特表2022-516535 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ノームインコーポレイテッドの特許一覧

特表2022-516535免疫チェックポイント抑制剤を含む抗がん用組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-28

(54)【発明の名称】免疫チェックポイント抑制剤を含む抗がん用組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 39/395 20060101AFI20220218BHJP

A61K 31/155 20060101ALI20220218BHJP

A61K 31/7004 20060101ALI20220218BHJP

A61K 31/6615 20060101ALI20220218BHJP

A61K 31/047 20060101ALI20220218BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20220218BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20220218BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61K31/155

A61K31/7004

A61K31/6615

A61K31/047

A61P35/00

A61P43/00 121

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021538354

(86)(22)【出願日】2019-12-30

(85)【翻訳文提出日】2021-06-29

(86)【国際出願番号】 KR2019018697

(87)【国際公開番号】W WO2020141828

(87)【国際公開日】2020-07-09

(31)【優先権主張番号】10-2018-0173504

(32)【優先日】2018-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521203865

【氏名又は名称】ノームインコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＡＨＭＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】ＴｅｃｈｎｏＣｕｂｅ５０７，１３－１８，Ｓｏｎｇｄｏｇｗａｈａｋ－ｒｏ１６ｂｅｏｎ－ｇｉｌＹｅｏｎｓｕ－ｇｕＩｎｃｈｅｏｎ２１９８４，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001807

【氏名又は名称】特許業務法人磯野国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】徐萬哲

(72)【発明者】

【氏名】鄭イウン

(72)【発明者】

【氏名】金恩志

(72)【発明者】

【氏名】鄭在仁

【テーマコード（参考）】

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA34

4C086EA01

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA06

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA13

4C206HA31

4C206KA01

4C206MA03

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA06

4C206ZB26

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を有効成分として、またはこれに（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を有効成分としてさらに含むがんの予防または治療用薬学組成物に関する。
本発明に係る組成物は、制限された適応症を有する免疫チェックポイント抑制剤に対して多様な癌腫に適応症を増やすだけではなく、特定薬物を適宜組み合わせて相乗的抗がん効果を奏して治療効果を極大化しながら副作用なしにがん細胞だけを死滅させることができるので、がんの予防または治療のための抗がん剤として有用に使用され得る。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を含むがんの予防または治療用、薬学組成物。

【請求項2】

（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含む請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項3】

前記組成物は、（１）免疫チェックポイント抑制剤、（２）ビグアニド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩、（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及び（４）イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む請求項２に記載の薬学組成物。

【請求項4】

前記組成物は、（１）免疫チェックポイント抑制剤、（２）ビグアニド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩、（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及び（４）イノシトールを含む請求項２に記載の薬学組成物。

【請求項5】

前記組成物は、（１）免疫チェックポイント抑制剤、（２）ビグアニド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩、（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びイノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を含む請求項２に記載の薬学組成物。

【請求項6】

（１）免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＯＸ４０抗体、抗－ＴＩＭ３抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上である請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項7】

（１）免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上である請求項６に記載の薬学組成物。

【請求項8】

前記免疫チェックポイント抑制剤の１回投与量は、０．０１－２５ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。

【請求項9】

（２）ビグアニド系化合物は、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）またはフェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）である請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。

【請求項10】

（４）イノシトール化合物は、Ｄ－カイロイノシトール（Ｄ－ｃｈｉｒｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、Ｌ－カイロイノシトール（Ｌ－ｃｈｉｒｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、ミオイノシトール（ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）及びシロイノシトール（ｓｃｙｌｌｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上である請求項２に記載の薬学組成物。

【請求項11】

がんは、肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、骨肉腫、膀胱癌、頭頸部癌、腎癌、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるものである請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項12】

（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を含むがんの予防または治療用薬学組成物。

【請求項13】

（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を、これを要する対象体に治療学的有効量で投与することを含む、がんの治療方法。

【請求項14】

（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物の投与をさらに含む請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

（１）免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＯＸ４０抗体、抗－ＴＩＭ３抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を含むがんの治療に使用するための組成物。

【請求項17】

前記組成物は、（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含むものである請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

がんの治療用医薬を製造するための（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を含む組成物、の使用。

【請求項19】

前記組成物は、（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含む、請求項１８に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫チェックポイント抑制剤と共にさらなる抗がん効果を奏することのできる有効成分を含む抗がん用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、現代医学が征服できていない代表的な難治性疾患の一つであり、伝統的な治療方法である手術、放射線、抗がん剤投与等の場合、短期的に治療効果を奏することができるが、細胞毒性、転移、再発等、多くの副作用が現れる問題を解決するために、新たな治療剤の開発が急務となっている。伝統的な腫瘍治療方法は、外科的手術、化学薬物治療剤を経て標的治療剤の開発につながり、近年、免疫環境を調節する免疫チェックポイント抗体（ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔａｎｔｉｂｏｄｙ）の登場で免疫治療の重要性が大きく浮上している（Ｃｏｕｚｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３；３４２：１４３２－１４３３）。

【0003】

抗がん免疫反応の抑制は、治療に対する腫瘍抵抗の重要なメカニズムと現れ、免疫チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ－４）とＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ－１）またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ１）を遮断する単一クローン抗体等の開発を通して患者の内因性抗がん免疫反応を刺激および／または拡大することが可能となった。

【0004】

このような経路は、免疫調節で明確な役割を果たすことができ、例えば、ＣＴＬＡ－４は、一次的にリンパ節でＴ細胞増殖を調節するのに対し、ＰＤ－１は、主に腫瘍微細環境でＴ細胞を抑制する。このような免疫チェックポイント抑制剤は、近年、多様な種類の腫瘍類型、特に黒色腫及び非小細胞肺癌に対して卓越した効能を立証し、迅速に患者の標準治療療法となった。

【0005】

現在までＦＤＡで市販許可を受けた免疫チェックポイント抑制剤は、米国製薬会社ブリストルマイヤーズスクイブ（ＢＭＳ）のヤーボイ（ＣＴＬＡ４抑制剤・成分名：イピリムマブ）とオプジーボ（ＰＤ－１抑制剤・成分名：ニボルマブ）、米国製薬会社メルク（ＭＳＤ）のキイトルーダ（ＰＤ－１抑制剤・成分名：ペムブロリズマブ）、スイス製薬会社ロシュのテセントリク（ＰＤ－Ｌ１抑制剤・成分名：アテゾリズマブ）、米国製薬会社ファイザーとドイツのメルクが共同開発したバベンチオ（ＰＤ－Ｌ１抑制剤・成分名：アベルマブ）、イギリス製薬会社アストラゼネカのイミフィンジ（ＰＤ－Ｌ１抑制剤・成分名：デュルバルマブ）等、計６個である。

【0006】

しかし、免疫チェックポイント抑制剤は、一般に、胃腸管、内分泌腺、皮膚及び肝に害を及ぼす免疫関連の副作用がある。このような副作用は、ほとんど活性化されたＴリンパ球による結果で免疫系の異常反応と関連したものと知られた。

【0007】

また、免疫チェックポイント抑制剤は、少数の患者にのみ効果的である。ほとんどの進行したがんで抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単一療法の反応率は約２０％であり、抗ＣＴＬＡ－４の反応率は約１２％であって、これは改善の必要性があることが分かる（Ｂｏｒｇｈａｅｉｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２０１５；３７３：１６２７－１６３９）。この低い効能は、既存の腫瘍関連Ｔ細胞免疫の欠如が原因である可能性がある（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｅｔａｌ．，ＡｍＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２０１６Ｆｅｂ；３９（１）：９８－１０６）。

【0008】

このような免疫チェックポイント抑制剤の治療効果を極大化するために、他の抗がん剤との併用臨床を研究している。一例として、進行性黒色腫の治療に二つの免疫抗がん剤（ニボルマブとイピリムマブの併用治療）がそれぞれの単独療法より生存率改善効果がさらに大きいものと示された。しかし、１０名のうち４名は治療を中断するほど治療と関連した副作用も高かった。このように、がんが誘発された時は、二つ以上の治療法を併用することが、今日、がん治療の礎石になったが、免疫チェックポイント抑制剤の場合は、高い反応率と共に治療中断率も相対的に高い結果を示している。

