特表 2022-516735 トマトブラウンルーゴスフルーツウイルスに抵抗性のトマト植物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-02

(54)【発明の名称】トマトブラウンルーゴスフルーツウイルスに抵抗性のトマト植物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/29 20060101AFI20220222BHJP

   A01H 6/82 20180101ALI20220222BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20220222BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20220222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/29

A01H6/82 ZNA

A01H5/10

A01H5/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021538784

(86)(22)【出願日】2019-12-09

(85)【翻訳文提出日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 EP2019084272

(87)【国際公開番号】W WO2020148021

(87)【国際公開日】2020-07-23

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2019/050830

(32)【優先日】2019-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509018845

【氏名又は名称】エンザ・ザデン・ビヘーア・ベスローテン・フエンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＡ ＺＡＤＥＮ ＢＥＨＥＥＲ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】イケマ， マリーケ

(72)【発明者】

【氏名】フェルヴェイ， コルネリス ウォルター

(72)【発明者】

【氏名】デ ラ フエンテ ファン ベンテム， セルジオ

(72)【発明者】

【氏名】ペレファレス， フレデリック ミシェル ピエール

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD04

2B030CA17

2B030CB02

(57)【要約】

本発明は、１つ又は複数のゲノム配列を含む、トバモウイルスに抵抗性のＳ．リコペルシクム種の植物に関する。より詳細には、本発明は、トマトブラウンルーゴスフルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性であるトマト植物（Ｓ．リコペルシクム）に関する。本発明は、トバモウイルスに対する抵抗性を提供するゲノム配列又は遺伝子座にさらに関する。さらに、本発明は、トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム植物を提供する方法に関する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トバモウイルスに抵抗性のＳ．リコペルシクム種の植物であって、ＴＢＲＦＶ抵抗性タンパク質をコードするＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子を含み、前記タンパク質が配列番号１１６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、植物。

【請求項2】

前記ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子が、配列番号１１５と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するコード配列を含む、請求項１に記載の植物。

【請求項3】

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される、又は前記配列番号のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する、１つ又は複数のゲノム配列を含む、請求項１又は２に記載の植物。

【請求項4】

配列番号８、配列番号１１、配列番号１４を含む、請求項１又は２に記載の植物。

【請求項5】

配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４を含む、請求項１又は２に記載の植物。

【請求項6】

トバモウイルス株Ｔｍ０、Ｔｍ１及びＴｍ２に抵抗性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物。

【請求項7】

前記トバモウイルスが、トマトブラウンルーゴスフルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の植物。

【請求項8】

前記ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子が、前記植物のゲノムにおいてヘテロ接合性又はホモ接合性で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の植物。

【請求項9】

前記１つ又は複数のゲノム配列が、前記植物のゲノム中でヘテロ接合性又はホモ接合性で存在する、請求項３～８のいずれか一項に記載の植物。

【請求項10】

前記１つ又は複数のゲノム配列が、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４３２７９中に見られるものである、請求項３～９のいずれか一項に記載の植物。

【請求項11】

前記ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子が、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４３２７９中に見られるものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の植物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の植物に由来する植物、植物部分、組織、細胞及び／又は種子。

【請求項13】

Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供する抵抗性遺伝子であって、配列番号１１５と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するコード配列によって表される、抵抗性遺伝子。

【請求項14】

Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供するゲノム配列であって、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される、又は前記配列番号のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する、ゲノム配列。

【請求項15】

Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供する抵抗性遺伝子座であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４、好ましくは配列番号３によって表される、遺伝子座。

【請求項16】

前記トバモウイルスがＴＢＲＦＶである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抵抗性遺伝子、ゲノム配列又は遺伝子座。

【請求項17】

トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム種の植物を提供する方法であって、
ａ）トバモウイルスに抵抗性であるＳ．ハブロカイテス植物を選択するステップであり、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の抵抗性遺伝子、ゲノム配列又は抵抗性遺伝子座、好ましくは前記抵抗性遺伝子の存在を確認するステップを含むステップと、
ｂ）ステップａ）の同定された抵抗性遺伝子、ゲノム配列又は遺伝子座を、例えば交雑によってＳ．リコペルシクム植物中に移入し、それによって前記Ｓ．リコペルシクム植物にトバモウイルス抵抗性を付与するステップとを含む、方法。

【請求項18】

ステップｂ）の後に、トバモウイルスに抵抗性である第１のＳ．リコペルシクム植物が選択され、トバモウイルスに抵抗性でない第２のＳ．リコペルシクム植物と交雑され、その後トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム植物を選択する、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ステップａ）においてＳ．ハブロカイテス植物中の前記抵抗性遺伝子、抵抗性を付与するゲノム配列又は抵抗性遺伝子座の前記存在を確認するステップが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、及び配列番号９４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２、好ましくは配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２からなる群から選択される１つ又は複数のマーカーによって実行される、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

Ｓ．リコペルシクム植物において請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子、抵抗性を付与するゲノム配列又は抵抗性遺伝子座の存在を確認するためのマーカーの使用であって、マーカーが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３及び配列番号９４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２、好ましくは配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２からなる群から選択される１つ又は複数である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１つ又は複数のゲノム配列を含む、トバモウイルスに抵抗性のＳ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）種の植物に関する。より詳細には、本発明は、トマトブラウンルーゴスフルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性であるトマト植物（Ｓ．リコペルシクム）に関する。本発明は、トバモウイルスに対する抵抗性を提供するゲノム配列又は遺伝子座にさらに関する。さらに、本発明は、トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム植物を提供する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

トバモウイルスは、タバコ、ジャガイモ、トマト及びナスなどのナス科植物を含めた植物を感染させるウイルス種であるビルガウイルス科の１つの属であり、世界中の野菜作物に対して最も深刻な脅威の１つである。トバモウイルスは、保護環境で栽培されるトマト作物において特に問題となり、外部からの種子汚染によって長距離にわたって、並びに作業者の手、衣服、道具による一般的な耕作行為を介して植物から植物へと機械的に伝達され、種子及び汚染土壌中で感染性を維持する能力がある。さらにまた、ウイルスに感染した場合にしばしば無病徴である一般的な雑草は、成長サイクルの間の隠れた貯蔵場所を構成する。

