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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-22
(54)【発明の名称】多能性幹細胞の能力を調節する方法およびその適用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20220215BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20220215BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220215BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220215BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20220215BHJP
A61K 31/724 20060101ALI20220215BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20220215BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220215BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220215BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735
C12N5/02 ZNA
C12N5/10
A61P35/00
A61K31/366
A61K31/724
A61K31/137
A61K45/00
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021537935
(86)(22)【出願日】2019-12-26
(85)【翻訳文提出日】2021-08-11
(86)【国際出願番号】 US2019068528
(87)【国際公開番号】W WO2020139914
(87)【国際公開日】2020-07-02
(31)【優先権主張番号】62/784,942
(32)【優先日】2018-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】596118493
【氏名又は名称】アカデミア シニカ
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ルゥ，ジョイス ジャン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ウェイ－ジュ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BD39
4B065CA44
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA17
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA08
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB26
(57)【要約】
本発明は、ポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）の発現を調整することによって多能性幹細胞（ＰＳＣ）の能力を調節する方法、およびその適用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞の能力を調節する方法であって、幹細胞を、有効量のポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）のモジュレーターに曝すことを含む、方法。
【請求項2】
モジュレーターがＰＯＤＸＬアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストが、多能性幹細胞の能力を下方制御することにおいて有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストが、抗ＰＯＤＸＬ抗体、ＰＯＤＸＬ標的干渉核酸、またはＰＯＤＸＬを阻害する低分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストが、コレステロール合成阻害剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
幹細胞が、コレステロールを含まない培養培地中で培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
モジュレーターが、ＰＯＤＸＬアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ＰＯＤＸＬアゴニストが、多能性幹細胞の能力を上方制御することにおいて有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
分化細胞を調製する方法であって、（ａ）未分化多能性幹細胞を分化に好適な条件に曝して、分化細胞および未分化多能性幹細胞を含む細胞集団を産生すること、
（ｂ）該細胞集団を有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤に曝すことによって、未分化多能性幹細胞を除去すること、および
（ｃ）適宜、残存する分化細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項10】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストが、抗ＰＯＤＸＬ抗体、ＰＯＤＸＬ標的干渉核酸、またはＰＯＤＸＬを阻害する低分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤が、シンバスタチン［（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）－１，２，３，７，８，８ａ－ヘキサヒドロ－３，７－ジメチル－８－［２－［（２Ｒ，４Ｒ）－テトラヒドロ－４－ヒドロキシ－６－オキソ－２Ｈ－ピラン－２－イル］エチル］－１－ナフタレニリ－２，２－ジメチルブタノアート］、ＡＹ９９４４（ｔｒａｎｓ－Ｎ，Ｎ－ビス［２－クロロフェニルメチル］－１，４－シクロヘキサンジメタンアミンジヒドロクロライド）、ＭＢＣＤ（メチル－β－シクロデキストリンメチル－β－シクロデキストリンシクロマルトヘプタオース、メチルエーテル）、プラカスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロバシミベ、ＶＵＬＭ １４５７、ＹＭ７５０、Ｕ １８６６６Ａ、ＣＩ ９７６、Ｒｏ ４８－８０７１フマラート、ＡＫ ７、ＢＭＳ ７９５３１１、ラリッスタット１、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ＳＢ ２０４９９０、フィリピンＩＩＩ、ＧＧＴＩ ２９８、トルセトラピブ、オルリスタット、エゼチミブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシツマブ、ナイアシン、およびアムロジピンからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
未分化多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、および拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
分化細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、肝細胞、心臓細胞、肺細胞、腸細胞、血球、胃細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、眼の細胞、耳の細胞、口腔細胞、および成体幹細胞（すべて分化細胞型）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
細胞が、コレステロールを含まない培養培地中で培養される、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
必要とする対象における奇形腫を治療する方法であって、有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤を対象に投与することを含む、方法。
【請求項16】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤が、シンバスタチン［（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）－１，２，３，７，８，８ａ－ヘキサヒドロ－３，７－ジメチル－８－［２－［（２Ｒ，４Ｒ）－テトラヒドロ－４－ヒドロキシ－６－オキソ－２Ｈ－ピラン－２－イル］エチル］－１－ナフタレニリ－２，２－ジメチルブタノアート］、ＡＹ９９４４（ｔｒａｎｓ－Ｎ，Ｎ－ビス［２－クロロフェニルメチル］－１，４－シクロヘキサンジメタンアミンジヒドロクロライド）、ＭＢＣＤ（メチル－β－シクロデキストリンメチル－β－シクロデキストリンシクロマルトヘプタオース、メチルエーテル）、プラカスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロバシミベ、ＶＵＬＭ １４５７、ＹＭ７５０、Ｕ １８６６６Ａ、ＣＩ ９７６、Ｒｏ ４８－８０７１フマラート、ＡＫ ７、ＢＭＳ ７９５３１１、ラリッスタット１、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ＳＢ ２０４９９０、フィリピンＩＩＩ、ＧＧＴＩ ２９８、トルセトラピブ、オルリスタット、エゼチミブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシツマブ、ナイアシン、およびアムロジピンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
多能性幹細胞の能力を上方制御する方法であって、幹細胞においてポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）の発現を誘導することを含む、方法。
【請求項18】
ＰＯＤＸＬの発現が、（ａ）ＰＯＤＸＬをコードする組換えポリヌクレオチドを幹細胞に導入すること、および（ｂ）ＰＯＤＸＬの発現を可能にする条件下で幹細胞を培養することによって誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
キメラ胚を調製する方法であって、非ヒト宿主の受精胚を、ＰＯＤＸＬをコードする組換えポリヌクレオチドを含むヒト拡張型多能性細胞（ｈＥＰＳＣ）と接触させること、およびＰＯＤＸＬを過剰発現するｈＥＰＳＣと接触した宿主胚を培養してキメラ胚を形成させることを含む、方法。
【請求項20】
接触が、ｈＥＰＳＣを宿主胚に注入することによって実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
キメラ胚を、非ヒト宿主と同じ種の、偽妊娠した雌の非ヒトレシピエント動物に移植して、子孫を産ませること、および適宜、該子孫から臓器を得ることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、ある割合の体細胞をｉＰＳＣに脱分化させる条件において体細胞を培養することを含み、該条件がコレステロールを含む培養培地を含む、方法。
【請求項23】
体細胞が、皮膚細胞、例えば線維芽細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法を実行するための、またはそのような方法を実行するための組成物を製造するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＰＯＤＸＬモジュレーターの使用。
【請求項25】
リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理するための、または多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理するための組成物を製造するための、コレステロールの使用。
【請求項26】
ＰＯＤＸＬモジュレーターを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を実行するための組成物。
【請求項27】
培地組成物であり、細胞培養のための基礎培地を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
コレステロールを含む、リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理するための組成物。
【請求項29】
細胞培養のための培地組成物であり、基礎培地を含む、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条のもと、その全内容が引用により本明細書に包含されている、２０１８年１２月２６日出願の米国特許仮出願第６２／７８４，９４２号の利益を主張するものである。
本出願は、米国特許法第１１９条のもと、その全内容が引用により本明細書に包含されている、２０１８年１２月２６日出願の米国特許仮出願第６２／７８４，９４２号の利益を主張するものである。
【0002】
本発明は、ポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）およびコレステロールの発現を調整することによって多能性幹細胞（ＰＳＣ）の能力を調節する方法、ならびにその適用に関する。
【背景技術】
【0003】
初期胚の内部細胞塊から生成されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、無限に増殖する能力を有し、内胚葉、中胚葉および外胚葉、ならびに潜在的には胎盤を除くあらゆる細胞型に分化する（Thomson et al., 1998）。ｈＥＳＣは、エピブラスト細胞のように挙動し、プライム型（primed state）と主張された（Brons et al., 2007；Kumari、2016；Nichols and Smith、2009；Tesar et al., 2007）。培養培地を変更することによって、プライム型ＥＳＣをナイーブ様状態へと変えることができる。ナイーブ幹細胞はほとんど分化しておらず、マウスではキメラを形成することができる（Chan et al., 2013；Gafni et al., 2013；Guo et al., 2016；Takashima et al., 2014；Takeda et al., 2000；Theunissen et al., 2014；Wang et al., 2014；Ware et al., 2014）。ＣｅｌｌおよびＮａｔｕｒｅで２０１７年に発表された２つの論文は、細胞を４～７種の化学物質と共に培養することによる拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ、extended pluripotent stem cell）を主張した（Yang et al., 2017a；Yang et al., 2017b）。ＥＰＳＣは、２～４細胞期の胚のように挙動する。マウスモデルでは、ＥＰＳＣは、ナイーブ幹細胞と比較してはるかに高い効率で内部細胞塊に寄与しており、栄養外胚葉にも分布することができる（Yang et al., 2017a；Yang et al., 2017b）。
【0004】
再生医療におけるＥＳＣの潜在性はきわめて大きいが、免疫拒絶反応の問題を生じる。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４（またはＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＬｉｎ２８）によって体細胞をＥＳＣ様細胞へと変えている人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が、再生医療のための有望な手法となっている。（Okita et al., 2007；Park et al., 2008；Takahashi et al., 2007；Wernig et al., 2007；Yu and Thomson、2008；Zhao and Daley、2008）。ｉＰＳＣは、ＥＳＣと比較して、同じ性質を有しており、無限に増殖し、多能性を有し、異所注入した場合、奇形腫を形成する。ｉＰＳＣは、黄斑ジストロフィー、パーキンソン病、および心疾患の患者を対象として臨床試験が行われている。
【0005】
ＰＳＣ再生に関して、数多くの論文において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃのような転写因子が研究されてきた（Dunn et al., 2014；Hu et al., 2009；Jaenisch and Young、2008；Jiang et al., 2008；Kagey et al., 2010；Leeb et al., 2010；Silva et al., 2009；van den Berg et al., 2010；Young、2011）。しかしながら、膜貫通型タンパク質は詳しく研究されていない。ＥｐＣＡＭ（Kuan et al., 2017）およびＥ－カドヘリン（Chen et al., 2011）のようなごく少数の因子ならびにＣ９ＯＲＦ１３５が、マウスＥＳＣまたはｈＥＳＣにおいて研究されてきた（Zhou et al., 2017）。
【0006】
ＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１は広く使用されており、未分化ｈＥＳＣの判定基準マーカーである（Andrews、2011；Muramatsu and Muramatsu、2004）。ＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１は、ポドカリキシンタンパク質（ＰＯＤＸＬ、またポドカリキシン様タンパク質－１、ＭＥＰ２１、ＰＣＬＰ１、Ｇｐ２００／ＧＣＴＭ－２、およびＴｈｒｏｍｂｏｍｕｃｉｎ（トロンボムチン）とも呼ばれる）のグリカンエピトープである。注目すべきは、ＴＲＡ－１－６０は、部分的にリプログラムされた細胞から完全にリプログラムされたｉＰＳＣを確認するために使用することができることである（Chan et al., 2009）。対照的に、公知の転写因子、ＮＡＮＯＧは、完全にリプログラミングしている細胞を印付けるために使用することはできない（Chan et al., 2009）。ＰＯＤＸＬは、未分化状態にあるｈＥＳＣにおいて非常に多く発現される（Brandenberger et al., 2004；Cai et al., 2006；Kang et al., 2016）。その発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子アクチンと同程度に高い（Kang et al., 2016）。ＰＯＤＸＬ発現レベルは、コア転写因子、ならびにＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧより高い。ＰＯＤＸＬに対する細胞傷害性抗体は、発癌性の未分化ＥＳＣ／ｉＰＳＣを殺すことができる（Choo et al., 2008；Kang et al., 2016；Tan et al., 2009）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、ヒト多能性幹細胞(ｈＰＳＣ)におけるコレステロールの重要性は、依然として把握できていない。
【0008】
本発明では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の能力がポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）の発現を調整することを介して調節され得ることが、予想外に見出されている。ＰＯＤＸＬは、ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣリプログラミングのために必須である。マイクロアレイの結果を通して、ＰＯＤＸＬの下流にあり、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ／ＥＰＳＣ再生を維持しているコレステロール生合成経路を見出した。ＥＳＣは、３種の分化細胞型、線維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）、およびｈＥＳＣ由来神経幹細胞（ＮＳＣ）と比較して、コレステロール阻害剤、シンバスタチン／ＡＹ９９４４／ＭβＣＤに対する感受性が高い。ＰＯＤＸＬ－コレステロール経路は、癌遺伝子ｃ－ＭＹＣおよび不死化遺伝子テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の上流である。ＰＯＤＸＬおよびコレステロールはまた、脂質ラフト形成も調節していた。これらのデータは、ＥＳＣ／ｉＰＳＣ再生において、ＰＯＤＸＬは、膜から伝達するコレステロール代謝を組織化するタンパク質であることを指摘している。
