特表2022-516025遺伝子的に改変されたＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ細菌の、調製およびその使用。
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-24
(54)【発明の名称】遺伝子的に改変されたＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ細菌の、調製およびその使用。
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220216BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220216BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220216BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20220216BHJP
C12P 7/04 20060101ALN20220216BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20220216BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N1/21
C12N15/09 110
C12N15/63 Z
C12P7/04
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021536334
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(85)【翻訳文提出日】2021-08-12
(86)【国際出願番号】 FR2019053227
(87)【国際公開番号】W WO2020128379
(87)【国際公開日】2020-06-25
(31)【優先権主張番号】1873492
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521268923
【氏名又は名称】イエフペ・エネルジ・ヌーヴェル
【氏名又は名称原語表記】ＩＦＰ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｎｏｕｖｅｌｌｅｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】オック，レミ
(72)【発明者】
【氏名】シャルティエ，グラディス
(72)【発明者】
【氏名】ヴァゼル，フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ロペス フェレイラ，ニコラ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC02
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA23X
4B065AA23Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA05
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、典型的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌であって、特に野生型においてアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する細菌、の遺伝子的な改変に関する。そのため、本発明はかかる遺伝的改変、特に、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列、またはその転写を制御する配列の除去または改変を可能にする方法、ツール、およびキット、得られた遺伝子的に改変された細菌、ならびにその使用、特に溶媒の生産、好ましくは工業的規模においての溶媒の生産に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌のゲノム内で、配列番号１８の配列のｃａｔＢ遺伝子、またはそれと少なくとも７０％同一である配列を認識する核酸。
【請求項2】
該核酸が、発現カセットおよびベクター、好ましくはプラスミドから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
該核酸がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および／または改変テンプレートを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項4】
該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌が野生型でイソプロパノールを生産し得る細菌であることを特徴とする、請求項１－３の何れか１項に記載の核酸。
【請求項5】
該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌が、サブクレードがＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ２７００６、およびＤＳＭ６４２３菌株と少なくとも９５％の同一性を有するサブクレードから選択されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌であることを特徴とする、請求項１－４の何れか１項に記載の核酸。
【請求項6】
配列番号２１の配列のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ、または配列番号３８の配列のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ｇＲＮＡ＿ｃａｔＢであることを特徴とする請求項２－５の何れか１項に記載の核酸。
【請求項7】
野生型でイソプロパノールを生産し得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌を形質転換する、および／また遺伝子的に改変するための、請求項２－６の何れか１項に記載の核酸の使用。
【請求項8】
配列番号１８の配列のｃａｔＢ遺伝子、またはそれと少なくとも７０％同一である配列をＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３のゲノム内で認識する核酸の、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３細菌を形質転換する、および／または遺伝子的に改変するための使用。
【請求項9】
該核酸が、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼによって認識されるモチーフにおいてメチル化を示さない、ＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ２７００６、およびＤＳＭ６４２３菌株と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、の同一性を示すサブクレード、から選択されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉサブクレード、を形質転換するための、請求項１－６の何れか１項に記載の核酸の使用。
【請求項10】
遺伝子改変ツールによってＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および好ましくは遺伝子的に改変するための方法であって、該細菌に請求項１－６の何れか１項に記載の核酸を導入することによって該細菌を形質転換するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項11】
該細菌が、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする、またはその転写を調節する標的配列の少なくとも１本の鎖の切断を担う酵素を用いたＣＲＩＳＰＲツールによって形質転換されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載の方法によって得られた、遺伝子的に改変されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌。
【請求項13】
番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１において寄託された、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌。
【請求項14】
請求項１２に記載の遺伝子的に改変された細菌、または番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１において寄託された、請求項１３に記載のＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌の、溶媒、好ましくはイソプロパノール、または溶媒混合物を生産するための、好ましくは工業的規模において生産するための使用。
【請求項15】
（ｉ）請求項２－６の何れか１項に記載の核酸および（ｉｉ）遺伝子改変ツールのエレメント；ｇＲＮＡである核酸、修復テンプレートである核酸、少なくとも１つのプライマーペア、および該ツールによってコードされるタンパク質の発現を可能にする誘導剤、から選択された少なくとも１つのツール、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、典型的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌、特に野生型ではアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する細菌、の遺伝子的な改変に関する。よってこれはかかる遺伝子的な改変、特に、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列、またはコードする配列の転写を調節する配列の除去もしくは改変、を可能にする方法、ツールおよびキット、得られた遺伝子的に改変された細菌およびその使用、特に溶媒の生産、好ましくは工業的規模においての溶媒の生産に関する。
【背景技術】
【0002】
技術背景
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属には、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属し、グラム陽性であり、厳格に嫌気性である、胞子形成細菌が含まれている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａはいくつかの理由で、科学的なコミュニティにとって重要なグループである。第１に、多くの重篤な疾患（例えば、破傷風、ボツリヌス症）は、このファミリーの病原性細菌の感染が原因である（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。第２に、酸生産菌株または溶媒生産菌株と呼ばれる菌株をバイオテクノロジーに利用できる可能性がある（Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｏｏｄ、１９８６、Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの非病原性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、ＡＢＥとして知られる発酵過程の間に、多種多様な糖を変換し、目的の化学種、特にアセトン、ブタノール、およびエタノールを生産する能力を天然に有する（Ｊｏｈｎ＆Ｗｏｏｄ、１９８６）。これに似た、アセトンを様々な割合でイソプロパノールへと還元するＩＢＥ発酵は、ある特定の種（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６、 Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３）において、これらの菌株のゲノム中に、２級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が存在しているおかげで可能である（ｓ－ＡＤＨ； Ｉｓｍａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、 Ｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属には、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属し、グラム陽性であり、厳格に嫌気性である、胞子形成細菌が含まれている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａはいくつかの理由で、科学的なコミュニティにとって重要なグループである。第１に、多くの重篤な疾患（例えば、破傷風、ボツリヌス症）は、このファミリーの病原性細菌の感染が原因である（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。第２に、酸生産菌株または溶媒生産菌株と呼ばれる菌株をバイオテクノロジーに利用できる可能性がある（Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｏｏｄ、１９８６、Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの非病原性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、ＡＢＥとして知られる発酵過程の間に、多種多様な糖を変換し、目的の化学種、特にアセトン、ブタノール、およびエタノールを生産する能力を天然に有する（Ｊｏｈｎ＆Ｗｏｏｄ、１９８６）。これに似た、アセトンを様々な割合でイソプロパノールへと還元するＩＢＥ発酵は、ある特定の種（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６、 Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３）において、これらの菌株のゲノム中に、２級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が存在しているおかげで可能である（ｓ－ＡＤＨ； Ｉｓｍａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、 Ｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
【0003】
溶媒生産Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種は顕著な表現型の類似性を示し、そのために現代のシーケンシング技術が出てくる以前はそれらの分類が困難であった（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔａｌ．，２００６）。これらの細菌の完全なゲノムのシーケンシングが可能であることから、現在はこの細菌属を、４つのメジャーな種：Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、に分類できる。最近の出版物では３０菌株の完全なゲノムを比較解析し、これらの溶媒生産Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａを４つのメインクレードに分類している（図１）。
【0004】
特に、これらのグループは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ種およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ種から、ＡＢＥ型発酵の研究のためのモデル菌株として、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４（ＤＳＭ７９２またはＬＭＧ５７１０とも呼ばれる）およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ８０５２を分離している。
【0005】
天然にＩＢＥ発酵をなし得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株は少なく、およびその大半はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ種に属している（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１８、表１を参照）。これらの菌株は、典型的にはＣ．ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＬＭＤ ２７．６、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＮＣＩＢ １０６５９、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＬＭＤ ２７．６、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＶＰＩ ２９６８、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＡＴＣＣ ６０１４、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＭｃＣｌｕｎｇ ３０８１、Ｃ．ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｃｕｍ ＩＡＭ １９２３９、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３、Ｃ．ｓｐ．Ａ１４２４、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ｏｐｔｉｎｏｉｉ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＢＧＳ１から選択される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、天然にイソプロパノールを生産し得る、特に天然にＩＢＥ発酵をなし得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌の菌株で、遺伝子的に改変された菌株、特に、クロラムフェニコールまたはチアンフェニコールなどの、アンフェニコールの分類に属する抗生物質に感受性を持つように遺伝子的に改変され、好ましくはイソプロパノールの最適化された生産が可能なように改変された菌株は、現在まで存在しない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、本発明の文脈において、および最初の機会として、遺伝子的に改変されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌について、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、典型的には、天然に（すなわち、野生型において）イソプロパノールを生産できる、特に、天然にＩＢＥ発酵をなし得る、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌であって、細菌に１以上の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えば、クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を野生型において含む特定の細菌、の遺伝子的な改変を可能にするツールについて、記載する。
【0008】
本発明における好ましい遺伝子的に改変された細菌は、１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素を発現しない細菌であって、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを発現しない細菌、例えば、ｃａｔＢ遺伝子を欠損している、または発現できない細菌である。
【0009】
本発明における好ましい遺伝子的に改変された細菌は、２０１８年１２月６日にＢｅｌｇｉａｎ Ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（「ＢＣＣＭ」，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５， Ｂ－９０００Ｇｅｎｔ－Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託番号ＬＭＧＰ－３１１５１で登録されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＦＰ９６２ ｄｅｌｔａ ｃａｔＢとしても識別される）として、本明細書で識別された細菌である。また、本明細書は任意の派生した細菌、クローン、変異株、またはその遺伝子改変バージョンに関する。
【0010】
本発明者らが記載する特定の対象物は、核酸であって、目的の細菌が抗生物質、典型的にはアンフェニコールの分類に属する抗生物質であって、好ましくはクロラムフェニコール、チアンフェニコール、アジダムフェニコール、およびフロルフェニコールから選択された抗生物質、を含む培地中で生育できるようにする酵素、典型的にはクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼなどのアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼである、酵素、をｉ）コードする配列、ｉｉ）コードする配列の転写を調節する配列、またはｉｉｉ）コードする配列に隣接する配列、の少なくとも１つの鎖を目的の細菌のゲノム内において認識する（少なくとも部分的に結合する）および好ましくは標的とする、すなわち、認識するおよび切断を可能にする、核酸である。
【0011】
本発明者らはまた、かかる核酸を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、好ましくは天然にイソプロパノールを生産できるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌、特にＩＢＥ発酵を行うことができるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌の、形質転換および／または遺伝子的な改変に使用することについて記載する。
【0012】
特に、本発明者らは、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３細菌を形質転換および／または遺伝子的に改変するための、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ゲノム中の配列番号１８の配列のｃａｔＢ遺伝子、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性をもつ配列、を認識する核酸の使用を記載する。
【0013】
野生型でイソプロパノールを生産し得る細菌は、例えば、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ細菌、Ｃ．ｄｒａｋｅｉ細菌、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ細菌、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ細菌、およびＣ．ｔｕｎｉｓｉｅｎｓｅ細菌から選ばれた細菌であり得、好ましくはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌、およびＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌から選択された細菌で有り得る。特に好ましい天然にイソプロパノールを生産できる細菌はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌である。
【0014】
特定の態様において、ｉ）アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、をコードする配列、ｉｉ）かかる配列の転写を調節する配列、またはｉｉｉ）かかる配列に隣接する配列、を認識する、好ましくは標的とする核酸は、ＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬＢ－５９３、ＮＣＣＢ２７００６から選択されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのサブクレード、およびＤＳＭ６４２３菌株と少なくとも９７％の同一性を有するサブクレードの形質転換に用いられる。
【0015】
本発明者らはさらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌を形質転換する、および好ましくは遺伝子的に改変するための方法を記載する。この方法は、目的の酵素、好ましくはアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを、ｉ）コードする配列、ｉｉ）コードする配列の転写を調節する配列、またはｉｉｉ）コードする配列に隣接する配列、を認識する、および好ましくは標的とする核酸を、この細菌に導入することによって、上記の細菌を形質転換するステップを含む。この方法は、典型的には、遺伝子改変ツールを用いて、例えば、ＣＲＩＳＰＲツール、グループＩＩイントロンに基づくツールおよびアレル交換ツールから選択された遺伝子改変ツールを用いて、実行される。かかる方法を用いて形質転換されたおよび遺伝子的に改変された細菌、例としてＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌、もまた記載されている。
【0016】
本発明者らが記載する他の態様は、溶媒、好ましくはイソプロパノール、または溶媒の混合物、を生産する、好ましくは工業的規模で生産するように遺伝子的に改変された、本発明における細菌、好ましくは寄託番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１で登録されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌、またはその遺伝子的に改変されたバージョン、の使用に関する。
【0017】
最後に、本明細書はキット、特に本文中に記載の核酸、および遺伝子改変ツール、特にＣＲＩＳＰＲツール、グループＩＩイントロンに基づくツールおよびアレル交換ツールから選択された遺伝子ツールの要素；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である核酸；修復テンプレートである核酸；少なくとも１つのプライマーペア；および上記ツールによってコードされるタンパク質の発現を可能にする誘導剤、から選択された遺伝子改変ツール、を含むキットに関する。
【発明の効果】
【0018】
発明の詳細な記載
１世紀以上にわたって工業的に使用してきたにも関わらず、それらの遺伝子的な改変における困難さから、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌についての知識は限られている。
１世紀以上にわたって工業的に使用してきたにも関わらず、それらの遺伝子的な改変における困難さから、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌についての知識は限られている。
【0019】
