特表 2022-516083 多発性硬化症及び他の脱髄性疾患の検出及び治療に有用な組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-24

(54)【発明の名称】多発性硬化症及び他の脱髄性疾患の検出及び治療に有用な組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20220216BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20220216BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220216BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220216BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20220216BHJP

   A61K 31/546 20060101ALI20220216BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20220216BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20220216BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20220216BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALN20220216BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALN20220216BHJP

   C07K 16/12 20060101ALN20220216BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

C12Q1/04

A61K45/00

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

A61P37/06

A61P29/00

A61P25/28

A61K31/407

A61K31/546

G01N33/53 M

G01N33/543 545A

C12Q1/6844 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/689 Z

C07K16/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021537182

(86)(22)【出願日】2019-12-20

(85)【翻訳文提出日】2021-06-24

(86)【国際出願番号】 US2019068068

(87)【国際公開番号】W WO2020139782

(87)【国際公開日】2020-07-02

(31)【優先権主張番号】62/785,377

(32)【優先日】2018-12-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/875,779

(32)【優先日】2019-07-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508087147

【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】クリーセル ジョン

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー ケイル エフ

(72)【発明者】

【氏名】ベタリヤ プリーティダ

(72)【発明者】

【氏名】グレンジャー ジェニファー

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA06

4B063QA13

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4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ03

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4B063QR08

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4B063QR35

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4B063QX01

4C084AA17

4C084NA05

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4C086AA01

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4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB32

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4C086ZB35

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

(57)【要約】

本明細書で開示されているのは、多発性硬化症を含む脱髄性疾患を有するまたは有すると疑われる対象にて１以上の微生物を検出する方法である。また、本明細書で開示されているのは、微生物の検出に基づいて、脱髄の悪化を発症している、または経験している対象を治療する方法である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において脱髄性疾患を診断する方法であって、前記方法が、
ａ）微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を前記対象から入手することと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ前記微生物特異的抗体が、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤と前記試料をインキュベートすることと；
ｃ）前記試料にて前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することと；
ｄ）前記１以上の微生物特異的抗体が前記試料に存在する場合に、前記対象を脱髄性疾患であると診断することとを含む、前記方法。

【請求項2】

対象において脱髄性疾患を検出する方法であって、前記方法が、
ａ）表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含むと疑われる試料を前記対象から得ることと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤のそれぞれが１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ前記１以上の微生物特異的抗体が、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で前記試料を前記１以上の微生物捕捉剤と接触させることと；
ｃ）前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下で前記混合生物試料をインキュベートすることと；
ｄ）前記検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することとを含み、
その際、前記混合生物試料における表１のリストから選択された１以上の微生物の存在は対象における脱髄性疾患を検出する、前記方法。

【請求項3】

前記対象が脱髄性疾患を有すると疑われる、または脱髄性疾患を有するリスクがある、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

さらに、前記試料における前記１以上の微生物特異的抗体に特異的であるさまざまな微生物捕捉剤を用いて、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記試料が脳組織、脳脊髄液、脊髄組織、または血液である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記脱髄性疾患が多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎または最初のエピソードからなる症候群である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

前記対象がヒトである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

さらに、前記対象に抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

検出された前記１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２または表８のリストから選択される細菌である場合、抗菌剤が前記対象に投与され；検出された前記１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２、または表８のリストから選択されるウイルスである場合、抗ウイルス剤が前記対象に投与され；あるいは検出された前記１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２、または表８のリストから選択される真菌である場合、抗真菌剤が前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

さらに、表２に列挙された前記微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項11】

さらに、表８に列挙された前記微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項12】

さらに、表２に列挙された微生物の群から選択される１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

さらに、表８に列挙された微生物の群から選択される１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項14】

さらに、前記試料における前記微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項15】

さらに、前記試料における１以上の核酸配列を増幅することを含み、その際、前記１以上の核酸配列は表１、表２または表８における前記微生物の１以上に対応する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記１以上の核酸配列を特異的に増幅するプライマー対を用いて前記１以上の核酸配列が増幅される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

さらに、表１、表２、または表８における前記微生物の１以上に対応する前記１以上の核酸配列の発現が、対照における表１、表２または表８の前記微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記検出する工程がマイクロアレイによって検出することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

前記検出する工程がＥＬＩＳＡによって検出することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

検出された前記１以上の微生物がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

対象にて脱髄性疾患を診断し、且つ治療する方法であって、前記方法が、
ａ）微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を前記対象から入手することと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ前記微生物特異的抗体が、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤と共に前記試料をインキュベートすることと；
ｃ）前記試料にて前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することと；
ｄ）前記１以上の微生物特異的抗体が前記試料に存在する場合に、前記対象を脱髄性疾患であると診断することと；
ｅ）ｉ）検出された前記１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される細菌である場合、抗菌剤を
ｉｉ）検出された前記１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択されるウイルスである場合、抗ウイルス剤を
ｉｉｉ）検出された前記１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される真菌である場合、抗真菌剤を、あるいは
ｖ）それらの組み合わせを前記対象に投与することとを含む、前記方法。

【請求項22】

対象にて脱髄性疾患を検出し、且つ治療する方法であって、前記方法が、
ａ）表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を前記対象から得ることと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤のそれぞれが１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ前記１以上の微生物特異的抗体が、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で前記試料を前記１以上の微生物捕捉剤と接触させることと；
ｃ）前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下で前記混合生物試料をインキュベートすることと；
ｄ）前記混合生物試料における表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在が対象にて脱髄性疾患を検出する、前記検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することと、
ｅ）ｉ）検出された前記１以上の微生物が表１、表２、または表８のリストから選択される細菌である場合、抗菌剤を
ｉｉ）検出された前記１以上の微生物が表１、表２、または表８のリストから選択されるウイルスである場合、抗ウイルス剤を
ｉｉｉ）検出された前記１以上の微生物が表１、表２、または表８のリストから選択される真菌である場合、抗真菌剤を、あるいは
ｖ）それらの組み合わせを前記対象に投与することとを含む、前記方法。

【請求項23】

前記対象が脱髄性疾患を有すると疑われる、または脱髄性疾患を有するリスクがある、請求項２１～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

さらに、前記試料にて前記１以上の微生物に特異的であるさまざまな抗体を用いて、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことを含む、請求項２１～２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記試料が脳組織、脳脊髄液、脊髄組織、または血液である、請求項２１～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記脱髄性疾患が多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎または最初のエピソードからなる症候群である、請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記対象がヒトである、請求項２１～２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

さらに、前記試料にて１以上の微生物の存在を検出することを含み、その際、前記１以上の微生物が表２の群から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項29】

さらに、前記試料にて１以上の微生物の存在を検出することを含み、その際、前記１以上の微生物が表８の群から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項30】

さらに、調べた前記微生物のそれぞれについて前記試料にて前記抗体のレベルを決定することを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項31】

さらに、試料における１以上の核酸配列を増幅することを含み、その際、前記１以上の核酸配列は表１、表２または表８における前記微生物の１以上に対応する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

前記１以上の核酸配列を特異的に増幅するプライマー対を用いて前記１以上の核酸配列が増幅される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

さらに、表１における前記微生物の１以上に対応する前記１以上の核酸配列の発現が、対照における表１の前記微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記検出する工程がマイクロアレイによって検出することを含む、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項35】

前記検出する工程がＥＬＩＳＡによって検出することを含む、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項36】

検出された前記１以上の微生物がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来する、請求項２１または２２に記載の方法

【請求項37】

試料にて１以上の抗体を検出する方法であって、前記方法が
ａ）表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ前記１以上の微生物特異的抗体が、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤と共に前記試料をインキュベートすることと；
ｃ）前記試料にて前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することとを含む、前記方法。

【請求項38】

前記１以上の微生物特異的抗体の存在の検出が脱髄性疾患を示す、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記試料が、脱髄性疾患を発症するリスクがある、または脱髄性疾患を有すると疑われる対象からのものである、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記対象がヒトである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記脱髄性疾患が多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎または最初のエピソードからなる症候群である、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項42】

前記試料が脳組織、脳脊髄液、脊髄組織、または血液である、請求項３７に記載の方法。

【請求項43】

さらに、表２の群から選択される前記１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項44】

さらに、表８の群から選択される前記１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項45】

さらに、前記試料における前記微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項46】

前記検出する工程がマイクロアレイによって検出することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項47】

前記検出する工程がＥＬＩＳＡによって検出することを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項48】

さらに、前記試料における１以上の核酸配列を増幅することを含み、その際、前記１以上の核酸配列は表１における前記微生物の１以上に対応する、請求項３７に記載の方法。

【請求項49】

さらに、表１における前記微生物の１以上に対応する前記１以上の核酸配列の発現が、対照における表１の前記微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記検出する工程がハイブリッド形成反応によって検出することを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記ハイブリッド形成反応がさらに、前記試料を１以上のプライマーセットとハイブリッド形成させることを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ハイブリッド形成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ポリメラーゼ連鎖反応が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記検出する工程が発現された配列タグによって検出することを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項55】

前記検出する工程が局在化によって検出することを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項56】

検出された前記１以上の微生物がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来する、請求項３７に記載の方法

【請求項57】

試料にて１以上の微生物を検出する方法であって、前記方法が
ａ）表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；
ｂ）１以上の微生物捕捉剤が表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に結合する、前記１以上の微生物捕捉剤と共に前記試料をインキュベートすることと；
ｃ）前記試料にて表１、表２、または表８のリストから選択される前記１以上の微生物の存在を検出することとを含む、前記方法。

【請求項58】

さらに、前記試料における前記１以上の微生物の量を決定することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記１以上の微生物の存在の検出が脱髄性疾患を示す、請求項５７に記載の方法。

【請求項60】

前記試料が、脱髄性疾患を発症するリスクがある、または脱髄性疾患を有すると疑われる対象からのものである、請求項５７に記載の方法。

【請求項61】

前記対象がヒトである、請求項５７に記載の方法。

【請求項62】

前記脱髄性疾患が多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎または最初のエピソードからなる症候群である、請求項５９または６０に記載の方法。

【請求項63】

前記試料が脳組織、脳脊髄液、脊髄組織、または血液である、請求項５７に記載の方法。

【請求項64】

さらに、表２の群から選択される前記１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項65】

さらに、表８の群から選択される前記１以上の微生物の存在を検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項66】

前記検出する工程がマイクロアレイによって検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項67】

前記検出する工程がＥＬＩＳＡによって検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項68】

さらに、前記試料における１以上の核酸配列を増幅することを含み、その際、前記１以上の核酸配列は表１における前記微生物の１以上に対応する、請求項５７に記載の方法。

【請求項69】

さらに、表１における前記微生物の１以上に対応する前記１以上の核酸配列の発現が、対照における表１の前記微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項70】

前記検出する工程がハイブリッド形成反応によって検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項71】

前記ハイブリッド形成反応がさらに、前記試料を１以上のプライマーセットとハイブリッド形成させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記ハイブリッド形成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ポリメラーゼ連鎖反応が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記検出する工程が発現された配列タグによって検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項75】

前記検出する工程が局在化によって検出することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項76】

検出された前記１以上の微生物がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来する、請求項５７に記載の方法

【請求項77】

多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳ関連疾患の患者を治療する方法であって、前記方法が、
ａ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される細菌である場合、抗菌剤を投与すること；
ｂ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択されるウイルスである場合、抗ウイルス剤を投与すること；
ｃ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される真菌である場合、抗真菌剤を投与すること；あるいは
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）の組み合わせを前記対象に投与することを含み；
その際、
ｉ．微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を前記患者から入手することと；
ｉｉ．１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ前記微生物特異的抗体が、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、前記１以上の微生物捕捉剤と共に前記試料をインキュベートすることと；
ｉｉｉ．前記試料にて前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することとによって前記患者が、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、またはそれらの組み合わせを必要としていると特定される、前記方法。

【請求項78】

前記抗菌剤がメロペネムまたはセフトリアキソンである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記ＭＳ関連疾患が視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、または最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）である、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

さらに、表２のリストから選択される前記微生物の１以上に特異的な前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項81】

さらに、表８のリストから選択される微生物の１以上に特異的な前記１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項82】

さらに、前記試料における前記微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項83】

さらに、前記試料における１以上の核酸配列を増幅することを含み、その際、前記１以上の核酸配列は表１における前記微生物の１以上に対応する、請求項７７に記載の方法。

【請求項84】

前記１以上の核酸配列を特異的に増幅するプライマー対を用いて前記１以上の核酸配列が増幅される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

さらに、表１における前記微生物の１以上に対応する前記１以上の核酸配列の発現が、対照における表１の前記微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記試料が脳組織、脳脊髄液、脊髄組織、または血液である、請求項７７に記載の方法。

【請求項87】

前記検出する工程がハイブリッド形成反応によって検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項88】

前記ハイブリッド形成反応がさらに、前記試料を１以上のプライマーセットとハイブリッド形成させることを含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記検出する工程がポリメラーゼ連鎖反応によって検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項90】

前記検出する工程がマイクロアレイによって検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項91】

前記検出する工程がＥＬＩＳＡによって検出することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項92】

検出された前記１以上の微生物がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来する、請求項７７に記載の方法

【請求項93】

前記微生物捕捉剤が抗体またはプローブである、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項94】

さらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、前記ＥＬＩＳＡ指数を前記対象のアルブミン指数と比較することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項95】

さらに、前記ＥＬＩＳＡ指数及び前記アルブミン指数の線形回帰分析を実行することを含む、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

さらに、プロット直線を生成することを含む、請求項９４に記載の方法。

【請求項97】

前記１以上の微生物について血清と比較する場合、前記アルブミン指数が９以下であり、且つＥＬＩＳＡ指数が前記プロットより上にあれば、ＣＳＦにおける１以上の微生物特異的抗体を示す、請求項９６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２７日に出願された米国仮出願第６２／７８５，３７７号及び２０１９年７月１８日に出願された米国仮出願第６２／８７５，７７９号の利益を主張する。これらの先願出願の内容は、本明細書で参照することによってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

多発性硬化症（ＭＳ）は、原因不明の慢性脱髄性疾患であり、米国では約４０万人の脳と脊髄に影響を及ぼす。ジステンパー（イヌ）、麻疹（ＳＳＰＥ、ヒト）、ＪＣウイルス（ヒト）、及びインフルエンザ（ヒト）を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の多数の感染症は脱髄の原因となり得る（Ａｔｋｉｎｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，２９１－３０３．（２０００））。微生物、特にウイルスは、地理的パターン、散発的な発生、及び移動試験を含む疾患の疫学に基づいて、ＭＳの原因病原体として長い間疑われてきた（Ｋｕｒｔｚｋｅ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１６，３２７－３４９（２００５）；Ｋｕｒｔｚｋｅ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．６，Ｓｕｐｐｌ．２，Ｓ１３４－１４０（２０００）；Ｍｅｉｎｌ，Ｅ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｓｉｓ ｏｆ ＭＳ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１２，３０３－３０７（１９９９）；及びＭｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＢＭＪ，３２５，１１２８（２００２））。

【発明の概要】

【0003】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断する方法であり、該方法は、ａ）微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ微生物特異的抗体が、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤と共に試料をインキュベートすることと；ｃ）試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することと；ｄ）１以上の微生物特異的抗体が試料に存在する場合に対象を脱髄性疾患であると診断することとを含む。

【0004】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を検出する方法であり、該方法は、ａ）表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤のそれぞれが１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させることと；ｃ）前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下で前記混合生物試料をインキュベートすることと；ｄ）前記検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出し、その際、前記混合生物試料における表１のリストから選択される１以上の微生物の存在が対象における脱髄性疾患を検出することとを含む。

【0005】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断し、且つ治療する方法であり、該方法は、ａ）微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ微生物特異的抗体が、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤と共に試料をインキュベートすることと；ｃ）試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することと；ｄ）１以上の微生物特異的抗体が試料に存在する場合に対象を脱髄性疾患であると診断することと；ｅ）ｉ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択された細菌である場合に抗菌剤を、ｉｉ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択されたウイルスである場合に抗ウイルス剤を、ｉｉｉ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択された真菌である場合の抗真菌剤を、またはｖ）それらの組み合わせを対象に投与することとを含む。

【0006】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を検出し、且つ治療する方法であり、該方法は、ａ）表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤のそれぞれが１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ１以上の微生物特異的抗体が、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させることと；ｃ）前記１以上の微生物捕捉剤が前記微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して検出可能な複合体を形成するような条件下で前記混合生物試料をインキュベートすることと；ｄ）前記検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出し、その際、前記混合生物試料における表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在が対象における脱髄性疾患を検出することと；ｅ）ｉ）検出された１以上の微生物が表１、表２または表８のリストから選択された細菌である場合に抗菌剤を、ｉｉ）検出された１以上の微生物が表１または表２のリストから選択されたウイルスである場合に抗ウイルス剤を、ｉｉｉ）検出された１以上の微生物が表１、表２または表８のリストから選択された真菌である場合の抗真菌剤を、またはｖ）それらの組み合わせを対象に投与することとを含む。

【0007】

本明細書で開示されているのは、試料にて１以上の抗体を検出する方法であり、該方法は、ａ）表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤と共に試料をインキュベートすることと；及びｃ）試料中にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することとを含む。

【0008】

本明細書で開示されているのは、試料にて１以上の微生物を検出する方法であり、該方法は、ａ）表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物を含有すると疑われる試料を対象から得ることと；ｂ）１以上の微生物捕捉剤が表１、表２、または表８のリストから選択される微生物の１以上に結合する、１以上の微生物捕捉剤と共に試料をインキュベートすることと；ｃ）試料にて表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することとを含む。

【0009】

本明細書で開示されているのは、多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳ関連疾患の患者を治療する方法であり、該方法は、ａ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される微生物である場合に抗菌剤を対象に投与すること、ｂ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択されるウイルスである場合に抗ウイルス剤を対象に投与すること、ｃ）検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２、または表８のリストから選択される真菌である場合に抗真菌剤を対象に投与することと、またはｄ）対象にａ）、ｂ）またはｃ）の組み合わせを投与することを含み、その際、患者は、ｉ）微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を患者から得ることと、ｉｉ）１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤と共に試料をインキュベートすることと、ｉｉｉ）試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することとによって抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤またはそれらの組み合わせを必要とすると特定される。

