特表 2022-515409 ローズウッド抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-18

(54)【発明の名称】ローズウッド抽出物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9789 20170101AFI20220210BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20220210BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20220210BHJP

【ＦＩ】

A61K8/9789

A61Q19/08

A61Q19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021536221

(86)(22)【出願日】2019-12-10

(85)【翻訳文提出日】2021-08-20

(86)【国際出願番号】 EP2019084365

(87)【国際公開番号】W WO2020126653

(87)【国際公開日】2020-06-25

(31)【優先権主張番号】1873706

(32)【優先日】2018-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500078211

【氏名又は名称】エル・ヴェ・エム・アッシュ ルシェルシュ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】フランキ，ジョスリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】ペシェ，ヴィルジニー

(72)【発明者】

【氏名】ジュアン，ミレーヌ

【テーマコード（参考）】

4C083

【Ｆターム（参考）】

4C083AA111

4C083AA112

4C083AA122

4C083AB032

4C083AB172

4C083AC122

4C083AC172

4C083AC182

4C083AC332

4C083AC352

4C083AC422

4C083AC532

4C083AD022

4C083AD072

4C083AD092

4C083AD152

4C083AD192

4C083AD352

4C083AD572

4C083AD662

4C083BB41

4C083BB46

4C083BB47

4C083BB51

4C083CC02

4C083CC13

4C083DD21

4C083DD31

4C083DD41

4C083EE06

4C083EE11

(57)【要約】

本発明は、化粧品的に許容される極性溶媒を用いた酵素抽出によって得られるローズウッド、好ましくは夏バラからのローズウッドの水性抽出物、その製造方法、およびその用途、特に皮膚の老化の兆候を防止および/または軽減するための薬剤に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚および/または唇、特に顔および/または体の皮膚に局所適用するための化粧品組成物であって、生理学的に許容される媒体中に、少なくとも有効量のローズウッドの水性抽出物と、特に、UVフィルターからなる群から選択される少なくとも1つの化粧品アジュバントとを含むものである。特に、UVフィルター、抗酸化剤、香料、エモリエント剤、保湿剤、ビタミン、アンチエイジング剤、リフティング剤、タイトニング剤、プランピング剤、鎮静剤、抗汚染剤、美白または色素沈着剤、フィラー、真珠光沢剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの化粧品アジュバントを含む、化粧品組成物。

【請求項2】

ローズウッドの水抽出物が、前記組成物の総重量を基準にして、原料の0.1%～80%、特に0.1%～20%、好ましくは0.5%～10%、さらに好ましくは1%～5%の範囲の含有量で組成物中に存在することを特徴とする、請求項1に記載の化粧品組成物。

【請求項3】

さらに、抗酸化剤、リフティング剤、タイトニング剤、プランピング剤、鎮静剤、抗汚染剤、および色素脱失剤から選択される少なくとも1つの化粧品活性剤を含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の化粧品組成物。

【請求項4】

皮膚の老化の兆候、特に皮膚の張りの低下、弾力性の低下、バリア機能の変化、しわや小じわの出現、乾燥肌、くすんだ不均一な顔色などを予防・軽減するための非治療的な化粧法であって、請求項1から3のいずれか1項に記載のローズウッドの水性抽出物を含む化粧品組成物を、健康な皮膚、特に顔や体の皮膚に塗布することを特徴とする方法。

【請求項5】

バラがエヴァンラット種、特にジャルダン・ドゥ・グランヴィル^{(登録商標)}バラ種であることを特徴とする、化粧品として許容される極性溶媒を用いた酵素抽出によって得られるローズウッド、好ましくはサマーローズウッドの水性エキス。

【請求項6】

ａ)適当な粒度で粉砕したローズウッドに水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)事前に粉砕したローズウッドと酵素混合物を撹拌しながらインキュベートし、目的の収率に応じた時間、油、タンパク質、発酵可能な糖分を反応媒体に放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質や発酵性糖類を含む水相、固相を得て、
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤を添加する
工程を含む酵素抽出方法によって得られることを特徴とする、請求項5に記載の抽出物。

【請求項7】

ａ)適当な粒度で粉砕したローズウッドに水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)事前に粉砕したローズウッドと酵素混合物を撹拌しながらインキュベートし、目的の収率に応じた時間、油、タンパク質、発酵可能な糖分を反応媒体に放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質や発酵性糖類を含む水相、固相を得て、
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤を添加する
工程を含む、請求項5または6に定義されたローズウッド抽出物、好ましくはサマーローズウッドの抽出物を調製する方法。

【請求項8】

皮膚の老化の兆候、特に皮膚の色調の低下、弾力性の低下、および/またはハリの低下、バリア機能の変化、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、および/またはくすんでむらのある顔色を防止および/または軽減することを目的とした薬剤として、非治療的に化粧品として使用可能な、請求項5または請求項6に記載のローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物。

【請求項9】

皮膚の鎮静、および/または皮膚の慢性的な微小炎症に関連する皮膚障害の予防および/または治療に使用するための、請求項5または6に記載のローズウッドの水性抽出物、または請求項1から3のいずれか1項に記載のそれを含む組成物。

【請求項10】

日光黒子の軽減に使用するための、請求項5もしくは6に記載のローズウッドの水性抽出物、または請求項1から3のいずれか1項に記載のそれを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ローズウッド、特にエヴァンラットまたはジャルダン・ドゥ・グランビル(Jardin de Granvilleル(登録商標))ローズの水性抽出物と、特に顔や体の皮膚の老化の兆候を予防および/または治療するための薬剤としての使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

背景技術
皮膚は、環境に対する身体の最初の保護膜である。そのため、外因性の要因(紫外線、温度変化、大気汚染、タバコの煙など)や内因性の要因(ホルモンなど)の影響を受け、それぞれ外因性老化や内因性(または生理的)老化と呼ばれる皮膚の老化現象が引き起こされる可能性がある。外因性の加齢は、深いシワやハリ・弾力を失った皮膚の形成、皮膚のバリア機能の変化、皮膚の自然免疫の変化などの臨床的変化をもたらし、特に手の甲、顔、ネックライン、男性の場合は頭蓋骨などに、加齢斑、褐色斑、日光黒子、光線性黒子、老人性黒子とも呼ばれる皮膚の色素斑が現れる。また、乾燥した肌は艶がなく、色素異常にも敏感であることが知られている。同時に、内因性または生理的な加齢により、皮膚細胞であるケラチノサイトの再生が遅くなり、それが皮下脂肪組織の減少や小じわの出現などの臨床的な変化として表れる。

【0003】

また、内因性および外因性のストレスは、「炎症」と「加齢」を縮めた「炎症加齢」の主な原因となる。2000年にFranceschi C et al. (Inflamm-aging.An evolutionary perspective on immunosenescence. Annals of the New York Academy of Sciences.2000; 908: 244-254)らによって解読されたこの慢性的で静かな炎症の方法は、では、ストレスに対する免疫系の自然な防御反応が、慢性的で静かな微小炎症方法へと変化し、特にケラチン質、特に皮膚の老化の原因となっていると説明されている。加齢に伴い、皮膚組織内に微小な炎症が繰り返し発生し、細胞の防御機能が低下することで、シワ、たるみ、乾燥肌、肌のくすみや色ムラなどの症状が現れる。この現象は時間の経過とともに増加し、すべてのタイプの肌、特に、ストレスや外部からの刺激によって壊れやすくなっている敏感肌の方に影響を与える。加齢に伴い、薄く壊れやすくなった表皮は、これらの刺激を受けやすくなり、細胞にストレスを与え、本来のホメオスタシスの状態を崩す。肌の免疫システムは自己防衛を行い、フリーラジカル、神経ペプチド、炎症性メディエーター(サイトカイン)などを過剰に放出する。これらの物質は、コラーゲンやエラスチン繊維の劣化を招き、細胞の再生能力を低下させ、肌の老化を促進させる。