【0009】

従って、抗がん剤による副作用を最小化しながら治療効果を上昇させるための研究が急務となっている。

【0010】

また、抗がん治療が失敗する主要原因は、抗がん剤が初期には効果を奏するが、次第に薬剤耐性が発現され、免疫力が極度に悪化するためである。従って、薬剤の毒性を増加させずにがん治療効能を改善させる方法が必要である。抗がん剤の効能を向上させる一つの方式で抗がん剤を組み合わせて使用できるが、不幸なことに、抗がん効果のある薬物を組み合わせるとして全て相乗効果を奏するとは期待できず、相乗効果を有する薬物の組み合わせを見つけることは非常に難しい事である。従って、抗がん剤の副作用を最小化しながら、抗がん効果が最大限に発揮され得る抗がん複合製剤の開発が至急な実情である。

【0011】

近年、がん細胞の新陳代謝と成長に重要な細胞信号伝達経路を標的とする抗がん治療法を開発することが現在多くの関心の対象となっているが、がん細胞の代謝に関与する代表的な薬物には、ビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系列の化合物であるメトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）と２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）がある（Ｗｏｋｏｕｎｅｔａｌ．，ＯｎｃｏｌＲｅｐ．２０１７；３７：２４１８－２４２４）。

【0012】

抗高血糖剤としてメトホルミンは、数十年にわたって２型糖尿病の最初の治療剤として使用されている。抗糖尿病治療剤としてのメトホルミンの広範な使用にもかかわらず、２００１年に哺乳類で潜在的な抗がん効果が初めて報告された。また、メトホルミンで治療した２型糖尿病患者のがん危険の減少に関する最初の報告書は、わずか１０年前に発表された。それ以来、多くの論文で、メトホルミンは、卵巣癌をはじめとする様々ながん細胞株及び異種移植動物または形質転換マウスで一貫した抗増殖作用を示した。代謝と関連して、メトホルミンは、複合Ｉ及びＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ抑制剤の新たな部類と明らかになり、ミトコンドリアに直接作用して呼吸を制限してエネルギーを非効率的にし、クエン酸循環を通してブドウ糖代謝を減少させる（Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，２０１４；２：１２－２５）。

【0013】

２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、該当過程に対する腫瘍細胞の依存性のため、潜在的な抗がん剤と見なされてきた。２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、グルコース類似体であって、グルコース伝達体により容易に吸収され得、該当作用の競争的抑制剤として作用してＡＴＰ産生を減少させ、固形腫瘍でカスパーゼ－３の活性化を通して細胞死を誘導する（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．２０１４；３５５：１７６－１８３）。

【0014】

一般に使用されるメトホルミンと２－デオキシ－Ｄ－グルコースの容量では、がんを十分に治療するには不足し、高容量の治療時、異常反応が現れ得るという限界点を有している（Ｒａｅｚｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３；７１：５２３－５３０）。チョン（Ｃｈｅｏｎｇ）等が研究したメトホルミンと２－デオキシ－Ｄ－グルコースの併用治療が乳癌細胞株に効果があることを示したが、これは、ヒトの人体内で耐えることができる濃度または血漿内投与可能な濃度より高かった（Ｃｈｅｏｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．２０１１；１０：２３５０－２３６２）。他の論文では、メトホルミンと２－デオキシ－Ｄ－グルコースの組み合わせがヒトの血漿で使用可能な濃度より高いメトホルミン濃度を使用して前立腺癌細胞で成功的にテストされた（ＢｅｎＳａｈｒａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１０；７０：２４６５－２４７５）。これは、臨床的に有効な抗がん剤であるメトホルミンと２－デオキシ－Ｄ－グルコースが生体内で合理的に達成できる範囲内でその治療濃度を下げることが好ましいことを示唆する。

【0015】

一方、イノシトールヘキサホスフェートとイノシトールは、ほとんどの穀物、種子、豆と植物に多量含有されており、哺乳動物細胞にも存在する天然有機リン化合物であり、リン酸塩の少ないリン酸塩形態（ＩＰ１－５）と共に存在する。イノシトールヘキサホスフェートは、多様な細胞の信号伝達、細胞増殖及び分化のような重要な細胞機能の調節に重要な役割を果たし、天然抗酸化物質として認められている（Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎｅｔａｌ．，ＪＮｕｔｒ．２００３；１３３：３７７８Ｓ－３７８４Ｓ）。

【0016】

近年、イノシトールヘキサホスフェートは、がん予防と実験腫瘍の成長、進行及び転移に対する抑制効果が一部報告されたことがある（Ｖｕｃｅｎｉｋｅｔａｌ．，ＮｕｔｒＣａｎｃｅｒ．２００６；５５：１０９－１２５）。

【0017】

予備臨床研究では、イノシトールヘキサホスフェートとイノシトールを化学療法と併用投与すると、化学療法の副作用を減らし、肝転移のある乳癌や大腸癌患者の生活の質が向上するという報告があるが、依然としてイノシトールヘキサホスフェートまたはイノシトールヘキサホスフェート及びイノシトールで複合製剤となったことだけでは効果的にがん細胞の成長を抑制することが難しい実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

そこで、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を有効成分として含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0019】

本発明は、また、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を有効成分として含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0020】

前記薬学組成物は、各化合物の低濃度の組み合わせでも効果的にがん細胞を死滅させることができ、人体の安全性確保とともに、今後、がん治療分野で大きく活用されると期待され、特にがん細胞特異的に毒性効果を奏し、副作用が減少したがんの予防または治療用薬学組成物として役割が可能である。

【課題を解決するための手段】

【0021】

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を有効成分として含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0022】

前記目的を達成するための他の様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0023】

また、前記がんの予防または治療用薬学組成物は、さらなる有効成分として、（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含むことができる。

【0024】

【0025】

本発明は、また、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0026】

本発明に係る前記薬学組成物は、個別的少量の有効成分を含み、副作用が少なく、かつがんを効果的に治療できる優れた効果を有する。本発明の薬学組成物は、単一化合物で治療する場合より複合製剤に含まれる個別化合物の量をさらに少なく使用することができ、これによって副作用の危険および／または深刻性は相当な水準下げながら治療の全体的な効果は有意味に高めることができる長所がある。

【0027】

特に本発明によれば、免疫チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ－４とＰＤ－１またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１を遮断する免疫チェックポイント抑制剤は、本発明に係る薬学組成物に含まれて使用されたとき、低い濃度でも優れた抗がん効果を奏する長所を有する。

【0028】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0029】

本発明の薬学組成物は、（１）免疫チェックポイント抑制剤を有効成分として含む。

【0030】

免疫チェックポイント抑制剤は、免疫抑制力の高いがんで免疫反応の進行を防ぐ免疫チェックポイントを遮断してがんの免疫回避を抑制することでがんを治療することができる。免疫チェックポイント抑制剤（ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、免疫学分野の発展で人体免疫系に対する多くの理解がなされた結果によって開発された新たな腫瘍治療剤であって抗がん戦略に多く使用されている。免疫チェックポイント抑制剤を使用して抗がん効果を奏するための例示的なメカニズムとして、ＣＴＬＡ－４によるＴリンパ球抑制メカニズムと既に活性化されたＴリンパ球を抑制するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１メカニズムがある。しかし、免疫チェックポイント抑制剤だけを利用した治療は、治療効率が低く、効果が不十分である等の限界が報告されている。

【0031】

しかし、本発明の薬学組成物は、他の治療メカニズムの有効成分を免疫チェックポイント抑制剤と併用投与して相乗補完効果によりがんの予防及び治療に役立つ。

【0032】

免疫チェックポイント抑制剤は、抗体、融合タンパク質、アプタマーまたはその免疫チェックポイントタンパク質－結合断片であってよい。例えば、免疫チェックポイント抑制剤は、抗－免疫チェックポイントタンパク質抗体またはその抗原－結合断片である。

【0033】

特定例において、免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片；抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片；抗－ＬＡＧ－３抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片；抗－ＯＸ４０抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片；抗－ＴＩＭ３抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片；及び抗－ＰＤ－１抗体、その誘導体またはその抗原－結合断片からなる群から選択されるいずれか一つ以上である。