【0010】

添付の図面は、本明細書に組み込まれてその一部を構成し、複数の態様を例示し、説明と合わせて本発明の原則を説明する役割を果たす。

【0011】

本発明のさらなる利点は、一部は以下の説明において記載されることになり、一部は説明から明らかとなるか、または本発明を実施することにより知ることができるだろう。本発明の利点は、特に添付の特許請求の範囲で指摘されている要素及び組み合わせによって実現され、且つ達成されるであろう。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は双方とも主張されているように、例示及び説明にすぎず、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】微生物ファミリーの正規化ヒット率階層的クラスター３．０分析（ｄｅ Ｈｏｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎｏｌａｎ，Ｊ．＆ Ｍｉｙａｎｏ，Ｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２０，１４５３－１４５４，（２００４））を示す図である。ＭＳ試料の少なくとも１つ（赤いバー）が対照のセットと比べて有意に過剰出現する（偽発見率、ｑ＜０．０５）ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリー（Ｎ＝４２）が示されている。正規化ＨＲをＬｏｇ₂変換した。列は、列のすべてのセルから各列の平均値を差し引くことによって中央に配置した。黄色は平均値（黒）を超える増加を示す一方で、青色は減少を示す。図の右側には、４つのＭＳ試料を含有し、対照を含有しない顕著なクラスターがある。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、ＭＳ微生物への代表的な読み取りペアマッピングを示す図である。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａ）とＬＵＺ２４様ファージ（Ｂ）のゲノム（ｘ軸）に沿った位置にマッピングされた一致した読み取りペアの数（ｙ軸）を示す。示されているマッピングはＭＡＰＱフィルタリングなしでＢｏｗｔｉｅ２．０アライメントによって行われた。図２Ａは、ヒト対象ＭＳ－０１９の脳試料由来のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの読み取りペアマッピングを示す。３０万、１００万、及び１５０万ｂｐでのピークは１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡにマッピングされる配列が含む。図２Ｂは、ヒト対象ＭＳ－０５３の脳試料由来のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージＬＵＺ２４様ウイルスの読み取りペアマッピングを示す。

【図3】ヒトＭＳ脳組織の免疫組織化学分析を示す。４人の脱髄対象、３人のてんかん対照、及び１人の脳膿瘍陽性対照に由来する５ミクロンのホルマリン固定パラフィン化脳組織切片を調べた。表示されている顕微鏡写真は代表的なものである。組織切片は、抗原賦活化とそれに続くカゼインブロッキングを用いて処理した。切片を、抗ペプチドグリカンｍＡｂ（ＭＡＢ９９５または２Ｅ９）、抗ＣＤ６８（マクロファージ、Ａｂｃａｍ）、抗リゾチーム（マクロファージ及び好中球、Ａｂｃａｍ）、またはアイソタイプ対照Ａｂ（ＩｇＧ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同等希釈液と共に４度で一晩インキュベートした。切片は抗ヒトＩｇＧ・ビオチンとアビジン・ＨＲＰで発色させた。示されている画像は１２５倍に拡大されている。対象ＭＳ－０１９の脳組織は、２つの異なる抗ペプチドグリカンｍＡｂによる特異的なペプチドグリカンの染色を示す。ペプチドグリカンのシグナルは、脳膿瘍陽性対照、検体ＭＳ－０５６、及びてんかん対照の対象０４０でも見られる。

【図4】対象／試料に特異的なＭＳ微生物を示す図である。検体については、分類群（ＮＡＭＥ）は、偽発見率（ｑ）が＜０．０５の対照とは有意に異なる。

【図5】直接比較したＣＳＦ血清学の結果を示す図である。バックグラウンド調整がない４つの対照のセットと直接比較したＯＤである。表示されたＺスコア。

【図6】図６Ａ～図６Ｆは、個々の対象のアルブミン指数に対してプロットされた６つのＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーに対する髄液ＥＬＩＳＡ指数（抗体）を示す図である。ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）は、ＭＳまたは他の神経疾患の個々の対象のアルブミン指数（ＡＩ）と比較される。四角で囲まれた領域は、血液脳関門（ＢＢＢ）が損なわれていないことを示す正常なアルブミン指数の領域（０～９）を示す。この直線は各抗原のＥＩとＢＢＢが損なわれていないこととの関係を示す線形回帰である。四角で囲まれた領域内及び直線より上の値は、考えられる髄腔内抗体合成（すなわち、脱髄の原因）を示す。特に、対象１０及び７２はＭＳ患者である一方で、８２は抗ＭＯＧ病である。図６ＡはＡｔｏｐｏｂｉｕｍについてのＥＩ対ＡＩを示す。図６ＢはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓについてのＥＩ対ＡＩを示す。図６ＣはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａについてのＥＩ対ＡＩを示す。図６ＤはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについてのＥＩ対ＡＩを示す。図６ＥはＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒについてのＥＩ対ＡＩを示す。図６ＦはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓについてのＥＩ対ＡＩを示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによってより容易に理解することができる。

【0014】

本方法及び組成物を開示及び説明する前に、それらは、他に特定されない限り、特定の合成方法に限定されず、他に特定されない限り、特定の試薬にも限定されず、よって、当然のことながら、異なるものになってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等の任意の方法及び材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料を本明細書に記載する。

【0015】

さらに、別段に明記しない限り、本明細書に記述されているいずれの方法も、その工程が特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることを決して意図するものではないことが理解されるべきである。したがって、方法の請求項がその工程が従うべき順序を実際に記載していない場合、または該工程が特定の順序に限定されるべきであることが請求項または説明に具体的に述べられていない場合、いかなる点でも順序が推測されることを決して意図しない。これは、工程の配置または操作の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、及び本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。

【0016】

本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。明細書中、本発明を、先行発明を理由にそのような刊行物に先行する権利がないとする承認として解釈されるべきものは何もない。さらに、本明細書に提供する公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、個別の確認が必要な場合がある。

【0017】

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。

【0018】

本明細書で使用される「または」という用語は、特定のリストの任意の１つの成員を意味する共に、そのリストの成員の任意の組み合わせも含む。

【0019】

範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」別の特定の値までのように表され得る。かかる範囲が表される場合、さらなる態様は、該１つの特定の値から、及び／または該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、該特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。さらに、該範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、及び他の端点とは独立しての双方で重要であることがさらに理解されるであろう。また、本明細書で開示されている多くの値があること、及び各値もまた、該値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書で開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0020】

本明細書で使用される、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、当該事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。

【0021】

本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、本明細書に記載されているようにアッセイされる、対象由来の組織または臓器；細胞（対象内、対象から直接採取、または培養にて維持された細胞もしくは培養細胞株由来の細胞のいずれか）；細胞溶解物（もしくは溶解物画分）または細胞抽出物；あるいは、細胞または細胞物質（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）由来の１以上の分子を含有する溶液を意味する。試料はまた、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排出物（例えば、血液、尿、糞便、唾液、涙液、胆汁、脳脊髄液、しかし、これらに限定されない）であってもよい。いくつかの態様では、試料は、脳、脊髄、脳脊髄液または血液から採取することができる。

【0022】

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、開示されている方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類であることができる。「対象」という用語にはまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌ等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ミバエ等）も含まれる。いくつかの態様では、対象は哺乳動物であることができる。いくつかの態様では、対象はヒトであることができる。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雌雄にかかわらず、成人、小児、青年、及び新生児の対象、ならびに胎児が包含されることが意図される。

【0023】

本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は疾患または障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト対象及び獣医学的対象を含む。開示されている方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与する工程の前に多発性硬化症の治療が必要であると診断されている。開示されている方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与する工程の前に脱髄性疾患の治療が必要であると診断されている。

【0024】

本明細書で使用されるとき、「正常」という用語は脱髄性疾患を有さない、または脱髄性疾患を発症する高い易罹患性を有さない個人、試料、または対象を指す。

【0025】

本明細書で使用されるとき、「易罹患性」という用語は、対象が疾患を発症する、または臨床的に疾患と診断される可能性を指す。例えば、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎または最初のエピソードからなる症候群）に対する易罹患性が高いヒト対象は、対象が脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、または最初のエピソードからなる症候群）を発症する、または臨床的にそうであると診断される可能性が高いヒト対象を指すことができる。

【0026】

本明細書で使用されるとき、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」態様を含むことができる。

【0027】

「特異的に結合する」とは、抗体がその同族の抗原を認識し、物理的に相互作用し（例えば、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である微生物特異的抗体）、且つ他の抗原を有意に認識せず、それと相互作用しないことを意味し；そのような抗体は当該技術分野で周知の技術によって生成されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。

【0028】

「プローブ」、「プライマー」、またはオリゴヌクレオチドとは、相補性配列（「標的」）を含有する第２のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と塩基対を形成することができる、定義された配列の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。得られるハイブリッドの安定性は発生する塩基対形成の程度に左右される。塩基対形成の程度は、プローブと標的分子との間の相補性の程度及びハイブリッド形成条件のストリンジェンシーの程度のようなパラメーターによって影響を受ける。ハイブリッド形成のストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、及びホルムアミドのような有機分子の濃度のようなパラメーターによって影響を受け、当業者に既知の方法によって決定される。微生物特異的抗体（微生物特異的抗体は、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である）に特異的なプローブまたはプライマーは、それらがハイブリッド形成する微生物特異的抗体の領域に対して少なくとも８０％～９０％の配列相補性、好ましくは少なくとも９１％～９５％の配列相補性、さらに好ましくは少なくとも９６％～９９％の配列相補性、及び最も好ましくは１００％の配列相補性を有する。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは当業者に周知の方法によって放射性または非放射性のいずれかで検出可能に標識されてもよい。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは、核酸ハイブリッド形成を含む方法、例えば、核酸配列決定、逆転写及び／またはポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリッド形成、ノーザンハイブリッド形成、原位置ハイブリッド形成、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に使用される。

【0029】

「特異的にハイブリッド形成する」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェントな条件下で実質的に相補性の核酸（例えば、微生物特異的抗体）を認識し、物理的に相互作用し（すなわち、塩基対形成し）、且つ他の核酸と実質的に塩基対形成しないことを意味する。

【0030】

「高ストリンジェントな条件」とは、６５℃の温度で０．５ＭのＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含有する緩衝液にて、または４２℃の温度で４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２ＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、１０％デキストラン硫酸、及び０．１％ＳＤＳを含む緩衝液にて少なくとも４０ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを使用した結果得られるものに匹敵するハイブリッド形成を可能にする条件を意味する。例えば、ＰＣＲ、ノーザン、サザン、または原位置のハイブリッド形成、ＤＮＡ配列決定等のような高ストリンジェントなハイブリッド形成のための他の条件は、分子生物学の当業者に周知である。（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８を参照のこと）。本明細書で使用されるとき「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスのいずれであれ、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋの塩基対形成によって相補性の核酸とハイブリッド形成することができる天然に存在するまたは合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、及び非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）も含むことができる。特に、核酸は、限定しないで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0031】

本明細書で使用されるとき、「対照」は、正常な対象からの、または脱髄していないもしくは脱髄された組織からの試料である。

【0032】

本明細書で使用されるとき、「過剰発現」は、正常な非脱髄組織で検出される発現よりも多い発現を意味する。例えば、過剰発現される核酸は、正常より約１標準偏差、または正常より約２標準偏差、または正常レベルの発現より約３標準偏差上回って発現されてもよい。したがって、対照レベルの発現を約３標準偏差上回って発現される核酸は過剰発現される核酸である。

【0033】

本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」という用語は、疾患、病的状態、または障害を治癒させる、寛解させる、安定化する、または予防する意図で行う患者の医療管理を指す。この用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病的状態、もしくは障害の改善を具体的に目的とする治療を含むと同時に、原因治療、すなわち、関連疾患、病的状態、もしくは障害の原因の除去を目的とする治療も含む。加えて、この用語は、緩和治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒ではなくて症候の軽減のために考案された治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の発症を最小限に抑えるまたは部分的にもしくは完全に抑制することを目的とする治療；及び、支援治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする別の特別な療法を補助するために採用される治療；及び支援治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする別の特別な療法を補助するために採用される治療を含む。種々の態様では、この用語は、哺乳類（例えば、ヒト）をはじめとする対象の任意の治療を包含し、（ｉ）疾患の素因を有する可能性があるが、疾患であると診断されたことがまだない対象にて疾患が発症するのを防ぐこと；（ｉｉ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発達を抑止すること；または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防すること」という用語は、ある物事が、特に有害作用により発生することを不可能にする、回避する、除去する、未然に防ぐ、停止させる、または妨害することを指す。減少させる、抑制する、または予防するが本明細書で使用されるとき、特に指示されない限り、他の２つの用語の使用も明確に開示されていることを理解すべきである。例えば、「予防する」とは、脱髄性疾患を発症する易罹患性が高い対象が脱髄性疾患を発症する可能性を最小限に抑えることを意味する。

【0035】

本明細書で使用される、用語「参照」、「参照発現」、「参照試料」、「参照値」、「対照」、「対照試料」等は、試料または１以上の微生物の発現レベルの文脈で用いられる場合、参照基準を指し、その際、該参照は、異なる組織（すなわち、同じ組織ではないが複数の組織）間で一定のレベルで発現され、実験条件によって影響を受けず、所定の病態（例えば、脱髄性疾患に罹患していない）の試料におけるレベルを示す。該参照値は、所定の基準値でも所定の基準値の範囲でもよく、無病、または所定の型もしくは重症度の病気を表す。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「診断された」という用語は、当業者、例えば、医師による身体検査を受けており、本明細書で開示されている化合物、組成物、または方法によって診断されるまたは治療されることが可能な状態を有することがわかっていることを意味する。例えば、本明細書で使用されるとき、「脱髄性疾患の障害があると診断された」は、当業者、例えば、医師による検査を受けており、本明細書で開示されている化合物または組成物よって診断されるまたは治療されることが可能な状態を有することがわかっていることを意味する。

【0037】

本明細書で使用されるとき、「微生物」という用語は、微視的な生物（すなわち、肉眼で見るには小さすぎる生き物）を指す。一般に、「微生物」という用語は、さまざまなサイズや特徴を有することができるさまざまな生命体を記載するのに使用される。例えば、微生物は、細菌、古細菌、真菌、原生生物、ウイルス、及び微視的な動物を指すことができる。

【0038】

本明細書で使用されるとき、「微生物捕捉剤」という用語は、少なくとも１つの微生物を（例えば、直接）結合するもしくは捕捉することができる、または表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である微生物特異的抗体を捕捉することができる（例えば、少なくとも１つの微生物を間接的に捕捉するまたは結合する）分子を指す。

【0039】

急性腫瘤形成性ＭＳは、脱髄性疾患の一部の患者が大きな急性病変を呈し、浮腫及び／または画像検査におけるリング状造影に関連することが多い急性の腫瘍様変異型である（Ｋｅｐｅｓ，Ｊ．Ｊ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３，１８－２７，（１９９３）；及びＬｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ，１３１，１７５９－１７７５，（２００８））。この型の炎症性脱髄性疾患は、偽腫瘍性ＭＳ、移行性硬化症、びまん性骨髄破壊性硬化症、及びＭａｒｂｕｒｇ変異型ＭＳとも呼ばれる。Ｋｅｐｅｓ（Ｋｅｐｅｓ，Ｊ．Ｊ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３，１８－２７，（１９９３））による最初の説明は、いくつかのそのような患者はＭＳの発症に進むことを示唆していた。しかしながら、生検で確認されたＣＮＳ炎症性脱髄性疾患の１６８人の患者を対象としたさらに最近のはるかに大規模な試験では、そのような患者の大多数（７９％）は続いて臨床的に明確なＭＳ（Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ，１３１，１７５９－１７７５，（２００８））を発症することが示された。最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）は、視神経炎のようなＭＳと両立し得る単一の発作を指す。ＣＩＳ及び磁気共鳴画像（ＭＲＩ）の病変を伴う患者の６０～８０パーセントは続いてＭＳを発症する一方で、およそ２０～４０パーセントは自己限定型過程を有する（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１，６０２－６１１（２００３）；Ｂｒｅｘ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６，１５８－１６４，（２００２）；及びＯｌｅｋ，Ｍ．ｉｎ ＵｐＴｏＤａｔｅ，（ｅｄ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｓｃａｒａｎｏ）（ＵｐＴｏＤａｔｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，２０１１）。

【0040】

多発性硬化症（ＭＳ）の病理は、Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉ（Ｐｏｐｅｓｃｕ，Ｂ．Ｆ．，Ｐｉｒｋｏ，Ｉ．及びＬｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｃ．Ｆ．Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．），１９，９０１－９２１，（２０１３）：「多発性硬化症（ＭＳ）の病理学的特徴は、プラークまたは病変と呼ばれるＣＮＳ内のミエリン喪失の複数の病巣領域である．．．によって上手くまとめられている。急性活動性ＭＳ病変は、古典的な「マクロファージの海」を形成する病変全体に均一に分布するマクロファージが大量に浸潤した過細胞性脱髄プラークである。これらのマクロファージは、破壊されたミエリン鞘の残遺物を取り込んで分解したことを示す（すなわち、活発な脱髄）、ミエリン残渣を含有する。

【0041】

脱髄の既知の感染性の原因及びＭＳプラークのマクロファージが優勢な病態を含むこれらの要因を考えると、脳実質内の微生物がＭＳの発症または既存のＭＳ疾患の悪化を引き起こし得ることが本明細書で企図される。本明細書で開示されているのは、一次性脱髄脳試料の微生物配列含量が一連の対照におけるものと異なるかどうかを調べた結果である。そのような組織からのＲＮＡ抽出と大規模配列解析の実現可能性が実証された。

【0042】

本明細書で開示されているのは、個々の患者における多発性硬化症の微生物的原因を実証するために使用することができる方法である。最初の工程は、ＭＳの脳病変からＲＮＡ配列決定データを取得し、その結果を一連の対照または参照試料と比較することだった。次に、ＭＳ群で有意に過剰出現している微生物分類群を用いて、ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーのリストを作成した。

