遺伝子改変植物部分は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、植物部分が果実、塊茎、穀粒（kernel）、または穀粒（grain）であることを含む。本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの植物の遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠を含み、遺伝子改変花粉粒または遺伝子改変胚珠は、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変プロトプラストを含み、遺伝子改変プロトプラストは、１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物由来のプロトプラストまたは細胞から生産された遺伝子改変組織培養物を含み、細胞またはプロトプラストは、葉、葉肉細胞、葯、めしべ、茎、葉柄、根、根端、塊茎、果実、種子、穀粒（kernel）、穀粒（grain）、花、子葉、胚軸、胚、または分裂組織細胞の群から選択される植物部分から生産され、遺伝子改変組織培養物は１個以上の遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、１個以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変組織培養物から再生された遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する遺伝子改変植物を含む。本態様のさらに別の実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれか１つの遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変植物種子を含む。本態様のさらなる実施形態は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、前述の実施形態のいずれかの植物のすべての生理学的および形態学的特徴を有する植物を生産する植物の種子を含む。

【0057】

＜遺伝子改変植物の生産方法および栽培方法＞
本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかの遺伝子改変植物を生産する方法を含み、（ａ）１個以上の遺伝子改変を植物細胞、組織、または他の外植片に導入する工程、（ｂ）植物細胞、組織、または他の外植片を遺伝子改変プラントレットに再生する工程、および（ｃ）遺伝子改変プラントレットを、形質転換されていないＷＴ植物と比較してサイトカイニンシグナル伝達に応答してＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質の活性を増加させる１個以上の遺伝子改変を有する遺伝子改変植物に育てる工程、を含む。本態様のさらなる実施形態は、工程（ｂ）の前に植物細胞、組織、または他の外植片をスクリーニングまたは選択するか、工程（ｂ）と（ｃ）との間にプラントレットをスクリーニングまたは選択するか、または工程（ｃ）の後に植物をスクリーニングまたは選択することによって、１個以上の遺伝子改変の成功した導入を確認することをさらに包含する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施形態において、形質転換は、粒子衝撃（すなわち、バイオリスティック、遺伝子銃）、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、根粒菌が媒介する形質転換、またはプロトプラストのトランスフェクションもしくは形質転換の群から選択される形質転換方法を使用して行われる。

【0058】

本態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができ、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を含む。本態様のさらなる実施形態は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、および当該プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含むベクターを含む。本態様のさらに別の実施形態は、プロモーターと、１つ以上のサイトカイニン応答エレメントと、を含み、プロモーターおよび１つ以上のサイトカイニン応答エレメントは、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位を介してＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小プロモーターの群から選択される。本開示のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントは、図５Ｄに示されるとおり、完全なＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントまたは必須のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント（ＣＹＣ－ボックス）であってよい。本態様のさらなる実施形態において、ベクターは、内因性のＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質に作動可能に連結された核ゲノム配列を標的とする、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上のサイトカイニン応答エレメント、３Ｃ領域、またはＣＥ領域の群から選択されるシス調節性エレメントを導入するために、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントによって編集される核ゲノム配列を含む。本態様のさらに別の実施形態は、１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含むベクターを有する上述の態様のいずれかと組み合わせることができ、核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体、ＴＡＬＥＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＴＡＬＥＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）、ＺＦＮタンパク質をコードする配列を含むベクター（ＺＦＮタンパク質は核ゲノム配列を標的とする）、オリゴヌクレオチドドナー（ＯＤＮ）（ＯＤＮは核ゲノム配列を標的とする）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードする配列および標的配列を含むベクター（標的配列は核ゲノム配列を標的とする）の群から選択される１つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。

【0059】

本態様のさらなる実施形態は、べクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント、または根粒形成するマメ科植物種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ピーナッツ（例えば、Ａｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ、Ａｒａｃｈｉｓ ｉｐａｅｎｓｉｓ）、キマメ（例えば、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）、ヒヨコマメ（例えば、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、ダイズ（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）、ハッショウマメ（例えば、Ｍｕｃｕｎａ ｐｒｕｒｉｅｎｓ）、マメ（例えば、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エンドウマメ（例えば、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、アズキマメ（例えば、Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ、Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ変種 ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、サヤインゲン（例えば、Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ変種 ｒａｄｉａｔａ）、クローバー（例えば、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ）、ルピナス（例えば、ハウチワマメ、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、Ｓｅｓｂａｎｉａ属（例えば、Ｓｅｓｂａｎｉａ ｒｏｓｔｒａｔａ）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、およびＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｌａの群から選択される根粒形成するマメ科植物種を含む。本態様のさらに別の実施形態は、５’上流ＮＩＮ配列、３Ｃ領域、ＣＥ領域、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント、または根粒形成するマメ科植物種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含むベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１または配列番号６１２の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、および配列番号６２６の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成しない種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらに別の実施形態において、根粒形成しない種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントは配列番号６１３である。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、根粒形成する非マメ科植物種由来の１つ以上のサイトカイニン応答エレメントを含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、または配列番号６８６の群から選択されるサイトカイニン応答エレメントを含む。

【0060】

本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２または配列番号６９３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号２２（すなわち、ＣｓａＮＩＮ；Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、配列番号７８（すなわち、ＨｌｕＮＩＮ；Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、配列番号１３６（すなわち、ＰａｎＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）、配列番号１３９（すなわち、ＰｒｉＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｉｇｉｄａ）、配列番号１４２（すなわち、ＰｒｕＮＩＮ；Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ｒｕｇｏｓａ）、配列番号１８５（すなわち、ＴｌｅＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｌｅｖｉｇａｔａ；ＮＩＮの切断型）、配列番号１８７（すなわち、ＴｏｒＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；ＮＩＮの切断型）、配列番号１９０（すなわち、ＴｔｏＮＩＮ；Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ；ＮＩＮの切断型）、配列番号２３６（すなわち、ＺｊｕＮＩＮ；Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ）、配列番号６８７（すなわち、ＡｇｌＮＩＮ；Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、配列番号６８８（すなわち、ＣｇｌＮＩＮ；Ｃａｓｕａｒｉｎａ ｇｌａｕｃａ）、配列番号６８９（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．１；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９０（すなわち、ＤｇｌＮＩＮ．２；Ｄａｔｉｓｃａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、配列番号６９１（すなわち、ＤｔｒＮＩＮ；Ｄｉｓｃａｒｉａ ｔｒｉｎｅｒｖｉｓ）、配列番号６９２（すなわち、ＤｄｒＮＩＮ；Ｄｒｙａｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、または配列番号６９３（すなわち、ＰｔｒＮＩＮ；Ｐｕｒｓｈｉａ ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様の別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＩＮタンパク質であり、且つ配列番号８９（すなわち、ＬｊＮＩＮ；Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）または配列番号１０８（すなわち、ＭｔＮＩＮ；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮ／ＮＬＰ１オーソグループタンパク質を含む。本態様のさらに別の実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ２－３オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１



、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６および配列番号３７７の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、ＮＬＰ４オーソグループタンパク質であり、且つ配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、および配列番号５２４の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。本態様のさらなる実施形態は、ベクターを用いて導入される遺伝子改変を有する前述の態様のいずれかと組み合わせることができ、基部のＮＩＮ／ＮＬＰオーソグループタンパク質であり、且つ配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１または配列番号６６２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７１％の配列同一性、少なくとも７２％の配列同一性、少なくとも７３％の配列同一性、少なくとも７４％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質を含む。

【0061】

前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる本態様のさらなる実施形態は、工程（ａ）の前に、ｎｉｎノックアウト変異体を生成するために内因性のＮＩＮ遺伝子またはＮＬＰ遺伝子をノックアウトすることと、工程（ｂ）の前に植物細胞、組織、または他の外植片をスクリーニングまたは選択すること、工程（ｂ）と（ｃ）との間にプラントレットをスクリーニングまたは選択すること、あるいは工程（ｃ）の後に植物をスクリーニングまたは選択することによって、前述の実施形態のＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードするヌクレオチドを含むコンストラクトのいずれか１つによるｎｉｎノックアウト変異体の成功した補完を確認することと、を含む。

【0062】

本開示のさらなる態様は、遺伝子改変された植物を有する前述した実施形態のいずれかの遺伝子改変植物を栽培する方法を含み、当該方法は、遺伝子改変実生苗（seedling）、遺伝子改変プラントレット、遺伝子改変挿し木、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、または遺伝子改変種子を土壌中に植え付けて、遺伝子改変植物を生産する、あるいは遺伝子改変実生苗、遺伝子改変プラントレット、または遺伝子改変挿し木を、土壌中で育てられた台木（root stock）もしくは第２の植物に接合して、遺伝子改変植物を生産する工程；収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を栽培する工程；および、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒（kernels）、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀粒（grain）を収穫する工程、を含む。

【0063】

＜遺伝子改変された植物および植物細胞を生産する分子生物学的方法＞
本発明の１つの実施形態は、１つ以上の修飾シス調節性エレメントおよび／または導入されたシス調節性エレメントを含む、遺伝子改変された植物または植物細胞を提供する。例えば、本開示は、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された１つ以上のサイトカイニン応答エレメントの付加を有する、遺伝子改変植物を提供し、ここで、１つ以上のサイトカイニン応答エレメントは植物の遺伝子改変によって導入されている、ＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸は植物の遺伝子改変によって導入されている、または１つ以上のサイトカイニン応答エレメントおよびＮＩＮタンパク質またはＮＬＰタンパク質をコードする核酸の両方は、植物の遺伝子改変によって導入されている。

【0064】

遺伝子改変された単子葉植物細胞および双子葉植物細胞の形質転換および生成は、当技術分野で周知である。例えば、Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988)；米国特許第５，６７９，５５８号；Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995)；Wang, et al. Acta Hort. 461:401-408 (1998)、およびBroothaerts, et al. Nature 433:629-633 (2005)を参照のこと。方法の選択は、形質転換される植物の種類、特定用途および／または所望の結果によって変化する。適切な形質転換技術は、当業者によって容易に選択される。

【0065】

細胞のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびオルガネラＤＮＡ）を欠失、挿入または他の方法で修飾するための当技術分野で公知の任意の方法論を、本明細書中に開示される本発明の実施において使用し得る。一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９システムおよび関連システム（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＯＤＮなど）を使用して、ゲノムＤＮＡ中の標的部位に異種由来の遺伝子を挿入するか、または異種由来の遺伝子を発現させるために内因性遺伝子を実質的に編集することができる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける、標的遺伝子の欠失または挿入のための遺伝子コンストラクトを含む、安全化されたＴｉプラスミドは、植物細胞を形質転換するために使用され、その後、形質転換された植物は、当技術分野において記載された手順（例えば、ＥＰ０１１６７１８、ＥＰ０２７０８２２、ＰＣＴ公報ＷＯ８４／０２９１３および公開された欧州特許出願（「ＥＰ」）０２４２２４６）を使用して、形質転換された植物細胞から再生され得る。Ｔｉプラスミドベクターはそれぞれ、ＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡの境界配列の間、または少なくとも右側境界配列の左側に位置する遺伝子を含む。もちろん、他のタイプのベクターは、遺伝子直接導入（例えば、ＥＰ０２３３２４７に記載されるような）、花粉が媒介する形質転換（例えば、ＥＰ０２７０３５６、ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０１８５６、および米国特許４，６８４，６１１に記載されるような）、植物ＲＮＡウイルスが媒介する形質転換（例えば、ＥＰ０ ０６７ ５５３および米国特許４，４０７，９５６に記載されるような）、リポソームが媒介する形質転換（例えば、米国特許４，５３６，４７５に記載されるような）、並びにトウモロコシの特定の系統を形質転換するための方法（例えば、米国特許６，１４０，５５３；Fromm et al., Bio/Technology (1990) 8, 833-839)；Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, (1990) 2, 603-618）、米の特定の系統を形質転換するための方法（Shimamoto et al., Nature, (1989) 338, 274-276；Datta et al., Bio/Technology, (1990) 8, 736-740）、および単子葉植物を通常形質転換するための方法（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９６）などの他の方法、などの手順を用いて、植物を形質転換するために使用される。綿の形質転換については、ＰＣＴ特許公報ＷＯ００／７１７３３に記載された方法を使用することができる。ダイズ形質転換については、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅら（Bio/Technology, (1988) 6, 915）およびＣｈｒｉｓｔｏｕら（Trends Biotech, (1990) 8, 145）またはＷＯ００／４２２０７の方法が参照される。異種由来の遺伝子は、密接に関連する植物種、遠縁の植物種、または基部植物（basal plants）（例えば、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属）に由来し得る（Possart et al., The Plant Cell, (2017) 29, 310-330；Frangedakis et al., New Phytol, (2017) 216, 591-604）。

