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特表2022-515920リファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-22
(54)【発明の名称】リファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/55 20170101AFI20220215BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20220215BHJP
A61K 31/4375 20060101ALI20220215BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220215BHJP
【ＦＩ】
A61K47/55
A61K31/395
A61K31/4375
A61P31/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021539517
(86)(22)【出願日】2020-01-03
(85)【翻訳文提出日】2021-07-20
(86)【国際出願番号】 CN2020070161
(87)【国際公開番号】W WO2020143534
(87)【国際公開日】2020-07-16
(31)【優先権主張番号】201910017484.3
(32)【優先日】2019-01-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519304240
【氏名又は名称】丹諾医薬（蘇州）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】馬 振坤
(72)【発明者】
【氏名】袁 鷹
(72)【発明者】
【氏名】劉 宇
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076CC31
4C076CC41
4C076DD60
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB09
4C086CB25
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB35
(57)【要約】
本発明は、メチシリン薬剤耐性、キノロン薬剤耐性、及び／又はキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌による細菌感染症の治療及び予防に有効なリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用を提供する。
本発明にて提供されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩は、メチシリン薬剤耐性、キノロン薬剤耐性、及びメチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌による細菌感染及び疾患の治療及び予防に有効であり、リファマイシンとキノロンとの組み合わせと比較して、自然発生的薬剤耐性の頻度を低減することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染による疾患の治療又は予防用の薬物の製造のための、Ｉで示されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用。【化1】
【請求項2】
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌は、メチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌、メチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌、又はキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌を含むことを特徴とする請求項１に記載の適用。
【請求項3】
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染症は、急性細菌感染症及び／又はバイオフィルム細菌感染症を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の適用。
【請求項4】
前記急性細菌感染症は、皮膚及び皮膚組織感染症、呼吸器感染症、又は菌血症を含むことを特徴とする請求項３に記載の適用。
【請求項5】
前記バイオフィルム感染症は、心臓弁感染症、人工関節感染症、カテーテル関連血液感染症のうちの１つ又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする請求項３に記載の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬技術分野に属するリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用に関する。
【背景技術】
【0002】
メチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）感染症は、現在、深刻な臨床治療疾患及び公衆健康問題である。ＭＲＳＡは、１９６０年代に初めて発見されて以来、その分離率が年々増加し、病院内感染の重要な病原菌となってコミュニティへの拡散傾向を示すとともに、多剤耐性の現象がますます厳しくなっており、バンコマイシンに対して異なる程度の薬剤耐性を示す黄色ブドウ球菌が出現し、大部分のＭＲＳＡはキノロンやマクロライド抗生物質に対して同時に薬剤耐性を生じるようになってきた。一方、ヒト組織や埋め込み型医療機器の表面に細菌のバイオフィルムが形成されることは、抗生物質の活性を低下させ、薬剤耐性菌を形成する上で重要な条件である。したがって、メチシリン及びキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌による感染、特にバイオフィルム関連感染の治療は、現在、満たされていない主要な臨床的ニーズである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