この属の菌株を最適化するために、近年、様々な遺伝子ツールが設計されており、最新世代ではＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）技術の使用に基づいている。この方法は、ＲＮＡ分子にガイドされ、ＤＮＡ分子（目的の標的配列）において二本鎖切断を行う、ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ツールの場合においては典型的にはＣａｓ型ヌクレアーゼであって、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）と呼ばれる酵素の使用に基づいている。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列が、ヌクレアーゼによる切断部位を決定し、非常に高い特異性をヌクレアーゼに付与する（図１７）。
【0020】
不可欠なＤＮＡ分子における二本鎖切断は生物にとって致命的であるため、生物の生存は、二本鎖切断の修復能力に依存する（例えば、Ｃｕｉ＆Ｂｉｋａｒｄ、２０１６を参照）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌において、二本鎖切断の修復は、切断された配列の無傷のコピーを必要とする相同組み換えメカニズムに依存している。元の配列を改変する一方で、この修復を可能にするＤＮＡフラグメントを細菌に供することによって、微生物に対し強制的に、そのゲノム中に望みの変更を組み込むことが可能である。実行された改変はもはや、標的配列の改変またはＰＡＭサイトを介したＣａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体によるゲノムＤＮＡの標的化を可能にしないものでなければならない（図１８）。
【0021】
この遺伝子ツールをＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌において機能するようにするための異なるアプローチが記載されてきた。これらの微生物は、それらの形質転換および相同組み換え頻度が低いため、遺伝子的な改変が困難であることが実際に知られている。いくつかのアプローチは、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉにおいて構成的に発現させる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）または、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ａｕｔｈｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおいて誘導性プロモーターの制御下で発現させる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｎａｇａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、Ｃａｓ９の使用に基づく。他の著者は、ゲノム中で２本鎖切断の代わりに１本鎖切断を行う、ヌクレアーゼの改変バージョンであるＣａｓ９ｎの使用について記載している（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この選択は、Ｃａｓ９が、試験した実験条件下でのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌における使用のためには有害すぎる、という観察結果によるものである。上記に記載されたツールのほとんどは、単一のプラスミドの使用に依拠している。最後に、例えばＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（Ｐｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）のように、微生物のゲノム内で内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同定されているならば、内在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することもまた可能である。
【0022】
ＣＲＩＳＰＲ技術を用いたツールは、（前述の最後の場合のように）改変対象となる菌株の内在性メカニズムを使用しない限り、細菌ゲノムに挿入し得る目的の核酸のサイズ（したがって、コーディング配列または遺伝子の数）が大幅に制限されるという大きな欠点がある（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５によると、最高で約１．８ｋｂ）。
【0023】
本発明者らは、この問題を顕著に解決する、２つの異なる核酸、典型的には２つのプラスミドの使用に基づいた、細菌、典型的にはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する細菌、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌に適した、細菌を改変するためのより強力な遺伝子ツールを発展させ、記載した（ＷＯ２０１７０６４４３９、Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７および図３を参照）。特定の実施形態において、このツールの第１の核酸は、Ｃａｓ９の発現を可能にし、および、実行する改変に特異的な、第２の核酸は、１以上のｇＲＮＡ発現カセットおよび、目的の配列により、Ｃａｓ９によって標的とされる、細菌ＤＮＡの部分の置き換えを可能にする修復テンプレートを含む。このシステムの毒性はｃａｓ９および／またはｇＲＮＡ発現カセットが誘導性プロモーターの制御下に置かれていることで制限されている。本発明者らは近年、このツールを改良し、非常に顕著に形質転換効率を増加させ、およびそのため、有用な数および量での（特に工業的規模の生産のための耐性菌株の選択という文脈において）遺伝子的に改変された目的の細菌の獲得量を増加させることを可能にした（ＦＲ１８／５４８３５を参照）。この改良されたツールにおいて、少なくとも１つの核酸は誘導性プロモーターの制御下におかれた抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質（「ａｃｒ」）をコードする配列を含む。この抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体の活性を抑制する。このタンパク質の発現は細菌の形質転換段階の間のみ自身が発現するように制御されている。
【0024】
本明細書の文脈において、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、ＢａｃｉｌｌｉまたはＴｏｇｏｂａｃｔｅｒｉａ、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａまたはＢａｃｉｌｌｉの分類に属する細菌を意味すると理解される。
【0025】
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する特定の細菌は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌を含む。
【0026】
「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌」とは特にＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを意味する。
【0027】
「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌」とは、工業的な目的の特定のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、典型的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産または酸生産細菌を意味する。「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌」という表現は、野生型の細菌に加えて、ＣＲＩＳＰＲシステムにさらされることなくその性能を向上させる目的で遺伝子的に改変された（例えば、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ，およびａｄｃ遺伝子の過剰発現）それに由来する菌株も包含する。
【0028】
「工業的な目的のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種」とは、発酵により、溶媒および酸、たとえば、酪酸または酢酸を、糖類または単糖から、典型的には、キシロース、アラビノース、フルクトースなどの５つの炭素原子を含む糖類、グルコースまたはマンノースなどの６つの炭素原子を含む糖類、セルロース、またはヘミセルロースといった多糖類、および／または、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌に消化および使用され得る例えば他の任意の炭素源（例えば、ＣＯ、ＣＯ２、およびメタノール）から生産し得る種を意味する。目的の溶媒生産細菌の例としては、アセトン、ブタノール、エタノールおよび／またはイソプロパノールを生産するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌であり、文献中では「ＡＢＥ菌株」（アセトン、ブタノール、エタノールの生産を可能にする発酵を行う菌株）および「ＩＢＥ菌株」（イソプロパノール（アセトンの還元による）、ブタノール、エタノールの生産を可能にする発酵を行う菌株）として同定されているような菌株である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌は、例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍから選択され得、最も好ましくはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、およびさらに好ましくはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉから選択され得る。
【0029】
イソプロパノールを天然に生産するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌は、典型的にはアセトンをイソプロパノールに還元する１次／２次アルコール脱水素酵素をコードするａｄｈ遺伝子をそのゲノム上に持っており、自然状態でＡＢＥ発酵をなし得る細菌とは遺伝子的にも機能的にも区別される。有利には、本発明の文脈において、本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の天然のイソプロパノール生産菌であるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３株を、参照株であるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２株と同様に遺伝子的に改変することに成功した。
【0030】
よって本発明者らは、天然に（すねわち、野生型において）イソプロパノールを生産し得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌、特に天然にＩＢＥ発酵をなし得る細菌であって、遺伝子的に改変した細菌、およびツール、特に遺伝子ツールであってその細菌の取得を可能にしたツール、について初めて記載する。これらのツールは、野生型において、イソプロパノールを生産し得る、特にＩＢＥ発酵をなし得る細菌であって、特に抗生物質への耐性を担う酵素をコードする遺伝子を有する細菌の、形質転換および遺伝子的な改変を顕著に促進するという利点を有する。
【0031】
実験部分に記載された作業の一部として、ＩＢＥ発酵が可能な菌株、すなわち、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉＤＳＭ６４２３菌株において、発明者らによって近年記載されたゲノムおよびトランスクリプトーム解析を行った。（Ｍａｔｅ ｄｅ Ｇｅｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0032】
特に、本発明者らは、この菌株のゲノムアセンブリの間に、染色体に加えて、２つの天然プラスミド（ｐＮＦ１およびｐＮＦ２）と線状バクテリオファージ（Φ６４２３）という移動性遺伝要素の存在を見出した（アクセッション番号ＰＲＪＥＢ１１６２６－ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＰＲＪＥＢ１１６２６）。
【0033】
本発明の特定の実施形態では、本発明者らはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株から天然のプラスミドｐＮＦ２を欠失させることに成功した。
【0034】
他の特定の実施形態では、本発明者らはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株の染色体にもともと存在するｕｐｐ遺伝子を欠失させることに成功した。よってこれらの実験は、本発明者らによって本文中に記載されるツール、より一般的にはその技術を用いて、野生型において、イソプロパノールを生産し得る、特に、ＩＢＥ発酵をなし得る細菌を、遺伝子的に改変し得ることを実証した。
【0035】
特に有利な実施形態では、本発明者らは特に、アンフェニコール類の抗生物質へ耐性を担う酵素をコードする遺伝子を天然に保有する（野生型で保有する）細菌を、アンフェニコール感受性にすることに成功した。
【0036】
本発明の文脈において、目的のアンフェニコールの例は、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、アジダムフェニコールおよびフロルフェニコール（Ｓｃｈｗａｒｚ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２００４）、特にクロラムフェニコールおよびチアンフェニコールである。
【0037】
よって、本発明の第１の態様は、目的の細菌、典型的には本文中に記載する、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する細菌、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、好ましくは天然に（すなわち、野生型において）イソプロパノールを生産し得る、特に天然にＩＢＥ発酵をなし得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌、好ましくは天然に１以上の抗生物質に耐性をもつ細菌、例えばＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、を遺伝子的に形質転換するおよび／または改変するために使用し得る遺伝子ツールに関する。好ましい細菌は、野生型において、細菌の染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子の両者を有する。
【0038】
特定の態様においては、この遺伝子ツールは、目的の細菌ゲノムにおいて、ｉ）目的の細菌が抗生物質を含んだ培地中で生育できるようにする、抗生物質への耐性を付与する酵素をコードする配列、ｉｉ）目的の細菌が抗生物質を含んだ培地中で生育できるようにする、抗生物質への耐性を付与する酵素をコードする配列の転写を調節する配列、またはｉｉｉ）目的の細菌が抗生物質を含んだ培地中で生育できるようにする、抗生物質への耐性を付与する酵素をコードする配列に隣接する配列、のうちの少なくとも１つの鎖を認識する（少なくとも部分的には結合する）、および好ましくは標的とする、すなわち認識するおよび切断を可能にする核酸（本文中では「目的の核酸」としても識別される）からなる。この目的の核酸は、典型的には、本発明の文脈において、認識された配列を細菌のゲノムから欠失させる、またはその発現を改変する、例えば、その発現を調節／制御する、特にその発現を阻害する、好ましくは上記の細菌が上記配列由来のタンパク質、特に機能性タンパク質を発現できないようにするためにその発現を改変するために使用される。この認識された配列はまた、本文中において「標的配列」または「標的にされた配列」として識別される。
【0039】
特定の実施形態では、この目的の核酸には、細菌ゲノム内のＤＮＡの標的とされた領域／部分／配列に対して、１００％同一、または少なくとも８０％同一、好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一な標的配列に相補的な、少なくとも一つの領域であって、および上記の領域／部分／配列に相補的な配列の全体または一部、典型的には少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１４、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド、典型的には１、１０、もしくは２０から１０００ヌクレオチドの間、例えば１、１０もしくは２０から９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００もしくは２００ヌクレオチドの間、１、１０もしくは２０から１００ヌクレオチドの間、１、１０もしくは２０から５０ヌクレオチドの間、または、１、１０もしくは２０から４０ヌクレオチドの間、例えば、１０から４０ヌクレオチドの間、１０から３０ヌクレオチドの間、１０から２０ヌクレオチドの間、２０から３０ヌクレオチドの間、１５から４０ヌクレオチドの間、１５から３０ヌクレオチドの間または１５から２０ヌクレオチドの間、好ましくは１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０ヌクレオチドを含む、配列にハイブリダイズし得る標的配列に相補的な少なくとも一つの領域を含む。目的の核酸内に存在する、標的配列に相補的な領域は、ＣＲＩＳＰＲツール内で、本文中に記載されるように用いられるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の「ＳＤＳ」領域に対応していてよい。
【0040】
他の特定の実施形態では、目的の核酸は、それぞれが標的配列と相補的な少なくとも2つの領域であって、細菌ゲノム内の上記の標的とされた領域／部分／配列と１００％同一または少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、少なくとも２つの領域を含む。これらの領域は、上記の領域／部分／配列に相補的な配列の全体または一部、典型的には上記のように、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド、典型的には１００から１０００ヌクレオチドの間を含む配列に、ハイブリダイズし得る。目的の核酸内に存在する、標的配列に相補的な領域は、例えば、ＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子ツール、ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子ツール、またはＡＣＥ（登録商標）型アレル交換ツールなどの本文中に記載の遺伝子改変ツールにおいて、標的とされた配列の５’および３’隣接領域を認識する、好ましくは標的とし得る。
【0041】
典型的には、標的配列は、アンフェニコール類に属する１以上の抗生物質、例えば、クロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコールを含む培地中で生育し得る、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の目的の細菌のゲノム内で、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えば、クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列であり、かかる配列の転写を調節する配列であり、またはかかる配列に隣接する配列である。
【0042】
特定の実施形態では、認識された配列はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３由来のクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔＢ遺伝子（ＣＩＢＥ＿３８５９）に対応する配列番号１８の配列、または上記のクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一なアミノ酸配列、または配列番号１８の配列の全体または少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を含む配列である。換言すると、認識された配列は、少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド、典型的には１から４０ヌクレオチドの間を含む配列、好ましくは配列番号１８の配列の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列であってよい。
【0043】
配列番号１８の配列によってコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩデータベースにおいて以下のエントリで識別された配列に対応する：ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、配列番号４４（ＷＰ＿０６３８４３２１９．１）、配列番号４５（ＷＰ＿０７８１１６０９２．１）、配列番号４６（ＷＰ＿０７７８４０３８３．１）、配列番号４７（ＷＰ＿０７７３０７７７０．１）、配列番号４８（ＷＰ＿１０３６９９３６８．１）、配列番号４９（ＷＰ＿０８７７０１８１２．１）、配列番号５０（ＷＰ＿０１７２１０１１２．１）、配列番号５１（ＷＰ＿０７７８３１８１８．１）、配列番号５２（ＷＰ＿０１２０５９３９８．１）、配列番号５３（ＷＰ＿０７７３６３８９３．１）、配列番号５４（ＷＰ＿０１５３９３５５３．１）、配列番号５５（ＷＰ＿０２３９７３８１４．１）、配列番号５６（ＷＰ＿０２６８８７８９５．１）、配列番号５７（ＡＷＫ５１５６８．１）、配列番号５８（ＷＰ＿００３３５９８８２．１）、配列番号５９（ＷＰ＿０９１６８７９１８．１）、配列番号６０（ＷＰ＿０５５６６８５４４．１）、配列番号６１（ＫＧＫ９０１５９．１）、配列番号６２（ＷＰ＿０３２０７９０３３．１）、配列番号６３（ＷＰ＿０２９１６３１６７．１）、配列番号６４（ＷＰ＿０１７４１４３５６．１）、配列番号６５（ＷＰ＿０７３２８５２０２．１）、配列番号６６（ＷＰ＿０６３８４３２２０．１）、および配列番号６７（ＷＰ＿０２１２８１９９５．１）。
【0044】
配列番号１８の配列によってコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７５％同一のアミノ酸配列の例は、以下の配列に対応する：ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１、ＷＰ＿０２６８８７８９５．１ ＡＷＫ５１５６８．１、ＷＰ＿００３３５９８８２．１、ＷＰ＿０９１６８７９１８．１、ＷＰ＿０５５６６８５４４．１およびＫＧＫ９０１５９．１。
【0045】
配列番号１８の配列によってコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列の例は、以下の配列に対応する：ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１、ＷＰ＿０２６８８７８９５．１およびＡＷＫ５１５６８．１。
【0046】
配列番号１８の配列によってコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列の例は、以下の配列に対応する：ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１、およびＷＰ＿０２６８８７８９５．１。
【0047】
配列番号１８の配列によってコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９９％同一である好ましいアミノ酸配列はＷＰ＿０７７８４３９３７．１、配列番号４４（ＷＰ＿０６３８４３２１９．１）および配列番号４５（ＷＰ＿０７８１１６０９２．１）の配列である。
【0048】
配列番号１８と同一である特定の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてＷＰ＿０７７８４３９３７．１のエントリで識別される配列である。
【0049】
特定の実施形態において、標的配列は、そのアミノ酸配列が配列番号６６に対応する（ＷＰ＿０６３８４３２２０．１）、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔＱ遺伝子に対応する配列番号６８の配列であり、または上記クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の配列であり、または配列番号６８の配列の全てまたは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む配列である。
【0050】
換言すると、認識される配列は、少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド、典型的には１から４０ヌクレオチドの間を含む配列、好ましくは配列番号６８の配列の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列で有り得る。
【0051】
さらに他の特定の実施形態では、認識される配列は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌中に天然に存在し、またはかかる細菌に人工的に導入される、当業者に知られたｃａｔＢ（配列番号１８）、ｃａｔＱ（配列番号６８）、ｃａｔＤ（配列番号６９、Ｓｃｈｗａｒｚ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２００４）またはｃａｔＰ（配列番号７０、Ｓｃｈｗａｒｚ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２００４）の核酸配列から選択される。
【0052】
上記に示すように、他の実施形態では、標的配列はまた、上記に示すようなコード配列（目的の細菌が抗生物質を含む培地中で生育できるようにする、抗生物質への耐性を付与する酵素をコードする）の転写を調節する配列、典型的にはプロモーター配列、例えばｃａｔＢ遺伝子のプロモーター配列（配列番号７３）またはｃａｔＱ遺伝子のプロモーター配列（配列番号７４）で有り得る。
【0053】
遺伝子ツールとして用いられる目的の核酸は、上記のコード配列の転写を制御する配列をその際認識する、つまり典型的には結合し得る。
【0054】
他の実施形態では、標的配列は上記のようなコード配列（目的の細菌が抗生物質を含む培地中で生育できるようにする、抗生物質への耐性を付与する酵素をコードする）に隣接する配列、例えば、配列番号１８の配列のｃａｔＢ遺伝子に隣接する配列、またはそれ少なくとも７０％と同一な配列であり得る。かかる隣接する配列は、典型的には１、１０または２０および１０００ヌクレオチドを、例えば、１、１０もしくは２０から９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００もしくは２００ヌクレオチドの間、１、１０もしくは２０から１００ヌクレオチドの間、１、１０もしくは２０から５０ヌクレオチドの間、または１、１０もしくは２０から４０ヌクレオチドの間、例えば、１０から４０ヌクレオチドの間、１０から３０ヌクレオチドの間、１０から２０ヌクレオチドの間、２０から３０ヌクレオチドの間、１５から４０ヌクレオチドの間、１５から３０ヌクレオチドの間もしくは１５から２０ヌクレオチドの間を含む
【0055】