【0003】

トバモウイルス感染は、汚染した場合、作物に悲惨な効果を有し得る。例えば、ウイルスを含まない環境で育苗することによる感染の防止は、一般に費用がかかり及び／又は環境に不都合である。加えて、これらの方法は、満足な結果を必ずしも提供しない。

【0004】

トバモウイルスは、非エンベロープ型であり、らせん棒状の幾何形状を持ち、らせん対称である。ウイルス粒子は、棒形状であり、直径およそ１８ｎｍ、長さ３００～３１０ｎｍを有する。それらの正のセンス一本鎖ＲＮＡゲノムは、直鎖状でセグメント化されておらず、長さおよそ６．３～６．５ｋｂである。この属には、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）又はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトマイルドモットルウイルス（ＴｏＭＭＶ）、及び最近新しく発見されたトマトブラウンルーゴスフルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）を含めた３５種類以上のウイルス種が存在する。

【0005】

トマトにおいて、現在認識されているトバモウイルス（より詳細にはＴｏＭＶ）の４つの系統の呼称（Ｔｍ－０、Ｔｍ－１、Ｔｍ－２及びＴｍ－２^２）は、関連する野生種から、遺伝子移入された抵抗性（Ｒ）遺伝子であるＴｍ１、Ｔｍ２及びＴｍ２^２に基づく。Ｔｍ１遺伝子は、ソラナムハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）から遺伝子移入され、不完全優性である。Ｔｍ２及びＴｍ２^２遺伝子は、ソラナムペルビアナム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）から遺伝子移入され、ＴｏＭＶに対して優性の完全な抵抗性を付与する。しかしながら、抵抗性が克服されるにつれてトバモウイルスの新たな系統が出現し、メキシコ、ヨルダン及びイスラエルの商業的な畑において抵抗性を破るトバモウイルス種が、最近報告されている。

【0006】

２０１４年末から２０１５年初めにかけて、イスラエル及びヨルダンにおいてトマトに感染する新たな病害の発生が起こった。病徴がある植物は、葉にモザイクパターンを示し、葉の狭まり及び黄色の斑点のある果実を時として伴った。研究は、この新たな病害が新たなトバモウイルスであることを示し、ＴＢＲＦＶと呼ばれた。ＴＢＲＦＶ感染は、葉に壊死病斑を伴い、トマト植物は、季節の終わりに軽度の葉の病徴を示すが、果物に強い茶色の萎縮病徴を示し、果実を消費に適さないものとする。さらにまた、ナス科ファミリーの他のメンバーに関しては、例えばトウガラシ植物が、３０℃を上回る高温で、感染したトマト植物の前の成長サイクルからの汚染土壌に植えられた場合、ＴＢＲＦＶは同様に感染する能力があるようである。

【0007】

トバモウイルスに対する戦いにおいて、Ｒ遺伝子Ｔｍ２及びＴｍ２^２の遺伝子移入によって抵抗性がトマトに導入され、ＴｏＭＶに対する抵抗性を得られた。しかしながら、ウイルスタンパク質の異なるドメインは、異なるタンパク質構造から構成されており、異なる抵抗性メカニズムには新たな抵抗性メカニズム及び／又は抵抗性遺伝子が必要なので、これらＲ遺伝子は新たなＴＢＲＦＶに対し抵抗性を発揮しない。さらにまた、ウイルスは、適応し、進化しその結果ウイルス突破を生じることになるので、経時的に抵抗性は破られることになる可能性が非常に高い。従って、新たな抵抗性遺伝子を同定し及び／又は組み合わせて、特に新たなＴＢＲＦＶに抵抗性の作物を提供する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上記を考慮すると、当業者にはＴＢＲＦＶ抵抗性のトマト植物、より詳細にはＴＢＲＦＶ抵抗性のＳ．リコペルシクムのニーズがある。加えて、当業者にはＴＢＲＦＶ抵抗性のＳ．リコペルシクム植物を得るための方法及び手段を提供するニーズがある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

当業者における上記ニーズを解決することは、他の目的の中でも、本発明の目的である。他の目的の中でも、本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に概説される本発明によって満たされる。

【0010】

特に、他の目的の中でも、上記の目的は、第１の態様によると、トバモウイルスに抵抗性のＳ．リコペルシクム種の植物であって、ＴＢＲＦＶ抵抗性タンパク質をコードするＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子を含み、そのタンパク質は、配列番号１１６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する、植物よる本発明によって満たされる。ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子は、ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質をコードすると予測される。

【0011】

好ましい実施形態によると、本発明は、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子が、配列番号１１５と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％のヌクレオチド配列同一性を有するコード配列を含む、前記植物に関する。