【課題を解決するための手段】
【0009】
したがって、一面において、本発明は、多能性幹細胞の能力を調節する方法であって、幹細胞を有効量のＰＯＤＸＬモジュレーターに曝すことを含む方法を提供する。
【0010】
幾つかの態様において、モジュレーターは、ＰＯＤＸＬアンタゴニストである。詳細に言えば、本明細書に記載したようなＰＯＤＸＬアンタゴニストは、多能性幹細胞の能力を下方制御することにおいて有効である。
【0011】
幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬアンタゴニストは、抗ＰＯＤＸＬ抗体、ＰＯＤＸＬ標的干渉核酸、またはＰＯＤＸＬを阻害する低分子である。
【0012】
幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬアンタゴニストは、コレステロール合成阻害剤である。
【0013】
幾つかの態様において、幹細胞は、コレステロールを含まない培養培地中で培養される。
【0014】
幾つかの他の態様において、モジュレーターは、ＰＯＤＸＬアゴニストである。詳細に言えば、本明細書に記載したようなＰＯＤＸＬアゴニストは、多能性幹細胞、例えばＥＳＣ／ｉＰＳＣ／ＥＰＳＣの能力を上方制御することにおいて有効である。
【0015】
さらなる一面において、本発明は、分化細胞を調製する方法であって、
（ａ）未分化多能性幹細胞を分化に好適な条件に曝して、分化細胞および未分化多能性幹細胞を含む細胞集団を産生すること、
（ｂ）該細胞集団を有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤に曝すことによって、未分化多能性幹細胞を除去すること、および
（ｃ）適宜、残存する分化細胞を培養すること
を含む方法を提供する。
（ａ）未分化多能性幹細胞を分化に好適な条件に曝して、分化細胞および未分化多能性幹細胞を含む細胞集団を産生すること、
（ｂ）該細胞集団を有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤に曝すことによって、未分化多能性幹細胞を除去すること、および
（ｃ）適宜、残存する分化細胞を培養すること
を含む方法を提供する。
【0016】
幾つかの態様において、未分化多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）からなる群より選択される。
【0017】
幾つかの態様において、分化細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、肝細胞、心臓細胞、肺細胞、腸細胞、血球、胃細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、眼の細胞、耳の細胞、口腔細胞、および成体幹細胞（すべて分化細胞型）からなる群より選択される。
【0018】
多能性幹細胞の能力を調節する方法および分化細胞を調製する方法を含む本発明の方法を実行するための、本明細書に記載したようなＰＯＤＸＬモジュレーターの使用もまた提供される。さらに、多能性幹細胞の能力を調節する方法および分化細胞を調製する方法を含む本発明の方法を実行するための、本明細書に記載したようなＰＯＤＸＬモジュレーターを含む組成物が提供される。
【0019】
本発明はまた、必要とする対象における奇形腫を治療する方法であって、有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤を対象に投与することを含む方法も提供する。
【0020】
本発明は、多能性幹細胞の能力を上方制御する方法であって、幹細胞においてポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）の発現を誘導することを含む方法を、さらに提供する。
【0021】
幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬの発現は、（ａ）ＰＯＤＸＬをコードする遺伝子を含む組換え核酸配列を幹細胞に導入すること、および（ｂ）ＰＯＤＸＬの発現を可能にする条件下で幹細胞を培養することによって誘導される。
【0022】
幾つかの態様において、化学物質、成長因子、細胞内タンパク質などのＰＯＤＸＬアゴニストは、ＰＯＤＸＬの発現を上方制御することができる。
【0023】
幾つかの態様において、本明細書に記載したような多能性幹細胞は、ＥＰＳＣ、ＥＳＣ、および／またはｉＰＳＣであり得る。
【0024】
別の面において、本発明は、胚におけるキメラ化の効率を促進する方法であって、非ヒト宿主の受精胚を、ＰＯＤＸＬをコードする組換えポリヌクレオチドを含むヒト拡張型多能性幹細胞（ｈＥＰＳＣ）と接触させること、およびＰＯＤＸＬを過剰発現するｈＥＰＳＣと接触した宿主胚を培養してキメラ胚を形成させることを含む方法を提供する。
【0025】
幾つかの態様において、接触は、ｈＥＰＳＣを宿主胚に注入することによって実行される。
【0026】
幾つかの態様において、宿主胚は、動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えば雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験用動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）から生成する。
【0027】
幾つかの態様において、該方法は、キメラ胚を、非ヒト宿主と同じ種の偽妊娠した雌の非ヒトレシピエント動物に移植して、子孫を産ませること、および適宜、該子孫からヒト化臓器を得ることを、さらに含む。
【0028】
さらに、本発明において、コレステロールが、体細胞、例えば線維芽細胞などの皮膚細胞のリプログラミング効率をブーストし得ることが見出されている。したがって、本発明は、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、ある割合の皮膚細胞をｉＰＳＣに脱分化させ得る条件において体細胞を培養することを含み、該条件がコレステロールを含む培養培地を含む、方法を提供する。幾つかの態様において、体細胞は、例えば組換え核酸を導入することによって、遺伝子操作されて、１つまたは複数のリプログラミング因子、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃを含むＯＳＫＭを過剰発現する。リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理するための、コレステロールの使用もまた提供される。さらに、組成物、例えば、リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理することにおいて有用であるコレステロールおよび基礎培地（basic medium）を含む、培地組成物が提供される。
【0029】
本発明の１つまたは複数の態様の詳細を下記の説明において示す。本発明の他の特徴または利点は、以下の幾つかの態様の詳細な説明、さらには添付する特許請求の範囲からも明らかとなるであろう。
【0030】
前述の発明の概要、および後述の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読めばさらに理解が深まるであろう。本発明を説明するために、目下の好ましい態様を図面に示す。ただし、本発明は示された厳密な配置および手段に限定されるものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１Ａ～１Ｊ。ＰＯＤＸＬはｈＰＳＣの自己複製および生存能のために必須であり、ＰＯＤＸＬ発現レベルはヒト胚胎状態と関連している。図１Ａは、ＰＯＤＸＬ発現レベルが、胚の１細胞期から４細胞期にわたって濃縮したことを示す。対照的に、重要な幹細胞性遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＬｉｎ２８Ａ発現は、桑実期および胚盤胞期においてピークとなった。データは、ＧＥＯデータセットＧＳＥ１８２９０より算出した。図１Ｂ～１Ｃは、ＦＡＣＳ分析により、ＰＯＤＸＬ発現が、ｈＥＳＣでは、抗ＰＯＤＸＬタンパク質抗体（図１Ｂ）およびＴｒａ－１－６０抗体（図１Ｃ）によって検出したいずれの場合も、間葉系幹細胞および線維芽細胞と比較して大量であったことを示す。Ｔｒａ－１－６０抗体は、ＰＯＤＸＬのグリコールエピトープを認識した。図１Ｄは、ＰＯＤＸＬが、ｈＥＳＣでは、間葉系幹細胞および線維芽細胞（ＣＲＬ－２０９７）と比較して、より大量に発現されたことを示す。通常培養されたＥＳＣおよびＥＰＳＣでは、ＰＯＤＸＬは過剰発現されたが、分化したＥＳＣ（ＥＢ）または線維芽細胞（２０９７）では下方制御されことを示したウェスタンブロット分析。図１Ｅは、ｓｈＰ６ＯＤＸＬが、Ｓ６細胞の自己複製を遮断することを示す。ｓｈＰＯＤＸＬ形質導入体は、形態的変化を誘導した。ｓｈＲＦＰ（陰性対照として用いた）およびＰＯＤＸＬに対する２つの異なるｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＯＤＸＬ＃１、ｓｈＰＯＤＸＬ＃２）のレンチウイルスを感染させたＨＵＥＳ６ ｈＥＳＣの明視野像を使用した。スケールバー、２００μｍ。ＰＯＤＸＬのノックダウンは相対細胞数を減少させた。アラマーブルーアッセイは、ｓｈＲＮＡ処理したＳ６ ｈＥＳＣにおいて行った。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＰＯＤＸＬのノックダウンは、ＥＳＣにおける多能性マーカー発現を阻害した。アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）アッセイを行った。ＡＬＰレベルは、アラマーブルーアッセイ（ＡＢ）による相対細胞数に対して算出した。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１Ｆは、ｓｈＰ６ＯＤＸＬが、Ｈ９細胞およびｉＰＳＣ－０２０７の自己複製を遮断することを示す。ＰＯＤＸＬのノックダウンは相対細胞数を減少させた。アラマーブルーアッセイは、ｓｈＲＮＡ処理したＳ６ ｈＥＳＣにおいて行った。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＰＯＤＸＬのノックダウンは、ＥＳＣにおいて多能性マーカー発現を阻害した。アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）を行った。ＡＬＰレベルは、アラマーブルーアッセイ（ＡＢ）による相対細胞数に対して算出した。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１Ｇは、ウェスタンブロットによって、ＨＵＥＳ６細胞においてレンチウイルス感染の３日後、ｃ－ＭＹＣおよびＴＥＲＴが減少したことが実証されたことを示す。図１Ｈは、ｓｈＰＯＤＸＬ発現ｈＥＳＣがアポトーシス／壊死を誘導されたことを示す。アネキシンＶ－ＰＩによって染色するＦＡＣＳ分析によって証明された。細胞に、６日間、ｓｈＲＦＰおよびｓｈＰＯＤＸＬレンチウイルスを感染させた。定量結果。フローサイトメトリーによって測定したＨＵＥＳ６細胞のアポトーシスの割合をグラフ化した。エラーバーは、４回の反復実験の標準偏差を表す。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１Ｉは、ＰＯＤＸＬの下方制御が、ｉＰＳＣ形成効率を低下させたことを示す。ｉＰＳＣ生成のプロトコール。ヒト包皮線維芽細胞を、０日目にＯｃｔ４、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、およびＳｏｘ２、ＲＦＰまたはＰＯＤＸＬを発現するレンチウイルスで処理した。ＡＬＰアッセイを１６日目に実施した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイを実施した。赤に染色されたＡＬＰ陽性コロニーを数えた。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１Ｊは、ＰＯＤＸＬのノックダウンが、拡張型多能性幹細胞のコロニーの大きさおよびコロニーの数を低減させたことを示す。６日間、レンチウイルスを用いてｓｈＲＮＡを感染させたＨＵＥＳ６由来ＥＰＳＣの明視野像。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図2】図２Ａ～２Ｇ。ＰＯＤＸＬはプライム型および拡張型多能性を促進することができる。図２Ａは、ＰＯＤＸＬ過剰発現が、ｓｈＰＯＤＸＬによって阻害された自己複製能をレスキューすることを示す。アラマーブルーアッセイ、アルカリホスファターゼ活性アッセイ、およびウェスタンブロットアッセイを実施した（図２Ａ）。Ｐ値は、一元配置分散分析を用いてｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣとの比較によって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。図２Ｂは、ＰＯＤＸＬの過剰発現が、ＨＵＥＳ６細胞の相対細胞数および幹細胞再生能を上方制御したことを示す。ウェスタンブロットアッセイ、アラマーブルーアッセイ、クリスタルバイオレットアッセイ、トリパンブルー排除アッセイ、およびアルカリホスファターゼ活性アッセイを実施した。３日間のレンチウイルス感染の後、ＰＯＤＸＬまたはＧＦＰ過剰発現ｈＥＳＣを算出した。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を実施することによって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２Ｃは、ＰＯＤＸＬがｉＰＳＣ形成効率を促進することを示す。ｉＰＳＣ生成のプロトコールを上段パネルに記載した。０日目に、ヒト包皮線維芽細胞に、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、ならびにＧＦＰまたはＰＯＤＸＬを発現するレンチウイルスベクターを感染させた。１６日目に、細胞を採取し、解析した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイを実施し、リプログラムされたＡＬＰ陽性コロニーを数えた。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を実施することによって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２Ｄは、ＰＯＤＸＬ発現ＥＰＳＣが、より多くのドーム形状コロニーを形成したことを示す。ＰＯＤＸＬを過剰発現させたＥＰＳＣのプロトコール（上段パネル）。フィーダー層を含まない、４日目のｈＥＰＳＣの明視野像。図２Ｅは、ｈＥＰＳＣにおけるＰＯＤＸＬの過剰発現が、コロニー数およびコロニーの大きさを増大させたことを示す。細胞は、６日間、薬剤を用いて選択した。コロニーの大きさは、イメージＰｒｏソフトウエアによって算出し、３連で実施した。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を実施することによって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２Ｆは、フィーダーを含まないＥＰＳＣ培養条件において、ＰＯＤＸＬの過剰発現が、細胞数およびＡＬＰ活性を上方制御したことを示す。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を実施することによって算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２Ｇは、ＰＯＤＸＬ過剰発現が、ＥＰＳＣにおけるドーム形状細胞形成を改善させたことを示す。Ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定を実施することによって算出した（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図3】図３Ａ～３Ｅ。ＰＯＤＸＬはＳＲＥＢＰ／ＨＭＧＣＲを調整することによって細胞のコレステロールレベルを上昇させる。図３Ａは、コレステロール合成の律速酵素ＨＭＧＣＲの発現が、ＰＯＤＸＬの上方制御または下方制御によって変化することを示す。３連の実験において、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によると、ＨＭＧＣＲおよび数種のコレステロール関連遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＯＤＸＬ下方制御ｈＥＳＣにおいて低下している。Ｐ値は、一元配置分散分析を実行することによって、ｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＨＭＧＣＲ ｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＯＤＸＬ過剰発現ｈＥＳＣにおいて上昇している。ＱＲＴ－ＰＣＲ分析は、３連で実施した。Ｐ値は、スチューデントの対応のないｔ検定を実行することによって、ＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ウェスタンブロットは、ＨＭＧＣＲ、ｃ－ＭＹＣ、およびＴＥＲＴの発現レベルが、ＰＯＤＸＬ過剰発現ｈＥＳＣにおいて上昇することを示す。ウェスタンブロットは、レンチウイルス形質導入の３日後に行った。ウェスタンブロットは、ｈＥＰＳＣ培養条件下、ｓｈＰＯＤＸＬを形質導入したＨＵＥＳ６において、ＨＭＧＣＲ、ｃ－ＭＹＣが下方制御されることを実証している。ウェスタンブロットは、６日間のレンチウイルス形質導入の後に行った。図３Ｂは、ＰＯＤＸＬを上方制御または下方制御した場合、コレステロールレベルが変化することを示す。コレステロールレベルは、ｓｈＰＯＤＸＬを形質導入したｈＥＳＣでは下方制御されている。細胞のコレステロール含有量は、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイキットによって調べた。Ｐ値は、一元配置分散分析を行うことによって、ｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。コレステロールレベルは、ＰＯＤＸＬ過剰発現ｈＥＳＣでは上方制御されている。Ｐ値は、スチューデントの対応のないｔ検定を行うことによって、ＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図３Ｃは、ｓｈＨＭＧＣＲがｈＥＳＣの自己複製を阻害することを示す。ｓｈＨＭＧＣＲレンチウイルスを形質導入したＨＵＥＳ６およびＨ９細胞の明視野像。ウイルスは、４日間、感染させた。ウェスタンブロット。ＨＭＧＣＲ、ｃ－ＭＹＣ、ＴＥＲＴは、ｓｈＨＭＧＣＲ感染ｈＥＳＣにおいて減少している。クリスタルバイオレットアッセイ、アルカリホスファターゼアッセイ。ｓｈＨＭＧＣＲにおける自己複製能の低下を示したアラマーブルーアッセイ。Ｐ値は、一元配置分散分析を実行することによって、ｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図３Ｄは、ウェスタンブロットが、ＥＰＳＣ培養物において、ＰＯＤＸＬを上方制御および下方制御した場合、ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２、ＨＭＧＣＲ発現レベルが変化したことを実証していることを示す。（上段パネル）規定培地中で培養されたｈＥＳＣにおいて、ＰＯＤＸＬの下方制御がＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２の発現を阻害することを示したウェスタンブロット。（下段左パネル）ＰＯＤＸＬのノックダウンは、ＨＭＧＣＲ、ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２、およびｃ－ＭＹＣ発現を下方制御した。（下段右パネル）ＰＯＤＸＬ発現の上方制御は、ＨＭＧＣＲ、ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２、テロメラーゼ、およびｃ－ＭＹＣ発現を増加させた。図３Ｅは、クロマチン結合ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２のレベルが、ＰＯＤＸＬを下方制御および上方制御した場合、変化したことを示す。（上段パネル）ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２、およびｃ－ＭＹＣタンパク質の細胞内局在化。ｓｈＰＯＤＸＬおよびｓｈＲＦＰウイルスを、３日間、ｈＥＳＣに形質導入した。ヒストン３（Ｈ３）、ＨＤＡＣ２、およびβ－チューブリン（β－ＴＵＢ）を、クロマチン結合画分、可溶性核画分、および細胞質画分のマーカーとして用いる。（下段パネル）ウェスタンブロットは、３日目における、ＰＯＤＸＬ過剰発現ｈＥＳＣにおけるＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２、およびｃ－ＭＹＣタンパク質の細胞内局在化を実証している。
