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特表2022-516449チャイニーズハムスター卵巣細胞における内在性レトロウイルスの特性評価および不活性化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-28
(54)【発明の名称】チャイニーズハムスター卵巣細胞における内在性レトロウイルスの特性評価および不活性化
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220218BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220218BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20220218BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220218BHJP
C12N 15/48 20060101ALN20220218BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20220218BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220218BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20220218BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20220218BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12P21/02 C
C12N5/071
C12N15/09 100
C12N15/48
C12N7/00
C12N15/113 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021536796
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(85)【翻訳文提出日】2021-08-20
(86)【国際出願番号】 EP2019086873
(87)【国際公開番号】W WO2020136149
(87)【国際公開日】2020-07-02
(31)【優先権主張番号】62/784,566
(32)【優先日】2018-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】521177418
【氏名又は名称】セレキシス エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】デュロワ，ピエール－オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】ボスハルト，サンドラ
(72)【発明者】
【氏名】ル メルシェ，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】シュミッド－ジーガード，エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】マーモッド，ニコラス
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA17
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
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4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA16
4B065CA44
(57)【要約】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に埋め込まれたＣ型内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）を変化させて、培養物上澄みにおけるレトロウイルスおよび／またはレトロウイルス様粒子の放出を修正する。これらの粒子の感染力の証拠は欠いているが、それらの存在は安全性への懸念を提起している。機能的に保存されたグループにクラスター化された１７３個のＣ型ＥＲＶ配列が同定された。１つのＣ型ＥＲＶグループからの転写物は、インタクトなオープンリーディングフレームを有する完全長であり、かつレトロウイルス様粒子の中に負荷された対応するウイルスＲＮＡゲノムを有するものと特定された。またウイルス粒子からのゲノムＲＮＡの配列分析から、それらが少ない発現されたＥＲＶ配列に起因し得ることが示された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いた、発現されたＥＲＶグループのｇａｇ遺伝子の分断／変化が本明細書に開示されている。ＤＮＡおよびｍＲＮＡレベルでのＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異の比較により、ＣＨＯ細胞からのウイルスＲＮＡが負荷された粒子の放出に関与する単一のＥＲＶ遺伝子座が同定された。この特定のＥＲＶ遺伝子座におけるＧａｇ機能喪失突然変異を有するクローンは、２５０倍を超える細胞上澄み中でのウイルスＲＮＡを含む粒子の減少を示した。特にＥＲＶ突然変異誘発は、細胞増殖、細胞サイズまたは組換えタンパク質産生を損なわなかった。バイオ医薬品製造中のＣＨＯ内在性レトロウイルスからの潜在的汚染を軽減するための新しい戦略および細胞、特に操作されたＣＨＯ細胞が本明細書において提供されている。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、そのゲノムに組み込まれた少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含むグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む前記細胞のゲノムを含み、
前記ゲノムは、前記グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列の１つ以上のｇａｇ配列内に１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個などの１個以上であるが２０個以下の変化を含み、それにより１つ以上の改変されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を生じさせ、かつ
前記変化の少なくとも１つは、前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のｇａｇ遺伝子内にあり、それにより少なくとも１つの改変された完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を生じさせる
ことを特徴とする、細胞。
【請求項2】
前記ゲノムは、前記ゲノムに組み込まれた前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む１００個超、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００個超のグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項3】
前記ゲノムに組み込まれた前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列は、配列番号３またはそれと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％超の配列同一性を有する配列に対応する、請求項１または２に記載の操作された細胞。
【請求項4】
前記１００個超、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００個超のグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のうち、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００超は完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列である、請求項２または３に記載の操作された細胞。
【請求項5】
前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のｇａｇ遺伝子内の前記少なくとも１つの変化の少なくとも１つは、機能喪失突然変異である、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項6】
前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列における前記変化は、翻訳の開始を阻止する、またはフレームシフトをＰＰＹＰモチーフの下流で前記ｇａｇ遺伝子に導入する、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項7】
前記変化は、前記完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列の１個以下の前記ｇａｇ遺伝子内、好ましくは配列番号３内、より好ましくは前記Ｍｙｒおよび／またはＰＰＹＰ Ｇａｇ出芽モチーフ、または、前記Ｍｙｒおよび／またはＰＰＹＰ Ｇａｇ出芽モチーフの５’および／または３’の連続したヌクレオチドを含む最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個のヌクレオチドの配列内にある、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項8】
前記変化は、前記ゲノムからの配列番号３またはそれと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を有する配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヌクレオチド、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％以上連続したヌクレオチドの欠失、および任意に配列番号１のヌクレオチド１～３００２０および３９３４８～５９５５８の欠失を含む変化を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項9】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および長い末端反復（ＬＴＲ）を含み、かつ前記ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／または前記ＬＴＲに少なくとも１つの変化を含む配列を含む前記細胞のゲノムを含み、
前記配列は、
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号１、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のバリアント、あるいは
（ｉｖ）前記ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／または前記ＬＴＲ以外で、（ｉ）および／または（ｉｉ）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を有する配列
から選択され、
前記少なくとも１つの変化は、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される
ことを特徴とする、細胞。
【請求項10】
前記少なくとも１つの変化は、前記ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／または前記ＬＴＲ内にあり、かつ前記ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／または前記ＬＴＲの連続したヌクレオチドを含む１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２個以下のヌクレオチドまたは前記ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／または前記ＬＴＲの１個のヌクレオチド内にある、請求項９に記載の操作された細胞。
【請求項11】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、そのゲノムは、（ｉ）配列番号３の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以下の連続したヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）との９０％超の配列同一性を有する配列
を含む
ことを特徴とする、細胞。
【請求項12】
前記少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列における前記変化は、ＰＰＹＰモチーフを含む前記ｇａｇ遺伝子内にあり、かつ（ｉ）前記ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または連続したヌクレオチドを含む最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個のヌクレオチドの配列、（ｉ）の前記配列の両端に位置する５’および／または３’は前記変化を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項13】
前記ゲノムは、前記グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列または１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下の改変されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列内に１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下の変化を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項14】
前記変化は欠失、挿入、置換もしくはそれらの組み合わせ、好ましくはアミノ末端グリシン残基を除去または置換することによりＧＡＧタンパク質のミリストイル化を阻害する１つまたはいくつかの突然変異、または宿主細胞からのウイルス粒子の放出を阻害するＰＰＹＰ突然変異、またはｇａｇ ｍＲＮＡの完全長ＧＡＧタンパク質への翻訳を妨害する１つもしくはいくつかのフレームシフト突然変異などの、Ｎ末端ＭｙｒモチーフをコードするＤＮＡ配列の変化である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項15】
前記変化はフレームシフト突然変異である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項16】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、そのゲノムに組み込まれたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む前記細胞のゲノムを含み、
配列番号３または配列番号３の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％連続したヌクレオチドなどの少なくとも１つ（１つを含む）の完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列、および任意に、配列番号３の両端に位置する１～５０、３０～１００、５０～１５０、１００～２００または２００、３００、４００超または５００超の連続したヌクレオチドを含む配列番号３の５’および／または３’フランキング領域は前記ゲノムから欠失されている
ことを特徴とする細胞。
【請求項17】
前記フランキング領域はそれぞれ配列番号４および配列番号５である、請求項１６に記載の操作された細胞。
【請求項18】
前記細胞の前記ゲノムは、（ｉ）配列番号４の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％連続したヌクレオチドおよび／またはそれと少なくとも９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有し、かつそれに直接隣接している配列、
（ｉｉ）配列番号５の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％連続したヌクレオチドおよび／またはそれと少なくとも９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列
を含む、請求項１６または１７に記載の操作された細胞。
【請求項19】
前記変化は、連続したヌクレオチドを含む少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの挿入、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの欠失またはそれらの組み合わせ、あるいは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの付加および／または除去において一緒に生じる挿入、置換および／または欠失の組み合わせである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項20】
前記ＥＲＶ要素は、槽内白血病ウイルス、コアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＥＲＶ、ネコ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ブタＣ型内在性レトロウイルスおよび／または槽内白血病ウイルスを含むガンマもしくはベータレトロウイルスＥＲＶからのものである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項21】
前記細胞は、時間単位当たりでいくつかのウイルス粒子（ＶＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはレトロウイルス（様）粒子（ＲＶ（Ｌ）Ｐ）を放出し、前記数はその操作されていない対応物によって放出される時間単位当たりのＶＰ、ＶＬＰまたはＲＶ（Ｌ）Ｐに対して好ましくは２倍超、より好ましくは１０倍超、さらにより好ましくは５０倍超、１００超倍、１５０倍超、２００倍超または２５０倍超減少している、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項22】
前記操作された細胞はＶＰ、特にＲＶＰを全く放出しないか実質的に放出しない、請求項１～２１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項23】
前記細胞は、導入遺伝子、好ましくは前記ゲノムに組み込まれた導入遺伝子をさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項24】
前記導入遺伝子は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）および／またはバイオ治療薬および／または非翻訳ＲＮＡなどのマーカータンパク質をコードするマーカー遺伝子である、請求項２３に記載の操作された細胞。
【請求項25】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、配列番号３またはそのバリアントを含み、かつｓｉＲＮＡをコードする配列をさらに含む前記細胞のゲノムを含み、
前記ｓｉＲＮＡの標的配列は配列番号３またはそのバリアント内、より好ましくはＧａｇ前駆体タンパク質をコードする配列番号３の配列またはそのバリアント内に位置する
ことを特徴とする細胞。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作された細胞を提供する工程と、バイオ治療薬などの導入遺伝子産物をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を前記操作された細胞に導入する工程と、
前記細胞において前記少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる工程であって、前記操作された細胞はＶＰまたはＶＬＰを全く放出しないか実質的に放出しない工程と
を含む、導入遺伝子産物を産生するための方法。
【請求項27】
（ｉ）配列番号３に対する少なくとも１つプライマー、および／または（ｉｉ）配列番号４または５に対する少なくとも１つのプライマー、ならびに
ＣＨＯ細胞のゲノムから配列番号１、配列番号３の有無、あるいは前記ＣＨＯ細胞のゲノムの配列番号３内の突然変異を検出するために（ｉ）および／または（ｉｉ）の前記プライマーを使用する方法に関する説明書
を含む、検出キットおよびその使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ウイルスなどの外来性物質によるバイオ医薬品の汚染は薬物供給を妨害し、それにより患者の安全を危険に曝す可能性がある。バイオ医薬品のウイルス汚染は稀であるがそれでもなお起こるものであり（１）、治療用タンパク質製剤におけるウイルス汚染のリスクを軽減することは最優先事項のままである。
【0002】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、バイオ医薬品のために最も広く使用されている哺乳類発現系である。とりわけＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質産生のために使用されている他の細胞株と比較して、その優れた安全性プロファイルの観点から好ましい産生宿主になった。例えばＣＨＯ細胞は、多くのヒトおよびマウスのレトロウイルスによって誘発される感染への抵抗性を含み、特定のウイルス感染に対して低い感受性を有することが分かっており（１）、マウスのレトロウイルスのいくつかは他の哺乳類細胞を感染させることが知られている（２、３）。さらにＣＨＯ細胞は他の齧歯類細胞とは異なり、哺乳類細胞、特にヒト細胞において複製することができる感染性レトロウイルスを産生することができないように見えた（３～６）。しかしウイルス様粒子（ＶＬＰ）がＣＨＯ細胞内で検出され、かつ培養培地で出芽して分離していた（７～１１）。そのようなＶＬＰの存在は、ハムスターからヒトへ内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の感染の可能性があるというリスクが残るだけでなく、他の外来性物質の検出を妨害してその感度を低下させるという理由から、安全性および規制上の懸念を生じさせる。
【0003】
本発明を例示し、かつ特に本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で使用されている特許および特許出願を含む刊行物および他の資料は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。便宜上それらの刊行物は、添付の文献目録を参照するための番号、または著者らの名前および発行年、あるいは特許／特許公開番号のいずれかによって以下の本文中で参照されている。
【0004】
ＶＬＰはいくつかの研究室によって独立して検出され、これは、それらが外因性感染ではなくＣＨＯゲノムの中に安定に組み込まれたＥＲＶに起因していることを示唆している（１２）。ＣＨＯ細胞は、槽内Ａ型ＥＲＶ（ＩＡＰ）、すなわち小胞体の槽内で未成熟粒子を形成する欠陥のあるＥＲＶクラス（１３）、および出芽しているＣ型ＥＲＶ（６、１２）の２つのクラスのＥＲＶを有する。Ｃ型ＥＲＶ配列は不完全に特性評価されたままであるが、以前の研究により、約１００～３００個のＣ型ＥＲＶ配列がＣＨＯゲノム中に存在し得ると推定された（６）。それらのうちいくつかは、ＭＬ２Ｇレトロウイルスなどの完全長の活発に転写されるプロウイルスであるように思われた（１０、１２）。しかし、Ｌｉｅらによって記載されたＭＬ２Ｇ ＥＲＶ配列は、その遺伝子のそれぞれ（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）の中にフレームシフト突然変異を含み、これは、この遺伝子座にある特異的ＥＲＶ配列がどんなＶＬＰも産生しないことを示唆している（１２）。それにも関わらず、この刊行物はこの種のＥＲＶ配列の他のメンバーが転写され、かつＶＬＰを産生する場合があることを示した。ＭＬ２Ｇ転写物は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ファミリーと約６４％の配列同一性を共有している。
【0005】