【0012】

別の好ましい実施形態によると、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される、又は前記配列番号のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する、１つ又は複数のゲノム配列を含む、前記植物に関する。ゲノム配列は、トバモウイルスに対する抵抗性を提供する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝的エレメントをコードする。配列が、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の公開データベースを使用して遺伝子相同性に関して調べられた。６つのゲノム配列が、ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質をコードする配列と相同性を有する（配列番号７、８、９、１０、１１及び１４）。４つのゲノム配列が、ＬＲＲ受容体様セリン／トレオニンプロテインキナーゼと相同性を有する（配列番号５、６、１２及び１３）。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】トバモウイルス、より詳細にはＳ．リコペルシクムにおいてＴＲＢＦＶに対する抵抗性を提供する遺伝子座のマッピングの概要を示す図である。マッピング用として２つの集団を創出するために、抵抗性表現型について選択されたＳ．ハブロカイテス株９０４７９－３をＳ．リコペルシクム株ＯＴ９及びＯＴ１３１７と交雑することによってＦ１植物が創出された。７００個以上の植物が、ＴＲＢＦＶ抵抗性に関して試験され、いくつかの組換え植物（２１個の植物）が選択され、病害試験の結果が、マーカーデータと組み合わせられる。いくつかの分子マーカー（Ｍ１～Ｍ４２）を使用して、ＴＲＢＦＶに対する抵抗性を提供するゲノム配列の位置及びサイズを決定した。明らかな分離が、抵抗（Ｒ）と感染性（Ｓ）の植物間に観察された。結果は、マーカーＭ１６とＭ１７の間に位置するゲノム領域が、ＴＲＢＦＶ抵抗性を提供していることを示し；対応する遺伝子座（ＬＹＣ４９４３ Ｒ遺伝子座と命名される）は、長さ１３３，５１５ｂｐであり、いくつかの推定遺伝子を含んでいる。さらなる細かいマッピングに基づいて、ＴＢＲＦＶ抵抗性を保有しているゲノム配列のサイズ及び場所は、マーカーＭ３３とＭ３８の間にあると決定され、Ｓ．リコペルシクムのＳＬ２．４０参照ゲノムと比較しておよそ６８，０００ｂｐ大きい（それぞれ、８５，２４０ｂｐ対１７，３２８ｂｐ）。従って、１つ又は複数の遺伝子が、「ＴＢＲＦＶ領域」と示されるこの領域内に位置し、ＴＢＲＦＶ抵抗性を提供している可能性が最も高い。

【図2】本発明の感染した及び感染してないトマト植物（Ｓ．リコペルシクム）並びにＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まない植物においてＴＢＲＦＶを検出するためのｑＰＣＲの結果を示す図である。低いＣｔ値（即ち３０以下）は、サンプル中に存在するウイルスＲＮＡの多い存在を示す。ＯＴ９は、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まないトマト植物である。対照サンプル（感染していないＯＴ９）は、３５～４０サイクルのＣｔ値を示し、感染している対照サンプル（感染ＯＴ９）は、２０～２５のＣｔ値を示した。３０サイクル以上のＣｔ値、好ましくはおよそ３５サイクルを示す植物は、抵抗性と考えられ、３０未満のＣｔ値を示す植物は、感染性と考えられた。ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座、ホモ接合性（Ｂ）又はヘテロ接合性（Ｈ）を含むトマト植物は、３０サイクル以上のＣｔ値を有し、抵抗性と考えられる。さらに、結果は、抵抗性が優性であることを示している。ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まなかった植物（Ａ及び感染したＯＴ９）は、２０～２５のＣｔ値を示し、植物がＴＢＲＦＶ感染症に感染性であることを示した。

【図3】トバモウイルスに対する抵抗性を提供する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝的エレメントをコードする本発明のゲノム配列配列番号１～配列番号１８の図式的概観を示す図である。

【図4】図１に加えてトバモウイルスに対する抵抗性を提供する遺伝子座のさらなるマッピングの概要を示す図である。Ｍ３３及びＭ３８で植物をさらに遺伝子型判定することによってさらなる組換え選択を実行して、同定したＴＢＲＦＶ領域における組換え植物を同定し、さらにこのＴＢＲＦＶ領域を限定した。組換え植物が、ＴＢＲＦＶ遺伝子座を網羅し、ＴＢＲＦＶ遺伝子座内の候補領域、即ちトバモウイルスに対する抵抗性を提供する１つ又は複数の遺伝子又は遺伝的エレメントをコードする本発明のゲノム配列配列番号１～配列番号１８を除去するように特に設計されたマーカー（Ｍ－ＳＥＱ １０、Ｍ－ＳＥＱ １１－１、Ｍ－ＳＥＱ １１－２、及びＭ－ＳＥＱ １４）を用いてさらに遺伝子型判定された。組換え植物１５３２１－０２、１５３２１－０３及び１５３２１－０７が、ＴＢＲＦＶ分離株ＡＥ５０の接種による抵抗性に対してスクリーニングされた。これら組換え植物に基づいて、ＴＢＲＦＶ感染を決定するための表現型判定、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲデータと組み合わせて、抵抗性を付与する遺伝子がゲノム配列番号１４の部分であると結論された。植物１５３２１－０２及び１５３２１－０３は、配列番号１４を含まず、感染性の対照株ＯＴ９で得られた値に相当する高いＥＬＩＳＡスコア及び低いｑＰＣＲ Ｃｔ値でＴＢＲＦＶに対して感染性であることを示し、ウイルス感染を示した。植物１５３２１－０７は、配列番号１４を含み、低いＥＬＩＳＡスコア及びより高いｑＰＣＲ Ｃｔ値でＴＢＲＦＶに抵抗性であることを示した。

【図5】ホモ接合性のＴＢＲＦＶ抵抗性株（１５３２２－０４）及び感染性の対照株（ＯＴ９）におけるＥＬＩＳＡによるＴＢＲＦＶ感染を示す図である。植物を、ＴＢＲＦＶに感染させ（＋ＴＲＢＦＶ）、ＴＲＢＦＶ抵抗性遺伝子を特異的に標的する構築物ＶＩＧＳ－０１ａ又は同定されているＴＲＢＦＶ領域内の異なる領域を標的する構築物ＶＩＧＳ－０１ｂを浸潤させた。ＥＬＩＳＡの読み取りは、４０５ｎｍでの吸収の測定によって行われた。ＴＢＲＦＶによって感染させた対照植物ＯＴ９は、２０００ａｂｓ又はより高い吸収レベルをもたらしたが、ＴＲＢＦＶで感染させた抵抗性植物株はおよそ５００ａｂｓの吸収レベルをもたらした。抵抗性植物株においてＴＲＢＦＶ抵抗性遺伝子が、ＶＩＧＳ－０１ａによってサイレンシングされた場合、１５００～２２５０ａｂｓの吸収レベルが測定され、ウイルス感染を示した。抵抗性植物株におけるＶＩＧＳ－０１ｂによるサイレンシングは、ＶＩＧＳによってサイレンシングされていない感染させた抵抗性植物株において観察されたのと類似の吸収レベルをもたらした。

