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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-08
(54)【発明の名称】中胚葉キラー（ＭＫ）細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20220301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220301BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220301BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220301BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
A61P35/00
A61K35/17 Z
A61K35/17 A
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021541188
(86)(22)【出願日】2020-01-13
(85)【翻訳文提出日】2021-09-10
(86)【国際出願番号】 GB2020050060
(87)【国際公開番号】W WO2020148520
(87)【国際公開日】2020-07-23
(31)【優先権主張番号】1900554.5
(32)【優先日】2019-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1916842.6
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521312732
【氏名又は名称】セル セラピー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】チャップマン、リー
(72)【発明者】
【氏名】スルタン、サビーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BB14
4B065BB40
4B065BC50
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB64
4C087DA31
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB22
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、中胚葉キラー（ＭＫ）細胞、及び療法における、特にがんを治療するためのその使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない中胚葉キラー（ＭＫ）細胞。
【請求項2】
検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現しない、請求項１に記載のＭＫ細胞。
【請求項3】
検出可能なレベルのＣＤ１４を発現しない、請求項１又は２に記載のＭＫ細胞。
【請求項4】
検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項5】
検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項6】
検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項7】
検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項8】
検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項9】
検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項10】
（ａ）検出可能なレベルのＣＤ１０２及び／若しくはＣＤ１２７を発現しない、（ｂ）検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現しない、（ｃ）検出可能なレベルのＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ６２Ｐのうちの１つ以上を発現しない、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせである、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項11】
検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項12】
検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１６０、ＣＤ３１４、及びＣＤ３３７のうちの１つ以上を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項13】
検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項14】
検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｆ、及びＣＤ１５９ａのうちの１つ以上を発現する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項15】
検出可能なレベルの（ａ）ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１、別名ＧＲＯａ）、（ｂ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）可溶性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒａ）、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６のうちの１つ以上を分泌する、上記請求項のいずれか一項に記載のＭＫ細胞。
【請求項16】
上記請求項のいずれか一項に記載の２つ以上のＭＫ細胞の集団。
【請求項17】
ＭＫ細胞の集団であって、前記集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、前記集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現する集団。
【請求項18】
前記集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、前記集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現する、請求項１６に記載のＭＫ細胞の集団。
【請求項19】
ＭＫ細胞の集団であって、（ｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）前記集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）前記集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）前記集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団。
【請求項20】
請求項１９に記載のＭＫ細胞の集団であって、（ｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約１５％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）前記集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）前記集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）前記集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）前記集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）前記集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団。
【請求項21】
（ａ）請求項１６～２０のいずれか一項記載に記載のＭＫ細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と、を含む医薬組成物。
【請求項22】
ＮＫ細胞の集団を更に含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項23】
請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）単核細胞（ＭＮＣ）が免疫調節性前駆（ｉＭＰ）細胞に分化するように誘導する条件下でＭＮＣを培養することと、（ｂ）低酸素条件下、及び前記ｉＭＰ細胞を接着させＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で前記ｉＭＰ細胞を培養することと、を含む方法。
【請求項24】
請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中でｉＭＰ細胞を培養することを含む方法。
【請求項25】
ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビトロ法であって、前記ＮＫ細胞の活性を高める条件下で、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団と共に前記ＮＫ細胞の集団をインキュベートすることを含む方法。
【請求項26】
請求項２５に記載の方法を使用して生成された、プライミングされたＮＫ細胞の集団。
【請求項27】
（ａ）請求項２６に記載のプライミングされたＮＫ細胞の集団と、（ｃ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と、を含む医薬組成物。
【請求項28】
ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビボ法であって、被験体におけるＮＫ細胞の活性を高める条件下で、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団又は請求項２１若しくは２２に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項29】
被験体におけるがんを治療する方法であって、（ａ）請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団、（ｂ）請求項２５に記載のプライミングされたＮＫ細胞の集団、（ｃ）請求項１６～２０のいずれか一項に記載のＭＫ細胞の集団及びＮＫ細胞の集団、又は（ｄ）請求項２１、２２、若しくは２６に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、中胚葉キラー（ＭＫ）細胞、及び療法における、特にがんを治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
中胚葉細胞は、多くの組織に由来し、他の細胞型の支持構造として作用する。骨髄は、例えば、造血細胞及び間葉系由来細胞の両方で構成される。２つの主な間葉系細胞型、すなわち、（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びその前駆体と（ｉｉ）骨髄にみられる間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）とが既に報告及び特性評価されている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多能性成体幹細胞である。ＭＳＣは、分化して骨格組織にみられる様々な特殊な細胞を形成する。例えば、軟骨の細胞（軟骨細胞）、骨の細胞（骨細胞））、脂肪の細胞（脂肪細胞）などに分化することができる。
【0003】
ＭＳＣは、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）及び心筋梗塞の治療などの様々な療法において既に使用されている。被験体に投与されたら、ＭＳＣは、典型的には、損傷組織に遊走（又は帰巣）し、パラクリンシグナル伝達を通して、また、損傷組織内の近傍細胞の生存、修復、及び再生を促進することによって、その治療効果を発揮する。
【0004】
ＭＳＣがある種の免疫抑制及び免疫強化の特性を保有している可能性があることを示唆するある程度の証拠が存在する。従って、ＭＳＣを使用して免疫反応を操作し、それによって、疾患を治療することができる可能性がある。しかし、現在の療法は、典型的には、ＭＳＣのサブタイプの混合物を注入することを含むが、該サブタイプの大部分は、必要な免疫調節特性を保有していない。これは、オフターゲット副作用及び体積関連副作用を引き起こす可能性がある高用量の細胞の使用を必要とする。更に、ＭＳＣは、典型的には、骨髄から入手されるので、このアプローチに必要な多数の細胞を入手することは困難である。
【0005】
他の中胚葉前駆細胞、すなわち、中胚葉系列の前駆細胞（ＰＭＬ）、免疫調節性前駆（ｉＭＰ）細胞、及び免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞も出願人によって開示されている。ＰＭＬは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）に開示されている。ｉＭＰ細胞は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）に開示されている。ｉｏＭＰ細胞は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５２４４７号（国際公開第２０１７０２５７２９号として公開）に開示されている。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、これまでに同定も単離もされていない新規の細胞型である中胚葉キラー（ＭＫ）細胞に関する。このＭＫ細胞はかなり特徴的であり、その組成、機能、及び特徴がＭＳＣ、ＭＰＣ、ＰＭＬ、ｉＭＰ細胞、及びｉｏＭＰ細胞とは異なり、これによって、強化された細胞傷害性及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を調節する能力が付与される。ＭＫ細胞は、がん細胞を直接殺傷することができる、すなわち、がん細胞傷害性である。ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞をプライミング／活性化する（すなわち、ＮＫ細胞の増殖及び／又は細胞傷害活性を高める）ことができる。ＭＫは、好ましくは、炎症部位に免疫細胞を誘引することができる。ＭＫ細胞は、類似のナチュラルキラー特徴を示すことからＮＫ細胞にちなんで命名されたが、骨髄などの中胚葉細胞から組織工学的に作製される。このＭＫ細胞はかなり特徴的であり、その組成、機能、及び特徴がＮＫ細胞とは異なる。
【0007】
本発明者らは、驚くべきことに、特異的マーカー発現パターンを有する新規中胚葉キラー（ＭＫ）細胞を同定した。具体的には、ＭＫ細胞は、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、ＣＤ１６及びＣＤ９６を発現し得る。ＭＫ細胞は、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。ＭＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し得ない。
【0008】
本発明のＭＫ細胞は、骨髄単核細胞（ＭＮＣ）又は末梢血ＭＮＣなどのＭＮＣから単離することができる。ＭＫ細胞は、インビトロ及びインビボでＮＫ細胞の細胞傷害活性を高めることができる。ＭＫ細胞は、それ自体インビトロ及びインビボでがん細胞を殺傷することができる。これは、実施例に示される。
【0009】
従って、本発明は、検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない中胚葉キラー（ＭＫ）細胞を提供する。
【0010】
また、本発明は、検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現しない、中胚葉キラー（ＭＫ）細胞を提供する。
【0011】
本発明はまた、以下を提供する：
－ 本発明の２つ以上のＭＫ細胞の集団；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団であって、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現する集団；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団であって、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現する集団；
－ ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団；
－ ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１５％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団；
－（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）単核細胞（ＭＮＣ）が免疫調節性前駆（ｉＭＰ）細胞に分化するように誘導する条件下でＭＮＣを培養することと、（ｂ）低酸素条件下、及び該ｉＭＰ細胞を接着させＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することと、を含む方法；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することを含む方法；
－ ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビトロ法であって、ＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団と共にＮＫ細胞の集団をインキュベートすることを含む方法；
－ 本発明の方法を用いて生成された、プライミングされたＮＫ細胞の集団；
－（ａ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団と、（ｃ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物；
－ ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビボ法であって、被験体におけるＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団又は本発明の医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法；並びに
－ 被験体におけるがんを治療する方法であって、（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｂ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、（ｃ）本発明のＭＫ細胞の集団及びＮＫ細胞の集団、又は（ｄ）本発明の医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法。
－ 本発明の２つ以上のＭＫ細胞の集団；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団であって、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現する集団；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団であって、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現する集団；
－ ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団；
－ ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１５％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団；
－（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）単核細胞（ＭＮＣ）が免疫調節性前駆（ｉＭＰ）細胞に分化するように誘導する条件下でＭＮＣを培養することと、（ｂ）低酸素条件下、及び該ｉＭＰ細胞を接着させＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することと、を含む方法；
－ 本発明のＭＫ細胞の集団を生成する方法であって、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することを含む方法；
－ ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビトロ法であって、ＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団と共にＮＫ細胞の集団をインキュベートすることを含む方法；
－ 本発明の方法を用いて生成された、プライミングされたＮＫ細胞の集団；
－（ａ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団と、（ｃ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物；
－ ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビボ法であって、被験体におけるＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団又は本発明の医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法；並びに
－ 被験体におけるがんを治療する方法であって、（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｂ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、（ｃ）本発明のＭＫ細胞の集団及びＮＫ細胞の集団、又は（ｄ）本発明の医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＭＫ００２及びＭＫ００４が、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）及びＲＰＭＩ－８２２６（形質細胞性骨髄腫）の両方に対して、ＩＭＰ００２及びＩＭＰ００４に比べて有意に高い細胞傷害性を示すことを示す（ｎ＝３；ｔ検定）。
【図2】ＭＫ００２及びＭＫ００４と共にインキュベートすると、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）及びＲＰＭＩ－８２２６（形質細胞性骨髄腫）に対するＮＫ細胞の細胞傷害性が有意に高まることを示す（ｎ＝３；ｔ検定）。ＭＫ００２＝ＭＫ００２でプライミングしたＮＫ細胞株。ＭＫ００４＝ＭＫ００４でプライミングしたＮＫ細胞株。
【図3】ＭＫ００４と共にインキュベートすると、ＲＰＭＩ－８２２６（形質細胞性骨髄腫）及びＵ２６６（形質細胞性骨髄腫）に対する初代ＮＫ細胞の細胞傷害性が有意に高まることを示す（ｎ＝３；ｔ検定）。ＭＫ００４＝ＭＫ００４でプライミングした初代ＮＫ細胞。
【図4】培養中の本発明のＭＫ細胞（ＭＫ００２）を示す。
【図5】未処理のとき及びＩＦＮ－γ（独立ｔ検定で有意ではない）又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌されたＧＲＯａの量を示す。各列は、５つのバッチからのデータを表す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図6】未処理のとき及びＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定で有意ではない）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌されたＩＬ－１２の量を示す。各列は、５つのバッチからのデータを表す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図7】未処理のとき及びＩＦＮ－γ（独立ｔ検定）又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定で有意ではない）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌されたＩＬ－２Ｒａの量を示す。各列は、５つのバッチからのデータを表す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図8】未処理のとき及びＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌されたＩＬ－８の量を示す。各列は、４つのバッチからのデータを表す（標準曲線と相関していなかったので、ＭＫＰＣのデータは含めなかった；平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図9】未処理のとき及びＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定で有意ではない）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌された可溶性ＴＲＡＩＬの量を示す。各列は、５つのバッチからのデータを表す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図10】未処理のとき及びＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α（独立ｔ検定で有意ではない）で処理したときに本発明のＭＫ細胞によって分泌されたＩＬ－６の量を示す。各列は、５つのバッチ全てからのデータを表す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝１）。
【図11】（Ａ）対照マウス、（Ｂ）未処理の本発明のＭＫ細胞で処理したマウス、（Ｃ）ＩＦＮ－γで処理した本発明のＭＫ細胞で処理したマウス、又は（Ｄ）ＴＮＦ－αで処理した本発明のＭＫ細胞で処理したマウスのエアパウチに存在するＮＫ細胞の百分率を示す（ＭＫ００６；平均±ＳＥＭ；ｎ＝５；独立ｔ検定）。
【図12】（Ａ）対照マウス、（Ｂ）未処理の本発明のＭＫ細胞で処理したマウス、（Ｃ）ＩＦＮ－γで処理した本発明のＭＫ細胞で処理したマウス、又は（Ｄ）ＴＮＦ－αで処理した本発明のＭＫ細胞で処理したマウスのエアパウチに存在する単球の百分率を示す（ＭＫ００６；平均±ＳＥＭ；ｎ＝５；独立ｔ検定）。