【0004】

そのため、上記のような皮膚の老化の兆候を予防・軽減できる新しいアンチエイジング成分が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

意外なことに、本出願人は、ローズウッド、特にジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}ローズの水性抽出物のインビトロ効果を示しており、特に酸化ストレスによって引き起こされる皮膚の老化を防止または治療するための活性剤としての使用を想定することが可能である。皮膚のバリア機能の変化を防止・軽減したり、皮膚の色素沈着斑の出現を防止・軽減したり、皮膚の自然免疫の変化を防止・軽減したり、皮膚の慢性的な微小炎症(「炎症」とも呼ばれる)に関連する皮膚の老化の兆候を防止・軽減したりする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の概要
本発明の第一の主題は、化粧品として許容される極性溶媒を用いた酵素抽出によって得られるローズウッド、好ましくはサマーローズウッドの水性抽出物に関する。

【0007】

本発明の別の主題は、
ａ)適当な粒径の植物材料に水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)植物材料と酵素混合物を撹拌下でインキュベートして、目的の収量に応じた時間、油分、タンパク質、発酵可能な糖分を反応媒体中に放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質と発酵性糖類を含む水相、および固相を得て、そして
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤を添加するまた、本発明は、皮膚および/または唇、特に顔および/または体の皮膚に局所的に適用するための化粧品組成物であって、生理学的に許容される媒体中に、本発明に係るローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物の有効量を含む化粧品組成物に関する。

【0008】

本発明の別の主題は、本発明によるローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物、特にエヴァンラットまたはジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}ローズの品種の、皮膚の老化の兆候を防止および/または軽減する、、肌のトーンの低下、弾力性の低下、ハリの低下、バリア機能の変化、シワや小ジワの出現、シミ、特に老人性黒子や日光黒子の出現、肌の乾燥、くすみや顔色の悪さなどを防ぎ、軽減するための薬剤としての、非治療的な化粧品の使用である。

【0009】

また、本発明は、特に老人性黒子や日光黒子などの色素斑の出現、肌の乾燥、顔色の悪さなどを予防・軽減するために、本発明で定義されたローズウッドの水性抽出物を含む化粧品組成物を顔や体の皮膚に塗布することを特徴とする、皮膚の老化の兆候、特に肌の張りや弾力性の低下、バリア機能の変化、シワや小ジワの出現を予防・軽減することを目的とした非治療的な化粧方法に関するものである。

【0010】

「顔色が悪い」という表現は、特に、光と輝きを欠いた、変化した、ぼやけた顔色を意味し、表面および色の不規則性を示し、一般的には不快感を伴い、肌の欠点や美的障害として感じられる症状を意味している。

【0011】

本発明の別の主題は、皮膚の鎮静化および/または皮膚の慢性微小炎症に関連する皮膚障害の予防および/または治療、特に皮膚の慢性微小炎症によって誘発される皮膚老化の兆候の予防および/または低減に使用するための、本発明に係るローズウッドの水性抽出物または本発明に係るそれを含む組成物である。

【0012】

皮膚の慢性微小炎症という表現は、皮膚に局所的に生じる目に見えない(サイレントな)微小炎症方法で、それが変性したり、解消が不十分な場合、慢性化することを意味する。特に、皮膚の慢性的な微小炎症は、組織の損傷の蓄積、免疫システムの不全、あるいは老化した炎症性サイトカイン分泌細胞の蓄積に関連している可能性がある。このような微小な炎症が繰り返されると、時間の経過とともに皮膚の老化が進む。

【発明を実施するための形態】

【0013】

発明の詳細な説明
ローズウッドの抽出物と調製方法
本発明の第一の主題は、化粧品として許容される極性溶媒を用いて酵素抽出して得られるローズウッド、好ましくはサマーローズウッドの水性抽出物に関する。

【0014】

本明細書では、水性抽出物と極性抽出物、親水性バラ抽出物とエコ抽出物という用語を互換的に使用する。ローズウッドの水性抽出物は、有利には化粧品的に許容される極性溶媒を用いて得られる。

【0015】

本発明による「ローズウッド抽出物」または「ローズウッドの水性抽出物」という用語は、特に、ローズウッドの極性(親水性)化合物が極性溶媒に可溶化および/または抽出されていることを意味すると理解される。有利なことに、このローズウッドエキスは、エコ抽出方法によって得られる。それ故にこれを「ローズウッド・エコ・エキス」と称する。

【0016】

「極性溶媒」という表現は、溶媒の極性指数の値が4以上であることを意味する。極性指数とは、分子の相対的な極性を示す熱力学的な量(溶解度と状態変化の量)に基づいて算出される量である。溶剤の極性の指標については、L.R. SNYDER: Classification of the solvent properties of common liquids; Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230の論文を参照すること。

【0017】

好ましい極性溶媒は、少なくとも1つのO-H型極性共有結合を含む化合物からなる。

【0018】

化粧品として許容される極性溶媒としては、水、エタノールなどのC₁-C₄アルコール、エチレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール、およびそれらの混合物から選ばれる溶媒またはその混合物が選択される。好ましくは、水を使用する。

【0019】

特定の実施形態によれば、抽出液の総重量に対して、94%～96%の水、3%～5%の乾燥エキス、0.5%～1%の保存料が含まれていることを特徴とする。

【0020】

植物材料
本発明の抽出物は、ローズウッドの抽出物である。本発明に従って、バラの抽出物、ローズウッドの抽出物、または特にエヴァンラットまたはジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}のバラの品種の抽出物は、互換的に参照される。

【0021】

当業者は、好ましくは、環境および有機農法によって特性が保存されている選択されたバラを選択する。特定の好ましい実施形態によれば、エヴァンラットまたはジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}バラの品種のバラの花びらの抽出物が使用される。

【0022】

ジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}'バラ(は、"Roses anciennes Andre Eve SAS "社が独占的に提供するハイブリッド品種であり、20110345の番号でCertificate of Plant Breeders’ Rightsによって保護されており、種についてはRosa L.、品種についてはEVANRATの表示が付いている。このバラの木は、5月から10月の間、常にバラの花で覆われており、優れたリモンタント効果を発揮している。

【0023】

このように、本発明の特定の好ましい実施形態によれば、ローズウッドの水性抽出物は、ローズウッド抽出物とも呼ばれ、EVANRATまたはローズ・ジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}品種のローズウッドの抽出物であることを特徴とする。

