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特表2022-517378炎症性疾患および疼痛を治療するためのペプチドおよびそれを含有する薬剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-08
(54)【発明の名称】炎症性疾患および疼痛を治療するためのペプチドおよびそれを含有する薬剤
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20220301BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220301BHJP
A61K 38/03 20060101ALI20220301BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220301BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220301BHJP
A61P 29/02 20060101ALI20220301BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20220301BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C12N15/11 Z
A61K38/03
A61P29/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P29/02
A61P25/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021541078
(86)(22)【出願日】2019-10-18
(85)【翻訳文提出日】2021-07-14
(86)【国際出願番号】 CN2019111788
(87)【国際公開番号】W WO2021072724
(87)【国際公開日】2021-04-22
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521311643
【氏名又は名称】沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100082418
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 朔生
(74)【代理人】
【識別番号】100167601
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 信之
(74)【代理人】
【識別番号】100201329
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 真二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100220917
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 忠大
(72)【発明者】
【氏名】林 成龍
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA02
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA081
4C084ZA961
4C084ZB111
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA16
4H045EA20
4H045FA33
4H045GA05
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、炎症性疾患を治療するためのペプチドおよびそのための薬剤の製造におけるその使用に関し、そのペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、その薬剤は有効量のペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。また、疼痛を治療するための薬剤の製造のためのペプチドの使用も提供され、その薬剤は、有効量のペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。本発明により、そのペプチドの投与が炎症指標を効果的に軽減し、抗侵害受容作用を示すことが確認される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項2】
有効量の請求項１に記載のペプチドおよび薬学上許容される担体を含むことを特徴とする、炎症性疾患を治療するための薬剤の製造のための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項3】
前記炎症性疾患は強直性脊椎炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、関節リウマチ、外傷性関節炎、化膿性関節炎、通風性関節炎、結核性関節炎、神経障害性関節炎、および血友病性関節炎を含むことを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
有効量の請求項１に記載のペプチドおよび薬学上許容される担体を含むことを特徴とする、疼痛を治療するための薬剤の製造のための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項5】
前記疼痛は神経障害性疼痛、炎症性疼痛、筋骨格疼痛、術後疼痛、癌性疼痛、急性疼痛、および慢性疼痛を含むことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記炎症性疼痛は、強直性脊椎炎疼痛、変形性関節症疼痛、リウマチ性関節炎疼痛、関節リウマチ疼痛、外傷性関節炎疼痛、化膿性関節炎疼痛、通風性関節炎疼痛、結核性関節炎疼痛、神経障害性関節炎疼痛、および血友病性関節炎疼痛を含むことを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記薬剤は腸溶剤形または非経口剤形であることを特徴とする、請求項２～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項8】
前記有効量は０．０００８μｇ／ｋｇ～８１５μｇ／ｋｇの範囲であることを特徴とする、請求項２または４に記載の使用。
【請求項9】
前記腸溶剤形は経口剤形であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項10】
前記非経口剤形は注射用剤形であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．発明の分野
本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチド、および炎症性疾患を治療するための薬剤の製造におけるその使用に関する。
本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチド、および炎症性疾患を治療するための薬剤の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
２．従来技術の説明
発赤、腫脹、発熱および疼痛を含む炎症応答は、傷害または病原体感染などの刺激に対する身体組織の一連の生理反応を指す。炎症応答は、生物が外因性病原体に反応する反応の１つであり、生物に有益な免疫応答の１つである。しかしながら、長期間持続する炎症、すなわち、慢性炎症は、花粉症、歯周炎、関節リウマチなどのいくつかの炎症性疾患を引き起こし得る。サイトカインは、炎症に対して調節作用を及ぼす。いくつかのサイトカインは、炎症応答に役割を果たす。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は多機能性サイトカインであり、炎症応答中にマクロファージまたは単球の増殖を促進し、下流炎症応答においてサイトカインの発現を活性化する。従って、それは炎症誘発性サイトカインである。全てのサイトカインの中で、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、炎症に取り組むための指標として慣用されている。さらに、インターロイキン－６もまた炎症誘発物質として働き、多くの単球およびマクロファージを患部に導き、炎症応答を引き起こす。
発赤、腫脹、発熱および疼痛を含む炎症応答は、傷害または病原体感染などの刺激に対する身体組織の一連の生理反応を指す。炎症応答は、生物が外因性病原体に反応する反応の１つであり、生物に有益な免疫応答の１つである。しかしながら、長期間持続する炎症、すなわち、慢性炎症は、花粉症、歯周炎、関節リウマチなどのいくつかの炎症性疾患を引き起こし得る。サイトカインは、炎症に対して調節作用を及ぼす。いくつかのサイトカインは、炎症応答に役割を果たす。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は多機能性サイトカインであり、炎症応答中にマクロファージまたは単球の増殖を促進し、下流炎症応答においてサイトカインの発現を活性化する。従って、それは炎症誘発性サイトカインである。全てのサイトカインの中で、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、炎症に取り組むための指標として慣用されている。さらに、インターロイキン－６もまた炎症誘発物質として働き、多くの単球およびマクロファージを患部に導き、炎症応答を引き起こす。
【0003】
国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）は、疼痛を、実際のまたは潜在的な組織損傷に関連する不快な感覚および感情体験と定義している。疼痛は、神経系の不快な感覚である。一般的な疼痛のタイプとしては、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、交感神経性疼痛、心因性疼痛などが含まれる。加えて、疼痛はまた、身体の部位、急性または慢性などの時間、病因、および生理学的特徴によっても区別できる。全ての疼痛の中で、急性疼痛の持続はより短く、通常、組織損傷の警報シグナルである。従って、このタイプの疼痛は組織回復の後に消失する。慢性疼痛の持続はより長く、通常、組織損傷のシグナルではなく、疾患のシグナルである。慢性疼痛を有する患者は、おそらく抑鬱、自閉、または過敏となってより高い社会コストを要する。よって、疼痛の管理は常に大きな医療問題となっている。
【発明の概要】
【0004】
新規な抗炎症性鎮痛剤を開発する差し迫った必要があるという事実に鑑みて、本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチドを提供する。さらに、本発明は、炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのペプチドの使用を提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含み、その薬剤は有効量の前記ペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。加えて、このペプチドは、疼痛を治療するために使用できる。よって、本発明はまた、炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのペプチドの使用も提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含み、その薬剤は有効量の前記ペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。
