知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-03
(54)【発明の名称】眼の血管新生を促進するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/19 20060101AFI20220224BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220224BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220224BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220224BHJP
【ＦＩ】
A61K38/19
A61P27/02
A61P43/00 111
A61P9/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021538948
(86)(22)【出願日】2019-12-26
(85)【翻訳文提出日】2021-07-26
(86)【国際出願番号】 US2019068595
(87)【国際公開番号】W WO2020142349
(87)【国際公開日】2020-07-09
(31)【優先権主張番号】62/788,174
(32)【優先日】2019-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508228061
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】フェラーラ，ナポレオン
(72)【発明者】
【氏名】リ，チン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ピン
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084DA01
4C084MA58
4C084NA14
4C084ZA33
(57)【要約】
白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）を含むＩＬ－６ファミリータンパク質を有する、眼の血管新生を促進するための組成物および方法が提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の眼における不十分な血管形成に関連する状態のための治療の方法であって、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与して、血管新生を促進することを含む、方法。
【請求項2】
前記投与が、網膜微小血管密度を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記投与が、脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記状態が、加齢性黄斑変性症である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記状態が、未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記投与が、硝子体内注射を介する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記有効量が、血管漏出を誘導しない、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記有効量が、浮腫を誘導しない、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＩＬ－６ファミリータンパク質が、白血病阻害因子（ＬＩＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＩＬ－６ファミリータンパク質が、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
対象の前記眼における血管形成を誘導する方法であって、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項12】
前記投与が、網膜血管新生を増加させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記投与が、脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記対象が、加齢性黄斑変性症を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記対象が、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記投与が、硝子体内注射を介する、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
前記有効量が、血管漏出を誘導しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
前記有効量が、浮腫を誘導しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項19】
前記ＩＬ－６ファミリータンパク質が、白血病阻害因子（ＬＩＦ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項20】
前記ＩＬ－６ファミリータンパク質が、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）である、請求項１０に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月４日に申請された米国仮出願第６２／７８８，１７４号の優先権の利益を主張し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１月４日に申請された米国仮出願第６２／７８８，１７４号の優先権の利益を主張し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、眼の状態を軽減するための血管新生の促進に関する。
【背景技術】
【0003】
血管新生は、胚発生、成人の血管恒常性、および組織修復に必要な生理学的プロセスである（１）。しかし、血管新生は、腫瘍、および湿性加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含むいくつかの眼内障害などのさまざまな病的状態にも寄与する（１）。腫瘍の進行中、新しい血管は、腫瘍組織に栄養素および酸素を提供し、したがって、重要な役割を果たし、眼内障害では、異常な漏出血管の成長が網膜を破壊し、失明につながり得る（１、２）。血管新生の分子基盤を分析し、新生物および他の疾患の療法的標的を特定するための広範な努力の結果、血管の発達および分化を伴う重要なシグナル伝達経路が発見された（１、３）。特に、多くの研究によって、生理学的血管新生におけるＶＥＧＦ経路の極めて重要な役割が確立され、この経路を標的とする療法は、癌および湿性ＡＭＤなどの眼疾患の治療に成功している（４、５）。逆に、血管新生を刺激することは、灌流の改善を通じて、さまざまな虚血性疾患を有する患者の転帰を改善する可能性を秘めている（６）。この仮説は、過去数十年間に一連の臨床試験を導き、冠状動脈または四肢虚血患者において遺伝子療法によってまたは組換えタンパク質として送達されるＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどの血管新生因子が試験された。残念ながら、前臨床研究が有望であるにもかかわらず、これらの研究はいずれも成功しなかった（７）。したがって、血管新生療法を改善するための新規の戦略を特定する必要がある。
【0004】
神経膠芽腫細胞はさまざまな血管新生因子を分泌し、そのような腫瘍の高度な血管表現型に寄与する（８）。ＬＮ－２２９神経膠芽腫細胞株に由来する異種移植腫瘍は、ＶＥＧＦの発現が非常に低いにもかかわらず、十分に血管形成される（９、１０）。したがって、ＬＮ－２２９セクレトームは、推定上の内皮マイトジェンを特徴付けるのに興味深いものである。
【0005】
サイトカインのＩＬ－６スーパーファミリーには、白血病阻害因子（ＬＩＦ）が含まれる。それは、胚性幹細胞の多能性を維持する能力があるため、実験的幹細胞生物学で幅広く使用されている。胚着床、造血細胞の発達、炎症応答、腫瘍の進行を含む異なるタイプの細胞および組織におけるＬＩＦのさまざまな役割も観察されている（６７）。
【0006】
血管新生におけるＬＩＦの役割には、まだ議論の余地がある。それは、当初はウシ大動脈内皮細胞における抗血管新生因子として特徴付けられ、ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞に対して効果を示さず（３５）、ＬＩＦが異なるタイプの内皮細胞において明確に機能することを示唆している。その後の研究では、かなりの複雑さが示された。ＬＩＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは、眼の血管系の低減および網膜血管の発達の抑制を示したが（１４）、ホモ接合型ＬＩＦノックアウト対立遺伝子を担持するマウスは、網膜の血管密度の増加を有した（１６）。出生後早期に子ラットに組換えＬＩＦを注射した結果、網膜の発達において無血管領域がわずかに増加した（２２）。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、ＩＬ－６スーパーファミリーのメンバー、およびその機能的フラグメントが、加齢性黄斑変性症および未熟児網膜症（ＲＯＰ）などであるが、これらに限定されない状態を療法的に治療する必要がある対象の眼の血管新生を増加させるために使用され得ることを提供する。実施形態において、対象は、ヒトである。
【0008】
実施形態において、本発明は、対象の眼における不十分な血管形成に関連する状態のための治療の方法を提供し、これは、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与して、血管新生を促進することを含む。実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質が白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）であることを提供する。
【0009】
実施形態において、本発明は、投与が網膜微小血管密度を増加させることを提供する。実施形態において、本発明は、投与が脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させることを提供する。
【0010】
実施形態において、本発明は、状態が加齢性黄斑変性症であることを提供する。実施形態において、本発明は、状態が未熟児網膜症（ＲＯＰ）であることを提供する。
【0011】
実施形態において、本発明は、投与が硝子体内注射を介することを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が血管漏出を誘導しないことを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が浮腫を誘導しないことを提供する。
【0012】
実施形態において、本発明は、対象の眼において血管形成を誘導する方法を提供し、これは、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0013】
実施形態において、本発明は、投与が網膜血管新生を増加させることを提供する。実施形態において、本発明は、投与が脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させることを提供する。
【0014】
実施形態において、本発明は、対象が加齢性黄斑変性症を有することを提供する。実施形態において、本発明は、対象が未熟児網膜症（ＲＯＰ）を有することを提供する。
【0015】
実施形態において、本発明は、投与が硝子体内注射を介することを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が血管漏出を誘導しないことを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が浮腫を誘導しないことを提供する。
【0016】
実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質が白血病阻害因子（ＬＩＦ）であることを提供する。実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質がカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）であることを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1E】組換えヒトＬＩＦタンパク質は、用量依存的にＢＣＥ細胞の成長を刺激する。ＢＣＥ細胞を、ビヒクル、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および示された濃度の組換えヒトＬＩＦ（ｒｈＬＩＦ）の存在下で培養した、ｎ＝３（図１Ｅ）。
【図1F】ＬＩＦおよびＶＥＧＦは、ＢＣＥ細胞成長を相乗的に刺激する。アラマーブルーを使用して、６日後に細胞増殖を分析した、ｎ＝３。バーおよびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない（図１Ｆ）。
【図2A】ＬＩＦがＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路を介してＢＣＥ細胞成長を促進することを示す。ＪＡＫ阻害剤バリシチニブ（Ｂａ）は、ＬＩＦによるＳＴＡＴ３の活性化をブロックする。ＢＣＥ細胞をＤＭＳＯ、バリシチニブ（２μＭ）、コビメチニブ（Ｃｏ）（１５０ｎＭ）、またはＢＥＺ２３５（ＢＥ）（５ｎＭ）とともに１時間プレインキュベートし、次に、ビヒクルまたはＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処理した。対照：阻害剤でのプレインキュベーションなし（図２Ａ）。
【図2B】バリシチニブは、ＬＩＦ誘導性ＢＣＥ細胞成長を抑制する。ＢＣＥ細胞をＤＭＳＯ、バリシチニブ、コビメチニブ、またはＢＥＺ２３５とともに１時間プレインキュベートし、次に、ビヒクル、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６日後に細胞増殖を分析した、ｎ＝３（図２Ｂ）。
【図2C】図２Ｃおよび２Ｄは、ＢＣＥ細胞におけるＳＴＡＴ３ノックダウンを示す。ＢＣＥ細胞を、ＳＴＡＴ３を標的とするｓｉＮｅｇａｔｉｖｅおよびｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを調べるためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅのＳＴＡＴ３レベルを１に設定した。３つの独立した実験からのデータを平均し、図２Ｃに示す。図２Ｄでは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで１５分間処理した。全細胞溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【図2D】図２Ｃおよび２Ｄは、ＢＣＥ細胞におけるＳＴＡＴ３ノックダウンを示す。ＢＣＥ細胞を、ＳＴＡＴ３を標的とするｓｉＮｅｇａｔｉｖｅおよびｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを調べるためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅのＳＴＡＴ３レベルを１に設定した。３つの独立した実験からのデータを平均し、図２Ｃに示す。図２Ｄでは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで１５分間処理した。全細胞溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【図2E】ＬＩＦ誘導性ＢＣＥ細胞成長をＳＴＡＴ３ノックダウンによって無効にした。ＳＴＡＴ３ノックダウンを伴うＢＣＥ細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで培養した。３日後に細胞増殖を分析した。各ビヒクルグループの５９０ｎｍでの蛍光読み取り値を１に設定した、ｎ＝３。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ、陰性対照ｓｉＲＮＡは、任意の既知の遺伝子を標的としない。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない（図２Ｅ）。
【図3A】ＬＩＦがエクスビボおよびインビボモデルにおいて血管新生を促進することを示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＬＩＦによるマウス脈絡膜発芽の誘導を示す。播種後６日での一次脈絡膜外植片からの血管増殖が図３Ａの代表的な写真に示される。示されるように、各サンプルにサプリメントを添加した。血管発芽の成長の定量化を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して実施した、ｎ＝５。
【図3B】ＬＩＦがエクスビボおよびインビボモデルにおいて血管新生を促進することを示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＬＩＦによるマウス脈絡膜発芽の誘導を示す。播種後６日での一次脈絡膜外植片からの血管増殖が図３Ａの代表的な写真に示される。示されるように、各サンプルにサプリメントを添加した。血管発芽の成長の定量化を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して実施した、ｎ＝５。
【図3C】図３Ｃおよび３Ｄは、ＬＩＦの硝子体内注射がマウスの眼の血管密度を増加させることを示す。成体マウスに、示された量のＶＥＧＦおよびＬＩＦを硝子体内注射した。注射の７日後、ＰＦＡ固定脈絡膜－強膜複合体および網膜をＣＤ３１ ＩＦに供した。ＣＤ３１陽性血管の代表的な画像を図３Ｃに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアで決定された血管密度を図３Ｄに示す、ｎ＝５～８。
【図3D】図３Ｃおよび３Ｄは、ＬＩＦの硝子体内注射がマウスの眼の血管密度を増加させることを示す。成体マウスに、示された量のＶＥＧＦおよびＬＩＦを硝子体内注射した。注射の７日後、ＰＦＡ固定脈絡膜－強膜複合体および網膜をＣＤ３１ ＩＦに供した。ＣＤ３１陽性血管の代表的な画像を図３Ｃに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアで決定された血管密度を図３Ｄに示す、ｎ＝５～８。
【図3E】図３Ｅおよび３Ｆは、ＬＩＦで処理されたマウスの網膜のＯＣＴＡ画像化を示す。成体マウスに１μｌのＬＩＦ（５０ｎｇ）またはビヒクル溶液（ＰＢＳ）を硝子体内注射した。網膜ＯＣＴＡ画像を注射の７日後に得て、代表的なものを図３Ｅに示す。血管密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して血管被覆領域／全領域表面の割合で決定し、図３Ｆに示す、ｎ＝７～８。
【図3F】図３Ｅおよび３Ｆは、ＬＩＦで処理されたマウスの網膜のＯＣＴＡ画像化を示す。成体マウスに１μｌのＬＩＦ（５０ｎｇ）またはビヒクル溶液（ＰＢＳ）を硝子体内注射した。網膜ＯＣＴＡ画像を注射の７日後に得て、代表的なものを図３Ｅに示す。血管密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して血管被覆領域／全領域表面の割合で決定し、図３Ｆに示す、ｎ＝７～８。
【図3G】図３Ｇおよび３Ｈは、ＬＩＦ処理がマウスの網膜の血管密度を増加させることを示す。成体マウスにＬＩＦ（１０ｎｇ）またはビヒクル溶液を硝子体内注射した。注射の７日後、マウスの眼の凍結切片をＨ＆Ｅ染色およびＣＤ３１ ＩＦ染色に供した。代表的な画像を図３Ｇに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したＣＤ３１陽性の定量化を図３Ｈに示す、ｎ＝４。
【図3H】図３Ｇおよび３Ｈは、ＬＩＦ処理がマウスの網膜の血管密度を増加させることを示す。成体マウスにＬＩＦ（１０ｎｇ）またはビヒクル溶液を硝子体内注射した。注射の７日後、マウスの眼の凍結切片をＨ＆Ｅ染色およびＣＤ３１ ＩＦ染色に供した。代表的な画像を図３Ｇに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したＣＤ３１陽性の定量化を図３Ｈに示す、ｎ＝４。
【図3I】図３Ｉおよび３Ｊでは、５日齢の新生児マウスにＬＩＦ（５０ｎｇ）またはビヒクル溶液（ＰＢＳ）を硝子体内注射した。３日間の処理後、マウスの網膜を、Ｄｙｉｇｈｔ－４８８標識レクチンを用いたＩＦ染色に供した。同様の眼球遺伝子座の代表的な画像を図３Ｉに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したレクチン標識領域の定量化を図３Ｊに示す、ｎ＝４。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図3J】図３Ｉおよび３Ｊでは、５日齢の新生児マウスにＬＩＦ（５０ｎｇ）またはビヒクル溶液（ＰＢＳ）を硝子体内注射した。３日間の処理後、マウスの網膜を、Ｄｙｉｇｈｔ－４８８標識レクチンを用いたＩＦ染色に供した。同様の眼球遺伝子座の代表的な画像を図３Ｉに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したレクチン標識領域の定量化を図３Ｊに示す、ｎ＝４。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図4A】ＬＩＦがＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路を介してＢＡＥ細胞成長を阻害することを示す。組換えヒトＬＩＦは、用量依存的にＢＡＥ細胞の成長を阻害する。ＢＡＥ細胞をビヒクルおよび示された濃度の組換えヒトＬＩＦ（ｒｈＬＩＦ）の存在下で培養した。６日後に細胞増殖を分析した、ｎ＝３（図４Ａ）。
【図4B】ＪＡＫ阻害剤バリシチニブは、ＬＩＦによるＳＴＡＴ３の活性化をブロックする。ＤＭＳＯおよび阻害剤とともに１時間プレインキュベートしたＢＡＥ細胞を、ビヒクルおよびＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処理した。全細胞溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。対照：阻害剤でのプレインキュベーションなし、Ｂａ：バリシチニブ（２μＭ）、Ｃｏ：コビメチニブ（１５０ｎＭ）、ＢＥ：ＢＥＺ２３５（５ｎＭ）（図４Ｂ）。
【図4C】ＪＡＫ阻害剤であるバリシチニブは、ＬＩＦ誘導性ＢＡＥ成長阻害を逆転させる。阻害剤と１時間プレインキュベートしたＢＡＥ細胞を、ビヒクル、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。アラマーブルーを使用して、６日後に細胞増殖を分析した、ｎ＝３（図４Ｃ）。
【図4D】図４Ｄおよび４Ｅは、ＢＡＥ細胞におけるＳＴＡＴ３のノックダウンを示す。ＢＡＥ細胞にＳＴＡＴ３を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを調べるためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅのＳＴＡＴ３レベルを１に設定した。３つの独立した実験からのデータを平均し、図４Ｄに示す。図４Ｅでは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクルで１５分間処理した。全細胞溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【図4E】図４Ｄおよび４Ｅは、ＢＡＥ細胞におけるＳＴＡＴ３のノックダウンを示す。ＢＡＥ細胞にＳＴＡＴ３を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを調べるためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅのＳＴＡＴ３レベルを１に設定した。３つの独立した実験からのデータを平均し、図４Ｄに示す。図４Ｅでは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクルで１５分間処理した。全細胞溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【図4F】図４Ｆは、ＳＴＡＴ３のノックダウンがＬＩＦ誘導性ＢＡＥ細胞成長阻害を無効にすることを示す。ＳＴＡＴ３ノックダウンを伴うＢＡＥ細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクルとともに培養した。３日後に細胞増殖を分析した。各ビヒクルグループの蛍光読み取り値を１に設定した、ｎ＝３。バーおよびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ、陰性対照ｓｉＲＮＡは、任意の既知の遺伝子を標的としない。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない。