【0024】

ローズウッドには、収穫される時期によって
- 一般的に11月から4月に収穫される冬材
- 一般的に5月から10月にかけて収穫される夏材
の2つの種類がある。

【0025】

特定の好ましい実施形態によれば、夏材が使用される。本明細書中では、ローズウッドやサマーローズウッドは同じ意味で使われる。

【0026】

本発明に係るローズウッドは、新鮮なバラの花全体から得られ、手動または機械的な分離によって植物の残りの部分から分離される。

【0027】

特定の実施形態では、ローズウッドを直接使って抽出する。

【0028】

別の実施形態では、ローズウッドは抽出前に予備乾燥される。

【0029】

特定の好ましい実施形態によれば、抽出工程の前にローズウッドを粉砕する。

【0030】

ローズウッドには、単糖類(果糖、ブドウ糖)と多糖類、特に二糖類、ポリフェノール(カテキン)、アミノ酸(主にアスパラギン酸、チロシン、アルギニン)、ミネラル(灰分、ナトリウム、カリウム、カルシウム)、フラボノイド(主に配糖体)、タンニンなどが含まれる。

【0031】

特に、カルシウムは表皮の分化を促進して皮膚の構造を強化し、カリウムは肌の潤いを高めてエネルギーの同化を促進する。植物性糖質(果糖、ブドウ糖)は、皮膚細胞にエネルギーを満たすためのものである。

【0032】

本発明に係るローズウッドの水抽出物は、天然の極性化合物を濃縮した抽出物である。本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、ローズウォーターとは異なる。ここでは、水性(極性)溶媒の存在下で、pH調整剤の添加の有無にかかわらず、天然のローズウッド化合物の抽出を含むローズウッド抽出物であり、製剤においては、水溶液または濃縮物の形態で実施され、濃縮物の溶媒が抽出溶媒および/または追加の溶媒であることが可能である。

【0033】

特定の実施形態によれば、本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、本発明に係るローズの水性抽出物全体の0.01%～1%、好ましくは0.05%～0.5%、より好ましくは0.1%～0.2%に相当するバラの花の抽出物を小さな割合でさらに含む。本実施形態では、原植物は、ローズウッドとローズの花を、木部0.01%に対して花部99.99%から木部1%に対して花部99%の割合で含んでいる。

【0034】

抽出方法
本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、当業者に知られている様々なエコ抽出方法、特に以下に記載する方法に従って得ることができる。

【0035】

特定の好ましい実施形態によれば、以下に説明する本発明に適応した抽出方法の植物材料として、EVANRAT品種のローズウッド、好ましくはジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}ローズ、好ましくは事前に乾燥させたローズウッドが使用される。

【0036】

「エコ抽出」"とは、安全で高品質な製品/抽出物を確保しつつ、エネルギー消費を削減し、さらに代替溶媒や再生可能な植物資源の使用を可能にする抽出方法を意味すると理解されている。エコ・エクストラクションは
- 品種選定と再生可能な植物資源の利用によるイノベーションの推進、
- 代替となる、いわゆるグリーンソルベント、主にアグロリソースを原料とするものの優先、
- 革新的な技術の使用によるエネルギー消費量の削減と、エネルギー回収の促進、
- 廃棄物ではなく副産物の創出を促進し、有機またはアグロリファイナリーの流れを統合、
- 技術革新による単位作業量の削減と、安全で堅牢な管理された方法の推進、そして
- 非変性、生分解性、コンタミフリー、そして何よりも「エキス」の値を持つ製品の優先
の6つの主要な原則を推進している(Farid Chemat, Dunod, 2010, Eco-extraction du veget al)。それ故に、緑の極性溶媒として水が有利に使われる。

【0037】

「固液抽出」とは、固体(生体由来材料)と液体(溶媒)を接触させることで、溶質と呼ばれる1つ以上の可溶性化合物を液体中に拡散・含浸させる抽出方法を意味する。これは一般的に、比較的迅速な物理的・物理化学的作用によって行われる。

【0038】

木材は、新鮮な状態で使用することも、冷凍して使用することも、空気乾燥、オーブン乾燥、凍結乾燥、ゼオライト乾燥など、当業者に知られている従来の乾燥手段を用いて予備乾燥することもできる。このように、ある実施形態では、抽出工程の前に、木材を乾燥および/または粉砕している。別の実施形態によると、木材は湿った状態で使用され、その後粉砕される。

【0039】

特定の実施形態では、当業者に知られている方法に従って、乳鉢、冷凍粉砕機、ブレンダー、従来の粉砕機、遠心分離機などを用いて、抽出前に木材を粉砕する。

【0040】

本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、特に酵素抽出処理によって得ることができる。

【0041】

選択された酵素は、植物材料に含まれる化合物の一部または全部を加水分解して、細胞壁を損傷させ、含まれる分子を有利に放出する。

【0042】

「細胞壁」または「植物壁」または「ペクトセルロース壁」は、各植物細胞を保護する細胞構造要素を意味するものと理解される。特に
- 中間層:ペクチンに富み、セルロースを含まない、
- 一次壁:主にセルロース(9%～25%)、ヘミセルロース(25%～58%)、ペクチン(10%～35%)、タンパク質(10%)で構成されている、
- 二次壁: セルロース、ヘミセルロース
の3つの部分で構成されている。

【0043】

抽出される分子に応じて、酵素はこれらの分子にアクセスするために加水分解される壁に適合される。有利には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼのいずれかの酵素を単独または組み合わせて使用できる。

【0044】

「セルラーゼ」とは、植物の細胞壁の主成分である、D-グルコースの直鎖からなる生体高分子であるセルロースを分解できる酵素を意味すると理解されている。セルラーゼによるセルロース分解の最終生成物はグルコースである。セルラーゼには、β-グルコシダーゼ、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、酸化型セルラーゼ、セルロースホスホリラーゼなどの種類がある。

【0045】

「ヘミセルラーゼ」とは、植物の細胞壁を構成するバイオポリマーであるヘミセルロースを分解し、特にセルロース繊維間の架橋や他のマトリックス化合物との結合を可能にする酵素を意味する。ヘミセルラーゼには、アラビナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼなど、いくつかの種類がある。

【0046】

「ペクチナーゼ」とは、植物の細胞壁に存在する多糖類であるペクチンを分解できる酵素を意味すると理解されている。ペクチナーゼには、エンドポリガラクツロナーゼやペクチンメチルエステラーゼなど、いくつかの種類がある。

【0047】

「プロテアーゼ」とは、ペプチド結合を分解できる酵素を意味すると理解されている。プロテアーゼは、本発明の方法において、構造タンパク質を加水分解し、原料の溶解性を向上させるために使用されるものであり、ペプチドを生成するためのものではない。

【0048】

それ故に、グルコースやセルロースを遊離させるセルラーゼ、還元糖のモノマーやオリゴマーを遊離させるヘミセルラーゼ、ウロン酸を遊離させるペクチナーゼ、構造タンパク質を加水分解して原料の溶解性を向上させるプロテアーゼなどが挙げられる。

【0049】

好ましい実施形態では、Institut National Polytechnique de Lorraine INPLの特許出願WO2011045387(特許出願FR2351461に対応)に記載されているプロトコルを用いてエコ抽出を行う。経済的な競争力を保ちつつ、規制や環境面での制約を満たす代替技術である。この革新的な方法により、植物から3種類の製品、すなわち油(ポリフェノール、ステロール、ビタミンEなどの栄養素が豊富)、水性抽出物、ケーキ(固相)を1つの工程で抽出できる。

【0050】

この方法は、特に以下の
ａ)適当な粒径の植物材料に水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)植物材料と酵素混合物を撹拌下でインキュベートして、目的の収量に応じた時間、油分、タンパク質、発酵可能な糖分を反応媒体中に放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質と発酵性糖類を含む水相、および固相を得て、そして
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤をする
の工程を含む。