【0034】

例えば、免疫チェックポイント抑制剤は、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；ピディリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＢＭＳ－９３６５５９、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＢＭＳ－９８６０１６、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＧＳＫ３１７４９９８、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＴＳＲ－０２２、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＭＢＧ４５３、その誘導体またはその抗原－結合断片；ＬＹ３３２１３６７、その誘導体またはその抗原－結合断片；及びＩＭＰ３２１組換え融合タンパク質からなる群から選択されるいずれか一つ以上であってよく、免疫チェックポイント抑制剤として使用され得る抗体または他の形態の免疫チェックポイント抑制剤であれば制限なく使用され得る。

【0035】

具体的に、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＯＸ４０抗体、抗－ＴＩＭ３抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上が好ましい。前記抗体は、例えば、通常の抗体製造企業等から購入して使用するか知られた抗体の製造方法によって製造して使用してもよい。

【0036】

前記免疫チェックポイント抑制剤は、前記言及された免疫チェックポイント抑制剤として作用効果があるか、その抑制メカニズムに関与する低分子化合物であってよい。このような低分子化合物は、例えば、免疫チェックポイントタンパク質に結合するか免疫チェックポイント抑制に関連したメカニズムに関与する低分子化合物であってよい。

【0037】

具体的に、低分子化合物は、ＢＭＳ－２０２（出処：ＢＭＳ）、ＢＭＳ－８（出処：ＢＭＳ）、ＣＡ１７０（出処：Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ＣＡ３２７（出処：Ｃｕｒｉｓ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ、ＧＤＣ－０９１９、ＢＭＳ－９８６２０５等であってよい。免疫チェックポイント抑制剤として使用されるか関連効果のある低分子化合物であれば制限なく使用され得る。

【0038】

本発明の薬学組成物は、（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む。

【0039】

本発明において、ビグアニド系化合物は、例えば、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）またはフェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）である。具体的に、メトホルミンは、下記化学式１の構造式を有する。

【0040】

[化学式１]

【化1】

【0041】

具体的に、フェンホルミンは、下記化学式２の構造式を有する。

【0042】

[化学式２]

【化2】

【0043】

本発明においては、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を複合製剤として使用したとき、少ない濃度でも高い抗がん効果を奏する。また、（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含む場合、よりさらに優れた抗がん効果を奏する。

【0044】

ビグアニド系列の薬物は、これに限定されるものではないが、細胞内エネルギーバランス及び栄養分代謝調節に中枢的な役割を果たしているＡＭＰＫ（ＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅ）という酵素を活性化させる作用メカニズムを通して抗がん効果を奏することができる。

【0045】

ラット（ｒａｔ）にメトホルミンを経口投与時、ＬＤ５０が１，４５０ｍｇ／ｋｇであって、メトホルミンは非常に安全性が確保された化合物であるということが分かるが、依然として高容量で使用されなければならない問題がある。一方、フェンホルミンは、経口用糖尿病治療剤であって、１９５０年後半に開発されてインスリン非依存型糖尿病（２型糖尿病）の治療に使用されようとしたが、乳酸アシドーシス（Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓ）という深刻な副作用により、１９７０年代後半、使用が全面禁止された。

【0046】

本発明においては、先に言及された複合製剤がそれぞれの単一製剤または２種化合物の組み合わせである組成物より遥かに低い濃度でも高い抗がん効果を奏しながらもメトホルミンまたはフェンホルミンが有している高容量投与の問題または副作用の問題点を改善できることを確認した。

【0047】

本発明の薬学組成物は、（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を有効成分として含む。

【0048】

本発明において、２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、化学式３で表示される構造を有する。

【0049】

[化学式３]

【化3】

【0050】

前記化学式３の化合物は、該当作用の抑制剤として作用効果を有する。

【0051】

２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、ブドウ糖の誘導体であって、ブドウ糖代謝過程において解糖作用（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を抑制し、小胞体内タンパク質の糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を阻害して小胞体ストレスを誘導する作用効果を有する。このように、ブドウ糖分解抑制剤である２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、単独ではがん細胞を殺すことはできないものと示されたが、本発明の複合製剤をなして優れた抗がん効果を奏する。

【0052】

本発明の薬学組成物は、さらなる有効成分として、（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物をさらに含んでもよい。

【0053】

本発明において、イノシトールヘキサホスフェートおよび／またはイノシトールは、がん細胞で様々な重要な経路を調節できる。本発明において、イノシトールヘキサホスフェートは、具体的に化学式４の構造を有する。

【0054】

[化学式４]

【化4】

【0055】

本発明において、イノシトールは、具体的に化学式５の構造を有する。

【0056】

[化学式５]

【化5】

【0057】

本発明においては、イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物またはその薬学的に許容可能な塩、及び２－デオキシ－Ｄ－グルコースに組み合わせることで低い濃度でも高い抗がん効果が奏されることを確認した。

【0058】

本発明において、ビグアニド系化合物及びイノシトールヘキサホスフェートは、薬学的に許容可能な塩の形態で存在し得る。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸により形成された酸付加塩が有用である。本明細書に使用されたように、「薬学的に許容可能な塩」とは、患者に比較的非毒性であり、無害な有効作用を有する濃度で、この塩に起因した副作用がビグアニド系化合物及びイノシトールヘキサホスフェートの有益な効能を低下させない任意の全ての有機または無機付加塩を意味する。

【0059】

このとき、付加塩として、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸等を使用することができ、有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸等を使用することができ、これらに制限されない。

【0060】

また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させ、非溶解化合物塩をろ過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得る。このとき、金属塩としては、特にナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩またはこれらの混合塩を製造することが製薬上適するが、これらに制限されるものではない。

【0061】

ビグアニド系化合物（メトホルミンまたはフェンホルミン）とイノシトールヘキサホスフェートそれぞれの薬学的に許容可能な塩は、特に断りのない限り、ビグアニド系化合物（メトホルミンまたはフェンホルミン）とイノシトールヘキサホスフェートそれぞれに存在し得る酸性または塩基性基の塩を含む。例えば、薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム塩等が含まれ得、アミノ基のその他の薬学的に許容可能な塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシレート）及びｐ－トルエンスルホン酸（トシレート）塩等があり、当業界に知られた塩の製造方法を通して製造され得る。

【0062】

本発明のビグアニド系化合物（メトホルミンまたはフェンホルミン）の塩としては、薬学的に許容可能な塩として、メトホルミンまたはフェンホルミンと同等な抗がん効果を奏するメトホルミンまたはフェンホルミン塩であればいずれも使用可能であり、好ましくは、塩酸メトホルミン、コハク酸メトホルミン、クエン酸メトホルミン、または塩酸フェンホルミン、コハク酸フェンホルミン、クエン酸フェンホルミン等が可能であるが、これに限定されるものではない。

【0063】

本発明のイノシトールヘキサホスフェート塩としては、薬学的に許容可能な塩として、イノシトールヘキサホスフェートと同等な抗がん効果を奏するイノシトールヘキサホスフェート塩であればいずれも使用可能であり、好ましくは、イノシトールヘキサホスフェートナトリウム、イノシトールヘキサホスフェートカリウム、イノシトールヘキサホスフェートカルシウム、イノシトールヘキサホスフェートアンモニウム、イノシトールヘキサホスフェートマグネシウム、イノシトールヘキサホスフェートカルシウムマグネシウム等が可能であるが、これに限定されるものではない。

【0064】

本発明のビグアニド系化合物、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールヘキサホスフェートはそれぞれこれらの誘導体も含む。前記「誘導体」とは、前記化合物の抗がん活性が変わらない限度内で前記化合物の一部を化学的に変化、例えば、官能基の導入、置換、欠失させて製造した化合物を意味するものであり、本発明に制限なく含まれ得る。

【0065】

本発明において、イノシトールは、多様な異性体での形態で存在し得る。異性体は、鏡像異性体と部分立体異性体をいずれも含む。薬学的に抗がん効果を奏するイノシトールであればいずれも使用可能であり、好ましくは、Ｄ－カイロイノシトール（Ｄ－ｃｈｉｒｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、Ｌ－カイロイノシトール（Ｌ－ｃｈｉｒｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、ミオイノシトール（ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）及びシロイノシトール（ｓｃｙｌｌｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上が可能であるが、これに限定されるものではない。