上記の従来技術に存在する欠点に鑑みて、本発明の目的は、メチシリン薬剤耐性及び／又はキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌による細菌感染症の治療及び予防に有効なリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明の目的は、以下の解決手段によって達成される。
【0005】
薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染による疾患の治療又は予防用の薬物の製造のための、Ｉで示されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用。
【0006】
【化1】
【0007】
上記の適用において、好ましくは、前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌は、メチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌、メチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌、又はキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌を含む。
【0008】
上記の適用において、好ましくは、前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染症は、急性細菌感染症及び／又はバイオフィルム細菌感染症を含む。
【0009】
上記の適用において、好ましくは、前記急性細菌感染症は、皮膚及び皮膚組織感染症、呼吸器感染症、又は菌血症を含む。
【0010】
上記の適用において、好ましくは、前記バイオフィルム感染症は、心臓弁感染症、人工関節感染症、カテーテル関連血液感染症のうちの１つ又は複数の組み合わせを含む。
【発明の効果】
【0011】
本発明の顕著な効果は、以下のとおりである。
【0012】
本発明にて提供されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩は、メチシリン薬剤耐性、キノロン薬剤耐性、及びメチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌による細菌感染及び疾患の治療及び予防に有効であり、自然発生的薬剤耐性の頻度を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1a】黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの１４日間の治療効果図である。
【図1b】黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉのリバウンド治療手段の効果図である。
【図2a】黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファンピシン＋レボフロキサシンの組み合わせの１４日間の治療効果図である。
【図2b】黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファンピシン＋レボフロキサシンの組み合わせのリバウンド治療手段の効果図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の技術的特徴、目的、及び有益な効果をより明確に理解するために、本発明の技術的解決手段を以下に詳細に説明するが、本発明の実施可能な範囲を制限するものとして理解されるべきではない。以下の実施例に記載の実験方法は、特に明記しない限り、いずれも従来の方法であり、前記試薬及び材料は、特に明記しない限り、いずれも商業チャネルで購入できる。
【0015】
下記の実施例では、便宜上、グラフ中で意味表示を行うために、リファマイシン－キノリジノン結合分子をＩと定義する。
【0016】
（実施例１）
本実施例は、メチシリン黄色ブドウ球菌の治療及び予防のための薬物の製造における、リファマイシン－キノリジノン結合分子（Ｉ）及びその薬学的に許容可能な塩の適用を提供する。
本実施例は、メチシリン黄色ブドウ球菌の治療及び予防のための薬物の製造における、リファマイシン－キノリジノン結合分子（Ｉ）及びその薬学的に許容可能な塩の適用を提供する。
【0017】
本実施例において、Ｉの薬学的に許容される全ての塩（例えば、モノナトリウム塩、二ナトリウム塩、カリウム塩など）は、インビボでＩ（式Ｉに示す）の薬物原型に変換されるため、実験テストにおいてＩを基礎とし、Ｉはダノール医薬有限公司から提供される。
【0018】
【化2】
【0019】
本実施例の適用において、キノロンに対する感受性及び異なる程度の薬剤耐性の背景で、Ｉに対するメチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌の感受性及び薬剤耐性の自然突然変異頻度の分析、及びリファンピシン、レボフロキサシン、並びにリファンピシンとレボフロキサシンの組み合わせの薬剤との比較について、具体的な方法は以下のとおりである。
【0020】
試験薬剤：ダノール医薬により提供され、－２０℃で保存されるリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ。比較化合物は商業チャネルで購入した。試験化合物関連情報を下記の表１に示す。
【0021】
【表1】
【0022】
上記化合物は、自然突然変異分析及び寒天最小静菌濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）分析を行う際に、それぞれ対応する溶媒中に、最大終濃度の１００倍の濃度の原液（１００Ｘ）として調製し、当日中に使用した。使用前に、ＩをＤＭＳＯでさらに希釈し、ベンズゾリン、リファンピシン及びレボフロキサシンを、水でさらに希釈した。ＤＭＳＯ濃度は、化合物の寒天希釈法によるＭＩＣ分析又は自然突然変異分析の過程において、いずれも１％（ｖ／ｖ）を超えなかった。
【0023】
