特表2022-517483重度のインスリン抵抗性糖尿病の対象における糖尿病の治療方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-09
(54)【発明の名称】重度のインスリン抵抗性糖尿病の対象における糖尿病の治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/433 20060101AFI20220302BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220302BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220302BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220302BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220302BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20220302BHJP
A61K 31/351 20060101ALI20220302BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20220302BHJP
A61K 31/7034 20060101ALI20220302BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20220302BHJP
【ＦＩ】
A61K31/433
A61P3/10
A61P13/12
A61P3/04
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K31/381
A61K31/351
A61K31/7048
A61K31/7034
A61K31/7056 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021525049
(86)(22)【出願日】2018-11-05
(85)【翻訳文提出日】2021-07-02
(86)【国際出願番号】 GB2018053203
(87)【国際公開番号】W WO2020095010
(87)【国際公開日】2020-05-14
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）平成３０年６月２１日にＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔにて公開、（２）平成３０年６月２１から平成３０年１０月１０までに書簡にて潜在的に関心のある企業へ公開、（３）平成３０年１１月５日から平成３０年１１月７日までに、コペンハーゲンで開催されたＢｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ ２０１８にて潜在的に関心のある企業へ公開、（４）平成３０年６月２１から平成３０年１０月１０までにスライド資料にて潜在的に関心のある企業へ公開
(71)【出願人】
【識別番号】521194220
【氏名又は名称】ボルチックグルーペン ビオ アーべー
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】エドルンド，ヘレナ
(72)【発明者】
【氏名】エリクソン，ビョルン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA59
4C084MA70
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZC35
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA07
4C086BB02
4C086BB03
4C086BC86
4C086EA08
4C086EA11
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA70
4C086NA05
4C086NA14
4C086NA15
4C086ZA70
4C086ZA81
4C086ZC35
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする対象の集団において糖尿病を治療する新しい方法に関する。この集団は通常、肥満、インスリン抵抗性、高血糖症であり、糖尿病性腎疾患の高いリスクを有する。式Ｉの化合物は、高体重、インスリン抵抗性および高血糖症を治療し、糸球体の微小血管灌流に好ましい効果を有することが見出されており、したがって、この患者群の治療に特に適している。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖尿病を治療する方法であって、式Ｉの化合物、【化1】
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記対象が、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定される、方法。
【請求項2】
２型糖尿病を治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象が肥満である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記対象が少なくとも３０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記対象が少なくとも１．４ｎｍｏｌ／Ｌ、任意に少なくとも１．５ｎｍｏｌ／Ｌの血中Ｃペプチド濃度を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記対象が糖尿病性腎疾患に対する感受性の高いリスクを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記対象が糖尿病性腎疾患を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記対象の体重が減少する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記対象の腎血行動態が改善される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記対象がヒトである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが、経口、経鼻、非経口、または吸入によって投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが、約１～約２０００ｍｇの範囲の１日量で対象に投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
（Ａ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと、（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグとの組み合わせ。
【請求項14】
薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と混合されている、請求項１３に記載の組み合わせを含む医薬製剤。
【請求項15】
キットオブバーツであって、（Ａ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および薬学的に許容される補助剤、希釈剤もしくは担体を含む組成物と、
（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および薬学的に許容される補助剤、希釈剤もしくは担体を含む組成物と、を含み、
構成要素（Ａ）および（Ｂ）は、互いに組み合わせて投与するのに適した形態でそれぞれ提供される、キットオブバーツ。
【請求項16】
医薬品に使用するための請求項１３に記載の組み合わせ、請求項１４に記載の医薬製剤、または請求項１５に記載のキットオブバーツ。
【請求項17】
ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグもまた前記対象に投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記式Ｉの化合物および前記ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤が、前記対象に連続して、別々に、および／または同時に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤は、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボネート、レモグリフロジンエタボネート、エルツグリフロジンおよびソタグリフロジン、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグからなる群から選択される、請求項１３に記載の組み合わせ、請求項１４に記載の医薬製剤、請求項１５に記載のキットオブバーツ、請求項１６に記載の使用のための組み合わせもしくは医薬製剤、または請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１３～１５および１９のいずれか一項に記載の組み合わせ、医薬製剤またはキットオブバーツの使用。
【請求項21】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１３もしくは請求項１９に記載のナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用であって、前記薬剤は、請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグよっても治療される対象に投与される、使用。
【請求項22】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用であって、前記薬剤は、請求項１３もしくは請求項１９に記載のナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグによっても治療される対象に投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、この治療に特に適した患者の糖尿病の治療におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化因子の使用に関する。適した患者は、インスリン抵抗性が増加し、体重が高いことで特徴づけられる。特に、この治療法は、重度のインスリン抵抗性糖尿病患者の２型糖尿病の治療に有用である。
【背景技術】
【0002】
糖尿病は、１型（またはインスリン依存性糖尿病）および２型（インスリン非依存性糖尿病）の２つの異なる疾患で構成されており、どちらも血糖恒常性の機能不全を伴う。２型糖尿病は現在、世界で４億人以上が罹患しており、この数は急速に増加している。２型糖尿病の合併症には、重度の心血管系の問題、腎不全、末梢神経障害、失明、さらには手足の喪失、そして最終的には病気の後期の死が含まれる。２型糖尿病はインスリン抵抗性を特徴とし、現在、決定的な治療法はない。今日使用されているほとんどの治療法は、機能不全のインスリンシグナル伝達の治療、肝臓からのグルコース排出の抑制、または腎臓でのグルコースの再吸収の抑制に焦点を当てているが、これらの治療法の多くにはいくつかの欠点と副作用がある。長期的な結果には改善が見られるが、過剰な死亡率と心血管系の罹患率は、医療システムにとって依然として大きな課題である。
【0003】
２型糖尿病の現在の最前線の治療法は、主に肝臓のグルコース産生を減らすことによって血漿グルコースを下げるビグアニドであるメトホルミンである。それにもかかわらず、メトホルミンによる血糖制御を達成していない２型糖尿病の対象に対する治療の必要性が残っている。
【0004】
糖尿病は現在、１型糖尿病と２型糖尿病の２つの主要な形態に分類されているが、特に２型糖尿病は非常に多様である。
【0005】
既存の治療ガイドラインは、不十分な代謝制御が現れたときに、それに応答するという事実に限られていて、どの患者が強化された治療を必要とするかを予測する手段がない。証拠によれば、標的組織が数十年後も不十分な代謝制御を記憶しているように見えるため、早期治療が寿命を縮める合併症の予防に重要であることを示唆している（Ｅｍｍａ Ａｈｌｑｖｉｓｔ ｅｔ． ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．５、ｐ３６１－３６９、 ２０１８）。
【0006】
診断時に合併症のリスクが高い個人を特定し、個別の治療レジメンを可能にするため、そのような患者にメカニズムを提供するより良い分類を特定する必要性が残っている。
【0007】
私たちは今や、重度のインスリン抵抗性糖尿病に苦しむ患者に驚くほど効果的な新しい治療法を発見した。
【0008】
本明細書における先に公開されたらしい文書のリストまたは議論は、その文書が最新技術の一部であるか、または普通の一般的な知識であることを認めるものとして必ずしも解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【0009】
本発明の第１の態様によれば、糖尿病を治療する方法が提供され、該方法は、式Ｉの化合物、
または、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを、それを必要とする対象に投与することを含む。ここで、この対象は、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定されたものである。
【化1】
または、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを、それを必要とする対象に投与することを含む。ここで、この対象は、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定されたものである。
【0010】
本発明の第１の態様の方法は、以下、「本発明の方法」と呼ばれる。
【0011】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象は、肥満、インスリン抵抗性、および高インスリン血症である、糖尿病を患っている対象のサブグループを表す。これらの対象は、他の糖尿病の対象と比較して、糖尿病性腎疾患を発症するリスクが５倍高くなっている。現在、効果的な治療法が不足しており、本発明の方法はこれらの対象に特に適している。
【0012】
言及され得る薬学的に許容される塩には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。そのような塩は、従来の手段によって、例えば、式Ｉの化合物の遊離酸または遊離塩基形を、１当量以上の適切な酸または塩基と、任意に溶媒中で、またはその塩が溶けない媒体中で反応させ、続いて標準的な技術を使用して（例えば、真空中で、凍結乾燥または濾過によって）、該溶媒または該媒体を除去することによって形成することができる。塩はまた、例えば適切なイオン交換樹脂を使用して、塩の形態の式Ｉの化合物の対イオンを別の対イオンと交換することによって、調製されてもよい。
【0013】
薬学的に許容される付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの鉱酸に由来するもの、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、アリールスルホン酸などの有機酸に由来するもの、ならびにナトリウム、マグネシウム、または好ましくはカリウムおよびカルシウムなどの金属に由来するものが含まれる。
【0014】
式Ｉの関連化合物の「プロドラッグ」という用語は、経口または非経口投与後、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で代謝されて、実験的に検出可能な量で、所定の時間内に（例えば、６～２４時間の投薬間隔内に（つまり、１日１～４回））その化合物を形成するいずれの化合物も含む。式Ｉの化合物のプロドラッグは、関連する化合物と同じ生物学的機能および／または活性を有するか、または提供する誘導体を含む。誤解を避けるために、「非経口」投与という用語には、経口投与以外のすべての形態の投与が含まれる。
【0015】
式Ｉの化合物のプロドラッグは、プロドラッグが哺乳動物対象に投与されるときに生体内で修飾が切断されるように、その化合物上に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。修飾は通常、親化合物をプロドラッグ置換基と合成することによって達成される。プロドラッグには、式Ｉの化合物中のアミノ基またはカルボニル基が、生体内で切断されて遊離アミノ基またはカルボニル基をそれぞれ再生し得る任意の基に結合している、式Ｉの化合物が含まれる。
【0016】
プロドラッグの例には、これらに限定されないが、カルボキシル官能基のエステル、Ｎ－アシル誘導体およびＮ－マンニッヒ塩基が含まれる。プロドラッグに関する一般的な情報は、例えばＢｕｎｄｅｇａａｒｄ、Ｈ．”Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”ｐ１－９２， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）に見出される。
【0017】
式Ｉの化合物、ならびに該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグは、簡潔にするために、以下、まとめて「式Ｉの化合物」と呼ばれる。
【0018】
式Ｉの化合物は、位置異性体として存在する可能性があり、互変異性を示す可能性もある。すべての互変異性型およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【0019】
本明細書で言及されるすべての個々の特徴（例えば、好ましい特徴）は、単独で、または本明細書で言及される他の任意の特徴（好ましい特徴を含む）と組み合わせて解釈することができる（したがって、好ましい特徴は、他の好ましい特徴と組み合わせて、またはそれらとは独立して解釈されることができる）。
【0020】
式Ｉの化合物は、脳に入らない直接の普遍的（ＰＡＮ）－ＡＭＰＫ活性化因子である。高血糖／糖尿病の前臨床モデルでは、式Ｉの化合物は、骨格筋へのグルコース取り込みを増加させ、インスリン抵抗性を低下させ、β細胞の休息を促進することがわかっている。式Ｉの化合物は、エネルギー消費を増加させ、肥満を予防／軽減する。運動と同様に、式Ｉの化合物は、血圧を下げ、微小血管灌流を増やし、心臓のＡＭＰＫを活性化し、心臓のグルコース取り込みを増やし、心臓のグリコーゲンレベルを下げ、左心室の１回拍出量と持久力を改善する。さらに、式Ｉの化合物は、マウスまたはラットにおいて心肥大を引き起こさない。したがって、重要なことに、式Ｉの化合物は、いかなる他の利用可能な抗糖尿病薬でも観察されない有益な代謝効果および心臓血管効果の組み合わせを示す。
【0021】
本発明の別の第１の態様によれば、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象の糖尿病の治療に使用するための、式Ｉの化合物（上記で定義）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが提供される。
【0022】
本発明のさらなる別の第１の態様によれば、重度のインスリン抵抗性糖尿病であると特定された対象の糖尿病を治療するための薬剤の製造における、式Ｉの化合物（上記で定義される）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用が提供される。
【0023】
糖尿病は、多食症、多飲症、多尿症、腎臓の損傷、神経学的損傷、心血管の損傷、網膜の損傷、下肢の損傷、疲労、落ち着きのなさ、体重減少、創傷治癒不良、乾燥したまたはかゆみのある皮膚、勃起不全、心不整脈、昏睡および発作等の、種々の徴候と関係することが多い。
【0024】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「の治療」（およびそれらの文法的変形）という用語は、対象の状態の重症度が軽減される、少なくとも部分的に改善されること、および／または、少なくとも１つの臨床症状がある程度の緩和、軽減もしくは減少すること、および／または疾患もしくは障害の進行が遅れていることを意味する。この点で、これらの用語は、対象の臨床症状の少なくとも１つの重症度の少なくとも部分的な減少、および／または該症状の少なくとも１つの期間の減少を指す場合がある。「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「の治療」という用語はまた、血糖値の低下（例えば、約１０．０ｍｍｏｌ／ｍＬ以下へ（例えば、約４．０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のレベルまで）、例えば、約７．５ｍｍｏｌ／ｍＬ以下（例えば、約４．０ｍｍｏｌ／Ｌ～約７．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のレベルまで）または約６ｍｍｏｌ／ｍＬ以下へ（例えば、約４．０ｍｍｏｌ／Ｌ～約６．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のレベルまで））を達成することを指す場合もある。特定の実施形態では、２型糖尿病の場合、この用語は、血糖値の低下を達成することを指す場合がある。
【0025】
本発明の方法を「必要としている対象」には、糖尿病、特に２型糖尿病に罹患している対象が含まれる。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、２型糖尿病を治療する方法である。
【0026】
本明細書で使用される「治療有効量」、「有効量」または「投与量」は、治療的および／または有益な効果でありえる所望の効果を生み出すのに十分な化合物、組成物、および／または製剤の量を指す。有効量または投与量は、対象の年齢または一般的な状態、治療される状態の重症度、投与される特定の薬剤、治療の期間、いずれの同時に受けている治療の性質、使用される薬学的に許容される担体、および当業者の知識および専門的判断にある同様の要因により変わるであろう。適切な場合は、いずれの個々の場合においても「治療的有効量」、「有効量」または「投与量」は、関連するテキストおよび文献を参照することによって、および／または日常的な実験を行うことによって、当業者によって決定することができる。当業者は、対象に何らかの利益が提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【0027】