【0005】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む。
【0006】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0007】
本発明はさらに、疼痛を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む。
【0008】
本発明はさらに、疼痛を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0009】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することを含み、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む方法を提供する。
【0010】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することからなり、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる方法を提供する。
【0011】
本発明はさらに、疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することを含み、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む方法を提供する。
【0012】
本発明はさらに、疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することからなり、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる方法を提供する。
【0013】
好ましくは、この変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この変異体のアミノ酸配列は、配列番号１のペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９０％を超える配列同一性を有し、炎症性疾患または疼痛を治療する効果を有する。いくつかの実施形態では、このペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換は、Ｃ末端および／またはＮ末端に作出される。
【0014】
好ましくは、この変異体は、配列番号１と比較して１～３個の保存的アミノ酸置換、より好ましくは、１～２個の保存的アミノ酸置換、いっそうより好ましくは、１個の保存的アミノ酸置換を有し、かつ、炎症性疾患または疼痛の治療の効果を有するアミノ酸配列を指す保存的変異体である。
【0015】
「保存的アミノ酸置換」は、元のアミノ酸配列と同じまたは類似の特性を有するアミノ酸での置換を指す。天然アミノ酸は、それらの側鎖の特性に基づいて以下のカテゴリーに分類できる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）
（２）中性親水性：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）
（５）鎖の特性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）
（６）芳香族：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）
（２）中性親水性：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）
（５）鎖の特性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）
（６）芳香族：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）
【0016】
よって、保存的アミノ酸置換は、これらのカテゴリーの１つのアミノ酸が同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換されることを意味する。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基での置換を含み得る。好ましくは、このペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体からなる。より好ましくは、このペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。好ましくは、本発明によれば、「薬学上許容される担体」としては、限定されるものではないが、溶媒、乳化剤、沈殿防止剤、崩壊剤、結合剤、賦形剤、分解防止剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、滑沢剤、界面活性剤およびその他の類似の担体または本発明に好適な担体が含まれる。
【0017】
好ましくは、前述の炎症性疾患としては、強直性脊椎炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、関節リウマチ、外傷性関節炎、化膿性関節炎、通風性関節炎、結核性関節炎、神経障害性関節炎、および血友病性関節炎が含まれる。
【0018】
好ましくは、前述の疼痛としては、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、筋骨格疼痛、術後疼痛、癌性疼痛、急性疼痛、および慢性疼痛が含まれる。
【0019】
好ましくは、前述の炎症性疼痛としては、強直性脊椎炎疼痛、変形性関節症疼痛、リウマチ性関節炎疼痛、関節リウマチ疼痛、外傷性関節炎疼痛、化膿性関節炎疼痛、通風性関節炎疼痛、結核性関節炎疼痛、神経障害性関節炎疼痛、および血友病性関節炎疼痛が含まれる。
【0020】
前述の薬剤は、腸溶剤形または非経口剤形であり得る。腸溶剤形としては、限定されるものではないが、経口剤形および浣腸の、腸溶コーティング錠剤、多層錠、糖衣錠、舌下錠、チュアブル錠、トローチ、カプセル剤、散剤、シロップ、溶液、エマルション、懸濁液、粘着剤、マグマ剤、液体抽出物、抽出液、酒精剤、エリキシル剤、およびチンキなどが含まれる。非経口剤形としては、限定されるものではないが、注射用剤形、軟膏、ローション、リニメント、およびエアロゾルが含まれる。
【0021】
好ましくは、有効量は、０．０００８μｇ／ｋｇ～８１５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0022】
好ましくは、本願のペプチドは、月１回～１日１回の頻度で投与される。より好ましくは、本願のペプチドは、月２回～週２回の頻度で投与される。より好ましくは、本願のペプチドは、週１回の頻度で投与される。
【0023】
より好ましくは、本願のペプチドは、前述の有効量で週１回投与される。
【0024】
本発明によれば、有効量は、本明細書の実施形態において、米国食品医薬品局により発行されている指針文書“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ”に従って、０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の配列番号１のペプチド濃度に基づいて計算される。体重（ｂ．ｗ．）６０ｋｇの成人では、用量は基準：１２．３×１日当たり体重ｋｇ当たりヒト推奨用量＝１×マウス用量によって換算できる。
【0025】
より好ましくは、有効量は、０．００８μｇ／ｋｇ～４１０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0026】
より好ましくは、有効量は、０．００８μｇ／ｋｇ～０．２５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0027】
より好ましくは、有効量は、０．０２５μｇ／ｋｇ～０．２５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0028】
より好ましくは、有効量は、８０μｇ／ｋｇ～４１０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0029】
より好ましくは、有効量は、８０μｇ／ｋｇ～２５０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0030】
好ましくは、腸溶剤形は、経口剤形である。
【0031】
好ましくは、非経口剤形は、注射用剤形である。
【0032】
本発明によれば、「治療」とは、治療の効果を達成するための本発明のペプチドを患者に投与することを指し、その治療の効果は、疾患または関連の症状の治癒の治癒、緩和、改善または軽減を指す。本発明によれば、炎症性疾患の治療は、炎症関連症状の改善を指し、いくつかの実施形態では、これは炎症指標の軽減によって評価される。本発明によれば、疼痛の治療は、疼痛関連症状の改善を指し、いくつかの実施形態では、これは疼痛知覚の閾値の上昇により、またはいくつかの実施形態では、足逃避閾値（ＰＷＴ）の上昇より評価される。
【0033】
本発明によれば、用語「有効量」は、所望の生体反応のための用量、すなわち、所望の治療効果のための用量を指す。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウス（試験群）におけるＴＮＦ－αの血清濃度を対照群と比較して示す。
【図2】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウス（試験群）におけるＩＬ－６の血清濃度を対照群と比較して示す。
【図3】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウス（試験群）の同側後足のＰＷＴの経時的変化をモルヒネ群（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して示す。
【図4】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウス（試験群）の反対側の足のＰＷＴの経時的変化をモルヒネ群（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して示す。
【図5】１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウスの同側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図6】１ｍｇ／ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウスの反対側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図7】それぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウスの同側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図8】それぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウスの反対側の足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図9】酢酸誘発ライジング試験における配列番号１のペプチドの抗侵害受容作用およびテールフリック試験における配列番号１のペプチドの最大効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明の所定の発明目的を達成するために採用した技術的手段を添付図面により、本発明の準備例および実施例に従ってさらに説明する。