【図13】ＭＫ００２及びＭＫ００４と共にインキュベートすると、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）に対する初代ＮＫ細胞の細胞傷害性が有意に高めることを示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；独立ｔ検定）。
【図14】試験したＭＫ細胞の全てのバッチがＭＣＦ７に対して細胞傷害性を示すことを示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２）。
【図15】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したＧＺＭＢ ｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図16】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したＧＺＭＨ ｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図17】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したＧＺＭＭ ｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図18】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したＧＺＭＡ ｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図19】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したＧＺＭＫ ｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図20】単培養（ＭＣ）と比較した、６時間、１２時間、又は２４時間ＲＰＭＩ－８２２６と共培養（ＣＣ）した後にＭＫ００４が発現したパーフォリンｍＲＮＡの量の倍数変化を示す（平均±ＳＤ；ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点でｎ＝２；独立ｔ検定）。
【図21】未処理（Ａ）、又は０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｂ）、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｃ）、若しくは２．０ｍＭ（Ｄ）で２４時間処理したときの、ＭＣＦ７に対するＭＫ００２、ＭＫ００４、及びＭＫ００６（Ｅ：Ｔ＝５．１；２４時間）の細胞傷害性を示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；独立ｔ検定）。
【図22】未処理（Ａ）、又はスクランブル／ノンターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡ（Ａ）、ＣＤ１７８／ＦａｓＬに対する特異的ｓｉＲＮＡ（Ｂ）、又はＣＤ２５３／ＴＲＡＩＬに対する特異的ｓｉＲＮＡ（Ｄ）で４８時間処理したときの、ＭＣＦ７に対するＭＫ００４及びＭＫ００６（Ｅ：Ｔ＝５．１；２４時間）の細胞傷害性を示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；独立ｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに合わせられることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0014】
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を含み、「組織（ａ ｔｉｓｓｕｅ）」への言及は、２つ以上のこのような組織を含み、「被験体（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、２人以上のこのような被験体を含む、などである。
【0015】
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0016】
本発明のＭＫ細胞
本発明は、中胚葉キラー（ＭＫ）細胞を提供する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ４５ＲＡ、（ｂ）ＣＤ４５ＲＢ、及び（ｃ）ＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現しない。本発明の状況において、検出可能なレベルを発現しないとは、ＭＫ細胞の約５％以下しか関連マーカーを発現しないことを意味する。
本発明は、中胚葉キラー（ＭＫ）細胞を提供する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ４５ＲＡ、（ｂ）ＣＤ４５ＲＢ、及び（ｃ）ＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現しない。本発明の状況において、検出可能なレベルを発現しないとは、ＭＫ細胞の約５％以下しか関連マーカーを発現しないことを意味する。
【0017】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１６及び／又はＣＤ９６を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、以下でより詳細に論じる通り、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で処理したときに検出可能なレベルのＣＤ１６及び／又はＣＤ９６を発現する。
【0018】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１６及び／又はＣＤ９６を発現し、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現しない。
【0019】
好ましい実施形態では、ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。好ましいＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現しない。
【0020】
ＭＫ細胞という用語は、本明細書では、中胚葉前駆キラー（ＭＰＫ）細胞、骨髄由来細胞、又は骨髄由来キラー細胞と互換的である。
【0021】
ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ１６及び／又はＣＤ９６を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルの上で定義した（ａ）ＣＤ４５ＲＡ、（ｂ）ＣＤ４５ＲＢ、及び（ｃ）ＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ５６を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、その表面において検出可能なレベルの以下に列挙するマーカーのいずれかを発現するか又は発現しない。同様に、ＭＫ細胞の集団は、その表面上において、列挙するマーカーのいずれかを発現し得る／発現し得ない。
【0022】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られている）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ；Ｗｅｉ Ｈｓｅｕｎ Ｙｅａｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３４３１０（２０１６））中に機能する。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0023】
ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥとしても知られている）は、ＮＫ細胞の接着において機能し、活性化したＮＫ細胞の細胞傷害性を刺激する（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｐｒｉｌ １，２００４，１７２（７）３９９４－３９９８）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0024】
ＣＤ１１２（ＰＲＲ２及びＮｅｃｔｉｎ－２としても知られている）は、ＮＫ細胞のプライミング／活性化に関与している（Ｄｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１７ Ｊｕｌ ７；２９２（２７）：１１４１３－１１４２２）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0025】
ＣＤ１３７Ｌ（４－１ＢＢ Ｌとしても知られている）は、ＮＫ細胞のプライミング／活性化に関与している（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１ Ｍａｒ；３４（２）：１８７－１９５．）。
【0026】
ＣＤ１７８（ＦａｓＬ及びＣＤ９５Ｌとしても知られている）は、ＮＫ細胞の細胞傷害性に関与している（Ｚａｍａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８ Ｄｅｃ ２１；１８８（１２）：２３７５－２３８０）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γ及び／又は腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）による処理／刺激によって増加し得る。
【0027】
ＣＤ２５３（ＴＲＡＩＬ及びＴＮＦＳＦ１０としても知られている）は、ＮＫ細胞の細胞傷害性に関与している（Ｚａｍａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８ Ｄｅｃ ２１；１８８（１２）：２３７５－２３８０）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞と区別される。実施例１５の結果は、本発明のＭＫ細胞が細胞傷害性を発揮する機序の一部をＣＤ２５３が形成していることを示唆している。
【0028】
ＣＤ２７７（ＢＴ３．１及びブチロフィリンＳＦ３ Ａ１としても知られている）は、免疫細胞の機能を制御する（Ｍｅｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ；４１（１２）：３４４３－５４）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。
【0029】
ＣＤ３４（ＨＰＣＡ１としても知られている）は、重要なＭＮＣマーカーである。このマーカーが発現しないことによって、ＭＫ細胞はＭＮＣと区別される。
【0030】
ＣＤ４５（ＬＣＡとしても知られている）は、重要なＭＮＣマーカーである。このマーカーが発現しないことによっても、ＭＫ細胞はＭＮＣ及びＮＫ細胞と区別される。
【0031】
ＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても知られている）は、重要なＮＫ細胞マーカーである（Ｚａｍａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８ Ｄｅｃ ２１；１８８（１２）：２３７５－２３８０）。このマーカーが発現しないことによって、ＭＫ細胞はＮＫ細胞と区別される。
【0032】
本発明のＭＫ細胞は、多数の利点を有する。主な利点をここにまとめる。しかし、以下の議論から更なる利点が明らかになるであろう。
【0033】
本発明のＭＫ細胞は、有利なことに、被験体における疾患を治療するために使用することができる。例えば、ＭＫ細胞は、被験体におけるがんを治療するために使用することができる。
【0034】
本発明のＭＫ細胞は、その直接的な効果を介して疾患を治療することができる。例えば、ＭＫ細胞は、接触依存性細胞溶解を介してがん細胞を殺傷することができる。好ましくは、ＭＫ細胞は、接触依存性細胞溶解を介して腫瘍細胞を殺傷する。また、ＭＫ細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通してがん細胞の死を誘導することもできる。
【0035】
本発明のＭＫ細胞は、免疫応答を調節することができる。言い換えれば、ＭＫ細胞は、免疫調整効果を有し得る。例えば、ＭＫは、インビトロ又はインビボの両方でＮＫ細胞の活性（特に、細胞傷害性）を高めることができる。例えば、ＭＫ細胞を用いて、プライミング又は活性化されたＮＫ細胞の集団をインビトロで生成することができる。プライミング又は活性化されたＮＫ細胞を使用して、被験体におけるがんなどの疾患を治療することができる。プライミング又は活性化されたＮＫ細胞は、単独で又はＭＫ細胞と組み合わせて被験体に投与してよい。また、ＭＫ細胞は、被験体における内因性ＮＫ細胞をプライミング又は活性化することもできる。
【0036】
本発明のＭＫ細胞の主な利点は、典型的にはインビボで安全である中胚葉細胞であるという点である。本発明のＭＫ細胞と類似（であるが異なる）方法で生成されたｉＭＰ細胞（同種中胚葉細胞）がヒト被験体において安全であるという十分な証拠がある（Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｎ；９（３）：２０２－１３）。ＭＫ細胞は細胞傷害性であるが、キメラ抗原受容体－Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞などの他の細胞傷害性細胞療法のいかなる副作用も誘導するとは予測されない。具体的には、ＭＫ細胞は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ：別名サイトカインストーム）、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、及びオフターゲット効果を誘導するとは予測されない。
【0037】
以下でより詳細に論じる通り、ＭＫ細胞は、ヒト個体などの個体から採取した骨髄単核細胞（ＭＮＣ）などのＭＮＣから生成される。ＭＫ細胞はＭＮＣから生成されるので、（骨髄などから）容易に生成することができ、また、治療される被験体にとって自己であってよく、従って、被験体による免疫拒絶のリスクが回避される。
【0038】
ＭＮＣの様々なサンプル（すなわち、骨髄の様々なサンプル）を得ることができるので、原理的には、１つの個体から無限の数のＭＫ細胞を生成することが可能である。１つの個体から非常に多数のＭＫ細胞を生成することは確かに可能である。従って、本発明のＭＫ細胞は、多数作製することができる。
【0039】
本発明のＭＫ細胞は、臨床的に関連する条件、例えば、微量のエンドトキシン及び他の環境汚染物質、並びにウシ胎仔血清などの動物生成物の非存在下において生成される。これにより、本発明のＭＫ細胞は、被験体に投与するのに特に好適なものになる。
【0040】
本発明のＭＫ細胞の多数の集団は、化学療法又は放射線療法などの任意の他の治療を開始する前に、被験体から採取した１つのサンプルから生成することができる。従って、本発明のＭＫ細胞は、これら治療のいかなる有害作用も回避することができる。
【0041】
本発明のＭＫ細胞は、迅速に作製することができる。ＭＫ細胞は、３４日間未満、例えば、約３３日間、約３２日間、約３１日間、約３０日間、約２９日間、約２８日間、約２７日間、約２６日間、又は約２５日間でＭＮＣから生成することができる。また、ＭＫ細胞を冷凍し、細胞バンクにし、使用時に解凍してもよい。
【0042】
ＭＮＣからＭＫ細胞を生成することで、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の間葉系幹細胞ＭＳＣの使用に関係する道徳的及び倫理的な影響が回避される。
【0043】
本発明のＭＫ細胞は、典型的には、ヒトＭＮＣから生成される。従って、本発明のＭＫ細胞は、典型的にはヒトである。上述及び後述のマーカーは、典型的には、ヒトマーカーである。あるいは、ＭＫ細胞は、他の動物又は哺乳類、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、若しくはブタなどの商業的に飼育されている動物、マウス若しくはラットなどの実験動物、又はネコ、イヌ、ウサギ、若しくはモルモットなどのペットからのＭＮＣから生成することもできる。
【0044】
本発明のＭＫ細胞は、系統限定マーカーの発現、構造的及び機能的特徴を含む、当技術分野において公知の標準的な方法を用いて中胚葉キラー細胞として同定することができる。ＭＫ細胞は、ＭＫ細胞に特徴的であることが知られている細胞表面マーカーを検出可能なレベルで発現する。これらについては以下で論じる。
【0045】
本発明のＭＫ細胞は、幹細胞ではない。具体的には、ＭＳＣではない。インビトロで複製／自己再生するので、前駆細胞である。インビトロでは適切な条件下において強制的に例えば軟骨又は骨の細胞に分化させることはできるが、典型的には、インビボでは分化しない。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、（ｉ）接触依存性細胞溶解又はＡＤＣＣなどの直接的な効果、（ｉｉ）免疫応答又は免疫細胞活性の調節（すなわち、免疫調節効果）、特に、ＮＫ細胞のプライミング／活性化、並びに（ｉｉ）がんの部位への免疫細胞、特にＮＫ細胞及び単球の誘引による抗がん効果を有する。未処理の本発明のＭＫ細胞（すなわち、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αで処理されていない本発明のＭＫ細胞）は、典型的には、効果（ｉ）及び（ｉｉ）を有する。ＩＦＮ－γで処理された本発明のＭＫ細胞は、典型的には、効果（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を有する。対照的に、幹細胞は、典型的には、代替組織に分化することによって疾患を治療する。
【0046】
本発明のＭＫ細胞は、典型的には、紡錘状の形態を特徴とする。ＭＫ細胞は、典型的には、線維芽細胞様である、すなわち、長くかつ薄いいくつかの細胞突起を有する小さな細胞体を有する。該細胞は、典型的には、直径約１０～約２０μｍである。これを図４に示す。
【0047】
本発明のＭＫ細胞は、そのマーカー発現パターンによって公知の細胞と区別される。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現する。ＭＫは、好ましくは、ｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ細胞、及びＭＳＣなどの公知の細胞と比べてより多い量のこれらマーカーを発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、これらの細胞と比べてより多い量の全てのマーカーを発現する。これは、本発明のＭＫにおけるマーカーの発現レベル／量を、同一条件下で同一技術を用いて、公知の細胞における発現レベル／量と比較することによって求めることができる。以下でより詳細に論じる通り、ＭＫ細胞の集団では、ｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ細胞、及びＭＳＣの集団よりも高い％の細胞がＭＫマーカーを発現する。上述した通り、ｉｏＭＰ細胞及びｉＭＰ細胞は当技術分野において公知である（そして、これら細胞に関するデータは実施例に提示する）。好適なＭＳＣは、市販されている。比較に用いられるＭＳＣは、好ましくは、ヒトＭＳＣである。ヒトＭＳＣは、Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ（登録商標）Ｌｔｄ．、Ｏｓｉｒｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（登録商標）Ｉｎｃ．、又はＬｏｎｚａ（登録商標）から市販されている。ヒトＭＳＣは、好ましくは、Ｌｏｎｚａ（登録商標）から入手される。このような細胞を実施例において比較のために使用した。ＭＳＣは、上述の動物又は哺乳類のいずれに由来するものであってもよい。
【0048】
ＭＫ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ４５ＲＡ、（ｂ）ＣＤ４５ＲＢ、及び（ｃ）ＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現しない。
【0049】
当技術分野において公知の標準的な方法を用いて、上述（及び後述）の様々なマーカーの検出可能な発現又は発現の増加を判定することができる。好適な方法としては、免疫細胞化学的検査、イムノアッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー、及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適なイムノアッセイとしては、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、酵素増幅免疫測定技術、放射性アレルゲン吸着（ＲＡＳＴ）検査、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイ、及び免疫蛍光法が挙げられるが、これらに限定されない。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及びＲＴ－ＰＣＲはいずれも定量的であるので、様々なマーカーが存在する場合、それらの発現レベルを測定するために使用することができる。ハイスループットＦＡＣＳ（ＨＴ－ＦＡＣＳ）の使用については、実施例に開示する。本明細書に開示されるマーカーのいずれかの発現又は発現増加は、好ましくは、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、又はＨＴ－ＦＡＣＳを用いて行われる。本明細書において論じる様々なマーカーの全てに対する抗体及び蛍光標識抗体が、市販されている。
【0050】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現しない。ＣＤ１４は、重要なＭＮＣマーカーである。このマーカーが発現しないことによって、ＭＫ細胞はＭＮＣと区別される。
【0051】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα、Ｔａｃ、及びｐ５５としても知られている）を発現する。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現はＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αによる処理／刺激によって増加し得る。
【0052】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１３６（ＭＳＰ－Ｒ及びＲＯＮとしても知られている）を発現する。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0053】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１５５（ＰＶＲとしても知られている）を発現する。ＣＤ１５５は、ＮＫ細胞のプライミング／活性化に関与している（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｊａｎｕａｒｙ １５，２０１０，１８４（２）９０２－９１１）。
【0054】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３としても知られている）を発現する。ＣＤ１８３は、がんにおけるＮＫの蓄積に関与している（Ｗｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｏｃｔ １５；６８（２０）：８４３７－４５）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0055】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２０５（ＤＥＣ－２０５としても知られている）を発現する。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0056】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ３３２（ＦＧＦＲ２、ＢＥＫ、及びＫＧＦＲとしても知られている）を発現する。ＣＤ３３２（ＦＧＦＲ２、ＢＥＫ、及びＫＧＦＲとしても知られている）は、免疫細胞の機能を制御する（Ｍｅｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ；４１（１２）：３４４３－５４）。また、このマーカーの発現によって、ＭＫ細胞はｉｏＭＰ細胞、ｉＭＰ、及びＭＳＣと区別される。このマーカーの発現は、ＩＦＮ－γによる処理／刺激によって増加し得る。
【0057】
本発明のＭＫ細胞は、（ａ）好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１０２及び／又はＣＤ１２７を発現しない。本発明のＭＫ細胞は、（ｂ）好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現しない。本発明のＭＫ細胞は、（ｃ）好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ６２Ｐのうちの１つ以上、好ましくは全てを発現しない。本発明のＭＫ細胞は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ｂ）及び（ｃ）、（ａ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）であってよい。また、このマーカー発現パターンによって、ＭＫ細胞はＰＭＬと区別される。本明細書（以下の表１又は２を含む）における（ｉ）ＣＤ５０、（ｉｉ）ＣＤ６２Ｅ、（ｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、及び（ｉｖ）ＣＤ６２Ｐのうちの１つ以上に対する言及は全て、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を参照し得る。また、ＣＤ５０、ＣＤ１０２、ＣＤ１２７が発現しないことによっても、ＭＫ細胞はＭＳＣと区別される。
【0058】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現する。ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ－７としても知られている）は、健常個体では少数しかみられず、ＨＩＶ－１及びＨＣＶに慢性的に感染している個体ではレベルが上昇する異常なＮＫ細胞サブセットを表すＣＤ５６陰性ＮＫ細胞では発現しない（Ｂｒｕｎｅｔｔａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４，３８２２－３８３０）。従って、ＣＤ３２８の発現により、ＭＫ細胞はＣＤ５６陰性のＮＫ細胞と区別される。