【図4】図４Ａ～４Ｃ。コレステロールはｈＰＳＣ再生に必須である。図４Ａは、コレステロール生合成の概略図を示す。ＰＯＤＸＬ過剰発現細胞では、コレステロール合成酵素（ＨＭＧＣＳ１、ＨＭＧＣＲ、ＳＱＬＥ、ＤＨＣＲ７）、コレステロールレベルセンサー（ＩＮＩＳ１Ｇ１）、およびＬＤＬＲ阻害剤（ＰＣＳＫ９）が、差次的に発現される。シンバスタチンはＨＭＧＣＲの酵素活性を遮断し、一方、ＡＹ９９４４はＤＨＣＲ７酵素活性を阻害する。ＭＢＣＤは、脂質ラフトにおけるコレステロールを除去する。図４Ｂは、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、およびＭＢＣＤがｈＥＳＣ再生を遮断したことを示す。（左パネル）ＨＵＥＳ６ ｈＥＳＣにおいて、３日間のシンバスタチン、ＡＹ９９４４、およびＭＢＣＤによる処理によって妨げられた、アルカリホスファターゼ活性。（右パネル）ウェスタンブロットは、シンバスタチンが、ＴＥＲＴ、ｃ－ＭＹＣ、ＨＭＧＣＲ、ＰＯＤＸＬ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１の発現を遮断することを実証している。図４Ｃは、３種の阻害剤が、ＰＯＤＸＬが媒介する幹細胞マーカー発現を遮断することを示す。アラマーブルーアッセイおよびアルカリホスファターゼ活性を、３日間の３種の阻害剤処理について調べた。スチューデントの対応のないｔ検定（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を、ＧＦＰ対照ｈＥＳＣに対して実施した。
【図5】図５Ａ～５Ｂ。コレステロールの付加はＰＯＤＸＬノックダウン細胞におけるｈＥＳＣ再生をレスキューする。図５Ａは、コレステロールが、ｓｈＰＯＤＸＬによりノックダウンされた相対細胞数および幹細胞マーカー発現を回復させることを示す。４日間コレステロールを付加したＰＯＤＸＬ下方制御ＨＵＥＳ６ ｈＥＳＣにおいて、アラマーブルーアッセイおよびＡＬＰ活性を実施した。図５Ｂは、コレステロール付加が、ＰＯＤＸＬノックダウンｈＥＳＣにおいてアポトーシスを低減させることを示す。アネキシンＶ／ＰＩ陽性細胞の定量化は、３連で行った（下段左パネル）。Ｐ値は、一元配置分散分析を実施することによって、ｓｈＲＦＰ ｈＥＳＣに対して算出した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（下段右パネル）コレステロールは、ｓｈＰＯＤＸＬの発現によるｃ－ＭＹＣ／ＴＥＲＴ発現低下を回復させている。ウェスタンブロットは、コレステロールを４日間付加したＰＯＤＸＬノックダウンＨＵＥＳ６ ｈＥＳＣにおいて行った。
【図6】コレステロールの付加はｉＰＳＣリプログラミング効率を促進する。ＣＲＬ２０９７（９代）を播種し、５００×濃縮ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（登録商標）ＮＳ０ サプリメント（Ｓ５４４２、Ｓｉｇｍａ）から希釈した最終濃度（０、０．５×、１×、２×、５×、８×）のコレステロールを加えて、レンチウイルスベクター（ＯＳＫＭ）を感染させた。アルカリホスファターゼアッセイを実施してリプログラミング効率を検定した。
【図7】誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＰＯＤＸＬノックアウトｉＰＳＣは、ＰＳＣの自己複製を遮断する。（上段パネル）このアッセイで使用したｓｇＲＮＡの位置の局在化。ｓｇＲＮＡ標的配列は、ＰＯＤＸＬ座位の５’ＵＴＲおよびイントロン１において位置付けた。サイズが５３７ｂｐであるエクソン１を、ゲノムから欠失させた。垂直方向の矢印は、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、およびｓｇＲＮＡ３の標的位置を指し示した。アラマーブルーアッセイによって測定された相対細胞数は、３日間および５日間薬剤選択された誘導性ＰＯＤＸＬノックアウト細胞において、それぞれ算出した。３日間薬剤選択された誘導性ＰＯＤＸＬノックアウト細胞における幹細胞マーカー発現について、それぞれＡＬＰアッセイを実施した。
【発明を実施するための形態】
【0032】
別段の定義がない限り、本明細書において使用する技術および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【0033】
１．定義
本明細書で用いる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で別段の明確な記載がない限り、複数の対象を含む。よって、例えば、「構成要素（a component）」への言及には、複数のそのような構成要素および当業者に既知のそれらの均等物が含まれる。
本明細書で用いる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で別段の明確な記載がない限り、複数の対象を含む。よって、例えば、「構成要素（a component）」への言及には、複数のそのような構成要素および当業者に既知のそれらの均等物が含まれる。
【0034】
「含む（comprise）」または「含むこと（comprising）」という用語は、１つまたは複数の特徴、成分、または構成要素の存在を許すことを意味する、含む（include）／含むこと（including）という意味で、一般的に使用される。「含む（comprise）」または「含むこと（comprising）」という用語は、「なる（consist）」または「からなる（consisting of）」という用語を包含する。
【0035】
本明細書で用いる「約」という用語は、使用されている数の数値のプラスまたはマイナス５％を意味する。
【0036】
本明細書で用いる、「多能性幹細胞」または「未分化多能性幹細胞」という用語は、自己複製することができ、多能性である細胞を意味する。「多能性」という用語は、あらゆる細胞系列に分化する細胞の能力を意味する。具体的には、多能性細胞は、３つの主要な胚葉：内胚葉、外胚葉、および中胚葉に分化することができる細胞を含む。一般的に、未分化多能性幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり、胚の供給源、例えば前胚、受精後の胚の８日前の胚に由来していてもよい。未分化多能性幹細胞にはまた、１つまたは複数の特異的遺伝子を挿入することによってかまたは化学物質を用いて刺激することによって非多能性細胞（例えば、体細胞）から人為的に誘導される人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）も、含むことができる。加えて、人工多能性幹細胞は、２つの特有の特性、すなわち自己複製能および多能性を有するという点で、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）と同じであるとみなされる。未分化多能性幹細胞にはまた、拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）も含めた。ＥＰＳＣは、胚注入した場合、栄養外胚葉および内部細胞塊に分化することができる。ＥＳＣおよびＩＰＳＣは、奇形腫を形成することができる。ヒトＥＳＣ、ＩＰＳＣ、またはＥＰＳＣは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、アルカリホスファターゼなどの特定の細胞マーカーを発現することがさらに知られている。
【0037】
本明細書で用いる、「能力」という用語は、典型的には、他の細胞型に分化する細胞の能力を含み得る。細胞が分化することができる細胞型が多いほど、その能力は大きい。場合によって、「能力」という用語は、細胞の自己複製能および／または成長／増殖／生存能もまた一般的に含み得る。
【0038】
本明細書で用いる、「拡張された細胞能力（extended cell potency）」という用語は、対応する細胞の少なくとも１つおよび複数の細胞型に分化する幹細胞の能力を意味する。
【0039】
本明細書で用いる、「拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）」という用語は、ＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来するものと比較した場合、インビボで（ｉｎ ｖｉｖｏ）胚体外系列を生成する能力が向上した多能性幹細胞を指し得る（Yang et al., 2017a；Yang et al., 2017b）。ＥＰＳＣは、４～７種の化学物質を用いてＥＳＣ／ｉＰＳＣを処理することによって生成される（Yang et al., 2017a；Yang et al., 2017b）。詳細に言えば、ＥＰＳＣは、胚の２～４細胞期を模倣し、内部細胞塊および栄養外胚葉（胎盤）のどちらにも寄与することができる。ＥＰＳＣは、ナイーブ型幹細胞と比較して、より優れた内部細胞塊におけるキメラ形成能を有する。ヒトナイーブ型幹細胞は、ナイーブ誘導培地を用いて生成させることができる（Chan et al., 2013；Gafni et al., 2013；Guo et al., 2016；Takashima et al., 2014；Takeda et al., 2000；Theunissen et al., 2014；Wang et al., 2014；Ware et al., 2014）。ナイーブ型およびＥＰＳＣはいずれも、マウスモデルにおけるキメラ化に寄与できるが、規定培地中で培養されたプライム型ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣは寄与することはできない。
【0040】
本明細書で用いる、幹細胞の「能力を調節すること」という句は、細胞の能力の１つまたは複数の特定の特徴を上方制御するかまたは下方制御することを含んでもよい。例えば、そのような手法を用いていない同じ細胞と比較した場合、幹細胞の能力を上方制御することは、上方制御する手法（例えば、細胞をＰＯＤＸＬアゴニストと接触させること）を介して、多能性を増強することおよび／または細胞の自己複製能／成長／増殖／生存を促進することを含んでもよく、幹細胞の能力を下方制御することは、下方制御する手法（例えば、細胞をＰＯＤＸＬアンタゴニストと接触させること）を介して、多能性を低下させることおよび／または細胞の自己複製能／成長／増殖／生存を阻害することを含んでもよい。
【0041】
本明細書で用いる、「分化」という用語は、多能性幹細胞を、特定の形態または機能の細胞のために濃縮される後代に分化させる過程を意味する。分化とは、相対的な過程である。成熟体細胞、例えば、骨芽細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、脂肪細胞（脂肪）、肝細胞（肝臓）、内皮細胞、ニューロン細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、肝細胞、心臓細胞、肺細胞、腸細胞、血球、胃細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、眼の細胞、耳の細胞、口腔細胞、成体幹細胞（すべて分化細胞型）は、自発的条件下で様々な細胞型に分化する能力を既に失い、最終分化されている可能性がある。
【0042】
本明細書で用いる、未分化多能性幹細胞に関して使用する場合の「除去する」または「排除する」という用語は、元の試料中のその他の成分からの、または処理の１つまたは複数の工程の後に残存している試料中の成分からの、そのような細胞の単離または分離を意味する。その他の成分には、例えば、その他の細胞、特に分化細胞が含まれ得る。標的細胞の除去または排除は、例えば試料中で分化細胞などのその他の成分が濃縮されるような、本明細書において使用するような化合物を適用することによって、試料中の標的細胞を殺すか、抑制するか、または枯渇させることを含んでもよい。標的細胞を殺すことには、アポトーシスまたは細胞に対する細胞傷害性を引き起こすことが含まれ得る。標的細胞を抑制することまたは枯渇させることには、測定可能な量による、数、割合、増殖、または活性（多能性能または腫瘍形成活性）の低減が含まれ得る。除去は、部分的であっても完全であってもよい。本明細書で用いる、未分化多能性幹細胞を実質的に含まない試料または培養物は、例えば、約１０％未満の、約５％未満の、約４％未満の、約３％未満の、約２％未満の、約１％未満の、または検出不可能な未分化多能性幹細胞を含有し得る。
【0043】
本明細書で用いる、「培養物」という用語は、培地を用いてインキュベートされた細胞の群を意味する。該細胞は継代され得る。細胞培養物は、動物組織から単離された後、継代されていない初代培養物であってもよく、または多数回継代されていてもよい（１回または複数回の継代培養物）。
【0044】
本明細書で用いる、「対象」という用語は、ヒト、ならびに愛玩動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えば雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験用動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）などの非ヒト動物を含む。
【0045】
本明細書で用いる、「処理すること」という用語は、疾患、疾患の症状もしくは状態、または疾患の進行を患う対象に、疾患、疾患の症状もしくは状態、疾患によって誘発された障害、または疾患の進行を、治癒させるか、回復させるか、軽減するか、緩和するか、変化させるか、治療するか、改善させるか、好転させるか、または影響する目的で、１種または複数の活性薬剤を含む組成物を適用または投与することを意味する。
【0046】
本明細書で用いる、「有効量」という用語は、処置される細胞または対象において生物学的作用を付与する有効成分の量を意味する。有効量は、処置経路および頻度、体重、ならびに前記有効成分を投与される細胞または個体の種などの、様々な理由に応じて、変更してもよい。
【0047】
ポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ）は、ＰＯＤＸＬ遺伝子によってコードされる、ＣＤ３４ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質である。具体的には、ヒトＰＯＤＸＬは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ヒトＰＯＤＸＬをコードするＰＯＤＸＬ遺伝子は、配列番号２の核酸配列を含む。
【0048】
本明細書で用いる、ＰＯＤＸＬのモジュレーターは、細胞を処理した場合、細胞においてＰＯＤＸＬ発現を上方制御するかまたは下方制御することができる薬剤、物質、または分子を意味する。具体的には、ＰＯＤＸＬアゴニストには、細胞を処理した場合、細胞におけるＰＯＤＸＬ発現レベルを、対照細胞（アゴニストの処理なし）のＰＯＤＸＬ発現レベルと比較して上方制御する（増強する）ことができる薬剤、物質、または分子が含まれる。ＰＯＤＸＬアンタゴニストには、細胞を処理した場合、細胞におけるＰＯＤＸＬ発現レベルを、対照細胞（アンタゴニストの処理なし）のＰＯＤＸＬ発現レベルと比較して下方制御する（低下させる）ことができる薬剤、物質、または分子が含まれる。
【0049】
本発明によると、ＰＯＤＸＬモジュレーターが、多能性幹細胞の能力を調節するために使用され得ることが初めて見出されている。幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬアゴニストは、多能性幹細胞の能力を上方制御する（増強する）ために使用される。幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬをコードする組換え核酸分子が、細胞においてＰＯＤＸＬを過剰発現させるために幹細胞に導入され、その後、該細胞は、多能性幹細胞の上方制御された（増強された）能力を示す。
【0050】
他の態様において、ＰＯＤＸＬアンタゴニストが、多能性幹細胞の能力を下方制御する（低下させる）ために使用される。具体的には、ＰＯＤＸＬアンタゴニストは、抗ＰＯＤＸＬ抗体、ＰＯＤＸＬ標的干渉核酸、またはＰＯＤＸＬを阻害する化合物であり得る。一部の特定の場合において、本明細書で用いるＰＯＤＸＬアンタゴニストは、コレステロール合成の阻害剤である。
【0051】
特定の態様において、本発明の方法は、前記試料を有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストに曝すことによって、培養試料から未分化多能性幹細胞を除去することである。
【0052】
特定の態様において、本発明の方法は、分化細胞を調製することであって、分化に好適な条件で未分化多能性幹細胞を培養して分化細胞および未分化多能性幹細胞を含む細胞集団を産し、該細胞集団を有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤に曝すことによって未分化多能性幹細胞を除去し／殺し；適宜、好適な条件、例えば細胞療法のために十分な細胞数を得るのに許容可能な条件で、残存する分化細胞を培養することである。
【0053】
幾つかの態様において、未分化多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される。好ましくは、該多能性幹細胞はヒト由来である。ヒトＥＳＣは、当技術分野において既知の技術を使用してヒト胚盤胞細胞から得ることができる。ヒトＩＰＳＣは、好適な体細胞ドナー細胞、例えば、ヒト線維芽細胞または血球を単離し、培養することによって調製され得、当技術分野において既知の技術を使用して遺伝子操作され得る。
【0054】
幾つかの態様において、本発明による未分化多能性幹細胞および／または分化細胞を培養するのに好適な培養培地は、当技術分野において利用可能であり、２０％ウシ胎仔血清または２０％ノックアウト血清を含む、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、またはＩＭＥＭ培地などである。培養は、通常の条件、例えば、１～５％ＣＯ２下、３７℃で行われ得る。分化は、所望の細胞系列に向かう分化を促進する培地成分を加えることによって促進され得る。ある態様において、本明細書で用いる適切な培養培地は、コレステロールを含まない市販の培地である。
【0055】
幾つかの態様において、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＡｌｂｕＭＡＸ Ｉ、Ｎ２サプリメント、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含有する。
【0056】
幾つかの態様において、培養培地は、ＥＰＳＣ誘導の有利になるように、１種または複数の成長因子および／または培養サプリメントを含んでもよい。培養サプリメントの例としては、Ｎ２、Ｂ２７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ、非必須アミノ酸、β－メルカプトエタノールおよびノックアウト血清代替物、組換えヒトＬＩＦ、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、（Ｓ）－（＋）－マレイン酸ジメチンデン、塩酸ミノサイクリン、ならびにＹ－２７６３２が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