【0036】
準備例１
本発明において使用されるＧｌｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｐのペプチドを合成するために標準的なＦｍｏｃ法およびマイクロ波ペプチド合成装置を適用した。ここで、Ｇｌｐはピログルタミン酸（Ｃａｓ Ｎｕｍｂｅｒ ９８－７９－３）である。一般に、Ｄ残基を予め添加したＷａｎｇ樹脂（装填量０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器に秤量し、合成前に新鮮なＤＭＦ（１０～１５ｍＬ）を加え、膨潤準備をした。膨潤時間はマイクロ波ペプチド合成装置で３分に設定した。
本発明において使用されるＧｌｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｐのペプチドを合成するために標準的なＦｍｏｃ法およびマイクロ波ペプチド合成装置を適用した。ここで、Ｇｌｐはピログルタミン酸（Ｃａｓ Ｎｕｍｂｅｒ ９８－７９－３）である。一般に、Ｄ残基を予め添加したＷａｎｇ樹脂（装填量０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器に秤量し、合成前に新鮮なＤＭＦ（１０～１５ｍＬ）を加え、膨潤準備をした。膨潤時間はマイクロ波ペプチド合成装置で３分に設定した。
【0037】
Ｎ末端アミン基を遊離状態にするために、ＤＭＦ中２０％ピペリジン５ｍＬを用いて最初とその次のＦｍｏｃ基を除去し、標準的な脱保護法（第１段階：温度７５℃、電圧１５５Ｗ、および温度保持時間１５秒 第２段階：温度９０℃、電圧３０Ｗ、および温度保持時間５０秒）によって「ＤＥＰ」工程の溶液として利用した。
【0038】
次に、Ｃ末端（「ＡＣＴ」工程として機能）、および所望のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－ＡＡ（保護側鎖）－ＯＨとして機能）を活性化するためにＤＭＦ中０．５ＭのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を５倍過剰量（ＤＭＦ中０．２Ｍの濃度）で加え、カップリング反応（工程ＡＡ）のためにＤＭＦ中１．０Ｍのオキシマを用いた。標準的なカップリング反応を行った（第１段階：温度７５℃、電圧１７０Ｗ、および温度保持時間１５秒 第２段階：温度９０℃、電圧３０Ｗ、および温度保持時間２３０秒）。約４分間ＡＡを行った後、Ｗａｎｇ樹脂をＤＭＦ溶液で洗浄した。ＤＥＰ－ＡＣＴ－ＡＡの工程を繰り返して、Ｃ末端からＮ末端へペプチドを構築した。
【0039】
最後に、このペプチドを、氷浴中、９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ２Ｏ／２．５％ＴＩＰＳで処理した後、それを２時間放置して室温とすることによって固相支持体から取り出す。濾過後に濾液を回収し、アイスエーテルを加えて沈澱させ、遠心分離して上清を除去した。その後、エーテルを加えてこの沈澱を洗浄した。前述の工程を３～６回繰り返した。最終的な沈澱を採取し、凍結乾燥させて白色の綿毛様生成物、すなわち、最終生成物を得た。この最終生成物の純度を高速液体クロマトグラフィーにより決定し、分子量および配列をＬＣ－ＭＳ／Ｍにより分析した。
【0040】
準備例２
ＩＣＲマウス（８～１２週齢、体重２０～２５ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎから）において次のように関節炎を誘導した。各マウスの右足関節に１ｍｇ／ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を５μＬの量で週１回継続的に注射した。最後の注射時を０週とする。４回の注射の後、ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスの片側の前部足関節に長期炎症および足の腫脹が少なくとも１２週間誘導され、両側の機械痛覚過敏もまた少なくとも１２週間、継続的に誘導され、従って、臨床的に長期慢性疼痛を患う関節リウマチモデルとして機能した。
ＩＣＲマウス（８～１２週齢、体重２０～２５ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎから）において次のように関節炎を誘導した。各マウスの右足関節に１ｍｇ／ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を５μＬの量で週１回継続的に注射した。最後の注射時を０週とする。４回の注射の後、ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスの片側の前部足関節に長期炎症および足の腫脹が少なくとも１２週間誘導され、両側の機械痛覚過敏もまた少なくとも１２週間、継続的に誘導され、従って、臨床的に長期慢性疼痛を患う関節リウマチモデルとして機能した。
【0041】
準備例３
侵害受容性疼痛試験および酸誘発慢性広範囲疼痛試験を行うために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雄マウス（２０～２５ｇ）を温度制御環境（２４±０．５℃）下、１２時間明暗周期（０８：００～２０：００に照明）で飼育し、標準的な実験室餌および水道水を自由に摂らせた。動物を試験的操作の前に２０～３０分馴化させた。動物飼育および取り扱い手順は疼痛研究で使用される動物に関する国際疼痛学会指針に準拠し、これらの手順は動物実験倫理委員会によって承認された。
侵害受容性疼痛試験および酸誘発慢性広範囲疼痛試験を行うために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雄マウス（２０～２５ｇ）を温度制御環境（２４±０．５℃）下、１２時間明暗周期（０８：００～２０：００に照明）で飼育し、標準的な実験室餌および水道水を自由に摂らせた。動物を試験的操作の前に２０～３０分馴化させた。動物飼育および取り扱い手順は疼痛研究で使用される動物に関する国際疼痛学会指針に準拠し、これらの手順は動物実験倫理委員会によって承認された。
【0042】
試験１
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、６個体のマウスを含む試験群とした。他方、水を投与したマウスを対照群とし、これも６個体のマウスを含んでいた。試験群および対照群のマウスを投与後１２週目に犠牲にした。心臓穿刺により血清採取を行う。マウスＴＮＦ－α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＴＡ００Ｂ）、マウスＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍ６００Ｂ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、試験群および対照群におけるマウスのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の血清濃度を決定および収集した。この結果から、配列番号１のペプチドの長期経口投与を受けた試験群のマウスのＴＮＦ－αの血清濃度は検出可能域外のレベルに低下していた、すなわち、検出されなかった（ＮＤ）ことが見て取れた（図１）。また、試験群のＩＬ－６の血清濃度も、対照群に比べて低下していた（図２）。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、全身炎症指標を実際に引き下げることができ、このことは、本発明の配列番号１のペプチドが炎症性疾患、特に、関節リウマチから生じる慢性全身炎症を実際に治療できることを証明する。
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、６個体のマウスを含む試験群とした。他方、水を投与したマウスを対照群とし、これも６個体のマウスを含んでいた。試験群および対照群のマウスを投与後１２週目に犠牲にした。心臓穿刺により血清採取を行う。マウスＴＮＦ－α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＴＡ００Ｂ）、マウスＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍ６００Ｂ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、試験群および対照群におけるマウスのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の血清濃度を決定および収集した。この結果から、配列番号１のペプチドの長期経口投与を受けた試験群のマウスのＴＮＦ－αの血清濃度は検出可能域外のレベルに低下していた、すなわち、検出されなかった（ＮＤ）ことが見て取れた（図１）。また、試験群のＩＬ－６の血清濃度も、対照群に比べて低下していた（図２）。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、全身炎症指標を実際に引き下げることができ、このことは、本発明の配列番号１のペプチドが炎症性疾患、特に、関節リウマチから生じる慢性全身炎症を実際に治療できることを証明する。
【0043】
試験２
準備例２からのマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのオピオイド鎮痛薬としてのモルヒネを４週目に経口投与し、これらを陽性対照とした。他方、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを経口投与したマウスを試験群とした。モルヒネ陽性対照群および試験群は両方とも６個体のマウスを含んだ。マウスの足逃避閾値（ＰＷＴ）を、投与から０分、３０分、６０分、９０分、１２０分後にｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより決定した。
準備例２からのマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのオピオイド鎮痛薬としてのモルヒネを４週目に経口投与し、これらを陽性対照とした。他方、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを経口投与したマウスを試験群とした。モルヒネ陽性対照群および試験群は両方とも６個体のマウスを含んだ。マウスの足逃避閾値（ＰＷＴ）を、投与から０分、３０分、６０分、９０分、１２０分後にｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより決定した。
【0044】