【0059】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＮＫ活性化受容体のうちの１つ以上及び／又は１つ以上のＮＫ抑制受容体を発現する。活性化及び抑制受容体は、ＮＫ細胞に関して後述するもののうちのいずれであってもよい。
【0060】
活性化受容体の観点から、本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ２ＤＬ４としても知られている）、ＣＤ１５８ｉ（ＫＩＲ２ＤＳ４としても知られている）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５としても知られている）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ及びＫＬＲとしても知られている）、及びＣＤ３３７（ＮＫｐ３０及びＬｙ１１７）のうちの１つ以上、好ましくは全てを発現する。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃとしても知られている）を発現する。
【0061】
抑制受容体の観点から、本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ１５８ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３としても知られている）、（ｂ）ＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ２ＤＬ５としても知られている）、及び（ｃ）ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａとしても知られている）のうちの１つ以上、好ましくは全てを発現する。該細胞は、検出可能なレベルの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ｂ）及び（ｃ）、（ａ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現し得る。
【0062】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃとしても知られている）を発現しない。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ２４４、（ｂ）ＣＤ３３５、及び（ｃ）ＣＤ３５２のうちの１つ以上、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ｂ）及び（ｃ）、（ａ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現しない。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＣＤ２４４、（ｂ）ＣＤ３３５、並びに（ｃ）ＣＤ３５２（定義された方法のいずれかで）及びＣＤ１５９ｃのうちの１つ以上を発現しない。これらマーカーが発現しないことによって、ＭＫ細胞はＮＫ細胞と区別される。
【0063】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、ＣＤ１４０ａを発現しない。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、（ｉ）ＣＤＨ６、（ｉｉ）ＣＤ１２９、（ｉｉｉ）ＣＤ２００、及び（ｉｖ）ＣＤ２７１のうちの１つ以上を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、（ｉ）～（ｉｖ）の任意の数及び組み合わせ、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を発現しない。
【0064】
本発明のＭＫ細胞は、ＭＳＣではない。ＭＳＣの典型的なマーカー発現パターンは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＆ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１１（１０．１００７／９７８－１－６０７６１－８６０－７＿１２）の表１に示されている。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ８６、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、ＣＤ２０２ｂ、及びＣＤ３０９のうちの１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、又はそれ以上を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ８６、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、ＣＤ２０２ｂ、及びＣＤ３０９を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ８６、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、ＣＤ２０２ｂ、及びＣＤ３０９を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＴＲＡＩＬ受容体のうちの１つ以上を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、及びＣＤ２６４のうちの１つ以上、例えば２つ若しくは３つ、又はそれ以上を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２６１、ＣＤ２６２、及びＣＤ２６４を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、及びＣＤ２６４を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１８４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、及びＣＤ２８２のうちの１つ以上、例えば２つ若しくは３つ、又はそれ以上を発現しない。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１８４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、及びＣＤ２８２を発現しない。
【0065】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、特にＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、及びＴＬＲ１０のうちの１つ以上を発現する。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、及びＣＤ２９０のうちの１つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上を発現する。
【0066】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの１つ以上のグランザイムを発現する。グランザイムは、細胞傷害性Ｔリンパ球及びＮＫ細胞で発現し、その細胞傷害性に関与するセリンプロテアーゼのファミリーである。グランザイム含有細胞と感染又は形質転換した標的細胞との間で受容体の媒介によるコンジュゲートが形成された後、グランザイムは、エンドサイトーシスを介して標的細胞に入り、アポトーシスを誘導する（Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ：ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２，ｒｅｖｉｅｗｓ３０１４．１（２００１）ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ－２００１－２－１２－ｒｅｖｉｅｗｓ３０１４）。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、（ｂ）グランザイムＨ（ＧＺＭＨ）、（ｃ）グランザイムＭ（ＧＺＭＭ）、（ｄ）グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、及び（ｅ）グランザイムＫ（ＧＺＭＫ）のうちの１つ以上、例えば、（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ａ）及び（ｂ）；（ａ）及び（ｃ）；（ａ）及び（ｄ）；（ａ）及び（ｅ）；（ｂ）及び（ｃ）；（ｂ）及び（ｄ）；（ｂ）及び（ｅ）；（ｃ）及び（ｄ）；（ｃ）及び（ｅ）；（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；並びに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を発現する。ＭＫ細胞による１つ以上のグランザイムの発現は、ＭＫ細胞をがん細胞、例えば、本明細書に記載のがん細胞のいずれかに曝露することによって増加させることができる。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、パーフォリン（ＰＲＦ１）を発現する。パーフォリンは、細胞傷害性Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の顆粒にみられる孔形成細胞溶解性タンパク質である（Ｏｓｉｎｓｋａ Ｉ，Ｐｏｐｋｏ Ｋ，Ｄｅｍｋｏｗ Ｕ．Ｐｅｒｆｏｒｉｎ：ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｌａｙｅｒ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｎｔ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；３９（１）：１０９－１１５．ｄｏｉ：１０．５１１４／ｃｅｊｉ．２０１４．４２１３５）。ＭＫ細胞によるパーフォリンの発現は、ＭＫ細胞をがん細胞、例えば、本明細書に記載のがん細胞のいずれかに曝露することによって増加させることができる。上記の方法のいずれを使用しても、１つ以上のグランザイム及び／又はパーフォリンの発現を検出することができる。実施例１３及び１４の結果は、ＭＫ細胞の細胞傷害性における１つ以上のグランザイム及び／又はパーフォリンの少なくとも部分的な役割を示唆している。
【0067】
本発明のＭＫ細胞は、典型的には、がん細胞に対して細胞傷害効果を有することができる（すなわち、がん細胞を殺傷することができる）。本発明のＭＫ細胞の細胞傷害効果を有する能力は、当技術分野において公知の標準的なアッセイを用いて測定することができる。本発明は、好ましくは、クロム－５１（５１Ｃｒ）放出アッセイを使用するが、これは、ＭＫ細胞による溶解後にがん細胞などの細胞からの５１Ｃｒ放出を測定する。ＭＫ細胞は、以下及び実施例で論じる通り、がん細胞と共にインキュベートすることができる。また、本発明は、好ましくは、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）放出アッセイを使用する。好適ながんについては、より詳細に論じる。
【0068】
また、本発明のＭＫ細胞は、典型的には、細胞傷害性及びＮＫプライミング機能を促進する様々なサイトカイン及び他の分子を分泌する。サイトカイン及び他の分子は、当技術分野において公知の方法を使用して測定することができる。好適な方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。１つの具体的な方法は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）から市販されているＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイである。
【0069】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１、別名ＧＲＯａ）、（ｂ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）可溶性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒａ）、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６のうちの１つ以上を分泌する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルの（ａ）～（ｆ）の全てを分泌することができる。これら分子の検出可能な分泌は、上述の通り測定することができる。上記の（ａ）～（ｆ）の定義において、（ａ）～（ｆ）のうちの１つ以上の任意の組み合わせ及び順列が分泌され得る。例えば、（ａ）～（ｆ）の各定義について、ＭＫ細胞は、検出可能なレベルの（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ｆ）；（ａ）及び（ｂ）；（ａ）及び（ｃ）；（ａ）及び（ｄ）；（ａ）及び（ｅ）；（ａ）及び（ｆ）；（ｂ）及び（ｃ）；（ｂ）及び（ｄ）；（ｂ）及び（ｅ）；（ｂ）及び（ｆ）；（ｃ）及び（ｄ）；（ｃ）及び（ｅ）；（ｃ）及び（ｆ）；（ｄ）及び（ｅ）；（ｄ）及び（ｆ）；（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）；又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を分泌し得る。（ｉ）～（ｖｉｉ）の組み合わせは、このリストから独立して選択することができる。ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ＧＲＯａ、（ｂ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）ＩＬ－２受容体α鎖（ＩＬ－２Ｒａ）、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６を分泌する。
【0070】
ＣＸＣＬ１（別名：ＧＲＯａ）は、好中球を誘引することができるケモカインである（Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９０ Ｍａｙ １；１７１（５）：１７９７－１８０２）。ＭＫ細胞によるＧＲＯａの分泌は、ＴＮＦ－αによって増加する。
【0071】
ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進することができ（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ １９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６０（５１０７）：５４７－９）、ＮＫ細胞（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００１ Ｓｅｐ；１１４（３）：６６０－５）及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を高める（「プライミング」）ことができる炎症促進性サイトカインである。
【0072】
ＩＬ－２Ｒａは、ＩＬ－２受容体の可溶型である。ＩＬ－２に結合することによって、炎症促進効果を発揮することができる。例えば、マウスにおいてＴｈ１７応答の発生を強化することができる（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＥ，Ｍｏｏｒｅ ＡＣ，Ｆａｌｌｏｎ ＰＧ，Ｗａｌｓｈ ＰＴ（２０１２）Ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ－２Ｒα（ｓＣＤ２５）Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｈ１７ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１０）：ｅ４７７４８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７７４８）。ＭＫ細胞によるＬ－２Ｒａの分泌は、ＩＦＮ－γによって増加する。
【0073】
ＩＬ－８は、好中球走化性因子としても知られており、炎症領域で好中球を誘引し、活性化する（Ｂｉｃｋｅｌ，Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．１９９３ Ｍａｙ；６４（５ Ｓｕｐｐｌ）：４５６－６０）。ＭＫ細胞によるＩＬ－８の分泌は、ＩＦＮ－γによって減少し、ＴＮＦ－αによって増加する。
【0074】
可溶性ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬの可溶性細胞外ドメイン）は、ほとんどの正常細胞に影響を与えることなく、広範な腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することができる。例えば、可溶性ｔｒａｉｌの過剰発現は、ヒト肺腺がんにおいてアポトーシスを誘導し、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の成長を阻害する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：（５）．Ｍａｒｃｈ １，２００５）。
【0075】
ＩＬ－６は、一般的には、抗炎症性サイトカインであると考えられるが、活発な免疫応答中にリンパ球の活性化、増殖、及び生存を促進することもできる（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；２６（１）：３８－４７）。
【0076】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＩＬ－１５及び／又はＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮγ誘導タンパク質１０（ＩＰ－１０）としても知られている）を分泌する。ＭＫ細胞は、好ましくは、上述の（ａ）ＧＲＯａ、（ｂ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）ＩＬ－２Ｒａ、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６のうちの１つ以上と組み合わせて、ＩＬ－１５及び／又はＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）を検出可能なレベルで分泌する。これら分子の検出可能な分泌は、上述の通り測定することができる。
【0077】
ＩＬ－１５は、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞の増殖を刺激し、幹、セントラル、及びエフェクタメモリＣＤ８ Ｔ細胞を誘導し、そして、ＩＬ－１５及び関連分子を用いた臨床試験が開始されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０，２０１４ － Ｉｓｓｕｅ １２）。
【0078】
ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）は、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞の化学誘引、Ｔ細胞の内皮細胞への接着促進、抗腫瘍活性、並びに骨髄のコロニー形成及び血管新生の阻害に関与している（Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６８（７）：３１９５－２０４；及びＡｎｇｉｏｌｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１８２（１）：１５５－６２）。
【0079】
ＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのインターロイキン６（ＩＬ－６）、ＩＬ－８、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２；単球走化性タンパク質－１；ＭＣＰ－１）及びケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５；活性化時に制御され、正常Ｔ細胞が発現及び分泌する；ＲＡＮＴＥＳ）のうちの１つ以上を分泌する。ＭＫ細胞は、これら因子の任意の数及び組み合わせを分泌することができる。ＭＫ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを分泌する。
【0080】
本発明のＭＫ細胞は、検出可能なレベルの（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、（ｉｉ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、（ｉｉｉ）インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、（ｉｖ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、（ｖｉ）ＩＦＮ－γ、及び（ｖｉｉ）インターロイキン－１α（ＩＬ－１α）のうちの１つ以上を分泌することができる。これらマーカーの検出可能な分泌は、上述の通り測定することができる。
【0081】
上記の（ｉ）～（ｖｉｉ）の定義において、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの１つ以上の任意の組み合わせが分泌され得る。例えば、（ｉ）～（ｖｉｉ）の各定義について、ＭＫ細胞は、検出可能なレベルの（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｖｉ）；（ｖｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）及び（ｖ）；（ｉ）及び（ｖｉ）；（ｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）及び（ｖ）；（ｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉｉ）及び（ｖ）；（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ，）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及びｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉｉ）、ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及びｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）；又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）を分泌し得る。（ｉ）～（ｖｉｉ）の組み合わせは、このリストから独立して選択することができる。
【0082】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのＩＦＮ－γを分泌する。ＩＦＮ－γの発現又は分泌は、上記の方法を使用して求めることができる。
【0083】
以下でより詳細に論じる通り、ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞をプライミング／活性化する（すなわち、ＮＫ細胞の増殖及び／又は細胞傷害活性を高める）ことができる。
【0084】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、被験体における特定の組織に遊走することができる。言い換えれば、疾患（がんなど）を有する被験体に該細胞を投与したとき、該細胞は、必要な組織（複数可）に遊走又は帰巣することができる。該組織は、健常被験体に通常存在する組織であってよい。あるいは、該組織は、腫瘍であってもよい。このＭＫ細胞の遊走能力は有利であるが、その理由は、例えば静脈内などの標準的な経路を介して細胞を注入することができ、次いで、該細胞が疾患の部位を標的とすることを意味するためである。細胞を患部組織に送達しなくてもよい。
【0085】
特定の組織は、上述したもののうちのいずれであってもよい。これは、遊走だけでなく、以上及び以下で詳細に論じる接着、遊出、増殖、抗腫瘍効果、免疫調整効果、炎症促進効果、及び抗炎症効果にも当てはまる。
【0086】
本発明のＭＫ細胞の患部組織に遊走する能力は、当技術分野において公知の標準的なアッセイを用いて測定することができる。好適な方法としては、ゲノム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（レポータ遺伝子の有無にかかわらないＲＴ－ＰＣＲ）及び標識技術が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本発明のＭＫ細胞を、蛍光色素などの関心対象の色素で染色してもよく、そして、色素からのシグナルを介して被験体においてモニタリングすることができる。このような方法は、当技術分野において常用されている。
【0087】
遊走（又は帰巣）は、典型的には、損傷した組織に到達する細胞の数を測定することによって判定される。また、（損傷した組織ではなく）肺に蓄積している細胞の数を観察することによって間接的に測定することもできる。
【0088】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、被験体における特定の患部組織に接着することができる。接着及び接着アッセイは、当技術分野において公知である（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５２２：２０３－１０）。
【0089】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、血管内皮を通じて被験体の特定の患部組織に遊出することができる。遊出アッセイは当技術分野において公知である（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００８；４４３：１５５－１７６）。