【図5A】ＬＩＦがモルモットの皮膚およびマウスの網膜に血管透過性を誘導しないことを示す。図５Ａでは、無毛のオスのモルモット（対照：ＨＡ－Ｈｒｈｒ／ＩＡＦ、４５０～５００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉｐ）投与によって麻酔をかけた。次に、動物は、１ｍｌの１％エバンスブルー染料の静脈内注射（陰茎静脈）を受けた。１５分後、ＰＢＳ中のｒｈＬＩＦの異なる用量（注射部位あたり１、５、２５、１００、２００ｎｇ）の皮内注射（０．０５ｍｌ／部位あたり）を肩の後ろの体幹の領域に投与した。０．０５ｍｌのＰＢＳおよび０．０５ｍｌのＰＢＳ中の２５ｎｇのＶＥＧＦを陰性および陽性対照として注射した。皮内注射の３０分後、ペントバルビタール（２００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって動物を安楽死させた。皮膚組織を結合組織から解剖し、写真を撮った、ｎ＝２。
【図5B】図５Ｂでは、血管漏出がマウスの網膜に示される。ＬＩＦ（１０ｎｇ）またはＶＥＧＦ（１００ｎｇ）を硝子体腔に注射した（対照として０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）。ＴＲＩＴＣ－デキストランを使用して、血管漏出を示した。網膜血管系をＦＩＴＣ－レクチンによって標識した、ｎ＝５。
【図6A】ＬＩＦがカテプシンＬのアップレギュレーションを介して細胞死を誘導することを示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＬＩＦ処理がＢＡＥ細胞において細胞死を誘導することを示す。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで２４時間処理すると、ＢＡＥ細胞をアネキシンＶ－Ｃｙ５で染色した。代表的な画像を図６Ａに示す。
【図6C】図６Ｃおよび６Ｄは、ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導カテプシンＬ発現を示す。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで２４時間処理した後、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、ＢＡＥ細胞のカテプシンＬ（ＣＴＳＬ）ｍＲＮＡレベルを調べた。ビヒクルグループのＣＴＳＬレベルを１に設定した。各サンプルのＣＴＳＬ ｍＲＮＡレベルをビヒクルグループと比較し、図６Ｃに倍率変化として示す、ｎ＝３。ＬＩＦ処理したＢＡＥ細胞からの総タンパク質をウシカテプシンＬ ＥＬＩＳＡに使用した。ビヒクル処理グループのカテプシンＬタンパク質レベルを１に設定した。カテプシンＬタンパク質の誘導倍率変化（ＬＩＦ処理サンプル対ビヒクルグループ）を計算し、３つの独立した実験からの倍率変化を図６Ｄに示す。
【図6D】図６Ｃおよび６Ｄは、ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導カテプシンＬ発現を示す。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクルで２４時間処理した後、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、ＢＡＥ細胞のカテプシンＬ（ＣＴＳＬ）ｍＲＮＡレベルを調べた。ビヒクルグループのＣＴＳＬレベルを１に設定した。各サンプルのＣＴＳＬ ｍＲＮＡレベルをビヒクルグループと比較し、図６Ｃに倍率変化として示す、ｎ＝３。ＬＩＦ処理したＢＡＥ細胞からの総タンパク質をウシカテプシンＬ ＥＬＩＳＡに使用した。ビヒクル処理グループのカテプシンＬタンパク質レベルを１に設定した。カテプシンＬタンパク質の誘導倍率変化（ＬＩＦ処理サンプル対ビヒクルグループ）を計算し、３つの独立した実験からの倍率変化を図６Ｄに示す。
【図6E】図６Ｅおよび６Ｆは、カテプシンＬ阻害剤ＣＡ０７４ｍｅおよびＣＡＡ０２２５がＬＩＦ誘導性ＢＡＥ細胞成長阻害を軽減することを示す。示された濃度のＣＡ０７４ｍｅおよびＣＡＡ０２２５とともに１時間プレインキュベートしたＢＡＥ細胞を、ビヒクル、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６日後に細胞成長を分析した、ｎ＝３。バーおよびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない。
【図6F】図６Ｅおよび６Ｆは、カテプシンＬ阻害剤ＣＡ０７４ｍｅおよびＣＡＡ０２２５がＬＩＦ誘導性ＢＡＥ細胞成長阻害を軽減することを示す。示された濃度のＣＡ０７４ｍｅおよびＣＡＡ０２２５とともに１時間プレインキュベートしたＢＡＥ細胞を、ビヒクル、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６日後に細胞成長を分析した、ｎ＝３。バーおよびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない。
【図7A】ＬＩＦがＢＡＥ細胞の細胞周期停止を誘導することを示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＬＩＦ処理がＢＡＥ細胞へのＢｒｄＵの取り込みを低減させることを示す。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクルで４８時間処理した後、ＢＡＥ細胞を１０μＭのＢｒｄＵとともに４時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲートＢｒｄＵ抗体で検出されたＢｒｄＵ取り込みの代表的な画像を図７Ａに示す。
【図7C】図７Ｃは、ＢＡＥのＬＩＦによるサイクリンＡおよびＢの発現の制止を示す。ＢＡＥおよびＢＣＥ細胞をＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクルで２４時間処理した。ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、ＣＴＳＬ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、およびＭＹＣのｍＲＮＡレベルを調べた。各遺伝子プローブについて、ビヒクル処理グループレベルを１に設定した。ＬＩＦ処理サンプル中のｍＲＮＡレベルをビヒクルグループに対して正規化した、ｎ＝３。バーおよびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＃：ｐ≦０．０００１、ｎｓ：統計的に有意ではない。
【図8A】マウスの眼のモデルにおける他のＩＬ－６ファミリータンパク質の効果を示す。組換えＬＩＦ（５０ｎｇ）および１μｌ中の異なる用量のＣＴ－１およびＰＢＳビヒクル対照をマウスの眼に硝子体内注射した（図８Ａ）。網膜血管系を、生きているマウスのＯＣＴ－Ａ画像化およびＣＤ３１免疫蛍光染色の両方で示した、ｎ＝５（図８Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかの如く同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0019】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語、ならびに任意の頭字語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施に使用され得るが、例示的な方法、装置、および材料が本明細書に記載される。
【0020】
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を使用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｔｈ ｅｄ．，（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２）などの文献で完全に説明されている。
【0021】
本発明は、ＩＬ６スーパーファミリーのメンバー、およびその機能的フラグメントが、加齢性黄斑変性症および未熟児網膜症（ＲＯＰ）などであるが、これらに限定されない状態を療法的に治療する必要がある対象の眼の血管新生を増加させるために使用され得ることを提供する。実施形態において、対象は、ヒトである。
【0022】
実施形態において、本発明は、対象の眼における不十分な血管形成に関連する状態のための治療の方法を提供し、これは、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与して、血管新生を促進することを含む。実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質が白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）であることを提供する。
【0023】
実施形態において、本発明は、投与が網膜微小血管密度を増加させることを提供する。実施形態において、本発明は、投与が脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させることを提供する。実施形態において、本発明は、投与が血管新生を刺激することを提供する。
【0024】
実施形態において、本発明は、状態が加齢性黄斑変性症であることを提供する。実施形態において、本発明は、状態が未熟児網膜症（ＲＯＰ）であることを提供する。
【0025】
実施形態において、本発明は、投与が硝子体内注射を介することを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が血管漏出を誘導しないことを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が浮腫を誘導しないことを提供する。
【0026】
実施形態において、本発明は、対象の眼において血管形成を誘導する方法を提供し、これは、有効量のＩＬ－６ファミリータンパク質またはその機能的フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0027】
実施形態において、本発明は、投与が網膜血管新生を増加させることを提供する。実施形態において、本発明は、投与が脈絡膜内皮細胞の増殖を増加させることを提供する。
【0028】
実施形態において、本発明は、対象が加齢性黄斑変性症を有することを提供する。実施形態において、本発明は、対象が未熟児網膜症（ＲＯＰ）を有することを提供する。
【0029】
実施形態において、本発明は、投与が硝子体内注射を介することを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が血管漏出を誘導しないことを提供する。実施形態において、本発明は、有効量が浮腫を誘導しないことを提供する。
【0030】
実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質が白血病阻害因子（ＬＩＦ）であることを提供する。実施形態において、本発明は、ＩＬ－６ファミリータンパク質がカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）であることを提供する。
【0031】
定義
本発明の理解を容易にするため、本明細書で使用されるいくつかの用語および略語を以下のように定義する。
本発明の理解を容易にするため、本明細書で使用されるいくつかの用語および略語を以下のように定義する。
【0032】
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味すると意図される。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙される要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。
【0033】
２つ以上の項目の列挙において「および／または」という用語が使用される場合、列挙された項目のいずれか１つを単独で使用しても、または列挙された項目のいずれか１つ以上と組み合わせて使用してもよいことを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢの一方または両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡとＢとの組み合わせを意味することが意図される。「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとの組み合わせ、ＡとＣとの組み合わせ、ＢとＣとの組み合わせ、またはＡとＢとＣとの組み合わせを意味することが意図される。
【0034】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
【0035】
範囲形式での説明は、便宜上かつ簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、考えられる全ての部分範囲とその範囲内の個々の数値が具体的に開示されるとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６が具体的に開示されるとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、本明細書では、値または範囲は、「約」、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、として表され得る。そのような値または範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることがさらに理解されよう。実施形態において、「約」は、例えば、列挙された値の１０％以内、列挙された値の５％以内、または列挙された値の２％以内を意味するために使用され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、治療されるヒトまたは動物の対象を意味する。
【0037】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される組成物を指し、組成物は、薬学的に活性な薬剤を含み、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に活性な薬剤と担体との組み合わせであってもよい。
【0038】
「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせ、または組み合わせ投与のためのパーツキットのいずれかを指し、１つ以上の活性化合物と組み合わせパートナー（例えば、「療法剤」または「補助薬剤」とも称される、以下で説明される別の薬物）とが同時に独立して、または時間間隔内に別々に投与され得る。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で利用される場合、「併用投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「組み合わせ投与（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路または同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される場合、「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合または組み合わせによって得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる生成物を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、または連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与によって、２つの化合物が療法上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。
【0039】
本明細書で使用される場合、「有効な」または「療法上有効な」は、疾患および病態に関連する症状を治療もしくは改善するか、または何らかの様式で低減するのに十分である薬学的に活性な化合物の量を指す。方法に関して使用される場合、その方法は、疾患または状態に関連する症状を治療もしくは改善する、または何らかの様式で低減するのに十分有効である。例えば、加齢性眼疾患に関して有効量は、その発病を阻止もしくは予防するか、あるいは疾患病状が始まっている場合は、その疾患の進行を緩和、改善、安定化、回復、もしくは遅延させるか、またはその疾患の病理学的結果を低減させるのに十分である量である。いずれの場合も、有効量は単回投与で与えても、または分割投与で与えてもよい。
【0040】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、患者における疾患に関連する症状を少なくとも改善することを包含し、その場合、改善は、広い意味で使用され、例えば、治療されている疾患または状態に関連する症状などのパラメータの低度が少なくとも低減することを指す。したがって、「治療」には、疾患、障害、または病的状態、または少なくともそれらに関連する症状が、完全に阻害される（例えば、発生が予防される）かまたは停止され（ｓｔｏｐｐｅｄ）（例えば、停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ））、患者がそれ以上その状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状に罹患することがないようにする状況が含まれる。
【0041】
本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、疾患もしくは障害、またはそれらの１つ以上の症状の発病、再発、または蔓延の予防を指す。ある特定の実施形態において、これらの用語は、症状の発病前に、特に本明細書に提供される疾患または障害のリスクのある対象への、１つ以上の他の追加の活性剤を伴うかまたは伴わない、本明細書に提供される化合物または剤形による治療またはそれらの投与を指す。これらの用語は、特定の疾患の症状の阻害または低減を包含する。ある特定の実施形態において、疾患の家族歴を有する対象は、予防レジメンの潜在的な候補である。ある特定の実施形態において、再発する症状の病歴を有する対象もまた、予防の潜在的な候補である。この点に関して、「予防」という用語は、「予防的治療」という用語と互換的に使用され得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、化合物の「予防的有効量」は、疾患もしくは障害を予防するか、またはその再発を予防するのに十分な量である。予防的有効量の化合物は、単独で、または１つ以上の他の薬剤と組み合わせて、疾患の予防において予防的利益を提供する療法剤の量を意味する。「予防的有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、または別の予防剤の予防有効性を増強させる量を包含し得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、「薬学的に活性な」という用語は、生物、特に人体の細胞および組織に対する物質の有益な生物学的活性を指す。「薬学的に活性な薬剤」または「薬物」は、薬学的に活性である物質であり、「薬学的に活性な成分」（ＡＰＩ）は、薬物中の薬学的に活性な物質である。
【0044】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物での使用に安全である他の製剤に加えて、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方、一般に認められている他の薬局方に列挙されていることを意味する。本発明は、硝子体内注射を含む、眼科送達用に配合された眼の治療のための組成物を企図する。
【0045】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、脱メチレン化化合物とともに投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはビヒクルを指す。そのような担体は、水および油などの無菌液体であってよく、油には、石油、動物、植物、または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒が含まれる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を作成する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照されたい。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、本組成物におけるそのような使用が企図される。
【0046】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示における多剤コンジュゲートなどの化合物の酸付加塩または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は、親剤または化合物の活性を保持し、それが投与される対象に対して、およびそれが投与される状況において、いかなる有害または望ましくない効果も与えない任意の塩である。薬学的に許容される塩は、システインを含むがこれらに限定されないアミノ酸に由来し得る。化合物を塩として生成するための方法は、当業者に既知である（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｚｕｒｉｃｈ，２００２、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１，１９７７）。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容される塩」は、非毒性、生物学的に許容可能、またはそうでなければ対象への投与に生物学的に好適である、本明細書に表される薬剤または化合物の遊離酸または塩基の塩を意味することを意図する。一般に、Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１－１９を参照されたい。好ましい薬学的に許容される塩は、薬理学的に有効であり、過度の毒性、刺激、またはアレルギー応答なしに対象の組織との接触に好適であるものである。本明細書に記載の薬剤または化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、両方のタイプの官能基、または各タイプの２つ以上を有し、したがって、いくつかの無機または有機塩基、ならびに無機および有機酸と反応して、薬学的に許容される塩を形成し得る。
【0047】
薬学的に許容される塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１，４－ジオン酸塩、ヘキシン－１，６－ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブチル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、［ガンマ］－ヒドロキシブチル酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、およびマンデル酸塩が含まれる。
【0048】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するおよび合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、α－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合するα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【0049】
本発明で使用するためのタンパク質のＩＬ－６ファミリーには、白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）が含まれる。本発明で使用するためのタンパク質のＩＬ－６ファミリーにはまた、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、およびＩＬ－１２ファミリーにも分類され得るヘテロ二量体サイトカインであるインターロイキン２７（ＩＬ－２７）などの血管新生を促進する他のＩＬ－６サイトカインも含まれ得る。しかしながら、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、逆の効果を有する。当業者は、本明細書に記載の本発明の知識を用いて、本発明で使用するための血管新生の促進活性について追加のＩＬ－６ファミリーメンバーを日常的にスクリーニングすることができる。ＩＬ－６ファミリータンパク質は、単離された、もしくは部分的に精製された天然に存在するタンパク質、または組換えによって生成されたタンパク質であり得る。
