特表 2022-516557 修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含むポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-28

(54)【発明の名称】修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含むポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/26 20060101AFI20220218BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20220218BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220218BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220218BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220218BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220218BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220218BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220218BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220218BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220218BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220218BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220218BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220218BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220218BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20220218BHJP

【ＦＩ】

C12N15/26

C07K14/55 ZNA

C07K16/18

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61K38/20

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 T

A61K38/19

A61K35/768

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021538982

(86)(22)【出願日】2020-01-06

(85)【翻訳文提出日】2021-08-24

(86)【国際出願番号】 US2020012296

(87)【国際公開番号】W WO2020146221

(87)【国際公開日】2020-07-16

(31)【優先権主張番号】62/789,075

(32)【優先日】2019-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514199744

【氏名又は名称】インヒブルクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ティマー ジョン シー．

(72)【発明者】

【氏名】エッケルマン ブレンダン ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ウィリス ケイトリン マッケイブ

(72)【発明者】

【氏名】スルツマイアー フロリアン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ベックランド ブライアン アール．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

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4B064CC24

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4B065AA90X

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4B065CA24

4B065CA25

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4C084AA07

4C084AA19

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4C084DA01

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4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC75

4C085AA14

4C085EE03

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドであって、修飾ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と比べてＩＬ－２受容体に対する親和性が低下している、ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態では、活性化Ｔ細胞に結合して作動する、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドが提供される。修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドの使用も提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドであって、前記修飾ＩＬ－２は、Ｐ６５、Ｄ８４、Ｅ９５、Ｍ２３、及びＨ１６から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

前記修飾ＩＬ－２は、修飾ヒトＩＬ－２である、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記アミノ酸位置は、配列番号１中のアミノ酸位置に対応する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５に置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記置換は、Ｐ６５Ｒ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｙ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｄ、及びＰ６５Ｎから選択される、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｈ１６に置換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記置換は、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、及びＨ１６Ｐから選択される、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｄ８４に置換を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記置換は、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｖ、及びＤ８４Ｐから選択される、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、及びＤ８４に置換を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、及びＤ８４Ｓを含む、請求項１０に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｍ２３に置換を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記置換は、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｇ、Ｍ２３Ｓ、Ｍ２３Ｔ、Ｍ２３Ｖ、及びＭ２３Ｐから選択される、請求項１２に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＭ２３Ａを含む、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｅ９５に置換を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記置換は、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ｔ、Ｅ９５Ｖ、Ｅ９５Ｐ、Ｅ９５Ｈ、及びＥ９５Ｎから選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＥ９５Ｑを含む、請求項１６に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｍ２３Ａ、及びＥ９５Ｑを含む、請求項１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｆ４２に置換を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

前記Ｆ４２での置換は、Ｆ４２Ｋ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、及びＦ４２Ｔから選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

前記修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５及びＬ７２から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項22】

前記修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。

【請求項23】

前記修飾ＩＬ－２は、Ｔ３及びＣ１２５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

前記修飾ＩＬ－２は、Ｔ３Ａ及びＣ１２５Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。

【請求項25】

前記修飾ＩＬ－２は、Ｈ１６Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ１５Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｍ２３Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ９５Ｑ－Ｆ４２Ｋ、Ｐ６５Ｒ－Ｈ１６Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ１５Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｍ２３Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ９５Ｑ、Ｔ３Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓ、及びＴ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓから選択される一連の置換を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

前記修飾ＩＬ－２は、前記一連の置換を含み、任意の付加的な置換を含まない、請求項２５に記載のポリペプチド。

【請求項27】

前記修飾ＩＬ－２は、配列番号８４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項28】

前記修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項29】

前記修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合している、請求項３０に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸位置Ｔ３６６に置換を含む、請求項３０又は３１に記載のポリペプチド。

【請求項33】

前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ置換を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。

【請求項34】

前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７から選択される少なくとも１つのＫａｂａｔアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。

【請求項35】

前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。

【請求項36】

前記Ｆｃ領域は、Ｓ３５４及びＹ３４９から選択されるＫａｂａｔ位置に置換を含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項37】

前記Ｆｃ領域は、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃ置換を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。

【請求項38】

前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸位置Ｈ４３５に置換を含む、請求項３０～３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項39】

前記Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ及びＨ４３５Ｋから選択される置換を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。

【請求項40】

前記Ｆｃ領域は、Ｍ２５２及びＭ４２８から選択される少なくとも１つのＫａｂａｔアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項３０～３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項41】

前記Ｆｃ領域は、Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖ置換を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。

【請求項42】

前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５の欠失を含む、請求項３０～４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項43】

前記Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項３０～４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項44】

前記Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。

【請求項45】

前記Ｆｃ領域は、配列番号４７～配列番号８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項46】

前記Ｆｃ領域は、重鎖定常領域の一部である、請求項３０～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項47】

前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域である、請求項４６に記載のポリペプチド。

【請求項48】

前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域である、請求項４７に記載のポリペプチド。

【請求項49】

前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域又は重鎖定常領域のＣ末端に融合している、請求項３０～４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項50】

前記修飾ＩＬ－２は、１個～２０個のアミノ酸を含むリンカーによって前記Ｆｃ領域又は重鎖定常領域のＣ末端に融合している、請求項４９に記載のポリペプチド。

【請求項51】

前記リンカーは、グリシンアミノ酸を含む、請求項５０に記載のポリペプチド。

【請求項52】

前記リンカーは、グリシン及びセリンアミノ酸を含む、請求項５１に記載のポリペプチド。

【請求項53】

前記リンカー中の前記アミノ酸の大部分又は全てがグリシン及びセリンである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項54】

前記ポリペプチドは、配列番号８６、配列番号８７、配列番号１０２、配列番号１０３、又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、請求項３０～３３、４２、及び４９～５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項55】

前記ポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項56】

前記ポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つの抗原結合ドメインを含む、請求項５５に記載のポリペプチド。

【請求項57】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、Ｔ細胞抗原又はナチュラルキラー細胞抗原に特異的に結合する、請求項５５又は５６に記載のポリペプチド。

【請求項58】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原又はＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原に特異的に結合する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項59】

前記少なくとも１つの抗原結合ドメインは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項５８に記載のポリペプチド。

【請求項60】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、アゴニストである、請求項５５～５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項61】

前記抗原結合ドメインは、アンタゴニストである、請求項５５～５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項62】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１０７ａ、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、又はＣＤ１６ａに特異的に結合する、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項63】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合する、請求項５５～６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項64】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインである、請求項５５～６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項65】

各抗原結合ドメインは、独立してヒト又はヒト化抗原結合ドメインである、請求項６４に記載のポリペプチド。

【請求項66】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインを含む、請求項５５～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項67】

各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインを含む、請求項６６に記載のポリペプチド。

【請求項68】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項５５～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項69】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＡＭＰ－５１４、ＴＳＲ－０４２、ＳＴＩ－Ａ１１１０、イピリムマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブから選択される抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項６８に記載のポリペプチド。

【請求項70】

前記少なくとも１つの抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、請求項６８又は６９に記載のポリペプチド。

【請求項71】

前記ポリペプチドは、重鎖定常領域を含み、前記ＶＨドメインは、前記重鎖定常領域に融合し、前記ＶＬドメインは、前記ＶＨドメインと結合している、請求項６８又は６９に記載のポリペプチド。

【請求項72】

前記ＶＬドメインは、軽鎖定常領域に融合している、請求項７１に記載のポリペプチド。

【請求項73】

前記軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダから選択される、請求項７２に記載のポリペプチド。

【請求項74】

前記抗原結合ドメインは、それぞれ同じである、請求項５５～７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項75】

前記抗原結合ドメインは、それぞれ同じ抗原に特異的に結合する、請求項５５～７４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項76】

前記抗原結合ドメインの少なくとも１つは、他の抗原結合ドメインの少なくとも１つとは異なる抗原に特異的に結合する、請求項５５～７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項77】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合し、少なくとも１つの他の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１以外のＴ細胞抗原又はナチュラルキラー細胞抗原に特異的に結合する、請求項５５～７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項78】

少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１０７ａ、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、又はＣＤ１６ａに結合する、請求項５５～７７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項79】

前記ポリペプチドは、生理学的条件下でホモ二量体を形成する、請求項３１～７８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項80】

前記修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒに対するヒト野生型ＩＬ－２の親和性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い親和性でヒトＩＬ－２Ｒに結合する、請求項１～７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項81】

第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、請求項１～７９のいずれか一項に記載のポリペプチドである、複合体。

【請求項82】

前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含む、請求項８１に記載の複合体。

【請求項83】

各Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプである、請求項８１又は８２に記載の複合体。

【請求項84】

各Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１である、請求項８３に記載の複合体。

【請求項85】

各Ｆｃ領域は、アミノ酸Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５の欠失を含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項86】

各Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ変異を含む、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項87】

前記Ｆｃ領域は、変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｌ又は変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖを含む、請求項８１～８６のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項88】

前記第１のＦｃ領域又は前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方のＦｃ領域は、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項89】

前記第１のＦｃ領域又は前記第２のＦｃ領域は、Ｓ３５４Ｃ変異を含む、請求項８８に記載の複合体。

【請求項90】

各Ｆｃ領域は、独立して配列番号４７～配列番号８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項８１～８９のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項91】

前記第２のポリペプチドは、修飾ＩＬ２を含まない、請求項８１～９０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項92】

前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項８１～９１のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項93】

前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項８１～９２のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項94】

前記第１のポリペプチドは、第１の抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域、及び修飾ＩＬ－２を含む、請求項８１～９３のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項95】

前記第１の抗原結合ドメインは、前記Ｆｃ領域のＮ末端に融合し、前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合する、請求項９４に記載の複合体。

【請求項96】

前記第２のポリペプチドは、第２の抗原結合ドメイン及びＦｃ領域を含む、請求項９４又は９５に記載の複合体。

【請求項97】

前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、同じか又は異なる、請求項９６に記載の複合体。

【請求項98】

ａ）前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、どちらもＰＤ－１に結合し、
ｂ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＬＡＧ３に結合し、
ｃ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、
ｄ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、４－１ＢＢに結合し、
ｅ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０に結合し、
ｆ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲに結合し、
ｇ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、
ｈ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ｂに結合し、
ｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ４に結合し、
ｊ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ３０に結合し、
ｋ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、
ｌ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＩＧＩＴに結合し、
ｍ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、
ｎ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２に結合し、
ｏ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｐ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１０７ａに結合し、
ｑ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、
ｒ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｓ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｔ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｕ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｗ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｘ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｙ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｚ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＬＡＧ３に結合し、
ａａ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｔｉｍ３に結合し、
ｂｂ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０に結合し、
ｃｃ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲに結合し、
ｄｄ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１０７ａに結合し、
ｅｅ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、又は、
ｆｆ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＩＣＯＳに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲ２に結合する、請求項９７に記載の複合体。

【請求項99】

前記修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒに対するヒト野生型ＩＬ－２の親和性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い親和性でヒトＩＬ－２Ｒに結合する、請求項８１～９８のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項100】

請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項101】

請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体をコードする単離された核酸。

【請求項102】

請求項１０１に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項103】

請求項１０１に記載の核酸又は請求項１０２に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。

【請求項104】

請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体を発現する単離された宿主細胞。

【請求項105】

請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で請求項１０３又は１０４に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【請求項106】

前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる方法であって、Ｔ細胞を請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、方法。

【請求項108】

前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、請求項１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍である、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

ＮＫ細胞増殖を増加させる方法であって、ＮＫ細胞を請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、方法。

【請求項112】

前記増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

癌を治療する方法であって、癌を伴う被験体に請求項１～８０のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項８１～９９のいずれか一項に記載の複合体、又は請求項１００に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項114】

前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

追加の療法剤を投与することを更に含む、請求項１１３又は１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記追加の療法剤は、抗癌剤である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、請求項１１６又は１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記抗癌生物製剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１を阻害する作用物質である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記抗癌生物製剤は、ＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴを阻害する作用物質である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項121】

前記抗癌剤は、抗体である、請求項１１６～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記抗癌生物製剤は、サイトカインである、請求項１１８に記載の方法。

【請求項123】

前記抗癌剤は、ＣＡＲ－Ｔ療法薬である、請求項１１６に記載の方法。

【請求項124】

前記抗癌剤は、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項125】

腫瘍切除及び／又は放射線療法を更に含む、請求項１１３～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年１月７日付で出願された米国仮出願第６２／７８９，０７５号の優先権の利益を主張し、その全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。

【0002】

本発明は、ＣＤ２５及びＣＤ１２２に対する親和性が低下した修飾ＩＬ－２、並びに標的化部分に融合された、かかる修飾ＩＬ－２に関する。本発明は、限定されるものではないが、癌を治療する方法を含む、修飾ＩＬ－２及び修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドを使用する方法にも関する。

【背景技術】

【0003】

ＩＬ－２は、ＣＤ２５、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２から構成されるヘテロ三量体ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、又はＣＤ１２２及びＣＤ１３２のみから構成されるヘテロ二量体ＩＬ－２受容体のいずれかを介してＴ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する強力なサイトカインである。どちらの形態のＩＬ－２ＲもＴ細胞の生存、増殖、及び全体的な活性化状態の強力なメディエーターである。ＩＬ－２は概して、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって活性化後に産生され、局所微小環境におけるシス及びトランスのシグナル伝達を媒介する。ＩＬ－２Ｒシグナル伝達は、エフェクターＴ細胞及び記憶Ｔ細胞へのナイーブＴ細胞の分化を誘導することができ、抑制性制御性Ｔ細胞を刺激することもできる。三量体形態のＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２に対して二量体形態よりも高い親和性を有するが、どちらも適度に高い親和性であり、急速な受容体媒介性の内在化及び分解を引き起こし、極めて短い半減期をもたらす。組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２、プロロイキン）が腎細胞癌及び悪性黒色腫の治療に臨床的に使用されているが、強い毒性を伴う。高親和性ＩＬ－２Ｒを発現する内皮細胞に対するＩＬ－２シグナル伝達の影響により、血管漏出症候群がプロロイキンで治療された癌患者にとって主な毒性の問題となっている。

【0004】

Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体のクラスター形成及びＮＦＡＴを介したシグナル伝達を引き起こす、それらのＴＣＲと相補性ペプチドが結合したＭＨＣを提示する隣接細胞とのライゲーションによって活性化される。ＣＤ２８を介したＴ細胞の共刺激がＣＤ８０及びＣＤ８６によって引き起こされ、これによりＴ細胞活性化が増強される。初期活性化後に、Ｔ細胞はサイトカイン受容体、並びにＴ細胞応答を調節する働きをする多くの共刺激受容体及びチェックポイント受容体を含む様々なタンパク質を上方調節する。

【0005】

持続的な抗腫瘍臨床応答が近年、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１等のチェックポイント受容体に対するアンタゴニスト抗体について報告されている。しかしながら、最も応答性が高い適応症であっても、奏効率は患者の約３０％に限られる。したがって、改善されたＴ細胞調節療法薬が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本明細書では、少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドが提供される。幾つかの実施の形態では、修飾ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と比べてＣＤ２５、ＣＤ１２２、及び／又はＩＬ－２Ｒに対する結合親和性が低下している。幾つかの実施の形態では、修飾ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２と比べて休止Ｔ細胞又は活性化Ｔ細胞に対する活性が低下している。

【0007】

実施形態１．
修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドであって、前記修飾ＩＬ－２は、Ｐ６５、Ｄ８４、Ｅ９５、Ｍ２３、及びＨ１６から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリペプチド。