特定の態様では、標的配列はかかるコード配列に隣接する配列のペアに対応し、それぞれの隣接する配列は、典型的には少なくとも２０ヌクレオチドを、典型的には１００から１０００ヌクレオチドの間、好ましくは２００から８００ヌクレオチドの間を含む。
【0056】
本発明で意味するところでは、「核酸」とは、任意の天然、合成、半合成、または組換えのＤＮＡまたはＲＮＡ分子であって、任意には化学的に修飾され（すなわち、非天然の塩基、修飾ヌクレオチドであって、例えば修飾された結合、修飾された塩基、および／または修飾された糖を含む修飾ヌクレオチドを含む）、またはコード配列から合成される転写産物のコドンが、そこでの使用を考慮して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌中で最も頻繁にみられるコドンであるように最適化されている、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の場合、最適化されたコドンは、典型的にはアデニン（「Ａ」）およびチミン（「Ｔ」）塩基に富んだコドンである。
【0057】
本明細書中で記載されるペプチド配列では、アミノ酸は以下の命名に従ってその１文字表記で示す：Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファンおよびＹ：チロシン。
【0058】
本発明の文脈において、目的の細菌を形質転換する、および／または遺伝子的に改変するための遺伝子ツールとして用いられる目的の核酸は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌であって天然にイソプロパノールを生産し得る、特に天然にＩＢＥ発酵をなし得る細菌のゲノム内において、目的の酵素、好ましくはアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えば、クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをｉ）コードする配列を認識する、ｉｉ）コードする配列の転写を調節する、またはｉｉｉ）コードする配列に隣接するＤＮＡフラグメントである。
【0059】
天然にイソプロパノールを生産し得る細菌は、例えばＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ細菌、Ｃ．ｄｒａｋｅｉ細菌、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ細菌、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ細菌、およびＣ．ｔｕｎｉｓｉｅｎｓｅ細菌から選択される細菌であってよく、好ましくはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌およびＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌から選択される細菌であってよい。特に好ましい、野生型でイソプロパノールを生産し得る細菌はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌である。
【0060】
特定の態様では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌は、そのサブクレードがＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＣＣＢ２７００６、およびＤＳＭ６４２３菌株と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するサブクレード、から選択されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌である。
【0061】
上記に示すように、本発明における目的の核酸は、細菌ゲノム内で認識される配列（「標的配列」）を欠失させ得る、またはその発現を改変し得る、例えば、その発現を調節、特に阻害し得る、好ましくは上記の細菌が上記配列由来のタンパク質、特に機能性タンパク質、好ましくはアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、を発現できないようにするためにその発現を改変し得る。
【0062】
この目的の核酸は、例えば、１以上の目的の（コード）配列、例えばその発現産物が細菌において目的の機能の実現に貢献するいくつかの目的のコード配列を含むオペロン、と（当業者が理解する意味で）作動可能に連結した転写プロモーターを含む核酸、または、加えて活性化配列および／または転写ターミネーターを含む核酸、など、典型的には、発現カセット（または「コンストラクト」）の形態である；または円状もしくは直線状、一本鎖もしくは二本鎖ベクター、例えば上記に定義する１以上の発現カセットを含む、プラスミド、ファージ、コスミド、人工もしくは合成染色体、の形態である。好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【0063】
目的の核酸、典型的にはカセットまたはベクターは、当業者によく知られた従来技術を用いてコンストラクトされ得る、および１以上のプロモーター、細菌性複製起点（ＯＲＩ配列）ターミネーター配列、選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、およびカセットまたはベクターの標的とする挿入を可能にする配列（例えば「隣接領域」）を含み得る。さらに、これらの発現カセットおよびベクターは当業者によく知られた技術によってゲノム内に組み込まれ得る。
【0064】
目的のＯＲＩ配列は、ｐＩＰ４０４、ｐＡＭβ１、ｐＣＢ１０２、ｒｅｐＨ（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの複製起点）、ＣｏｌＥ１またはｒｅｐ（Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞内でベクター、典型的にはプラスミドの維持を可能にする、任意の他の複製起点、から選択されてよい
【0065】
目的のターミネーター配列はａｄｃ、ｔｈｌ、ｂｃｓオペロンのターミネーター、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍにおいて転写終結を可能にする、当業者に知られた任意の他のターミネーターから選択されてよい
【0066】
目的の選択遺伝子（耐性遺伝子）は、ｅｒｍＢ、ｃａｔＰ、ｂｌａ、ｔｅｔＡ、ｔｅｔＭ、および／またはアンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、テトラサイクリン、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の選択に使われ得る、当業者によく知られた任意の他の抗生物質への耐性を与える、任意の他の遺伝子から選択されてよい。
【0067】
認識された、酵素をコードする配列が、細菌にクロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコール耐性を付与するような配列である、特定の実施形態では、使用される選択遺伝子はクロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコール耐性遺伝子ではなく、および好ましくはｃａｔＢ、ｃａｔＱ、ｃａｔＤまたはｃａｔＰ遺伝子の何れかでもない。
【0068】
特定の実施形態では、目的の核酸は、目的の酵素、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、をコードする、その転写を調節する、またはコードする配列に隣接する配列（「標的配列」、「標的とされる配列」または「認識される配列」）を標的とする１以上のガイドＲＮＡｓ（ｇＲＮＡｓ）、および／または、改変テンプレート（本文中で「編集テンプレート」としても識別される）、例えば、好ましくは標的配列の発現を阻害または抑制するための、標的配列の全体、または一部を排除もしくは改変する事を可能にするテンプレート、典型的には、上述の標的配列の上流および下流に位置する配列に相同な（対応する）配列を含むマトリックス、典型的にはそれぞれが１０もしくは２０塩基対から１０００、１５００もしくは２０００塩基対の間であり、例えば、１００、２００、３００、４００もしくは５００塩基対から１０００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００塩基対の間、好ましくは１００から１５００または１００から１０００塩基対の間、およびさらに好ましくは５００から１０００塩基対の間、または２００から８００塩基対の間を含む配列（標的配列の上流および下流に位置する上記配列に相同な配列）を含むマトリックスを含む
【0069】
特定の目的の核酸は、それぞれのカセットが少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする、１以上の発現カセットを含むベクターの形態である。
【0070】
本発明における特定の遺伝子ツールは、いくつかの（少なくとも２つ）の上記の目的の核酸を含み、上記の目的の核酸は互いに異なる。
【0071】
特定の実施形態では、目的の細菌、典型的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換するおよび／または遺伝子的に改変するための遺伝子ツールとして用いられる、目的の核酸は、細菌に１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードする配列、転写を調節する配列、またはコードする配列に隣接する配列、を認識する、およびこの細菌ゲノム内の上記配列を欠失させ得る、または非機能的にし得る核酸であって、特に、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼ（ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプを示すＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製）に認識されるモチーフとなるレベルでのメチル化を示さない核酸である。
【0072】
形質転換、および／または遺伝子的に改変された目的の細菌がＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、特にＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３およびＮＣＣＢ２７００６の内の１つのサブクレードに属している場合、遺伝子ツールとして用いられる目的の核酸、例えばプラスミド、はＤａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼに認識されるモチーフとなるレベルでのメチル化を示さない核酸であり、典型的には、ＧＡＴＣモチーフのアデノシン（「Ａ」）、および／またはＣＣＷＧＧモチーフ（Ｗはアデノシン（「Ａ」）またはチミン（「Ｔ」）に対応していてよい）の第２シトシン「Ｃ」は脱メチル化されている核酸である。
【0073】
Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼに認識されるモチーフのメチル化を示さない核酸は、典型的にはｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプを持つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＮＶ１１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から調製され得る。これと同じ核酸は、例えば、ＥｃｏＫＩ型メチルトランスフェラーゼによって行われた他のメチル化を含み得る、後者はＡＡＣ（Ｎ６）ＧＴＧＣおよびＧＣＡＣ（Ｎ６）ＧＴＴモチーフのアデニン（「Ａ」）を標的とする（Ｎは任意の塩基に対応し得る）。
【0074】
好ましい実施形態では、標的とされた配列は、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼにおけるｃａｔＢ遺伝子に、この遺伝子の転写を調節する配列に、またはこの遺伝子に隣接する配列に、対応する。
【0075】
本発明の文脈において遺伝子ツールとして用いられる特定の目的の核酸は、例えば、ベクター、好ましくはプラスミド、例えば、本明細書の実験部分に記載された、配列番号２１の配列のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ、または、配列番号３８の配列のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ｇＲＮＡ＿ｃａｔＢ、特に、上記配列の、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼに認識されるモチーフにおけるメチル化を示さないバージョンである。
【0076】
本明細書はまた、本文中に記載するように、目的の細菌、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の溶媒生産細菌であって野生型においてイソプロパノールを生産し得る、特に野生型においてＩＢＥ発酵をなし得る細菌を、形質転換するおよび／または遺伝子的に改変するための、目的の核酸の使用に関する。
【0077】
野生型でイソプロパノールを生産し得る、特に野生型でＩＢＥ発酵をなし得る細菌は、例えば、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ細菌、Ｃ．ｄｒａｋｅｉ細菌、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ細菌、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ細菌、およびＣ．ｔｕｎｉｓｉｅｎｓｅ細菌、から選択された細菌で有り得る、好ましくは細菌Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ細菌、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ細菌およびＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ細菌から選択された細菌で有り得る。
【0078】
（天然に）野生型においてイソプロパノールを生産し得る、特に野生型においてＩＢＥ発酵をなし得る、特に好ましい細菌はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌である。
【0079】
目的の酸生産細菌は、ＣＯ２およびＨ２から酸および／または溶媒を生産する細菌である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の酸生産細菌は、例えば、Ｃ．ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓから選択され得る。
【0080】
特定の実施形態では、当該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌は「ＡＢＥ菌株」であり、好ましくはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２菌株（ＡＴＣＣ８２４菌株またはＬＭＧ５７１０とも呼ばれる）、またはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２菌株である。
【0081】
他の特定の実施形態では、当該Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌は「ＩＢＥ菌株」であり、典型的には本明細書で識別されるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌の内の１つであり、例えば、そのサブクレードが、ＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ２７００６、またはＣ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＤＳＺＭ７９３細菌（Ｇｅｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ． １９８３）、および、かかるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉまたはＣ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌のサブクレードであってＤＳＭ６４２３菌株と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すサブクレード、から選択されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉである。特定の好ましいＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌、またはＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌のサブクレードは、ｐＮＦ２プラスミドを欠失している。
【0082】
一方ではＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ２７００６サブクレード、他方ではＤＳＺＭ７９３のそれぞれのゲノムは、ＤＳＭ６４２３サブクレードのゲノムと少なくとも９７％の配列同一性の割合を示す。
【0083】
本発明者らは発酵試験を行い、サブクレードがＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１５およびＮＣＣＢ２７００６であるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌が野生型においてイソプロパノールを生産し得ることを確かめた。（表１を参照）。
【0084】
【表1】
天然イソプロパノール生産菌株Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１５およびＮＣＣＢ２７００６を用いたグルコース発酵試験のまとめ。
【0085】
本発明の特に好ましい実施形態では、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌はＤＳＭ６４２３サブクレード細菌である。
【0086】
本発明のさらにその他の好ましい実施形態では、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ細菌はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＦＰ９６３ΔｃａｔＢΔｐＮＦ２菌株（２０１９年２月２０日にＢＣＣＭ－ＬＭＧ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７で登録され、および本文中ではＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢΔｐＮＦ２としても識別される）である。
【0087】
特定の実施形態では、形質転換される、および好ましくは遺伝子的に改変される細菌は、野生型において上記細菌内に天然に存在する、少なくとも一つの染色体外のＤＮＡ分子（典型的には少なくとも１つのプラスミド）を欠失させることを可能にする、本発明における核酸または遺伝子ツールを用いた第１の形質転換ステップおよび第１の遺伝子的な改変ステップに暴露された細菌である
【0088】
本発明者らによって記載された他の態様は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を、本発明の遺伝子ツール、典型的には上記の本発明の目的の核酸を用いて、形質転換する、および、好ましくはそれをさらに遺伝子的に改変するための方法に関する。該方法には、上記細菌に本文に記載の目的の核酸を導入することで該細菌を形質転換するステップを含む。該方法には、形質転換された細菌、すなわち、所望の組換え／改変／最適化を有する細菌を得る、回収する、選択する、または単離するステップをさらに含んでもよい。
【0089】
特定の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および好ましくは遺伝子的に改変するための方法は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、グループＩＩイントロン（例えば、ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（登録商標）ツールまたはＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）ツール）の使用に基づくツール、およびアレル交換ツール（例えば、ＡＣＥ（登録商標）ツール）から選択された遺伝子改変ツールに関連し、および上記のように本発明における目的の核酸を上記細菌に導入する事で該細菌を形質転換するステップを含む。
【0090】
本発明は、典型的には、有利には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および好ましくは遺伝子的に改変するために選択された遺伝子改変ツールが、野生型において１以上の抗生物質に対する耐性を担う酵素をコードする遺伝子を有する、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉなどの細菌において使用されることが意図されている場合に実装され、およびそのような上記遺伝子ツールの実装には、この細菌が野生型では耐性を持つ抗生物質に対する耐性マーカーの発現を可能にする核酸を用いて上記細菌を形質転換するステップ、および／または上記抗生物質（この細菌が野生型で耐性を持つ）を用いて形質転換された細菌および／または遺伝子改変された細菌を選択するステップを含む。
【0091】
本発明、例えば、ＣＲＩＳＰＲツール、グループＩＩイントロンの使用に基づくツール、およびアレル交換ツールから選択された遺伝子改変ツールの使用、によって有利に得られる改変は、細菌に１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を欠失させること、またはこの配列を非機能的にすることからなる。本発明を通して有利に得られる他の改変は、細菌の性能、例えば、目的の溶媒または溶媒の混合物の生産性能を向上させるために細菌を遺伝子的に改変する事からなり、上記細菌は、事前に、本発明により、野生型では耐性のある抗生物質に対して感受性を持つように改変されている。
【0092】
好ましい実施形態では、本発明にかかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）技術／遺伝子ツール、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ツール（ＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質）の使用（実装）に基づいている。
【0093】
この方法は、ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ツールの場合、典型的にはＣａｓ－型ヌクレアーゼであって、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質９（Ｃａｓ９タンパク質））と呼ばれる酵素の使用に基づき、これは、ＲＮＡ分子によってガイドされ、ＤＮＡ分子（目的の標的配列）の二本鎖切断をひき起こす。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列はヌクレアーゼの切断部位を決定し、ヌクレアーゼに非常に高い特異性を与える。微生物の生存に不可欠なＤＮＡ分子内の二本鎖切断は、実際に生物にとって致命的であるため、生物の生存はそれを修復する能力に依存することになる（例えばＣｕｉ ＆ Ｂｉｋａｒｄ， ２０１６を参照）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌では、二本鎖切断の修復は、切断された配列の無傷のコピーを必要とする相同組換えメカニズムに依存している。元の配列を変更する一方で、この修復の発動を可能にするＤＮＡフラグメントを細菌に提供することで、所望の変更をそのゲノムに組み込ませることを微生物に強いることができる。
【0094】
本発明は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に記載の、ヌクレアーゼを含む単一プラスミド、ｇＲＮＡおよび修復テンプレートを用いた従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ツールを用いて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌において実装され得る。該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは２つの異なる不可欠の要素を含んでおり、それはすなわち、ｉ）エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－関連のヌクレアーゼの場合、Ｃａｓ、およびｉｉ）ガイドＲＮＡ。該ガイドＲＮＡは細菌のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）の組み合わせからなるキメラＲＮＡの形態である。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質のガイドとして働く、「スペーサー配列」に対応するｃｒＲＮＡの標的特異性、およびｃｒＲＮＡのコンフォメーション特性を合わせた一本鎖転写産物である。ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質が細胞内で同時に発現すると、供された修復テンプレートのおかげで、標的ゲノム配列は、永続的に改変される。当業者であれば、周知の技術を用いて、標的とする染色体領域または移動性遺伝子要素に応じて、ｇＲＮＡの配列や構造を容易に定義できる（例えば、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３の論文を参照）。
【0095】
遺伝子ツールの要素（核酸またはｇＲＮＡ）の細菌への導入は、直接的または間接的な、当業者に知られた任意の方法、例えば、形質転換、コンジュゲーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、その他方法で実行され、好ましくは、エレクトロポレーション法である（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【0096】
本発明者らは近年、細菌を改変するための、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を改変するのに適した、および本発明の文脈において使用できる、２つのプラスミドの使用に基づいた遺伝子ツールを発展および記載してきた、（ＷＯ２０１７／０６４４３９、Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７、および本明細書に添付する図１５を参照）。
【0097】
特定の実施形態では、このツールの「第１」プラスミドはＣａｓヌクレアーゼの発現を可能にし、および実行される改変に特異的な「第２」プラスミドは、１以上のｇＲＮＡ発現カセット（典型的には細菌のＤＮＡの異なる領域を標的とする）および、相同組み換えメカニズムによって、目的の配列によってＣａｓが標的とする細菌ＤＮＡの一部の置き換えを可能にする、修復テンプレートを含む。Ｃａｓ遺伝子および／またはｇＲＮＡ発現カセットは、構成的、または誘導性の、好ましくは誘導性の、当業者に知られた発現プロモーター（例えば、出願番号ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載され、および参照により本明細書中に組み込まれている。）、および好ましくは異なっているが、同一の誘導剤で誘導可能な発現プロモーター、の制御下に置かれている。