【0051】

このようにして、分離工程(e)の最後に、本発明に係るローズウッド抽出物に対応する水性相が得られる。

【0052】

したがって、本発明の別の主題は、
ａ)適当な粒度で粉砕したローズウッドに水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)事前に粉砕したローズウッドと酵素混合物を撹拌しながらインキュベートし、目的の収率に応じた時間、油、タンパク質、発酵可能な糖分を反応媒体に放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質と発酵性糖類を含む水相、および固相を得て、そして
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤を添加する
工程を含む、本発明に従ったローズウッド抽出物を調製するための方法に関する。

【0053】

本発明に係る前記ローズウッド抽出物は、分離工程(e)の後に得られる。

【0054】

有利なことに、この抽出方法では、施設や人員の安全性、人の健康、環境の保全に関する多くの問題を引き起こす可能性のあるヘキサンなどの有機溶媒を使用しない。この技術は、揮発性有機化合物(VOC)の排出を削減する。これは、タンパク質や糖類、その他の高品質な副産物を油や水性エキスの形で抽出できるクリーンな方法であり、化粧品に直接使用できる。

【0055】

粉砕工程では、使用する機器や粉砕する材料の乾いた状態や湿った状態に応じて、時間や速度を調整する必要がある。

【0056】

水を加える工程では、使用する機器に応じて、速度、時間、水/固体の比率を調整する必要がある。

【0057】

酵素加水分解工程では、使用する酵素を決定し、酵素/基質比、加水分解時間、撹拌速度、pH、温度などの各種パラメータを調整する必要がある。

【0058】

内因性または外因性酵素の不活性化工程では、不活性化温度、温度、時間、およびpHなどのパラメータを調整する必要がある。

【0059】

遠心分離の工程では、速度、温度、時間、pHなどのパラメータを調整する必要がある。

【0060】

特定の実施形態によれば、工程a)において、植物材料の適切な粒径は、有利には前記植物材料を粉砕することによって得られる。酵素の作用を促進するために、粉砕は可能な限り細かくする必要がある。理想的には、すべての粒子が50μmに近いサイズ、好ましくは10μmに近いサイズであることが望ましい。

【0061】

材料に添加する水の質量は、当該植物材料の質量の1～2倍であり、これを超えないことが好ましい。

【0062】

特に工程b)では、セルラーゼ活性に対するペクチナーゼ活性の比が少なくとも0.14、好ましくは0.3～2.5、より好ましくは0.35～0.45であり、ペクチナーゼ活性とヘミセルラーゼ活性の比が少なくとも7.10^-3;好ましくは1.10^-2～0.5、より好ましくは1.10^-2～2.10^-2である。

【0063】

より詳細には、使用される酵素混合物は、少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、および有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む。特定の実施形態によれば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼは、酵素混合物の75%を占め、プロテアーゼは、前記酵素混合物の25%を占める。特定の実施形態によれば、セルラーゼは、酵素混合物の1%から50%、好ましくは20重量%から30重量%の範囲の含有量で存在し、ヘミセルラーゼは、1%から50%の範囲の含有量で存在する。好ましくは酵素混合物の20重量%から30重量%であり、ペクチナーゼは酵素混合物の1重量%から50重量%、好ましくは20重量%から30重量%の範囲の含有量で存在する。また、有利には、プロテアーゼは、酵素混合物の重量に対して1%から50%、好ましくは20%から30%の範囲の含有量で存在する。

【0064】

好ましい実施態様において、セルラーゼ25%、ヘミセルラーゼ25%、ペクチナーゼ25%、プロテアーゼ25%を含む酵素混合物を使用する。

【0065】

好ましくは、上記で定義した酵素混合物の使用量は、水と植物材料の混合物の体積に対して、0.25%以上10%以下、好ましくは1%以上6%以下である。

【0066】

有利には、工程c)によるインキュベーションは、25℃～75℃、好ましくは40℃～60℃、好ましくは50℃前後の温度で、2～20時間、好ましくは4～12時間行われる。

【0067】

その後、例えば、好ましくは80℃～105℃で5～20分加熱することで酵素を失活させ、加水分解反応を停止させる。

【0068】

次に、工程d)に従って、遠心分離やデカンテーションなどの既知の適切な分離技術を用いて、反応媒体を分離する。

【0069】

特定の実施形態では、混合物を0.8mm、0.5mmのふるいで予備濾過して固相の大部分を除去した後、孔径0.2μmの清澄化プレートで2バールの圧力で殺菌濾過を行うのが有利である。

【0070】

滅菌濾過後に得られた水相は、防腐剤(クエン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム)で安定化されている。

【0071】

したがって、好ましい実施形態によれば、ローズウッド、好ましくはサマーローズウッドの前記水性抽出物は、
ａ)適当な粒度で粉砕したローズウッドに水を加え、
ｂ)少なくとも1つのセルラーゼ、少なくとも1つのヘミセルラーゼ、少なくとも1つのペクチナーゼ、および有利には少なくとも1つのプロテアーゼを含む酵素混合物を添加し、
ｃ)事前に粉砕したローズウッドと酵素混合物を撹拌しながらインキュベートし、反応媒体中に油分(存在する場合)、タンパク質、発酵可能な糖分を目的の収量に応じた時間だけ放出し、
ｄ)反応液を分離して、遊離油、タンパク質と発酵性糖類を含む水相、および固相を得て、そして
ｅ)水相を分離し、所望により防腐剤を添加する
工程を含む抽出方法によって得られる。

【0072】

本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、特にアミノ酸(アスパラギン酸、チロシン、アルギニン)と全糖類(グルコース、フルクトース)の存在を特徴とする。

【0073】

また、本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、発酵抽出物ではないことを特徴とする。

【0074】

特定の実施形態によれば、本発明に従って得られたローズウッドの水性抽出物は、94%から96%の範囲の含水量、1%から6%、好ましくは3%から5%の範囲の乾燥抽出物含量、および抽出物の総重量を基準にして0.5%から1%の範囲の含水量の防腐剤を含んでいる。本発明に従ったこのローズウッドエキスのINCI名は、水(および)ローズエキス(および)クエン酸(および)ソルビン酸カリウム(および)安息香酸ナトリウムである。

【0075】

組成物およびガレヌス
また、本発明は、皮膚および/または唇、特に顔および/または体の皮膚に局所的に適用するための化粧品組成物であって、生理学的に許容される媒体中に、本発明に係るローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物の有効量を含む化粧品組成物に関する。

【0076】

「局所適用」とは、ケラチン質に適用することを意図した組成物を意味すると理解される。実際、経口組成物は皮膚への局所適用を意図したものではない。

【0077】

ローズウッドの水性抽出物は、本発明の化粧品組成物に、所望の効果を得るのに有効な量で存在する。

【0078】

特に、組成物の総重量を基準とした原材料の重量に対して、0.1%～80%、特に0.5%～60%の範囲の含有量で存在する。第一の実施形態では、組成物の総重量を基準にして、原材料の重量に対して50%から80%、特に60%から75%の範囲の含有量で存在する。別の特定の実施形態によれば、組成物の総重量を基準にして、0.1%～20%、好ましくは0.5%～10%、さらに好ましくは1%～5%の原料の含有量で存在する。以下にその説明的実施例を示す。本発明の化粧品組成物は、ケラチン質、特に皮膚への局所適用に適した任意のガレヌス形態であってよく、例えば、美容液、水中油型エマルション、油中水型エマルション、マルチプルエマルション、マイクロエマルション、ローション、サスペンション、水性ゲル、スティック、パウダーなどが挙げられる。本発明に係る組成物は、ケラチン質のためのケアおよび/またはメイクアップ組成物であってもよい。