【0066】

本発明の遺伝子改変植物は、同じ特性を有するより多くの遺伝子改変植物を生産するために、または同じもしくは関連する植物種の他の品種に遺伝子改変を導入するために、従来の品種改良スキームにおいて使用され得る。改変された植物から得られる種子は、好ましくは、染色体ＤＮＡ中の安定な挿入として、または内因性遺伝子もしくはプロモーターに対する修飾として、遺伝子改変を含む。本発明による遺伝子改変を含む植物は、本発明の遺伝子改変を含む植物（例えば、果樹または鑑賞植物）の台木を含む植物、または台木に由来する植物を含む。したがって、形質転換された植物または植物部分に挿入された任意の非トランスジェニック移植植物部分が、本発明に含まれる。

【0067】

本発明のサイトカイニンシグナル伝達に応答するシス調節性エレメントは、Ｂ型サイトカイニン応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位（すなわち、サイトカイニン応答性エレメント）を含む。これらのサイトカイニン応答性エレメントは、インビトロおよびインビボ研究におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて確認され、かつ実験的に特徴づけられ（Sakai et al., Science, (2001) 294, 1519-1521；Hosoda et al., Plant Cell, (2002) 14, 2015-2029；Imamura et al., Plant Cell Phys, (2003), 22, 122-131, Zhao et al., Nature Letters (2010), 465, 1089-1093）、そしてイネにおいても保存されていることが示された（Ross et al., J. Exp. Bot., (2004) 55, 1721-1731）。Ｂ型ＲＲ結合部位におけるコア保存エレメントは核酸配列ＧＡＴであり、５’－（Ａ／Ｇ）および３’－（Ｃ／Ｔ）と隣接している。本発明のサイトカイニン応答性エレメント（すなわち、サイトカイニン応答エレメント）は、植物または合成物質から単離され得る。植物から単離されたサイトカイニン応答エレメントは、根粒形成するマメ科植物種由来のＮＩＮ遺伝子の５’上流領域から単離され、そして図４Ａおよび図５Ａ～５Ｃに示されるとおり、より大きな領域（例えば、３Ｃ領域、ＣＥ領域）を含み得る。合成のサイトカイニン応答エレメントの設計は、Zurcher et al., Plant Phys, (2013) 161, 1066-1075（これは、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。

【0068】

本発明の導入されたサイトカイニン応答エレメントは、宿主細胞ＤＮＡに挿入され得、その結果、挿入されたサイトカイニン応答エレメント部分は、適切な３’末端転写調節シグナル（例えば、転写物形成およびポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、５’）になる。これは、好ましくは、植物細胞ゲノム（核または葉緑体）中にサイトカイニン応答エレメントを挿入することによって達成される。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入されたサイトカイニン応答エレメントは、核ゲノムに安定に組み込まれる。核酸配列が核ゲノムに組み込まれたままであり、次の植物世代にわたって発現され続ける（例えば、検出可能なｍＲＮＡ転写物またはタンパク質が生産される）場合に、安定な組み込みが存在する。核ゲノムへの安定な組み込みおよび／または核ゲノムの編集は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、微粒子衝撃、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、プロトプラストのエレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）によって達成され得る。いくつかの実施形態において、本発明のサイトカイニン応答エレメントは、ＮＩＮ遺伝子またはＮＬＰ遺伝子と共に宿主細胞ＤＮＡに挿入される。好ましいポリアデニル化および転写物形成シグナルは、ノパリン合成遺伝子（Depicker et al., J. Molec Appl Gen, (1982) 1, 561-573）、オクトピン合成遺伝子（Gielen et al., EMBO J, (1984) 3:835 845）、ＳＣＳＶまたはＭａｌｉｃ酵素ターミネーター（Schunmann et al., Plant Funct Biol, (2003) 30:453-460）、および形質転換植物細胞における３’非翻訳ＤＮＡ配列として作用するＴ ＤＮＡ遺伝子７（Velten and Schell, Nucleic Acids Res, (1985) 13, 6981 6998）のシグナルが含まれる。

【0069】

導入されたサイトカイニン応答エレメントは、好ましくは植物発現可能なプロモーターに作動可能に連結されている。本明細書中で使用される「植物発現可能なプロモーター」は、植物細胞における本発明の遺伝子改変の発現を確実にするプロモーターをいう。植物発現可能なプロモーターは、植物遺伝子の５’上流領域（根粒形成するマメ科植物種由来のＮＩＮ遺伝子の５’上流領域など）であり得、これは３Ｃ領域、ＣＥ領域、および／またはＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含み得る。本開示のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントは、図５Ｄに示されるとおり、完全なＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントまたは必須のＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント（ＣＹＣ－ボックス）であり得る。さらに、植物発現可能なプロモーターは、構成的プロモーターであり得る。さらに、植物発現可能なプロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、植物のいくつかの細胞または組織において（例えば、根内鞘細胞において）、より高レベルの発現を指示するプロモーターであり得る。

【0070】

好ましい実施形態において、根粒形成するマメ科植物種由来のＮＩＮ遺伝子の５’上流領域に由来するプロモーターおよび他のコンポーネント（すなわち、ＮＩＮ遺伝子プロモーター）が使用される。非限定的な例としては、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子の転写開始部位までのＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントを含む５’上流配列を含むＮＩＮ遺伝子プロモーター、３Ｃ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子プロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子プロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＮＩＮ遺伝子プロモーターが挙げられる。

【0071】

植物細胞においてしばしば使用される構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイク（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（KAY et al. Science, 236, 4805, 1987）、最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Benfey & Chua, Science, (1990) 250, 959-966）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの他の種々の派生物、トウモロコシ（maize）ユビキチンプロモーター（CHRISTENSEN & QUAIL, Transgenic Res, 5, 213-8, 1996）、トレフォイルプロモーター（Ljubql, MAEKAWA et al. Mol Plant Microbe Interact. 21, 375-82, 2008）、葉脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター（国際出願ＷＯ９７／４８８１９）、およびシロイヌナズナＵＢＱ１０プロモーター、Norris et al. Plant Mol. Biol. 21, 895-906, 1993）である。好ましい実施形態において、サイトカイニン応答性エレメントを含む最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが使用される。非限定的な例としては、ＣＥ領域に作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結されたＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメントに作動可能に連結された最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣＥ領域に作動可能に連結された最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、および１つ以上のサイトカイニン応答エレメントに作動可能に連結された最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが挙げられる。

【0072】

植物における恒常的発現を指示するプロモーターのさらなる例は、当該技術分野において公知であり、以下を含む：例えば、分離株ＣＭ１８４１（Gardner et al., Nucleic Acids Res, (1981) 9, 2871-2887）、ＣａｂｂＢ Ｓ（Franck et al., Cell (1980) 21, 285 294）およびＣａｂｂＢ ＪＩ（Hull and Howell, Virology, (1987) 86, 482 493）のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の強力な恒常的３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；ユビキチンファミリー由来のプロモーター（例えば、Christensen et al., Plant Mol Biol, (1992) 18, 675-689のトウモロコシ（maize）ユビキチンプロモーター）、ｇｏｓ２プロモーター（de Pater et al., The Plant J (1992) 2, 834-844）、ｅｍｕプロモーター（Last et al., Theor Appl Genet, (1990) 81, 581-588）、Ａｎら（The Plant J, (1996) 10, 107）によって記載されたプロモーター、Ｚｈａｎｇら（The Plant Cell, (1991) 3, 1155-1165）によって記載されたイネアクチンプロモーターなどのアクチンプロモーター；キャッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター（ＷＯ９７／４８８１９、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら（Plant Mol Biol, (1998) 37, 1055-1067）、サブタレニアンクローバースタントウイルス（Subterranean Clover Stunt Virus）由来のプロモーターのｐＰＬＥＸシリーズ（ＷＯ９６／０６９３２、特にＳ４またはＳ７プロモーター）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、例えばｐＡｄｈ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）、およびＴ ＤＮＡの１’遺伝子および２’遺伝子の発現をそれぞれ駆動するＴＲ１’プロモーターおよびＴＲ２’プロモーター（それぞれ「ＴＲ１’プロモーター」および「ＴＲ２’プロモーター」）（Velten et al., EMBO J, (1984) 3, 2723 2730）。

【0073】

組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、ＮＦＲ１またはＮＦＲ５／ＮＦＰプロモーター、特にロータスＮＦＲ５プロモーター（配列番号２４）およびロータスＮＦＲ１プロモーター（配列番号２５）、トウモロコシ（maize）アロチオネインプロモーター（DE FRAMOND et al, FEBS 290, 103-106, 1991 出願ＥＰ４５２２６９）、キチナーゼプロモーター（SAMAC et al. Plant Physiol 93, 907-914, 1990）、トウモロコシ（maize）ＺＲＰ２プロモーター（米国特許第５，６３３，３６３号）、トマトＬｅＥｘｔｌプロモーター（Bucher et al. Plant Physiol. 128, 911-923, 2002）、グルタミンシンテターゼ大豆根プロモーター（HIREL et al. Plant Mol. Biol. 20, 207-218, 1992）、ＲＣＣ３プロモーター（ＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０１６１０４）、イネアンチキチン（antiquitine）プロモーター（ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０７６１１５）、ＬＲＲ受容体キナーゼプロモーター（ＰＣＴ出願ＷＯ０２／４６４３９）、およびシロイヌナズナｐＣＯ２プロモーター（HEIDSTRA et al, Genes Dev. 18, 1964-1969, 2004）が挙げられる。これらの植物プロモーターは、エンハンサーエレメントと組み合わせることができ、最小プロモーターエレメントと組み合わせることができ、または所望の発現プロフィールを確実にするために反復エレメントを含むことができる。

【0074】

いくつかの実施形態において、植物細胞における発現を増加させるための遺伝学的エレメントを利用することができる。例えば、導入された遺伝子の５’末端または３’末端のイントロン、または導入された遺伝子のコード配列、例えば、ｈｓｐ７０イントロンである。他のこのような遺伝学的エレメントには、プロモーターエンハンサーエレメント、重複または三重プロモーター領域、別の導入遺伝子とは異なる５’リーダー配列または内因性（植物宿主）遺伝子リーダー配列とは異なる５’リーダー配列、同じ植物で使用される別の導入遺伝子とは異なる３’トレーラー配列または内因性（植物宿主）トレーラー配列とは異なる３’トレーラー配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0075】

組換え核酸または修飾核酸という用語は、単離されたポリヌクレオチドのセグメントの遺伝子工学技術または化学合成による人工操作によって達成される２つの他の分離された配列のセグメントの組み合わせによって作製されるポリヌクレオチドを指す。そうすることによって、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを共に連結して、所望の機能の組み合わせを生成し得る。