細菌分離株：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）分離株をＭｉｃｒｏｍｙｘ菌株の保存センターの－８０℃保存室から取り出し、解凍した後、トリプトン大豆寒天＋５％羊血（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）のプレート培地に接種し、続いて３５℃で一晩好気培養した。試験中、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３（ＭＲＳＡ、菌株番号１００）菌株を品質管理のために添加した。
【0024】
試験用培地：寒天希釈法によるＭＩＣ分析及び自然突然変異分析には、いずれもＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地（ＭＨＡ、ＢＤ／ＢＢＬ）を用いた。各菌株の接種材料をＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎカチオン調製液体培地（ＣＡＭＨＢ、ＢＤ／ＢＢＬ）に懸濁した。ベンズゾリン試験の際、塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を終濃度の２％でＣＡＭＨＢに添加した。コロニー計数のために細菌懸濁液を希釈する場合も、ＣＡＭＨＢを使用した。
【0025】
寒天希釈法によるＭＩＣ測定：ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）推奨に準拠して、寒天希釈法によるＭＩＣ値測定を行った。全ての試験試薬について、１００倍の最終試験濃度から開始して、２倍段階の一連希釈（Ｉは０．５～０．０００５μｇ／ｍＬ、ベンズゾリンは８～０．０６μｇ／ｍＬ、リファンピシンは１～０．００１μｇ／ｍＬ、レボフロキサシンは６４～０．０１５μｇ／ｍＬ）を行う。１００Ｘ試験試薬０．２ｍＬ＋寒天培地１９．８ｍＬの割合で、各試験試薬を予熱したＭＨＡ寒天培地（５０－５５℃）とともに滅菌チューブに入れ、穏やかに振盪し、続いて滅菌ペトリ皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に流し込んだ。ペトリ皿を室温で凝固させた。０．５マックス濁度標準菌懸濁液を調製し、ＣＡＭＨＢで１：１０に希釈し、続いて、ステンレス鋼マルチポイントシーダーを用いて、薬用プレート上に１０４ＣＦＵ／ポイントで接種した。寒天培地表面の接種材料を乾燥させた後、プレートを逆さにし、好気的に３５℃で２０～２４時間培養し、その成長状況を検査した。ＭＩＣは、培地表面での細菌成長を有意に阻害する試験薬剤に必要な最小濃度である。
【0026】
自然突然変異頻度測定：寒天希釈法によるＭＩＣ測定結果に基づいて、黄色ブドウ球菌３２６５、３２７０、３２７８及び６３１２菌株において、Ｉ及びリファンピシン薬剤耐性突然変異が生じる頻度を、０．５、２及び８μｇ／ｍＬの濃度で試験した。リファンピシン／レボフロキサシンの併用薬剤の試験濃度は、０．５／０．５、２／２及び８／８μｇ／ｍＬであった。各試験試薬原液は、いずれも自然突然変異頻度分析用の寒天プレートに必要とされる最終標的試験濃度の１００倍で調製した。
【0027】
各試験菌株の培養のために、０．５ｍＬの１００Ｘ Ｉ、リファンピシン又はリファンピシン／レボフロキサシン混合薬を、４９．５０ｍＬ（４９ｍＬの併用薬剤群）の５０－５５℃の高圧冷却ＭＨＡと混合した。薬物／寒天混合物を、１５０×１５ｍｍ滅菌プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に、各プレート５０ｍＬに分注する。各自然突然変異分析プレートの標的接種量は、少なくとも１０９ＣＦＵであった。ペトリ皿を室温に置いて凝固させた。
【0028】
自然突然変異頻度分析接種材料の調製方法は、新たに成長した菌株を滅菌綿棒で掻き取り、続いて６ｍＬのＣＡＭＨＢで高濃度の細胞懸濁液（濁度約１．７０）を調製した。懸濁生菌数はＭＨＡ１０倍連続希釈法でカウントし、続いて数回カウントして平均値を求めた。分析の際に、接種材料０．２５ｍＬを１５０×１５ｍｍのプレート表面に、各試験薬物濃度でプレート２枚ずつ塗布し、乾燥後、プレートを逆さにし、３５℃で４８時間培養し、続いて生菌数をカウントした。自然突然変異頻度の計算式は以下のとおりである。
【0029】
自然突然変異頻度＝各選択培地群の平均コロニー数／各プレート上で培養された細胞総数
【0030】
各選択培地にいずれもコロニーが存在しない場合には、コロニー数が１の場合の突然変異頻度以下（例えば、１／プレート培養細胞総数）と報告された。また、コロニー数の平均値が小数（例えば、１６．５）である場合、当該数字は、上に整数を求めた（例えば、１６．５は１７と記載される）。
【0031】
並行実験では、マックス濁度０．５の標準菌懸濁液を、標準寒天希釈分析の接種材料（１０４ＣＦＵ／スポット）としてさらに調製した。ＣＡＭＨＢで１：１０に希釈した懸濁液から、２μＬの接種材料を、それぞれのＩ又はリファンピシンの濃度が２Ｘ及び４Ｘ ＭＩＣである（寒天希釈法）寒天培地（すなわち、自然突然変異分析に使用した培地）に移し、各培地に２枚ずつのプレートを接種した。当該ステップは、薬物原液の濃度が標準接種材料の成長を阻害することができることを確認するために、自然突然変異分析で使用される培地及び薬物を使用した。レボフロキサシン原液の品質管理を、標準接種材料及び８～０．００８μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを用いて、別々の寒天希釈で分析した。当該方法は、自然突然変異頻度分析における黄色ブドウ球菌株の大部分がレボフロキサシンに対して耐性があるため、レボフロキサシン原液の最適な品質管理のための手段である。上記のプレートを３５℃条件で２０～２４時間インキュベートし、続いて観察した。
【0032】
自然突然変異の同定結果の確認：自然突然変異体を、新たに調製した寒天培地に移して一晩培養し、続いてＢｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｔｙｐｅｒ ＭＡＬＤＩ装置を用いて同定した。
【0033】