本明細書で使用される場合、「疾患」および「障害」という用語（および同様に、状態、病気、医学的課題などの用語）は、交換可能に使用され得る。
【0028】
「重度のインスリン抵抗性糖尿病」（ＳＩＲＤ）を有する者として定義される糖尿病患者の明確な集団は、有効な治療上の選択肢を欠いている。本発明者らは、式Ｉの化合物について観察される臨床的および薬物動態学的効果が、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有する糖尿病患者の治療上の要求に特に適していることを見出した。式Ｉの化合物を使用する治療をこれらの患者に適用することにより、臓器の罹患率の低下および生存率の上昇を含む、重要な臨床的利益を実現することができる。
【0029】
「インスリン抵抗性」という用語は、正常な、または場合によっては増加したインスリン産生を有するが、インスリン感受性が著しく低下している対象を指す。対象者は、Ｅｍｍａ Ａｈｌｑｖｉｓｔ ｅｔ．Ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６， Ｎｏ．５，ｐ３６１－３６９， ２０１８に定められた基準に従って、重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っていると分類されてもよい。そこに記載されている研究では、対象者は６つの変数（グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体、診断時年齢、ＢＭＩ（肥満度指数）、ＨｂＡ１ｃ、ならびにβ細胞機能およびインスリン抵抗性に関する恒常性モデル評価の２つの推定値）に基づいてグループ化され、合併症の発症および投薬の処方に関する患者記録からの予測データと関連づけられた。重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っている対象は、通常、少なくとも３０ｋｇ／ｍ２、特に少なくとも３５ｋｇ／ｍ２などの高いＢＭＩを持っている。対象はまた、少なくとも５２ｍｍｏｌ／ｍｏｌのＨｂＡ１ｃの水準を有し得る。さらに、対象者は、特定の試験場所で基準範囲を超えるＣ－ペプチドレベルを有する可能性がある。これらの臨床パラメータのそれぞれの決定は、当業者に知られている日常的な方法を使用して容易に達成することができる。
【0030】
式Ｉの化合物による治療は、マウスにおいて体重を減らし、インスリン抵抗性を改善し、そして高血糖症を治療することができることが見出された。本発明の化合物を食餌誘発性肥満マウスに投与すると、骨格筋におけるグルコース取り込みが増加し、β細胞ストレスが減少し、β細胞の休止が促進された。
【0031】
この化合物のヒトへの投与は、糸球体の微小血管灌流に好ましい効果があることもわかっている。この化合物は、メトホルミンで治療を受ける２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者を対象とした第ＩＩａ相臨床試験で、空腹時血糖値とインスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ－ＩＲ）を低下させた。この化合物はまた、動物と２型糖尿病患者の両方で、末梢微小血管灌流を改善し、血圧を低下させた。したがって、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの投与は、糖尿病、特に重度のインスリン抵抗性糖尿病に苦しむ対象において有益な効果をもたらすことが期待される。
【0032】
これらの効果には、対象の体重の減少が含まれる場合がある。例えば、対象の体重は、対象がもはや肥満であると見なされない程減少させることができる。患者はＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２以上であると、肥満であると判断される場合がある。これは、ＷＨＯ分類システムに従い、ＢＭＩが３０～３５ｋｇ／ｍ２である「肥満クラスＩ」または「中程度の肥満」を含みます。より高いＢＭＩレベルでは、患者は重度の肥満（肥満クラスＩＩ；３５～４０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ）、非常に重度の肥満（肥満クラスＩＩＩ；４０～４５ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ）、病的肥満（肥満クラスＩＶ；４５～５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ）、またはさらに高い程度の肥満として分類される場合がある。したがって、本発明の方法を使用するそのような患者の治療は、患者がより低い体重のカテゴリーに分類される結果となり得、さらに、患者のＢＭＩが肥満の閾値未満に低下する結果となり得る。ＢＭＩが２５～３０ｋｇ／ｍ２の患者は、通常、太りすぎとして分類され、重度のインスリン抵抗性糖尿病として分類されない場合もあるが、本願の治療法の恩恵を受ける可能性がある。本発明の特定の実施形態では、対象の体重が減少する。
【0033】
したがって、本発明の方法は、肥満である対象の治療に特に適している。本発明の文脈において、特に明記しない限り、「肥満」という用語は、ＷＨＯ分類システムに従って肥満クラスＩ以上に分類される対象を含む。したがって、実施形態では、この方法は、少なくとも３０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する対象に対して実施される。本発明の別の実施形態では、対象の肥満度指数は、減少し、例えば、そのため、患者は重症度の低い肥満クラスに分類されるか、またはまったく肥満ではないものとして分類される。
【0034】
本明細書で使用される場合、対象（または複数の対象）への言及は、哺乳動物（例えば、ヒト）対象を含む、治療されている、または予防的医薬を受けている、生きている対象を指す。特に、対象への言及はヒトである対象を指す。
【0035】
本発明の方法は、治療されている対象に他の有益な効果を生じさせ得る。例えば、本発明の化合物は、２型糖尿病に苦しむ患者の腎血行動態に好ましい効果を有することが示されている。この化合物は、糸球体内圧の低下と一致する、患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）の迅速で安定した可逆的な低下を引き起こす可能性がある。これは、初期の血行力学的効果を示している。したがって、本発明の方法は、対象の腎血行動態を改善することができる。より具体的には、本発明の方法は、対象における推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）の低下を介して決定され得る糸球体内圧の低下、例えば臨床治療的低下を生じる可能性がある。
【0036】
その他の臨床的利点には、臓器の罹患率の低下、および診断後の推定期間を上回る生存の可能性の増加が含まれる。
【0037】
対象は、上記のように重度のインスリン抵抗性糖尿病を有するとして分類され得る。本発明の方法による治療が特に有効である可能性がある特定の対象には、少なくとも５２ｍｍｏｌ／ｍｏｌのＨｂＡ１ｃレベルを有する対象が含まれる。この値は、当技術分野で知られている日常的な方法を使用して決定することができる。
【0038】
言及され得る他の特定の対象には、特定の試験で場所での基準範囲を超えるＣ－ペプチドレベルを有する対象が含まれる。Ｃ－ペプチドは、プロインスリン分子においてインスリンのＡ鎖をＢ鎖に接続する短い３１アミノ酸のポリペプチドである。糖尿病では、Ｃ－ペプチド血清レベルの測定は、同様の臨床的特徴を持つ疾患から区別するため使用できる。基準範囲は、患者および最近の食物摂取量などの最近の活動によって異なる場合がある。例えば、絶食後の健康な個人におけるＣ－ペプチド測定値は、０．１３～０．７０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であり得る。重度のインスリン抵抗性糖尿病を有する対象に関し言及され得る特有の上昇値には、１．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上、より限定すると１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血中Ｃ－ペプチド濃度が含まれる。
【0039】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする対象は、糖尿病性腎疾患にかかり易いというリスクが高いまたは、糖尿病性腎症と診断される可能性がある。また、心血管疾患を患っている、またはそのリスクが高い可能性がある。本発明の方法は、患者、特にここに示される者に少なくともいくつかの臓器保護の利益を提供すると考えられている。結果として、本発明の方法による重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする対象の治療は、治療中および／または治療後の糖尿病性腎疾患の有病率の低下をもたらす可能性がある。したがって、治療される対象には、糖尿病性腎疾患に対する感受性のリスクが高いことが好ましい。すでに糖尿病性腎疾患を患っている対象もまた、例えば、糖尿病性腎疾患の重症度が増加する速度の低下によって、本発明の治療方法から利益を得る可能性がある。本発明の一実施形態では、治療される対象は糖尿病性腎疾患を有する。
【0040】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っている対象の治療は、対象が、まずその状態を有すると識別されることを必要とする。診断に必要な臨床パラメータのいくつかは、本明細書の他の場所およびＥｍｍａ Ａｈｌｑｖｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐ３６１－３６９，２０１８に述べられている。したがって、本発明は、糖尿病を治療する方法にも関し、該方法は、以下を含む。
（ｉ）重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っている対象を特定し、および
（ｉｉ）式Ｉの化合物（本明細書の他の場所で定義される）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを該対象に投与する。
（ｉ）重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っている対象を特定し、および
（ｉｉ）式Ｉの化合物（本明細書の他の場所で定義される）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを該対象に投与する。
【0041】
ステップ（ｉ）は、これらの対象について上記の生理学的および病理学的側面の少なくとも１つの評価を含む、対象の臨床評価に関係する。対象は、Ａｈｌｑｖｉｓｔ ｅｔ．ａｌ、同上、に定められた基準を満たしている場合、重度のインスリン抵抗性糖尿病を患っていると見なされる。これは、例えば、以下の１つまたは好ましくはすべてを含み得る：３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、５２ｍｍｏｌ／ｍｏｌ以上のＨｂＡ１ｃレベル、および特定の試験場所での基準範囲を超えるＣ－ペプチドレベル。
【0042】
ステップ（ｉｉ）は、本明細書の他の場所に記載されているものを含む、任意の適切な投与経路、製剤、および投与計画を使用して実施することができる。該治療は、例えば、対象における全身性インスリン抵抗性の発症の抑制をもたらす可能性がある。該治療はまた、対象による食物摂取を減少させることのない可能性も有しながら、体重減少および体脂肪減少の誘発をもたらす可能性がある。治療から生じる可能性のある他の臨床効果は、実施例から明らかになるであろう。
【0043】
式Ｉの化合物は、４－クロロ－Ｎ－［２－［（４－クロロフェニル）メチル］－３－オキソ－１，２，４－チアジアゾール－５－イル］ベンズアミドとしても知られている。
【0044】
化合物が互変異性体として存在する可能性がある場合、述べられた構造は可能な互変異性体の形態の１つを表し、観察される実際の互変異性体は、溶媒、温度、またはｐＨなどの環境要因によって変わる可能性がある。
【0045】
式Ｉの化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグは、例えば以下に記載されるように、当業者に周知の技術に従って調製することができる。例えば、４－クロロ－Ｎ－［２－［（４－クロロフェニル）メチル］－３－オキソ－１，２，４－チアジアゾール－５－イル］ベンズアミドは、国際特許出願ＷＯ２０１１／００４１６２に記載されている技術に従って製造することができる。そして、そのすべての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0046】
したがって、本発明の化合物は、空腹時血糖値およびインスリン抵抗性（例えば、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価による）の両方の低下を促進する任意の形態で対象に投与することができる。特に、本発明の化合物は、経口、静脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経粘膜（例えば、舌下または頬側）、直腸、経皮、鼻、肺（例えば、気管または気管支）、局所的に、他の任意の非経口経路により、薬学的に許容される剤型でこの化合物を含む医薬調製物の形態で投与され得る。特定の実施形態では、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグは、経口、経鼻、非経口または吸入によって投与される。好ましくは、投与は経口的に行われる。
【0047】
本発明の化合物は、一般に、薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と混合した医薬製剤として投与され、これらは、意図される投与経路および標準的な薬学上の実施を十分に考慮して選択され得る。そのような薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であっても良く、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さなくても良い。適切な医薬製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）に見出すことができる。非経口投与の場合、パイロジェンを含まず、必要なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液を使用することができる。多くの方法が文献に記載されているので、適切な溶液は当業者に十分に知られよう。薬物送達の方法の簡単なレビューはまた、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９ １５２７（１９９０）に見出されるかも知れない。
【0048】
本明細書に記載の本発明の方法において、薬学的に活性な化合物は、経口投与用の錠剤、カプセルまたはエリキシル、直腸投与用の坐剤、非経口もしくは筋肉内投与用の滅菌溶液もしくは懸濁液を含む既知の製剤によって、または吸入などを経由して投与することができる。吸入による投与は、好ましくはネブライザーを使用して行われ、例えば、本発明の化合物を、好ましくは治療対象に刺激または咳を引き起こさずに、肺胞および細気管支を含む小さな肺組織に送達する。
【0049】
他の適切な製剤の調製は、当業者が日常的な技術を使用して、ならびに／または標準的および／もしくは認められた薬学的な実施に従って、創意を必要とせずに達成することができる。
【0050】
対象に投与される本発明の化合物の量は、治療または予防を受ける状態、状態の重症度、対象、および投与経路、および使用される化合物により変わり得るが、当業者によって創意を必要とせずに決定され得る。本発明の化合物は、それを必要とする患者に様々な治療上有効な用量で投与することができる。
【0051】
用量は患者ごとに異なるが、適切な１日量は、患者１人につき約０．１～約５０００ｍｇの範囲（例、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ｍｇ、１２５０ｍｇ、１５００ｍｇ、１７５０ｍｇ、２０００ｍｇ、２５００ｍｇ、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、４５００ｍｇ、５０００ｍｇなど、またはその中の任意の範囲または値）であり、単回または複数回投与される。投与は、連続的または断続的でもよい（例えば、ボーラス注射による）。投与量はまた、投与のタイミングおよび頻度によって決定され得る。経口投与または非経口投与の場合、投与量は、好ましくは、本発明の化合物、１日あたり約１ｍｇ～約２０００ｍｇまで変化する（または、使用される場合、対応する量の薬学的に許容される塩またはそのプロドラッグ）。特定の実施形態では、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグは、約１～約２０００ｍｇの範囲の１日量で対象に投与される。
【0052】
化合物の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはわずか０．１％の変動を指す。
【0053】
いずれにせよ、本発明の文脈において哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物において治療的反応をもたらすのに十分であるべきである。当業者は、正確な用量および組成ならびに最も適切な送達レジメンの選択が、とりわけ、製剤の薬理学的特性、治療を受ける状態の性質および重症度、ならびに投薬を受ける者の身体的状態および精神的鋭敏さ、ならびに特定の化合物の力価、治療される患者の年齢、状態、体重、性別および反応、ならびに疾患の病期／重症度によっても影響を受けることを認識するであろう。
【0054】
開業医または他の当業者は、個々の患者に最も適した実際の投与量をいつものように決定することができるであろう。上記の投与量は、平均的な場合の例である。もちろん、より高いまたはより低い投与量範囲がふさわしい個々の例があり得よう。そして、そのようなものは本発明の範囲内である。
【0055】
さらに、いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１つ以上の他の治療薬、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと組み合わせて、上記の用途（例えば、２型糖尿病の治療のために）のための薬剤を製造するために使用される。
【0056】
この点で言及される可能性のある特定の他の治療薬には、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤が含まれる。当業者は、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤が、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２の活性を阻害する物質または薬剤であることを理解するであろう。したがって、本発明の第２の態様によれば、以下の組み合わせが提供される。
（Ａ）式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ）および
（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ）。
該組み合わせは、本明細書では「本発明の組み合わせ」と呼ばれる。
（Ａ）式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ）および
（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ）。
該組み合わせは、本明細書では「本発明の組み合わせ」と呼ばれる。
【0057】
「ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２の活性を阻害する」という表現は、物質または薬剤がナトリウム－グルコース輸送タンパク質２の１つ以上の機能の低下を誘発することを意味し、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２の機能の低下により、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２の１つ以上の機能の停止、または特定の機能の速度の低下を含めている。完全にまたは部分的に阻害され得る特定の機能とは、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２がグルコース輸送体として作用する能力である。
【0058】
ＳＧＬＴ２阻害剤は、ＳＧＬＴ２の活性を選択的に阻害する物質または薬剤である。ＳＧＬＴ２の活性を選択的に阻害することにより、ＳＧＬＴ２阻害剤が、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質１（ＳＧＬＴ１）の１つ以上の機能に優先してＳＧＬＴ２の１つ以上の機能を選択的に停止またはその速度を低下させることを意味する。たとえば、ＳＧＬＴＩを上回るＳＧＬＴ２に対する選択性のレベルは、約２：１～５０００：１の範囲でも良い。例えば、ＳＧＬＴ２阻害剤は、ＳＧＬＴ２対ＳＧＬＴ１について、約１０：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、約５０００：１、約５０００：１よりも大きい選択性を有しても良い。したがって、特定の実施形態では、ＳＧＬＴ２阻害剤は、選択的ＳＧＬＴ２阻害剤である。当業者は、物質または薬剤がナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤として作用するかどうかを当業者が決定することを可能にする、実施可能な標準的な試験を認識するであろう。
【0059】