【0098】
ｇＲＮＡは天然のＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組み換え技術によって生産されたＲＮＡで有り得る。これらのｇＲＮＡは当業者に知られた任意の方法、例えば、化学合成、ｉｎ ｖｉｖｏ転写または増幅技術など、によって調製され得る。複数のｇＲＮＡを用いる場合は、各ｇＲＮＡの発現を、異なるプロモーターによって制御し得る。好ましくは、用いられるプロモーターは全てのｇＲＮＡにおいて同一である。特定の実施形態では、同一のプロモーターは、発現させようとするいくつかの、たとえばいくつかのみ、または換言すると全部またはいくつかのｇＲＮＡの発現を可能にするために用いられ得る。
【0099】
他の特定の実施形態では、本発明の文脈における使用に適した、ｉｉ）上記の「第１」および「第２」核酸の少なくとも１つは、さらに、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡｓ）をコードし、または該遺伝子ツールは、各ガイドＲＮＡが、細菌のＤＮＡの標的とされた部分に相補的な、Ｃａｓ酵素に結合するＲＮＡ構造および配列を含む、１以上のガイドＲＮＡをさらに含む、およびｉｉｉ）上記の「第１」および「第２」核酸の少なくとも１つは、誘導性プロモーターの制御下に置かれた抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含み、または、該遺伝子ツールが、好ましくはＣａｓおよび／または該ＲＮＡの発現を制御しているプロモーターとは異なっており、他の誘導剤で誘導可能な誘導性プロモーターの制御下に置かれている抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする「第３」核酸をさらに含む。
【0100】
好ましい実施形態では、抗－ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、好ましくは遺伝子ツールの核酸配列の、目的の菌種への導入段階の間に、ヌクレアーゼの作用を阻害し得る、好ましくは中和し得る。
【0101】
本発明の文脈において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および典型的には、相同組み換えを用いて遺伝子的に改変するために実装され得るＣＲＩＳＰＲ技術に関する特定の方法は以下のステップを含む：
ａ）本発明者らが記載するＣＲＩＳＰＲ遺伝子ツールを、抗－ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための誘導剤の存在下で、細菌に導入すること、および
ｂ）ステップａ）の終了後に得られた形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する、典型的にはＣａｓ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にする誘導剤を含まない培地中で（または関連しない条件下で）培養すること。
ａ）本発明者らが記載するＣＲＩＳＰＲ遺伝子ツールを、抗－ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための誘導剤の存在下で、細菌に導入すること、および
ｂ）ステップａ）の終了後に得られた形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する、典型的にはＣａｓ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にする誘導剤を含まない培地中で（または関連しない条件下で）培養すること。
【0102】
特定の実施形態では、該方法は、上記の遺伝子ツールが上記細菌に導入されると、細菌の目的の遺伝子的な改変を可能にするために、かかるプロモーターが遺伝子ツール内に存在している場合には、ステップｂ）の最中、またはその後に、Ｃａｓおよび／またはｇＲＮＡの発現を制御している誘導性プロモーターの発現を、誘導するステップをさらに含む。該誘導は、選択した誘導性プロモーターに関連した発現阻害を解除できる物質を用いて実行される
【0103】
他の特定の実施形態では、該方法は、修復マトリックスを含む核酸を除去する（細菌細胞が上記核酸について、「なくなった」と考える）、および／または、ｇＲＮＡもしくはステップａ）において遺伝子ツールと共に導入されたｇＲＮＡをコードする配列、を除去する、追加ステップｃ）を含む。
【0104】
さらに他の特定の実施形態では、該方法は、ステップｂ）またはステップｃ）に続いて、既に導入されたそれ（それら）とは異なる修復マトリックス、および、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する誘導剤の存在下で、細菌ゲノムの標的とされたゾーンに対して、上記の異なる修復マトリックスに含まれる目的の配列を組み込むことが可能な１以上のガイドＲＮＡ発現カセットを含む、第ｎの、例えば第３、第４、第５、などの核酸を導入する、１以上の追加ステップを含み、各追加ステップの後には、よって形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する、典型的にはＣａｓ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にする誘導剤を含まない培地中で培養するステップが入る。
【0105】
本発明における方法の特定の実施形態では、上記に記載するようなＣＲＩＳＰＲツールまたは方法を用いて、目的の標的配列の少なくとも１本の鎖の切断を担う酵素を用いて（例えば、コードすることで）、細菌を形質転換する、ここで、特定の実施形態における該酵素はヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ型ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９酵素およびＭＡＤ７酵素から選択されたヌクレアーゼである。好ましくは、該目的の標的配列は、例えば、ｃａｔＢ遺伝子などの、細菌に１以上の抗生物質、好ましくはアンフェニコールの分類に属する１以上の抗生物質、典型的にはクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼなどのアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、に対する耐性を付与する酵素をコードする配列であり、コードする配列の転写を調節する配列であり、または上記コードする配列に隣接する配列である、
【0106】
本発明において使用するために適したＣａｓ９タンパク質の例としては、以下に限らないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（出願番号ＷＯ２０１７／０６４４３９の配列番号１およびＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１０９２２２５１．１を参照）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５を参照）由来のＣａｓ９タンパク質を含む。
【0107】
ＭＡＤ７ヌクレアーゼ（アミノ酸配列は配列番号７２に対応する）は、「Ｃａｓ１２」または「Ｃｐｆ１」としても識別され、当業者に知られたかかるヌクレアーゼと結合し得るｇＲＮＡと組み合わせることにより、本発明の文脈において、他にも有利に使用され得る。（Ｇａｒｃｉａ－Ｄｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７およびＳｔｅｌｌａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１７を参照）。
【0108】
特定の態様では、ＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする配列は配列Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株において容易に発現されるように最適化された配列であり、好ましくは配列番号７１の配列である。
【0109】
使用する場合、抗－ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、典型的には「抗Ｃａｓ」タンパク質である、すなわち、Ｃａｓの作用を阻害または抑制／中和し得るタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えば、ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである場合のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、の作用を阻害または保護／中和し得るタンパク質である。
【0110】
有利には抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、例えば、ＡｃｒＩＩＡ１、ＡｃｒＩＩＡ２、ＡｃｒＩＩＡ３、ＡｃｒＩＩＡ４、ＡｃｒＩＩＡ５、ＡｃｒＩＩＣ１、ＡｃｒＩＩＣ２およびＡｃｒＩＩＣ３から選択された「抗Ｃａｓ９」タンパク質である（Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。好ましくは該「抗Ｃａｓ９」タンパク質はＡｃｒＩＩＡ２またはＡｃｒＩＩＡ４である。かかるタンパク質は、例えばＣａｓ９酵素に結合することによって、典型的には、Ｃａｓ９の作用を非常に顕著に制限し、理想的に抑制する。
【0111】
他の有利に用いられ得る抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は「抗ＭＡＤ７」タンパク質であり、例えば、ＡｃｒＶＡ１タンパク質である（Ｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0112】
標的にされたＤＮＡ部位（「認識された配列」）と同様に、編集／修復テンプレートは自身に、天然および／または合成の、コードおよび／または非コード配列に対応する１以上の核酸配列または核酸配列部位を含み得る。該テンプレートはまた、１以上の「外来」配列、すなわち、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌のゲノム、または上記の属の特定の種のゲノムに天然には存在しない、配列を含み得る。マトリックスはまた、これらの配列の組み合わせを含み得る。
【0113】
本発明で用いられる遺伝子ツールにより、修復テンプレートの、目的の核酸をもつ細菌ゲノム、典型的には、少なくとも１つの塩基対（ｂｐ）、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、１、０００、１００００、１０００００もしくは１００００００ｂｐ、典型的には１ｂｐから２０ｋｂの間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３ｋｂ、または１ｂｐおよび１０ｋｂの間、好ましくは１０ｂｐから１０ｋｂの間、または１ｋｐから１０ｋｂの間、例えば、１ｂｐから５ｋｂの間、２ｋｂから５ｋｂの間、または２．５もしくは３ｋｂから５ｋｂの間を含むＤＮＡ配列または配列部位、への組み込みの誘導が可能である。
【0114】
特定の実施形態では、目的のＤＮＡ配列の発現によりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌は、いくつかの異なる糖、例えば、少なくとも２つの異なる糖、典型的には、６つの炭素原子を含む糖（例えば、グルコースまたはマンノース）の内の、および／または５つの炭素原子を含む糖（例えば、キシロース、アラビノース、またはフルクトース）の内の少なくとも２つの異なる糖、好ましくは、例えば、グルコース、キシロースおよびマンノース；グルコース、アラビノースおよびマンノース；ならびにグルコース、キシロースおよびアラビノースの内から選択された少なくとも３つの異なる糖、の発酵（典型的には、同時に）が可能になる。
【0115】
他の特定の実施形態では、目的のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの目的の転写産物、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌による溶媒の生産を促進する転写産物、典型的には少なくとも１つの目的のタンパク質、例えば、酵素；トランスポーターなどの膜タンパク質；他のタンパク質のための成熟タンパク質（シャペロンタンパク質）；転写因子；またはそれらの組み合わせ、をコードする。
【0116】
他の実施形態では、本発明における方法は、グループＩＩイントロンの使用、および例えば、ＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子技術／ツールまたはＴａｒｇｅＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子ツールの実装に基づく。
【0117】
ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（登録商標）技術は、リプログラム可能なグループＩＩイントロン（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のＬｌ．ｌｔｒＢイントロンに基づく）の使用に依存しており、細菌のゲノムを速やかに、所望の遺伝子座に組み込むことが可能であり（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、典型的には標的遺伝子の不活化を目的とする。編集領域の認識およびリバーススプライシングによるゲノムへの挿入のメカニズムは、一方ではイントロンおよび上記領域の相同性に基づいており、もう一方ではタンパク質（ｌｔｒＡ）の作用に基づいている。
【0118】
ＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）技術は、同様のアプローチに基づいており、イントロン配列内に選択マーカーを追加することで補完されている（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このマーカーにより、ゲノム内へのイントロンの組み込みを選択でき、よって所望の変異の獲得を促進する。この遺伝子システムはまた、グループＩイントロンを利用している。実際に、該選択マーカー（レトロトランポジション活性化マーカー，またはＲＡＭと呼ばれる）は、かかる遺伝子要素によって妨げられ、プラスミドからの発現が阻止される（このシステムのより正確な説明：Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）この遺伝子要素のスプライシングは、ゲノムに組み込まれる前に行われ、その結果、抵抗性遺伝子の活性型を持つ染色体が得られる。このシステムの最適化されたバージョンでは、この遺伝子の上流と下流にＦＬＰ／ＦＲＴサイトが含まれており、ＦＲＴリコンビナーゼを使って抵抗性遺伝子を除去することができる（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【0119】
他の実施形態では、本発明における方法はアレル交換ツールの使用、および例えばＡＣＥ（登録商標）遺伝子技術／ツールの実装に基づく。
【0120】
ＡＣＥ（登録商標）技術は栄養要求性変異株（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４におけるｐｙｒＥ遺伝子の欠失によるウラシル要求性であり、５－フルオロオロチン酸（Ａ－５－ＦＯ）への耐性も生じる；Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）の使用に基づく。このシステムは当業者によく知られた、アレル交換メカニズムを使用する。疑似自滅（ｐｓｅｕｄｏ－ｓｕｉｃｉｄｅ）ベクター（非常に低コピー）の形質転換に続いて、第１のアレル交換イベントによる細菌の染色体への後者の組み込みは、プラスミド上に最初から存在している耐性遺伝子によって選択される。組み込みステップは、ｐｙｒＥ遺伝子座内、または他の遺伝子座内の２つの異なるやり方で実行され得る：
ｐｙｒＥ遺伝子座において組み込む場合、ｐｙｒＥ遺伝子もまた、プラスミド上に位置するが、発現しない（非機能性プロモーター）。第２の組み換えによって機能的なｐｙｒＥ遺伝子が回復し、そして栄養要求性によって選択され得る（ウラシルを含まない最小培地）。非機能性ｐｙｒＥ遺伝子もまた、選択可能な特徴（Ａ－５－ＦＯへの感受性）を有するため、同じモデルにおいて他の組み込みが可能であり、ｐｙｒＥの状態を機能的なものと非機能的なものとの間で連続的に切り替えることができる。
ｐｙｒＥ遺伝子座において組み込む場合、ｐｙｒＥ遺伝子もまた、プラスミド上に位置するが、発現しない（非機能性プロモーター）。第２の組み換えによって機能的なｐｙｒＥ遺伝子が回復し、そして栄養要求性によって選択され得る（ウラシルを含まない最小培地）。非機能性ｐｙｒＥ遺伝子もまた、選択可能な特徴（Ａ－５－ＦＯへの感受性）を有するため、同じモデルにおいて他の組み込みが可能であり、ｐｙｒＥの状態を機能的なものと非機能的なものとの間で連続的に切り替えることができる。
【0121】
他の遺伝子座において組み込む場合、組み換え後に対抗選択マーカーの発現を可能にする遺伝子領域を標的とする（典型的には、他の遺伝子、好ましくは高発現遺伝子、の後のオペロン）。そしてこの第２の組み換えは栄養要求性によって選択される（ウラシルを含まない最小培地）。
【0122】
グループＩＩイントロンの使用、および例えばＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子技術／ツールもしくはＴａｒｇｅＴｒｏｎ（登録商標）遺伝子ツールの実装に基づく、またはアレル交換ツールの使用、および例えばＡＣＥ（登録商標）遺伝子技術／ツールの実装に基づく記載された実施形態では、標的とされた配列は好ましくは、目的の酵素、好ましくは上記に説明するように、アンフェニコールＯ－アセチルトランスフェラーゼ、をコードする配列に隣接する配列である。
【0123】
本発明の他の目的物は、本明細書において本発明者らにより記載された方法によって得られた、形質転換、および／または遺伝子的に改変された細菌、典型的には本発明者らに記載された一つの種に属する、またはサブクレードの内の一つに対応するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、および任意の派生細菌、クローン、変異株、またはその遺伝子的な改変バージョン、に関する。
【0124】
そして形質転換、および／または遺伝子的に改変された本発明の典型である細菌は、もはや１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素を発現しない細菌、特に、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを発現しない細菌、例えば、野生型においてｃａｔＢ遺伝子を発現するが、一度形質転換されるおよび／または遺伝子的に改変されると、本発明のなすところにより、上記ｃａｔＢ遺伝子を欠失する、または上記ｃａｔＢ遺伝子を発現できなくなる、細菌である。よって本発明の効果によって形質転換、および／または遺伝子的に改変された細菌は、アンフェニコールに対して、例えば本文に記載のアンフェニコール、特にクロラムフェニコールまたはチアンフェニコールに対して感受性になる。
【0125】
本発明における好ましい遺伝子的に改変される細菌の特定の例としては、２０１８年１２月６日にＢｅｌｇｉａｎ Ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（「ＢＣＣＭ」，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５， Ｂ－９０００Ｇｅｎｔ－Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託番号ＬＭＧＰ－３１１５１で登録された本明細書中でＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢとして識別された細菌である。本明細書はまた、チアンフェニコールおよび／またはクロラムフェニコールなどのアンフェニコールに感受性を保つ、上記細菌の任意の派生細菌、クローン、変異株、または遺伝子的に改変されたバージョンに関する。
【0126】
特定の実施形態では、本発明における形質転換、および／または遺伝子的に改変された細菌であり、１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素、特にクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼなどのアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを発現しない細菌、例えばＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌はなお形質転換、および好ましくは遺伝子的に改変され得る。これは核酸、例えば、本明細書の、例えば実験部分に記載のプラスミドを用いて行うことができる。有利に使用し得る核酸の例は、配列番号２３の配列のプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒである（本明細書の実験部分に記載）。
【0127】
本発明の特定の態様は、実際に、本発明における遺伝子的に改変された細菌、好ましくは番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１で寄託されたＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ細菌またはその遺伝子的に改変されたバージョンの使用、例えば本文中に記載の遺伝子ツールまたは方法を用いて、自発的にそのゲノムに導入された目的の核酸の発現を通じて、１以上の溶媒、好ましくは少なくともイソプロパノールを、好ましくは工業的規模で生産するための使用に関する。
【0128】
本発明はまた、（ｉ）本発明における目的の核酸、典型的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌における、特に本文に記載のＩＢＥ発酵をなし得る細菌における、目的の酵素をコードする配列を、またはコードする配列の転写を調節する配列を、認識するＤＮＡフラグメント、および（ｉｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌の改良バリアントを生産するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および典型的には遺伝子的に改変するための、以下の遺伝子改変ツールの要素から選択された少なくとも１つのツール、好ましくはいくつかのツール；ｇＲＮＡである核酸；修復テンプレートである核酸；少なくとも１つのプライマーペア、例えば、本発明の文脈において記載のプライマーペア；および上記ツールによってコードされるタンパク質の、例えば、Ｃａｓ９またはＭＡＤ７型ヌクレアーゼの、発現を可能にする誘導剤、を含むキットに関する。
【0129】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を形質転換する、および典型的には遺伝子的に改変するための遺伝子改変ツールは、上述の説明のように、例えばＣＲＩＳＰＲツール、グループＩＩイントロンに基づくツールおよびアレル交換ツール、から選択され得る。
【0130】
キットは、用いられるヌクレアーゼおよび／または１以上のガイドＲＮＡの発現を制御するために遺伝子ツール内で任意に使用される、選択された誘導性プロモーターに合わせた１以上の誘導剤をさらに含んでいてもよい。
【0131】
本発明における特定のキットはタグを含むヌクレアーゼの発現を可能にする。
【0132】
本発明におけるキットはさらに、培地などの１以上の消耗品、少なくとも１つのコンピテントなＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌（すなわち、形質転換に適した）、少なくとも１つのｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、１以上の選択分子、または説明書、を含み得る。
【0133】
本明細書はまた、本文に記載のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の形質転換および理想的な遺伝子的な改変の方法の実装のための、および／またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌、好ましくは天然にイソプロパノールを生産するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌を用いた、溶媒もしくはバイオ燃料、またはその混合物の生産、好ましくは工業的な規模での生産のための、本発明におけるキット、またはこのキットの要素の１以上の使用に関する。
【0134】
生産され得る溶媒は、典型的にはアセトン、ブタノール、エタノール、イソプロパノール、またはその混合物、典型的にはエタノール／イソプロパノール、ブタノール／イソプロパノール、またはエタノール／ブタノール混合物、好ましくはイソプロパノール／ブタノール混合物でありうる。
【0135】
本発明における形質転換された細菌の使用は、典型的には工業的な規模で、年間で少なくとも１００トンのアセトン、少なくとも１００トンのエタノール、少なくとも１０００トンのイソプロパノール、少なくとも１８００トンのブタノール、または少なくとも４００００トンのその混合物の生産を可能にする。
【0136】
以下の実施例および図は発明の範囲を制限することなく本発明をより十全に説明する事を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0137】
【0138】
【0139】
【0140】
【0141】
【0142】
【0143】
【0144】
【0145】
【0146】
【0147】
【0148】
【図12】図１２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３のｕｐｐ遺伝子座の改変を示す。図１２Ａは、ｕｐｐ遺伝子座の遺伝子構成を表す：遺伝子、ｇＲＮＡターゲットサイト、および修復テンプレートが、ゲノムＤＮＡ上の対応するホモロジー領域と関連付けられている。ＰＣＲ検証のためのプライマーハイブリダイゼーションサイト（ＲＨ０１０とＲＨ０１１）も示されている。図１２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３のｕｐｐ遺伝子座の改変を示す。図１２ＢはＲＨ０１０およびＲＨ０１１プライマーを用いた、ｕｐｐ遺伝子座の増幅を示す。改変したｕｐｐ遺伝子では１０９０ｂｐと予測されるのに対し、野生型遺伝子の場合、１６８０ｂｐの増幅が予想される。Ｍは１００ｂｐ－３ｋｂのサイズマーカー（Ｌｏｎｚａ）；ＷＴは野生型菌種を示す。
【0149】
【0150】
【0151】
【0152】
【0153】
【0154】
【0155】
【0156】