薬剤耐性菌に対する投与結果：レボフロキサシンに対しては薬剤耐性を有するがリファンピシンに対して感受性を有するＭＲＳＡ分離株で細菌のＩに対する薬剤耐性変異を評価した。表２は、寒天希釈法により測定した２３株のＭＲＳＡ分離株のＩ、リファンピシン、ベンズゾリン及びレボフロキサシンに対する感受性である。全ての菌株は、いずれもベンズゾリンに対して薬剤耐性を有し、ＭＲＳＡ表現型を確かに有することが示された。
【0034】
【表2】
【0035】
備考：表中の上付きの意味：１は、有効なブレークポイントに基づく表現型分類、２は、ＣＬＳＩの品質管理範囲、３は、終点未定、太字は、自然突然変異分析のために選択された菌株である。
【0036】
Ｉは、ＭＲＳＡに対する非常に強力な阻害活性を有し、各試験菌株に対するＭＩＣがリファンピシンと同様にいずれも０．０１５μｇ／ｍＬであった。全２３株の菌株はいずれもリファンピシンに感受性（ＭＩＣ≦１μｇ／ｍＬ、感受性であった）を示したが、レボフロキサシンのＭＩＣ値は０．２５－６４μｇ／ｍＬの範囲であった。本実施例では、自然突然変異頻度分析のための測定菌株として、ＬＥＶＲＲＩＦＳ分離株３２６５、３２７０、及び６３１２、並びにＬＥＶＳＲＩＦＳ分離株３２７８を選択した。
【0037】
４種のＭＲＳＡ分離株をＩ又はリファンピシン（０．５、２又は８ｕｇ／ｍＬの濃度）を含有する培地を用いて自然突然変異頻度分析を行った結果を表３に示す。また、等量のリファンピシン及びレボフロキサシン混合物（各０．５、２又は８μｇ／ｍＬ）を含有するプレートも調製した。１プレート当たりの接種量は３．８～５．４×１０９ＣＦＵであった。Ｉプレート上ではいずれかの自然突然変異体も回収できず、したがってその自然突然変異頻度は＜１．８５－２．５６×１０－１０の範囲であった。対照的に、各試験菌株は、ＭＩＣの６３－１０００倍の培地中のリファンピシン濃度を選択したにもかかわらず、依然として多数の自然突然変異体を生成した。
【0038】
リファンピシン／レボフロキサシン混合培地においてＬＥＶＳＲＩＦＳ菌株の３２７８の自然突然変異体をスクリーニングすることができなかったことは、おそらく、両方の薬物の含有量がいずれもそのＭＩＣよりもはるかに高かったためである。しかしながら、６３１２及び各８μｇ／ｍＬのリファンピシン／レボフロキサシン含有プレート（レボフロキサシン濃度がＭＩＣよりも高い）を除いた残りのＬＥＶＲＲＩＦＳ菌株は、各濃度のリファンピシン／レボフロキサシン混合投与に対していずれも薬剤耐性を示した。当該結果は、リファンピシンとレボフロキサシンとを混合して使用し、レボフロキサシンの濃度がＭＩＣよりも高い場合には、自然突然変異体の生成を阻害でき、レボフロキサシンの濃度がＭＩＣよりも低い場合には、混合薬によっても薬剤耐性変異体の生成を阻害できないことを示した。
【0039】
表４に示すように、培地及び薬物原液の品質管理試験の結果は、ＭＩＣ値が決定された所定の範囲内にあることを示し、したがって、本実験方法は有効である。ＭＩＣの２倍、４倍のＩ及びリファンピシン濃度の選択培地に標準接種量で接種した後、無菌的に成長したところ、寒天中の薬剤濃度が試験菌株に対して強い阻害効果を確かに有することが確認された。
【0040】
【表3】
【0041】
備考：表中、自然突然変異分析培地にコロニーが成長しなかった場合、コロニー数１に従って自然突然変異率を算出した。上付き２は、リファンピシン及びレボフロキサシン各々０．５、２又は８μｇ／ｍＬを含有する培地を示し、上付き３は、レボフロキサシンのＭＩＣを示す。
【0042】
【表4】
【0043】
備考：表中の上付き１は、ＣＬＳＩ品質管理範囲を示す。
【0044】
以上をまとめて、４種の試験ＭＲＳＡ菌株のいずれも、０．５、２、及び８μｇ／ｍＬのＩ濃度の条件下で薬剤耐性を生じなかった。リファンピシン単剤試験時の自然突然変異の頻度が高いことが予想に合致している。リファンピシン／レボフロキサシンの併用薬剤は、レボフロキサシン濃度がＭＩＣよりも高い場合のみに薬剤耐性突然変異を防止することができる（全ての濃度条件下でＬＥＶＳＲＩＦＳ菌株、及び?８μｇ／ｍＬのレボフロキサシンに薬剤耐性を有するＬＥＶＲＲＩＦＳ菌株を含む）。
【0045】
（実施例２）
本実施例は、メチシリン黄色ブドウ球菌の治療及び予防のための薬物の製造における、リファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用を提供する。その医薬成分は、リファマイシン－キノリジノン結合分子（Ｉ）及び抗菌剤を含み、その使用量は任意に調製できる。
本実施例は、メチシリン黄色ブドウ球菌の治療及び予防のための薬物の製造における、リファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用を提供する。その医薬成分は、リファマイシン－キノリジノン結合分子（Ｉ）及び抗菌剤を含み、その使用量は任意に調製できる。
【0046】
それとともに、本実施例においても、上記の薬物製剤について、バイオフィルム感染に対する治療効果試験を行った。式Ｉのリファマイシン－キノリジノン結合分子は、同質遺伝子型薬剤耐性黄色ブドウ球菌株を用いたマウスのバイオフィルム移植モデルにおける、リファンピシン、レボフロキサシン及びガチフロキサシン（単独及び併用）とのインビボ治療効果を有する。
【0047】
試験薬剤：ダノール医薬により提供され、－２０℃で保存されるリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ。その他の試験化合物及び試薬は、商業的に購入した。本実施例では、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの薬学的に許容される全ての塩（例えば、モノナトリウム塩、二ナトリウム塩、カリウム塩など）は、インビボでＩ（式Ｉに示す）の薬学的原型に変換されるため、試験はＩをベースとする。ＭＩＣ試験におけるＩの調製溶液に０．００２％のトウェイン８０を添加した。試験用製剤は１０％エタノール／５％重炭酸ナトリウム／６％ポリオキシエチレンヒマシ油ＥＬで調製（体積比）し得た。さらなる製剤は、滅菌水、５％重炭酸ナトリウム又は０．９％生理食塩水を用いて、式Ｉの分子化合物を添加して調製し得た。式Ｉのリファマイシン－キノリジノン結合分子の製剤を３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。臨床的最大曝露量Ｃｍａｘに到達することをシミュレートするように、リファンピシン及びレボフロキサシン混合治療を、２０ｍｇ／ｋｇ＋２５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。