【0066】

それぞれ抗がん効果が知られた２種以上の薬物を組み合わせるとして、組み合わされた薬物が互いに相乗効果（シナジー効果）を奏するとは期待できず、むしろ、組み合わせにより薬物の機能が相殺される場合があって、相乗効果を有する薬物の組み合わせを見つけることは非常に難しい事である。本発明においては、抗がん剤の最小濃度使用で副作用を最小化しながら抗がん効果は最大限に発揮できる抗がん複合製剤を開発した。

【0067】

本発明において、好ましいがんの予防または治療用薬学組成物の様態は、
免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、及び２－デオキシ－Ｄ－グルコースを含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールを含む組成物；または
免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩及びイノシトールを含む組成物であってよい。
本発明において、前記免疫チェックポイント抑制剤は、例えば、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＯＸ４０抗体、抗－ＴＩＭ３抗体、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上であってよい。より好ましくは、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つである。または、前記免疫チェックポイント抑制剤は、免疫チェックポイントタンパク質に結合するか免疫チェックポイント抑制に関連したメカニズムに関与する低分子化合物であってよい。

【0068】

例えば、前記目的を達成するための一つの様態として、抗－ＣＴＬＡ－４抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコースの複合製剤、抗－ＣＴＬＡ－４抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェートの複合製剤、抗－ＣＴＬＡ－４抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールの複合製剤、及び抗－ＣＴＬＡ－４抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェート／イノシトールの複合製剤は、各化合物の単一製剤や２種の化合物が含まれた複合製剤より腫瘍の大きさを減少させる効果が非常に高く奏された。

【0069】

また、前記目的を達成するための他の様態として、抗－ＰＤ－１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコースの複合製剤、抗－ＰＤ－１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェートの複合製剤、抗－ＰＤ－１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールの複合製剤、及び抗－ＰＤ－１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェート／イノシトールの複合製剤は、各化合物の単一製剤や２種の化合物が含まれた複合製剤より腫瘍の大きさを減少させる効果が非常に高く奏された。

【0070】

また、前記目的を達成するための他の様態として、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコースの複合製剤、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェートの複合製剤、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールの複合製剤、及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体／メトホルミン／２－デオキシ－Ｄ－グルコース／イノシトールヘキサホスフェート／イノシトールの複合製剤は、各化合物の単一製剤や２種の化合物が含まれた複合製剤より腫瘍の大きさを減少させる効果が非常に高く奏された。

【0071】

本発明において、前記ビグアニド系化合物としては、メトホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、またはフェンホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩であってよい。

【0072】

ビグアニド系化合物としては、メトホルミンを中心とした組成物を検討すると、本発明のがんの予防または治療用薬学組成物は、
免疫チェックポイント抑制剤、メトホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、及び２－デオキシ－Ｄ－グルコースを含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、メトホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、メトホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールを含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、メトホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩、及びイノシトールを含む組成物であってよい。

【0073】

また他のビグアニド系化合物としては、フェンホルミンを中心とした組成物を検討すると、本発明のがんの予防または治療用組成物は、
免疫チェックポイント抑制剤、フェンホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、及び２－デオキシ－Ｄ－グルコースを含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、フェンホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、フェンホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、及びイノシトールを含む組成物；
免疫チェックポイント抑制剤、フェンホルミンまたはこれらの薬学的に許容可能な塩、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩、及びイノシトールを含む組成物であってよい。
本発明の一実施例においては、本発明に係る薬学組成物ががん動物モデルで顕著に優れた効果でがんを抑制できることを確認した。即ち、本発明によれば、免疫チェックポイント抑制剤、ビグアニド系化合物、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、イノシトールヘキサホスフェート及びイノシトールそれぞれは、単独で使用する場合、抗がん効果が不十分で過量で使用しなければならないが、前記化合物を組み合わせた複合製剤で使用するようになると、少ない量でもがん細胞を効果的に死滅できることを確認した。

【0074】

本発明に係る各薬学組成物において、各化合物の組み合わせの重量比は、特に制限されない。

【0075】

例えば、免疫チェックポイント抑制剤として、単一クローン抗体で、例えば、抗－ＣＴＬＡ４抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＯＸ４０抗体、抗－ＴＩＭ３抗体、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択されるいずれか一つ以上は、１回投与量が０．０１－２５ｍｇ／ｋｇの範囲内で使用してよい。

【0076】

免疫チェックポイント抑制剤を除く化合物は、治療するがんの種類によって下記のような範囲で使用してよい。

【0077】

例えば、メトホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコースの重量比は、１：０．２～１：５の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0078】

例えば、フェンホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコースの重量比は、１：１～１：５０の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0079】

また他の例として、メトホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩の重量比は、１：０．２：０．５～１：５：２０の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0080】

また他の例として、フェンホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩の重量比は、１：１：１～１：５０：２００の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0081】

また他の例として、メトホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールの重量比は、１：０．２：０．５～１：５：２０の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0082】

また他の例として、フェンホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールの重量比は、１：１：１～１：５０：２００の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0083】

また他の例として、メトホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩：イノシトールの重量比は、１：０．２：０．５：０．５～１：５：２０：２０の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。

【0084】

また他の例として、フェンホルミンまたはその薬学的に許容可能な塩：２－デオキシ－Ｄ－グルコース：イノシトールヘキサホスフェートまたはその薬学的に許容可能な塩：イノシトールの重量比は、１：１：１：１～１：５０：２００：２００の範囲であってよく、治療するがんの種類によって組み合わせの相対量は変わり得る。
本発明は、また、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を有効成分として含むがんの予防または治療用薬学組成物を提供する。（１）乃至（４）の定義は、先に検討したとおりである。

【0085】

本発明において使用される用語「がん（ｃａｎｃｅｒ）」とは、細胞の死滅調節と関連した疾病であって、正常なアポトーシス均衡が崩れる場合、細胞が過多増殖するようになることで生じる疾病をいう。このような非正常な過多増殖細胞は、場合によって周囲の組織及び臓器に侵入して腫塊を形成し、体内の正常な構造を破壊するか変形させるようになるが、このような状態をがんという。一般に、腫瘍（ｔｕｍｏｒ）とは、身体組織の自律的な過剰成長により非正常に育った塊を意味し、良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎｔｕｍｏｒ）と悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）とに区分できる。悪性腫瘍は、良性腫瘍に比して成長速度が非常に速く、周辺の組織に浸潤しながら転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）が起こって生命を脅かすようになる。このような悪性腫瘍を通常「がん（ｃａｎｃｅｒ）」と呼び、がんの種類としては、脳脊髄腫瘍、脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胸腺腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胆道癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、リンパ腫、白血病、例えば、急性白血病または慢性白血病、骨肉腫、多発性骨髄腫、肉腫、黒色腫、悪性黒色腫及び皮膚癌等がある。本発明の抗がん用組成物は、がんの種類に制限なく使用され得るが、本発明の目的上、肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、大腸癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、骨肉腫、膀胱癌、頭頸部癌、腎癌、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されたいずれか一つ以上のがんの予防または治療に有用に使用され得る。

【0086】

本発明において使用される用語「予防または治療」とは、本発明に係る薬学組成物または複合製剤を利用することでがんの発病を抑制するか発病を遅延する全ての行為をいい、特に「治療」とは、前記組成物を使用してがんを好転させるか有益に変更する全ての行為を意味する。

【0087】

従って、本発明は、がんの予防または治療を要する対象体に（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を治療学的有効量で投与することを含む、がんの予防または治療方法を提供する。前記方法は、さらに（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を治療学的有効量で投与することをさらに含むことができる。

【0088】

本発明において使用される用語「投与」とは、適切な方法において本発明に関する薬学組成物または複合製剤を対象に提供することを意味する。ここで、対象とは動物を意味し、有益な効果を示す哺乳類であってよく、典型的には本発明に関する薬学組成物または複合製剤で治療される哺乳類であってよい。そのような個々の好ましい例としては、ヒトのような霊長類を含むことができる。