【0079】

「ケラチン質」とは、皮膚および/またはその付属物、ならびに唇、特に顔および/または体の皮膚と唇を意味すると理解される。

【0080】

本組成物は、顔および/または体の皮膚、または唇に塗布することが好ましいとされており、例えば、化粧水、ケアクリーム、美容液、顔用流体、顔および/または体用のケアジェル、リップケア組成物、リップバーム、口紅、グロスなどの形態である。

【0081】

特定の実施形態によれば、本発明に係る化粧品組成物は、顔のためのケアおよび/またはメイクアップクリームの形態である。

【0082】

別の特定の実施形態によれば、本発明に係る化粧品組成物は、目の輪郭のための水性ゲルの形態である。

【0083】

別の特定の実施形態によれば、本発明に係る化粧品組成物は、唇のためのケアおよび/またはメイクアップ組成物の形態である。

【0084】

水相は、前記組成物の総重量を基準にして、1%から99%の重量を占める。

【0085】

水相
本発明に係る組成物の水相は、水および所望により水溶性溶媒とからなる。

【0086】

本発明でいう「水溶性溶剤」とは、室温で液体であり、水と混和する化合物(25℃、大気圧での水との混和率が50%以上)を意味する。次のものが特記され得る。
－エタノール、イソプロパノール、およびそれらの混合物などのC₁-C₅の低級モノアルコール；
－エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジプロピレングリコールなどのC₂-C₈グリコール、およびそれらの混合物；
－C₂-C₃₂ポリオール、例えばポリグリセロール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、
およびその混合物。

【0087】

また、親水性ゲル化剤、酸化防止剤、防腐剤、およびそれらの混合物を含んでいてもよい。

【0088】

親水性ゲル化剤としては、INCI名カルボマーや商品名カーボポール^{(登録商標)}などのアクリル酸系ポリマー、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、カルボキシビニル系ポリマー、アクリル系やポリウレタン系の会合型増粘剤、アルギン酸塩などの多糖類ゲル化剤、キサンタンガム、カラギーナンガム、寒天ガム、グアーガム、ジェランガムなどの天然ガムまたは変性ガム、キトサン、マンナン、プルラン、セルロース誘導体、ゼラチン、ペクチン、ベントンや変性シリカなどの無機ゲル化剤、およびこれらの混合物などが挙げられる。

【0089】

天然ガムまたは修飾ガムとは、水性媒体中で水和して粘性のある溶液または分散液を形成する多糖類(所望により修飾されている)を意味すると理解される。天然ガムには、種子や植物の根から抽出した藻類エキス、植物滲出液、微生物発酵で得られたガムなどがある。修飾ガムまたは半合成ガムには、セルロースやデンプンの誘導体や、一般的にはすべての天然ガムの誘導体が含まれる。

【0090】

特定の実施形態によれば、本発明の化粧品組成物は、特に、少なくとも1つのアクリルポリマー、特にアクリル酸ポリマーまたはアクリル酸とメタクリル酸のコポリマーの存在によって、ゲル化した水相を含む。

【0091】

本発明の化粧品組成物における親水性ゲル化剤の含有量は、当該組成物の全重量を基準にして、一般的に0.5%～5%、特に0.7%～4%、好ましくは0.9%～3%、さらに好ましくは1%～2%の範囲となる。

【0092】

脂肪または油相
本発明の化粧品組成物は、脂肪相(固体脂肪)または油相をさらに含んでいてもよい。

【0093】

「油相」は、油または相互に混和する油の混合物を意味すると理解される。「油」とは、本発明の意味において、水に不溶で、25℃、大気圧で液体である脂肪を意味すると理解される。

【0094】

本発明に係る油相は、炭化水素系、シリコーン系、フッ素系または非フッ素系の油、およびそれらの混合物から構成されていてもよい。

【0095】

これらの油は、揮発性または不揮発性、植物性、鉱物性または合成のものがある。

【0096】

「炭化水素油」とは、本発明では、主に水素原子と炭素原子を含む油を意味する。

【0097】

本発明において、「シリコーンオイル」とは、少なくとも1つのケイ素原子、特に少なくとも1つのSi-O基を含む油を意味すると理解される。

【0098】

本発明において「フッ素系オイル」とは、少なくとも1つのフッ素原子を含む油を意味する。

【0099】

不揮発性の炭化水素油としては、炭化水素油、植物由来の炭化水素油、合成C₁₀-C₄₀エーテル、合成C₁₀-C₄₀エステル、C₁₂-C₂₆脂肪アルコール、C₁₂-C₂₂高級脂肪酸、およびこれらの混合物を特に挙げることができる。

【0100】

不揮発性シリコーンオイルとしては、フェニル化シリコーンオイル、非フェニル化シリコーンオイル、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0101】

油は、本発明の組成物中に、組成物の総重量を基準にして0.01%から95%の範囲の重量で存在してもよい。

【0102】

脂肪相または油相には、親油性ゲル化剤、フィルム形成ポリマー、界面活性剤、酸化防止剤、およびそれらの混合物が含まれることもある。

【0103】

本発明の特定の実施形態によれば、化粧品組成物は、溶液、エマルジョン、セラムまたはゲルの形態である。

【0104】

特定の実施形態によれば、本発明の化粧品組成物は、EVANRATまたはローズ・ジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}品種の抽出物以外の他のバラの抽出物を含まない。

【0105】

追加成分
本発明の組成物は、UVフィルター、酸化防止剤、香料、化粧品活性剤、例えばエモリエント剤、保湿剤、ビタミン類、アンチエイジング剤、リフティング剤、タイトニング剤、プランピング剤、鎮静剤、汚染防止剤、美白・脱色剤、フィラー、真珠光沢剤、およびこれらの混合物など、通常の化粧品に使用されるあらゆる添加剤を含むことができる。

【0106】

したがって、特定の実施形態によれば、本発明は、皮膚および/または唇、特に顔および/または体の皮膚に局所的に適用するための化粧品組成物であって、生理学的に許容される媒体中に、本発明によるローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物の少なくとも有効量と、UVフィルタからなる群から選択される少なくとも1つの化粧品アジュバントとを含む化粧品組成物に関する。抗酸化剤、香料、エモリエント剤、保湿剤、ビタミン、抗老化剤、リフティング剤、タイトニング剤、プランピング剤、鎮静剤、抗汚染剤、美白または色素沈着剤、フィラー、真珠光沢剤、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの化粧品アジュバントを含む。

【0107】

特定の好ましい実施形態によれば、この組成物は、抗酸化剤、リフティング剤、引き締め剤、プランピング剤、鎮静剤、抗汚染剤、および/または脱色素剤から選択される少なくとも1つの化粧品活性剤も含む。また、フィラーや真珠光沢剤、特に白の真珠光沢剤を含むことができ、色の欠点(クマ)を覆い隠し、目元を明るくできる。

【0108】

化粧品およびその他の用途
また、本発明は、本発明に係るローズウッドの少なくとも1つの水性抽出物、特にEVANRATまたはジャルダン・ドゥ・グランビル(登録商標)ローズ品種の水性抽出物を、皮膚の老化の兆候、特に皮膚のトーンの低下、弾力性の低下および/またはハリの低下、バリア機能の変化、シワおよび/または小ジワの出現、乾燥肌、および/またはくすんだ不均一な顔色を防止および/または軽減することを目的とした薬剤として、非治療的に使用することに関する。