ＣＨＯ細胞は一般に非感染性レトロウイルス粒子を産生すると考えられているが、その理由はそれらの感染力を実証することができないからである。それにも関わらず、ＣＨＯゲノム中の数えきれない予測されるＣ型ＥＲＶプロウイルスの少なくとも１種が感染性であるか感染性になるというリスクを排除することはできない。これは、いくつかの化学処理の際に観察されるように（１４）、後成的に発現停止されたＥＲＶが発現される状態となった場合、機能不全ＥＲＶが機能獲得突然変異を獲得し得る場合、またはＥＲＶが互いに組換えを起こすかトランス補完する場合に起こり得る。そのような遺伝子の変化は、全体的に高まった遺伝的不安定性を有するＣＨＯ細胞などの不死化細胞株において起こる可能性が高い（１５）。特に、ＣＨＯ Ｃ型ＥＲＶがＭＬＶファミリー（種の垣根を超えて霊長類細胞さえも感染させることが知られているレトロウイルスファミリー）と酷似していること（１６）は、ＣＨＯ粒子が他のレトロウイルスで見られるようにヒトにとって病原体となる可能性を有し得ることをさらに示している（１７）。最後に、ＣＨＯ細胞ＶＬＰは、ウイルス粒子（ＶＰ）について期待されるようなＣ型レトロウイルスに関連するウイルスゲノムＲＮＡ配列を含むことが報告された（Ｄｅ Ｗｉｔ，Ｃ．，Ｆａｕｔｚ，Ｃ．，＆Ｘｕ，Ｙ．（２０００）．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ（ＣＨＯ細胞培養におけるレトロウイルス様粒子の定量化のためのリアルタイム定量的ＰＣＲ）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２８（３），１３７-１４８）。しかし、ＣＨＯ細胞によるＶＬＰおよびＶＰの放出に関与するＥＲＶ配列は特性評価されていないままである。故にＣＨＯ内在源に起因するウイルス汚染を回避するための戦略は非常に望ましい。
【0006】
ハムスターＥＲＶ感染を効率的に防止するための最も有望な戦略は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性突然変異誘発を用いてレトロウイルスを不活性化させることである。プログラム可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ系が、ヒトおよびブタの細胞においてＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）をプロウイルス配列の中に導入するために既に用いられている（１８、１９）。不正確なＤＳＢ修復は、ウイルス配列内で挿入および欠失を引き起こし、かつウイルス活性を阻害する場合がある。影響力の大きい論文において、Ｙａｎｇらは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して全ての６２個のゲノムブタＥＲＶ配列をノックアウトし、それによりＥＲＶ感染力の１０００倍超の減少を得ることができることを実証した（１９）。成功はしたが、高い細胞毒性、頻繁なゲノム再編成および低い編集効率により、ウイルス不活性化は技術的に難しいままである（１９、２０）。単一遺伝子の従来の編集と比較した多遺伝子座部位の編集効率の低下についての１つの説明は、非常に多くのＥＲＶ様配列が正確かつ突然変異を含まない修復のための修復テンプレートとして機能することができ、従ってＥＲＶ突然変異誘発に対抗し、かつ染色体再編成を促進するというものである。しかし、ＣＨＯ細胞におけるＣ型ＥＲＶ配列の不完全な特性評価ならびにゲノムＣ型ＥＲＶ配列とウイルス粒子との間の明らかな関連性の欠如は、ＣＨＯ細胞における同様のＥＲＶ不活性化戦略の確立を妨害した。
【0007】
２０１６年１２月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１９／０１９４６９４Ａ１号は、過去のウイルス／レトロウイルス感染の少ない量の残遺物を有する哺乳類細胞および哺乳類細胞株と、それを産生および使用する方法とを開示している。操作されたＣＨＯ－Ｋ１などの操作された細胞がそこに開示されている。この操作は変化、好ましくは多数の変化を細胞のゲノム内のＥＲＶの中に導入することによりゲノムを変化させて、ＶＬＰおよび／またはＶＰの放出を抑えるか無くすことを目的としていた。機能性グループ１ＥＲＶの完全なコンセンサスＤＮＡ配列が米国特許出願公開第２０１９／０１９４６９４Ａ１号の配列番号１に示されている。米国特許出願公開第２０１９／０１９４６９４Ａ１号の開示内容は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【0008】
当該技術分野では、潜在的に機能性ＶＰを全く放出しないか実質的に放出しないようにＣＨＯ細胞などの細胞を操作する必要がある。これは、細胞があらゆる導入遺伝子産物、特に治療活性を有するタンパク質を発現するように設計されている場合に特に重要である。得られる操作された細胞は、それらの導入遺伝子産物の産生における僅かな減少を示すかその減少を示さないことが必要である。当該技術分野では、特に導入遺伝子産物の産生のためにそのような操作された細胞を提供する必要がある。ＣＨＯ培養物上澄みにおける不完全に特性評価されているレトロウイルス核酸の存在を制限するか無くすことも必要である。この必要性および他の必要性を本明細書において対処する。
【発明の概要】
【0009】
ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いてゲノム、トランスクリプトームおよびウイルス粒子レベルで、出芽しているＣ型ＥＲＶ配列を深く特性評価した。以前の研究とは対照的に、オープンリーディングフレームを含む完全長転写物をもたらす転写されたＣ型ＥＲＶグループ１配列を同定し、これは、このＥＲＶグループが潜在的に機能性のレトロウイルスをもたらすことを示唆している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いて、発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を突然変異させ、単一ＥＲＶのｇａｇ遺伝子内の特異的な機能喪失突然変異が、２５０倍超の機能性ウイルスＲＮＡが負荷された粒子の放出を減少させるのに十分であることを証明することができた。これは単一のＥＲＶ遺伝子座が、ＣＨＯ細胞から放出された大部分のＣ型ウイルス粒子に関与していることを示した。要するに、バイオ治療薬（本明細書では治療薬ともいう）を産生するＣＨＯ細胞の培養物における内在性ウイルス汚染の完全な根絶への道を開く、ＣＨＯ細胞の安全性プロファイルをさらに向上させるための新規な戦略が本明細書において提供されている。
【0010】
本発明は一実施形態では、操作されたＣＨＯ－Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、そのゲノムに組み込まれた少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含むグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む上記細胞のゲノムを含み、当該ゲノムは、グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列の１つ以上のｇａｇ配列内に１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個などの１個以上であるが２０個以下の変化を含み、それにより１つ以上の改変されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を生じさせ、かつ当該変化の少なくとも１つは少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のｇａｇ遺伝子内にあり、それにより少なくとも１つの改変された完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を生じさせることを特徴とする細胞に関する。
【0011】
当該ゲノムは、当該ゲノムに組み込まれた少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む１００個超、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００個超のグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含んでいてもよい。
【0012】
当該ゲノムに組み込まれた少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列は、配列番号３またはそれと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％超の配列同一性を有する配列に対応していてもよい。
【0013】
１００個超、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００個超のグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のうち、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００超は完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列であってもよい。
【0014】
少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のｇａｇ遺伝子内の少なくとも１つの変化の少なくとも１つは、機能喪失突然変異であってもよい。
【0015】
少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列における変化は翻訳の開始を阻止してもよく、あるいはフレームシフトをＰＰＹＰモチーフの下流でｇａｇ遺伝子に導入してもよい。
【0016】
当該変化は、完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列の１個以下のｇａｇ遺伝子内、好ましくは配列番号３内、より好ましくはＭｙｒおよび／またはＰＰＹＰ Ｇａｇ出芽モチーフ、または、Ｍｙｒおよび／またはＰＰＹＰ Ｇａｇ出芽モチーフの５’および／または３’の連続したヌクレオチドを含む最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個のヌクレオチドの配列内にあってもよい。
【0017】
当該変化は、当該ゲノムからの配列番号３またはそれと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を有する配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヌクレオチド、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％以上連続したヌクレオチドの欠失、および任意に配列番号１のヌクレオチド１～３００２０および３９３４８～５９５５８の欠失を含む変化を含んでもよい。
【0018】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、
ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および長い末端反復（ＬＴＲ）を含み、かつｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲに少なくとも１つの変化を含む配列を含む上記細胞のゲノムを含み、
上記配列は、
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号１、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のバリアント、あるいは
（ｉｖ）ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲ以外で、（ｉ）および／または（ｉｉ）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を有する配列
から選択され、
前記少なくとも１つの変化は、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする操作された細胞も本明細書に開示されている。
ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および長い末端反復（ＬＴＲ）を含み、かつｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲに少なくとも１つの変化を含む配列を含む上記細胞のゲノムを含み、
上記配列は、
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号１、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のバリアント、あるいは
（ｉｖ）ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲ以外で、（ｉ）および／または（ｉｉ）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を有する配列
から選択され、
前記少なくとも１つの変化は、挿入、欠失、置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする操作された細胞も本明細書に開示されている。
【0019】
少なくとも１つの変化は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲ内にあってもよく、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲの連続したヌクレオチドを含む１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２個以下のヌクレオチドまたは１個のヌクレオチド内にある。
【0020】
操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、そのゲノムは、
（ｉ）配列番号３の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以下の連続したヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）との９０％超の配列同一性を有する配列
を含む
ことを特徴とする操作された細胞も本明細書に開示されている。
（ｉ）配列番号３の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以下の連続したヌクレオチド、または
（ｉｉ）（ｉ）との９０％超の配列同一性を有する配列
を含む
ことを特徴とする操作された細胞も本明細書に開示されている。
【0021】
少なくとも１つの完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列における変化は、ＰＰＹＰモチーフを含むｇａｇ遺伝子内にあってもよく、ここでは（ｉ）ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または連続したヌクレオチドを含む最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個のヌクレオチドの配列、（ｉ）の配列の両端に位置する５’および／または３’が変化を含んでいてもよい。
【0022】
当該ゲノムは、グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列に１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下の変化を含んでいてもよい。
【0023】
当該ゲノムは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下の改変されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含んでいてもよい。
【0024】
当該変化は、欠失、挿入、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくはアミノ末端グリシン残基を除去または置換することによりｇａｇタンパク質のミリストイル化を阻害し得る１つまたはいくつかの突然変異、または宿主細胞からのウイルス粒子の放出を阻害し得るＰＰＹＰ突然変異、またはｇａｇ ｍＲＮＡの完全長ＧＡＧタンパク質への翻訳を妨害し得る１つもしくはいくつかのフレームシフト突然変異などのＮ末端ＭｙｒモチーフをコードするＤＮＡ配列の変化であってもよい。
【0025】
当該変化はフレームシフト突然変異であってもよい。
【0026】
本発明はさらなる実施形態では、操作されたＣＨＯ－Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、
そのゲノムに組み込まれたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む上記細胞のゲノムを含み、
配列番号３または配列番号３の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％連続したヌクレオチドなどの少なくとも１つ（１つを含む）の完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列、および
任意に、配列番号３の両端に位置する１～５０、３０～１００、５０～１５０、１００～２００または２００、３００、４００超または５００超の連続したヌクレオチドを含む配列番号３の５’および／または３’フランキング領域（すなわち、当該ゲノムにおいて配列番号３の５’および／または３’に位置している配列）が当該ゲノムから欠失されている
ことを特徴とする操作された細胞に関する。
そのゲノムに組み込まれたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む上記細胞のゲノムを含み、
配列番号３または配列番号３の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％連続したヌクレオチドなどの少なくとも１つ（１つを含む）の完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列、および
任意に、配列番号３の両端に位置する１～５０、３０～１００、５０～１５０、１００～２００または２００、３００、４００超または５００超の連続したヌクレオチドを含む配列番号３の５’および／または３’フランキング領域（すなわち、当該ゲノムにおいて配列番号３の５’および／または３’に位置している配列）が当該ゲノムから欠失されている
ことを特徴とする操作された細胞に関する。
【0027】
フランキング領域はそれぞれ配列番号４および配列番号５であってもよい。
【0028】
上記細胞のゲノムは、（ｉ）配列番号４の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％連続したヌクレオチド、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有し、かつそれに直接隣接している配列、配列番号５の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％連続したヌクレオチド、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。好ましくは、配列番号４は得られる配列内の配列番号５の５’である。
【0029】
当該変化は、連続したヌクレオチドを含む少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの挿入、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの欠失またはそれらの組み合わせ、あるいは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０もしくは１００個のヌクレオチドの付加および／または除去において一緒に生じる挿入、置換および／または欠失の組み合わせであってもよい。
【0030】
ＥＲＶ要素は、槽内白血病ウイルス、コアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＥＲＶ、ネコ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ブタＣ型内在性レトロウイルスおよび／または槽内白血病ウイルスを含むガンマもしくはベータレトロウイルスＥＲＶからのものであってもよい。
【0031】
操作された細胞は、時間単位当たりでいくつかのウイルス粒子（ＶＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）および／またはレトロウイルス（様）粒子（ＲＶ（Ｌ）Ｐ）を放出してもよく、その数は、その操作されていない対応物によって放出される時間単位当たりのＶＰ、ＶＬＰおよび／またはＲＶ（Ｌ）Ｐに対して、好ましくは２倍超、より好ましくは１０倍超、さらにより好ましくは５０倍超、１００超倍、１５０倍超、２００倍超または２５０倍超減少している。
【0032】
操作された細胞は、ＶＰおよび／またはＶＬＰを全く放出しないか実質的に放出しなくてもよく、特にＲＶＰおよび／またはＲＶＬＰを実質的に放出しなくてもよい。
【0033】
操作された細胞は、好ましくは当該ゲノムに組み込まれた導入遺伝子をさらに含んでいてもよい。
【0034】
導入遺伝子は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、バイオ治療薬および／または非翻訳ＲＮＡなどのマーカータンパク質をコードするマーカー遺伝子であってもよい。
【0035】
本発明はさらなる実施形態では、
操作されたＣＨＯ－Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、
配列番号３またはそのバリアントを含み、かつｓｉＲＮＡをコードする配列をさらに含む上記細胞のゲノムを含み、
ｓｉＲＮＡの標的配列は、配列番号３内、好ましくは配列番号３の配列またはそのバリアント内、より好ましくはｇａｇ前駆体タンパク質をコードする配列番号３の配列またはそのバリアント内に位置している
ことを特徴とする操作された細胞に関する。
操作されたＣＨＯ－Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの好ましくは哺乳類細胞株の操作された細胞であって、
配列番号３またはそのバリアントを含み、かつｓｉＲＮＡをコードする配列をさらに含む上記細胞のゲノムを含み、
ｓｉＲＮＡの標的配列は、配列番号３内、好ましくは配列番号３の配列またはそのバリアント内、より好ましくはｇａｇ前駆体タンパク質をコードする配列番号３の配列またはそのバリアント内に位置している
ことを特徴とする操作された細胞に関する。
【0036】
本発明はさらなる実施形態では、
前記請求項のいずれか１項に記載の操作された細胞を提供する工程と、
バイオ治療薬などの導入遺伝子産物をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を操作された細胞に導入する工程と、
当該細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる工程であって、前記操作された細胞はＶＬＰを全く放出しないか実質的に放出しない工程と
を含む、導入遺伝子産物を産生するための方法に関する。
前記請求項のいずれか１項に記載の操作された細胞を提供する工程と、
バイオ治療薬などの導入遺伝子産物をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を操作された細胞に導入する工程と、
当該細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる工程であって、前記操作された細胞はＶＬＰを全く放出しないか実質的に放出しない工程と
を含む、導入遺伝子産物を産生するための方法に関する。
【0037】
（ｉ）配列番号３に対する少なくとも１つのプライマー、および／または
（ｉｉ）配列番号４または５に対する少なくとも１つのプライマー、および
ＣＨＯ細胞のゲノムから配列番号１、配列番号３の有無またはＣＨＯ細胞のゲノムの配列番号３内の突然変異を検出するために（ｉ）および／または（ｉｉ）のプライマーを使用する方法に関する説明書
を含む、検出キットおよびその使用も開示されている。
（ｉｉ）配列番号４または５に対する少なくとも１つのプライマー、および
ＣＨＯ細胞のゲノムから配列番号１、配列番号３の有無またはＣＨＯ細胞のゲノムの配列番号３内の突然変異を検出するために（ｉ）および／または（ｉｉ）のプライマーを使用する方法に関する説明書
を含む、検出キットおよびその使用も開示されている。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】ＣＨＯ－Ｋ１ゲノム内の完全長Ｃ型ＥＲＶ ＤＮＡ配列の系統学的分析。配列アラインメントは標準的なパラメータ、すなわち２００ＰＡＭ／ｋ＝２のスコア行列、２．５５のギャップオープンペナルティおよび０．１２３の提供値により、ＭＡＦＦＴアライナーのバージョン７（６４）を用いて実現した。アラインメントは、完全なｇａｇ－ｐｏｌ－ｅｎｖ配列（Ａ）のために、あるいは１１２個の完全長Ｃ型ＥＲＶのｇａｇ（Ｂ）、ｐｏｌ（Ｃ）およびｅｎｖ（Ｄ）配列において別々に実現した。ＧＥＮＥＩＯＵＳ Ｔｒｅｅ Ｂｕｉｌｄｅｒのバージョン１１．１．５を用い、かつ遺伝的距離モデルＨＫＹおよび配列類似性に基づくＵＰＧＭＡ法を用いて、これらのアラインメントから系統樹を作成した。系統樹の下のスケールは１つのヌクレオチド当たりの置換率を示す。その３つのサブクラスターを有するグループ１およびグループ２は角括弧によって示されている。