【0089】

本発明のがんの予防または治療用薬学組成物は、前記言及した有効成分以外に必要に応じてがん治療用化学療法剤をさらに含むことができる。

【0090】

また、本発明のがんの予防または治療用薬学組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。本発明の組成物は、それぞれの使用目的に合わせて、常法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、滅菌注射溶液の形態、軟膏剤等の外用剤、坐剤等に剤形化して使用され得、このような組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、鉱物油等が挙げられる。

【0091】

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等を混ぜて剤形化する。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。

【0092】

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が使用され得る。注射剤の基剤としては、溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤及び防腐剤のような従来の添加剤を含むことができる。

【0093】

本発明の組成物は、経口、静脈内、皮下、皮内、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、経皮等、多様な方式を利用して投与でき、投与量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得、当業者により容易に決定され得る。本発明に係る組成物の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢等によって増減し得るが、例えば、５種化合物の複合製剤の場合、免疫チェックポイント抑制剤として単一クローン抗体である抗－ＰＤ－１を使用する場合、１回の投与量は、０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、ビグアニド系化合物としてメトホルミンを使用する場合は、１日当たり５～８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、フェンホルミンを使用する場合は、１日当たり０．１～１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、２－デオキシ－Ｄ－グルコースは、１日当たり０．１～１６０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、イノシトールヘキサホスフェートは、１日当たり２～６００ｍｇ／ｋｇ（体重）、そしてイノシトールは、１日当たり２～６００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。ただし、前記投与量により本発明の範囲が限定されるものではない。

【0094】

また一つの様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を個体に投与してがんを予防または治療する方法に関するものである。

【0095】

また一つの様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を個体に投与してがんを予防または治療する方法に関するものである。

【0096】

また一つの様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を含むがんの予防または治療に使用するための組成物に関するものである。

【0097】

また一つの様態として、本発明は、（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物を含むがんの予防または治療に使用するための組成物に関するものである。

【0098】

また一つの様態として、本発明は、がんの予防または治療のための医薬を製造するための（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；及び（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）の使用に関するものである。

【0099】

また一つの様態として、本発明は、がんの予防または治療のための医薬を製造するための（１）免疫チェックポイント抑制剤；（２）ビグアニド系（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）化合物またはその薬学的に許容可能な塩；（３）２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）；及び（４）イノシトールヘキサホスフェート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはその薬学的に許容可能な塩、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、またはこれらの混合物の使用に関するものである。

【発明の効果】

【0100】

本発明の組成物は、制限された適応症を有する免疫チェックポイント抑制剤に対して多様な癌腫に適応症を増やすだけではなく、特定薬物を適宜組み合わせて相乗的抗がん効果を奏して治療効果を極大化しながら副作用なしにがん細胞だけを死滅させることができるので、がんの予防または治療のための抗がん剤として有用に使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0101】

【図1】図１および図２は、ヒトに由来したがん細胞株に対してメトホルミン（ＭＥＴ）、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２ＤＧ）及びイノシトールヘキサホスフェート（ＩＰ６）の単独及び複合製剤をヒトの血漿で使用可能な低濃度で処理し、４８時間後、ＭＴＴ分析法による細胞生存率を百分率で示したグラフである。各棒の縦棒は、標準偏差を示す。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。（１Ａ）ヒトの肝に由来したがん細胞であるＨｅｐＧ２細胞株に対して調査したグラフである。（１Ｂ）ヒトの肺に由来したがん細胞であるＡ５４９細胞株に対して調査したグラフである。（１Ｃ）ヒトの胃に由来したがん細胞であるＡＧＳ細胞株に対して調査したグラフである。（１Ｄ）ヒトの膵臓に由来したがん細胞であるＰＡＮＣ－１細胞株に対して調査したグラフである。（１Ｅ）ヒトの大腸に由来したがん細胞であるＤＬＤ－１細胞株に対して調査したグラフである。（１Ｆ）ヒトの子宮頸部に由来したがん細胞であるＨｅＬａ細胞株に対して調査したグラフである。

【図2】（２Ａ）ヒトの乳房に由来したがん細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対して調査したグラフである。（２Ｂ）ヒトの前立腺に由来したがん細胞であるＰＣ－３細胞株に対して調査したグラフである。（２Ｃ）ヒトの卵巣に由来したがん細胞であるＳＫ－ＯＶ－３細胞株に対して調査したグラフである。（２Ｄ）ヒトの膀胱に由来したがん細胞であるＴ２４細胞株に対して調査したグラフである。（２Ｅ）ヒトの脳に由来したがん細胞であるＵ－８７ＭＧ細胞株に対して調査したグラフである。（２Ｆ）ヒトの骨肉に由来したがん細胞であるＳａｏｓ－２細胞株に対して調査したグラフである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図3】図３および図４は、ヒトに由来したがん細胞株に対してフェンホルミン（ＰＨＥ）、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び複合製剤をヒトの血漿で使用可能な低濃度で処理し、４８時間後、ＭＴＴ分析法による細胞生存率を百分率で示したグラフである。各棒の縦棒は、標準偏差を示す。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。（３Ａ）ヒトの肝に由来したがん細胞であるＨｅｐＧ２細胞株に対して調査したグラフである。（３Ｂ）ヒトの肺に由来したがん細胞であるＡ５４９細胞株に対して調査したグラフである。（３Ｃ）ヒトの胃に由来したがん細胞であるＡＧＳ細胞株に対して調査したグラフである。（３Ｄ）ヒトの膵臓に由来したがん細胞であるＰＡＮＣ－１細胞株に対して調査したグラフである。（３Ｅ）ヒトの大腸に由来したがん細胞であるＤＬＤ－１細胞株に対して調査したグラフである。（３Ｆ）ヒトの子宮頸部に由来したがん細胞であるＨｅＬａ細胞株に対して調査したグラフである。

【図4】（４Ａ）ヒトの乳房に由来したがん細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対して調査したグラフである。（４Ｂ）ヒトの前立腺に由来したがん細胞であるＰＣ－３細胞株に対して調査したグラフである。（４Ｃ）ヒトの卵巣に由来したがん細胞であるＳＫ－ＯＶ－３細胞株に対して調査したグラフである。（４Ｄ）ヒトの膀胱に由来したがん細胞であるＴ２４細胞株に対して調査したグラフである。（４Ｅ）ヒトの脳に由来したがん細胞であるＵ－８７ＭＧ細胞株に対して調査したグラフである。（４Ｆ）ヒトの骨肉に由来したがん細胞であるＳａｏｓ－２細胞株に対して調査したグラフである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図5】ヒトに由来した正常な細胞株に対してＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び複合製剤をヒトの血漿で使用可能な低濃度で処理し、４８時間後、ＭＴＴ分析法による細胞生存率を百分率で示したグラフである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図6】４Ｔ１細胞での生存率とタンパク質発現を示した図である。各棒の縦棒は、標準偏差を示す。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。（６Ａ）マウス由来乳癌４Ｔ１細胞に対するＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用処理し、４８時間後、ＭＴＴ分析法による細胞生存率を百分率で示したグラフである。（６Ｂ、６Ｃ）ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用処理によるＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化発現を示した図である。＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7】４Ｔ１細胞に対するＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び複合製剤のＡＴＰ合成抑制グラフである。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した二元分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図8】実験動物で抗－ＰＤ－１抗体、ＭＥＴ、２ＤＧ、ＩＰ６及びＩｎｓの単独及び複合製剤投与による３日間隔で腫瘍の体積を測定したグラフである。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した二元分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図9】実験動物で抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、ＭＥＴ、２ＤＧ、ＩＰ６及びＩｎｓの単独及び複合製剤投与による３日間隔で腫瘍の体積を測定したグラフである。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した二元分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図10】実験動物で抗－ＣＴＬＡ－４抗体、ＭＥＴ、２ＤＧ、ＩＰ６及びＩｎｓの単独及び複合製剤投与による３日間隔で腫瘍の体積を測定したグラフである。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した二元分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより遂行された。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0102】

本発明の利点及び特徴、そして、それらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すると、明確になるだろう。しかし、本発明は、以下において開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形状に具現され、単に、本実施例は、本発明の開示が完全なものとなるようにし、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇により定義されるだけである。