【0050】
そのような天然に存在するＩＬ－６ファミリーメンバーのアミノ酸配列は当技術分野で周知されている。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸またはアミノ酸のわずかな割合を変更、追加、または削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、削除、または追加が、「保存的に修飾された変異体」であり、その変更の結果、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知されている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加され、それらを除外しない。
【0051】
実施形態において、本発明は、不十分または十分でない血管新生を特徴とする疾患または状態の予防または治療のための血管新生の促進を対象とする。そのような疾患または状態には、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、糖尿病性足潰瘍、肺高血圧症、虚血、慢性潰瘍、脱毛症または髪の灰色化、皮弁の再生、創傷および火傷の治癒、人工皮膚のインプラント、胚の発達、ならびに移植のための血管の調製が含まれるが、これらに限定されない。
【0052】
本発明は、ＬＩＦを一次脈絡膜内皮細胞のマイトジェンとして特定する。本発明以前は、正確なメカニズムはほとんど知られていなかったが、ＬＩＦは内皮細胞の成長／血管新生の陰性調節因子として長い間特徴付けられていた。１９９２年に、ＬＩＦがＢＡＥ細胞成長の阻害剤であることが初めて報告された（３５）。その後の研究では、ＬＩＦはｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ誘導性内皮細胞増殖の阻害剤としても説明されている（１５、４１）。唯一の例外は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を介して生成された不死化内皮細胞株におけるＬＩＦの一部のマイトジェン効果を示す研究であった（４２）。
【0053】
本発明は、ＬＩＦがインビトロで一次内皮細胞成長を刺激し得ることを初めて実証する。さらに、本発明は、ＬＩＦ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達軸が内皮細胞におけるマイトジェン効果の原因であることを開示する。組換えＬＩＦの硝子体内注射は、成体マウスの網膜の血管密度を著しく増加させ、ＬＩＦの血管新生刺激の役割を確認する。興味深いことに、ＣＴ－１はまた、網膜の血管新生を誘導し、またＮａＩＯ３モデルにおいて保護的である。
【0054】
遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）では、ＬＩＦの発現レベルは、網膜血管系の発達と陰性相関がある（１４、１６）。それでも、ＬＩＦは複数の細胞タイプに影響を及ぼし（１６、４３）、ＧＥＭＭの網膜の発達を完全に破壊することさえあることが以前に報告されている（４４）。特に、ＬＩＦは網膜星状細胞の成熟に悪影響を及ぼし、次に未成熟星状細胞によるＶＥＧＦ発現を促進し、これが血管密度の増加に寄与し得る（１６、３１、３２、４５）。したがって、ＧＥＭＭの網膜血管系の変更は、内皮細胞に対するＬＩＦの直接的な効果ではない可能性がある。別の研究では、腹腔内および硝子体内の両方のＬＩＦ注射によって、新生児ラットの眼の血管密度が中程度に減少し（２２）、ＬＩＦのそのような阻害性の役割はまた、網膜の発達に対するその効果によっても説明されることができる。さらに、硝子体内注射のＬＩＦの用量は、その研究では明確に示されていなかった（２２）。本発明に開示されたタイトでベル型の用量応答を考慮すると、本発明を以前の研究と比較することは困難である。実際、文献の不一致の少なくともいくつかは、数ナノグラムから数百ナノグラムの範囲の、異なる研究で用いられた幅広く異なる用量のＬＩＦによって説明される可能性がある（１６、２２）。
【0055】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児における一般的な失明の原因となる疾患であり、血管系の発達の遅延および既存の血管の退行、それに続く低酸素誘導性網膜新血管新生を特徴とする（４６）。眼におけるＶＥＧＦ発現の劇的なダウンレギュレーションは、ＲＯＰの発症および進行に関連しており（４７）、外因性ＶＥＧＦの投与はマウスにおけるＲＯＰの重症度を軽減する（４７）。しかしながら、ＶＥＧＦは血管透過性の増加を伴う病理学的新血管新生に寄与するため、療法剤としてＶＥＧＦを使用することへの懸念は根強く残っている（４８）。本発明において、ＬＩＦは、ＶＥＧＦとは異なり、モルモットの皮膚において血管透過性を誘導しない（図５Ａ）。さらに、ＴＲＩＴＣ標識デキストランを使用して、マウスの網膜微小血管漏出を決定した。ＬＩＦ（１０ｎｇ）またはＶＥＧＦ（１００ｎｇ）を、ＴＲＩＴＣ－デキストラン注射の１５分前に硝子体内注射した。結果は、ＶＥＧＦとは異なり、ＬＩＦは網膜微小血管漏出を誘導しないことを示す（図５Ｂ）。したがって、ＬＩＦをＲＯＰのいくつかの段階で使用して、血管の退行を予防し得る。
【0056】
以前の報告（３５）と一致して、本発明は、ＬＩＦがＢＡＥ細胞成長阻害をもたらすことを示す。本発明は、これがＬＩＦ処理時のアネキシンＶ染色の増加によって証明されるように、少なくとも部分的に、細胞死に起因することを示す。興味深いことに、リソソームシステインプロテアーゼカテプシンＬの２つの阻害剤（すなわち、ＣＡ－０７４ｍｅおよびＣＡＡ０２２５）は、カスパーゼ阻害剤ではなく、ＬＩＦ誘導性細胞死を逆転させ、カスパーゼ非依存性細胞死の関与を示唆している。さらに、カテプシンＢ特異的阻害剤ＣＡ０７４はＢＡＥ細胞死の救済に失敗し、カテプシンＢではなくカテプシンＬがＬＩＦ処理ＢＡＥ細胞でアップレギュレーションされ、カテプシンＬがＬＩＦ誘導性リソソーム細胞死の実行者であることを示している。
【0057】
カテプシンＢおよびＬの誘導は、オートファジーおよび細胞死に関与している（４９、５０）。本発明は、内皮細胞死の誘導においてＬＩＦ－カテプシンＬ経路を関与させる最初のものである。これは、そのようなシグナル伝達経路が特定の生理学的または病理学的プロセスに関わっているかどうかという疑問を提起する。興味深いことに、ＬＩＦおよびカテプシンＬの両方が、腹部大動脈瘤およびアテローム性動脈硬化症などの血管疾患の発症および進行に関与している（５１～５３）。これらのデータは、病理学的設定における血管系の調節におけるＬＩＦ－カテプシンＬ経路の役割をまとめて示唆する。
【0058】
本発明において、ＬＩＦはまた、ＢＡＥ細胞におけるサイクリンＡ／Ｂ発現の減少を伴うＢｒｄＵ取り込みの低減をもたらし、ＬＩＦ誘導性細胞周期停止がＢＡＥ成長阻害において役割を果たすことを示唆している。サイクリンＡ１およびサイクリンＢ１が直接ＳＴＡＴ３標的であることが以前に報告された（５４）。また、ＳＴＡＴ３は特定の設定に応じてサイクリンＡ／Ｂのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方に関与しており（５５～５８）、ＳＴＡＴ３によるサイクリンＡ発現の抑制はその直接の標的ＰＩＭ１によって媒介されていた（５８）。これは、ＬＩＦによるＰＩＭ１の誘導がＢＡＥ細胞でのみ行われるため、ＬＩＦがＢＡＥ細胞ではサイクリンＡ／Ｂの発現を制止するが、ＢＣＥ細胞では制止しない理由を説明している。
【0059】
本発明は、２つのタイプの内皮細胞において同じシグナル伝達経路によって誘発される反対の応答（増殖対成長阻害）を開示する。活性化されたＳＴＡＴ３は、これら２つの細胞タイプの固有の遺伝子セットをトランス活性化する。実際、ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞でのＬＩＦ処理時に、Ｓ相およびＧ２／Ｍサイクリン遺伝子ＣＣＮＡ２およびＣＣＮＢ１のダウンレギュレーション、ならびにＢＡＥ細胞ではリソソームシステインプロテアーゼＣＴＳＬのアップレギュレーションだが、ＢＣＥ細胞では増殖遺伝子ＭＹＣのみのアップレギュレーションを含むいくつかの遺伝子の発現が異なる。異なるタイプの内皮細胞は、同じ刺激に対する異なる応答を決定する独自の遺伝子発現パターン／エピジェネティックプロファイリングを有する（５９～６１）。異なる内皮細胞におけるＬＩＦの反対の効果の本発明の開示は、そのような多様性の新規の側面を例示する：同じシグナル伝達経路が、内皮細胞タイプ特異的転写プログラムに応じて、発散効果を媒介する。本発明は、ＬＩＦによって誘導されるリソソームプロテアーゼカテプシンＬが内皮細胞の細胞死をもたらすことを初めて報告する。
【0060】
本発明は、実施形態において、脈絡膜および網膜内皮細胞におけるＬＩＦの予想外のマイトジェンの役割を開示し、ＬＩＦおよびＣＴ－１の両方がインビボで網膜微小血管密度を増加させることを示す。実際、湿性または乾性のＡＭＤを有する患者の脈絡毛細管板層などの眼血管を保護することは、萎縮を予防し得るため有益である（６２）。ＬＩＦおよびＣＴ－１の両方が、ＮａＩＯ３モデルにおいて保護効果を有し、これらの薬剤は、網膜色素上皮および脈絡毛細管板を保護するため、ＡＭＤにおける萎縮の予防において療法的価値を有することを示唆する。ＬＩＦおよびおそらくＣＴ－１の直接的な透過性効果の欠如は、この点で特に有用である。注目すべきことに、ＯＳＭは反対の効果を有し、ＬＩＦおよびＣＴ－１の効果に特異性があることを示している。
【実施例】
【0061】
材料および方法
試薬
抗体：ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＦ－２２１－ＮＡ）、ヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＦ－２７９－ＮＡ）、ヒトＬＩＦ抗体（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃Ｌ９２７７）、正規のヤギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＢ－１０８－Ｃ）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲートＢｒｄＵ抗体３Ｄ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃３６４１０６）
試薬
抗体：ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＦ－２２１－ＮＡ）、ヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＦ－２７９－ＮＡ）、ヒトＬＩＦ抗体（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃Ｌ９２７７）、正規のヤギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＡＢ－１０８－Ｃ）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲートＢｒｄＵ抗体３Ｄ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃３６４１０６）
【0062】
小分子阻害剤：バリシチニブ（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡＴ＃Ａ４１４１５０）、コビメチニブ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＣＡＴ＃ＨＹ－１３０６４）、ＢＥＺ２３５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、ＣＡＴ＃Ｓ１４０９）、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＦＭＫ００１）、Ｚ－ＤＥＶＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＦＭＫ００４）、Ｑ－ＶＤ（ＯＭｅ）－ＯＰｈ（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡＴ＃Ａ８１６５）、５－ＡＩＱ 塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃Ａ７４７９）、ＣＡ－０７４ｍｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡＴ＃２０５５３１）、ＣＡ－０７４（Ｔｏｃｒｉｓ、ＣＡＴ＃４８６３）、およびＣＡＡ０２２５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡＴ＃２１９５０２）
【0063】
組換えタンパク質：ヒトＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃ＳＲＰ９００１）、ヒトＬＩＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃５９３９０２）、ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＣＡＴ＃１００－１３Ａ）、ヒトペルオキシレドキシン１（Ａｂｃａｍ、ＣＡＴ＃ａｂ７４１７２）、ヒトＩＬ－８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃５７４２０２）、およびヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃２９３－ＶＥ）
【0064】
細胞培養
ＬＮ－２２９ヒト神経膠芽腫細胞を、５％ＦＢＳで補充した高グルコースＤＭＥＭで維持した。ウシ脈絡膜内皮（ＢＣＥ）（Ｐ５－Ｐ９）およびウシ網膜内皮（ＢＲＥ）（Ｐ５－Ｐ９）細胞を、フィブロネクチンでコーティングした培養プレート上で、１０％ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで補充したＤＭＥＭ－低グルコースで維持した。ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞（Ｐ５－Ｐ１０）を、１０％ＢＣＳで補充したＤＭＥＭ－低グルコースで維持した。ヒト網膜微小血管内皮（ＨＲＭＥ）細胞（Ｐ４－Ｐ９）を、ゼラチンでコーティングした培養プレート上で、抗生物質を有するＥＧＭ２培地で維持した。全ての細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃に維持した。
ＬＮ－２２９ヒト神経膠芽腫細胞を、５％ＦＢＳで補充した高グルコースＤＭＥＭで維持した。ウシ脈絡膜内皮（ＢＣＥ）（Ｐ５－Ｐ９）およびウシ網膜内皮（ＢＲＥ）（Ｐ５－Ｐ９）細胞を、フィブロネクチンでコーティングした培養プレート上で、１０％ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで補充したＤＭＥＭ－低グルコースで維持した。ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞（Ｐ５－Ｐ１０）を、１０％ＢＣＳで補充したＤＭＥＭ－低グルコースで維持した。ヒト網膜微小血管内皮（ＨＲＭＥ）細胞（Ｐ４－Ｐ９）を、ゼラチンでコーティングした培養プレート上で、抗生物質を有するＥＧＭ２培地で維持した。全ての細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃に維持した。
【0065】
内皮細胞増殖アッセイ
ウシ内皮増殖アッセイを、以前に記載されているように本質的に実施した（６３、６４）。ＢＣＥ（１×１０３細胞／ウェル）またはＢＲＥ（５×１０２細胞／ウェル）細胞を、培養培地（１０％ＢＣＳ、２ｍＭのグルタミン、および抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）およびウェルあたり総体積２００μｌの試験材料中で９６ウェルプレートに播種した。ＢＡＥ細胞を、培養培地（１％ＢＣＳおよび抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）およびウェルあたり総体積２００μｌの試験材料中、２×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートにプレーティングした。ＨＲＭＥ細胞を、アッセイ培地（２０％ＦＢＳおよび抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）、およびウェルあたり総体積２００μｌを作製する試験材料中、ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレートに１×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。抗体または小分子阻害剤を伴うアッセイでは、阻害剤またはビヒクル対照を最初に添加し、次に試験材料を１時間後に添加した。６日後（特に指定しない限り）、細胞をアラマーブルーとともに４時間インキュベートした。蛍光を、５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。各実験を２回／３回実行し、少なくとも３回繰り返した。
ウシ内皮増殖アッセイを、以前に記載されているように本質的に実施した（６３、６４）。ＢＣＥ（１×１０３細胞／ウェル）またはＢＲＥ（５×１０２細胞／ウェル）細胞を、培養培地（１０％ＢＣＳ、２ｍＭのグルタミン、および抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）およびウェルあたり総体積２００μｌの試験材料中で９６ウェルプレートに播種した。ＢＡＥ細胞を、培養培地（１％ＢＣＳおよび抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）およびウェルあたり総体積２００μｌの試験材料中、２×１０３細胞の密度で９６ウェルプレートにプレーティングした。ＨＲＭＥ細胞を、アッセイ培地（２０％ＦＢＳおよび抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース）、およびウェルあたり総体積２００μｌを作製する試験材料中、ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレートに１×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。抗体または小分子阻害剤を伴うアッセイでは、阻害剤またはビヒクル対照を最初に添加し、次に試験材料を１時間後に添加した。６日後（特に指定しない限り）、細胞をアラマーブルーとともに４時間インキュベートした。蛍光を、５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。各実験を２回／３回実行し、少なくとも３回繰り返した。
【0066】
ＬＮ－２２９細胞馴化培地
５×１０６個のＬＮ－２２９細胞を、３５ｍｌの培地（０．５％ＦＢＳおよび１％抗生物質を有するＤＭＥＭ－高グルコース）を有する１５ｃｍ培養皿に播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。ＬＮ－２２９ ＣＭを遠心分離によって回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、後で使用するために－８０℃で保存した。
５×１０６個のＬＮ－２２９細胞を、３５ｍｌの培地（０．５％ＦＢＳおよび１％抗生物質を有するＤＭＥＭ－高グルコース）を有する１５ｃｍ培養皿に播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。ＬＮ－２２９ ＣＭを遠心分離によって回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、後で使用するために－８０℃で保存した。
【0067】
ＬＮ－２２９ ＣＭにおける内皮マイトジェンのクロマトグラフィー濃縮
約４００ｍｌのＬＮ－２２９ ＣＭを、クロマトグラフィー精製の連続によって内皮マイトジェンの濃縮に供した。ＣＭを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０にバッファー交換し、ろ過（０．２μｍ）し、ＧＥ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ（商標）ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に装填した。トリスバッファー中の０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、および２ＭのＮａＣｌで段階的に溶出した後、溶出画分のアリコートを上記のようにＢＣＥ細胞成長アッセイで試験した。次にマイトジェン画分をプールし、０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ（ＴＦＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で希釈し、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＲＰ Ｃ４逆相カラム（４．６ｘ１００ｍｍ、Ｅｉｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｉｅｎ，ＩＬ）に適用した。画分を、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線勾配で溶出した。溶出画分を、ＭｉＶａｃ ＤＵＯ濃縮器（Ｇｅｎｅｖａｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＫ）を使用して蒸発させ、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、上のように試験した。マイトジェン画分および隣接陰性を質量分析に供した。
約４００ｍｌのＬＮ－２２９ ＣＭを、クロマトグラフィー精製の連続によって内皮マイトジェンの濃縮に供した。ＣＭを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０にバッファー交換し、ろ過（０．２μｍ）し、ＧＥ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑ（商標）ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に装填した。トリスバッファー中の０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、および２ＭのＮａＣｌで段階的に溶出した後、溶出画分のアリコートを上記のようにＢＣＥ細胞成長アッセイで試験した。次にマイトジェン画分をプールし、０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ（ＴＦＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で希釈し、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＲＰ Ｃ４逆相カラム（４．６ｘ１００ｍｍ、Ｅｉｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｉｅｎ，ＩＬ）に適用した。画分を、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線勾配で溶出した。溶出画分を、ＭｉＶａｃ ＤＵＯ濃縮器（Ｇｅｎｅｖａｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＫ）を使用して蒸発させ、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、上のように試験した。マイトジェン画分および隣接陰性を質量分析に供した。
【0068】
ＥＬＩＳＡ
ＬＮ－２２９ ＣＭサンプル中のＶＥＧＦおよびＬＩＦレベルを、ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＤＶＥ００）およびヒトＬＩＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃４４３５０７）によって、それぞれ製造業者の指示に従って決定した。ＢＡＥ細胞中のカテプシンＬレベルを、製造業者の指示に従ってウシカテプシンＬ ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ、ＣＡＴ＃ＭＢＳ２８８７６０９）を使用して測定した。
ＬＮ－２２９ ＣＭサンプル中のＶＥＧＦおよびＬＩＦレベルを、ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃ＤＶＥ００）およびヒトＬＩＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃４４３５０７）によって、それぞれ製造業者の指示に従って決定した。ＢＡＥ細胞中のカテプシンＬレベルを、製造業者の指示に従ってウシカテプシンＬ ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ、ＣＡＴ＃ＭＢＳ２８８７６０９）を使用して測定した。