【図2】野生型ＣＨＯ細胞において発現されたＣ型ＥＲＶ配列の特性評価。グループ１およびグループ２Ｃ型ＥＲＶ配列においてＣＨＯ－Ｋ１細胞から得られた全細胞内ＲＮＡ（Ａ）またはウイルス粒子ＲＮＡ（Ｂ）のＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングリードのマッピング。グループ１のためのコンセンサス配列に対し、グループ２ＥＲＶのために２つの異なる遺伝子座（遺伝子座Ａおよび遺伝子座Ｂ）上でリードをマッピングした。マッピングしたリードの最大数が各パネルの左軸に示されており、ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（１００万個のリードの１キロベース当たりのリード数））が右側に記載されている。（Ｃ）グループ１Ｃ型ＥＲＶを特異的に標的とする蛍光プローブを用いたＣＨＯ－Ｋ１染色体ＦＩＳＨ分析の代表的な分裂中期スプレッド。染色体ＤＮＡが表されており、組み込まれたレトロウイルス配列のＦＩＳＨシグナルはより薄い色の点として示されている。（Ｄ）３つの代表的な細胞分裂間期ＣＨＯ－Ｋ１細胞が示されており、ｍＲＮＡは中央領域に示され、グループ１Ｃ型ＥＲＶ ＲＮＡは末端に示されている。明るい薄い色の点は、転写部位における発生期のグループ１ｍＲＮＡを表す。遺伝子座ＡおよびＢ上のグループ２ＥＲＶの概略図（Ａ）に存在する印は、これらのＥＲＶ配列において生じる突然変異型、すなわちＮ末端に２つのフレームシフト突然変異、およびＣ型グループ２ＥＲＶ遺伝子座Ａの図（左）に３つの終止コドン突然変異、およびＣ型グループ２ＥＲＶ遺伝子座Ｂの図（左）に２つの欠失を示し、その欠失サイズは塩基の数として示されている。
【図3】ＥＲＶ突然変異誘発のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的部位。ｇａｇグループ１Ｃ型ＥＲＶのミリストイル化（Ｍｙｒ）およびＰＰＹＰモチーフを標的とするように設計された８つのｓｇＲＮＡ配列の向きおよび位置が灰色の矢印によって示されている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＤＳＢ部位は、順鎖（Ｍｙｒ２、ＰＰＹＰ５、ＰＰＹＰ６、ＰＰＹＰ７）を標的とするｓｇＲＮＡのための白い三角形、および逆鎖（Ｍｙｒ４、Ｍｙｒ８、ＰＰＹＰ１３、ＰＰＹＰ２０）を標的とするｓｇＲＮＡのための黒い三角形によって示されている。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位は太字で示されている。
【図4】ＭｙｒおよびＰＰＹＰモチーフのフランキング領域における配列多様性の評価およびＤＮＡディープシーケンシングによるＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異の分析。ＭｙｒおよびＰＰＹＰ ＣＲＩＳＰＲ標的部位を取り囲んでいる約３００ｂｐの標的増幅をＣ型ＥＲＶ特異的プライマーを用いて行い、アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングにより分析した。クラスター分析は、Ｍｙｒ（Ａ）およびＰＰＹＰ（Ｂ）フランキング配列からの野生型ＣＨＯ－Ｋ１ディープシーケンシングリードの９７％類似性に基づいていた。クラスターは、図１に同定されている系統学的グループに従って角括弧によって示されている。Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡおよびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ認識部位ならびに隣接するＰＡＭ配列を含むクラスターは太字で示されており、標的部位当たりの最も豊富なクラスターは、Ｍｙｒのためのクラスター８（Ａ）／（Ｅ）およびＰＰＹＰのためのクラスター２４２５（Ｂ）／（Ｆ）である。右側にある値は、リードの総数に対する各サブクラスターのために得られたリード頻度を表す。（Ｃ）Ｍｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ処理された多クローン集団から単離された７つのクローン（Ｃ０２、Ｄ１２、Ｇ０９、Ａ０２、Ｅ１０、Ｋ０３、Ｋ１４）における異なる突然変異の数およびそれらの対応するリード頻度。全てのクローンは、発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座において突然変異を示す。灰色の影つきの四角は、平均リード頻度よりも頻繁に生じる突然変異を表し（＞０．４％、左側の軸）、同一の突然変異を含むＥＲＶ遺伝子座の予測数は破線で示されている。各クローンの突然変異したＥＲＶ遺伝子座の推定される総数は右側の軸によって示されている。（Ｄ）Ｃ－ＮＨＥＪ、ａｌｔ－ＥＪもしくはＨＲ媒介性遺伝子変換ＤＳＢ修復機序に適合するＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ誘導修復ジャンクションの頻度。これらの３つの主要ＤＳＢ修復機序に適合しない修復ジャンクションは不明としてグループ化されている。Ｓａｎｇｅｒ ｍＲＮＡおよびＩｌｌｕｍｉｎａＤＮＡディープシーケンシングの両方から得られた全部で７４個のＤＮＡ修復ジャンクション（ｎＭｙｒ＝４７、ｎＰＰＹＰ＝２７）を分析した。（ＥおよびＦ）３０個のＭｙｒ２および１２個のＰＰＹＰ６誘導突然変異ディープシーケンシングリードの突然変異フランキング配列を最も良く表している野生型ＣＨＯクラスターの頻度。隣接するＰＡＭ部位を含むＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ認識部位を含むクラスターは太字で示されており（オンターゲット）、ｓｇＲＮＡミスマッチを有するクラスターは通常の文字で示されている（オフターゲット）。オフターゲットクラスターはｓｇＲＮＡ認識部位内の１３位または１５位にミスマッチを有する。
【図5】発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列における突然変異したＣＨＯクローンのウイルス粒子ＲＮＡシーケンシング。グループ１コンセンサス配列、グループ２遺伝子座Ａおよび遺伝子座Ｂ上でのＭｙｒ２ ｓｇＲＮＡクローン（Ｄ１２、左のパネル）およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡクローン（Ｅ１０、右のパネル）からのウイルスＲＮＡ粒子ディープシーケンシングリードのマッピングを野生型ＣＨＯウイルス粒子について示されているように行った（図２Ｂ）。Ｄ１２およびＥ１０突然変異体はどちらも機能的に関連するグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座にＧａｇ機能喪失突然変異を含む。各パネルに対するリードマッピングの数が左軸に示されており、ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（１００万個のリードの１キロベース当たりのリード数））が右側に記載されている。
【図6】ＥＲＶ突然変異したＣＨＯ細胞における細胞増殖、細胞サイズおよび治療的ＩｇＧ免疫グロブリン産生の評価。野生型ＣＨＯ細胞（ＷＴ）、空のｓｇＲＮＡベクターで処理された細胞（Ｅｍｐｔｙ）、バルク選別された多クローンのＣＲＩＳＰＲ処理された細胞（Ｐｏｌｙ）ならびに５日間の培養後に発現されたＥＲＶ遺伝子座（Ｃ０２、Ｄ１２、Ｇ０９、Ａ０２、Ｅ１０、Ｋ０３およびＫ１４）または発現されなかったＥＲＶ遺伝子座（Ｂ０１、Ｂ０３）に突然変異を含むクローンにおいて、生存細胞密度（Ａ）および細胞サイズ（Ｂ）を測定した。同じ試料を安定的にトランスフェクトしてＩｇＧ免疫グロブリン抗体を発現させ、１０日間の流加培養の間に細胞密度（Ｃ）、細胞生存度（Ｄ）およびＩｇＧ産生（Ｅ）について評価した。空ベクター対照に対する統計的有意性を、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの偽発見率補正を含む両側の対応のないスチューデントｔ検定を用いて計算した（ｎ≧２、エラーバーは標準誤差を表す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図7】フローサイトメトリーによるｇａｇ特異的ｓｇＲＮＡ媒介性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断の評価。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＭｙｒもしくはＰＰＹＰモチーフ特異的ｓｇＲＮＡ（Ｍｙｒ２、Ｍｙｒ４、Ｍｙｒ８、ＰＰＹＰ５、ＰＰＹＰ６、ＰＰＹＰ７、ＰＰＹＰ１３、ＰＰＹＰ２０ ｓｇＲＮＡ）またはノンターゲティング空ベクター対照およびｄｓＲｅｄトランスフェクション対照発現プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のｄｓＲｅｄ陽性（ｄｓＲｅｄ＋）細胞の頻度（Ａ）、ｄｓＲｅｄ蛍光強度（Ｂ）および高顆粒細胞の頻度（ＣおよびＤ）の分析。パネルＣは、空ベクター、Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡおよびＰＰＹＰ６で処理された細胞の粒度（ＳＳＣ）に対するサイズ（ＦＳＣ）フローサイトメトリー密度プロットを示す。より大きいゲートはインタクトな非デブリ細胞を選択し、より小さいゲートは、パネルＤに定量化されているように高い粒度レベルを有するＣＨＯ細胞サブ集団を示す。ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率補正を含む両側の対応のないスチューデントｔ検定を用いて、空ベクター対照に対する統計的有意性を計算した（ｎ＝３、エラーバーは標準誤差を表す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図8】多クローンＣＨＯ集団の標的ｍＲＮＡシーケンシングによるｇａｇ特異的ｓｇＲＮＡ媒介性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断効率の推定。示されているグループ１Ｃ型特異的プライマーを用いてバルク選別したＣＲＩＳＰＲ処理された多クローン集団の逆方向転写された細胞内ｍＲＮＡから得られた多クローンのＰＣＲ産物のインデル突然変異分析。突然変異頻度をＳａｎｇｅｒクロマトグラムの分解により推定した（２８）。未処理の野生型対照試料に対して予測される突然変異頻度はクロマトグラムの右に示されている。各ｓｇＲＮＡのためのＤＳＢ部位は黒色の線で示されており、矢印によって示されているシーケンシング方向に対してＤＳＢ部位の下流の分解ウィンドウは影つきの灰色で示されている。図示されているＭｙｒモチーフは配列番号８６のヌクレオチド１０～７１に対応している。図示されているＰＰＹＰモチーフは配列番号７６のヌクレオチド２１～９８に対応している。
【図9】ＭｙｒおよびＰＰＹＰ多様性クラスターの野生型ＣＨＯコンセンサス配列。ディープシーケンシングした野生型ＣＨＯ細胞のＭｙｒ（Ａ）およびＰＰＹＰ（Ｂ）フランキング領域のクラスター配列。影は図４Ａおよび図４Ｂに示されている系統学的グループに対応している。隣接するＰＡＭ配列と共にｓｇＲＮＡ認識部位（黒色の輪郭の矢印）を含むＭｙｒおよびＰＰＹＰクラスターは太字で書かれている。ＭｙｒおよびＰＰＹＰモチーフはそれぞれ非常に薄い灰色および濃い灰色の輪郭の四角で示されている。Ｍｙｒフランキング領域に対するＰＰＹＰフランキング領域のより高い配列複雑性は、欠失または挿入を示している欠損配列または株および一塩基バリアントによってそれぞれ示されている。
【図10】ＥＲＶ遺伝子座特異的突然変異の特性評価およびクローン集団内でのそれらの頻度。異なるクローンにおいて正常なリード頻度（０．２～０．４％）または高いリード頻度（＞０．４％）で検出された突然変異のＩｌｌｕｍｉｎａ生リードの分析。円グラフは、同一のＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を有するが、異なる突然変異フランキング配列を有する同定されたグループの数および頻度を表す（例えば、Ｄ１２＿１＿１およびＧ０９＿１＿１）。円グラフの５１％で示されている部分は、それらのフランキング配列に基づいて区別することができなかった予測されるＥＲＶ遺伝子座の数を示す４つのほぼ等しい部分を提供する。
【図11】Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡおよびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ媒介性突然変異および修復ジャンクションの特性評価。４７個のＭｙｒ２および２７個のＰＰＹＰ６誘導修復ジャンクションを、誘発された突然変異型（欠失、挿入、インデル）（Ａ）、ＧａｇおよびＥＲＶ機能に対する突然変異の効果（ＥＲＶコード領域、翻訳阻害、フレームシフト突然変異、インフレーム突然変異以外）（Ｂ）、突然変異サイズ分布（Ｃ）ならびにＭＭＥＪおよびＳＤ－ＭＭＥＪ ａｌｔ－ＥＪ修復経路活性を含む、ｓｇＲＮＡ特異的突然変異シグネチャーについて分析した。インデル突然変異は、この図および本明細書全体を通して挿入に伴う欠失として定められている。ＭＭＥＪおよびＳＤ－ＭＭＥＪ修復機序の両方に適合する修復ジャンクションは「ＭＭＥＪ＋ＳＤ－ＭＭＥＪ」として分類されている。修復ジャンクションは、Ｓａｎｇｅｒ ｍＲＮＡおよびＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡディープシーケンシングの両方から得られた。
【図12】ユニークな機能的に活性なグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座の同定。（Ａ）Ｅ１０（ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ）クローンの全ゲノムシーケンシング後に得られた１５ｋｂのＰａｃＢｉｏリードの概略図。そのリードは、完全長ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび完全長３’ＬＴＲ配列ならびにｇａｇ遺伝子におけるＥ１０特異的ＣＲＩＳＰＲ突然変異を含み、かつＣＨＯゲノムの中に及んでいる。（Ｂ）公的に入手可能なＮＣＢＩ ＣＨＯゲノムに対するＰａｃＢｉｏ ＣＨＯゲノム特異的配列のアラインメント。ＮＣＢＩスキャフォールド識別子が上に示されている。予測されるグループ１Ｃ型ＥＲＶ組込み部位が示されている。ＥＲＶ組込み部位を取り囲んでいるゲノム領域は、ＮＣＢＩによって注釈づけされているように、２つのタンパク質コード遺伝子（Ｃｉｄｅｃ、Ｊａｇｎ１）ならびに３つの偽遺伝子（Ｒｐｓ１５、Ｒｐｌ１８ａ、Ｒｐｌ３４；薄い灰色の背景で示されている）を含む。Ｃｉｄｅｃ（細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターｃ）は脂質代謝に関与する脂肪滴タンパク質をコードし（６５）、Ｊａｇｎ１（ｊａｇｕｎａｌ相同体１）は、初期分泌経路に関与する小胞体タンパク質をコードし（６６）、Ｒｐｓ１５、Ｒｐｌ１８ａ、Ｒｐｌ３４はリボソームタンパク質をコードする。各遺伝子のために予測されるｍＲＮＡ発現レベルはＲＮＡシーケンシングデータによって推定され、かつＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（１００万個のリードの１キロベース当たりのリード数））で表されている。（Ｃ）Ｍｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡフランキング領域のＳａｎｇｅｒシーケンシング結果。グループ１特異的プライマーを用いて全細胞内ｍＲＮＡ（図の中では「ｍＲＮＡ」）から、あるいは発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶに特異的なプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（図の中では「ＤＮＡ」）から得られたＰＣＲアンプリコンに対してＳａｎｇｅｒシーケンシングを行った。クローンＣ０２、Ｄ１２、Ｇ０９、Ａ０２、Ｅ１０、Ｋ０３、Ｋ１４は、機能的に活性なグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座に突然変異を含んでいるが、クローン（Ｂ０１およびＢ０３）ならびに空ベクター対照は含んでいない。予測されるＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ＤＳＢ部位は点線で示されている。
【図13】ＥＲＶ突然変異したＣＨＯ細胞によってＶＰ中で放出されたウイルスＲＮＡ量の評価。未処理細胞（ＵＴ）、空のｓｇＲＮＡベクターで処理された細胞（Ｅｍｐｔｙ）、バルク選別された多クローンのＣＲＩＳＰＲ処理された細胞（Ｐｏｌｙ）、ならびに発現されたＣ型グループ１ＥＲＶ遺伝子座（Ｃ０２、Ｄ１２、Ｇ０９、Ａ０２、Ｅ１０、Ｋ０３およびＫ１４）に突然変異を含むか、検出されるＥＲＶ突然変異を含まないクローン（Ｂ０１、Ｂ０３）の５日間の培養物の上澄み中に存在するウイルス粒子からレトロウイルスＲＮＡゲノムを単離した。（Ａ）ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためにプロセシングし、かつ得られたリードを配列番号３のグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座に対してマッピングした。ＥＲＶリードを、配列番号３の発現されたグループ１ＥＲＶ遺伝子座の配列（灰色の棒）および対照として使用されるＣＨＯ細胞の４５ＳリボソームＲＮＡ（黒色の棒）配列に対してマッピングした。ｙ軸は各シーケンシング反応での１キロベース当たりのリード数を表す。（Ｂ）細胞培養物上澄み中に放出されたＶＰから単離された逆方向転写された全ＲＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）分析。３つの独立したＣＨＯ細胞培養物から得られた試料から逆転写およびｑ－ＰＣＲ分析を３つ組で行った。グループ１ＥＲＶ ＬＴＲ特異的プライマーを用いてゲノムレトロウイルス配列を定量化した。データを分析した細胞の数に対して正規化し、ＵＴ細胞に対する倍数変化の平均および標準偏差として表わす。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明に係る操作された細胞を含む細胞、好ましくは哺乳類細胞／真核細胞は、細胞培養条件下に維持することができる。標準的な細胞培養条件は、組換えタンパク質の産生に使用される例えば完全合成培地中で３０～４０℃、好ましくは（約）３７℃である。この種の細胞の非限定的な例は、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＤＧ４４およびＣＨＯ－Ｓ細胞およびＳＵＲＥ ＣＨＯ－Ｍ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１の誘導体）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ならびにベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）などの非霊長類真核細胞である。霊長類真核性宿主細胞としては、例えば、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）および２９３［ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３］ならびに３Ｔ３［ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３］およびサル腎臓ＣＶ１株［ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０］が挙げられ、ＳＶ４０で形質転換されているもの（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）も挙げられる。操作されたという用語は、細胞のゲノムが、例えば挿入、欠失および／または置換によって変化されていることを意味する。当業者であれば容易に理解するように、操作されている細胞は、本明細書に記載されているように操作する前であっても天然に生じない細胞である。上記細胞は、特に様々なＣＨＯ細胞は、治療用タンパク質の産生のためなどにバイオテクノロジー用途でよく使用されている。これも当業者であれば容易に理解するように、バイオテクノロジー用途で、特に例えば治療用タンパク質の発現のために使用されているか使用することができる限り、上記細胞以外の他の細胞を操作してもよい。
【0040】
内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、生殖細胞の古代のレトロウイルス感染に由来し、かつ何百万年も前に哺乳類および他の脊椎動物細胞に組み込まれた配列である。これらのＥＲＶはメンデルの法則に従って受け継がれている。完全な内在性レトロウイルスのサイズは平均して６～１２ｋｂであり、常に同じ順序で生じるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。コード配列の両端には２つのＬＴＲ（長い末端反復配列）がある。大部分のＥＲＶは、多数の不活性化突然変異を保持しているので欠陥がある。さらに、それらは後成的サイレンシング効果によって不活性化させることができる（すなわち転写されない）。但し、いくつかのＥＲＶはそれらのゲノム中にオープンリーディングフレームをなお有し、かつ／またはそれらは転写活性を有している場合がある。哺乳類のＥＲＶは強い類似性を有し、かつ槽内白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、コアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）を含むガンマレトロウイルスおよびベータレトロウイルスの属に由来し得る。ＥＲＶはゲノム中に維持されており、遺伝的多様性の源および他のウイルス病原体に対する保護を提供することなどの、そのゲノムの中にそれらが組み込まれている細胞にとって特定の利点を有している場合がある。但しそれらは感染性になり、導入遺伝子すなわちタンパク質の文脈では、特に癌、細胞ストレスおよび／または後成的修飾によるＥＲＶ覚醒の結果として、本明細書のどこかに記載されている発現においてリスクを有する可能性がある。
【0041】
レトロウイルスゲノム内でコードされる３つの主要なタンパク質は、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖである。ｇａｇ遺伝子によってコードされるＧａｇ（グループ抗原）はポリタンパク質であり、これはプロセッシングを受けて、マトリックスおよびレトロウイルスコアを決定する核タンパク質コア粒子を含む他のコアタンパク質になる。Ｐｏｌはｐｏｌ遺伝子によってコードされる逆転写酵素であり、リボヌクレアーゼＨおよびインテグラーゼ機能を有する。その活性によりウイルスの二本鎖ＤＮＡの予め組み込まれた形態が得られ、インテグラーゼ機能により宿主のゲノム内への組込みが生じ、かつ宿主のゲノムへの組込み後にリボヌクレアーゼ機能を介して逆転写も生じる。Ｅｎｖはｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープタンパク質であり、ウイルス親和性を決定するウイルスの脂質層内に存在する。
【0042】
２０１６年１２月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１９／０１９４６９４Ａ１号は、ガンマレトロウイルス関連ＥＲＶを形成するために細胞のゲノムに組み込むことができるガンマレトロウイルスの３つのクラスを実証した。１５９個のＩＡＰ（槽内Ａ型粒子）配列および１４４個のＣ型マウスＥＲＶ様配列、ならびにＧＡＬＶ（テナガザル白血病ウイルス）に関連する６個の配列が以前に報告された。
【0043】
ＣＨＯゲノムからのガンマレトロウイルス様ＥＲＶの１２１個のＧＡＧ配列に基づく近隣結合法による合意樹も、２０１６年１２月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１９／０１９４６９４Ａ１号で考察された。グループ１および２ＥＲＶの両方が転写活性ＥＲＶを含んでいることが分かった。グループ２ＥＲＶの中の１つの配列は活性であることが分かったが、終止コドンを含んでいた。対照的にグループ１の中の複数の配列は活性であり、かつコード配列内に終止コドンを含んでいないことが分かった。ＧａｇおよびＰｏｌ ｃＤＮＡ分析は、完全長ＥＲＶ配列によってコードされる発現されたＥＲＶの存在と一貫していた。それらの配列に基づいて、グループ１ウイルスのコンセンサス配列をｇｃｃｃｃｃｇｃｃａ ｔａｔｃｃｇｃｃａｃ ｔｇｃｃｇｃｃｃｃｃ ａｃｃａｇａｇｇｃａ ｇａａｇｃｇｇ［配列番号６］として決定した。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄを比較されたい。
【0044】