【図20】図２０はｐＣａｓ９ａｃｒプラスミドマップ（配列番号２３）を示す。ｅｒｍＢ：エリスロマイシン耐性遺伝子、ｒｅｐ：Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；ｒｅｐＨ：Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの複製起点、Ｔｔｈｌ：チオラーゼターミネーター、ｍｉｎｉＰｔｈｌ：構成的プロモーター（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、Ｐｃｍ－ｔｅｔＯ２／１：ｔｅｔＲの産物によって抑制され、アンヒドロテトラサイクリン、「ａＴｃ」によって誘導可能なプロモーター（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２）、Ｐｂｇａｌ：ｌａｃＲの産物によって抑制され、ラクトースによって誘導可能なプロモーター（Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）、ａｃｒＩＩＡ４：抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質ＡｃｒＩＩ１４をコードする遺伝子、ｂｇａＲ：発現産物がＰｂｇａｌからの転写を抑制する、遺伝子。
【0157】
【0158】
【0159】
【0160】
【0161】
【0162】
【0163】
【0164】
【0165】
【0166】
【0167】
【0168】
【0169】
【0170】
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0171】
実施例１
材料および方法
培養条件
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．ｌ－１、グルコース５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０ＢをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．ｌ－１、酵母エキス５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．ｌ－１）で培養した。固体培地は１５ｇ．ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで作成した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地にそれぞれに、４０または５００ｍｇ．ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地それぞれに２５または１２．５ｍｇ．ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地に１５ｍｇ．ｌ－１）を必要な場合には使用した。
材料および方法
培養条件
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．ｌ－１、グルコース５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０ＢをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．ｌ－１、酵母エキス５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．ｌ－１）で培養した。固体培地は１５ｇ．ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで作成した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地にそれぞれに、４０または５００ｍｇ．ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地それぞれに２５または１２．５ｍｇ．ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地に１５ｍｇ．ｌ－１）を必要な場合には使用した。
【0172】
核酸の取り扱い
全ての酵素およびキットは提供元の推奨に従って使用した。
全ての酵素およびキットは提供元の推奨に従って使用した。
【0173】
プラスミドのコンストラクション
図２０に示すｐＣａｓ９ａｃｒプラスミド（配列番号２３）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが合成したＰｂｇａｌプロモーターの制御下にあるｂｇａＲおよびａｃｒＩＩＡ４を含むフラグメント（配列番号８１）をｐＣａｓ９ｉｎｄベクターのＳａｃＩサイトにおいてクローニングすることでコンストラクトした（Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
図２０に示すｐＣａｓ９ａｃｒプラスミド（配列番号２３）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが合成したＰｂｇａｌプロモーターの制御下にあるｂｇａＲおよびａｃｒＩＩＡ４を含むフラグメント（配列番号８１）をｐＣａｓ９ｉｎｄベクターのＳａｃＩサイトにおいてクローニングすることでコンストラクトした（Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0174】
ｐＧＲＮＡｉｎｄプラスミド（配列番号８２）をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成されたＰｃｍ－２ｔｅｔＯ１プロモーター（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）の制御下にあるｇＲＮＡの発現カセット（配列番号８３）をｐＥＣ７５０Ｃベクター（配列番号１０６）のＳａｃＩサイトにおいてクローニングすることでコンストラクトした。（Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0175】
ｐＧＲＮＡ－ｘｙｌＢ（配列番号１０２）、ｐＧＲＮＡ－ｘｙｌＲ（配列番号１０３）、ｐＧＲＮＡ－ｇｌｃＧ（配列番号１０４）およびｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ（配列番号１０５）プラスミドを、それぞれのプライマーペア、５′－ＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＣＴＡＧ－３′および５′－ＡＡＡＣＣＴＡＧＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣ－３′、５′－ＴＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＴ－３′および５′－ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＣ－３′、５′－ＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡ－３′および５′－ＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡ－３′、５′－ＴＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡ－３′および５′－ＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＧＣ－３′で、ＢｓａＩで切断したｐＧＲＮＡｉｎｄプラスミド（配列番号８２）内においてクローニングすることによってコンストラクトした。
【0176】
ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢプラスミド（配列番号７９）を、一方は５′－ＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣ－３′および５′－ＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧ－３′、他方は５′－ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣ－３′および５′－ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＧＧ－３′のプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のＰＣＲアセンブリのオーバーラップによって得られたＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断したｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢベクターにおいてクローニングすることでコンストラクトした。
【0177】
ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢプラスミド（配列番号８０）を一方は５′－ＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣ－３′および５′－ＧＣＴＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧ－３′他方は５′－ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＡＣＣ－３′および５′－ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＧ－３のプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のＰＣＲアセンブリのオーバーラップによって得られたＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断したＧＲＮＡ－ｂｄｈＢベクターにおいてクローニングすることでコンストラクトした。
【0178】
形質転換
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２をＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３に記載のプロトコルに従って形質転換した。ｇＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドで形質転換され、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒ）をすでに含む、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２形質転換体の選択を、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇａｎｄ）およびラクトース（４０ｎＭ）を含む固体２ＹＴＧ培地で行った。
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２をＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３に記載のプロトコルに従って形質転換した。ｇＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドで形質転換され、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒ）をすでに含む、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２形質転換体の選択を、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇａｎｄ）およびラクトース（４０ｎＭ）を含む固体２ＹＴＧ培地で行った。
【0179】
ｃａｓ９発現の誘導
得られた形質転換体の生育過程において、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）およびｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現誘導剤、ａＴｃ（１ｍｇ．ｌ－１）を含む固体２ＹＴＧ培地でｃａｓ９の発現の誘導を行った。
得られた形質転換体の生育過程において、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）およびｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現誘導剤、ａＴｃ（１ｍｇ．ｌ－１）を含む固体２ＹＴＧ培地でｃａｓ９の発現の誘導を行った。
【0180】
ｂｄｈ遺伝子座の増幅
ｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子の遺伝子座におけるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２のゲノム編集は、Ｑ５（登録商標）高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＮＥＢ）とプライマーＶ１（５′－ＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴ－３′）およびＶ２（５′－ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴ－３′）を用いたＰＣＲによって制御された。
ｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子の遺伝子座におけるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２のゲノム編集は、Ｑ５（登録商標）高信頼性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＮＥＢ）とプライマーＶ１（５′－ＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴ－３′）およびＶ２（５′－ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴ－３′）を用いたＰＣＲによって制御された。
【0181】
結果
形質転換効率
ａｃｒＩＩＡ４ 遺伝子の挿入がＣａｓ９発現プラスミドの形質転換頻度に与える影響を評価するために、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含んだＤＳＭ７９２菌株に、異なるｇＲＮＡ発現プラスミドを形質転換し、その形質転換体をラクトース補填培地で選択した。得られた形質転換頻度を図２１に示す。
形質転換効率
ａｃｒＩＩＡ４ 遺伝子の挿入がＣａｓ９発現プラスミドの形質転換頻度に与える影響を評価するために、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含んだＤＳＭ７９２菌株に、異なるｇＲＮＡ発現プラスミドを形質転換し、その形質転換体をラクトース補填培地で選択した。得られた形質転換頻度を図２１に示す。
【0182】
ΔｂｄｈＢおよびΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ変異体の作成
ｂｄｈＢ（ｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ－配列番号１０５）を標的とするｇＲＮＡ発現カセットを含む標的プラスミド、ならびにｂｄｈＢ遺伝子単独（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢ－配列番号７９）またはｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ－配列番号８０）の欠失を可能にする修復テンプレートを含む２つの派生プラスミドを、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に形質転換した。得られた形質転換頻度を表２に示す。
ｂｄｈＢ（ｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ－配列番号１０５）を標的とするｇＲＮＡ発現カセットを含む標的プラスミド、ならびにｂｄｈＢ遺伝子単独（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢ－配列番号７９）またはｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ－配列番号８０）の欠失を可能にする修復テンプレートを含む２つの派生プラスミドを、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に形質転換した。得られた形質転換頻度を表２に示す。
【表2】
【0183】
ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒを含むＤＳＭ７９２菌株における、ｂｄｈＢを標的とするプラスミドの形質転換頻度。頻度は形質転換に用いられたＤＮＡ１μｇあたりの得られた形質転換体の数で示し、少なくとも２の独立した実験の平均値を示す。
【0184】
得られた形質転換体を、アンヒドロテトラサイクリン、ａＴｃを補填した培地上で培養することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの発現を誘導する段階を経た（図２２）。
【0185】
所望の変更を２つのａＴＣ耐性コロニー由来のゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲによって確認した（図２３）。
【0186】
結論
Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子ツールは２つのプラスミドを用いる：－第１プラスミド、ｐＣａｓ９ｉｎｄは、ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９を含む、および第２プラスミドは、ｐＥＣ７５０Ｃから派生し、ｇＲＮＡ発現カセット（第２ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にある）およびこのシステムによって誘導された２本鎖切断を修復するための編集テンプレートを含む。
Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子ツールは２つのプラスミドを用いる：－第１プラスミド、ｐＣａｓ９ｉｎｄは、ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９を含む、および第２プラスミドは、ｐＥＣ７５０Ｃから派生し、ｇＲＮＡ発現カセット（第２ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にある）およびこのシステムによって誘導された２本鎖切断を修復するための編集テンプレートを含む。
【0187】
しかし、本発明者らはａＴｃ誘導性プロモーターを用いたＣａｓ９の発現制御と同様の、ｇＲＮＡの発現制御にも関わらず、いくつかのｇＲＮＡが依然としてあまりに毒性があるように見える事を観察したため、その結果遺伝子ツールによって細菌の形質転換効率を制限し、よって染色体の改変を制限した。
【0188】
この遺伝子ツールを改良するため、抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子、ａｃｒＩＩＡ４、をラクトース誘導性プロモーターの制御下にあるように挿入する事でｃａｓ９発現プラスミドを改変した。そして異なるｇＲＮＡ発現プラスミドの形質転換効率は顕著に向上し、試験した全プラスミドの形質転換体が得られた。
【0189】
ｐＣａｓ９ｉｎｄを含むＤＳＭ７９２菌株に導入できなかったプラスミドを用いて、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＤＳＭ７９２ゲノム内のｂｄｈＢ遺伝子座の編集もまた、実行し得た。改変効率の観察は以前の観察（Ｗａｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と同様に、試験したコロニーの１００％が改変された。
【0190】
結論として、ｃａｓ９発現プラスミドの改変はＣａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体のより良い制御を可能にし、形質転換体においてＣａｓ９の作用が目的の変異体を得るための引き金となり得るような形質転換体の取得を有利に促進する。
【0191】
実施例２
材料および方法
培養条件
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．Ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．Ｌ－１、グルコース５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．Ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－βおよびＩＮＶ１１０をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．Ｌ－１、酵母エキス５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．Ｌ－１）で培養した。固体培地を１５ｇ．Ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで作成した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地中に、それぞれ２０または５００ｍｇ．Ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地中に、それぞれ２５または１２．５ｍｇ．Ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地中に１５ｍｇ．Ｌ－１）またはスペクチノマイシン（ＬＢまたは２ＹＴＧ培地中に、それぞれ１００または６５０ｍｇ．Ｌ－１の濃度）を、必要な場合には使用した。
材料および方法
培養条件
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．Ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．Ｌ－１、グルコース５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．Ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－βおよびＩＮＶ１１０をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．Ｌ－１、酵母エキス５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．Ｌ－１）で培養した。固体培地を１５ｇ．Ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで作成した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地中に、それぞれ２０または５００ｍｇ．Ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地中に、それぞれ２５または１２．５ｍｇ．Ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地中に１５ｍｇ．Ｌ－１）またはスペクチノマイシン（ＬＢまたは２ＹＴＧ培地中に、それぞれ１００または６５０ｍｇ．Ｌ－１の濃度）を、必要な場合には使用した。
【0192】
核酸およびプラスミドベクター
全ての酵素およびキットは、提供元の推奨に従って使用した。
全ての酵素およびキットは、提供元の推奨に従って使用した。
【0193】
コロニーＰＣＲ試験は、以下のプロトコルに従った：
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ の単離したコロニーを１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。この溶液を攪拌せずに９８℃で１０分間加熱した。そして、０．５μＬのこの細菌溶解物をＰｈｉｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑ５（ＮＥＢ）またはＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ポリメラーゼを用いた１０μＬの反応系におけるＰＣＲテンプレートとして用い得る。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ の単離したコロニーを１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。この溶液を攪拌せずに９８℃で１０分間加熱した。そして、０．５μＬのこの細菌溶解物をＰｈｉｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑ５（ＮＥＢ）またはＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ポリメラーゼを用いた１０μＬの反応系におけるＰＣＲテンプレートとして用い得る。
【0194】
全ての、コンストラクションにおいて用いたプライマーのリスト（名前／ＤＮＡ配列）を以下に詳しく示す：
以下の９つのプラスミドベクターを調製した。
【表A】
以下の９つのプラスミドベクターを調製した。
【0195】
プラスミド番号１：ｐＥＸ－Ａ２５８－ΔｃａｔＢ（配列番号１７）
これはプラスミドｐＥＸ－Ａ２５８にクローニングした合成ＤＮＡフラグメントΔｃａｔＢを含む。このΔｃａｔＢフラグメントはｉ）アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター（発現カセット：配列番号１９）の制御下にあるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３のｃａｔＢ遺伝子（クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするクロラムフェニコール耐性遺伝子－配列番号１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセット、およびｉｉ）ｃａｔＢ遺伝子の上流および下流に位置する相同な４００ｂｐを含む編集テンプレート（配列番号２０）を含む。
これはプラスミドｐＥＸ－Ａ２５８にクローニングした合成ＤＮＡフラグメントΔｃａｔＢを含む。このΔｃａｔＢフラグメントはｉ）アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター（発現カセット：配列番号１９）の制御下にあるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３のｃａｔＢ遺伝子（クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするクロラムフェニコール耐性遺伝子－配列番号１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセット、およびｉｉ）ｃａｔＢ遺伝子の上流および下流に位置する相同な４００ｂｐを含む編集テンプレート（配列番号２０）を含む。
【0196】
プラスミド番号２：ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ（図２および配列番号２１を参照）。
これはＰＣＲで増幅され（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｒｅｖ）、およびＸｈｏＩ制限酵素によって個々のＤＮＡを切断した後にｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載－配列番号２２）にクローニングされたΔｃａｔＢフラグメントを含む。
これはＰＣＲで増幅され（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｒｅｖ）、およびＸｈｏＩ制限酵素によって個々のＤＮＡを切断した後にｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載－配列番号２２）にクローニングされたΔｃａｔＢフラグメントを含む。
【0197】
プラスミド番号３：ｐＣａｓ９ａｃｒ（図３および配列番号２３を参照）