【図6】ホモ接合性のＴＢＲＦＶ抵抗性株（１５３２２－０４）及び感染性の対照株（ＯＴ９）におけるｑＰＣＲによるＴＢＲＦＶ感染を示す図である。植物を、ＴＢＲＦＶに感染させ（＋ＴＲＢＦＶ）、ＴＲＢＦＶ抵抗性遺伝子を特異的に標的する構築物ＶＩＧＳ－０１ａ又は同定されているＴＲＢＦＶ領域内の異なる領域を標的する構築物ＶＩＧＳ－０１ｂを浸潤させた。感染させた対照サンプルはおよそ１２又は１３のＣｔ値を示した。ＴＲＢＦＶで感染させた抵抗性植物株は、およそ３０のＣｔ値を示し、ＴＢＲＦＶ抵抗性を示した。抵抗性植物株においてＴＲＢＦＶ抵抗性遺伝子が、ＶＩＧＳ－０１ａによってサイレンシングされた場合、Ｃｔ値は、感染させた対照細胞より高いおよそ１２～２０に低下することが観察され、ウイルス感染を明らかに示した。抵抗性植物株におけるＶＩＧＳ－０１ｂによるサイレンシングは、ＶＩＧＳによってサイレンシングされていない感染させた抵抗性植物株において観察されたのと類似のＣｔレベル（Ｃｔ値およそ３０）をもたらした。

【発明を実施するための形態】

【0014】

植物による病原体認識は、２つの主要な型のタンパク質が関わる宿主受容体の関連する２つの群、即ち、受容体様キナーゼ又はタンパク質（ＲＬＫ又はＲＬＰ）及びヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピートタンパク質（ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質）を介して行われる。第１の群は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識を専門とするパターン認識受容体（ＰＲＲ）である。ＲＬＰ又はＲＬＫは、細胞膜に結合しており、細胞外免疫受容体である。植物ＲＬＫは、植物－病原体相互作用及び防御応答に関係し、植物受容体キナーゼ（ＰＲＫ）は、細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び細胞質セリン／トレオニン（ｓｅｒ／ｔｈｒ）プロテインキナーゼドメインを含有するタンパク質と定義され得る。植物ＬＲＲ－ＲＬＫ（ロイシンリッチリピート－受容体様キナーゼ）は、機能的細胞質キナーゼドメインを保有し、現在までに分析されている植物ＬＲＲ－ＲＬＫの全ては、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ活性を保有する。これら受容体によって得られる病原体に対する抵抗性は、ＰＡＭＰ誘導性免疫（ＰＴＩ）と呼ばれる。他の群は、抵抗性タンパク質（Ｒタンパク質）と呼ばれる細胞内受容体を主に含む。植物における病害抵抗性遺伝子の大多数は、ヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピートタンパク質、別名ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質をコードしている。これらのタンパク質は、ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）及びロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン並びに可変的なアミノ及びカルボキシ末端ドメインによって特徴付けられ、細菌、ウイルス、真菌、線虫、昆虫及び卵菌を含めた多様な病原体の検出に関係する。トバモウイルス抵抗性を提供する同定されているゲノム配列の大多数は、複数のＬＲＲドメインを含む。これらドメインが、エフェクター認識、従って病害感染性／抵抗性を決定すると思われる。

【0015】

病原体は、ＰＡＭＰ又はＭＡＭＰを修飾又は変化させることによってＰＴＩを乗り越えるための反対戦略を発達させる。次いで、植物は、これらエフェクターを認識する方法を発達させ、エフェクター誘導性免疫（ＥＴＩ）として公知のより速く、より強い二次防御応答を誘導することになる。ＥＴＩは、Ｒタンパク質によって媒介され、感染部位の周りに限局性の細胞死を伴う。ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質及び／又は植物受容体キナーゼをコードしているこれらの新しく同定された抵抗性遺伝子及び／又はゲノム領域の存在は、抵抗性を乗り越える病原体の機会を低下させることになる、或いは他の抵抗性遺伝子と組み合わせた場合、病害抵抗性は、なおいっそう改善され得る。

【0016】

好ましい実施形態によると、本発明は、配列番号３によって表されるゲノム配列を含む、前記植物に関する。ゲノム配列配列番号３は、ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質及びＬＲＲ受容体様セリン／トレオニンプロテインキナーゼをコードする配列と相同性を有する複数の配列を含む。

【0017】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む、前記植物に関する。

【0018】

本発明によると、植物のトバモウイルス抵抗性は、配列番号８、９、１０、１１及び１４の群から選択されるＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質をコードしているゲノム配列のうちの１つ又は複数、例えば配列番号８と配列番号９、又は配列番号８と配列番号１０、配列番号８と配列番号１１、配列番号９と配列番号１０、配列番号９と配列番号１１、配列番号１０と配列番号１１の組合せによる影響を受け得る。さらに又は代わりに、抵抗性は、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１２及び配列番号１３の群から選択されるＬＲＲ受容体様セリン／トレオニンタンパク質キナーゼをコードする１つ又は複数のゲノム配列による影響を受け得る。

【0019】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１４のゲノム配列を含む、前記植物に関する。

【0020】

好ましい実施形態によると、本発明は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４を含む、前記植物に関する。

【0021】

別の好ましい実施形態によると、本発明は、トバモウイルス株Ｔｍ－０、Ｔｍ－１及びＴｍ－２に抵抗性である、前記植物に関する。トマトにおいて、４つの系統のトバモウイルスが、同定されている；Ｔｍ－０、Ｔｍ－１、Ｔｍ－２及びＴｍ－２^２。

【0022】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、トマトブラウンルーゴスフルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性である、前記植物に関する。

【0023】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明、ＴＢＲＦＶが、ウイルス分離株ＡＥ０５０である、前記植物に関する。

【0024】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、トマト植物［ソラヌムリコペルシクム］である、前記植物に関する。