完全長ＥＲＶ配列、特に完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列は細胞のゲノムに組み込まれている配列であり、変化を導入する前に発現させる、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のインタクトなオープンリーディングフレームを有する機能性転写物に転写することができる。従って完全長ＥＲＶ配列、特に完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列は、少なくともＧａｇ前駆体タンパク質、Ｐｏｌコード逆転写酵素およびＥｎｖタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、完全長ＥＲＶ配列は一方または両方の長い末端反復（ＬＴＲ）あるいはその１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％連続したヌクレオチドなどのその一部も含む。さらにより好ましい実施形態では、完全長および発現されたＥＲＶ配列は、配列番号３またはそれと９０％、９５％、９８％もしくは９９％超の配列同一性を有する配列に対応している。
【0045】
完全長グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のいくつかにより、ウイルス粒子（ＶＰ）の中にパッケージングされた完全長ウイルスゲノムＲＮＡを含み得るウイルス粒子の形成および放出をもたらしてもよい。本出願の文脈では、ＶＰとはウイルスゲノムの少なくとも一部を含むウイルス粒子を指す。場合によっては、ＶＰは、完全長ウイルスゲノムＲＮＡを含んでいてもよく、従って機能性ＶＰであってもよい。本発明の文脈で使用されるＶＬＰは、ＶＰであるように見えるがウイルスゲノムのいくつかの部分を欠いている粒子である。
【0046】
機能喪失突然変異は適切なタンパク質合成を妨害し、故にそのような突然変異が生じた場合には機能性タンパク質は合成されない。例えばｇａｇ遺伝子における機能喪失突然変異の場合、ＥＲＶ出芽が生じないように、Ｇａｇ前駆体タンパク質またはその切断産物の１つは損なわれている。
【0047】
本発明に従って操作された細胞は、大部分においてＣＨＯ－Ｋ１細胞などのそれが由来する細胞のゲノムと同一であるゲノムを含んでいてもよい。但し、これらのゲノムの一部であるグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列を含む、１９、１８、１７、１６、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個などの少なくとも１個であって２０個以下のＥＲＶ配列は、本明細書に記載されている変化を含む。
【0048】
ｇａｇ遺伝子はＧａｇ前駆体タンパク質を生じ、これはスプライシングされていないウイルスｍＲＮＡから発現される。Ｇａｇ前駆体タンパク質はウイルス成熟のプロセス中に、ウイルスにコードされたプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって、ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、ＮＣ（ヌクレオカプシド）およびさらなるタンパク質ドメイン（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のｐｐ１２またはＨＩＶのｐ６）と命名された一般に４つのより小さいタンパク質に切断される。本明細書において言及されているｇａｇ配列は、Ｇａｇ前駆体タンパク質を生じても生じなくてもよい。
【0049】
ｇａｇ遺伝子は、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流に位置するＮ末端Ｍｙｒモチーフをコードする。Ｍｙｒモチーフの変化は本発明の一部である。そのような変化は一般にＧａｇミリストイル化を妨害し、かつ例えば翻訳を阻止するか、機能喪失突然変異したｇａｇ転写物を生成する。結果として本発明の特定の実施形態では、適切なウイルス粒子の血漿膜での組み立ておよび／またはレトロウイルス粒子放出を阻止してもよい。配列番号３のＭｙｒモチーフは、１３３４～１３３６（ａｔｇ ｇｇｇ ｃａａ）に位置する配列によってコードされる。Ｍｙｒモチーフは本明細書ではＭｙｒ出芽モチーフともいう。
【0050】
ｇａｇ遺伝子のＰＰｘＹモチーフもレトロウイルスの出芽に寄与する。ＰＰｘＹモチーフの変化も本発明の一部である。そのような変化によりウイルス粒子放出を強力に阻害してもよい。ＰＰｘＹモチーフは、グループ１およびグループ２ＣＨＯ ＥＲＶにおいて保存されたＰＰＹＰモチーフ（またはＰＰＹＰ出芽モチーフ）と重なり合っていてもよく、これをこのＣＨＯ特異的ＰＰｘＹ関連出芽モチーフを指すために以後ＰＰＹＰと呼ぶ。ＰＰＹＰは、配列番号３の１８５１～１８６８（ｃｃｃ ｃｃｇ ｃｃａ ｔａｔ ｃｃｇ ｃｃａ）に位置する配列によってコードされる。
【0051】
ＭＡポリペプチドは、前駆体タンパク質のＮ末端すなわちミリストイル化末端から誘導される。大部分のＭＡ分子はウイルス粒子脂質二重層の内面に付着したままであり、当該粒子を安定化させる。
【0052】
ＣＡタンパク質はウイルス粒子の円錐形コアを形成する。
【0053】
ＧａｇのＮＣ領域は、レトロウイルスのいわゆるパッケージングシグナルを特異的に認識することに関与する。パッケージングシグナルはウイルスＲＮＡの５’末端の近くに位置する４つのステムループ構造を含み、かつ異種ＲＮＡのウイルス粒子への組込みを媒介するのに十分である。ＮＣは２つの亜鉛フィンガーモチーフによって媒介される相互作用によりパッケージングシグナルに結合する。
【0054】
別のタンパク質ドメインは、前駆体タンパク質Ｇａｇとアクセサリータンパク質Ｖｐｒとの相互作用を媒介し、Ｖｐｒを組み立てウイルス粒子の中に組込ませる。ＨＩＶ中のｐ６領域は、感染細胞からの出芽ウイルス粒子の効率的な放出のために必要とされるいわゆる後期ドメインも含む（Ｈｏｐｅ＆Ｔｒｏｎｏ，２０００）。
【0055】
ウイルスプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、リボヌクレアーゼＨおよび逆転写酵素（ＲＴ）は、Ｇａｇ－Ｐｏｌ融合タンパク質の文脈において発現される。Ｇａｇ－Ｐｏｌ前駆体は一般にリボソームフレームシフトイベントによって生成され、これは、特異的なシス作用性ＲＮＡモチーフ（Ｇａｇ ＲＮＡの遠位領域内のヘプタヌクレオチド配列およびその後に続く短いステムループ）によって惹起される。リボソームがこのモチーフに遭遇した場合、それらは翻訳を中断することなく約５％の確率でｐｏｌリーディングフレームにシフトする。リボソームフレームシフトの頻度は、ＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体が約２０：１の比で産生される理由を説明する。
【0056】
ウイルス成熟中にウイルスによりコードされたプロテアーゼは、ＰｏｌポリペプチドをＧａｇから切断し、かつそれをさらに消化してプロテアーゼ、ＲＴ、リボヌクレアーゼＨおよびインテグラーゼ活性に分離する。これらの切断は全てが効率的に起きるわけではなく、例えばＲＴタンパク質の約５０％が単一ポリペプチド（ｐ６５）としてリボヌクレアーゼＨに結合されたままである（Ｈｏｐｅ＆Ｔｒｏｎｏ，２０００）。
【0057】
ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素をコードする。逆転写のプロセス中にポリメラーゼは、ウイルス粒子中に存在する単鎖ゲノムＲＮＡの二量体の二本鎖ＤＮＡのコピーを作成する。リボヌクレアーゼＨは元のＲＮＡテンプレートを第１のＤＮＡ鎖から除去し、ＤＮＡの相補鎖の合成を可能にする。ポリメラーゼの主な機能性化学種はヘテロ二量体である。放出されたウイルス粒子のカプシド内に、ｐｏｌ遺伝子産物の全てを見つけることができる。
【0058】
ＩＮタンパク質は、プロウイルスＤＮＡを感染細胞のゲノムＤＮＡ内に挿入するのを媒介する。このプロセッシングはＩＮの３つの異なる機能によって媒介される。
【0059】
Ｅｎｖタンパク質は単独でスプライスされたｍＲＮＡから発現される。Ｅｎｖは最初に小胞体内で合成され、Ｇｏｌｇｉ複合体を通って移動し、そこでグリコシル化される。Ｅｎｖグリコシル化は一般に感染力のために必要とされる。細胞プロテアーゼはタンパク質を膜貫通ドメインと表面ドメインとに切断する（Ｈｏｐｅ＆Ｔｒｏｎｏ，２０００）。
【0060】
ゲノムのいくつかのＥＲＶから発現されたウイルスゲノムＲＮＡは、ＶＰの形態で細胞から放出させることができる。他の発現されたＥＲＶは、ＲＶＬＰの形成を引き起こすことができるがＶＰの形成は引き起すことはできないため、ウイルスゲノムＲＮＡの形態で放出させることはできない。しかし一般に、放出されるものは感染性になる可能性がより高い。
【0061】
従って、好ましくは標準もしくはストレス培養条件下の両方で、ＶＰを全く発現および放出させることができず、または実質的に放出させることができず、好ましくはＶＬＰも全く発現および放出させることができないような、本明細書に記載されているように操作された細胞を有することが一般に有利である。そのように操作された細胞を含む細胞培養物が、本明細書に記載されているＶＰ／ＶＬＰ放出減少手順に供されていないそれらの対応物よりも５０％少ない、４０％少ない、３０％少ない、２０％少ない、１０％少ない、好ましくは５％少ないＶＰ／ＶＬＰを放出する場合に、実質的にＶＰ／ＶＬＰは放出されないものとする。そのような対応物は、例えば市販されているＣＨＯ－Ｋ１細胞である。全く発現させないまたは実質的に発現させないとは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、好ましくは５％未満の突然変異されていないＧａｇ ｍＲＮＡ配列をＰＣＲおよびシーケンシング分析によって検出することができることを意味する。全く放出させないとは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）およびｃＤＮＡ ＰＣＲアッセイにより評価した場合またはＱＩＡＧＥＮ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）から得た場合に、検出可能なウイルス配列の放出が全く生じないか実質的に生じないことを意味する。
【0062】
配列または遺伝子に対する変化としては、本明細書に記載されているように操作する前に細胞において、特に細胞の１つ以上の（例えば１つ以上の特異的）ＥＲＶにおいて生じない付加／挿入、欠失および／または置換が挙げられる。特定の実施形態では当該変化は、任意にＥＲＶのフランキング領域５’および／または３’を含む少なくとも１つ、特定の実施形態ではたった１つの、すなわち単一のＥＲＶ全体の切除を包含してもよい。当該変化は、例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲにおける少なくとも１つの変化を含んでもよい。特定の実施形態では、当該変化は、完全長ＥＲＶ配列などの特に１つ以上のＥＲＶ配列および／または本明細書に開示されている１つ以上の特異的配列のｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子および／またはＬＴＲの連続したヌクレオチドを含む１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２個以下のヌクレオチドまたは１個のヌクレオチドの変化を含む。
【0063】
異種核酸配列は、本発明に従って操作する前に細胞において生じない核酸配列であり、関連する種類の核酸配列は細胞中に存在する可能性が高い。本発明の文脈において使用される導入遺伝子は、所与の成熟したタンパク質、前駆体タンパク質またはタンパク質をコードしない機能性ＲＮＡ（非翻訳ＲＮＡ）をコードするそのような異種核酸配列、特にデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（本明細書ではタンパク質をコードするＤＮＡともいう）である。導入遺伝子を単離し、かつ細胞の中に導入して導入遺伝子産物を産生させる。本発明に係るいくつかの好ましい導入遺伝子はＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのマーカータンパク質をコードする。それらを使用してＥＲＶ要素への成功した組込み、故にその変化／不活性化を検出することができる。他の導入遺伝子は、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃ融合タンパク質および他のタンパク質、特に治療活性を有するタンパク質（「バイオ治療薬」）などの目的の細胞によって最終的に産生されるタンパク質をコードするものである。
【0064】
本明細書で使用される「ゲノム編集」とは、ゲノム配列の修飾（「編集」）を指し、少なくとも１つヌクレオチドの欠失、少なくとも１つヌクレオチドの付加／挿入、または少なくとも１つヌクレオチドの置換を含んでもよい。編集されたゲノム配列を本明細書では標的核酸配列ともいう。標的化挿入は特異的な所定の標的部位で生じる挿入である。ゲノム編集ツールは、例えばヌクレアーゼまたはニッカーゼにより二本鎖もしくは一本鎖切断をゲノムの中に導入し、これらの切断を修復するために細胞の組換え機序（以下の考察を参照）に少なくとも部分的に依存する。これらのツールは一般に配列特異的ＤＮＡ結合モジュールも含む。
【0065】
ＺＦＮ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は、特異的ゲノム位置においてエラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を刺激するＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことにより、幅広い遺伝的修飾を可能にする。
【0066】
ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復））系の配列特異性は、低分子ＲＮＡによって決定される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、バクテリオファージおよび他の移動性遺伝要素のゲノムに一致する「スペーサー」配列によって分離された一連の反復配列からなる。反復配列－スペーサーアレイは長い前駆体として転写され、かつ反復配列内でプロセッシングされて、ＣＲＩＳＰＲ系によって切断される標的配列を指定する低分子ｃｒＲＮＡ（プロトスペーサーとしても知られている）を生成する。切断のために多くの場合に、標的領域の直接下流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている配列モチーフの存在が必要とされる。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は通常、反復配列－スペーサーアレイの両端に位置し、かつｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）生合成および標的に関与する酵素的機構をコードする。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡガイドを使用して切断の部位を指定するｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９へのｃｒＲＮＡガイドの負荷はｃｒＲＮＡ前駆体のプロセッシング中に生じ、かつその前駆体に対して低分子ＲＮＡアンチセンス、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびリボヌクレアーゼＩＩＩを必要とする。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮによるゲノム編集とは対照的に、Ｃａｓ９標的特異的変化はタンパク質の操作を必要とせず、ｓｇＲＮＡとも呼ばれる短いｃｒＲＮＡガイドの設計のみを必要とする。
【0067】
これまでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの３つの異なるバリアントがゲノム編集プロトコルに採用されてきた。その１つは野生型Ｃａｓ９であり、これは二本鎖ＤＮＡを部位特異的に切断することができ、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構の活性化をもたらす。ＤＳＢは細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって修復することができ、これにより標的遺伝子座を分断する挿入および／または欠失（インデル）が生じる。あるいは、標的遺伝子座との相同性を有するドナーテンプレートが供給される場合、ＤＳＢは相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって修復されてもよく、これにより正確な置換突然変異を引き起こすことが可能になる。
【0068】
ニッカーゼ活性のみを有するＣａｓ９Ｄ１０Ａとして知られている変異型を開発することにより、高い正確性を目指してＣａｓ９系をさらに操作した。これは、それが１つのみのＤＮＡ鎖を切断し、かつＮＨＥＪを活性化させないことを意味する。代わりに、相同な修復テンプレートが提供された場合、高忠実度ＨＤＲ経路のみによりＤＮＡ修復が行われ、インデル突然変異が減少する。従ってＣａｓ９Ｄ１０Ａは、隣接するＤＮＡニックを生成するように設計された対のＣａｓ９複合体によって遺伝子座が標的とされる場合に、標的特異性の点で多くの用途においてより魅力的である。
【0069】
本発明の文脈では、ＥＲＶ要素の特異的配列またはコンセンサス配列は、例えば上記系のうちの１つによる切断部位を指定するために決定される。そのような特異的もしくはコンセンサス配列は、好ましくは５～５０、好ましくは１０～５０または１５～２５または２５～５０または３０～５０塩基対長である。コンセンサス配列は切断をなお行うことができる限り、例えば１、２、３、４または５つのミスマッチを含んでいてもよい（互いに対して６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％超の相補性を有していてもよい）。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ゲノム内のＭｙｒおよびＰＰＹＰ特異的ｓｇＲＮＡに特異的な標的部位を示す図３および表１を参照されたい。上記系を天然に生じない系または異種系と呼び、これは、それらが本発明に従って操作する前の細胞の一部ではなく、それらが細胞に導入されることを意味する。特異的ＤＮＡ切断イベントにより、特定の実施形態では発現されたＥＲＶの転写サイレンシングが生じる。
【0070】
本発明に係るベクターは、このベクターによって発現させることができ、そこに連結され、かつ一般にその中に組み込まれている導入遺伝子などの別の核酸を運ぶことができる核酸分子である。例えばプラスミドはベクターの一種であり、レトロウイルスまたはレンチウイルスは別の種類のベクターである。本発明の好ましい実施形態では、トランスフェクション前にベクターを直線化する。発現ベクターは異種調節要素を含むか、発現ベクターによって運ばれる導入遺伝子などの核酸配列の転写および／または発現を促進するように設計されたそのような調節要素の制御下にある。調節要素は、エンハンサーおよび／またはプロモーターを含むが、本明細書に記載されている様々な他の要素も含む。
【0071】
非ウイルスベクターのうちトランスポゾンは、宿主ゲノム内の複数の遺伝子座において高頻度でＤＮＡ配列の単一コピーを組み込むそれらの能力により特に魅力的である（組込みベクター）。ウイルスベクターとは異なり、いくつかのトランスポゾンは細胞遺伝子の近くに優先的に入り込まないことが報告されており、従ってそれらは有害な突然変異を導入する可能性が低い。さらにトランスポゾンは作製および取り扱いが容易であり、一般に逆方向反復配列が両端に位置するカーゴＤＮＡを含むトランスポゾンドナーベクターと、トランスポゼース発現ヘルパープラスミドまたはｍＲＮＡとからなる。内在性トランスポゾンのコピーを妨害することなく様々な細胞株にＤＮＡを動員するために、いくつかのトランスポゾン系が開発された。例えば、最初にキャベツシャクトリムシの蛾から単離されたＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、カーゴＤＮＡを様々な哺乳類細胞の中に効率的に転移させる。
【0072】
また本発明の文脈では、ベクター、特に非組込みベクターを遺伝子または機能性ＲＮＡの一過性の発現のために使用してもよい。一過性の発現は限られた時間での発現であり、発現期間はベクター設計および培養条件によって決まる。但し、一過性の発現は少なくとも２４時間であって一般に７日以下の期間にわたる発現を意味する。
【0073】
カーゴＤＮＡがプラスミドベクター上の導入遺伝子の近くに配置された場合に、後成的調節要素を使用してそれを望ましくない後成的効果から保護することができる。例えば、強力なヒトＭＡＲ１－６８によって例示されるように、ヘテロクロマチンサイレンシングを防止しながらもカーゴＤＮＡゲノムの組込みおよび転写を増加させるために、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）と呼ばれる要素が提案された。それらはインスレーターとしても機能し、それにより隣接する細胞遺伝子の活性化を防止することができる。従ってＭＡＲ要素は、プラスミドもしくはウイルスベクターの文脈では、高い持続的な発現を媒介するために使用されてきた。一過性の遺伝子発現のために、プラスミドまたは非組込みレンチウイルス（ＮＩＬ）ベクターなどの非組込みベクター（エピソームベクターと呼ぶ場合もある）を使用してもよい。それらは宿主細胞内に安定的または一過性に維持して複製させることができる。
【0074】
ベクターのベクター配列は、導入遺伝子などのあらゆる「他の」核酸ならびにＭＡＲ要素などの遺伝要素を除外したベクターのＤＮＡもしくはＲＮＡ配列である。
【0075】
配列同一性という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、これらの配列は最大の一致が得られるようにアラインメントされる。「同一性」それ自体は、当該技術分野において認識されている意味を有し、公開されている技術を用いて計算することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（コンピュータを用いた分子生物学），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（配列データのコンピュータ解析、パート１），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列解析），ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（配列解析プライマー），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９１を参照）。２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、「同一性」という用語は、これらの配列内の所与の位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を定めるものとして当業者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
【0076】
あらゆる特定の核酸分子が、例えば配列番号１、２、３、４、５のガンマレトロウイルス様配列またはその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか否かは、最初の配列アラインメントのためにＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州サンブルーノ）を用い、次いで複数の配列アラインメントのためにＥＳＥＥバージョン３．０ ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）などの公知のコンピュータプログラムを用いて従来の方法で決定することができる。
【0077】
アミノ酸配列が例えば配列番号１、２、３、４、５によって発現されたタンパク質またはその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）、Ｕｎｉｘ用バージョン８、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、ウィスコンシン州マディソン５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを用いて従来の方法で決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間の最良の相同部分を見つける。
【0078】
ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴまたはあらゆる他の配列アラインメントプログラムを使用して特定の配列が本発明に係る参照配列と例えば９５％同一であるか否かを決定する場合、同一性の割合が参照核酸もしくはアミノ酸配列の完全長にわたって計算され、かつ参照配列中のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるようにパラメータを設定する。
【0079】
グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との最良の全体的な一致を決定するための別の好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）。配列アラインメントでは、クエリーおよび対象配列はどちらもＤＮＡ配列である。ＵをＴに変換することによりＲＮＡ配列を比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果はパーセント同一性で表される。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用される好ましいパラメータは、行列＝ユニタリ、ｋ－タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、無作為化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列長（いずれか短い方）である。
【0080】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列との９５％「同一性」を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列がそのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチド当たり平均して最大５つの点突然変異を含む場合があること以外は参照配列と同一である。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％は欠失されているか別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％のいくつかのヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。クエリー配列は配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載されているように指定されたあらゆる断片であってもよい。
【0081】
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、メリーランド州ベセズダ）などのいくつかの提供源およびインターネットから入手可能であり、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用される。それは、このプログラムを用いて配列同一性および配列類似性を決定する方法の説明と共に、ＮＣＢＩウェブサイトにおいてアクセスすることができる。
【0082】
本発明は、本明細書に開示されている配列との特定の配列同一性を有する配列だけでなく、同等に本明細書に開示されている配列のいずれかの配列バリアントにも関する。従って本発明は、特定の配列同一性が言及されているあらゆる文脈における配列バリアントにも関し、かつ逆もまた同様である。「配列バリアント」とは、本明細書に開示されている配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）とは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般にバリアントは、本明細書に開示されている配列と全体的に非常に類似しており、かつ多くの領域において同一である。
【0083】
バリアントはコード領域、非コード領域またはそれらの両方に変化を含んでいてもよい。サイレント置換、付加または欠失を生じるが、例えばコードされるポリペプチドの特性または活性を変えない変化を含む配列バリアントが特に好ましい。遺伝暗号の縮重に起因するサイレント置換によって生成されるヌクレオチドバリアントが好ましい。さらに、あらゆる組み合わせで５～１０個、１～５個または１～２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されているバリアントも好ましい。
【0084】
本発明は、前記ポリヌクレオチドの対立遺伝子バリアントも包含する。対立遺伝子バリアントは同じ染色体遺伝子座を占めている２つ以上の他の形態の遺伝子のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は突然変異により天然に生じ、かつ集団内に多型を生じさせる場合がある。遺伝子突然変異はサイレントなものであってもよく（コードされるポリペプチドに変化はない）、あるいは改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子バリアントは、遺伝子の対立遺伝子バリアントによってコードされるポリペプチドである。
【0085】
バリアントポリペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失および／または異なるアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置換により、配列番号１、２、３、４または５に示されているアミノ酸配列とは異なってもよい。好ましくはアミノ酸の変化は重要でない性質のものであり、それは著しく影響を与えない保存的アミノ酸置換、例えばタンパク質の折り畳みおよび／または活性、小さい欠失（典型的には１～約３０個のアミノ酸の欠失）、アミノ末端メチオニン残基などの小さいアミノもしくはカルボキシル末端伸長、最大約２０～２５個の残基の小さいリンカーペプチド、あるいは正味電荷または別の機能（ポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープまたは結合ドメインなど）を変えることにより精製を促進する小さい伸長である。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ならびに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン）のグループ内でのものである。一般に特異的活性を変化させないアミノ酸置換は当該技術分野で知られており、例えば「Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ著，１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク」に記載されている。最も一般に生じる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌならびにこれらの逆の置換である。
【0086】
「連続したヌクレオチド」の特定の百分位数は、互いに直接続くヌクレオチドを意味する。従って６００００個のヌクレオチドを含む配列番号２のヌクレオチドの１０％は、ヌクレオチド１～６０００またはヌクレオチド２～６００１などであってもよい。
【0087】
ある配列が別の配列に「直接隣接している」と言う場合、これは介在配列が存在しないことを意味する。フランキング領域は特定の配列に直接隣接しており、かつ特異的核酸配列の５’および３’領域を示す。
【0088】
例えばｓｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシングについては、例えば米国特許出願公開第２０１８００１６５８３号のどこかに記載されており、その内容全体ならびに特にその開示および遺伝子サイレンシングについては、参照により本明細書に組み込まれる。
【0089】
ＣＨＯ細胞は治療用タンパク質のために最も広く使用されている発現系であり、４０年超にわたって認識されている外来性ウイルス様粒子源でもある（７～１０）。これらの粒子は一度も感染性であることは示されておらず、それらのゲノム起源および可能な進化は大部分が不明のままである。従って安全性への懸念は続いており、治療用タンパク質を精製する際は十分な注意を払わなければならない。ここでは、ゲノム、トランスクリプトームおよびウイルス粒子レベルでのＣＨＯ内在性レトロウイルス要素を特性評価することによりこの問題の解決に取りかかり、ＣＨＯ細胞が、グループ１Ｃ型ＥＲＶのウイルスＲＮＡゲノムが負荷されたインタクトなウイルス粒子を放出することができることを証明する。当該配列は完全長オープンリーディングフレームをコードし、従って機能性ウイルスタンパク質を産生する可能性が高い。この発見は、１９９４年に公開されたＣＨＯウイルス粒子配列に関する唯一の入手可能な研究に挑むものであり、この研究ではその著者らはＥＲＶ遺伝子内に数多くの突然変異を有する欠陥のあるＤＮＡ配列のみを検出した（１２）。この更新されたウイルス粒子ＲＮＡ配列を使用すると、ＣＨＯウイルス粒子の発現および放出に関与する可能なＥＲＶ遺伝子座の数は、ＣＨＯゲノム内の最大３０個のよく保存されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のグループに限定されていた。
【0090】
次に、機能的に関連するグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列のＭｙｒおよびＰＰＹＰ出芽モチーフをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いて突然変異させて、ＥＲＶ出芽を防止することを試みた。一過性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現後に、単離されたクローンの１０～１５％が発現されたグループ１配列中に突然変異を含んでおり、そのうちのいくつかがＧａｇ機能喪失効果を引き起こした。ユニークな突然変異を定められたＥＲＶ配列の中に導入して、ＣＨＯ細胞内のウイルスＣ型粒子形成の起点として単一のゲノムＥＲＶ遺伝子座の位置を突き止めることができた。最も興味深いことに、この特定の遺伝子座の部位特異的突然変異誘発は、ウイルスゲノムＲＮＡを運ぶウイルス粒子の放出を回避するのに十分であった。これは、ＣＨＯゲノム中に存在する他のＥＲＶがＧａｇ機能喪失を補完することができないことやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９突然変異誘発で再活性化された状態になり得ないことを示していた。
【0091】
多遺伝子座ゲノム編集のための一般的な技術的課題は、広範囲なＤＮＡ損傷の存在である。この損傷は複数のＣａｓ９誘導ＤＳＢによって誘発される場合があり、これは通常ｐ５３シグナル伝達を活性化させ、かつ細胞死を引き起こす（２０、４７～５０）。本研究で設計されたｓｇＲＮＡは、ＣＨＯゲノム内の約６０個の異なるグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座を完璧に認識するが、それらの一部しか転写されず、従ってＣａｓ９によって優先的に切断することができると予測した。実際にはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９処理されたクローンは、単一の一過性トランスフェクション後に１～１４個の異なる突然変異部位を有しており、これはＣＨＯ細胞が最大１４個の別個のＤＳＢのＤＮＡ損傷応答および修復に対処できることを示唆している。単一のＤＳＢ切断により細胞死が生じる初代細胞と比較して（５０）、ＣＨＯ細胞などの形質転換細胞株は典型的に、より高いレベルの内在性ＤＮＡ損傷に遭遇するが、ここから分かるように、それらは多遺伝子座ゲノム編集に対処して生き残ることができる可能性がより高い（５１）。しかしＣＨＯ細胞であっても、ＥＲＶを標的とするｓｇＲＮＡによるかなり穏やかな一過性の処理後に細胞増殖および／または生存度の低下が観察され、これは標的部位の予測される数と十分に相関していた。細胞毒性を高めれば、さらにより高度に突然変異したクローンの単離を防止したかもしれない。これは、最大６２個の内在性ウイルス要素において突然変異を含む一次ブタ細胞の単離を報告する最近の研究がｐ５３媒介性細胞死を抑制するために抗アポトーシス処理を必要とした理由を説明する（２０）。
【0092】
多遺伝子座の編集における別の課題は、ＨＲ（相同的組換え）修復のためにテンプレートとして使用することができるＣＨＯゲノム中に存在する複数の反復ＥＲＶ配列であり、これはＣ－ＮＨＥＪ（カノニカル非相同末端結合修復）およびａｌｔ－ＥＪ（他の末端結合）修復経路によって媒介される効率的な遺伝子ノックアウトに対抗することができる。ＣＨＯ細胞では、ＨＲ活性は他の細胞と比較してかなり低いと考えられている（５２、５３）。典型的には、ＨＲはＤＳＢ（二本鎖切断）を正確に修復することができるが、不正確な修復結果も生じる（５４）。ここでは、両方のｓｇＲＮＡ部位における分析された修復ジャンクションの約１０％が他のＥＲＶ遺伝子座からのテンプレート化された挿入などのＨＲに適合するシグネチャーを含んでいることが分かった。従ってＨＲ修復は活性であり、かつおそらく効率的なＥＲＶ突然変異誘発に対抗すると仮説を立てた。
【0093】
本研究で使用したゲノム編集戦略は主として、適切なＧａｇタンパク質合成を妨害し、かつそれによりＥＲＶ出芽を防止するＧａｇ機能喪失突然変異を導入することを目指した。但し当業者であれば、ｐｏｌ遺伝子またはｅｎｖ遺伝子および／またはＬＴＲの少なくとも１つにおける機能喪失突然変異を適当な手順により導入できることも分かっているであろう。予想した通り、発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列において突然変異したクローンは、グループ１およびグループ２ＥＲＶの変わらないｍＲＮＡ発現レベルを示したが、カプセル化されたウイルスＲＮＡを放出する機能が強く損なわれていた（データは示さず)。さらに、ＥＲＶ突然変異したクローンは対照試料と比較して、細胞増殖、細胞サイズまたは治療用タンパク質産生において首尾一貫して異なっていなかった。故に、クローン間の差はクローン特異的であり得る。クローンの変異はクローンを多クローン集団から単離する際の一般的な現象であり、クローンのサブクローニング中であっても認められてきた（５７、５８）。クローン特異的な変異性は例えば、ランダム突然変異および／または特にＣＲＩＳＰＲ処理中のＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異の獲得、異なるストレス応答への曝露に起因するクローン間の遺伝的異質性だけでなく、タンパク質発現および／または後成的効果における確率的変動によっても生じる（４９、５８、５９）。さらに、細胞の細胞質における非翻訳もしくはナンセンスｍＲＮＡならびに短縮タンパク質および通常は機能不全のタンパク質の蓄積は、不明の副作用に関連づけられてきた（６０）。
【0094】
本開示は、機能的に活性なＥＲＶ遺伝子座をグループ１Ｃ型特異的ｓｇＲＮＡを用いて選択的に突然変異させることができることを示す。これはＣＨＯ細胞の安全性プロファイルを向上させ、かつそれによりバイオ医薬品の製造中にウイルスクリアランスのために必要とされるウイルス不活性化および除去工程の数を実質的に減少させるための新規な手段を提供する。単一のＥＲＶ遺伝子座がＣＨＯ細胞によるＥＲＶ発現およびウイルス粒子放出に関与し得るという発見により、ＨＩＶ感染したヒト細胞のために行われてきたように、２つの部位特異的ｓｇＲＮＡを用いて１０ｋｂ長のプロウイルスゲノム全体を切除することが可能になる（６１）。ＥＲＶ突然変異誘発のためのこの手法は、誘発されたＤＮＡ損傷応答を低下させ、おそらくＣＨＯゲノムの他の要素の突然変異から生じる細胞質における欠陥のあるＥＲＶ ＲＮＡの蓄積および／または他の有害な副作用を回避し、かつ従ってオンターゲット表現型に対する厄介な効果を減らすことができる。
【0095】
材料および方法
細胞培養
懸濁液に適応させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｋ１）由来細胞を、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ ５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社）、Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）および抗生物質－抗真菌剤溶液（ＧＩＢＣＯ社）が添加された血清非含有ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に維持した。エリスロシンＢ色素（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）によりＣＨＯ細胞生存度を評価し、ＬＵＮＡ－ＦＬ Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＬＯＧＯＳ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）を用いて生存細胞密度および細胞サイズを定量化した。この細胞を１８０ｒｐｍ撹拌速度で、加湿インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２で５０ｍｌのＴｕｂｅＳｐｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｔｕｂｅｓ（ＴＰＰ社、スイス）の中で培養し、３～４日間ごとに継代した。
細胞培養
懸濁液に適応させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｋ１）由来細胞を、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ ５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社）、Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）および抗生物質－抗真菌剤溶液（ＧＩＢＣＯ社）が添加された血清非含有ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に維持した。エリスロシンＢ色素（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）によりＣＨＯ細胞生存度を評価し、ＬＵＮＡ－ＦＬ Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＬＯＧＯＳ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）を用いて生存細胞密度および細胞サイズを定量化した。この細胞を１８０ｒｐｍ撹拌速度で、加湿インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２で５０ｍｌのＴｕｂｅＳｐｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｔｕｂｅｓ（ＴＰＰ社、スイス）の中で培養し、３～４日間ごとに継代した。
【0096】
プラスミド構築
哺乳類のコドン最適化した化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ発現プラスミドＪＤＳ２４６（ＡＤＤＧＥＮＥ社プラスミド＃４３８６１）（２１）を使用して、部位特異的ＤＳＢを導入した。ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ Ｒパッケージ（２２）を適用して、グループ１ＥＲＶのｇａｇコンセンサス配列内のミリストイル化（Ｍｙｒ）もしくはＰＰＹＰモチーフを標的とする単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を設計した。
哺乳類のコドン最適化した化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ヌクレアーゼ発現プラスミドＪＤＳ２４６（ＡＤＤＧＥＮＥ社プラスミド＃４３８６１）（２１）を使用して、部位特異的ＤＳＢを導入した。ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ Ｒパッケージ（２２）を適用して、グループ１ＥＲＶのｇａｇコンセンサス配列内のミリストイル化（Ｍｙｒ）もしくはＰＰＹＰモチーフを標的とする単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を設計した。
【0097】
標的モチーフ以外に２５ｂｐ以下のＤＳＢ切断を媒介し、かつ様々なスコアリングツールを用いて高いｓｇＲＮＡ効率を有すると予測されたため、全ての潜在的なｓｇＲＮＡのうち、３種類のＭｙｒ（Ｍｙｒ２、Ｍｙｒ４、Ｍｙｒ８）および５種類のＰＰＹＰ（ＰＰＹＰ５、ＰＰＹＰ６、ＰＰＹＰ７、ＰＰＹＰ１３、ＰＰＹＰ２０）特異的ｓｇＲＮＡ配列を選択した（ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ，（２２）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｃａｎ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲのための配列スキャン），（２３）；ｓｇＲＮＡ ｓｃｏｒｅｒ １．０，（２４））（表１）。
【表1】
【0098】
ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ Ｒ（登録商標）パッケージを用い、参照配列としてＣＨＯ－Ｋ１細胞ゲノムを用いて、これらのｓｇＲＮＡ配列のためのゲノムワイドなオフターゲット切断解析を行った。Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＴＡＲＧＥＴＥＲソフトウェアサポートツールを用いてｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し（２５、２６）、かつその後に、以前に記載されているようにアニーリングされたｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチドを哺乳類のｓｇＲＮＡ発現ベクターＭＬＭ３６３６（ＡＤＤＧＥＮＥ社プラスミド＃４３８６０）の中にクローン化した（２１）。５’末端においてグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを欠いているｓｇＲＮＡ配列のために、さらなる対形成していないＧを付加してｓｇＲＮＡ発現プラスミドからの転写をさらに向上させた（２７）。使用した全てのプライマーはＭＩＣＲＯＳＹＮＴＨ社（スイスのバルガッハ）から購入し、表２に列挙されている。
【表2】
【0099】
ＶＰおよびＶＬＰからのＲＮＡ抽出
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡミニキット（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用い、いくつかの修正を有する製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡをＶＰおよびＶＬＰを単離させたＣＨＯ培養物上澄みから抽出した。新たに調製した上澄みまたは１回の冷凍および解凍サイクル後の上澄みを使用した。５００μｌの上澄みを０．２２μｍの膜フィルタを有するＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ－Ｘカラム遠心管に充填し、１６０００ｇで１分間遠心分離した。約１２．５単位のリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を５００μｌのＣＨＯ細胞培養物上澄みに添加し、これを３７℃で１５分間インキュベートして場合により存在する残留ＤＮＡを消化する。次いで、得られた抽出物をＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡミニキットプロトコルに記載されている通りに処理した。スピンカラムから回収したＲＮＡを３０μｌのリボヌクレアーゼ非含有水に再懸濁し、その後に１０単位のリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を用いて３７℃で３０分間もう１回デオキシリボヌクレアーゼ処理をした。５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを添加した後に、抽出物を７０℃で１５分間インキュベートすることによりデオキシリボヌクレアーゼ変性工程を行った。その後に、試料中に残っているＥＤＴＡなどの塩を除去するために、これらの試料をＭＩＣＲＯＤＩＡＬＹＳＩＳ ＭＦ－ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ（ＭＥＲＫ－ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）ＶＳＷＰ型（０．０２５μｍの孔径）上に１５分間置いた。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡミニキット（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用い、いくつかの修正を有する製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡをＶＰおよびＶＬＰを単離させたＣＨＯ培養物上澄みから抽出した。新たに調製した上澄みまたは１回の冷凍および解凍サイクル後の上澄みを使用した。５００μｌの上澄みを０．２２μｍの膜フィルタを有するＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ－Ｘカラム遠心管に充填し、１６０００ｇで１分間遠心分離した。約１２．５単位のリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を５００μｌのＣＨＯ細胞培養物上澄みに添加し、これを３７℃で１５分間インキュベートして場合により存在する残留ＤＮＡを消化する。次いで、得られた抽出物をＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡミニキットプロトコルに記載されている通りに処理した。スピンカラムから回収したＲＮＡを３０μｌのリボヌクレアーゼ非含有水に再懸濁し、その後に１０単位のリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を用いて３７℃で３０分間もう１回デオキシリボヌクレアーゼ処理をした。５ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡを添加した後に、抽出物を７０℃で１５分間インキュベートすることによりデオキシリボヌクレアーゼ変性工程を行った。その後に、試料中に残っているＥＤＴＡなどの塩を除去するために、これらの試料をＭＩＣＲＯＤＩＡＬＹＳＩＳ ＭＦ－ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ（ＭＥＲＫ－ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）ＶＳＷＰ型（０．０２５μｍの孔径）上に１５分間置いた。