【0043】

本明細書で開示されているのはまた、単独で、または個々の患者及びその後の治療の標的における多発性硬化症の微生物的原因を実証するために使用することができる本明細書に記載されている方法と組み合わせて使用することができる方法である。例えば、本明細書で開示されているのは、血液脳関門が損なわれていないことを評価するために使用することができる方法である。いくつかの態様では、前記方法を用いて、多発性硬化症や他の脱髄性疾患に関連し得る血液脳関門の漏出を検出する及び／または修正することができる。いくつかの態様では、前記方法を用いて、本明細書で開示されているＭＳ微生物ファミリーのＭＳ微生物のいくつかに向けられるＭＳ患者のＣＳＦにおける抗体が髄腔内抗体合成を指示するかどうかを決定することができる。

【0044】

本明細書に記載されているのは、一連のアッセイ（例えば、血清学的）で使用することができる一連の微生物試薬である。本明細書で開示されているのは、ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの一部に対して向けられるＭＳ患者のＣＳＦ中の抗体を検出するのに使用することができるアッセイである。ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの例示的なリストを表１、表２及び／または表８と同様に図４及び／または図５にて提供する。本明細書で開示されている方法の結果を用いて、脱髄を発症している（すなわち、新たな発症）または脱髄の悪化（すなわち、再発）を経験しているＭＳ及び関連疾患（例えば、急性散在性脳脊髄炎または視神経脊髄炎）の患者にて抗微生物療法を指図することができる。例えば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｏｐｈｉｌｉａに対するＣＳＦの反応性がある患者は、この嫌気性細菌に対して不活性であると予測されるセフトリアキソンではなく、活性であると予測される静脈内メロペネムで治療されてもよい。

【0045】

本明細書に記載されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーを用いて、脱髄を引き起こしている本明細書で開示されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの１以上を検出するための具体的なＰＣＲ試薬を開発することもできる。例えば、プライマーを開発して、これらのＭＳの原因となる生物を検出するのに使用することができる。ＣＳＦ試料は、特異的な抗菌抗体とオリゴクローナルバンドが出現する前に、その経過の初期段階であり、且つ脱髄を発症している患者から使用することができる。特異的なＰＣＲプライマーを開発し、脳組織、脊髄、ＣＳＦ、または血液において本明細書で開示されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーを検出するのに使用することができる。１回の検査で多数のプライマーセットを多重化することができる。この場合もやはり、早期脱髄患者（または確立されたＭＳの発作を有する患者）のＣＳＦにおける微生物ＤＮＡ（または可能性は低いＲＮＡ）の検出を用いて特定の抗菌治療を指図することができる。

【0046】

本明細書に開示されている方法は、ＭＳの推定される根本的な原因、及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、及び最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）を含むが、これらに限定されないいくつかの関連する脱髄障害を検出し、且つ治療するのに使用することができる。本明細書で開示されている方法の利点は、それらがＣＮＳへの損傷を制限するまたは元に戻すのに役立つことができることである。例えば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｏｐｈｉｌｉａに対するＣＳＦの反応性がある患者は、この嫌気性細菌に対して不活性であると予測されるセフトリアキソンではなく、活性があると予測される静脈内メロペネムで治療されてもよい。現在のＭＳ治療は、治療の選択の根底にある特定の要因がなく、成功または失敗の合理的な期待がない場合、信頼性が低く一貫性がない。急性ＭＳ発作の現在の治療法には、深刻な副作用を有し得る、広く免疫抑制性である戦略（例えば、ステロイド、リツキシマブ）が含まれる。

【0047】

本明細書に記載されているのは、単独で、または一連のアッセイ（例えば、血清学的）で使用することができる方法及び微生物試薬である。本明細書に記載されているのは、本明細書に記載されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーのすべてではないがいくつかに対して向けられる、ＭＳ患者のＣＳＦ中の抗体を検出するために使用することができる方法である。

【0048】

本明細書に記載されているのは、単独で、または一連のアッセイと組み合わせて使用することができる方法である。本明細書に記載されているのは、微生物ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）を決定し、ＥＩの結果を対象のアルブミン指数と比較することを含む方法である。いくつかの態様では、前記方法を用いて、本明細書で開示されているＭＳ微生物ファミリーのＭＳ微生物の１以上に向けられるＭＳ患者のＣＳＦにおける抗体が髄腔内抗体合成を指示するかどうかを判定することができる。さらに、前記方法を用いて、本明細書に記載されている他の検出方法のいずれかを用いて検出されなかった可能性がある、または除外された対象を特定することができる。例えば、微生物ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）を決定し、対象のＥＩの結果を対象のアルブミン指数と比較する開示されている方法を用いて、微生物ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）のみを決定することと比べて脱髄性疾患の対象の特定を改善することができる。

【0049】

本明細書に記載されているアッセイ及び方法を用いて、脱髄を発症している（例えば、新たに発症する）または脱髄の悪化を経験している（例えば、再発する）ＭＳ及び関連疾患（すなわち、ＡＤＥＭ、ＮＭＯ）の患者にて抗菌療法を指図することができる。例えば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｏｐｈｉｌｉａに対するＣＳＦの反応性がある患者は、この嫌気性細菌に対して不活性であると予測されるセフトリアキソンではなく、活性があると予測される静脈内メロペネムで治療することができる。

【0050】

本明細書に記載されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーを用いて、脱髄を引き起こしている本明細書で開示されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの１以上を検出するための特異的なＰＣＲ試薬を開発することもできる。プライマーを開発して、ＭＳの原因となる生物を検出することができる。試薬（例えば、プライマー）は、特異的な抗菌抗体及びオリゴクローナルバンドが現れる前に、その経過の初期段階であり、脱髄を発症している患者のＣＳＦに適用することができる。いくつかの態様では、多数のプライマーセットが単一の検査で多重化される。本明細書で開示されているのは、特定の抗菌治療を指図するのに使用することができる、早期脱髄患者（または確立されたＭＳの発作を有する患者）のＣＳＦにおける微生物ＤＮＡ（または可能性は低いＲＮＡ）の検出の方法である。

【0051】

本明細書に記載されているのは、ＭＳ、及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）及び最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）を含むが、これらに限定されない、いくつかの関連する脱髄障害の推定される根本原因を検出する、及び治療する方法である。

【0052】

本明細書に開示されているのは、本明細書に記載されているＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの１以上に対して向けられる、ＭＳ患者のＣＳＦ中の抗体を検出するための血清学的アッセイである。本明細書で開示されているのは、脱髄を発症している（例えば、新たに発症する）またはその悪化を経験している（例えば、再発する）ＭＳ及び関連疾患（例えば、ＡＤＥＭ、ＮＭＯ）の患者にて抗菌療法を指図する方法である。
表１．微生物の例。

¹ＮＣＢＩ分類に分類されるとおりである。門は細菌及び真菌の微生物について列挙されているが、ウイルスについては列挙されていない。
²ＭｉｃｒｏｂｅＷｉｋｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｃｒｏｂｅｗｉｋｉ．ｋｅｎｙｏｎ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ＭｉｃｒｏｂｅＷｉｋｉ）、命名法に則った原核生物の名前のリスト（ＬＰＳＮ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｎｅｔ）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）、及び他のオンライン情報源によって記載されたとおりである。
³治療薬は、ＰｕｂＭｅｄの記事、微生物のＷｅｂサイト（Ｍｉｃｒｏｂｅｗｉｋｉ等）、ＳａｎｆｏｒｄＧｕｉｄｅのような種々のオンライン情報源を用いて決定した。
表２．微生物の例。

大規模配列決定データに由来するＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリー。属レベルでＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーとしての資格を得るために、ＭＳ群由来の少なくとも１つの検体は、１０以上のＭＡＰＱ値の対照群（２５１の別々の属）より有意に増加した（ｑ＜０．０５）この分類群への読み取りペアマッピングを有した。示されているＭＳ微生物属は、ＭＳ群（３５属）のすべての検体の中で少なくとも１００のマッピングされた読み取りを有していた。

【0053】

方法
本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断する及び／または検出する方法である。本明細書で開示されている方法は、微生物学的診断を行うために有用であることができる。本明細書に記載されている検出方法は、核酸のＰＣＲ増幅を介して直接、または開示されている微生物の１以上を特異的に結合する抗体またはペプチドを使用する直接検出を介して実施することができる。本明細書に記載されている検出方法は、微生物特異的抗体の１以上に特異的な抗体を検出することによっても実施することができる。例えば、本明細書で開示されているのは、１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させることを含む方法であり、その際、１以上の微生物捕捉剤のそれぞれは１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ１以上の微生物特異的抗体は表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である。

【0054】

本明細書で開示されているのはまた、脱髄性疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法、脱髄性疾患の対象を治療する方法、または脱髄性疾患を有すると疑われる対象を治療する方法である。１以上の微生物または１以上の微生物特異的抗体の存在が決定されると、適切な治療を提供するまたは施行することができる。

【0055】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断する及び／または検出する方法であり、その際、本明細書で開示されている方法を用いて抗体の髄腔内産生を判定することができる。本明細書で開示されている方法は、微生物学的診断を行うために有用であることができる。本明細書で開示されている方法はまた、本明細書に記載される他の方法のいずれにおいても特定されなかった脱髄性疾患の対象を特定するのに使用することもできる。本明細書で開示されている方法を用いて血液脳関門が損なわれていないことを判定することができる。本明細書に記載されている検出方法は、対象の微生物ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）を対象のアルブミン指数（ＡＩ）と比較することができる。本明細書で開示されている方法は、開示されている微生物の１以上に結合するまたは特異的に結合する抗体を使用するＥＬＩＳＡを介して実施することができる。例えば、本明細書で開示されているのは、１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合して混合生物試料を生成することを可能にする条件で試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させることを含む方法であり、その際、１以上の微生物捕捉剤のそれぞれは１以上の微生物特異的抗体に特異的であり、且つ１以上の微生物特異的抗体は、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的である。ＥＩは試料（例えば、ＣＳＦまたは脊髄液）における抗体の評価尺度である。いくつかの態様では、ＥＩ値は、損なわれていない血液脳関門を示す正常のＡＩ（例えば、０～９）と比較することができる。アルブミン指数＝ＣＳＦアルブミン（ｍｇ／Ｌ）／血清アルブミン（ｇ／Ｌ）。ＡＩは、血清アルブミン濃度に合わせて調整された、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の指数である。ＡＩはＢＢＢ機能障害で上昇する。例えば、表１、表２及び／または表８のリストから選択される１以上の微生物についての対象のＥＩは、対象のＡＩに対してプロットすることができる。線形回帰分析を実行して、各抗原のＥＩとＢＢＢが損なわれていないこと（アルブミン指数で評価されるような）との関係を示すことができる。線形回帰の直線またはプロット直線を生成し、調べられる各細菌抗原または微生物の「予想されるＥＩ」を提供し、ＭＳ及び他の脱髄性疾患の対象に関連し得る漏出性ＢＢＢを正すのに使用することができる。回帰直線より上の値、特に正常なＡＩ領域内の値（例えば、０～９）は髄腔内抗体合成の可能性（すなわち、脱髄の因果関係）を示す。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法は、単独で、または本明細書に記載されている他の方法のいずれかと組み合わせて使用することができる。

【0056】

診断の方法：本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から生体試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、対象は、脱髄性疾患を有することが疑われ得る、または脱髄性疾患を有するリスクがあり得る。いくつかの態様では、方法は試料にて１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、試料における１以上の微生物は表１、表２、または表８のリストから選択することができる。いくつかの態様では、１以上の微生物の存在は試料にて１以上の抗体の存在を検出することによって間接的に検出することができる。いくつかの態様では、１以上の抗体は試料における１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は表１または表２のリストから選択された１以上の微生物が試料中に存在する場合に、対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。

【0057】

いくつかの態様では、対象にて脱髄性疾患を診断する方法は、対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は微生物特異的抗体を含有すると疑われ得る。いくつかの態様では、方法は試料を１以上の微生物捕捉剤と共にインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤は微生物特異的抗体の１以上に結合することができる。いくつかの態様では、微生物特異的抗体は、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は１以上の微生物特異的抗体が試料中に存在する場合に、対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料を１以上の微生物捕捉剤とインキュベートする工程、及び異なる微生物捕捉剤を用いて試料における１以上の微生物特異的抗体の存在を検出する工程を繰り返すことを含むことができる。いくつかの態様では、さまざまな微生物捕捉剤は試料中の１以上の微生物特異的抗体に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２、または表８に列挙された微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、診断する方法はさらに、試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出し、ＥＬＩＳＡ指数を決定し、ＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、ＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を試料のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上にあることができる。

【0058】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を診断する、且つ治療する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は微生物特異的抗体を含有すると疑われ得る。いくつかの態様では、この方法は試料を１以上の微生物捕捉剤と共にインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤は微生物特異的抗体の１以上に結合することができる。いくつかの態様では、微生物特異的抗体は、表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、１以上の微生物特異的抗体が試料中に存在する場合に対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択される細菌である場合に抗菌剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択されるウイルスである場合に抗ウイルス剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択される真菌である場合に抗真菌剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、または抗真菌剤の組み合わせを対象に投与することを含むことができる。いくつかの態様では、対象にて脱髄性疾患を診断する及び治療する方法はさらに、試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出し、ＥＬＩＳＡ指数を決定し、ＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、血清と比べてＣＳＦにて微生物の１以上に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、ＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、対象のＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べて、ＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上にあることができる。

【0059】

間接的検出の方法：本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を検出する方法である。いくつかの態様では、対象にて脱髄性疾患を検出する方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有することが疑われ得る。いくつかの態様では、方法は、試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させて混合生物試料を生成することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤のそれぞれは１以上の微生物特異的抗体に特異的であることができる。いくつかの態様では、１以上の微生物特異的抗体は表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して、検出可能な複合体を形成することができるような条件下で混合生物試料をインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、この方法は、検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、混合生物試料における表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在は対象にて脱髄性疾患を検出することができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料を接触させる工程、及びさまざまな微生物捕捉剤を用いて混合生物試料をインキュベートする工程を繰り返すことを含むことができる。いくつかの態様では、さまざまな微生物捕捉剤は試料における１以上の微生物特異的抗体に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８に列挙された微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、方法はさらにＥＬＩＳＡ指数を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＬＩＳＡ指数は、アルブミン指数に対して比較するまたはプロットすることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、ＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、対象のＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上にあることができる。

【0060】

本明細書で開示されているのは、対象にて脱髄性疾患を検出し、且つ治療する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有することが疑われ得る。いくつかの態様では、方法は、試料を１以上の微生物捕捉剤と接触させて混合生物試料を生成することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤のそれぞれは１以上の微生物特異的抗体に特異的であることができる。いくつかの態様では、１以上の微生物特異的抗体は表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は、前記１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の少なくとも１つに特異的に結合して、検出可能な複合体を形成することができるような条件下で混合生物試料をインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、この方法は、検出可能な複合体の存在を検出し、それによって、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、混合生物試料における表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在は対象にて脱髄性疾患を検出することができる。いくつかの態様では、方法は、検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択される細菌である場合に抗菌剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択されるウイルスである場合に抗ウイルス剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、検出された１以上の微生物特異的抗体が表１、表２または表８のリストから選択される真菌である場合に抗真菌剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、または抗真菌剤の組み合わせを対象に投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は抗寄生虫剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤または抗真菌剤の組み合わせを対象に投与することを含むことができる。

【0061】

いくつかの態様では、さまざまな微生物捕捉剤は試料における１以上の微生物特異的抗体に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８に列挙された微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、方法はさらに、試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出し、ＥＬＩＳＡ指数を決定し、ＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比はＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、対象のＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べて、ＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上であることができる。

【0062】

本明細書で開示されているのはまた、対象にて脱髄性疾患を診断する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、対象は、脱髄性疾患を有することが疑われ得る、または脱髄性疾患を有するリスクがあり得る。いくつかの態様では、方法は試料にて１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物は、表１、表２、または表８のリストから選択することができる。いくつかの態様では、方法は表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物が試料に存在する場合に対象を脱髄性疾患であると診断することを含むことができる。

【0063】

本明細書で開示されているのは、試料にて１以上の抗体を検出する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な微生物特異的抗体を含有することが疑われ得る。いくつかの態様では、方法は試料を１以上の微生物捕捉剤とインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤は微生物特異的抗体の１以上に結合することができる。いくつかの態様では、１以上の微生物特異的抗体は表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的であることができる。いくつかの態様では、方法は試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物特異的抗体の存在の検出は、脱髄性疾患を示すことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８に列挙された微生物の１以上に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、方法はさらにＥＬＩＳＡ指数を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出し、ＥＬＩＳＡ指数を決定し、ＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、血清と比べてＣＳＦにて１以上の微生物に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、ＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、対象のＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べて、ＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上にあることができる。

【0064】

直接検出の方法：本明細書で開示されているのは、試料にて１以上の微生物を検出する方法である。いくつかの態様では、方法は対象から試料を得ることを含むことができる。いくつかの態様では、試料は表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物を含有することが疑われ得る。いくつかの態様では、方法は試料を１以上の微生物捕捉剤と共にインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物捕捉剤は表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物に結合することができる。いくつかの態様では、方法は試料にて表１、表２、または表８のリストから選択される１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８に列挙された１以上の微生物の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における微生物の１以上の量を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の微生物の存在を検出することは、脱髄性疾患を示す。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、方法はさらにＥＬＩＳＡ指数を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はＥＬＩＳＡ指数をアルブミン指数と比較することができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出し、ＥＬＩＳＡ指数を決定し、ＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、ＥＩ比を決定することができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、血清と比べてＣＳＦにて微生物の１以上に対する微生物特異的抗体が多いことを示す、＞１．０であることができる。いくつかの態様では、ＥＩ比は、ＣＳＦよりも血清にて微生物特異的抗体が多いことを示す、＜１．０であることができる。いくつかの態様では、方法はさらに、１以上の微生物についてＥＬＩＳＡ指数を決定し、線形回帰分析を実行し、プロット直線を生成することによってＥＬＩＳＡ指数を対象のＡＩと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、対象のＡＩは９以下であることができ、ＥＬＩＳＡ指数は、１以上の微生物についての血清と比べて、ＣＳＦにて１以上の微生物特異的抗体を示すプロット直線より上にあることができる。