プラスミド番号４：ｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（図４および配列番号２４を参照）
これは、ｕｐｐ遺伝子の上流および下流と相同な２つのＤＮＡフラグメント（それぞれの配列長：５００（配列番号２６）３７７（配列番号２７）塩基対）からなり、およびｕｐｐ遺伝子の欠失に用いる修復テンプレート（配列番号２５）を含む。このアセンブリを、ギブソンクローニングシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ２Ｘ）を用いて取得した。このために、上流および下流部分を、それぞれのプライマーＲＨ００１／ＲＨ００２およびＲＨ００３／ＲＨ００４を用いて、ＤＳＭ６４２３菌株（Ｍａｔｅ ｄｅ Ｇｅｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８およびアクセッション番号ＰＲＪＥＢ１１６２６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＰＲＪＥＢ１１６２６を参照））のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。そしてこれら２つのフラグメントは事前に制限酵素（ＳａｌＩおよびＳａｃＩ制限酵素）によって線状化されたｐＥＣ７５０Ｓにアセンブリされた。
プラスミド番号４：ｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（図４および配列番号２４を参照）
これは、ｕｐｐ遺伝子の上流および下流と相同な２つのＤＮＡフラグメント（それぞれの配列長：５００（配列番号２６）３７７（配列番号２７）塩基対）からなり、およびｕｐｐ遺伝子の欠失に用いる修復テンプレート（配列番号２５）を含む。このアセンブリを、ギブソンクローニングシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ２Ｘ）を用いて取得した。このために、上流および下流部分を、それぞれのプライマーＲＨ００１／ＲＨ００２およびＲＨ００３／ＲＨ００４を用いて、ＤＳＭ６４２３菌株（Ｍａｔｅ ｄｅ Ｇｅｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８およびアクセッション番号ＰＲＪＥＢ１１６２６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＰＲＪＥＢ１１６２６を参照））のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。そしてこれら２つのフラグメントは事前に制限酵素（ＳａｌＩおよびＳａｃＩ制限酵素）によって線状化されたｐＥＣ７５０Ｓにアセンブリされた。
【0198】
プラスミド番号５：ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐ（図５および配列番号２８を参照）
このプラスミドは、ｐＥＸ－Ａ２と呼ばれる複製用プラスミドに挿入された、構成的プロモーター（配列番号３０の配列のノンコーディングＲＮＡ）の制御下でｕｐｐ遺伝子（ｕｐｐを標的とするプロトスペーサー（配列番号３１））を標的とするｇＲＮＡの発現カセット（配列番号２９）に対応するｇＲＮＡ－ｕｐｐＤＮＡフラグメントを含む。
このプラスミドは、ｐＥＸ－Ａ２と呼ばれる複製用プラスミドに挿入された、構成的プロモーター（配列番号３０の配列のノンコーディングＲＮＡ）の制御下でｕｐｐ遺伝子（ｕｐｐを標的とするプロトスペーサー（配列番号３１））を標的とするｇＲＮＡの発現カセット（配列番号２９）に対応するｇＲＮＡ－ｕｐｐＤＮＡフラグメントを含む。
【0199】
プラスミド番号６：ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐ（図６および配列番号３２を参照）。
これは、プラスミドｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（配列番号２４）を基礎として、追加的に、構成的プロモーターの制御下でｕｐｐ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む、ＤＮＡフラグメントを含む。このフラグメントはｐＥＸ－Ａ２に挿入され、ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐと名付けられた。そして、挿入産物をプライマーｐＥＸ－ｆｗｄおよびｐＥＸ－ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素 ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断した。最終的に、このフラグメントを、事前に同じ制限酵素で切断していたｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲにライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐを得た。
これは、プラスミドｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（配列番号２４）を基礎として、追加的に、構成的プロモーターの制御下でｕｐｐ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む、ＤＮＡフラグメントを含む。このフラグメントはｐＥＸ－Ａ２に挿入され、ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐと名付けられた。そして、挿入産物をプライマーｐＥＸ－ｆｗｄおよびｐＥＸ－ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素 ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断した。最終的に、このフラグメントを、事前に同じ制限酵素で切断していたｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲにライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐを得た。
【0200】
プラスミド番号７：ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐ（図７および配列番号３３を参照）。
そして、このガイドＲＮＡおよび修復テンプレートを含むカセットを、プライマーｐＥＣ７５０Ｃ－ｆｗｄおよびＭ１３－ｒｅｖを用いて増幅した。増幅産物をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ酵素の制限酵素によって切断し、そしてｐＥＣ７５０Ｃに酵素ライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐを得た。
そして、このガイドＲＮＡおよび修復テンプレートを含むカセットを、プライマーｐＥＣ７５０Ｃ－ｆｗｄおよびＭ１３－ｒｅｖを用いて増幅した。増幅産物をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ酵素の制限酵素によって切断し、そしてｐＥＣ７５０Ｃに酵素ライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐを得た。
【0201】
プラスミド番号８：ｐＧＲＮＡ－ｐＮＦ２（図８および配列番号３４を参照）
このプラスミドはｐＥＣ７５０Ｃを基礎とし、ｐＮＦ２プラスミド（配列番号１１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
このプラスミドはｐＥＣ７５０Ｃを基礎とし、ｐＮＦ２プラスミド（配列番号１１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
【0202】
プラスミド番号９：ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ｇＲＮＡ＿ｃａｔＢ（図１６および配列番号３８を参照）。
これはＰＣＲ（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｇＲＮ Ａ＿ｒｅｖ）によって増幅されたｃａｔＢ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ配列をコードする配列であって、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載）に、ＸｈｏＩ制限酵素による個々のＤＮＡの切断およびライゲーションの後でクローニングされた配列を含む。
これはＰＣＲ（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｇＲＮ Ａ＿ｒｅｖ）によって増幅されたｃａｔＢ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ配列をコードする配列であって、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載）に、ＸｈｏＩ制限酵素による個々のＤＮＡの切断およびライゲーションの後でクローニングされた配列を含む。
【0203】
プラスミド番号１０：ｐＮＦ３（図２５および配列番号１１９を参照）
これは、特に複製起点およびプラスミド複製タンパク質（ＣＩＢＥ＿ｐ２０００１）をコードする遺伝子を含むｐＮＦ２の部分を含み、プライマーＨ０２１およびＲＨ０２２を用いて増幅された。そして、このＰＣＲ産物はプラスミドｐＵＣ１９（配列番号１１７）のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトにクローニングされた。
これは、特に複製起点およびプラスミド複製タンパク質（ＣＩＢＥ＿ｐ２０００１）をコードする遺伝子を含むｐＮＦ２の部分を含み、プライマーＨ０２１およびＲＨ０２２を用いて増幅された。そして、このＰＣＲ産物はプラスミドｐＵＣ１９（配列番号１１７）のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトにクローニングされた。
【0204】
プラスミド番号１１：ｐＥＣ７５１Ｓ（図２６および配列番号１２１を参照）
これは、ＣａｔＰクロラムフェニコール耐性遺伝子（配列番号７０）を除いたすべてのｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）のエレメントを含む。後者をスペクチノマイシンに対する抵抗性を付与するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ａａｄ９ 遺伝子（配列番号１３０）と置き換えた。このエレメントはプラスミドｐＭＴＬ００７Ｓ－Ｅ１（配列番号１２０）からプライマーａａｄ９－ｆｗｄ２およびａａｄ９－ｒｅｖによって増幅され、およびｐＥＣ７５０ＣのＡｖａＩＩおよびＨｐａＩサイトに、ｃａｔＰ 遺伝子（配列番号７０）の代わりにクローニングされた。
これは、ＣａｔＰクロラムフェニコール耐性遺伝子（配列番号７０）を除いたすべてのｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）のエレメントを含む。後者をスペクチノマイシンに対する抵抗性を付与するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ａａｄ９ 遺伝子（配列番号１３０）と置き換えた。このエレメントはプラスミドｐＭＴＬ００７Ｓ－Ｅ１（配列番号１２０）からプライマーａａｄ９－ｆｗｄ２およびａａｄ９－ｒｅｖによって増幅され、およびｐＥＣ７５０ＣのＡｖａＩＩおよびＨｐａＩサイトに、ｃａｔＰ 遺伝子（配列番号７０）の代わりにクローニングされた。
【0205】
プラスミド番号１２：ｐＮＦ３Ｓ（図２７および配列番号１２３を参照）
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にａａｄ９遺伝子（ｐＥＣ７５１ＳからプライマーＲＨ０３１およびＲＨ０３２で増幅した）が挿入されている。
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にａａｄ９遺伝子（ｐＥＣ７５１ＳからプライマーＲＨ０３１およびＲＨ０３２で増幅した）が挿入されている。
【0206】
プラスミド番号１３：ｐＮＦ３Ｅ（図２８および配列番号１２４を参照）
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、ｍｉｎｉＰｔｈｌプロモーターの制御下でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｅｒｍＢ遺伝子（配列番号１３１）が挿入されている。このエレメントはｐＦＷ０１からプライマーＲＨ１３８およびＲＨ１３９によって増幅され、ｐＮＦ３ＥのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にクローニングされた、
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、ｍｉｎｉＰｔｈｌプロモーターの制御下でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｅｒｍＢ遺伝子（配列番号１３１）が挿入されている。このエレメントはｐＦＷ０１からプライマーＲＨ１３８およびＲＨ１３９によって増幅され、ｐＮＦ３ＥのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にクローニングされた、
【0207】
プラスミド番号１４：ｐＮＦ３Ｃ（図２９および配列番号１２５を参照）
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｃａｔＰ遺伝子（配列番号７０）が挿入されている。このエレメントはｐＥＣ７５０ＣからプライマーＲＨ１４０およびＲＨ１４１によって増幅され、ｐＮＦ３ＥのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にクローニングされた。
これはｐＮＦ３の全てのエレメントを含み、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｃａｔＰ遺伝子（配列番号７０）が挿入されている。このエレメントはｐＥＣ７５０ＣからプライマーＲＨ１４０およびＲＨ１４１によって増幅され、ｐＮＦ３ＥのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイト間にクローニングされた。
【0208】
結果１
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ ６４２３菌株の形質転換
プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ ｄａｍ－ｄｃｍ－菌株（ＩＮＶ１１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入され、複製された。これにより、形質転換によるＤＳＭ６４２３菌株へのｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢプラスミドの導入前にこのプラスミドのＤａｍ－およびＤｃｍ－型のメチル化を除去することが可能であり、形質転換はＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）に記載されたプロトコルを参照にして、以下の改変を加える：菌株を、大量のプラスミド（２０μｇ）で、ＯＤ６００が０．８の時点で、以下のエレクトロポレーションパラメーターを用いて形質転換する：１００Ω、２５μＦ、１４００Ｖ。エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むペトリディッシュに播種することで、ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢプラスミドを含むＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３形質転換体が得られた。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ ６４２３菌株の形質転換
プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ ｄａｍ－ｄｃｍ－菌株（ＩＮＶ１１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入され、複製された。これにより、形質転換によるＤＳＭ６４２３菌株へのｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢプラスミドの導入前にこのプラスミドのＤａｍ－およびＤｃｍ－型のメチル化を除去することが可能であり、形質転換はＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）に記載されたプロトコルを参照にして、以下の改変を加える：菌株を、大量のプラスミド（２０μｇ）で、ＯＤ６００が０．８の時点で、以下のエレクトロポレーションパラメーターを用いて形質転換する：１００Ω、２５μＦ、１４００Ｖ。エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むペトリディッシュに播種することで、ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢプラスミドを含むＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３形質転換体が得られた。
【0209】
ｃａｓ９発現の誘導およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株の取得
いくつかのエリスロマイシン耐性コロニーを１００μｌの培地（２ＹＴＧ）に採取し、培地で希釈係数が１０４になるまで段階希釈した。各コロニーについて、８μｌの各希釈溶液をエリスロマイシンおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含んだペトリディッシュ上に播き、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘導した。
いくつかのエリスロマイシン耐性コロニーを１００μｌの培地（２ＹＴＧ）に採取し、培地で希釈係数が１０４になるまで段階希釈した。各コロニーについて、８μｌの各希釈溶液をエリスロマイシンおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含んだペトリディッシュ上に播き、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘導した。
【0210】
ゲノムＤＮＡを抽出した後、プレート上で培養したクローン内のＣａｔＢ遺伝子の欠失を、プライマーＲＨ０７６およびＲＨ０７７を用いたＰＣＲによって検証した（図９を参照）。
【0211】
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株のチアンフェニコール感受性の検証
ＣａｔＢ遺伝子の欠失がチアンフェニコールへの新規感受性を付与したことを確かめるために、寒天培地における比較解析を行った。Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢを２ＹＴＧ培地で前培養し、１００μｌのこれらの前培養液を、チアンフェニコールを１５ｍｇ／Ｌの濃度で添加した、または非添加の２ＹＴＧ寒天培地上に播種した。図１０は最初のＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株のみがチアンフェニコール添加培地で生育し得ることを示す。
ＣａｔＢ遺伝子の欠失がチアンフェニコールへの新規感受性を付与したことを確かめるために、寒天培地における比較解析を行った。Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢを２ＹＴＧ培地で前培養し、１００μｌのこれらの前培養液を、チアンフェニコールを１５ｍｇ／Ｌの濃度で添加した、または非添加の２ＹＴＧ寒天培地上に播種した。図１０は最初のＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株のみがチアンフェニコール添加培地で生育し得ることを示す。
【0212】
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールによるｕｐｐ 遺伝子の欠損
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株のクローンを、ｄａｍ－およびｄｃｍ－型メチルトランスフェラーゼ－認識モチーフ（ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製）におけるメチル化を示さないｐＣａｓ９ａｃｒベクターで事前に形質転換した。Ｃ。ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内に保持されるプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒの存在の確認を、プライマーＲＨ０２５およびＲＨ１３４を用いたコロニーＰＣＲによって検証した。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株のクローンを、ｄａｍ－およびｄｃｍ－型メチルトランスフェラーゼ－認識モチーフ（ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製）におけるメチル化を示さないｐＣａｓ９ａｃｒベクターで事前に形質転換した。Ｃ。ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内に保持されるプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒの存在の確認を、プライマーＲＨ０２５およびＲＨ１３４を用いたコロニーＰＣＲによって検証した。
【0213】
エリスロマイシン耐性クローンを事前に脱メチル化したｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐで形質転換した。得られたコロニーをエリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）、チアンフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）およびラクトース（４０ｍＭ）を含む培地で選択した。
【0214】
そして、これらのコロニーのいくつかを１００μｌの培地（２ＹＴＧ）に再懸濁し、培地で段階希釈した（希釈係数１０４）。５μｌの各希釈液をエリスロマイシン、チアンフェニコールおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むペトリディッシュ上に播いた（図１１を参照）。
【0215】
各クローンについて、２つのａＴｃ耐性コロニーを、ｕｐｐ遺伝子座を増幅するように設計したプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって試験した（図１２を参照）。
【0216】
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株における、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールを用いた天然プラスミドｐＮＦ２の欠失。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株のクローンを、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼ－認識モチーフ（ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製）におけるメチル化を示さないｐＣａｓ９ｉｎｄベクターで事前に形質転換した。Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄの存在を、プライマー ｐＣａｓ９ｉｎｄ＿ｆｗｄ（配列番号４２）およびｐＣａｓ９ｉｎｄ＿ｒｅｖ（配列番号４３）を用いたＰＣＲによって検証した（図１３を参照）。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ菌株のクローンを、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼ－認識モチーフ（ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製）におけるメチル化を示さないｐＣａｓ９ｉｎｄベクターで事前に形質転換した。Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄの存在を、プライマー ｐＣａｓ９ｉｎｄ＿ｆｗｄ（配列番号４２）およびｐＣａｓ９ｉｎｄ＿ｒｅｖ（配列番号４３）を用いたＰＣＲによって検証した（図１３を参照）。
【0217】
そして、エリスロマイシン耐性クローンを、ｄａｍ－ｄｃｍ－ジェノタイプのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌から調製した、ｐＧＲＮＡ－ｐＮＦ２の形質転換に用いた。
【0218】
エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびチアンフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）を含む培地上で得られたいくつかのコロニーを、培地に再懸濁し、希釈係数１０４まで段階的に希釈した。８μＬの各希釈溶液をエリスロマイシン、チアンフェニコールおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含んだペトリディッシュ上に播き、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現させた。
【0219】
天然プラスミドｐＮＦ２が存在しないことを、プライマー ｐＮＦ２＿ｆｗｄ（配列番号３９）およびｐＮＦ２＿ｒｅｖ（配列番号４０）を用いたＰＣＲで検証した（図１４を参照）。
【0220】
結論
この研究過程で、本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内に異なるプラスミドを導入および保持する事に成功した。本発明者らは単一プラスミドの使用に基づいたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールを使用してＣａｔＢ遺伝子を欠失させることに成功した。寒天試験によって得られた組み換え菌株のチアンフェニコール感受性が確認された。
この研究過程で、本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株内に異なるプラスミドを導入および保持する事に成功した。本発明者らは単一プラスミドの使用に基づいたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールを使用してＣａｔＢ遺伝子を欠失させることに成功した。寒天試験によって得られた組み換え菌株のチアンフェニコール感受性が確認された。
【0221】
この欠失は、本発明者にとって、特許出願ＦＲ１８５４８３５に記載された、２つのプラスミドが必要なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールの使用を可能にした。本発明の目的を実証する２つの実施例を行った：ｕｐｐ遺伝子の欠失およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉＤＳＭ６４２３菌株にとって必須ではない天然のプラスミドの除去。