【0076】

本明細書中で使用される場合、用語「上方調節」は、サイトカイニンシグナル伝達などの刺激に応答した上方調節に特に重点を置いた遺伝子改変の結果として、野生型生物（例えば、植物）における発現と比較して増加した発現（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドなどの）をいう。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現よりも約１０％多いわずかな増加である。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現と比較して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、１００％など）の増加である。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子が上方調節される。いくつかの実施形態において、外因性遺伝子は、発現されることによって上方調節される。植物における遺伝子の上方調節は、誘導性応答エレメントが付加された構成的プロモーター、誘導性プロモーター、誘導性応答エレメントが付加された高発現プロモーター（例えば、ＰｓａＤプロモーター）、エンハンサー、転写および／もしくは翻訳調節性配列、コドン最適化、修飾転写因子、並びに／またはサイトカイニンシグナル伝達などの刺激に応答して上方調節される遺伝子の発現を制御する変異遺伝子もしくは改変遺伝子を含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって達成され得るが、これらに限定されるものではない。

【0077】

組換え核酸が特定の配列の発現、クローニング、または複製を意図する場合、宿主細胞への導入のために調製されるＤＮＡコンストラクトは、所望のポリペプチドをコードする意図されるＤＮＡフラグメントを含む宿主によって認識される複製系（例えば、ベクター）を通常は含み、そしてまた、ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結された転写開始調節配列および翻訳開始調節配列を含み得る。さらに、このようなコンストラクトは、細胞局在化シグナル（例えば、原形質膜局在化シグナル）を含み得る。好ましい実施形態において、このようなＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞のゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡに導入される。

【0078】

いくつかの実施形態において、組み込まれていない発現系を使用して、１つ以上の導入された遺伝子の発現を誘導することができる。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製起点または自律的に複製する配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびｍＲＮＡ安定化配列など）を含み得る。シグナルペプチドはまた、必要に応じて、タンパク質が細胞膜、細胞壁を横切るおよび／もしくは細胞膜、細胞壁に留まる、または細胞から分泌されることを可能にする、同じ種または関連する種の分泌ポリペプチドから含まれ得る。

【0079】

本明細書中に開示される本発明の方法論を実施する際に有用な選択マーカーは、陽性選択マーカーであり得る。典型的には、陽性選択は、目的の組換えポリヌクレオチドが細胞内に存在する場合にのみ、遺伝子学的に改変された細胞が毒性物質の存在下で生存し得る場合をいう。陰性選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカーもまた、当技術分野において周知であり、そして本発明によって意図される。当業者は、入手可能な任意の関連マーカーが本明細書中に開示される本発明を実施する際に利用され得ることを認識する。

【0080】

本発明の組換え株のスクリーニングおよび分子分析は、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して行うことができる。ハイブリダイゼーション手順は、本明細書中に記載される技術を使用して修飾されたポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを同定するために有用であり、本明細書中に教示されるとおり有用である対象調節性配列と十分な相同性を有する。特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術の改善がなされるにつれて、それらは当業者によって容易に適用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に公知の任意の適切な標識で標識され得る。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件（例えば、温度および塩濃度）は、検出閾値のストリンジェンシーを変化させるために変更され得る。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなるガイドラインについては、例えば、Sambrook et al. (1989) vide infra or Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, N.Y.を参照のこと。

【0081】

さらに、遺伝子学的に改変された株のスクリーニングおよび分子分析、ならびに所望の単離された核酸の作製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施され得る。ＰＣＲは、核酸配列の反復的な、酵素的な、準備された合成である。この手順は当業者に周知であり、そして一般的に使用される（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354を参照のこと）。ＰＣＲは、標的配列の反対鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーと隣接する目的のＤＮＡフラグメントの酵素増幅に基づく。プライマーは、３’末端が互いに向くように配向される。鋳型の熱変性、それらの相補的配列へのプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの延伸の反復サイクルは、ＰＣＲプライマーの５’末端によって規定されるセグメントの増幅を生じる。各プライマーの伸長産物は他のプライマーの鋳型として働くことができるので、各サイクルは、前のサイクルにおいて産生されたＤＮＡ鋳型の量を本質的に２倍にする。これは、数時間で数百万倍までの、特異的標的断片の指数関数的な蓄積を生じる。好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されるＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、増幅プロセスを完全に自動化することができる。使用することができる他の酵素は、当業者に公知である。

【0082】

本発明の核酸およびタンパク質はまた、ＮＩＮタンパク質およびＮＬＰタンパク質について具体的に開示された配列の相同体を包含し得る。相同性（例えば、配列同一性）は、５０％～１００％であり得る。いくつかの例において、そのような相同性は、８０％を超え、８５％を超え、９０％を超え、または９５％を超える。配列の任意の意図される使用に必要とされる相同性または同一性の程度は、当業者によって容易に同定される。本明細書中で使用されるように、２つの核酸の配列同一性パーセントは、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268によって開示され、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変された、当該技術分野で公知のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:402-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。所望の配列同一性パーセントを有するヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行う。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402に記載のとおりに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用する。www.ncbi.nih.govを参照のこと。

【0083】

好ましい宿主細胞は植物細胞である。組換え宿主細胞は、本文脈において、単離された核酸分子を含有するように遺伝子学的に改変されたものであり、宿主細胞中に通常存在し且つ機能的である１つ以上が欠失した遺伝子または他の機能的ではない遺伝子を含有するか、または少なくとも１つの組換えタンパク質を産生する１つ以上の遺伝子を含有する。本発明のタンパク質をコードする核酸は、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーション、または当業者に公知の任意の他の方法論を含むが、これらに限定されない、特定の型の細胞に適切な当該分野に公知の任意の手段によって導入され得る。

【0084】

本発明を一般的に説明したが、本発明は、特定の具体例を参照することによって、より良く理解されるのであろう。特定の具体例は、本発明をさらに説明するために本明細書に含まれ、且つ特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0085】

〔実施例〕
本開示は以下の実施例においてさらに詳細に記載されるが、これらの実施例は特許請求される本開示の範囲を限定することを決して意図しない。添付の図面は、本開示の明細書および説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。以下の実施例は例示のために提供されるが、特許請求される開示を限定するために提供されるものではない。

【0086】

実施例１：上流のサイトカイニン応答性シスエレメントは、完全な相補性を可能にするために、内鞘におけるＮＩＮの発現に必要である
以下の実施例は、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａにおける根粒原基形成に必要な、ＮＩＮ ５’－上流領域に位置するシス調節性サイトカイニン応答性エレメントの同定について述べる。この領域の重要性は、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体を補完することによって示された。

【0087】

材料および方法
植物材料および成長、毛根形質転換および根粒菌の接種：Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ生態型（ecotype） Ｊｅｍａｌｏｎｇ Ａ１７を野生型植物として用いた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ｍｓｕ４４０が媒介する毛根形質転換を、Ｌｉｍｐｅｎｓら，２００４（Limpens et al., J. Exp. Bot., (2004) 55, 983-992）に記載されているように行った。Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ植物は、２１℃および１６時間 明／８時間 暗レジームにて、Ｆａｒｈａｅｕｓ（Ｆａ）培地を含む低硝酸塩［０．２５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ_３）_２］で飽和させたパーライト中で成長させた。１週間の成長後、植物に、ＧＦＰを恒常的に発現するＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ） ＲＣＲ２０１１（株ＲＣＲ２０１１．ｐＨＣ６０）またはＰｒｏｎｉｆＨ：ＧＦＰレポーターを保有するものを接種し、これにより、これらのレポーターは、実験目的のために使用したが、補完には必要ではなかった（ＯＤ_６００＝０．１、植物当たり２ｍＬ）。Ｆａプレート上で成長する植物に、１つの根当たり０．５μＬの根粒菌懸濁液をスポット接種した。

【0088】

コンストラクト：Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および表１に挙げたプライマーを用いて、ＰＣＲによりＮＩＮ遺伝子（３’ＵＴＲを含む）およびプロモーター領域のＤＮＡの種々のセグメントを作製した。ｐＥＮＴＲ－Ｄ－ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のために使用したＤＮＡセグメントを、追加の５’－ＣＡＣＣ配列を含むフォワードプライマーを用いて増幅させた。ａｔｔＢ４部位（ＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＮＮ、配列番号６２７）を含むフォワードプライマーおよびａｔｔＢ１部位を有するリバースプライマー（ＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＮ、配列番号６２８）を使用して、ＢＰ組換え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるベクターｐＤＯＮＯＲ Ｐ４－Ｐ１へのクローニングのためのＤＮＡセグメントを作製した。ａｔｔＢ２（ＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡ、配列番号６２９）を有するフォワードプライマーおよびａｔｔＢ３（ＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣ、配列番号６３０）を有するリバースプライマーを使用して、ベクターｐＤＯＮＯＲ Ｐ２－Ｐ３へのクローニングのためのＤＮＡフラグメントを増幅させた。２ラウンドのＰＣＲを使用して、サイトカイニン応答エレメント含有（ＣＥ）領域における３つのドメイン（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３）に対応する３つの欠失、ならびに－５ｋｂ領域における推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の欠失を作り出した（例えば、図５Ａ～５Ｃを参照のこと）。ＰＣＲの第１ラウンドでは、欠失によって分離された２つのＤＮＡ断片を特異的プライマーで増幅させて、１５ｂｐオーバーハングを導入した。以下の特異的プライマーをＰＣＲの第１ラウンドにおいて使用した：ＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ１－ＲおよびＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ１－Ｆ（Ｄ１ドメインにおける欠失を作り出すため）、ＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ２－ＲおよびＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ２－Ｆ（Ｄ２ドメインにおける欠失を作り出すため）、ＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ３－ＲおよびＰｒｏＮＩＮ－ΔＤ３－Ｆ（Ｄ３ドメインにおける欠失を作り出すため）、ならびにＰｒｏＮＩＮ－ΔＣＹＣＬＯＰＳ－ＲおよびＰｒｏＮＩＮ－ΔＣＹＣＬＯＰＳ－Ｆ（ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位における欠失を作り出すため）（表１）。続いて、ＰＣＲ産物を精製および混合し、ＰＣＲの第１ラウンドにおいて作製した混合物５μＬをＰＣＲの第２ラウンドのための鋳型として使用した。ＰＣＲの第２ラウンドにおいて、プライマーＰｒｏＮＩＮ－ＣＥ－ＦおよびＰｒｏＮＩＮ－ＣＥ－Ｒ、ＰｒｏＮＩＮ－５ｋｂ－ＦおよびＰｒｏＮＩＮ－０ｋｂ－Ｒ、またはＰｒｏＮＩＮ－２．２ｋｂ－ＦおよびＰｒｏＮＩＮ－０ｋｂ－Ｒ（表１）を用いて、ＣＥ、－２．２ｋｂ領域、または－５ｋｂ領域に欠失を有する単一の増幅産物を作製した。マルチサイトＬＲ組換え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、エントリーベクターを、改変ゲートウェイバイナリーベクターｐＫＧＷ－Ｒ－ＭＧＷ（Ovchinnikova et al., Spp. Mol. Plant. Microbe. Interact., (2011) 24, 1333-1344）に組み換えた。表１に列挙したプライマーを用いて作製したコンストラクトは、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{５ｋｂ（Δｃｙｃｌｏｐｓ）}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ１）－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ２）－５ｋｂ}：ＮＩＮ、およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ３）－５ｋｂ}：ＮＩＮであった。

【表1】

【0089】

組織学的分析および顕微鏡検査：ＰｒｏＮＩＮ：ＧＵＳコンストラクトを保有するトランスジェニック根を、ＧＵＳ緩衝液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）中の３％スクロース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ｋ－フェロシアン化物、２ｍＭ ｋ－フェリシアン化物、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｘ－Ｇｌｕｃ］中、３７℃で１～２時間インキュベートした。プラスチック中に植物組織を包埋し、切片化し、そして染色を、Ｘｉａｏら（Xiao et al., Development, (2014) 141, 3517-3528）に記載のとおり行った。ＤＦＣ４２５Ｃカメラ（Ｌｅｉｃａ）を装備したＤＭ５５００Ｂ顕微鏡を用いて切片を分析した。トランスジェニック根および根粒の明視野画像および蛍光画像を、ステレオマクロスコープ（Ｍ１６５ ＦＣ、Ｌｅｉｃａ）を用いて撮影した。ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ）顕微鏡を用いて共焦点画像を撮影した。４８８ｎｍおよび５４３ｎｍの励起波長を、それぞれＧＦＰおよびヨウ化プロピジウムのために使用した。