ＰＯＤＸＬアンタゴニストによる処理によって残存する未分化多能性幹細胞を選択的に殺し、それらの分化した後代から除去することができるため、残存する未分化多能性幹細胞を除去した後の分化した後代を含む試料を、腫瘍形成リスクの低い細胞療法において適用することができる。特に、ＰＯＤＸＬアンタゴニストによる処理後に生きている未分化多能性幹細胞の量は、対照の細胞（例えば、そのような処理をしていない同じ細胞）より約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ない。より具体的には、除去は完璧なものである。すなわち、そのような処理後の未分化多能性幹細胞は完全に死滅し、残存する未分化多能性幹細胞は検出することができない。
【0058】
さらに、本発明はまた、必要とする対象における奇形腫を治療する方法であって、有効量のＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0059】
幾つかの態様において、ＰＯＤＸＬアンタゴニストまたはコレステロール合成阻害剤は、シンバスタチン［（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）－１，２，３，７，８，８ａ－ヘキサヒドロ－３，７－ジメチル－８－［２－［（２Ｒ，４Ｒ）－テトラヒドロ－４－ヒドロキシ－６－オキソ－２Ｈ－ピラン－２－イル］エチル］－１－ナフタレニリ（naphthalenyly）－２，２－ジメチルブタノアート］、ＡＹ９９４４（ｔｒａｎｓ－Ｎ，Ｎ－ビス［２－クロロフェニルメチル］－１，４－シクロヘキサンジメタンアミンジヒドロクロライド）、ＭＢＣＤ（メチル－β－シクロデキストリンメチル－β－シクロデキストリンシクロマルトヘプタオース、メチルエーテル）、プラバスタチン（pracastatin）、アトルバスタチン、ピタバスタチン、アバシミベ（rovasimibe）、ＶＵＬＭ １４５７、ＹＭ７５０、Ｕ １８６６６Ａ、ＣＩ９７６、Ｒｏ ４８－８０７１フマラート、ＡＫ ７、ＢＭＳ ７９５３１１、ラリッスタット１（Ｌａｌｉｓｔａｔ １）、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ＳＢ２０４９９０、フィリピンＩＩＩ（Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ）、ＧＧＴＩ２９８、トルセトラピブ、オルリスタット（Ｏｒｌｉ ｓｔａｓ）、エゼチミブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシズマブ（Bococitumab）、ナイアシン、アムロジピンからなる群より選択される。
【0060】
【化1】
シンバスタチン
【化2】
【化3】
【0061】
本発明によると、ＰＯＤＸＬの活性化が、幹細胞、特に拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）の能力を増強することができ、よって、キメラ胚がより効率的な手法で調製され得ることが見出されている。
【0062】
特定の態様において、本発明の方法は、キメラ胚を調製することであって、非ヒト宿主の受精胚を、ＰＯＤＸＬをコードする組換えポリヌクレオチドを含むヒトＥＰＳＣと接触させること、およびＰＯＤＸＬを過剰発現するｈＥＰＳＣと接触した宿主胚を培養してキメラ胚を形成させることを含む。具体的には、ヒトＥＰＳＣは、宿主受精胚に注入される。調製されたキメラ胚を、宿主と同じ種の偽妊娠した雌の非ヒトレシピエント動物に移植して、子孫を産ませ、該子孫から臓器を採取することができ、これを治療の目的で、必要とする対象に移植することができる。
【0063】
本発明はまた、ＰＯＤＸＬモジュレーター、例えばＰＯＤＸＬアゴニストもしくはＰＯＤＸＬアンタゴニスト、または組成物、例えば多能性幹細胞の能力を調節する方法および分化細胞を調製する方法を含む本発明の方法を実行するための培地組成物、の使用も提供する。
【0064】
本発明は、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、ある割合の皮膚細胞をｉＰＳＣに脱分化させることを可能にする条件において体細胞を培養することを含み、該条件がコレステロールを含む培養培地を含む、方法をさらに提供する。幾つかの態様において、体細胞は、例えば組換え核酸を導入されることによって、遺伝子操作されて、１種または複数のリプログラミング因子、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃを含むＯＳＫＭを過剰発現する。リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理するための、コレステロールの使用もまた提供される。さらに、組成物、例えば、リプログラミングを介して体細胞から多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するために体細胞を処理することにおいて有用であるコレステロールおよび基礎培地を含む、培地組成物が提供される。特に、コレステロールは、体細胞をｉＰＳＣへリプログラミングすることにおいて有効な量で組成物中に存在する。
【0065】
本発明を下記実施例によってさらに例証するが、これらは、限定ではなく、実証を目的として提供されるものである。当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示されている特定の態様においてなされることが可能であり、それらによって同様のまたは類似の結果がなお得られることを理解されたい。
【実施例】
【0066】
腫瘍転移において十分に特徴付けされている機能を除いては、ｈＰＳＣにおける膜貫通型糖タンパク質ポドカリキシン様タンパク質１（ＰＯＤＸＬ、またポドカリキシン様タンパク質－１、ＰＣＬＰ１、ＭＥＰ２１、Ｇｐ２００／ＧＣＴＭ－２、およびトロンボムチンとも呼ばれる）の機能は不明である。ここでは、未分化ｈＰＳＣにおけるＰＯＤＸＬのノックダウンが、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼタンパク質の発現をあまねく遮断して、自己複製能を有意に阻害したことを実証する。注目すべきは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）の誘導またはリプログラミングは、ＰＯＤＸＬをノックダウンした場合、著しく遮断されることである。矛盾なく、ＰＯＤＸＬの上方制御は、ｈＰＳＣ再生を容易にし、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼの発現を増進させ、ｉＰＳＣ／ＥＰＳＣ形成を促進する。マイクロアレイ分析では、ＰＯＤＸＬの過剰発現は、コレステロール生合成を制御するＨＭＧＣＲ発現を活性化している。ＰＯＤＸＬは、ＳＲＥＢＰ１／２発現もまた上方制御することが見出された。注目すべきは、ｈＰＳＣは、コレステロール阻害剤、ならびに自己複製能および生存能の阻害をもたらす脂質ラフト破壊に対し、より感受性が高いことである。コレステロールは、ｓｈＰＯＤＸＬノックダウンが媒介した多能性喪失を、用量依存的に完全にレスキューすることができる。コレステロールは、ｓｈＲＮＡによって下方制御されたＴＥＲＴ、ｃ－ＭＹＣ、およびＨＭＧＣＲの発現もまた明らかにレスキューする。我々のデータは、ｈＰＳＣ自己複製を制御するコレステロール代謝を調節することにおいて、ＰＯＤＸＬが重要であることを強調するものである。
【0067】
１．材料および方法
１．１ プライム型ｈＰＳＣの培養
ＨＵＥＳ６（Ｓ６）細胞株は、Ｄｏｕｇｌａｓ Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ博士の研究室（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）から厚意により提供されたものである（Cowan et al., 2004）。ＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）から入手した（Thomson et al., 1998）。ｉＰＳＣ－０１０２およびｉＰＳＣ－０２０７細胞株は、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（台湾）から持ち帰った。
１．１ プライム型ｈＰＳＣの培養
ＨＵＥＳ６（Ｓ６）細胞株は、Ｄｏｕｇｌａｓ Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ博士の研究室（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）から厚意により提供されたものである（Cowan et al., 2004）。ＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）から入手した（Thomson et al., 1998）。ｉＰＳＣ－０１０２およびｉＰＳＣ－０２０７細胞株は、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（台湾）から持ち帰った。
【0068】
フィーダーフリー実験では、細胞は、合成培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地）で培養した。
【0069】
１．２ ヒトＥＰＳＣの培養
ヒトＥＰＳ細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、Ｎ２Ｂ２７－ＬＣＤＭ培地中で維持した。４００ｍｌのＮ２Ｂ２７－ＬＣＤＭの場合、１９３ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１３３０－０３２）、１９３ｍＬ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１１０３－０４９）、２ｍＬ Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１７５０２－０４８）、４ｍＬ Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２５８７－０１０）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３５０５０－０６１）、１％非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１１４０－０５０）、０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ３１４８）、および５％ノックアウト血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３１８１５０２）、組換えヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０５）、ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ；ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃ－６５５６）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（１μＭ；Ａｂｍｏｌｅ、Ｍ２７８２）、（Ｓ）－（＋）－マレイン酸ジメチンデン（ＤｉＭ、２μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ、１４２５）、および塩酸ミノサイクリン（ＭｉＨ、２μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ、３２６８）、Ｙ－２７６３２（２μＭ、ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｙ－５３０１）が含まれる。ヒトＥＰＳＣは、マイトマイシンＣで不活性化させたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で継代した（１ｃｍ２当たり３＊１０４細胞）。
ヒトＥＰＳ細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、Ｎ２Ｂ２７－ＬＣＤＭ培地中で維持した。４００ｍｌのＮ２Ｂ２７－ＬＣＤＭの場合、１９３ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１３３０－０３２）、１９３ｍＬ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１１０３－０４９）、２ｍＬ Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１７５０２－０４８）、４ｍＬ Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２５８７－０１０）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３５０５０－０６１）、１％非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１１４０－０５０）、０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ３１４８）、および５％ノックアウト血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３１８１５０２）、組換えヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０５）、ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ；ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃ－６５５６）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（１μＭ；Ａｂｍｏｌｅ、Ｍ２７８２）、（Ｓ）－（＋）－マレイン酸ジメチンデン（ＤｉＭ、２μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ、１４２５）、および塩酸ミノサイクリン（ＭｉＨ、２μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ、３２６８）、Ｙ－２７６３２（２μＭ、ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｙ－５３０１）が含まれる。ヒトＥＰＳＣは、マイトマイシンＣで不活性化させたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で継代した（１ｃｍ２当たり３＊１０４細胞）。
【0070】
フィーダーフリー条件では、ｈＰＳＣは、レンチウイルス形質導入の前に、５％ＫＳＲの非存在下のＮ２Ｂ２７－ＬＣＤＭ培地中で１日、培養した。
【0071】
１．３ 胚様体形成
胚様体（ＥＢ）を形成させるために、ｈＥＳＣを剥離し、細胞凝集塊を、１３日間、ｂＦＧＦを含まないｈＰＳＣ培地中で継代した。
胚様体（ＥＢ）を形成させるために、ｈＥＳＣを剥離し、細胞凝集塊を、１３日間、ｂＦＧＦを含まないｈＰＳＣ培地中で継代した。
【0072】
１．４ アラマーブルーアッセイおよびトリパンブルー排除アッセイ
ｈＥＳＣは、１５％アラマーブルーを含有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１５１７００１）を用いて、３７℃で５時間、培養した。活性は、５７０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって算出した。細胞数をトリパンブルーアッセイによって数えるために、細胞をトリプシンで処理し、懸濁細胞に０．２％トリパンブルーを混ぜ（１：１）、血球計算器を用いて数えた。
ｈＥＳＣは、１５％アラマーブルーを含有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１５１７００１）を用いて、３７℃で５時間、培養した。活性は、５７０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって算出した。細胞数をトリパンブルーアッセイによって数えるために、細胞をトリプシンで処理し、懸濁細胞に０．２％トリパンブルーを混ぜ（１：１）、血球計算器を用いて数えた。
【0073】
１．５ クリスタルバイオレット染色アッセイ
ｈＥＳＣを、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間、固定した。細胞を、０．１％クリスタルバイオレットを用いて、１０分間、染色した。ＰＢＳで洗浄した後、抽出溶液を加えた。吸光度を、５９０ｎｍにて測定した。
ｈＥＳＣを、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間、固定した。細胞を、０．１％クリスタルバイオレットを用いて、１０分間、染色した。ＰＢＳで洗浄した後、抽出溶液を加えた。吸光度を、５９０ｎｍにて測定した。
【0074】
１．６ アルカリホスファターゼ活性および染色アッセイ
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、培養培地中にＡＬＰの基質であるｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）（Ｎ７６５３、ｓｉｇｍａ）を加えることによって算出した。プレートを３７℃で５分未満インキュベートし、次いで吸光度を４０５ｎｍにて測定した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色では、ｈＰＳＣをまずＰＢＳで洗浄し、固定液として４％ホルムアルデヒドを使用した。３分間の固定の後、細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、ＡＬＰ染色試薬（Ｓｉｇｍａ）によって染色した。次いで、細胞をＰＢＳによってさらに洗浄した。
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、培養培地中にＡＬＰの基質であるｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）（Ｎ７６５３、ｓｉｇｍａ）を加えることによって算出した。プレートを３７℃で５分未満インキュベートし、次いで吸光度を４０５ｎｍにて測定した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色では、ｈＰＳＣをまずＰＢＳで洗浄し、固定液として４％ホルムアルデヒドを使用した。３分間の固定の後、細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、ＡＬＰ染色試薬（Ｓｉｇｍａ）によって染色した。次いで、細胞をＰＢＳによってさらに洗浄した。
【0075】
１．７ レンチウイルス作製およびｈＥＳＣ形質導入
レンチウイルス作製は、一部の修正を加えて、先述のように行った（Huang et al., 2014）。手短に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した（１０ｃｍディッシュ当たり７５０万個）。次いで、細胞に以下のプラスミド（１９．２μｇ）をトランスフェクトした。ＰＯＤＸＬのｃＤＮＡ、ｓｈＰＯＤＸＬ（ｓｈＰＯＤＸＬ＃１：ＴＲＣＮ００００３１０１１７、５’－ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＴ－３’（配列番号３）；ｓｈＰＯＤＸＬ＃２：ＴＲＣＮ００００１１７０１９、５’－ＧＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴ－３’（配列番号４））（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｔａｉｐｅｉ、台湾）、およびベクターの対照。１５．６μｇのヘルパープラスミド（ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１：ｐＭＤ．Ｇ＝１０：１（ｗ／ｗ）を加えた。２４時間後、培地を、１％ＢＳＡを含有する新鮮培地に変えた。上清を回収し、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。レンチウイルス形質導入のために、マトリゲルをプレコートしたプレート上に細胞を播種し、８μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンの存在下でレンチウイルスと共にインキュベートした。