【0222】
結果２
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株の形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－β菌株で調製したプラスミドをまた、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株ＮＣＩＭＢ８０５２の形質転換に用いた。一方、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３においては、該プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ｄａｍ－ｄｃｍ－菌株（ＩＮＶ１１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に事前に導入し、および複製した。これによって、形質転換によるＤＳＭ６４２３菌株への該プラスミドの導入の前に、目的のプラスミド上のＤａｍ－およびＤｃｍ－型メチル化を除去することが可能である。
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株の形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－β菌株で調製したプラスミドをまた、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株ＮＣＩＭＢ８０５２の形質転換に用いた。一方、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３においては、該プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ｄａｍ－ｄｃｍ－菌株（ＩＮＶ１１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に事前に導入し、および複製した。これによって、形質転換によるＤＳＭ６４２３菌株への該プラスミドの導入の前に、目的のプラスミド上のＤａｍ－およびＤｃｍ－型メチル化を除去することが可能である。
【0223】
形質転換は、これらの菌株でなくとも、各菌株に対して同様に実行される、すなわち、Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ。１９９２に記載されたプロトコルを参照し、以下の改変を加える：菌株を、大量のプラスミド（５－２０μｇ）で、ＯＤ６００が０．６－０．８の時点で、以下のエレクトロポレーションパラメーターを用いて形質転換する：１００Ω， ２５μＦ， １４００Ｖ。２ＹＴＧで３時間再生後、該菌株を所望の抗生物質（エリスロマイシン：２０－４０μｇ／ｍＬ、チアンフェニコール：１５μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン：６５０μｇ／ｍＬ）を含むペトリディッシュ（２ＹＴＧ寒天）に播いた。
【0224】
Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株の形質転換効率の比較
形質転換は、以下のＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株において生物学的２連で行った。：ＤＳＭ６４２３野生型、ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢおよびＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２（図３０）。このために、形質転換効率が良くないために、細菌を改変するために用いることが特に難しいｐＣａｓ９ｉｎｄベクターを用いた。これはまた、３つ全ての菌株が感受性を示す抗生物質である、エリスロマイシンへの耐性を付与する遺伝子を含む。
形質転換は、以下のＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ菌株において生物学的２連で行った。：ＤＳＭ６４２３野生型、ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢおよびＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２（図３０）。このために、形質転換効率が良くないために、細菌を改変するために用いることが特に難しいｐＣａｓ９ｉｎｄベクターを用いた。これはまた、３つ全ての菌株が感受性を示す抗生物質である、エリスロマイシンへの耐性を付与する遺伝子を含む。
【0225】
その結果は、天然プラスミドｐＮＦ２がなくなったことで、形質転換効率が約１５－２０倍に向上したことをしめす。
【0226】
形質転換効率をまた、チアンフェニコールへの耐性を付与するプラスミドｐＥＣ７５０Ｃについて、野生型はこの抗生物質への耐性をもつため、ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢ（ＩＦＰ９６２ΔｃａｔＢ）およびＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢΔｐＮＦ２（ＩＦＰ９６３ΔｃａｔＢΔｐＮＦ２）菌株においてのみ、試験した（図３１）。このプラスミドにおいては、形質転換効率の上昇はさらに顕著である（約２０００倍の向上）。
【0227】
ｐＮＦ３プラスミドと他のプラスミドの形質転換効率の比較
天然プラスミドｐＮＦ２の複製起点を含むプラスミドの形質転換効率を決定するために、プラスミドｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３ＣをＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２菌株に導入した。エリスロマイシンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターを使用することで、耐性遺伝子の性質に基づいて、ベクターの形質転換効率の比較が可能である。プラスミド ｐＦＷ０１およびｐＥＣ７５０Ｃもまた形質転換された。これら２つのプラスミドは異なる抗生物質に対する耐性遺伝子（それぞれエリスロマイシンおよびチアンフェニコール）を含んでおり、通常はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉおよびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの形質転換に用いられる。
天然プラスミドｐＮＦ２の複製起点を含むプラスミドの形質転換効率を決定するために、プラスミドｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３ＣをＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２菌株に導入した。エリスロマイシンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターを使用することで、耐性遺伝子の性質に基づいて、ベクターの形質転換効率の比較が可能である。プラスミド ｐＦＷ０１およびｐＥＣ７５０Ｃもまた形質転換された。これら２つのプラスミドは異なる抗生物質に対する耐性遺伝子（それぞれエリスロマイシンおよびチアンフェニコール）を含んでおり、通常はＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉおよびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの形質転換に用いられる。
【0228】
図３２に示すように、該ｐＮＦ３に基づくベクターは優れた形質転換効率を示し、特にＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２において有用である。特に、ｐＮＦ３Ｅ（エリスロマイシン耐性遺伝子を含む）は同じ耐性遺伝子を含むｐＦＷ０１に比して顕著に高い形質転換効率を示した。これと同一のプラスミドは、野生型Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株には導入できず（生物学的２連において、形質転換されたプラスミドを５μｇ用いて得られたのは０コロニーであった。）、天然プラスミドｐＮＦ２の存在の影響を実証した。
【0229】
他の菌株／種における、ｐＮＦ３プラスミドの形質転換能の検証
他の溶媒生産Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株におけるこの新しいプラスミドの使用可能性を示すために、本発明者らは、ＡＢＥ菌株Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２におけるプラスミドｐＦＷ０１、ｐＮＦ３Ｅ、およびｐＮＦ３Ｓの形質転換効率の比較解析を行った（図３３）。ＮＣＩＭＢ ８０５２株は天然にチアンフェニコールに耐性があるため、ｐＮＦ３Ｃの代わりにスペクチノマイシンに耐性を付与するｐＮＦ３Ｓを用いた。
他の溶媒生産Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株におけるこの新しいプラスミドの使用可能性を示すために、本発明者らは、ＡＢＥ菌株Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２におけるプラスミドｐＦＷ０１、ｐＮＦ３Ｅ、およびｐＮＦ３Ｓの形質転換効率の比較解析を行った（図３３）。ＮＣＩＭＢ ８０５２株は天然にチアンフェニコールに耐性があるため、ｐＮＦ３Ｃの代わりにスペクチノマイシンに耐性を付与するｐＮＦ３Ｓを用いた。
【0230】
その結果、ＮＣＩＭＢ８０５２菌株がｐＮＦ３に基づくプラスミドで形質転換可能であることを実証し、これらのベクターが広い意味でＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ種に適用できることを示した。
【0231】
また、該一群のｐＮＦ３に基づく合成ベクターの適用可能性を、参照菌株であるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のＤＳＭ７９２菌株において試験した。形質転換アッセイは、この菌株のｐＮＦ３Ｃプラスミドでの形質転換可能性を示した（形質転換効率は、形質転換に用いたＤＮＡ１μｇあたり３コロニーが観察されたのに対し、ｐＥＣ７５０Ｃプラスミドでは１２０コロニー／μｇであった）。
【0232】
出願ＦＲ１８／７３４９２に記載されている遺伝子ツールとｐＮＦ３プラスミドの互換性の検証
特許出願ＦＲ１８／７３４９２は、ΔｃａｔＢ菌株および、エリスロマイシン耐性遺伝子およびチアンフェニコール耐性遺伝子の使用を必要とする、２プラスミドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を記載する。新規の１群のｐＮＦ３プラスミドの価値を実証するために、該ｐＮＦ３Ｃベクターを、すでにｐＣａｓ９ａｃｒプラスミドを含むΔｃａｔＢ菌株に形質転換した。２連で行ったこの形質転換は、０．６２５±０．１２５コロニー／μｇＤＮＡ（平均値±標準誤差）の形質転換効率を示し、ｐＮＦ３Ｃに基づくベクターがΔｃａｔＢ菌株においてｐＣａｓ９ａｃｒと組み合わせて使用され得ることを実証した。
特許出願ＦＲ１８／７３４９２は、ΔｃａｔＢ菌株および、エリスロマイシン耐性遺伝子およびチアンフェニコール耐性遺伝子の使用を必要とする、２プラスミドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を記載する。新規の１群のｐＮＦ３プラスミドの価値を実証するために、該ｐＮＦ３Ｃベクターを、すでにｐＣａｓ９ａｃｒプラスミドを含むΔｃａｔＢ菌株に形質転換した。２連で行ったこの形質転換は、０．６２５±０．１２５コロニー／μｇＤＮＡ（平均値±標準誤差）の形質転換効率を示し、ｐＮＦ３Ｃに基づくベクターがΔｃａｔＢ菌株においてｐＣａｓ９ａｃｒと組み合わせて使用され得ることを実証した。
【0233】
これらの結果と並行して、その複製起点（配列番号１１８）を含むｐＮＦ２プラスミドの一部を再利用することで、新規の一群のシャトルベクター（配列番号１１９、１２３、１２４および１２５）の作成に成功し得、これは望むように改変でき、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株での複製、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３への再導入が可能である。これらの新規ベクターは、例えばＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３およびその派生体における、特に２つの異なる核酸を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツールを用いた、遺伝子編集を実行するために有利な形質転換効率を示す。
【0234】
これらの新規ベクターはまた、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉの他の菌株（ＮＣＩＭＢ８０５２）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（特にＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）においての試験に成功し、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の他の生命体へのそれらの適用可能性を実証した。試験はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいても行われている。
【0235】
結論
これらの結果から、天然プラスミドｐＮＦ２を欠失させると、それを含んでいた細菌の形質転換頻度が大幅に増加することが実証された（ｐＦＷ０１では約１５倍、ｐＥＣ７５０Ｃでは約２０００倍）。この結果は、特に、形質転換が困難であることが知られているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の場合に、および特に、天然に形質転換効率が低い（プラスミド１μｇあたり５コロニー未満）という問題を抱えるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株の場合に、興味深い。
これらの結果から、天然プラスミドｐＮＦ２を欠失させると、それを含んでいた細菌の形質転換頻度が大幅に増加することが実証された（ｐＦＷ０１では約１５倍、ｐＥＣ７５０Ｃでは約２０００倍）。この結果は、特に、形質転換が困難であることが知られているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の場合に、および特に、天然に形質転換効率が低い（プラスミド１μｇあたり５コロニー未満）という問題を抱えるＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＤＳＭ６４２３菌株の場合に、興味深い。
【0236】
参考文献
－ Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., & Lovley, D. R. (2014). Lactose－inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Applied and environmental microbiology, 80(8), 2410－2416.
－ Chen J.－S., Hiu S.F. (1986) Acetone－butanol－isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym,Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 8:371－376.
－ Cui, L., & Bikard, D. (2016). Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic acids research, 44(9), 4243－4251.
－ Currie, D. H., Herring, C. D., Guss, A. M., Olson, D. G., Hogsett, D. A., & Lynd, L. R. (2013). Functional heterologous expression of an engineered full length CipA from Clostridium thermocellum in Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Biotechnology for biofuels, 6(1), 32.
－ DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR－Cas systems. Nucleic acids research, 41(7), 4336－4343.
－ Dong, H., Tao, W., Zhang, Y., & Li, Y. (2012). Development of an anhydrotetracycline－inducible gene expression system for solvent－producing Clostridium acetobutylicum: A useful tool for strain engineering. Metabolic engineering, 14(1), 59－67.
－ Dong, D., Guo, M., Wang, S., Zhu, Y., Wang, S., Xiong, Z., ... & Huang, Z. (2017). Structural basis of CRISPR－SpyCas9 inhibition by an anti－CRISPR protein. Nature, 546(7658), 436.
－ Dupuy, B., Mani, N., Katayama, S., & Sonenshein, A. L. (2005). Transcription activation of a UV‐inducible Clostridium perfringens bacteriocin gene by a novel σ factor. Molecular microbiology, 55(4), 1196－1206.
－ Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P. E., & Berg, R. H. (1992). Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. Journal of the American Chemical Society, 114(5), 1895－1897.
－ Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K., Makarova, K. S., Lecrivain, A. L., Bzdrenga, J., ... & Charpentier, E. (2013). Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual－RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR－Cas systems. Nucleic acids research, 42(4), 2577－2590.
－ Garcia－Doval C, Jinek M. Molecular architectures and mechanisms of Class 2 CRISPR－associated nucleases. Curr Opin Struct Biol. 2017 Dec;47:157－166. doi: 10.1016/j.sbi.2017.10.015 Ajouter au projet Citavi par DOI. Epub 2017 Nov 3. Review.
－ George H.A., Johnson J.L., Moore W. E. C., Holdeman, L. V., Chen J. S. (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Env. Microbiol. 45:1160－1163.
－ Gonzales y Tucker RD, Frazee B. View from the front lines: an emergency medicine perspective on clostridial infections in injection drug users. Anaerobe. 2014 Dec; 30:108－15.
－ Hartman, A. H., Liu, H., & Melville, S. B. (2011). Construction and characterization of a lactose－inducible promoter system for controlled gene expression in Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(2), 471－478.
－ Heap, J. T., Ehsaan, M., Cooksley, C. M., Ng, Y. K., Cartman, S. T., Winzer, K., & Minton, N. P. (2012). Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter－selection marker. Nucleic acids research, 40(8), e59－e59.
－ Heap, J. T., Kuehne, S. A., Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49－55.
－ Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., & Minton, N. P. (2007). The ClosTron: a universal gene knock－out system for the genus Clostridium. Journal of microbiological methods, 70(3), 452－464.
－ Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., & Minton, N. P. (2009). A modular system for Clostridium shuttle plasmids. Journal of microbiological methods, 78(1), 79－85.
－ Hidalgo－Cantabrana, C., O’Flaherty, S., & Barrangou, R. (2017). CRISPR－based engineering of next－generation lactic acid bacteria. Current opinion in microbiology, 37, 79－87.
－ Hiu S.F., Zhu C.－X., Yan R.－T., Chen J.－S. (1987) Butanol－ethanol dehydrogenase and butanol－ethanol－isopropanol dehydrogenase: different alcohol dehydrogenases in two strains of Clostridium beijerinckii (Clostridium butylicum). Appl. Env. Microbiol. 53:697－703.
－ Huang, H., Chai, C., Li, N., Rowe, P., Minton, N. P., Yang, S., & Gu, Y. (2016). CRISPR/Cas9－based efficient genome editing in Clostridium ljungdahlii, an autotrophic gas－fermenting bacterium. ACS synthetic biology, 5(12), 1355－1361.
－ Huggins, A.S., Bannam, T.L. and Rood, J.I. (1992) Comparative sequence analysis of the catB gene from Clostridium butyricum. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 2548－2551.
－ Ismaiel A.A., Zhu C.X., Colby G.D., Chen, J. S. (1993). Purification and characterization of a primary－secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J. Bacteriol. 175:5097－5105.
－ Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual－RNA－guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816－821.
－ Jones D.T., Woods D.R. (1986) Acetone－butanol fermentation revisited. Microbiological Reviews 50:484－524.
－ Kolek J., Sedlar K., Provaznik I., Patakova P. (2016). Dam and Dcm methylations prevent gene transfer into Clostridium pasteurianum NRRL B－598: development of methods for electrotransformation, conjugation, and sonoporation. Biotechnol Biofuels. 9:14.
－ Li, Q., Chen, J., Minton, N. P., Zhang, Y., Wen, Z., Liu, J., ... & Gu, Y. (2016). CRISPR‐based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. Biotechnology journal, 11(7), 961－972.
－ Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... & Van Der Oost, J. (2011). Evolution and classification of the CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467.
－ Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., ... & Horvath, P. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13(11), 722.
－ Marino, N. D., Zhang, J. Y., Borges, A. L., Sousa, A. A., Leon, L. M., Rauch, B. J., ... & Bondy－Denomy, J. (2018). Discovery of widespread type I and type V CRISPR－Cas inhibitors. Science, 362(6411), 240－242.