【0090】

ＲＮＡ単離およびｑＲＴ－ＰＣＲ：ＥＺＮＡ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）を用いて、１週齢のＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７およびｄａｐｈｎｅ様根からＲＮＡを単離した。１μｇの単離ＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたｃＤＮＡ合成のために用いた。リアルタイムｑＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＣＦＸリアルタイムシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１０μｌの反応で行った。プライマー名に「ｑＰＣＲ」で示された表１に列挙されたプライマーを使用して、遺伝子発現レベルを決定した。遺伝子発現レベルは、基準遺伝子としてＡＣＴＩＮ２を用いて標準化した。

【0091】

サイトカイニンを用いた発現誘導：遺伝子発現がサイトカイニンによって誘導されたか否かを決定するために、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７（ＷＴ）の根およびｄａｐｈｎｅ様の根を、１０^－７Ｍ ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）または水のいずれかで１６時間処理した。次に、表１に列挙したプライマーを用いて、遺伝子ＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。この実験を、合計３つの生物学的レプリケートについて繰り返した。

【0092】

コロニー、感染糸、根粒の定量：コロニーまたは感染糸を含むカーリングした根毛の数を定量するために、２０よりも多いトランスジェニック根（長さ５～１０ｃｍ）を約１ｃｍの断片に切断し、無作為に選択して計数した。１個の根当たりの根粒数を定量するために、５～１０ｃｍの長さのトランスジェニック根を選択した。

【0093】

ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中の３％グルタールアルデヒドと混合した４％パラホルムアルデヒドでＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの根を固定し、パラフィン（Ｐａｒａｐｌａｓｔ Ｘ－ｔｒａ， ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に包埋した。７μｍの根の切片をＲＪ２０３５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）によって調製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＶｉｅｗＲＮＡ（商標）ＩＳＨ Ｔｉｓｓｕｅ １－Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ユーザーマニュアル（cdn.panomics.comにおいて、ディレクトリdownloads/17400RevF%20140822_ViewRNA%20ISH%20Tissue%201-Plex.pdfの下で入手可能）の指示に従って、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ＲＮＡ ＩＳＨプローブセットを設計し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの要求により合成した。プローブのカタログ番号は、Ｍｔ ＮＩＮについてはＶＦ１－２０３１２、Ｍｔ ＣＲＥ１についてはＶＦ１－６０００８６５、Ｍｔ ＲＲ１についてはＶＦ１－６０００８６６、およびＭｔ ＮＦ－ＹＡ１についてはＶＦ－２０３１１であった。典型的なプローブセットは、標的ｍＲＮＡを横断する特定の領域にハイブリダイズした約２０ペアのオリゴヌクレオチドプローブ（２０ｎｔ長）からなっていた。各プローブは、約２０ヌクレオチドの領域、短いリンカー領域およびテール配列から構成された。２つのテール配列（ダブルＺ）は、シグナル増幅のための部位を共に形成した。このような設計は、非特異的ハイブリダイゼーション事象が増幅される機会を減少させることによって、バックグラウンドコントロールの増加を確実にした。根粒形成特異的遺伝子については、非接種根を陰性対照として用いた。接種されていない根で実施したＣＲＥ１およびＲＲ１を用いたＩＳＨについては、ＥＮＯＤ２（根粒特異的遺伝子）プローブセットを陰性対照として使用した。画像は、ＤＦＣ４２５ｃカメラ（Ｌｅｉｃａ）を装備したＡＵ５５００Ｂ顕微鏡で撮影した。

【0094】

ｄａｐｈｎｅ様のマップベースのクローニング：Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＦＮ８１１３（ｃｖ Ｊｅｍａｎｄ Ａ１７）とＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ｊｅｍａｌｏｎｇ Ａ２０との間の交配から分離Ｆ２集団を作製した（１１８植物体）。この集団はＮｏｄ＋植物体：Ｎｏｄ－植物体の約３：１比率を示した（１１８のＦ２植物体；８４Ｎｏｄ＋：３４Ｎｏｄ－）。３：１比率は、ＦＮ８１１３が、そのＮｏｄ－表現型の原因となる単一の劣性変異を有することを示した。標準的なＣＴＡＢ ＤＮＡミニプレップ法を用いてＤＮＡを抽出した。Ｍｕｎら（Mun et al., Genetics, (2006) 172, 2541-2555）に基づく単純反復配列マーカー（ＳＳＲ：Simple sequence repeat）を最初に使用して、ＦＮ８１１３遺伝子座の全体的な染色体位置を決定した。変異は、ＮＩＮが位置する第５染色体の末端に位置することが示された。その後、第５染色体上のＦＮ８１１３遺伝子座のための追加のＳＳＲマーカーを開発し、染色体ウォーキングに用いた。１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、２．５％アガロースゲル上で分析した。ＢＡＣクローンＣＵ４２４４９４上のＳＳＲマーカーＪＨ５．１７（表１）は、ＦＮ８１１３遺伝子座に最も近い連鎖（linkage）を示した。第５染色体の遠位端で交差は見られなかった。次に、全ゲノムシークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２０００、ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ）を用いて、遺伝子マッピングから同定したゲノム領域における変異を同定した。これにより、第２染色体から第５染色体への約２．４９Ｍｂｐ領域の転座が明らかになり、ＮＩＮ開始コドンの４１２０ｂｐ上流に挿入されていた（－４１２０）。さらに、－４１２１と－４１３５との間の１５ｂｐの小さな欠失が検出された（図１Ｈ）。ＮＩＮコード配列に変異は見出されなかった。変異領域のゲノム配列は、配列番号５２５として提供される。ｂｗａ＿ｍｅｍアルゴリズム（Li and Durbin, Bioinformatics, (2010) 26, 589-595）を用いて、Ｙｏｕｎｇら（Young et al., Nature, (2011) 480, 520-524）によって公開されたＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａゲノムに対して、クリーンなＤＮＡ配列リード（reads）をマッピングした。クリップされたリード（clipped reads）および誤ってマップされたメイトペア（mate pairs）は、染色体間転座を明らかにし、変異にまたがるリードを、ＢＬＡＳＴＮを用いてゲノムに位置合わせさせることによってさらに確認した。

【0095】

ＮＩＮの上流領域のアラインメント：この研究のほとんどは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ８．１．９（https://www.geneious.com）を使用して実施した（Kearse et al., Bioinformatics, (2012) 28, 1647-1649）。Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮタンパク質配列を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ８．１．９を用いて、カスタムＢＬＡＳＴデータベースに対してＢＬＡＳＴ処理した（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990) 215, 403-410; Kearse et al., Bioinformatics, (2012) 28, 1647-1649）。良質な公的に利用可能なゲノム配列を有するマメ科植物種の多様な選択を使用した：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（Young et al., Nature, (2011) 480, 520-524）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Sato et al., DNA Res., (2008) 15, 227-239）、Ａｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（Bertioli et al., Nat. Genet., (2016) 48, 438-446), Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（Varshney et al., Nat. Biotechnol., (2013) 31, 240-246）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Schmutz et al., Nature, (2010) 463, 178-183）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（Hane et al., Plant Biotechnol. J., (2017) 15, 318-330）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（Varshney et al., Nat. Biotechnol., (2012) 30, 83-89）、およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（De Vega et al., Sci. Rep., (2015) 5）。選択したＮＩＮスキャフォールド（表２）とＮＩＮの上流８０ｋｂまでおよび下流１０ｋｂまでを、これらマメ科植物種のゲノムから抽出した。選択した配列は、ｍＶＩＳＴＡウェブベースのアラインメントツールを使用してカスタムアラインメントされた（http://genome.lbl.gov/vista/mvista; Frazer et al., Nucleic Acids Res., (2004) 32, 273-279）。選択されたアラインメントプログラムは、再配列を検出するシャッフル－ラガングローバルアラインメントプログラムであった（Brudno et al., Bioinformatics, (2003) 19, i54-i62）。このより大きなスケールのアラインメントとは別に、個々のアラインメントは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｐｌｕｇｉｎとしてＭＡＵＶＥを使用して行われ（Darling et al., Genome Res., (2004) 14, 1394-1403）、これは全ての種におけるＮＩＮ開始コドンと比較して保存された配列をより正確に決定することを可能にした。検出した保存領域の完全な概要を表２に見出すことができる。

【0096】

【表2】

ＣＥ領域のアラインメントおよび結合部位の予測：選択したスキャフォールドについてのＣＥ領域の検出された保存配列（表２）を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｐｌｕｇｉｎ（Katoh, Nucleic Acids Res., (2002) 30, 3059-3066）としてのＭＡＦＦＴｖ７．０１７を使用してアラインメントした。保存された結合部位を、ＰｌａｎｔＰＡＮ２．０（Chow et al., Nucleic Acids Res., (2016) 44, D1154-D1164）を用いて予測した。いくつかの部位を、予め公開された推定Ｂ型ＲＲ結合配列との相同性に基づいて手動で追加した（Heyl and Schmulling, Curr. Opin. Plant Biol., (2003) 6, 480-488; Hosoda et al., Plant Cell, (2002) 14, 2015-2029; Imamura et al., Plant Cell Physiol., (2003) 44, 122-131）。

【0097】

結果
感染および根粒形成が分離された新規Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ変異体の単離：Ｎｏｄ－変異体ＦＮ８１１３を、高速中性子照射変異誘発したＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ種子（Ｎｏｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＬＬＣ．、Ａｒｄｍｏｒｅ ＵＳＡ）から取得した植物集団のスクリーニングによって同定した。この変異体は、その表現型がＬ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ｄａｐｈｎｅ変異体の表現型と著しく類似していたことから、ｄａｐｈｎｅ様と名付けられた。図１Ｄおよび図１Ｅに示すように、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉを接種した３週間後に、ｄａｐｈｎｅ様は、ＷＴと比較して過剰な感染糸形成を示したが（図１Ａおよび１Ｂ）、根粒形成は、野生型と比較して強く損なわれていた。ｄａｐｈｎｅ様の根毛カーリング（図１Ｆ）は、捕捉された細菌がコロニーを形成し、感染糸が形成されたという点で、ＷＴの根毛カーリングに類似していた（図１Ｃ）。ＷＴ根およびｄａｐｈｎｅ様根における感染糸数を、接種の２週間後に定量した；これは、ｄａｐｈｎｅ様における感染糸数が、ＷＴにおける感染糸数よりも１０倍超多かったことを示した（図１Ｉ）。感染糸の大部分はｄａｐｈｎｅ様根毛で停止していた。しかし、根の長手方向断面は、いくつかの感染糸（矢印によって示される）が皮層細胞層に到達し得ることを示した（図１Ｇ）。図１Ｇはまた、いくつかの皮層細胞が、感染糸の周りで局所的に分裂することがあることを示すが（矢頭によって示される）、内根細胞層における細胞分裂は誘導されなかった。内根細胞層では、ＷＴ植物において根粒原基が開始される。

【0098】

Ｍｔ ＮＩＮの５ｋｂ上流領域は根毛カーリングおよび感染のための個別の調節性配列を含む：ｄａｐｈｎｅ様の表現型は、原基形成に必要なＮＩＮ調節性配列がその開始コドンの４１２０ｂｐよりも上流に位置することを示した。さらに、表現型は、この４１２０ｂｐ領域内に位置する調節性配列が適切な根毛カーリングおよび感染糸形成に十分であることを示した。これを確認するために、開始コドンの上流の５ｋｂ領域を使用して、ＮＩＮの発現を駆動した。ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する根の形質転換によって、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１（ヌル変異体）（Marsh et al., Plant Physiol., (2007) 144, 324-335）の根に導入した。接種後４週（４ｗｐｉ）に、分析した４４個のトランスジェニック根のうち４１個が過剰な感染糸形成を示した（図２Ｂ～２Ｄ）。多数の感染にもかかわらず、これらの根は、４個の根粒が観察された１つの根を除き、根粒を形成しなかった（図２Ｂ～２Ｄ）。感染したトランスジェニック根の長手方向断面から、内鞘、内皮、内側の皮層細胞層（inner cortical cell layers）において細胞分裂が誘導されないことが確認された（図２Ａ）。図２Ａはまた、感染糸は表皮において停止されたが、皮層に達することもあったことを示す。これらのデータは、５ｋｂプロモーター領域は感染糸形成に十分であるが、原基形成のための調節性配列を欠いていることを実証している。