【0069】
ｓｉＲＮＡによるＳＴＡＴ３ノックダウン
ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレート上にプレーティングした。ＢＣＥ細胞を、１０％ＢＣＳ、２ｍＭ、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および抗生物質で補充した２ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースで一晩インキュベートし、ＢＡＥ細胞を、１０％ＢＣＳおよび抗生物質で補充した２ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースで一晩培養した。古い培地の代わりに２ｍｌの抗生物質を含まない培地を使用した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ（Ａｍｂｉｏｎ、ＣＡＴ＃ＡＭ４６１１）、ｓｉＳＴＡＴ３－９１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３６１１４６Ｃ０４）、ｓｉＳＴＡＴ３－１４９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３６１１４６Ｃ０５）、およびｓｉＳＴＡＴ３－４５４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３８４２３５Ａ１０）を含むｓｉＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃３１９８５０６２）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＴ＃１３７７８１５０）と混合した。簡単に説明すると、２５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ、７．５ｕｌのＲＮＡｉＭＡＸ試薬、および１２５ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含有する混合物を使用して、各ウェルの細胞をトランスフェクトし、最終的なｓｉＲＮＡ濃度を１２．５ｎＭにした。ＲＮＡｉＭＡＸおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭの混合物を非ｓｉＲＮＡ対照として使用した。細胞をｓｉＲＮＡとともに８時間インキュベートし、次に新鮮な正規の培養培地を使用して、ｓｉＲＮＡ含有培地を置き換えた。ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションの２４時間後、細胞を内皮増殖アッセイおよびＲＮＡ／タンパク質抽出に使用した。
ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレート上にプレーティングした。ＢＣＥ細胞を、１０％ＢＣＳ、２ｍＭ、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および抗生物質で補充した２ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースで一晩インキュベートし、ＢＡＥ細胞を、１０％ＢＣＳおよび抗生物質で補充した２ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースで一晩培養した。古い培地の代わりに２ｍｌの抗生物質を含まない培地を使用した。ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ（Ａｍｂｉｏｎ、ＣＡＴ＃ＡＭ４６１１）、ｓｉＳＴＡＴ３－９１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３６１１４６Ｃ０４）、ｓｉＳＴＡＴ３－１４９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３６１１４６Ｃ０５）、およびｓｉＳＴＡＴ３－４５４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃３８４２３５Ａ１０）を含むｓｉＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃３１９８５０６２）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＴ＃１３７７８１５０）と混合した。簡単に説明すると、２５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ、７．５ｕｌのＲＮＡｉＭＡＸ試薬、および１２５ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含有する混合物を使用して、各ウェルの細胞をトランスフェクトし、最終的なｓｉＲＮＡ濃度を１２．５ｎＭにした。ＲＮＡｉＭＡＸおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭの混合物を非ｓｉＲＮＡ対照として使用した。細胞をｓｉＲＮＡとともに８時間インキュベートし、次に新鮮な正規の培養培地を使用して、ｓｉＲＮＡ含有培地を置き換えた。ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションの２４時間後、細胞を内皮増殖アッセイおよびＲＮＡ／タンパク質抽出に使用した。
【0070】
ウエスタンブロッティング
ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞を成長培地で一晩培養した。成長培地を除去し、次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。組換えヒトＬＩＦを１５分間細胞に添加し、続いて次の培地で３時間インキュベートした：１０％ＢＣＳ、２ｍＭのグルタミン、およびＢＣＥ細胞用抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース、ならびに１％ＢＣＳおよびＢＡＥ細胞用の抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース。該当する場合、ＬＩＦ処理の１時間前に、小分子阻害剤（すなわち、バリシチニブ、コビメチニブ、ＢＥＺ２３５、およびビヒクル対照ＤＭＳＯ）を細胞に添加した。次に、細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＴ＃８９９０１）、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＡＴ＃７８４４０）で溶解した。細胞溶解物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＡＴ＃２３２２７）で測定した。等量のタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＴ＃ＮＷ０４１２５ＢＯＸ）の電気泳動に供し、次にＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、室温で１時間、ＴＢＳＴ中の５％脱脂乳を用いてブロックし、４℃で一晩、０．５％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ中で下記の一次抗体、次に室温で１時間、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：２０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートした。シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して開発された。使用した一次抗体：抗リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃９１３１、１：３０００）、抗ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４９０４、１：３０００）、抗リン酸化－ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４３７６）、１：５０００）、抗ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４６９５、１：５０００）、抗リン酸化－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４０６０、１：２０００）、抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４６９１、１：２０００）、およびＨＲＰコンジュゲート抗ベータ－アクチン（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃ＡＣ－１５、１；１００００）。
ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞を成長培地で一晩培養した。成長培地を除去し、次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。組換えヒトＬＩＦを１５分間細胞に添加し、続いて次の培地で３時間インキュベートした：１０％ＢＣＳ、２ｍＭのグルタミン、およびＢＣＥ細胞用抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース、ならびに１％ＢＣＳおよびＢＡＥ細胞用の抗生物質で補充したＤＭＥＭ－低グルコース。該当する場合、ＬＩＦ処理の１時間前に、小分子阻害剤（すなわち、バリシチニブ、コビメチニブ、ＢＥＺ２３５、およびビヒクル対照ＤＭＳＯ）を細胞に添加した。次に、細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＴ＃８９９０１）、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＡＴ＃７８４４０）で溶解した。細胞溶解物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＡＴ＃２３２２７）で測定した。等量のタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＴ＃ＮＷ０４１２５ＢＯＸ）の電気泳動に供し、次にＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、室温で１時間、ＴＢＳＴ中の５％脱脂乳を用いてブロックし、４℃で一晩、０．５％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ中で下記の一次抗体、次に室温で１時間、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：２０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートした。シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して開発された。使用した一次抗体：抗リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃９１３１、１：３０００）、抗ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４９０４、１：３０００）、抗リン酸化－ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４３７６）、１：５０００）、抗ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４６９５、１：５０００）、抗リン酸化－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４０６０、１：２０００）、抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＣＡＴ＃４６９１、１：２０００）、およびＨＲＰコンジュゲート抗ベータ－アクチン（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃ＡＣ－１５、１；１００００）。
【0071】
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ－ＰＣＲ
示された処理の後、ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃１５５９６０２６）で溶解し、製造業者の指示に従ってＲＮＡ抽出に供した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定し、１μｇの全ＲＮＡをＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。等量（通常、１０ｎｇ／反応）のｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃４４４４５５７）およびＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステムを使用してｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。調べた遺伝子の相対的なｍＲＮＡレベルを、内部対照ＲＰＬＰ０（リボソームタンパク質側茎サブユニットＰ０）に対して正規化し、対照サンプルグループと比較することによって決定し、倍率変化として報告した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイプローブを使用した：ウシＲＰＬＰ０（Ｂｔ０３２１８０８６＿ｍ１）、ウシＳＴＡＴ３（Ｂｔ０３２５９８６５＿ｍ１）、ウシＣＴＳＬ１（Ｂｔ０３２５７３０７＿ｍ１およびＢｔ０３２５７３０９＿ｍ１）、ウシＣＴＳＢ（Ｂｔ０３２５９１６１＿ｍ１）、ウシＭＹＣ（Ｂｔ０３２６０３７７＿ｍ１）、ウシＪｕｎＢ（Ｂｔ０３２４６９１９＿ｓ１）、ウシＣＣＮＡ２（Ｂｔ０３２４０５０３＿ｇ１）、ウシＣＣＮＢ１（Ｂｔ０３２３７８５３＿ｇ１）、およびウシＰＩＭ１（Ｂｔ０３２１２９５７＿ｍ１）。実験を３回実行し、３回繰り返した。
示された処理の後、ＢＣＥおよびＢＡＥ細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃１５５９６０２６）で溶解し、製造業者の指示に従ってＲＮＡ抽出に供した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定し、１μｇの全ＲＮＡをＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。等量（通常、１０ｎｇ／反応）のｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＴ＃４４４４５５７）およびＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステムを使用してｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。調べた遺伝子の相対的なｍＲＮＡレベルを、内部対照ＲＰＬＰ０（リボソームタンパク質側茎サブユニットＰ０）に対して正規化し、対照サンプルグループと比較することによって決定し、倍率変化として報告した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイプローブを使用した：ウシＲＰＬＰ０（Ｂｔ０３２１８０８６＿ｍ１）、ウシＳＴＡＴ３（Ｂｔ０３２５９８６５＿ｍ１）、ウシＣＴＳＬ１（Ｂｔ０３２５７３０７＿ｍ１およびＢｔ０３２５７３０９＿ｍ１）、ウシＣＴＳＢ（Ｂｔ０３２５９１６１＿ｍ１）、ウシＭＹＣ（Ｂｔ０３２６０３７７＿ｍ１）、ウシＪｕｎＢ（Ｂｔ０３２４６９１９＿ｓ１）、ウシＣＣＮＡ２（Ｂｔ０３２４０５０３＿ｇ１）、ウシＣＣＮＢ１（Ｂｔ０３２３７８５３＿ｇ１）、およびウシＰＩＭ１（Ｂｔ０３２１２９５７＿ｍ１）。実験を３回実行し、３回繰り返した。
【0072】
細胞死のためのアネキシンＶ染色
ＢＡＥ細胞を、１２ウェルプレートに、１ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ－低グルコースおよび１０％ＢＣＳ）とともに２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、次に３７℃で一晩インキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を０．５ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースおよび１％ＢＣＳでインキュベートした。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクル対照（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）を細胞に添加した。２４時間のＬＩＦ処理後、製造業者の指示に従って、アネキシンＶ－Ｃｙ５アポトーシス染色検出キット（Ａｂｃａｍ、ＣＡＴ＃ａｂ１４１５０）を使用して、細胞死マーカーであるアネキシンＶについて細胞を調べた。簡単に説明すると、細胞培養培地を除去し、０．５ｍｌのアネキシンＶ結合溶液を細胞上に置いた。５μｌのアネキシンＶ－Ｃｙ５を添加し、続いて細胞を室温で５分間インキュベートした。次に、染色溶液を廃棄し、０．５ｍｌのアネキシンＶ結合溶液と置き換えた。アネキシンＶ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。４つの確率場を選択し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、細胞死の指標としての全細胞被覆領域におけるアネキシンＶ染色領域の割合を決定した。アネキシンＶ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。実験を３回実行し、３回繰り返した。
ＢＡＥ細胞を、１２ウェルプレートに、１ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ－低グルコースおよび１０％ＢＣＳ）とともに２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、次に３７℃で一晩インキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を０．５ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースおよび１％ＢＣＳでインキュベートした。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクル対照（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）を細胞に添加した。２４時間のＬＩＦ処理後、製造業者の指示に従って、アネキシンＶ－Ｃｙ５アポトーシス染色検出キット（Ａｂｃａｍ、ＣＡＴ＃ａｂ１４１５０）を使用して、細胞死マーカーであるアネキシンＶについて細胞を調べた。簡単に説明すると、細胞培養培地を除去し、０．５ｍｌのアネキシンＶ結合溶液を細胞上に置いた。５μｌのアネキシンＶ－Ｃｙ５を添加し、続いて細胞を室温で５分間インキュベートした。次に、染色溶液を廃棄し、０．５ｍｌのアネキシンＶ結合溶液と置き換えた。アネキシンＶ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。４つの確率場を選択し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、細胞死の指標としての全細胞被覆領域におけるアネキシンＶ染色領域の割合を決定した。アネキシンＶ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。実験を３回実行し、３回繰り返した。
【0073】
ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
ＢＡＥ細胞を、各ウェル１８ｍｍのポリ－Ｄ－リジン処理したカバーガラスを用いて、１２ウェルプレート中に、１ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ－低グルコースおよび１０％ＢＣＳ）とともに２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を０．５ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースおよび１％ＢＣＳでインキュベートした。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクル対照（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）を細胞に添加した。４８時間のＬＩＦ処理後、ＤＭＳＯ中の２．５μｌの２ｍＭのＢｒｄＵを各ウェルに最終濃度１０μＭまで添加し、４時間インキュベートすることによって、細胞をＢｒｄＵ取り込みに供した。次に、細胞を、フルオロアレクサ－４８８とコンジュゲートしたＢｒｄＵに対する抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃３６４１０６、１：４００）を使用してＢｒｄＵ免疫蛍光染色に供した。簡単に説明すると、ＢｒｄＵ標識培地を培養プレートから除去し、細胞をＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定した。細胞ＤＮＡを、氷上で１Ｎ ＨＣｌを用いて１０分間、室温で２ＮＨＣｌを用いて１０分間変性させ、続いてＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を透過処理した。細胞カバーガラスを、４℃で一晩、５％ヤギ血清－ＰＢＳＴ中のフルオロアレクサ－４８８コンジュゲートＢｒｄＵ抗体とともにインキュベートした。次に、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ａｂｃａｍ、ＣＡＴ＃ａｂ１０４１３９）を用いて、カバーガラスをスライドガラスに装着した。ＢｒｄＵ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。各サンプルに対して４つのフィールドをランダムに選択し、ＢｒｄＵ陽性の核、ならびに全核（ＤＡＰＩ陽性）を手動でカウントし、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を、ＢｒｄＵ陽性核の数を全核の数で割ることによって決定した。実験を２回／３回実行し、３回繰り返した。
ＢＡＥ細胞を、各ウェル１８ｍｍのポリ－Ｄ－リジン処理したカバーガラスを用いて、１２ウェルプレート中に、１ｍｌの培養培地（ＤＭＥＭ－低グルコースおよび１０％ＢＣＳ）とともに２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。培養培地を除去した後、細胞を０．５ｍｌのＤＭＥＭ－低グルコースおよび１％ＢＣＳでインキュベートした。ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびビヒクル対照（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）を細胞に添加した。４８時間のＬＩＦ処理後、ＤＭＳＯ中の２．５μｌの２ｍＭのＢｒｄＵを各ウェルに最終濃度１０μＭまで添加し、４時間インキュベートすることによって、細胞をＢｒｄＵ取り込みに供した。次に、細胞を、フルオロアレクサ－４８８とコンジュゲートしたＢｒｄＵに対する抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡＴ＃３６４１０６、１：４００）を使用してＢｒｄＵ免疫蛍光染色に供した。簡単に説明すると、ＢｒｄＵ標識培地を培養プレートから除去し、細胞をＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定した。細胞ＤＮＡを、氷上で１Ｎ ＨＣｌを用いて１０分間、室温で２ＮＨＣｌを用いて１０分間変性させ、続いてＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を透過処理した。細胞カバーガラスを、４℃で一晩、５％ヤギ血清－ＰＢＳＴ中のフルオロアレクサ－４８８コンジュゲートＢｒｄＵ抗体とともにインキュベートした。次に、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ａｂｃａｍ、ＣＡＴ＃ａｂ１０４１３９）を用いて、カバーガラスをスライドガラスに装着した。ＢｒｄＵ染色の画像化を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。各サンプルに対して４つのフィールドをランダムに選択し、ＢｒｄＵ陽性の核、ならびに全核（ＤＡＰＩ陽性）を手動でカウントし、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を、ＢｒｄＵ陽性核の数を全核の数で割ることによって決定した。実験を２回／３回実行し、３回繰り返した。