【0025】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、１つ又は複数のゲノム配列及び／又はＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子が、前記植物のゲノムにおいてヘテロ接合性又はホモ接合性で存在する、前記植物に関する。実験データから、抵抗性は優性であり、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子及び／又はゲノム配列は、トバモウイルスに対する抵抗性を得るためには植物のゲノム中で少なくともヘテロ接合性で存在しなければならないと結論され得る。

【0026】

さらに別の好ましい実施形態によると、本発明は、前記ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子及び／又は１つ若しくは複数のゲノム配列が、寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４３２７９中に見られるものである、前記植物に関する。ＮＣＩＭＢ ４３２７９、ソラヌムリコペルシクム種子は、ＮＣＩＭＢ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、ＡＢ２１ ９ＹＡ Ａｂｅｒｄｅｅｎ、英国で、２０１８年１１月１６日に寄託された。

【0027】

本発明は、第２の態様によると、本発明の植物に由来する植物、植物部分、組織、細胞及び／又は種子に関する。

【0028】

本発明は、別の態様によると、Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供する前記抵抗性遺伝子（ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子）であって、配列番号１１５と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するコード配列によって表される、抵抗性遺伝子に関する。

【0029】

本発明は、別の態様によると、Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供するゲノム配列であって、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される、又は前記配列番号のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する、ゲノム配列に関する。好ましくは、ゲノム配列は、配列番号８、配列番号１１又は配列番号１４である。

【0030】

本発明は、別の態様によると、Ｓ．リコペルシクム植物においてトバモウイルスに対する抵抗性を提供する抵抗性遺伝子座であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４、好ましくは配列番号３によって表される、遺伝子座に関する。

【0031】

本発明の好ましい実施形態によると、抵抗性遺伝子、ゲノム配列又は抵抗性遺伝子座は、ＴＢＲＦＶに対する抵抗性を提供する。

【0032】

本発明は、別の態様によると、トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム種の植物を提供する方法であって、
ａ）トバモウイルスに抵抗性であるＳ．ハブロカイテス植物を選択するステップであり、本発明の抵抗性遺伝子、ゲノム配列又は抵抗性遺伝子座の存在を確認するステップを含むステップと、
ｂ）ステップａ）の同定されたゲノム配列又は遺伝子座をＳ．リコペルシクム植物中に移入し、それによって前記Ｓ．リコペルシクム植物にトバモウイルス抵抗性を付与するステップとを含む、方法に関する。移入は、選択されたＳ．ハブロカイテス植物をＳ．リコペルシクムと交雑することによって行われ得る。その後、トバモウイルス抵抗性のＳ．リコペルシクム植物が選択され得る。

【0033】

別の好ましい実施形態によると、本発明は、ステップｂ）の後に、トバモウイルスに抵抗性である第１のＳ．リコペルシクム植物が選択され、トバモウイルスに抵抗性でない第２のＳ．リコペルシクム植物と交雑され、その後トバモウイルスに抵抗性であるＳ．リコペルシクム植物を選択する、前記方法に関する。

【0034】

好ましい実施形態によると、本発明は、ステップａ）において、Ｓ．ハブロカイテス植物中の抵抗性遺伝子（ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子）、抵抗性を付与するゲノム配列又は抵抗性遺伝子座の存在を確認するステップは、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、及び配列番号９４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２、好ましくは配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数によって実行される、前記方法に関する。

【0035】

本発明は、さらなる態様によると、Ｓ．リコペルシクム植物においてＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子、ＴＢＲＦＶ抵抗性を付与するゲノム配列又は抵抗性遺伝子座の存在を確認するためのマーカーの使用であって、マーカーが、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、及び配列番号９４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２、好ましくは、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２からなる群から選択される１つ又は複数である、使用に関する。

【0036】

本発明は、以下の例及び図においてさらに詳述されることになる。

【実施例】

【0037】

ＴＢＲＦＶのトマト植物への接種
ＴＢＲＦＶ分離株ＡＥ０５０（サウジアラビア起源）を使用して、病害アッセイを実行した。植物材料としてＴＢＲＦＶに感染性の植物株である株ＯＴ９を使用して、ウイルスを維持した。株ＯＴ９に葉液を機械的に接種するために元サンプルから入手した病徴のある葉を使用した。ウイルスを、新たな３週齢の苗に対する毎月の葉液の機械的接種によって全身的に感染させたトマト植物ＯＴ９上で維持した。

【0038】

ソラヌムペンネリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、Ｓ．ペルビアナム、Ｓ．キレンセ（Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、Ｓ．ハブロカイテス、Ｓ．ピンピネリフォリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）、Ｓ．ネオリキイ（Ｓ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）、Ｓ．コルネリオムレリ（Ｓ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｌｌｅｒｉ）、Ｓ．クミエレウスキイ（Ｓ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、Ｓ．ケエスマニアエ（Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）、Ｓ．ガラパゲンセ（Ｓ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）の種のトマト植物をスクリーニングした（合計９１２個の野生ナス属系統からおよそ８００個）。各系統の植物１２個を、ＴＢＲＦＶ分離株ＡＥ０５０で感染させた。

【0039】

種子をバーミキュライト中に播種し、苗をロックウールブロックに移植し、播種４週間後に接種した。出発材料として、感染させたＯＴ９の病徴がある葉を採集し、カーボランダム（１グラム／１００ｍＬ）を含む冷却した脱塩水中で乳鉢及び乳棒ですり潰した。各試験植物の３週齢の苗の最も古い葉を、１本指で葉を一回穏やかに擦ることによってＡＥ０５０で機械的に接種した。

【0040】

植物を、植物及び葉の目視による得点によって表現型判定した。植物を、一定の時間間隔での目視により病徴について得点する。接種の２、４及び６週間後に病徴を目視で査定し、残りの植物に対するＥＬＩＳＡ試験を６週目以降１カ月間隔で行った。植物の５０％以上は、接種２週間後に既に病徴を示した。