【0099】

単一の推定ＣＹＣＬＯＰＳ／Ｍｔ ＩＰＤ３結合部位が開始コドンの約－３ｋｂ上流に位置することが以前に知られていた（図４Ａおよび５Ｄ、表２）（Singh et al., Cell Host Microbe, (2014) 15, 139-152）。従って、－２．２ｋｂ上流領域を用いてＮＩＮの発現を駆動するコンストラクト（ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮコンストラクト）を開発し、表皮におけるＮＩＮの機能が推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位に完全に依存するか否かを決定した（図５Ａ～５Ｃ）。次いで、このコンストラクトを、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する毛根形質転換を使用して、ｎｉｎ－１を形質転換することによって、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮコンストラクトおよび空ベクターと比較した。図２Ｈ～２Ｊに示すように、空ベクターで形質転換したｎｉｎ－１ヌル変異体は、過剰な根毛カーリングを有していた。しかし、感染糸および微小コロニーを形成することができなかった。ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮコンストラクトで形質転換された全ての３７本の分析された根は、細菌コロニーを捕捉する緊密な根毛カールを示した。しかし、感染糸はまれであった（図２Ｅ～２Ｇ）。ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮトランスジェニック根において、細菌コロニーを含む２９８本のカールした根毛を分析した。しかし、約３％のみが感染糸を有していた。これらのデータは、根毛のカーリングおよび感染チャンバの構築は、推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位に依存しないことを示す。対照的に、カールした根毛の約７０％が、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮトランスジェニック根（ｎ＝３２４）において感染糸を形成した。これらの結果は、－５ｋｂから－２．２ｋｂの領域が感染糸形成に重要な調節性配列を含むことを示した。観察された表現型は、Ｌ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓおよびＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｃｙｃｌｏｐｓ－３ｌｉｐｄ３－２変異体の表現型を思い出させた（Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (2008) 105, 20540-20545; Horvath et al., Mol. Plant-Microbe Interact., (2011) 24, 1345-1358）。Ｌ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓおよびＭ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｃｙｃｌｏｐｓ－３ｌｉｐｄ３－２変異体は、緊密にカールした根毛に細菌コロニーが形成される表現型を有するが、感染糸は形成されない。まとめると、これらの結果は、－２．２ｋｂ上流領域は、緊密な根毛カーリングをもたらす発現レベルで表皮においてＮＩＮの発現を活性化するのに十分であることを示す。この緊密なカーリングは、根粒菌がカールのポケットの内側にコロニーを形成することを可能にする。しかし、推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位がおそらく関与する、－５ｋｂ上流と－２．２ｋｂ上流との間に位置する追加の調節性配列が、効率的な感染糸形成に必要である。これを試験するために、推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位が欠失している－５ｋｂプロモーターによって駆動されるＮＩＮで形質転換されたｎｉｎ－１根（ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（ΔＣＹＣＬＯＰＳ）：ＮＩＮ）を試験した（図２Ｋ～２Ｍ）。推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位を欠失させることによって、感染糸を形成した微小ロコロニーを有するカールした根毛の数は、７０％から７％に低下した（ｎ＝４３４）。この結果は、ＮＩＮプロモーター内の推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位が、効率的な感染糸形成に必須であることを示した。

【0100】

推定サイトカイニン応答エレメントを有する保存領域は、Ｍｔ ＮＩＮコード領域の約１８ｋｂ上流に位置する：上述のように、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮで形質転換したｄａｐｈｎｅ様ならびにｎｉｎ－１は、感染糸形成を誘導することができたが、根粒原基形成を誘導することはできなかった。－５ｋｂ領域の上流に位置する遠隔調節性領域を同定するために、８種のマメ科植物種（Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、Ｌ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎおよびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）のＮＩＮコード領域の開始から最初の上流遺伝子に及ぶゲノムＤＮＡ配列を比較した。ＮＩＮ開始コドンのはるかに上流に、３つの保存領域（３Ｃ）を有するＤＮＡ配列を同定した（図３および４Ａ、表２）。Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａにおいて、３Ｃは、ＮＩＮ開始コドンの１５～２０ｋｂ上流に位置し、Ｌ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓにおいて、３Ｃは、４２～４９ｋｂ上流の間に位置していた（表２）。３Ｃの保存された部分において観察された類似性のレベルは、ＮＩＮコード領域において観察されたものと同様であった（図３）。３Ｃにおける第２の領域は、最も保存されており、約１０個の推定Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位を含んでいた（図３、４Ａ、および５Ａ～５Ｃ）（Sheen, Science, (2002) 296, 1650-1652; Heyl and Schmulling, Curr. Opin. Plant Biol., (2003) 6, 480-488; Hosoda et al., Plant Cell, (2002) 14, 2015-2029; Imamura et al., Plant Cell Physiol., (2003) 44, 122-131）。したがって、この領域をサイトカイニン応答エレメント含有（ＣＥ）領域と命名した。

【0101】

ＣＥ領域は、根粒器官形成に必要な調節性エレメントを含んでいる：（上流）－５ｋｂ領域は、感染に十分であることが見出されたので、３Ｃ領域（約４ｋｂ）が根粒原基形成のための調節性配列を含んでいるか否かを決定するために、３Ｃを（上流）－５ｋｂ領域に融合した（ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ）。ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮを、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する毛根形質転換によって、ｎｉｎ－１に導入した。図４Ｂに示すように、分析された２６個のトランスジェニック根のうち２１個は、１個の根当たり約８個の根粒を形成した。上記のように、ＣＥ領域（約１ｋｂ）は、いくつかの推定サイトカイニン応答エレメントを含むことが見出された。ＣＥ領域が原基形成を誘発するのに充分であったか否かを決定するために、ｎｉｎ－１を、ＮＩＮを駆動している－５ｋｂ領域に融合したＣＥ領域で形質転換した（ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ）。図４Ｂに示すように、３７個のトランスジェニック根のうち１８個が、１個の根当たり約８個の根粒を形成した。このデータは、ＣＥ領域が原基形成に必要な調節性配列を含むことを実証する。さらに、ルートを表現するＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮを発現している根上に形成された根粒の数は、空ベクター（対照）で形質転換された野生型の根の根粒の数と同様であった（図４Ｂ）。従って、上記データは、根粒形成の自己調節（ＡＯＮ：autoregulation of nodulation）メカニズムもまた活性化されることをさらに実証している（Soyano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (2014) 111, 14607-14612）。

【0102】

ピンク色の根粒は、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮまたはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮのいずれかで形質転換したｎｉｎ－１根上に形成された。図６Ａおよび６Ｃは、ピンク色の根粒がｎｉｎ－１のトランスジェニック根上に形成されたことを実証する。ピンク色の着色はレグヘモグロビンに由来し、窒素を活発に固定している根粒の特徴である。図６Ｂおよび６Ｄは、これらの同じ根粒の長手方向断面を示し、成長点（Ｍ）、感染ゾーン（ＩＦ）、および固定ゾーン（ＦＸ）を含む、正常な根粒帯状分布を示した。ＰｒｏｎｉｆＨ：ＧＦＰレポーターを保持しているＳ． ｍｅｌｉｌｏｔｉを接種することによって、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮトランスジェニックｎｉｎ－１根上に誘導された根粒は、ｎｉｆＨが固定ゾーンにおいて発現されることを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。従って、－５ｋｂ領域と組み合わせたＣＥは、野生型様の根粒器官形成を誘導するのに十分であった。

【0103】

２．４９Ｍｂｐの挿入を含むｄａｐｈｎｅ様ＣＥ領域は、ＮＩＮの正確な発現に寄与することができず、さらに、サイトカイニン応答性ＣＥ領域の重要性を示した：ピンク色の根粒は、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換したｄａｐｈｎｅ様根上に形成された（図６Ｅ）。接種後４週で分析した１７個のトランスジェニック根の内の１５個が、１個の根当たり平均して約７つの根粒を形成し、ｄａｐｈｎｅ様バックグラウンドにおける過剰な感染表現型は、これら１７個のトランスジェニック根のうちの１１個においてレスキューされた。図６Ｆは、これらの同じ根粒の長手方向断面を示し、成長点（Ｍ）、感染ゾーン（ＩＦ）、および固定ゾーン（ＦＸ）を含む正常な根粒帯状分布を示した。この結果は、ｄａｐｈｎｅ様表現型が、ＣＥ領域の機能を妨げる２．４９Ｍｂｐの挿入によって引き起こされたようようであることを示した。従って、ＣＥ領域がｄａｐｈｎｅ様における根粒器官形成を補完するのに十分であるか否かを試験した。これを行うために、ＣＥ領域に融合した最小ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（－４６ｂｐ）（Benfey and Chua, Science, (1990), 250:959-966）（ＰｒｏＮＩＮＣＥ－３５Ｓｍｉｎ：ＮＩＮ）を使用して、ｄａｐｈｎｅ様根を形質転換した。図６Ｇはピンク色の根粒がトランスジェニック根上に形成されたことを実証した。一方、図６Ｈはこれらの同じ根粒の長手方向断面を示し、正常な根粒帯状分布を示した。４５個のトランスジェニックｄａｐｈｎｅ様根の内３７個は、接種後４週間で１個の根当たり平均で４個の根粒を形成した。これは、ＣＥ領域が根粒器官形成を誘導するのに十分であるが、－５ｋｂ領域との組合せにおいて、より多くの根粒（１個の根当たり約７個）を形成することができたことを示した。結節形成能は、ＮＩＮの発現を駆動するＣＥ領域によってｄａｐｈｎｅ様においてレスキューされ得たことから、ｄａｐｈｎｅ様におけるＣＥ領域は、ＮＩＮの発現を制御することができず、さらにサイトカイニンによって誘導され得ない可能性が高いと考えられた。そこで、野生型（Ｊｅｍｉｎｇａｌｄ Ａ１７）およびｄａｐｈｎｅ様におけるサイトカイニンと水（対照として）とによるＮＩＮの発現の誘導を比較した。対照と比較して、１０－７Ｍベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）適用の１６時間後に、野生型において、ＮＩＮの発現レベルは３７倍増加し、ＮＦ－ＹＡ１発現レベルは１１６倍増加した。一方、ｄａｐｈｎｅ様において、ＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現レベルは変化しなかった（図８Ａ～図８Ｂ）。これは、ＣＥ領域がサイトカイニンによるＮＩＮの発現の誘導に必要であること、およびｄａｐｈｎｅ様のＣＥ領域がＮＩＮの正確な発現に寄与し得なかったことを示した。