【0008】

実施形態２．
前記修飾ＩＬ－２は、修飾ヒトＩＬ－２である、実施形態１のポリペプチド。

【0009】

実施形態３．
前記アミノ酸位置は、配列番号１中のアミノ酸位置に対応する、実施形態１又は２のポリペプチド。

【0010】

実施形態４．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0011】

実施形態５．
前記置換は、Ｐ６５Ｒ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｙ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｄ、及びＰ６５Ｎから選択される、実施形態４のポリペプチド。

【0012】

実施形態６．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｈ１６に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0013】

実施形態７．
前記置換は、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、及びＨ１６Ｐから選択される、実施形態６のポリペプチド。

【0014】

実施形態８．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｄ８４に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0015】

実施形態９．
前記置換は、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｖ、及びＤ８４Ｐから選択される、実施形態８のポリペプチド。

【0016】

実施形態１０．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、及びＤ８４に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0017】

実施形態１１．
前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、及びＤ８４Ｓを含む、実施形態１０のポリペプチド。

【0018】

実施形態１２．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｍ２３に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0019】

実施形態１３．
前記置換は、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｇ、Ｍ２３Ｓ、Ｍ２３Ｔ、Ｍ２３Ｖ、及びＭ２３Ｐから選択される、実施形態１２のポリペプチド。

【0020】

実施形態１４．
前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＭ２３Ａを含む、実施形態１３のポリペプチド。

【0021】

実施形態１５．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｅ９５に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0022】

実施形態１６．
前記置換は、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ｔ、Ｅ９５Ｖ、Ｅ９５Ｐ、Ｅ９５Ｈ、及びＥ９５Ｎから選択される、実施形態１５のポリペプチド。

【0023】

実施形態１７．
前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＥ９５Ｑを含む、実施形態１６のポリペプチド。

【0024】

実施形態１８．
前記修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｍ２３Ａ、及びＥ９５Ｑを含む、実施形態１７のポリペプチド。

【0025】

実施形態１９．
前記修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｆ４２に置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0026】

実施形態２０．
前記Ｆ４２での置換は、Ｆ４２Ｋ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、及びＦ４２Ｔから選択される、実施形態１９のポリペプチド。

【0027】

実施形態２１．
前記修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５及びＬ７２から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0028】

実施形態２２．
前記修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇから選択される少なくとも１つの置換を含む、実施形態２１のポリペプチド。

【0029】

実施形態２３．
前記修飾ＩＬ－２は、Ｔ３及びＣ１２５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0030】

実施形態２４．
前記修飾ＩＬ－２は、Ｔ３Ａ及びＣ１２５Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む、実施形態２３のポリペプチド。

【0031】

実施形態２５．
前記修飾ＩＬ－２は、Ｈ１６Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ１５Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｍ２３Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ９５Ｑ－Ｆ４２Ｋ、Ｐ６５Ｒ－Ｈ１６Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ１５Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｍ２３Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ９５Ｑ、Ｔ３Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓ、及びＴ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓから選択される一連の置換を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0032】

実施形態２６．
前記修飾ＩＬ－２は、前記一連の置換を含み、任意の付加的な置換を含まない、実施形態２５のポリペプチド。

【0033】

実施形態２７．
前記修飾ＩＬ－２は、配列番号８４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0034】

実施形態２８．
前記修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0035】

実施形態２９．
前記修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0036】

実施形態３０．
前記ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0037】

実施形態３１．
前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合している、実施形態３０のポリペプチド。

【0038】

実施形態３２．
前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸位置Ｔ３６６に置換を含む、実施形態３０又は３１のポリペプチド。

【0039】

実施形態３３．
前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ置換を含む、実施形態３２のポリペプチド。

【0040】

実施形態３４．
前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７から選択される少なくとも１つのＫａｂａｔアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、実施形態３１のポリペプチド。

【0041】

実施形態３５．
前記Ｆｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む、実施形態３４のポリペプチド。

【0042】

実施形態３６．
前記Ｆｃ領域は、Ｓ３５４及びＹ３４９から選択されるＫａｂａｔ位置に置換を含む、実施形態３０～３５のいずれか１つのポリペプチド。

【0043】

実施形態３７．
前記Ｆｃ領域は、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃ置換を含む、実施形態３６のポリペプチド。

【0044】

実施形態３８．
前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸位置Ｈ４３５に置換を含む、実施形態３０～３７のいずれか１つのポリペプチド。

【0045】

実施形態３９．
前記Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ及びＨ４３５Ｋから選択される置換を含む、実施形態３８のポリペプチド。

【0046】

実施形態４０．
前記Ｆｃ領域は、Ｍ２５２及びＭ４２８から選択される少なくとも１つのＫａｂａｔアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、実施形態３０～３９のポリペプチド。

【0047】

実施形態４１．
前記Ｆｃ領域は、Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖ置換を含む、実施形態４０のポリペプチド。

【0048】

実施形態４２．
前記Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔアミノ酸Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５の欠失を含む、実施形態３０～４１のいずれか１つのポリペプチド。

【0049】

実施形態４３．
前記Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、実施形態３０～４１のいずれか１つのポリペプチド。

【0050】

実施形態４４．
前記Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換を含む、実施形態４３のポリペプチド。

【0051】

実施形態４５．
前記Ｆｃ領域は、配列番号４７～配列番号８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態３０～４４のいずれか１つのポリペプチド。

【0052】

実施形態４６．
前記Ｆｃ領域は、重鎖定常領域の一部である、実施形態３０～４４のいずれか１つのポリペプチド。

【0053】

実施形態４７．
前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域である、実施形態４６のポリペプチド。

【0054】

実施形態４８．
前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域である、実施形態４７のポリペプチド。

【0055】

実施形態４９．
前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域又は重鎖定常領域のＣ末端に融合している、実施形態３０～４８のいずれか１つのポリペプチド。

【0056】

実施形態５０．
前記修飾ＩＬ－２は、１個～２０個のアミノ酸を含むリンカーによって前記Ｆｃ領域又は重鎖定常領域のＣ末端に融合している、実施形態４９のポリペプチド。

【0057】

実施形態５１．
前記リンカーは、グリシンアミノ酸を含む、実施形態５０のポリペプチド。

【0058】

実施形態５２．
前記リンカーは、グリシン及びセリンアミノ酸を含む、実施形態５１のポリペプチド。

【0059】

実施形態５３．
前記リンカー中の前記アミノ酸の大部分又は全てがグリシン及びセリンである、実施形態５０～５２のいずれか１つのポリペプチド。

【0060】

実施形態５４．
前記ポリペプチドは、配列番号８６、配列番号８７、配列番号１０２、配列番号１０３、又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、実施形態３０～３３、４２、及び４９～５３のいずれか１つのポリペプチド。

【0061】

実施形態５５．
前記ポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、上記の実施形態のいずれか１つのポリペプチド。

【0062】

実施形態５６．
前記ポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つの抗原結合ドメインを含む、実施形態５５のポリペプチド。

【0063】

実施形態５７．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、Ｔ細胞抗原又はナチュラルキラー細胞抗原に特異的に結合する、実施形態５５又は５６のポリペプチド。

【0064】

実施形態５８．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原又はＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原に特異的に結合する、実施形態５５～５７のいずれか１つのポリペプチド。

【0065】

実施形態５９．
前記少なくとも１つの抗原結合ドメインは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合する、実施形態５８のポリペプチド。

【0066】

実施形態６０．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、アゴニストである、実施形態５５～５９のいずれか１つのポリペプチド。

【0067】

実施形態６１．
前記抗原結合ドメインは、アンタゴニストである、実施形態５５～５９のいずれか１つのポリペプチド。

【0068】

実施形態６２．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１０７ａ、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、又はＣＤ１６ａに特異的に結合する、実施形態５５～６１のいずれか１つのポリペプチド。

【0069】

実施形態６３．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合する、実施形態５５～６２のいずれか１つのポリペプチド。

【0070】

実施形態６４．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインである、実施形態５５～６３のいずれか１つのポリペプチド。

【0071】

実施形態６５．
各抗原結合ドメインは、独立してヒト又はヒト化抗原結合ドメインである、実施形態６４のポリペプチド。

【0072】

実施形態６６．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインを含む、実施形態５５～６５のいずれか１つのポリペプチド。

【0073】

実施形態６７．
各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインを含む、実施形態６６のポリペプチド。

【0074】

実施形態６８．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、実施形態５５～６５のいずれか１つのポリペプチド。

【0075】

実施形態６９．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＡＭＰ－５１４、ＴＳＲ－０４２、ＳＴＩ－Ａ１１１０、イピリムマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブから選択される抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、実施形態６８のポリペプチド。

【0076】

実施形態７０．
前記少なくとも１つの抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態６８又は６９のポリペプチド。

【0077】

実施形態７１．
前記ポリペプチドは、重鎖定常領域を含み、前記ＶＨドメインは、前記重鎖定常領域に融合し、前記ＶＬドメインは、前記ＶＨドメインと結合している、実施形態６８又は６９のポリペプチド。

【0078】

実施形態７２．
前記ＶＬドメインは、軽鎖定常領域に融合している、実施形態７１のポリペプチド。

【0079】

実施形態７３．
前記軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダから選択される、実施形態７２のポリペプチド。

【0080】

実施形態７４．
前記抗原結合ドメインは、それぞれ同じである、実施形態５５～７３のいずれか１つのポリペプチド。

【0081】

実施形態７５．
前記抗原結合ドメインは、それぞれ同じ抗原に特異的に結合する、実施形態５５～７４のポリペプチド。

【0082】

実施形態７６．
前記抗原結合ドメインの少なくとも１つは、他の抗原結合ドメインの少なくとも１つとは異なる抗原に特異的に結合する、実施形態５５～７３のポリペプチド。

【0083】

実施形態７７．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合し、少なくとも１つの他の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１以外のＴ細胞抗原又はナチュラルキラー細胞抗原に特異的に結合する、実施形態５５～７３のいずれか１つのポリペプチド。

【0084】

実施形態７８．
少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１０７ａ、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、又はＣＤ１６ａに結合する、実施形態５５～７７のいずれか１つのポリペプチド。

【0085】

実施形態７９．
前記ポリペプチドは、生理学的条件下でホモ二量体を形成する、実施形態３１～７８のいずれか１つのポリペプチド。

【0086】

実施形態８０．
前記修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒに対するヒト野生型ＩＬ－２の親和性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い親和性でヒトＩＬ－２Ｒに結合する、実施形態１～７９のいずれか１つのポリペプチド。

【0087】

実施形態８１．
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、実施形態１～７９のいずれか１つのポリペプチドである、複合体。

【0088】

実施形態８２．
前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含む、実施形態８１の複合体。

【0089】

実施形態８３．
各Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプである、実施形態８１又は８２の複合体。

【0090】

実施形態８４．
各Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１である、実施形態８３の複合体。

【0091】

実施形態８５．
各Ｆｃ領域は、アミノ酸Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５の欠失を含む、実施形態８１～８４のいずれか１つの複合体。

【0092】

実施形態８６．
各Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ変異を含む、実施形態８１～８５のいずれか１つの複合体。

【0093】

実施形態８７．
前記Ｆｃ領域は、変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｌ又は変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖを含む、実施形態８１～８６のいずれか１つの複合体。

【0094】

実施形態８８．
前記第１のＦｃ領域又は前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方のＦｃ領域は、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、実施形態８１～８７のいずれか１つの複合体。

【0095】

実施形態８９．
前記第１のＦｃ領域又は前記第２のＦｃ領域は、Ｓ３５４Ｃ変異を含む、実施形態８８の複合体。

【0096】

実施形態９０．
各Ｆｃ領域は、独立して配列番号４７～配列番号８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態８１～８９のいずれか１つの複合体。

【0097】

実施形態９１．
前記第２のポリペプチドは、修飾ＩＬ２を含まない、実施形態８１～９０のいずれか１つの複合体。

【0098】

実施形態９２．
前記第１のポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施形態８１～９１のいずれか１つの複合体。

【0099】

実施形態９３．
前記第２のポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施形態８１～９２のいずれか１つの複合体。

【0100】

実施形態９４．
前記第１のポリペプチドは、第１の抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域、及び修飾ＩＬ－２を含む、実施形態８１～９３のいずれか１つの複合体。

【0101】

実施形態９５．
前記第１の抗原結合ドメインは、前記Ｆｃ領域のＮ末端に融合し、前記修飾ＩＬ－２は、前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合する、実施形態９４の複合体。

【0102】

実施形態９６．
前記第２のポリペプチドは、第２の抗原結合ドメイン及びＦｃ領域を含む、実施形態９４又は９５の複合体。

【0103】

実施形態９７．
前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、同じか又は異なる、実施形態９６の複合体。

【0104】

実施形態９８．
ａ）前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、どちらもＰＤ－１に結合し、
ｂ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＬＡＧ３に結合し、
ｃ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、
ｄ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、４－１ＢＢに結合し、
ｅ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０に結合し、
ｆ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲに結合し、
ｇ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、
ｈ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ｂに結合し、
ｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ４に結合し、
ｊ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ３０に結合し、
ｋ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、
ｌ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＩＧＩＴに結合し、
ｍ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、
ｎ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＢＲ２に結合し、
ｏ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｐ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１０７ａに結合し、
ｑ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＰＤ－１に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、
ｒ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｓ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ８ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｔ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｕ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｗ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｘ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＧＦＲβＲ２に結合し、
ｙ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｓに結合し、
ｚ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＬＡＧ３に結合し、
ａａ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、Ｔｉｍ３に結合し、
ｂｂ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０に結合し、
ｃｃ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲに結合し、
ｄｄ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１０７ａに結合し、
ｅｅ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＴＬＡ－４に結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６に結合し、又は、
ｆｆ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＩＣＯＳに結合し、かつ前記第２の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲ２に結合する、実施形態９７の複合体。

【0105】

実施形態９９．
前記修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒに対するヒト野生型ＩＬ－２の親和性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い親和性でヒトＩＬ－２Ｒに結合する、実施形態８１～９８のいずれか１つの複合体。

【0106】

実施形態１００．
実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【0107】

実施形態１０１．
実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体をコードする単離された核酸。

【0108】

実施形態１０２．
実施形態１０１の核酸を含む発現ベクター。

【0109】

実施形態１０３．
実施形態１０１の核酸又は実施形態１０２の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。

【0110】

実施形態１０４．
実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体を発現する単離された宿主細胞。

【0111】

実施形態１０５．
実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で実施形態１０３又は１０４の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【0112】

実施形態１０６．
前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、実施形態１０５の方法。

【0113】

実施形態１０７．
ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる方法であって、Ｔ細胞を実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体と接触させることを含む、方法。

【0114】

実施形態１０８．
前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、実施形態１０７の方法。

【0115】

実施形態１０９．
前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、実施形態１０７の方法。

【0116】

実施形態１１０．
前記増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍である、実施形態１０７～１０９のいずれか１つの方法。

【0117】

実施形態１１１．
ＮＫ細胞増殖を増加させる方法であって、ＮＫ細胞を実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体と接触させることを含む、方法。

【0118】

実施形態１１２．
前記増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍である、実施形態１１１の方法。

【0119】

実施形態１１３．
癌を治療する方法であって、癌を伴う被験体に実施形態１～８０のいずれか１つのポリペプチド、又は実施形態８１～９９のいずれか１つの複合体、又は実施形態１００の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0120】

実施形態１１４．
前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、実施形態１１３の方法。

【0121】

実施形態１１５．
追加の療法剤を投与することを更に含む、実施形態１１３又は１１４の方法。

【0122】

実施形態１１６．
前記追加の療法剤は、抗癌剤である、実施形態１１５の方法。

【0123】

実施形態１１７．
前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、実施形態１１６の方法。

【0124】

実施形態１１８．
前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、実施形態１１６又は１１７の方法。

【0125】

実施形態１１９．
前記抗癌生物製剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１を阻害する作用物質である、実施形態１１８の方法。