【0065】

組織試料を得ること：対象の脳または脊髄組織、血液、及びＣＳＦの試料の抽出及び採取の手順は、当該技術分野で知られている方法によって行うことができる。凍結組織検体も使用することができる。上記のように、組織試料はコア針生検を用いて対象から得ることができる。該試料は全細胞または細胞小器官であることができる。細胞は、組織を削り取ること、組織試料を処理して個々の細胞を遊離させること、または体液から細胞を単離することによって採取することができる。試料は、新鮮組織、乾燥組織、培養細胞または組織であることができる。試料は、未固定である、または固定されることができる。本明細書に記載されている方法を用いて、脳または脊髄の任意の部分を得て、評価することができる。

【0066】

本明細書で開示されているのは、試料内の微生物を検出する方法である。当業者によって理解されるように、試料溶液は、体液（血液、生検組織、ＣＳＦを含むがこれらに限定されない）を含むが、これらに限定されない、任意の数の供給源を含んでもよい。試料は１ミリリットル未満の範囲であることができ、さらに細菌濃度の範囲であることができる。さらに、試料は血液、脳組織、脊髄組織、またはＣＳＦに存在することができる。

【0067】

本明細書で開示されている方法のいずれかでは、対象は脱髄性疾患を有すると疑われ得る。本明細書で開示されている方法のいずれかでは、対象は脱髄性疾患を有するリスクがあり得る。いくつかの態様では、脱髄性疾患は、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、または最初のエピソードからなる症候群であり得る。いくつかの態様では、この対象はヒトであることができる。いくつかの態様では、試料は脳組織、脳脊髄液、脊髄組織または血液であることができる。

【0068】

本明細書で開示されている方法のいずれかでは、方法はさらに、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、またはそれらの組み合わせを対象に投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は抗寄生虫剤を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤または抗真菌剤の組み合わせを対象に投与することを含むことができる。いくつかの態様では、検出された１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２または表８のリストから選択される細菌であり得る場合、抗菌剤を対象に投与することができる。いくつかの態様では、検出された１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２または表８のリストから選択されたウイルスである場合、抗ウイルス剤を対象に投与することができる。いくつかの態様では、検出された１以上の微生物特異的抗体または微生物が表１、表２または表８のリストから選択される真菌である場合、抗真菌剤を対象に投与することができる。

【0069】

本明細書で開示されている方法のいずれかでは、方法はさらに、試料における１以上の核酸配列を増幅することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の核酸配列は表１、表２または表８の微生物のうちの１以上に対応する。いくつかの態様では、１以上の核酸配列は、１以上の核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を用いて増幅することができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８の微生物の１以上に対応する１以上の核酸配列の発現が、対照における表１、表２または表８の微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はハイブリッド形成反応によって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、ハイブリッド形成反応はさらに、試料を１以上のプライマーセットにハイブリッド形成させることを含むことができる。いくつかの態様では、ハイブリッド形成反応はポリメラーゼ連鎖反応であることができる。いくつかの態様では、検出する工程は発現された配列タグによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程は局在化によって検出することを含むことができる。

【0070】

いくつかの態様では、微生物捕捉剤は抗体、ペプチド、タンパク質またはプローブであることができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されている１以上の微生物（例えば、表１、表２及び表８を参照のこと）を用いて、対象（例えば、ＭＳを有する患者またはＭＳを有することが疑われる患者）のＣＳＦ由来の抗体の１以上に結合することができる。いくつかの態様では、細菌抗原は０．５のＯＤで超音波処理することができ、シングルウェルプレートまたはマルチウェルプレートの底にコーティングすることができる。いくつかの態様では、細菌抗原はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＮｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａに由来し得る。

【0071】

本明細書に記載されている方法またはアッセイまたは試験のいずれかでは、陽性対照、陰性対照、またはその双方をさらに含めることができる。陽性対照の例には、市販のＣＳＦ製剤（Ｒａｎｄｏｘ）及び抗Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製品＃ＰＡ１－７３１１６）が挙げられるが、これらに限定されない。陰性対照の例には、ＰＢＳ及びＩｇＧを枯渇させたＲａｎｄｏｘ ＣＳＦ（すべての抗体を欠いている）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0072】

いくつかの態様では、１以上の検出方法を用いて、本明細書で開示されている微生物の１以上に対する特異的なＣＳＦ抗体の結合を実証することができる。いくつかの態様では、ＭＳまたは他の自己免疫疾患を患っている、またはそれを有する疑いのある対象にて１以上の微生物を調べることができる（及び／または検出することができる）。いくつかの態様では、検出の方法は間接的方法であることができる。いくつかの態様では、間接的方法はＥＬＩＳＡであることができる。いくつかの態様では、ＥＬＩＳＡを使用して２以上の微生物を調べることができる（及び／または検出することができる）。

【0073】

治療の方法：本明細書で開示されているのは、多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳ関連疾患の患者を治療する方法である。いくつかの態様では、方法は抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤またはそれらの組み合わせを患者に投与することを含むことができる。いくつかの態様では、患者は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、またはそれらの組み合わせを必要としていると特定することができる。いくつかの態様では、患者は、微生物特異的抗体を含有すると疑われる試料を患者から得ることと；１以上の微生物捕捉剤が微生物特異的抗体の１以上に結合し、且つ微生物特異的抗体が表１、表２または表８リストから選択される１以上の微生物に特異的である、１以上の微生物捕捉剤と試料をインキュベートすることと；試料中にて１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することとによって特定することができる。いくつかの態様では、抗菌剤は、メロペネムまたはセフトリアキソンであることができる。いくつかの態様では、ＭＳ関連疾患は、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、または最初のエピソードからなる症候群であることができる。いくつかの態様では、検出する工程はマイクロアレイによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、検出される１以上の微生物はＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属に由来し得る。いくつかの態様では、試料は脳組織、脳脊髄液、脊髄組織または血液であることができる。

【0074】

いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２または表８のリストから選択される１以上の微生物に特異的な１以上の微生物特異的抗体の存在を検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における微生物特異的抗体の１以上の量を決定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法はさらに、試料における１以上の核酸配列を増幅することを含むことができる。いくつかの態様では、１以上の核酸配列は表１、表２、または表８の微生物の１以上に対応することができる。いくつかの態様では、１以上の核酸配列は、１以上の核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を用いて増幅することができる。いくつかの態様では、方法はさらに、表１、表２、または表８の微生物の１以上に対応する１以上の核酸配列の発現が、対照における表１、表２または表８の微生物の同じ１以上の核酸配列の発現レベルと比べて過剰発現しているかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はハイブリッド形成反応によって検出することを含むことができる。いくつかの態様では、ハイブリッド形成反応はさらに、試料を１以上のプライマーセットとハイブリッド形成させることを含むことができる。いくつかの態様では、検出する工程はポリメラーゼ連鎖反応によって検出することを含むことができる。

【0075】

検出の方法：本明細書で開示されている１以上の微生物または微生物特異的抗体の存在または非存在または発現レベルは、直接的に（例えば、免疫アッセイ、質量分光分析）または間接的に（例えば、１以上の微生物に特異的である１以上の抗体の存在または非存在；タンパク質またはペプチドのｍＲＮＡ発現を決定すること）決定することができる。質量分光分析の例には、ＥＩ、ＣＩ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩのようなイオン化源、及びＱｕａｄ、イオントラップ、ＴＯＦ、ＦＴまたはそれらの組み合わせのような分析、分光分析、同位体比質量分分光析（ＩＲＭＳ）、熱イオン化質量分光分析（ＴＩＭＳ）、スパーク光源質量分光分析、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、またはＳＲＭが挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術のいずれかを予備分画または集積法と組み合わせて行うことができる。免疫アッセイの例には、免疫ブロット、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射性免疫アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。免疫アッセイ法は、検出のために抗体を使用し、抗原のレベルの測定は当該技術分野で既知である。抗体は、スティック、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、またはアレイのような固体支持体に不動化することができる。

【0076】

本明細書で開示されている１以上の微生物または微生物特異的抗体の存在または非存在または発現レベルはまた、組織試料にて１以上の微生物に特異的である１以上の抗体の存在または非存在を決定することによって間接的に決定することもできる。ＲＮＡ発現の方法には、細胞のｍＲＮＡの抽出及び遺伝子の全部または一部をコードする転写産物とハイブリッド形成する標識されたプローブを用いたノーザンブロット、遺伝子特異的プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いたｍＲＮＡの増幅と、それに続く種々の方法による遺伝子産物の定量的検出；細胞からのＲＮＡの抽出（標識が続き、その後、当該遺伝子をコードするｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを探索するのに使用される）；原位置ハイブリッド形成；ならびにレポーター遺伝子の検出が挙げられるが、それらに限定されない。

【0077】

タンパク質の発現レベルを測定する方法には、ウェスタンブロット、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及びフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。方法はまた、酵素活性または他のタンパク質パートナーとの相互作用を含むが、これらに限定されない特定のタンパク質特性に基づくアッセイも含むことができる。結合アッセイもまた使用することができ、当該技術分野では周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて、２つのタンパク質間の複合体の結合定数を測定することができる。１つのタンパク質から別のタンパク質への結合を測定または検出するために適切な他のアッセイとしては、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ及び放射性免疫アッセイが挙げられる。分光学的変化を観察することによる結合の測定が用いられる場合もあれば、当該タンパク質の光学特性が、蛍光、ＵＶ吸収、円偏光二色性、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定される場合もある。別の方法として、特定の抗体を用いた免疫アッセイを用いて、腫瘍細胞における特定のタンパク質の発現を検出することができる。

【0078】

開示されている方法はまた、１以上の微生物の特定（またはそのような特定の欠如）に基づく、所望の治療の感受性の定量化及び／または適性も提供する。前記情報は治療上の決定につながることができる。

【0079】

タンパク質アレイ：本明細書で開示されているのは、ポリペプチドまたはタンパク質のアレイである。いくつかの態様では、タンパク質アレイは、本明細書で開示されている微生物パネルの構成要素に特異的な抗体、アプタマー、及び他の同族の結合リガンドを含むプローブを含むことができる。タンパク質アレイ及びタンパク質アレイを構築する方法は当業者に周知である。

【0080】

好適であることができるタンパク質アレイの１つの型は不動化された「捕捉抗体」を使用する。ポリペプチドは、処理された表面（例えば、アミノシラン）によって、またはビオチン・ストレプトアビジン結合を介して固体基板（例えば、ガラス）に結合される。次にアレイを、時間、緩衝液成分、及び認識特異性に依存する方法で捕捉抗体に結合することができるプローブを含有する溶液と共にインキュベートする。次いで、プローブは、前もって標識されているのであれば直接視覚化することができ、または二次標識試薬（別の抗体等）に結合させることができる。可視化される捕捉抗体に結合するプローブの量は、利用する標識方法に左右され得る；一般に、標識の発光を励起し、及び検出するのに適切であるフィルターセットを使用するＣＣＤイメージャーまたはレーザースキャナーを使用することができる。イメージャーは、検出された光子の量を、市販のソフトウェアパッケージを用いて分析することができる電子信号（多くの場合、８ビットまたは１６ビットの尺度）に変換する。

【0081】

アレイの基板は、有機または無機、生物学的または非生物学的、またはこれらの材料の任意の組み合わせであることができる。基板は透明または半透明であることができる。アレイにおける基板として使用するのに好適な材料の例には、シリコン、シリカ、石英、ガラス、制御細孔ガラス、炭素、アルミナ、二酸化チタン、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ゼオライト、及びガリウムヒ素；ならびに金、白金、アルミニウム、銅、チタン、及びそれらの合金を含む金属が挙げられるが、これらに限定されない。セラミック及びポリマーも基板として使用することができる。好適なポリマーには、ポリスチレン；ポリ（テトラ）フルオロエチレン；（ポリ）二フッ化ビニリデン；ポリカーボネート；ポリメタクリル酸メチル；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリ（エーテルエーテル）ケトン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）；ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；コブロックポリマー；及びＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。フォトレジスト、重合したＬａｎｇｍｕｉｒ－Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜、及びＬＩＧＡ構造も基板として役立つことができる。

【0082】

アレイはさらに、基板上に形成することができる、または基板に塗布することができるコーティングを含むことができる。基板は、物理蒸着（ＰＶＤ）またはプラズマ化学気相堆積（ＰＥＣＶＤ）のいずれかに基づく薄膜技術を使用することによるコーティングによって修飾することができる。あるいは、プラズマ照射を用いて基板を直接活性化することができる。例えば、プラズマエッチング手順を用いて、ポリマー表面（すなわち、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒド等のような極性官能基を露出させるためのポリスチレンまたはポリエチレン）を酸化することができる。

【0083】

コーティングは金属膜を含むことができる。金属膜の例には、アルミニウム、クロム、チタン、ニッケルステンレス鋼亜鉛、鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、カドミウム、タングステン、コバルト、及びそれらの合金または酸化物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、金属膜は貴金属膜であることができる。コーティングに使用することができる貴金属の例には、金、白金、銀、銅、及びパラジウムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、コーティングは金または金合金を含む。電子ビーム蒸着を用いて、表面に金の薄いコーティングを提供することができる。いくつかの態様では、金属膜は約５０ｎｍから約５００ｎｍの厚さであることができる。

【0084】

あるいは、コーティングは、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、水素化ケイ素、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、アルミナ、ガラス、ヒドロキシル化表面、及びポリマーであることができる。

【0085】

本明細書に記載されているアレイは、指定可能な要素の集合を含むことができる。マイクロタイタープレート内に含有されるアレイ、または各要素が異なるＸ座標とＹ座標に存在することができる平面に印刷されるアレイのようなそのような要素は空間的に指定可能であることができる。あるいは、要素は、タグ、ビーズ、ナノ粒子、または物理的特性に基づいて指定可能であることができる。マイクロアレイは、当業者に既知の方法に従って調製することができる。本明細書で使用されるとき「アレイ」という用語は、複数の指定可能な要素を伴った任意の生物学的アッセイを指すことができる。いくつかの態様では、指定可能な要素は、ポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）または核酸プローブであることができる。本明細書で使用されるとき、「要素」は、本明細書で開示されている１以上の微生物によって、本明細書で開示されている微生物のいずれかに関係するまたは関連するような、ポリペプチド断片またはそのようなポリペプチドをコードする転写物によって結合され得る任意のプローブ（ポリペプチドまたは核酸に基づく）を指す。分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質、グリコシル化分子、炭水化物、リン酸化修飾を伴うポリペプチド、及びシトルリン修飾を伴うポリペプチド、アプタマー、酸化分子、及び他の分子であることができるが、これらに限定されない。

【0086】

本明細書に記載されている要素について、「位置指定可能性」は、場所、位置、タグ、切断可能なタグまたはマーカー、識別子、スペクトル特性、電気泳動特性、または要素の特定を可能にする他の物理的特性を指す。コーディングとしても知られる位置指定可能性の例は、分子の位置が固定され、その位置が独自性と相関している空間位置指定可能性である。この種の空間アレイは一般に、平面基板上に合成するまたはスポット形成することができ、例えば、マイクロアレイを生成し、その際、多数の異なる分子が小さな領域に密に配置される（例えば、ｃｍ２あたり少なくとも約４００の異なる配列を含み、ｃｍ²あたり１０００の配列、またはｃｍ²あたり５０００以上もの配列であることができる）。プレート内のウェルがそれぞれ別個のプローブを含有する、さらに密度の低いアレイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのプレート）は、プレートあたり約９６配列から、ｃｍ²あたり最大約１００配列まで、マイクロアレイの密度までを含むことができる。他の空間アレイは光ファイバーを利用しており、その際、異なるプローブをファイバーに結合することができ、それを結合と分析のために束状構造に形成することができる。ポリペプチドの空間アレイの製造及び使用のための方法は当該技術分野で既知である。

【0087】

この種の空間コーディングアレイの代替は、分子「タグ」の使用であり、その際、標的プローブを検出可能な標識またはタグに連結することができ、それはプローブの配列に関するコード化された情報を提供することができる。これらのタグは要素から切断され、その後検出されて要素を特定することができる。いくつかの態様では、プローブのセットは、コード化されたビーズのセットに合成されるまたは付着されることができ、その際、各ビーズは別個のプローブに連結することができ、且つビーズは、付着されたプローブの特定を可能にする方法でコード化することができる。この種の「タグアレイ」では、結合の検出にフローサイトメトリーを使用することができる。例えば、蛍光コーディングを有するミクロスフェアは、特定のミクロスフェアを特定することができる。プローブは、「色分けされた」対象物に共有結合させることができる。標識された標的ポリペプチドはフローサイトメトリーによって検出することができ、ミクロスフェア上のコーディングを用いて、結合したプローブ（例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合断片、またはリガンド）を特定することができる。

【0088】

いくつかの態様では、アレイは、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその抗原結合断片）アレイであることができる。本明細書で使用されるとき、「免疫グロブリンアレイ」は、試料内に含有されるポリペプチドの特定を可能にする方法で配置された標的ポリペプチドに結合することができる、空間的に分離された別個の分子実体のセットを指す。いくつかの態様では、アレイは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質、グリコシル化分子、リン酸化修飾を伴うポリペプチド、及びシトルリン修飾を伴うポリペプチド、アプタマー、及び他の分子のうちの１以上を含むことができる。

【0089】

組成物
抗体：本明細書で開示されているのは、本明細書で開示されている微生物または微生物特異的抗体の１以上に特異的に結合することができる、単離された抗体、抗体断片及びそれらの抗原結合断片である。任意で、単離された抗体、抗体断片、またはそれらの抗原結合断片は中和抗体であることができる。