【0109】

また、本発明は、皮膚の老化の兆候、特に肌の張りの低下、弾力性の低下、バリア機能の変化、シワや小ジワの出現、乾燥肌、くすんだ不均一な顔色などを予防・軽減することを目的とした非治療的な化粧法であり、本発明で定義されたローズウッドの水性抽出物を含む化粧品組成物を、顔、体、唇などの皮膚に塗布することを特徴とする。

【0110】

本発明による「皮膚および口唇」とは、特に健康な皮膚および口唇を意味する。すなわち、病的な状態に関連するような状態や障害がない(病的な状態にある)「不健康な」対象を意味する。

【0111】

特定の実施形態によれば、この組成物は、乾燥した肌、壊れやすい肌、敏感な肌、ストレスを受けた肌、特に、ハリ、しなやかさ、弾力性を失った疲れた肌に適用される。

【0112】

別の特定の実施形態によると、この組成物は、乾燥した、壊れやすい、敏感な、および/またはストレスを受けた唇に適用される。特定の実施形態によると、この組成物は、乾燥した、および/または、壊れやすい唇に適用される。別の実施形態によると、ストレスを受けた唇にである。別の実施形態によると、敏感な唇にである。

【0113】

本発明の別の主題は、皮膚の鎮静化、および/または皮膚の慢性微小炎症に関連する皮膚障害の予防および/または治療、特に皮膚の慢性微小炎症によって誘発される皮膚老化の兆候の予防および/または減少に使用するための、本発明に係るローズウッドの水性抽出物、または本発明に係るそれを含む組成物である。

【0114】

本発明のこの態様によれば、ローズウッドの水性抽出物は、慢性的な微小炎症、特に炎症作用を有する内因性および/または外因性のストレスによる炎症に関連する障害を有する皮膚に使用される。

【0115】

本発明はさらに、日光黒子の軽減に使用するための、本発明に係るローズウッドの水性抽出物またはそれを含む組成物に関する。

【0116】

本発明のこの局面によれば、ローズウッドの水性抽出物は、日焼けによる変質を起こした皮膚に使用される。

【0117】

この組成物は、顔や体の皮膚、または唇に塗布できる。特定の実施形態によると、この組成物は、顔および/または体に適用される。

【0118】

別の態様によれば、本発明は、皮膚を鎮静化するため、および/または皮膚の慢性的な微小炎症に関連する皮膚障害を予防および/または治療するための、本発明に係るローズウッド抽出物、またはそれを含む組成物に関する。

【0119】

さらに本発明は、本発明に係るローズウッド抽出物、またはそれを含む、日光黒子を軽減するための組成物に関するものである。

【0120】

別の態様によれば、本発明は、ケラチン質、好ましくは皮膚および/または唇を治療し、皮膚を落ち着かせ、および/または皮膚の慢性的な微小炎症に関連する皮膚障害を予防および/または治療するための方法であって、本発明によるローズウッド抽出物、またはそれを含む組成物をその必要がある人に投与することを含む方法に関する。

【0121】

本発明はまた、ケラチン質、好ましくは皮膚および/または唇を処理して日光黒子を軽減するための方法であって、本発明に係るローズウッド抽出物またはそれを含む組成物を必要とする人に投与することを含む方法に関する。

【0122】

次に、本発明を以下の非限定的な実施例で説明する。特に断りのない限り、%は、組成物の総重量を基準とした重量%で表される。

【実施例】

【0123】

実施例1:ローズウッドからの抽出とその抽出物の分析
植物の調製
ローズウッドとEVANRATのバラの花、特にジャルダン・ドゥ・グランビル^{(登録商標)}というバラの品種を使用している。
原料のローズウッド(所望によりローズフラワーを加える)は、3つの工程を経てパウダー状にされる。
工程1:ガーデンシュレッダーに通して、2cm程度の断面を得る
工程2: 工業用グラインダーに通す

【0124】

溶液に入れる
酵素抽出は、最大容量70Lのリアクターで行った。反応器はプロペラで撹拌され、ダブルジャケットでサーモスタット制御されている。
0.1%のバラの花が入ったローズウッドパウダー16kgを47.5kgの水に分散させて懸濁させる。
内在性酵素を失活させるために、85℃で1分間昇温した後、50℃で安定させた。

【0125】

植物壁の溶解
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ75%とプロテアーゼ25%の混合物からなるHEL1PR1酵素カクテル0.8kgを対応する反応混合物(5%w/w)に加えた。反応は4時間続けられ、温度は50℃に維持された。

【0126】

酵素の不活性化
混合物を85℃で1分間加熱して酵素を失活させた後、35℃に戻した。

【0127】

プレフィルトレーション
この混合物を0.8mm、0.5mmのふるいにかけ、固相の大部分を除去した後、シート上でプレフィルターをかける。

【0128】

濾過滅菌
孔径0.2μmのクラリファイングプレート(PALL社製)を用いて、2barの圧力で濾過を行った。

【0129】

製剤
滅菌濾過後に得られた水相は、以下の保存料で安定化されている。
- クエン酸
- ソルビン酸カリウムおよび
- 安息香酸ナトリウム

【0130】

濾過後、抽出液の全重量を基準にして乾物が3.7%のローズウッドの水抽出液が得られる。この抽出物は、皮膚に対する効果を示すために以下の例で使用されている。以下の例では、ケラチノサイトおよび/またはメラノサイトの培養物が使用されている。
防腐剤で安定化されていないこの水抽出物を用いて行った定量試験の結果は以下の通りである。
総ポリフェノール(g/L):2.5
還元糖(g/L):16.2
タンパク質窒素(g/L):0.64
総タンパク質(g/L):<6
ブドウ糖(g/100g):1.4(±0.8
フラクトース(g/100g):0.3(±0.3

【0131】

実施例2:ケラチノサイトの培養で目的の遺伝子の発現を調べるためのプロトコル
正常ヒトケラチノサイト(NHK)を培養した後、実施例1で調製したローズウッドの水抽出物で処理する。
NHKを処理した後、抽出されたtotal RNAを逆転写して得られたcDNAから、研究対象の遺伝子に関するTaqMan low-density array(TLDA)試験を行う。
ローズウッドの水抽出物は、原料(賦形剤である水)の重量に対して0.1%または0.25%で試験する。

【0132】

NHK培養
正常なヒトのケラチノサイトは、整形手術で得られた皮膚サンプルに由来する。12ウェルプレートに50,000個/ウェルの播種密度でEpilifeの完全培地で培養する。サブコンフルエンス時に、細胞を上述の用量のバラ抽出物で24時間処理する。

【0133】

TaqMan低密度アレイ(TLDA)技術
得られた総RNA
細胞培養液を除去し、250μLのRLT lysis buffer(Nucleospin RNA Trace kit, Macherey-Nagelに付属)を加える。セルスクレーパーで細胞を掻き取り、細胞ライセートを1.2mLのディープウェルプレートに回収する(Nucleospin RNAキットに付属)。決められたプロトコルに従って、総RNAを抽出する。
得られた総RNA溶液は、Microlab STARに接続されたマイクロプレートリーダー spectrostar NANO(BMG Labtech)を用いて測定し、その品質を確認する。この装置は、自動リキッドハンドラーを制御するコンピュータに接続されており、結果を分析するための専用ソフトウェア(MARS software)を備えている。この手法では、384ウェルのマイクロプレート(LoBase)と、自動リキッドハンドラーで行われるピペッティングとspectrostar NANOリーダーで生成される値を検証するためのポジティブコントロール(RNA 250, AM7155, Thermofisher)が必要である。