【0126】

実施形態１２０．
前記抗癌生物製剤は、ＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴを阻害する作用物質である、実施形態１１８の方法。

【0127】

実施形態１２１．
前記抗癌剤は、抗体である、実施形態１１６～１２０のいずれか１つの方法。

【0128】

実施形態１２２．
前記抗癌生物製剤は、サイトカインである、実施形態１１８の方法。

【0129】

実施形態１２３．
前記抗癌剤は、ＣＡＲ－Ｔ療法薬である、実施形態１１６の方法。

【0130】

実施形態１２４．
前記抗癌剤は、腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１１６の方法。

【0131】

実施形態１２５．
腫瘍切除及び／又は放射線療法を更に含む、実施形態１１３～１２４のいずれか１つの方法。

【図面の簡単な説明】

【0132】

【図1A-1H】様々なＩＬ－２融合タンパク質のフォーマットの概略を示す図である。図１Ａは、ヘテロ二量体ノブインホール（knob-in-hole）ＩｇＧ１ ＦｃのＮ末端に連結されたＩＬ－２を示す。図１Ｂは、シングルドメイン抗体のヘテロ二量体ＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端に連結されたＩＬ－２を示す。図１Ｃ～図１Ｅは、１つのＶＨＨ（図１Ｅ）、２つの同一のＶＨＨ（図１Ｃ）、又は２つの異なるＶＨＨ（図１Ｄ）に連結されたＩＬ－２を示す。図１Ｆは、従来の抗体のホモ二量体重鎖定常領域のＣ末端に連結されたＩＬ－２を示す。図１Ｇは、従来の抗体のヘテロ二量体重鎖定常領域のＣ末端に連結されたＩＬ－２を示す。図１Ｈは、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体のＣ末端に融合されたＩＬ－２を示す。

【図2A-2C】フローサイトメトリーによって測定される、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＣＤ１３２）の様々な組合せを一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞に対する、図１Ａに示されるようにヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合された野生型ＩＬ－２（図２Ａ）又は修飾ＩＬ－２（図２Ａ～図２Ｃ）を含むＩＬ－２融合タンパク質の結合を示す図である。「ＵＴ ２９３Ｆ」は、トランスフェクションされていない２９３Ｆ細胞を示す。

【図3A-3B】フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ２５及びＣＤ１２２を一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞に対する、図１Ａに示されるようにヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の結合を示す図である。

【図4A-4B】フローサイトメトリーによって測定される、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２、又はＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＣＤ１３２を一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞に対する、図１Ａに示されるようにヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の結合を示す図である。

【図5A-5B】フローサイトメトリーによって測定される、休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の結合を示す図である。「アイソタイプコントロール」は、ＩＬ－２を含まないコントロールタンパク質を示す。

【図6A-6B】フローサイトメトリーによって測定される、濃縮された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、図６Ａ）、誘導された制御性Ｔ細胞（誘導されたＴｒｅｇ、図６Ｂ）、及び濃縮されたレスポンダーＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｓｐ、図６Ｃ）に対する、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の結合を示す図である。

【図7A-7D】休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の活性を示す図である。増殖（図７Ａ及び図７Ｃ）及びＣＤ７１レベル（図７Ｂ及び図７Ｄ）を測定した。図７Ｅ及び図７Ｆは、細胞内リン酸化ＳＴＡＴ５レベルのフローサイトメトリー検出によって測定される、休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２の活性を示す。「アイソタイプ」は、ＩＬ－２を含まないコントロールタンパク質を示す。

【図8A-8B】図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又は修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質での７日間の処理後の濃縮されたＴｒｅｇの活性化のマーカーとしての増殖及びＣＤ２５レベルを示す図である。

【図9A-9D】ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するペンブロリズマブ、図１Ｆに示されるようにＩＬ－２－ＲＡＳが重鎖Ｃ末端に融合されたペンブロリズマブの類縁体、及びＩＬ－２－ＲＡＳ単独（図９Ｃ及び図９Ｄ）の活性及び結合を示す図である。ＣＤ８^＋（図９Ａ）及びＣＤ４^＋（図９Ｂ）Ｔ細胞に対する活性をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔのフローサイトメトリー検出によって測定した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図９Ｃ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図９Ｄ）に対する結合の程度をフローサイトメトリーによって測定した。

【図10A-10D】ＩＬ－２に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖の誘導の依存性を示す図である。プレブロッキング（pre-blocking）を行わない（図１０Ａ及び図１０Ｂ）又は飽和濃度のペンブロリズマブでプレブロッキングした（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）場合のＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１０Ａ及び図１０Ｃ）又はＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）の増殖に対するペンブロリズマブ、非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳ、及び図１Ｆに示されるようにＩＬ－２－ＲＡＳが重鎖Ｃ末端に融合されたペンブロリズマブの類縁体の影響を示す。

【図11】図１Ｆに示されるようにＩＬ－２－ＲＡＳが重鎖Ｃ末端に融合されたペンブロリズマブの類縁体、並びに図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ、及び図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２によるＣＤ４^＋Ｔレスポンダー（Ｔｒｅｓｐ）細胞増殖の回復を示す図である。Ｔｒｅｓｐ増殖をＣＤ３結合（Ｔｒｅｓｐ＋ビーズ）によって誘導した後、自家制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を用いて抑制した。「Ｔｒｅｓｐ＋ビーズ」の線は、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下でのＣＤ３結合によるベースラインＴｒｅｓｐ細胞増殖を示す。「Ｎｏ Ａｂ」の線は、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でのＣＤ３結合によるベースラインＴｒｅｓｐ細胞増殖を示す。

【図12A-12B】プレートに結合した、図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された非標的化野生型ＩＬ－２（「ＩＬ－２ ＷＴ」）又はＩＬ－２－ＲＡＳによるＴ細胞のトランス活性化を示す図である。Ｔ細胞活性化を細胞内リン酸化ＳＴＡＴ５レベルのフローサイトメトリー検出によって測定した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１２Ａ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）の応答を示す。

【図13A-13I】ＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する、図１Ｈに示されるようにＮＫｐ４６を標的とするヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体のＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ、ＮＫｐ４６を標的とするヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体単独、及び図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又はＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質の活性及び結合を示す図である。ＮＫ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１３Ｃ）の増殖、並びにＮＫ細胞（図１３Ｄ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１３Ｅ）、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１３Ｆ）のｐＳＴＡＴレベルをフローサイトメトリーによって測定した。ＮＫ細胞（図１３Ｇ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１３Ｈ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１３Ｉ）に対する指定のポリペプチドの結合もフローサイトメトリーによって測定した。

【図14A-14H】ＣＤ８^＋Ｔ細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する、図１Ｇに示されるように従来の抗ＬＡＧ３ヘテロ二量体抗体（ＭＡｂ）のＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃを有する抗ＬＡＧ３ ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ、図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ、図１Ｂに示されるように非標的化ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２、又はＩＬ－２を有しないＬＡＧ３標的化ＭＡｂ若しくはＬＡＧ３標的化ＶＨＨ－Ｆｃ分子の活性及び結合を示す図である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１４Ａ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１４Ｂ）の増殖、並びにＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１４Ｃ及び図１４Ｅ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１４Ｄ及び図１４Ｆ）上での活性化マーカーＣＤ２５（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）及びＣＤ７１（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）の発現をフローサイトメトリーによって測定した。図１４Ｇ及び図１４Ｈは、活性化前（pre-activated）ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１４Ｇ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１４Ｈ）に対する結合を示す。

【図15】ＶＨＨの標的抗原を発現せず、したがってレポーター遺伝子の誘導について過剰発現されたＩＬ－２受容体に対する修飾ＩＬ－２の結合のみに依存するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞に対する、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃを有するＶＨＨのＣ末端に融合された指定の修飾ＩＬ－２を含む融合タンパク質の活性を示す図である。レポーター細胞においてｐＳＴＡＴ５シグナル伝達のＩＬ－２受容体媒介性誘導に応答して発現された分泌型胚性アルカリホスファターゼの活性を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0133】

本明細書に示される実施形態は、Ｔ細胞の活性を調節する修飾ＩＬ－２を含むポリペプチド、及び癌を治療する様々な方法におけるそれらの使用に関する。

【0134】

定義及び様々な実施形態
本明細書に使用されるセクションの見出しは編成のみを目的とし、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

【0135】

特許出願、特許公報、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすと具体的かつ個別に示されているかのように、引用することにより本明細書の一部をなす。

【0136】

本明細書に記載又は参照される技術及び手順は、一般に十分に理解されており、通常、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. AuSable, et al. eds., (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)、PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994）、Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)並びにそれらの最新版に記載される広く利用されている方法論等の当業者による慣例的な方法論を用いて使用される。

【0137】

別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段の要求がない限り、又は明白に特段の指示がない限り、単数名辞は複数を含み、複数名辞は単数を含むものとする。様々な出典又は参考文献の間での定義の矛盾については、本明細書に示される定義が優先される。

【0138】

一般に、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)でのようなＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔでのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

【0139】

本明細書に記載される本発明の実施形態は、「からなる（consisting）」実施形態及び／又は「から本質的になる（consisting essentially of）」実施形態を含むと理解される。本明細書で使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、特段の指示がない限り複数の参照を含む。本明細書での「又は」という用語の使用は、選択肢が互いに排他的であることを意味すると解釈されない。

【0140】

本出願では、「又は」の使用は、明白に特段の指定がない限り又は当業者によって理解されない限り、「及び／又は」を意味する。多項従属請求項の文脈では、「又は」の使用は、２項以上の先行する独立請求項又は従属請求項を引用する。

【0141】

「参照試料」、「参照細胞」、又は「参照組織」という語句は、少なくとも１つの未知の特徴を有する試料との比較として使用され得る少なくとも１つの既知の特徴を有する試料を示す。幾つかの実施形態では、参照試料は、陽性又は陰性の指標として使用され得る。参照試料を使用することで、未知の特徴を有する試料中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルに対して、例えば、健康な組織中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを確立することができる。幾つかの実施形態では、参照試料は、同じ被験体に由来するが、試験される部分とは異なる被験体の部分に由来する試料である。幾つかの実施形態では、参照試料は、癌を取り囲む又は癌に隣接する組織領域に由来する試料である。幾つかの実施形態では、参照試料は、試験される被験体に由来するものではなく、対象の障害（例えば、特定の癌又はＴ細胞関連障害）を有する又は有しないことが既知の被験体に由来する試料である。幾つかの実施形態では、参照試料は、同じ被験体に由来するものであるが、被験体が癌を発症する前の時点での試料である。幾つかの実施形態では、参照試料は、同じ被験体又は異なる被験体からの良性癌試料に由来する試料である。比較のために陰性参照試料が使用される場合に、陰性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、該分子が存在しない及び／又は低いレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。比較のために陽性参照試料が使用される場合に、陽性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、或るレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。

【0142】

療法剤の投与から恩恵を受ける又は療法剤の投与に応答するという文脈において本明細書で使用される「便益」、「臨床的便益」、「応答性」、及び「治療的応答性」という用語は、様々なエンドポイント、例えば、減速及び完全な停止を含む疾患進行の或る程度の抑止、疾患エピソード及び／又は症状の数の減少、病変サイズの縮小、隣接する末梢器官及び／又は末梢組織内への疾患細胞浸潤の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、病気蔓延の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、障害に関連する１つ以上の症状の或る程度の軽減、治療後の無病提示、例えば無増悪生存期間の長さの増加、全生存期間の延長、より高い奏効率、及び／又は治療後の所与の時点での死亡率の低下を評価することによって推し量ることができる。「非応答性」又は「応答しない」被験体又は癌は、「応答する」という上記の条件を満たさないものである。

【0143】

「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し得る。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然及び／又は非天然のヌクレオチドを含み、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含み得る。「核酸配列」は、核酸分子又はポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの線状配列を指す。

【0144】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、及び多量体を含み得る。この定義には、完全長タンパク質及びその断片の両方が含まれる。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本開示の目的で、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換等の修飾（一般に性質について保存的）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるような意図的なものであり得る、又はタンパク質を産生する宿主の変異若しくはＰＣＲ増幅によるエラーによるような偶発的なものであり得る。「アミノ酸配列」は、ポリペプチド又はタンパク質に含まれるアミノ酸の線状配列を指す。

【0145】

本明細書で使用される「ＩＬ－２」又は「インターロイキン－２」は、細胞内でのＩＬ－２前駆体のプロセシングから生ずるあらゆる天然の成熟ＩＬ－２を指す。この用語は、特段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル又はアカゲザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのＩＬ－２を含む。この用語はまた、スプライス変異体又はアレル変異体等のＩＬ－２の天然に存在する変異体を含む。非限定的な例示的なヒトＩＬ－２アミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５７７．２に示されている。配列番号１（成熟型）を参照されたい。

【0146】

本明細書で使用される「修飾ＩＬ－２」は、少なくとも１つのアミノ酸位置での置換により野生型ＩＬ－２アミノ酸配列とは異なるポリペプチドを指す。

【0147】

抗原又はエピトープに「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当該技術分野で十分に知られている。別の細胞又は物質と反応又は会合するよりも特定の細胞又は物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合に、分子は「特異的な結合」又は「優先的な結合」を示すと言及される。抗原結合ドメインは、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合に、抗原に「特異的に結合」又は「優先的に結合」する。例えば、エピトープに特異的に又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、同じ標的抗原上の他のエピトープ又は他の標的抗原上のエピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこのエピトープと結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドである。また、この定義を解釈することにより、例えば、第１の抗原に特異的又は優先的に結合する抗原結合ドメインが、第２の抗原に特異的又は優先的に結合し得る又は結合し得ないことも理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るものの）必ずしも必要としない。一般に、必ずしもそうとは限らないが、結合への言及は優先的な結合を意味する。「特異性」は、結合性タンパク質が抗原に選択的に結合する能力を指す。

【0148】

本明細書で使用される場合に、ＩＬ－２の活性に関する「調節する」という用語は、ＩＬ－２の活性の変化を指す。幾つかの実施形態では、「調節する」とは、ＩＬ－２活性の増加を指す。

【0149】

本明細書で使用される場合に、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、抗原結合ドメイン含有ポリペプチド）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質等の抗原）上の部位を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸、ポリペプチド、又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面編成物を含み、特定の３次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。エピトープは、標的分子の連続残基及び／又は並置された非連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、通常、変性溶剤への曝露で保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶剤による処理で失われる。エピトープは、限定されるものではないが、少なくとも３個、少なくとも５個、又は８個～１０個の残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態では、エピトープは、２０残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）未満、１５残基未満、又は１２残基未満の長さである。２つの抗体は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合に、抗原内の同じエピトープに結合し得る。幾つかの実施形態では、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基との或る特定の最小距離によって特定され得る。幾つかの実施形態では、エピトープは、上記距離によって特定され得て、抗原結合分子の残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与するそれらの残基に更に限定され得る。エピトープは、様々なスキャンによっても同様に特定され得る。例えば、アラニンスキャン又はアルギニンスキャンは、抗原結合分子が相互作用し得る１つ以上の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基のセットは、特定の抗原結合ドメイン又は分子に対するエピトープの一部であることから他の残基を除外するものではない。むしろ、そのようなセットの存在は、最小のエピトープの列（又は種類のセット）を示す。したがって、幾つかの実施形態では、エピトープとして特定された残基のセットは、抗原上のエピトープについての残基の排他的リストではなく、抗原に関連する最小のエピトープを示す。