【0090】

本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は広い意味で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を含む。損なわれていない免疫グロブリン分子に加えて、本明細書で開示されているのはまた、それら免疫グロブリン分子の抗体断片またはポリマー、及び本明細書で開示されているポリペプチドと相互作用するそれらの能力について選択される限り、免疫グロブリン分子またはその断片のヒト型またはヒト化型である。「抗体断片」は完全な抗体の一部である。完全抗体は２本の完全な軽鎖と２本の完全な重鎖を有する抗体を指す。抗体断片は１以上の鎖の全部または一部を欠いている。抗体断片の例には半抗体及び半抗体の断片が挙げられるが、これらに限定されない。半抗体は単一の軽鎖と単一の重鎖で構成される。２本の軽鎖及び２本の重鎖を有する抗体または抗体断片を還元することによって半抗体及び半抗体断片を生成することができる。そのような抗体断片は還元抗体と呼ばれる。還元抗体は露出した反応性のスルフヒドリル基を有する。これらのスルフヒドリル基は、反応性化学基または生体分子の抗体断片へのカップリングとして使用することができる。好ましい半抗体断片はＦ（ａｂ）である。抗体または抗体断片のヒンジ領域は軽鎖が終了し、重鎖が続く領域である。

【0091】

本明細書で開示されている方法にて使用するための抗体断片は、抗原（例えば、本明細書に記載されている微生物特異的抗体、または微生物の１以上）に結合することができる。いくつかの態様では、抗体断片は抗原に特異的であることができる。抗体または抗体断片は、他のエピトープよりも１つのエピトープに有意に高い親和性で結合するならば、抗原に特異的である。抗原は、抗体断片が結合することができる任意の分子、化合物、組成物、またはその一部であることができる。例えば、抗原は本明細書に記載されている微生物特異的抗体である、または微生物の１以上であることができる。分析物は対象とする任意の分子、化合物または組成物であることができる。抗体または抗体断片は、本明細書に記載されている試験管内アッセイを用いて、または類似の方法によってそれらの所望の活性について調べることができる。

【0092】

本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在してもよい天然に存在する考えられる変異を除いて同一である。開示されているのはまた、重鎖または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である一方で、鎖（複数可）の残りは別の種に由来するまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の拮抗活性を示す限りそのような抗体の断片である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照のこと）。

【0093】

モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。例えば、開示されているモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物が通常、免疫剤で免疫付与され、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を導き出す。

【0094】

モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）に記載されたもののような組み換えＤＮＡ法により製造されてもよい。開示されているモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離し、且つ配列決定することができる。抗体または活性がある抗体断片のライブラリーはまた、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらの米国特許第５，８０４，４４０号及びＢａｒｂａｓらの米国特許第６，０９６，４４１号に記載されているように、ファージディスプレイ技術を用いて生成し、スクリーニングすることもできる。

【0095】

試験管内の方法も一価抗体を調製するのに好適である。その断片、例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または他の抗原結合部分を生成するための抗体の消化は当該技術分野で既知の日常的技法を用いて達成することができる。例えば、消化はパパインを用いて行うことができる。パパイン消化の例は１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８、及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されており、その内容は、一価抗体を調製するための抗体のパパイン消化の教示について参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。抗体のパパイン消化は通常、それぞれが単一の抗原結合部位を持つＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、且つ依然として抗原を架橋することができる断片が得られる。

【0096】

抗体または抗体断片の活性が修飾されていない抗体または抗体断片と比較して有意に変化または障害されていないという条件で、断片は、他の配列に結合されるか否かに関わらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択される修飾を含むこともできる。これらの修飾は、いくつかの追加の特性、例えば、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去／付加すること、その生物寿命を増加させること、その分泌特性を変えること等を提供することができる。いずれの場合も、抗体または抗体断片は、その同族抗原への特異的結合のような生物活性特性を持たなければならない。抗体または抗体断片の機能的領域または活性領域は、タンパク質の特定領域の突然変異誘発と、それに続く発現及び発現したポリペプチドの検査によって特定されてもよい。そのような方法は、当該技術分野における熟練実践者には容易に明らかであり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８－３５４，１９９２）。

【0097】

本明細書で使用されるとき、「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語はまた、ヒト抗体またはヒト化抗体を指すこともできる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて自然に抗原性であり、したがって、ヒトに投与された場合、望ましくない免疫応答を引き起こし得る。したがって、方法におけるヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を減らすのに役立つ。

【0098】

ヒト抗体は任意の技術を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体産生のための技術の例には、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６：９５，１９９１）によって記載されたものが挙げられる。ヒト抗体（及びその断片）は、ファージディスプレイライブラリーを用いて生成することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。

【0099】

ヒト抗体はトランスジェニック動物から入手することもできる。例えば、免疫付与に応答して、ヒト抗体の完全なレパトアを産生することができるトランスジェニック変異マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１－２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５，２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと）。具体的には、これらのキメラマウス及び生殖細胞系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生の完全な抑制を生じ、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子アレイのそのような生殖系列変異マウスへの導入の成功は、抗原負荷の際にヒト抗体の産生を生じる。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載されているように、Ｅｎｖ－ＣＤ４－共受容体複合体を用いて選択される。

【0100】

任意で、ヒト抗体はヒトＢ細胞のエプスタインバーウイルス形質転換のための方法を用いてメモリーＢ細胞から作製することができる。（例えば、メモリーＢ細胞からヒトモノクローナル抗体を作製する方法を教示するために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＴｒｉａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ，ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４，Ａｕｇ；１０（８）：８７１－５．（２００４）を参照のこと）。要するに、自然感染を生き延びた対象由来のメモリーＢ細胞は、照射された単核細胞とメモリーＢ細胞のポリクローナル活性化因子として作用するＣｐＧオリゴヌクレオチドとの存在下で単離され、ＥＢＶによって不死化される。メモリーＢ細胞を培養し、特異的抗体の存在について分析する。次に、所望の特異性の抗体を産生する培養物由来のＥＢＶ－Ｂ細胞を、照射された単核細胞の存在下で限界希釈することによってクローン化し、クローニング効率を高めるためにＣｐＧ２００６を添加して培養する。ＥＢＶ－Ｂ細胞の培養後、モノクローナル抗体を単離することができる。そのような方法は、（１）生涯にわたって安定であり、末梢血から容易に単離することができるメモリーＢリンパ球の不死化によって産生される抗体、及び（２）自然感染を生き延びた感作された天然宿主から単離された抗体を提供するので、異なる感受性を示すので異なる免疫応答を示し得る実験動物の免疫付与の必要性を排除する。

【0101】

抗体のヒト化技術は一般に、抗体分子の１以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組み換えＤＮＡ技術の使用を伴う。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含有するキメラの抗体または抗体鎖（またはその断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、ＦａＢ’、または抗体の他の抗原結合部分）である。

【0102】

ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定のレベルの特異性及び親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１以上のＣＤＲ由来の残基で置き換える。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワークの配列にも見いだされない残基も含有してもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。実際に、ヒト化抗体は通常、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含有する（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２））。

【0103】

非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同試験者（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８））の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列の代わりに齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲの配列を使うことによって生成することができる。ヒト化抗体を製造するために使用することができる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５、９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．）、及び米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．）にも記載されている。本明細書で開示されている抗体も対象に投与することができる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。本明細書で開示されているポリペプチドに対する広範に中和する抗体及び抗体断片はまた、抗体または抗体断片をコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として対象または対象に投与することができるので、対象自身の細胞が核酸を取り込み、コードされた抗体または抗体断片を産生し、分泌する。

【0104】

キット
いくつかの態様では、本明細書で開示されている１以上の微生物の存在または発現を検出する、増幅するまたは測定することができる１以上のプローブまたはプライマーを含むキットが開示されている。開示されているのはまた、本明細書で開示されている微生物捕捉剤、微生物または微生物特異的抗体のうちの１以上を含むキットである。

【0105】

本明細書で開示されているのは、本明細書に記載されている微生物の１以上とハイブリッド形成するまたは結合することができる１以上のプライマー、プローブ、ポリペプチド、または抗体を含む固体支持体である。固体支持体は、分析物及び分析物結合分子のような分子を関連付けることができる固体状態の基板または支持体である。分析物（例えば、ナノ粒子やタンパク質の石灰化）は、直接または間接的に固体支持体と関連付けることができる。例えば、分析物は固体支持体に直接不動化することができる。分析物捕捉剤（例えば、捕捉化合物）もまた、固体支持体上に不動化することができる。

【0106】

上述のように、当業者は、本明細書で開示されている１以上の微生物または微生物特異的抗体（タンパク質または核酸）の存在または発現レベルを任意の数の方法で決定することができる。試料内の生体マーカーのＲＮＡ産物のレベルを検出するまたは定量するために、マイクロアレイのようなアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット分析を使用することができる。したがって、いくつかの態様では、微生物の１以上の発現レベルは、アレイ、マイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイまたはノーザンブロット分析を用いて決定することができる。

【0107】

アレイは固体支持体の形態である。アレイ検出器も、複数の異なる捕捉化合物または検出化合物がアレイ状、グリッド状または他の組織化されたパターンで結合している固体支持体の形態である。

【0108】

固体支持体で用いる固体状態の基板には、例えば、分子が結合することができる任意の固体物質を挙げることができる。そのような物質の例には、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。固体状態の基板は、薄膜、膜、ボトル、ディッシュ、繊維、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子またはそれらの組み合わせを含む任意の有用な形態を有することができる。固体状態の基板及び固体支持体は、多孔性であることができ、または非多孔性であることができる。固体状態の基板の例は、マイクロタイターディッシュ（例えば、標準的な９６ウェル型）である。マルチウェルスライドグラスも使用することができる。例えば、ウェルごとに１つのアレイを含有するものを使用し、アッセイの再現性の卓越した制御、向上したスループットと試料処理、及び自動化が容易さを可能にすることができる。

【0109】

異なる化合物をセットとして一緒に使用することができる。セットは、別々の反応で別々に使用される、またはアレイに不動化される化合物（例えば、微生物捕捉剤または微生物特異的抗体）のすべてまたはサブセットの混合物として使用することができる。別々にまたは混合物として使用される化合物は、例えば、固体支持体との会合または固体支持体上での不動化を介して物理的に分離することができる。アレイは、アレイ上の特定されたまたは事前に定義された位置に不動化された複数の化合物を含むことができる。アレイ上の事前に定義された各場所は一般に、１種類の成分を有することができる（すなわち、その場所にあるすべての成分は同じである）。各場所は成分の複数のコピーを有することができる。アレイにおける異なる成分の空間的分離は、本明細書で開示されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドの別個の検出及び同定を可能にする。

【0110】

所与のアレイが単一のユニットまたは構造であることは必要とされない。化合物のセットは、任意の数の固体支持体に分配することができる。例えば、各化合物は、別個の反応の試験管もしくは容器、または別個のビーズもしくは微粒子に不動化することができる。遺伝子発現パネルまたはアレイまたは診断装置の開示されている方法及び使用のさまざまな態様は、固体支持体上に不動化されたさまざまな成分（例えば、さまざまなタンパク質に特異的なさまざまな化合物）と共に実施することができる。

【0111】

一部の固体支持体は、固体状態の基板に付着させた抗体のような捕捉化合物を有することができる。そのような捕捉化合物は、石灰化ナノ粒子または石灰化ナノ粒子上のタンパク質に特異的であることができる。次に、捕捉された石灰化したナノ粒子またはタンパク質は、抗体のような第２の検出化合物の結合によって検出することができる。検出化合物は、石灰化ナノ粒子上の同じタンパク質または異なるタンパク質に特異的であることができる。

【0112】

核酸、ペプチドまたは抗体（及び他のタンパク質）を固体状態の基板に不動化する方法は十分に確立されている。不動化は、例えば、標準的な不動化の化学的性質を用いて、アミノ化表面、カルボキシル化表面、またはヒドロキシル化表面に付着させることによって達成することができる。付着剤の例には、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジンビオチン、光架橋剤、エポキシド、マレイミド、及びＮ－［ｙ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、及びヘテロ２官能性架橋剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、抗体の遊離アミノ基を固体状態の基板内に存在する反応性側基に化学的に架橋することによって基板に結合させることができる。抗体は、例えば、架橋剤としてそれぞれグルタルアルデヒド、カルボジイミド、またはＧＭＢＳを用いて、遊離のアミノ基、カルボキシル基、またはイオウ基を含有する基板に化学的に架橋することができる。この方法では、遊離抗体を含有する水溶液をグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固体状態の基板とインキュベートすることができる。

【0113】

抗体または他のタンパク質を固体状態の基板に付着させる方法は、基板をアミノシランまたはチオールシランで官能化し、次いで官能化された基板をスベリン酸ビス－スルホ－スクシンイミジル（ＢＳ３）のようなホモ２官能性架橋剤またはＧＭＢＳのようなヘテロ２官能性架橋剤で活性化することである。ＧＭＢＳとの架橋については、メルカプトプロピルトリメトキシシランの溶液（９５％エタノールｐＨ５．５中で１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）に１時間浸漬することと、９５％エタノールですすぐことと、１２０℃で４時間加熱することとによってガラス基板を化学的に官能化することができる。チオール誘導体化スライドは、１％ジメチルホルムアミド、９９％エタノールにおけるＧＭＢＳの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液に室温で１時間浸漬することによって活性化することができる。抗体またはタンパク質は活性化された基板に直接加えることができ、それを２％ウシ血清アルブミンのような薬剤を含有する溶液でブロックし、風乾することができる。他の標準的な不動化の化学は当業者によって知られている。

【0114】

固体支持体に不動化された各成分（例えば、抗体）は、固体支持体の異なる事前定義された領域に配置することができる。異なる事前定義された領域のそれぞれは互いに物理的に分離することができる。固体支持体の異なる事前定義された領域間の距離は固定することができ、または可変であることができる。例えば、アレイでは、各成分を互いに固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに関連付けられた成分は固定した空間関係にはないであろう。複数の固体支持ユニット（例えば、複数のビーズ）の使用は変動する距離を生じることができる。

【0115】

成分は、任意の密度で固体支持体に会合するまたは不動化することができる。成分は、１立方センチメートルあたり４００を超えるさまざまな成分の密度で固体支持体に不動化することができる。成分のアレイは任意の数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体に不動化された少なくとも１，０００のさまざまな成分、固体支持体に不動化された少なくとも１０，０００のさまざまな成分、固体支持体に不動化された少なくとも１００，０００のさまざまな成分、または固体支持体に不動化された少なくとも１，０００，０００のさまざまな成分を有することができる。

【0116】

さらに、本明細書に記載されている微生物はまた、髄鞘形成不全疾患に対する易罹患性またはその存在もしくは進行のためのマーカー（すなわち、生体マーカー）として使用することもできる。本明細書に記載されている方法及びアッセイは経時的に実施することができ、マーカーのレベルの変化を評価することができる。例えば、アッセイは、６ヵ月から１年の期間２４～７２時間ごとに実行することができ、その後、必要に応じて実行することができる。アッセイは、治療プロトコールの前に、最中に、または後で完了することもできる。全体で、本明細書で開示されている微生物または微生物特異的抗体は、脱髄性疾患の個人のリスクまたは進行をプロファイリングするために使用することができる。この文脈内で使用されるとき、「差次的に発現される」または「差次的発現」という用語は、生体マーカーの生成物（例えば、ＲＮＡまたは遺伝子産物）の発現レベルを測定することによってアッセイすることができる、本明細書で開示されている生体マーカーの発現レベルの差異、例えば、生体マーカーの発現されたメッセンジャーＲＮＡ転写物もしくはその一部、または発現されたタンパク質のレベルの差異を指す。いくつかの態様では、この差異は有意に異なる。

【0117】

感度を改善するために、本明細書で開示されている１を超える微生物を所与の試料内でアッセイすることができる。本明細書で提供されているさまざまなタンパク質、抗体、核酸に特異的な結合剤は、単一のアッセイ内で組み合わせることができる。さらに、複数のプライマーまたはプローブを同時に使用することができる。そのようなアッセイを支援するために、特定の生体マーカーはそのような検査の特異性に役立つことができる。

【0118】

一般に、本明細書で開示されているのは、患者における微生物（例えば、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ））及び微生物感染症（多微生物感染症を含む）の特定（診断を含む）のための方法である。試料内のさまざまな微生物を特定するために使用される種々の方法があり、例えば、特異性を提供する。いくつかの態様では、複数の検出面を使用することができる。いくつかの態様では、各検出面は、さまざまな具体的な微生物捕捉剤を有することができる。すなわち、１つの検出面は、特定の微生物の種または属に対する抗体を含む微生物捕捉剤を含んでもよく、別の検出面は異なる特定の種に対する異なる微生物捕捉剤を含んでもよい。いくつかの態様では、互いに流体的に分離されている複数の検出面；例えば、複数の検出モジュール、例えば、検出チャネルを使用することができ、その際、１つの試料を検出モジュールに分割することができ、次いで、評価のために、異なる条件、例えば、異なる微生物捕捉剤に供することができる。本明細書で概説されるように、複数の異なる検出面は、非特異的なまたは特異的な微生物捕捉剤を有することができる。

【0119】

いくつかの態様では、検出面（複数可）は、微生物または微生物特異的抗体の非特異的捕捉に依存することができるが、検出方法は、特異的結合リガンドに依存することができ；例えば、微生物の特定の種または属に対する微生物特異的抗体は、蛍光標識と共に使用することができる。いくつかの態様では、同時検出は通常、異なる標識を含有する異なる結合リガンドに依存する一方で、連続検出は、１以上の洗浄工程とそれに続き、同じ標識を持つ異なる結合リガンドを用いて行うことができる。本発明の別の態様は、特定の捕捉または特定の標識のいずれかの使用を回避する。いくつかの態様では、方法は、検出可能な変化または既知の変化に基づく検出面上での微生物の空間的分離を用いて微生物の具体的な特定を提供する。例えば、単一の微生物の分裂を検出する能力は、任意の数のパラメーター、特に、増殖速度、代謝活性の評価、異なる抗生物質による細胞殺傷の速度、ならびにサイズ、形状、及び同胞生物との関係を含むことができる微生物の形態（例えば、クラスターまたはチェーンへの増殖、表面での２次元増殖、または表面から離れた３次元増殖）を含むが、これらに限定されない速度論的パラメーターに基づく特定を可能にする。速度の評価に加えて、単一のデータポイント分析も行われてもよい（例えば、表面上での個々の微生物に関連する面積の増加（例えば、正の増殖）、停滞した面積（正の増殖なし）、または面積の喪失（例えば、負の増殖、アポトーシス及び／または死）。