試験の結果を図３および図４に示した。配列番号１の投与後、両群のマウスの同側後足および反対側の足のＰＷＴ値は、モルヒネ陽性対照群のように上昇傾向を示した。従って、これは、本願の配列番号１のペプチドが、モルヒネと同様の抗侵害受容作用を有したが、必要な量は少なかったことを証明する。また、試験群およびモルヒネ群において投与後９０分の時点で最大抗侵害受容作用が示されたことも見て取れた。９０分で、モルヒネ群では、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０８５±０．０１５ｇから０．６４±０．０８９ｇに上昇し（図３に示されるとおり）、マウスの反対側の足のＰＷＴ値は０．４３±０．０３３ｇから１．９６±０．４８８ｇに上昇し（図４に示されるとおり）、一方、試験群では、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０７ｇから０．９±０．１５６ｇに上昇し（図３に示されるとおり）、マウスの反対側の足のＰＷＴ値は０．５±０．０４７ｇから１．３５±０．１９３ｇに上昇した（図４に示されるとおり）。さらに、抗侵害受容作用は投与後１２０分で低下し始めた。
【0045】
試験３
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、これらを灰色の矢印で示した。準備例２のマウスに関するＣＦＡ注射の４回の時機を図５および図６に黒い矢印で示した。２つの投与群はともに６個体のマウスを含んだ。水を経口投与したマウスを対照群として用いた。対照群もまた６個体のマウスを含んだ。ＰＷＴ値は、投与後９０分の時点でｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、これらを灰色の矢印で示した。準備例２のマウスに関するＣＦＡ注射の４回の時機を図５および図６に黒い矢印で示した。２つの投与群はともに６個体のマウスを含んだ。水を経口投与したマウスを対照群として用いた。対照群もまた６個体のマウスを含んだ。ＰＷＴ値は、投与後９０分の時点でｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
【0046】
試験結果を図５および図６に示した。１ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、同側後足のＰＷＴ値は０．０９ｇから０．５～１ｇに上昇し（図５に示されるとおり）、反対側の足のＰＷＴ値は３週目の０．４ｇから０．６～１．２ｇに上昇した。３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後（図６に示されるとおり）、同側後足のＰＷＴ値は３週目の０．０９ｇから０．６３～１ｇに上昇し（図５に示されるとおり）、反対側の足のＰＷＴ値は０．４ｇから０．８７～１．２７ｇに上昇した（図６に示されるとおり）。よって、試験の結果は、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの抗侵害受容作用が長期投与の後に同等であったことを示した。
【0047】
試験４
準備例２から２４個体のマウスを供給した。マウスにそれぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した。全ての投与群は６個体のマウスを含んだ。他の６個体のマウスに水を経口投与し、これを対照群とした。投与後９０分の時点でＰＷＴ値をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
準備例２から２４個体のマウスを供給した。マウスにそれぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した。全ての投与群は６個体のマウスを含んだ。他の６個体のマウスに水を経口投与し、これを対照群とした。投与後９０分の時点でＰＷＴ値をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
【0048】
結果を図７および図８に示した。０．３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから１ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１ｇに上昇した。１μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから０．６ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１．４ｇに上昇した。３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから０．１６ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１ｇに上昇した。これらの試験結果は、０．３μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドが経口投与後に抗侵害受容作用を有したことを示した。
【0049】
試験５
酸誘発腹部収縮アッセイをＨ．Ｏ．Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｃ．Ｄｉｎｎｅｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｔｈｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２，２９５－３１０（１９６８）に従って行った。一般に、準備例３からのマウスを小さな観察室に入れ、２０分間馴化した。内臓痛の指標となる「ライジング」応答（腹部収縮）を誘導する１％酢酸３００μＬ）を注射する１０分前に、マウスに蒸留水（ビヒクル対照として）または種々の濃度（０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した。ビヒクル対照群および配列番号１のペプチドを投与した投与群はそれぞれ５～１２個体のマウスを含んだ。酸注射後３０分以内の腹部収縮の数を数え、各群のマウスの平均収縮数を計算した。酸誘発ライジングの抗侵害受容作用を抗侵害受容作用％として示した。
（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数－投与群のマウスの平均収縮数）／（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数）×１００％
酸誘発腹部収縮アッセイをＨ．Ｏ．Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｃ．Ｄｉｎｎｅｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｔｈｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２，２９５－３１０（１９６８）に従って行った。一般に、準備例３からのマウスを小さな観察室に入れ、２０分間馴化した。内臓痛の指標となる「ライジング」応答（腹部収縮）を誘導する１％酢酸３００μＬ）を注射する１０分前に、マウスに蒸留水（ビヒクル対照として）または種々の濃度（０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した。ビヒクル対照群および配列番号１のペプチドを投与した投与群はそれぞれ５～１２個体のマウスを含んだ。酸注射後３０分以内の腹部収縮の数を数え、各群のマウスの平均収縮数を計算した。酸誘発ライジングの抗侵害受容作用を抗侵害受容作用％として示した。
（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数－投与群のマウスの平均収縮数）／（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数）×１００％
【0050】
試験６
放射熱テールフリック試験をＦ．Ｅ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐａｉｎ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７２，７４－７９（１９４１）に従って改変した。準備例３の５～１２個体のマウスを入れ、テールフリック試験の前に３０分間、固定器に馴化した。較正および装置の維持のために熱流束赤外放射計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア、カタログ番号３７３００）を用いた。マウスの尾の先端から２ｃｍの部位に刺激を与え、マウスが熱源から尾を退けるまでにかかる時間をテールフリッキング潜時と定義した。組織損傷のリスクを制限するために、カットオフ時間を３０．１秒に設定した。熱強度は、ベースライン潜時が大部分の動物で約５～８秒となるように調整した。潜時は、種々の用量（０．０１μｇ／ｋｇ、０．０３μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した後、示された時間間隔（１０～９０分）で、１０分毎に記録した。次に、１０～９０分間の平均潜時を計算した。Ｌ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｋ．Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｓｏｍｅ Ｎａｒｃｏｔｉｃ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｏｍｏｒｐｈａｎ Ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １４３，１４１－１４８（１９６４）に従い、テールフリック試験の抗侵害受容作用を式：
％ＭＰＥ＝（投薬後潜時－投薬後潜時）／（カットオフ時間－投薬前潜時）×１００％
によって定義される「％ＭＰＥ」（最大効果）で示した。
放射熱テールフリック試験をＦ．Ｅ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐａｉｎ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７２，７４－７９（１９４１）に従って改変した。準備例３の５～１２個体のマウスを入れ、テールフリック試験の前に３０分間、固定器に馴化した。較正および装置の維持のために熱流束赤外放射計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア、カタログ番号３７３００）を用いた。マウスの尾の先端から２ｃｍの部位に刺激を与え、マウスが熱源から尾を退けるまでにかかる時間をテールフリッキング潜時と定義した。組織損傷のリスクを制限するために、カットオフ時間を３０．１秒に設定した。熱強度は、ベースライン潜時が大部分の動物で約５～８秒となるように調整した。潜時は、種々の用量（０．０１μｇ／ｋｇ、０．０３μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した後、示された時間間隔（１０～９０分）で、１０分毎に記録した。次に、１０～９０分間の平均潜時を計算した。Ｌ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｋ．Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｓｏｍｅ Ｎａｒｃｏｔｉｃ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｏｍｏｒｐｈａｎ Ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １４３，１４１－１４８（１９６４）に従い、テールフリック試験の抗侵害受容作用を式：