【0134】

相補的DNAの合成
逆転写(RT)キットは、High-Capacity Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher)を使用した。提示されたプロトコルに従って使用された。500ngのtotal RNAを水で希釈して最終容量25μLとし、あらかじめ後述の方法で調製した25μLのHigh-Capacity Reverse Transcription Kit 2X reaction mixの存在下で、25℃で10分、37℃で2時間インキュベートする。異なるインキュベーションは、TRobot(Biometra)で行われる。

【表1】

【0135】

PCR-TaqMan低密度アレイ
各RTの15μLを60μLの水と混合し、DNAポリメラーゼを含むTaqMan Gene Expressionマスターミックス(ThermoFisher)75μLを加える。ホモジナイズした後、100μLを、検査対象の遺伝子に対応するプローブ(下記の表2)が入ったマイクロ流体カードに付着させ、遠心分離して密封する。プレートに蒸着された遺伝子のプロファイルに対応するCDロムをSDS 2.3ソフトウェアに読み込ませ、カード上の各遺伝子の位置を示す。PCRを開始する前に、結果の正規化に使用するコントロール遺伝子(または「内在性」)を示す。後者は、ABI Prism 7900HT Sequence Detection Systemにおいて、Applied Biosystems社が提供するプロトコルに従って実施される。qPCRの工程は、50℃で2分、94.5℃で10分、97℃で30秒、59.7℃で1分を40サイクルである。求める効果に応じて、当業者はどの遺伝子を研究に含めるかを決定する。使用するPCRプライマーのヌクレオチド配列を決定し、各遺伝子に対して最適化することは、当業者の一般的な知識にかかっている。

【0136】

統計解析
リアルタイム定量PCRは、その効率が90%～110%であれば使用可能である。各サンプルについて、信号が現れるサイクル数は、SDS 2.3ソフトウェアによって決定される。同じアッセイにおいて、得られた目的の転写産物の発現レベルを、β-2-ミクログロブリンのハウスキーピング遺伝子で得られた値に正規化する。この遺伝子は、構成的かつ不変的に発現するため、実験中に生じるすべての変動(トータルRNAのアッセイ、ピペッティング、逆転写工程、装置内でのPCR)を回避できる。
TLDA RT-PCR法では、比較ΔΔCt法により定量化を行う。得られた相対定量(RQ)値は、コントロール(ここでは未照射)と比較した発現の振幅(コントロールのx倍以上または以下)のレベルに対応する。RQは、コントロールを1とした場合、以下の計算で求められる。
RQ=2^{-ΔΔCt =} 2－(^ΔCt処理－^{ΔCt未処理)}。
処理ΔCt=Ct処理標的遺伝子-Ct処理ハウスキーピング遺伝子
ΔCt未処理 Ct未処理標的遺伝子 - Ct未処理ハウスキーピング遺伝子

【0137】

転写活性の統計的に有意な変化を評価するために、スチューデントのt検定を使用する。各条件は3連で実施する(未処理3回、同条件で処理3回)。まず、2つのデータマトリックスを比較して、フィッシャーのF検定を適用する。その値がα=0.05より大きい場合、スチューデントのt検定の分散は2となり、フィッシャーのt検定がα=0.05より小さい場合、分散は3となる。保持される転写の変動は、スチューデントのt検定がα= 0.05未満の変動になる。

【0138】

結果はn=3の平均値で示した。処理した細胞と未処理の細胞の効果を比較するために、スチューデントのt検定を使用した。
結果はp<0.05(^*)またはp<0.01(^**)で有意とした。
その結果を以下の表3に示す。

【0139】

実施例3:ローズウッドの水抽出物の酸化ストレスに対する効果
フリーラジカルの中和に関与し、その結果、特に皮膚細胞を老化から保護する内因性の抗酸化酵素の遺伝子発現の刺激に対する本発明に係るローズウッド抽出物の効果を検討した。この研究は、実施例2で詳述したプロトコルに従って、ケラチノサイトの培養で行われた。

【表2】

【0140】

【表3】

【0141】

これらの結果から、本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、酸化ストレスへの対応に関わる遺伝子を刺激し、フリーラジカルの蓄積を制限することが分かった。そのため、ローズウッドの水性エキスは、特に環境、汚染、タバコなどによって引き起こされる皮膚反応を防止・軽減し、皮膚の細胞老化を防止するのに有利である。

【0142】

実施例4:ローズウッドの水抽出物のバリア機能への影響
本発明に係るローズウッド抽出物が、細胞の凝集、表皮の分化、あるいは表皮の恒常性に関与し、皮膚のバリア機能の調節に関与する遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。この研究は、実施例2で詳述したプロトコルに従って、ケラチノサイトの培養で行われた。

【表4】

【0143】

【表5】

【0144】

これらの結果は、本発明によるローズウッドの水性抽出物が、表皮分化および細胞凝集の多くのメディエーターを刺激することを示している。したがって、本発明によるローズウッドの水性抽出物は、皮膚バリア機能を促進および/または刺激するために、特に皮膚の硬さ、しなやかさおよび弾力性を促進するために有利である。

【0145】

実施例5:メラニン移動に対するローズウッドの水性抽出物の効果
この研究の目的は、本発明に従ってローズウッド抽出物の推定された脱色効果を調査することである。この評価は、ケラチノサイト/メラノサイト共培養モデルでメラニン移動速度を測定することによって実行される。

【0146】

NHK/NHM共培養モデル
NHKは、EpilifeとM254培地(Invitrogen)の混合液1mLに、24ウェル培地でそれぞれ25%と75%、50,000細胞/ウェルで播種される。
24時間の培養後、NHMを同じ再生培地に400μL /ウェルで4000細胞/ウェルで添加する。

【0147】

細胞処理
37℃で24時間培養した後、共培養物を活性剤(本発明によるローズウッド抽出物または陽性対照)で処理するかまたは処理しない。
未処理のコントロールとポジティブコントロールの10μmol/Lの濃度のナイアシンアミド(Sigma)が研究に含まれる。
細胞は、本発明による0.1%ローズウッド抽出物または陽性対照条件のためのナイアシンアミドで更新せずに48時間処理される。

【0148】

免疫染色
48時間の処理後、培地を除去する。細胞をPBS(Invitrogen)ですすぎ、ホルマリン(Sigma)で10分間固定する。
PBSですすいだ後、培養ウェルに0.1%PBS/Triton溶液(Sigma)を10分間充填して固定細胞膜を透過性にし、PBSで2回すすぐ。
細胞を1%PBS/BSA溶液(Sigma)で覆う。室温で30分後、PBS/BSA溶液を除去する。次に、細胞を、1%PBS-BSA溶液で1:150に希釈した一次抗メラノーママーカー抗体HMB45(Dako、、Mouse)の溶液で、室温で2時間覆う。次に、細胞をPBS溶液で3回すすぐ。
次に、細胞を1%PBS-BSA溶液で1:300に希釈した二次抗マウス抗体溶液(Alexa fluor 568、ヤギ抗マウス、Invitrogen)で覆う。細胞核は1:100に希釈したDAPI(Invitrogen)で染色し、アクチンは二次抗体溶液で1:100に希釈したAlexa Fluor488ファロイジンで染色する。細胞は、光から保護された室温で60分間インキュベートされる。培養ウェルをPBSで3回すすいだ後、数滴の封入剤(DAKO)を細胞に沈着させる。
プレートは、画像を取得するまで4℃で暗所に保管する。