【0104】

６つの推定サイトカイニン応答エレメントを有するドメインは、根粒原基形成に必須である：サイトカイニンが根粒原基形成の正の調節因子であることが知られていた（Suzaki et al., Front. Plant Sci., (2013) 4, 1-6）。そこで、ＣＥ領域内の推定サイトカイニン応答エレメントが原基形成に必須であるか否かを決定する実験を行った。この目的のために、ＣＥ領域においていくつかの欠失を作り出した。ＣＥ領域は４７２ｂｐ領域を含み、これは８つの研究されたマメ科植物種すべてにおいて高度に保存されている（図３、図４Ａ、および図５Ａ～５Ｃ）。４７２ｂｐ領域を、ドメイン１～３（Ｄ１～Ｄ３）の３つの部分に分けた。Ｄ１およびＤ３はそれぞれ、６つおよび３つの推定サイトカイニン応答要素を含むことが見出された。一方で、Ｄ２は、推定ＡＰ２結合部位および単一のサイトカイニン応答エレメントを含んでいた（図４Ａおよび図５Ａ～５Ｃ）。ＥＲＮ（根粒形成に必要なエチレン応答因子（Ethylene response factor Required for Nodulation））を含むＡＰ２ファミリーの転写因子は、根粒形成の調節に関与する（Andriankaja et al., Plant Cell, (2007) 19, 2866-2885; Middleton et al., Plant Cell Online, (2007) 19, 1221-1234; Wang et al., Plant Cell, (2014) 26, 4782-4801）。それらのそれぞれの根粒原基形成に対する寄与を調べるために、Ｄ１、Ｄ２またはＤ３を１ｋｂ ＣＥ領域から別々に欠失させ（図４Ａおよび図５Ａ～５Ｃ）、これらの修飾ＣＥ領域を－５ｋｂ領域に融合させてＮＩＮの発現を駆動した。３つのコンストラクトをＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する根の形質転換によって、ｎｉｎ－１に導入した。図４Ｂおよび図９Ａに示されるとおり、Ｄ１の欠失は根粒を形成する能力を取り除いた。一方、Ｄ２の欠失は根粒形成に対して有意な効果を有さなかった（図４Ｂおよび図９Ｂ）。Ｄ３の欠失は根粒を有する根の相対的な数の４９％から２１％への減少を引き起こし、また、１個の根当たりの平均根粒数を８個から５．４個に減少させた（図４Ｂおよび図９Ｃ）。これらの結果は、Ｄ１における少なくとも調節性配列が、ＮＩＮが制御する根粒原基形成に必須であることを示した。さらに、上記データは、Ｄ１内の推定サイトカイニン応答エレメントが、ＮＩＮが制御する根粒原基形成の原因であることを示した。対照的に、Ｄ２における推定ＡＰ２結合部位は、根粒器官形成に必須ではなかった。

【0105】

ＮＩＮの発現は、細胞自律的ではない（non-cell-autonomous）方法で内根細胞層において誘導される：Ｍｔ ＮＩＮの２．２ｋｂ上流領域は、Ｎｏｄ因子適用の２４時間後に表皮において活性化されることが知られていた（Vernie et al., Plant Cell, (2015) 27, 3410-3424）。しかし、このプロモーター領域は、根粒器官形成に必要であることが示されている調節性配列を欠いていた（上述参照）。したがって、原基形成の間の内根細胞層におけるＮＩＮの発現を、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって評価した。内鞘細胞が分裂し、且ついくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）において起こった始原的段階（図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて使用した段階）を使用して分析を行った。。皮層細胞がより広範囲に分裂したわずかに遅い段階（図１０Ｃおよび図１０Ｄにおいて使用した段階）においても分析を行った。どちらの段階においても、感染糸はまだ原基に到達していなかった。図１０Ａに示すように、より若い段階では、ＮＩＮ ｍＲＮＡは、内鞘および表皮において生じたが、分裂した皮層細胞においてはほとんど検出できなかった。最も高い発現レベルは、内鞘由来細胞において生じた。図１０Ｃに示すように、皮層細胞がより広範囲に分裂していたより古い段階では、皮層由来細胞におけるＮＩＮの発現レベルは、内鞘におけるＮＩＮの発現レベルと同様であった。上記データは、ＮＩＮの発現が内鞘において最初に強く誘導され、次いで、他の内部細胞層に広がったことを示す。

【0106】

ＮＦ－ＹＡ１は、ＮＩＮの直接の標的である（Soyano et al., PLos Genet. (2013) 9）。ＮＩＮと同様に、ＮＦ－ＹＡ１は表皮において発現しており、ここで根粒菌感染を制御する（Laporte et al., J. Exp. Bot., (2014) 65, 481-494）。ＮＩＮはまた原基におけるＮＦ－ＹＡ１発現を制御するか否かを試験するために、プローブとしてＮＦ－ＹＡ１を用いて、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ＮＦ－ＹＡ１がペイサイクルにおいて最初に誘導されたので、結果は、ＮＦ－ＹＡ１およびＮＩＮが同様の発現を有することを実証した（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。これらの類似した発現パターンは、ＮＦ－ＹＡ１が内鞘および他の根粒原基細胞においてＮＩＮによって調節されている可能性を示している。さらに、結果は、表皮に存在する根粒菌は、内鞘由来細胞においてＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現を誘導することを示す。

【0107】

ＣＥ領域は、内鞘におけるＮＩＮ表現の誘導のために必要である：内部細胞層におけるＮＩＮ表現にＣＥ領域が必要であるか否かを決定するために、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳおよびＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳの表現パターンを比較した。初めに、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳおよびＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳの両方を、Ａ１７ ＷＴ Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａに導入した。内鞘細胞が分裂し、且つ内側の皮層細胞層においていくつかの垂層分裂が起こった原基発達の初期段階に分析を行った。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるとおり、両方のコンストラクトは、表皮、内鞘、および内皮において発現された。一方、より低いシグナルがいくつかの皮層細胞において検出された。これは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮがｎｉｎ－１バックグラウンドにおける原基形成には十分ではないことが示されたため、予期しない結果となった。結果は、内部細胞層におけるＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳの発現がＷＴバックグラウンドで産生された内因性ＮＩＮによって誘導されたことを示す。結果はさらに、内層におけるＮＩＮの発現が、ＮＩＮ自体を含む正のフィードバックループによって調節されること、およびこのために必要な必須のシス調節エレメントは－５ｋｂプロモーター領域に位置していたことを示す。

【0108】

上記を確認するために、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳおよびＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳを、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換によってｄａｐｈｎｅ様に導入した。ｄａｐｈｎｅ様において、感染糸が形成され、ＮＩＮが表皮に誘導され、且つ移動性シグナル（mobile signal）の産生は影響を受けないことを示した。しかし、根粒原基形成が損なわれ、内部細胞層においてＮＩＮ生産がないことを示した。実際、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳトランスジェニック根は、表皮および外皮層においてのみＧＵＳ発現を示した（図１１Ｃ）。一方、内鞘細胞において発現は観察されなかった。対照的に、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳトランスジェニック根は、表皮、外皮層および内鞘においてＧＵＳの発現を示した（図１１Ｄ）。さらに、ｄａｐｈｎｅ様の内鞘におけるＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳの発現は弱く、これは、それ自身の発現を正に調節するフィードバックループにおけるＮＩＮの関与と一致する。この場合、ＮＩＮがないため、細胞分裂は内鞘において誘導されなかった。ＣＥ領域が内鞘におけるＮＩＮの発現に必要であることをさらに実証するために、根粒菌を接種した２日後（ｄｐｉ）に、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、ｄａｐｈｎｅ様原基におけるＮＩＮの発現を調べた（図１０Ｅ）。これは、ＷＴ（図１０Ａ）とは異なり、ＮＩＮは表皮および外皮層において発現したが、内鞘においては発現しなかったことを示した（図１０Ｅ）。この結果は、ＣＥ領域が内鞘におけるＮＩＮの発現に必要であることを示した。まとめると、結果は、内鞘におけるＣＥが制御するＮＩＮの発現は、ＷＴ根における細胞分裂に先行することを実証する。これらの結果は、ＣＥ領域が内鞘におけるＮＩＮの発現の初期誘導に必要であることを示す。

【0109】

内鞘におけるＮＩＮの誘導は、表皮におけるＮＩＮの発現に依存する：上記の結果は、表皮におけるＮｏｄ因子シグナル伝達によって生成された移動性シグナルが内鞘におけるＮＩＮの発現を誘導することを示した。この場合、内鞘におけるＮＩＮの発現は、表皮におけるＮＩＮ誘導に依存するのであろう。これを試験するために、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳおよびＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳを、毛根形質転換によってｎｉｎ‐１に導入した。両方の場合において、ＧＵＳは表皮および外皮層にのみ提示されたが、接種後３週間の内鞘には提示されなかった（図１１Ｅおよび図１１Ｆ）。従って、上記データは、ＮＩＮが内鞘細胞におけるＮＩＮの発現を誘導するために表皮において必要であったことを示唆する。

【0110】

ＣＲＥ１とＲＲ１は、接種されていない根の内鞘において発現する：ＣＥ領域における複数のＢ型ＲＲ応答調節性エレメントの発生は、サイトカイニンシグナル伝達機構が内鞘におけるＮＩＮ転写活性化に重要であることを示した。このことが事実であるか否かを決定するために、サイトカイニン受容体ＣＲＥ１の発現パターンと、その推定標的であるＢ型応答制御因子（RESPONSE REGULATOR）ＲＲ１とを評価した。ＲＲ１は、根粒形成の間に発現する（Gonzalez-Rizzo et al., Plant Cell Online, (2006) 18, 2680-2693）。ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、ＣＲＥ１は接種されていない根の内鞘細胞および脈管細胞において活発に転写されるが、内皮細胞または皮層細胞においては転写されないことを見出した（図１２Ａ）。また、Ｂ型ＲＲ１のｍＲＮＡは、内鞘において最も高いレベルで存在し、根の脈管細胞においてより低い程度で存在した（図１２Ｂ）。したがって、ＣＲＥ１およびＲＲ１の両方は、根粒菌のシグナル伝達が開始する前に、内鞘において既に発現しており、まず内鞘層のみがサイトカイニンに応答することを示した。

【0111】

要約：上に示したデータは、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの根粒器官形成につながるＮＩＮの発現の調節のために遠隔上流調節性領域（ＣＥ）が必要であることを示している。データはさらに、感染プロセスのための調節性配列は、開始コドンのすぐ上流５ｋｂ領域内に位置することを示している。ＣＥ領域は数個のサイトカイニン応答エレメントを含み、６つのサイトカイニン応答エレメントを含むドメイン１（Ｄ１）は根粒原基形成に必須である。ＣＥ機能を破壊する挿入を有するｄａｐｈｎｅ様変異体は、この能力を失うことから、ＣＥ領域は、サイトカイニンによって誘導されるＮＩＮの発現にとってさらに重要である。根粒原基形成は、内鞘におけるＮＩＮの誘導で始まり、その後皮層細胞にまで及ぶ。さらに、上記データは、サイトカイニン結合遺伝子ＣＲＥ１およびＲＲ１が内鞘において発現することを実証する。まとめると、結果は、サイトカイニンを知覚することが原基形成開始時のＮＩＮの誘導に関与することを示す。

【0112】

感染プロセスの間に、ＮＩＮは、適切なカールが形成されると根毛の成長が停止するメカニズムに関与している。このプロセスに必要な調節性配列は、－２．２ｋｂプロモーター領域内に位置しており、この領域は推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位を欠いている。したがって、上記データは、ＣＹＣＬＯＰＳ（Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａにおけるＩＰＤ３）に加えて、別の転写因子が表皮におけるＮＩＮの発現の調節に関与することを示す。さらに、－２．２ｋｂ領域の誘導された発現が効率的な感染糸形成に十分でないと仮定すると、表皮におけるＮＩＮの発現レベルが感染糸形成に必要とされる閾値レベル未満のままであるのに対して、ＮＩＮの発現の閾値レベルは、推定ＣＹＣＬＯＰＳ結合部位を含む－５ｋｂプロモーター領域の誘導された発現によって到達され得ることを、上記データは示す（図１３）。