％ＭＰＥ＝（投薬後潜時－投薬後潜時）／（カットオフ時間－投薬前潜時）×１００％
によって定義される「％ＭＰＥ」（最大効果）で示した。
【0051】
試験５および試験６の結果を図９に示した。１μｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量の配列番号１のペプチドは、酸誘発ライジング試験において最良の抗侵害受容作用を示し、一方、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇは、放射熱テールフリック試験において最良の抗侵害受容作用を示した。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、高濃度および低濃度の両方で抗侵害受容作用を有する。
【0052】
結論として、本発明のペプチドは、炎症性疾患、特に、関節リウマチを治療する効果、および疼痛、特に、関節リウマチから生じる疼痛を治療する効果を有する。
【0053】
上記の実施形態は、いずれの態様においても本発明を限定することを意図しない本発明の好ましい実施形態にすぎない。好ましい実施形態を上記に開示するが、それらはいずれの態様においても本発明を限定することを意図しない。当業者は、本発明の技術的な解決の範囲から逸脱することなく、上記の開示を、等価な変形形態または等価な実施形態の改変としてその内容に軽微な改変を加えて利用できる。本発明の趣旨および原理の範囲内のいずれの改変、なされる等価の置換、改良なども、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項2】
有効量の請求項１に記載のペプチドおよび薬学上許容される担体を含むことを特徴とする、炎症性疾患を治療するための薬剤。
【請求項3】
前記炎症性疾患は強直性脊椎炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、関節リウマチ、外傷性関節炎、化膿性関節炎、通風性関節炎、結核性関節炎、神経障害性関節炎、および血友病性関節炎を含むことを特徴とする、請求項２に記載の薬剤。
【請求項4】
有効量の請求項１に記載のペプチドおよび薬学上許容される担体を含むことを特徴とする、疼痛を治療するための薬剤。
【請求項5】
前記疼痛は神経障害性疼痛、炎症性疼痛、筋骨格疼痛、術後疼痛、癌性疼痛、急性疼痛、および慢性疼痛を含むことを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項6】
前記炎症性疼痛は、強直性脊椎炎疼痛、変形性関節症疼痛、リウマチ性関節炎疼痛、関節リウマチ疼痛、外傷性関節炎疼痛、化膿性関節炎疼痛、通風性関節炎疼痛、結核性関節炎疼痛、神経障害性関節炎疼痛、および血友病性関節炎疼痛を含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬剤。
【請求項7】
前記薬剤は腸溶剤形または非経口剤形であることを特徴とする、請求項２～６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項8】
前記有効量は０．０００８μｇ／ｋｇ～８１５μｇ／ｋｇの範囲であることを特徴とする、請求項２～６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項9】
前記腸溶剤形は経口剤形であることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤。
【請求項10】
前記非経口剤形は注射用剤形であることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．発明の分野
本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチド、および炎症性疾患を治療するための薬剤の製造におけるその使用に関する。
本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチド、および炎症性疾患を治療するための薬剤の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
２．従来技術の説明
発赤、腫脹、発熱および疼痛を含む炎症応答は、傷害または病原体感染などの刺激に対する身体組織の一連の生理反応を指す。炎症応答は、生物が外因性病原体に反応する反応の１つであり、生物に有益な免疫応答の１つである。しかしながら、長期間持続する炎症、すなわち、慢性炎症は、花粉症、歯周炎、関節リウマチなどのいくつかの炎症性疾患を引き起こし得る。サイトカインは、炎症に対して調節作用を及ぼす。いくつかのサイトカインは、炎症応答に役割を果たす。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は多機能性サイトカインであり、炎症応答中にマクロファージまたは単球の増殖を促進し、下流炎症応答においてサイトカインの発現を活性化する。従って、それは炎症誘発性サイトカインである。全てのサイトカインの中で、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、炎症に取り組むための指標として慣用されている。さらに、インターロイキン－６もまた炎症誘発物質として働き、多くの単球およびマクロファージを患部に導き、炎症応答を引き起こす。
発赤、腫脹、発熱および疼痛を含む炎症応答は、傷害または病原体感染などの刺激に対する身体組織の一連の生理反応を指す。炎症応答は、生物が外因性病原体に反応する反応の１つであり、生物に有益な免疫応答の１つである。しかしながら、長期間持続する炎症、すなわち、慢性炎症は、花粉症、歯周炎、関節リウマチなどのいくつかの炎症性疾患を引き起こし得る。サイトカインは、炎症に対して調節作用を及ぼす。いくつかのサイトカインは、炎症応答に役割を果たす。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は多機能性サイトカインであり、炎症応答中にマクロファージまたは単球の増殖を促進し、下流炎症応答においてサイトカインの発現を活性化する。従って、それは炎症誘発性サイトカインである。全てのサイトカインの中で、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、炎症に取り組むための指標として慣用されている。さらに、インターロイキン－６もまた炎症誘発物質として働き、多くの単球およびマクロファージを患部に導き、炎症応答を引き起こす。
【0003】
国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）は、疼痛を、実際のまたは潜在的な組織損傷に関連する不快な感覚および感情体験と定義している。疼痛は、神経系の不快な感覚である。一般的な疼痛のタイプとしては、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、交感神経性疼痛、心因性疼痛などが含まれる。加えて、疼痛はまた、身体の部位、急性または慢性などの時間、病因、および生理学的特徴によっても区別できる。全ての疼痛の中で、急性疼痛の持続はより短く、通常、組織損傷の警報シグナルである。従って、このタイプの疼痛は組織回復の後に消失する。慢性疼痛の持続はより長く、通常、組織損傷のシグナルではなく、疾患のシグナルである。慢性疼痛を有する患者は、おそらく抑鬱、自閉、または過敏となってより高い社会コストを要する。よって、疼痛の管理は常に大きな医療問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許出願第２０１８／０１３４７５１ Ａ１号明細書
【特許文献2】米国特許出願第２０１５／０２１８２１４ Ａ１号明細書
【特許文献3】中国特許第１０４３２１３３７Ａ号明細書
【特許文献4】中国特許第１０７８４９０９１Ａ号明細書
【特許文献5】中国特許第１０７８４７５５０Ａ号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｚｈｅｎｇ， Ｙｕｑｉｕ， ｅｔ ａｌ． ”Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ＮＦ－κＢ ａｎｄ ＭＡＰＫｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＢＶ２ ｃｅｌｌｓ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １３６．４ （２０１８）： ２４２－２４８
【非特許文献2】Ｍｉｕｒａ， Ｔｏｍｏｓｈｉ， ｅｔ ａｌ． ”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｎ ｏｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｒａｔ： ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ （２００５）： ０５０３１１００１６－０５０３１１００１６
【発明の概要】
【0006】
新規な抗炎症性鎮痛剤を開発する差し迫った必要があるという事実に鑑みて、本発明は、炎症性疾患および疼痛を治療するために使用可能なペプチドを提供する。さらに、本発明は、炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのペプチドの使用を提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含み、その薬剤は有効量の前記ペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。加えて、このペプチドは、疼痛を治療するために使用できる。よって、本発明はまた、炎症性疾患を治療するための薬剤を製造するためのペプチドの使用も提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含み、その薬剤は有効量の前記ペプチドおよび薬学上許容される担体を含む。
【0007】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む。
【0008】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0009】
本発明はさらに、疼痛を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む。
【0010】
本発明はさらに、疼痛を治療するためのペプチドを提供し、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0011】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することを含み、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む方法を提供する。
【0012】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することからなり、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる方法を提供する。
【0013】
本発明はさらに、疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することを含み、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体を含む方法を提供する。