【0041】

目視による得点を、１週間毎に実行した。植物を、目視による病徴について得点する。葉の黄色いモザイクパターン、葉の変形（狭まり、斑点）の存在を、植物レベルで１週間毎に記録した。最初の病徴は、接種１２～１４日後に一般に観察された。葉にそのような病徴が観察されなかった場合、植物を抵抗性と分類した。葉に病徴のいずれかを示した植物を、「感染性」と分類した。葉サンプルを無病徴植物（即ち抵抗性）から採集して、ＥＬＩＳＡによって、いずれかのウイルスの存在について試験した。

【0042】

スクリーニングにより、抵抗性育種のためにいくつかの候補を選択することが可能になり、最良の候補は、ペルー由来のＳ．ハブロカイテス系であるＬＹＣ４９４３であった。ＬＹＣ４９４３は、接種後１５週間以上病徴がなく、ＥＬＩＳＡによりウイルスを含まないことを試験した。

【0043】

ＥＬＩＳＡによるＴＢＲＦＶ感染の決定
感染をＥＬＩＳＡによって決定した。全ての植物から頂部葉（完全に広がっている）１枚を採集した。葉を、Ｒ３０２ Ｄ６３Ｎ－４７２型機械（ＶＥＣＴＯＲ ａａｎｄｒｉｊｆｔｅｃｈｎｉｅｋ Ｂ．Ｖ．、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、オランダ）を使用して破砕し、葉液を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液２ｍＬを添加することによって採集した。抽出液１００μＬを、ＴｏＭＶに対する抗体（供給元Ｐｒｉｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ）と共にＥＬＩＳＡに使用した。ＥＬＩＳＡの読み取りを、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ装置で４０５ｎｍの吸収を測定することによって行った。純系の対照植物の１．５倍以上の吸収値を示す植物は、感染している（感染性）と考えられた。

【0044】

ＴＢＲＦＶ抵抗性ゲノム配列のバイオアッセイ及びマッピング
元のＬＹＣ４９４３（Ｓ．ハブロカイテス）種子ロットを、抵抗性について分離する。９つの異なるＦ１ファミリーを、バイオアッセイ用に播種して、完全に抵抗性であり（抵抗性が固定されている）、さらなる戻し交配に使用されることになるＦ１ファミリーを同定した。４つのＦ１ファミリーが発芽し、バイオアッセイにおいて試験された。ＬＹＣ４９４３植物３（９０４７９－３）で創出されたＦ１植物を抵抗性表現型について選択して、戻し交配株としてＳ．リコペルシクム株ＯＴ９及びＯＴ１３１７を選択してマッピング用として２つの集団を創出した。マッピングに使用されたマーカーＭ１～Ｍ４２（それぞれ、配列番号１９～配列番号１０２）を表１に挙げる。

【0045】

２９８個の植物［（ＯＴ９×９０４７９－３）×ＯＴ９］及び４８４個の植物（ＯＴ１３１７×９０４７９－３）＝合計７８２個の植物を、ＴＢＲＶＦ分離株ＡＥ０５０で接種した。接種２～３週間後にはＴＢＲＦＶ病徴が存在し、眼による表現型判定を行った。明らかな分離が、抵抗性（Ｒ）と感染性（Ｓ）植物の間に観察され、抵抗性の表現型は、参照ゲノムＳＬ２．４０（Ｓ．リコペルシクム）において２，６７３，６０９ｂｐで８番染色体上に位置するマーカーＭ１（表１を参照のこと）と連鎖している可能性がある。９２個の植物を、２６個のマーカーで遺伝子型判定して、ＱＴＬに隣接させた（Ｍ２～Ｍ２７、表１を参照のこと）。これらの結果に基づくと、抵抗性は、参照ゲノムＳＬ２．４０において５３，１１８，９８４ｂｐ～５７，０３８，５４４ｂｐの間にマップされ得る（Ｍ８とＭ２０の間、表１及び図１を参照のこと）。

【表1】

【0046】

７８２個の植物の全体の集団を、隣接するマーカーＭ８及びＭ２０で遺伝子型判定して、さらなる細かいマッピングのために組換え植物を見いだした。これにより、２１個の組換え植物を得られた（図１を参照のこと）。これら２１個の組換え植物を選択し、１１個のマーカーＭ９～Ｍ１９で遺伝子型判定して、領域をさらに細かくマップした（表１）。抵抗性は、参照ゲノムＳＬ２．４０上で５６，９２０，７２０～５６，９９０，００４の間（マーカーＭ１６とＭ１７の間）で細かくマップされ得る。

【0047】

Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ配列決定技術を使用して抵抗性ＬＹＣ４９４３領域を配列決定することにより、１３３，５１５ｂｐの遺伝子座を得た。２１個の組換え植物を、ＬＹＣ４９４３のこの特定の遺伝子座内の追加のマーカー（Ｍ２８～Ｍ４２）で遺伝子型判定した。組換え植物、植物５９４及び６０８に基づくと、抵抗性領域は、参照ゲノムＳＬ２．４０に基づいて５６，９４１，０４３～５６，９５８，３７１位の間に位置し、ＬＹＣ４９４３遺伝子座上の１５，８９３～１０１，１３３位の間の位置（Ｍ３３とＭ３８の間、図１を参照のこと）と一致すると決定された。

【0048】

細かいマッピングに基づいて、ＴＢＲＦＶ抵抗性を保有しているゲノム配列のサイズ及び場所は、マーカーＭ３３とＭ３８の間にあると決定され、Ｓ．リコペルシクムのＳＬ２．４０参照ゲノムと比較しておよそ６８，０００ｂｐ大きい（それぞれ、８５，２４０ｂｐ対１７，３２８ｂｐ）。従って、１つ又は複数の遺伝子が、図１において「ＴＢＲＦＶ領域」と示されるこの領域内に位置し、ＴＢＲＦＶ抵抗性を提供している可能性が非常に高く、この出願において配列番号３と示される。参照ゲノムＳＬ２．４０及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測分析（ＩＴＡＧ ２．３）に基づくと、ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、細かくマップした領域内に位置する。米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースに対して細かくマップしたＴＢＲＦＶ領域をｂｌａｓｔ検索することにより、７つのゲノム断片が得られ、そのうち５つ（配列番号８、９、１０、１１及び１４）は、ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質と相同性を有し、２つ（配列番号１２及び配列番号１３）は、ＬＲＲ受容体様セリン／トレオニンプロテインキナーゼと相同性を有する。