【0150】

「非線状エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子（例えば、抗原結合ドメイン含有ポリペプチド）が結合する抗原性タンパク質内の非連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの残基がエピトープの他の示された残基と非連続的であるが、１つ以上の残基が他の残基と連続的である場合もある。

【0151】

「線状エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子（例えば、抗原結合ドメイン含有ポリペプチド）が結合する抗原性タンパク質内の連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態では、線状エピトープ内の残基の全てが、抗原結合分子によって直接的に結合される（又は結合に関与する）必要があるわけではないことに留意されたい。幾つかの実施形態では、線状エピトープは、事実上線状エピトープの配列からなるペプチドによる免疫化に由来し得る、又はタンパク質の残部から相対的に分離されたタンパク質の構造区間に由来し得る（こうして、抗原結合分子は、少なくとも主として、まさにその配列区間と相互作用し得る）。

【0152】

「抗体」及び「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で区別なく使用され、限定されるものではないが、慣例的な抗体（典型的には、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、典型的には重鎖に類似している１つだけの鎖を含む）、ＶＨＨ含有ポリペプチド（少なくとも１つの重鎖のみの抗体可変ドメイン、すなわちＶＨＨを含むポリペプチド）、及び所望の抗原結合活性を示す限り上述のいずれかのフラグメントを含む抗原結合ドメインを含む様々なポリペプチドを包含する。幾つかの実施形態では、抗体は二量体化ドメインを含む。そのような二量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＣＨ１は典型的には、軽鎖定常ドメインＣＬと対をなす一方で、ヒンジは二量体化を介在する）及びＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ヒンジは二量体化を介在する）が挙げられる。抗体という用語には、限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びラクダ（ラマを含む）、サメ、マウス、ヒト、カニクイザル等の様々な種の抗体も含まれる。

【0153】

「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、単一の単量体ドメイン、典型的には、軽鎖を有しない重鎖（又はＶＨＨ）を有する抗体を指すために、本明細書では区別なく使用される。

【0154】

本明細書で使用される「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨドメイン」又は「ＶＨＨ抗原結合ドメイン」という用語は、ラクダ抗体又はサメ抗体等のシングルドメイン抗体の抗原結合部分を指す。幾つかの実施形態では、ＶＨＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と表される３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域とを含む。幾つかの実施形態では、ＶＨＨは、ＶＨＨが実質的に抗原結合及び特異性を維持する限り、部分的なＦＲ１及び／又はＦＲ４のみを含むように又はそれらのフレームワーク領域の一方若しくは両方を欠くように、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよい。

【0155】

「ＶＨＨ含有ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、ＶＨＨポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つ以上のＶＨＨドメインを含み、ここで、各ＶＨＨドメインは、同じ又は異なっていてもよい。幾つかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。幾つかのそのような実施形態では、ＶＨＨポリペプチドは、二量体を形成し得る。ＶＨＨ含有ポリペプチドの非限定的な構造としては、ＶＨＨ_１－Ｆｃ、ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ、及びＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが挙げられ、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３は、同じ又は異なっていてもよい。そのような構造の幾つかの実施形態では、或るＶＨＨは、リンカーによって別のＶＨＨに連結され得る、又は或るＶＨＨは、リンカーによってＦｃに連結され得る。幾つかのそのような実施形態では、リンカーは、１個～２０個のアミノ酸、好ましくは、主にグリシン及び任意にセリンから構成される１個～２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ＶＨＨ含有ポリペプチドがＦｃを含む場合に、それは二量体を形成する。したがって、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、四価であるとみなされる（すなわち、二量体は４つのＶＨＨドメインを有する）。同様に、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、六価であるとみなされる（すなわち、二量体は６つのＶＨＨドメインを有する）。

【0156】

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団の抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを含む）を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、モノクローナル抗体の試料は、抗原上の同じエピトープに結合することができる。「モノクローナル」という修飾成句は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離され得る。

【0157】

「ＣＤＲ」という用語は、少なくとも１つの当業者に対する特定様式によって定義される相補性決定領域を示す。幾つかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組合せ、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義（contact definition）のいずれかに従って定義され得る。ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲを含む。

【0158】

本明細書で使用される「重鎖定常領域」という用語は、少なくとも３つの重鎖定常ドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む領域を指す。当然ながら、ドメイン内の機能を変えない欠失及び改変は、特段の指定がない限り、「重鎖定常領域」という用語の範囲内に含まれる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、γ、δ、及びαが挙げられる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、ε及びμも挙げられる。それぞれの重鎖定常領域は、１つの抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体はＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体はＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体はＩｇＡ抗体である。さらに、μ定常領域を含む抗体はＩｇＭ抗体であり、ε定常領域を含む抗体はＩｇＥ抗体である。或る特定のアイソタイプは、更にサブクラスに細分化され得る。例えば、ＩｇＧ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１（γ_１定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ２（γ_２定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ３（γ_３定常領域を含む）抗体、及びＩｇＧ４（γ_４定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＡ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＡ１（α_１定常領域を含む）抗体及びＩｇＡ２（α_２定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＭ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられる。

【0159】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖定常領域の一部を指す。幾つかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。様々な実施形態では、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合に、ヒンジは、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を介在する。Ｆｃ領域は、本明細書で論じられる任意の抗体重鎖定常領域アイソタイプのものであり得る。幾つかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。

【0160】

本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書で論じられるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができる、又はアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施形態では、アミノ酸の変化の数は、ＶＨＨ等の単一の抗原結合ドメイン内の全てのヒトフレームワークにわたって１０個未満、又は９個未満、又は８個未満、又は７個未満、又は６個未満、又は５個未満、又は４個未満、又は３個未満である。

【0161】

「親和性」は、分子（例えば、抗体又はＶＨＨ含有ポリペプチド）の単一の結合部位及びその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の合計の強さを指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性又は見かけの親和性は、一般に、それぞれ解離定数（Ｋ_Ｄ）又はＫ_{Ｄ（見かけ）}によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されている方法を含む、当該技術分野で既知の通常の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ、ＫｉｎＥｘＡ、フローサイトメトリー、及び／又は表面プラズモン共鳴デバイス等）によって測定され得る。このような方法としては、限定されるものではないが、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｏｃｔｅｔ（商標）、又はフローサイトメトリーを要する方法が挙げられる。

【0162】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、抗原結合分子／抗原相互作用の平衡解離定数を指す。本明細書で「Ｋ_Ｄ」という用語が使用される場合に、それには、Ｋ_Ｄ及びＫ_{Ｄ（見かけ）}が含まれる。

【0163】

幾つかの実施形態では、抗原結合分子のＫ_Ｄは、フローサイトメトリーによって、抗原発現細胞系統を使用し、各抗体濃度で測定された平均蛍光を非線形１サイト結合方程式（graphpad社のＰｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にフィッティングして測定される。幾つかのそのような実施形態では、Ｋ_ＤはＫ_{Ｄ（見かけ）}である。

【0164】

「生物学的活性」という用語は、分子の任意の１つ以上の生物学的特性（ｉｎ ｖｉｖｏで見られるように天然に存在するか、又は組換え手段によって提供される若しくは可能となるかどうか）を指す。生物学的特性としては、限定されるものではないが、リガンドの結合、細胞増殖（Ｔ細胞増殖等）の誘導又は増加、及びサイトカインの発現の誘導又は増加が挙げられる。

【0165】

本明細書で使用される「ＩＬ－２活性」又はＩＬ－２の「生物学的活性」という用語には、ＩＬ－２の任意の生物学的作用又は生物学的関連機能の少なくとも１つが含まれる。幾つかの実施形態では、ＩＬ－２活性としては、ＩＬ－２がＴ細胞増殖を誘導し、及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する能力が挙げられる。非限定的な例示的なＩＬ－２活性としては、ｐＳＴＡＴ５発現の増加、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加、Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現の増加、並びにＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化及び増殖に対するＴｒｅｇ細胞の抑制活性の低下が挙げられる。

【0166】

「アゴニスト」抗体又は「活性化」抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド等）は、標的抗原の生物学的活性を増加及び／又は活性化する抗体である。幾つかの実施形態では、アゴニスト抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上増加させる。

【0167】

「アンタゴニスト」抗体、「ブロッキング」抗体、又は「中和」抗体は、標的抗原の生物学的活性を低下及び／又は不活性化する抗体である。幾つかの実施形態では、中和抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上低下させる。

【0168】

「親和性成熟」ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原に対する親和性に改善をもたらす改変を有しない親ＶＨＨ含有ポリペプチドと比較して１つ以上のＣＤＲに１つ以上のそのような改変を有するＶＨＨ含有ポリペプチドを指す。

【0169】

本明細書で使用される「ヒト化ＶＨＨ」は、１つ以上のフレームワーク領域が実質的にヒトフレームワーク領域で置き換えられたＶＨＨを指す。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンの或る特定のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化ＶＨＨは、当初のＶＨＨにもヒトフレームワーク配列にも見られないが、ＶＨＨ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの性能を更に改良及び最適化するために含まれる残基を含み得る。幾つかの実施形態では、ヒト化ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ヒトＦｃ領域を含む。理解されるように、ヒト化配列は、その一次配列によって特定され得て、必ずしも抗体が作製された過程を示すわけではない。

【0170】

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、並びにＢ細胞活性化等が挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを要し、様々なアッセイを使用して評価することができる。

【0171】

「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域としては、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）、天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、並びにそれらの天然に存在する変異体が挙げられる。

【0172】

「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、天然配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、約１個～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１個～約５個のアミノ酸置換を有する。幾つかの実施形態では、本明細書の変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、それらと少なくとも約９０％の配列同一性、それらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

【0173】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載している。幾つかの実施形態では、ＦｃγＲは、天然のヒトＦｃＲである。幾つかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体であって、これらの受容体のアレル変異体及び選択的スプライシングされた形態を含む受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有するが、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)、Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)、及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)でレビューされている。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語によって包含される。例えば、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、胎児性受容体ＦｃＲｎを含み、これは、母体のＩｇＧの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）及び免疫グロブリンの恒常性の調節の役割を担う。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)、Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)、国際公開第２００４／９２２１９号（Hintonら）を参照されたい）。

【0174】

本明細書で使用される「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、当業者が２つ以上の値の間の差を、上記値によって測定される生物学的特徴の文脈内で生物学的意義及び／又は統計学的有意性が殆どない又は全くないとみなすような、２つ以上の数値の間の十分に高度な類似性を示す。幾つかの実施形態では、２つ以上の実質的に同様の値は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％のいずれか１つの概数以下だけ異なる。

【0175】

ポリペプチド「変異体」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、天然配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体としては、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されているポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態では、変異体は、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、変異体は、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0176】

本明細書で使用される場合に、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は抗体配列に関する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」及び「ホモロジー」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、特定のペプチド配列又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントのアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（DNASTAR社）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技能の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0177】

アミノ酸置換には、限定されるものではないが、ポリペプチド中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置き換えることが含まれ得る。例示的な置換を表１に示す。アミノ酸置換を対象の抗体に導入し、産物を所望の活性、例えば、抗原若しくはレセプター結合の保持／改善、抗原若しくはレセプター結合の減少、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【0178】

【表1】

【0179】

共通の側鎖特性に従ってアミノ酸をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

【0180】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。

【0181】

「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得る、クローニングされたポリヌクレオチド（単数又は複数）を含むように操作することができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、以下のエレメントのうちの１つ以上を含み得る：複製起点、対象のポリペプチドの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等）、及び／又は１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及び比色アッセイで使用することができる遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ等）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において対象のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを指す。

【0182】

「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得る又はレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例示的な真核細胞としては、霊長類動物細胞又は非霊長類動物細胞等の哺乳動物細胞、酵母等の真菌細胞、植物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞としては、限定されるものではないが、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びに２９３Ｆ細胞及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの派生物、例えば２９３－６Ｅ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、及びＣＨＯ－ＤＳ細胞が挙げられる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれるが、自然変異、偶発変異、又は意図的変異のため、子孫は必ずしも当初の親細胞と完全に同一（形態又はゲノムＤＮＡ相補において）であるとは限らない。宿主細胞には、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（複数の場合もある）と共にｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞も含まれる。

【0183】

本明細書で使用される「単離された」という用語は、典型的に天然に一緒に見出される又は一緒に産生される成分の少なくとも幾つかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合に、ポリペプチドを含む上清を、それを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的に天然に見られるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合に、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合に、又は例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合に、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。

【0184】

「個体」及び「被験体」という用語は、動物、例えば哺乳動物を指すために本明細書では区別なく使用される。幾つかの実施形態では、限定されるものではないが、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物競技用動物（sport animals）、及び哺乳動物ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。幾つかの例では、「個体」又は「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする個体又は被験体を指す。幾つかの実施形態では、治療を受ける被験体は、被験体が治療に関連する障害を有する又は障害を患う十分なリスクがあると特定されたことを表す患者であり得る。

【0185】

本明細書で使用される「疾患」又は「障害」は、治療が必要とされる及び／又は所望される状態を指す。

【0186】

「腫瘍細胞」、「癌細胞」、「癌」、「腫瘍」、及び／又は「新生物」という用語は、特段の指定がない限り、本明細書では区別なく使用され、身体器官及び系の正常な機能を妨げる制御不能な増殖及び／又は異常な細胞生存の増加及び／又はアポトーシスの阻害を示す細胞（又は複数の細胞）を指す。この定義には、良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに潜伏腫瘍又は微小転移が含まれる。

【0187】

「癌」及び「腫瘍」という用語は、固形癌及び血液癌／リンパ腺癌を包含するとともに、異形成等の悪性腫瘍、前悪性腫瘍、及び良性腫瘍も包含する。また、この定義には、免疫系（例えば、免疫回避メカニズム及び免疫エスケープメカニズム）によって妨げられない異常な増殖を伴う細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。例示的な癌としては、限定されるものではないが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、並びにその他の癌腫及び肉腫、並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫等）及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖が挙げられる。

【0188】

本明細書で使用される「非腫瘍細胞」という用語は、正常な細胞又は組織を指す。例示的な非腫瘍細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、間質性腎臓細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、骨芽細胞、及び乳房、骨格筋、膵臓、胃、卵巣、小腸、胎盤、子宮、精巣、腎臓、肺、心臓、脳、肝臓、前立腺、結腸、リンパ器官、骨に位置する細胞、及び骨由来の間葉系幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される「末梢に位置する細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞の近く及び／又は腫瘍微小環境内に位置しない非腫瘍細胞を指す。

【0189】

本明細書で使用される「腫瘍微小環境内の細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞を取り囲む及び／又は腫瘍細胞に栄養を与える細胞、分子、細胞外マトリックス及び／又は血管を指す。例示的な腫瘍微小環境内の細胞又は組織としては、限定されるものではないが、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、マクロファージ、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞が挙げられる。腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境内に位置する細胞／組織を特定する方法は、本明細書で以下に記載されるように当該技術分野で十分に知られている。

【0190】

幾つかの実施形態では、「増加」又は「減少」は、それぞれ、統計学的に有意な増加又は減少を指す。当業者に明らかであるように、「調節」はまた、試験作用物質が存在することを除き同じ条件と比較した、標的又は抗原のそのリガンド、結合相手、ホモ多量体形若しくはヘテロ多量体形へと会合する相手又は基質の１つ以上に対する親和性、アビディティー、特異性及び／又は選択性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、標的又は抗原が存在する培地又は環境における１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、及び／又は細胞増殖若しくはサイトカイン産生を含み得る。これは、関与する標的に応じて、それ自体が既知の又は本明細書に記載される任意の適切な方法で及び／又は任意の適切なアッセイを使用して決定され得る。