【0014】
本発明はさらに、疼痛を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のペプチドを投与することからなり、このペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる方法を提供する。
【0015】
好ましくは、この変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この変異体のアミノ酸配列は、配列番号１のペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９０％を超える配列同一性を有し、炎症性疾患または疼痛を治療する効果を有する。いくつかの実施形態では、このペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換は、Ｃ末端および／またはＮ末端に作出される。
【0016】
好ましくは、この変異体は、配列番号１と比較して１～３個の保存的アミノ酸置換、より好ましくは、１～２個の保存的アミノ酸置換、いっそうより好ましくは、１個の保存的アミノ酸置換を有し、かつ、炎症性疾患または疼痛の治療の効果を有するアミノ酸配列を指す保存的変異体である。
【0017】
「保存的アミノ酸置換」は、元のアミノ酸配列と同じまたは類似の特性を有するアミノ酸での置換を指す。天然アミノ酸は、それらの側鎖の特性に基づいて以下のカテゴリーに分類できる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）
（２）中性親水性：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）
（５）鎖の特性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）
（６）芳香族：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）
（２）中性親水性：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）
（５）鎖の特性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）
（６）芳香族：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）
【0018】
よって、保存的アミノ酸置換は、これらのカテゴリーの１つのアミノ酸が同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換されることを意味する。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基での置換を含み得る。好ましくは、このペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体からなる。より好ましくは、このペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。好ましくは、本発明によれば、「薬学上許容される担体」としては、限定されるものではないが、溶媒、乳化剤、沈殿防止剤、崩壊剤、結合剤、賦形剤、分解防止剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、滑沢剤、界面活性剤およびその他の類似の担体または本発明に好適な担体が含まれる。
【0019】
好ましくは、前述の炎症性疾患としては、強直性脊椎炎、変形性関節症、リウマチ性関節炎、関節リウマチ、外傷性関節炎、化膿性関節炎、通風性関節炎、結核性関節炎、神経障害性関節炎、および血友病性関節炎が含まれる。
【0020】
好ましくは、前述の疼痛としては、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、筋骨格疼痛、術後疼痛、癌性疼痛、急性疼痛、および慢性疼痛が含まれる。
【0021】
好ましくは、前述の炎症性疼痛としては、強直性脊椎炎疼痛、変形性関節症疼痛、リウマチ性関節炎疼痛、関節リウマチ疼痛、外傷性関節炎疼痛、化膿性関節炎疼痛、通風性関節炎疼痛、結核性関節炎疼痛、神経障害性関節炎疼痛、および血友病性関節炎疼痛が含まれる。
【0022】
前述の薬剤は、腸溶剤形または非経口剤形であり得る。腸溶剤形としては、限定されるものではないが、経口剤形および浣腸の、腸溶コーティング錠剤、多層錠、糖衣錠、舌下錠、チュアブル錠、トローチ、カプセル剤、散剤、シロップ、溶液、エマルション、懸濁液、粘着剤、マグマ剤、液体抽出物、抽出液、酒精剤、エリキシル剤、およびチンキなどが含まれる。非経口剤形としては、限定されるものではないが、注射用剤形、軟膏、ローション、リニメント、およびエアロゾルが含まれる。
【0023】
好ましくは、有効量は、０．０００８μｇ／ｋｇ～８１５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0024】
好ましくは、本願のペプチドは、月１回～１日１回の頻度で投与される。より好ましくは、本願のペプチドは、月２回～週２回の頻度で投与される。より好ましくは、本願のペプチドは、週１回の頻度で投与される。
【0025】
より好ましくは、本願のペプチドは、前述の有効量で週１回投与される。
【0026】
本発明によれば、有効量は、本明細書の実施形態において、米国食品医薬品局により発行されている指針文書“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ”に従って、０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の配列番号１のペプチド濃度に基づいて計算される。体重（ｂ．ｗ．）６０ｋｇの成人では、用量は基準：１２．３×１日当たり体重ｋｇ当たりヒト推奨用量＝１×マウス用量によって換算できる。
【0027】
より好ましくは、有効量は、０．００８μｇ／ｋｇ～４１０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0028】
より好ましくは、有効量は、０．００８μｇ／ｋｇ～０．２５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0029】
より好ましくは、有効量は、０．０２５μｇ／ｋｇ～０．２５μｇ／ｋｇの範囲である。
【0030】
より好ましくは、有効量は、８０μｇ／ｋｇ～４１０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0031】
より好ましくは、有効量は、８０μｇ／ｋｇ～２５０μｇ／ｋｇの範囲である。
【0032】
好ましくは、腸溶剤形は、経口剤形である。
【0033】
好ましくは、非経口剤形は、注射用剤形である。
【0034】
本発明によれば、「治療」とは、治療の効果を達成するための本発明のペプチドを患者に投与することを指し、その治療の効果は、疾患または関連の症状の治癒の治癒、緩和、改善または軽減を指す。本発明によれば、炎症性疾患の治療は、炎症関連症状の改善を指し、いくつかの実施形態では、これは炎症指標の軽減によって評価される。本発明によれば、疼痛の治療は、疼痛関連症状の改善を指し、いくつかの実施形態では、これは疼痛知覚の閾値の上昇により、またはいくつかの実施形態では、足逃避閾値（ＰＷＴ）の上昇より評価される。
【0035】
本発明によれば、用語「有効量」は、所望の生体反応のための用量、すなわち、所望の治療効果のための用量を指す。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウス（試験群）におけるＴＮＦ－αの血清濃度を対照群と比較して示す。
【図2】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウス（試験群）におけるＩＬ－６の血清濃度を対照群と比較して示す。
【図3】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウス（試験群）の同側後足のＰＷＴの経時的変化をモルヒネ群（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して示す。
【図4】３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウス（試験群）の反対側の足のＰＷＴの経時的変化をモルヒネ群（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して示す。
【図5】１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウスの同側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図6】１ｍｇ／ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬの配列番号１のペプチドを４週目～１２週目まで毎週投与した後のマウスの反対側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図7】それぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウスの同側後足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図8】それぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した後のマウスの反対側の足のＰＷＴを対照群と比較して示す。
【図9】酢酸誘発ライジング試験における配列番号１のペプチドの抗侵害受容作用およびテールフリック試験における配列番号１のペプチドの最大効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明の所定の発明目的を達成するために採用した技術的手段を添付図面により、本発明の準備例および実施例に従ってさらに説明する。
【0038】
準備例１
本発明において使用されるＧｌｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｐのペプチドを合成するために標準的なＦｍｏｃ法およびマイクロ波ペプチド合成装置を適用した。ここで、Ｇｌｐはピログルタミン酸（ピロリドンカルボン酸）（Ｃａｓ Ｎｕｍｂｅｒ ９８－７９－３）である。一般に、Ｄ残基を予め添加したＷａｎｇ樹脂（装填量０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器に秤量し、合成前に新鮮なＤＭＦ（１０～１５ｍＬ）を加え、膨潤準備をした。膨潤時間はマイクロ波ペプチド合成装置で３分に設定した。
本発明において使用されるＧｌｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｐのペプチドを合成するために標準的なＦｍｏｃ法およびマイクロ波ペプチド合成装置を適用した。ここで、Ｇｌｐはピログルタミン酸（ピロリドンカルボン酸）（Ｃａｓ Ｎｕｍｂｅｒ ９８－７９－３）である。一般に、Ｄ残基を予め添加したＷａｎｇ樹脂（装填量０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器に秤量し、合成前に新鮮なＤＭＦ（１０～１５ｍＬ）を加え、膨潤準備をした。膨潤時間はマイクロ波ペプチド合成装置で３分に設定した。
【0039】