【0120】

いくつかの態様では、本発明は、対象にて脱髄性疾患を検出するための固体支持体またはキットを提供する。いくつかの態様では、対象は、脱髄性疾患を有することが疑われ得る、または脱髄性疾患を有するリスクがある。いくつかの態様では、本発明は、試料にて１以上の抗体を検出するための固体支持体またはキットを提供する。いくつかの態様では、１以上の微生物特異的抗体の存在の検出は脱髄性疾患を示すことができる。いくつかの態様では、本発明は、試料にて１以上の微生物を検出するための固体支持体またはキットを提供する。いくつかの態様では、試料は、脱髄性疾患を発症するリスクがある、または脱髄性疾患を有することが疑われる対象に由来し得る。固体支持体またはキットは、表１、表２、または表８のリストから選択された１以上の微生物の存在を決定するのに有用であることができる核酸プローブ、抗体、微生物特異的抗体、プライマー、及び／または微生物捕捉剤を含むことができる。

【0121】

キットはまた、キットが容易に且つ効率的に使用され得るように、種々の補助物質に使用することができる試薬、例えば、溶媒、洗浄緩衝液等を含むこともできる。

【実施例】

【0122】

実施例１：生存患者から得られた一次性脱髄脳検体における微生物配列のスペクトル及び細菌細胞壁抗原

【0123】

要約：多発性硬化症（ＭＳ）は脳と脊髄における複数の病変を特徴とする自己免疫疾患である。ＲＮＡ配列決定を用いて、微生物配列を特定し、３０のヒト脳生検検体におけるヒト遺伝子の発現パターンを特徴付けた。既知の微生物分類群に対して並べたＲＮＡは、１５のてんかん対照の群と比較して１２の一次性脱髄（ＭＳ）脳検体のうち１０で有意に集積され、１１の異なる門に由来する２９のＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの属のリストにつながった。本明細書に記載されているＭＳ微生物のほとんどは嫌気性細菌である。いくつかの共通のＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーがあったが、有意な微生物ＲＮＡ集積を伴う１０のＭＳ試料のそれぞれは、ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの異なるセットを有した。微生物配列決定の読み取りの割合は、対照（７７．４ＰＰＭ、ｐ＝０．０１６）と比べてＭＳ群（１２８．８ＰＰＭ）の方が大きかった。細菌のペプチドグリカンはいくつかのＭＳ対象の脳組織切片で実証された。ヒトの遺伝子発現分析は、ＭＳ群における炎症関連経路の発現の増加を示した。このデータは、脱髄性脳病変が微生物のＲＮＡ配列と細菌抗原の存在に関連していることを示している。これは、ＭＳが病変内の微生物の多様なセットの存在によって引き起こされることを示唆している。

【0124】

材料及び方法：対象：試験対象の特徴を表３に示す。１１人の対象から配列決定のために１２の脳生検試料を選択した。これらの１１人の対象のうち１０人からの生検は脱髄を示す病変を有した。別の対象（ＭＳ－０６２）は十分に確立された進行性ＭＳを有した。これら１１人の対象は、明確さと簡潔さのためにＭＳ群として指定されている。（１人の対象、ＭＳ－０２１は３ヵ月の経過で２回生検された。）脳生検の所見は神経病理学者が審査した。ＭＳ対象の疾患経過は、単一の脱髄症状の発現から重度の劇症疾患（マールブルグ病または腫瘤形成性疾患）までに及んだ。臨床情報は、電子記録、紙の記録、及び治療を行う医師との議論からまとめられた。臨床診断及び画像所見はＭＳ神経内科医が審査した。３人の対象は、他の神経疾患（ＯＮＤ）と呼ばれるいくつかの他の過程を示す脳生検の病変を有した。対照群は、発作を制御するために脳組織の一部を切除したてんかんの１５人の対象から採取した組織からなる。ＭＳ及びＯＮＤの対象からの検体は白質だった一方で、てんかん対照の対象からの検体は主に大脳皮質（灰白質）からのものだった。

【0125】

検体の調製、ＲＮＡ抽出、及びライブラリーの調製：脳生検ブロックを得た。複数の手順を用いて試料の外来性の汚染を防止した：新しい刃を持った専用ミクロトームを各検体に使用し、ベンチ領域を清浄にし、検体の処理の間で汚染除去し、組織の先頭の５０ミクロンを捨て、滅菌使い捨て器具を用いて検体を取り扱い、検体間ではミクロトームをアルコールと漂白剤で消毒した。ＲＮＡ抽出のために厚さ１０μｍの５つの切片を採取した。

【0126】

ＤＮＡ分解酵素工程を含むＱｉａｇｅｎ ＦＦＰＥ ＲＮＡキットを用いて脳生検でＲＮＡ抽出を行った。これらのＭＳ脳生検検体のうち１２個からのＲＮＡは品質管理に合格し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォームにて２回の別々の実行で配列決定されている。配列決定された１２のＭＳ試料のうち１０は女性の対象からのものである。女性対象の１人（対象０２１）は３ヵ月間隔で２回生検された。微生物配列について試料を集積するために、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ＭＲＺＨ１１６）を用いて試料からヒトｒＲＮＡを物理的に枯渇させた。配列決定のために、無指向性の相補性ＤＮＡライブラリーを構築し、ＨｉＳｅｑ－２５００でペアエンド１２５ｂｐの配列決定を実施した。同じ機器と手順を用いて１５の対照てんかんＦＦＰＥ試料を並行して処理し、且つ配列決定した。２つの慢性脳炎及び１つの無酸素性脳損傷の試料を配列決定して、他の神経疾患（ＯＮＤ）対照として役立てた。目に見える組織（すなわち、パラフィン）がないと定義された２つのブランク検体及びヒトゲノムまたはトランスクリプトームにマッピングされた試料の読み取りの＜１０％を配列決定し、分析に使用した。ＲＮＡ－ｓｅｑによって１２５ｂｐのペアエンド読み取りが得られた。

【0127】

配列決定及び品質管理：ペアの１２５ｂｐの読み取りの品質管理はＳｉｃｋｌｅプログラムによって実施した。低品質のペアを除去し、端末の低品質のベースコールをトリミングした（Ｓｉｃｋｌｅ：ＦａｓｔＱファイルｖ．１．３３（２０１１）用のスライディングウィンドウ、適応型、品質ベースのトリミングツール）。Ｓｉｃｋｌｅパラメーターは、ペアのいずれかのメンバーが長さ＜４０ｂｐトリミングされたときに読み取りペアを破棄するように設定した。各試料のＨＱ読み取りペアを、Ｂｏｗｔｉｅ２（設定：－ｑ－－ｋ１－ｐｈｒｅｄ３３－－局所）（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．９，３５７－３５９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１９２３，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ９／ｎ４／ａｂｓ／ｎｍｅｔｈ．１９２３．ｈｔｍｌ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０１２））を用いていくつかのデータベースに対して並べた。ヒトのゲノム及び／またはヒトのトランスクリプトーム（ＧＲＣｈアセンブリ）に対して並べた読み取りを宿主遺伝子発現の差異について別々に分析した。次に、残りの非ヒトの読み取りを、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｌａｂで編集された汎微生物データベースに対して並べた。汎微生物データベースには、非冗長ウイルスデータベース（完全な及び部分的なウイルス配列を含む）、ＧｅｎＢａｎｋにおける完全な細菌、古細菌、真菌、及び原生生物のゲノムが含まれている。この１１Ｇｂの汎微生物データベースは１３０万を超える配列記録を含有し、それぞれが１０，６５４種を表すＧｅｎＢａｎｋ識別子（ｇｉ）によって特定される。Ｆｉｓｃｈｅｒ（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．Ｆ．Ｔｈｅ Ｐａｎｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ，＜ｈｔｔｐ：／／ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｐａｔｈ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｐａｎｍｉｃｒｏｂｉａｌ＿ｎｒｄｂ．ｆａｓｔａ．ｚｉｐ＞（２０１７））。微生物の配列比較はＢｏｗｔｉｅ２（設定：－－ｅｎｄ－ｔｏ－ｅｎｄ－ｐｈｒｅｄ３３）でも実施した。同じ微生物配列に対して並ぶ読み取りペア（一致ペア）を数え、分析に進めた。

【0128】

ＲＮＡ－ｓｅｑは各試料で正確に同じ数のＨＱペアを生成しなかったので、汎微生物データベースにおける各配列に対して並べた試料由来の読み取り数を、高品質ペアの読み取り数（百万単位）で割ることによって正規化し、１００万あたりのペア（ＰＰＭ）を得た。これらの正規化されたヒット率（ＨＲ）は、各微生物分類群及び試料ごとに算出した。分類群ＰＰＭは、可能な場合は集計し、属及び科のレベルで分析した。２つの配列決定実行（実行１と実行２）からのデータを組み合わせて、分析した。実行２に固有の不自然な結果が観察され、実行１よりもＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に並ぶ読み取りが多かった。この不自然な結果の影響を受けた分類群は、実行２のブランク（組織なし）検体のＨＲを実行１の対照試料のＨＲと比較することによってＨＲ分析から除外した。次に、配列決定実行１の対照のその分類群の平均ＨＲよりも大きい片方または双方のブランクにおけるＨＲを持つ分類群を除外した。ブランクは、目に見える組織を含まない登録された対象に由来する別個のＦＦＰＥ脳生検検体だった。

【0129】

ヒトの遺伝子発現：Ｂｏｗｔｉｅ（ｖ２．２．５．０）、ｔｏｐｈａｔ（ｖ２．０．１４）及びｃｕｆｆｄｉｆｆ（ｖ２．２．１）を用いて脱髄試料群及び対照試料群における既知のスプライス変異型の差次的発現レベルを算出した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８，５１１－５１５，（２０１０）；及びＴｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－ｓｅｑ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１，４６－５３，（２０１３）。Ｔｏｐｈａｔは、「－ｎｏ－ｎｏｖｅｌ－ｊｕｎｃｓ」設定で実行した。Ｃｕｆｆｄｉｆｆは各試料についてｔｏｐｈａｔの出力「ａｃｃｅｐｔｅｄ＿ｈｉｔｓ．ｂａｍ」ファイルで実行した。偽発見率（ＦＤＲ）を＜０．０５に制御して、差次的に発現された転写物を群間で特定した。使用したトランスクリプトームモデルは、２０１４年５月２３日のＧＲＣｈ３７Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７５から導出した。差次的に発現する遺伝子の経路集積は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ及びｔｈｅ Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｃｕｒａｔｅｄ経路データベース（Ｆａｂｒｅｇａｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４，Ｄ４８１－４８７，（２０１６））によって算出した。

【0130】

統計分析：試験集団の人口統計及び特性をＡＮＯＶＡを用いて比較し、次いで離散型変数（例えば、性別）についてはＦｉｓｈｅｒの直接確率検定、またはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの非パラメーター検定（例えば、年齢、採取年）で確認した（Ｌｏｗｒｙ，Ｒ．ＶａｓｓａｒＳｔａｔｓ：Ｗｅｂｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ，＜ｈｔｔｐ：／／ｖａｓｓａｒｓｔａｔｓ．ｎｅｔ／＞）。各ＭＳ脳試料についての微生物のリストは、データセット内の有意な外れ値を探すことによって導き出された。各試料についての各分類群からのＨＲは変換されたログ₂だった。Ｚスコアは１５の対照試料を予想される分布として用いて、すべてのＭＳ試料について算出した。分析はファミリー及び属のレベルで実施した。Ｚスコアは正規分布を用いてｐ値に変換した。ＭＳ群にて過小出現ではなく、過剰出現している微生物配列に関心があったので、片側検定を実施した。多重比較を修正するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．＆ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）５７，２８９－３００（１９９５））の偽発見率制御法によってｐ値をｑ値に変換した。ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーは１５の対照のセットと比較して少なくとも１つのＭＳ試料にて有意に（ｑ＜０．０５）過剰出現しているものとして定義され、ＨＲは１．０ＰＰＭ未満である。Ｐｙｔｈｏｎ２．７を用いてＨＲに基づく有意性を算出した。ＨＲの正規化、変換、及びＺスコアの算出は、ｎｕｍｐｙとｐａｎｄａｓを用いて実施し；ｐ値及びｑ値は、ｓｃｉｐｙ．ｓｔａｔｓ（Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ｔ．Ｅ．（２００６）；ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｗ．ｉｎ ＳｃｉＰｙ ２０１０；及びＳｃｉＰｙ：Ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｙｔｈｏｎ（２００１））で算出した。

【0131】

免疫組織化学：対象ＭＳ－０１９及びＭＳ－０５６、てんかん対照０３９及び０４０、及び脳膿瘍（陽性対照）に由来する５ミクロンの病理学的脳組織切片を調べた。組織切片は、抗原脱マスキング（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品Ｈ３３００）、続いて０．５％カゼインブロッキング（Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。切片を、抗ペプチドグリカンＩｇＧ１ ｍＡｂ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製品ＭＡＢ９９５、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、抗ＣＤ６８（マクロファージ、ａｂ９５５、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗リゾチーム（マクロファージ及び好中球、ａｂ１０８５０８、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）、またはマウスアイソタイプ対照Ａｂ（ＩｇＧ１アイソタイプ対照、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＡ５－１４４５３）と共に４度で一晩インキュベートした。追加の抗ペプチドグリカンモノクローナル抗体（ｍＡｂ ２Ｅ９）が提供された。２Ｅ９は、脾臓マクロファージにて腸内細菌叢由来の細菌抗原を検出するための試薬として１９９４年に最初に開発されたＩｇＧ３ ｍＡｂである（Ｋｏｏｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，１４３５－１４４１，（１９９４））。このｍＡｂは、脳組織におけるペプチドグリカンを示すのにも使用されている（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｉ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ，１２４，１５４４－１５５４（２００１）；及びＢｒａｎｔｏｎ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ，６，３７３４４，（２０１６））。切片は、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＡ－２０００，Ｖｅｃｔｏｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）とストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ（Ｓ５５１２，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）とによって発色させた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡で画像解析を行った。

【0132】

結果：試験集団：試験集団の特徴を表３に示す。年齢及び性別の分布には群間で有意差はなかった。脳検体の採取はＭＳ群（中央値２００７、ｐ＜０．００１）と比べて対照群（中央値２０１２）では幾分後で実施された。これは、てんかんの外科的対照（さらに一般的）と比べて一次性脱髄検体（相対的に稀）が豊富であることに起因し、さらに最近のてんかん対照検体が登録された状況につながっている。対照群は、ＭＳ群（中央値１、ｐ＝０．００５）と比べて脳検体採取の１ヵ月前に有意に多くの外科的処置を受けた（中央値２）。外科的処置の数が多いのは、てんかん原性焦点の切除前に対照で行われたマッピング処置によるものである。

【0133】

脳検体の特徴：この試験で使用された脳検体は、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したＦＦＰＥだった。生検部位には、ＭＳ群及び他の神経疾患（ＯＮＤ）群の白質と灰白質の混合物が含まれていた。対照生検は主に皮質（灰白質）から採取した。ＭＳ群からの１２の生検のうちの１０は、ＭＳと一致する脱髄の神経病理学的な読み取りデータを有した。最初の検体は診断が不十分（すなわち、正常な脳）であったため、対象の１人（ＭＳ－０２１）は２回生検された。十分に確立された進行性ＭＳの別の対象（ＭＳ－０６２）は、血管周囲の炎症を示した灰白質から主になる生検を受けた。ＯＮＤ群の３人の対象は、最初に放射線と臨床所見に基づいてＭＳを有すると疑われたが、後に、その検体の神経病変に基づいて再分類された（すなわち、一次性脱髄ではない）。

【0134】

ＭＳ群及びＯＮＤ群における臨床所見：ＭＳ群の１１人の対象のうち６人は、記録にオリゴクローナルバンド（ＯＣＢ）検査を有した。これらのうち、４つが陽性で、２つが陰性だった。１人のＯＮＤ対象（ＯＮＤ－００３）も、ＭＳではなく急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）と脳炎の最終的な診断にもかかわらず、陽性であったＯＣＢ検査を有した。ＭＳ群の１１人の対象は多発性硬化症と一致する疾患を有し、６人は疾患修飾療法を受けた（表３）。対象の１人（ＭＳ－２１）が数ヵ月間隔で２回の脳生検を実施したので、ＭＳ対象はＭＳ試料よりも１人少なくなっている。
表３．試験集団の特徴。

¹ＭＳは一次性脱髄群を指す。ＯＮＤ＝他の神経疾患；Ｃ＝てんかん対照
²検体採取時に年齢（年）が報告される。
³病理学報告で指定されているような脳組織採取の部位。てんかんの対照部位は主に皮質に由来した。利用可能な場合、側性が提供される。
⁴神経病理学者によって記載されたようなＭＳ及びＯＮＤの症例における読み取りデータ。臨床病理報告は、審査に利用できないこれらの群の検体から及び対照にて要約されている。ＦＣＤ＝限局性皮質異形成症
⁵医療記録及び治療神経科医との議論から評価。ＲＲＭＳ＝再発寛解型ＭＳ；ＡＤＥＭ＝急性散在性脳脊髄炎；ＣＶＡ＝脳血管発作（脳卒中）
⁶ＮＤ＝検査されず
⁷ＭＳ神経内科医によって審査されたような、審査に利用できなければ医療記録に報告されたような脳ＭＲＩ（及び／またはＣＴ）所見。
⁸診断用脳生検後に提供される疾患修飾療法（ＤＭＴ）。ＭＳ群の生検は診断を確立するためのものであったので、これらの対象はいずれも検体採取時に疾患修飾療法を受けていなかった。ＮＴＺ＝ナタリズマブ；ＩＦＮｂ＝インターフェロンベータ；ＤＭＦ＝フマル酸ジメチル；ＧＡ＝酢酸グラタリマー、ＮＯＶ＝ノバントロン、ＡＺＰ＝アザチオプリン、ＲＴＸ＝リツキシマブ