【0100】
ＥＲＶ配列の不活性化、蛍光細胞濃縮および単細胞単離
トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を３００，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションの当日に、ＮＥＯＮトランスフェクション系（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用い、製造業者の説明書に従って、７００，０００個の細胞に３７００ｎｇのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および１１１０ｎｇのＭｙｒもしくはＰＰＹＰ特異的ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを電気穿孔した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドを等モル比で使用した。２００ｎｇのｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓプラスミド（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）をトランスフェクション対照として各トランスフェクション条件に追加した。ＣＲＩＳＰＲ対照実験のために、ＭｙｒもしくはＰＰＹＰ特異的ｓｇＲＮＡプラスミドを空のｓｇＲＮＡ発現ベクター（空ベクター対照）で置き換えた。
トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を３００，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションの当日に、ＮＥＯＮトランスフェクション系（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用い、製造業者の説明書に従って、７００，０００個の細胞に３７００ｎｇのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および１１１０ｎｇのＭｙｒもしくはＰＰＹＰ特異的ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを電気穿孔した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドを等モル比で使用した。２００ｎｇのｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓプラスミド（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）をトランスフェクション対照として各トランスフェクション条件に追加した。ＣＲＩＳＰＲ対照実験のために、ＭｙｒもしくはＰＰＹＰ特異的ｓｇＲＮＡプラスミドを空のｓｇＲＮＡ発現ベクター（空ベクター対照）で置き換えた。
【0101】
トランスフェクトおよびＥＲＶ突然変異したＣＨＯ細胞を濃縮するために、少なくとも７０，０００個の細胞をトランスフェクションから４８～７２時間後にＭＯＦＬＯ ＡＳＴＲＩＯＳ ＥＱまたはＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて、最も高い３０～４０％のトランスフェクトされたｄｓＲｅｄを発現している細胞集団についてバルク選別した。次いで、培地を交換するために細胞を簡単に遠心分離し、かつ増殖させた。単細胞クローンを単離するために、ＣＲＩＳＰＲ処理された細胞をＤＡＰＩ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）と共に室温で１５分間インキュベートした。生存細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（登録商標）（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いて９６ウェルプレートの中に単細胞選別した。Ｌ－グルタミン、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、抗生物質－抗真菌剤溶液およびＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＣＨＯ ＡＣＦ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）が添加されたＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ＳＦＭ４ＣＨＯ培地において細胞クローンを回収して、選別後生存を高めた。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアｖ１０．４．２を用いてフローサイトメトリーデータを分析した。細胞を最初に前方散乱（ＦＳＣ）に対して側方散乱（ＳＳＣ）を用いてゲートをかけてインタクトな細胞集団をデブリから分離し、次いでＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－ＷおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ｗプロットで単細胞を選択した。次いでゲーティング対照として非蛍光細胞を用いて、この単細胞集団をｄｓＲｅｄ＋細胞についてゲートをかけた。
【0102】
ＥＲＶ突然変異効率
ＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡの切断効率を評価するために、転写されたＥＲＶ配列の中でＥＲＶ突然変異頻度を決定した。ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ ＲＮＡキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ ＮＡＧＥＬ社）を用いてＣＲＩＳＰＲ処理されたポリクローナル細胞集団から全ＲＮＡを抽出し、かつオリゴ（ｄＴ）１５プライマーおよびＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写系（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて逆方向転写してｃＤＮＡにした。ＣＲＩＳＰＲ処理された単細胞クローンのために、ＳＶ ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて全ＲＮＡを単離し、かつＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｉｘ，オリゴ（ｄＴ）（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて逆方向転写した。グループ１ＥＲＶ特異的プライマーと共にＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、ＣＲＩＳＰＲ標的領域のＰＣＲ増幅を行った（表２Ｂ）。ＳａｎｇｅｒシーケンシングによりＰＣＲ産物を分析し、かつ突然変異について分析した。混合されたＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムの分解およびＴＩＤＥソフトウェア（２８）を用いた未処理（野生型）細胞との比較により、ＣＲＩＳＰＲ処理された多クローン集団における突然変異誘発頻度を決定した。
ＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡの切断効率を評価するために、転写されたＥＲＶ配列の中でＥＲＶ突然変異頻度を決定した。ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ ＲＮＡキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ ＮＡＧＥＬ社）を用いてＣＲＩＳＰＲ処理されたポリクローナル細胞集団から全ＲＮＡを抽出し、かつオリゴ（ｄＴ）１５プライマーおよびＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写系（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて逆方向転写してｃＤＮＡにした。ＣＲＩＳＰＲ処理された単細胞クローンのために、ＳＶ ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて全ＲＮＡを単離し、かつＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｉｘ，オリゴ（ｄＴ）（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いて逆方向転写した。グループ１ＥＲＶ特異的プライマーと共にＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、ＣＲＩＳＰＲ標的領域のＰＣＲ増幅を行った（表２Ｂ）。ＳａｎｇｅｒシーケンシングによりＰＣＲ産物を分析し、かつ突然変異について分析した。混合されたＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムの分解およびＴＩＤＥソフトウェア（２８）を用いた未処理（野生型）細胞との比較により、ＣＲＩＳＰＲ処理された多クローン集団における突然変異誘発頻度を決定した。
【0103】
ＣＲＩＳＰＲ標的ゲノム領域のディープアンプリコンシーケンシング分析
ゲノムレベルでのＣＲＩＳＰＲ誘導ＥＲＶ突然変異の数を評価するために、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＥＲＶ編集されたＣＨＯクローンからＤＮＡを抽出した。この抽出したゲノムＤＮＡを使用して、いくつかの修正を含むＩｌｌｕｍｉｎａ社の「１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（１６Ｓメタゲノムシーケンシングライブラリー調製）」プロトコルに記載されている二段階ＰＣＲ手法でシーケンシングライブラリーを準備した。簡単に言うと、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｍツールを用いて変性プライマーを設計して（２９）、全ての予測されるＣ型ＥＲＶ配列のＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ標的部位の両端に位置する約３００ｂｐのゲノム領域を増幅させた（Ｍｙｒのために２９０ｂｐのアンプリコン、ＰＰＹＰのために３１４ｂｐのアンプリコン、表２）。変性プライマーは、テンプレート複雑性を増加させるために様々な０～３ｂｐの異種スペーサーを含んでおり（３０）、ＭｙｒもしくはＰＰＹＰプライマーは予測されるゲノム頻度で混合されていた。１回目のＰＣＲラウンドでは、１００ｎｇの単離されたゲノムＤＮＡを使用して、ＭｙｒおよびＰＰＹＰ標的遺伝子座をそれぞれ２３および２０サイクルのためにＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（登録商標）（２×）（ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）を用いてＰＣＲ増幅させた。１：１ビーズ比を用いてＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（登録商標）ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）でＰＣＲアンプリコンを精製した。アンプリコンの品質およびサイズをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で確認し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いてＤＮＡを定量化した。２回目のＰＣＲラウンドでは、８ＰＣＲサイクルを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ（登録商標）シーケンシングアダプターを１５ｎｇの精製したアンプリコンに付加した。最終ライブラリーを１：１．１２ビーズ比を用いて、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（登録商標）ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）で精製した。ライブラリーの品質およびサイズをＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ社）を用いて確認し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて定量化した。ライブラリーを等モル比でプールし、２５％ＰｈｉＸを添加し、かつローザンヌ大学（スイス）のゲノム技術施設（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）上で２×２５０ｂｐのペアエンドシーケンシングを用いてシークエンシングした。
ゲノムレベルでのＣＲＩＳＰＲ誘導ＥＲＶ突然変異の数を評価するために、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＥＲＶ編集されたＣＨＯクローンからＤＮＡを抽出した。この抽出したゲノムＤＮＡを使用して、いくつかの修正を含むＩｌｌｕｍｉｎａ社の「１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（１６Ｓメタゲノムシーケンシングライブラリー調製）」プロトコルに記載されている二段階ＰＣＲ手法でシーケンシングライブラリーを準備した。簡単に言うと、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｍツールを用いて変性プライマーを設計して（２９）、全ての予測されるＣ型ＥＲＶ配列のＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ標的部位の両端に位置する約３００ｂｐのゲノム領域を増幅させた（Ｍｙｒのために２９０ｂｐのアンプリコン、ＰＰＹＰのために３１４ｂｐのアンプリコン、表２）。変性プライマーは、テンプレート複雑性を増加させるために様々な０～３ｂｐの異種スペーサーを含んでおり（３０）、ＭｙｒもしくはＰＰＹＰプライマーは予測されるゲノム頻度で混合されていた。１回目のＰＣＲラウンドでは、１００ｎｇの単離されたゲノムＤＮＡを使用して、ＭｙｒおよびＰＰＹＰ標的遺伝子座をそれぞれ２３および２０サイクルのためにＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（登録商標）（２×）（ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）を用いてＰＣＲ増幅させた。１：１ビーズ比を用いてＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（登録商標）ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）でＰＣＲアンプリコンを精製した。アンプリコンの品質およびサイズをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で確認し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いてＤＮＡを定量化した。２回目のＰＣＲラウンドでは、８ＰＣＲサイクルを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ（登録商標）シーケンシングアダプターを１５ｎｇの精製したアンプリコンに付加した。最終ライブラリーを１：１．１２ビーズ比を用いて、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（登録商標）ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）で精製した。ライブラリーの品質およびサイズをＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ社）を用いて確認し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて定量化した。ライブラリーを等モル比でプールし、２５％ＰｈｉＸを添加し、かつローザンヌ大学（スイス）のゲノム技術施設（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）上で２×２５０ｂｐのペアエンドシーケンシングを用いてシークエンシングした。
【0104】
全ての同定された突然変異について、突然変異フランキング領域におけるＥＲＶ遺伝子座特異的遺伝変異について試験するために、ＵＰＧＭＡ系統樹法の下でＪｕｋｅｓ－Ｃａｎｔｏｒ遺伝的距離モデルを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ生リードをクラスター化させた。
【0105】
ＥＲＶ突然変異したＣＨＯクローンの全ゲノムシーケンシング
全ＣＨＯゲノムにおける突然変異したＥＲＶ遺伝子座を同定するために、血液＆細胞培養ＤＮＡキット（Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて高分子量ＤＮＡをｓｇＲＮＡ ＰＰＹＰ６処理されたＥ１０クローンから抽出した。ＤＮＡの品質および量をそれぞれ、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ社）およびＱｕｉｂｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて確認した。ローザンヌ大学（スイス）のゲノム技術施設において、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）上で試料シーケンシングを行った。
全ＣＨＯゲノムにおける突然変異したＥＲＶ遺伝子座を同定するために、血液＆細胞培養ＤＮＡキット（Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて高分子量ＤＮＡをｓｇＲＮＡ ＰＰＹＰ６処理されたＥ１０クローンから抽出した。ＤＮＡの品質および量をそれぞれ、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ社）およびＱｕｉｂｉｔ（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて確認した。ローザンヌ大学（スイス）のゲノム技術施設において、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）上で試料シーケンシングを行った。
【0106】
治療用タンパク質発現の分析
ＥＲＶ修正された細胞の治療用タンパク質産生能力を評価するために、ＥＲＶ特異的もしくは空のｓｇＲＮＡ発現プラスミドで予め処理されたポリクローナル細胞集団および細胞クローンに、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するトラスツズマブ免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖および軽鎖発現ベクターを電気穿孔した（３１）。対照として、並行して野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞を同じ発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に、細胞を５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培養培地に移し、かつ３週間にわたって選択した。
ＥＲＶ修正された細胞の治療用タンパク質産生能力を評価するために、ＥＲＶ特異的もしくは空のｓｇＲＮＡ発現プラスミドで予め処理されたポリクローナル細胞集団および細胞クローンに、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するトラスツズマブ免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖および軽鎖発現ベクターを電気穿孔した（３１）。対照として、並行して野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞を同じ発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に、細胞を５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培養培地に移し、かつ３週間にわたって選択した。
【0107】
安定なトラスツズマブを発現する細胞集団の培養物からの免疫グロブリン力価を、先に記載したように１０日間の流加培養中に定量化した（３１）。簡単に言うと、細胞をピューロマイシン選択なしに０．３×１０６細胞／ｍｌで５ｍｌの初期培養物体積で播種した。細胞培養物に細胞培養の０日目、２日目、３日目および６～８日目に初期培養物体積の１６％でＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ ５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社）を与えた。細胞密度および生存度を３日目、６日目、８日目および１０日目に評価し、かつ６日目、８日目および１０日目に細胞培養物上澄みにおける免疫グロブリン分泌をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【0108】
ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるＥＲＶ要素の特性評価
ＣＨＯ細胞中に存在するＥＲＶを探すために、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）ロングリードシーケンシングを用いてＣＨＯ－Ｋ１ゲノムを新たに組み立て、かつ以前に報告されたＩＡＰおよびＭＬ２Ｇマウスレトロウイルス配列をこの組立体の中で探した（１２、１３）。さらに本発明者らは、配列類似性によって同定されたＥＲＶ要素を補完および検証するためにプロファイルも使用した。約１６０コピーのＩＡＰ様プロウイルス要素をＣＨＯゲノム内で見つけた。約２００個のＩＡＰに加えて、ＣＨＯ細胞中のＭＬ２Ｇと少なくとも８０％の配列同一性を共有する１７３個のガンマレトロウイルスＣ型プロウイルスを同定した（１２）（表３）。
ＣＨＯ細胞中に存在するＥＲＶを探すために、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）ロングリードシーケンシングを用いてＣＨＯ－Ｋ１ゲノムを新たに組み立て、かつ以前に報告されたＩＡＰおよびＭＬ２Ｇマウスレトロウイルス配列をこの組立体の中で探した（１２、１３）。さらに本発明者らは、配列類似性によって同定されたＥＲＶ要素を補完および検証するためにプロファイルも使用した。約１６０コピーのＩＡＰ様プロウイルス要素をＣＨＯゲノム内で見つけた。約２００個のＩＡＰに加えて、ＣＨＯ細胞中のＭＬ２Ｇと少なくとも８０％の配列同一性を共有する１７３個のガンマレトロウイルスＣ型プロウイルスを同定した（１２）（表３）。
【表3】
【0109】