Ｎ末端アミン基を遊離状態にするために、ＤＭＦ中２０％ピペリジン５ｍＬを用いて最初とその次のＦｍｏｃ基を除去し、標準的な脱保護法（第１段階：温度７５℃、電圧１５５Ｗ、および温度保持時間１５秒 第２段階：温度９０℃、電圧３０Ｗ、および温度保持時間５０秒）によって「ＤＥＰ」工程の溶液として利用した。
【0040】
次に、Ｃ末端（「ＡＣＴ」工程として機能）、および所望のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－ＡＡ（保護側鎖）－ＯＨとして機能）を活性化するためにＤＭＦ中０．５ＭのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を５倍過剰量（ＤＭＦ中０．２Ｍの濃度）で加え、カップリング反応（工程ＡＡ）のためにＤＭＦ中１．０Ｍのオキシマを用いた。標準的なカップリング反応を行った（第１段階：温度７５℃、電圧１７０Ｗ、および温度保持時間１５秒 第２段階：温度９０℃、電圧３０Ｗ、および温度保持時間２３０秒）。約４分間ＡＡを行った後、Ｗａｎｇ樹脂をＤＭＦ溶液で洗浄した。ＤＥＰ－ＡＣＴ－ＡＡの工程を繰り返して、Ｃ末端からＮ末端へペプチドを構築した。
【0041】
最後に、このペプチドを、氷浴中、９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ２Ｏ／２．５％ＴＩＰＳで処理した後、それを２時間放置して室温とすることによって固相支持体から取り出す。濾過後に濾液を回収し、アイスエーテルを加えて沈澱させ、遠心分離して上清を除去した。その後、エーテルを加えてこの沈澱を洗浄した。前述の工程を３～６回繰り返した。最終的な沈澱を採取し、凍結乾燥させて白色の綿毛様生成物、すなわち、最終生成物を得た。この最終生成物の純度を高速液体クロマトグラフィーにより決定し、分子量および配列をＬＣ－ＭＳ／Ｍにより分析した。
【0042】
準備例２
ＩＣＲマウス（８～１２週齢、体重２０～２５ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎから）において次のように関節炎を誘導した。各マウスの右足関節に１ｍｇ／ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を５μＬの量で週１回継続的に注射した。最後の注射時を０週とする。４回の注射の後、ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスの片側の前部足関節に長期炎症および足の腫脹が少なくとも１２週間誘導され、両側の機械痛覚過敏もまた少なくとも１２週間、継続的に誘導され、従って、臨床的に長期慢性疼痛を患う関節リウマチモデルとして機能した。
ＩＣＲマウス（８～１２週齢、体重２０～２５ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎから）において次のように関節炎を誘導した。各マウスの右足関節に１ｍｇ／ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を５μＬの量で週１回継続的に注射した。最後の注射時を０週とする。４回の注射の後、ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスの片側の前部足関節に長期炎症および足の腫脹が少なくとも１２週間誘導され、両側の機械痛覚過敏もまた少なくとも１２週間、継続的に誘導され、従って、臨床的に長期慢性疼痛を患う関節リウマチモデルとして機能した。
【0043】
準備例３
侵害受容性疼痛試験および酸誘発慢性広範囲疼痛試験を行うために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雄マウス（２０～２５ｇ）を温度制御環境（２４±０．５℃）下、１２時間明暗周期（０８：００～２０：００に照明）で飼育し、標準的な実験室餌および水道水を自由に摂らせた。動物を試験的操作の前に２０～３０分馴化させた。動物飼育および取り扱い手順は疼痛研究で使用される動物に関する国際疼痛学会指針に準拠し、これらの手順は動物実験倫理委員会によって承認された。
侵害受容性疼痛試験および酸誘発慢性広範囲疼痛試験を行うために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雄マウス（２０～２５ｇ）を温度制御環境（２４±０．５℃）下、１２時間明暗周期（０８：００～２０：００に照明）で飼育し、標準的な実験室餌および水道水を自由に摂らせた。動物を試験的操作の前に２０～３０分馴化させた。動物飼育および取り扱い手順は疼痛研究で使用される動物に関する国際疼痛学会指針に準拠し、これらの手順は動物実験倫理委員会によって承認された。
【0044】
試験１
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、６個体のマウスを含む試験群とした。他方、水を投与したマウスを対照群とし、これも６個体のマウスを含んでいた。試験群および対照群のマウスを投与後１２週目に犠牲にした。心臓穿刺により血清採取を行う。マウスＴＮＦ－α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＴＡ００Ｂ）、マウスＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍ６００Ｂ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、試験群および対照群におけるマウスのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の血清濃度を決定および収集した。この結果から、配列番号１のペプチドの長期経口投与を受けた試験群のマウスのＴＮＦ－αの血清濃度は検出可能域外のレベルに低下していた、すなわち、検出されなかった（ＮＤ）ことが見て取れた（図１）。また、試験群のＩＬ－６の血清濃度も、対照群に比べて低下していた（図２）。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、全身炎症指標を実際に引き下げることができ、このことは、本発明の配列番号１のペプチドが炎症性疾患、特に、関節リウマチから生じる慢性全身炎症を実際に治療できることを証明する。
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、６個体のマウスを含む試験群とした。他方、水を投与したマウスを対照群とし、これも６個体のマウスを含んでいた。試験群および対照群のマウスを投与後１２週目に犠牲にした。心臓穿刺により血清採取を行う。マウスＴＮＦ－α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＴＡ００Ｂ）、マウスＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍ６００Ｂ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、試験群および対照群におけるマウスのＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の血清濃度を決定および収集した。この結果から、配列番号１のペプチドの長期経口投与を受けた試験群のマウスのＴＮＦ－αの血清濃度は検出可能域外のレベルに低下していた、すなわち、検出されなかった（ＮＤ）ことが見て取れた（図１）。また、試験群のＩＬ－６の血清濃度も、対照群に比べて低下していた（図２）。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、全身炎症指標を実際に引き下げることができ、このことは、本発明の配列番号１のペプチドが炎症性疾患、特に、関節リウマチから生じる慢性全身炎症を実際に治療できることを証明する。
【0045】
試験２
準備例２からのマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのオピオイド鎮痛薬としてのモルヒネを４週目に経口投与し、これらを陽性対照とした。他方、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを経口投与したマウスを試験群とした。モルヒネ陽性対照群および試験群は両方とも６個体のマウスを含んだ。マウスの足逃避閾値（ＰＷＴ）を、投与から０分、３０分、６０分、９０分、１２０分後にｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより決定した。
準備例２からのマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのオピオイド鎮痛薬としてのモルヒネを４週目に経口投与し、これらを陽性対照とした。他方、滅菌水に溶解させた３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを経口投与したマウスを試験群とした。モルヒネ陽性対照群および試験群は両方とも６個体のマウスを含んだ。マウスの足逃避閾値（ＰＷＴ）を、投与から０分、３０分、６０分、９０分、１２０分後にｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより決定した。
【0046】
試験の結果を図３および図４に示した。配列番号１の投与後、両群のマウスの同側後足および反対側の足のＰＷＴ値は、モルヒネ陽性対照群のように上昇傾向を示した。従って、これは、本願の配列番号１のペプチドが、モルヒネと同様の抗侵害受容作用を有したが、必要な量は少なかったことを証明する。また、試験群およびモルヒネ群において投与後９０分の時点で最大抗侵害受容作用が示されたことも見て取れた。９０分で、モルヒネ群では、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０８５±０．０１５ｇから０．６４±０．０８９ｇに上昇し（図３に示されるとおり）、マウスの反対側の足のＰＷＴ値は０．４３±０．０３３ｇから１．９６±０．４８８ｇに上昇し（図４に示されるとおり）、一方、試験群では、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０７ｇから０．９±０．１５６ｇに上昇し（図３に示されるとおり）、マウスの反対側の足のＰＷＴ値は０．５±０．０４７ｇから１．３５±０．１９３ｇに上昇した（図４に示されるとおり）。さらに、抗侵害受容作用は投与後１２０分で低下し始めた。
【0047】
試験３
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、これらを灰色の矢印で示した。準備例２のマウスに関するＣＦＡ注射の４回の時機を図５および図６に黒い矢印で示した。２つの投与群はともに６個体のマウスを含んだ。水を経口投与したマウスを対照群として用いた。対照群もまた６個体のマウスを含んだ。ＰＷＴ値は、投与後９０分の時点でｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
準備例２からのマウスに、滅菌水に溶解させた１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを４週目に経口投与し、その後、１２週目まで週１回ペプチドを継続的に投与し、これらを灰色の矢印で示した。準備例２のマウスに関するＣＦＡ注射の４回の時機を図５および図６に黒い矢印で示した。２つの投与群はともに６個体のマウスを含んだ。水を経口投与したマウスを対照群として用いた。対照群もまた６個体のマウスを含んだ。ＰＷＴ値は、投与後９０分の時点でｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