【0048】
細菌：バイオフィルム形成用の黄色ブドウ球菌は、野生型ＣＢ１４０６と、その同質遺伝子型フルオロキノリン薬剤耐性誘導体ＣＢ１８２３（ｐａｒＣＳ８０Ｆ）、ＣＢ１８４０（ｎｏｒＡｕｐ）及びＣＢ１８５７（ｐａｒＣＳ８０Ｆ＋ｎｏｒＡｕｐ）とである。最小阻害濃度（ＭＩＣ）試験は、ＣＬＳＩ推奨ブロス微量希釈法で行った。
【0049】
試験動物：本実施例では、５－６週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスを用いた。マウスは、この試験の間に自由に摂取することができ、飲むことができた。動物の管理及び使用に関する試験手段及び変更又は操作は、動物の管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の審査及び承認を通して開始前にすでに行われている。
【0050】
インプラントを定植するためのインビトロ準備：テフロン（登録商標）静脈カテーテル（１４－Ｇｕａｇｅ ＡｂｂｏＣａｔｈ－Ｔ＃２７１－１０００又はＢｒａｕｎ Ｉｎｔｒｏｃａｎ＃４２５ ２５９４）を１ｃｍの断片に切断し、７０％エタノールに１５分間浸漬することにより滅菌し、ＵＶ光下で２０分間乾燥させ、続いて滅菌１．５ｍＬポリプロピレンチューブに入れ、３７℃に加熱した。細菌接種材料を、０．２５％グルコースを添加したトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢＧ）中で１：１０希釈し、２５０ｒｐｍで１時間、３７℃で振盪しながらインキュベートする一晩培養によって調製した。培養物を、１．０Ｅ＋０６ＣＦＵ／ｍＬまでＴＳＢＧで３７℃に希釈し、各カテーテルに１ｍＬを添加し、３７℃で２．５時間振盪せずに培養し、続いて１８℃に冷却してインプラント外科手術が完了するまで成長を遅らせた。
【0051】
皮下インプラント感染の形成及び治療：マウスをイソフルラン蒸気（４Ｌ／ｍｉｎ）で麻酔し、両側を剃毛し、エタノール／ポビドンヨードで消毒し、２箇所の３ｍｍの切開を行った。皮下腔を形成し、続いて予め接着した細菌が定植されたカテーテルセグメントを腔内に挿入し、外科用ステープルで縫合した。これらのマウスをケージに戻し、有害反応を定期的にモニターした。治療を手術後１週間（細菌定植及びバイオフィルム形成）にわたり開始し、腹腔内注射（ＩＰ）を１日２回行い、治療群は、７日治療、７日治療＋７日無治療リバウンド期間、７日治療＋７日反発＋７日再治療、各治療群又は試料採取群の５匹のマウス（合計１０匹のインプラント）を含んだ。インプラントに関連する細菌は、埋め込み手術中及び感染後２８日間の間隔で、埋め込みカテーテルセグメントをサンプリングすることによってモニターした。
【0052】
感染インプラントのサンプリング：感染マウスを二酸化炭素吸入で安楽死させ、両側を７０％エタノールで滅菌し、感染カテーテルセグメントを切除して１ｍｌのリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．２（１×ＰＢＳ）に移した。取り出された植え込みカテーテルセグメントの内面に付着した細菌を、２００μＬ１×ＰＢＳをカテーテルに添加して繰り返し吸引し、続いて５分間高速で振盪した。移植試料をドライアイス／エタノール中で一時的に凍結し、ＣＦＵカウントが測定されるまで－８０℃で保存した。
【0053】
ＣＦＵカウント測定：カテーテルを３７℃の水浴中で急速に解凍させ、２分間振盪し、一連希釈後に寒天プレート上で８μＬ滴下し、斑点を観察した。無薬木炭又はＭＨＩＩ寒天プレート上で培養した後、生菌数を決定した。耐性菌の生存及び出現を、１μｇ／ｍＬの薬物（リファンピシン、レボフロキサシン、Ｉ）を含有するＭＨＩＩ寒天培地に、希釈したカテーテル細菌試料を同時に並行して別々に添加して評価した。全てのＣＦＵ測定の検出下限は、２．０９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／インプラント以下であった。
【0054】
データ分析：希釈法によるＣＦＵ／カテーテル測定でコロニーをカウントした結果、５－５０個コロニー／斑点であった。カウントは、連続希釈係数で乗算された。得られた元の値をｌｏｇ１０ＣＦＵに変換して平均値と標準偏差とを算出した。治療群のｌｏｇ減少量は、対照治療マウスの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ値から薬物治療マウスの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ値を引いたものであった。
【0055】
結果：図１ａ、１ｂは、黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの治療効果図であり、溶媒対照治療の抗生物質治療マウスの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテルであった。以下の手段により、ＩＰ注射による１日２回の治療、１－１）１４日間治療：感染後１週間から１４日間の投与、１－２）再発治療：感染後１週間から７日間の治療（７未治療日間の再発期間及びさらなる７日間の再治療日を含む）を施した。Ｌｏｇ１０ＣＦＵカウントを、治療開始（７日目）、１４日目（投与７日後）、２１日目（治療１４日後又は７日再発）及び２８日目（７日再治療）後に測定した。検出限界は、２．０９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／インプラントであった。
【0056】