【0191】

本明細書で使用される場合に、「免疫応答」は、疾患（例えば、癌又は癌転移）の発症を抑止若しくは未然防止する又はその症状を改善するのに十分である細胞性免疫応答及び／又は体液性免疫応答を包含することが意図される。「免疫応答」は、自然免疫系及び適応免疫系の両方の側面を包含し得る。

【0192】

本明細書で使用される場合に、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書で使用される「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患用の療法薬の任意の投与又は適用を対象とする。本開示の目的では、有益な又は所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の進展（例えば、転移、例えば肺又はリンパ節への転移）の未然防止又は遅延、疾患の再発の未然防止又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患又は疾患の進行の抑止、疾患又はその進行の抑止又は減速、その発達の阻止、及び寛解（部分的でも全体的でも）のいずれか１つ以上が挙げられる。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果の軽減も含まれる。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図している。上記に従って、治療という用語は、障害の全ての側面を１００パーセント除去する必要はない。

【0193】

「改善する」とは、療法剤を投与しない場合と比べて、１つ以上の症状が軽減又は向上することを意味する。「改善」には、症状の持続期間が短縮又は減少することも含まれる。

【0194】

「抗癌剤」という用語は、本明細書では、その最も広い意味で、１つ以上の癌の治療に使用される作用物質を指すために使用される。そのような作用物質の例示的なクラスとしては、限定されるものではないが、化学療法剤、抗癌生物製剤（サイトカイン、受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物、及び抗体等）、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ等）、及び腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。

【0195】

「生体試料」という用語は、生きている生き物又はかつて生きていた生き物からの或る量の物質を意味する。そのような物質としては、限定されるものではないが、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、及び脾臓が挙げられる。

【0196】

「コントロール」又は「参照」という用語は、分析物を含まないことが既知の組成物（「ネガティブコントロール」）又は分析物を含むことが既知の組成物（「ポジティブコントロール」）を指す。ポジティブコントロールは、既知の濃度の分析物を含み得る。

【0197】

「抑止」又は「抑止する」という用語は、任意の表現型特徴の減少若しくは停止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低減する」又は「抑止する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる、低減する、又は停止することである。幾つかの実施形態では、「低減する」又は「抑止する」とは、１０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態では、「低減する」又は「抑止する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態では、「低減する」又は「抑止する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態では、上記の量は、或る期間にわたって、同じ期間にわたるコントロールに対して抑止又は減少される。

【0198】

本明細書で使用される場合に、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患（癌等）の発症を遅らせる、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化させる、抑制する、及び／又は引き延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／又は治療される個体に応じて、様々な長さの時間となり得る。当業者に明らかであるように、十分な又は大幅な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で未然防止を包含し得る。例えば、転移の発生等の末期癌を遅延させることができる。

【0199】

本明細書で使用される「未然防止」は、疾患の素因を有し得るが、まだ疾患と診断されていない被験体における疾患の発生又は再発に対する予防をもたらすことを含む。特段の指示がない限り、「低減する」、「抑止する」、又は「未然防止する」という用語は、全期間にわたる完全な未然防止を示すのではなく又は必要とするのではなく、測定される期間だけにわたる未然防止を示す又は必要とする。

【0200】

物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが個体において所望の応答を誘発する能力等の要因によって変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な作用が物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の有毒作用又は有害作用を上回る量である。治療有効量は、１回以上の投与で送達され得る。治療有効量は、必要な投与量で必要な時間にわたって、所望の治療的結果及び／又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0201】

「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、有効成分（複数の場合もある）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤を投与する被験体に対して許容不可能なほど有毒な追加の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は滅菌され得る。

【0202】

「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に投与するための「医薬組成物」を一緒に含む療法剤とともに使用される当該技術分野において慣用の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容可能な担体は、使用される製剤にとって適切である。

【0203】

１つ以上の更なる療法剤と「組み合わせて」の投与には、同時（併用）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。

【0204】

「同時に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、又は１つの療法剤の投与が他の療法剤の投与に対して短い期間に含まれる、又は両方の療法剤の治療効果が少なくとも或る期間にわたり重複する、投与を指すために使用される。

【0205】

「連続的に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、時間的に重複しない、又は療法剤の治療効果が重複しない、投与を指すために使用される。

【0206】

本明細書で使用される場合に、「～と組み合わせて」は、或る治療法の施与に別の治療法を加えることを指す。したがって、「～と組み合わせて」は、或る治療法を、個体に他の治療法を施す前、その間、又はその後に施すことを指す。

【0207】

「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれる使用説明書であって、そのような治療製品の使用に関する指示、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、使用説明書を指すために使用される。

【0208】

「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患若しくは障害（例えば、癌）の治療用の医薬、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）又はキットである。幾つかの実施形態では、製造物又はキットは、本明細書に記載される方法を実施するユニットとして宣伝、配送、又は販売される。

【0209】

「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、例えば、抗体又は抗原に結合されて、特異的結合ペアのメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能にする部分を意味する。特異的結合ペアの標識されたメンバーは、「検出可能に標識された」と称される。したがって、「標識された結合性タンパク質」という用語は、結合性タンパク質の特定をもたらす標識が組み込まれたタンパク質を指す。幾つかの実施形態では、標識は、視覚的に又は機器的手段により検出可能なシグナルを生成し得る検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み又はマーキングされたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光学的方法若しくは比色法により検出され得る酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部のポリペプチドへの結合である。ポリペプチドの標識の例としては、限定されるものではないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、又は^１５３Ｓｍ）、色素原、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、及びガドリニウムキレート等の磁性剤が挙げられる。イムノアッセイに通常使用される標識の代表的な例としては、光を発する部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を発する部分、例えば、フルオレセインが挙げられる。この点について、その部分自体は検出可能に標識されていない場合もあるが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。

【0210】

例示的な修飾ＩＬ－２含有ポリペプチド
本明細書では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２受容体に対する修飾ＩＬ－２の親和性を野生型ＩＬ－２と比較して低下させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。様々な実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒのアゴニストである。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は修飾ヒトＩＬ－２であり、ＩＬ－２ＲはヒトＩＬ－２Ｒである。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒに対するヒト野生型ＩＬ－２の親和性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍低い親和性でヒトＩＬ－２Ｒに結合する。

【0211】

様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの抗原結合ドメインを含み、ここで、少なくとも１つ又は全てがＴ細胞又はナチュラルキラー細胞抗原に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、又は４つの抗原結合ドメインを含み、ここで、少なくとも１つ又は全てがＴ細胞又はナチュラルキラー細胞抗原に結合する。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、抗原結合ドメインの非存在下でＩＬ－２Ｒに結合しない又はＩＬ－２Ｒを活性化しない。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ポリペプチドがＩＬ－２Ｒと同じ細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む場合にのみ細胞上のＩＬ－２Ｒに結合し、及び／又はＩＬ－２Ｒを活性化する。

【0212】

様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｐ６５、Ｄ８４、Ｅ９５、Ｍ２３、及びＨ１６から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、及びＤ８４に置換を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、Ｄ８４、及びＭ２３に置換を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、Ｄ８４、及びＥ９５に置換を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｐ６５、Ｈ１６、Ｄ８４、Ｍ２３、及びＥ９５に置換を含む。

【0213】

幾つかの実施形態では、アミノ酸位置Ｐ６５での置換は、Ｐ６５Ｒ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｙ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｄ、及びＰ６５Ｎから選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸位置Ｈ１６での置換は、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、及びＨ１６Ｐから選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸位置Ｄ８４での置換は、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｖ、及びＤ８４Ｐから選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸位置Ｍ２３での置換は、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｇ、Ｍ２３Ｓ、Ｍ２３Ｔ、Ｍ２３Ｖ、及びＭ２３Ｐから選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸位置Ｅ９５での置換は、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ｔ、Ｅ９５Ｖ、Ｅ９５Ｐ、Ｅ９５Ｈ、及びＥ９５Ｎから選択される。

【0214】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、アミノ酸位置Ｆ４２に置換を更に含む。幾つかのそのような実施形態では、Ｆ４２での置換は、Ｆ４２Ｋ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、及びＦ４２Ｔから選択される。

【0215】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５及びＬ７２から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を更に含む。幾つかのそのような実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇから選択される少なくとも１つの置換を含む。

【0216】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｔ３及びＣ１２５から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を更に含む。幾つかのそのような実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｔ３Ａ及びＣ１２５Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む。

【0217】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、及びＤ８４Ｓを含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＭ２３Ａを含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、及びＥ９５Ｑを含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、置換Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｍ２３Ａ、及びＥ９５Ｑを含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、Ｈ１６Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ１５Ｓ－Ｆ４２Ｋ、Ｍ２３Ａ－Ｆ４２Ｋ、Ｅ９５Ｑ－Ｆ４２Ｋ、Ｐ６５Ｒ－Ｈ１６Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ１５Ｓ、Ｐ６５Ｒ－Ｍ２３Ａ、Ｐ６５Ｒ－Ｅ９５Ｑ、Ｔ３Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｃ１２５Ｓ、Ｔ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓ、及びＴ３Ａ－Ｈ１６Ａ－Ｍ２３Ａ－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ－Ｅ９５Ｑ－Ｃ１２５Ｓから選択される置換を含む。

【0218】

本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、修飾ＩＬ－２が修飾ヒトＩＬ－２であってもよい。様々な実施形態では、置換のアミノ酸位置は、配列番号１中のアミノ酸位置に対応する。

【0219】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、配列番号８４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、本明細書で論じられる置換の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、本明細書で論じられる置換の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、配列番号３、配列番号５～配列番号９、配列番号１２～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0220】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、又は４つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、Ｆｃ領域は、生理学的条件で修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの二量体化を介在し、こうして二量体が形成されることにより、抗原結合部位の数が２倍となる。例えば、３つの抗原結合ドメインとＦｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、単量体としては三価であるが、生理学的条件では、Ｆｃ領域が二量体化を介在することができ、こうして修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、そのような条件下で六価の二量体として存在する。

【0221】

様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択される配列を含む。様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、配列番号３、配列番号５～配列番号９、及び配列番号１２～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択される配列を含む。様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、配列番号２１を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合ドメインを更に含む。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインはヒト化されている。

【0222】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、天然の（natural or native）同種結合相手、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（操作されたリポカリン）、Ｄａｒｐｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（操作されたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、シスチンノットドメイン、Ａｆｆｉｌｉｎ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、又は操作されたＣＨ３ドメインである。幾つかの実施形態では、天然の同種結合相手は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の天然の同種結合相手又はＴＡＡに対する結合活性を示すその変異体のリガンド若しくは細胞外ドメイン、又はその結合フラグメントを含む。

【0223】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２と少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むポリペプチドは、抗腫瘍Ｔ細胞応答又はナチュラルキラー細胞応答を増強する一方でＴｒｅｇ、末梢Ｔ細胞、及び内皮細胞を回避する。幾つかのそのような実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが修飾ＩＬ－２を活性化Ｔ細胞に対して標的化する。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒが、少なくとも１つの抗原結合ドメインが結合する抗原と同じ細胞上にある場合にのみＩＬ－２Ｒに結合してＩＬ－２Ｒを調節する。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒが、少なくとも１つの抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞とは異なる細胞上にある場合にＩＬ－２Ｒに結合しない又はＩＬ－２Ｒを活性化しない。

【0224】

様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１０７ａ、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、及びＣＤ１６ａから選択されるタンパク質に結合する。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドは、ニボルマブ（BMS社；ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（Merck社；ＰＤ－１）、ＡＭＰ－５１４（Amplimmune社；ＰＤ－１）、ＴＳＲ－０４２（Tesaro/AnaptysBio社、ＡＮＢ－０１１；ＰＤ－１）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Sorrento Therapeutics社；ＰＤ－１）、イピリムマブ（BMS社；ＣＴＬＡ－４）、トレメリムマブ（AstraZeneca社、ＣＴＬＡ－４）、ウレルマブ（BMS、４－１ＢＢ）、ウトミルマブ（Pfizer社、４－１ＢＢ）、アテゾリズマブ（Roche社、ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（AstraZeneca社、ＰＤ－Ｌ１）、モナリズマブ（ＮＫＧ２Ａ、Innate Pharma社及びAstraZeneca社）、ＢＭＳ－９８６０１６（Bristo- Meyers Squibb社、ＬＡＧ－３）の抗原結合ドメインを含む。

【0225】

幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＬＡＧ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ８ａに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。

【0226】

幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインはヒト化され得る。ヒト化抗原結合ドメイン（ＶＨＨ含有ポリペプチド等）を含むポリペプチドは、治療分子として有用である。それというのも、ヒト化抗原結合ドメイン及びヒト化抗体は、抗体療法薬に対する免疫応答をもたらして療法薬の有効性を低下させ得る非ヒト抗体に対するヒト免疫応答を低減又は排除するからである。一般に、ヒト化抗原結合ドメイン又はヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗原結合ドメイン又はヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態では、ヒト化抗原結合ドメイン又はヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基の元となる抗体）からの対応する残基で置換される。

【0227】

ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633においてレビューされており、例えば、Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329、Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号、Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34、Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）、Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60（「ＦＲシャッフリング（FR shuffling）」を記載している）、並びにOsbourn et al., (2005) Methods 36:61-68及びKlimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択（guided selection）」アプローチを記載している）で更に記載されている。

【0228】

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296を参照されたい）、重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285、及びPresta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684、及びRosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271 :22611-22618を参照されたい）が挙げられる。典型的には、ＶＨＨのＦＲ領域をヒトＦＲ領域と置き換えることで、ヒト化ＶＨＨが作製される。幾つかの実施形態では、ヒトＦＲの或る特定のＦＲ残基を置き換えることで、ヒト化ＶＨＨの１つ以上の特性が改善される。そのような置き換えられた残基を有するＶＨＨドメインも、本明細書では更に「ヒト化」と称される。

【0229】

様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域であるか、又はヒトＦｃ領域に由来する。

【0230】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ＩｇＧ１ Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５に対応する３つのアミノ酸欠失を下部ヒンジに含み、本明細書で「Ｆｃ ｘＥＬＬ」と称される。Ｆｃ ｘＥＬＬポリペプチドはＦｃγＲと結合しないため、「エフェクターサイレント」又は「エフェクターヌル」と称されるが、幾つかの実施形態では、ｘＥＬＬ Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するため、半減期の延長及びＦｃＲｎ媒介性リサイクリング（FcRn mediated recycling）と関連したトランスサイトーシスを伴う。

【0231】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖを含み、本明細書で「Ｆｃ－ＹＶ」と称される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｌを含み、本明細書で「Ｆｃ－ＹＬ」と称される。幾つかの実施形態では、そのような変異は、エンドソームの酸性ｐＨ（６．５近く）でＦｃＲｎへの結合を増強するのに対し、中性ｐＨ（約７．２）では検出可能な結合が失われることから、ＦｃＲｎ媒介性リサイクリングの増強及び半減期の延長が可能となる。

【0232】

幾つかの実施形態では、本明細書で修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ヘテロ二量体化のために設計された変異を含み、本明細書において「ノブ」及び「ホール」と称される。幾つかの実施形態では、「ノブ」Ｆｃ領域は、変異Ｔ３６６Ｗを含む。幾つかの実施形態では、「ホール」Ｆｃ領域は、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体化に使用されるＦｃ領域は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第１のメンバー上の変異Ｓ３５４Ｃ等の追加の変異を含み、この変異は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバー上の対応する変異Ｙ３４９Ｃと非対称ジスルフィドを形成する。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むことで、ＦｃＲｎ結合を維持しつつプロテインＡの結合を妨げる。幾つかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むのに対して、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバーは、Ｈ４３５で修飾されていない。様々な実施形態では、ホールＦｃ領域は、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むが（修飾がＨ４３５Ｒである場合に、場合によっては「ホール－Ｒ」と称される）、ノブＦｃ領域はそれを含まない。幾つかの場合には、ホール－Ｒ変異は、存在し得るホモ二量体ホールＦｃ領域に対するヘテロ二量体の精製を改善する。