【0048】
試験結果を図５および図６に示した。１ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、同側後足のＰＷＴ値は０．０９ｇから０．５～１ｇに上昇し（図５に示されるとおり）、反対側の足のＰＷＴ値は３週目の０．４ｇから０．６～１．２ｇに上昇した（図６に示されるとおり）。３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、同側後足のＰＷＴ値は３週目の０．０９ｇから０．６３～１ｇに上昇し（図５に示されるとおり）、反対側の足のＰＷＴ値は０．４ｇから０．８７～１．２７ｇに上昇した（図６に示されるとおり）。よって、試験の結果は、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの抗侵害受容作用が長期投与の後に同等であったことを示した。
【0049】
試験４
準備例２から２４個体のマウスを供給した。マウスにそれぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した。全ての投与群は６個体のマウスを含んだ。他の６個体のマウスに水を経口投与し、これを対照群とした。投与後９０分の時点でＰＷＴ値をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
準備例２から２４個体のマウスを供給した。マウスにそれぞれ０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、または３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドを投与した。全ての投与群は６個体のマウスを含んだ。他の６個体のマウスに水を経口投与し、これを対照群とした。投与後９０分の時点でＰＷＴ値をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより測定した。
【0050】
結果を図７および図８に示した。０．３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから１ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１ｇに上昇した。１μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから０．６ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１．４ｇに上昇した。３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドの経口投与後、マウスの同側後足のＰＷＴ値は０．０６５ｇから０．１６ｇに上昇し、反対側の足のＰＷＴ値は０．３２ｇから１ｇに上昇した。これらの試験結果は、０．３μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇの配列番号１のペプチドが経口投与後に抗侵害受容作用を有したことを示した。
【0051】
試験５
酸誘発腹部収縮アッセイをＨ．Ｏ．Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｃ．Ｄｉｎｎｅｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｔｈｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２，２９５－３１０（１９６８）に従って行った。一般に、準備例３からのマウスを小さな観察室に入れ、２０分間馴化した。内臓痛の指標となる「ライジング」応答（腹部収縮）を誘導する１％酢酸３００μＬ）を注射する１０分前に、マウスに蒸留水（ビヒクル対照として）または種々の濃度（０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した。ビヒクル対照群および配列番号１のペプチドを投与した投与群はそれぞれ５～１２個体のマウスを含んだ。酸注射後３０分以内の腹部収縮の数を数え、各群のマウスの平均収縮数を計算した。酸誘発ライジングの抗侵害受容作用を抗侵害受容作用％として示した。
（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数－投与群のマウスの平均収縮数）／（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数）×１００％
酸誘発腹部収縮アッセイをＨ．Ｏ．Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｃ．Ｄｉｎｎｅｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｔｈｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２，２９５－３１０（１９６８）に従って行った。一般に、準備例３からのマウスを小さな観察室に入れ、２０分間馴化した。内臓痛の指標となる「ライジング」応答（腹部収縮）を誘導する１％酢酸３００μＬ）を注射する１０分前に、マウスに蒸留水（ビヒクル対照として）または種々の濃度（０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した。ビヒクル対照群および配列番号１のペプチドを投与した投与群はそれぞれ５～１２個体のマウスを含んだ。酸注射後３０分以内の腹部収縮の数を数え、各群のマウスの平均収縮数を計算した。酸誘発ライジングの抗侵害受容作用を抗侵害受容作用％として示した。
（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数－投与群のマウスの平均収縮数）／（ビヒクル対照群のマウスの平均収縮数）×１００％
【0052】
試験６
放射熱テールフリック試験をＦ．Ｅ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐａｉｎ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７２，７４－７９（１９４１）に従って改変した。準備例３の５～１２個体のマウスを入れ、テールフリック試験の前に３０分間、固定器に馴化した。較正および装置の維持のために熱流束赤外放射計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア、カタログ番号３７３００）を用いた。マウスの尾の先端から２ｃｍの部位に刺激を与え、マウスが熱源から尾を退けるまでにかかる時間をテールフリッキング潜時と定義した。組織損傷のリスクを制限するために、カットオフ時間を３０．１秒に設定した。熱強度は、ベースライン潜時が大部分の動物で約５～８秒となるように調整した。潜時は、種々の用量（０．０１μｇ／ｋｇ、０．０３μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した後、示された時間間隔（１０～９０分）で、１０分毎に記録した。次に、１０～９０分間の平均潜時を計算した。Ｌ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｋ．Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｓｏｍｅ Ｎａｒｃｏｔｉｃ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｏｍｏｒｐｈａｎ Ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １４３，１４１－１４８（１９６４）に従い、テールフリック試験の抗侵害受容作用を式：
％ＭＰＥ＝（投薬後潜時－投薬後潜時）／（カットオフ時間－投薬前潜時）×１００％
によって定義される「％ＭＰＥ」（最大効果）で示した。
放射熱テールフリック試験をＦ．Ｅ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐａｉｎ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７２，７４－７９（１９４１）に従って改変した。準備例３の５～１２個体のマウスを入れ、テールフリック試験の前に３０分間、固定器に馴化した。較正および装置の維持のために熱流束赤外放射計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア、カタログ番号３７３００）を用いた。マウスの尾の先端から２ｃｍの部位に刺激を与え、マウスが熱源から尾を退けるまでにかかる時間をテールフリッキング潜時と定義した。組織損傷のリスクを制限するために、カットオフ時間を３０．１秒に設定した。熱強度は、ベースライン潜時が大部分の動物で約５～８秒となるように調整した。潜時は、種々の用量（０．０１μｇ／ｋｇ、０．０３μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）の配列番号１のペプチドを経口投与した後、示された時間間隔（１０～９０分）で、１０分毎に記録した。次に、１０～９０分間の平均潜時を計算した。Ｌ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｋ．Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｓｏｍｅ Ｎａｒｃｏｔｉｃ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｏｍｏｒｐｈａｎ Ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １４３，１４１－１４８（１９６４）に従い、テールフリック試験の抗侵害受容作用を式：
％ＭＰＥ＝（投薬後潜時－投薬後潜時）／（カットオフ時間－投薬前潜時）×１００％
によって定義される「％ＭＰＥ」（最大効果）で示した。
【0053】
試験５および試験６の結果を図９に示した。１μｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量の配列番号１のペプチドは、酸誘発ライジング試験において最良の抗侵害受容作用を示し、一方、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇは、放射熱テールフリック試験において最良の抗侵害受容作用を示した。従って、本発明の配列番号１のペプチドは、高濃度および低濃度の両方で抗侵害受容作用を有する。
【0054】
結論として、本発明のペプチドは、炎症性疾患、特に、関節リウマチを治療する効果、および疼痛、特に、関節リウマチから生じる疼痛を治療する効果を有する。
【0055】
上記の実施形態は、いずれの態様においても本発明を限定することを意図しない本発明の好ましい実施形態にすぎない。好ましい実施形態を上記に開示するが、それらはいずれの態様においても本発明を限定することを意図しない。当業者は、本発明の技術的な解決の範囲から逸脱することなく、上記の開示を、等価な変形形態または等価な実施形態の改変としてその内容に軽微な改変を加えて利用できる。本発明の趣旨および原理の範囲内のいずれの改変、なされる等価の置換、改良なども、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【国際調査報告】