【0090】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、炎症部位に免疫細胞を誘引又は化学誘引することができる。本発明のＭＫ細胞は、より好ましくは、がん又は腫瘍に免疫細胞を誘引又は化学誘引することができる。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、炎症、がん、又は腫瘍の部位への免疫細胞の遊走を誘導することができる。本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、炎症促進性である。好ましくは、これら誘引／化学誘引／炎症促進効果のいずれかを有するＭＫ細胞は、ＩＦＮ－γで処理されるか又は処理されている。免疫細胞の誘引／化学誘引／遊走を測定するために、細胞の遊走又は移動を測定するための上述の方法のいずれを使用してもよい。免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、若しくはＮＫ細胞などのリンパ球、好中球、又は単球／マクロファージであってよい。免疫細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞及び／又は免疫細胞である。
【0091】
本発明のＭＫ細胞は、好ましくは、自己である。言い換えれば、該細胞は、好ましくは、その細胞が投与される被験体に由来する。あるいは、ＭＫ細胞は、好ましくは、同種である。言い換えれば、該細胞は、好ましくは、異なる被験体／ドナー、又は細胞が投与される被験体と免疫学的に適合する被験体／ドナーに由来する。
【0092】
本発明のＭＫ細胞は、単離されていても、実質的に単離されていても、精製されていても、実質的に精製されていてもよい。ＭＫ細胞は、培養培地、本発明の他の細胞、又は他の細胞型などの任意の他の成分を完全に含まない場合、単離又は精製されている。ＭＫ細胞は、その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤、例えば培養培地と混合されている場合、実質的に単離されている。あるいは、本発明のＭＫ細胞は、後述する通り、成長マトリックス中に存在していてもよく、表面上に固定化されていてもよい。
【0093】
本発明のＭＫ細胞は、抗体ベースの技術を含む様々な技術を用いて単離することができる。細胞は、ＭＫ細胞上に存在する表面マーカーへのモノクローナル抗体の結合に基づく、陰性及び陽性選択技術を用いて単離することができる（上記参照）。従って、ＭＫ細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び磁気ビーズ分離を含む、任意の抗体ベースの技術を用いて分離することができる。
【0094】
以下でより詳細に論じるが、ＭＫ細胞は、エクスビボで処理してもよい。従って、細胞に治療又は診断剤をロード又はトランスフェクションし、次いで、本発明の方法において治療的に使用することができる。
【0095】
本発明の集団
また、本発明は、本発明のＭＫ細胞の集団を提供する。また、本発明は、本発明の２つ以上のＭＫ細胞の集団を提供する。ＭＫ細胞は、上に定義したもののうちのいずれであってもよい。任意の数の細胞が集団内に存在していてよい。本発明の集団は、少なくとも約５，０００個の細胞、例えば、少なくとも約６，０００個、少なくとも約７，０００個、少なくとも約８，０００個、少なくとも約９，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約３０，０００個、少なくとも約４０，０００個、少なくとも約５０，０００個、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約２００，０００個、又は少なくとも約２５０，０００個の細胞を含んでいてよい。本発明の集団は、好ましくは、少なくとも約５×１０５個の本発明のＭＫ細胞を含む。集団は、より好ましくは、少なくとも約１×１０６個、少なくとも約２×１０６個、少なくとも約２．５×１０６個、少なくとも約５×１０６個、少なくとも約１×１０７個、少なくとも約２×１０７個、少なくとも約５×１０７個、少なくとも約１×１０８個、又は少なくとも約２×１０８個の本発明のＭＫ細胞を含む。いくつかの例では、集団は、少なくとも約１．０×１０７個、少なくとも約１．０×１０８個、少なくとも約１．０×１０９個、少なくとも約１．０×１０１０個、少なくとも約１．０×１０１１個、又は少なくとも約１．０×１０１２個の本発明のＭＫ細胞、又は更にはそれ以上を含んでいてもよい。
また、本発明は、本発明のＭＫ細胞の集団を提供する。また、本発明は、本発明の２つ以上のＭＫ細胞の集団を提供する。ＭＫ細胞は、上に定義したもののうちのいずれであってもよい。任意の数の細胞が集団内に存在していてよい。本発明の集団は、少なくとも約５，０００個の細胞、例えば、少なくとも約６，０００個、少なくとも約７，０００個、少なくとも約８，０００個、少なくとも約９，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約３０，０００個、少なくとも約４０，０００個、少なくとも約５０，０００個、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約２００，０００個、又は少なくとも約２５０，０００個の細胞を含んでいてよい。本発明の集団は、好ましくは、少なくとも約５×１０５個の本発明のＭＫ細胞を含む。集団は、より好ましくは、少なくとも約１×１０６個、少なくとも約２×１０６個、少なくとも約２．５×１０６個、少なくとも約５×１０６個、少なくとも約１×１０７個、少なくとも約２×１０７個、少なくとも約５×１０７個、少なくとも約１×１０８個、又は少なくとも約２×１０８個の本発明のＭＫ細胞を含む。いくつかの例では、集団は、少なくとも約１．０×１０７個、少なくとも約１．０×１０８個、少なくとも約１．０×１０９個、少なくとも約１．０×１０１０個、少なくとも約１．０×１０１１個、又は少なくとも約１．０×１０１２個の本発明のＭＫ細胞、又は更にはそれ以上を含んでいてもよい。
【0096】
本発明のＭＫ細胞を含む集団は、本発明のＭＫ細胞に加えて他の細胞を含んでいてもよい。しかし、好ましくは、集団内の細胞の少なくとも約７０％は本発明のＭＫ細胞である。より好ましくは、集団内の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が本発明のＭＫ細胞である。好ましい実施形態では、集団内の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％がＭＫ細胞であり、上に定義した陽性ＭＫマーカーを発現し、上に定義した陰性ＭＫマーカーを発現しない。別の好ましい実施形態では、集団内の細胞の少なくとも約９０％がＭＫ細胞であり、上に定義した陽性ＭＫマーカーを発現し、上に定義した陰性ＭＫマーカーを発現しない。別の好ましい実施形態では、集団内の細胞の少なくとも約９５％がＭＫ細胞であり、上に定義した陽性ＭＫマーカーを発現し、上に定義した陰性ＭＫマーカーを発現しない。
【0097】
本発明は、また、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４及びＣＤ４５を発現する、本発明のＭＫ細胞の集団を提供する。これら集団では、集団内の細胞の約１５％超（又は上述の％のいずれか）が、本発明のＭＫ細胞が検出可能に発現すると上述した特定のマーカーを検出可能なレベルで発現し得る。同様に、約５％以下（又は上述の下方の％のいずれか）は、本発明のＭＫ細胞が検出可能には発現しないと上述した特定のマーカーを検出可能なレベルで発現し得る。これら集団は、上述の細胞数のうちのいずれかを含み得る。表１は、本発明の特定の集団を示す。
【0098】
【表1-1】
【0099】
【表1-2】
【0100】
【表1-3】
【0101】
上述の及び表１に示した集団では、好ましくは、集団内の細胞の約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％、又はが、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表１の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表１に示した集団では、より好ましくは、集団内の細胞の約６０％以上が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表１の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表１に示した集団では、より好ましくは、集団内の細胞の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％、又はそれ以上が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表１の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表１に示した集団では、集団内の細胞の約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表１の列３のマーカー）を発現し得る。
【0102】
本発明は、また、集団内の細胞の約１５％超が検出可能なレベルのＣＤ１６、ＣＤ９６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１７８、ＣＤ２５３、及びＣＤ２７７を発現し、集団内の細胞の約５％以下が検出可能なレベルのＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ５６を発現する、本発明のＭＫ細胞の集団を提供する。これら集団では、集団内の細胞の約１５％超（又は上述の％のいずれか）が、本発明のＭＫ細胞が検出可能に発現すると上述した特定のマーカーを検出可能なレベルで発現し得る。同様に、約５％以下（又は上述の下方の％のいずれか）は、本発明のＭＫ細胞が検出可能には発現しないと上述した特定のマーカーを検出可能なレベルで発現し得る。これら集団は、上述の細胞数のうちのいずれかを含み得る。表２は、本発明の特定の集団を示す。
【0103】
【表2-1】
【0104】
【表2-2】
【0105】
【表2-3】
【0106】
上述の及び表２に示した集団では、好ましくは、集団内の細胞の約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％、又はが、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表２の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表２に示した集団では、より好ましくは、集団内の細胞の約６０％以上が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表２の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表２に示した集団では、より好ましくは、集団内の細胞の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％、又はそれ以上が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表２の列２のマーカー）を発現する。上述の及び表２に示した集団では、集団内の細胞の約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルの関連マーカー（特に表２の列３のマーカー）を発現し得る。
【0107】
本発明はまた、ＭＫ細胞の特定の集団を提供する。本発明は、ＭＫ細胞の集団であって
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２１％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２１％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
【0108】
本発明はまた、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約５８％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２１％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下又は約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約５８％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２１％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下又は約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
【0109】
好ましくは、以下のうちの１つ以上、又はより好ましくは全てである：
－ 集団内の細胞の約１０％以下、例えば、約９％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約３２％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約２９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下、例えば、約１％以下又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下、例えば、約１％以下又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約１０％以下、例えば、約９％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約６０％以下、例えば、約５０％以下、約４６％以下、約３０％以下、又は約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約３％以下、例えば、約２％以下又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下、例えば、約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３３％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約５９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２２％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７２％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６％又は少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約８％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
－ 集団内の細胞の約１０％以下、例えば、約９％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約３２％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約２９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下、例えば、約１％以下又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下、例えば、約１％以下又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約１０％以下、例えば、約９％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約６０％以下、例えば、約５０％以下、約４６％以下、約３０％以下、又は約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約３％以下、例えば、約２％以下又は約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、又は約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下、例えば、約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３３％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約５９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２２％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７２％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６％又は少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約８％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
【0110】
好ましくは、集団内の細胞の約３％以下、例えば、約２．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する。
【0111】
本発明の特定の集団は、表１又は表２に示すマーカーの組み合わせのいずれかを参照して上記の通り定義することができる。
【0112】
また、本発明は、実施例３におけるＭＫ００２及びＭＫ００４に基づいて本発明の特定の集団を提供する。本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
【0113】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約６６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８６％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約６６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８６％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６２％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約６０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
【0114】
好ましくは、以下のうちの１つ以上、又はより好ましくは全てである：
－ 集団内の細胞の約９％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３２％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約９％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約４６％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約４５％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４０％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７２％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約８７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
－ 集団内の細胞の約９％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約８０％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３２％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約９％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約４６％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約４５％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約３％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４０％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７２％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約８７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
【0115】
本発明の特定の集団は、表１又は表２に示すマーカーの組み合わせのいずれかを参照して定義することができる。集団は、最も好ましくは、表７に示すＭＫ００２のマーカー発現パターンを有する。
【0116】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２７％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２７％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
【0117】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５８％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２７％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約５８％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２７％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９７％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約９３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
【0118】
好ましくは、以下のうちの１つ以上、又はより好ましくは全てである：
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１５％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約２０％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約１９％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２２％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞のうちの少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４８％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３５％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の約２．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２０％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１５％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の約２０％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約１９％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２２％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞のうちの少なくとも約５１％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４８％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３５％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の約２．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
【0119】
本発明の特定の集団は、表１又は表２に示すマーカーの組み合わせのいずれかを参照して定義することができる。集団は、最も好ましくは、表７に示すＭＫ００４のマーカー発現パターンを有する。
【0120】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９１％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６５％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８８％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９１％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約６５％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約８８％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
【0121】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約３４％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８３％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９１％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約６５％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約８８％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約３４％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８３％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約９１％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約６５％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約８８％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約９６％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約４．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