【0049】

次に、さらなる細かいマッピングを実行し、６６８個のＢＣ２植物［（ＯＴ９×９０４７９－３）×ＯＴ９×ＯＴ９］をＭ３３及びＭ３８で遺伝子型判定することによって組換え選択を実行して、ＴＢＲＦＶ領域における組換え植物を同定し、それにより、３つの植物１５３２１－０２、１５３２１－０３及び１５３２１－０７を得た（図４を参照のこと）。これら３つの植物を、ＴＢＲＦＶ分離株ＡＥ５０の接種によって抵抗性について試験した。ＴＢＲＦＶ接種のおよそ３週間後に、植物を観察によって表現型判定し、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲを実行してウイルス感染をモニタリングした。組換え植物を、ＴＢＲＦＶ遺伝子座を網羅し、ＴＢＲＦＶ遺伝子座内の候補遺伝子を除去するように特に設計されたマーカー（Ｍ－ＳＥＱ １０、Ｍ－ＳＥＱ １１－１、Ｍ－ＳＥＱ １１－２、及びＭ－ＳＥＱ １４、それぞれ配列番号１０５～配列番号１１２）を用いて遺伝子型判定した。この手法により、本発明の候補ゲノム配列、配列番号１～配列番号１８のうちどれが、ＴＢＲＦＶに対する抵抗性を特に提供するかという洞察を得られる。組換え植物並びに病害試験、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲによる表現型判定に基づいて、抵抗性を付与する遺伝子が、配列番号１４のゲノム配列、より詳細には配列番号１６のタンパク質をコードしている配列番号１１５のコードＤＮＡ配列によってコードされていると結論した。

【0050】

ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含む植物におけるＴｍ０、Ｔｍ１及びＴｍ２系統抵抗性の検証
ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座（配列番号１）を含む本発明のトマト植物（Ｓ．リコペルシクム）を、Ｔｍ０、１及び２系統に対して抵抗性について試験した。ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座の存在を、マーカーＭ１６、Ｍ１７及びＭ３３によって決定した。植物が、Ｔｍ２^２遺伝子（Ｔｍ０、１及び２系統に対する抵抗性をもたらす公知の遺伝子である）を含有しないことを、さらに確認した。一部の場合において、植物は、Ｔｍ１抵抗性遺伝子を含有した。対照として、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含有しない植物を選択した。

【0051】

６つの植物がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座（ヘテロ接合性）を含み、２つの植物（７及び８）がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まない８つの植物（表２、１～８を参照のこと）に、Ｔｍ０分離株を接種した。６つの植物がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座（ヘテロ接合性）を含み、２つの植物（１５及び１６）がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まない８つの植物（表２、９～１６を参照のこと）に、Ｔｍ－１分離株を接種した。４つの植物がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座（２つのホモ接合性１７、１８、＋２つのヘテロ接合性１９、２０）を含み、４つの植物がＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まない８つの植物（表２、１７～２８を参照のこと）に、Ｔｍ２分離株を接種した。対照として、感染性の栽培種トマト株ＯＴ９５にも、３つ全ての系統を接種した。

【0052】

第１の病徴は、接種１２～１４日後に一般に観察された。葉にモザイクパターンの病徴が観察されなかった場合、植物を抵抗性（Ｒ）と分類し；葉に病徴のいずれかを示した植物を、感染性（Ｓ）と分類した。１つ１つの植物の表現型を、ＴＢＲＦＶ遺伝子型と比較した。結果を、以下の表２に要約する。

【表2】

【0053】

結果Ｔｍ０
ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含有した植物は全て抵抗性である。植物７及び８は、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含有しないが、抵抗性であった。その結果を説明し得る理由は、Ｔｍ１遺伝子が、ＴｏＭＶ分離株Ｔｍ－０に対する抵抗性の原因であるということである。加えて、植物１、２及び３は、Ｔｍ１遺伝子を含有しないが、ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含有し、抵抗性であることを示した。

【0054】

結果Ｔｍ１
抵抗性表現型は、ＴＢＲＦＶ遺伝子型と連鎖しており、ＴｏＭＶ分離株Ｔｍ－１に対する抵抗性をもたらす。

【0055】

結果Ｔｍ２
抵抗性表現型（ヘテロ接合性、ホモ接合性）は、ＴＢＲＦＶ遺伝子型と連鎖しており、ＴｏＭＶ分離株Ｔｍ－２に対する抵抗性をもたらす。

【0056】

ｑＰＣＲによるトマト（Ｓ．リコペルシクム）におけるＴＢＲＦＶ感染の決定
ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座（ヘテロ接合性又はホモ接合性）を含むトマト植物及びこの領域を含有しない植物を、マーカー（Ｍ１６及びＭ１７）を使用してＴＢＲＦＶバイオアッセイのために選択した。植物をＴＢＲＦＶに感染させ、感染性トマト株ＯＴ９（感染させていない及び感染させたＯＴ９）を対照として含めた。

【0057】

接種３週間後に、全ての植物の、植物の最上部の葉１枚を、６．３５ｍｍの金属小球を含有する２ｍＬ管に採集した。管を、液体窒素中で凍結させた。管を高速で振盪して、植物材料を粉砕した。管を遠心沈殿させた後、マシュレ－ネーゲル（Ｍａｃｈｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）（商標）ヌクレオスピン（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ）（商標）ＲＮＡ Ｐｌａｎｔを使用して標準的なＲＮＡ摘出を実施した。ＲＮＡ濃度を、ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ ９６（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して測定し、濃度１００ｎｇ／μＬに希釈した。９００ｎｇを使用して、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ合成した。ｃＤＮＡ １０ｎｇを使用して、インターカレート色素としてＬＣ Ｇｒｅｅｎを使用してリアルタイムＰＣＲした。ＴＢＲＦＶ系統を増幅するために２つのプライマーの組合せを使用した、表３を参照のこと（それぞれ配列番号１０３及び配列番号１０４）。