好ましい実施形態において、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤は、９００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有するいわゆる「小分子」である。このような分子は、「薬物様」分子と呼ばれても良い。特定の実施形態において、本発明の組み合わせに存在するナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤は、グリフロジン（ｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）である。グリフロジンは、既知のクラスの小分子ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤である。Ｈａｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２０１６、６５、２７８４－２７９４）およびＶｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１６、５、１０４８－１０５６）は最近、あるグリフロジン類の可能な作用機序について議論した。ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２を阻害することにより、グリフロジンは糸球体濾液からの腎臓でのグルコースの再吸収（すなわち、腎グルコース再吸収）の程度を低下させ、それが次に血糖濃度を低下させる。ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２を阻害することができるいずれの化合物も、本発明の組み合わせにおいて有効であり得る。
【0060】
本発明の組み合わせに存在し得る（グリフロジンクラスの）特定のナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤には、カナグリフロジン（ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ダパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、エンパグリフロジン（ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、イプラグリフロジン（ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、トホグリフロジン（ｔｏｆｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、セルグリフロジン（ｓｅｒｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）（セルグリフロジンエタボネート（ｓｅｒｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｅｔａｂｏｎａｔｅ）など）、レモグリフロジン（ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）（レモグリフロジンエタボネート（ｒｅｍｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｅｔａｂｏｎａｔｅ）など）、エルツグリフロジン（ｅｒｔｕｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）およびソタグリフロジン（ｓｏｔａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、本発明の組み合わせに存在するナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤は、カナグリフロジン［（１Ｓ）－１，５－アンヒドロ－１－Ｃ－（３－｛［５－（４－フルオロフェニル）チオフェン－２－イル］メチル］｝－４－メチルフェニル）－Ｄ－グルシトールとしても知られる］、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグである。
【0061】
本発明の組み合わせは、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする対象の糖尿病を治療するのに特に有用であり得る。したがって、本発明の第３の態様では、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする対象の糖尿病を治療する方法が提供され、この方法は、本明細書で定義される本発明の組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0062】
同様に、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特徴付けられる対象における糖尿病を治療するための薬剤の製造において、本明細書で定義される本発明の組み合わせの使用が提供される。
【0063】
本発明の組み合わせの成分（Ａ）および（Ｂ）（すなわち、式Ｉの化合物およびＳＧＬＴ２阻害剤）は、別個の製剤として、または組み合わせた調製物として（すなわち、式１の化合物およびＳＧＬＴ２阻害剤を含む単一の製剤として提供され得る）提供され得る。式Ｉの化合物およびＳＧＬＴ２阻害剤は、対象に有益な効果を可能にするために、同時に、または時間的に十分に接近して、（任意に繰り返して）投与することができる。好ましくは、該有益な効果は、治療の一部または全過程にわたって、式Ｉの化合物を含む処方物またはＳＧＬＴ２阻害剤を含む処方物の使用によって達成可能なものよりも大きいか、または、治療が２つの主成分の両方ではなく一方の使用を含むときには、観察されない有益な効果である。治療の過程での本発明の組み合わせの有益な効果の評価は、治療を受けるまたは予防される状態に依存するが、当業者によって通常の方法により達成され得る。
【0064】
たとえば、当業者は、本発明の組み合わせの成分（Ａ）および（Ｂ）が、関連する状態の治療の過程にわたって、連続して、別々に、および／または同時に投与され得ることを認識するであろう。この方法での投与は、２つの活性物質が異なる薬物動態プロファイルを持っている場合に必要になる場合がある。例えば、組み合わせの一方の成分の投与頻度は、他方の投与頻度とは別に変更する必要があるかもしれない。したがって、本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物およびナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤は、それを必要とする対象に、連続して、別々に、および／または同時に投与される。
【0065】
式Ｉの化合物は、糖尿病を治療する目的でナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤で治療されてきた（または治療される予定の）対象に投与することができる。したがって、本発明の別の態様において、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用が提供されるが、その場合、この薬剤はナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、本明細書の他の場所で定義されたもの）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグでも治療される対象に投与される。
【0066】
同様に、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤は、糖尿病を治療する目的で式Ｉの化合物でも治療された（または治療される予定の）対象に投与することができる。したがって、本発明の別の態様において、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、本明細書の他の場所で定義されるもの）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用が提供されるが、その場合、この薬剤は式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグでも治療される対象に投与される。
【0067】
グリフロジンなどのナトリウム－グルコース輸送タンパク質２阻害剤、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグは、例えば以下に記載されるように、当業者に周知の技術に従って調製することができる。例えば、カナグリフロジンは、国際特許出願第ＷＯ２００５／０１２３２６に記載されている技術に従って製造することができる。誤解を避けるために、本明細書におけるカナグリフロジンへの言及は、商品名Ｉｎｖｏｋａｎａ（登録商標）で販売されているカナグリフロジン半水和物を含む。カナグリフロジンおよび他のＳＧＬＴ２阻害剤は、当技術分野で知られ一般的に受け入れられている投薬量に従ったレベルで投与することができる。
【0068】
本発明の組み合わせで存在する式Ｉの化合物の量は、既存のＳＧＬＴ２阻害剤の量と同じであっても異なっていてもよい。たとえば、本発明の組み合わせで存在する式Ｉの化合物に対するＳＧＬＴ２阻害剤の重量比は、約１：１０００～約１０００：１、例えば、約１：１００～１０：１（例えば、約１：１０～約１：１）であり得る。言及され得る式Ｉの化合物に対するＳＧＬＴ２阻害剤の特定の重量比には、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、１：５、１：５．５、１：６、１：６．５、１：７、１：７．５、１：８、１：８．５、１：９、１：９．５、１：１０を含む。
【0069】
式Ｉの化合物は、マウスの高体重、インスリン抵抗性および高血糖症を治療することが示され、そしてそれは、ヒトの糸球体における微小血管灌流に好ましい効果を有することが示されている。重度のインスリン抵抗性糖尿病を有することを特徴とする、明確な、治療が不十分なヒト患者の集団が認識されている。この集団は通常、肥満、インスリン抵抗性、高血糖症であり、糖尿病性腎疾患のリスクが高い。この集団の糖尿病の治療に式Ｉの化合物を使用することの利点は、このように治療の目的とすることが、この現在不十分な治療しかされていない患者グループが著しく向上した治療上の注意を受け得ることを含む。
【0070】
本明細書に開示される本発明の方法はまた、式Ｉの化合物を含む方法が、そのような対象の糖尿病の治療に有用であるとして従来技術で知られている方法と比較して、より有効であり、より毒性が低く、より長く作用し、より強力であり、より少ない副作用を生じ得る、および／または、他の有用な薬理学的、物理的、もしくは化学的特性を有し得るという長所も有し得る。そのような効果は、医療専門家、治療対象、または観察者によって、臨床的、客観的、および／または主観的に評価され得る。
【0071】
本発明の化合物について本明細書に要約されたデータは、式Ｉの試験化合物が、高体重、インスリン抵抗性および高血糖を効果的に治療し、糸球体における微小血管灌流に好ましい効果を有することを示す。
【0072】
本明細書で参照されるすべての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により組み込まれる。用語が矛盾する場合は、本明細書が優先される。さらに、本発明の一態様に記載されている実施形態は、記載されている態様に限定されない。実施形態はまた、当該実施形態が、本発明の異なる態様がそれらの意図された目的のために動作することを妨げることのない限り、本発明のこれらの態様にも適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0073】
以下の図面は、本発明の概念の様々な態様を説明するために提供されており、本明細書で指定されない限り、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図1】（Ａ～Ｆ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｐ－Ｔ１７２ ＡＭＰＫを増加させ、細胞内のＰ－Ｔ１７２ＡＭＰＫおよびＡＴＰを増加させる。（ＡおよびＢ）ＡＴＰの非存在下（Ａ）（条件ごとにｎ＝８）および１．０ｍＭのＡＴＰ存在下（Ｂ）（条件ごとにｎ＝４）でのｐ－Ｔ１７２ＡＭＰＫのＰＰ２Ｃを介した脱リン酸化の試験物質の用量依存的抑制の代表的なイムノブロット分析および定量。（Ｃ－Ｅ）Ｗｉ－３８ヒト肺線維芽細胞におけるｐ－Ｔ１７２ ＡＭＰＫのおよびｐ－Ｓ７９ ＡＣＣのリン酸化（条件ごとにｎ＝１１）の試験物質の用量依存的な増加の代表的なイムノブロット分析（Ｃ）及び定量（ｐ－Ｔ１７２ ＡＭＰＫ（Ｄ），ｐ－Ｓ７９ ＡＣＣ（Ｅ））。（Ｆ）試験物質で処理したＷｉ－３８ヒト肺線維芽細胞におけるＡＴＰ／タンパク質レベルの用量依存的な増加（条件ごとにｎ＝６）。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図2】（Ａ～Ｉ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、食餌誘発性肥満マウスの高血糖およびインスリン抵抗性を予防する。（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられ、ビヒクルまたは試験物質±メトホルミンを経口強制投与されたＢ６マウスの週単位のスケジュール。（ＢおよびＣ）ビヒクル（ｎ＝１０）、試験物質（ｎ＝１０）、メトホルミン（ｎ＝１０）、および試験物質＋メトホルミン（ｎ＝１０）で６週間処理されたＨＦＤ給餌のＢ６マウスにおける空腹時グルコース（Ｂ）および空腹時インスリン（Ｃ）。（Ｄ）ＢおよびＣからの恒常性モデル評価－インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ）計算。（Ｅ）ビヒクル（ｎ＝１０）、試験物質（ｎ＝１０）、メトホルミン（ｎ＝１０）、および試験物質＋メトホルミン（ｎ＝１０）で８週間処理されたＨＦＤ給餌のＢ６マウスのふくらはぎ筋肉におけるｐ－Ｔ１７２ＡＭＰＫレベルの代表的なイムノブロット分析および定量。（Ｆ）ビヒクル（ｎ＝１０）、試験物質（ｎ＝１０）、メトホルミン（ｎ＝９）、および試験物質＋メトホルミン（ｎ＝１０）で８週間処理されたＨＦＤ給餌のＢ６マウスのふくらはぎの筋肉におけるＴｘｎｉｐおよびＧｌｕｔ１の相対的なｍＲＮＡレベル。（ＧおよびＨ）通常食（ＲＤ）（ｎ＝４０）またはＨＦＤいずれかを７週間（＝開始；ｎ＝１０＋１０）与えたＢ６マウスの空腹時血糖値（Ｇ）およびインスリンレベル（Ｈ）。次に、ＨＦＤを与えられたマウスに、さらに４週間ＨＦＤを継続し、ビヒクル（ｎ＝１０）または試験物質＋メトホルミン（ｎ＝１０）を経口強制投与した。（Ｉ）ＧおよびＨからのＨＯＭＡ－ＩＲ計算。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ステューデントのｔ検定）として表される。
【図3】（Ａ～Ｈ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、ｈＩＡＰＰｔｇ食餌誘発性肥満マウスの糖尿病を予防する。（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられ、ビヒクルまたは試験物質を経口強制投与されたｈＩＡＰＰｔｇマウスの週単位のスケジュール。（ＢおよびＣ）ビヒクル（ｎ＝２５）および試験物質（ｎ＝２７）で６週間処理し、ＨＦＤを給餌したｈＩＡＰＰｔｇマウスにおける空腹時血糖値（Ｂ）およびインスリンレベル（Ｃ）。（ＤおよびＥ）ビヒクル（ＩＰＧＴＴ、ｎ＝１３；ＯＧＴＴ、ｎ＝７）および試験物質（ＩＰＧＴＴ、ｎ＝１６；ＯＧＴＴ、ｎ＝７）で６週間処理されたＨＦＤ給餌のｈＩＡＰＰｔｇマウスにおける腹腔内投与（ｉ．ｐ．）耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）（Ｄ）および経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）（Ｅ）中の血糖、血漿インスリンプロファイル、およびＡＵＣ。（Ｆ）通常食（ＲＤ）（ｎ＝７）を給餌された１０週齢のｈＩＡＰＰｔｇマウスと比較した、試験物質で６週間（Ｄから、ｎ＝１６）処理されたＨＦＤ給餌の１６週齢のｈＩＡＰＰｔｇマウスのＩＰＧＴＴ中の血漿インスリンプロファイルおよびＡＵＣ。（Ｇ）ＢおよびＣのグルコースおよびインスリンレベルからのＨＯＭＡ－ＩＲ計算。（Ｈ）ビヒクルおよび試験物質で処理したｈＩＡＰＰｔｇマウスにおけるＩＰＧＴＴ（Ｄ）およびＯＧＴＴ（Ｅ）からのＭａｔｓｕｄａ指数計算。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図4】（Ａ～Ｍ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、用量依存的に、食餌誘発性肥満マウスの高血糖を回避し、ｈＩＡＰＰｔｇ食餌誘発性肥満マウスの糖尿病を元に戻す。（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤであって、０．４（ｎ＝５）、０．８（ｎ＝１０）および２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含むものを７週間、摂取したＣＢＡマウスのふくらはぎの筋肉におけるｐ－Ｔ１７２ＡＭＰＫレベルの代表的なイムノブロット分析および定量。（Ｂ－Ｄ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤであって、０．４（ｎ＝５）、０．８（ｎ＝１０）および２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含むものを６週間、摂取したＣＢＡマウスにおける空腹時血糖値（Ｂ）および空腹時インスリンレベル（Ｃ）、ならびにＨＯＭＡ－ＩＲ（Ｄ；ＢおよびＣから）。（Ｅ）ＨＦＤを９週間与えた後、さらに７週間ＨＦＤを継続するか、または試験物質－ＨＦＤ（Ｆ－Ｈで２ｍｇ／ｇ、ｌ－Ｍで０．８ｍｇ／ｇ）に切り替えたｈＩＡＰＰｔｇマウスの週単位のスケジュール。（Ｆ－Ｈ）開始時、ＨＦＤ給餌９週および１５週におけるｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝１０）の、ならびに開始時、９週のＨＦＤ、および９週のＨＦＤ＋６週の試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）におけるｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝１２）の、空腹時血糖値（Ｆ）およびインスリンレベル（Ｇ）、ならびにＨＯＭＡ－ＩＲ（Ｈ；ＦおよびＧから）。（ＩおよびＪ）１５週間のＨＦＤ（ｎ＝１２）またはＨＦＤ９週間＋６週間の試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）（ｎ＝７）でのｈＩＡＰＰｔｇマウスの体重（Ｉ）および体脂肪（Ｊ）の変化。（Ｋ－Ｍ）１５週間のＨＦＤ給餌のｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝１２）の開始時、９週、１５週における、ならびに開始時、９週のＨＦＤにおける、および９週＋６週試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）（ｎ＝７）における、ｈＩＡＰＰｔｇマウスの空腹時血糖値（Ｋ）およびインスリンレベル（Ｌ）、およびＨＯＭＡ－ＩＲ（Ｍ；ＫおよびＬから）。データは、平均±ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定［Ａ－Ｄ、Ｉ、およびＪ］；対応のある両側ｔ検定）として表される。