レンチウイルス作製は、一部の修正を加えて、先述のように行った（Huang et al., 2014）。手短に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した（１０ｃｍディッシュ当たり７５０万個）。次いで、細胞に以下のプラスミド（１９．２μｇ）をトランスフェクトした。ＰＯＤＸＬのｃＤＮＡ、ｓｈＰＯＤＸＬ（ｓｈＰＯＤＸＬ＃１：ＴＲＣＮ００００３１０１１７、５’－ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＴ－３’（配列番号３）；ｓｈＰＯＤＸＬ＃２：ＴＲＣＮ００００１１７０１９、５’－ＧＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴ－３’（配列番号４））（Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｔａｉｐｅｉ、台湾）、およびベクターの対照。１５．６μｇのヘルパープラスミド（ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１：ｐＭＤ．Ｇ＝１０：１（ｗ／ｗ）を加えた。２４時間後、培地を、１％ＢＳＡを含有する新鮮培地に変えた。上清を回収し、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。レンチウイルス形質導入のために、マトリゲルをプレコートしたプレート上に細胞を播種し、８μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンの存在下でレンチウイルスと共にインキュベートした。
【0076】
１．８ ｈｉＰＳＣを生成するための体細胞のリプログラミング
ヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２０９７（商標））に、Ａｘｅｌ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ博士から入手したｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＳＦ．ｈＯＫＳＭ．ｉｄＴｏｍａｔｏ．ｐｒｅＦＲＴレンチウイルス（Warlich et al., 2011）、およびＰＯＤＸＬ過剰発現またはｓｈＲＮＡレンチウイルスを同時に感染させた。感染後１～３日目までは、毎日、細胞は、誘導培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５０μＭ酪酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸）を交換した。感染後４日目、細胞をマトリゲルをコートしたプレートに継代した。６日間、細胞を誘導培地で培養し、２５０μＭ酪酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む、誘導培地とｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ、８５８５０）とが半々の培地に変えた。７～１６日目の間は、毎日、トランスフェクトした細胞のｍＴｅＳＲ１を変えた。
ヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２０９７（商標））に、Ａｘｅｌ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ博士から入手したｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＳＦ．ｈＯＫＳＭ．ｉｄＴｏｍａｔｏ．ｐｒｅＦＲＴレンチウイルス（Warlich et al., 2011）、およびＰＯＤＸＬ過剰発現またはｓｈＲＮＡレンチウイルスを同時に感染させた。感染後１～３日目までは、毎日、細胞は、誘導培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５０μＭ酪酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸）を交換した。感染後４日目、細胞をマトリゲルをコートしたプレートに継代した。６日間、細胞を誘導培地で培養し、２５０μＭ酪酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む、誘導培地とｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ、８５８５０）とが半々の培地に変えた。７～１６日目の間は、毎日、トランスフェクトした細胞のｍＴｅＳＲ１を変えた。
【0077】
１．９ ｓｇＲＮＡ デザインおよびサブクローン
ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲデザイン（http://crispr.mit.edu）は、オフターゲット効果をほとんどを有さないｓｇＲＮＡを設計するように実施した。ｓｇＲＮＡは、ＰＯＤＸＬ座位の５’ＵＴＲおよびイントロン１における配列を標的とするように設計した。ｓｇＲＮＡ１は、ＴＳＳ部位から－２０５に位置付ける。ｓｇＲＮＡ２はＴＳＳ部位から－５８に位置付けし、ｓｇＲＮＡ３はＴＳＳ部位から＋４６０に位置付ける。Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃ ６８４６３）は、ＢｂｓＩを用いて切断し、ゲルを精製した。標的ｓｇＲＮＡ配列を含む一対のオリゴヌクレオチドを変性させ、アニールさせ、Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡベクターに連結させた。
ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲデザイン（http://crispr.mit.edu）は、オフターゲット効果をほとんどを有さないｓｇＲＮＡを設計するように実施した。ｓｇＲＮＡは、ＰＯＤＸＬ座位の５’ＵＴＲおよびイントロン１における配列を標的とするように設計した。ｓｇＲＮＡ１は、ＴＳＳ部位から－２０５に位置付ける。ｓｇＲＮＡ２はＴＳＳ部位から－５８に位置付けし、ｓｇＲＮＡ３はＴＳＳ部位から＋４６０に位置付ける。Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃ ６８４６３）は、ＢｂｓＩを用いて切断し、ゲルを精製した。標的ｓｇＲＮＡ配列を含む一対のオリゴヌクレオチドを変性させ、アニールさせ、Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡベクターに連結させた。
【0078】
１．１０ ゲノム欠失アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｓｇＲＮＡ対（ｓｇＲＮＡ１＋ｓｇＲＮＡ３）および（ｓｇＲＮＡ２＋ｓｇＲＮＡ３）ならびに野生型Ｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした。３日間のトランスフェクションの後、ゲノムＤＮＡを回収した。遺伝子型判定のために、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、２５ｕｌのＰＣＲ反応ミックス（ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ）中に加えた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｓｇＲＮＡ対（ｓｇＲＮＡ１＋ｓｇＲＮＡ３）および（ｓｇＲＮＡ２＋ｓｇＲＮＡ３）ならびに野生型Ｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした。３日間のトランスフェクションの後、ゲノムＤＮＡを回収した。遺伝子型判定のために、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、２５ｕｌのＰＣＲ反応ミックス（ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ）中に加えた。
【0079】
１．１１ ｉＰＳＣにおける誘導性ＣＲＩＳＰＲ株の作製
ＡＡＶ部位に安定的に組み込まれたドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を有する誘導性ｉＰＳＣ株（ＣＲＩＳＰＲｎ Ｇｅｎ １Ｃ ｉＰＳＣ株）は、Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ氏の研究室で生成し、入手した（Mandegar et al., 2016）。２４時間後、ドキシサイクリン（２μＭ）を含むかまたは含まない（溶媒対照群として）新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を２４時間加えて、Ｃａｓ９遺伝子発現を誘導した。次いで、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ＬＴ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＭＩＲ ２３０４）を使用して、ｉＰＳＣ株に、様々な対のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１＋ｓｇＲＮＡ３、またはｓｇＲＮＡ２＋ｓｇＲＮＡ３）およびブラストサイジン発現ベクター（ｐＬＡＳ３Ｗ－ＧＦＰ－Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地をＥ８培地に交換した。１日かけて２．５μｇ／ｍｌブラストサイジンを用いて細胞を選択し、次いで、毎日、５μｇ／ｍｌブラストサイジンを含み、ドキシサイクリンの存在または非存在の培地を新しくした。
ＡＡＶ部位に安定的に組み込まれたドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を有する誘導性ｉＰＳＣ株（ＣＲＩＳＰＲｎ Ｇｅｎ １Ｃ ｉＰＳＣ株）は、Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ氏の研究室で生成し、入手した（Mandegar et al., 2016）。２４時間後、ドキシサイクリン（２μＭ）を含むかまたは含まない（溶媒対照群として）新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を２４時間加えて、Ｃａｓ９遺伝子発現を誘導した。次いで、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ＬＴ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＭＩＲ ２３０４）を使用して、ｉＰＳＣ株に、様々な対のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１＋ｓｇＲＮＡ３、またはｓｇＲＮＡ２＋ｓｇＲＮＡ３）およびブラストサイジン発現ベクター（ｐＬＡＳ３Ｗ－ＧＦＰ－Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地をＥ８培地に交換した。１日かけて２．５μｇ／ｍｌブラストサイジンを用いて細胞を選択し、次いで、毎日、５μｇ／ｍｌブラストサイジンを含み、ドキシサイクリンの存在または非存在の培地を新しくした。
【0080】
１．１２ ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
全ＲＮＡは、ＴＯＯＬＳｍａｒｔ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ、ＤＰＴ－ＢＤ２４）を用いて精製した。逆転写は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００５１）を用いて実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＲ０３８９）を使用して実施した。データは、デルタ・デルタＣＴ法を用いて定量化した。試料は、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベル対照に対して正規化した。
全ＲＮＡは、ＴＯＯＬＳｍａｒｔ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ、ＤＰＴ－ＢＤ２４）を用いて精製した。逆転写は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００５１）を用いて実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＲ０３８９）を使用して実施した。データは、デルタ・デルタＣＴ法を用いて定量化した。試料は、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベル対照に対して正規化した。
【0081】
１．１３ ウェスタンブロット分析
全細胞タンパク質抽出物は、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１３２００１）の存在下で使用して、ｈＰＳＣから精製した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによって定量化した。等量のタンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、０．２２μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＳＥＱ０００１０）上にブロットした。ブロットを、室温で１時間、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中でブロッキングした。このブロットを、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。これらの抗体としては、以下が挙げられる：抗ＰＯＤＸＬ（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２３９０４）、抗ＴＲＡ－１－６０（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１７０５）、抗ＴＲＡ－１－８１（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１７０６）、抗ｃ－ＭＹＣ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ３２０７２）、抗ＯＣＴ４（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＫＬＦ４（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ７２５４３）、抗ＴＥＲＴ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１８３１０５）、抗ＨＭＧＣＲ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１７４８３０）、抗ＳＲＥＢＰ１（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３５５１）、抗ＳＲＥＢＰ２（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ３０６８２）、抗ＦｌＯＴＩＬＬＩＮ－１（１：１０００；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１０８２１）、抗ＣＤ４９Ｂ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１３３５５７）、抗ＣＤ４９Ｆ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、２１７６５７）、抗インテグリンβ１（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３５９０）、抗ヒストン３（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９１）、抗ＨＤＡＣ２（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－８１５９９）、抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ９４８５）、抗β－チューブリン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ４２００７１５）、抗β－アクチン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、Ａ１９７８）。ブロットを、ＴＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。このブロットを、以下の特異的二次抗体と、４℃で一晩、反応させた：抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（１：１００００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－０３６－１５０）、抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（１：１００００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－０３６－１５２）、抗マウスＩｇＭ、ＨＲＰ結合抗体（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１２８Ｐ）。膜をＴＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、次いでＥＣＬ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０９５）を用いて顕色させた。
全細胞タンパク質抽出物は、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１３２００１）の存在下で使用して、ｈＰＳＣから精製した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによって定量化した。等量のタンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、０．２２μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＳＥＱ０００１０）上にブロットした。ブロットを、室温で１時間、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中でブロッキングした。このブロットを、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。これらの抗体としては、以下が挙げられる：抗ＰＯＤＸＬ（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２３９０４）、抗ＴＲＡ－１－６０（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１７０５）、抗ＴＲＡ－１－８１（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１７０６）、抗ｃ－ＭＹＣ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ３２０７２）、抗ＯＣＴ４（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＫＬＦ４（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ７２５４３）、抗ＴＥＲＴ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１８３１０５）、抗ＨＭＧＣＲ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１７４８３０）、抗ＳＲＥＢＰ１（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３５５１）、抗ＳＲＥＢＰ２（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ３０６８２）、抗ＦｌＯＴＩＬＬＩＮ－１（１：１０００；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１０８２１）、抗ＣＤ４９Ｂ（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１３３５５７）、抗ＣＤ４９Ｆ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、２１７６５７）、抗インテグリンβ１（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３５９０）、抗ヒストン３（１：１０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９１）、抗ＨＤＡＣ２（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－８１５９９）、抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ９４８５）、抗β－チューブリン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ４２００７１５）、抗β－アクチン（１：５０００；Ｓｉｇｍａ、Ａ１９７８）。ブロットを、ＴＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。このブロットを、以下の特異的二次抗体と、４℃で一晩、反応させた：抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（１：１００００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－０３６－１５０）、抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（１：１００００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－０３６－１５２）、抗マウスＩｇＭ、ＨＲＰ結合抗体（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１２８Ｐ）。膜をＴＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、次いでＥＣＬ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０９５）を用いて顕色させた。