【0103】

下記実施例においては、免疫チェックポイント抑制剤として単一クローン抗体である抗－ｍｏｕｓｅＰＤ－１ｍＡｂ（ＲＭＰ１－１４）、抗－ｍｏｕｓｅＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）、抗－ｍｏｕｓｅＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（ＵＣ１０－４Ｆ１０－１１）を使用した。また、ビグアニド系化合物としてメトホルミンまたはフェンホルミンの薬学的に許容可能な様々な塩の形態の中で塩酸メトホルミン（ＭｅｔｆｏｒｍｉｎＨＣｌ）、塩酸フェンホルミン（ＰｈｅｎｆｏｒｍｉｎＨＣｌ）を使用した。これらの塩の形態は、実施例によって限定されるものではない。また、イノシトールヘキサホスフェートの薬学的に許容可能な様々な塩の形態の中でイノシトールヘキサホスフェート（Ｐｈｙｔｉｃａｃｉｄ）を使用した。これらの形態は、実施例によって限定されるものではない。また、イノシトールの異性体の中でミオイノシトール（ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を使用した。これらの異性体は、実施例によって限定されるものではない。

【0104】

細胞培養

【0105】

本試験に使用した細胞は、腫瘍細胞として、肝癌（ＨｅｐＧ２）、肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＡＧＳ）、膵癌（ＰＡＮＣ－１）、大腸癌（ＤＬＤ－１）、子宮頸癌（ＨｅＬａ）、乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、前立腺癌（ＰＣ－３）、卵巣癌（ＳＫ－ＯＶ－３）、膀胱癌（Ｔ２４）、膠芽腫（Ｕ－８７ＭＧ）、骨肉腫（Ｓａｏｓ－２）、マウス由来乳癌（４Ｔ１）を使用し、非腫瘍細胞としては、前立腺（ＰＺ－ＨＰＶ－７）、大腸（ＣＣＤ－１８Ｃｏ）、肺（ＭＲＣ５）細胞株を使用したが、全ての細胞株は、韓国細胞株銀行（ＫｏｒｅａｎＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）または米国ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で購入して使用した。

【0106】

前記細胞は、ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ１６４０，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）に１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加した細胞培養液を利用し、３７℃インキュベーター（５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒ）で維持・培養した。細胞が培養皿の８０％程度満たされると、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）で細胞の単層を洗い、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－２．６５ｍＭＥＤＴＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を処理して継代培養し、培地は２日毎に取り替えた。

【0107】

使用した薬物

【0108】

使用した単一クローン抗体として、抗－ｍｏｕｓｅＰＤ－１ｍＡｂ（ＲＭＰ１－１４）、抗－ｍｏｕｓｅＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）、抗－ｍｏｕｓｅＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（ＵＣ１０－４Ｆ１０－１１）は、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社で購入し、製造会社が提示したとおりに保管し、取り扱った。

【0109】

塩酸メトホルミン（ＭｅｔｆｏｒｍｉｎＨＣｌ、以下、ＭＥＴ）、塩酸フェンホルミン（ＰｈｅｎｆｏｒｍｉｎＨＣｌ、以下、ＰＨＥ）、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ、以下、２ＤＧ）、イノシトールヘキサホスフェート（Ｐｈｙｔｉｃａｃｉｄ、以下、ＩＰ６）、ミオイノシトール（ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ、以下、Ｉｎｓ）は、シグマ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）で購入した。本発明において実験を通して得られた結果をまとめた表と図面で使用した全ての薬物は、略語として表記した。

【0110】

参照例１：試験管内細胞成長抑制分析

【0111】

ＭＥＴまたはＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６の細胞毒性は、ＭＴＴａｓｓａｙ［３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌ－２）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅａｓｓａｙ］を通して確認した。前記細胞（３～４×１０^５細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレート内に分注して１２時間以上安定化させた後、各ウェルの培地を除去し、それぞれの細胞に対するＭＥＴまたはＰＨＥ、２ＤＧそしてＩＰ６を濃度別にまたは混合して血清が含まれていない培地と共に処理した。対照群細胞に対しては、ＰＢＳを培地内に添加した。４８時間の間、ＣＯ_２が含まれた３７℃で培養後、対照群及び混合物を含む培地をきれいに除去し、ＭＴＴ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４時間の間培養した。以後にはＭＴＴ試薬を含む培地をきれいに除去し、生きている細胞により形成されたＭＴＴｆｏｒｍａｚａｎ結晶は、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を入れて室温で１５ｍｉｎ以上放置して溶解させた。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して５６０ｎｍの波長で吸光度を測定した。

【0112】

参照例２：単一製剤及び複合製剤の実験方法

【0113】

前記細胞（３～４×１０^５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、単一製剤薬物としてＭＥＴまたはＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６それぞれを濃度別に処理して細胞増殖抑制率を確認した。

【0114】

複合製剤薬物としては、ＭＥＴまたはＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６からなる群から選択された２種以上の化合物からなる複合製剤のＩＣ５０に該当する薬物の濃度で処理した。全ての細胞株は、単一または複合製剤の濃度で４８時間培養後、成長抑制効果をＭＴＴ分析法で測定した。

【0115】

参照例３：実験動物

【0116】

特定病原体のない（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）５週齢、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、（株）ドゥヨルバイオテックで購入して使用した。１週間の検疫及び適応過程を経た後、体重減少のない健常な動物を選別して実験に使用した。

【0117】

実験動物は、温度２３±３℃、相対湿度５０±１０％、換気回数１０－１５回／時間、照明時間１２時間（０８：００－２０：００）、照度１５０－３００Ｌｕｘに設定された飼育環境で飼育した。試験前の期間の間、実験動物は、実験動物用固形飼料（（株）カーギルアグリピュリナ）と飲水を自由摂取するようにした。

【0118】

参照例４：腫瘍細胞移植及び試験物質投与

【0119】

ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１週間の適応期間を経た後、実験動物の左側乳房脂肪組織に乳癌細胞である４Ｔ１細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を注入した後、目視で腫瘍組織が発生することを観察した。実験動物の腫瘍組織の大きさが約５０ｍｍ^３となったとき、乱塊法に基づいて１０個の試験群に分類した。即ち、対照群、Ｉｎｓ群（Ｉｎｓ１０００ｍｇ／ｋｇ）、ＩＰ６群（ＩＰ６１０００ｍｇ／ｋｇ）、ＭＥＴ群（ＭＥＴ５００ｍｇ／ｋｇ）、２ＤＧ群（２ＤＧ１０００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＡｂ群（単一クローン抗体（抗－ＰＤ１抗体または抗－ＰＤ－Ｌ１抗体または抗－ＣＴＬＡ－４抗体）として１５０μｇ／マウス）、ｍＡｂ＋ＭＥＴ＋２ＤＧ群（ｍＡｂ１５０μｇ／マウス＋ＭＥＴ５００ｍｇ／ｋｇ＋２ＤＧ１０００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＡｂ＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋Ｉｎｓ群（ｍＡｂ１５０μｇ／マウス＋ＭＥＴ５００ｍｇ／ｋｇ＋２ＤＧ１０００ｍｇ／ｋｇ＋Ｉｎｓ１０００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＡｂ＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群（ｍＡｂ１５０μｇ／マウス＋ＭＥＴ５００ｍｇ／ｋｇ＋２ＤＧ１０００ｍｇ／ｋｇ＋ＩＰ６１０００ｍｇ／ｋｇ）、ｍＡｂ＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群（ｍＡｂ１５０μｇ／マウス＋ＭＥＴ５００ｍｇ／ｋｇ＋２ＤＧ１０００ｍｇ／ｋｇ＋ＩＰ６５００ｍｇ／ｋｇ＋Ｉｎｓ５００ｍｇ／ｋｇ）に分類し、各試験群は、各１０匹の実験動物を使用した。試験物質単一クローン抗体は、試験群分離時点を１日として４日周期に腹腔投与し、試験物質Ｉｎｓ、ＩＰ６、ＭＥＴ、２ＤＧは、試験群分離時点を１日として試験終了時点まで蒸留水に溶かし、３週間一定時間に経口投与した。

【0120】

参照例５：実験動物の体重及び腫瘍の体積の測定

【0121】

試験期間の間、実験動物の体重は、試験物質投与日から１週間に１回一定の時間に体重を測定した。腫瘍の体積は、３日間隔でデジタルカリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して腫瘍の長さと幅を測定し、次の計算式に代入して腫瘍の体積を計算した。