（ｃ）集団内の細胞の約１％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する集団を提供する。
【0122】
好ましくは、以下のうちの１つ以上、又はより好ましくは全てである：
－ 集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３９％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６％が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１６％が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１１％が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約２．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞のうちの少なくとも約７８％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７６％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約３４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
－ 集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４３％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３９％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４６％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約６％が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１６％が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５４％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約４％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１１％が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約２．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３７％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞のうちの少なくとも約７８％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約７６％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２１％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約４８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約３４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
【0123】
本発明の特定の集団は、表１又は表２に示すマーカーの組み合わせのいずれかを参照して定義することができる。集団は、最も好ましくは、表１１に示すＩＦＮ－γで処理されたＭＫ００４のマーカー発現パターンを有する。
【0124】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約３０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約７７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約８２％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約３０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約７７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約８２％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
且つ
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現する集団を提供する。
【0125】
本発明は、好ましくは、ＭＫ細胞の集団であって、
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約４５％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約３０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約７７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８２％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
且つ
集団内の細胞の約１０％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤＣＤ５６を発現する集団を提供する。
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも約１６％が、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約４５％が、検出可能なレベルのＣＤ９６を発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約２３％が、検出可能なレベルのＣＤ１１２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも約７９％が、検出可能なレベルのＣＤ１３７Ｌを発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも約３０％が、検出可能なレベルのＣＤ１７８を発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも約７７％が、検出可能なレベルのＣＤ２５３を発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも約８２％が、検出可能なレベルのＣＤ２７７を発現し、
（ａ）集団内の細胞の約０．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ３４を発現し、
（ｂ）集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ４５を発現し、
且つ
集団内の細胞の約１０％以下が、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する、又は集団内の細胞の少なくとも約１０％が、検出可能なレベルのＣＤＣＤ５６を発現する集団を提供する。
【0126】
好ましくは、以下のうちの１つ以上、又はより好ましくは全てである：
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１２％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５２％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１９％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１１％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５２％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３９％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３１％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１２％が、検出可能なレベルのＣＤ２５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５２％が、検出可能なレベルのＣＤ１３６を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１９％が、検出可能なレベルのＣＤ１８３を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１１％が、検出可能なレベルのＣＤ２０５を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ３３２を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０２を発現する；
－ 集団内の細胞の約５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１２７を発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１０４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１２６を発現する；
－ 集団内の細胞の約１．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｅを発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｌを発現する；
－ 集団内の細胞の約２％以下が、検出可能なレベルのＣＤ６２Ｐを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約２４％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｄを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約１８％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｉを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約５２％が、検出可能なレベルのＣＤ１６０を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３９％が、検出可能なレベルのＣＤ３１４を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３１％が、検出可能なレベルのＣＤ３３７を発現する；
－ 集団内の細胞の約３．５％以下が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ｃを発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｂ２を発現する；
－ 集団内の細胞の少なくとも約３３％が、検出可能なレベルのＣＤ１５８ｆを発現する；及び
－ 集団内の細胞の少なくとも約９％が、検出可能なレベルのＣＤ１５９ａを発現する。
【0127】
本発明の特定の集団は、表１又は表２に示すマーカーの組み合わせのいずれかを参照して定義することができる。集団は、最も好ましくは、表１１に示すＴＮＦ－αで処理されたＭＫ００４のマーカー発現パターンを有する。
【0128】
上述の集団のいずれにおいても、好ましくは、集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、（ａ）ＣＤ４５ＲＡ、（ｂ）ＣＤ４５ＲＢ、及び（ｃ）ＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を発現する。
【0129】
上述のいずれの集団においても、好ましくは、集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、例えばその表面上においてＣＤ１４０ａを発現する。上述した集団のいずれにおいても、好ましくは、集団内の細胞の約５％以下、例えば、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下が、（ｉ）ＣＤＨ６、（ｉｉ）ＣＤ１２９、（ｉｉｉ）ＣＤ２００、及び（ｉｖ）ＣＤ２７１のうちの１つ以上、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を発現する。
【0130】
これら好ましい集団内の細胞は、検出可能なレベルの本発明のＭＫに関して上述したマーカーのいずれかを更に発現し得る。これら好ましい集団内の細胞は、上述したＭＫ細胞の有利な特性のいずれかを有し得る。
【0131】
特定のマーカーを発現している細胞の％に関して集団を定義する上記実施形態のいずれにおいても、集団は、好ましくは、少なくとも約５，０００個の細胞、例えば、少なくとも約６，０００個、少なくとも約７，０００個、少なくとも約８，０００個、少なくとも約９，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約３０，０００個、少なくとも約４０，０００個、少なくとも約５０，０００個、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約２００，０００個、少なくとも約２５０，０００個、又は少なくとも約５００，０００個の細胞を含む。該集団は、より好ましくは、少なくとも約５０００個の細胞、少なくとも約５０，０００個の細胞、又は少なくとも約２５０，０００個の細胞を含む。これら集団は、上述した細胞数のいずれかを含み得る。
【0132】
本発明の集団はいずれも、好ましくは、検出可能なレベルの（ａ）ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１、別名ＧＲＯａ）、（ｂ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）可溶性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒａ）、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６のうちの１つ以上を分泌する。ＭＫ細胞は、検出可能なレベルの上述した（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせ及び順列を分泌し得る。本発明の集団はいずれも、好ましくは、検出可能なレベルのＩＬ－１５及び／又はＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）を分泌する。該集団は、好ましくは、上述の（ａ）ＧＲＯａ、（ｂ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、（ｃ）ＩＬ－２Ｒａ、（ｄ）ＩＬ－８、（ｅ）可溶性ＴＲＡＩＬ、及び（ｆ）ＩＬ－６のうちの１つ以上と組み合わせて、ＩＬ－１５及び／又はＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）を検出可能なレベルで分泌する。
【0133】
本明細書において開示される細胞のいずれの集団も、使用前に他の細胞で希釈してもよい。例えば、該集団を、被験体の血液、ＭＮＣ、ＭＳＣ、ＮＫ細胞、ＰＭＬ、ｉＭＰ細胞、ｉｏＭＰ細胞、又はこれらの組み合わせと組み合わせてよい。
【0134】
本発明の集団は、上述の通り療法に有利である。本発明の安全なＭＫ細胞を多数含む集団を生成する能力は、本発明の重要な利点の１つである。本発明は、関心対象の組織に効率的に遊走し、そこに到着したら抗腫瘍効果を有することができる細胞の集団で被験体を治療することを可能にする。これにより、低用量の細胞を使用することができるようになり、ＣＡＲ－Ｔ細胞に関連する副作用及び体積関連副作用が回避される。
【0135】
本発明の集団は、好ましくは、相同である。言い換えれば、集団内のｉＭＰ細胞は全て、好ましくは、遺伝子型及び表現型が同一である。該集団は、好ましくは、上に定義した通り自己又は同種である。
【0136】
しかし、該集団は、半同種であってもよい。半同種の集団は、典型的には、２人以上の被験体からのＭＮＣから生成される。言い換えれば、集団内の細胞は全て、好ましくは、遺伝的に同一又は十分に遺伝的に同一である。本発明のＭＫ細胞は被験体に由来し得るので、治療される被験体に対して自己であり得る。
【0137】
本発明の集団は、単離されていても、実質的に単離されていても、精製されていても、実質的に精製されていてもよい。集団は、培養培地及び他の細胞などの任意の他の成分を完全に含まない場合、単離又は精製されている。集団は、その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤、例えば培養培地と混合されている場合、実質的に単離されている。他の担体及び希釈剤については、以下でより詳細に論じる。実質的に単離又は実質的に精製されている集団は、本発明のＭＫ細胞以外の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の集団は、後述する通り、成長マトリックス中に存在していてもよく、表面上に固定化されていてもよい。
【0138】
該集団は、典型的には、インビトロで培養される。細胞を培養するための技術は、当業者に周知である。細胞は、血清を含まない培地中、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養してよい。細胞は、好ましくは、以下でより詳細に論じる通り、低酸素条件下で血小板溶解物と共に培養される。細胞は、標準的な６ウェルプレートなどのフラットプレートのウェルを含む、任意の好適なフラスコ又は容器で培養してよい。このようなプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ、Ｎｕｎｃ、Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ、又はＦａｌｃｏｎから市販されている。ウェルは、典型的には、約１ｍＬ～約４ｍＬの容量を有する。
【0139】
集団を収容又は培養するフラスコ、容器、又はウェルは、ＭＫ細胞の取り扱いを容易にするために改造してもよい。例えば、フラスコ、容器、又はウェルは、細胞の培養を容易にするために、例えば、成長マトリックスを含むように改造してもよい。フラスコ、容器、又はウェルは、ＭＫ細胞の付着を可能にするため又はＭＫ細胞の表面への固定化を可能にするために改造してもよい。ラミニン若しくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、又は細胞に結合し、該細胞を表面（複数可）上に固定化若しくは捕捉する任意の他の捕捉分子で、１つ以上の表面をコーティングしてもよい。
【0140】
集団は、本明細書に記載の技術のいずれかを用いてエクスビボで改変することができる。例えば、集団に治療又は診断剤をトランスフェクト又はロードしてよい。次いで、以下でより詳細に論じる治療の方法において該集団を使用することができる。
【0141】
本発明のＭＫセルの生成方法
また、本発明は、本発明の集団を生成する方法を提供する。該方法は、単核細胞（ＭＮＣ）のｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下でＭＮＣを培養することを含む（工程（ａ））。この工程は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）に開示されている。次いで、該方法は、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、ｉＭＰ細胞を培養することを含む（工程（ｂ））。ＭＫ細胞は、本発明の細胞に関して上述したマーカー発現プロファイルを有する。該細胞は、（実施例に開示されているものなどの）通常の技術を用いて収集し、冷凍又は直ちに使用してよい。
また、本発明は、本発明の集団を生成する方法を提供する。該方法は、単核細胞（ＭＮＣ）のｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下でＭＮＣを培養することを含む（工程（ａ））。この工程は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）に開示されている。次いで、該方法は、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、ｉＭＰ細胞を培養することを含む（工程（ｂ））。ＭＫ細胞は、本発明の細胞に関して上述したマーカー発現プロファイルを有する。該細胞は、（実施例に開示されているものなどの）通常の技術を用いて収集し、冷凍又は直ちに使用してよい。
【0142】
単核細胞（ＭＮＣ）及びその単離方法は、当技術分野において公知である。ＭＮＣは、好ましくは、骨髄から単離された初代ＭＮＣである。ＭＮＣは、好ましくは、リンパ球、単球、及び／又はマクロファージなどの末梢血ＭＮＣ（ＰＢＭＣ）であってよい。ＭＮＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）などの親水性多糖類を用いて、骨髄又は血液から単離することができる。例えば、実施例で開示する通り、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）（市販されているの密度培地）を用いてＭＮＣを単離してもよい。
【0143】
方法の全ての工程において、細胞は、血清を含まない培地中、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養される。
【0144】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）に記載の通り、工程（ａ）では、ＭＮＣは、典型的には、表５に列挙されている成分を有するヌクレオシドを含まない最小必須培地（ＭＥＭ）Ａｌｐｈａ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：３２５６１－１０２）中で培養されて、ｉＭＰ細胞を形成する。ＭＥＭは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な供給源から市販されている。工程（ａ）は、好ましくは、単核細胞（ＭＮＣ）のｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下で、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まない培養培地中でＭＮＣを培養することを含む。リボヌクレオシド及びデキソイリボヌクレオシドは、後述するもののうちのいずれであってもよい。
【0145】
工程（ａ）における培地は、好ましくは、ヘパリン及び／又はペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）を更に含む。工程（ａ）における培地には、血小板溶解物が補給される。工程（ａ）は、好ましくは、単核細胞（ＭＮＣ）のｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下で、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まず、血小板溶解物を含む培養培地中でＭＮＣを培養することを含む。リボヌクレオシド及びデキソイリボヌクレオシドは、後述するもののうちのいずれであってもよい。血小板溶解物とは、血小板の溶解を通じて放出された、血小板に含有されている天然成長因子の組み合わせを指す。溶解は、化学的手段（すなわち、ＣａＣｌ２）、浸透圧的手段（蒸留水の使用）、又は凍結／解凍の手順を通して達成することができる。血小板溶解物は、米国特許第５，１９８，３５７号に記載の通り全血由来であってよい。血小板溶解物は、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５２９１１号（国際公開第２０１３／０７６５０７号として公開）に記載の通り調製される。血小板溶解物は、好ましくは、各凍結相で液体窒素を用いて４回の凍結／解凍サイクルによって調製される。血漿溶解物は、好ましくは、ヒト血漿溶解物である。培地は、好ましくは、約２０体積％以下、例えば、約１５体積％以下、又は約１０体積％以下の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、約５体積％～約２０体積％、例えば、約１０体積％～約１５体積％の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、約１０体積％の血小板溶解物を含む。
【0146】
本発明の方法の工程（ａ）は、典型的には、ＭＮＣのｉＭＰ細胞への分化を誘導するのに十分な時間、ＭＮＣを培養することを含む。十分な時間は、典型的には約１５～約２５日間、好ましくは約１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、又は２４日間である。約８日間後に細胞を継代し、培地を交換してよい。細胞がほぼコンフルエントになったとき、更に約４日間、５日間、又は６日間後に、細胞を再び継代し、培地を交換してよい（合計約１２日間、１３日間、１４日間）。次いで、ほぼコンフルエントになったときの約６日間、７日間、又は８日間後に、ｉＭＰ細胞を収集してよい（合計約１８～２２日間）。
【0147】
工程（ａ）は、典型的には、ＭＫ細胞を接着させる条件下でＭＮＣを培養することを含む。細胞を接着させる様々なサイズの培養フラスコ、並びに６、１２、２４、及び９６ウェルのプレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、及びＧｒｅｉｎｅｒ（登録商標）などの様々な供給源から市販されている。
【0148】
工程（ａ）では、ＭＮＣは、好ましくは、低酸素条件下で培養される。低酸素条件とは、大気中に２０．９５％未満の酸素が存在することを意味する。ＭＮＣは、好ましくは、約２０．５％未満の酸素（Ｏ２）、例えば、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％の酸素（Ｏ２）で培養される。ＭＮＣは、約０％～約１９％のＯ２、例えば、約１％～約１５％のＯ２、約２％～約１０％のＯ２、又は約５％～約８％のＯ２で培養してよい。ＭＮＣは、最も好ましくは、約１６％～約１９％のＯ２で培養される。上に引用した％酸素（又は％Ｏ２）の数値は、培養中のインキュベータ内の気体中の酸素の体積％に関する。該方法は、典型的には、細胞に能動的に酸素を供給しないインキュベータ内で行われる。インキュベータによって能動的に酸素が供給されないとしても、大気由来の酸素は依然として存在する。これは、典型的には、約１６～約１９％である。該方法は、約１６％～約１９％の酸素（Ｏ２）で細胞を培養することを含み得る。更に酸素レベルを下げるために、専用の低酸素インキュベータが利用可能である。