【0113】

根粒原基開始の間のＮＩＮの機能に関するモデルを図１３に示す。Ｎｏｄ因子の知覚後、ＮＩＮは表皮において急速に誘導される。ＮＩＮプロモーターの－５ｋｂ調節性領域は緊密な根のカーリングおよび感染糸形成の両方に十分であるが、－２．２ｋｂ領域によって駆動される発現は緊密な根のカーリングおよびカール内部の細菌コロニーの形成にのみ十分である。移動性シグナルはＮＩＮ依存的な様式で表皮において生成され、そしてそれは内鞘に移動し、そこで、移動性シグナルは内根細胞層におけるサイトカイニンの蓄積を引き起こす。内鞘におけるＣＲＥ１受容体は、サイトカイニンを知覚し、Ｂ型ＲＲ１を活性化し、さらにＮＩＮの発現を活性化する。内鞘におけるＮＩＮの誘導は、ＣＥ領域の存在を必要とし、ＮＩＮ自体を含む正のフィードバックループを含む。内鞘におけるＮＩＮの誘発はＮＩＮ自身を含むポ正のフィードバックループを含むとの結論は、Ｍ． ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ野生型バックグラウンドにおけるＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳの発現は根粒原基において誘発されるが、このプロモーター領域は原基形成を引き起こすには十分ではないという知見によって支持される。この結果は、原基形成を引き起こさないＮＩＮのプロモーター領域が原基におけるＧＵＳの発現を駆動するのに十分であるというＬ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓにおける研究と類似している（Yoro et al., Plant Physiol., (2014) 165, 747-758; Heckmann et al., Mol. Plant-Microbe Interact, (2011) 24, 1385-1395; Kosuta et al., Plant J., (2011) 67, 929-940）。ＮＩＮは次に、ＮＦ－ＹＡ１の発現を直接活性化し、さらに細胞分裂を刺激する。このデータは、内鞘におけるＮＩＮの誘導が内鞘細胞の有糸分裂活性化に先行することを示す。その後、内鞘におけるＮＩＮが誘発する反応は、内皮および内鞘細胞において、細胞分裂とＮＩＮの発現とに寄与する。

【0114】

根粒原基形成には内根層におけるＮＩＮの発現の誘導が必要であるという結論は、内皮および皮層において活性な異種のシロイヌナズナエンハンサーによって駆動されるＮＩＮによって、Ｌ． ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ｄａｐｈｎｅ変異体において根粒器官形成が回復するという観察結果と一致する（Yoro et al., Plany Physiol., (2014) 165, 747-758）。上記の結果は、６つのサイトカイニン応答エレメントを含むＣＥ内の領域の欠失が原基形成を阻止することを実証する。これは、内鞘におけるサイトカイニンシグナル伝達がＮＩＮの発現を誘導することを示す。これは、根粒菌のシグナル伝達が開始される前の内鞘におけるサイトカイニン受容体（ＣＲＥ１）およびＢ型応答レギュレーター（ＲＲ１）の発現によってさらに支持される。これらの知見は、ＧＵＳ発現を駆動するＣＲＥ１プロモーター領域が原生木部極（protoxylem poles）（Boivin et al., Plant Cell Environ., (2016) 39, 2198-2209）（根粒原基が形成される部位）の反対側の内皮／内鞘細胞において特異的に発現されることを示す以前の研究と一致する（Heidstra et al., Development, (1997) 124, 1781-1787）。さらに、この能力を失ったｄａｐｈｎｅ様変異体によって、サイトカイニン誘導性のＮＩＮの発現に対するＣＥ領域の重要性が示唆された。

【0115】

ＣＥ領域は、検討した８種のマメ科植物種において保存されている。これらはマメ科のマメ亜科（Papilionoideae）サブファミリーの異なる分岐群に属し、Ｇｅｎｉｓｔｏｉｄｓ、ＩＲＬＣ、Ｒｏｂｉｎｉｏｉｄｓ、ＭｉｌｌｅｔｉｏｉｄｓおよびＤａｌｂｅｒｇｉｏｉｄｓ分岐群を代表する。したがって、上記データは、サイトカイニンによるＮＩＮの発現の調節がこのサブファミリーにおいて保存されていることを示す。

【0116】

上記の結果は、内鞘におけるＮＩＮの誘導後に、その発現が内皮および内皮層に拡大することを示す。皮層細胞が垂層分裂した若い根粒原基（図１０Ａおよび図１０Ｂ）において、ＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現は内鞘において最も高く、分裂した皮層細胞および内皮細胞においてほとんど検出できない。上記結果は、内鞘におけるＮＩＮ誘導性の応答が内皮および皮層細胞における細胞分裂に寄与することを示す（図１３）。発生の後期段階において、ＮＩＮは、分裂する皮層細胞において発現される（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。

【0117】

根粒原基における細胞分裂は、最初の細胞分裂の前に生じるオーキシンの蓄積と相関する（Mathesius et al., Plant J., (1998) 14, 23-34; Suzaki et al., Development, (2012) 4006, 3997-4006）。オーキシンの蓄積（ＤＲ５発現）は、それがｎｉｎヌル変異体では起こらないので、ＮＩＮに依存する（Suzaki et al., Development, (2012) 4006, 3997-4006）。さらに、ＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の両方の異所性発現は、側根発生の間に異常な細胞分裂を誘導するのに十分であり（Soyano et al., PLos Genet. (2013) 9）、これは、それらの発現がオーキシンの局所蓄積を引き起こすことを示す。上記データは、内鞘におけるサイトカイニンシグナル伝達がＮＩＮの発現を誘発し、オーキシンの局所蓄積を導き、続いて有糸分裂活性を誘発することを示す（図１３）。この結論は、ＳＴＹ遺伝子がＮＦ－ＹＡ１の標的であることを示す以前の研究によって支持される（Hossain et al., Mpmi, (2016) 29, 950-964）。ＳＴＹ遺伝子は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＹＵＣＣＡオーキシン生合成遺伝子を調節することが示されている転写因子をコードする（Eklund et al., Plant Cell, (2010) 22, 349-363; Eklund et al., Development, (2010) 137, 1275-1284; Sohlberg et al., Plant J., (2006) 47, 112-123）。

【図面の簡単な説明】

【0118】

【図1A】図１Ａ～１Ｉは、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様（ＦＮ８１１３）変異体根の表現型およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（根粒菌）ＲＣＲ２０１１．ｐＨＣ６０株を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７野生型（ＷＴ）根の表現型を示す。図１Ａは、Ａ１７ ＷＴ根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す。

【図1B】図１Ｂは、Ａ１７ ＷＴ根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す。

【図1C】図１Ｃおよび図１Ｆは、接種後７日（ｄｐｉ）のＷＴ（図１Ｃ；スケールバー １０μｍ）およびヨウ化プロピジウムを用いて染色したｄａｐｈｎｅ様変異体根（図１Ｆ；スケールバー １０μｍ）の共焦点画像を示し、細菌コロニー（矢頭）および感染糸（矢印）がｄａｐｈｎｅ様変異根およびＷＴ根において同等であることを示す。

【図1D】図１Ｄは、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す。

【図1E】図１Ｅは、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（スケールバー ２ｍｍ）における感染糸のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す。図１Ａ～１Ｂと図１Ｄ～１Ｅとの比較は、ｄａｐｈｎｅ様変異体根（図１Ｄ～１Ｅ）がＷＴ（図１Ａ～１Ｂ）と比較して過剰な数の感染糸を有することを示す。

【図1F】図１Ｃおよび図１Ｆは、接種後７日（ｄｐｉ）のＷＴ（図１Ｃ；スケールバー １０μｍ）およびヨウ化プロピジウムを用いて染色したｄａｐｈｎｅ様変異体根（図１Ｆ；スケールバー １０μｍ）の共焦点画像を示し、細菌コロニー（矢頭）および感染糸（矢印）がｄａｐｈｎｅ様変異根およびＷＴ根において同等であることを示す。

【図1G】図１Ｇは、トルイジンブルーを用いて染色した接種後３週（ｗｐｉ）のｄａｐｈｎｅ様変異体根の縦断面図を示し、感染糸（矢印）が皮層細胞層に到達できることがあり、いくらか細胞分裂が誘導されることを示している（矢頭）（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；矢印は感染糸を示す；矢頭は細胞分裂を示す）。

【図1H】図１Ｈは、ＮＩＮ遺伝子（太い灰色の矢印）開始コドン（細い黒い矢印上の「ＡＴＧ」）の４１２０ｂｐ上流に２．４９ＭＢの第２染色体挿入部分（矢印の間に示される側面配列は、配列番号６３３および配列番号６３４である）を有する、ｄａｐｈｎｅ様変異体におけるＮＩＮ遺伝子座の配置図を示す。第５染色体配列は、左から右へ、配列番号６３２、配列番号６３５、および配列番号６３６である。図１Ａ～１Ｇに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図1I】図１Ｉは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した接種後１４日（ｄｐｉ）の根における、共焦点画像からのデータの平均±ＳＤを示す（これらの根の代表的な画像を図１Ｃおよび１Ｆに示す）。

【図2A】図２Ａ～２Ｍは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮ、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮ、またはコンストラクトＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス（cyclops））：ＮＩＮを導入することによって、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根における感染過程の部分的な補完を示す。図２Ａは、トルイジンブルーを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換されたｎｉｎ－１変異体根の縦断面を示し、皮層細胞層に到達することができる感染糸（矢印）を示す（スケールバー ５０μｍ；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；矢印は感染糸を示す）。

【図2B】図２Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、過剰な感染糸形成（スケールバー ２ｍｍ）を表す。

【図2C】図２Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、過剰な感染糸形成（スケールバー ２ｍｍ）を表す。

【図2D】図２Ｄは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＮＩＮ根を用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛（スケールバー １０μｍ）中で開始された感染糸形成（長い白線）を表す。

【図2E】図２Ｅは、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛（スケールバー ２ｍｍ）を表す。

【図2F】図２Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換されたｎｉｎ－１根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛（スケールバー ２ｍｍ）を表す。

【図2G】図２Ｇは、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した、ＰｒｏＮＩＮ_{２．２ｋｂ}：ＮＩＮ根を用いて形状質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛の内側の細菌カールコロニー（緻密な白色形状）を表すが、感染糸の形成は示さない（スケールバー １０μｍ）。

【図2H】図２Ｈは、空のベクターを用いて形質転換した、感染糸を有さないｎｉｎ－１変異体根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示す（スケールバー ２ｍｍ）。

【図2I】図２Ｉは、空のベクターを用いて形質転換した、感染糸を有さないｎｉｎ－１変異体根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示す（スケールバー ２ｍｍ）。

【図2J】図２Ｊは、ヨウ化プロピジウムで染色した、空ベクターを用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、細菌コロニーのない過剰な根毛のカールを表す（スケールバー １０μｍ）。

【図2K】図２Ｋは、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス）：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１根のステレオ透過光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛を表す（スケールバー ２ｍｍ）。

【図2L】図２Ｌは、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス）：ＮＩＮを用いて形質転換したｎｉｎ－１根のステレオ蛍光マクロスコープ画像を示し、多数のカールした根毛を表す（スケールバー ２ｍｍ）。

【図2M】図２Ｍは、ヨウ化プロピジウムで染色した、ＰｒｏＮＩＮ５ｋｂ（Δシクロプス（cyclops））：ＮＩＮ根を用いて形質転換したｎｉｎ－１変異体根の共焦点画像を示し、カールした根毛の内側に細菌カールコロニー（緻密な白色形状）を表すが、感染糸形成は示さない（スケールバー １０μｍ）。図２Ａ～２Ｍは、ＧＦＰを恒常的に発現するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１．ｐＨＣ６０を４ｗｐｉ接種で収集した根の画像を示す。図２Ａ～２Ｍに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図3】図３は、８種のマメ科植物種由来の、ＮＩＮ遺伝子開始コドンから２ｋｂ下流、およびＮＩＮ ５’上流領域を含むゲノムＤＮＡ配列のｍＶＩＳＴＡアラインメントを示す。ｘ軸は、ＫｂにおけるＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮ開始コドンからの距離（右から左に走る）を提供し、一方、ｙ軸は、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ配列に対する保存レベルの割合（各マメ科植物種について、下から上に走る）を提供する。ピークは、５０％～１００％の比率でのＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａとの配列同一性のレベルを示し、５０％未満の同一性は記録しなかった。ＮＩＮ開始コドンから２ｋｂ下流の配列を、「ＡＴＧ」と表示された細い黒矢印の右側に描き、５’非コード上流ＤＮＡ配列を、細い黒矢印の左側に描く。２つの濃い灰色の長方形は３つの保存領域（３Ｃ領域；左）および－５ｋｂプロモーター領域（右）の位置を示し、灰色の垂直矢印は、－５ｋｂプロモーター領域内のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の位置を示す。