【0082】
１．１４ コレステロール定量化
コレステロールレベルは、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄコレステロールアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって測定した。試料を反応緩衝液で希釈し、次いでＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ作業溶液（３００μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ、２Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、および２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ）（１：１）と、さらに反応させた。この試料を、３７℃で３０分間、反応させた。吸光度は５９０ｎｍにて検出した。コレステロール値は、コレステロール標準液を使用して算出し、正規化は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によるタンパク質含有量によって行った。
コレステロールレベルは、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄコレステロールアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって測定した。試料を反応緩衝液で希釈し、次いでＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ作業溶液（３００μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ、２Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、および２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ）（１：１）と、さらに反応させた。この試料を、３７℃で３０分間、反応させた。吸光度は５９０ｎｍにて検出した。コレステロール値は、コレステロール標準液を使用して算出し、正規化は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によるタンパク質含有量によって行った。
【0083】
１．１５ フローサイトメトリー
ｈＥＳＣをアキュターゼによって解離させた。細胞を、製造業者の使用説明書に従って染色した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、８８－８００５－７２）。手短に述べると、細胞（５×１０５）を、１００μｌ １Ｘ結合緩衝液中に懸濁し、次いで２．５μｌのアネキシンＶ－ＦＩＴＣで染色した。室温で２０分間の反応の後、細胞を、２．５μｌのＰＩ液と共に１０分間、インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで希釈し、フローサイトメーターによって解析した。
ｈＥＳＣをアキュターゼによって解離させた。細胞を、製造業者の使用説明書に従って染色した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、８８－８００５－７２）。手短に述べると、細胞（５×１０５）を、１００μｌ １Ｘ結合緩衝液中に懸濁し、次いで２．５μｌのアネキシンＶ－ＦＩＴＣで染色した。室温で２０分間の反応の後、細胞を、２．５μｌのＰＩ液と共に１０分間、インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで希釈し、フローサイトメーターによって解析した。
【0084】
１．１６ マイクロアレイおよびＧＯ－ｔｅｒｍ解析
公開したデータアレイ（表２に列記）ならびにＧＦＰおよびＰＯＤＸＬ過剰発現アレイは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ １１によって解析した。２以上の倍率変化および０．５未満の倍率変化を有する候補遺伝子を列記した。ＧＯ－ｔｅｒｍ解析は、ＤＡＶＩＤプログラムを用いて実施した。
公開したデータアレイ（表２に列記）ならびにＧＦＰおよびＰＯＤＸＬ過剰発現アレイは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ １１によって解析した。２以上の倍率変化および０．５未満の倍率変化を有する候補遺伝子を列記した。ＧＯ－ｔｅｒｍ解析は、ＤＡＶＩＤプログラムを用いて実施した。
【0085】
１．１７ ＢＭＭＳＣおよびＮＳＣの培養
ヒトＢＭＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）は、ＭＳＣ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍ（合成、異種成分不含有、無血清培地）中で培養し、阻害剤処理されたＣｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅプレート上で、３日間増殖させた。ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）は、７日間、Ｇｉｂｃｏ ＰＳＣ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（無血清培地）を用いてＨ９ ｈＥＳＣから分化させた。次いで、ＮＳＣを、マトリゲルをコートしたプレート上に再播種し、３日間、各阻害剤を供給した。
ヒトＢＭＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）は、ＭＳＣ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍ（合成、異種成分不含有、無血清培地）中で培養し、阻害剤処理されたＣｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅプレート上で、３日間増殖させた。ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）は、７日間、Ｇｉｂｃｏ ＰＳＣ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（無血清培地）を用いてＨ９ ｈＥＳＣから分化させた。次いで、ＮＳＣを、マトリゲルをコートしたプレート上に再播種し、３日間、各阻害剤を供給した。
【0086】
１．１８ コレステロールによる処理
ＣＲＬ２０９７（９代）を播種し、５００Ｘ濃縮ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（登録商標）ＮＳ０ サプリメント（Ｓ５４４２、Ｓｉｇｍａ）から希釈した最終濃度（０、０．５×、１×、２×、５×、８×）のコレステロールを用いて、レンチウイルスベクター（ＯＳＫＭ）を感染させた。ウイルス形質導入の４日後、細胞を、マトリゲルをコートした６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞数２７，０００個として再播種した。細胞付着の２日後、コレステロールを、リプログラミング処理の間、連続的に供給した。ｉＰＳＣ生成に対するコレステロールの効果を十分に評価するために、ｉＰＳＣ生成には、無血清合成Ｅ８培地（２５０μｍ酪酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ含有）を使用した。
ＣＲＬ２０９７（９代）を播種し、５００Ｘ濃縮ＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（登録商標）ＮＳ０ サプリメント（Ｓ５４４２、Ｓｉｇｍａ）から希釈した最終濃度（０、０．５×、１×、２×、５×、８×）のコレステロールを用いて、レンチウイルスベクター（ＯＳＫＭ）を感染させた。ウイルス形質導入の４日後、細胞を、マトリゲルをコートした６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞数２７，０００個として再播種した。細胞付着の２日後、コレステロールを、リプログラミング処理の間、連続的に供給した。ｉＰＳＣ生成に対するコレステロールの効果を十分に評価するために、ｉＰＳＣ生成には、無血清合成Ｅ８培地（２５０μｍ酪酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ含有）を使用した。
【0087】
１．１９ 統計分析
データは、平均±ＳＤ／平均±ＳＥＭとして示した。Ｐ値は、両側スチューデントの対応のないｔ検定または一元配置分散分析を使用して算出し、Ｐ＜０．０５が、データが有意差を有することを意味する。すべての図面および統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して確証した。
データは、平均±ＳＤ／平均±ＳＥＭとして示した。Ｐ値は、両側スチューデントの対応のないｔ検定または一元配置分散分析を使用して算出し、Ｐ＜０．０５が、データが有意差を有することを意味する。すべての図面および統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して確証した。
【0088】
２．結果
２．１ ＰＯＤＸＬはｈＰＳＣ増殖および多能性のために必要である
ヒト初期胚におけるＰＯＤＸＬの発現パターンを調べるために、着床前段階の間のＰＯＤＸＬ ｍＲＮＡの相対量を確認した。我々が使用したデータセットは、先の研究（Kang et al., 2016）とは異なる。ＰＯＤＸＬ転写物が、１細胞期から４細胞期に濃縮されることも見出された（バー、図１Ａ）。発現レベルは、８細胞期から胚盤胞までは中程度である（バー、図１Ａ）。ＰＯＤＸＬの発現パターンは、その他の幹細胞の主要マーカー、例えばＯＣＴ４、ＬＩＮ２８Ａ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＫＬＦ４とは著しく異なっていた。これらのマーカーはすべて８細胞期後にのみ大量に発現した（バー、図１Ａおよびデータ非表示）。興味深いことに、１細胞期から胚盤胞までは、ＰＯＤＸＬ、ＯＣＴ４、およびＬＩＮ２８Ａは、全測定遺伝子と比較して高発現転写物に属した（ほぼ１００％）（ドット、図１Ａ）。対照的に、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＫＬＦ４は、１細胞期から４細胞期では発現は少なく、その後、８細胞期の後に１００％パーセンタイルまで大量に発現する。ＰＯＤＸＬが初期胚において大量に発現していたことから、ＰＯＤＸＬは、初期発生において、特に１～４細胞期に集中して、重大な役割を果たしている可能性がある。
２．１ ＰＯＤＸＬはｈＰＳＣ増殖および多能性のために必要である
ヒト初期胚におけるＰＯＤＸＬの発現パターンを調べるために、着床前段階の間のＰＯＤＸＬ ｍＲＮＡの相対量を確認した。我々が使用したデータセットは、先の研究（Kang et al., 2016）とは異なる。ＰＯＤＸＬ転写物が、１細胞期から４細胞期に濃縮されることも見出された（バー、図１Ａ）。発現レベルは、８細胞期から胚盤胞までは中程度である（バー、図１Ａ）。ＰＯＤＸＬの発現パターンは、その他の幹細胞の主要マーカー、例えばＯＣＴ４、ＬＩＮ２８Ａ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＫＬＦ４とは著しく異なっていた。これらのマーカーはすべて８細胞期後にのみ大量に発現した（バー、図１Ａおよびデータ非表示）。興味深いことに、１細胞期から胚盤胞までは、ＰＯＤＸＬ、ＯＣＴ４、およびＬＩＮ２８Ａは、全測定遺伝子と比較して高発現転写物に属した（ほぼ１００％）（ドット、図１Ａ）。対照的に、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＫＬＦ４は、１細胞期から４細胞期では発現は少なく、その後、８細胞期の後に１００％パーセンタイルまで大量に発現する。ＰＯＤＸＬが初期胚において大量に発現していたことから、ＰＯＤＸＬは、初期発生において、特に１～４細胞期に集中して、重大な役割を果たしている可能性がある。
【0089】
ＰＳＣおよび分化細胞におけるＰＯＤＸＬ発現パターンを明らかにするために、何十ものアレイを用いて網羅的なトランスクリプトームの発現パターンを解析した。階層的クラスタリングヒートマップからは、ＰＯＤＸＬ転写物がＰＳＣで大量に発現されており、分化細胞では発現レベルがはるかに低かったことが示された（データ非表示）。同様に、タンパク質レベルでは、ＰＯＤＸＬ発現は、２つの未分化ｈＥＳＣ株、ＨＵＥＳ６およびＨ９において濃縮していた。発現レベルは、多分化能間葉系幹細胞では低下しており、線維芽細胞ではさらに低い発現であった（図１Ｂ）。ＰＯＤＸＬ上のグリコールエピトープを認識する別のＰＯＤＸＬ抗体、ＴＲＡ－１－６０を用いた場合、結果は同じであった（図１Ｃ）。さらに、ウェスタンブロット分析によると、ＰＯＤＸＬタンパク質レベルは、ＥＰＳＣおよびプライム型ｈＥＳＣ（ＨＵＥＳ６およびＨ９）ではより大量に発現されており、分化したＥＳＣ由来胚様体（ＥＢ）、および線維芽細胞（ＣＲＬ－２０９７）では、著しく低下していた（図１Ｄ）。よって、我々のデータは、ＰＯＤＸＬがヒトＰＳＣにおいて大量に発現されることを実証した。
【0090】
ｈＰＳＣにおけるＰＯＤＸＬの機能を調べるために、２つの異なるｓｈＲＮＡを使用してＰＯＤＸＬをノックダウンさせた。ＨＵＥＳ６細胞では、細胞は、２種のｓｈＲＮＡノックダウンの後に分化した（図１Ｅ）。相対細胞数（アラマーブルーアッセイおよびクリスタルバイオレットアッセイ）および幹細胞マーカー、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、いずれも有意に下方制御された（図１Ｅ）。矛盾なく、ｓｈＲＮＡは、Ｈ９およびｉＰＳＣ－０２０７細胞においても同様に、ＥＳＣ再生を無効にする（図１Ｆ）。レンチウイルスノックダウンのたった３日後に、ｓｈＰＯＤＸＬ発現ｈＥＳＣは、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）が下方制御されており、これは、細胞増殖および不死化にとってきわめて重大なことである（図１Ｇ）。アネキシン Ｖ－ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodine）（ＰＩ）分析によると、ｓｈＰＯＤＸＬ発現細胞では、ｓｈＲＦＰ対照ｈＥＳＣと比較してアポトーシスが増加した（図１Ｈ）。このように、ＰＯＤＸＬノックダウンは、アポトーシスを誘発し、ｈＰＳＣ再生を阻害した。
【0091】
ｉＰＳＣリプログラミングにおけるＰＯＤＸＬの機能的役割を調べるために、ヒト初代包皮線維芽細胞ＣＲＬ２０９７に、ｓｈＰＯＤＸＬおよび４種の因子（ＯＫＳＭ）を同時に感染させた。形質導入後１６日目に、ｉＰＳＣコロニーを算出した（図１Ｉ）。ｓｈＰＯＤＸＬを感染させた細胞では、コロニーはｓｈＲＦＰ対照と比較してはるかに少なかった（図１Ｉ）。このデータから、ＰＯＤＸＬの下方制御がｉＰＳＣリプログラミングを阻害したことが示された。
【0092】
これまでのデータでは、ＰＯＤＸＬ発現は、胚の４細胞胚までの接合体において濃縮していた（図１Ａ）。よって、ＰＯＤＸＬは、胚形成のきわめて初期段階での幹細胞性の維持において重大な役割を果たしている可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、ｓｈＰＯＤＸＬを使用して、ＨＵＥＳ６およびＨ９由来ＥＰＳＣにおいてＰＯＤＸＬ遺伝子を下方制御した。ＥＰＳＣは、Ｙａｎｇらによって公表されている合成カクテルによって生成した（Yang et al., 2017b）。ｓｈＲＮＡを用いたＰＯＤＸＬノックダウンの後、ＥＰＳＣのコロニーの大きさおよびコロニーの数はいずれも低減したことが見出された（図１Ｊ）。
【0093】
２．２ ＰＯＤＸＬの過剰発現はｓｈＰＯＤＸＬ処理によって誘導された多能性ならびにｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼ発現の低下を回復させる
ｓｈＲＮＡのオフターゲット効果を排除するために、ｓｈＰＯＤＸＬ発現細胞においてＰＯＤＸＬを過剰発現させた。ｓｈＰＯＤＸＬ発現細胞におけるＰＯＤＸＬの過剰発現は、相対細胞数および幹細胞マーカーの減少をレスキューした（図２Ａ）。ＰＯＤＸＬの過剰発現は、特に、ｓｈＰＯＤＸＬ発現によってもたらされた、ｈＥＳＣ増殖マーカー、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼの下方制御を回復させた（図２Ａ）。よって、ｓｈＰＯＤＸＬが誘導した表現型の変化は、ＰＯＤＸＬ発現の喪失によって引き起こされたものであった。ｓｈＲＮＡによって、オフターゲット効果は生じていない。
ｓｈＲＮＡのオフターゲット効果を排除するために、ｓｈＰＯＤＸＬ発現細胞においてＰＯＤＸＬを過剰発現させた。ｓｈＰＯＤＸＬ発現細胞におけるＰＯＤＸＬの過剰発現は、相対細胞数および幹細胞マーカーの減少をレスキューした（図２Ａ）。ＰＯＤＸＬの過剰発現は、特に、ｓｈＰＯＤＸＬ発現によってもたらされた、ｈＥＳＣ増殖マーカー、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼの下方制御を回復させた（図２Ａ）。よって、ｓｈＰＯＤＸＬが誘導した表現型の変化は、ＰＯＤＸＬ発現の喪失によって引き起こされたものであった。ｓｈＲＮＡによって、オフターゲット効果は生じていない。
【0094】
２．３ ＰＯＤＸＬはプライム型および拡張型ｈＰＳＣ再生に十分なものである
ＨＵＥＳ６におけるＰＯＤＸＬ過剰発現は、ウェスタンブロット分析によって証明した（図２Ｂ）。興味深いことに、ＰＯＤＸＬ過剰発現させた場合、相対細胞数（クリスタルバイオレットアッセイ、アラマーブルーアッセイ、トリパンブルー排除アッセイ）および幹細胞マーカー（ＡＬＰ活性）は、いずれも増加した（図２Ｂ）。ＰＯＤＸＬはまた、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼの発現も高めることができる（図２Ｂ）。リプログラミングにおけるＰＯＤＸＬの機能的役割を調べるために、ヒト包皮線維芽細胞にＰＯＤＸＬレンチウイルスおよび４種の因子（ＯＫＳＭ）を同時に感染させた。形質導入の１６日後に、ｉＰＳＣコロニーを数えた（図２Ｃ）。注目すべきは、ＰＯＤＸＬの過剰発現は、ＧＦＰ対照と比較してリプログラミング効率を高め得ることである（図２Ｃ）。このデータは、ＰＯＤＸＬが、体細胞から誘導される多能性の樹立において重大な役割を果たしていることを意味する。