【0074】
マウス脈絡膜外植片アッセイ
４８ウェルプレートで、６０μＬの成長因子還元基底膜抽出物（ＧＦＲ－ＢＭＥ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３５４２３０）を各ウェルに添加し、３７℃で２０分間固化させた。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｐ２０歳）から解剖した立方体の末梢脈絡膜－強膜複合体（約１ｍｍ×１ｍｍ）を、前述のように各ウェルの中央に添加した（２３）。６０μＬのＧＦＲ－ＢＭＥの最上層を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。２％ＦＢＳおよび抗生物質で補充した５００μＬの内皮細胞成長基本培地ＥＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ、ＣＡＴ＃ＣＣ３１５６）を添加すると、脈絡膜外植片の内因性ＶＥＧＦ活性を、５μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ Ｍａｂ Ｂ２０－４．１．１によって鈍化した。抗体との９０分のインキュベーション後、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦまたはＰＢＳ対照を試験ウェルに添加した。組織を、５％ＣＯ２を有する標準的な細胞培養条件でインキュベートし、新鮮な培地を４８時間ごとに交換した。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡を使用して、各外植片の位相差Ｚスタック画像を５日目に撮影した。血管の発芽領域を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。実験を３回繰り返し、毎回条件ごとに５回の繰り返しを分析することによってデータを得た。
４８ウェルプレートで、６０μＬの成長因子還元基底膜抽出物（ＧＦＲ－ＢＭＥ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３５４２３０）を各ウェルに添加し、３７℃で２０分間固化させた。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｐ２０歳）から解剖した立方体の末梢脈絡膜－強膜複合体（約１ｍｍ×１ｍｍ）を、前述のように各ウェルの中央に添加した（２３）。６０μＬのＧＦＲ－ＢＭＥの最上層を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。２％ＦＢＳおよび抗生物質で補充した５００μＬの内皮細胞成長基本培地ＥＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ、ＣＡＴ＃ＣＣ３１５６）を添加すると、脈絡膜外植片の内因性ＶＥＧＦ活性を、５μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ Ｍａｂ Ｂ２０－４．１．１によって鈍化した。抗体との９０分のインキュベーション後、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦまたはＰＢＳ対照を試験ウェルに添加した。組織を、５％ＣＯ２を有する標準的な細胞培養条件でインキュベートし、新鮮な培地を４８時間ごとに交換した。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡を使用して、各外植片の位相差Ｚスタック画像を５日目に撮影した。血管の発芽領域を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。実験を３回繰り返し、毎回条件ごとに５回の繰り返しを分析することによってデータを得た。
【0075】
マウスの眼における組換えタンパク質の硝子体内注射
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週およびＰ５）を、ケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。１μｌのＰＢＳおよびＰＢＳビヒクル対照中の示された量の組換えＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃ＳＲＰ９００１）を、３３ゲージのハミルトン注射器で硝子体内注射した。注射の７日後（成体マウスの場合）または３日後（新生児マウスの場合）、動物を安楽死させ、次に眼を除核し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。脈絡膜－強膜複合体および網膜を分離し、抗ＣＤ３１免疫蛍光（ＩＦ）またはレクチン標識を実施して、網膜および脈絡膜組織の両方のホールマウント染色または網膜のフラットマウントによって血管系を証明した。ＣＤ３１ ＩＦの場合、ラット抗マウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡＴ＃５５０２７４）を、１：１００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲート抗ラット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＴ＃Ａ１１００６）とともに４時間インキュベートした後、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）またはＡ１Ｒ共焦点ＳＴＯＲＭ超解像システム（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、４８８ｎｍチャネルを介してホールマウントを画像化した。レクチン染色の場合、Ｄｙｌｉｇｈｔ－４８８標識レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡＴ＃ＤＬ－１１７４）を１：２００に希釈し、Ａ１Ｒ共焦点ＳＴＯＲＭ超解像システム（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像を得た。脈絡膜および網膜の血管密度の定量化をＩｍａｇｅ Ｊによって実行した。統計分析には、スチューデントのｔ検定を使用した。各実験を３回繰り返し、毎回同様の結果が得られ、各処理グループは、全ての実験で４つまたは５つの個別のサンプルで構成されていた。全ての動物実験手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、動物管理プログラム（ＡＣＰ）のガイドラインに従って行われた。
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週およびＰ５）を、ケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。１μｌのＰＢＳおよびＰＢＳビヒクル対照中の示された量の組換えＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＴ＃ＳＲＰ９００１）を、３３ゲージのハミルトン注射器で硝子体内注射した。注射の７日後（成体マウスの場合）または３日後（新生児マウスの場合）、動物を安楽死させ、次に眼を除核し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。脈絡膜－強膜複合体および網膜を分離し、抗ＣＤ３１免疫蛍光（ＩＦ）またはレクチン標識を実施して、網膜および脈絡膜組織の両方のホールマウント染色または網膜のフラットマウントによって血管系を証明した。ＣＤ３１ ＩＦの場合、ラット抗マウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡＴ＃５５０２７４）を、１：１００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲート抗ラット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡＴ＃Ａ１１００６）とともに４時間インキュベートした後、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）またはＡ１Ｒ共焦点ＳＴＯＲＭ超解像システム（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、４８８ｎｍチャネルを介してホールマウントを画像化した。レクチン染色の場合、Ｄｙｌｉｇｈｔ－４８８標識レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡＴ＃ＤＬ－１１７４）を１：２００に希釈し、Ａ１Ｒ共焦点ＳＴＯＲＭ超解像システム（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像を得た。脈絡膜および網膜の血管密度の定量化をＩｍａｇｅ Ｊによって実行した。統計分析には、スチューデントのｔ検定を使用した。各実験を３回繰り返し、毎回同様の結果が得られ、各処理グループは、全ての実験で４つまたは５つの個別のサンプルで構成されていた。全ての動物実験手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、動物管理プログラム（ＡＣＰ）のガイドラインに従って行われた。
【0076】
ヨウ素酸ナトリウムモデル
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。滅菌のＮａＩＯ３を、単回静脈内注射（２０ｍｇ／ｋｇ体重）として投与した（２８）（２９）。対照マウスにＰＢＳを注射した。ＰＢＳ、ＬＩＦ（５０ｎｇ）、ＣＴ－１（異なる用量）、またはＯＳＭ（１０ｎｇ）を５匹のマウスグループに硝子体内注射した。注射の５、７、および９日後、脈絡膜毛細血管をＯＣＴ－Ａシステムによってモニターした。注射の９日後、マウスを殺し、Ｈ＆Ｅおよび免疫蛍光染色のために眼を採取した。脈絡膜毛細血管の無血管領域を、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。滅菌のＮａＩＯ３を、単回静脈内注射（２０ｍｇ／ｋｇ体重）として投与した（２８）（２９）。対照マウスにＰＢＳを注射した。ＰＢＳ、ＬＩＦ（５０ｎｇ）、ＣＴ－１（異なる用量）、またはＯＳＭ（１０ｎｇ）を５匹のマウスグループに硝子体内注射した。注射の５、７、および９日後、脈絡膜毛細血管をＯＣＴ－Ａシステムによってモニターした。注射の９日後、マウスを殺し、Ｈ＆Ｅおよび免疫蛍光染色のために眼を採取した。脈絡膜毛細血管の無血管領域を、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。
【0077】
網膜の血管漏出の測定
組換えヒトＶＥＧＦ（１００ｎｇ）またはＬＩＦ（１０ｎｇ）を硝子体に注射した（ビヒクル対照として０．１％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液）。次に、ＴＲＩＴＣ－デキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｕｌ）を尾静脈に注射した。１０分後、動物を屠殺し、眼を除核した。網膜フラットマウントを顕微鏡下で画像化した（６５）。
組換えヒトＶＥＧＦ（１００ｎｇ）またはＬＩＦ（１０ｎｇ）を硝子体に注射した（ビヒクル対照として０．１％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液）。次に、ＴＲＩＴＣ－デキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｕｌ）を尾静脈に注射した。１０分後、動物を屠殺し、眼を除核した。網膜フラットマウントを顕微鏡下で画像化した（６５）。
【0078】
光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）画像化
成体マウスの網膜の光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）画像化を、ＬＩＦ注射の７日後に、前述された方法論と一致するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＳｅａｔｔｌｅのＲ．Ｋ．Ｗａｎｇ博士のグループによって開発された１３００ｎｍの光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）システムを使用して実施した（６６）。簡単に説明すると、１３００ｎｍおよび２００ｋＨｚのＡラインレートを中心とする９０ｎｍの帯域幅を有する単一経度モードで動作する掃引レーザを使用して、マウスの網膜をスキャンし、１．５×１．５ｍｍ２の視野の血管系の画像を生成した。２５００のＢフレームが５００の断面で捕捉され、各断面で５つのＢフレームが繰り返された。網膜血管密度を定量化するために、３Ｄ構造のＯＣＴスキャンにおける網膜層および脈絡膜層を超反射網膜色素上皮（ＲＰＥ）によって分離した。次に、正視の最大強度の投影を生成した。次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、全視野領域における血管被覆領域の割合を計算することによって、血管密度を決定した。
成体マウスの網膜の光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）画像化を、ＬＩＦ注射の７日後に、前述された方法論と一致するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＳｅａｔｔｌｅのＲ．Ｋ．Ｗａｎｇ博士のグループによって開発された１３００ｎｍの光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）システムを使用して実施した（６６）。簡単に説明すると、１３００ｎｍおよび２００ｋＨｚのＡラインレートを中心とする９０ｎｍの帯域幅を有する単一経度モードで動作する掃引レーザを使用して、マウスの網膜をスキャンし、１．５×１．５ｍｍ２の視野の血管系の画像を生成した。２５００のＢフレームが５００の断面で捕捉され、各断面で５つのＢフレームが繰り返された。網膜血管密度を定量化するために、３Ｄ構造のＯＣＴスキャンにおける網膜層および脈絡膜層を超反射網膜色素上皮（ＲＰＥ）によって分離した。次に、正視の最大強度の投影を生成した。次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、全視野領域における血管被覆領域の割合を計算することによって、血管密度を決定した。
【0079】
統計分析
実験を少なくとも３回繰り返し、質量分析を除いて同様の結果が得られた。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓｄ）を表す。研究の２つのグループのみを比較するために、両側スチューデントのｔ検定を実施した。３つ以上のデータグループを用いた研究のグループ間の比較のために、多重比較を伴う一元配置分散分析を実施した。２つ以上の変数を用いた研究のグループ間の比較のために、多重比較を伴う二元配置分散分析を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。全ての統計分析を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアパッケージを使用して実施した。
実験を少なくとも３回繰り返し、質量分析を除いて同様の結果が得られた。棒グラフは、平均±標準偏差（ｓｄ）を表す。研究の２つのグループのみを比較するために、両側スチューデントのｔ検定を実施した。３つ以上のデータグループを用いた研究のグループ間の比較のために、多重比較を伴う一元配置分散分析を実施した。２つ以上の変数を用いた研究のグループ間の比較のために、多重比較を伴う二元配置分散分析を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。全ての統計分析を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアパッケージを使用して実施した。
【0080】
結果
脈絡膜内皮細胞のマイトジェンとしてのＬＩＦの特定
ＬＮ－２２９細胞馴化培地（ＬＮ－２２９ ＣＭ）は、ウシ脈絡膜内皮（ＢＣＥ）細胞の成長を刺激することができる（図１Ａ）。しかしながら、以前の研究（９、１０）と一致して、ＬＮ－２２９細胞は、培地にＶＥＧＦをほとんど分泌しない。抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０－４．１（１１）は、ＬＮ－２２９ ＣＭのマイトジェン効果を抑制せず（図１Ｂ）、ＶＥＧＦ非依存性経路の関与を示唆している。ＬＮ－２２９ ＣＭの血管新生因子プロファイルを、特定の抗体アレイを使用して調べた。この分析は、ＣＭに豊富に含まれていたＰＤＧＦ－ＡＡ、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１としても既知である）、およびインターロイキン８（ＩＬ－８）を除いて、既知の血管新生因子の大部分が検出できないことを明らかにしている。しかしながら、ＰＤＧＦ－ＡＡまたはＣＣＬ２を中和する抗体は、ＬＮ－２２９ ＣＭによって誘導されるＢＣＥ細胞成長を抑制することができない。さらに、組換えＰＤＧＦ－ＡＡおよびＩＬ－８はＢＣＥ細胞成長を刺激できない（表１）。
脈絡膜内皮細胞のマイトジェンとしてのＬＩＦの特定
ＬＮ－２２９細胞馴化培地（ＬＮ－２２９ ＣＭ）は、ウシ脈絡膜内皮（ＢＣＥ）細胞の成長を刺激することができる（図１Ａ）。しかしながら、以前の研究（９、１０）と一致して、ＬＮ－２２９細胞は、培地にＶＥＧＦをほとんど分泌しない。抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０－４．１（１１）は、ＬＮ－２２９ ＣＭのマイトジェン効果を抑制せず（図１Ｂ）、ＶＥＧＦ非依存性経路の関与を示唆している。ＬＮ－２２９ ＣＭの血管新生因子プロファイルを、特定の抗体アレイを使用して調べた。この分析は、ＣＭに豊富に含まれていたＰＤＧＦ－ＡＡ、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１としても既知である）、およびインターロイキン８（ＩＬ－８）を除いて、既知の血管新生因子の大部分が検出できないことを明らかにしている。しかしながら、ＰＤＧＦ－ＡＡまたはＣＣＬ２を中和する抗体は、ＬＮ－２２９ ＣＭによって誘導されるＢＣＥ細胞成長を抑制することができない。さらに、組換えＰＤＧＦ－ＡＡおよびＩＬ－８はＢＣＥ細胞成長を刺激できない（表１）。
【表1】
【0081】
ＬＮ－２２９ ＣＭのマイトジェン因子を特定するために、プロテオミクスアプローチを採用した。ＢＣＥマイトジェン活性を、陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーの２つの連続したクロマトグラフィーステップによって強化した。各ステップで、４～５個の連続した画分で構成される吸光度の１つのピークのみが、マイトジェン活性を示した。逆相カラムステップの後、ピークマイトジェン画分（Ｒ２６およびＲ２７）、最小マイトジェン画分（Ｒ２５およびＲ２８）、および隣接陰性（Ｒ２４およびＲ２９）画分（図１Ｃ）を質量分析に供した。細胞内タンパク質をスクリーニングすることによって、５つの候補タンパク質の短いリストを生成した（表２）。
【表2】
【0082】
列挙した５つのタンパク質のうち４つは血清成分であり、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ）－１、－２、および－６、ならびにアルファ－２－マクログロブリンを含むレドックス酵素として機能し、ＬＩＦはサイトカインとして際立っていた。インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリータンパク質のメンバーであるＬＩＦは、広く発現し、複数の細胞タイプおよび組織で効果を発揮し、かつ胚性幹細胞の自己複製、胚盤胞着床、星状細胞分化を含むさまざまな重大な生理学的プロセスに関与している（１２、１３）。このサイトカインは以前に内皮細胞成長阻害剤および抗血管新生剤として特徴付けられていたため、本明細書のＬＩＦの存在は予想外であった（１４－１６）。しかしながら、ＬＩＦに対する抗体は、逆相画分によって誘導されるＢＣＥ細胞の成長を完全に抑制した（図１Ｄ）。各画分のＬＩＦレベルはマイトジェン活性と強く相関していた：最も生物活性のある画分、Ｒ２６およびＲ２７は最高のＬＩＦ濃度を示し、Ｒ２５およびＲ２８は微量のＬＩＦを有していたが、不活性画分Ｒ２４およびＲ２９はＬＩＦを欠いていた（表３）。
【表3】
【0083】
これらの観察は、ＬＩＦがマイトジェン効果の原因である可能性があることを示唆した。実際、組換えＬＩＦはＢＣＥ細胞の成長を刺激した（図１Ｅ）が、他の候補であるＰＲＤＸ１は効果を有せず（表１）、ＬＩＦがマイトジェン因子であることをさらに確認した。ウシ網膜内皮（ＢＲＥ）細胞で試験した場合、ＬＩＦはまたマイトジェン活性を発揮した。興味深いことに、ＶＥＧＦおよびＬＩＦは一緒になって、ＢＣＥ（図１Ｆ）およびＢＲＥ細胞の両方で相加的なマイトジェン効果よりも大きくなり、ＬＩＦとＶＥＧＦとの間の相乗関係を示唆している。実際、ＬＩＦはヒト網膜微小血管内皮細胞で強力なマイトジェン応答を誘発することはなかったが、その添加はＶＥＧＦ刺激による成長を著しく増強した。
【0084】
内皮細胞成長に対するＬＩＦの効果は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路によって媒介される
ＩＬ－６ファミリーの全てのメンバーは、受容体成分ｇｐ１３０を共有しているが、ＬＩＦシグナル伝達は、ｇｐ１３０：ＬＩＦＲ受容体二量体を介して伝達され、ＩＬ－６はＩＬ６Ｒα：ｇｐ１３０：ｇｐ１３０：ＩＬ６Ｒαテトラマーを介してその下流シグナルを活性化する（１２）。ｇｐ１３０に関連する４つのヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２）の中で、ＬＩＦシグナル伝達は、リン酸転移を介してＪＡＫ１を選択的に活性化する（１２、１７、１８）。ＬＩＦによって活性化されると、ＪＡＫは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ、およびＲＡＳ－ＭＡＰＫの３つの固有のシグナル伝達カスケードを誘発し、これらは、特定の方法で細胞タイプにおいて異なる機能に寄与する（１２、１９）。ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路に関して、ＬＩＦシグナル伝達は、ＳＴＡＴ３を優先的に活性化するが、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ５はＪＡＫ１によってリン酸化され得る（１９、２０）。どの経路がＢＣＥ細胞のＬＩＦ誘導性成長刺激の原因であるかを調べるために、それぞれＪＡＫ１／２、ＭＥＫ１／２（ＭＡＰＫ経路）、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲに特異的に反する小分子阻害剤バリシチニブ、コビメチニブ、およびＢＥＺ２３５のセットを用いた。ＢＣＥ細胞では、１５分間のＬＩＦ処理によって、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫのリン酸化が誘発されたが、ＡＫＴリン酸化にはほとんど効果を示さなかった（図２Ａ）。ＪＡＫ１／２阻害剤バリシチニブとのプレインキュベーションは、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ ＭＡＰＫのＬＩＦ誘導性リン酸化をほぼ完全に抑制し（図２Ａ）、コビメチニブ前処理は、ＥＲＫリン酸化をブロックしたが、ＳＴＡＴ３およびＡＫＴリン酸化に対する効果を示さなかった（図２Ａ）。ＢＥＺ２３５は、ＬＩＦ処理に関係なく、ＡＫＴリン酸化に中程度の効果しか有さなかった（図２Ａ）。さらに、バリシチニブは、ＬＩＦ誘導性細胞成長を完全にブロックしたが、コビメチニブは、最小限の効果を示し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤ＢＥＺ２３５は、ＬＩＦ刺激性細胞成長に効果を有さなかった（図２Ｂ）。これらの観察は、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路がＢＣＥ細胞におけるＬＩＦ刺激の主要な要因ではない可能性があることを示唆しており、したがって、ＪＡＫ－ＳＴＡＴが関与している。ＳＴＡＴ３はＬＩＦ誘導性ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードの優先媒介物質であり（１９、２０）、幅広いさまざまな細胞タイプの増殖および生存に関与しているため（２１）、ｓｉＲＮＡノックダウンによるＢＣＥでのＳＴＡＴ３の役割をさらに調べた。ｓｉＲＮＡは、ＢＣＥ細胞のＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＳＴＡＴ３レベルを正常に抑止した（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＳＴＡＴ３のダウンレギュレーションは、インビトロでＬＩＦ誘導性ＢＣＥ細胞成長をブロックした（図２Ｅ）。これらの観察は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達軸がＢＣＥ細胞におけるＬＩＦのマイトジェン効果を媒介することを示した。