【0233】

修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドで使用され得る非限定的な例示的なＦｃ領域としては、配列番号４７～配列番号８３のアミノ酸配列を含むＦｃ領域が挙げられる。

【0234】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＣ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号３、配列番号５～配列番号９、配列番号１２～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＣ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＣ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号３～配列番号９、配列番号１１～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号３、配列番号５～配列番号９、配列番号１２～配列番号２１、及び配列番号２３～配列番号３１から選択されるアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、配列番号３４～配列番号４３及び配列番号４６から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４３と、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞上で発現される抗原に結合する抗原結合ドメインとを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６と、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞上で発現される抗原に結合する抗原結合ドメインとを含む。

【0235】

修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの例示的な活性
様々な実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒ活性のアゴニストである。アゴニスト活性は、幾つかの実施形態では、本明細書の実施例に示される方法を使用して、例えば２９３Ｆ細胞又は同様の細胞を使用して決定され得る。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔ細胞に標的化される場合にＩＬ－２Ｒ活性のアゴニストであるが、標的化の非存在下でアゴニスト活性を殆ど又は全く示さない。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞に標的化される場合にＩＬ－２Ｒ活性のアゴニストであるが、標的化の非存在下でアゴニスト活性を殆ど又は全く示さない。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を標的とする修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞上で発現される抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。

【0236】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。幾つかのそのような実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を、ポリペプチドの非存在下でのＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させ、休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を、ポリペプチドの非存在下で観察される増殖と比べて実質的に増加させない。

【0237】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞の増殖を増加させる。幾つかのそのような実施形態では、ＮＫ細胞は活性化ＮＫ細胞である。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化ＮＫ細胞の増殖を増加させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、活性化ＮＫ細胞の増殖を、ポリペプチドの非存在下でのＮＫ細胞増殖と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、活性化ＮＫ細胞の増殖を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させ、休止ＮＫ細胞の増殖を、ポリペプチドの非存在下で観察される増殖と比べて実質的に増加させない。

【0238】

活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。非限定的な例示的なアッセイは以下の通りである。ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞を１人以上の健康なヒトドナーから分離することができる。Ｔ細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色し、抗ＣＤ３抗体で活性化し、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドと接触させた後に、ＦＡＣＳで分析する。ＣＴＶ染色の喪失は増殖を示す。幾つかの実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、例えば、異なる健康なヒトドナーから分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を測定することによって、一連の実験又はプールされたＴ細胞からの平均として決定される。幾つかの実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞を使用して実施される実験からの、又は少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞のプールからの平均として決定される。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でさえもＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。

【0239】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を増加させる。ＣＤ７１発現はＴ細胞の活性化を示している。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を増加させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を、ポリペプチドの非存在下でのＣＤ７１発現と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させ、休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を、ポリペプチドの非存在下で観察されるＣＤ７１発現と比べて実質的に増加させない。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を増加させる。

【0240】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現の増加は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。非限定的な例示的なアッセイは以下の通りである。ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１人以上の健康なヒトドナーから分離し、抗ＣＤ３抗体で刺激し、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドと接触させた後に、ＦＡＣＳによってＣＤ７１発現について分析することができる。幾つかの実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現の増加は、例えば、異なる健康なヒトドナーから分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を測定することによって、一連の実験又はプールされたＴ細胞からの平均として決定される。幾つかの実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現の増加は、少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞を使用して実施される実験からの、又は少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞のプールからの平均として決定される。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でさえもＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ７１発現を増加させる。

【0241】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。ｐＳＴＡＴ５発現はＴ細胞の活性化を示している。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのｐＳＴＡＴ５発現を、ポリペプチドの非存在下でのｐＳＴＡＴ５発現と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現の増加は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でさえもＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。

【0242】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。ｐＳＴＡＴ５発現はＮＫ細胞の活性化を示している。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＮＫ細胞上でのｐＳＴＡＴ５発現を、ポリペプチドの非存在下でのｐＳＴＡＴ５発現と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも５倍増加させる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現を増加させる。ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５発現の増加は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。

【0243】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性を低減又は減弱させる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ抑制活性を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％低減させる。慣例的なＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＴｒｅｇ抑制活性の減少は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。非限定的な例示的なアッセイは以下の通りである。Ｔｒｅｇ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を、健康なヒトドナーＰＢＭＣから分離した後に、増殖性細胞用蛍光色素で異なる様式で標識する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激し、一方で、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの存在下でインキュベートする。２つのＴ細胞集団を３日間共培養し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖及び活性化をフローサイトメトリーでモニターする。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の存在下であるが本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの非存在下でのＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化及び増殖と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化及び増殖を増加させる。

【0244】

ポリペプチドの発現及び産生
修飾ＩＬ－２含有結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。したがって、様々な実施形態では、修飾ＩＬ－２を含むポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。幾つかの実施形態では、核酸分子は、修飾ＩＬ－２及び少なくとも１つの抗原結合ドメインをコードする。様々な実施形態では、核酸分子は、修飾ＩＬ－２と、Ｆｃ領域と、任意に少なくとも１つの抗原結合ドメインとをコードする。幾つかの実施形態では、Ｆｃ領域は、「ノブ」又は「ホール」変異等のヘテロ二量体化のために設計された変異を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２と、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、ここで、Ｆｃ領域は少なくとも１つの抗原結合ドメインのＣ末端に融合され、修飾ＩＬ－２はＦｃ領域のＣ末端に融合される。上述の実施形態のいずれかにおいて、核酸分子はまた、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの分泌を指示するリーダー配列もコードすることができ、そのリーダー配列は、典型的には、これが分泌されたポリペプチド中に存在しないように切断される。リーダー配列は、天然の重鎖（又はＶＨＨ）リーダー配列であり得る、又は別の異種リーダー配列であり得る。

【0245】

核酸分子は、当該技術分野で慣用の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。幾つかの実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。

【0246】

本明細書に記載される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。幾つかの実施形態では、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞若しくはＣＨＯ由来細胞等の所望の細胞型、又はＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。

【0247】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、細菌細胞等の原核細胞において、又は真菌細胞（酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞等の真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当該技術分野で既知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドの発現に使用され得る例示的な真核細胞としては、限定されるものではないが、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３Ｆ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びにＮＳＯ細胞が挙げられる。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、酵母において発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照されたい。幾つかの実施形態では、特定の真核宿主細胞は、ポリペプチドに対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、幾つかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３Ｆ細胞で産生される同じポリペプチドよりも高レベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。

【0248】

所望の宿主細胞への１つ以上の核酸（ベクター等）の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を含むあらゆる方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過的又は安定的にトランスフェクションされ得る。

【0249】

本明細書に記載される核酸又はベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞で発現された修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、任意の適切な方法によって精製され得る。そのような方法としては、限定されるものではないが、親和性マトリックス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられる。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＲＯＲ１ ＥＣＤ及びＦｃ領域に結合する作用物質が挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティーカラムを使用して、Ｆｃ領域に結合することで、Ｆｃ領域を含む修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルカラム又はフェニルカラムもまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換等）も、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。

【0250】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、無細胞系において産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)、Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)、Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。

【0251】

幾つかの実施形態では、上記の方法によって作製された修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、宿主細胞において作製される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、無細胞系において作製される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは精製される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む細胞培養培地が提供される。

【0252】

幾つかの実施形態では、上記の方法によって作製された抗体を含む組成物が提供される。幾つかの実施形態では、該組成物は、宿主細胞において作製された修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、該組成物は、無細胞系において作製された修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、該組成物は、精製された修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む。

【0253】

修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを使用して疾患を治療する例示的な方法
幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。このような疾患としては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖及び活性化の増加から恩恵を受けるあらゆる疾患が挙げられる。幾つかの実施形態では、個体における癌を治療する方法が提供される。該方法は、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを有効量、個体に投与することを含む。そのような治療方法は、ヒト又は動物における治療方法であり得る。幾つかの実施形態では、ヒトを治療する方法が提供される。本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを使用して治療することができる非限定的な例示的な癌としては、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、並びに外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。

【0254】

修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、必要に応じて被験体に投与され得る。投与の頻度の決定は、治療される病態、治療される被験体の年齢、治療される病態の重症度、治療される被験体の全般的健康状態等の考慮に基づいて、主治医等の当業者によって行われ得る。幾つかの実施形態では、有効用量の修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドが被験体に１回以上投与される。幾つかの実施形態では、有効用量の修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドが、被験体に毎日、週に２回、毎週、２週間ごとに、月に１回等で投与される。有効用量の修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドが被験体に少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドの有効用量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年間にわたる複数回を含む複数回で投与され得る。

【0255】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む医薬組成物は、癌を治療する（癌の予防を含む）及び／又はＴ細胞増殖を増加させるのに有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被験体の体重、その被験体の身体的状態若しくは健康状態、治療される病態の広範さ、又は治療される被験体の年齢に依存する。一般に、ポリペプチドは、用量当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約５０μｇ／ｋｇ（体重）～約５ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、用量当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）以下、例えば、４ｍｇ／ｋｇ未満、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、又は１ｍｇ／ｋｇ未満の範囲の抗体の量で投与され得る。

【0256】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、又は皮下を含む様々な経路によってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。意図される用途に応じて、適切な製剤及び投与経路を選択することができる。

【0257】

幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを使用する治療的処置は、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることによって達成される。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化の増加は、癌の成長を抑止する。

【0258】

医薬組成物
幾つかの実施形態では、修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む組成物は、多種多様な薬学的に許容可能な担体を含む製剤で提供される（例えば、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)、Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい）。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容可能な担体が利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤等の様々な薬学的に許容可能な補助物質も利用可能である。非限定的な例示的な担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せが挙げられる。

【0259】

幾つかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、又は２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを含む。

【0260】

併用療法
修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、単独で又は他の抗癌剤等の他の治療方式と組み合わせて投与され得る。修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、他の治療方式の前、実質的にそれと同時に、又はその後に供給され得る（すなわち、同時に又は連続的に）。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、放射線療法、化学療法、ワクチン接種、標的腫瘍療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌免疫療法、サイトカイン療法、外科的切除、クロマチン修飾、切除、冷却療法、腫瘍標的に対するアンチセンス剤、腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡ剤、腫瘍標的に対するマイクロＲＮＡ剤若しくは抗癌剤／抗腫瘍剤、又は抗体、サイトカイン若しくは受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物等の生物製剤を施すことを更に含み得る。

【0261】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、第２の療法剤、例えば、ＰＤ－１抗体と同時に与えられる。ＰＤ－１抗体の例としては、ニボルマブ（BMS社）、ペンブロリズマブ（Merck社）、ＡＭＰ－５１４（Amplimmune社）、ＴＳＲ－０４２（Tesaro/AnaptysBio社、ＡＮＢ－０１１）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Sorrento Therapeutics社）、及びプログラム死－１（ＰＤ－１）に対する他の作用物質が挙げられる。

【0262】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、第２の療法剤、例えば、ＰＤ－Ｌ１療法薬と同時に与えられる。ＰＤ－Ｌ１療法薬の例としては、ピディリズマブ（CureTech社、ＣＴ－０１１）、デュルバルマブ（Medimmune/AstraZeneca社）、アテゾリズマブ（Genentech/Roche社）、アベルマブ（Pfizer社）、ＡＭＰ－２２４（Amplimmune社）、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb社）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Sorrento Therapeutics社）、及びプログラム死－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）に対する他の作用物質が挙げられる。

【0263】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドは、ＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）療法薬、腫瘍溶解性ウイルス療法薬、サイトカイン療法薬、及び／又はＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ等の他のチェックポイント分子を標的とする作用物質と同時に与えられる。

【0264】

診断及び治療の非限定的な例示的な方法
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、被験体及び／又は被験体（例えば、癌患者）からの検体を評価するのに有用である。幾つかの実施形態では、評価は、診断、予後診断、及び／又は治療への奏効のうちの１つ以上である。

【0265】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、タンパク質の存在、非存在、又はレベルを評価することを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、核酸の存在、非存在、又は発現のレベルを評価することを含む。これらの測定に本明細書に記載される組成物を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、腫瘍の検体又は腫瘍から培養された細胞を、本明細書に記載される療法剤と接触させることを含む。

【0266】

幾つかの実施形態では、評価により、治療（本明細書に記載されるポリペプチドによる治療を含む）が指示され得る。幾つかの実施形態では、評価により、切除後の補助療法を使用する又は差し控えることが指示され得る。補助治療とも呼ばれる補助療法は、一次治療、主治療、又は初回治療に加えてなされる治療である。非限定的な例として、補助療法は、全ての検出可能な疾患が取り除かれたが、潜在疾患のため再燃の統計的リスクが残っている場合に、通常は手術後になされる追加の治療であり得る。幾つかの実施形態では、上記ポリペプチドは、癌の治療における補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態では、上記抗体は、癌の治療における単独補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、癌の治療における補助療法薬としては差し控えられる。例えば、患者が本明細書に記載される抗体に応答する可能性が低い又は最小限の応答しか有しない場合に、生活の質のために、及び無効な化学療法による不必要な毒性を避けるために、治療を施さなくてもよい。このような場合に、緩和ケアが使用される場合がある。

【0267】

幾つかの実施形態では、切除前に術前補助療法薬として上記ポリペプチドが投与される。幾つかの実施形態では、術前補助療法薬は、任意の手術の前に腫瘍を縮小及び／又はダウングレードする療法薬を指す。幾つかの実施形態では、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与される化学療法薬を意味する。幾つかの実施形態では、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与されるポリペプチドを意味する。術前補助化学療法薬が通常考慮される癌型としては、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、及び肺癌が挙げられる。幾つかの実施形態では、上記抗体は、癌の治療における術前補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態では、その使用は切除前である。

【0268】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法で企図される腫瘍微小環境は、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１つ以上である。

【0269】

キット
本明細書に記載される修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドのいずれか及び適切な包装を含む製造品及びキットも提供される。幾つかの実施形態では、本発明は、（ｉ）修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドと、（ｉｉ）該キットを使用して修飾ＩＬ－２含有ポリペプチドを個体に投与するための使用説明書とを備えるキットを含む。

【0270】

本明細書に記載される組成物に適切な包装は、当該技術分野で知られており、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、フレキシブルな包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が含まれる。これらの製造品は、更に滅菌及び／又は密封され得る。本明細書に記載される組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、単回又は多回単位剤形で適切な包装内で保存され得て、更に滅菌及び密封もされ得る。本発明のキットに提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた指示であるが、機械可読の指示（例えば、磁気記憶ディスク又は光学記憶ディスクに保持された指示）も許容可能である。抗体の使用に関する使用説明書は一般に、意図された治療又は工業的使用のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。キットは、個々の適切な治療を選択することの説明を更に含み得る。

【0271】

容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多回用量包装）又はサブユニット用量であり得る。例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月以上のいずれかの概数の期間等の長期間にわたって個体に効果的な治療をもたらすのに十分な用量の本明細書に開示される分子を含むキットも提供され得る。キットはまた、多回単位用量の分子及び使用説明書を含むことができ、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局での保存及び使用に十分な量で包装され得る。幾つかの実施形態では、キットは、再構成、再懸濁、又は再水和することで、一般的にポリペプチドの安定な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を含む。

【実施例】

【0272】

以下で論じられる実施例は、本発明を純粋に例示することが意図され、決して本発明を限定するとみなされるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が、実施された全て又は唯一の実験であることを表すとは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。特段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか又は近大気圧である。