ＨＵＥＳ６におけるＰＯＤＸＬ過剰発現は、ウェスタンブロット分析によって証明した（図２Ｂ）。興味深いことに、ＰＯＤＸＬ過剰発現させた場合、相対細胞数（クリスタルバイオレットアッセイ、アラマーブルーアッセイ、トリパンブルー排除アッセイ）および幹細胞マーカー（ＡＬＰ活性）は、いずれも増加した（図２Ｂ）。ＰＯＤＸＬはまた、ｃ－ＭＹＣおよびテロメラーゼの発現も高めることができる（図２Ｂ）。リプログラミングにおけるＰＯＤＸＬの機能的役割を調べるために、ヒト包皮線維芽細胞にＰＯＤＸＬレンチウイルスおよび４種の因子（ＯＫＳＭ）を同時に感染させた。形質導入の１６日後に、ｉＰＳＣコロニーを数えた（図２Ｃ）。注目すべきは、ＰＯＤＸＬの過剰発現は、ＧＦＰ対照と比較してリプログラミング効率を高め得ることである（図２Ｃ）。このデータは、ＰＯＤＸＬが、体細胞から誘導される多能性の樹立において重大な役割を果たしていることを意味する。
【0095】
Ｙａｎｇらは、細胞を胚性および胚体外系列のいずれにも発生できるようにする４種の化学物質を用いた、プライム型ＥＳＣからの拡張型多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）の誘導を報告した（Yang et al., 2017b）。トランスクリプトームのプロファイルにおいては、これらのＥＰＳＣは、４細胞期の胚を部分的に模倣している（Yang et al., 2017b）。よって、ＥＰＳＣリプログラミングにおけるＰＯＤＸＬの機能を試験するために、ｈＰＳＣを、ＥＰＳＣを誘導するカクテルであるＮ２Ｂ２７－ＬＣＤＭ培地中で培養した（Yang et al., 2017b）。ＰＯＤＸＬ過剰発現させた場合、ＧＦＰ対照と比較して、ドーム形状コロニーの数の増加が見出された（図２Ｄ）。矛盾なく、異所性ＰＯＤＸＬ発現の後、コロニーの大きさおよびコロニーの数が有意に増大した（図２Ｅ）。ＧＦＰ対照と比較した場合、ＰＯＤＸＬ過剰発現によって、相対細胞数は、Ｈ９－ＥＰＳＣでは８．８倍、ＨＵＥＳ６－ＥＰＳＣでは５．６倍増加した（図２Ｆ）。幹細胞マーカーＡＬＰ活性もまた、Ｈ９－ＥＰＳＣでは８．１倍、ＨＵＥＳ６－ＥＰＳＣでは２．３倍増加した（図２Ｆ）。これは、ＰＯＤＸＬがＥＰＳＣの増加を促進することを意味する。ｈＥＳＣにおいてＰＯＤＸＬ過剰発現によるＥＰＳＣの開始をまず確認して、次いでＥＰＳＣ培地に移すと、ＧＦＰ対照群と比較してドーム形状コロニーの数はやはり増加した（図２Ｇ）。これは、ＰＯＤＸＬがＥＰＳＣ形成の開始を増進することができることを示唆している。要約すると、我々のデータは、ＰＯＤＸＬがプライム型多能性の維持ならびに拡張型多能性の開始および獲得のための重大な因子として機能することを、はっきりと示している。
【0096】
２．４ ＰＯＤＸＬはＨＭＧＣＲおよびＳＲＥＢＰを通してコレステロールレベルおよびｃ－ＭＹＣレベルを調節する
ＰＯＤＸＬによって誘発される初期シグナルのマップを作成するために、３日間ＰＯＤＸＬを過剰発現させた細胞において、ｃＤＮＡマイクロアレイを実施した。Ｄａｖｉｄの機能ツール（Huang da et al., 2009a、b）によると、上方制御された遺伝子セットでは、コレステロール生合成経路が有意に高まっていた（データ非表示）。下方制御された遺伝子セットでは、ＲＮＡ代謝過程および形態形成の調節が高まっていた（データ非表示）。３８個の遺伝子が２倍を超えて上方制御され、一方、２６個の遺伝子が２倍を超えて下方制御されたことが見出された（データ非表示）。上方制御された遺伝子には、以下の６つのコレステロール関連遺伝子、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ１（ＨＭＧＣＳ１）、７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、インスリン誘導遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）（１．６倍増の変化）（データ非表示）が含まれる。同時に、下方制御された遺伝子セットとしては、分化関連遺伝子－ＴＢＸ３、ＴＧＦＢ２、ＺＥＢ２、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ３、ＦＯＸＥ１（データ非表示）が含まれる。この結果は、ＰＯＤＸＬがコレステロール生合成経路を正に調節する可能性があることを強く示唆するものである。
ＰＯＤＸＬによって誘発される初期シグナルのマップを作成するために、３日間ＰＯＤＸＬを過剰発現させた細胞において、ｃＤＮＡマイクロアレイを実施した。Ｄａｖｉｄの機能ツール（Huang da et al., 2009a、b）によると、上方制御された遺伝子セットでは、コレステロール生合成経路が有意に高まっていた（データ非表示）。下方制御された遺伝子セットでは、ＲＮＡ代謝過程および形態形成の調節が高まっていた（データ非表示）。３８個の遺伝子が２倍を超えて上方制御され、一方、２６個の遺伝子が２倍を超えて下方制御されたことが見出された（データ非表示）。上方制御された遺伝子には、以下の６つのコレステロール関連遺伝子、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ１（ＨＭＧＣＳ１）、７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、インスリン誘導遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）（１．６倍増の変化）（データ非表示）が含まれる。同時に、下方制御された遺伝子セットとしては、分化関連遺伝子－ＴＢＸ３、ＴＧＦＢ２、ＺＥＢ２、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ３、ＦＯＸＥ１（データ非表示）が含まれる。この結果は、ＰＯＤＸＬがコレステロール生合成経路を正に調節する可能性があることを強く示唆するものである。
【0097】
ＰＯＤＸＬがどのようにコレステロール恒常性経路に影響を与えるのかを理解するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＰＯＤＸＬノックダウンした場合、幾つかのコレステロール関連遺伝子が下方制御された（図３Ａ）。コレステロール合成については、律速酵素ＨＭＧＣＲに関して研究する。ＨＭＧＣＲ転写物レベルおよびタンパク質レベルは、ｓｈＰＯＤＸＬ感染後には低下し、ＰＯＤＸＬ過剰発現後には上昇した（図３Ａ）。また、ｓｈＰＯＤＸＬまたはＰＯＤＸＬ過剰発現ウイルス感染後、細胞の総コレステロール含有量は、比例的に下方制御または上方制御された（図３Ｂ）。これらのデータは、ＰＯＤＸＬレベルが細胞のコレステロールレベルに影響を与えたことを示唆している。ＨＭＧＣＲの重要性を実証するために、２つの異なるｓｈＲＮＡを使用して、ＨＭＧＣＲをノックダウンさせた。ＨＭＧＣＲノックダウン細胞は分化し、表現型はｓｈＰＯＤＸＬ処理と同様に見える（図３Ｃ）。矛盾なく、ｓｈＨＭＧＣＲ ｈＥＳＣでは、相対細胞数および幹細胞マーカー発現の低減もまた観察された（図３Ｃ）。注目すべきは、ＨＭＧＣＲ下方制御は、ｃ－ＭＹＣおよびＴＥＲＴの発現レベルも低下させることである（図３Ｃ）。
【0098】
ＳＲＥＢＰ２は、内因性コレステロール生合成の主たる調節因子である。ＳＲＥＢＰ２は、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧＣＳ１、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）などの多数のコレステロール合成遺伝子の発現を活性化する（Horton et al., 2002；Madison、2016）。ＳＲＥＢＰ１ａもまた、すべての組織におけるコレステロール合成経路を促進することができる（Horton et al., 2002；Madison、2016）。ＨＭＧＣＲは、コレステロール生合成における律速酵素である。先の論文中では、ＨＭＧＣＲ発現が、ＳＲＥＢＰ２およびＳＲＥＢＰ１によって調節されている。次に、ＰＯＤＸＬがこのＳＲＥＢＰ２またはＳＲＥＢＰ１発現レベルを調節できるかどうかを確認した。ｍＲＮＡレベルによると、ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２は、ｓｈＰＯＤＸＬ形質導入体では低下していた（図３Ａ）。ウェスタンブロット分析によると、プライム型ｈＥＳＣ－ＨＵＥＳ６（図３Ｄ）およびＨＵＥＳ６由来ＥＰＳＣ（図３Ｄ）では、ＰＯＤＸＬの下方制御は、ＳＲＥＢＰ２およびＳＲＥＢＰ１のタンパク質発現レベルを低下させていた。矛盾なく、ＰＯＤＸＬの過剰発現は、ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２タンパク質レベルを上昇させていた（図３Ｄ）。
【0099】
次に、転写因子ＳＲＥＢＰ２およびＳＲＥＢＰ１が、その活性を意味する。ＤＮＡに結合するかどうかを確認する。ｓｈＰＯＤＸＬ ｈＥＳＣでは、明らかに、ＳＲＥＢＰ２およびＳＲＥＢＰ１はいずれもクロマチン結合画分において減少しており、これは、ＤＮＡに結合するＳＲＥＢＰ２およびＳＲＥＢＰ１の低減を示している（図３Ｅ）。それにもかかわらず、ＳＲＥＢＰ２およびＳＥＲＢＰ１はいずれも、ＰＯＤＸＬ過剰発現させた場合、クロマチン結合画分において増加した（図３Ｅ）。我々の先のデータでは、ＰＯＤＸＬはｃ－ＭＹＣ発現のために必要であることを実証した（図１Ｈおよび図３Ａ）。ＰＯＤＸＬノックダウンさせた場合、ｃ－ＭＹＣレベルが、細胞質、可溶性の核部分、およびクロマチン結合画分において下方制御されたことが観察された（図３Ｅ）。ＰＯＤＸＬ過剰発現させた場合、ｃ－ＭＹＣレベルは、細胞質ゾルおよびクロマチン結合画分において上昇した（図３Ｅ）。先の報告では、ＳＲＥＢＰ２がｃ－ＭＹＣ発現を活性化して前立腺がん（ＰＣａ）の幹細胞性および転移を促進することが示されている（Li et al., 2016）。まとめると、先の報告（Li et al., 2016)(Horton et al., 2002；Madison、2016)および我々の知見に基づき、ＰＯＤＸＬ－ＳＲＥＢＰシグナルは、ｈＰＳＣにおいてＨＭＧＣＲおよびｃ－ＭＹＣ発現の両方を調節することができるという仮説を立てた。
【0100】
２．５ コレステロールはｈＰＳＣ多能性および生存に必須である
多能性に関するコレステロールの機能的役割を確認するために、コレステロール阻害剤、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、メチル－β－シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を使用して、コレステロール生合成を阻害した（図４Ａ）。シンバスタチンは、ＨＭＧＣＲを阻害するＦＤＡ承認処方薬であり、心臓血管系疾患を治療するために広く使用されている（Zhou and Liao、2009）。ＨＭＧＣＲは、コレステロール生合成の律速酵素である。スタチンの副作用はほとんどなく、細胞傷害性の副作用はヒトでは報告されていない。ＡＹ９９４４は、Δ７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）を阻害し、コレステロールのレベルを低下させる（Wassila Gaoua、2000）。メチル－β－シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）は、細胞のコレステロールを直接的に取り除く（Mahammad and Parmryd、2015）（図４Ａ）。我々の研究では、細胞形態が約２４時間以内に変化したことが見出された。コレステロール阻害剤処理の３日後、相対細胞数および幹細胞マーカー発現が劇的に減少した（図４Ｂおよびデータ非表示）。さらに、ウェスタンブロット分析によると、シンバスタチンは、ＴＥＲＴ、ｃ－ＭＹＣ、ＨＭＧＣＲ、およびＰＯＤＸＬ発現レベルを下方制御した（図４Ｂ）。次に、ＰＳＣがコレステロール経路により依存するかどうかを知りたい。よって、３種のコレステロール阻害剤の感受性を、ＰＳＣおよび３種の体細胞性線維芽細胞において比較した。比較には、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＣＲＬ－２０９７）、ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ－５Ｔａ）、および胎仔肺線維芽細胞株（ＩＭＲ－９０）を使用した。３種の阻害剤すべてのＩＣ５０は、ＨＵＥＳ６およびＨ９では、線維芽細胞、ＣＲＬ－２０９７、ＩＭＲ－９０、およびＢＪ－５Ｔａと比較して非常に低い（表１）。初代線維芽細胞では、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、ＭＢＣＤのＩＣ５０は、ＨＵＥＳ６より５２倍、３１倍、および２倍高い（表１）。ｈＰＳＣは、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）より１６３倍（シンバスタチン）、５３倍（ＡＹ９９４４）、および２．６５倍（ＭＢＣＤ）高い感受性を示す（表１）。同様の方法で、ｈＰＳＣはまた、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）より、５６８倍（シンバスタチン）、２５１倍（ＡＹ９９４４）、および２．４４倍（ＭＢＣＤ）高い感受性を示す（表１）。よって、コレステロール阻害剤は、未分化ｈＰＳＣを排除し、分化細胞を残すために使用することができる。
多能性に関するコレステロールの機能的役割を確認するために、コレステロール阻害剤、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、メチル－β－シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を使用して、コレステロール生合成を阻害した（図４Ａ）。シンバスタチンは、ＨＭＧＣＲを阻害するＦＤＡ承認処方薬であり、心臓血管系疾患を治療するために広く使用されている（Zhou and Liao、2009）。ＨＭＧＣＲは、コレステロール生合成の律速酵素である。スタチンの副作用はほとんどなく、細胞傷害性の副作用はヒトでは報告されていない。ＡＹ９９４４は、Δ７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）を阻害し、コレステロールのレベルを低下させる（Wassila Gaoua、2000）。メチル－β－シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）は、細胞のコレステロールを直接的に取り除く（Mahammad and Parmryd、2015）（図４Ａ）。我々の研究では、細胞形態が約２４時間以内に変化したことが見出された。コレステロール阻害剤処理の３日後、相対細胞数および幹細胞マーカー発現が劇的に減少した（図４Ｂおよびデータ非表示）。さらに、ウェスタンブロット分析によると、シンバスタチンは、ＴＥＲＴ、ｃ－ＭＹＣ、ＨＭＧＣＲ、およびＰＯＤＸＬ発現レベルを下方制御した（図４Ｂ）。次に、ＰＳＣがコレステロール経路により依存するかどうかを知りたい。よって、３種のコレステロール阻害剤の感受性を、ＰＳＣおよび３種の体細胞性線維芽細胞において比較した。比較には、初代ヒト包皮線維芽細胞（ＣＲＬ－２０９７）、ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ－５Ｔａ）、および胎仔肺線維芽細胞株（ＩＭＲ－９０）を使用した。３種の阻害剤すべてのＩＣ５０は、ＨＵＥＳ６およびＨ９では、線維芽細胞、ＣＲＬ－２０９７、ＩＭＲ－９０、およびＢＪ－５Ｔａと比較して非常に低い（表１）。初代線維芽細胞では、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、ＭＢＣＤのＩＣ５０は、ＨＵＥＳ６より５２倍、３１倍、および２倍高い（表１）。ｈＰＳＣは、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）より１６３倍（シンバスタチン）、５３倍（ＡＹ９９４４）、および２．６５倍（ＭＢＣＤ）高い感受性を示す（表１）。同様の方法で、ｈＰＳＣはまた、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）より、５６８倍（シンバスタチン）、２５１倍（ＡＹ９９４４）、および２．４４倍（ＭＢＣＤ）高い感受性を示す（表１）。よって、コレステロール阻害剤は、未分化ｈＰＳＣを排除し、分化細胞を残すために使用することができる。
【0101】
【表1】
【0102】
これらの結果から、ｈＰＳＣは、体細胞性線維芽細胞と比較して、コレステロール合成の阻害に対する感受性がはるかに高いことが示された。
【0103】
コレステロールがＰＯＤＸＬの下流の標的であるのかどうかを明らかにするために、まず、ＰＯＤＸＬを１日かけて過剰発現させた。次いで、細胞を、コレステロール阻害剤、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、およびＭＢＣＤで別々に処理した。ｈＥＳＣでは、ＰＯＤＸＬの過剰発現によって細胞増殖およびＡＬＰ活性が増進した（図４Ｃ）。しかしながら、この自己複製の上方制御は、シンバスタチン、ＡＹ９９４４、およびＭＢＣＤによる処理によって用量依存的に阻害された（図４Ｃ）。この結果は、コレステロールがＰＯＤＸＬの下流エフェクターであることを示唆している。
【0104】
２．６ コレステロールはｓｈＰＯＤＸＬ表現型をレスキューし、ｉＰＳＣリプログラミング効率をブーストすることができる
コレステロールがＰＯＤＸＬの主要な下流であるかどうかを調べるために、コレステロールを用いたレスキュー実験を実施した。驚くべきことに、コレステロールサプリメントは、ＰＯＤＸＬノックダウンによる形態変化、相対細胞数喪失、およびＡＬＰ活性の低下を妨げている（図５Ａ）。また、ｈＰＳＣのアポトーシスも、６日間のＰＯＤＸＬノックダウンの後のコレステロール付加によって実質的に回復した（図５Ｂ）。さらに、ｃ－ＭＹＣ、ＴＥＲＴ、ＨＭＧＣＲ、ＰＯＤＸＬ、ＴＲＡ－１－６０の発現レベルは、ＰＯＤＸＬ下方制御された細胞にコレステロールを加えることによってレスキューされた（図５Ｂ）。要約すると、これらのデータは、ＰＯＤＸＬが主にコレステロールを介してｈＰＳＣ再生を調節することを示唆するものである。
コレステロールがＰＯＤＸＬの主要な下流であるかどうかを調べるために、コレステロールを用いたレスキュー実験を実施した。驚くべきことに、コレステロールサプリメントは、ＰＯＤＸＬノックダウンによる形態変化、相対細胞数喪失、およびＡＬＰ活性の低下を妨げている（図５Ａ）。また、ｈＰＳＣのアポトーシスも、６日間のＰＯＤＸＬノックダウンの後のコレステロール付加によって実質的に回復した（図５Ｂ）。さらに、ｃ－ＭＹＣ、ＴＥＲＴ、ＨＭＧＣＲ、ＰＯＤＸＬ、ＴＲＡ－１－６０の発現レベルは、ＰＯＤＸＬ下方制御された細胞にコレステロールを加えることによってレスキューされた（図５Ｂ）。要約すると、これらのデータは、ＰＯＤＸＬが主にコレステロールを介してｈＰＳＣ再生を調節することを示唆するものである。
【0105】
また、コレステロールは、４種のＯＳＫＭ因子と共にリプログラミング効率をブーストすることができる（全体的なＡＰ陽性、７．６２倍）。図６を参照されたい。
【0106】
２．７ ＰＯＤＸＬの誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトはｈＰＳＣの自己複製を阻害する
ｓｈＲＮＡのオフターゲットを排除するために、誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集法を使用してｈＰＳＣゲノムにおいてＰＯＤＸＬをノックアウトした（図７）。誘導性ｉＰＳＣ株は、ＡＡＶ座位中にドキシサイクリン誘導性システムを安定的に組み込むことによって生成した（Mandegar et al., 2016）。次いで、ｓｇＲＮＡの形質導入に加えてドキシサイクリンが存在すると、ゲノムが切断されることとなる。ｓｇＲＮＡの２つのペア（ｓｇＲＮＡ１＋２）および（ｓｇＲＮＡ１＋３）（図７）を導入した後、エクソン１を除去する。３日間のドキシサイクリン付加の場合、溶媒対照と比較してコロニーの大きさは小さくなり、ＡＬＰ活性は低下することが見出された（図７）。５日間のドキシサイクリン発現の後、コロニーはほとんど認められず、これは、ＰＯＤＸＬのノックアウトが、ｈＰＳＣ自己複製を強く阻害することを示唆するものである（図７）。これはまた、ｓｈＲＮＡの結果がオフターゲット効果に起因するものではないことを意味している。