【0135】

配列決定及び配列比較：３２の試料（ＭＳ１２、対照１５、ＯＮＤ３、ブランク２）のうち、配列決定の総収量は１．０６～２．９６×１０⁸の高品質読み取りペア（ＨＱペア）だった。試料群間でＨＱペアの数に有意差はなかった。全体として、配列決定の品質は高く、元のフィルタリングされていない読み取りペアの２．６％がデータセットから破棄された。残りのＨＱペアは、微生物とヒトのデータベースの配列比較に使用された。ほとんどのＨＱペア（９５．７％）は完全長（１２５ｂｐ）だった。残りのトリミングされた読み取りの平均長（ＨＱペアの４．３％）は１２３．９ｂｐだった。

【0136】

ヒト及び微生物データベースに対する配列比較を表４に示す。ヒトゲノムに対して並べた読み取りは微生物分析から除外した。汎微生物データベースの単一配列に対して高い品質及び特異性でマッピングした３０の実験試料からの合計２１６，１５９の一致して並んだペア（表５）。これらの微生物の読み取りのほとんどは細菌だった。それらは主にＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門（５０．３％）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門（２０．３％）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門（１６．２％）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門（４．６％）、または他の門（８．５％）由来のｒＲＮＡ配列にマッピングされた。微生物読み取りの割合は、対照（７７．４ＰＰＭ、ｐ＝０．０１６）と比べてＭＳ群（１２８．８ＰＰＭ）の方が大きかった。

【0137】

表４．配列決定配列比較の概要。マッピングされた微生物の読み取りペアの総数は、マッピング品質（ＭＡＰＱ）でフィルタリングする前に、Ｂｏｗｔｉｅ２．０によって報告されたように単一の並べた読み取りペアを用いて推定した。

¹ヒトのゲノム／トランスクリプトームまたはＰｈｉＸ内部配列決定対照のいずれかに対する一致した読み取りペアのマッピング
²汎微生物データベースに１回マッピングする一致した読み取りペア±平均の標準誤差（ＳＥＭ）
³ＨＱ読み取りペアで割った微生物一致読み取りペアの値に１０⁶を掛けたもの±ＳＥＭ
＊対照群と比較してＰ＜０．０５
表５．汎微生物データベースに対する配列比較の分類学的分布。

¹細菌、古細菌、真菌、原生生物、及びウイルスを含む
²１以上の試料が１以上のデータベース配列に整列する分類群（ＭＡＰＱ値≧１０）

【0138】

ＭＳ群で過剰出現している微生物配列の具体的な独自性を決定するために、データベースでの配列に対する配列比較の特異性の尺度であるＭＡＰＱ測定基準を用いて追加のフィルタリングを実行した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８，５１１－５１５，（２０１０）；及びＴｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，３１，４６－５３，（２０１３））。ヒトによる読み取り、ＰｈｉＸ対照による読み取り、及びＭＡＰＱが１０未満の読み取りはさらなる分析から除外した。残りの配列比較は、報告されたマッピングが汎微生物データベースにおける単一の最良の配列一致に対するものである９０％を超える確率を有する。一致するペアがある場合、正しいマッピングの確率は９９％を超える。ＭＳ試料の少なくとも１つにおける微生物配列の有意な過剰出現（ｑ＜０．０５）は４３の科及び８４の属で見られた。科レベルの過剰出現を図１に示す。属レベルの過剰出現を表６に示す。

【0139】

表６．大規模配列決定データに由来するＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリー。属レベルでＭＳ微生物としての資格を得るために、ＭＳ群由来の少なくとも１つの検体は、１０以上のＭＡＰＱ値（８４の別々の属）の対照群より有意に増加した（ｑ＜０．０５）この分類群への読み取りペアマッピングを有した。示されているＭＳ微生物属は、ＭＳ群（２９の属）のすべての検体の中で少なくとも１００のマッピングされた読み取りを有していた。

¹ＮＣＢＩ分類にて分類されたとおりである。門は細菌及び真菌の微生物について列挙されているが、ウイルスについては列挙されない。
²ＭＳ全体に由来する分類群（Ｎ＝１２）または対照群（Ｎ＝１５）にマッピングされた読み取りの総数。
³対照群（Ｎ＝１５）と比べてこの分類群への読み取りマッピングが有意に増加した（ｑ＜０．０５）ＭＳ検体の数（１２のうちの）
⁴ヒトの病原体として一般的に認識されている。
⁵ＭｉｃｒｏｂｅＷｉｋｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｃｒｏｂｅｗｉｋｉ．ｋｅｎｙｏｎ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ＭｉｃｒｏｂｅＷｉｋｉ）、命名法に則った原核生物の名前のリスト（ＬＰＳＮ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏ．ｎｅｔ）、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）、及び他のオンライン情報源によって記載されたとおりである。

【0140】

Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（試料ＭＳ－０１９）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージＬＵＺ２４様ウイルス（試料ＭＳ－０５３）についての読み取りペア配列比較の代表的なマッピングを図２に示す。これらのゲノム全体で観察されたＲＮＡ存在量の分布は予想される遺伝子発現と一致している。例えば、原核生物（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）のマッピングはｒＲＮＡ遺伝子内で集積されており、他の細菌遺伝子へのマッピングははるかに少ない。また、ＬＵＺ２４様ウイルスについては、複製バクテリオファージで予想されるように、観察されたＲＮＡの存在量は構造遺伝子にマッピングされる。

【0141】

ＭＳ微生物：各ＭＳ脳試料についての微生物のリストは、データセット内の有意な外れ値を探すことによって導き出された（分析の詳細については方法を参照のこと）。各検体を対照のセットと比較し、偽発見率（ｑ＜０．０５）を用いて複数の比較を調整した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．＆ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）５７，２８９－３００（１９９５））。４２の微生物ファミリーに由来する配列がＭＳ群の少なくとも１つの試料にて過剰出現していた。ＭＳ微生物には、１つの古細菌、３５の細菌、２つの真菌、及び４つのウイルス科が含まれていた（図１）。

【0142】

ＭＳ試料の少なくとも１つにおける微生物配列の有意な過剰出現（ｑ＜０．０５）は８４の属でも見られた。リストは、ＭＳ群のメンバーの間で１００以上のマッピングされた読み取りがある属を含むようにフィルタリングした。これは、１１の異なる門からの２９のＭＳ微生物属のさらに扱いやすいリストにつながった（表６）。ＭＳ試料のセット全体でマッピングされた読み取りの数が最も多いＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーには、細菌属Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、及び真菌属Ｕｓｔｉｌａｇｏが含まれ、それぞれに１０００を超えるマッピングされた読み取りがある。表６に列挙されたＭＳ微生物には、２６の細菌、２つの真菌、及び１つのウイルスの属が含まれる。８４属の完全なリストは示されていない。

【0143】

ＭＳ微生物をランク付けする別の方法は、対照よりも有意に増加した検体の数によるものである：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＲｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ（５検体が増加）；Ｕｓｔｉｌａｇｏ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ、及びＡｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（４検体増加）；ならびにＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｏｌｕｍｏｎａｓ（３検体が増加）。ＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーも対象（試料）ごとに列挙されている。（表３を参照のこと。対象ＭＳ－０２１は２回生検されたので、このデータは実際には検体固有である。）１２人のＭＳ対象のうち１０人は、少なくとも１つの過剰出現した微生物属を有した。試料で観察された微生物候補の数は０から２８に及んだ。

【0144】

ＭＳクラスターの分析：４つのＭＳ試料１７、２１－２、５５、及び５６は、図１の右側に表示されているように、科レベルでＭＳ微生物の集積の類似パターンを示した。これらの試料をいくつかの技術的及び臨床的なパラメーターについてＭＳ群内の他と比べた。「クラスター」（Ｎ＝４）対「クラスターなし」（Ｎ＝８）のＭＳ亜群は総ＲＮＡ収量でも、微生物画分でも有意差はなかった。４つのクラスター試料は、クラスターなし試料の８つのうち６つと比べて、病理学的分析でマクロファージが顕著だった（ｐ＝ＮＳ）。同様に、神経学的症状の発症日と脳生検の間の間隔は亜群間で差異はなかった。予想通り、クラスター群は、クラスターなし群（平均６．４、ｐ＝０．０１）よりも属レベル（平均２１．０）で有意に多くのＭＳ微生物を有した。

【0145】

ヒトの差次的遺伝子発現：６８２の遺伝子がＭＳ群と対照群（ＦＤＲ＜０．０５）の間で差次的に発現されていることが見いだされた。対照試料と比較して、ＭＳ試料は多くの過剰発現した免疫関連遺伝子を有する。経路による集積の分析は、５つの免疫関連経路、１つの分泌経路、及び２つの細胞表面相互作用経路がＭＳ試料で過剰発現している遺伝子について有意に集積されていることを示している（表７）。逆に、マクロファージを相対的に含まない対照試料は、神経遺伝子の相対的に高い発現及び神経経路の集積を示す。

【0146】

表７．ＭＳで過剰発現したヒト遺伝子発現経路。Ｂｏｗｔｉｅ（ｖ２．２．５．０）、ｔｏｐｈａｔ（ｖ２．０．１４）及びｃｕｆｆｄｉｆｆ（ｖ２．２．１）を用いて脱髄試料群及び対照試料群における既知のスプライス変異型の差次的発現レベルを算出した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８，５１１－５１５，（２０１０）；及びＴｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１，４６－５３，（２０１３））。差次的に発現する遺伝子の経路集積は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ及びｔｈｅ Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｃｕｒａｔｅｄ経路データベース（Ｆａｂｒｅｇａｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４，Ｄ４８１－４８７，（２０１６））によって算出した。

【0147】

免疫組織化学分析：残念ながら、ＭＳ群からの配列決定された検体のすべてがその後の免疫組織化学分析を可能にするのに十分な大きさであったわけではない。４つの検体を抗菌性（ペプチドグリカン）モノクローナル抗体及び対照による染色に供した。ペプチドグリカンは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の双方の構造的な細胞壁成分である。この分析の代表的な脳組織切片を対照と共に図３に示す。ペプチドグリカンのシグナルは、ＭＳ検体と別の脳膿瘍陽性対照検体の双方で実証された。いくつかのペプチドグリカンのシグナルはいくつかのてんかん対照検体でも観察されたが、染色のパターンははるかに限られていた。一致したＩｇＧ１アイソタイプ対照は抗ペプチドグリカンのシグナルの特異性を支持する。抗ＣＤ６８及び抗リゾチームの染色はＭＳ－０１９検体におけるマクロファージ及び好中球の存在を確認した。従来の神経病理学は、他のＭＳ検体のほとんどにて活性化マクロファージの存在を示した。

【0148】

考察：ＲＮＡ配列決定及び免疫組織化学は双方とも、対照とは異なるＭＳ脳検体の多くに微生物が存在することを示唆している。ＭＳ微生物が検出された脳生検試料では、配列は細菌分類群の多様なセットにマッピングされた。試料は同じ細菌の特性を共有しておらず、すべての試料で単一の細菌分類群が見いだされたわけではない。このことは、ＭＳ疾患が病変内での種々の微生物の存在に関連すること、またはマクロファージ浸潤が病変への細菌輸送の経路を提供することを示唆している。これらの可能性は相互に排他的ではなく、微生物のＲＮＡと細胞壁成分がどのように脳に到達するのか、及び微生物またはその成分の存在が疾患の発症または経過に影響を与えるかどうかを定義するために、さらなる試験が必要とされるであろう。

【0149】

この試験はいくつかの重要な制限を有する。第１に、対照検体はてんかんに冒された組織から採取された。したがって、対照検体は完全に正常な脳からのものではない。剖検試料は、正常な病理学的外観のために特別に選択されてもよいが、この試験の初期のいくつかのそのような試料の品質分析は、ＦＦＰＥ剖検脳試料からのＲＮＡが非常に低品質であり、配列決定に使用するには質が低すぎることを示した。したがって、主に皮質（てんかん原性焦点）から採取されたてんかん対照と、皮質と白質の双方を含有するＭＳ試料との間のいくつかのミスマッチは避けられなかった。微生物分析に対する生検部位の影響は排除することができない。第２に、ＭＳ患者の多くは何らかの疾患修飾療法（表３におけるＤＭＴ）を受けた一方で、てんかん対照の対象はまったく異なる薬物のセットでその状態を治療された。ＭＳ薬もてんかん薬も抗菌薬とは見なされていないので、これはありそうもないことであるが、試料の微生物組成に対するいくつかの薬物の影響を排除することはできない。最後に、対照と比較したＭＳ試料の初期の採取日は、採取日と微生物のマッピングされた読み取りの間に認識できる関係がなかったので、おそらく結果にほとんどまたはまったく影響を有さなかった。

【0150】

ここに提示されたデータは、ＭＳ脳病変における分類学的に多様な生物、主に細菌に由来する微生物高分子の存在間の相関関係を明らかにしている。これは、いくつかの細菌ゲノム（例えば、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）への配列決定読み取りの明確なマッピングによって、及び数人の対象の病変内の細菌ペプチドグリカンの免疫組織化学的検出によって支持されている。ここで報告されたデータは、生きている微生物と、もはや生存できない微生物の残遺物（例えば、核酸、ペプチドグリカン）とを具体的に区別していない。しかしながら、ＭＳ脳試料の２つ（ＭＳ－０２１－２及びＭＳ－０５３）におけるバクテリオファージ、ＬＵＺ２４様ウイルスの存在は、その宿主であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａも存在したことを暗示する。（グラム陰性菌配列がフィルターで除去された場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ自体は最終分析から失われる可能性があった。）ＬＵＺ２４様ウイルスは溶菌性（または毒性）であり、テンペレート（または溶原性）ではないバクテリオファージであるので、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓも採取時のこれらの試料にて活発に複製していた可能性がある（Ｃｅｙｓｓｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３７７，２３３－２３８，（２００８））。ＭＳ脳検体で複製細菌を非複製細菌から区別するには、さらに多くの作業が必要とするであろうが、マクロファージの浸潤及び脱髄を刺激するには、生存不能な細菌成分で十分であってもよい可能性がある。

【0151】

微生物ＲＮＡは対照検体でも観察され、これは免疫組織化学分析によっても裏付けられた。この理由は明確ではないが、てんかん対照で配置されたマッピング電極及び実施された公開手順に関係していてもよい。これらの公開手順はてんかん原性焦点を見つけ、マッピングし、除去するために必要だった。パイプラインに沿ったポイントでの汚染を排除するための努力がなされたが、ＦＦＰＥ検体自体は必ずしも完全に無菌であるわけではなく、または微生物ＲＮＡがないわけではなく、対照（てんかん）と対比した実験（ＭＳ）の試験設計の使用を必要とする。対照検体における微生物の読み取りも、脳組織内でのてんかん原性焦点について何かを語っていてもよい。

【0152】

ＭＳ微生物の多く（表６に列挙された）は嫌気性細菌属に由来する。これらの多くは共生細菌（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）と見なされてもよく、それらがＭＳの病態形成に役割を担うかどうかは現在不明である。しかしながら、配列決定分析によって、脳膿瘍でも種々の嫌気性及び非病原性の細菌種が観察されている（Ａｌ Ｍａｓａｌｍａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，５４，２０２－２１０，（２０１２））。多くの脳膿瘍検体は培養で増殖せず、これらの病変の微生物学は複雑であるので、脳膿瘍内に見られる微生物は病理学的過程に何らかの役割を有してもよい。微生物学的複雑性のこの概念はＭＳにも適用されてもよい。

【0153】

ＭＳ群の検体のいくつかは、図１の右側にクラスターとして示されている、科レベルでのＭＳ微生物の集積を有した。これらの４つの試料がなぜ他のＭＳ脳生検試料よりも多数のＭＳ微生物を有したのかは明らかでない。

【0154】

オランダのＬａｍａｎのグループは、ＭＳのドナーからの脳組織における免疫組織化学によって細菌抗原、特にペプチドグリカンを最初に示した（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｉ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ，１２４，１５４４－１５５４（２００１））。著者らはまた、活動性ＭＳの患者のＣＳＦにおける抗ペプチドグリカン抗体も実証した。このグループはさらに次に、ペプチドグリカンがＣＮＳ自己免疫の発症に関与するという仮説を立てた（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１７４，８０８－８１６（２００５））。その時以来、Ｃｈｒｉｓ Ｐｏｗｅｒが率いるカナダのグループは、ＭＳ患者の１人を含む、ＣＮＳの種々の疾患の患者からの脳組織にて細菌の配列を示した（Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ５４６７３，（２０１３））。さらに最近では、このグループは６つの剖検由来のＭＳと６つの対照脳試料でＲＮＡ配列決定を実施した（Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ，６，３７３４４，（２０１６））。彼らの分析は、進行性ＭＳ及び対照脳試料におけるＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ配列の優勢を明らかにし、３つの再発寛解型ＭＳ脳試料ではＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ配列が優勢であった。これらの結果は、ＩＨＣ及び遺伝子発現試験によって裏付けられ、ＭＳに特徴的な脱髄病変内の微生物叢の破壊と一致すると解釈された。さらに多くの対照、さらに大規模な配列決定、異なるマッピングと分析方法、及び生きている対象からの固定パラフィン化検体が使用されたが、Ｐｏｗｅｒのグループの知見は本明細書で開示されている報告に類似している。

【0155】

対照と比較したＭＳ患者の糞便中のいくつかの細菌の集積は、他のグループによって観察されている（Ｃａｎｔａｒｅｌ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，７２９－７３４，（２０１５）；及びＪａｎｇｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７，１２０１５，（２０１６））。Ｊａｎｇｉらによる試験も健常な対照と比較したＭＳ患者の糞便微生物叢を調べた配列決定試験であった。興味深いことに、２つの属－Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及びＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒにマッピングされた配列はＭＳ患者の糞便で増加した。糞便ではなく脳組織検体での現在の配列決定試験でもＭＳ微生物の間でＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａを特定した（表６を参照）。