【0273】

実施例１：ＩＬ－２のＰ６５Ｒ変異は、ＣＤ２５結合を本質的に排除する
ＩＬ－２変異体を、立体閉塞（steric occlusion）によってＣＤ２５界面を破壊するように設計し（Ｐ６５Ｒ及びＰ６５Ｅ）、ＩＬ－２受容体の１つ以上の成分（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、及び／又はＣＤ１３２）を一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞に対する結合について試験した。変異体を、ＣＤ２５に対する親和性が低下していることが報告された変異体であるＩＬ－２－Ｆ４２Ｋと比較した。「ノブ」ＦｃのＮ末端に融合され、「ホール」Ｆｃ（配列番号４４）と複合された野生型ヒトＩＬ－２（配列番号３２）、ＩＬ－２－Ｆ４２Ｋ（配列番号３３）、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｒ（配列番号３５）、又はＩＬ－２－Ｐ６５Ｅ（配列番号３４）を含む漸増濃度の融合タンパク質を、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞に添加し、４℃で４５分間インキュベートした。

【0274】

結合を、実質的に以下のようにフローサイトメトリーによって分析した。細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）中で１回洗浄し、細胞ペレットを１００μｌの表面マーカー染色溶液（ＦＡＣＳバッファー中に１：３００の希釈率でＡ６４７結合抗ヒトＦｃｇ二次抗体を含有する）中に再懸濁した。細胞を４℃で４５分間インキュベートした後に、最終洗浄し、フローサイトメーターで分析した。細胞デブリをＦＳＣ／ＳＳＣでのサイズ排除によって除外し、死細胞をそれらのヨウ化プロピジウムの陽性シグナルに基づいて除外した。ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈでのダブレット及び凝集物の除外を使用して単一細胞を選択した。一過的にトランスフェクションされた細胞も細胞質ＥＧＦＰを発現し、ＦＬ１陽性であった細胞を分析した。抗ヒト二次抗体のＭＦＩレベルの増加は、ＩＬ－２結合を示していた。細胞集団の分析にＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用した。次いで、各マーカーについての生の平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）をエクスポートし、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭを使用して分析した。値をグラフ化し、力価測定曲線をフィッティングさせて、非線形回帰Ｏｎｅ－ｓｉｔｅ －－ Ｔｏｔａｌ曲線フィットを使用して用量反応関係を評価した。

【0275】

図２Ａ～図２Ｃに示されるように、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｅ変異体を含む融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質と比べて僅かに低下したＩＬ－２Ｒに対する親和性を示した。ＩＬ－２ Ｆ４２Ｋを含む融合タンパク質は、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｅを含む融合タンパク質よりも低い親和性を示したが、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｒを含む融合タンパク質は、ヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒに対して最も低い親和性を示した（図２Ａ）。さらに、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｒを含む融合タンパク質は、ＣＤ２５／ＣＤ１３２に対して検出可能な結合を示さず、ＣＤ２５／ＣＤ１２２に弱くしか結合しなかったが（図２Ｃ）、ＩＬ－２－Ｆ４２Ｋを含む融合タンパク質は、ＣＤ２５／ＣＤ１３２に対して幾らかの親和性を保持し（図２Ｂ）、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｒを含む融合タンパク質よりも高い親和性でＣＤ２５／ＣＤ１２２に結合した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。したがって、Ｐ６５Ｒで変異したＩＬ－２は、ＣＤ２５含有ＩＬ－２受容体に対する結合が顕著に低下していた。

【0276】

実施例２：ＣＤ１２２に対する親和性を低下させるＩＬ－２修飾
実施例１で述べたように、Ｐ６５Ｒ ＩＬ－２変異は、立体閉塞によってＣＤ２５界面を破壊するように設計された。加えて、ＩＬ－２変異を、或る特定の接触残基相互作用の排除によってＣＤ１２２界面に対する親和性を低下させるように設計した（例えば、Ｄ８４Ｓ、Ｅ９５Ｑ、Ｍ２３Ａ、Ｈ１６Ａ、及びＥ１５Ｓ）。単一又は二重変異体を、ＩＬ－２Ｒに対する一価ＩＬ－２結合のためにヘテロ二量体Ｆｃ（ジスルフィドにより「ホール」Ｆｃ配列番号４４を含むホールにノブを安定化させた）の「ノブ」部分のＮ末端に融合させた。相対結合親和性を、２９３Ｆ細胞にＣＤ２５及びＣＤ１２２を一過的にトランスフェクションすることによって評価した（ＣＤ１３２との同時トランスフェクションは、同様の結果を示したが、付加的な結合アビディティーにより観察される親和性の差が減少した）。結合したＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に実質的に記載されるように蛍光抗ヒト二次抗体で検出し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0277】

図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＣＤ１２２界面に変異を有するＦ４２Ｋを組み込んだ二重ＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質（配列番号３６～配列番号３９）は全て、ＩＬ－２－Ｆ４２Ｋ－Ｅ１５Ｓ（配列番号８５）を除き、単一変異体ＩＬ－２－Ｆ４２Ｋ（配列番号３３）を含むものと比べて、ＣＤ２５／ＣＤ１２２に対する結合親和性の低下を示した。

【0278】

実施例３：ＩＬ－２－ＲＡＳ（Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、及びＤ８４Ｓ）は、三量体及び二量体形態のＩＬ－２Ｒの状況でＣＤ１２２に対する親和性が低下した
実施例２に記載のＣＤ１２２親和性を低下させる変異をＰ６５Ｒ変異と組み合わせて、ＩＬ－２二重及び三重変異体を構築した。ＩＬ－２変異体を、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に対する一価ＩＬ－２結合のためにヘテロ二量体Ｆｃ「ノブ」部分のＮ末端に融合させ、配列番号４４を含む「ホール」Ｆｃと対合させた。得られる融合タンパク質の相対結合親和性を、実施例１に実質的に記載されるように、ＩＬ－２Ｒサブユニットを一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞において評価した。

【0279】

野生型ＩＬ－２（配列番号３２）を含む融合タンパク質と比べて、ＩＬ－２－Ｐ６５Ｒ－Ｈ１６Ａ（配列番号４１）を含む融合タンパク質及びＩＬ－２－Ｐ６５Ｒ－Ｄ８４Ｓ（配列番号４２）を含む融合タンパク質は、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（ヘテロ二量体ＩＬ－２Ｒ）（図４Ａ）及びヘテロ三量体ＩＬ－２Ｒ（図４Ｂ）の両方に対する親和性が低下したが、三重変異体ＩＬ－２ Ｐ６５Ｒ－Ｈ１６Ａ－Ｄ８４Ｓ（「ＩＬ－２－ＲＡＳ」、配列番号４３）を含む融合タンパク質の親和性は、更に一層減弱した（図４Ａ及び図４Ｂ）。最大結合及びＥＣ_５０の両方においてこれらのＩＬ－２変異体について観察された結合のシフトは、これらの変異がオンレート（ＥＣ_５０の右へのシフト）及びオフレート（最大結合の低下）を低下させたことを示唆している。

【0280】

実施例４．ＩＬ－２－ＲＡＳは、休止Ｔ細胞及び活性化前Ｔ細胞に対する親和性が低下した
Ｔ細胞を単離するために、非Ｔ細胞集団を、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δに対するビオチン化された抗系譜マーカー抗体（BioLegend社）で室温にて２０分間標識した。次いで、磁性ストレプトアビジン粒子と一緒に室温で２０分間インキュベートすることにより、非Ｔ細胞集団を減少させた（５００μｌのビーズスラリーに加えて１００×１０^６個当たり５００μｌの細胞懸濁液、マグネット上で２×８分間インキュベートする）。非結合細胞の上清は単離したＴ細胞を含んでいた。

【0281】

一部の単離Ｔ細胞（３ｍＬ中５．５×１０^６個）を、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３ ＯＫＴ３抗体（BD Biosciences社）でプレコートした６ウェルプレートにおいて２日間インキュベートすることによって活性化した後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中２×１０^６個／ｍＬで１日静置した。休止Ｔ細胞又は活性化前Ｔ細胞を結合アッセイに直接使用した。休止Ｔ細胞又は活性化前Ｔ細胞に対する、非標的化ＶＨＨ－Ｆｃアイソタイプコントロール、及びヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ又は野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質の結合を、以下の二次抗体：ＡＦ６４７抗ヒトＦｃ（１：１０００）、ＰＩ（１：２０００）、ＢＶ７８５－ＣＤ４（１：３００）、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ－ＣＤ８（１：５００）及びＰＥ／Ｃｙ７－ＣＤ２５（１：１００）を使用した以外は実施例１に実質的に記載されるように、フローサイトメトリーによって測定した。

【0282】

非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳ融合タンパク質（配列番号４６を含む）は、休止Ｔ細胞（図５Ａ）及び活性化前Ｔ細胞（図５Ｂ）に対し、非標的化ＶＨＨドメイン及び野生型ＩＬ－２（配列番号４５を含む）を含む融合タンパク質と比較して低下した親和性で結合した。ＩＬ－２を含まないアイソタイプコントロールは、図５Ａ及び図５Ｂに示されるように休止Ｔ細胞又は活性化前Ｔ細胞に結合しなかった。

【0283】

実施例５：ＩＬ－２－ＲＡＳは、Ｔｒｅｇに対する親和性が低下した
制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）はＣＤ２５、並びにＣＤ１２２及びＣＤ１３２の高い内因性発現を有し、野生型ＩＬ－２に対して高度に応答性であった。非標的化ＶＨＨのヘテロ二量体Ｆｃ（ジスルフィドによりホールにノブを安定化させた）の「ノブ」部分のＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２（配列番号４５を含む）又はＩＬ－２－ＲＡＳ三重変異体（配列番号４６を含む）を含む融合タンパク質のＴｒｅｇに対する結合を測定した。

【0284】

ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞分離キット（Stemcell社）を製造業者の指示に従って使用することにより、Ｔｒｅｇ及びＣＤ４^＋Ｔレスポンダー細胞（Ｔｒｅｓｐ）を新鮮で健康なドナーＰＢＭＣから濃縮し、単離した。ｒｈＴＧＦ－Ｂ１、オールトランスレチノイン酸、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＩＬ－２を補充したＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で７日間の培養によってＴｒｅｇをナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞から生成した。

【0285】

２つの細胞集団を区別するために、濃縮されたＴｒｅｇ及びＣＤ４^＋レスポンダーＴ細胞を、それぞれ増殖色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）及びＣＦＳＥにより３７℃で１０分間標識した。洗浄後に、Ｔｒｅｇ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ及び１×抗生物質／抗真菌剤を補充したＲＰＭＩ中で１．５×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁した。Ｔｒｅｇを５０μｌの容量で播種することで、９６ウェル丸底プレートにおいて７５０００個のＴｒｅｇ／ウェルを得た。１０ｎＭのＩＬ－２－ＲＡＳの存在下で、Ｔｒｅｇを３７℃にて一晩インキュベートし、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーによって分析した。

【0286】

図６に示されるように、野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質とは対照的に、ＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質は、ＰＢＭＣから濃縮されたＴｒｅｇ（図６Ａ）、誘導されたＴｒｅｇ（図６Ｂ）、又はＣＤ４^＋Ｔレスポンダー（図６Ｃ）に対して観察可能な結合を示さなかった。

【0287】

実施例６：ＩＬ－２－ＲＡＳは、休止Ｔ細胞に対する活性を低下させた
Ｔ細胞を、実施例４に実質的に記載されるように磁性ビーズ分離によって単離し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、ヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２（配列番号４５を含む）又はＩＬ－２－ＲＡＳ（配列番号４６を含む）を含む融合タンパク質で処理した。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７１、及びＣＴＶのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。増殖Ｔ細胞はＣＴＶレベルが低下している。

【0288】

図７Ａ及び図７Ｃに示されるように、休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導するのに必要とされるＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質の濃度は、同じ増殖の誘導を達成するのに必要とされる野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質の濃度又はＩＬ－２ｖ－類縁体を含む融合タンパク質の濃度よりも１００倍超高かった。

【0289】

図７Ｂ及び図７Ｄに示されるように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞上でＴ細胞活性化のマーカーであるＣＤ７１発現を誘導するのに必要とされるＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質の濃度は、同じ活性化の誘導を達成するのに必要とされる野生型ＩＬ－２又はＩＬ－２ｖ－類縁体を含む融合タンパク質の濃度よりも少なくとも１００倍高かった。

【0290】

Ｔ細胞活性化は、活性化Ｔ細胞において増加するリン酸化ＳＴＡＴ５レベルによっても測定することができる。Ｔ細胞を磁性ビーズ分離によって単離し、ヘテロ二量体Ｆｃを含む非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２（配列番号４５を含む）を含む融合タンパク質又はヘテロ二量体Ｆｃを含む非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳ（配列番号４６を含む）を含む融合タンパク質で１５分間処理した。細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（BD Biosciences社）で固定し、９０％氷冷メタノール中で透過処理し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのリン酸化ＳＴＡＴ５（「ｐＳＴＡＴ５」）のレベルを、抗ｐＳＴＡＴ５－ＰＥ抗体（１：７０）を使用するフローサイトメトリーを用いて測定した。細胞を以下の抗体：抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（１：２００）、ＣＤ５６－ＢＶ４２１（１：１００）、ＣＤ４－ＢＶ７８５（１：２００）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ（１：３００）で共染色した。

【0291】

図７Ｅ及び図７Ｆに示されるように、非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳ融合タンパク質は、試験した最も高い濃度であっても休止ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５の最小のリン酸化しか達成しなかったが、非標的化ＩＬ－２－野生型融合タンパク質は、試験した最も高い濃度よりも１０００倍超低い濃度でＳＴＡＴ５リン酸化を誘導した。

【0292】

実施例７：ＩＬ－２変異体は、Ｔｒｅｇに対する活性が低下した
ＥａｓｙＳｅｐ（商標） Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞分離キット（Stemcell社）を使用して、ＴｒｅｇをＰＢＭＣから単離した。ＴｒｅｇをＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識し、１００μｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中において１ウェル（９６ウェル、Ｕ型底）当たり０．１５×１０^６個の細胞で播種した。細胞を１００ｎＭから開始する１００μｌの融合タンパク質の力価測定と組み合わせ、１：４で力価測定した。細胞を７日間インキュベートした。７日目に、増殖及び活性化のマーカーであるＣＤ２５を、以下の抗体：ＢＶ７８５－ＣＤ４（１：３００）、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ－ＣＤ８（１：５００）、ＰＥ／Ｃｙ７－ＣＤ２５（１：１００）、ＰＩ（１：２０００）を使用した以外は実施例１に実質的に記載されるように、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって測定した。

【0293】

図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２（配列番号４５を含む）を含む融合タンパク質は、Ｔｒｅｇの増殖及び活性化マーカーＣＤ２５の発現を誘導したが、野生型ＩＬ－２の代わりにＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質（配列番号４６を含む）では誘導されなかった。

【0294】

実施例８：ＰＤ－１を発現する活性化Ｔ細胞は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳによって刺激される
ＰＤ－１発現Ｔ細胞に結合してこの細胞を刺激する能力を、ペンブロリズマブ（従来の抗ＰＤ－１抗体）、並びにペンブロリズマブ類縁体及び重鎖のＣ末端に連結されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質（図１Ｆを参照されたい）を使用して試験した。