図２ａ、図２ｂは、黄色ブドウ球菌の同質遺伝子型キノロン薬剤耐性菌株に感染したマウスに対するリファンピシン＋レボフロキサシンの組み合わせの治療効果図であり、溶媒対照処置マウス及び抗生物質治療マウスの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテルである。以下の手段により、ＩＰ注射による１日２回の治療、２－１）１４日間治療：感染後１週間から１４日間の投与、２－２）再発治療処置：感染後１週間から７日間の治療（７未治療日間の反発期及びさらなる７日間の治療日を含む）を施した。Ｌｏｇ１０ＣＦＵカウントを、治療開始（７日目）、１４日目（投与７日後）、２１日目（治療１４日後又は７日再発）及び２８日目（７日再治療）後に測定した。検出限界は、２．０９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／インプラントであった。
【0057】
黄色ブドウ球菌ＣＢ１４０６（野生型）に対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ及びリファンピシン＋レボフロキサシンの治療結果を、表５－１、５－２及び図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂに示す。
【0058】
【表5-1】
【0059】
【表5-2】
【0060】
１４日間連続して３０ｍｇ／ｋｇ／の腹腔内注射で１日２回投与し、Ｉは野生型黄色ブドウ球菌感染カテーテル部位での細菌コロニー数（ＣＦＵ）の４．６ｌｏｇ減少をもたらした。同じ治療手段において、リファンピシン＋レボフロキサシン（２０＋２５ｍｇ／ｋｇ）の併用は、同様のカウント数減少（４．７ｌｏｇ）を示した。Ｉ又はリファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物のいずれかにおいても、リファンピシン又はＩの薬剤耐性の産生が観察されなかったことは、抗生物質プレートを含むカテーテルから回収した菌株の成長から証明された。
【0061】
再発治療手段において、最初治療７日、続いて休薬７日及び最後の追加治療７日、Ｉは、それぞれ２．１、４．６及び４．７ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少をもたらした。リファンピシン＋レボフロキサシンは、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉよりも若干治療効果が低く、同時にそれぞれ１．５、３．８、及び４．０ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少を示した。Ｉで処置した動物は、全ての試料採取部位でリファンピシン又はそれ自体に対する薬剤耐性が観察されなかった。対照的に、リファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物の２５％のカテーテルは、７日の再処置期間後にリファンピシンに対する薬剤耐性を示した。
【0062】
キノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌ＣＢ１８２３（ｐａｒＣＳ８０Ｆ）に対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ及びリファンピシン＋レボフロキサシン薬剤の組み合わせの治療結果を、表６－１、表６－２及び図１ａ、図１ｂ、図２ａ、図２ｂに示す。
【0063】
【表6-1】
【0064】
【表6-2】
【0065】
１４日間連続して３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したところ、Ｉは、黄色ブドウ球菌ＣＢ１８２３（ｐａｒＣＳ８０Ｆ）感染カテーテル部位での細菌数の４．３ｌｏｇ減少をもたらした。同じ治療手段において、リファンピシン＋レボフロキサシン（２０＋２５ｍｇ／ｋｇ）の併用は、同様のカウント数減少（４．２ｌｏｇ）を示した。Ｉで治療した動物のいずれかにおいても、リファンピシン又はＩによる薬剤耐性の生成が観察されなかったことは、抗生物質プレートのカテーテルから回収した菌株の成長から証明された。対照的に、リファンピシン＋レボフロキサシン治療群の２５％は、リファンピシンに対する薬剤耐性を示した。
【0066】
再発治療手段において、治療７日、休薬７日及び再治療７日後に、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、それぞれ、２．４、４．４及び４．５ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少をもたらした。リファンピシン＋レボフロキサシンは、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉよりも若干治療効果が低く、同時にそれぞれ２．２、３．１、及び３．６ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少を示し、リファンピシンに対するリファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物の薬剤耐性が観察された。治療７日、休薬７日及び再治療７日後の薬剤耐性の割合は、それぞれ０％、３０％及び３０％であった。
【0067】
リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ及びリファンピシン＋レボフロキサシンの組み合わせの排出ポンプ活性化によるキノロン薬剤耐性をもたらす黄色ブドウ球菌ＣＢの治療結果を、表７－１、表７－２及び図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂに示す。
【0068】
【表7-1】
【0069】
【表7-2】
【0070】
１４日間連続して３０ｍｇ／ｋｇの用量で治療したところ、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、黄色ブドウ球菌ＣＢ１８４０（ｎｏｒＡｕｐ）感染カテーテルの細菌数の４．９ｌｏｇ１０ＣＦＵの減少をもたらした。同じ治療手段において、リファンピシン＋レボフロキサシン（２０＋２５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは、同様のカウント数減少（４．９ｌｏｇ１０ＣＦＵ）を示した。リファンピシン又はリファンマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの薬剤耐性の生成が、リファンマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ又はリファンピシン＋レボフロキサシンで治療した動物のいずれにおいても観察されなかったことは、抗生物質を含有するプレート上でのカテーテルから回収した菌株の成長から証明された。