【図5】（Ａ～Ｅ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、骨格筋へのグルコース取り込みを増加させる。（Ａ）示されているとおり、試験物質で処理されたラット骨格Ｌ６筋管細胞における２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）の取り込み。（ビヒクル、ｎ＝８；２．５μＭ試験物質、ｎ＝６；５．０μＭ試験物質、ｎ＝６；および１０．０μＭ試験物質、ｎ＝３）。（Ｂ－Ｄ）示されているとおり、代表的なイムノブロット分析（Ｂ）ＡＭＰＫ発現の定量（Ｃ）（ｎ＝６）、および試験物質で処理されたｓｉＲＮＡ導入ラット骨格Ｌ６筋管細胞における２－ＤＧグルコース取り込みが（各条件についてｎ＝８）（Ｄ）。（Ｅ）高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝８）または試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）（ｎ＝６）を２週間摂取したＣＢＡマウスのふくらはぎおよび大腿筋の－フルオロデオキシグルコース（－ＦＤＧ）レベル。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図6】（Ａ～Ｈ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、ｈＩＡＰＰｔｇ食餌誘発性肥満マウスにおけるアミロイド形成を減少させ、食餌誘発性肥満マウスにおけるアルギニン誘発性インスリン分泌を改善する。高脂肪食（ＨＦＤ）を１６週間摂取したｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝９）およびＨＦＤを９週間摂取し、追加の７週間は、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に転換したｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝９）の、Ｔｈｉｏ－Ｓ＋アミロイド沈着物の代表的な画像（Ａ）および定量（Ｂ）。（Ｃ）ＩＮＳ－１インスリノーマ細胞におけるｐ－Ｔ１７２ＡＭＰＫの試験物質刺激の代表的なイムノブロット分析および定量化（条件ごと、それぞれビヒクル、２．５μＭおよび５μＭ試験物質、ｎ＝９；１０μＭ試験物質、ｎ＝６、）、マウス初代膵島（条件ごとにｎ＝６）、ｈＩＡＰＰｔｇマウス初代膵島（条件ごとにｎ＝６）、およびヒト膵島（条件ごとにｎ＝８）。（ＤおよびＥ）示されているとおり、１１ｍＭグルコース（ｎ＝３６膵島）、２２ｍＭグルコース（ｎ＝４５膵島）、２２ｍＭグルコースならびに２．５μＭ（ｎ＝４２膵島）、５．０μＭ（ｎ＝４１膵島）および１０μＭ試験物質（ｎ＝３６膵島）を含むもの中で、９６時間生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で培養されたｈＩＡＰＰｔｇ膵島におけるＴｈｉｏ－Ｓ＋アミロイド沈着物の代表的な画像（Ｄ）および定量（Ｅ）（それぞれについてｎ＝３試験）。（ＦおよびＧ）示されているとおり、１１ｍＭグルコース（ｎ＝４３膵島）、５．０μＭ ３－ＭＡを含む１１ｍＭグルコース（ｎ＝５９膵島）、２２ｍＭグルコース（ｎ＝５４膵島）、５．０μＭ試験物質を含む２２ｍＭグルコース（３５膵島）、および５．０μＭ試験物質と５．０μＭ ３－ＭＡを含む２２ｍＭグルコース（ｎ＝４４膵島）中で９６時間、生体外で培養されたｈＩＡＰＰｔｇ膵島におけるＴｈｉｏ－Ｓ＋アミロイド沈着物の代表的な画像（Ｆ）および定量（Ｇ）（それぞれｎ＝３の試験）。（Ｈ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）（ｎ＝１０）を１１週間与えたＣＢＡマウスへのアルギニン（１ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後の血漿インスリンプロファイルおよびＡＵＣ。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図7】（Ａ～Ｈ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、熱中性条件で、確立された肥満を元に戻す。（ＡおよびＢ）示されているとおり、飼育および熱中性条件で、高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝５）と試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）（ｎ＝５）を交換したときのＣＢＡマウスの経時的な体重変化（Ａ）および食物摂取量（Ｂ）。（Ｃ～Ｅ）ＨＦＤ（ｎ＝８）および試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）（ｎ＝８）を１１週間与えたＣＢＡマウスにおける酸素消費量（Ｖ０２）（Ｃ）、呼吸交換率（ＲＥＲ）（Ｄ）、およびエネルギー消費量（ＥＥ）率（Ｅ）。（Ｆ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤ（０．４（ｎ＝５）、０．８（ｎ＝１０）、および２ｍｇ／ｇ（ｎ－１０））を７週間与えられたＣＢＡマウスの鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）におけるＡＴＧＬおよびｐ－Ｓ４０６ＡＴＧＬの代表的なイムノブロット分析および定量。（Ｇ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤであって２ｍｇ／ｇ試験物質をふくむもの（ｎ＝１０）を７週間与えられた１９週齢のＣＢＡマウスのＡｔｇｌ、Ｃｐｔ１ｂ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、およびＣｏｘ８ｂの相対的なｍＲＮＡレベル。（Ｈ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および試験物質－ＨＦＤであって２ｍｇ／ｇ試験物質を含むもの（ｎ＝１０）を７週間与えられた１９週齢のＣＢＡマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）のＣｄ３６、Ｆａｓ、Ｓｃｄ１、Ａｃｃ１、およびＣｐｔ１ｂの相対的ｍＲＮＡレベル。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図8】（Ａ～Ｇ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、食餌誘発性肥満マウスの心臓グリコーゲンを減少させ、一回拍出量を改善するが、心肥大を引き起こさない。（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝１０）ならびに０．８（ｎ＝１０）および２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含む試験物質－ＨＦＤを７週間与えられたＣＢＡマウスの心臓グリコーゲン含有量。（Ｂ）ＨＦＤ（ｎ＝８）または試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）（ｎ＝６）を２週間与えたＣＢＡマウスの心臓における－フルオロデオキシグルコース（－ＦＤＧ）レベル。（Ｃ）ＨＦＤ（ｎ＝１０）および０．８（ｎ＝１０）および２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含む試験物質－ＨＦＤを７週間含与えられたＣＢＡマウスの心臓重量。（Ｄ～Ｆ）通常食（ＲＤ）を与えられた１６週齢のＣＢＡマウス（ｎ＝９）の、ならびにＨＦＤ（ｎ＝９）および０．８ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）または２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含む試験物質－ＨＦＤを６週間与えられた１８週齢のＣＢＡマウスの拡張末期容積（ＥＤＶ）（Ｄ）、収縮末期容積（ＥＳＶ）（Ｅ）、および一回拍出量（ＳＶ）（Ｆ）。（Ｇ）通常食（ＲＤ）を与えられた１６週齢のＣＢＡマウス（ｎ＝９）の、ならびにＨＦＤ（ｎ＝９）および０．８ ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）または２ｍｇ／ｇ（ｎ＝１０）の試験物質を含む試験物質－ＨＦＤを６週間与えられた１８週齢のＣＢＡマウスの心拍数（ＨＲ）。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）として表される。
【図9】（Ａ－Ｆ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、マウスの微小血管の血流と持久力を改善する。（ＡおよびＢ）ビヒクルで（ｎ＝１０）および試験物質で処理された（ｎ＝１０）、８週間高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられたＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ（Ｆ１）マウスの左後足における末梢血灌流の代表的なレーザードップラー画像（Ａ）および定量（Ｂ）。（ＣおよびＤ）ビヒクルで（ｎ＝１４）および試験物質（ｎ＝１４）で処理された老化した痩せたＢ６マウスの、試験物質処理３０日後の持久力試験（Ｃ）および乳酸レベル（Ｄ）。（ＥおよびＦ）ビヒクルまたは示された濃度で試験物質を単回投与された犬の収縮期（Ｅ）および拡張期（Ｆ）血圧。データは平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃＃Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＃＃＃Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）として表される。ＥおよびＦで、＊はビヒクル対５４０ｍｇ／ｋｇ試験物質を示し、＃はビヒクル対１８０ｍｇ／ｋｇ試験物質を示す。
【図10】（Ａ～Ｅ）。試験物質（「Ｏ３０４」）は、２型糖尿病において、空腹時血糖値および血圧を低下させ、微小血管灌流を増加させる。メトホルミンを投与された２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者。（Ａ～Ｃ）メトホルミンを投与され、プラセボ（ｎ＝２４）および試験物質（ｎ＝２５）で治療を受け、１日目の空腹時血糖値（ＦＰＧ）範囲は７より高く１３．３ｍｍｏｌ／ｌより低い（１２６より高く２４０ｍｇ／ｄｌより低い）２型糖尿病患者における１日目および２８日目の空腹時血糖値（ＦＰＧ）（ＡおよびＢ）およびＨＯＭＡ－ＩＲ（Ｃ）。（Ｄ）２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉におけるスクリーニング時（ＭＲＩ１）および２７－２９日目（ＭＲＩ２）にＭＲＩによってモニターされた動的Ｔ２＊－定量化によって評価された充血性微小血管灌流。試験物質群とプラセボ群は、ベースラインでのピークまでの時間（ＴＴＰ）に基づいて半分に分かれた。ここで、短いＴＴＰ（プラセボＡ［ｎ＝１４］、試験物質Ａ［ｎ＝１４］）および長いＴＴＰ（プラセボＢ［ｎ＝１３］、試験物質Ｂ［ｎ＝１４］）は、それぞれ充血性灌流の速度が比較的高いことと低いことを表している。ＴＴＰの有意な短縮（Ｐ＝０．０４３）とΔ－Ｔ２＊の増加（Ｐ＝０．０３４）が、試験物質群のベースラインでの灌流速度が比較的低い（長いＴＴＰ）被験者（すなわち、試験物質Ｂ ＭＲＩ１と試験物質ＢＭＲＩ２の比較）で観察されたが、ＴＴＰが短い被験者では観察されず、また、プラセボ群のベースラインでＴＴＰが短い被験者または長い被験者にも差はなかった。（Ｅ）プラセボ（ｎ＝２７）または試験物質（ｎ＝３０）で治療されたメトホルミンの投与を受ける２型糖尿病患者における１から２８日目の収縮期および拡張期血圧の絶対的および相対的変化。データは、平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ウィルコクソンの符号付順位和検定）として表されます。
【図11】化合物１とカナグリフロジンの併用療法。空腹時血糖、空腹時血漿インスリンおよびＨＯＭＡ－ＩＲ。
【実施例】
【0074】
実施例１および２で使用した試験物質は、４－クロロ－Ｎ－［２－［（４－クロロフェニル）メチル］－３－オキソ－１，２，４－チアジアゾール－５－イル］ベンズアミドであった。この物質は以下「試験物質」などと呼ばれる。この研究で使用された試験物質は、Ａｎｔｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｖｔ Ｌｔｄ．（インド、バンガロール）によって Ｂａｌｔｉｃ Ｂｉｏ ＡＢ（ウメオ、スウェーデン）およびＢｅｔａｇｅｎｏｎ ＡＢ（ウメオ、スウェーデン）のため、合成および精製された。７．４．
【0075】
実施例１
ここでは、ｐＡＭＰＫの脱リン酸化を抑制することでＡＭＰＫ活性を高めることがわかった、試験物質と呼ばれるＰＡＮ－ＡＭＰＫ活性化因子の同定と試験について説明する。
ここでは、ｐＡＭＰＫの脱リン酸化を抑制することでＡＭＰＫ活性を高めることがわかった、試験物質と呼ばれるＰＡＮ－ＡＭＰＫ活性化因子の同定と試験について説明する。
【0076】
方法
研究デザイン
動物実験の場合、研究が実行される前にサンプルサイズの推定値は計算されなかった。特に明記しない限り、実験はランダム化されなかった。研究者は、いくつかの測定および定量化（ブドウ糖負荷試験、グルコース刺激インスリン分泌、アルギニン刺激インスリン分泌、アミロイド定量、心エコー検査、および心臓の超音波検査）を除いて、実験および結果評価中、割り付けを盲検化しなかった。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）データの場合、各ｎ値は１匹のマウスに対応する。アミロイドの定量では、各ｎ値は、それぞれ独立した試験および調査された膵島の総数に対応する。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）データの場合、各ｎ値は独立した試験に対応する。同じ試験が繰り返された場合、それらの平均はｎ＝１として考慮された。
研究デザイン
動物実験の場合、研究が実行される前にサンプルサイズの推定値は計算されなかった。特に明記しない限り、実験はランダム化されなかった。研究者は、いくつかの測定および定量化（ブドウ糖負荷試験、グルコース刺激インスリン分泌、アルギニン刺激インスリン分泌、アミロイド定量、心エコー検査、および心臓の超音波検査）を除いて、実験および結果評価中、割り付けを盲検化しなかった。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）データの場合、各ｎ値は１匹のマウスに対応する。アミロイドの定量では、各ｎ値は、それぞれ独立した試験および調査された膵島の総数に対応する。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）データの場合、各ｎ値は独立した試験に対応する。同じ試験が繰り返された場合、それらの平均はｎ＝１として考慮された。
【0077】
細胞培養アッセイでは、試験物質をＤＭＳＯ Ｈｙｂｒｉ－ＭａｘＴＭ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ２６５０）に溶解した。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）アッセイでは、試験物質を２％ｗ／ｖメチルセルロース、４ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４に溶解した。メトホルミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ１５０９５９）を２％ｗ／ｖメチルセルロース、４ｍＭリン酸緩衝液ｐＨに溶解した。
【0078】
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃマウスおよびＮＴａｃ：ＳＤラットにおける試験物質の薬物動態は、絶食していない動物の血漿のＵＨＰＬＣ－ＥＳＩ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＭＳＭＳを介して決定された。試験物質（４０ｍｇ／ｋｇ試験物質）は強制経口投与され、投与後４、８、１２、２４時間後に採血された。試験物質レベルは、試験物質（４０ ｍｇ／ｋｇ試験物質）を１日１回、３週間、強制経口投与された、絶食していない対照：ＣＤ（ＳＤ）ラットからの肝臓と脳で測定した。試験物質をアセトニトリルで抽出し、ＵＨＰＬＣ－ＥＳＩ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＭＳＭＳを使用してレベルを決定した。
【0079】
動物
雌対照：ＣＤ（ＳＤ）ラット（系統＃００１）、雄と雌のＷｉｓｔａｒラット（系統＃００３）、およびＺｕｃｋｅｒ Ｃｒｌ：ＺＵＣ－Ｌｅｐｒｆａラット（系統＃１８５）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂから入手した。雌のＮＴａｃ：ＳＤラットはＴａｃｏｎｉｃから入手した。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスは、ＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃０００６６４）から入手した。雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂ６ＪＢｏｍ）から入手した。雄のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ（Ｆ１）マウスは、ＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃１００１１）から入手した。ＣＢＡ／ＣａＣｒｌ（ＣＢＡ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＣＢＡ／ＣａＣｒｌ）から入手した。ｈＩＡＰＰｔｇマウスはＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃００８２３２）から入手し、兄弟姉妹の交配およびＣＢＡへの１０世代以上の戻し交配によって維持された。野生型同腹仔をｈＩＡＰＰｔｇマウスの対照として使用した。
雌対照：ＣＤ（ＳＤ）ラット（系統＃００１）、雄と雌のＷｉｓｔａｒラット（系統＃００３）、およびＺｕｃｋｅｒ Ｃｒｌ：ＺＵＣ－Ｌｅｐｒｆａラット（系統＃１８５）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂから入手した。雌のＮＴａｃ：ＳＤラットはＴａｃｏｎｉｃから入手した。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスは、ＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃０００６６４）から入手した。雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂ６ＪＢｏｍ）から入手した。雄のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ（Ｆ１）マウスは、ＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃１００１１）から入手した。ＣＢＡ／ＣａＣｒｌ（ＣＢＡ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＣＢＡ／ＣａＣｒｌ）から入手した。ｈＩＡＰＰｔｇマウスはＪＡＸマウス（Ｊａｘ＃００８２３２）から入手し、兄弟姉妹の交配およびＣＢＡへの１０世代以上の戻し交配によって維持された。野生型同腹仔をｈＩＡＰＰｔｇマウスの対照として使用した。
【0080】
１４－１５週齢の雄Ｂ６は、開始体重に基づいて、ビヒクル、メトホルミン、試験物質、およびメトホルミン＋試験物質治療群（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）に、１０匹／群で割り当てられ、８週間の試験期間全期間、ＨＦＤが与えられた。
【0081】
７週齢の雄Ｂ６にＨＦＤを７週間与え、その後、体重に基づいて、試験物質群およびメトホルミン＋試験物質治療群（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）に割り当て、さらに４週間ＨＦＤを与えた。
【0082】
１２週齢のＣＢＡマウスをＨＦＤと３つの試験物質－ＨＦＤ群（０．４ｍｇ／ｇ、０．８ｍｇ／ｇ、および２ｍｇ／ｇ）に７週間、無作為に割り付けた。表示のある場合、対照として通常食を与えた１６～１７週齢のＣＢＡマウスを使用した。
【0083】
１４週齢のＣＢＡマウスを２２℃で飼育しながら、ＨＦＤ群および試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）群に２週間無作為に割り付けた。次に、２つの群をＨＦＤから試験物質－ＨＦＤに、またはその逆にさらに４．５週間切り替えてから、２２°Ｃから３０°Ｃ（熱中性）に移した。３０℃で１週間後、餌を再び切り替え、切り替え後１週間で深部体温を測定した。
【0084】
１０～１１週齢の雄ｈＩＡＰＰｔｇマウスを、ビヒクルおよび試験物質治療群（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）に無作為に割り付け、６週間の試験期間を通してＨＦＤを与えた。１０～１１週齢の雄ｈＩＡＰＰｔｇ；ＣＢＡマウスおよび野生型同腹仔にＨＦＤを９週間与えた。９週間後、マウスを犠牲にするか、２つの群に無作為に割り付け、さらに７週間ＨＦＤを継続するか、または試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に切り替えた。
【0085】
８～１０週齢のＷｉｓｔａｒ雄および雌ラットにビヒクルまたは試験物質を１００、３００、もしくは６００ｍｇ／ｋｇ／日で６か月間、強制経口投与で処理された。
【0086】
動物は、温度／湿度が制御された（２２℃／５０％湿度）部屋で１２：１２時間の明／暗サイクルで飼育され、標準飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ＃８０１７３０）、高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ， Ｉｎｃ． ＃Ｄ１２４９２）またはそれぞれ２ｍｇ／ｇ試験物質、０．８ｍｇ／ｇ試験物質および０．４ｍｇ／ｇ試験物質で試験物質を注文配合されたＨＦＤ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．＃Ｄ１２４９２）のいずれかで随意に給餌された。
【0087】
単回の強制経口投与後の意識のあるビーグル犬における無線遠隔測定法を使用した心血管安全性薬理学研究
遠隔測定分析は、ＣｉＴｏｘＬＡＢ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（ラヴァル、ケベック、カナダ）によって、以前に遠隔測定送信機の埋め込み手術を受けたＣｉＴｏｘＬＡＢ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｄｏｇ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ Ｃｏｌｏｎｙから選択された成犬の雄のビーグル犬で実施され、動脈血圧、心電図、体温、および自発運動をモニターした（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、モデルＤ７０－ＰＣＴ）。すべての外科的処置は、関連する標準操作手順に従って実施された。遠隔測定送信機は、各動物の内腹斜筋と腹横筋の腱膜の間に配置された。圧力カテーテルを大腿動脈に挿入し、生体電位リードをＬｅａｄＩＩ構成で皮下に延ばした。試験物質は、６０、１８０、または５４０ｍｇ／ｋｇの懸濁液として強制投与された。
遠隔測定分析は、ＣｉＴｏｘＬＡＢ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（ラヴァル、ケベック、カナダ）によって、以前に遠隔測定送信機の埋め込み手術を受けたＣｉＴｏｘＬＡＢ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｄｏｇ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ Ｃｏｌｏｎｙから選択された成犬の雄のビーグル犬で実施され、動脈血圧、心電図、体温、および自発運動をモニターした（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、モデルＤ７０－ＰＣＴ）。すべての外科的処置は、関連する標準操作手順に従って実施された。遠隔測定送信機は、各動物の内腹斜筋と腹横筋の腱膜の間に配置された。圧力カテーテルを大腿動脈に挿入し、生体電位リードをＬｅａｄＩＩ構成で皮下に延ばした。試験物質は、６０、１８０、または５４０ｍｇ／ｋｇの懸濁液として強制投与された。
【0088】
食品管理、体重および組成
各ケージに２００ｇのペレットを与えることにより、食物摂取量を毎週測定した。１週間後、消費されたペレットの量を計算し、動物／ケージの数に応じて調整した。体重は毎週測定された。体組成はＥｃｈｏＭＲＩを使用して評価された。