ｓｈＲＮＡのオフターゲットを排除するために、誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集法を使用してｈＰＳＣゲノムにおいてＰＯＤＸＬをノックアウトした（図７）。誘導性ｉＰＳＣ株は、ＡＡＶ座位中にドキシサイクリン誘導性システムを安定的に組み込むことによって生成した（Mandegar et al., 2016）。次いで、ｓｇＲＮＡの形質導入に加えてドキシサイクリンが存在すると、ゲノムが切断されることとなる。ｓｇＲＮＡの２つのペア（ｓｇＲＮＡ１＋２）および（ｓｇＲＮＡ１＋３）（図７）を導入した後、エクソン１を除去する。３日間のドキシサイクリン付加の場合、溶媒対照と比較してコロニーの大きさは小さくなり、ＡＬＰ活性は低下することが見出された（図７）。５日間のドキシサイクリン発現の後、コロニーはほとんど認められず、これは、ＰＯＤＸＬのノックアウトが、ｈＰＳＣ自己複製を強く阻害することを示唆するものである（図７）。これはまた、ｓｈＲＮＡの結果がオフターゲット効果に起因するものではないことを意味している。
【0107】
３．考察
十分に研究された多数の転写調節因子および証拠によって、クロマチン状態のエピジェネティックな調節因子がＰＳＣの自己複製の異なる状態を維持するために重要であることが裏付けられていること（Jaenisch and Young、2008）を除けば、ｈＰＳＣ再生における膜貫通型タンパク質の機能的役割はほとんどわかっていない。ここでは、表面マーカー、ＰＯＤＸＬが、自己複製するプライム型ＰＳＣおよびＥＰＳＣにおいて重要な役割を果たすという証拠を提供する。我々の知る限りでは、これは、ＰＳＣにおけるコレステロールシグナルの重要性を強調し、その分子機序を定義する初めての研究である。
十分に研究された多数の転写調節因子および証拠によって、クロマチン状態のエピジェネティックな調節因子がＰＳＣの自己複製の異なる状態を維持するために重要であることが裏付けられていること（Jaenisch and Young、2008）を除けば、ｈＰＳＣ再生における膜貫通型タンパク質の機能的役割はほとんどわかっていない。ここでは、表面マーカー、ＰＯＤＸＬが、自己複製するプライム型ＰＳＣおよびＥＰＳＣにおいて重要な役割を果たすという証拠を提供する。我々の知る限りでは、これは、ＰＳＣにおけるコレステロールシグナルの重要性を強調し、その分子機序を定義する初めての研究である。
【0108】
ｃ－ＭＹＣは、増殖、抗アポトーシス、および幹細胞再生にきわめて重要である（Chappell and Dalton、2013；Scognamiglio et al., 2016；Varlakhanova et al., 2011；Varlakhanova et al., 2010；Wilson et al., 2004）。興味深いことに、ヒトｉＰＳＣ生成は、ＭＹＣ阻害剤の存在によって阻害されており（Asaf Zviran、2019）、これは、ＭｙｃがｉＰＳＣリプログラミングに必須であることを示唆している。初期発生の間、ＭＹＣファミリーメンバーの間で機能的重複があるにもかかわらず、ＰＳＣにおいてｃ－ＭＹＣおよびＮ－ＭＹＣを同時にノックアウトすると、細胞周期の遮断に起因する自己複製障害および多能性の喪失、ならびに原始内胚葉および中胚葉系列への細胞分化がもたらされる（Smith et al., 2010）。また、ｃ－ＭＹＣは、ＰＳＣのテロメアの伸長および不死化特性の維持のためにきわめて重要なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を活性化することができる（Wu et al., 1999）。ＰＯＤＸがｈＰＳＣにおいてｃ－ＭＹＣおよびＴＥＲＴ発現を特に調節することに注目する（図１Ｇおよび図２Ｂ）。興味深いことに、ＰＯＤＸＬはプライム型多能性樹立のために必須でもあり十分でもあることが見出された（図１Ｉおよび図２Ｃ）。
【0109】
ＰＯＤＸＬノックダウンによってヒトｉＰＳＣ生成は損なわれており（図１Ｉ）、このことはまた、多能性の樹立におけるＰＯＤＸＬの初期の重大な役割を明らかにする。同時に、ヒトＥＰＳＣにおけるＰＯＤＸＬのノックダウンも、コロニーの大きさおよびコロニーの数を低減させ（図１Ｊ）、一方、強制的なＰＯＤＸＬ発現は、コロニーの大きさおよびコロニーの数を増大させることができる（図２Ｅおよび図２Ｄ）。さらに、強制的なＰＯＤＸＬ発現は、拡張型多能性リプログラミングへの、プライム型におけるドーム形状様コロニー形成の効率をさらに上昇させることができ（図２Ｇ）、これは、ＰＯＤＸＬが、拡張型多能性樹立のために十分であることを示唆している。手短に言うと、ＰＯＤＸＬはプライム型多能性および拡張型多能性の樹立に必要であり、このことは、ヒト初期胚発生におけるＭＹＣおよびＴＥＲＴに関連したその特異な役割を示唆するものである。
【0110】
ｓｈＲＮＡのオフターゲットの懸念の排除のために、強制的な異所性ＰＯＤＸＬ発現がｓｈＰＯＤＸＬで誘導された表現型をレスキューすることができる（図２Ａ）。さらに、誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集法を使用して、ｉＰＳＣにおいてＰＯＤＸＬのノックアウトも行った（図７）。予想された通り、誘導性ＰＯＤＸＫノックアウトは、細胞増殖および多能性に不利益であったことがわかった（図７）。しかしながら、ある報告では、安定的にＰＯＤＸＬノックアウトされたｈＥＳＣ株は幹細胞多能性に対する影響は示さなかったが、ポドサイト様細胞では接合部組織欠損を引き起こすことが示されている（Freedman et al., 2015）。最近、幾つかの報告によって、生存に有害となるはずである遺伝子喪失に対して生物を保護する機序として、遺伝子代償が存在することが示された（Rossi et al., 2015；Sztal et al., 2018）。これらは、単一細胞クローニングにおいて、有害なＰＯＤＸＬ喪失に対して保護する代償的ネットワークの活性化の問題を提起しているかもしれない。これによって、誘導性クローンと安定なクローンとにおける相違を説明することができる。よって、代償ネットワークが細胞培養選択圧下のＰＯＤＸＬノックアウト安定クローンにおいて誘発されたのかどうかという疑問は、さらに確認する必要がある。
【0111】
コレステロールは、ステロールホルモンおよびビタミンＤ産生においてだけでなく、シグナル伝達および脂質ラフト形成においても重要な役割を果たしている。しかし、ＰＳＣにおけるコレステロール代謝と再生との間の関係を理解するうえで利用できるデータは限られている。ある論文では、シンバスタチンが、ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ依存性細胞シグナル伝達を調整することによってマウスＥＳＣ自己複製を損なわせており、コレステロール非依存性であったことが報告されている（Lee et al., 2007）。際立ったことに、我々の研究において、ＰＯＤＸＬが、主要な調節因子であるＳＲＥＢＰ１／ＳＲＥＢＰ２とコレステロール生合成経路の律速酵素であるＨＭＧＣＲとを調節することによって、コレステロールレベルおよび脂質ラフト形成を調節し得ることが見出された（図３）。また、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＱＬＥ、ＬＤＬＲ、ＳＣＤ、ＰＣＳＫ９、ＳＣＡＰなどのコレステロール合成経路における幾つかの遺伝子転写物が、ＰＳＣにおいて上方制御されることもわかった（図３Ａ）。シンバスタチンおよびＡＹ９９４４によるコレステロール経路の遮断またはＭＢＣＤによるコレステロール欠乏が、ｈＰＳＣの自己複製能に深刻な影響を与えることに注目することが重要である（図４Ａおよび図４Ｂ）。線維芽細胞と比較して、ｈＰＳＣは、コレステロール遮断により高い感受性を示した（図４Ｃ）。先の報告では、スタチンは、核型異常のｈＥＳＣに対して毒性であるにしかすぎないが、正常核型を有するＰＳＣは殺すことができないことが主張された（Gauthaman et al., 2009）。しかしながら、それらの細胞は、培地中に高レベルのコレステロールを含有するノックアウト血清（ＫＳＲ）の存在下で、多量のｂＦＧＦ（１６ｎｇ／ｍｌ）と共に培養されていた（２０％ＫＳＲは約１．４０８μｇ／ｍｌのコレステロールと等価である）（Garcia-Gonzalo and Izpisua Belmonte、2008；Zhang et al., 2016）。対照的に、我々の細胞は、今日では幹細胞の分野において広く使用されている合成Ｅ８培地を用いて培養している。我々の細胞は核型分析を行っており、Ｈ９およびＨＵＥＳ６細胞いずれにおいても核型は正常である（データ非表示）。よって、我々の結果と先の結果との相違は、培養培地に起因することが示唆された。胚は血液拡散からしかコレステロールを得ることができないことから、胚が接触することができるコレステロールの量は少ないと推定される。このデータは、コレステロール生合成が、未分化ＰＳＣの幹細胞性特性と関連することを確証するものである。
【0112】
まとめると、我々のデータから、ＰＯＤＸＬは、ヒトプライム型および拡張型ＰＳＣにおいて大量に発現されており、ＳＲＥＢＰ１／ＳＲＥＢＰ２－ＨＭＧＣＲ－ｃ－ＭＹＣ－ＴＥＲＴシグナル伝達を通して自己複製を促進する膜貫通型タンパク質として機能することが示唆される。ＰＯＤＸＬの強力な能力が、ｃ－ＭＹＣ、ＴＥＲＴ、コレステロール経路を活性化し、増殖を促進し、アポトーシスを妨げると仮定すると、がん幹細胞も、腫瘍初発および進行に関して、ＰＯＤＸＬへの同様の依存を示す可能性があると憶測したくなる。また、ＰＯＤＸＬは、プライム型および拡張型多能性を支持することにおけるその特性により、再生医療における理論上無限の潜在力を有するものであり、将来、抗がん療法の効果的な標的を提供するものである。
【0113】
配列情報
ヒトＰＯＤＸＬのアミノ酸配列（配列番号１）
MRCALALSALLLLLSTPPLLPSSPSPSPSPSQNATQTTTDSSNKTAPTPASSVTIMATDTAQQSTVPTSKANEILASVKATTLGVSSDSPGTTTLAQQVSGPVNTTVARGGGSGNPTTTIESPKSTKSADTTTVATSTATAKPNTTSSQNGAEDTTNSGGKSSHSVTTDLTSTKAEHLTTPHPTSPLSPRQPTSTHPVATPTSSGHDHLMKISSSSSTVAIPGYTFTSPGMTTTLLETVFHHVSQAGLELLTSGDLPTLASQSAGITASSVISQRTQQTSSQMPASSTAPSSQETVQPTSPATALRTPTLPETMSSSPTAASTTHRYPKTPSPTVAHESNWAKCEDLETQTQSEKQLVLNLTGNTLCAGGASDEKLISLICRAVKATFNPAQDKCGIRLASVPGSQTVVVKEITIHTKLPAKDVYERLKDKWDELKEAGVSDMKLGDQGPPEEAEDRFSMPLIITIVCMASFLLLVAALYGCCHQRLSQRKDQQRLTEELQTVENGYHDNPTLEVMETSSEMQEKKVVSLNGELGDSWIVPLDNLTKDDLDEEEDTHL
ヒトＰＯＤＸＬ遺伝子の核酸配列（配列番号２）
ATGCGCTGCGCGCTGGCGCTCTCGGCGCTGCTGCTACTGTTGTCAACGCCGCCGCTGCTGCCGTCGTCGCCGTCGCCGTCGCCGTCGCCCTCCCAGAATGCAACCCAGACTACTACGGACTCATCTAACAAAACAGCACCGACTCCAGCATCCAGTGTCACCATCATGGCTACAGATACAGCCCAGCAGAGCACAGTCCCCACTTCCAAGGCCAACGAAATCTTGGCCTCGGTCAAGGCGACCACCCTTGGTGTATCCAGTGACTCACCGGGGACTACAACCCTGGCTCAGCAAGTCTCAGGCCCAGTCAACACTACCGTGGCTAGAGGAGGCGGCTCAGGCAACCCTACTACCACCATCGAGAGCCCCAAGAGCACAAAAAGTGCAGACACCACTACAGTTGCAACCTCCACAGCCACAGCTAAACCTAACACCACAAGCAGCCAGAATGGAGCAGAAGATACAACAAACTCTGGGGGGAAAAGCAGCCACAGTGTGACCACAGACCTCACATCCACTAAGGCAGAACATCTGACGACCCCTCACCCTACAAGTCCACTTAGCCCCCGACAACCCACTTCGACGCATCCTGTGGCCACCCCAACAAGCTCGGGACATGACCATCTTATGAAAATTTCAAGCAGTTCAAGCACTGTGGCTATCCCTGGCTACACCTTCACAAGCCCGGGGATGACCACCACCCTACTAGAGACAGTGTTTCACCATGTCAGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCGGGTGATCTGCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGCGTCATCGGTTATCTCGCAAAGAACTCAACAGACCTCCAGTCAGATGCCAGCCAGCTCTACGGCCCCTTCCTCCCAGGAGACAGTGCAGCCCACGAGCCCGGCAACGGCATTGAGAACACCTACCCTGCCAGAGACCATGAGCTCCAGCCCCACAGCAGCATCAACTACCCACCGATACCCCAAAACACCTTCTCCCACTGTGGCTCATGAGAGTAACTGGGCAAAGTGTGAGGATCTTGAGACACAGACACAGAGTGAGAAGCAGCTCGTCCTGAACCTCACAGGAAACACCCTCTGTGCAGGGGGCGCTTCGGATGAGAAATTGATCTCACTGATATGCCGAGCAGTCAAAGCCACCTTCAACCCGGCCCAAGATAAGTGCGGCATACGGCTGGCATCTGTTCCAGGAAGTCAGACCGTGGTCGTCAAAGAAATCACTATTCACACTAAGCTCCCTGCCAAGGATGTGTACGAGCGGCTGAAGGACAAATGGGATGAACTAAAGGAGGCAGGGGTCAGTGACATGAAGCTAGGGGACCAGGGGCCACCGGAGGAGGCCGAGGACCGCTTCAGCATGCCCCTCATCATCACCATCGTCTGCATGGCATCATTCCTGCTCCTCGTGGCGGCCCTCTATGGCTGCTGCCACCAGCGCCTCTCCCAGAGGAAGGACCAGCA GCGGCTAACAGAGGAGCTGCAGACAGTGGAGAATGGTTACCATGACAACCCAACACTGGAAGTGATGGAGACCTCTTCTGAGATGCAGGAGAAGAAGGTGGTCAGCCTCAACGGGGAGCTGGGGGACAGCTGGATCGTCCCTCTGGACAACCTGACCAAGGACGACCTGGATGAGGAGGAAGACACACACCTCTAG
ヒトＰＯＤＸＬのアミノ酸配列（配列番号１）
MRCALALSALLLLLSTPPLLPSSPSPSPSPSQNATQTTTDSSNKTAPTPASSVTIMATDTAQQSTVPTSKANEILASVKATTLGVSSDSPGTTTLAQQVSGPVNTTVARGGGSGNPTTTIESPKSTKSADTTTVATSTATAKPNTTSSQNGAEDTTNSGGKSSHSVTTDLTSTKAEHLTTPHPTSPLSPRQPTSTHPVATPTSSGHDHLMKISSSSSTVAIPGYTFTSPGMTTTLLETVFHHVSQAGLELLTSGDLPTLASQSAGITASSVISQRTQQTSSQMPASSTAPSSQETVQPTSPATALRTPTLPETMSSSPTAASTTHRYPKTPSPTVAHESNWAKCEDLETQTQSEKQLVLNLTGNTLCAGGASDEKLISLICRAVKATFNPAQDKCGIRLASVPGSQTVVVKEITIHTKLPAKDVYERLKDKWDELKEAGVSDMKLGDQGPPEEAEDRFSMPLIITIVCMASFLLLVAALYGCCHQRLSQRKDQQRLTEELQTVENGYHDNPTLEVMETSSEMQEKKVVSLNGELGDSWIVPLDNLTKDDLDEEEDTHL
ヒトＰＯＤＸＬ遺伝子の核酸配列（配列番号２）
ATGCGCTGCGCGCTGGCGCTCTCGGCGCTGCTGCTACTGTTGTCAACGCCGCCGCTGCTGCCGTCGTCGCCGTCGCCGTCGCCGTCGCCCTCCCAGAATGCAACCCAGACTACTACGGACTCATCTAACAAAACAGCACCGACTCCAGCATCCAGTGTCACCATCATGGCTACAGATACAGCCCAGCAGAGCACAGTCCCCACTTCCAAGGCCAACGAAATCTTGGCCTCGGTCAAGGCGACCACCCTTGGTGTATCCAGTGACTCACCGGGGACTACAACCCTGGCTCAGCAAGTCTCAGGCCCAGTCAACACTACCGTGGCTAGAGGAGGCGGCTCAGGCAACCCTACTACCACCATCGAGAGCCCCAAGAGCACAAAAAGTGCAGACACCACTACAGTTGCAACCTCCACAGCCACAGCTAAACCTAACACCACAAGCAGCCAGAATGGAGCAGAAGATACAACAAACTCTGGGGGGAAAAGCAGCCACAGTGTGACCACAGACCTCACATCCACTAAGGCAGAACATCTGACGACCCCTCACCCTACAAGTCCACTTAGCCCCCGACAACCCACTTCGACGCATCCTGTGGCCACCCCAACAAGCTCGGGACATGACCATCTTATGAAAATTTCAAGCAGTTCAAGCACTGTGGCTATCCCTGGCTACACCTTCACAAGCCCGGGGATGACCACCACCCTACTAGAGACAGTGTTTCACCATGTCAGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCGGGTGATCTGCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGCGTCATCGGTTATCTCGCAAAGAACTCAACAGACCTCCAGTCAGATGCCAGCCAGCTCTACGGCCCCTTCCTCCCAGGAGACAGTGCAGCCCACGAGCCCGGCAACGGCATTGAGAACACCTACCCTGCCAGAGACCATGAGCTCCAGCCCCACAGCAGCATCAACTACCCACCGATACCCCAAAACACCTTCTCCCACTGTGGCTCATGAGAGTAACTGGGCAAAGTGTGAGGATCTTGAGACACAGACACAGAGTGAGAAGCAGCTCGTCCTGAACCTCACAGGAAACACCCTCTGTGCAGGGGGCGCTTCGGATGAGAAATTGATCTCACTGATATGCCGAGCAGTCAAAGCCACCTTCAACCCGGCCCAAGATAAGTGCGGCATACGGCTGGCATCTGTTCCAGGAAGTCAGACCGTGGTCGTCAAAGAAATCACTATTCACACTAAGCTCCCTGCCAAGGATGTGTACGAGCGGCTGAAGGACAAATGGGATGAACTAAAGGAGGCAGGGGTCAGTGACATGAAGCTAGGGGACCAGGGGCCACCGGAGGAGGCCGAGGACCGCTTCAGCATGCCCCTCATCATCACCATCGTCTGCATGGCATCATTCCTGCTCCTCGTGGCGGCCCTCTATGGCTGCTGCCACCAGCGCCTCTCCCAGAGGAAGGACCAGCA GCGGCTAACAGAGGAGCTGCAGACAGTGGAGAATGGTTACCATGACAACCCAACACTGGAAGTGATGGAGACCTCTTCTGAGATGCAGGAGAAGAAGGTGGTCAGCCTCAACGGGGAGCTGGGGGACAGCTGGATCGTCCCTCTGGACAACCTGACCAAGGACGACCTGGATGAGGAGGAAGACACACACCTCTAG
【0114】
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【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】