【0122】

腫瘍の体積（ｍｍ^３）＝（幅^２×長さ）／２

【0123】

参照例６：統計処理

【0124】

全ての分析数値は、平均±ＳＤで示した。対照群と試験物質投与群の差を比較するためにＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０ソフトウェアを使用してＴｕｋｅｙの多重比較事後分析を利用した一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）または二元分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）テストにより有意性を検証した。ｐ＜０．０５以上である時のみ統計的に有意性があるものと判断した。

【0125】

＜実施例１＞ＭＥＴ（またはＰＨＥ）、２ＤＧ及びＩＰ６の単一製剤及び複合製剤の細胞増殖抑制実験

【0126】

１２種のがん細胞を使用してＭＥＴ（またはＰＨＥ）、２ＤＧ及びＩＰ６の単一製剤及び複合製剤の細胞増殖抑制効果を比較した。

【0127】

実施例１－１：ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用投与後の細胞生存率

【0128】

図１及び図２は、ヒトがん細胞株である肝癌（ＨｅｐＧ２）、肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＡＧＳ）、膵癌（ＰＡＮＣ－１）、大腸癌（ＤＬＤ－１）、子宮頸癌（ＨｅＬａ）、乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、前立腺癌（ＰＣ－３）、卵巣癌（ＳＫ－ＯＶ－３）、膀胱癌（Ｔ２４）、膠芽腫（Ｕ－８７ＭＧ）、骨肉腫（Ｓａｏｓ－２）を中心にＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用投与後の細胞生存率を調査した図である。

【0129】

図１Ａは、４ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した肝癌（ＨｅｐＧ２）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１７．４４±４．８％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である４５．４０±４．２％より２．６倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0130】

図１Ｂは、４ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した肺癌（Ａ５４９）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１９．４３±５．２％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である４８．８４±５．３％より２．５倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0131】

図１Ｃは、２ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した胃癌（ＡＧＳ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１５．２０±４．２％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５３．００±３．８％より３．５倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0132】

図１Ｄは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膵癌（ＰＡＮＣ－１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２５．２７±５．２％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６５．４０±４．３％より２．６倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0133】

図１Ｅは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．４ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した大腸癌（ＤＬＤ－１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２６．７０±４．７％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６５．４０±４．６％より２．４倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0134】

図１Ｆは、６ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．５ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２４．６７±３．６％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５２．８９±４．６％より２．１倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0135】

図２Ａは、６ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２６．３７±５．３％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５５．１５±４．５％より２．１倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0136】

図２Ｂは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した前立腺癌（ＰＣ－３）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１９．５１±５．６％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６６．７０±４．６％より３．４倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0137】

図２Ｃは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．５ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した卵巣癌（ＳＫ－ＯＶ－３）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２２．８０±５．２％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６６．８０±３．６％より２．９倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0138】

図２Ｄは、４ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膀胱癌（Ｔ２４）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２６．４２±４．８％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６３．３０±４．２％より２．４倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0139】

図２Ｅは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．４ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膠芽腫（Ｕ－８７ＭＧ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２０．８０±５．７％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６１．３２±４．８％より２．９倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0140】

図２Ｆは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した骨肉腫（Ｓａｏｓ－２）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２４．５２±５．７％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６４．３３±４．９％より２．６倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0141】

前記結果より、ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の３重複合製剤は、単独または２重複合製剤より優れたがん細胞増殖抑制効果を確認した。

【0142】

実施例１－２：ＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用投与後の細胞生存率

【0143】

図３及び図４は、ヒトがん細胞株である肝癌（ＨｅｐＧ２）、肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＡＧＳ）、膵癌（ＰＡＮＣ－１）、大腸癌（ＤＬＤ－１）、子宮頸癌（ＨｅＬａ）、乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、前立腺癌（ＰＣ－３）、卵巣癌（ＳＫ－ＯＶ－３）、膀胱癌（Ｔ２４）、膠芽腫（Ｕ－８７ＭＧ）、骨肉腫（Ｓａｏｓ－２）を中心にＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び併用投与後の細胞生存率を調査した図である。

【0144】

図３Ａは、０．３ｍＭ濃度のＰＨＥ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した肝癌（ＨｅｐＧ２）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２０．２１±４．１％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である４９．５５±４．８％より２．５倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0145】

図３Ｂは、０．３ｍＭ濃度のＰＨＥ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した肺癌（Ａ５４９）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２２．４１±５．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５４．７７±５．８％より２．４倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0146】

図３Ｃは、０．３ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した胃癌（ＡＧＳ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１７．３８±３．８％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５０．４５±３．９％より２．９倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0147】

図３Ｄは、０．２ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膵癌（ＰＡＮＣ－１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２５．２７±５．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６５．４０±４．３％より２．６倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0148】

図３Ｅは、０．３ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．４ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した大腸癌（ＤＬＤ－１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２２．２１±４．８％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６０．９８±４．７％より２．７倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0149】

図３Ｆは、０．２ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．５ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２５．６５±３．９％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５４．６７±４．６％より２．１倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0150】

図４Ａは、０．２ｍＭ濃度のＰＨＥ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２０．７６±４．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である４８．５４±４．５％より２．３倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0151】

図４Ｂは、０．３ｍＭ濃度のＰＨＥ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した前立腺癌（ＰＣ－３）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２０．７７±４．３％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５９．６６±４．６％より２．９倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0152】

図４Ｃは、０．４ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．５ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した卵巣癌（ＳＫ－ＯＶ－３）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２０．４４±４．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６０．５４±５．１％より３．０倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0153】

図４Ｄは、０．４ｍＭ濃度のＰＨＥ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膀胱癌（Ｔ２４）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２１．４５±４．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５８．７０±４．５％より２．７倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0154】

図４Ｅは、０．２ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．４ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した膠芽腫（Ｕ－８７ＭＧ）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は１５．７６±４．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である５４．３２±４．８％より３．４倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0155】

図４Ｆは、０．２ｍＭ濃度のＰＨＥ、０．７ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した骨肉腫（Ｓａｏｓ－２）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＰＨＥ＋２ＤＧ＋ＩＰ６組み合わせたものの生存率は２２．７６±４．２％であって、ＰＨＥ＋２ＤＧ組み合わせたものの生存率である６１．９３±４．７％より２．７倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0156】

前記結果より、ＰＨＥ、２ＤＧ及びＩＰ６の３重複合製剤は、単独または２重複合製剤より優れたがん細胞増殖抑制効果を確認した。

【0157】

実施例２：ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の複合製剤が正常細胞に及ぼす影響

【0158】

図５は、ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の複合製剤が正常細胞に及ぼす影響を調べるために、腫瘍細胞として、前立腺癌（ＰＣ－３）、大腸癌（ＤＬＤ－１）、肺癌（Ａ５４９）細胞株を、非腫瘍細胞としては、前立腺（ＰＺ－ＨＰＶ－７）、大腸（ＣＣＤ－１８Ｃｏ）、肺（ＭＲＣ５）細胞株に前記３種の組み合わせ製剤を処理し、４８時間後にＭＴＴ分析法で細胞毒性を調査した図である。

【0159】

５ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６の複合製剤で処理したＰＣ－３、ＰＺ－ＨＰＶ－７細胞株での結果を見ると、腫瘍細胞であるＰＣ－３細胞株では生存力が大きく減少したのに対し、非腫瘍細胞ＰＺ－ＨＰＶ－７細胞株では生存力に影響を及ぼさなかった（Ｐ＜０．０００１）。

【0160】

５ｍＭ濃度のＭＥＴ、０．４ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６の複合製剤で処理したＤＬＤ－１、ＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞株での結果を見ると、腫瘍細胞であるＤＬＤ－１細胞株では生存力が大きく減少したのに対し、非腫瘍細胞ＣＣＤ－１８Ｃｏ細胞株では生存力に影響を及ぼさなかった（Ｐ＜０．０００１）。

【0161】

４ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６の複合製剤で処理したＡ５４９、ＭＲＣ５細胞株での結果を見ると、腫瘍細胞であるＡ５４９細胞株では生存力が大きく減少したのに対し、非腫瘍細胞ＭＲＣ５細胞株では生存力に影響を及ぼさなかった（Ｐ＜０．０００１）。