ＩＬ－６ファミリーの全てのメンバーは、受容体成分ｇｐ１３０を共有しているが、ＬＩＦシグナル伝達は、ｇｐ１３０：ＬＩＦＲ受容体二量体を介して伝達され、ＩＬ－６はＩＬ６Ｒα：ｇｐ１３０：ｇｐ１３０：ＩＬ６Ｒαテトラマーを介してその下流シグナルを活性化する（１２）。ｇｐ１３０に関連する４つのヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２）の中で、ＬＩＦシグナル伝達は、リン酸転移を介してＪＡＫ１を選択的に活性化する（１２、１７、１８）。ＬＩＦによって活性化されると、ＪＡＫは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ、およびＲＡＳ－ＭＡＰＫの３つの固有のシグナル伝達カスケードを誘発し、これらは、特定の方法で細胞タイプにおいて異なる機能に寄与する（１２、１９）。ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路に関して、ＬＩＦシグナル伝達は、ＳＴＡＴ３を優先的に活性化するが、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ５はＪＡＫ１によってリン酸化され得る（１９、２０）。どの経路がＢＣＥ細胞のＬＩＦ誘導性成長刺激の原因であるかを調べるために、それぞれＪＡＫ１／２、ＭＥＫ１／２（ＭＡＰＫ経路）、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲに特異的に反する小分子阻害剤バリシチニブ、コビメチニブ、およびＢＥＺ２３５のセットを用いた。ＢＣＥ細胞では、１５分間のＬＩＦ処理によって、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫのリン酸化が誘発されたが、ＡＫＴリン酸化にはほとんど効果を示さなかった（図２Ａ）。ＪＡＫ１／２阻害剤バリシチニブとのプレインキュベーションは、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ ＭＡＰＫのＬＩＦ誘導性リン酸化をほぼ完全に抑制し（図２Ａ）、コビメチニブ前処理は、ＥＲＫリン酸化をブロックしたが、ＳＴＡＴ３およびＡＫＴリン酸化に対する効果を示さなかった（図２Ａ）。ＢＥＺ２３５は、ＬＩＦ処理に関係なく、ＡＫＴリン酸化に中程度の効果しか有さなかった（図２Ａ）。さらに、バリシチニブは、ＬＩＦ誘導性細胞成長を完全にブロックしたが、コビメチニブは、最小限の効果を示し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤ＢＥＺ２３５は、ＬＩＦ刺激性細胞成長に効果を有さなかった（図２Ｂ）。これらの観察は、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路がＢＣＥ細胞におけるＬＩＦ刺激の主要な要因ではない可能性があることを示唆しており、したがって、ＪＡＫ－ＳＴＡＴが関与している。ＳＴＡＴ３はＬＩＦ誘導性ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードの優先媒介物質であり（１９、２０）、幅広いさまざまな細胞タイプの増殖および生存に関与しているため（２１）、ｓｉＲＮＡノックダウンによるＢＣＥでのＳＴＡＴ３の役割をさらに調べた。ｓｉＲＮＡは、ＢＣＥ細胞のＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＳＴＡＴ３レベルを正常に抑止した（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＳＴＡＴ３のダウンレギュレーションは、インビトロでＬＩＦ誘導性ＢＣＥ細胞成長をブロックした（図２Ｅ）。これらの観察は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達軸がＢＣＥ細胞におけるＬＩＦのマイトジェン効果を媒介することを示した。
【0085】
ＬＩＦは、エクスビボおよびインビボで内皮細胞の成長を促進した
ＬＩＦは、インビトロで脈絡膜および網膜内皮細胞の増殖を誘導し得る。しかしながら、以前の報告は、ＬＩＦが発達中の眼の血管機能に悪影響を及ぼす可能性があることを示唆していた（１４、１６、２２）。これらの明らかな不一致を解決するために、ＬＩＦがエクスビボおよびインビボ、特に眼の内皮細胞で異なって機能するかどうかを調べた。脈絡膜内皮細胞に対するＬＩＦの効果を、以前の報告から修正されたエクスビボ脈絡膜外植片モデルで最初に調べた（２３）。ＬＩＦに応答して、外植片からマトリゲルへの微小血管の成長は、対照のそれと比較して著しく増強された（図３Ａおよび３Ｂ）。次に、インビボでのＬＩＦ効果を、６～８週齢のマウスへの硝子体内注射によって調べた。内皮細胞表面マーカーＣＤ３１に対する抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）で評価したところ、１眼あたり１０ｎｇの用量でＬＩＦを投与すると、網膜微小血管密度が著しく増加したが、１００ｎｇの用量では効果が低く（図３Ｃおよび３Ｄ）、多くのサイトカインで観察されたベル型の応答と一致している（２４）。光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）も、ＬＩＦ注射後の網膜血管密度の著しい増加を記録した（図３Ｅおよび３Ｆ）。マウスの眼の断面におけるＣＤ３１の免疫蛍光染色も、ＬＩＦ注射が成体マウスの網膜の血管密度を増加させることを実証した（図３Ｇおよび３Ｈ）。
ＬＩＦは、インビトロで脈絡膜および網膜内皮細胞の増殖を誘導し得る。しかしながら、以前の報告は、ＬＩＦが発達中の眼の血管機能に悪影響を及ぼす可能性があることを示唆していた（１４、１６、２２）。これらの明らかな不一致を解決するために、ＬＩＦがエクスビボおよびインビボ、特に眼の内皮細胞で異なって機能するかどうかを調べた。脈絡膜内皮細胞に対するＬＩＦの効果を、以前の報告から修正されたエクスビボ脈絡膜外植片モデルで最初に調べた（２３）。ＬＩＦに応答して、外植片からマトリゲルへの微小血管の成長は、対照のそれと比較して著しく増強された（図３Ａおよび３Ｂ）。次に、インビボでのＬＩＦ効果を、６～８週齢のマウスへの硝子体内注射によって調べた。内皮細胞表面マーカーＣＤ３１に対する抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）で評価したところ、１眼あたり１０ｎｇの用量でＬＩＦを投与すると、網膜微小血管密度が著しく増加したが、１００ｎｇの用量では効果が低く（図３Ｃおよび３Ｄ）、多くのサイトカインで観察されたベル型の応答と一致している（２４）。光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）も、ＬＩＦ注射後の網膜血管密度の著しい増加を記録した（図３Ｅおよび３Ｆ）。マウスの眼の断面におけるＣＤ３１の免疫蛍光染色も、ＬＩＦ注射が成体マウスの網膜の血管密度を増加させることを実証した（図３Ｇおよび３Ｈ）。
【0086】
そのような血管新生刺激効果が、エンドトキシンなどの微量の汚染物質および注射に関連する非特異的な事象ではなく、ＬＩＦによって真に誘導されたことを確認するために、組換えＬＩＦを９５℃に２時間さらすことで熱不活化したが、これは、エンドトキシンの安定性には影響を及ぼさない（３０）。そのような処理は、インビトロでのマイトジェンおよびインビボでの血管新生を促進するＬＩＦ能力を無効にした。しかしながら、ＬＩＦノックアウトマウスを使用した以前の研究は、ＬＩＦの発現が網膜血管密度と陰性関連があることを示唆していた（１６）。そのような観察と本発明のデータとの間の違いは、ＬＩＦが異なる発達段階で網膜血管新生を調節する際に固有の役割を果たす可能性を高める。重要なことに、ＬＩＦはまた、網膜星状細胞の成熟にも重大な役割を果たしており、網膜血管系の発達に二次的に影響を及ぼし得る（３１、３２）。発達中の網膜血管系に対するＬＩＦの効果を調べ、星状細胞の発達に対する影響を最小限に抑えるために、網膜血管系が発達しているが星状細胞ネットワークがすでに確立され、成熟中の生後５日（Ｐ５）のマウスにＬＩＦを硝子体内注射した（３３、３４）。そのような新生児マウスにおけるＬＩＦ処理はまた、注射の３日後に評価したところ、血管密度の著しい増加をもたらし（図３Ｉおよび３Ｊ）、網膜血管系におけるＬＩＦの血管新生刺激効果を確認した。
【0087】
ＬＩＦはインターロイキン－６（ＩＬ－６）ファミリーのメンバーであるため（２５）、網膜新血管新生に対する他の２つのファミリーメンバーであるカルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）（２６）およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（２７）の効果を試験した。５０ｎｇのＬＩＦに匹敵して、２０ｎｇおよび１００ｎｇのＣＴ－１は、網膜密度においてそれぞれ約３０％および５０％の増加をもたらした。しかしながら、促進の代わりに、血管密度は、ＯＳＭ処理マウスの網膜で減少した。網膜血管系に対するＬＩＦおよびＣＴ－１の効果とは異なるＯＳＭによって誘導される効果は、ＯＳＭがＬＩＦおよびＣＴ－１が活性化するのと同じシグナル伝達経路を活性化しない可能性があり、ＯＳＭは、ｇｐ１３０：：ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０：：ＯＳＭＲ受容体複合体の両方に結合できるが、ＬＩＦおよびＣＴ－１は、ｇｐ１３０：：ＬＩＦＲ複合体のみを利用することを示唆する。
【0088】
ＮａＩＯ３マウスモデルは、萎縮性ＡＭＤの前臨床モデルとして幅広く使用されている（２８）。このモデルでは、ＲＰＥ層および脈絡膜毛細血管の両方が酷く損傷している（２９）。したがって、ＬＩＦ、ＣＴ－１、およびＯＳＭを、このモデルで脈絡膜毛細血管の回復を促進する能力について試験した。ＮａＩＯ３の静脈内注射後、ＬＩＦ、ＣＴ－１、またはＯＳＭを硝子体内注射した。網膜血管系に対する効果と一致して、ＬＩＦおよびＣＴ－１は、ＰＢＳグループと比較して無血管領域を低減した。対照的に、ＯＳＭで処理した脈絡膜の無血管領域は、ＰＢＳグループよりも大きかった（図８Ｃおよび８Ｄ）。ＮａＩＯ３の治療に対する網膜血管系へのＬＩＦおよびＣＴ－１の保護効果は、網膜内皮細胞における直接的なマイトジェン活性および可能性として酸化ストレス誘導性損傷から網膜ＲＰＥ細胞を保護する能力の両方に起因し得、次に血管新生刺激因子、例えば、ＶＥＧＦの分泌を介して網膜血管系の維持をサポートする。
【0089】
ＬＩＦは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路を介して成長阻害をもたらした
以前の研究（３５）と一致して、ＬＩＦは、ＢＡＥ細胞の成長阻害をもたらし（図４Ａ）、内皮機能の調節におけるＬＩＦの複雑な役割を示唆している。ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性シグナル伝達カスケードを調べるために、バリシチニブ、コビメチニブ、およびＢＥＺ２３５を使用して、ＬＩＦ－ｇｐ１３０：ＬＩＦＲ下流成分であるＪＡＫ１／２、ＭＥＫ１／２、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲを阻害した。ＢＡＥ細胞では、１５分間のＬＩＦ処理によって、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）、およびＡＫＴがリン酸化された（図４Ｂ）。バリシチニブ前処理は、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ、およびＡＫＴのＬＩＦ誘導性リン酸化を著しく抑制し、コビメチニブおよびＢＥＺ２３５前処理もまた、それぞれＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化を効果的に制止した（図４Ｂ）。興味深いことに、バリシチニブは、ＢＡＥ細胞においてＬＩＦによって誘導された成長抑制を逆転させた唯一の阻害剤であり（図４Ｃ）、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路がＢＡＥ細胞でのＬＩＦの効果を媒介したことを示唆している。ＬＩＦによるＢＡＥ細胞の阻害がＪＡＫ－ＳＴＡＴ３カスケードに起因するかどうかをさらに調べるために、ＳＴＡＴ３をＢＡＥ細胞の３つの異なるｓｉＲＮＡで約８０％ノックダウンした（図４Ｄおよび４Ｅ）。興味深いことに、ＢＡＥ細胞におけるＳＴＡＴ３のノックダウンは、ＬＩＦによる成長阻害を改善した（図４Ｆ）。これらの観察は、ＬＩＦ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路が、内皮細胞のタイプに依存していた内皮細胞成長の調節において反対の役割を果たす可能性があることを実証する。
以前の研究（３５）と一致して、ＬＩＦは、ＢＡＥ細胞の成長阻害をもたらし（図４Ａ）、内皮機能の調節におけるＬＩＦの複雑な役割を示唆している。ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性シグナル伝達カスケードを調べるために、バリシチニブ、コビメチニブ、およびＢＥＺ２３５を使用して、ＬＩＦ－ｇｐ１３０：ＬＩＦＲ下流成分であるＪＡＫ１／２、ＭＥＫ１／２、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲを阻害した。ＢＡＥ細胞では、１５分間のＬＩＦ処理によって、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）、およびＡＫＴがリン酸化された（図４Ｂ）。バリシチニブ前処理は、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ、およびＡＫＴのＬＩＦ誘導性リン酸化を著しく抑制し、コビメチニブおよびＢＥＺ２３５前処理もまた、それぞれＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化を効果的に制止した（図４Ｂ）。興味深いことに、バリシチニブは、ＢＡＥ細胞においてＬＩＦによって誘導された成長抑制を逆転させた唯一の阻害剤であり（図４Ｃ）、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路がＢＡＥ細胞でのＬＩＦの効果を媒介したことを示唆している。ＬＩＦによるＢＡＥ細胞の阻害がＪＡＫ－ＳＴＡＴ３カスケードに起因するかどうかをさらに調べるために、ＳＴＡＴ３をＢＡＥ細胞の３つの異なるｓｉＲＮＡで約８０％ノックダウンした（図４Ｄおよび４Ｅ）。興味深いことに、ＢＡＥ細胞におけるＳＴＡＴ３のノックダウンは、ＬＩＦによる成長阻害を改善した（図４Ｆ）。これらの観察は、ＬＩＦ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路が、内皮細胞のタイプに依存していた内皮細胞成長の調節において反対の役割を果たす可能性があることを実証する。
【0090】
ＬＩＦは、カテプシンＬ依存性細胞死および細胞周期停止を介してＢＡＥ細胞成長を阻害した
次に、ＢＡＥ細胞においてＬＩＦによってどの成長阻害効果（例えば、細胞周期停止、細胞老化、またはプログラム細胞死）が誘導されたかを調べた。ＩＬ－６－ＳＴＡＴ３シグナル伝達は細胞老化と密接に関連していたため（３６～３８）、ＬＩＦ－ＳＴＡＴ３軸もＢＡＥ細胞の老化を誘導すると最初に仮説が立てられた。しかしながら、老化関連β－ガラクトシダーゼアッセイでは、ＬＩＦで４８時間処理したＢＡＥ細胞の老化細胞数の増加は観察されず、老化がＢＡＥ細胞のＬＩＦによって誘発される主な効果ではなかったことを示唆している。興味深いことに、細胞死マーカーであるアネキシンＶのための染色は、ＬＩＦで２４時間処理したＢＡＥ細胞でアネキシンＶ陽性の細胞の比率が増加したことを示し（図６Ａおよび６Ｂ）、ＬＩＦ処理が細胞死を誘導したことを示している。驚いたことに、カスパーゼ阻害剤（Ｑ－ＶＤ－ＯＰＨ、Ｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ、およびＺ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ）またはポリ（アデノシン５’－二リン酸リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（５－ＡＩＱ）との共インキュベーションは、ＬＩＦによって誘導された細胞死の表現型を救うことができなかった。これらのデータは、カスパーゼ非依存性経路がＢＡＥ細胞のＬＩＦ媒介性細胞死に関与し得ることを示唆する。ＢＡＥおよびＢＣＥ細胞におけるＬＩＦの分化した役割の分子基盤を調査するために、ＬＩＦによって誘導／抑制された遺伝子を、ＬＩＦとともに６時間インキュベートしたＢＡＥおよびＢＣＥ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。注目すべきことに、ＬＩＦ処理は、これら２つの細胞タイプで固有の遺伝子発現パターンをもたらした。特に、少なくともいくつかの状況では、血管新生阻害剤（３９）であることが以前に示された分泌タンパク質であるＩＧＦＢＰ３は、ＢＡＥでは約８倍アップレギュレーションされたが、ＢＣＥ細胞ではアップレギュレートされず、これは後にｑＲＴ－ＰＣＲによって確認された。しかしながら、組換えＩＧＦＢＰ３は、ＢＡＥ細胞成長に対して効果を有しなかった。さらに、ＬＩＦで７２時間処理したＢＡＥ細胞の馴化培地は、ＬＩＦ中和抗体の存在下でＢＡＥ細胞成長を阻害せず、ＬＩＦ誘導性ＢＡＥ成長阻害は、分泌因子によって媒介されるという仮説に反した。ＳＴＡＴ３は、リソソームプロテアーゼであるカテプシンＢおよびＬのアップレギュレーションを介して、カスパーゼ非依存性細胞死を誘導し得ることが以前に報告されている（４０）。したがって、ＬＩＦがＢＡＥ細胞でそのようなシグナル伝達カスケードを誘発する可能性があるかどうかを調べた。興味深いことに、ＣＴＳＢではなくＣＴＳＬは、ＢＡＥ細胞での２４時間の処理によって、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＬＩＦによって劇的にアップレギュレーションされた（図６Ｃおよび６Ｄ）。カテプシンＢおよびＬの両方に拮抗する阻害剤であるＣＡ０７４ｍｅとの共インキュベーションは、ＣＡ０７４ｍｅの用量依存的にＢＡＥ細胞のＬＩＦ誘導性成長阻害を軽減した（図６Ｅ）。さらに、別のカテプシンＬ特異的阻害剤であるＣＡＡ０２２５も、程度は低いものの、ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性成長阻害を制止した（図６Ｆ）。対照的に、カテプシンＢ選択的阻害剤であるＣＡ０７４は、試験した最高用量である５０μＭでもＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性効果を抑制することができなかった。興味深いことに、ＢＣＥ細胞のカテプシンＬ ｍＲＮＡ（ＣＴＳＬ）レベルは、細胞がビヒクルまたはＬＩＦとともにいつインキュベートされたかに関係なく、ｑＲＴ－ＰＣＲでは検出できなかった。これらのデータは、ＬＩＦがＢＡＥ細胞でカテプシンＬのアップレギュレーションを誘導し、次にカスパーゼ非依存性細胞死をもたらしたことをまとめて示した。さらに、ＬＩＦとともに４８時間インキュベートした後、ＢＡＥ細胞は、ビヒクル対照と比較してＢｒｄＵ取り込みの著しい低減を示し（図７Ａおよび７Ｂ）、細胞周期停止がＬＩＦによって誘発されたことを示唆している。この概念は、ＬＩＦ処理されたＢＡＥではサイクリンＡ／Ｂのダウンレギュレーションによってサポートされたが、ＢＣＥ細胞ではサポートされなかった（図７Ｃ）。
次に、ＢＡＥ細胞においてＬＩＦによってどの成長阻害効果（例えば、細胞周期停止、細胞老化、またはプログラム細胞死）が誘導されたかを調べた。ＩＬ－６－ＳＴＡＴ３シグナル伝達は細胞老化と密接に関連していたため（３６～３８）、ＬＩＦ－ＳＴＡＴ３軸もＢＡＥ細胞の老化を誘導すると最初に仮説が立てられた。しかしながら、老化関連β－ガラクトシダーゼアッセイでは、ＬＩＦで４８時間処理したＢＡＥ細胞の老化細胞数の増加は観察されず、老化がＢＡＥ細胞のＬＩＦによって誘発される主な効果ではなかったことを示唆している。興味深いことに、細胞死マーカーであるアネキシンＶのための染色は、ＬＩＦで２４時間処理したＢＡＥ細胞でアネキシンＶ陽性の細胞の比率が増加したことを示し（図６Ａおよび６Ｂ）、ＬＩＦ処理が細胞死を誘導したことを示している。驚いたことに、カスパーゼ阻害剤（Ｑ－ＶＤ－ＯＰＨ、Ｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ、およびＺ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ）またはポリ（アデノシン５’－二リン酸リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（５－ＡＩＱ）との共インキュベーションは、ＬＩＦによって誘導された細胞死の表現型を救うことができなかった。これらのデータは、カスパーゼ非依存性経路がＢＡＥ細胞のＬＩＦ媒介性細胞死に関与し得ることを示唆する。ＢＡＥおよびＢＣＥ細胞におけるＬＩＦの分化した役割の分子基盤を調査するために、ＬＩＦによって誘導／抑制された遺伝子を、ＬＩＦとともに６時間インキュベートしたＢＡＥおよびＢＣＥ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。注目すべきことに、ＬＩＦ処理は、これら２つの細胞タイプで固有の遺伝子発現パターンをもたらした。特に、少なくともいくつかの状況では、血管新生阻害剤（３９）であることが以前に示された分泌タンパク質であるＩＧＦＢＰ３は、ＢＡＥでは約８倍アップレギュレーションされたが、ＢＣＥ細胞ではアップレギュレートされず、これは後にｑＲＴ－ＰＣＲによって確認された。しかしながら、組換えＩＧＦＢＰ３は、ＢＡＥ細胞成長に対して効果を有しなかった。さらに、ＬＩＦで７２時間処理したＢＡＥ細胞の馴化培地は、ＬＩＦ中和抗体の存在下でＢＡＥ細胞成長を阻害せず、ＬＩＦ誘導性ＢＡＥ成長阻害は、分泌因子によって媒介されるという仮説に反した。ＳＴＡＴ３は、リソソームプロテアーゼであるカテプシンＢおよびＬのアップレギュレーションを介して、カスパーゼ非依存性細胞死を誘導し得ることが以前に報告されている（４０）。したがって、ＬＩＦがＢＡＥ細胞でそのようなシグナル伝達カスケードを誘発する可能性があるかどうかを調べた。興味深いことに、ＣＴＳＢではなくＣＴＳＬは、ＢＡＥ細胞での２４時間の処理によって、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＬＩＦによって劇的にアップレギュレーションされた（図６Ｃおよび６Ｄ）。カテプシンＢおよびＬの両方に拮抗する阻害剤であるＣＡ０７４ｍｅとの共インキュベーションは、ＣＡ０７４ｍｅの用量依存的にＢＡＥ細胞のＬＩＦ誘導性成長阻害を軽減した（図６Ｅ）。さらに、別のカテプシンＬ特異的阻害剤であるＣＡＡ０２２５も、程度は低いものの、ＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性成長阻害を制止した（図６Ｆ）。対照的に、カテプシンＢ選択的阻害剤であるＣＡ０７４は、試験した最高用量である５０μＭでもＢＡＥ細胞におけるＬＩＦ誘導性効果を抑制することができなかった。興味深いことに、ＢＣＥ細胞のカテプシンＬ ｍＲＮＡ（ＣＴＳＬ）レベルは、細胞がビヒクルまたはＬＩＦとともにいつインキュベートされたかに関係なく、ｑＲＴ－ＰＣＲでは検出できなかった。これらのデータは、ＬＩＦがＢＡＥ細胞でカテプシンＬのアップレギュレーションを誘導し、次にカスパーゼ非依存性細胞死をもたらしたことをまとめて示した。さらに、ＬＩＦとともに４８時間インキュベートした後、ＢＡＥ細胞は、ビヒクル対照と比較してＢｒｄＵ取り込みの著しい低減を示し（図７Ａおよび７Ｂ）、細胞周期停止がＬＩＦによって誘発されたことを示唆している。この概念は、ＬＩＦ処理されたＢＡＥではサイクリンＡ／Ｂのダウンレギュレーションによってサポートされたが、ＢＣＥ細胞ではサポートされなかった（図７Ｃ）。
【0091】
実施形態において、本発明は、血管成長、すなわち、血管新生を誘導するための、ＬＩＦおよびＣＴ－１などのＩＬ－６サイトカインの新規で予想外の活性を提供する。
【0092】
例えば、本発明は、内皮細胞成長の阻害剤として以前に特徴付けられた分子であるＬＩＦが、インビトロ、エクスビボ、およびインビボ研究によって評価されるように、眼において予想外の血管新生刺激特性を有することを提供する。
【0093】
本発明は、ＬＩＦが脈絡膜内皮細胞の増殖を直接刺激することができる一方で、それが大動脈内皮細胞の成長を阻害することを提供し、内皮細胞に対するその効果の特異性および独自性を強調する。ＬＩＦはまた、マウスの硝子体に注射されると、脈絡膜外植片からの内皮の発芽および血管新生を促進した。
【0094】
ＬＩＦは、よく特徴付けられたサイトカインであり、ＩＬ６ファミリーのメンバーである。それは、ＬＩＦ受容体と相互作用し、次にＧＰ１３０とヘテロ二量体を形成し、他の効果の中でもとりわけＳｔａｔ３の活性化をもたらす。
【0095】