【0071】
再発治療手段において、治療７日、休薬７日及び再治療７日後に、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、それぞれ、２．４、４．９及び４．９ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少をもたらした。リファンピシン＋レボフロキサシンは、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉよりも若干治療効果が低く、同時にそれぞれ２．０、４．５、及び４．７ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少を示した。リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉで処置した動物は、全ての試料採取箇所でリファンピシン又はそれ自体に対する薬剤耐性が観察されなかった。対照的に、リファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物の１１％のカテーテルは、７日の再治療後にリファンピシンに対する薬剤耐性を示した。
【0072】
キノロン二重薬剤耐性機能を含む黄色ブドウ球菌ＣＢ１８５７（ｐａｒＣＳ８０Ｆ＋ｎｏｒＡｕｐ）に対するリファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ及びリファンピシン＋レボフロキサシンの組み合わせの治療結果を、表８－１、８－２及び図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂに示す。
【0073】
【表8-1】
【0074】
【表8-2】
【0075】
１４日間連続して３０ｍｇ／ｋｇの用量で治療したところ、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、黄色ブドウ球菌ＣＢ１８５７（ｐａｒＣＳ８０Ｆ＋ｎｏｒＡｕｐ）感染カテーテルの細菌数の４．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ減少をもたらした。同じ処置手段において、リファンピシン＋レボフロキサシン（２０＋２５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは、同様のカウント数減少（４．３ｌｏｇ１０ＣＦＵ）を示した。リファンピシン－キノリジノン結合分子Ｉで処置した動物では、リファンピシン又はリファンピシン－キノリジノン結合分子Ｉの薬剤耐性の生成が観察されなかったことは、抗生物質を含有するプレート上でのカテーテルから回収した菌株の成長から証明された。対照的に、リファンピシン＋レボフロキサシン１０％で治療したマウスは、リファンピシンに対する薬剤耐性を示した。
【0076】
再発治療手段において、治療７日、休薬７日及び再治療７日後に、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、それぞれ、２．５、４．４及び４．４ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少をもたらした。リファンピシン＋レボフロキサシンは、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉよりも若干治療効果が低く、同時にそれぞれ１．８、３．７及び４．１ｌｏｇ１０ＣＦＵの細菌数の減少を示した。試料採取時点で、リファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物が、リファンピシンに対する薬剤耐性を有することが観察された。治療７日、休薬７日、再治療７日後のカテーテル薬剤耐性の割合はそれぞれ２２％、２０％、２２％であった。７日の再治療期間後、リファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物の１１％のカテーテルは、リファンピシン＋レボフロキサシンに対する二重耐性を示した。
【0077】
本実施例では、医療機器関連細菌感染症に対する抗菌薬物のインビボ薬効を、マウス皮下埋め込みカテーテル感染モデルにより評価した。使用した細菌は、バイオフィルムを生成する同質遺伝子型薬剤耐性黄色ブドウ球菌であった。野生型バイオフィルム菌株ＣＢ１４０６から開始して、同質遺伝子型変異を有する抗フルオロキノロン誘導体ＣＢ１８２３（ｐａｒＣＳ８０Ｆ）、ＣＢ１８４０（ｎｏｒＡｕｐ）、及びＣＢ１８５７（ｐａｒＣＳ８０Ｆ＋ｎｏｒＡｕｐ）が生成された。
【0078】
これらの４種の菌株は、マウスにおいて類似の成長動態を示し、感染後７日目～２８日目の間、細菌の平均カウントは、テフロン（登録商標）のインプラント上で、６．８－７．３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／インプラントであった。
【0079】
１４日間治療したマウスの微生物学的検出を、カテーテルのコロニー数のｌｏｇ１０ＣＦＵの減少を測定することによって行うところ、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ（３０ｍｇ／ｋｇ）及びリファンピシン＋レボフロキサシン（合計用量２０＋２５ｍｇ／ｋｇ又は４５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは、類似の治療効果を示し、ｌｏｇ１０ＣＦＵの減少範囲がいずれも４．３－４．９であった。リファンピシン＋レボフロキサシンで処置した動物では、ｐａｒＣＳ８０Ｆ突然変異を含む生物（ＣＢ１８２３及びＣＢ１８５７）の感染において、リファンピシンに対する薬剤耐性の出現率がわずかに高いことが観察された。
【0080】
リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉは、再発治療手段において、混合物よりも良好な治療効果を示す。治療７日、休薬（再発）７日及び再治療７日の、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ及びリファンピシン＋レボフロキサシンの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ減少は、それぞれ２．４、４．６及び４．６、並びに１．９、３．８及び４．１であったが、リファンピシン＋レボフロキサシンの再治療７日後、全ての生物学的試料は、いずれもリファンピシンに対する薬剤耐性を示した。
【0081】
リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの有効性は、単一又は混合フルオロキノロン薬剤耐性表現型を表現する菌株を使用するマウスバイオフィルム感染モデルで検証された。リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの薬効は、各種の黄色ブドウ球菌株の感染に対するリファンピシン＋レボフロキサシンの有効性よりも優れたか類似した。併用薬剤と比較して、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉの用量はより低くなった。リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉで治療したマウスでは、リファンピシンに対する薬剤耐性が観察されず、リファマイシン－キノリジノン結合分子Ｉ自体に対する薬剤耐性もなかった。
【0082】
以上のことから、本発明にて提供されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩は、メチシリン薬剤耐性、キノロン薬剤耐性、及びメチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌による細菌感染及び疾患の治療又は予防に有効であり、リファマイシンとキノロンの薬剤との組み合わせと比較して、自然発生的薬剤耐性の頻度を低減することができる。
【0083】
（付記）
（付記１）
薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染による疾患の治療又は予防用の薬物の製造のための、Ｉで示されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用。
（付記１）
薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染による疾患の治療又は予防用の薬物の製造のための、Ｉで示されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の適用。
【化3】
【0084】
（付記２）
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌は、メチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌、メチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌、又はキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌を含むことを特徴とする付記１に記載の適用。
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌は、メチシリン及びキノロン多剤耐性黄色ブドウ球菌、メチシリン薬剤耐性黄色ブドウ球菌、又はキノロン薬剤耐性黄色ブドウ球菌を含むことを特徴とする付記１に記載の適用。
【0085】
（付記３）
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染症は、急性細菌感染症及び／又はバイオフィルム細菌感染症を含むことを特徴とする付記１又は２に記載の適用。
前記薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染症は、急性細菌感染症及び／又はバイオフィルム細菌感染症を含むことを特徴とする付記１又は２に記載の適用。
【0086】
（付記４）
前記急性細菌感染症は、皮膚及び皮膚組織感染症、呼吸器感染症、又は菌血症を含むことを特徴とする付記３に記載の適用。
前記急性細菌感染症は、皮膚及び皮膚組織感染症、呼吸器感染症、又は菌血症を含むことを特徴とする付記３に記載の適用。
【0087】
（付記５）
前記バイオフィルム感染症は、心臓弁感染症、人工関節感染症、カテーテル関連血液感染症のうちの１つ又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする付記３に記載の適用。
前記バイオフィルム感染症は、心臓弁感染症、人工関節感染症、カテーテル関連血液感染症のうちの１つ又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする付記３に記載の適用。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【手続補正書】
【提出日】2021-07-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リファンピシンに対して感受性を有するキノリジノン薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染による疾患の治療又は予防用の薬物の製造のための、Ｉで示されるリファマイシン－キノリジノン結合分子及びその薬学的に許容される塩の使用であって、【化1】
【請求項2】
前記急性細菌感染症は、皮膚及び皮膚組織感染症、呼吸器感染症、又は菌血症を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記バイオフィルム感染症は、心臓弁感染症、人工関節感染症、カテーテル関連血液感染症のうちの１つ又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】