【0162】

前記３種の組み合わせ製剤の各非腫瘍細胞に対する細胞死は、腫瘍細胞とは異なる様相を示し、生体内で安全な薬物であることが確認された。

【0163】

実施例３：ＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び複合製剤による４Ｔ１細胞の生存率とタンパク質発現

【0164】

生きている細胞の代謝過程は、ＡＴＰとＡＤＰをエネルギー源として使用し、ＡＭＰを生成するようになる。ＡＭＰＫ（ＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）は、ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｋｉｎａｓｅであって脂質とブドウ糖代謝の調節因子として知られており、眼の糖尿に重要な調節作用をする。ＡＭＰＫは、細胞内エネルギー消耗時に増加するＡＭＰにより活性化されてＡＴＰ使用を抑制させ、異化作用（ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）を誘導してエネルギー恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持するのに核心的な役割を果たす。ＡＭＰＫ活性化は、がん細胞の増殖を抑制する作用をし、脂肪代謝の側面では、脂肪酸合成を誘導する酵素であるＡＣＣ（ａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を抑制する。

【0165】

図６Ａは、５ｍＭ濃度のＭＥＴ、２ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理したマウス由来乳癌（４Ｔ１）細胞株での生存率を示している。併用処理した製剤は、対照群を含む単独処理したものより生存力が大きく減少した（Ｐ＜０．０００１）。併用処理したグループとの比較では、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群の生存率は２３．０４±４．０％であって、ＭＥＴ＋２ＤＧ群の生存率である５０．０３±４．０％より２．２倍の高い減少を示した（Ｐ＜０．０００１）。

【0166】

図６Ｂと図６Ｃにおいて、ＭＥＴ＋２ＤＧ群よりＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群でＡＭＰＫを顕著に活性化させ（Ｐ＜０．０００１）、ＡＣＣのリン酸化を減少させた（Ｐ＜０．０５）。

【0167】

実施例４．４Ｔ１細胞に対するＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６の単独及び複合製剤のＡＴＰ合成抑制

【0168】

ＡＴＰ（アデノシン三リン酸、ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、生物のエネルギー源であり、細胞内ＡＴＰ合成が抑制されるとエネルギー代謝活性度が減少する。実施例３のマウス由来乳癌細胞株４Ｔ１に対してＭＥＴ、２ＤＧ及びＩＰ６のＡＴＰ合成抑制効果を確認した。

【0169】

４Ｔ１の各細胞（１０^３－１０^４ｃｅｌｌｓ）を６０ｍｍ培養皿で２４時間の間培養し、４ｍＭ濃度のＭＥＴ、１ｍＭ濃度の２ＤＧ、１ｍＭ濃度のＩＰ６で単独及び併用処理した後、さらに４８時間の間培養した。以後、細胞を回収し、計数して１００μｌの１０体積％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ培養液に希釈し、これを９６－ウェルプレートの各ウェルに移した。前記細胞が入っているウェルにプロメガＡＴＰ分析キット（Ｇ７５７２，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）の分析バッファ（ｒＬ／Ｌｒｅａｇｅｎｔ＋ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）１００μｌを添加し、蛍光の発光程度を５６０ｎｍで吸光度測定した。その結果を図７に示した。

【0170】

実験の結果、図７のように、実験に使用された４Ｔ１細胞株で単独及び併用処理において単独よりは併用処理でＡＴＰ合成が阻害されるものと示された（Ｐ＜０．０００１）。そして、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群は、ＭＥＴ＋２ＤＧ群よりＡＴＰ合成が顕著に阻害されるものと示された（Ｐ＜０．０５）。その結果、ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群の複合製剤ががん細胞で最も効果的にエネルギー準位を減少させるということが分かった。下記実施例５－７においては、試験物質Ｉｎｓ、ＩＰ６、ＭＥＴ、２ＤＧと免疫チェックポイント抑制剤との併用投与による腫瘍成長抑制効果を示したものである。

【0171】

実施例５．抗－ＰＤ－１、Ｉｎｓ、ＩＰ６、ＭＥＴ及び２ＤＧの単独及び複合製剤が腫瘍の体積変化に及ぼす影響

【0172】

腫瘍組織の大きさが約５０ｍｍ^３であるとき、試験群を分類して試験物質投与を開始し、試験物質投与の開始日から３日間隔で腫瘍の体積を測定した。実験の結果、図８のように、試験物質投与の３日目から対照群と比較して単独及び併用処理群の腫瘍の体積が減少する傾向を示した。試験物質投与の２１日目、単一クローン抗体だけを投与した抗－ＰＤ－１群は、抗－ＰＤ－１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ群と有意差を示した（Ｐ＜０．０１）。そして、対照群、Ｉｎｓ群、ＩＰ６群、ＭＥＴ群、２ＤＧ群、抗－ＰＤ－１群は、単一クローン抗体を含む４種以上の複合製剤である抗－ＰＤ－１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋Ｉｎｓ、抗－ＰＤ－１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群、抗－ＰＤ－１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群と比較して高い有意差を示した（Ｐ＜０．０００１）。腫瘍の体積において、全体１０個の群の中では、抗－ＰＤ－１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群が最も高い減少を示して、高い腫瘍成長抑制効果を示した（図８）。

【0173】

実施例６．抗－ＰＤ－Ｌ１、Ｉｎｓ、ＩＰ６、ＭＥＴ及び２ＤＧの単独及び複合製剤が腫瘍の体積変化に及ぼす影響

【0174】

腫瘍組織の大きさが約５０ｍｍ^３であるとき、試験群を分類して試験物質投与を開始し、試験物質投与の開始日から３日間隔で腫瘍の体積を測定した。実験の結果、図９のように、試験物質投与の３日目から対照群と比較して単独及び併用処理群の腫瘍の体積が減少する傾向を示した。試験物質投与の２１日目、単一クローン抗体だけを投与した抗－ＰＤ－Ｌ１群は、抗－ＰＤ－Ｌ１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ群と有意差を示した（Ｐ＜０．０１）。そして、対照群、Ｉｎｓ群、ＩＰ６群、ＭＥＴ群、２ＤＧ群、抗－ＰＤ－Ｌ１群は、単一クローン抗体を含む４種以上の複合製剤である抗－ＰＤ－Ｌ１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋Ｉｎｓ、抗－ＰＤ－Ｌ１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群、抗－ＰＤ－Ｌ１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群と比較して高い有意差を示した（Ｐ＜０．０００１）。腫瘍の体積において、全体１０個の群の中では、抗－ＰＤ－Ｌ１＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群が最も高い減少を示して、高い腫瘍成長抑制効果を示した（図９）。

【0175】

実施例７．抗－ＣＴＬＡ－４、Ｉｎｓ、ＩＰ６、ＭＥＴ及び２ＤＧの単独及び複合製剤が腫瘍の体積変化に及ぼす影響

【0176】

腫瘍組織の大きさが約５０ｍｍ^３であるとき、試験群を分類して試験物質投与を開始し、試験物質投与の開始日から３日間隔で腫瘍の体積を測定した。実験の結果、図１０のように、試験物質投与の３日目から対照群と比較して単独及び併用処理群の腫瘍の体積が減少する傾向を示した。試験物質投与の２１日目、単一クローン抗体だけを投与した抗－ＣＴＬＡ－４群は、抗－ＣＴＬＡ－４＋ＭＥＴ＋２ＤＧ群と高い有意差を示した（Ｐ＜０．００１）。そして、対照群、Ｉｎｓ群、ＩＰ６群、ＭＥＴ群、２ＤＧ群、抗－ＣＴＬＡ－４群は、単一クローン抗体を含む４種以上の複合製剤である抗－ＣＴＬＡ－４＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋Ｉｎｓ、抗－ＣＴＬＡ－４＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６群、抗－ＣＴＬＡ－４＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群と比較して高い有意差を示した（Ｐ＜０．０００１）。腫瘍の体積において、全体１０個の群の中では、抗－ＣＴＬＡ－４＋ＭＥＴ＋２ＤＧ＋ＩＰ６＋Ｉｎｓ群が最も高い減少を示して、高い腫瘍成長抑制効果を示した（図１０）。

【図1】