本発明は、ＬＩＦが内皮細胞のサブセットの成長を促進できることを提供し、網膜／脈絡膜、冠状動脈、および心筋疾患における低灌流を含むさまざまな状態における療法的介入の機会を提供する（Ｒｅｂｏｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｉｍｏｎ－Ｙａｒｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＬＩＦが血管透過性を誘導しないという観察は、この因子の投与がＶＥＧＦに関連する望ましくない血管漏出を回避することを示唆する（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0096】
本発明は、ＬＩＦおよびＣＴ－１などのＩＬ－６ファミリーメンバーが、酸化ストレスによる損傷を含む損傷からＲＰＥを保護できることを示唆する。これは、ＲＰＥの損傷または変性に関連する網膜状態を治療するための新規の療法戦略を表すはずである。
参考文献
１．Ａ．Ｓ．Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２７，５６３－５８４（２０１１）．
２．Ｍ．Ｐｏｔｅｎｔｅ，Ｈ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １４６，８７３－８８７（２０１１）．
３．Ｇ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７，２４２－２４８（２０００）．
４．Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ａ．Ｐ．Ａｄａｍｉｓ，Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １５，３８５－４０３（２０１６）．
５．Ｒ．Ｓ．Ａｐｔｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，ＶＥＧＦ ｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂｅｙｏｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ １７６，１２４８－１２６４（２０１９）．
６．Ｊ．Ｍ．Ｉｓｎｅｒ，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ８２，６３Ｓ－６４Ｓ（１９９８）．
７．Ｍ．Ｓｉｍｏｎｓ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｗｈｅｒｅ ｄｏ ｗｅ ｓｔａｎｄ ｎｏｗ？ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１，１５５６－１５６６（２００５）．
８．Ｓ．Ｄａｓ，Ｐ．Ａ．Ｍａｒｓｄｅｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６９，１５６１－１５６３（２０１３）．
９．Ｃ．Ｄｅｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥｐｈｒｉｎＢ２ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＺＥＢ２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，１２３２９（２０１６）．
１０．Ｒ．Ｆｅｒｌａ，Ｍ．Ｂｏｎｏｍｉ，Ｌ．Ｏｔｖｏｓ，Ｊｒ．，Ｅ．Ｓｕｒｍａｃｚ，Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｅｐｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＶＥＧＦ ｅｆｆｅｃｔｓ．ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ １１，３０３（２０１１）．
１１．Ａ．Ｈｏｌｍ，Ｔ．Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｕｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２８，３０２－３１６（２０１８）．
１２．Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ，Ｊ．Ｊ．Ｂａｂｏｎ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２６，５３３－５４４（２０１５）．
１３．Ｇ．Ｘ．Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７５，２４６－２５５（２０１６）．
１４．Ｊ．Ａｓｈ，Ｄ．Ｓ．ＭｃＬｅｏｄ，Ｇ．Ａ．Ｌｕｔｔｙ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ｂｌｏｃｋｓ ｎｏｒｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｙｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ １１，２９８－３０８（２００５）．
１５．Ｍ．Ｓ．Ｐｅｐｐｅｒ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｌ．Ｏｒｃｉ，Ｒ．Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０８（Ｐｔ １），７３－８３（１９９５）．
１６．Ｙ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｍ．Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，Ｋ．Ｋｉｓｈｉ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔ．Ｓｕｄａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＶＥＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，２３９３－２４０３（２００８）．
１７．Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ １－ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３－ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３ ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２２，１６７３－１６８１（２００８）．
１８．Ｓ．Ｊ．Ｒｏｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｋ１ ｇｅｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ ａｎｄ ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｋｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ ９３，３７３－３８３（１９９８）．
１９．Ｓ．Ｇ．Ｒａｎｅ，Ｅ．Ｐ．Ｒｅｄｄｙ，Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅｓ：ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，５６６２－５６７９（２０００）．
２０．Ｈ．Ｋｉｕ，Ｓ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３０，８８－１０６（２０１２）．
２１．Ｈ．Ｙｕ，Ｄ．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｒ．Ｊｏｖｅ，ＳＴＡＴｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａ ｌｅａｄｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＳＴＡＴ３．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ ９，７９８－８０９（２００９）．
２２．Ｊ．Ｒ．ＭｃＣｏｌｍ，Ｐ．Ｇｅｉｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｎｏｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８３，４３８－４４６（２００６）．
２３．Ｚ．Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｏｒｏｉｄ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ａｓｓａｙ：ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８，ｅ６９５５２（２０１３）．
２４．Ｍ．Ａｔａｎａｓｏｖａ，Ａ．Ｗｈｉｔｔｙ，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４７，５０２－５３０（２０１２）．
２５．Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ－１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｇｐ１３０ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０，１０９１５－１０９２２（１９９５）．
２６．Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ １，ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９２，１１４２－１１４６（１９９５）．
２７．Ｄ．Ｐ．Ｇｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｇ．Ｂｒｕｃｅ，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ４，６１－６５（１９９２）．
２８．Ｊ．Ｈａｎｕｓ，Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｓａｒｒａｆ，Ｊ．Ｍａ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄａｔｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ ２，１６０５４（２０１６）．
２９．Ａ．Ｍｉｚｏｔａ，Ｅ．Ａｄａｃｈｉ－Ｕｓａｍｉ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎａ ａｆｔｅｒ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄａｔｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ３７，１８５９－１８６５（１９９７）．
３０．Ｐ．Ｏ．Ｍａｇａｌｈａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ ＆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｃｉｅｔｅ ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ ｄｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅｓ １０，３８８－４０４（２００７）．
３１．Ｓ．Ｓａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９，１３２７－１３３５（２０１２）．
３２．Ｈ．Ｗｅｓｔ，Ｗ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｍ．Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｂｙ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２，１８５５－１８６２（２００５）．
３３．Ｃ．Ｔａｏ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｙｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ ２４３，１５０１－１５１０（２０１４）．
３４．Ｌ．Ｊ．Ｄｕａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｐａｎ，Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．Ｆｏｎｇ，Ｒｅｔｉｎａｌ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｔｉｎａｓ ｂｙ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７，１７６０８（２０１７）．
３５．Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ．Ｗｉｎｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８９，６９８－７０２（１９９２）．
３６．Ｈ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．Ｋｕｎｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｎａｋａｊｉｍａ，ＩＬ－６－ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊａｋ－Ｓｔａｔ ２，ｅ２５７６３（２０１３）．
３７．Ｍ．Ｓａｐｏｃｈｎｉｋ，Ｍ．Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｅ．Ａｒｚｔ，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ－６ ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５８，Ｒ２４１－Ｒ２５３（２０１７）．
３８．Ｒ．Ｓａｌａｍａ，Ｍ．Ｓａｄａｉｅ，Ｍ．Ｈｏａｒｅ，Ｍ．Ｎａｒｉｔａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２８，９９－１１４（２０１４）．
３９．Ｂ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６，１８１１－１８１９（２００７）．
４０．Ｐ．Ａ．Ｋｒｅｕｚａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ３ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １３，３０３－３０９（２０１１）．
４１．Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ Ｕ－９３７ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ，ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ１．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１，２４９０１－２４９０６（１９９６）．
４２．Ｍ．Ｖａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９，１８３５－１８４２（１９９９）．
４３．Ｔ．Ｐａｎｎｉｃｋｅ，Ｌ．Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ，Ａ．Ｇｒｏｓｃｈｅ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ６７０，６９－７４（２０１８）．
４４．Ｄ．Ｍ．Ｓｈｅｒｒｙ，Ｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｈ．Ｌｉ，Ｄ．Ｒ．Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｄ．Ａｓｈ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ８２，３１６－３３２（２００５）．
４５．Ｌ．Ｂｏｚｏｙａｎ，Ｊ．Ｋｈｌｇｈａｔｙａｎ，Ａ．Ｓａｇｈａｔｅｌｙａｎ，Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｂｒａｉｎ ｖｉａ ＶＥＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３２，１６８７－１７０４（２０１２）．
４６．Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １０，１３３－１４０（２００７）．
４７．Ｔ．Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｗｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ｈａｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，１０２４－１０２８（１９９５）．
４８．Ｊ．Ｓ．Ｐｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７，３３１－３７１（２００８）．
４９．Ｓ．Ｐｅｎｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｐ５５α ａｎｄ ｐ５０α ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２８１，４５５７－４５６７（２０１４）．
５０．Ａ．Ｋａａｓｉｋ，Ｔ．Ｒｉｋｋ，Ａ．Ｐｉｉｒｓｏｏ，Ｔ．Ｚｈａｒｋｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｚｈａｒｋｏｖｓｋｙ，Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ．Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２，１０２３－１０３１（２００５）．
５１．Ｊ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ａｏｒｔｉｃ ａｎｅｕｒｙｓｍ，ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １８４，３０２－３１１（２００６）．
５２．Ｗ．Ｌｉ，Ｌ．Ｋｏｒｎｍａｒｋ，Ｌ．Ｊｏｎａｓｓｏｎ，Ｃ．Ｆｏｒｓｓｅｌｌ，Ｘ．Ｍ．Ｙｕａｎ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２０２，９２－１０２（２００９）．
５３．Ｎ．Ａ．Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．Ｌｏｗｅ，Ｌ．Ｌｕ，Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｏｔｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｇｒｏｗｔｈ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９，３０１－３０５（１９９３）．
５４．Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｘ．Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｉｒｅｃｔ Ｓｔａｔ３ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３，３７９１－３７９８（２００８）．
５５．Ｍ．Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｍ．Ｌｅａｒｎｅｄ，Ｈ．Ｔｉａｎ，Ｌ．Ｌｉｎｇ，Ｎｏｎ－ｃｅｌｌ－ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－６／ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｓ ＦＧＦ１９－ｄｒｉｖｅｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，１５４３３（２０１７）．
５６．Ｒ．Ｌ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＳＴＡＴ３－Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９，７２（２０１９）．
５７．Ｃ．Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＪｕｎＢ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩＬ－６／ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｕｖｅａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｖｉａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｓ ３８（２０１８）．
５８．Ｂ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＩＭ－１ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｎｋｓ ＩＬ－６ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ １３，８７９－８８９（２０１４）．
５９．Ｊ．ＬｅＣｏｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＶＥＧＦＲ－１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，８９０－８９３（２００３）．
６０．Ｈ．Ｇ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｇ．Ｙ．Ｋｏｈ，Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：Ｆｒｏｍ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７（２０１７）．
６１．Ｄ．Ｊ．Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｏｒｇａｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ２６，２０４－２１９（２０１３）．
６２．Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｅ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ５，ｅａａｕ６７３２（２０１９）．
６３．Ｌ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ ＶＥＧＦ－Ａ：Ａ Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４９，５２２－５２７（２００８）．
６４．Ｈ．Ｘｉｎ，Ｃ．Ｚｈｏｎｇ，Ｅ．Ｎｕｄｌｅｍａｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＥＧＦ－Ａｘ．Ｃｅｌｌ １６７，２７５－２８４ ｅ２７６（２０１６）．
６５．Ｌ．Ｓｃｈｅｐｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦＲ２／Ｓｒｃ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，２３３７－２３４６（２００８）．
６６．Ｊ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｒｅｔｉｎａ，ｃｈｏｒｏｉｄ，ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｃｈｏｒｏｉｄ ｉｎ ｒａｔｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｂｙ １３００ｎｍ ｓｗｅｐｔ－ｓｏｕｒｃｅ ＯＣＴ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ １２１，３７－４５（２０１９）．