－ Mate de Gerando, H., Wasels, F., Bisson, A., Clement, B., Bidard, F., Jourdier E., Lopez－Contreras A., Lopes Ferreira N. (2018). Genome and transcriptome of the natural isopropanol producer Clostridium beijerinckii DSM 6423. BMC genomics. 19:242.
－ Mearls, E. B., Olson, D. G., Herring, C. D., & Lynd, L. R. (2015). Development of a regulatable plasmid－based gene expression system for Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 99(18), 7589－7599.
－ Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190－195.
－ Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190－195.
－ Moon HG, Jang YS, Cho C, Lee J, Binkley R, Lee SY. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett. 2016 Feb;363(3).
－ Nagaraju, S., Davies, N. K., Walker, D. J. F., Kopke, M., & Simpson, S. D. (2016). Genome editing of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9. Biotechnology for biofuels, 9(1), 219.
－ Nariya, H., Miyata, S., Kuwahara, T., & Okabe, A. (2011). Development and characterization of a xylose－inducible gene expression system for Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(23), 8439－8441.
－ Newcomb, M., Millen, J., Chen, C. Y., & Wu, J. D. (2011). Co－transcription of the celC gene cluster in Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 90(2), 625－634.
－ Pawluk, A., Davidson, A. R., & Maxwell, K. L. (2018). Anti－CRISPR: Discovery, mechanism and function. Nature Reviews Microbiology, 16(1), 12
－ Poehlein A., Solano J.D.M., Flitsch S.K., Krabben P., Winzer K., Reid S.J., Jones D.T., Green E., Minton N.P., Daniel R., Durre P. (2017). Microbial solvent formation revisited by comparative genome analysis. Biotechnol Biofuels. 10:58.
－ Pyne, M. E., Bruder, M. R., Moo－Young, M., Chung, D. A., & Chou, C. P. (2016). Harnessing heterologous and endogenous CRISPR－Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium. Scientific reports, 6.
－ Rauch, B. J., Silvis, M. R., Hultquist, J. F., Waters, C. S., McGregor, M. J., Krogan, N. J., & Bondy－Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR－Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1－2), 150－158.
－ Rajewska M., Wegrzyn K, Konieczny I., FEMS Microbiol Rev. 2012 Mar; 36(2). AT－rich region and repeated sequences － the essential elements of replication origins of bacterial replicons :408－34.
－ Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., & Weiss, D. S. (2015). Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and environmental microbiology, 81(5), 1652－1660.
－ Rogers P., Chen J.－S., Zidwick M. (2006) in The prokaryotes. 3rd edition, Vol. 1, edited by Dworkin M (Springer, New York, USA,2006). 3rd edition, Vol. 1, pp. 672－755.
－ Schwarz S, Kehrenberg C, Doublet B, Cloeckaert A. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol. FEMS Microbiol Rev. 2004 Nov;28(5):519－42.
－ Stella S, Alcon P, Montoya G. Class 2 CRISPR－Cas RNA－guided endonucleases: Swiss Army knives of genome editing. Nat Struct Mol Biol. 2017 Nov;24(11):882－892. doi: 10.1038/nsmb.3486
－ Wang, S., Dong, S., Wang, P., Tao, Y., & Wang, Y. (2017). Genome Editing in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1－4 with the CRISPR－Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 83(10), e00233－17.
－ Wang Y, Li X, Milne CB, et al. Development of a gene knockout system using mobile group II introns (Targetron) and genetic disruption of acid production pathways in Clostridium beijerinckii. Appl Environ Microbiol. 2013; 79(19): 5853－63.
－ Wang, Y. et al. Markerless chromosomal gene deletion in Clostridium beijerinckii using CRISPR/Cas9 system. J. Biotechnol.2015. 200: 1－5.
－ Wang, Y., Zhang, Z. T., Seo, S. O., Lynn, P., Lu, T., Jin, Y. S., & Blaschek, H. P. (2016). Bacterial genome editing with CRISPR－Cas9: deletion, Integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology, 5(7), 721－732.
－ Wasels, F., Jean－Marie, J., Collas, F., Lopez－Contreras, A. M., & Ferreira, N. L. (2017). A two－plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum. Journal of microbiological methods. 140:5－11.
－ Xu, T., Li, Y., Shi, Z., Hemme, C. L., Li, Y., Zhu, Y., ... & Zhou, J. (2015). Efficient genome editing in Clostridium cellulolyticum via CRISPR－Cas9 nickase. Applied and environmental microbiology, 81(13), 4423－4431.
－ Yadav, R., Kumar, V., Baweja, M., & Shukla, P. (2018). Gene editing and genetic engineering approaches for advanced probiotics: A Review. Critical reviews in food science and nutrition, 58(10), 1735－1746.－ Yue Chen, Bruce A. McClane, Derek J. Fisher, Julian I. Rood, Phalguni Gupta; Construction of an Alpha Toxin Gene Knockout Mutant of Clostridium perfringens Type A by Use of a Mobile Group II Intron; Appl. Environ. Microbiol. Nov 2005, 71 (11) 7542－7547; DOI: 10.1128/AEM.71.11.7542－7547.2005.
－ Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., & Cui, Q. (2015). A novel arabinose－inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnology for biofuels, 8(1), 36.
－ Zhang C., Tinggang L. Jianzhong H. (2018) Characterization and genome analysis of a butanol－isopropanol－producing Clostridium beijerinckii strain BGS1. Biotechnol Biofuels (2018) 11:280.
－ Zhong, J., Karberg, M., & Lambowitz, A. M. (2003). Targeted and random bacterial gene disruption using a group II intron (targetron) vector containing a retrotransposition‐activated selectable marker. Nucleic acids research, 31(6), 1656－1664.
－ Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., & Lovley, D. R. (2014). Lactose－inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Applied and environmental microbiology, 80(8), 2410－2416.
－ Chen J.－S., Hiu S.F. (1986) Acetone－butanol－isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym,Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 8:371－376.
－ Cui, L., & Bikard, D. (2016). Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic acids research, 44(9), 4243－4251.
－ Currie, D. H., Herring, C. D., Guss, A. M., Olson, D. G., Hogsett, D. A., & Lynd, L. R. (2013). Functional heterologous expression of an engineered full length CipA from Clostridium thermocellum in Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Biotechnology for biofuels, 6(1), 32.
－ DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR－Cas systems. Nucleic acids research, 41(7), 4336－4343.
－ Dong, H., Tao, W., Zhang, Y., & Li, Y. (2012). Development of an anhydrotetracycline－inducible gene expression system for solvent－producing Clostridium acetobutylicum: A useful tool for strain engineering. Metabolic engineering, 14(1), 59－67.
－ Dong, D., Guo, M., Wang, S., Zhu, Y., Wang, S., Xiong, Z., ... & Huang, Z. (2017). Structural basis of CRISPR－SpyCas9 inhibition by an anti－CRISPR protein. Nature, 546(7658), 436.
－ Dupuy, B., Mani, N., Katayama, S., & Sonenshein, A. L. (2005). Transcription activation of a UV‐inducible Clostridium perfringens bacteriocin gene by a novel σ factor. Molecular microbiology, 55(4), 1196－1206.
－ Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P. E., & Berg, R. H. (1992). Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. Journal of the American Chemical Society, 114(5), 1895－1897.
－ Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K., Makarova, K. S., Lecrivain, A. L., Bzdrenga, J., ... & Charpentier, E. (2013). Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual－RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR－Cas systems. Nucleic acids research, 42(4), 2577－2590.
－ Garcia－Doval C, Jinek M. Molecular architectures and mechanisms of Class 2 CRISPR－associated nucleases. Curr Opin Struct Biol. 2017 Dec;47:157－166. doi: 10.1016/j.sbi.2017.10.015 Ajouter au projet Citavi par DOI. Epub 2017 Nov 3. Review.
－ George H.A., Johnson J.L., Moore W. E. C., Holdeman, L. V., Chen J. S. (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Env. Microbiol. 45:1160－1163.
－ Gonzales y Tucker RD, Frazee B. View from the front lines: an emergency medicine perspective on clostridial infections in injection drug users. Anaerobe. 2014 Dec; 30:108－15.
－ Hartman, A. H., Liu, H., & Melville, S. B. (2011). Construction and characterization of a lactose－inducible promoter system for controlled gene expression in Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(2), 471－478.
－ Heap, J. T., Ehsaan, M., Cooksley, C. M., Ng, Y. K., Cartman, S. T., Winzer, K., & Minton, N. P. (2012). Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter－selection marker. Nucleic acids research, 40(8), e59－e59.
－ Heap, J. T., Kuehne, S. A., Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49－55.
－ Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., & Minton, N. P. (2007). The ClosTron: a universal gene knock－out system for the genus Clostridium. Journal of microbiological methods, 70(3), 452－464.
－ Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., & Minton, N. P. (2009). A modular system for Clostridium shuttle plasmids. Journal of microbiological methods, 78(1), 79－85.
－ Hidalgo－Cantabrana, C., O’Flaherty, S., & Barrangou, R. (2017). CRISPR－based engineering of next－generation lactic acid bacteria. Current opinion in microbiology, 37, 79－87.
－ Hiu S.F., Zhu C.－X., Yan R.－T., Chen J.－S. (1987) Butanol－ethanol dehydrogenase and butanol－ethanol－isopropanol dehydrogenase: different alcohol dehydrogenases in two strains of Clostridium beijerinckii (Clostridium butylicum). Appl. Env. Microbiol. 53:697－703.
－ Huang, H., Chai, C., Li, N., Rowe, P., Minton, N. P., Yang, S., & Gu, Y. (2016). CRISPR/Cas9－based efficient genome editing in Clostridium ljungdahlii, an autotrophic gas－fermenting bacterium. ACS synthetic biology, 5(12), 1355－1361.
－ Huggins, A.S., Bannam, T.L. and Rood, J.I. (1992) Comparative sequence analysis of the catB gene from Clostridium butyricum. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 2548－2551.
－ Ismaiel A.A., Zhu C.X., Colby G.D., Chen, J. S. (1993). Purification and characterization of a primary－secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J. Bacteriol. 175:5097－5105.
－ Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual－RNA－guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816－821.
－ Jones D.T., Woods D.R. (1986) Acetone－butanol fermentation revisited. Microbiological Reviews 50:484－524.
－ Kolek J., Sedlar K., Provaznik I., Patakova P. (2016). Dam and Dcm methylations prevent gene transfer into Clostridium pasteurianum NRRL B－598: development of methods for electrotransformation, conjugation, and sonoporation. Biotechnol Biofuels. 9:14.
－ Li, Q., Chen, J., Minton, N. P., Zhang, Y., Wen, Z., Liu, J., ... & Gu, Y. (2016). CRISPR‐based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. Biotechnology journal, 11(7), 961－972.
－ Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... & Van Der Oost, J. (2011). Evolution and classification of the CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467.
－ Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., ... & Horvath, P. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13(11), 722.
－ Marino, N. D., Zhang, J. Y., Borges, A. L., Sousa, A. A., Leon, L. M., Rauch, B. J., ... & Bondy－Denomy, J. (2018). Discovery of widespread type I and type V CRISPR－Cas inhibitors. Science, 362(6411), 240－242.
－ Mate de Gerando, H., Wasels, F., Bisson, A., Clement, B., Bidard, F., Jourdier E., Lopez－Contreras A., Lopes Ferreira N. (2018). Genome and transcriptome of the natural isopropanol producer Clostridium beijerinckii DSM 6423. BMC genomics. 19:242.
－ Mearls, E. B., Olson, D. G., Herring, C. D., & Lynd, L. R. (2015). Development of a regulatable plasmid－based gene expression system for Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 99(18), 7589－7599.
－ Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190－195.
－ Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190－195.
－ Moon HG, Jang YS, Cho C, Lee J, Binkley R, Lee SY. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett. 2016 Feb;363(3).
－ Nagaraju, S., Davies, N. K., Walker, D. J. F., Kopke, M., & Simpson, S. D. (2016). Genome editing of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9. Biotechnology for biofuels, 9(1), 219.
－ Nariya, H., Miyata, S., Kuwahara, T., & Okabe, A. (2011). Development and characterization of a xylose－inducible gene expression system for Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(23), 8439－8441.
－ Newcomb, M., Millen, J., Chen, C. Y., & Wu, J. D. (2011). Co－transcription of the celC gene cluster in Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 90(2), 625－634.
－ Pawluk, A., Davidson, A. R., & Maxwell, K. L. (2018). Anti－CRISPR: Discovery, mechanism and function. Nature Reviews Microbiology, 16(1), 12
－ Poehlein A., Solano J.D.M., Flitsch S.K., Krabben P., Winzer K., Reid S.J., Jones D.T., Green E., Minton N.P., Daniel R., Durre P. (2017). Microbial solvent formation revisited by comparative genome analysis. Biotechnol Biofuels. 10:58.
－ Pyne, M. E., Bruder, M. R., Moo－Young, M., Chung, D. A., & Chou, C. P. (2016). Harnessing heterologous and endogenous CRISPR－Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium. Scientific reports, 6.
－ Rauch, B. J., Silvis, M. R., Hultquist, J. F., Waters, C. S., McGregor, M. J., Krogan, N. J., & Bondy－Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR－Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1－2), 150－158.
－ Rajewska M., Wegrzyn K, Konieczny I., FEMS Microbiol Rev. 2012 Mar; 36(2). AT－rich region and repeated sequences － the essential elements of replication origins of bacterial replicons :408－34.
－ Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., & Weiss, D. S. (2015). Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and environmental microbiology, 81(5), 1652－1660.
－ Rogers P., Chen J.－S., Zidwick M. (2006) in The prokaryotes. 3rd edition, Vol. 1, edited by Dworkin M (Springer, New York, USA,2006). 3rd edition, Vol. 1, pp. 672－755.
－ Schwarz S, Kehrenberg C, Doublet B, Cloeckaert A. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol. FEMS Microbiol Rev. 2004 Nov;28(5):519－42.
－ Stella S, Alcon P, Montoya G. Class 2 CRISPR－Cas RNA－guided endonucleases: Swiss Army knives of genome editing. Nat Struct Mol Biol. 2017 Nov;24(11):882－892. doi: 10.1038/nsmb.3486
－ Wang, S., Dong, S., Wang, P., Tao, Y., & Wang, Y. (2017). Genome Editing in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1－4 with the CRISPR－Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 83(10), e00233－17.
－ Wang Y, Li X, Milne CB, et al. Development of a gene knockout system using mobile group II introns (Targetron) and genetic disruption of acid production pathways in Clostridium beijerinckii. Appl Environ Microbiol. 2013; 79(19): 5853－63.
－ Wang, Y. et al. Markerless chromosomal gene deletion in Clostridium beijerinckii using CRISPR/Cas9 system. J. Biotechnol.2015. 200: 1－5.
－ Wang, Y., Zhang, Z. T., Seo, S. O., Lynn, P., Lu, T., Jin, Y. S., & Blaschek, H. P. (2016). Bacterial genome editing with CRISPR－Cas9: deletion, Integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology, 5(7), 721－732.
－ Wasels, F., Jean－Marie, J., Collas, F., Lopez－Contreras, A. M., & Ferreira, N. L. (2017). A two－plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum. Journal of microbiological methods. 140:5－11.
－ Xu, T., Li, Y., Shi, Z., Hemme, C. L., Li, Y., Zhu, Y., ... & Zhou, J. (2015). Efficient genome editing in Clostridium cellulolyticum via CRISPR－Cas9 nickase. Applied and environmental microbiology, 81(13), 4423－4431.
－ Yadav, R., Kumar, V., Baweja, M., & Shukla, P. (2018). Gene editing and genetic engineering approaches for advanced probiotics: A Review. Critical reviews in food science and nutrition, 58(10), 1735－1746.－ Yue Chen, Bruce A. McClane, Derek J. Fisher, Julian I. Rood, Phalguni Gupta; Construction of an Alpha Toxin Gene Knockout Mutant of Clostridium perfringens Type A by Use of a Mobile Group II Intron; Appl. Environ. Microbiol. Nov 2005, 71 (11) 7542－7547; DOI: 10.1128/AEM.71.11.7542－7547.2005.
－ Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., & Cui, Q. (2015). A novel arabinose－inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnology for biofuels, 8(1), 36.
－ Zhang C., Tinggang L. Jianzhong H. (2018) Characterization and genome analysis of a butanol－isopropanol－producing Clostridium beijerinckii strain BGS1. Biotechnol Biofuels (2018) 11:280.
－ Zhong, J., Karberg, M., & Lambowitz, A. M. (2003). Targeted and random bacterial gene disruption using a group II intron (targetron) vector containing a retrotransposition‐activated selectable marker. Nucleic acids research, 31(6), 1656－1664.
【図1】
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【図20】
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【図24】
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【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】
【国際調査報告】