【0156】

対象ＭＳ－２１は数ヶ月の経過にわたって２回生検され、それ自体の意図しない対照として作用した。最初の生検（ＭＳ－２１－１）は正常だった一方で、２回目の生検（ＭＳ－２１－２）は明確な脱髄を示した。興味深いことに、５つのＭＳ微生物は最初の（ほぼ正常な）生検にてマッピングされた相対的に少数の読み取り（それぞれ５０以下）と共に検出された。しかしながら、２回目の罹患生検は２８のＭＳ微生物を明らかにし、これらのＭＳ微生物のうち４つは、それぞれ１００を超えるマッピングされた読み取りを有した。このデータは単一の対象からのものである一方で、それは脱髄病変が対照とは有意に異なる複数の種類のさらに多くの細菌に関連しているという仮説を裏付けている。

【0157】

ヒトの遺伝子発現分析は、対照と比較してＭＳ対象の間で脳組織にて最も有意に過剰発現されたときのＴｏｌｌ様受容体のカスケードと、エンドソームＴＬＲ経路の輸送及びプロセシングとを特定した。これらの経路には、双方とも細菌性病原体に対する免疫に関連するＴＬＲ２とＴＬＲ４、及びｓｓＲＮＡ（ウイルス）に対する免疫に関連するＴＬＲ７が含まれる。他のグループは、ＭＳとＴＬＲの間に関連性があることを示している（Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０，６３４－６４５，（２０１１）；Ｈａｍｉｄ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｒａｎｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ，ａｓｔｈｍａ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５，７５－８１（２０１６）；Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｔａｎａｓｅｓｃｕ，Ｒ．＆ Ｇｒａｎ，Ｂ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，６，３５１３１－３５１３２，（２０１５）；Ｎｙｉｒｅｎｄａ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４，５７６１－５７７４，（２０１５）；及びＷｈｉｔｅ，Ａ．Ｔ．，Ｌｉｇｈｔ，Ａ．Ｒ．，Ｈｕｇｈｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｖａｎｈａｉｔｓｍａ，Ｔ．Ａ．＆ Ｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｃ．Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７４，４６－５４，（２０１２））。興味深いことに、ＭＳ患者のＰＢＭＣでは対照と比較してＴＬＲ４の発現が低いのに対して、本発明者らは冒された脳組織ではより高い発現を検出した（Ｈａｍｉｄ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；及びＩｒａｎｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ，ａｓｔｈｍａ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５，７５－８１（２０１６）；及びＷｈｉｔｅ，Ａ．Ｔ．，Ｌｉｇｈｔ，Ａ．Ｒ．，Ｈｕｇｈｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｖａｎｈａｉｔｓｍａ，Ｔ．Ａ．＆ Ｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｃ．Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７４，４６－５４，（２０１２））。

【0158】

ＭＳ病変で観察された微生物配列と抗原の供給源は現在不明である。少なくとも２つの可能性がある：１）細菌血症からの血行性播種、または２）微生物が浸潤性マクロファージによって持ち込まれた。細菌が実際に細菌血症からのＭＳ病変に播種されているならば、これが以前に発見されていないのは奇妙だと思われる。しかしながら、この試験で特定されたＭＳ微生物の多くは嫌気性である、または培養不可能でさえあり、脳膿瘍（脱髄とは異なる病理学的所見）からの微生物の回収は困難であることが多いことは十分に確立されている。マクロファージは、自己免疫プロセスの結果として、細菌のＲＮＡ及び抗原をこれらのＭＳ病変に持ち込んでいてもよい。マクロファージ及び好中球は通常、開始剤ではなく組織損傷への応答側であると見なされる一方で、マクロファージは組織破壊に積極的に関与することができる（Ｄｒａｇｏｍｉｒ，Ａ．Ｃ．，Ｌａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｄ．＆ Ｌａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２５３，１７０－１７７，（２０１１）；及びＬａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｐｉｌａｒｏ，Ａ．Ｍ．＆ Ｊｉ，Ｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８６，２１６－２２６（１９８６））。

【0159】

いくつかの最近のマウスの試験は、正常な腸内細菌叢が、血液脳関門を通過し、パターン認識受容体Ｐｇｌｙｒｐ２と相互作用するペプチドグリカンを介して脳の発達と行動に影響を与えることを示している（Ａｒｅｎｔｓｅｎ，Ｔ．，Ｋｈａｌｉｄ，Ｒ．，Ｑｉａｎ，Ｙ．＆ Ｄｉａｚ Ｈｅｉｊｔｚ，Ｒ．Ｂｒａｉｎ，ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７，３４５－３５４，（２０１８）；Ａｒｅｎｔｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２２，２５７－２６６，（２０１７）；及びＤｉａｚ Ｈｅｉｊｔｚ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０８，３０４７－３０５２，（２０１１））。ペプチドグリカンの供給源は発達中の正常な腸内細菌叢であると思われる。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳに似た動物モデル疾患）を調べている別のグループは、ペプチドグリカンが受容体ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、及びＲＩＰ２及び樹状細胞を介して作用して疾患を悪化させることを示した（Ｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３４，７５－８４，（２０１１））。ＴＬＲ２及びＮＯＤも霊長類にてＥＡＥ疾患活性に介在すると思われる（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６９，１６７１－１６８５，（２００６））。最後に、経口Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉによるＥＡＥマウスの治療は、疾患の重症度の評価基準を改善した（Ｌｉｂｂｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｅｓ，９，４９５－５１３，（２０１８））。マウスにおけるこれらの興味深い知見のいずれかがヒトＭＳに直接適用されるかどうかは明らかではないが、それらはＥＡＥの進行に対するペプチドグリカンとその検知分子の重要性を明らかにしている。

【0160】

感染が長期的な免疫機能障害をもたらす「免疫学的瘢痕化」の概念が提唱されている（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），３５０，１６１，（２０１５）））。これは、微生物抗原の持続性がなくても、ＭＳで発生する持続性または再発性の機能障害を説明するのに役立ち得る。本試験は、一般に診断目的で疾患経過の初期に行われる脳生検を含んでいた。

【0161】

実施例２：微生物配列脳検体のスペクトル

【0162】

表８はＭＳ微生物のリストを提供する。偏りのない（大規模、次世代）ＲＮＡ配列決定は、１８のホルマリン固定し、パラフィン包埋した一次性脱髄脳検体（ＭＳ群）、１６のてんかん脳検体（対照群）、及び２つのブランク（組織なし）で実施された。表８に含めるための基準には、（１）（ａ）ＭＳ：対照の比≧３．０；及び（ｂ）ＭＳ：ブランクの比＞１．５であるＭＳ群での過剰発現；及び（２）ＭＳ群（Ｎ＝１６）のメンバーから合計された＞１０００の総読み取り（ＭＡＰＱフィルタリングは実施されなかった）が含まれる。
表８．微生物の例。

＊バクテリオファージの宿主細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを調べた

【0163】

次に、繰り返し測定についてＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）を平均し、脱髄性疾患（ＤＤ、ＭＳ群）、他の神経疾患（ＯＮＤ群）、または正常なＣＳＦを有することが予想されるシャント患者（対照群）の登録済みヒト対象間でＣＳＦの血清学的反応を分類するために使用した。ＥＩ値は、実験ＯＤ値を３つのキャリブレーターＣＳＦ検体の平均ＯＤで割ることによって決定した。陽性対照及び陰性対照は各ＣＳＦ血清学的実行の妥当性を確認した。細菌抗原は以前の配列決定データから選択した。間接ＥＬＩＳＡは、超音波処理して洗浄した細菌全体に対してＣＳＦ（原液）を用いて実施した。

【0164】

表９は、６つのＭＳ微生物または微生物ファミリーに対するＣＳＦ血清学から集めた各群についての血清学データの要約を示す。表９は、ＭＳ、ＯＮＤ、及び対照群の間での抗体反応の質的な差異を示すために組織されている。データを統計的に分析し、ＭＳ群及びＯＮＤ群が調べた抗原のほとんどについて対照よりも反応性が高いことを確認した。表８に提供されている結果は、活動性ＭＳの患者の治療を指図するためのパネル型検査として使用することができる。
表９．血清学的要約。ＥＩ≦１．０＝「－」、陰性；ＥＩ１．１～２．９＝“＋／－”，不確か；ＥＩ３．０～４．９＝“＋”，低陽性；ＥＩ≧５．０＝“＋＋”，高陽性。

ＮＤ＝実施されず
陰性一致＝ＣＳＦと血清にて同一バンド

【0165】

脱髄性疾患の評価におけるアルブミン指数と比較した微生物のＥＬＩＳＡ指数。図６はアルブミン指数と対比させたＥＩを示す。これらのデータは、対象の一部におけるＭＳ微生物またはＭＳ微生物ファミリーの一部に対する抗体の髄腔内合成の可能性を示している。例えば、この表で生成されたデータは、どの対象が所与の抗原に対して予想外に高い抗体レベルを有するかを提供し、血液脳関門を通過する血清からの抗体の漏出を説明する。そのような検査を用いて活動性ＭＳ患者の治療を指図することができる。

【0166】

さらに具体的には、図６は、アルブミン指数（ＡＩ）に対してプロットした６つのＭＳ微生物候補抗原についての髄液ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ、抗体の尺度）を示す。ボックスは、血液脳関門（ＢＢＢ）が損なわれていないことを示す正常なアルブミン指数領域（０～９）を示す。示した直線は、各抗原についてのＥＩとＢＢＢが損なわれていないこと（アルブミン指数で評価されるような）との間の関係を示す線形回帰分析である。この直線は、調べた各細菌抗原について「予想されるＥＩ」を提供し、ＭＳや他の脱髄性疾患の患者に見られることが多い漏出性ＢＢＢを正すことを可能にする。回帰直線より上の値、及び特に、正常アルブミン指数で囲んだ領域内の値は、髄腔内抗体合成の可能性（すなわち、脱髄の因果関係）を示している。

【0167】

対象のアルブミン指数は次のように算出することができる：アルブミン指数＝ＣＳＦアルブミン（ｍｇ／Ｌ）／血清アルブミン（ｇ／Ｌ）。ＡＩは、血清アルブミン濃度に対して調整されたＢＢＢの完全性の指標である。ＡＩはＢＢＢ機能障害で上昇するが、若干の制限がある。例えば、ＬｅＶｉｎｅ ＳＭ．Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１６，Ａｐｒ．１２；１６：４７．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８８３－０１６－０５６４－９．ＰＭＩＤ：２７０６７０００；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４８２８７

【0168】

ＥＬＩＳＡ指数は以下のように算出する／決定することができる。
細菌抗原の調製：選択基準：抗原を採取する前に、ＥＬＩＳＡの最適化について種々のＯＤを得るために連続希釈を実施した。細菌株は凍結乾燥、凍結乾燥培養物としてＡＴＣＣから入手した。製品シートに指定された適切な培地とインキュベート条件を用いて、培養物を再水和した。生物は、凍結乾燥状態から出し、増殖の指数増殖期に入るとすぐにストック培養物を１０％グリセロールの最終濃度にて－８０℃で保存した。抗原採取を目的としたブロス培養物及びプレート培養物は、指数増殖期の間にまたはその直後に採取した。抗原を採取する前に、ブロス培養物からの細胞をＰＢＳで洗浄し、約１０ｅ８～１０ｅ９の細胞に相当する１．０のＯＤを得るためにプレート培養物とブロス培養物の双方から連続希釈を行った。液体中の細菌細胞の濃度を推定するために使用される一般的な測定基準である６００ｎｍでＧｅｎ５ ２．０８ＥＬＩＳＡプレートリーダーでプレートを読み取った。連続サイクル時間、４０％のデューティサイクル、及びＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０にて位置４．５で細胞を１０秒間超音波処理した。超音波処理した生物を次いで、将来の使用のために－８０℃で保存した

【0169】

ＥＬＩＳＡの最適化：平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを使用し、５０μＬ／ウェルの採取した抗原（超音波処理した細菌）でコーティングし、カバーし、４℃で一晩揺り動かした。Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を伴ったリン酸緩衝生理食塩水でプレートを洗浄し（洗浄は１００μＬ／ウェルの緩衝液で行った）、室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、再度ＰＢＳＴで洗浄した後、適切な一次抗体を適用し、それをＲＴで２時間揺り動かした。一次抗体のインキュベートに続いて、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、適切な二次抗体を適用し、それをＲＴで１時間揺り動かした。二次抗体のインキュベートに続いて、プレートをＰＢＳＴ、その後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢによって５分間洗浄した。１００μＬ／ウェルの２規定の硫酸（２Ｎ ＨＣｌ）によって反応を停止し、Ｇｅｎ５ ２．０８ＥＬＩＳＡプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。

【0170】

ＥＬＩＳＡ手順を最適化するために一連の工程を要した。１）種々の一次抗菌抗体を、強い及び弱い（バックグラウンドのすぐ上にある）陽性対照が得られる濃度からなる最良の陽性対照について評価した。これらの抗体は、モノクローナル抗ペプチドグリカン（ｍＡｂ９９５）、モノクローナル抗ＬＰＳ、及びポリクローナル抗ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなった。２）抗菌抗体の使用に加えて、１０ｍｇ／ｄｌのＩｇＧを陽性対照として有するヒトＣＳＦ対照であるＲａｎｄｏｘ（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ、ＵＫ）、陰性対照としてＲａｎｄｏｘを枯渇させたものも使用した。この枯渇はＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰキット（ＧＥ）で達成し、枯渇はＨｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ ＩｇＧ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で検証した。最適な枯渇を得るには２回のパスで十分であると判断された。３）その後、種々のブロッキング剤を各抗体濃度で評価して、どれが最も効率的であるかを見いだし、それらには５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ウシ血清で補完したＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中のブロッカーＢＬＯＴＴＯ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ブロッカーカゼイン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びスターティングブロッカー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれた。４）前述の最適化と共に、次に抗原コーティング濃度を約０．５、約１．０及び約２．０のＯＤを用いて調整した。実際、プレートはその後、指定された希釈：抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ＰＩ－２０００、１：３０００）、抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ＰＩ－１０００、１：３０００）、及び抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１０，０００）での適切な二次抗体を伴った。これらの最適化工程は各細菌生物に対して行われた。

【0171】

最適化プロセス全体を通して、ウサギ抗－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、強弱陽性双方の濃度はさまざまであるが、調べた生物にとって最適な一次抗菌抗体だった。調べた生物に特異的な抗体を使用することができる一方で、使用したポリクローナル抗体は細菌に共通する特徴を認識するためには十分であり、はるかに費用効果が高かった。およそ１．０のＯＤが得られる抗体の連続希釈を強陽性対照として使用し、バックグラウンドのすぐ上にあるものを弱陽性対照として使用した。Ｒａｎｄｏｘは、ＣＳＦ試料の精度の制御を確立するためではあるが、陽性対照としても役立った。同様に、Ｒａｎｄｏｘを枯渇させたものは陰性対照として役立ち、ＥＬＩＳＡ指数（ＥＩ）を算出するのに使用した。

【0172】

ＥＬＩＳＡの分析：ＣＳＦ及び希釈血清試料ごとに２つ組で実行し、対照は３つ組で実行した。ＥＩを得るために、各実験試料と対照試料の平均ＯＤを取得し、別名本発明者らの「カットオフキャリブレーター」として知られるＲａｎｄｏｘを枯渇させたもので除算した。これは、再現性を示すために、またＩｇＧの髄腔内合成を評価するためにそれぞれの患者の血清で繰り返された。これは、血清をＣＳＦの同じ濃度まで希釈し、ＣＳＦのＯＤの希釈血清のＯＤに対する比率を使用することによって達成された。ＯＤが１より大きいものはすべて髄腔内合成を示唆している（Ｈａｌｐｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８９）。

【0173】

アルブミン指数に対してＥＩを比較することを含む方法を用いて、脱髄がある患者における髄腔内抗体合成（例えば、本明細書で開示されている、例えば、表８に列挙されている１以上の微生物に対する抗体）を示すこと及び／または判定することができる。この方法を用いて治療を指図することができる。例えば、対象３は、いくつかの異なるＭＳ候補抗原（例えば、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、及Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に対して非常に高いＥＩ値を示す。しかしながら、対象３のアルブミン指数も非常に高く（約３０）、漏出性ＢＢＢを示す。さらに、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａに対する対象３の抗体レベルは予想レベル（線形回帰直線）を上回っている。このデータは、対象３が、血清からの漏出だけで説明できるよりも多くのＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａに対する抗体を産生していることを示している。開示されている方法を使用して、脱髄の因果関係を証明し、次に治療を指図するために使用することができる抗体（すなわち、脳及び脊髄で作製された抗体）の髄腔内産生を評価することができる。

【0174】

抗体の髄腔内産生を決定するための他の方法が知られている。例えば、最も直接的な方法は、血清（通常は約１０００ｍｇ／ｄｌ）及びＣＳＦ（通常は＜５）双方における総ＩｇＧ濃度を測定し、血清を適切に希釈し、総ＩｇＧ濃度が同じであるＣＳＦと血清の双方のＥＩを測定することである。この方法は「直接法」と呼ばれ、ＣＳＦのＥＩの血清のＥＩに対する比が１．０以下である。＞１．０の比は髄腔内抗体産生を示す。

【0175】

ＣＳＦと血清の直接比較は、５つの細菌抗原（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に対する脱髄対象の一部について実施された。この分析は抗原の一部に対するＭＳ対象８２及び８３について＞１．０のＣＳＦ／血清のＥＩ比を示した。他のＥＩ比は＜１．０だったということは、ＣＳＦよりも血清中の抗体が多いことを示している。

【0176】

しかしながら、微生物のＥＩ対アルブミン指数の方法はＣＳＦにおける抗体レベルが予想よりも高かった他のいくつかの対象を特定した。これらには、対象１０（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、対象７２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、対象１３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及び対象３（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）が含まれる。この方法は、ＢＢＢが損なわれていないことを判定する既知の方法を用いて、さもなければ見逃され得る対象を特定するのに使用することができる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図4-6】

【図4-7】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【国際調査報告】