各ケージに２００ｇのペレットを与えることにより、食物摂取量を毎週測定した。１週間後、消費されたペレットの量を計算し、動物／ケージの数に応じて調整した。体重は毎週測定された。体組成はＥｃｈｏＭＲＩを使用して評価された。
【0089】
心エコー検査
左心室の構造と機能は、ＭＳ５５０Ｄ変換器を使用した経胸壁高周波心エコー検査で分析された。検査は、軽いイソフルラン麻酔（８００ｍＬ酸素中１．５～２．０％）中に実施された。麻酔レベルは、呼吸数を毎分８０～１１０回に保つように調整された。左心室容積は、シンプソンの法則の再構成を使用してＢモードで決定された。すべての画像は、Ｖｅｖｏ ＬＡＢソフトウェア１．７．０を使用して盲検式でオフラインにて分析された。一回拍出量、心拍出量および心拍数、ならびに壁の厚さおよび左心室の直径を分析した。平均値をとるため３回の測定／動物を実施した。
左心室の構造と機能は、ＭＳ５５０Ｄ変換器を使用した経胸壁高周波心エコー検査で分析された。検査は、軽いイソフルラン麻酔（８００ｍＬ酸素中１．５～２．０％）中に実施された。麻酔レベルは、呼吸数を毎分８０～１１０回に保つように調整された。左心室容積は、シンプソンの法則の再構成を使用してＢモードで決定された。すべての画像は、Ｖｅｖｏ ＬＡＢソフトウェア１．７．０を使用して盲検式でオフラインにて分析された。一回拍出量、心拍出量および心拍数、ならびに壁の厚さおよび左心室の直径を分析した。平均値をとるため３回の測定／動物を実施した。
【0090】
レーザードップラー画像
９週齢のＦ１マウスにＨＦＤを８週間与え、ビヒクルまたは試験物質（４０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）で処理した。血液灌流分析の１日前に、Ｖｅｅｔ脱毛クリームを使用して左後足から脱毛した。イソフルランを使用してマウスを麻酔し、加熱パッド上に置いた。ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭ ＩＩ Ｉｍａｇｅｓを使用して血液灌流をスキャンし、ＬＤＰＩｗｉｎソフトウェア（バージョン２．６．１）を使用して画像を分析した。
９週齢のＦ１マウスにＨＦＤを８週間与え、ビヒクルまたは試験物質（４０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）で処理した。血液灌流分析の１日前に、Ｖｅｅｔ脱毛クリームを使用して左後足から脱毛した。イソフルランを使用してマウスを麻酔し、加熱パッド上に置いた。ＰｅｒｉＳｃａｎ ＰＩＭ ＩＩ Ｉｍａｇｅｓを使用して血液灌流をスキャンし、ＬＤＰＩｗｉｎソフトウェア（バージョン２．６．１）を使用して画像を分析した。
【0091】
トレッドミル
トレッドミルテストでは、体力枯渇までの走行距離が同等の１４月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２つの群（１４匹／群）に割り付け、その後ビヒクルまたは試験物質（２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）で３０日間処理した。試験の１週間前に、マウスはトレッドミルで５分間の習熟セッションを行った。プロトコルは次のとおり：１８．８ｍ／分で１５分、２４．４ｍ／分で５分、体力枯渇するまで２７．１ｍ／分。体力枯渇時に、血中乳酸値を乳酸テストメーター（Ａｒｋｒａｙ）を使用して測定した。
トレッドミルテストでは、体力枯渇までの走行距離が同等の１４月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２つの群（１４匹／群）に割り付け、その後ビヒクルまたは試験物質（２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口）で３０日間処理した。試験の１週間前に、マウスはトレッドミルで５分間の習熟セッションを行った。プロトコルは次のとおり：１８．８ｍ／分で１５分、２４．４ｍ／分で５分、体力枯渇するまで２７．１ｍ／分。体力枯渇時に、血中乳酸値を乳酸テストメーター（Ａｒｋｒａｙ）を使用して測定した。
【0092】
間接熱量測定
ＨＦＤまたは０．８ｍｇ／ｇを配合したＨＦＤを１１週間投与した２１週齢のＣＢＡマウスを、周囲温度２２℃で１２時間の明期と１２時間の暗期のサイクルで個別にチャンバーに収容し、最低１２時間チャンバーに順応させ、その後データを収集した。ＶＯ２およびＶＣＯ２率は、ＴＳＥ ＰｈｅｎｏＭａｓｔｅｒ熱量測定代謝ケージ（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）で間接熱量測定によって３日間測定された。呼吸交換率（ＲＥＲ）は、生成されたＶＣＯ２／消費されたＶＯ２の比率として計算された。ＲＥＲが０．７の場合は、脂肪が主要な燃料源であることを示し、ＲＥＲが１．０に近い場合は、炭水化物が主要な燃料であることを示す。エネルギー消費量（ＥＥ）は、酸素の発熱量（ＣＶ）［＝３．８１５＋（１．２３２ｘＲＥＲ）］と消費されたＯ２の容積の積として計算され、つまり、［ＥＥ＝ＣＶｘＶＯ２（ｋｃａｌ／ｈ）］であり、除脂肪体重に関係した。
ＨＦＤまたは０．８ｍｇ／ｇを配合したＨＦＤを１１週間投与した２１週齢のＣＢＡマウスを、周囲温度２２℃で１２時間の明期と１２時間の暗期のサイクルで個別にチャンバーに収容し、最低１２時間チャンバーに順応させ、その後データを収集した。ＶＯ２およびＶＣＯ２率は、ＴＳＥ ＰｈｅｎｏＭａｓｔｅｒ熱量測定代謝ケージ（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）で間接熱量測定によって３日間測定された。呼吸交換率（ＲＥＲ）は、生成されたＶＣＯ２／消費されたＶＯ２の比率として計算された。ＲＥＲが０．７の場合は、脂肪が主要な燃料源であることを示し、ＲＥＲが１．０に近い場合は、炭水化物が主要な燃料であることを示す。エネルギー消費量（ＥＥ）は、酸素の発熱量（ＣＶ）［＝３．８１５＋（１．２３２ｘＲＥＲ）］と消費されたＯ２の容積の積として計算され、つまり、［ＥＥ＝ＣＶｘＶＯ２（ｋｃａｌ／ｈ）］であり、除脂肪体重に関係した。
【0093】
赤外線熱画像
試験物質（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクルで１２日間処置され、鎮静されていないＺｕｃｋｅｒラットの皮膚温度を赤外線カメラ（ＦＬＩＲｉｘ ｓｅｒｉｅｓ ＥｘｔｅｃｈＩＲＣ３０、ＦＬＩＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で記録し、特定のソフトウェアパッケージ（ＦＬＩＲＱｕｉｃｋＲｅｐｏｒｔバージョン１．２ＳＰ２（１．０．１．２１７））で分析された。群あたり９匹のラットを使用し、最終投与の２時間後に各動物の平均および最大皮膚表面温度を測定した。
試験物質（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクルで１２日間処置され、鎮静されていないＺｕｃｋｅｒラットの皮膚温度を赤外線カメラ（ＦＬＩＲｉｘ ｓｅｒｉｅｓ ＥｘｔｅｃｈＩＲＣ３０、ＦＬＩＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で記録し、特定のソフトウェアパッケージ（ＦＬＩＲＱｕｉｃｋＲｅｐｏｒｔバージョン１．２ＳＰ２（１．０．１．２１７））で分析された。群あたり９匹のラットを使用し、最終投与の２時間後に各動物の平均および最大皮膚表面温度を測定した。
【0094】
グルコースおよび血清関連の測定
グルコース刺激インスリン分泌と組み合わせた経口および腹腔内ブドウ糖負荷試験を、グルコース（ＳＩＧＭＡ＃Ｇ７０２１）（０．７５ｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射後、６時間絶食した非鎮静マウス（Ｈｙｐｎｏｒｍ（Ｖｅｔａ Ｐｈａｒｍａ）／Ｍｉｄａｚｏｌａｍ（Ｈａｍｌｅｎｍｉｃｅ））で実施した。アルギニン刺激インスリン分泌は、ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（０．８ ｍｇ／ｇ）を１１週間投与された絶食していない２１週齢のＣＢＡマウスにアルギニン（ＳＩＧＭＡ＃Ａ５１３１）（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した後に測定された。血糖値はＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｕｌｔｒａ ２、Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ）を使用して測定し、血漿インスリンは超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．＃９００８０）を介して分析した。曲線下面積（ＡＵＣ）は、台形公式に従って計算された。インスリン抵抗性の恒常性モデル（ＨＯＭＡ－ＩＲ）は、空腹時血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）×空腹時血漿インスリン（μＵ／ Ｌ）／２２．５を介して計算された。ＭＡＴＳＵＤＡ指数は、［１００００／ｓｑｒｔ（インスリン（０分）＋グルコース（０分）＋インスリン平均（０－６０分）＋グルコース平均（０－６０分）］を介して計算された。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定（両側検定）によって計算された。
グルコース刺激インスリン分泌と組み合わせた経口および腹腔内ブドウ糖負荷試験を、グルコース（ＳＩＧＭＡ＃Ｇ７０２１）（０．７５ｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射後、６時間絶食した非鎮静マウス（Ｈｙｐｎｏｒｍ（Ｖｅｔａ Ｐｈａｒｍａ）／Ｍｉｄａｚｏｌａｍ（Ｈａｍｌｅｎｍｉｃｅ））で実施した。アルギニン刺激インスリン分泌は、ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（０．８ ｍｇ／ｇ）を１１週間投与された絶食していない２１週齢のＣＢＡマウスにアルギニン（ＳＩＧＭＡ＃Ａ５１３１）（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した後に測定された。血糖値はＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｕｌｔｒａ ２、Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ）を使用して測定し、血漿インスリンは超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．＃９００８０）を介して分析した。曲線下面積（ＡＵＣ）は、台形公式に従って計算された。インスリン抵抗性の恒常性モデル（ＨＯＭＡ－ＩＲ）は、空腹時血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）×空腹時血漿インスリン（μＵ／ Ｌ）／２２．５を介して計算された。ＭＡＴＳＵＤＡ指数は、［１００００／ｓｑｒｔ（インスリン（０分）＋グルコース（０分）＋インスリン平均（０－６０分）＋グルコース平均（０－６０分）］を介して計算された。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定（両側検定）によって計算された。
【0095】
オートファジーフラックスアッセイ
ＩＮＳ－１Ｅ細胞は、インキュベーションの最後の６０分間、１００ｎＭバフィロマイシン（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）Ａ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ＃ｔｌｒｌ－ｂａｆ１）の存在下または非存在下で、５μＭ試験物質と共にもしくは試験物資を伴わず、２４時間インキュベートされた。ＬＣ３ＩＩのレベルは、ウエスタンブロット分析によって決定され、定量された。使用した一次および二次抗体を表１に示す。
ＩＮＳ－１Ｅ細胞は、インキュベーションの最後の６０分間、１００ｎＭバフィロマイシン（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）Ａ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ＃ｔｌｒｌ－ｂａｆ１）の存在下または非存在下で、５μＭ試験物質と共にもしくは試験物資を伴わず、２４時間インキュベートされた。ＬＣ３ＩＩのレベルは、ウエスタンブロット分析によって決定され、定量された。使用した一次および二次抗体を表１に示す。
【0096】
【表1】
【0097】
アミロイド分析および生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）膵島アミロイドアッセイ
膵島アミロイドの定量は、ＨＦＤを１６週間与えられたｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝７マウス／ｎ＝６９膵島）から、および、ＨＦＤを９週間投与され、その後試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に切り替えられ７週間投与されたｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝５マウス／ｎ＝ ４８膵島）から単離された膵臓組織で行われた。単離された膵臓をそのまま凍結し、切片化し、アミロイド含有量を以前に記載されたようにチオフラビン－Ｓで染色することにより定量した（参考文献２）。生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）分析のために、膵臓のコラゲナーゼ消化によって膵島を単離し（参考文献１）、１１．１または２２．２ ｍＭグルコース（ＧＩＢＣＯ＃Ａ２４９４０－０１）、１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ＃１０５００）、５０Ｕ；μｇ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ＃１１３６０－０３９）および０．１％２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ３１４８）を補充したＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ＃１１８７９－０）で培養した。培養の０日目から０、２．５、５．０、および１０μＭの試験物質を加えた。オートファジー阻害の効果を評価するために、培養の０日目から５μＭの３－メチルアデニン（３－ＭＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｍ９２８１）を試験物質５μＭと組み合わせて添加した。対照はＤＭＳＯ１：２０００を含んでいた。培地と化合物は２日ごとに交換した。処理の９２時間後、膵島を包埋し、切片化し、アミロイド含有量を以前に記載されたようにチオフラビン－Ｓで染色することにより定量した（参考文献２）。少なくとも３つの独立した試験が評価された。
膵島アミロイドの定量は、ＨＦＤを１６週間与えられたｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝７マウス／ｎ＝６９膵島）から、および、ＨＦＤを９週間投与され、その後試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に切り替えられ７週間投与されたｈＩＡＰＰｔｇマウス（ｎ＝５マウス／ｎ＝ ４８膵島）から単離された膵臓組織で行われた。単離された膵臓をそのまま凍結し、切片化し、アミロイド含有量を以前に記載されたようにチオフラビン－Ｓで染色することにより定量した（参考文献２）。生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）分析のために、膵臓のコラゲナーゼ消化によって膵島を単離し（参考文献１）、１１．１または２２．２ ｍＭグルコース（ＧＩＢＣＯ＃Ａ２４９４０－０１）、１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ＃１０５００）、５０Ｕ；μｇ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ＃１１３６０－０３９）および０．１％２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ３１４８）を補充したＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ＃１１８７９－０）で培養した。培養の０日目から０、２．５、５．０、および１０μＭの試験物質を加えた。オートファジー阻害の効果を評価するために、培養の０日目から５μＭの３－メチルアデニン（３－ＭＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｍ９２８１）を試験物質５μＭと組み合わせて添加した。対照はＤＭＳＯ１：２０００を含んでいた。培地と化合物は２日ごとに交換した。処理の９２時間後、膵島を包埋し、切片化し、アミロイド含有量を以前に記載されたようにチオフラビン－Ｓで染色することにより定量した（参考文献２）。少なくとも３つの独立した試験が評価された。
【0098】
細胞のＡＴＰ含有量の決定
Ｗｉ－３８ヒト肺線維芽細胞を試験物質で１６時間刺激した。その後、ＡＴＰ含有量は、ＡＴＰ生物発光アッセイキットＨＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃１１６９９７０９００１）を使用して、製造元の推奨に従って決定された。ＡＴＰデータは、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）を使用して決定された細胞タンパク質に対して正規化された。
Ｗｉ－３８ヒト肺線維芽細胞を試験物質で１６時間刺激した。その後、ＡＴＰ含有量は、ＡＴＰ生物発光アッセイキットＨＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃１１６９９７０９００１）を使用して、製造元の推奨に従って決定された。ＡＴＰデータは、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）を使用して決定された細胞タンパク質に対して正規化された。
【0099】
ウエスタンブロット分析
すべての細胞株を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０ｍＭフッ化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃Ｓ７９２０）、１０ｍＭβ－グリセロホスフェート（ＳＩＧＭＡ＃Ｇ６３７６）、および１ｍＭバナジン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃７２０６０）で溶解し、１４，０００ｒｐｍで１分後に上清を回収した。膵島（ヒトおよびマウス）を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ＃０４ ６９３ １２４ ００１）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ＃０４ ９０６ ８３７ ００１）で溶解した。右ふくらはぎの筋肉、心臓、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、および肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を、液体窒素を使用して乳棒で粉砕し、氷冷ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃Ｓ７６５３）、１．０％ＮＰ４０（ＵＳＢ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ ＃Ｄ６７５０）、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃７１５１５）、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭβ－グリセロールリン酸、１ｍＭバナジン酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ＃０４６９３１２４００１）、１タブレット／１０ｍｌ溶解緩衝液）で均質化した。１４，０００ｒｐｍで２分後に上清を収集した。この手順は、すべての脂肪が除去され、４℃で、上清が透明になるまで繰り返された。サンプルは４～１５％ポリアクリルアミドゲルで分析した。使用した一次および二次抗体を表１に示す。値は、ＡＭＰＫα、β－アクチン、ＧＡＰＤＨ、またはそれぞれの非リン酸化対応物に対して正規化された。
すべての細胞株を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０ｍＭフッ化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃Ｓ７９２０）、１０ｍＭβ－グリセロホスフェート（ＳＩＧＭＡ＃Ｇ６３７６）、および１ｍＭバナジン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃７２０６０）で溶解し、１４，０００ｒｐｍで１分後に上清を回収した。膵島（ヒトおよびマウス）を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ＃０４ ６９３ １２４ ００１）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ＃０４ ９０６ ８３７ ００１）で溶解した。右ふくらはぎの筋肉、心臓、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、および肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を、液体窒素を使用して乳棒で粉砕し、氷冷ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃Ｓ７６５３）、１．０％ＮＰ４０（ＵＳＢ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ ＃Ｄ６７５０）、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ＃７１５１５）、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭβ－グリセロールリン酸、１ｍＭバナジン酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ＃０４６９３１２４００１）、１タブレット／１０ｍｌ溶解緩衝液）で均質化した。１４，０００ｒｐｍで２分後に上清を収集した。この手順は、すべての脂肪が除去され、４℃で、上清が透明になるまで繰り返された。サンプルは４～１５％ポリアクリルアミドゲルで分析した。使用した一次および二次抗体を表１に示す。値は、ＡＭＰＫα、β－アクチン、ＧＡＰＤＨ、またはそれぞれの非リン酸化対応物に対して正規化された。