【0295】

健康なドナーに由来する濃縮されたＴ細胞を、実施例４に実質的に記載されるように活性化した。６ウェルプレートを１μｇ／ｍｌ ＯＫＴ３抗体で４℃にて一晩コーティングした。翌日、プレートを２回洗浄して非結合ＯＫＴ３抗体を除去した。濃縮されたＴ細胞を、ＣＴＬ培地を用いて融解し、完全ＲＰＭＩ中で５．５×１０^６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、コーティングしたプレートに１ウェル当たり３ｍＬで播種した。２日後に、活性化Ｔ細胞を収集し、１回洗浄した後、ＯＫＴ３抗体を含まない培地中に２４時間播種して静置した。細胞を増殖色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した。Ｔ細胞を計数した後、２×１０^６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。１ウェル当たり１００μＬの再懸濁した細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した。ペンブロリズマブ又はペンブロリズマブ類縁体－ＩＬ－２－ＲＡＳ融合物を１００ｎＭの最終濃度から開始して添加し、１：５で力価測定した。３日目に、Ｔ細胞を生存率マーカーＰＩ及び以下の蛍光標識抗体：ＣＤ４－ＢＶ７８５、ＣＤ８－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ、ＣＤ２５－ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ７１－ＦＩＴＣ、及びＣＤ６９－ＡＰＣにより室温で２０分間染色した。プレートを、増殖の測定について実施例７に実質的に記載されるように、また結合については実施例１のように、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで読み取り、更なる分析のためにデータをＥｘｃｅｌにエクスポートした。

【0296】

図９に示されるように、ペンブロリズマブ類縁体－ＩＬ－２－ＲＡＳ融合タンパク質は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖（図９Ａ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖（図９Ｂ）を刺激したが、ペンブロリズマブ単独では刺激しなかった。特定の理論に縛られることを意図するものではないが、観察された増殖の二相性の性質により、低濃度での活性がＰＤ－１標的化活性によるものであり、より高濃度での活性の増加が非標的化活性によるものであることが示唆され得る。図９Ｃ及び図９Ｄに示されるように、ペンブロリズマブ及びペンブロリズマブ類縁体－ＩＬ－２－ＲＡＳは、どちらも同様の親和性で活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に結合したが、但し、付加的な結合が１０ｎＭ超の希釈範囲の上限でＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質について観察され、これはＩＬ－２Ｒに対するＩＬ－２－ＲＡＳの結合によって媒介された可能性がある。

【0297】

実施例９：活性化Ｔ細胞上でのＰＤ－１のプレブロッキングは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳによるシグナル伝達を妨げる
実施例４に実質的に記載されるように、Ｔ細胞を健康なドナーから磁性ビーズ分離によって単離して濃縮し、ＯＫＴ３抗体をコーティングしたプレート上でインキュベートして、Ｔ細胞を活性化した。細胞をＣＴＶで標識した。活性化前Ｔ細胞を、ＰＤ－１結合部位をブロッキングするために抗ＰＤ－１抗体であるペンブロリズマブと一緒にインキュベートするか、又はコントロールとして非標的化抗体と一緒にインキュベートした。次いで、細胞を、ペンブロリズマブ類縁体に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、又はコントロールとして非標的化抗体に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質と一緒に３日間インキュベートした。ＩＬ－２シグナル伝達の程度を、実施例７に実質的に記載されるように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって測定することで評価した。

【0298】

図１０Ａ～図１０Ｄに示されるように、野生型ＩＬ－２は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方の強い増殖を誘導したが、ペンブロリズマブ又はＩＬ－２－ＲＡＳ及び非標的化抗体を含む融合タンパク質で処理したＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＰＤ－１のプレブロッキングの影響を受けない低レベルの増殖を示した。対照的に、ＩＬ－２－ＲＡＳ及びペンブロリズマブ類縁体を含む融合タンパク質で処理したＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）及びＣＤ８^＋Ｔ細胞（図１０Ａ及び図１０Ｃ）は、どちらも顕著なＰＤ－１依存性増殖を示し（図１０Ａ及び図１０Ｂ）、これは抗ＰＤ－１抗体とのプレインキュベーションによってブロッキングされた（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。したがって、ＩＬ－２－ＲＡＳ及び抗ＰＤ－１抗体を含む融合タンパク質は、ＰＤ－１がＴ細胞上で発現され、かつ接近可能な場合にのみＴ細胞を活性化した。

【0299】

実施例１０：ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、Ｔｒｅｇ抑制を克服する
ＣＤ４^＋Ｔレスポンダー細胞及びＴｒｅｇを、実施例５に記載されるように単離した。ＣＤ４^＋レスポンダー細胞をＣＴＶで標識し、単離されたＴｒｅｇと２：１の比率で混合し、抗ＣＤ３ビーズ（２個のＴ細胞につき１個のビーズ）により活性化した。得られる混合物を、図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２、図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、又は抗ＰＤ－１抗体に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質（ペンブロリズマブ類縁体－ＩＬ－２－ＲＡＳ）の希釈系列で７日間処理した。実施例７に実質的に記載されるように、増殖をフローサイトメトリーによって測定した。

【0300】

図１１に示されるように、Ｔレスポンダー細胞はＴｒｅｇによって抑制されたが、非標的化野生型ＩＬ－２、並びにＩＬ－２－ＲＡＳ及び抗ＰＤ－１抗体を含む融合タンパク質（ペンブロリズマブ類縁体－ＩＬ－２－ＲＡＳ）は、Ｔｒｅｇの存在に関わらず、ＣＤ４^＋Ｔレスポンダー細胞の増殖を誘導した。ＩＬ－２－ＲＡＳ及び非標的化抗体を含む融合タンパク質での細胞の処理は、増殖を同程度まで回復させなかった。非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳのみが、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳ融合タンパク質よりもはるかに高い濃度でＴレスポンダーに対するＴｒｅｇの抑制効果を打ち消すことができた。したがって、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、Ｔｒｅｇの抑制効果を克服し、この活性はＴ細胞上で発現されるＰＤ－１への結合に依存していた。

【0301】

実施例１１：ＰＤ－１標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、トランスでシグナル伝達しない
ビーズを、製造業者の推奨コーティング手順に従って、４×１０^８個のビーズ当たり２００μｇのＰＤ－１抗原でコーティングする。簡潔には、ビーズをバッファー１（０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４～８．０）中で１回洗浄した後に、チューブローテーターにおいてＰＤ－１抗原を含むバッファー１中で室温にて１８時間インキュベートする。次いで、ビーズをバッファー２（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．４）で４回洗浄する。ビーズをバッファー３（０．２ＭのＴｒｉｓ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ８．５）中で３７℃にて４時間インキュベートすることにより、遊離トシル基を不活性化させる。次いで、ビーズをバッファー２中で１回洗浄し、４００×１０^６個のビーズ／ｍＬの濃度に再懸濁する。

【0302】

コーティングされたビーズを、野生型ＩＬ－２又は抗ＰＤ－１抗体に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質と一緒にインキュベートし、洗浄する。次いで、ビーズを単離された休止Ｔ細胞と一緒にインキュベートする。ＩＬ－２シグナル伝達を、フローサイトメトリーによってｐＳＴＡＴ５レベルを測定することで評価する。

【0303】

ビーズに結合した野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を強く活性化するが、ビーズに結合したＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質は、試験した最も高い濃度までＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して活性を有しない。したがって、ＩＬ－２－ＲＡＳのＴ細胞標的化がＩＬ－２シグナル伝達に必要とされ、標的化ＩＬ－２－ＲＡＳのシグナル伝達は、トランスでは起こらない。

【0304】

実施例１２：ＩＬ－２－ＲＡＳは、トランスでシグナル伝達しない
１０００ｎＭから開始して１：４で希釈した非標的化野生型ＩＬ－２及び非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳの希釈系列をアッセイプレートにコーティングし、一晩インキュベートし、洗浄した。Ｔ細胞を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化を、実施例６に実質的に記載されるように、リン酸化ＳＴＡＴ５レベルを検出することによって測定した。

【0305】

図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ｐＳＴＡＴ５誘導によって測定したところ、野生型ＩＬ－２によってトランスで活性化されたが、非標的化ＩＬ－２－ＲＡＳはトランスで活性化することができなかった。特定の理論に縛られることを意図するものではないが、ＣＤ２５及びＣＤ１２２に対するＩＬ－２－ＲＡＳの親和性の低下は、下流のシグナル伝達を誘導するＩＬ－２Ｒの効率的な結合及びクラスター形成を妨げた可能性がある。したがって、標的化ＩＬ－２－ＲＡＳ融合タンパク質のみがｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を引き起こす。

【0306】

実施例１３：ＮＫｐ４６標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、ＮＫ細胞増殖を特異的に引き起こす
図１Ｈに示されるようにＮＫｐ４６を標的とするヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体のＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃに連結された非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２又はＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、及びＮＫｐ４６を標的とするヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体単独のＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する影響を決定した。

【0307】

健康なドナーに由来する新鮮なＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔで標識し、丸底９６ウェルプレートにおいて２０００００個の細胞／ウェルで播種した。融合タンパク質及びＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ－Ｆｃコントロールの希釈物を、播種した細胞に添加し、３７℃で７日間インキュベートした。７日目に、以下の抗体：抗ＣＤ３－ＢＶ７８５（１：２００）、抗ＣＤ５６－ＡＰＣ（１：１００）、抗ＣＤ４－ＰＥ（１：２００）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ（１：３００）及びＰＩ（１：２０００）を使用した以外は実施例７に実質的に記載されるように、細胞増殖を測定した。

【0308】

加えて、健康なドナーに由来する新鮮なＰＢＭＣを、同じ融合タンパク質又はＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ－Ｆｃコントロールで処理し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞（ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋）におけるｐＳＴＡＴ５レベルを、実施例６に実質的に記載されるように、リン酸化ＳＴＡＴ５レベルを検出することによって測定した。

【0309】

健康なドナーに由来する新鮮なＰＢＭＣに対する融合タンパク質及びＮＫｐ４６ ｓｃＦＶ－Ｆｃコントロールの結合を、以下の抗体：抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（１：１００）、抗ＣＤ５６－ＢＶ４２１（１：１００）、抗ＣＤ４－ＢＶ７８５（１：２００）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ（１：３００）、抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１：５００）、及びＰＩ（１：２０００）を使用した以外は実施例１に実質的に記載されるように測定した。

【0310】

図１３Ａ～図１３Ｉに示されるように、ＮＫｐ４６標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、ＮＫ細胞の増殖及び活性化を強力に活性化したが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞には影響を及ぼさなかった。対照的に、非標的化野生型ＩＬ－２は、試験した全てのリンパ球（ＮＫ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞）の増殖及び活性化を引き起こした。ＮＫｐ４６ ｓｃＦＶ－Ｆｃ（ＩＬ－２－ＲＡＳを有しない）の結合は、ＮＫ増殖又はｐＳＴＡＴ５誘導を引き起こさなかった。したがって、ＮＫｐ４６標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、ＮＫ細胞上でＩＬ－２のシスシグナル伝達を引き起こしたが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞をトランスで活性化しなかった。

【0311】

実施例１４：ＬＡＧ３標的化ＩＬ－２－ＲＡＳは、活性化前ＬＡＧ３^＋Ｔ細胞を刺激する
図１Ｇに示されるように従来の抗ＬＡＧ３ヘテロ二量体抗体（ＭＡｂ）のＣ末端に融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、図１Ｂに示されるようにヘテロ二量体Ｆｃを含む抗ＬＡＧ３ ＶＨＨに融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、図１Ｂに示されるように非標的化ＶＨＨに融合されたＩＬ－２－ＲＡＳを含む融合タンパク質、又は図１Ｂに示されるように非標的化ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合された野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質、又はＬＡＧ３標的化Ｍａｂ（コントロール）、又はＬＡＧ３標的化ＶＨＨ－Ｆｃ（コントロール）のＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する影響をアッセイした。

【0312】

健康なドナーに由来する濃縮されたＴ細胞を、コーティングした１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び１０μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８で４８時間刺激した後、２４時間静置した。活性化前細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔで標識し、２０００００細胞／ウェルで播種した。融合タンパク質及びコントロールタンパク質の希釈物を添加し、３日間インキュベートした。活性化マーカーであるＣＤ２５及びＣＤ７１の増殖及び発現を、実質的に実施例７のように、但し付加的な抗体：抗ＣＤ２５－ＦＩＴＣ（１：１００）及び抗ＣＤ７１－ＰＥ／Ｃｙ７を用いて測定した。

【0313】

刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＬＡＧ３をＣＤ８^＋Ｔ細胞の４５％まで上方調節し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＬＡＧ３をＣＤ４^＋Ｔ細胞の２２％まで上方調節した。対照的に、非刺激Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞のいずれについてもＬＡＧ３発現に対してほぼ０％陽性である。

【0314】

図１４Ａ～図１４Ｄに示されるように、抗ＬＡＧ３ Ｍａｂ－ＩＬ－２－ＲＡＳ及び抗ＬＡＧ３ ＶＨＨ－ＩＬ－２－ＲＡＳの両方が、ＣＤ２５（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）及びＣＤ７１（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）の発現レベルによって示されるＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋の増殖（図１４Ａ及び図１４Ｂ）及び活性化を増加させた。非標的化野生型ＩＬ－２は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖及び活性化の強力な誘導因子であり、刺激されたＴ細胞により高い親和性及び飽和度で結合した。

【0315】

実施例１５：ＩＬ－２の変異体の組合せは、非標的化活性を更に低下させる
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞（InvivoGen社）を使用して、非標的化ＩＬ－２変異体の相対活性を測定した。レポーター細胞を、非標的化ＶＨＨのＣ末端に融合されたＩＬ－２－変異体の希釈物で処理し、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ分析の前に２０時間インキュベートした。

【0316】

図１５に示されるように、ＩＬ－２変異体は広範な活性を示した。上記の実験から、ＩＬ－２－ＲＡＳ（Ｐ６５Ｒ、Ｈ１６Ａ、及びＤ８４Ｓ）がＩＬ－２Ｒに対する結合を野生型ＩＬ－２と比較して劇的に低下させ（図４～図６を参照されたい）、活性を野生型ＩＬ－２と比較して低下させた（図７Ａ～図７Ｅを参照されたい）ことが示された。付加的なＭ２３Ａ変異を有するＩＬ－２－ＲＡＳ及び付加的なＥ９５Ｑ変異を有するＩＬ－２－ＲＡＳは、どちらもＩＬ－２－ＲＡＳと比較して活性の低下を示し、ＩＬ－２－ＲＡＳとＭ２３Ａ及びＥ９５Ｑの両方との組合せは、活性を更に一層減弱させた。ＰＤ－１発現レポーター細胞を用いた実験では、これらの親和性が低下したＩＬ－２変異体が全て同等のＰＤ－１標的化活性を示し（データは示さない）、ＰＤ－１に対するシスでの高親和性結合が、ＩＬ－２Ｒに対するＩＬ－２変異体の親和性の低下を相殺し得ることが示唆される。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター系は相対活性の測定に有用であったが、レポーター系においてＩＬ－２変異体について観察されたＥＣ_５０は、おそらくは初代細胞上でのより低いＩＬ－２Ｒレベルと比較したレポーター細胞におけるＩＬ－２Ｒ成分の過剰発現のために、初代リンパ球と比較して顕著に左にシフトした。

【0317】

本開示は、本発明の趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての点で例示としてみなされるべきであって、本開示を限定するものとはみなされない。したがって、本開示の範囲は、上述の詳細な説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるため、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内にある全ての変更は、本明細書に含まれることが意図される。

【0318】

【表2】

【0319】

囲み又は下線を有する配列では、個々の文字の周りの囲みは、対応する野生型又は親配列に対するアミノ酸置換を示し、文字の群の周りの囲みは、リンカー配列を示す。下線付きの文字は、リンカー配列を示す。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図13I】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図14G】

【図14H】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】