【0149】
工程（ａ）では、ＭＮＣは、最も好ましくは、血小板溶解液の存在下且つ低酸素条件下でＭＮＣを培養される。
【0150】
工程（ａ）では、ＭＮＣがｉＭＰ細胞に分化する。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号）に記載されている。ｉＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＭＩＣ Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３（スフィンゴシン－１－リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体１型；ＣＸＣＲ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）、ＣＸＣＲ２、及びＣＤ１２６を発現する。また、ｉＭＰ細胞は、典型的には、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２７１を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５を発現しない。血小板溶解物、接着、及び低酸素のいずれか、好ましくは全てを含む、上述した工程（ａ）の培養条件いずれかを用いて、ＭＮＣをｉＭＰ細胞に分化させることができる。
【0151】
工程（ｂ）では、該方法は、好ましくは、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することを更に含む。１つ以上のリボヌクレオシドは、好ましくは、（ｉ）アデノシン、（ｉｉ）シチジン、（ｉｉｉ）グアノシン、及び（ｉｖ）ウリジンのうちの１つ以上である。１つ以上のデオキシリボヌクレオシドは、好ましくは、１つ以上の（ｉ）２’デオキシアデノシン、（ｉｉ）２’デオキシシチジンＨＣｌ、（ｉｉｉ）２’デオキシグアノシン、及び（ｉｖ）チミジンである。いずれの場合も、培養培地は、（ｉ）～（ｉｖ）の任意の数及び組み合わせ、例えば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含んでいてよい。培養培地は、好ましくは、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、２’デオキシアデノシン、２’デオキシシチジンＨＣｌ、２’デオキシグアノシン、及びチミジンを含む。工程（ｂ）における培養培地は、好ましくは、Ｌ－グルタミンを更に含み、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含まない。
【0152】
工程（ｂ）では、該方法は、より好ましくは、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、表６に列挙する成分を含み、血小板溶解物を含む培地中で、ｉＭＰ細胞を培養することを更に含む。表６に列挙する成分を含む培地は、好ましくは、実施例で使用するヌクレオシドを含むＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）である。
【0153】
工程（ｂ）は、典型的には、約６日間、７日間、又は８日間かかる。ＭＫ細胞は、ほぼコンフルエントになったら、収集してよい。工程（ａ）及び（ｂ）は、典型的には、おおよそ、合計約２４～約３０日間、例えば約２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、又は２９日間かかる。工程（ｂ）は、ＭＫ細胞を約６日間、７日間、又は８日間培養し、ＭＫ細胞を継代（再播種）し、更に約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、又は８日間培養することを含んでいてよい。この例では、工程（ａ）及び（ｂ）は、典型的には、おおよそ、合計約２４～約３４日間、例えば約２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、又は３３日間かかる。
【0154】
工程（ａ）について上述した血小板溶解物及び低酸素条件に関する実施形態はいずれも、工程（ｂ）にも同様に適用される。工程（ｂ）で使用される血小板溶解物は、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５２９１１号（国際公開第２０１３／０７６５０７号として公開）に記載の通り調製される。血小板溶解物は、好ましくは、各凍結相で液体窒素を用いて４回の凍結／解凍サイクルによって調製される。工程（ｂ）における培地は、好ましくは、ヘパリン及び／又はペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）を更に含む。
【0155】
工程（ｂ）は、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培地に補給することを更に含んでいてもよい。約１００ｕｇ／ｍＬ～約１０００ｕｇ／ｍＬなどの任意の量のＩＦＮ－γを使用してよい。培地には、好ましくは、５００ｕｇ／ｍＬを補給する。約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬなどの任意の量のＴＮＦ－αを使用してよい。培地には、好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬを補給する。工程（ｂ）は、好ましくは、２４時間／１日間、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培地に補給することを更に含む。工程（ｂ）は、より好ましくは、２４時間／１日間、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培地に補給し、次いで、ＭＫ細胞を収集する前に２日間、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培養培地から除去することを更に含む。例えば、工程（ｂ）が約６日間かかる場合、好ましくは、４日目にＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培養培地に補給し、５及び６日目にＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを除去することを含む。工程（ｂ）が、ＭＫ細胞を約６日間培養し、ＭＫ細胞を継代（再播種）し、更に６日間培養することを含む場合、好ましくは、１０日目にＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを培養培地に補給し、１１及び１２日目にＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを除去することを含む。当業者であれば、この概念を上述の工程（ｂ）の他のタイミングにも適用することができる。
【0156】
また、本発明は、工程（ｂ）のみを含む、本発明のＭＫ細胞の集団を生成する方法を提供する。該方法は、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させてＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することを含む。上述の全ての実施形態がこの方法にも同様に適用される。
【0157】
上述の議論から明らかである通り、本発明の方法は、臨床的に関連する条件、すなわち、微量の内毒素、並びにリポ多糖類、リポペプチド、及びペプチドグリカンなどの他の環境汚染物質の非存在下で実施される。このことから、本発明のＭＫ細胞は、被験体への投与に特に適したものになる。
【0158】
ＭＮＣは、好ましくは、被験体又は同種ドナーから得られる。本発明は、また、被験体への投与に好適な本発明の集団を生成する方法であって、（ａ）該被験体から得られたＭＮＣを、該ＭＮＣのｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下で培養することと、（ｂ）低酸素条件下、及び該ｉＭＰ細胞を接着させて、該被験体に投与するのに好適なＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することと、を含む方法を提供する。また、本発明は、被験体への投与に好適な本発明の集団を生成する方法であって、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させて、該被験体に投与するのに好適なＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該被験体に由来するｉＭＰ細胞を培養することを含む方法を提供する。集団は、被験体に対して自己であり、従って、移植の際に拒絶されない。本発明は、また、被験体への投与に好適であり、この方法で生成される本発明の集団を提供する。
【0159】
あるいは、本発明は、また、被験体への投与に好適な本発明の集団を生成する方法であって、（ａ）異なる被験体から得られたＭＮＣを、該ＭＮＣのｉＭＰ細胞への分化を誘導する条件下で培養することと、（ｂ）低酸素条件下、及び該ｉＭＰ細胞を接着させて、該被験体に投与するのに好適なＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、該ｉＭＰ細胞を培養することと、を含む方法を提供する。また、本発明は、被験体への投与に好適な本発明の集団を生成する方法であって、低酸素条件下、及びｉＭＰ細胞を接着させて、該被験体に投与するのに好適なＭＫ細胞に分化させる条件下において、１つ以上のリボヌクレオシド、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、及び血小板溶解物を含む培地中で、異なる被験体に由来するｉＭＰ細胞を培養することを含む方法を提供する。集団は、被験体と同種になる。同種の中胚葉細胞がヒト被験体において安全であるという十分な証拠が存在する（Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｎ；９（３）：２０２－１３）。本発明は、また、被験体への投与に好適であり、この方法で生成される本発明の集団を提供する。
【0160】
インビトロ法
本発明のＭＫ細胞又は集団は、免疫細胞の活性を制御するインビトロ法において使用することができる。具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビトロ法であって、ＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団と共にＮＫ細胞の集団をインキュベートすることを含む方法を提供する。該方法は、好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高める。細胞傷害性を測定する方法は、上に開示されている。該方法は、ＮＫ細胞の増殖を更に増加させることができる。言い換えれば、プライミングは、好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害性及び／又は増殖を増加させることを含む。ＮＫ細胞の活性は、インキュベーション中又は後に評価してよい。
本発明のＭＫ細胞又は集団は、免疫細胞の活性を制御するインビトロ法において使用することができる。具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビトロ法であって、ＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団と共にＮＫ細胞の集団をインキュベートすることを含む方法を提供する。該方法は、好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高める。細胞傷害性を測定する方法は、上に開示されている。該方法は、ＮＫ細胞の増殖を更に増加させることができる。言い換えれば、プライミングは、好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害性及び／又は増殖を増加させることを含む。ＮＫ細胞の活性は、インキュベーション中又は後に評価してよい。
【0161】
該方法は、ＭＫ細胞及びＮＫ細胞を、インターロイキン－１８（ＩＬ－８）などのＮＫ細胞をプライミング／活性化する剤と共にインキュベートすることを更に含んでいてもよい。他のこのような剤は、当技術分野において公知である。
【0162】
ＮＫ細胞の集団は、本発明のＭＫ細胞に関して上述した数のいずれかを含む、任意の数のＮＫ細胞を含んでいてよい。
【0163】
ＮＫ細胞は、典型的には、顆粒リンパ球である。これは、標準的な顕微鏡観察技術を用いて判定することができる。ＮＫ細胞は、典型的には、直径約１０～約３０μｍ、例えば直径約１４～約２０μｍである。
【0164】
ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、低いが検出可能なレベルのＣＤ５６を発現する（ＣＤ５６ｄｉｍとしても知られている）。ＮＫ細胞は、その表面において、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現し得る（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔとしても知られている）。
【0165】
ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、検出可能なレベルのＣＤ１６を発現する（ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔとしても知られている）。ＮＫ細胞は、その表面において低いが検出可能なレベルのＣＤ１６を発現し得る（ＣＤ１６ｄｉｍとしても知られている）。
【0166】
ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、検出可能なレベルのＣＤ３を発現しない（ＣＤ３－としても知られている）。
【0167】
ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、検出可能なレベルのＴＣＲを発現しない（ＴＣＲ－としても知られている）。ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、検出可能なレベルのＴＣＲαβを発現しない。ＮＫ細胞は、好ましくは、その表面において、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現しない。
【0168】
ＮＫ細胞は、好ましくは、ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔであり、より好ましくは、ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ３－／ＴＣＲ－である。
【0169】
ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１６ｄｉｍ、より好ましくはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１６ｄｉｍ／ＣＤ３－／ＴＣＲ－であってよい。
【0170】
また、ＮＫ細胞は、典型的には、その表面において、検出可能なレベルの１つ以上の活性化受容体を発現する。活性化受容体は、感染又は形質転換した細胞上に存在する標的リガンドに結合し、ＮＫ細胞を活性化する。本発明の状況では、これら受容体を通じたＮＫ細胞の活性化は、細胞の増殖及び／又は細胞の細胞傷害活性の増加に対応し得る。これらはいずれも、当技術分野において標準的な方法を用いて測定することができる。活性化受容体は、標的リガンドに結合したときなどに、ＮＫ細胞の増殖及び／又は細胞傷害活性を刺激又は増加させることができる。以下の表３に、ＮＫ細胞が発現し得る１つ以上の活性化受容体及びその標的リガンドをまとめる。
【0171】
【表3】
【0172】
ＮＫ細胞は、その表面において、これら活性化受容体の任意の数及び任意の組み合わせを検出可能なレベルで発現し得る。この状況において、検出可能なレベルとは、ＮＫ細胞集団の５％超が関連受容体を発現することを意味する。
【0173】
また、ＮＫ細胞は、典型的には、その表面において、検出可能なレベルの１つ以上の抑制受容体を発現する。抑制受容体は、その標的リガンドに結合したとき、ＮＫ細胞の活性化を抑制する。以下の表４に、ＮＫ細胞が発現し得る１つ以上の抑制受容体及びその標的リガンドをまとめる。
【0174】
【表4】
【0175】
ＮＫ細胞は、その表面において、これら抑制受容体の任意の数及び任意の組み合わせを検出可能なレベルで発現し得る。この状況において、検出可能なレベルとは、ＮＫ細胞集団の５％超が関連受容体を発現することを意味する。
【0176】
ＮＫ細胞は、好ましくは、ヒトである。ＮＫ細胞は、上述の動物のいずれに由来してもよい。ヒトＮＫ細胞は、典型的には、ヒト被験体に由来する。ヒトＮＫ細胞は、任意の方法で得ることができる。ヒトＮＫ細胞は、ヒト被験体の末梢血から単離することができる。これを行う方法は、当技術分野において公知である。例えば、末梢血から白血球細胞／白血球を単離し、その表面上のマーカーに基づいてＮＫ細胞を単離又は選択してよい。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ３－などの上述のマーカーのいずれを使用してもよい。末梢血から単離された白血球細胞／白血球は、免疫磁気ビーズセレクションに供してよい。
【0177】
ＮＫ細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞から生成され得る。ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、末梢血又は骨髄から単離することができる。あるいは、ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから市販されている。ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）を用いてＮＫ細胞に分化させることができる。
【0178】
ＮＫ細胞は、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来していてよい。このような細胞は、多能性を誘導するために使用した１つ以上の転写因子の存在に基づいて同定することができる。このような転写因子としては、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｎ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、及びＧｌｉｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞は、このような転写因子を送達するために使用される機構の証拠も含み得る。
【0179】
ＮＫ細胞は、自己であってもよい。言い換えれば、該細胞は、その細胞が投与される被験体に由来していてよい。ＮＫ細胞は、好ましくは、同種である。言い換えれば、該細胞は、好ましくは、異なる対象に由来する。自己ＮＫ細胞又は同種ＮＫ細胞のヒト被験体への投与は、文書で十分に裏付けられている。
【0180】
次いで、単離されたＮＫ細胞を、当技術分野において公知の方法を用いてインビトロで培養してよい。インターロイキン２（ＩＬ－２）を使用して、ＮＫ細胞の分化及び増殖を誘導することができる。また、抗ＣＤ３抗体を使用して、インビトロにおいてＩＬ－２に駆動されるＮＫ細胞の増幅を増加させることができる。従って、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及び任意で抗ＣＤ３抗体を含む培地で培養してよい。このような抗体は、当業者であれば入手可能である。培地は、ＩＬ－１５を更に含んでいてもよい。培地は、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のうちの１つ以上を更に含んでいてもよい。
【0181】
ＮＫ細胞は、追加のシグナルを提供して増殖を促進するためにアクセサリ細胞と共に培養してもよい。好適なアクセサリ細胞としては、放射線照射したＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様細胞、ＨＦＷＴ（ウィルムス腫瘍由来の細胞株）、及びＢＣＲ－ＡＢＬ１慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ６５２が挙げられるが、これらに限定されはない。
【0182】
ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ－９２（Ｇｏｎｇ；ＪＨ，Ｍａｋｉ；Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ；ＨＧ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＮＫ－９２）ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｖｏｌ．８ Ｉｓｓｕｅ ４，１９９４，ｐ．６５８－６５８）又はＫＨＹＧ－１（Ｙａｇｉｔａ；Ｍ，Ｈｕａｎｇ；ＣＬ，Ｕｍｅｈａｒａ；Ｈ，Ｍａｔｓｕｏ；Ｙ，Ｔａｂａｔａ；Ｒ，Ｍｉｙａｋｅ；Ｍ，Ｋｏｎａｔａ；Ｙ，Ｔａｋａｔｓｕｋｉ；Ｋ，Ａ ｎｏｖｅｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＫＨＹＧ－１）ｆｒｏｍ ａ ｓｕｂｊｅｃｔ ｗｉｔｈ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｐ５３ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｖｏｌ．１４ Ｉｓｓｕｅ ５，２０００，ｐ．９２２－９３０）であってよい。
【0183】
ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、任意の期間インキュベートしてよい。期間は、約３０秒間～約３日間のいずれであってもよい。例えば、期間は、約３０秒間、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１日間、約２日間、又は約３日間であってよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、好ましくは、１日間インキュベートされる。
【0184】
ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）のインサートを挟んでインキュベートしてもよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、ＭＫ細胞培養培地（上記参照）又はＮＫ細胞培養培地（上記参照）中で培養してもよい。
【0185】
プライミングされたＮＫ細胞
また、本発明は、本発明を用いてプライミング／活性化されたＮＫ細胞の集団を提供する。プライミングされたＮＫ細胞は、活性が高まる。好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が高まる。これを測定する方法は、上に開示されている。ＮＫ細胞の増殖も増加し得る。ＮＫ細胞は、上に論じたもののうちのいずれであってもよい。プライミングされたＮＫ細胞の集団は、本発明のＭＫ細胞に関して上述した数のいずれかを含む、任意の数のＮＫ細胞を含んでいてよい。
また、本発明は、本発明を用いてプライミング／活性化されたＮＫ細胞の集団を提供する。プライミングされたＮＫ細胞は、活性が高まる。好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が高まる。これを測定する方法は、上に開示されている。ＮＫ細胞の増殖も増加し得る。ＮＫ細胞は、上に論じたもののうちのいずれであってもよい。プライミングされたＮＫ細胞の集団は、本発明のＭＫ細胞に関して上述した数のいずれかを含む、任意の数のＮＫ細胞を含んでいてよい。
【0186】
インビボ法
本発明のＭＫ細胞又は集団は、免疫細胞の活性を制御するインビボ法において使用することができる。具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビボ法であって、被験体におけるＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団又はＭＫ細胞の集団を含む本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。細胞の用量、医薬組成物、及び投与経路については、以下でより詳細に論じる。
本発明のＭＫ細胞又は集団は、免疫細胞の活性を制御するインビボ法において使用することができる。具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の集団をプライミングするインビボ法であって、被験体におけるＮＫ細胞の活性を高める条件下で、本発明のＭＫ細胞の集団又はＭＫ細胞の集団を含む本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。細胞の用量、医薬組成物、及び投与経路については、以下でより詳細に論じる。
【0187】
ＮＫ細胞は、被験体から抽出し、上述の通り単離することができる。該方法は、好ましくは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高める。これを測定する方法は、上に開示されている。該方法は、ＮＫ細胞の増殖を増加させることができる。
【0188】
医薬組成物及び投与
本発明は、更に、（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。ＭＫ細胞の集団は、上に論じたもののうちのいずれであってもよい。医薬組成物は、ＮＫ細胞の集団を更に含んでいてもよい。ＮＫ細胞は、上述したプライミングされていないＮＫ細胞の集団又は本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団を含む、上述したもののうちのいずれであってもよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、いかなる比率で存在していてもよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、好ましくは、約１：約１などのほぼ等しい比率で存在する。また、約１：約２、約１：約３、約１：約５、約１：約１０、約１：約２０、約１：約５０、約１：約１００、又はそれ以上を含むがこれらに限定されない他の比率も本発明により想定される。好適な細胞数については、上述及び後述する。