【図4A】図４Ａおよび図４Ｂは、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＮＩＮ ５’上流領域におけるエレメントの概略図の代表を示し、実験は、サイトカイニン応答エレメント包含（ＣＥ）領域が根粒器官形成に必須であることをを証明する結果となる。図４Ａは、ＮＩＮコード配列開始部位の－１５Ｋｂ～－２０Ｋｂ上流に位置するボックスとしてＮＩＮ ５’上流領域に存在する３Ｃ領域を示す（ＮＩＮ遺伝子＝太い灰色の矢印；開始コドン＝細い黒い矢印上の「ＡＴＧ」）。３Ｃ領域の中央領域は、１Ｋｂ ＣＥ領域であり、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と名付けられた３つの部分またはドメインに分割される４７２ｂｐの保存領域を含む（灰色のボックスで示す）。図４Ａはまた、ｄａｐｈｎｅ様変異体における挿入の位置およびＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の位置を示し、ＮＩＮコード配列開始部位の－２．２Ｋｂと－５Ｋｂ上流の間に位置する標識矢印として示されている。

【図4B】図４Ｂは、空のベクターを用いて形質転換したＡ１７ ＷＴ Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ根（一番上のバー）と、空のベクターまたはＮＩＮ ５’上流領域の異なる部分によって駆動されるＮＩＮ遺伝子を保有するコンストラクトを用いて形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根と、に形成された根粒の数を示す（下部６つのバー；各バーは使用された特異的コンストラクトで標識される）。試験したすべての根に対する根粒形成根の比率（「根粒形成根／トランスジェニック根」と標識した矢印で示す）をグラフの左側に提供する。グラフは、根粒形成根当りの根粒の数を示し、データは平均±ＳＤであり、根粒の数を、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ２０１１．ｐＨＣ６０株を用いて４ｗｐｉで計数した。

【図5A】図５Ａ～５Ｄは、サイトカイニン応答エレメント包含（ＣＥ）領域（より大きな３Ｃ領域の第２領域または中間領域に対応する）および８つのマメ科植物種のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位の保存された部分のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。図５Ａ～５Ｃは、８つのマメ科植物種；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号６６３）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（配列番号６６４）、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号６６５）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（配列番号６６６）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（配列番号６６７）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（配列番号６６８）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（配列番号６６９）、およびＡｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（配列番号６７０）のＣＥ領域の保存された部分（すなわち、隣接領域なし）のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。ＣＥ領域の保存された部分は、約１０の推定Ｂ型サイトカイニンシグナル伝達応答レギュレーター（ＲＲ）結合部位（配列番号６１３、太字）、および１つのＡＰ２結合エレメント（配列番号６３１、図５Ｂの黒いボックスで囲まれている）を含む。ＣＥ領域の保存された部分は、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と名付けられた３つのドメインに分割され、その範囲および境界は、アラインメントの下の黒い矢印およびアラインメントを通る垂直な黒い線によって示される。図５Ａは、ドメインＤ１の全ておよびドメインＤ２の一部を含む、ＣＥ領域の保存された部分の５’部分のアラインメントを示す。

【図5B】図５Ｂは、ドメインＤ２の一部およびドメインＤ３の一部を含む、ＣＥ領域の保存された部分の中心部分のアラインメントを示す。

【図5C】図５Ｃは、ドメインＤ３の一部を含むＣＥ領域の保存された部分の３’部分のアラインメントを示す。

【図5D】図５Ｄは、８つのマメ科植物種；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号６７１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（配列番号６７２）、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号６７３）、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（配列番号６７４）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（配列番号６７５）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（配列番号６７６）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（配列番号６７７）、およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（配列番号６７８）のＣＹＣＬＯＰＳ結合部位のＭＡＦＦＴアラインメントを示す。破線で囲んだ２つのボックスは、ＣＹＣ－ボックスといわれる、ＣＹＣＬＯＰＳ応答エレメント（ＣＹＣＬＯＰＳ応答シスエレメントまたはＣＹＣ－ＲＥともいわれる）内にある、アラインメントの上方に黒い矢印で表されている必須シスエレメントの回文配列を示す。

【図6A】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6B】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6C】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6D】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6E】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6F】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6G】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図6H】図６Ａ～６Ｈは、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが媒介する形質転換（３５ｍｉｎ＝最小ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いて、コンストラクトＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮ、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮを導入することによる、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１およびｄａｐｈｎｅ様変異体根の根粒形成しない表現型の補完を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ａ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｃ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｎｉｎ－１のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｅおよび図６Ｇは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｅ；スケールバー ２ｍｍ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｇ；スケールバー ２ｍｍ）に、ｄａｐｈｎｅ様のトランスジェニック根に根粒が形成されることを示す。カラーの画像中の根粒は、ピンク色として見ることができ、これは根粒が窒素を積極的に固定していることを示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_{３Ｃ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｂ；スケールバー ２００μ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｄ；スケールバー ２００μ）の、トルイジンブルーで染色されたｎｉｎ－１のトランスジェニック根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒分布を有する。図６Ｆおよび図６Ｈは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｆ；スケールバー ２００μＭ）、またはＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－３５Ｓｍｉｎ}：ＮＩＮで形質転換された場合（図６Ｈ；スケールバー ２００μＭ）の、トルイジンブルーで染色されたｄａｐｈｎｅ様の形質転換根に形成された根粒の縦断面を示しており、これらは、分裂組織（Ｍ）、感染区域（ＩＦ）、および固定区域（ＦＸ）を含む通常の根粒帯状分布を有する。図６Ａ～６Ｈにおいて、構成的に発現されたＧＦＰを含有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１株を接種材料として使用し、根粒を４ｗｐｉで収集した。図６Ａ～６Ｈは、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図7A】図７Ａおよび図７Ｂは、ＰｒｏｎｉｆＨ：ＧＦＰレポーターを有するＳ．ｍｅｌｉｌｏｔｉを接種した場合に、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＮＩＮトランスジェニックｎｉｎ－１根の根粒において、ｎｉｆＨ発現が誘導されることを示す。図７Ａは、４ｗｐｉトランスジェニック根粒の共焦点画像を示し、これは、固定区域（ＦＸ）において、ｎｉｆＨ（明るい灰色）のスイッチが入ることを示す（ＩＦ＝感染区域；スケールバー ２００μｍ）。

【図7B】図７Ｂは、固定区域においてスイッチが入ったｎｉｆＨを示す、図７Ａの拡大画像を示す（Ｓ＝共生；スケールバー ５０μｍ）。図７Ａ～７Ｂに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図8A】図８Ａ～８Ｂは、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様における水の対照（water control）と比較して、サイトカイニン誘導に応答した相対的なＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。図８Ａは、サイトカイニン誘導のための１０－７Ｍベンジルアミノプリン（ＢＡＰ；標識「１０^－７ ＢＡＰ」によって示される）または対照として水（標識「Ｈ_２Ｏ」によって示される）を１６時間適用した後の、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様におけるＮＩＮの相対発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。

【図8B】図８Ｂは、サイトカイニン誘導のための１０－７Ｍ ＢＡＰまたは対照としての水を１６時間適用した後の、Ａ１７ ＷＴおよびｄａｐｈｎｅ様におけるＮＦ－ＹＡ１の相対発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析を示す。図８Ａ～８Ｂは、ＳＥＭを表示するエラーバーを用いて３つの生物学的レプリケートの平均を示す。

【図9A】図９Ａ～９Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ１／Ｄ２／Ｄ３）－５ｋｂ}：ＮＩＮコンストラクトを用いて形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根の表現型を示す。図９Ａは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ１）－５ｋｂ}：ＮＩＮで形質転換された、接種されたｎｉｎ－１根の縦断面を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；感染糸を矢印で示す）。

【図9B】図９Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ２）－５ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換した、接種されたｎｉｎ－１根の縦断面を示す（ＩＦ＝感染区域；ＦＸ＝固定区域；Ｍ＝分裂組織；スケールバー ２００μＭ）。

【図9C】図９Ｃは、ＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ（ΔＤ３）－５ｋｂ}：ＮＩＮを用いて形質転換した、ｎｉｎ－１の根粒の断面を示す（ＩＦ＝感染区域；ＦＸ＝固定区域；スケールバー ２００μｍ）。図９Ａ～９Ｃの断面は、トルイジンブルーを用いて染色する。図９Ａ～９Ｃに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図10C】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図10D】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図10E】図１０Ａ～１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根粒原基およびｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮおよびＮＦ－ＹＡ１の発現傾向を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、内鞘細胞が分裂し、いくつかの垂層分裂が内側の皮層細胞層（Ｃ４およびＣ５）で起こった、根粒原基発生の段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ａ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｂ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｃ～１０Ｄは、皮層細胞がより広範囲に分裂した場合の、根粒原基発生の後期段階におけるＡ１７根粒原基のＮＩＮ（図１０Ｃ）およびＮＦ－ＹＡ１（図１０Ｄ）のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ｅは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種した２日後の、ｄａｐｈｎｅ様変異体原基におけるＮＩＮのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示す。図１０Ａ～１０Ｅにおいて、ハイブリダイゼーションシグナルは暗い点として描かれ、矢頭によって示された。矢印は感染糸を示す（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１０Ａ～１０Ｅに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11C】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11D】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11E】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図11F】図１１Ａ～１１Ｆは、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ ＲＣＲ２０１１を接種してから４８時間後の内鞘における根粒菌誘導ＮＩＮ発現にＣＥ領域が必要であることを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ａ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｂ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根を示す。図１１Ａ～１１Ｂにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、内皮、および内鞘にあり、矢頭で示されている（より低いＧＵＳ発現がいくつかの皮層細胞にもある；矢頭で示していない）。図１１Ｃ～１１Ｄは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｃ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｄ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｄａｐｈｎｅ様変異体根を示す。図１１Ｃでは、ＧＵＳ発現が表皮および外側皮層にあり、矢頭で示されている。図１１Ｄにおいて、ＧＵＳ発現が表皮、外側皮層、および内鞘にあり（内鞘におけるより弱い発現）、矢頭で示される。図１１Ｅ～１１Ｆは、ＰｒｏＮＩＮ_５ｋｂ：ＧＵＳ（図１１Ｅ）およびＰｒｏＮＩＮ_{ＣＥ－５ｋｂ}：ＧＵＳ（図１１Ｆ）で形質転換したＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ｎｉｎ－１変異体根を示す。図１１Ｅ～１１Ｆにおいて、ＧＵＳ発現は表皮および外側皮層にあり、矢頭で示される。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。図１１Ａ～１１Ｆに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図12A】図１２Ａおよび１２Ｂは、非接種Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａ１７ ＷＴ根におけるＣＲＥ１およびＲＲ１ ＲＮＡの局在を示す。図１２Ａは、非接種根におけるＣＲＥ１のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示し、ハイブリダイゼーションシグナルは、暗い点として描かれ、矢頭で示される（スケールバー ５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；ｖｂ＝維管束）。

【図12B】図１２Ｂは、非接種根におけるＲＲ１のＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ局在を示し、ハイブリダイゼーションシグナルは、暗い点として示され、矢頭で示される（スケールバー５０μｍ；ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘；ｖｂ＝維管束）。図１２Ａ～１２Ｂに示される画像は、複数のレプリケートからの代表的な画像である。

【図13】図１３は、根粒原基開始中のＮＩＮ機能のモデルを示す。根毛のカールにおいて、細菌コロニーが灰色の点として示されており、根毛の軸において、感染糸が明るい灰色の線として示されている（根毛が細胞の表皮から垂直な突起として示されている）。注釈：「－２．２Ｋｂ」および「－５Ｋｂ」は、ＮＩＮ ５’上流領域部分を示す（ｅｐ＝表皮；Ｃ４＝皮層細胞層４；Ｃ５＝皮層細胞層５；ｅｄ＝内皮；ｐｃ＝内鞘）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【配列表】

2022515341000001.app

【国際調査報告】