Ｃ型プロウイルスの同定された数は以前の推定値に一致していたが（６）、いくつかのＥＲＶコピーは組立体の中に上手く配置することができなかったことが認められ、これは１７３コピーがＣＨＯ細胞中のＣ型ＥＲＶ要素の総リザーバーの過小評価である可能性が高いことを示唆している。同定された１７３個のＣ型ＥＲＶ配列のうち１１２個のみが、機能性ＥＲＶを産生するために必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含んでいた。これらの完全長ハムスターＣ型ＥＲＶ配列の系統学的分析により、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）およびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他の哺乳類のレトロウイルス要素とのそれらの高い類似性が明らかになった（データは示さず）。これらのＣ型ＥＲＶ配列のうち、本発明者らは２つの異なるグループ、すなわちそれぞれ１０１個および３６個のメンバーからなるグループ１およびグループ２を同定した（図１Ａ）。グループ１およびグループ２Ｃ型ＥＲＶは、完全な５’ＬＴＲ－ｇａｇ－ｐｏｌ－ｅｎｖ－３’ＬＴＲプロウイルス構造を有する、支配的かつ機能的に最も保存された配列クラスターを形成し、かつそれらはまた、霊長類細胞株を感染させるウイルス粒子を産生することが知られているＭＬＶ要素と最も高い類似性を共有していた（１６）。これはグループ１および２ＥＲＶがウイルス粒子形成のための最も可能性の高い候補であることを暗示していた。
【0110】
さらなる配列分析により、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子はグループ１およびグループ２ＥＲＶ配列の中で高度に保存されていたが、グループ１に属するＥＲＶはグループ２からのＥＲＶよりも全体的に低い多様性を示すことが強調され（図１Ｂ～図１Ｄ）、かつ例えばＥｎｖ系の系統発生から、ＥＲＶのおそらく異なり、かつあまり保存されていない第３のグループの存在が明らかとなった（図１Ｄ）。平均してグループ１ＥＲＶ配列は９９％の配列同一性を共有しており、かつ３つのサブグループ（図１Ｂ～図１Ｄでは異なる影で示されている）を形成する可能性が高い。但し、これらのＥＲＶ配列の全体的に高い保存およびＰａｃＢｉｏ（登録商標）リードを用いて組み立てられたゲノムにおけるシーケンシングエラーの頻度は、これらのグループ１、２およびグループ３ＥＲＶのうちのどれが機能性であり、かつ潜在的に活性であり得るかという直接同定を妨害した。
【0111】
ゲノムＣＨＯ ＥＲＶの特性評価を補完するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ（登録商標）技術を用いて全細胞内ｍＲＮＡをシークエンシングして、転写されたＥＲＶ配列をさらに正確なものにした。Ｃ型ＥＲＶ ｍＲＮＡは、ＣＨＯ細胞の中で上から１０番以内の最も豊富な転写物の中に含まれていた（データは示さず）。これらのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）リードをＣ型ＥＲＶの代表配列にマッピングすることより、全てのリードの９９．５％がグループ１および２に対応する配列を有していることが分かり、これは、これらの２つのグループがＣＨＯ細胞の転写されたＥＲＶの大多数に寄与していることを示している。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）リードを主に２つの容易に同定可能なグループ２ＥＲＶ配列とマッピングする間に、それらは約３０個のグループ１ＥＲＶ配列にマッピングした（図２Ａ）。グループ１ＥＲＶは最も高度に保存されていたため、これらのリードをユニークなグループ１遺伝子座の１個または数個へ明白に帰属させることは出来なかった。興味深いことに、両方の転写されたグループ２ＥＲＶ配列は中断されたＯＲＦおよび／または欠損しているコード配列を含んでおり、一方はｐｏｌ遺伝子内に２３５０ｂｐの欠失を含み、他方はｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子内に１つのフレームシフトとｐｏｌ内に３つの終止コドン突然変異とを有していた。これらの突然変異はＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認された。対照的に、転写されたグループ１ＥＲＶ配列は完全長ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ転写物をコードするようであった。全体的に見て、これはＣＨＯ細胞内の総ＥＲＶ要素の約２～２０％に対応する３～３２個のＥＲＶ遺伝子座が転写されたことを示唆していた（表３）。そのようなＥＲＶ発現頻度は、内部で生じたＥＲＶの大多数が細胞株および生物において後成的に発現停止されることを示す以前の報告に一致している（３２）。最後に、全細胞内ｍＲＮＡのうち、ＬＴＲを含むウイルスゲノムＲＮＡも検出され、これはＣＨＯ細胞が、細胞上澄みにおいてレトロウイルス粒子としてカプセル化されて放出され得るレトロウイルスゲノムを産生することができることを示している。
【0112】
培養されたＣＨＯ細胞によって放出されたレトロウイルス様粒子を単離し、かつウイルスゲノムＲＮＡ配列を抽出して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）技術を用いるディープシーケンシングにより特性評価した。全細胞内ｍＲＮＡ配列と比較した場合に、ＬＴＲを含むウイルスゲノムＲＮＡの２０倍濃縮が観察された（図２Ａ）。これは、ＣＨＯ細胞がゲノムウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を細胞上澄みの中に排出することができることを示していた。これらのウイルスＲＮＡ配列の詳細な分析から、放出されたウイルス粒子中にグループ１由来リードが主として存在することが示された（図２Ｂ）。さらに、これらの配列をたった１～５つの異なるグループ１ＥＲＶ配列にマッピングすることができ、これは、少ないグループ１ＥＲＶ遺伝子座のみがＣＨＯ細胞におけるウイルス粒子（ＶＰ）の産生に関与していることが示唆している（表３）。
【0113】
機能性グループ１Ｃ型ＥＲＶ配列をさらに特性評価するために、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験のためのグループ１特異的プローブを設計した。これらのプローブを用いてＣＨＯ－Ｋ１ゲノム内の約５０～１００個のグループ１ＥＲＶ組込み部位が検出され、これは新しく組み立てられたゲノム中で検出されたウイルス組込みイベントの数に一致している（図２Ｃおよび表３）。可能な組込みホットスポットが最小の染色体のうちの１つの中にある状態で、レトロウイルスの組込みをＣＨＯ－Ｋ１ゲノム全体に分散させた。さらにグループ１発生期ｍＲＮＡを染色した場合、単一のグループ１ＥＲＶ遺伝子座のみが転写活性であり得ることを示唆するユニークな高度に転写された部位が観察された（図２Ｄ）。
【0114】
要するに、ゲノム、トランスクリプトームおよびウイルス粒子（ＶＰ）レベルにおける系統的なＥＲＶ特性評価から、いくつかのＣ型グループ１ＥＲＶがＣＨＯ－Ｋ１細胞からの機能性レトロウイルス粒子の発現および放出のための有力候補として同定された。Ｃ型ＥＲＶ配列の中での高い配列同一性により、発現されたＥＲＶ遺伝子座の正確な数は明らかにはならなかったが、これらのデータから、ゲノム編集により少ない転写されたグループ１ＥＲＶ遺伝子座を突然変異させるだけでＥＲＶ粒子形成を防止するのに十分であり得ることが示唆された。
【0115】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集のためのＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡ配列の設計
ＣＨＯ細胞からの潜在的に感染性のウイルス粒子（ＶＰ）の放出を阻害するために、ＶＰ放出のために重要な保存されたＥＲＶ配列モチーフを分断することが目標であった。Ｇａｇタンパク質はレトロウイルスの出芽中に中心的役割を担い、かつ首尾一貫してそれはＣＨＯ細胞内のＣ型ＥＲＶの中に保存されていた。しかし、例えばｐｏｌ遺伝子とは対照的に、ｇａｇ配列はグループ１をグループ２Ｃ型ＥＲＶ配列から同定するのに十分に異なっており、これによりグループ１ＥＲＶ粒子を特異的に標的とすることが可能であった（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ウイルス出芽に関与する２つの保存されたｇａｇ配列、すなわちミリストイル化（Ｍｙｒ）およびＰＰｘＹモチーフをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性突然変異誘発のための標的として選択した。Ｎ末端Ｍｙｒモチーフは、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流の２位にあるグリシン残基に位置している（図３）。Ｇａｇのミリストイル化は一般に、そのタンパク質を宿主血漿膜に向けるために不可欠であるとみなされている（３３）。Ｇａｇミリストイル化を直接妨害する突然変異、生理的開始部位からの翻訳を阻止する突然変異、または機能喪失ｇａｇ転写物を生成する突然変異は、血漿膜における適切なウイルス粒子の組み立てを乱し、故にレトロウイルス粒子の出芽を阻止する（３３、３４）。Ｍｙｒに加えて、保存されたプロリン高含有ＰＰｘＹモチーフもおそらくＥＳＣＲＴ機構と相互作用することによりレトロウイルスの出芽に寄与し（３５）、かつその突然変異はウイルス粒子放出を強力に阻害する（３６）。ＰＰｘＹモチーフはグループ１およびグループ２ＣＨＯ ＥＲＶの中に保存されたＰＰＹＰモチーフ（これは以後、このＣＨＯ特異的ＰＰｘＹ関連出芽モチーフを指すためにＰＰＹＰと呼ぶ）と重なり合っていた。
ＣＨＯ細胞からの潜在的に感染性のウイルス粒子（ＶＰ）の放出を阻害するために、ＶＰ放出のために重要な保存されたＥＲＶ配列モチーフを分断することが目標であった。Ｇａｇタンパク質はレトロウイルスの出芽中に中心的役割を担い、かつ首尾一貫してそれはＣＨＯ細胞内のＣ型ＥＲＶの中に保存されていた。しかし、例えばｐｏｌ遺伝子とは対照的に、ｇａｇ配列はグループ１をグループ２Ｃ型ＥＲＶ配列から同定するのに十分に異なっており、これによりグループ１ＥＲＶ粒子を特異的に標的とすることが可能であった（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ウイルス出芽に関与する２つの保存されたｇａｇ配列、すなわちミリストイル化（Ｍｙｒ）およびＰＰｘＹモチーフをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性突然変異誘発のための標的として選択した。Ｎ末端Ｍｙｒモチーフは、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流の２位にあるグリシン残基に位置している（図３）。Ｇａｇのミリストイル化は一般に、そのタンパク質を宿主血漿膜に向けるために不可欠であるとみなされている（３３）。Ｇａｇミリストイル化を直接妨害する突然変異、生理的開始部位からの翻訳を阻止する突然変異、または機能喪失ｇａｇ転写物を生成する突然変異は、血漿膜における適切なウイルス粒子の組み立てを乱し、故にレトロウイルス粒子の出芽を阻止する（３３、３４）。Ｍｙｒに加えて、保存されたプロリン高含有ＰＰｘＹモチーフもおそらくＥＳＣＲＴ機構と相互作用することによりレトロウイルスの出芽に寄与し（３５）、かつその突然変異はウイルス粒子放出を強力に阻害する（３６）。ＰＰｘＹモチーフはグループ１およびグループ２ＣＨＯ ＥＲＶの中に保存されたＰＰＹＰモチーフ（これは以後、このＣＨＯ特異的ＰＰｘＹ関連出芽モチーフを指すためにＰＰＹＰと呼ぶ）と重なり合っていた。
【0116】
３つの構築物がＭｙｒモチーフ（Ｍｙｒ２、Ｍｙｒ４、Ｍｙｒ８）を標的とし、かつ５つの構築物がＰＰＹＰモチーフ（ＰＰＹＰ５、ＰＰＹＰ６、ＰＰＹＰ７、ＰＰＹＰ１３、ＰＰＹＰ２０）を標的とする、グループ１ｇａｇコンセンサス配列に対する８つのｓｇＲＮＡを設計した（図３）。選択されたｓｇＲＮＡ配列は対応する標的モチーフの近くに位置し、かつ最大で３つのミスマッチおよび非カノニカルプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を許容する場合に最大２８３個の部位を標的とすること以外は、３３～１１７個の標的ＥＲＶ配列に完璧に一致するものと予測した（表１）。重要なことに、全てのこれらの潜在的切断部位はＥＲＶ配列に位置し、ＣＨＯゲノム内の他のオフターゲット部位は検出されなかった。これらのｓｇＲＮＡ配列は多数の予測される標的部位を含むが、発現されたＥＲＶはそのオープンクロマチンの優先的選択によりＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって優先的に切断され得ると仮説を立てた（３７）。
【0117】
Ｇａｇ出芽モチーフを突然変異させるために、ＣＨＯ－Ｋ１親細胞をｄｓＲｅｄトランスフェクション対照プラスミドと共にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＭｙｒもしくはＰＰＹＰｓｇＲＮＡ発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲ対照試料のために、ｇａｇ特異的ｓｇＲＮＡ発現プラスミドをノンターゲティング空ベクターｓｇＲＮＡ対照プラスミド（空ベクター）または未処理のままもの（野生型）で置き換えた。標的モチーフに突然変異を含む細胞を濃縮するために、トランスフェクトされたｄｓＲｅｄ陽性（ｄｓＲｅｄ＋）細胞をバルク選別した。ＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡによる処理後に、対照試料と比較してトランスフェクトされたｄｓＲｅｄ＋細胞の全体的に減少した頻度ならびにｄｓＲｅｄ＋細胞におけるｄｓＲｅｄ蛍光強度の有意な低下が認められ、これは最も高度にトランスフェクトされた細胞は高頻度のゲノム切断により生き残ることができないことを示唆している（図７Ａおよび図７Ｂ）。首尾一貫して、この効果は最も少ない数の予測される標的部位を有するＭｙｒ４ ｓｇＲＮＡで処理された細胞では減少していた。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ処理後に高い細胞粒度も観察し、これはｄｓＲｅｄ＋細胞の頻度および発現強度と逆相関していた（図７Ｃおよび図７Ｄ）。高顆粒細胞は、アポトーシス促進性および／または瀕死の細胞集団からなることが以前に報告された（３８）。要するに、これはＣＲＩＳＰＲ媒介性ＥＲＶ切断が、特に高度にトランスフェクトされた細胞において細胞増殖および生存を妨害するという証拠を提供し、これは、ＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡはＤＳＢをＣＨＯゲノム内の複数の標的部位に効率的に導入することを暗示している。
【0118】
発現されたグループ１ＥＲＶにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介性突然変異誘発頻度を推定するために、バルク選別されたＭｙｒおよびＰＰＹＰ処理された細胞の全細胞内ｍＲＮＡを逆方向転写し、ＰＣＲ増幅し、その後に単一コロニーの配列分析前に、多クローンＰＣＲ産物の直接シーケンシングまたはそれらの細菌性ベクター内へのクローニングを行った。これらの分析に基づき、設計されたｇａｇ特異的ｓｇＲＮＡがＥＲＶ ｍＲＮＡの約９～３５％の中に突然変異を導入し、かつＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡが最も効率的であると推定された（図８、表４、表５）。興味深いことに、回収された突然変異のいくつかは、翻訳を阻止するかフレームシフトを導入し、従ってＧａｇ機能喪失表現型を引き起こすと予想された。
【表4】
【0119】
表５は、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびに様々なｓｇＲＮＡ（Ｍｙｒ２、ＰＰＹＰ６およびＰＰＹＰ１３）で処理されたＣＨＯ－Ｋ１細胞の発現されたＥＲＶ修復ジャンクションのｍＲＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングデータを示す。これらの配列は、プラスミドベクター内にクローン化させたｃＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒシーケンシングから得られる。
【表5】
【0120】
表５は、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびに様々なｓｇＲＮＡ（Ｍｙｒ２、ＰＰＹＰ６およびＰＰＹＰ１３）で処理されたＣＨＯ－Ｋ１細胞の発現されたＥＲＶ修復ジャンクションのｍＲＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングデータを示す。列２には、様々なｓｇＲＮＡおよび野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導された予測される平滑末端ＤＳＢ部位がイタリック体のＡｒｉａｌ Ｂｌａｃｋフォント（例えば
）で強調されており、ＰＡＭ部位は太字のＡｒｉａｌフォント（例えば
）で示されている。ＭｙｒおよびＰＰＹＰ標的モチーフは普通のＡｒｉａｌ Ｂｌａｃｋフォント（例えば
）で強調されている。マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）修復機序の前から存在するマイクロホモロジー（ＭＨ）は太字で示されており、合成依存的マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）機序の新規ＭＨは二重線で下線が引かれている。挿入された塩基は太字で表されており、欠失された塩基は「－」符号で表されており、置換は太字の黒色で表されている。（８）４番目のヌクレオチドの重複からなる頻繁な１ｂｐの挿入も以前に観察されており（Ｌｅｍｏｓ ２０１８，Ｔａｈｅｒｉ ２０１８）、（９）挿入のためのＤＮＡテンプレート配列は２９０ｂｐ上流に位置し、（１０）挿入のためのＤＮＡテンプレート配列は７１ｂｐ下流に位置していた。
【化1】
【化2】
【化3】
【0121】
表５の列２は、様々なｓｇＲＮＡによって誘導された予測される平滑末端ＤＳＢ部位を示し、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは強調されている（さらなる詳細は表の説明文を参照）。列３には、突然変異のサイズおよびＭＨ長さ（単位：ｂｐ）が提供されている。新規ＭＨのプライミング部位と切断部位との間の距離はカッコで示されている。列４は、ＥＲＶ突然変異型がインフレーム突然変異、アウトオブフレーム突然変異、翻訳阻害（ＡＴＧ翻訳開始コドンの突然変異）またはＥＲＶコード領域以外に位置している突然変異を含むことを示す。アウトオブフレーム突然変異および翻訳阻害はＥＲＶ発現およびＶＬＰ形成に影響を与える可能性が高く、インフレーム突然変異およびコード領域以外の突然変異はその可能性が低い。列５には、手動ジャンクション分析に基づく最も起こりそうなＤＳＢ修復機序が示されている。可能な修復機序は、Ｃ－ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、ＳＤ－ＭＭＥＪ（スナップバック）、ＳＤ－ＭＭＥＪ（ループアウト）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、相同的組換え（ＨＲ）および不明を含む。スナップバックＳＤ－ＭＭＥＪ機序の場合、新規プライミング部位は逆方向反復配列であり、ループアウトＳＤ－ＭＭＥＪ機序は直接反復配列を有するプライミング部位を使用する（Ｋｈｏｄａｖｅｒｉｄａｎ ２０１７）。観察されたジャンクション配列が２つ以上の機序に適合しており、かつ両方が同等に現れる可能性が高い場合、全ての潜在的な経路が列挙されている。Ｓｃｈｉｍｍｅｌら ２０１７（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ２０１７）に記載されているプログラムを用いて、ジャンクションを切断部位における相同性およびテンプレート化された挿入（ＳＤ－ＭＭＥＪ）について確認した。列６は、ＭＨサイズおよび欠失長さに従って各修復パターンのスコアを示す。Ｂａｅら ２０１４（Ｂａｅ ２０１４）に記載されているＲＧｅｎｏｍｅ「Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ」ツール（ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｍｉｃｈ－ｃａｌｃｕｌａｔｏｒウェブサイト）を用いて、パターンスコアを計算した。そのスコアが高くなるほど、予測される突然変異が観察される可能性が高くなる。そのパターンスコアは、切断部位においてＭＨを示す修復ジャンクションのためにのみ有効である（ＭＭＥＪ媒介修復）。列７は、Ａｌｌａｎら ２０１８（Ａｌｌａｎ ２０１８）に記載されているオンラインツールＦＯＲＥＣａｓＴ１（登録商標）（Ｆａｖｏｒｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｖｅｎｔｓ ａｔ Ｃａｓ９ Ｔａｒｇｅｔｓ；ｐａｒｔｓｌａｂ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＦＯＲＥＣａｓＴウェブサイト）を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集結果の予測される頻度を示す。その頻度が高くなるほど、より多くのジャンクションが予測される突然変異パターンを含むと期待される。予測される１０種の最も頻繁な突然変異頻度のみが列挙されている。
【0122】
ＥＲＶ突然変異したＣＨＯ－Ｋ１クローンの単離および特性評価
発現されたグループ１ＥＲＶ配列の約１０～１５％が突然変異されているものと予測した場合、ウイルス粒子放出の潜在的減少は多クローン集団内で検出することが難しくなると仮説を立てた。従って、単一のＣＨＯ細胞クローンをバルク選別されたＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６編集された細胞プールから単離し、発現されたグループ１ＥＲＶ配列中に突然変異を有するものをスクリーニングした。９５個のうち１８個（１８％）および１８１個のうち１４個（８％）のＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ処理されたクローンがそれぞれ、ｍＲＮＡレベルでグループ１ＥＲＶ突然変異を含んでおり、これは以前の推定値に一致している（表６、表４、表５）。
発現されたグループ１ＥＲＶ配列の約１０～１５％が突然変異されているものと予測した場合、ウイルス粒子放出の潜在的減少は多クローン集団内で検出することが難しくなると仮説を立てた。従って、単一のＣＨＯ細胞クローンをバルク選別されたＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６編集された細胞プールから単離し、発現されたグループ１ＥＲＶ配列中に突然変異を有するものをスクリーニングした。９５個のうち１８個（１８％）および１８１個のうち１４個（８％）のＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ処理されたクローンがそれぞれ、ｍＲＮＡレベルでグループ１ＥＲＶ突然変異を含んでおり、これは以前の推定値に一致している（表６、表４、表５）。
【表6】
【0123】
Ｍｙｒ２が突然変異したクローンのうち、その大多数がＡＴＧ開始コドンの上流に同一の１ｂｐの挿入を有していた（表７）。これはねじれ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断に起因している可能性が高かった（３９）。ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡで処理されたクローンはＰＰＹＰモチーフに跨る突然変異を獲得しなかった。それにも関わらず、２つのＭｙｒ２および１１個のＰＰＹＰ６誘導クローンは、翻訳を阻止するかｇａｇ転写物をフレームシフトする突然変異を含んでいたため、それらはウイルス粒子放出を減少させるための有望な候補になった。全てのクローンの修復ジャンクションのＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムが明らかな単独突然変異した配列を示し、かつＣＲＩＳＰＲフランキング配列においてバックグラウンドノイズを欠いていることも観察された。これは、単一のグループ１ＥＲＶ遺伝子座のみが顕著に転写され、ＣＨＯ細胞によるウイルス粒子を産生させ得るという仮説を支持していた。
【表7】
【0124】
表７は、親の操作されていないＣｈｏ細胞の突然変異されていない配列（ゲノム）に対して野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡで処理されたＣＨＯ－Ｋ１クローンの発現されたＥＲＶ修復ジャンクション（ジャンクション）のｍＲＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングデータを示す。これらの配列はｃＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒシーケンシングから得た。同じ修復ジャンクションが２回以上検出された場合、数は（ｎ＝）として各試料名の下に示されている。列２には、２つのｓｇＲＮＡおよび野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導された予測される平滑末端ＤＳＢ部位がイタリック体のＡｒｉａｌ Ｂｌａｃｋフォント（例えば