本発明は、更に、（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。ＭＫ細胞の集団は、上に論じたもののうちのいずれであってもよい。医薬組成物は、ＮＫ細胞の集団を更に含んでいてもよい。ＮＫ細胞は、上述したプライミングされていないＮＫ細胞の集団又は本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団を含む、上述したもののうちのいずれであってもよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、いかなる比率で存在していてもよい。ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、好ましくは、約１：約１などのほぼ等しい比率で存在する。また、約１：約２、約１：約３、約１：約５、約１：約１０、約１：約２０、約１：約５０、約１：約１００、又はそれ以上を含むがこれらに限定されない他の比率も本発明により想定される。好適な細胞数については、上述及び後述する。
【0189】
本発明は、また、（ａ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団と、（ｃ）薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。プライミングされたＮＫ細胞の集団は、上述したもののうちのいずれであってもよい。医薬組成物は、本発明のＭＫ細胞の集団を更に含んでいてもよい。細胞は、上述のいかなる比率で存在していてもよい。
【0190】
本発明の様々な組成物は、任意の好適な方法で製剤化してよい。薬学分野における常法を使用して、標準的な薬学的に許容し得る担体及び／又は賦形剤を用いて細胞の製剤化を行うことができる。製剤の正確な性質は、投与される細胞及び所望の投与経路を含むいくつかの要因に依存する。好適な種類の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに十分に記載されている。
【0191】
細胞は、いかなる経路で投与してもよいように製剤化してよい。好適な経路としては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、心内膜心筋、心筋外膜、心室内、冠動脈内、逆行冠静脈洞、動脈内、心膜内、骨内、又は肺内の経路が挙げられるが、これらに限定されない。また、肝臓、腎臓、又は肺の組織などの関心対象の組織に直接細胞を投与してもよい。腫瘍に直接細胞を投与してもよい。
【0192】
組成物は、生理学的に許容し得る担体又は希釈剤と一緒に調製してもよい。典型的には、このような組成物は、細胞の液体懸濁液として調製される。細胞は、薬学的に許容し得、且つ活性成分と適合する賦形剤と混合してもよい。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールなど、及びこれらの組み合わせである。
【0193】
更に、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又は有効性を強化するアジュバントなどの補助物質を微量含有していてもよい。組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミンを含む。
【0194】
１つの好適な担体又は希釈剤は、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（登録商標）である。これは、静脈内投与用の無菌ノンパイロジェン等張液である。１００ｍＬあたり、塩化ナトリウムＵＳＰ（ＮａＣｌ）５２６ｍｇ；グルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）５０２ｍｇ；酢酸ナトリウム三水和物ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）３６８ｍｇ；塩化カリウムＵＳＰ（ＫＣｌ）３７ｍｇ；及び塩化マグネシウムＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）３０ｍｇを含有する。抗菌剤は含有しない。水酸化ナトリウムでｐＨを調整する。ｐＨは、７．４（６．５～８．０）である。
【0195】
ＭＫ細胞は、１つ以上のリポソーム及び／又は１つ以上のマイクロバブル内に含まれていてもよい。好適なリポソームは、当技術分野において公知である。好適なリポソームは、例えば、Ａｋｂａｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１３，８：１０２及びＭｅｇｈａｎａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１（１）：１－１０に開示されている。リポソームの形成において使用するのに好適な脂質については、マイクロバブルに関連して後述する。
【0196】
マイクロバブル、その形成及び生物医学的使用は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｒｓｉ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，Ｂｕｂｂｌｅ Ｓｃｉ Ｅｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎｏｖ ２００９；１（１－２）：３－１７）。マイクロバブルは、直径１ミリメートル未満且つ直径１マイクロメートル超の気泡である。本発明で使用されるマイクロバブルは、好ましくは、直径８μｍ以下、例えば、直径７μｍ以下、直径６μｍ以下、直径５μｍ以下、直径４μｍ以下、直径３μｍ以下、又は直径２μｍ以下である。マイクロバブルは、いかなる物質から形成されてもよい。マイクロバブルの一般的な構成は、気体のコアがシェルによって安定化されている。気体のコアは、空気、又はパーフルオロカーボン、窒素、若しくはパーフルオロプロパンなどの重質ガスを含んでいてよい。重質ガスは、水溶性が低いので、マイクロバブルの溶解につながるマイクロバブルからの漏出の可能性が低い。重質ガスのコアを有するマイクロバブルは、典型的には、循環中により長く持続する。シェルは、いかなる材料から形成されてもよい。シェルの材料は、好ましくは、タンパク質、界面活性剤、脂質、ポリマー、又はこれらの混合物を含む。
【0197】
細胞は、投薬製剤に適合する方法で、そして、治療的に有効な量で投与され得る。投与される量は、治療される被験体、被験体の免疫系の能力、及び所望の修復度合いに依存する。投与に必要な細胞の正確な量は、開業医の判断に依存し得、そして、各被験体に特有であり得る。
【0198】
任意の好適な数の細胞を被験体に投与してよい。例えば、被験体１ｋｇあたり少なくとも約０．２×１０６個、約０．２５×１０６個、約０．５×１０６個、約１．５×１０６個、約４．０×１０６個、又は約５．０×１０６個の細胞を投与してよい。例えば、少なくとも約１０５個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、約１０９個の細胞を投与してよい。目安として、投与される本発明の細胞の数は、約１０５～約１０９個、好ましくは約１０６～約１０８個であってよい。典型的には、最大で約２×１０８個の細胞が各被験体に投与される。本発明の集団に関して上述した特定の数のいずれを投与してもよい。
【0199】
細胞を投与するか又は細胞が存在する場合、細胞の生存を促進するために培養培地が存在していてもよい。場合によっては、本発明の細胞を凍結したアリコートで提供してもよく、凍結中の生存を促進するためにＤＭＳＯなどの物質が存在していてもよい。このような凍結細胞は、典型的には、解凍し、次いで、維持又は投与のためにバッファ又は培地に入れる。また、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製のＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）などの特定の凍結保存培地も市販されており、これら培地に含有される細胞を解凍後に被験体に直接投与することができるという証拠もある。
【0200】
医薬、方法、及び治療用途
本発明のＭＫ細胞は、ヒト又は動物の身体の療法の方法において使用することができる。従って、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の治療の方法において使用するための、本発明のＭＫ細胞、本発明のＭＫ細胞の集団、又は本発明の医薬組成物を提供する。
本発明のＭＫ細胞は、ヒト又は動物の身体の療法の方法において使用することができる。従って、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の治療の方法において使用するための、本発明のＭＫ細胞、本発明のＭＫ細胞の集団、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【0201】
本発明のプライミングされたＮＫ細胞は、ヒト又は動物の身体の療法の方法において使用することができる。従って、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の治療の方法において使用するための、本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団又は本発明の医薬組成物を提供する。
【0202】
本発明は、被験体におけるがんを治療する方法であって、該被験体に（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｂ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、又は（ｃ）本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明は、対象におけるがんの治療において使用するための（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｂ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、又は（ｃ）本発明の医薬組成物を提供する。また、本発明は、被験体におけるがんを治療するための医薬の製造における、（ａ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｂ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、又は（ｃ）本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【0203】
ＭＫ細胞の集団は、上述したもののうちのいずれであってもよい。ＮＫ細胞の集団は、上述したもののうちのいずれであってもよい。医薬組成物は、上述したもののうちのいずれであってもよく、（ｉ）本発明のＭＫ細胞の集団、（ｉｉ）本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団、（ｉｉｉ）本発明のＭＫ細胞の集団及び（任意の）ＮＫ細胞の集団、又は（ｉｖ）本発明のＭＫ細胞の集団及び本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団を含んでいてよい。
【0204】
がんは、任意のがんであってよい。がんは、がん腫、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、又は白血病であってよい。好ましくは、がんは、肛門がん、胆管がん（胆嚢管がん）、膀胱がん、血液がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、内分泌腫瘍、眼がん（眼球メラノーマなど）、卵管がん、胆嚢がん、頭頸部がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ節がん、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、骨髄腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、食道がん、膵臓がん、陰茎がん、原発性腹膜がん、前立腺がん、腹膜偽粘液腫、皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、気管がん、原発不明がん、膣がん、外陰がん、又は子宮内膜がんである。白血病は、好ましくは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、又は慢性骨髄／骨髄性白血病である。リンパ腫は、好ましくは、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。がんは、好ましくは、原発がん又は続発性がんである。がんは、好ましくは、慢性骨髄性白血病又は形質細胞性骨髄腫である。がんは、好ましくは、乳がんである。
【0205】
また、該方法は、本発明のＭＫ細胞の集団と、本発明のプライミングされたＮＫ細胞の集団などのＮＫ細胞の集団とを両方投与することを含んでいてもよい。このような場合、ＭＫ細胞及びＮＫ細胞は、同時に（同一の医薬組成物などで）、逐次、又は別々に投与してよい。ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞の前に投与してもよく、後に投与してもよい。例えば、ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞を投与する約１～約２８日間、例えば、約３～約２５日間、約６～約２２日間、約９～約１８日間、又は約１２～約１５日間前又は後に、被験体に投与してよい。ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞を投与する最長約１日間、最長約２日間、最長約３日間、最長約４日間、最長約５日間、最長約６日間、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、最長約１０日間、最長約１１日間、最長約１２日間、最長約１３日間、最長約１４日間、最長約１５日間、最長約１６日間、最長約１７日間、最長約１８日間、最長約１９日間、最長約２０日間、最長約２１日間、最長約２２日間、最長約２３日間、最長約２４日間、最長約２５日間、最長約２６日間、最長約２７日間、又は最長約２８日間前又は後に、被験体に投与してよい。細胞の好適な数、及びＭＫ細胞とＮＫ細胞との比率については、上述の通りである。
【0206】
本発明のＭＫ細胞の集団、ＮＫ細胞の集団、及び／又は医薬組成物は、被験体に一度に投与してよい。あるいは、本発明のＭＫ細胞の集団、ＮＫ細胞の集団、及び／又は医薬組成物は、少なくとも約２回、例えば、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約６回、少なくとも約７回、少なくとも約８回、少なくとも約９回、又は少なくとも約１０回で被験体に投与してもよい。投与間の間隔は、約１～約２８日間、例えば、約３～約２５日間、約６～約２２日間、約９～約１８日間、又は約１２～約１５日間であってよい。好ましくは、投与間の間隔は約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、又は２８日間である。
【0207】
いずれの場合も、ＭＫ細胞及び／又はＮＫ細胞は、好ましくは、被験体又は同種のドナーに由来する。被験体からＭＫ細胞及びＮＫ細胞を得ることで、その細胞自体が被験体の免疫系に拒絶されないことが保証されるはずである。ドナーとレシピエントとの間に何らかの違いがあると、最終的には、ＭＫ細胞及びＮＫ細胞のクリアランスが生じるが、少なくとも疾患を部分的に治療する前には生じない。
【0208】
本発明は、被験体に治療的に有効な数のＭＫ細胞及び／又はＮＫ細胞を被験体に投与することに関する。治療的に有効な数とは、疾患の１つ以上の症状を回復させる数値である。治療的に有効な数とは、好ましくは、疾患を治療する数である。好適な細胞の数については、以下でより詳細に論じる。
【0209】
ＭＫ細胞及び／又はＮＫ細胞は、任意の好適な対象に投与することができる。被験体は、一般的に、ヒト被験体である。被験体は、上述した動物又は哺乳類のいずれであってもよい。
【0210】
被験体は、乳幼児、未成年者、又は成人であってよい。被験体は、疾患を有することが知られていてもよく、又は疾患を有すると疑われる。被験体は、関連疾患に罹患しやすくてもよく、又は罹患するリスクがあってもよい。例えば、被験体は、遺伝的にがんになりやすい傾向があってよい。
【0211】
本発明は、疾患を治療するための他の手段及び物質と組み合わせて使用してもよい。場合によっては、ＭＫ細胞及び／又はＮＫ細胞は、疾患を治療する、又は疾患の症状を回復させる、又は疼痛を緩和することを意図する他の物質と同時に、逐次、又は別々に投与してもよい。ＭＫ細胞及び／又はＮＫ細胞は、疾患の既存の治療と組み合わせて使用することができ、例えば、このような治療と単純に混合してもよい。従って、本発明は、疾患の既存の治療の効力を高めるために使用することができる。
【0212】
ハイブリッド組成物
１つ以上の本発明のＭＫ細胞は、１つ以上の生体適合性繊維と１つ以上の本発明のＭＫ細胞とを含むハイブリッド組成物の一部を形成してもよい。１つ以上の生体適合性繊維は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７２号（国際公開第２０１５／１８９５８６号として公開）に開示されているもののいずれであってもよい。また、ハイブリッド組成物は、１つ以上のＮＫ細胞、例えば、１つ以上の本発明のプライミングされたＮＫ細胞を含んでいてもよい。
１つ以上の本発明のＭＫ細胞は、１つ以上の生体適合性繊維と１つ以上の本発明のＭＫ細胞とを含むハイブリッド組成物の一部を形成してもよい。１つ以上の生体適合性繊維は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７２号（国際公開第２０１５／１８９５８６号として公開）に開示されているもののいずれであってもよい。また、ハイブリッド組成物は、１つ以上のＮＫ細胞、例えば、１つ以上の本発明のプライミングされたＮＫ細胞を含んでいてもよい。
【0213】
１つ以上の本発明のＭＫ細胞は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７２号（国際公開第２０１５／１８９５８６号として公開）に開示されているようなハイブリッド組成物の一部を形成してもよく、好ましくは、このような組成物の一部として被験体に投与される。具体的には、本発明は、
（ａ）１つ以上の生体適合性繊維と；
（ｂ）１つ以上の本発明のＭＫ細胞と；
（ｃ）（ｉ）１つ以上のＭＫ細胞を１つ以上の繊維に付着させる及び／若しくは１つ以上のＭＫ細胞及び１つ以上の繊維を埋め込む、並びに／又は（ｉｉ）組成物を組織に付着させることができる１つ以上の生体適合性成分と、を含むハイブリッド組成物を提供する。また、ハイブリッド組成物は、１つ以上のＮＫ細胞、例えば、１つ以上の本発明のプライミングされたＮＫ細胞を含んでいてもよい。
（ａ）１つ以上の生体適合性繊維と；
（ｂ）１つ以上の本発明のＭＫ細胞と；
（ｃ）（ｉ）１つ以上のＭＫ細胞を１つ以上の繊維に付着させる及び／若しくは１つ以上のＭＫ細胞及び１つ以上の繊維を埋め込む、並びに／又は（ｉｉ）組成物を組織に付着させることができる１つ以上の生体適合性成分と、を含むハイブリッド組成物を提供する。また、ハイブリッド組成物は、１つ以上のＮＫ細胞、例えば、１つ以上の本発明のプライミングされたＮＫ細胞を含んでいてもよい。
【0214】
以下の実施例によって、本発明を説明する。
【実施例】
【0215】
実施例１－骨髄及びＭＫ細胞の増幅（バッチＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００２ＲＧ
ヒト骨髄サンプルをハンク緩衝生理食塩水で希釈し、遠心分離によって単核細胞（ＭＮＣ）を単離するためにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅに重ねた。次いで、ＭＮＣをハンク緩衝生理食塩水に再懸濁させ、０．４％トリパンブルー排除アッセイを用いてカウントして、細胞生存率を評価した。細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解液、及びヘパリンを含有する、ヌクレオシドを含まないＭＥＭ Ａｌｐｈａ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、製品コード３２５６１－１０２）の入った培養フラスコに播種し（０日目）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。この補給された培地は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）及び国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）の実施例で使用されているのと同じものである。
ヒト骨髄サンプルをハンク緩衝生理食塩水で希釈し、遠心分離によって単核細胞（ＭＮＣ）を単離するためにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅに重ねた。次いで、ＭＮＣをハンク緩衝生理食塩水に再懸濁させ、０．４％トリパンブルー排除アッセイを用いてカウントして、細胞生存率を評価した。細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解液、及びヘパリンを含有する、ヌクレオシドを含まないＭＥＭ Ａｌｐｈａ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、製品コード３２５６１－１０２）の入った培養フラスコに播種し（０日目）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。この補給された培地は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）及び国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号（国際公開第２０１５／１８９５８７号として公開）の実施例で使用されているのと同じものである。
【0216】
これら実施例の全ての例において、血小板溶解物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）及び国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２９１１号（国際公開第２０１３／０７６５０７号として公開）に記載されている通り生成し：各凍結相で液体窒素を用いて４回の凍結／解凍サイクルを行った。
【0217】
【表5-1】
【0218】
【表5-2】
【0219】
８日目に、細胞を継代（再播種）し、培地を交換した。１２日目に、細胞を継代（再播種）し、培地を交換した。
【0220】
１９日目に、細胞はｉＭＰ細胞（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号；国際公開第２０１５／１８９５８７号の主題）になり、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解物、及びヘパリンを含有する新たな培地（ヌクレオシドを含むＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３；下記成分を参照）に継代（再播種）し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。６日後（２５日目）、細胞はＭＫ細胞（図４参照）になり、製造業者の指示に従って細胞溶解溶液を用いて収集した。細胞を、１０％ジメチルスルホキシドを補給した培養培地で－８０℃まで凍結保存し、後で使用するために液体窒素中で保存した。このバッチ（ＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００２ＲＧ）から得られたＭＫ細胞をＭＫ００２と呼んだ。
【0221】
【表6-1】
【0222】
【表6-2】
【0223】
実施例２－骨髄及びＭＫ細胞の増幅（バッチＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００４）
細胞の継代（再播種）時期が若干異なることだけを除いて、異なる骨髄サンプル（従ってバッチ番号が異なる）を用いて上記の通り実施例１を繰り返した。ヒトＭＮＣ（実施例１と同様に調製）を、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解物、及びヘパリンを含有するαＭＥＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸの入った培養フラスコに播種し（０日目）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）に記載の通り、血小板溶解物を生成した：各凍結相で液体窒素を用いて４回の凍結／解凍サイクルを行った。
細胞の継代（再播種）時期が若干異なることだけを除いて、異なる骨髄サンプル（従ってバッチ番号が異なる）を用いて上記の通り実施例１を繰り返した。ヒトＭＮＣ（実施例１と同様に調製）を、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解物、及びヘパリンを含有するαＭＥＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸの入った培養フラスコに播種し（０日目）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００号（国際公開第２０１３／００５０５３号として公開）に記載の通り、血小板溶解物を生成した：各凍結相で液体窒素を用いて４回の凍結／解凍サイクルを行った。
【0224】
８日目に、細胞を継代（再播種）し、培地を交換した。１４日目に、細胞を継代（再播種）し、培地を交換した。
【0225】
２１日目に、細胞はｉＭＰ細胞（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号；国際公開第２０１５／１８９５８７号の主題）になり、ペニシリン－ストレプトマイシン、血小板溶解物、及びヘパリンを含有する新たな培地（ヌクレオシドを含むＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３；（上記成分を参照）に継代（再播種）し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。６日後（２７日目）、細胞はＭＫ細胞になり、製造業者の指示に従って細胞溶解溶液を用いて収集した。細胞を、１０％ジメチルスルホキシドを補給した培養培地で－８０℃まで凍結保存し、後で使用するために液体窒素中で保存した。このバッチ（ＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００４）から得られたＭＫ細胞をＭＫ００４と呼んだ。
【0226】
実施例３－ＨＴ－ＦＡＣＳ分析
ハイスループット蛍光活性化細胞選別（ＨＴ－ＦＡＣＳ）分析は、懸濁液中の細胞の細胞表面表現型を迅速に特性評価することができるハイスループットスクリーニングプラットフォームであり、現在約３８０種の細胞表面マーカーがパネルに存在する。このプラットフォームは、広範な検証を受けており、多くの種類のヒトの組織及び細胞で実施されている。このパネルは、９６ウェルプレートに配列された約３８０種のヒト細胞表面特異的抗体からなる。