【表3】

【0058】

サンプル中に存在するウイルスＲＮＡが多いほど、（ウイルスＲＮＡの）ｃＤＮＡを増幅し、シグナルを拾うのに必要なＰＣＲサイクルがより少ないので、ｑＰＣＲにおけるＣｔ値は低くなる。対照サンプル（感染していないＯＴ９）は、３５～４０サイクルのＣｔ値を示し、感染している対照サンプル（感染ＯＴ９）は、２０～２５のＣｔ値を示した。従って、３０サイクル以上のＣｔ値、好ましくはおよそ３５サイクルを示す植物は、抵抗性と考えられ、３０未満のＣｔ値を示す植物は、感染性と考えられた。（図２を参照のこと）。

【0059】

ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座、ホモ接合性（Ｂ）又はヘテロ接合性（Ｈ）を含むトマト植物は全て、３０サイクル以上のＣｔ値を有し、抵抗性と考えられ得る。結果は、抵抗性が優性であることを示している。ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含まなかった植物（Ａ）は、２０～２５のＣｔ値を示し、植物がＴＢＲＦＶ感染症に感染性であることを示した。

【0060】

抵抗性トマト植物のゲノム配列の配列決定
２０１８年４月２７日にＮａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（２０１８年）、Ｒａｃｈａｅｌ Ｗｏｒｋｍａｎら、「Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」において公開されたプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを、本発明の抵抗性植物（Ｓ．リコペルシクム）、即ちＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子座を含む植物から単離した。配列決定ライブラリを、ＰＣＲ不要の、非多重化、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ－Ｐｒｏｍｅｔｈｉｏｎ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）を使用して調製した。単離手順の結果、配列決定のためにＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシステム（ＯＮＴ配列決定）で使用される高品質配列決定ライブラリを得た。Ｐｒｏｍｅｔｈｉｏｎ Ｆｌｏｗｃｅｌｌ Ｐａｃｋｓ（３０００個細孔／フローセル）バージョンＲ９．４．１．を配列決定に使用した。

【0061】

さらにまた、ＴＢＲＦＶ遺伝子座をさらに分析し、ＴＢＲＦＶ抵抗性を提供する遺伝子を同定するために、抵抗性株（ＬＹＣ４９４３）においてＯＮＴ配列決定を実行した。抵抗性ＬＹＣ４９４３株の完全な転写産物アイソフォームの配列決定を、Ｉｓｏ－Ｓｅｑ分析アプリケーション（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＰａｃＢｉｏ）を使用して行った。これにより、マーカーＭ３３とＭ３８の間、より詳細には配列番号１１５のＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子の領域に位置する候補抵抗性転写産物／遺伝子を１つだけ得た。この転写産物は、配列番号１１６のＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ抵抗性タンパク質をコードすると予測された。

【0062】

ＶＩＧＳを使用する遺伝子検証
ＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子（配列番号１１５）が実際にＴＢＲＦＶに対する抵抗性を付与する遺伝子であることを確認するために、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分析を実行した。タバコ茎壊疽ウイルス（ＴＲＶ）由来のＶＩＧＳベクターが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、リコペルシコンエスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）などの植物及び他の植物において遺伝子機能を研究するために多く記載されている［例えばＨｕａｎｇ Ｃ、Ｑｉａｎ Ｙ、Ｌｉ Ｚ、Ｚｈｏｕ Ｘ．：Ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１２年；５５（２）：９９～１０８頁を参照のこと］。

【0063】

従って、２つのＶＩＧＳ構築物、配列番号１１５を特異的に標的するための１つの構築物ＶＩＧＳ－０１ａ、及び配列番号７、即ち以前に同定されているＴＢＲＦＶ遺伝子座内に同様に位置する配列を標的する対照構築物ＶＩＧＳ－０１ｂを開発した（表４）。

【表4】

【0064】

ＶＩＧＳ断片を合成し（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋｓ）その後ＴＲＶベクターへとクローニングした。ＤＮＡ配列を、サンガー配列決定によって確認した。ベクターは、標的配列を含む機能的ＴＲＶ粒子に必要とされるタンパク質をコードしている配列を全て含有する。ＶＩＧＳ－０１ａ及びＶＩＧＳ－０１ｂ構築物を含むＶＩＧＳベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）系統ＧＶ３１０１に形質転換し、ＶＩＧＳ実験に使用して、本実験に使用したトマト植物中の内在性ｍＲＮＡレベルを減少させた。ホモ接合性ＴＢＲＦＶ抵抗性株（１５３２２－０４）及び感染性対照株（ＯＴ９）を、ＶＩＧＳ実験に使用し、植物を、苗段階（子葉）でアグロバクテリウム浸潤させ、その後アグロバクテリウム浸潤の３週間後にＴＢＲＦＶ分離株Ｅ５０を接種した。ＴＢＲＦＶ接種２週間後、個々の植物を、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲによって表現型判定し、構築物ＶＩＧＳ－０１ａを浸潤させた抵抗性植物では感染性が見られたが、構築物ＶＩＧＳ－０１ｂを使用して浸潤させた抵抗性植物に感染性は検出されないことが明らかになった。ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲの結果を、図５及び図６に示し、結果を表５に要約した。

【表5】

【0065】

予想通り、ＯＴ９株植物は全て感染性であった。疑わしいＴＢＲＦＶ抵抗性遺伝子を、この遺伝子を特異的に標的するように設計したＶＩＧＳ－０１ａ構築物を使用してサイレンシングした場合、完全に抵抗性であることが以前に示されたＲ株がＴＢＲＦＶに感染性になり、一方でＶＩＧＳ－０１ｂ構築物（対照構築物）を使用したサイレンシングは、試験した植物にいかなる感染性ももたらさなかった。これらの結果に基づくと、遺伝子配列番号１１５が、ＴＢＲＦＶに対する抵抗性を付与すると結論され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】