）で強調されており、ＰＡＭ部位ならびにＭｙｒおよびＰＰＹＰ標的モチーフは通常のＡｒｉａｌ Ｂｌａｃｋフォント（例えば
）で強調されている。マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）修復機序の前から存在するマイクロホモロジー（ＭＨ）は太字の灰色の文字（例えば
）で示されており、合成依存的マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）機序の新規ＭＨには二重線で下線が引かれている。挿入された塩基は小さい太字のＣｏｕｒｉｅｒ文字（例えば、
）で表されており、欠失された塩基は「－」符号で表されており、置換はイタリック体で表されており、かつ一本の太線で下線が引かれている（濃く強調されている四角はＧＧＧを含んでいる）。ＮＡ：入手不可。（８）４番目のヌクレオチドの重複からなる頻繁な１ｂｐの挿入も以前に観察された（Ｌｅｍｏｓ ２０１８、Ｔａｈｅｒｉ ２０１８）。（９）不明な機序であるが同様のジャンクションパターンがＳｈｉｎら ２０１７（Ｓｈｉｎ ２０１７）に記載されている。
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【0125】
ＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異をゲノムレベルでさらに調査するために、Ｃ型ＥＲＶのＭｙｒおよびＰＰＹＰフランキング領域を、発現されたＥＲＶ配列内に突然変異を有するＣＨＯクローンのサブセットにおいてディープシーケンシングした（表７）。Ｇａｇ機能喪失突然変異を有する２つのＭｙｒ２および４つのＰＰＹＰ６で編集されたクローンを発現されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列（Ｍｙｒ２のためにクローンＣＯ２およびＤ１２；ＰＰＹＰ６のためにＡ０２、Ｅ１０、Ｋ０３およびＫ１４）ならびにグループ１ＥＲＶコード領域以外の突然変異を有する１つのＭｙｒ２誘導クローン（Ｇ０９）において選択し、それらを野生型および空ベクター対照試料と共に遺伝子型を同定した。
【0126】
表７は、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡで処理されたＣＨＯ－Ｋ１クローンの発現されたＥＲＶ修復ジャンクションのｍＲＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングデータを示す。これらの配列はｃＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒシーケンシングから得た。列２では、２つのｓｇＲＮＡおよび野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導された予測される平滑末端ＤＳＢ部位が強調されている（さらなる詳細については表の説明文を参照）。列３では、突然変異のサイズおよびＭＨ長さ（単位：ｂｐ）が提供されている。新規ＭＨのプライミング部位と切断部位との間の距離はカッコで示されている。
【0127】
列４は、ＥＲＶ突然変異型がインフレーム突然変異、アウトオブフレーム突然変異、翻訳阻害（ＡＴＧ翻訳開始コドンの突然変異）またはＥＲＶコード領域以外に位置している突然変異を含むことを示す。アウトオブフレーム突然変異および翻訳阻害はＥＲＶ発現およびＶＬＰ形成に影響を与える可能性が高く、インフレーム突然変異およびコード領域以外の突然変異はその可能性が低い。列５には、手動ジャンクション分析に基づく最も起こりそうなＤＳＢ修復機序が示されている。可能な修復機序は、Ｃ－ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、ＳＤ－ＭＭＥＪ（スナップバック）、ＳＤ－ＭＭＥＪ（ループアウト）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、相同的組換え（ＨＲ）および不明を含む。スナップバックＳＤ－ＭＭＥＪ機序の場合、新規プライミング部位は逆方向反復配列であり、ループアウトＳＤ－ＭＭＥＪ機序は直接反復配列を有するプライミング部位を使用する（Ｋｈｏｄａｖｅｒｉｄａｎ ２０１７）。観察されたジャンクション配列が２つ以上の機序に適合可能であり、かつ両方が同等に現れる可能性が高い場合、全ての潜在的な経路が列挙されている。Ｓｃｈｉｍｍｅｌら ２０１７（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ２０１７）に記載されているプログラムを用いて、ジャンクションを切断部位における相同性およびテンプレート化された挿入（ＳＤ－ＭＭＥＪ）について確認した。列６は、ＭＨサイズおよび欠失長さに従って各修復パターンのスコアを示す。Ｂａｅら ２０１４（Ｂａｅ ２０１４）に記載されているＲＧｅｎｏｍｅ「Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ」ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｍｉｃｈ－ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ／）を用いてパターンスコアを計算した。そのスコアが高くなるほど、予測される突然変異が観察される可能性が高くなる。そのパターンスコアは切断部位にＭＨを有する修復ジャンクションのためにのみ有効である（ＭＭＥＪ媒介修復）。列７は、Ａｌｌａｎら ２０１８（Ａｌｌａｎ ２０１８）に記載されているオンラインツールＦＯＲＥＣａｓＴ（Ｆａｖｏｕｒｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｖｅｎｔｓ ａｔ Ｃａｓ９ Ｔａｒｇｅｔｓ；ｈｔｔｐｓ：／／ｐａｒｔｓｌａｂ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＦＯＲＥＣａｓＴ）を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集結果の予測される頻度を示す。その頻度が高くなるほど、より多くのジャンクションが予測される突然変異パターンを含むと期待される。予測される１０種の最も頻繁な突然変異頻度のみが列挙されている。
【0128】
ＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を検出し、かつそれらを各標的において天然に生じる配列変異から区別するために、野生型ＣＨＯ細胞からのリードをクラスター化させ、これらのクラスターコンセンサス配列を使用して多様性プロファイルを作成した。９７％の配列類似性によりクラスター化する場合、ＭｙｒおよびＰＰＹＰフランキング領域内に存在する天然のＥＲＶ配列多様性を表した３４個のＭｙｒおよび２８個のＰＰＹＰクラスターを同定した（図４Ａおよび図４Ｂ、図９）。全体的に高い配列多様性にも関わらず、ＭｙｒおよびＰＰＹＰモチーフそれ自体は、ウイルス出芽についてそれらの生物学的有意性に一致して高度に保存されていた。同定されたクラスターは、ＣＨＯゲノムからの以前に特性評価されたＣ型ＥＲＶグループならびにそれらの予測される頻度に十分に相関しており、これは、全体ゲノムレベルにおいてＥＲＶ配列の特性評価を裏付けている（図１、図４Ａおよび図４Ｂ）。
【0129】
両方の標的のために、最も大きいクラスターは全てのリードの約４０％を包含しており、それは第２の最も大きいクラスターよりも少なくとも４倍以上豊富であった（強調表示、図４Ａおよび図４Ｂ）。興味深いことに、最も大きいクラスターのコンセンサス配列もＣＨＯウイルス粒子から決定されたグループ１Ｃ型ＥＲＶ配列に一致していた。全てのクラスターのうち、１３個のＭｙｒクラスターおよび８個のＰＰＹＰクラスターをＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡによって標的とすることができ、それらはそれぞれ６１％および７２％のキャプチャーされたリード多様性を含んでいた（太字、図４Ａおよび図４Ｂ）。
【0130】
これらの野生型ＣＨＯクラスターおよび多様性プロファイルを用いて、ｍＲＮＡレベルで既に検出されている突然変異を含む、１つのクローン当たり１～７個の異なるＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を見つけた（四角の数、図４Ｃ）。検出された突然変異の範囲は、１１４ｂｐの欠失から最大７８ｂｐの挿入にまで及んでいた。予想した通り、空ベクター発現プラスミドで処理されたＣＨＯ細胞はＣＲＩＳＰＲ標的部位においてさらなる突然変異を欠いていた。いくつかの突然変異、例えば１ｂｐの挿入は、ｓｇＲＮＡ特異的修復結果から期待されるように、全ての３つの遺伝子型が同定されたＭｙｒ２で処理されたクローン内で生じたが、ＰＰＹＰ６クローン内には存在しなかった（４０）。
【0131】
典型的には、所与の突然変異は約０．３％のリード頻度で検出され、従ってこれはＣＨＯゲノム内の単一のＥＲＶ遺伝子座を表しているに違いない（図４Ｃ）。しかし３種類のＭｙｒ２誘導突然変異は０．３％を優に上回るリード頻度で発見され、その際に同じ１ｂｐの挿入が全てのＧ０９クローンリードの２．６％中に存在していた。従ってこれは、同じ突然変異が同じクローンで２回以上生じ得ることを暗示している。この仮説を指示して、予測される単一遺伝子座突然変異のリード（すなわちクローンＡ０２またはＥ１０）は突然変異フランキング領域において非常に類似しており、豊富な突然変異のリード（すなわちＧ０９ １＿１）は突然変異フランキング領域に変異を含んでおり、これは同じ突然変異が異なるＥＲＶ遺伝子座で繰り返し生じた可能性があるということを示唆している（図１０）。Ｇ０９ １＿１の場合、５つのＥＲＶグループは他のグループよりも４倍以上のリードを有する１つのグループにより区別することができ、これはこの突然変異がＧ０９クローン内の８つの異なるＥＲＶ遺伝子座で生じたはずであることを示している。従って、各クローンが一過性のＣＲＩＳＰＲトランスフェクション後に１～１４個のＥＲＶ突然変異を獲得したと結論づけた（図４Ｃ）。ＤＮＡレベルで１つのみの突然変異したＥＲＶを有するクローンの同定は、この突然変異が細胞内ＲＮＡレベルで検出された単一突然変異と同一であるという発見と共に、単一のグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座が転写され、かつＣＨＯ細胞からのＣ型レトロウイルス粒子の放出に関与している可能性が高いことをさらに実証した。
【0132】
１つのクローン内での同一の突然変異の繰り返しの発生により、それらが遺伝子変換、すなわち相同的組換え（ＨＲ）に関連する修復機序（ここでは、以前の突然変異したＥＲＶ遺伝子座がテンプレートとして使用されて他の切断されたＥＲＶ部位を修復する）に起因し得るか否かという問題が提起された。Ｍｙｒ２－およびＰＰＹＰ６媒介性切断後のＨＲ活性の証拠を見つけるために、以前に得られたｍＲＮＡおよびＤＮＡデータを１つにまとめ、全部で７４個のＤＮＡ修復ジャンクション（ｎＭｙｒ＝４７、ｎＰＰＹＰ＝２７）を分析した。Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡ媒介性切断により、挿入が優先される全体的により高い突然変異頻度が生じ、ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡは主として欠失を生じさせた。特にＧａｇ機能喪失突然変異は、ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ誘導修復されたジャンクションの７０％において観察されたが、全てのＭｙｒ２ ｓｇＲＮＡ誘導突然変異の３０％のみであった（図１１Ｂ）。Ｍｙｒ２およびＰＰＹＰ６誘導修復ジャンクションの大多数は、古典的な非相同末端結合（Ｃ－ＮＨＥＪ）および他の末端結合（ａｌｔ－ＥＪ）修復活性に適合していた（図４Ｄ）。Ｃ－ＮＨＥＪは典型的には小さい挿入および欠失をもたらし、ａｌｔ－ＥＪはＤＳＢ部位においてマイクロホモロジーを利用して切断された末端をアニールし、これにより多くの場合により大きく、かつより複雑な突然変異を生じさせる。ａｌｔ－ＥＪ修復は大部分の哺乳類細胞においてバックアップ経路であるとみなされているが、ｇａｇ遺伝子を標的とした場合に２５％～５５％のａｌｔ－ＥＪに適合するジャンクションが検出され、これはＣＨＯ細胞における本質的に高いａｌｔ－ＥＪ活性という結論を支持している（４１、４２）。ａｌｔ－ＥＪ修復ジャンクションのうちのいくつかは、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）または合成依存的マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）ａｌｔ－ＥＪサブ経路に一意的に起因し得、その他はＭＭＥＪおよびＳＤ－ＭＭＥＪ修復の両方に一貫していた（４３、４４）（図１１Ｄ）。興味深いことに、全ての分析された修復ジャンクションの約１０％は、他のＥＲＶ遺伝子座から、あるいは遠い配列を使用したこと以外は同じＥＲＶ遺伝子座からテンプレート化された挿入を含んでおり、それ以外はａｌｔ－ＥＪ機序によって媒介されたマイクロホモロジーを欠いている明らかな重複を示した。これらの後者のジャンクションの全てがＣＲＩＳＰＲ切断後のＭｙｒ２およびＰＰＹＰ６標的部位における相同組換え修復活性に一貫している（図４Ｄ）。従って、ＨＲ媒介性遺伝子変換は、実際に特定の突然変異の複数の発生を引き起こしていたに違いない。
【0133】
次に、突然変異が特定のＥＲＶ遺伝子座の優先的な切断を示すいくつかのＣ型ＥＲＶクラスターにおいてより頻繁に生じたか否かを評価した。予想した通り、突然変異はグループ１のクラスターに一意的に関連づけられたがグループ２のクラスターには一意的に関連づけられず、これによりグループ１のみに対するｓｇＲＮＡ特異性が確認された（図４Ｅおよび図４Ｆ）。突然変異の大多数は最も豊富なＭｙｒもしくはＰＰＹＰクラスター内に位置し、これは活発に転写され、かつ故に発現されたＥＲＶを表す。さらなるクラスターにおいて他の突然変異が認められたがより低い頻度であり、それらは全てＰＡＭ配列に隣接するＭｙｒ２もしくはＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ認識部位を含んでいた（図４Ｅおよび図４Ｆ、太字のフォント）。驚くべきことに、ｓｇＲＮＡ標的部位に対する１つの塩基対ミスマッチを含むＭｙｒおよびＰＰＹＰクラスターにおけるＣＲＩＳＰＲ切断も観察され、これはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が標的認識中に小さいミスマッチを許容することを示す以前の報告を支持していた（４５）（図４Ｅおよび図４Ｆ、通常のフォント）。全体的に見て、高頻度の突然変異に関連づけられたクラスターは発現されたＥＲＶ遺伝子座を包含している可能性が最も高いと結論づけた。
【0134】
ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるユニークなウイルス粒子（ＶＰ）を産生するＥＲＶ遺伝子座の同定
ＳａｎｇｅｒクロマトグラムならびにＲＮＡおよび標的ＤＮＡアンプリコンシーケンシング中に観察されたｇａｇ突然変異のリード頻度はそれぞれ、単一のグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座が転写され、かつ従ってＣＨＯ細胞によるウイルス粒子産生を媒介し得るという仮定を裏付けた。この仮定をさらに実証するために、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）手法を用いてＥ１０クローンのゲノムを完全にシークエンシングして、ＥＲＶを含む遺伝子座の明白な決定のために十分に長いリードを得た。このクローンは単一突然変異したＥＲＶのみを含むように見えたのでこれを選択して、ＲＮＡレベルでのそのユニークな突然変異を潜在的にユニークなゲノム遺伝子座と相関させた（図４Ｃ）。Ｅ１０クローンゲノム配列の分析により、ｍＲＮＡレベルで検出された突然変異を有する単一のＥＲＶ遺伝子座を同定した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。次いで、ＰＣＲ増幅と、親のＣＨＯ細胞株中のＥＲＶ配列以外に位置する遺伝子座特異的プライマーおよびディープシーケンシングしたクローンを用いるＤＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングとにより、予測されるＥＲＶ組込み部位を検証した。ｍＲＮＡレベルでＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を含む全てのディープシーケンシングしたクローンはこのＥＲＶ遺伝子座に同一の突然変異も有し、これは、このゲノム領域が発現されたＣ型ＥＲＶ要素を有することをさらに支持している（図１２Ｃ）。興味深いことにこの特定のＥＲＶ組込みは、他の対立遺伝子が対応するＥＲＶ組込みを欠いているためヘミ接合性であり、かつ２つの適度に発現されたＣＨＯ細胞遺伝子間のオープンクロマチンの中に生じたことが分かった。
ＳａｎｇｅｒクロマトグラムならびにＲＮＡおよび標的ＤＮＡアンプリコンシーケンシング中に観察されたｇａｇ突然変異のリード頻度はそれぞれ、単一のグループ１Ｃ型ＥＲＶ遺伝子座が転写され、かつ従ってＣＨＯ細胞によるウイルス粒子産生を媒介し得るという仮定を裏付けた。この仮定をさらに実証するために、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）手法を用いてＥ１０クローンのゲノムを完全にシークエンシングして、ＥＲＶを含む遺伝子座の明白な決定のために十分に長いリードを得た。このクローンは単一突然変異したＥＲＶのみを含むように見えたのでこれを選択して、ＲＮＡレベルでのそのユニークな突然変異を潜在的にユニークなゲノム遺伝子座と相関させた（図４Ｃ）。Ｅ１０クローンゲノム配列の分析により、ｍＲＮＡレベルで検出された突然変異を有する単一のＥＲＶ遺伝子座を同定した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。次いで、ＰＣＲ増幅と、親のＣＨＯ細胞株中のＥＲＶ配列以外に位置する遺伝子座特異的プライマーおよびディープシーケンシングしたクローンを用いるＤＮＡ Ｓａｎｇｅｒシーケンシングとにより、予測されるＥＲＶ組込み部位を検証した。ｍＲＮＡレベルでＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を含む全てのディープシーケンシングしたクローンはこのＥＲＶ遺伝子座に同一の突然変異も有し、これは、このゲノム領域が発現されたＣ型ＥＲＶ要素を有することをさらに支持している（図１２Ｃ）。興味深いことにこの特定のＥＲＶ組込みは、他の対立遺伝子が対応するＥＲＶ組込みを欠いているためヘミ接合性であり、かつ２つの適度に発現されたＣＨＯ細胞遺伝子間のオープンクロマチンの中に生じたことが分かった。
【0135】
次に、この発現されたＥＲＶ遺伝子座におけるＧａｇ機能喪失突然変異がウイルス粒子出芽の予測される阻害を生じさせ得るか否かを評価した。以前に特性評価された突然変異したクローンの他に、本発明者らはそれらの対応するバルク選別された多クローン集団ならびにさらなる対照としての発現されたグループ１ＥＲＶ配列において検出可能な突然変異を欠いているクローン（Ｍｙｒ２のためにＢ０１、ＰＰＹＰ６のためにＢ０３）を並行して分析した。最初に、ウイルス粒子をＣＨＯ細胞培養物の上澄みから抽出し、Ｃ型ウイルスゲノムの量をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量化した。予備データは、Ｇａｇ機能喪失突然変異体によって排出されるウイルス粒子が対照試料よりも８０％少ないグループ１Ｃ型ゲノムウイルスＲＮＡを含み、グループ２ゲノムウイルスＲＮＡの量は検出限界に近いままであることを示唆した（データは示さず）。この発見を実証するために、Ｄ１２（Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡ）およびＥ１０（ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡ）クローンによって排出されたウイルス粒子から抽出されたＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングした。注目すべきことに、野生型ＣＨＯ細胞と比較した場合に、Ｄ１２およびＥ１０の両方においてグループ１ＥＲＶ配列に対するリードマッピングにおける２５０倍超の減少が観察され、グループ２に対する微量のリードマッピングは検出レベルに近いままであった（図１３と比較）。これは、単一の発現されたグループ１ＥＲＶ配列において翻訳の開始を阻止する突然変異（Ｄ１２）またはＰＰＹＰモチーフの下流でｇａｇ遺伝子にフレームシフトを導入する突然変異（Ｅ１０）が完全なウイルス粒子の出芽を大幅に減少させるのに十分であることを示していた。
【0136】
減少したウイルス出芽を示す編集されたＣＨＯ細胞株の特性評価
ＣＲＩＳＰＲ突然変異誘発がウイルス粒子放出を効率的に不活性化させたことを観察したので、次に、ＥＲＶ不活性化が細胞増殖、細胞サイズおよび治療用タンパク質産生などの他のＣＨＯ細胞特性に影響を与えるか否かを試験した。ＥＲＶ編集されたクローンは、５日間の培養後に約１２．５×１０６個の細胞／ｍｌに達する密度で、多クローン集団、野生型および空ベクターで処理された細胞対照と同様の速度で増殖することが分かった（図６Ａ）。そのような細胞密度は、約２０時間の期待されるＣＨＯ－Ｋ１倍加時間に一致している（４６）。２つのＭｙｒ２ ｓｇＲＮＡクローン（Ｃ０２、Ｄ１２）および１つのＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡクローン（Ｋ１４）は僅かに修正された細胞周期持続期間を示したが、その効果は統計的に有意ではなかった。さらに細胞のサイズはＥＲＶ編集された細胞、特にＣ０２クローンにおいて高くなる傾向があったが、それらは空ベクター対照細胞と比較した場合に有意に異なっていなかった（図６Ｂ）。
ＣＲＩＳＰＲ突然変異誘発がウイルス粒子放出を効率的に不活性化させたことを観察したので、次に、ＥＲＶ不活性化が細胞増殖、細胞サイズおよび治療用タンパク質産生などの他のＣＨＯ細胞特性に影響を与えるか否かを試験した。ＥＲＶ編集されたクローンは、５日間の培養後に約１２．５×１０６個の細胞／ｍｌに達する密度で、多クローン集団、野生型および空ベクターで処理された細胞対照と同様の速度で増殖することが分かった（図６Ａ）。そのような細胞密度は、約２０時間の期待されるＣＨＯ－Ｋ１倍加時間に一致している（４６）。２つのＭｙｒ２ ｓｇＲＮＡクローン（Ｃ０２、Ｄ１２）および１つのＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡクローン（Ｋ１４）は僅かに修正された細胞周期持続期間を示したが、その効果は統計的に有意ではなかった。さらに細胞のサイズはＥＲＶ編集された細胞、特にＣ０２クローンにおいて高くなる傾向があったが、それらは空ベクター対照細胞と比較した場合に有意に異なっていなかった（図６Ｂ）。
【0137】
最後に、ＥＲＶ編集されたＣＨＯ細胞の治療用タンパク質を産生する能力、すなわちバイオテクノロジー用途のためのＣＨＯ細胞の重要な特性を評価した。以前に特性評価されたＥＲＶ突然変異した細胞を使用して、ヒト化治療的ＩｇＧ免疫グロブリンを安定に発現する多クローン集団を生成し、かつ１０日間の流加培養中にＩｇＧ分泌を定量化した。ＩｇＧタンパク質を発現するＥＲＶ編集されたクローンおよび多クローン集団は、治療用タンパク質の発現を生じずに観察された野生型および空ベクター対照細胞と同様の細胞増殖および細胞生存度特性を示した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。細胞培養物上澄みにおけるＩｇＧ力価は、分泌型ＩｇＧタンパク質の蓄積から期待される通り、流加培養実験の過程で増加し、対照細胞および大部分のＥＲＶ編集された細胞クローンのための流加培養の終了時に約３００～４００ｍｇ／ｌに達した（図６Ｅ）。従って、ＥＲＶ突然変異誘発はＩｇＧタンパク質を産生するＣＨＯ細胞の能力に全体的に影響を与えなかったが、クローンＣ０２（Ｍｙｒ２ ｓｇＲＮＡ）は、おそらくその増殖の減少および細胞サイズの増加を反映して有意により少ない免疫グロブリンを分泌し、クローンＥ１０およびＫ０３（ＰＰＹＰ６ ｓｇＲＮＡの両方）は空ベクター対照に対して５０％超のＩｇＧを産生した。全体的に見て、これは、多遺伝子座ＥＲＶ編集に曝露されたＣＨＯクローンは一般に正常なＣＨＯ特性を維持しているが、いくつかのクローン、特にＰＰＹＰ領域に突然変異を有するクローンは、治療用タンパク質を産生するためのより高い代謝能力を獲得していたように見えることを示した。しかし、この見た目に増強された代謝能力は、特異的なＥＲＶ突然変異型あるいは突然変異の総数または細胞増殖もしくはサイズのいずれにも相関させることはできず、これはクローン特異的効果を示唆している。
【0138】
当業者であれば理解するように、上記説明は本発明を限定するものではなく、本発明の特定の実施形態の例を提供するものである。上に提供されている手引きを用いて、当業者であれば、本明細書に具体的に記載されていない多種多様な他の実施形態を考案することができる。
【0139】
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】