６７．Ｙｕｅ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｈｕ，Ｗ．（２０１５）．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ＆ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ２．
参考文献
１．Ａ．Ｓ．Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２７，５６３－５８４（２０１１）．
２．Ｍ．Ｐｏｔｅｎｔｅ，Ｈ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １４６，８７３－８８７（２０１１）．
３．Ｇ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７，２４２－２４８（２０００）．
４．Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ａ．Ｐ．Ａｄａｍｉｓ，Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １５，３８５－４０３（２０１６）．
５．Ｒ．Ｓ．Ａｐｔｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，ＶＥＧＦ ｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂｅｙｏｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ １７６，１２４８－１２６４（２０１９）．
６．Ｊ．Ｍ．Ｉｓｎｅｒ，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ８２，６３Ｓ－６４Ｓ（１９９８）．
７．Ｍ．Ｓｉｍｏｎｓ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｗｈｅｒｅ ｄｏ ｗｅ ｓｔａｎｄ ｎｏｗ？ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１，１５５６－１５６６（２００５）．
８．Ｓ．Ｄａｓ，Ｐ．Ａ．Ｍａｒｓｄｅｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６９，１５６１－１５６３（２０１３）．
９．Ｃ．Ｄｅｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥｐｈｒｉｎＢ２ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＺＥＢ２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，１２３２９（２０１６）．
１０．Ｒ．Ｆｅｒｌａ，Ｍ．Ｂｏｎｏｍｉ，Ｌ．Ｏｔｖｏｓ，Ｊｒ．，Ｅ．Ｓｕｒｍａｃｚ，Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｅｐｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＶＥＧＦ ｅｆｆｅｃｔｓ．ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ １１，３０３（２０１１）．
１１．Ａ．Ｈｏｌｍ，Ｔ．Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｕｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２８，３０２－３１６（２０１８）．
１２．Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ，Ｊ．Ｊ．Ｂａｂｏｎ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２６，５３３－５４４（２０１５）．
１３．Ｇ．Ｘ．Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７５，２４６－２５５（２０１６）．
１４．Ｊ．Ａｓｈ，Ｄ．Ｓ．ＭｃＬｅｏｄ，Ｇ．Ａ．Ｌｕｔｔｙ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ｂｌｏｃｋｓ ｎｏｒｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｙｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ １１，２９８－３０８（２００５）．
１５．Ｍ．Ｓ．Ｐｅｐｐｅｒ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｌ．Ｏｒｃｉ，Ｒ．Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０８（Ｐｔ １），７３－８３（１９９５）．
１６．Ｙ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｍ．Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，Ｋ．Ｋｉｓｈｉ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔ．Ｓｕｄａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＶＥＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，２３９３－２４０３（２００８）．
１７．Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ １－ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３－ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３ ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２２，１６７３－１６８１（２００８）．
１８．Ｓ．Ｊ．Ｒｏｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｋ１ ｇｅｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ ａｎｄ ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｋｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ ９３，３７３－３８３（１９９８）．
１９．Ｓ．Ｇ．Ｒａｎｅ，Ｅ．Ｐ．Ｒｅｄｄｙ，Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅｓ：ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，５６６２－５６７９（２０００）．
２０．Ｈ．Ｋｉｕ，Ｓ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３０，８８－１０６（２０１２）．
２１．Ｈ．Ｙｕ，Ｄ．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｒ．Ｊｏｖｅ，ＳＴＡＴｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａ ｌｅａｄｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＳＴＡＴ３．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ ９，７９８－８０９（２００９）．
２２．Ｊ．Ｒ．ＭｃＣｏｌｍ，Ｐ．Ｇｅｉｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ） ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｎｏｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ８３，４３８－４４６（２００６）．
２３．Ｚ．Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｏｒｏｉｄ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ａｓｓａｙ：ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８，ｅ６９５５２（２０１３）．
２４．Ｍ．Ａｔａｎａｓｏｖａ，Ａ．Ｗｈｉｔｔｙ，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４７，５０２－５３０（２０１２）．
２５．Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ－１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｇｐ１３０ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０，１０９１５－１０９２２（１９９５）．
２６．Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ １，ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９２，１１４２－１１４６（１９９５）．
２７．Ｄ．Ｐ．Ｇｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｇ．Ｂｒｕｃｅ，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ４，６１－６５（１９９２）．
２８．Ｊ．Ｈａｎｕｓ，Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｓａｒｒａｆ，Ｊ．Ｍａ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄａｔｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ ２，１６０５４（２０１６）．
２９．Ａ．Ｍｉｚｏｔａ，Ｅ．Ａｄａｃｈｉ－Ｕｓａｍｉ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎａ ａｆｔｅｒ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄａｔｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ３７，１８５９－１８６５（１９９７）．
３０．Ｐ．Ｏ．Ｍａｇａｌｈａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ ＆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｃｉｅｔｅ ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ ｄｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅｓ １０，３８８－４０４（２００７）．
３１．Ｓ．Ｓａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９，１３２７－１３３５（２０１２）．
３２．Ｈ．Ｗｅｓｔ，Ｗ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｍ．Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｂｙ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２，１８５５－１８６２（２００５）．
３３．Ｃ．Ｔａｏ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｙｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ ２４３，１５０１－１５１０（２０１４）．
３４．Ｌ．Ｊ．Ｄｕａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｐａｎ，Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．Ｆｏｎｇ，Ｒｅｔｉｎａｌ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｔｉｎａｓ ｂｙ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７，１７６０８（２０１７）．
３５．Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ．Ｗｉｎｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８９，６９８－７０２（１９９２）．
３６．Ｈ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．Ｋｕｎｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｎａｋａｊｉｍａ，ＩＬ－６－ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊａｋ－Ｓｔａｔ ２，ｅ２５７６３（２０１３）．
３７．Ｍ．Ｓａｐｏｃｈｎｉｋ，Ｍ．Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｅ．Ａｒｚｔ，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ－６ ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５８，Ｒ２４１－Ｒ２５３（２０１７）．
３８．Ｒ．Ｓａｌａｍａ，Ｍ．Ｓａｄａｉｅ，Ｍ．Ｈｏａｒｅ，Ｍ．Ｎａｒｉｔａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２８，９９－１１４（２０１４）．
３９．Ｂ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６，１８１１－１８１９（２００７）．
４０．Ｐ．Ａ．Ｋｒｅｕｚａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ３ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １３，３０３－３０９（２０１１）．
４１．Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ Ｕ－９３７ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ，ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ１．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１，２４９０１－２４９０６（１９９６）．
４２．Ｍ．Ｖａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９，１８３５－１８４２（１９９９）．
４３．Ｔ．Ｐａｎｎｉｃｋｅ，Ｌ．Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ，Ａ．Ｇｒｏｓｃｈｅ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ６７０，６９－７４（２０１８）．
４４．Ｄ．Ｍ．Ｓｈｅｒｒｙ，Ｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｈ．Ｌｉ，Ｄ．Ｒ．Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｄ．Ａｓｈ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ８２，３１６－３３２（２００５）．
４５．Ｌ．Ｂｏｚｏｙａｎ，Ｊ．Ｋｈｌｇｈａｔｙａｎ，Ａ．Ｓａｇｈａｔｅｌｙａｎ，Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｂｒａｉｎ ｖｉａ ＶＥＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３２，１６８７－１７０４（２０１２）．
４６．Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １０，１３３－１４０（２００７）．
４７．Ｔ．Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｗｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ｈａｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，１０２４－１０２８（１９９５）．
４８．Ｊ．Ｓ．Ｐｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７，３３１－３７１（２００８）．
４９．Ｓ．Ｐｅｎｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｐ５５α ａｎｄ ｐ５０α ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２８１，４５５７－４５６７（２０１４）．
５０．Ａ．Ｋａａｓｉｋ，Ｔ．Ｒｉｋｋ，Ａ．Ｐｉｉｒｓｏｏ，Ｔ．Ｚｈａｒｋｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｚｈａｒｋｏｖｓｋｙ，Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ．Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２，１０２３－１０３１（２００５）．
５１．Ｊ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ａｏｒｔｉｃ ａｎｅｕｒｙｓｍ，ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １８４，３０２－３１１（２００６）．
５２．Ｗ．Ｌｉ，Ｌ．Ｋｏｒｎｍａｒｋ，Ｌ．Ｊｏｎａｓｓｏｎ，Ｃ．Ｆｏｒｓｓｅｌｌ，Ｘ．Ｍ．Ｙｕａｎ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２０２，９２－１０２（２００９）．
５３．Ｎ．Ａ．Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．Ｌｏｗｅ，Ｌ．Ｌｕ，Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｏｔｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｇｒｏｗｔｈ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９，３０１－３０５（１９９３）．
５４．Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｘ．Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｉｒｅｃｔ Ｓｔａｔ３ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３，３７９１－３７９８（２００８）．
５５．Ｍ．Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｍ．Ｌｅａｒｎｅｄ，Ｈ．Ｔｉａｎ，Ｌ．Ｌｉｎｇ，Ｎｏｎ－ｃｅｌｌ－ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－６／ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｓ ＦＧＦ１９－ｄｒｉｖｅｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，１５４３３（２０１７）．
５６．Ｒ．Ｌ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＳＴＡＴ３－Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９，７２（２０１９）．
５７．Ｃ．Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＪｕｎＢ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩＬ－６／ＳＴＡＴ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｕｖｅａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｖｉａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｓ ３８（２０１８）．
５８．Ｂ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＩＭ－１ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｎｋｓ ＩＬ－６ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ １３，８７９－８８９（２０１４）．
５９．Ｊ．ＬｅＣｏｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＶＥＧＦＲ－１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，８９０－８９３（２００３）．
６０．Ｈ．Ｇ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｇ．Ｙ．Ｋｏｈ，Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：Ｆｒｏｍ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７（２０１７）．
６１．Ｄ．Ｊ．Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｏｒｇａｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ２６，２０４－２１９（２０１３）．
６２．Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｅ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ５，ｅａａｕ６７３２（２０１９）．
６３．Ｌ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ ＶＥＧＦ－Ａ：Ａ Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４９，５２２－５２７（２００８）．
６４．Ｈ．Ｘｉｎ，Ｃ．Ｚｈｏｎｇ，Ｅ．Ｎｕｄｌｅｍａｎ，Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＥＧＦ－Ａｘ．Ｃｅｌｌ １６７，２７５－２８４ ｅ２７６（２０１６）．
６５．Ｌ．Ｓｃｈｅｐｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦＲ２／Ｓｒｃ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，２３３７－２３４６（２００８）．
６６．Ｊ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｒｅｔｉｎａ，ｃｈｏｒｏｉｄ，ａｎｄ ｏｕｔｅｒ ｃｈｏｒｏｉｄ ｉｎ ｒａｔｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｂｙ １３００ｎｍ ｓｗｅｐｔ－ｓｏｕｒｃｅ ＯＣＴ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ １２１，３７－４５（２０１９）．
６７．Ｙｕｅ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｈｕ，Ｗ．（２０１５）．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ＆ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ２．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【国際調査報告】