【0100】
定量的リアルタイムＰＣＲ （ｑＲＴ－ＰＣＲ）
ＲＮＡ精製のために、ふくらはぎの筋肉、ｉＷＡＴ、肩甲骨間ＢＡＴ、および左側肝葉を、液体窒素を使用して乳棒で粉砕し、その後、それぞれのＲＮＡキットに移した。肝臓からのＲＮＡは、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ＃７４０９５５．５０）を使用して調製した。脂肪組織からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ＃７４８０４）を使用して調製した。ふくらはぎの筋肉組織からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ＃７４７０４）を使用して調製した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１７５２－２５０）を製造元の指示に従って使用して行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４００４）を使用して単離された膵島から全ＲＮＡを調製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１８０８０－０５１）を製造元の指示に従って使用して第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ｍＲＮＡ発現レベルの定量化は、本質的に以前に記載されたように実施された（参考文献３）。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されるプライマーを表２に示す。チロシン３－モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質であるゼータポリペプチド（ＹＷＨＡＳ）を使用して、ＴＢＰが使用された膵島を除いて発現レベルを正規化した。
ＲＮＡ精製のために、ふくらはぎの筋肉、ｉＷＡＴ、肩甲骨間ＢＡＴ、および左側肝葉を、液体窒素を使用して乳棒で粉砕し、その後、それぞれのＲＮＡキットに移した。肝臓からのＲＮＡは、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ＃７４０９５５．５０）を使用して調製した。脂肪組織からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ＃７４８０４）を使用して調製した。ふくらはぎの筋肉組織からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ＃７４７０４）を使用して調製した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１７５２－２５０）を製造元の指示に従って使用して行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４００４）を使用して単離された膵島から全ＲＮＡを調製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１８０８０－０５１）を製造元の指示に従って使用して第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ｍＲＮＡ発現レベルの定量化は、本質的に以前に記載されたように実施された（参考文献３）。ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されるプライマーを表２に示す。チロシン３－モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質であるゼータポリペプチド（ＹＷＨＡＳ）を使用して、ＴＢＰが使用された膵島を除いて発現レベルを正規化した。
【0101】
【表2】
【0102】
肝臓の脂質抽出とトリグリセリドの決定
０．２～０．３ｇの肝臓を３ｍｌのＰＢＳで均質化した後、６ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加した。相分離が起こらなくなるまでサンプルを混合し、室温で３０分間放置し、４，５００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。クロロホルム相をあらかじめ秤量したガラス器具に移し、一晩４℃に保った。水滴をすべて除去し、クロロホルムを窒素流で蒸発させた後、ＳｐｅｅｄＶａｃを介して１５分間残留溶媒を除去した。ガラス器具の重量を再測定し、総脂質を計算した（ｍｇ／ｇ肝臓）。残留物を３５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／メタノールに溶解した。肝臓トリグリセリドは、血清トリグリセリド測定キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＴＲ０１００）を使用して測定した。分析は、５４０ｎｍではなく５６０ｎｍで分析するトリグリセリド測定についてわずかな変更を加えて、製造元の推奨に従って行われた。
０．２～０．３ｇの肝臓を３ｍｌのＰＢＳで均質化した後、６ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加した。相分離が起こらなくなるまでサンプルを混合し、室温で３０分間放置し、４，５００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。クロロホルム相をあらかじめ秤量したガラス器具に移し、一晩４℃に保った。水滴をすべて除去し、クロロホルムを窒素流で蒸発させた後、ＳｐｅｅｄＶａｃを介して１５分間残留溶媒を除去した。ガラス器具の重量を再測定し、総脂質を計算した（ｍｇ／ｇ肝臓）。残留物を３５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／メタノールに溶解した。肝臓トリグリセリドは、血清トリグリセリド測定キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＴＲ０１００）を使用して測定した。分析は、５４０ｎｍではなく５６０ｎｍで分析するトリグリセリド測定についてわずかな変更を加えて、製造元の推奨に従って行われた。
【0103】
グリコーゲンの測定
心臓グリコーゲン含有量は、製造元の推奨に従って、グリコーゲンアッセイキット（Ａｂｃａｍ＃ａｂ６５６２０）を使用して測定された。
心臓グリコーゲン含有量は、製造元の推奨に従って、グリコーゲンアッセイキット（Ａｂｃａｍ＃ａｂ６５６２０）を使用して測定された。
【0104】
総脂質への［１，２－１４Ｃ］アセテートの取り込み
初代ヒト肝細胞（２４ウェルディッシュで６５，０００～１３０，０００細胞／ウェル）をビヒクル対照、無血清ウィリアムズ培地Ｅ中の０．６２５、１．２５、２．５、または５μＭの試験物質で２時間処理し、その後、さらに４時間、０．２５μＣｉ［１，２－１４Ｃ］－アセテート／ウェルを添加した。増殖条件については、表３を参照されたい。２００μｌの０．５％トリプシンを、細胞を剥離するために使用し、その後、８００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した。サンプルをボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで回転させ、２分後に、水層を廃棄した。この手順は、２回繰り返した。まず７００μＬのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２で、次いで、４００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２で繰り返した。有機相をシンチレーションバイアルに移し、窒素流によって蒸発乾固させた。残留物を３ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００．４３７）に溶解し、Ｗａｌｌａｃ １４１４ベータカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で１分間１４Ｃを測定した。脂質抽出の前に、１０μｌのサンプルを使用してタンパク質濃度を測定した。１４Ｃ値は細胞タンパク質濃度に対して正規化された。
初代ヒト肝細胞（２４ウェルディッシュで６５，０００～１３０，０００細胞／ウェル）をビヒクル対照、無血清ウィリアムズ培地Ｅ中の０．６２５、１．２５、２．５、または５μＭの試験物質で２時間処理し、その後、さらに４時間、０．２５μＣｉ［１，２－１４Ｃ］－アセテート／ウェルを添加した。増殖条件については、表３を参照されたい。２００μｌの０．５％トリプシンを、細胞を剥離するために使用し、その後、８００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した。サンプルをボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで回転させ、２分後に、水層を廃棄した。この手順は、２回繰り返した。まず７００μＬのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２で、次いで、４００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）および５００μｌの４ｍＭのＭｇＣｌ２で繰り返した。有機相をシンチレーションバイアルに移し、窒素流によって蒸発乾固させた。残留物を３ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ ＨｉＳａｆｅ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００．４３７）に溶解し、Ｗａｌｌａｃ １４１４ベータカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で１分間１４Ｃを測定した。脂質抽出の前に、１０μｌのサンプルを使用してタンパク質濃度を測定した。１４Ｃ値は細胞タンパク質濃度に対して正規化された。
【0105】
【表3-1】
【0106】
【表3-2】
【0107】
生体内脂質生成
ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を５週間投与した１５週齢のＣＢＡマウスを一晩飢餓状態にし、そして再投与し、９０分後０．９％ＮａＣｌで希釈した１０００μＣｉ ３Ｈ－ＮａＯａｃ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＴ００３００５ＭＣ）を注射した。９０分後、０．２～０．３ｇの肝臓を単離し、３ｍｌのＰＢＳで均質化した後、６ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加した。相分離が起こらなくなるまでサンプルを混合し、室温で放置し、３０分後、４，５００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。水相を除去し、３ｍｌのクロロホルムをシンチレーションバイアルに移し、４０℃の水浴に入れながら窒素流で蒸発乾固させた。残留物を３ｍｌのｏｐｔｉｐｈａｓｅ ｈｉｓａｆｅ ３（パーキンエルマー＃１２００．４３７）に溶解し、そして３ＨをＷａｌｌａｃ １４１４カウンターで１分間測定した。３Ｈの値は、肝臓重量で正規化した。
ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を５週間投与した１５週齢のＣＢＡマウスを一晩飢餓状態にし、そして再投与し、９０分後０．９％ＮａＣｌで希釈した１０００μＣｉ ３Ｈ－ＮａＯａｃ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＴ００３００５ＭＣ）を注射した。９０分後、０．２～０．３ｇの肝臓を単離し、３ｍｌのＰＢＳで均質化した後、６ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加した。相分離が起こらなくなるまでサンプルを混合し、室温で放置し、３０分後、４，５００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。水相を除去し、３ｍｌのクロロホルムをシンチレーションバイアルに移し、４０℃の水浴に入れながら窒素流で蒸発乾固させた。残留物を３ｍｌのｏｐｔｉｐｈａｓｅ ｈｉｓａｆｅ ３（パーキンエルマー＃１２００．４３７）に溶解し、そして３ＨをＷａｌｌａｃ １４１４カウンターで１分間測定した。３Ｈの値は、肝臓重量で正規化した。
【0108】
Ｌ６筋管におけるグルコース取り込み
高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ＃３１９６６）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃１０５００－０６４）、および２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ１＃５７５０）で増殖させたラットＬ６骨格筋細胞は１４日間血清濃度を２％に下げることにより、分化が誘導され、それまでに筋芽細胞の大部分が筋管に分化した。筋管を無血清低グルコース（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２１８８５）ですすぎ、ビヒクル対照、２．５、５、および１０μＭの試験物質（無血清低グルコースＤＭＥＭ、０．１％ＤＭＳＯ）で２時間、処理し、グルコースを含まない無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６６）ですすぎ、その後、それを２０分間インキュベートした後、１０分間、１μＣｉの２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＴ５４９Ａ２５０ＵＣ）を添加した。細胞を、グルコースを含まない無血清ＤＭＥＭで３回リンスし、１ｍｌ ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で溶解した。３００μｌを４ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００－４３７）に加えた後、Ｗａｌｌａｃ １４１４ベータカウンターで１分間カウントした。ビヒクルを１に設定することにより、ＣＰＭを任意の単位に変換した。
高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ＃３１９６６）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃１０５００－０６４）、および２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ１＃５７５０）で増殖させたラットＬ６骨格筋細胞は１４日間血清濃度を２％に下げることにより、分化が誘導され、それまでに筋芽細胞の大部分が筋管に分化した。筋管を無血清低グルコース（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２１８８５）ですすぎ、ビヒクル対照、２．５、５、および１０μＭの試験物質（無血清低グルコースＤＭＥＭ、０．１％ＤＭＳＯ）で２時間、処理し、グルコースを含まない無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６６）ですすぎ、その後、それを２０分間インキュベートした後、１０分間、１μＣｉの２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＴ５４９Ａ２５０ＵＣ）を添加した。細胞を、グルコースを含まない無血清ＤＭＥＭで３回リンスし、１ｍｌ ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で溶解した。３００μｌを４ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００－４３７）に加えた後、Ｗａｌｌａｃ １４１４ベータカウンターで１分間カウントした。ビヒクルを１に設定することにより、ＣＰＭを任意の単位に変換した。
【0109】
分化を開始させた６－７日後に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬を（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１３７７８０３０）製造元の指示に従い（フォワードトランスフェクション）使用して、Ｌ６筋管にｓｉＡＭＰＫα１およびα２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ＃ｓｃ－２７０１４２および＃ｓｃ－１５５９８５）またはＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ＃ＡＭ４６３５）を導入した。ｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭに設定した。導入の前日、培地を、抗生物質を含まない培地（高グルコース、４．５ｇ／Ｌ、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ＃３１９６６）および２％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃１０５００－０６４））に変えた。ｓｉＡＭＰＫα１およびα２およびＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ がそれぞれ導入された細胞におけるＡＭＰＫα１およびα２発現のレベルをウエスタンブロットによって定量した。試験物質（５μＭ）の非存在下または存在下での４時間のグルコース取り込みを、上記の導入の７２時間後にアッセイした。試験物質によって誘導されたグルコース取り込みは、それぞれ、ｓｉＡＭＰＫα１およびα２ならびにＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを導入された細胞におけるビヒクル対照による取り込みに対して正規化された。
【0110】
生体内グルコース取り込み
ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間投与した１２週齢のＣＢＡマウスを、３時間飢餓状態にした後、軽度のイソフルラン麻酔（８００ｍＬ／ｍｉｎ Ｏ２で１．５～２％）下、総量７０～１００μＬの生理食塩水中の９±１．１ＭＢｑの臨床グレード１８Ｆ－フルオロ－デオキシ－グルコース（－ＦＤＧ）（ウメアのＮｏｒｒｌａｎｄｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの核医学部門で調製）を静脈内注射した。注射後、マウスを覚醒させ、ケージ内を自由に動き回らせた。１８０分後、マウスを深いイソフルラン麻酔下で犠牲にし、大動脈を介したＰＢＳの逆行性灌流によって血液を除去した。肝臓が青白いとき、組織を収集し、１０分間の静的取り込みについてスキャンした（ｎａｎｏＳｃａｎ ＰＥＴ／ＣＴ、Ｍｅｄｉｓｏ、ハンガリー）。次に、組織を生体外スキャニングでスキャンして、単離された組織への取り込みを評価した。画像は、スパイクフィルター、遅延ウィンドウランダム補正、散乱、ＣＴベース減衰補正を使用して、軸方向距離９８ｍｍをカバーする、４回の反復と４つのサブセット（Ｍｅｄｉｓｏ Ｔｅｒａ－Ｔｏｍｏ ３Ｄ）による３Ｄ反復再構成で０．４ｘ０．４ｍｍの解像度に再構成された。関心のあるボリュームは、ｉｍｌｏｏｋ４ｄ（ｗｗｗ．ｄｉｃｏｍ－ｐｏｒｔ．ｃｏｍ）を使用して各組織上で、手動で輪郭が描かれた。トレーサーの取り込みは、次の式を使用して、標準化された取り込み値（ＳＵＶ）として定量化された。ＳＵＶ＝Ｃ／（Ｉ／ｍ）；Ｃは測定された組織活性濃度（Ｂｑ／ｍＬ）、Ｉは注射された用量（Ｂｑ）およびｍは体重（ｇ）である。ＣとＩは同一時刻に減衰補正される。
ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間投与した１２週齢のＣＢＡマウスを、３時間飢餓状態にした後、軽度のイソフルラン麻酔（８００ｍＬ／ｍｉｎ Ｏ２で１．５～２％）下、総量７０～１００μＬの生理食塩水中の９±１．１ＭＢｑの臨床グレード１８Ｆ－フルオロ－デオキシ－グルコース（－ＦＤＧ）（ウメアのＮｏｒｒｌａｎｄｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの核医学部門で調製）を静脈内注射した。注射後、マウスを覚醒させ、ケージ内を自由に動き回らせた。１８０分後、マウスを深いイソフルラン麻酔下で犠牲にし、大動脈を介したＰＢＳの逆行性灌流によって血液を除去した。肝臓が青白いとき、組織を収集し、１０分間の静的取り込みについてスキャンした（ｎａｎｏＳｃａｎ ＰＥＴ／ＣＴ、Ｍｅｄｉｓｏ、ハンガリー）。次に、組織を生体外スキャニングでスキャンして、単離された組織への取り込みを評価した。画像は、スパイクフィルター、遅延ウィンドウランダム補正、散乱、ＣＴベース減衰補正を使用して、軸方向距離９８ｍｍをカバーする、４回の反復と４つのサブセット（Ｍｅｄｉｓｏ Ｔｅｒａ－Ｔｏｍｏ ３Ｄ）による３Ｄ反復再構成で０．４ｘ０．４ｍｍの解像度に再構成された。関心のあるボリュームは、ｉｍｌｏｏｋ４ｄ（ｗｗｗ．ｄｉｃｏｍ－ｐｏｒｔ．ｃｏｍ）を使用して各組織上で、手動で輪郭が描かれた。トレーサーの取り込みは、次の式を使用して、標準化された取り込み値（ＳＵＶ）として定量化された。ＳＵＶ＝Ｃ／（Ｉ／ｍ）；Ｃは測定された組織活性濃度（Ｂｑ／ｍＬ）、Ｉは注射された用量（Ｂｑ）およびｍは体重（ｇ）である。ＣとＩは同一時刻に減衰補正される。
【0111】
ＳＡＭＳペプチドＡＭＰＫ活性アッセイ