ハイスループット蛍光活性化細胞選別（ＨＴ－ＦＡＣＳ）分析は、懸濁液中の細胞の細胞表面表現型を迅速に特性評価することができるハイスループットスクリーニングプラットフォームであり、現在約３８０種の細胞表面マーカーがパネルに存在する。このプラットフォームは、広範な検証を受けており、多くの種類のヒトの組織及び細胞で実施されている。このパネルは、９６ウェルプレートに配列された約３８０種のヒト細胞表面特異的抗体からなる。
【0227】
目的は、本発明のヒトＭＫ細胞の表面抗原発現プロファイルを決定することであった。両バッチのＭＫ細胞（ＭＫ００２及びＭＫ００４）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシド含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）の入った培養フラスコに播種した。２日目に培地を交換して、細胞を５日間成長させた。細胞を回収するために、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を０．２５％トリプシン５ｍＬで剥離するまで処理した。培地を添加して（８ｍＬ）トリプシンを失活させ、細胞を回収した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、合計５ｍＬのＨＢＳＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡを補給した、カルシウム／マグネシウムを除いたハンクス平衡塩類溶液）に再懸濁させた（単一細胞懸濁液）。サンプルの１アリコート（１０μＬ）を用いて、排除色素（０．２％トリパンブルー）を用いることによって生細胞の総数を求めた。
【0228】
１００μＬのサンプルを各ウェルにロードした（ＦＡＣＳで１０，０００～２０，０００事象の回収を確保するために、１ウェルあたり約４０，０００個の細胞）。ＢＤ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓａｍｐｌｅｒ（自動サンプラー）でアップグレードしたＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａで、サンプルを分析した。ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、フローサイトメトリーデータの解析を行った。プロットと、各抗体ごとの陽性細胞の割合を含むＥｘｃｅｌスプレッドシートとで結果を提供する。
【0229】
【表7-1】
【0230】
【表7-2】
【0231】
【表7-3】
【0232】
【表7-4】
【0233】
【表7-5】
【0234】
【表7-6】
【0235】
【表7-7】
【0236】
【表7-8】
【0237】
【表7-9】
【0238】
実施例４－ＭＫの細胞傷害性
ＭＫの細胞傷害性については、両バッチのＭＫ細胞（ＭＫ００２及びＭＫ００４）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む６ウェルプレートにトリプリケートで播種した。細胞を３日間成長させた後、収集した（実施例１及び３で述べた通り）。ＭＫ細胞をＣｒ放出アッセイ培地（ＡＩＭ）で洗浄し、該培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種して、標的細胞であるＫ５６２（慢性骨髄性白血病）及びＵ２６６（形質細胞性骨髄腫）に１０：１の所望のＥ：Ｔ比で曝露した。殺傷活性を評価するための標準的な４ｈ Ｃｒ放出アッセイにプレートを適用した。ＭＫ００２及びＭＫ００４と同じバッチからのｉＭＰ細胞を、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号；国際公開第２０１５／１８９５８７号に記載の通り調製し（最後の培養工程で補給αＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸを、ヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａに交換しなかったことを除いて、実施例１及び２と同じ方法を使用して）、対照として使用した。細胞傷害性の結果を図１に示す。ＭＫ細胞は、ｉＭＰ細胞と比較して、有意に高い細胞傷害性を示した。
ＭＫの細胞傷害性については、両バッチのＭＫ細胞（ＭＫ００２及びＭＫ００４）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む６ウェルプレートにトリプリケートで播種した。細胞を３日間成長させた後、収集した（実施例１及び３で述べた通り）。ＭＫ細胞をＣｒ放出アッセイ培地（ＡＩＭ）で洗浄し、該培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種して、標的細胞であるＫ５６２（慢性骨髄性白血病）及びＵ２６６（形質細胞性骨髄腫）に１０：１の所望のＥ：Ｔ比で曝露した。殺傷活性を評価するための標準的な４ｈ Ｃｒ放出アッセイにプレートを適用した。ＭＫ００２及びＭＫ００４と同じバッチからのｉＭＰ細胞を、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３号；国際公開第２０１５／１８９５８７号に記載の通り調製し（最後の培養工程で補給αＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸを、ヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａに交換しなかったことを除いて、実施例１及び２と同じ方法を使用して）、対照として使用した。細胞傷害性の結果を図１に示す。ＭＫ細胞は、ｉＭＰ細胞と比較して、有意に高い細胞傷害性を示した。
【0239】
実施例５－ＮＫ細胞のＭＫプライミング
ＮＫのプライミングについては、両バッチのＭＫ細胞（ＭＫ００２及びＭＫ００４）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む６ウェルプレートにトリプリケートで播種した。細胞を２日間成長させた後、培地を除去し、細胞の単層を温ＨＢＳＳで１回すすいだ。単層にＮＫ特異的培地（ＧＭ．１又はＸ－Ｖｉｖｏ １０）を添加した。ウェル内に配置したＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートにＮＫ細胞を添加し、単独で培養したＮＫ細胞を対照として用いた。プレートを１日間インキュベートした。ＮＫ細胞を収集し、Ｃｒ放出アッセイ培地（ＡＩＭ）で洗浄し、該培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種して、標的細胞であるＫ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＲＰＭＩ－８２２６（形質細胞性骨髄腫）、及びＵ２６６（形質細胞性骨髄腫）に１０：１の所望のＥ：Ｔ比で曝露した。殺傷活性を評価するための標準的な４ｈ Ｃｒ放出アッセイにプレートを適用した。ＮＫプライミングの結果を図２及び図３に示す。ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞をプライミングし、その細胞傷害性を高めた。
ＮＫのプライミングについては、両バッチのＭＫ細胞（ＭＫ００２及びＭＫ００４）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシドを含む補給ＭＥＭ Ａｌｐｈａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む６ウェルプレートにトリプリケートで播種した。細胞を２日間成長させた後、培地を除去し、細胞の単層を温ＨＢＳＳで１回すすいだ。単層にＮＫ特異的培地（ＧＭ．１又はＸ－Ｖｉｖｏ １０）を添加した。ウェル内に配置したＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートにＮＫ細胞を添加し、単独で培養したＮＫ細胞を対照として用いた。プレートを１日間インキュベートした。ＮＫ細胞を収集し、Ｃｒ放出アッセイ培地（ＡＩＭ）で洗浄し、該培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種して、標的細胞であるＫ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＲＰＭＩ－８２２６（形質細胞性骨髄腫）、及びＵ２６６（形質細胞性骨髄腫）に１０：１の所望のＥ：Ｔ比で曝露した。殺傷活性を評価するための標準的な４ｈ Ｃｒ放出アッセイにプレートを適用した。ＮＫプライミングの結果を図２及び図３に示す。ＭＫ細胞は、ＮＫ細胞をプライミングし、その細胞傷害性を高めた。
【0240】
実施例６－ＭＮＣとＣ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５
バッチＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００２ＲＧ及びＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００４からのＭＮＣによるＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５の発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒで細胞をカウントし、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中２×１０５細胞／２５μＬとなるように調製した。以下の試薬を用いた。
バッチＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００２ＲＧ及びＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００４からのＭＮＣによるＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５の発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒで細胞をカウントし、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中２×１０５細胞／２５μＬとなるように調製した。以下の試薬を用いた。
【0241】
【表8】
【0242】
【表9】
【0243】
【表10】
【0244】
実施例７－ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αで処理したＭＫ細胞のＨＴ－ＦＡＣＳ分析
ＭＫ００４を用い、５日間の成長のうちの２日目に培地を交換したときに、５００ｕｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ又は１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－αを培地に添加して、実施例３を繰り返した。ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αの１日後、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを除去して再び培地を交換した。５日目に、細胞を回収し、実施例３に記載の通り試験した。本発明の特定のマーカーの結果を以下の表１１に示す。
ＭＫ００４を用い、５日間の成長のうちの２日目に培地を交換したときに、５００ｕｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ又は１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－αを培地に添加して、実施例３を繰り返した。ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αの１日後、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを除去して再び培地を交換した。５日目に、細胞を回収し、実施例３に記載の通り試験した。本発明の特定のマーカーの結果を以下の表１１に示す。
【0245】
【表11-1】
【0246】
【表11-2】
【0247】
実施例８－追加バッチからのＭＫ細胞の生成
以下の通り追加の３つのバッチを用いて実施例１及び２を繰り返した（バッチは、由来する骨髄サンプルに関連して付番又は命名されている）：
－ ＭＫ００１を生成するためのＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００１ＲＧ
－ ＭＫ００６を生成するためのＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００６ＲＧ
－ ＭＫＰＣを生成するためのＰＣ。
以下の通り追加の３つのバッチを用いて実施例１及び２を繰り返した（バッチは、由来する骨髄サンプルに関連して付番又は命名されている）：
－ ＭＫ００１を生成するためのＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００１ＲＧ
－ ＭＫ００６を生成するためのＣＬＸＲ－Ｈ－１７－００６ＲＧ
－ ＭＫＰＣを生成するためのＰＣ。
【0248】
実施例９－ＭＫ細胞のセクレトーム分析
目的は、本発明のヒトＭＫ細胞のセクレトームプロファイルを決定することであった。５つの異なるバッチのＭＫ細胞（ＭＫ００１、ＭＫ００２、ＭＫ００４、ＭＫ００６、及びＭＫＰＣ）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシド含む補給ＭＥＭα（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む培養フラスコに播種した。２日目に培地を交換して、細胞を５日間成長させた（未処理細胞）。あるいは、２日目に培地を交換したときに、５００ｕｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ又は１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－αを培地に添加した（ＩＦＮ－γ処理又はＴＮＦ－α処理）。ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αの１日後、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを除去して再び培地を交換した。
目的は、本発明のヒトＭＫ細胞のセクレトームプロファイルを決定することであった。５つの異なるバッチのＭＫ細胞（ＭＫ００１、ＭＫ００２、ＭＫ００４、ＭＫ００６、及びＭＫＰＣ）を解凍し、実施例１及び２で定義したヌクレオシド含む補給ＭＥＭα（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；製品コード：１２５７１－０６３）を含む培養フラスコに播種した。２日目に培地を交換して、細胞を５日間成長させた（未処理細胞）。あるいは、２日目に培地を交換したときに、５００ｕｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ又は１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－αを培地に添加した（ＩＦＮ－γ処理又はＴＮＦ－α処理）。ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αの１日後、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを除去して再び培地を交換した。
【0249】
いずれの場合も、５日目に馴化培地を回収した。（ビーズベースの）Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サイトカインプロファイリング（ヒト４８プレックスフォーマット）を用いて、各サンプル中のＧＲＯａ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－８、可溶性ＴＲＡＩＬ、及びＩＬ－６のレベルを測定した。各サイトカイン／ケモカイン又は成長因子に対する抗体に結合した磁気ビーズを含む９６ウェルプレートにサンプルを添加した。各ウェルから蛍光シグナルを捕捉し、濃度を求めた。
【0250】
実験は１回で完了した。全５バッチの結果（平均値±ＳＥＭ）を図５～１０に示す（ただし、上のレジェンドに記載の通り図８を除く）。本発明のＭＫ細胞は、試験したサイトカインを全て検出可能なレベルで分泌する。ＩＦＮ－γ刺激により、ＩＬ－２Ｒａの分泌量が有意に増加し、ＩＬ－８の分泌量が有意に減少した。ＴＮＦ－α刺激は、ＧＲＯａ及びＩＬ－８の分泌を有意に増加させた。
【0251】
実施例１０－エアパウチモデルにおいて使用されるカラギーナン
目的は、カラギーナンエアパウチモデルを用いて、炎症部位に免疫細胞を誘引する本発明のＭＫ細胞の能力を判定することであった。
目的は、カラギーナンエアパウチモデルを用いて、炎症部位に免疫細胞を誘引する本発明のＭＫ細胞の能力を判定することであった。
【0252】
麻酔下で、マウス（免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃ）の背部に滅菌空気を注入した。マウスを４～５日放置してパウチを発達させ、必要に応じてその間にパウチを再膨張させた。１％カラギーナン（炎症誘導剤）５ｍＬを各パウチに注入し、数時間放置して炎症反応を発生させた。次いで、パウチを、本発明の未処理ＭＫ細胞、本発明のＩＦＮ－γ処理ＭＫ細胞、又は本発明のＴＮＦ－α処理ＭＫ細胞（いずれもバッチＭＫ００６から）で処理し、実施例８及び９で説明した通り調製した。マウス１頭あたり生理食塩水０．２ｍＬ中１００万個のＭＫ細胞を各パウチに投与した。対照は未処理のままとした（カラギーナンのみ対照）。
【0253】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入することによってパウチに穴を開け、軽くマッサージして細胞を混ぜ合わせ、追加のＰＢＳで洗浄して細胞を全て抽出した。抽出された細胞を、ＦＡＣＳを用いて分析し、存在するＮＫ細胞及び単球の割合を求めた。この実験を５回繰り返した（１処理あたり５個のパウチ）。
【0254】
【0255】
実施例１１－ＮＫ細胞のＭＫプライミング
バッチＭＫ００２及びＭＫ００４からの未処理ＭＫ細胞、初代ＮＫ細胞、及びＫ５６２（慢性骨髄性白血病）を用いて、実施例５の方法を３回繰り返した（ｎ＝３）。結果を図１３に示す。ＭＫ細胞は、初代ＮＫ細胞をプライミングし、その細胞傷害性を有意に高めた。
バッチＭＫ００２及びＭＫ００４からの未処理ＭＫ細胞、初代ＮＫ細胞、及びＫ５６２（慢性骨髄性白血病）を用いて、実施例５の方法を３回繰り返した（ｎ＝３）。結果を図１３に示す。ＭＫ細胞は、初代ＮＫ細胞をプライミングし、その細胞傷害性を有意に高めた。
【0256】
実施例１２－ＭＫの細胞傷害性
本発明のＭＫ細胞の４つの異なるバッチ（ＭＫ００２、ＭＫ００４、ＭＫ００６ ＭＫＰＣ）及び乳がん細胞株であるＭＣＦ７について、１０：１の所望のＥ：Ｔ比で実施例４の方法を２回繰り返した（ｎ＝２）。細胞傷害性の結果を図１４に示す。全てのバッチからのＭＫ細胞が、ＭＣＦ７に対して細胞傷害性を示した。
本発明のＭＫ細胞の４つの異なるバッチ（ＭＫ００２、ＭＫ００４、ＭＫ００６ ＭＫＰＣ）及び乳がん細胞株であるＭＣＦ７について、１０：１の所望のＥ：Ｔ比で実施例４の方法を２回繰り返した（ｎ＝２）。細胞傷害性の結果を図１４に示す。全てのバッチからのＭＫ細胞が、ＭＣＦ７に対して細胞傷害性を示した。
【0257】
実施例１３－ＭＫ細胞によるグランザイム及びパーフォリンの発現
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、バッチＭＫ００４のＭＫ細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡを合成した。特異的熱プロファイルでグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、Ｈ（ＧＺＭＨ）、Ｍ（ＧＺＭＭ）、Ａ（ＧＺＭＡ）、及びＫ（ＧＺＭＫ）、並びにパーフォリンに特異的なプライマーを用いてアンプリコンを増幅した。アンプリコン生成物を２％ゲルで泳動し、ＥＴＢｒを用いてバンドを検出した。ＭＫ細胞がＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＭ、ＧＺＭＡ、及びＧＺＭＫ、並びにパーフォリンを発現することが確認された（データは示さない）。
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、バッチＭＫ００４のＭＫ細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡを合成した。特異的熱プロファイルでグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、Ｈ（ＧＺＭＨ）、Ｍ（ＧＺＭＭ）、Ａ（ＧＺＭＡ）、及びＫ（ＧＺＭＫ）、並びにパーフォリンに特異的なプライマーを用いてアンプリコンを増幅した。アンプリコン生成物を２％ゲルで泳動し、ＥＴＢｒを用いてバンドを検出した。ＭＫ細胞がＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＭ、ＧＺＭＡ、及びＧＺＭＫ、並びにパーフォリンを発現することが確認された（データは示さない）。
【0258】
また、単独で培養した（単培養：ＭＣ）又は１０：１の所望のＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ－８２２６細胞と共に６時間、１２時間、及び２４時間共培養した後の（共培養：ＣＣ）バッチＭＫ００４のＭＫ細胞からも、ＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡを合成した。Ｓｙｂｒグリーンマスターミックスを用いて、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＭ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＫ、パーフォリン、及びＧＡＤＰＨの定量的ＰＣＲシグナルを検出した。ＭＣに対するＣＣ条件で各遺伝子の発現の倍数変化を求め、その結果を図１５～２０に示す（ＭＣ及びＣＣのいずれについても各時点で各ＲＮＡごとにｎ＝２）。ＧＺＭ及びパーフォリンの値をＧＡＤＰＨの値に対して正規化した。得られた値を、各時間におけるＭＣに対するＣＣについて調べた（ＣＣ－ＭＣ）。倍数変化（ＦＣ）値を得るために、以下を適用した：２＾（－（ＣＣ－ＭＣ））。１よりも大きい値は、ＣＣがＭＣに比べて遺伝子の発現を増加させることを示す。図１５～２０に示すように、ＲＰＭＩ－８２２６細胞との共培養によって、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＭ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＫ、及びパーフォリンの発現が増加した。
【0259】
実施例１４－ＥＧＴＡを用いたＭＫ細胞の細胞傷害性の抑制
ＥＧＴＡは、顆粒エキソサイトーシスの非特異的阻害剤である。３つのバッチ（ＭＫ００２、ＭＫ００４、及びＭＫ００６）のＭＫ細胞を、異なる濃度のＥＧＴＡ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ）で２４時間前処理し、滅菌ＨＢＳＳですすぎ、ＭＣＦ７細胞（所望のＥ：Ｔ比５：１として）に更に２４時間曝露し、クロム放出アッセイを用いてその殺傷活性を評価した（実施例４及び１２に記載の通り）。図２１に示す通り、ＥＧＴＡは、３つのバッチのＭＫ細胞全ての細胞傷害性を有意に低下させた。このことは、ＭＫ細胞の細胞傷害性において顆粒エキソサイトーシスが少なくとも部分的に役割を果たすことを示唆している。
ＥＧＴＡは、顆粒エキソサイトーシスの非特異的阻害剤である。３つのバッチ（ＭＫ００２、ＭＫ００４、及びＭＫ００６）のＭＫ細胞を、異なる濃度のＥＧＴＡ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ）で２４時間前処理し、滅菌ＨＢＳＳですすぎ、ＭＣＦ７細胞（所望のＥ：Ｔ比５：１として）に更に２４時間曝露し、クロム放出アッセイを用いてその殺傷活性を評価した（実施例４及び１２に記載の通り）。図２１に示す通り、ＥＧＴＡは、３つのバッチのＭＫ細胞全ての細胞傷害性を有意に低下させた。このことは、ＭＫ細胞の細胞傷害性において顆粒エキソサイトーシスが少なくとも部分的に役割を果たすことを示唆している。
【0260】
実施例１５－ｓｉＲＮＡを用いたＭＫ細胞の細胞傷害性の抑制
バッチＭＫ００４及びＭＫ００６のＭＫ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、２５ｐＭのＣＤ１７８／ＦａｓＬ（ｓｉＦａｓＬ）又はＣＤ２５３／ＴＲＡＩＬ（ｓｉＴＲＡＩＬ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ又はスクランブル／ノンターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで処理した。４８時間後、滅菌ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄し、ＭＣＦ７細胞（所望のＥ：Ｔ比５：１として）に更に２４時間曝露し、クロム放出アッセイを用いてその殺傷活性を評価した（実施例４及び１２に記載の通り）。分析はトリプリケートで行った（各条件につき３つのウェル）。結果を図２２に示す。ＴＲＡＩＬを阻害すると、ＭＫ００６の細胞傷害性が有意に低下し（スクランブル／ＮＴ ｓｉＲＮＡと比較して）、これは、ＭＫ細胞の細胞傷害性におけるこの表面マーカーの役割を示唆している。
バッチＭＫ００４及びＭＫ００６のＭＫ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、２５ｐＭのＣＤ１７８／ＦａｓＬ（ｓｉＦａｓＬ）又はＣＤ２５３／ＴＲＡＩＬ（ｓｉＴＲＡＩＬ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ又はスクランブル／ノンターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで処理した。４８時間後、滅菌ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄し、ＭＣＦ７細胞（所望のＥ：Ｔ比５：１として）に更に２４時間曝露し、クロム放出アッセイを用いてその殺傷活性を評価した（実施例４及び１２に記載の通り）。分析はトリプリケートで行った（各条件につき３つのウェル）。結果を図２２に示す。ＴＲＡＩＬを阻害すると、ＭＫ００６の細胞傷害性が有意に低下し（スクランブル／ＮＴ ｓｉＲＮＡと比較して）、これは、ＭＫ細胞の細胞傷害性におけるこの表面マーカーの役割を示唆している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】