【0149】

HCSによる画像取得
プレートは、サプライヤーの推奨に従って、Thermo Cellomics ArrayScanXTiでスキャンされる。

【0150】

画像分析
CellProfiler分析ソフトウェアを使用して画像を分析する。ケラチノサイトの表面積ごとに転送されるメラノソームの数を定量化するプログラムが作成される。結果はMicrosoft Excelファイルに直接転送される。

【0151】

統計解析
結果の統計解析には、Microsoft Excelソフトウェアを使用している。
この解析では、ケラチノサイト表面積あたりのメラノソーム転写数の平均値、標準偏差、信頼区間(α=0.05)を算出する。統計的に有意な変動を評価するために、スチューデントのt検定を使用している。まず、2つのデータマトリックスを比較して、フィッシャーのF検定を適用する。この値がα=0.05より大きい場合、スチューデントのt検定の分散は2となり、フィッシャーのF検定の値がα=0.05より小さい場合、分散は3となる。また、スチューデントのt検定がα=0.05未満のものを保持した変動とする。

【0152】

結果
ポジティブコントロール、および異なる用量の試験成分を未処理のコントロールと比較する。ポジティブコントロール(ナイアシンアミド)では、未処理のコントロールと比較して、メラノソームの移動量が-30%減少していることが確認された。ローズウッド抽出物を0.1%投与したところ、ケラチノサイト1個あたりのメラノソームの移動数が未投与の対照と比較して-30%の有意な減少が認められた(ナイアシンアミド陽性対照と同等)。
この研究では、ローズウッド抽出物の色素脱失効果が注目されている。この抽出物は、特に手の甲、顔、首筋、男性の場合は頭蓋骨などに見られる、顔色の不均一さ、皮膚の色素斑、年齢斑の予防および治療に特に有利であると考えられる。

【0153】

実施例6:ローズウッドの水抽出物の自然免疫への影響
本発明に係るローズウッド抽出物が、抗菌ペプチドをコードする遺伝子、つまり自然免疫に関与する遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。この研究は、実施例2で詳述したプロトコルに従って、ケラチノサイトの培養で行われた。

【表6】

【0154】

【表7】

【0155】

この研究では、抗菌ペプチドをコードする遺伝子の発現が強く刺激されたことが観察され、本発明に係るローズウッド抽出物の皮膚の自然免疫を促進する能力に関する有益な効果が強調された。

【0156】

実施例7:ローズウッドの水抽出物の微小炎症に対する効果
本発明に係るローズウッド抽出物が、皮膚の老化や炎症現象を促進する皮膚の微小炎症過程に関与する遺伝子であるサイトカインまたはサイトカイン受容体の発現に及ぼす影響を調べた。この研究は、実施例2で詳述したプロトコルに従って、ケラチノサイトの培養で行われた。

【表8】

【0157】

【表9】

【0158】

これらの結果から、本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、炎症の多数のメディエーター、特にサイトカインとサイトカイン受容体を阻害することが分かった。したがって、本発明に係るローズウッドの水性抽出物は、皮膚の慢性的な微小炎症の影響を防止および/または軽減し、その結果、皮膚の老化または炎症に対抗するために使用するのに有利である。

【0159】

結論
酸化ストレス、バリア機能、色素沈着、免疫、微小炎症に観察された効果の全体像は、本発明に従ったローズウッド抽出物が、皮膚の老化を引き起こす主な要因を予防および/または治療し、その結果、老化した皮膚の外観を改善することに関心があることを示している。

【0160】

実施例8: 製剤
8.1 エマルジョンの形態の組成物

【表10】

^* 実施例1に記載のとおり

【0161】

この組成物は、以下の手順に従って調製される。
－ゲル化剤を70℃に加熱した水相(ローズウッド水抽出物と水酸化ナトリウムを除く)に分散させ；
－脂肪相(濃縮香料と酸化防止剤を除く)を70℃に加熱し；
－エマルジョンは、強い撹拌下で脂肪相を水相に導入することで作り；
－ゲル化剤を水酸化ナトリウムを加えることによって中和し、エマルジョンは、芳香濃縮物、酸化防止剤、およびローズウッドの水性抽出物を低温で導入しながら、適度に攪拌しながら冷却する。
肌、特に顔に塗布することで、肌に張りと弾力性を与え、顔の印象を変える。

【0162】

8.2 球状または球状の脂肪の固体分散物の形態の組成物

【表11】

^* 実施例1に記載のとおり

【0163】

この組成物は、以下の手順に従って調製される。
－ワックス(C_10-18トリグリセリド=GatefosseのLipocire)は、酸化防止剤とともに融点以上(数度)に加熱され；
－溶解した脂肪相を、脂肪相と同じ温度に加熱しておいた水に、撹拌しながら注ぎ；
－望ましい液滴サイズが得られるまで、全体を回転装置で数分間撹拌し続け；
－得られた分散液を、あらかじめ冷却しておいたグリコール水(約-4℃)を加えて急冷し、脂質回転楕円体を固化させ；
－回転楕円体が固まったら撹拌を止め、表面で回収するか、濾過し；
－水相を、水、キサンタンガム、防腐剤、および本発明に係るローズウッドの水性抽出物を混合して調製し；
－回転楕円体を表面から回収し、本発明に係るローズウッドの水性抽出物を含むキサンタンゲルに組み込む。
肌に塗布することで、目に見えるエイジングサインを軽減する。特に、肌にハリとツヤを与え、顔の楕円形の部分を再構築する。

【0164】

8.3: 顔用の水性ゲル状の組成物

【表12】

^* 実施例1に記載のとおり

【0165】

本発明に係るローズウッド抽出物と防腐剤を混合し、室温で撹拌下にホモジナイズする。撹拌下で糖類を加え、次にカルボマーを加え、さらに撹拌下で水とEDTAを加える。その後、水性ゲルは、均質なゲルが得られるまで、攪拌下で水酸化ナトリウムを加えて中和される。
顔の肌に塗布することで、肌の乾燥や顔色のくすみ、色むらを補正し、肌の若々しさに貢献する水性ジェルである。

【0166】

8.4: クマのための微量栄養素のジェルセーラムの形をした組成物

【表13】

^* 実施例1に記載のとおり

【0167】

水相の成分(水、グリコール、カルボマー)を80℃で撹拌しながら混合する。その後、保存料、ゲル化剤を80℃で撹拌しながら加え、75℃まで温度を下げる。その後、界面活性剤を水相に撹拌下で乳化させる。あらかじめペースト状にして均質化したフィラーとパール剤を40℃で添加する。続いて、本発明に係るローズウッドの水性抽出物であるクライオエキスを、40℃で30℃まで攪拌しながら加える。
このジェル状美容液を目元に塗ると、シワや小ジワが目立たなくなり、目元が引き締まり、クマや腫れが目立たなくなる。使うたびに若々しい目元がよみがえる。

【0168】

8.5 リップバーム

【表14】

この組成物は、従来のバームの処方方法に従って成分を混合して調製される。
このリップバームは、乾燥した唇や傷つきやすい唇に塗ると、潤いを与えて滑らかにする。

【国際調査報告】