５０ｎｇＡＭＰＫ（Ｕｐｓｔａｔｅ＃１４－３０５）を、バッファー（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４５、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＤＭＳＯ）中の２．５、５、または１０μＭ試験物質、または２０μＭ ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ２００２）とさまざまな組み合わせで混合した。すべての設定で、１０μｇのＳＡＭＳおよび０．０３μＣｉ／μｌの３２Ｐ ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＧ５０２Ｚ５００ＵＣ）が加えられた。総反応量は２５μｌで、すべての成分を氷上で混合し、３７℃で１５分間反応を行った後、５μｌのリン酸で終了させ、氷上に戻した。２５μｌの反応液をＷｈａｔｍａｎＰ８１フィルター上で、５０℃で２分間乾燥し、２５０ｍｌの１％リン酸で２分間、３回洗浄した後、４ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００－４３７）に加えてＷａｌｌａｃ １４１４ベータカウンターで１分、カウントした。放射能は酵素活性と相関している。
５０ｎｇＡＭＰＫ（Ｕｐｓｔａｔｅ＃１４－３０５）を、バッファー（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４５、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＤＭＳＯ）中の２．５、５、または１０μＭ試験物質、または２０μＭ ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ２００２）とさまざまな組み合わせで混合した。すべての設定で、１０μｇのＳＡＭＳおよび０．０３μＣｉ／μｌの３２Ｐ ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＧ５０２Ｚ５００ＵＣ）が加えられた。総反応量は２５μｌで、すべての成分を氷上で混合し、３７℃で１５分間反応を行った後、５μｌのリン酸で終了させ、氷上に戻した。２５μｌの反応液をＷｈａｔｍａｎＰ８１フィルター上で、５０℃で２分間乾燥し、２５０ｍｌの１％リン酸で２分間、３回洗浄した後、４ｍｌの液体シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃１２００－４３７）に加えてＷａｌｌａｃ １４１４ベータカウンターで１分、カウントした。放射能は酵素活性と相関している。
【0112】
ＡＭＰＫ活性化アッセイ
表３には、細胞株の起源、増殖条件、および試験物質を介したＡＭＰＫの活性化の設定が含まれている。ヒト骨格筋細胞は、２％馬血清（Ｇｉｂｃｏ＃２６０５０－０７０）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２１８８５）で筋管分化が誘導されるまで、細胞の供給者から入手した増殖培地で２日間増殖させ、その後、表３に記載されているように試験物質で処理した。到着後、ヒト肝細胞を３７℃で１分間解凍した後、解凍培地（ＣＨＲＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＣＭ７０００）に移した。１０分、室温で１００ｘ ｇの遠心分離の後、細胞ペレットを肝細胞プレーティングサプリメントパック（Ｇｉｂｃｏ＃ＣＭ３０００）を添加したウィリアムズ培地Ｅ（Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１２１７６０１）に再懸濁した。細胞をゼラチンコーティングされた６０ｍｍディッシュにプレーティングし、次に一晩インキュベートした後、表３に記載されているように試験物質で処理した。ＩＮＳ－１Ｅ細胞は、試験物質を添加する前に、活性化条件（表３）用の培地で４時間前処理した。全ての細胞株は、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター中で維持した。表３は、増殖条件とマウスおよびヒトの膵島における試験物質によるＡＭＰＫの活性化の設定を示している。採取後、マウス膵島を３７℃、５％ＣＯ２で増殖条件培地にて２日間培養した後、試験物質で２時間処理した。非糖尿病の、およびＴ２Ｄ（２型糖尿病）のドナーからのヒト膵島は、スウェーデンの法律およびウメオのヒト研究倫理委員会（ｗｗｗ．ｅｐｎ．ｓｅ）に準拠したＪＤＲＦアワード３１－２００８－４１６ ＥＣＩＴ Ｉｓｌｅｔ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈプログラムを通じて提供された。到着後、膵島を５０ｍｌファルコンチューブに移し、５分間静置した後、上清を除去し、培地（ＣＭＲＬ培地（ＧＩＢＣＯ＃２１５３０－０２７）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ＃１０５００）、 ２０Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ：Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）および１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ＃３５０５０－０３８））を加えた。膵島を培地でさらに３回洗浄した後、ペトリ皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで一晩回復させた後、試験物質で４時間処理した。
表３には、細胞株の起源、増殖条件、および試験物質を介したＡＭＰＫの活性化の設定が含まれている。ヒト骨格筋細胞は、２％馬血清（Ｇｉｂｃｏ＃２６０５０－０７０）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２１８８５）で筋管分化が誘導されるまで、細胞の供給者から入手した増殖培地で２日間増殖させ、その後、表３に記載されているように試験物質で処理した。到着後、ヒト肝細胞を３７℃で１分間解凍した後、解凍培地（ＣＨＲＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＣＭ７０００）に移した。１０分、室温で１００ｘ ｇの遠心分離の後、細胞ペレットを肝細胞プレーティングサプリメントパック（Ｇｉｂｃｏ＃ＣＭ３０００）を添加したウィリアムズ培地Ｅ（Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１２１７６０１）に再懸濁した。細胞をゼラチンコーティングされた６０ｍｍディッシュにプレーティングし、次に一晩インキュベートした後、表３に記載されているように試験物質で処理した。ＩＮＳ－１Ｅ細胞は、試験物質を添加する前に、活性化条件（表３）用の培地で４時間前処理した。全ての細胞株は、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター中で維持した。表３は、増殖条件とマウスおよびヒトの膵島における試験物質によるＡＭＰＫの活性化の設定を示している。採取後、マウス膵島を３７℃、５％ＣＯ２で増殖条件培地にて２日間培養した後、試験物質で２時間処理した。非糖尿病の、およびＴ２Ｄ（２型糖尿病）のドナーからのヒト膵島は、スウェーデンの法律およびウメオのヒト研究倫理委員会（ｗｗｗ．ｅｐｎ．ｓｅ）に準拠したＪＤＲＦアワード３１－２００８－４１６ ＥＣＩＴ Ｉｓｌｅｔ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈプログラムを通じて提供された。到着後、膵島を５０ｍｌファルコンチューブに移し、５分間静置した後、上清を除去し、培地（ＣＭＲＬ培地（ＧＩＢＣＯ＃２１５３０－０２７）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ＃１０５００）、 ２０Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ：Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）および１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ＃３５０５０－０３８））を加えた。膵島を培地でさらに３回洗浄した後、ペトリ皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで一晩回復させた後、試験物質で４時間処理した。
【0113】
ＡＭＰＫ生体外（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）脱リン酸化アッセイ
ＡＭＰＫα２／β１／γ１三量体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＰＶ４６７４、ロット１２６１３６１Ｂ）（１ｎｇ／μｌ）を、バッファー（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７０４１）および０．４％、ＤＭＳＯ）中の１０μＭの試験物質、２０μＭの試験物質、または１５０μＭのＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ２７５４）＋／－１ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ１８５２－１ＶＬ）＋／－ＰＰ２Ｃα（０．２５－０．７５ｎｇ／μｌ）（Ａｂｃａｍ ａｂ５１２０５－１００；ロットＧＲ５４１３３－５）および５ｍＭ ＭｎＣｌ２（総量２０μｌ）とインキュベートした。ＡＭＰＫα２／β１／γ１＋／－ＡＴＰを試験物質およびＡＤＰと３０℃で２分間プレインキュベートした後、ＰＰ２Ｃ／ＭｎＣｌ２を添加して脱リン酸化反応を開始し、これは３０℃で１０～１５分間継続した。０．１７％ＢＳＡ、１３ｍＭ ＥＤＴＡ、１．３ｘ ＸＴサンプルバッファーおよび０．６７％β－メルカプトエタノールを含むＰＢＳを添加して反応を停止させた。サンプルを氷上に５分間置き、１００℃で５分間加熱し、冷却してからウエスタンゲルで泳動した。すべてのステップは、高品質の低タンパク質結合エッペンドルフチューブで実行された。別の実験では、１０μＭの試験物質、２０μＭの試験物質、１５０μＭのＡＤＰのみ、あるいは１０μＭの試験物質＋１５０μＭのＡＤＰおよび２０μＭの試験物質＋１５０μＭのＡＤＰの組み合わせをバッファー（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチンおよび０．４％ＤＭＳＯ）中、＋／－０．２５－０．５ｎｇ／μＬ ＰＰ２Ｃαおよび５ｍＭのＭｎＣｌ２、または５ｍＭのＭｇＣｌ２の条件で、１ｎｇ／μｌのＡＭＰＫα２／β１／γ１もしくはＡＭＰＫα１／β１／γ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社＃ＰＶ４６７２）三量体とインキュベートした。ＡＭＰＫは、試験物質およびＡＤＰまたは組み合わせと３０℃で２分間、順次プレインキュベートし、その後ＰＰ２Ｃ／ＭｎＣｌ２またはＰＰ２Ｃ／ＭｇＣｌ２を逐次添加し、脱リン酸化反応を開始した。これは、３０℃で５～１５分間続けた。その後、反応を停止し、上記のように分析した。
ＡＭＰＫα２／β１／γ１三量体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＰＶ４６７４、ロット１２６１３６１Ｂ）（１ｎｇ／μｌ）を、バッファー（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７０４１）および０．４％、ＤＭＳＯ）中の１０μＭの試験物質、２０μＭの試験物質、または１５０μＭのＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ２７５４）＋／－１ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ１８５２－１ＶＬ）＋／－ＰＰ２Ｃα（０．２５－０．７５ｎｇ／μｌ）（Ａｂｃａｍ ａｂ５１２０５－１００；ロットＧＲ５４１３３－５）および５ｍＭ ＭｎＣｌ２（総量２０μｌ）とインキュベートした。ＡＭＰＫα２／β１／γ１＋／－ＡＴＰを試験物質およびＡＤＰと３０℃で２分間プレインキュベートした後、ＰＰ２Ｃ／ＭｎＣｌ２を添加して脱リン酸化反応を開始し、これは３０℃で１０～１５分間継続した。０．１７％ＢＳＡ、１３ｍＭ ＥＤＴＡ、１．３ｘ ＸＴサンプルバッファーおよび０．６７％β－メルカプトエタノールを含むＰＢＳを添加して反応を停止させた。サンプルを氷上に５分間置き、１００℃で５分間加熱し、冷却してからウエスタンゲルで泳動した。すべてのステップは、高品質の低タンパク質結合エッペンドルフチューブで実行された。別の実験では、１０μＭの試験物質、２０μＭの試験物質、１５０μＭのＡＤＰのみ、あるいは１０μＭの試験物質＋１５０μＭのＡＤＰおよび２０μＭの試験物質＋１５０μＭのＡＤＰの組み合わせをバッファー（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチンおよび０．４％ＤＭＳＯ）中、＋／－０．２５－０．５ｎｇ／μＬ ＰＰ２Ｃαおよび５ｍＭのＭｎＣｌ２、または５ｍＭのＭｇＣｌ２の条件で、１ｎｇ／μｌのＡＭＰＫα２／β１／γ１もしくはＡＭＰＫα１／β１／γ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社＃ＰＶ４６７２）三量体とインキュベートした。ＡＭＰＫは、試験物質およびＡＤＰまたは組み合わせと３０℃で２分間、順次プレインキュベートし、その後ＰＰ２Ｃ／ＭｎＣｌ２またはＰＰ２Ｃ／ＭｇＣｌ２を逐次添加し、脱リン酸化反応を開始した。これは、３０℃で５～１５分間続けた。その後、反応を停止し、上記のように分析した。
【0114】
ＰＰ２Ｃホスファターゼ活性アッセイ
ＰＰ２Ｃαの活性を測定するため、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で３ｎｇ／μｌのＰＰ２Ｃα（Ａｂｃａｍ ａｂ５１２０５）および５、１０、または２０μＭの試験物質をＳｅｎｓｏｌｙｔｅ ＦＤＰプロテインホスファターゼアッセイキット（Ａｎａｓｐｅｃ＃７１１００）で、製造元の指示に従い使用した。蛍光強度は、Ｂｉｏ Ｔｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨ４マルチモードマイクロプレートリーダーで測定した。
ＰＰ２Ｃαの活性を測定するため、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で３ｎｇ／μｌのＰＰ２Ｃα（Ａｂｃａｍ ａｂ５１２０５）および５、１０、または２０μＭの試験物質をＳｅｎｓｏｌｙｔｅ ＦＤＰプロテインホスファターゼアッセイキット（Ａｎａｓｐｅｃ＃７１１００）で、製造元の指示に従い使用した。蛍光強度は、Ｂｉｏ Ｔｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨ４マルチモードマイクロプレートリーダーで測定した。
【0115】
定量化と統計分析
ウエスタンブロット実験の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓバージョン４．１ ｂｕｉｌｄ １６）およびＩｍａｇｅ－Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．４５ｓ）を使用して実行された。アミロイド含有量の定量は、Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェア（バージョン１．４９ｍ）を使用して実行された。生体外およびマウス生体内のデータのすべての統計分析は、両側スチューデントのｔ検定によって実行された。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると見なした。患者データ分析は、混合モデルＡｎｏｖａ検定（全体を通して、絶対変化には二元配置分散分析を使用し、変化率には一元配置分散分析を使用）とノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して実行した。複合エンドポイントは、カイ二乗検定とフィッシャーの直接確率検定を使用して分析された。
ウエスタンブロット実験の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓバージョン４．１ ｂｕｉｌｄ １６）およびＩｍａｇｅ－Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．４５ｓ）を使用して実行された。アミロイド含有量の定量は、Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェア（バージョン１．４９ｍ）を使用して実行された。生体外およびマウス生体内のデータのすべての統計分析は、両側スチューデントのｔ検定によって実行された。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると見なした。患者データ分析は、混合モデルＡｎｏｖａ検定（全体を通して、絶対変化には二元配置分散分析を使用し、変化率には一元配置分散分析を使用）とノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して実行した。複合エンドポイントは、カイ二乗検定とフィッシャーの直接確率検定を使用して分析された。
【0116】
結果
試験物質は、生体外でｐＡＭＰＫの脱リン酸化を抑制し、細胞内で普遍的（ＰＡＮ）－ＡＭＰＫ活性化因子として作用する。
上記と一致して、生体外では、試験物質は、ＰＰ２Ｃの活性を阻害することなく、ヒト組換えＡＭＰＫα、－β、および－γ三量体のｐ－Ｔ１７２のプロテインホスファターゼ２Ｃ媒介（ＰＰ２Ｃ媒介）脱リン酸化を抑制した（図１Ａ）。試験物質はまた、過剰なＡＴＰの存在下での脱リン酸化からｐＡＭＰＫを保護し（図１Ｂ）、ＡＤＰと相加的に作用したが、ＡＭＰＫをアロステリックに活性化しなかった。したがって、試験物質は、ＡＭＰＫ活性に対するＡＤＰの効果を模倣したが、ＡＭＰの効果は模倣しなかった。
試験物質は、生体外でｐＡＭＰＫの脱リン酸化を抑制し、細胞内で普遍的（ＰＡＮ）－ＡＭＰＫ活性化因子として作用する。
上記と一致して、生体外では、試験物質は、ＰＰ２Ｃの活性を阻害することなく、ヒト組換えＡＭＰＫα、－β、および－γ三量体のｐ－Ｔ１７２のプロテインホスファターゼ２Ｃ媒介（ＰＰ２Ｃ媒介）脱リン酸化を抑制した（図１Ａ）。試験物質はまた、過剰なＡＴＰの存在下での脱リン酸化からｐＡＭＰＫを保護し（図１Ｂ）、ＡＤＰと相加的に作用したが、ＡＭＰＫをアロステリックに活性化しなかった。したがって、試験物質は、ＡＭＰＫ活性に対するＡＤＰの効果を模倣したが、ＡＭＰの効果は模倣しなかった。
【0117】
形質転換されていないヒトＷｉ－３８肺線維芽細胞では、試験物質はｐＡＭＰＫ、下流の標的ｐ－Ｓ７９ ＡＣＣ（ｐＡＣＣ）、およびＡＴＰ／タンパク質比のレベルを用量依存的に増加させた（図１、Ｃ－Ｆ）。特に、試験物質は、β２サブユニットを優先的に発現するヒト骨格筋管や肝細胞などの２型糖尿病に関与する細胞を含む、β１またはβ２サブユニットのいずれかを発現するさまざまな異なるＡＭＰＫヘテロ三量体を含む多くの異なる細胞型でｐＡＭＰＫを増加させた。したがって、試験物質は細胞内でＰＡＮ－ＡＭＰＫ活性化因子として機能する。試験物質の作用機序は、細胞が主要な上流キナーゼＬＫＢ１を発現することを必要とする。上記と一致して、ＬＫＢ１非存在（ｎｕｌｌ）である表現型、ＨｅＬａ細胞では、試験物質は、非常に低い基礎レベルのｐＡＭＰＫおよびｐＡＣＣを増加させることができなかったが、対照として、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）を介してＡＭＰＫを活性化するＣａ２＋イオノフォア、イオノマイシンはこれらの細胞で容易にＡＭＰＫを活性化した。したがって、試験物質は、固有のＡＭＰＫ活性を有する生理学的に関連する細胞においてＡＭＰＫ活性をさらに増加させるだけである。
【0118】
試験物質は、ＤＩＯマウスのインスリン抵抗性と高血糖を予防する。
げっ歯類では、試験物質は長い血漿半減期により経口投与可能であるが、血液脳関門を通過しない。試験物質を単独で、または臨床設定のようにメトホルミンと組み合わせて生体内で高血糖およびインスリン抵抗性を軽減できるかどうかに対処するために、マウスに「ＤＩＯ」（食餌誘発性肥満）と呼ばれる高脂肪食（ＨＦＤ）を与え、ビヒクル、試験物質、メトホルミン、または試験物質＋メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）をそれぞれ８週間、強制的に経口投与した（図２Ａ）。このレジメンでは、メトホルミンではなく、試験物質および試験物質＋メトホルミンは、ＨＦＤによって引き起こした空腹時血糖値および血漿インスリンレベルの上昇を回避した（図２、ＢおよびＣ）。その結果、ビヒクルと比較して、試験物質および試験物質＋メトホルミンで処理されたＤＩＯマウスは、ＨＯＭＡ－ＩＲ計算によって評価されるようなインスリン抵抗性を発症しなかった（図２Ｄ）。さらに、高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性の強力な予防と一致して、メトホルミンではなく、試験物質および試験物質＋メトホルミンは、ＤＩＯマウスのふくらはぎの筋肉で有意にｐＡＭＰＫを増加させ（図２Ｅ）、Ｔｘｎｉｐ ｍＲＮＡレベルを減少させ、Ｇｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルを増加させた（図２Ｆ）、これはインスリン依存性とインスリン非依存性の両方の効果と一致している。要約すると、試験物質はふくらはぎの筋肉のｐＡＭＰＫを増加させ、ＤＩＯマウスの高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性から強力に保護した。メトホルミンは有意な効果を示さなかったが、試験物質＋メトホルミンは、試験物質単独と比較して最も効果的であり、ＨＯＭＡ－ＩＲを有意に低下させたように見えた。
げっ歯類では、試験物質は長い血漿半減期により経口投与可能であるが、血液脳関門を通過しない。試験物質を単独で、または臨床設定のようにメトホルミンと組み合わせて生体内で高血糖およびインスリン抵抗性を軽減できるかどうかに対処するために、マウスに「ＤＩＯ」（食餌誘発性肥満）と呼ばれる高脂肪食（ＨＦＤ）を与え、ビヒクル、試験物質、メトホルミン、または試験物質＋メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）をそれぞれ８週間、強制的に経口投与した（図２Ａ）。このレジメンでは、メトホルミンではなく、試験物質および試験物質＋メトホルミンは、ＨＦＤによって引き起こした空腹時血糖値および血漿インスリンレベルの上昇を回避した（図２、ＢおよびＣ）。その結果、ビヒクルと比較して、試験物質および試験物質＋メトホルミンで処理されたＤＩＯマウスは、ＨＯＭＡ－ＩＲ計算によって評価されるようなインスリン抵抗性を発症しなかった（図２Ｄ）。さらに、高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性の強力な予防と一致して、メトホルミンではなく、試験物質および試験物質＋メトホルミンは、ＤＩＯマウスのふくらはぎの筋肉で有意にｐＡＭＰＫを増加させ（図２Ｅ）、Ｔｘｎｉｐ ｍＲＮＡレベルを減少させ、Ｇｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルを増加させた（図２Ｆ）、これはインスリン依存性とインスリン非依存性の両方の効果と一致している。要約すると、試験物質はふくらはぎの筋肉のｐＡＭＰＫを増加させ、ＤＩＯマウスの高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性から強力に保護した。メトホルミンは有意な効果を示さなかったが、試験物質＋メトホルミンは、試験物質単独と比較して最も効果的であり、ＨＯＭＡ－ＩＲを有意に低下させたように見えた。
【0119】
２型糖尿病の患者では、確立された高血糖を軽減するために、試験物質をメトホルミンと組み合わせて使用されるであろう。これらの条件を模倣するために、マウスにＨＦＤを７週間与え、通常の食餌（ＲＤ）を与えたマウスと比較して高血糖とインスリン抵抗性を生じさせ（図２、ＧＩ）、ついで４週間、ＨＦＤを継続しながらビヒクルまたは試験物質＋メトホルミンで治療した。空腹時インスリンレベルとＨＯＭＡ－ＩＲの低下は、試験物質＋メトホルミンによる１週間の治療後に明らかだったが、空腹時血糖値は、ビヒクルと比較して、試験物質＋メトホルミンによる２週間の治療後に初めて有意に低下した（図２、ＧＩ）。長期治療は血糖値をさらに低下させ、４週間の治療後、空腹時血糖値はＲＤを与えられたマウスの血糖値まで低下した（図２Ｇ）。したがって、試験物質＋メトホルミンの代謝効果（すなわち、高血糖の減少）は、人間で観察される高血糖に対する運動および／またはカロリー制限の効果に十分に類似している。
【0120】
試験物質は、ｈＩＡＰＰｔｇＤＩＯマウスの糖尿病を予防および回復させる。
ＤＩＯマウスは高血糖になるが、明白な糖尿病ではないため、次に、ヒト２型糖尿病を模倣したマウスモデル（すなわち、ＨＦＤ誘発性のβ細胞機能障害と組み合わせたインスリン抵抗性／高血糖）での試験物質の効果を調査した。この目的のために、ラットインスリン２プロモーターの制御下でアミロイド形成性ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）遺伝子を発現するマウス（ｈＩＡＰＰｔｇマウスと呼ばれる）を使用し、ＨＦＤ食を６週間与えた（図３Ａ）。ｈＩＡＰＰｔｇ ＤＩＯマウスでは、ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇ／日で強制経口投与された試験物質により、６時間の空腹時血糖および血漿インスリンレベルの増加が回避された（図３、ＢおよびＣ）。腹腔内（Ｉ．ｐ．）（図３Ｄ）および経口（図３Ｅ）耐糖能試験（ＧＴＴ）は、試験物質が耐糖能障害および代償性高インスリン血症の発症を予防することを確認し、インスリン分泌過多の相対的正常化を示し、これはＲＤの１０週齢のｈＩＡＰＰｔｇマウスのそれを反映した（図３Ｆ）。さらに、全身インスリン感受性のＨＯＭＡ－ＩＲおよび松田指数モデルは、試験物質がｈＩＡＰＰｔｇ ＤＩＯマウスの全身インスリン抵抗性の発症を抑制したことを示した（図３、ＧおよびＨ）。
ＤＩＯマウスは高血糖になるが、明白な糖尿病ではないため、次に、ヒト２型糖尿病を模倣したマウスモデル（すなわち、ＨＦＤ誘発性のβ細胞機能障害と組み合わせたインスリン抵抗性／高血糖）での試験物質の効果を調査した。この目的のために、ラットインスリン２プロモーターの制御下でアミロイド形成性ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）遺伝子を発現するマウス（ｈＩＡＰＰｔｇマウスと呼ばれる）を使用し、ＨＦＤ食を６週間与えた（図３Ａ）。ｈＩＡＰＰｔｇ ＤＩＯマウスでは、ビヒクルと比較して、１００ｍｇ／ｋｇ／日で強制経口投与された試験物質により、６時間の空腹時血糖および血漿インスリンレベルの増加が回避された（図３、ＢおよびＣ）。腹腔内（Ｉ．ｐ．）（図３Ｄ）および経口（図３Ｅ）耐糖能試験（ＧＴＴ）は、試験物質が耐糖能障害および代償性高インスリン血症の発症を予防することを確認し、インスリン分泌過多の相対的正常化を示し、これはＲＤの１０週齢のｈＩＡＰＰｔｇマウスのそれを反映した（図３Ｆ）。さらに、全身インスリン感受性のＨＯＭＡ－ＩＲおよび松田指数モデルは、試験物質がｈＩＡＰＰｔｇ ＤＩＯマウスの全身インスリン抵抗性の発症を抑制したことを示した（図３、ＧおよびＨ）。
【0121】
試験物質が肥満の糖尿病ｈＩＡＰＰｔｇマウスで確立された糖尿病と肥満を元に戻すことができるかどうかを試験し、ＨＦＤ誘発性肥満に対する強制経口投与の潜在的な交絡効果を回避するために、試験物質－ＨＦＤと呼ばれる試験物質を含有するＨＦＤを処方した。グルコース恒常性に対する試験物質の用量反応効果を試験するために、次に、ＣＢＡマウスにＨＦＤまたは０．４、０．８、および２ｍｇ／ｇの試験物質を配合した試験物質－ＨＦＤを７週間与えた。ＣＢＡマウスでは、試験物質－ＨＦＤはふくらはぎの筋肉のｐＡＭＰＫを用量依存的に増加させ（図４Ａ）、高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性を強力に予防した（図４、Ｂ－Ｄ）。試験物質が確立された糖尿病を元に戻すことができるかどうかを試験するために、ｈＩＡＰＰｔｇマウスにＨＦＤを９週間与え、次に試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に７週間切り替えた（図４Ｅ）。切り替え後６週間で、試験物質－ＨＦＤは、確立された高血糖、高インスリン血症、およびインスリン抵抗性を元に戻し、したがって糖尿病を元に戻した（図４、Ｆ－Ｈ）。さらに、試験物質は、食物摂取量の増加にもかかわらず、体重および体脂肪の減少を誘発した。
【0122】
２ｍｇ／ｇの試験物質を配合したＨＦＤを与えたｈＩＡＰＰｔｇマウスの確立された糖尿病および肥満に対する試験物質の強力な効果は、これらのマウスで観察された有益な代謝効果（図４、Ｆ－Ｈ）が体重と体脂肪に対する効果の二次的な作用である可能性を残す。したがって、この問題に対処するために、より低い試験物質－ＨＦＤ濃度を使用する、ｈＩＡＰＰｔｇマウスに対する食餌切り替え実験を行い、マウスにＨＦＤを９週間与えた後、７週間、ＨＦＤを継続するか、または試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）に切り替えた。このレジメンでは、７週間の試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）への切り替えは、体重または体脂肪の減少を引き起こさなかった（図４、ＩおよびＪ）。それにもかかわらず、試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）への切り替え後６週間で、グルコースおよびインスリンのレベルならびにＨＯＭＡ－ＩＲが有意に減少し（図４、Ｋ－Ｍ）、これらの条件下では、試験物質の有益な代謝効果は、体重および体脂肪減少への効果とは独立していることを示す。総合すると、これらの結果は、試験物質が、肥満誘発性糖尿病である２型糖尿病マウスモデルにおいて、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血糖症、および顕性糖尿病を強力に回避することを示している。
【0123】
試験物質は、生体外での骨格筋管および生体内での骨格筋におけるグルコース取り込みを増加させる。
骨格筋では、ＡＭＰＫの活性化は、インスリン非依存性のグルコース取り込みの増加とインスリン抵抗性の低下の両方に関係している。したがって、骨格筋管では、試験物質は、インスリンの非存在下で、用量依存的およびＡＭＰＫ依存的に２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）の取り込みを増加させた（図５、Ａ－Ｄ）。さらに、放射性標識グルコース類似体－フルオロデオキシグルコース（－ＦＤＧ）の尾静脈注射のＰＥＴ分析を使用すると、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間与えられたマウスのふくらはぎのおよび大腿の筋肉において－ＦＤＧ取り込みの有意な増加が観察された（図５Ｅ）。これは、試験物質が生体内で骨格筋へのグルコース取り込みを促進することを示している。まとめると、これらの発見は、グルコース恒常性に対する試験物質の好ましい効果が、少なくとも部分的に、骨格筋における試験物質のグルコース取り込みへの刺激によって媒介されるという証拠を提供する。
骨格筋では、ＡＭＰＫの活性化は、インスリン非依存性のグルコース取り込みの増加とインスリン抵抗性の低下の両方に関係している。したがって、骨格筋管では、試験物質は、インスリンの非存在下で、用量依存的およびＡＭＰＫ依存的に２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）の取り込みを増加させた（図５、Ａ－Ｄ）。さらに、放射性標識グルコース類似体－フルオロデオキシグルコース（－ＦＤＧ）の尾静脈注射のＰＥＴ分析を使用すると、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間与えられたマウスのふくらはぎのおよび大腿の筋肉において－ＦＤＧ取り込みの有意な増加が観察された（図５Ｅ）。これは、試験物質が生体内で骨格筋へのグルコース取り込みを促進することを示している。まとめると、これらの発見は、グルコース恒常性に対する試験物質の好ましい効果が、少なくとも部分的に、骨格筋における試験物質のグルコース取り込みへの刺激によって媒介されるという証拠を提供する。
【0124】
試験物質は、β細胞のストレスを軽減し、β細胞の休息を促進する。
２型糖尿病では、有毒なＩＡＰＰ凝集体／アミロイドがβ細胞ストレスおよびβ細胞の劣化に関連している。ＨＦＤから試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に７週間切り替えたｈＩＡＰＰｔｇ ＨＦＤマウスでは、形成された膵島アミロイドの量は、ＨＦＤを７週間継続したマウスと比較して有意に減少した（図６、ＡおよびＢ）。しかし、試験物質－ＨＦＤを与えられたｈＩＡＰＰｔｇマウスで観察されたアミロイドの量の減少は、高血糖とインスリン抵抗性の改善の二次的効果である可能性がある。しかし、試験物質は、ラットインスリノーマＩＮＳ－１細胞、単離された初代マウスＷＴおよびｈＩＡＰＰｔｇ膵島、およびヒト膵島においてｐＡＭＰＫαを直接増加させた（図６Ｃ）。したがって、膵島細胞に対する試験物質の潜在的な直接効果を調査するために、次に、単離された初代ｈＩＡＰＰｔｇ膵島を高グルコース（２２ｍＭ）レベルで培養することによりアミロイド形成を誘発した。試験物質は、用量依存的に、２２ｍＭグルコースで培養されたｈＩＡＰＰｔｇ膵島におけるアミロイド形成を強力に弱めた（図６、ＤおよびＥ）。基礎オートファジーはβ細胞をｈＩＡＰＰオリゴマー毒性から保護することが示されており、ＡＭＰＫの活性化はオートファジーを促進する。上記と整合して、試験物質は、β細胞株ＩＮＳ－１Ｅにおいて、オートファジーフラックスを増強した。およびオートファジー阻害剤３－ＭＡの存在下で、２２ｍＭグルコースでのアミロイド形成に対する試験物質の予防効果は大幅に弱められた（図６、ＦおよびＧ）。しかし、ＡＭＰＫの活性化は、小胞体（ＥＲ）機能の維持を通じて代謝ストレスを受けたβ細胞の機能と生存を改善することも示され、試験物質は、２２ｍＭグルコースで培養された初代マウスの膵島における折りたたまれていないタンパク質応答遺伝子の発現の増加（すなわち、ＥＲストレスを示す）を大幅に防止した。したがって、試験物質は、肥満誘発性の２型糖尿病マウスモデル、ならびに生体外で、高グルコースレベルで培養された単離されたマウス膵島におけるβ細胞アミロイド形成を回避する。まとめると、本発明者らの発見は、正確なメカニズムにはさらなる分析が必要であるが、試験物質は、高血糖症および全身インスリン抵抗性を低減し、ならびにβ細胞のオートファジーおよび／または小胞体機能を増強することの両者によって、生体内で代謝的に誘導されるβ細胞ストレスおよびアミロイド形成を打ち消すことを示唆している。
２型糖尿病では、有毒なＩＡＰＰ凝集体／アミロイドがβ細胞ストレスおよびβ細胞の劣化に関連している。ＨＦＤから試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）に７週間切り替えたｈＩＡＰＰｔｇ ＨＦＤマウスでは、形成された膵島アミロイドの量は、ＨＦＤを７週間継続したマウスと比較して有意に減少した（図６、ＡおよびＢ）。しかし、試験物質－ＨＦＤを与えられたｈＩＡＰＰｔｇマウスで観察されたアミロイドの量の減少は、高血糖とインスリン抵抗性の改善の二次的効果である可能性がある。しかし、試験物質は、ラットインスリノーマＩＮＳ－１細胞、単離された初代マウスＷＴおよびｈＩＡＰＰｔｇ膵島、およびヒト膵島においてｐＡＭＰＫαを直接増加させた（図６Ｃ）。したがって、膵島細胞に対する試験物質の潜在的な直接効果を調査するために、次に、単離された初代ｈＩＡＰＰｔｇ膵島を高グルコース（２２ｍＭ）レベルで培養することによりアミロイド形成を誘発した。試験物質は、用量依存的に、２２ｍＭグルコースで培養されたｈＩＡＰＰｔｇ膵島におけるアミロイド形成を強力に弱めた（図６、ＤおよびＥ）。基礎オートファジーはβ細胞をｈＩＡＰＰオリゴマー毒性から保護することが示されており、ＡＭＰＫの活性化はオートファジーを促進する。上記と整合して、試験物質は、β細胞株ＩＮＳ－１Ｅにおいて、オートファジーフラックスを増強した。およびオートファジー阻害剤３－ＭＡの存在下で、２２ｍＭグルコースでのアミロイド形成に対する試験物質の予防効果は大幅に弱められた（図６、ＦおよびＧ）。しかし、ＡＭＰＫの活性化は、小胞体（ＥＲ）機能の維持を通じて代謝ストレスを受けたβ細胞の機能と生存を改善することも示され、試験物質は、２２ｍＭグルコースで培養された初代マウスの膵島における折りたたまれていないタンパク質応答遺伝子の発現の増加（すなわち、ＥＲストレスを示す）を大幅に防止した。したがって、試験物質は、肥満誘発性の２型糖尿病マウスモデル、ならびに生体外で、高グルコースレベルで培養された単離されたマウス膵島におけるβ細胞アミロイド形成を回避する。まとめると、本発明者らの発見は、正確なメカニズムにはさらなる分析が必要であるが、試験物質は、高血糖症および全身インスリン抵抗性を低減し、ならびにβ細胞のオートファジーおよび／または小胞体機能を増強することの両者によって、生体内で代謝的に誘導されるβ細胞ストレスおよびアミロイド形成を打ち消すことを示唆している。
【0125】
おそらく間接的および直接的の両方で、β細胞ストレスを低減する試験物質の見かけの能力は、試験物質がβ細胞の休止も促進し、それが次に長期のβ細胞機能を維持するのではないかという疑問を提起する。インスリン分泌のアルギニン刺激は、第一段階のインスリン放出（すなわち、すぐに放出可能な顆粒のプール）を評価し、機能的なβ細胞予備能の推定値を提供する。したがって、β細胞機能に対する試験物質の効果を評価するために、次に、インスリン分泌のアルギニン刺激を分析した。インスリン分泌のアルギニン刺激は、ＨＦＤ（図６Ｈ）を与えられたマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）を１１週間与えられたマウスで２倍増加した（図６Ｈ）。これは、試験物質がβ細胞のストレスを軽減し、β細胞の休息を促進し、次いで、β細胞の機能を維持／回復させるというさらなる証拠を提供するものである。
【0126】
試験物質は、熱中性条件での肥満を減らし、エネルギー消費を増やす。
肥満に対する試験物質の効果をさらに調査するために、クロスオーバー実験を行った。１４日間ＨＦＤを与えられたマウスは急速に体重が増加したが、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を与えられたマウスは、１～１４日間にＨＦＤを与えられたマウスよりも多くの食物を消費したが、ほとんど体重が増加しなかった（図７、ＡおよびＢ）。ＨＦＤと試験物質－ＨＦＤをこれら２つの群のマウス間で切り替えると、１５日目にＨＦＤから試験物質－ＨＦＤに切り替えたマウスは急速に体重が減り始め、再び食物摂取量が相対的に増加した。逆に、試験物質－ＨＦＤからＨＦＤに切り替えたマウスは、相対的な食物摂取量を減らしながら体重を増やした（図７、ＡおよびＢ）。次に、試験物質が熱中性で体重減少を誘発するかどうかを試験し、試験物質－ＨＦＤを継続しながら、飼育温度から３０℃に、４９日目から移されたマウスは、依然として体重増加を回避したが、ＨＦＤを与えられたマウスは体重増加を続けた（図７Ａ）。さらに、３０℃で飼育されたマウスは、５７日目にＨＦＤから試験物質－ＨＦＤに食餌を切り替えたとき、急速に体重が減り始めた。逆に、試験物質－ＨＦＤからＨＦＤに切り替えたマウスは急速に体重が増加し始めた（図７Ａ）。これらの条件下では、コア温度のわずかな（０．２℃）有意でない上昇のみが観察された（ＨＦＤ－処理マウスで３７．７℃±０．１２℃、ｎ＝５、および試験物質－ＨＦＤ処理マウスで３７．９℃±０．０８℃、ｎ＝５）。したがって、試験物質はまた、熱中性で肥満を減少させる。
肥満に対する試験物質の効果をさらに調査するために、クロスオーバー実験を行った。１４日間ＨＦＤを与えられたマウスは急速に体重が増加したが、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を与えられたマウスは、１～１４日間にＨＦＤを与えられたマウスよりも多くの食物を消費したが、ほとんど体重が増加しなかった（図７、ＡおよびＢ）。ＨＦＤと試験物質－ＨＦＤをこれら２つの群のマウス間で切り替えると、１５日目にＨＦＤから試験物質－ＨＦＤに切り替えたマウスは急速に体重が減り始め、再び食物摂取量が相対的に増加した。逆に、試験物質－ＨＦＤからＨＦＤに切り替えたマウスは、相対的な食物摂取量を減らしながら体重を増やした（図７、ＡおよびＢ）。次に、試験物質が熱中性で体重減少を誘発するかどうかを試験し、試験物質－ＨＦＤを継続しながら、飼育温度から３０℃に、４９日目から移されたマウスは、依然として体重増加を回避したが、ＨＦＤを与えられたマウスは体重増加を続けた（図７Ａ）。さらに、３０℃で飼育されたマウスは、５７日目にＨＦＤから試験物質－ＨＦＤに食餌を切り替えたとき、急速に体重が減り始めた。逆に、試験物質－ＨＦＤからＨＦＤに切り替えたマウスは急速に体重が増加し始めた（図７Ａ）。これらの条件下では、コア温度のわずかな（０．２℃）有意でない上昇のみが観察された（ＨＦＤ－処理マウスで３７．７℃±０．１２℃、ｎ＝５、および試験物質－ＨＦＤ処理マウスで３７．９℃±０．０８℃、ｎ＝５）。したがって、試験物質はまた、熱中性で肥満を減少させる。
【0127】
試験物質がエネルギー消費量（ＥＥ）を増加させることによって肥満を回避するかどうかに直接対処するために、ＨＦＤまたは試験物質－ＨＦＤ（０．８ｍｇ／ｇ）を１１週間投与されたマウスについて酸素消費（ＶＯ２）、呼吸交換率（ＰＥＲ）、およびエネルギー消費量（ＥＥ）を３日間測定した。ＶＯ２は、ＨＦＤのマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤのマウスでは明期と暗期の両方で有意に増加した（図７Ｃ）。ＲＥＲは、２日目の明期および、暗期の３日間を通じた測定で有意に減少し、試験物質－ＨＦＤを与えられたマウスが主なエネルギー源を炭水化物から脂肪酸（ＦＡｓ）に切り替えたという証拠を提供した（図７Ｄ）。予想通り、ＥＥは明期と暗期の両方で大幅に増加した（図７Ｅ）。まとめると、これらのデータは、試験物質がエネルギー代謝を高めることによって体重増加を抑制することを強く示唆している。
【0128】
試験物質は、脂肪トリグリセライドリパーゼ（ＡＴＧＬ）活性と白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）における脂肪酸（ＦＡ）酸化に関連する遺伝子の発現を増加させる。
体脂肪の減少と一致して、試験物質－ＨＦＤを与えられた（２ｍｇ／ｇ）マウスは、ＨＦＤを与えられたマウスよりも鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）および精巣上体の白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の脂肪体の重量が著しく低かった。ＷＡＴ貯蔵を減らすには、脂肪分解を強化する必要がある。基礎トリグリセリド（ＴＧ）加水分解を触媒する律速酵素をコードするデスヌトリン（ｄｅｓｎｕｔｒｉｎ）／ＡｔｇｌはＡＭＰＫの直接の標的であり、ＡＭＰＫによるＳ４０６のリン酸化はＡＴＧＬ活性を増加させ、脂肪分解を増加させるはずである。上記のとおり、試験物質－ＨＦＤはｉＷＡＴのｐ－Ｓ４０６ＡＴＧＬレベルとＡｔｇｌｍＲＮＡレベルの両方を増加させた（図７、ＦおよびＧ）。さらに、ミトコンドリアのＦＡ取り込みを増加させるＣｐｔ１ｂ、およびミトコンドリア活性／ＦＡ酸化を増加させるＣｏｘ８ｂも、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を与えられたマウスのｉＷＡＴで増加した（図７Ｇ）。試験物質は、用量依存的に、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）でのＵＣＰ１の発現およびｉＷＡＴでの低レベルＵＣＰ１の発現をわずかに減少させ、試験物質の抗肥満効果の機構としてＷＡＴでの脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）の異所性発現に反することを示している。まとめると、これらのデータは、試験物質が、少なくとも部分的に、ＷＡＴにおける脂肪分解およびＦＡ酸化を増加させることによって肥満を回避するという証拠を提供する。
体脂肪の減少と一致して、試験物質－ＨＦＤを与えられた（２ｍｇ／ｇ）マウスは、ＨＦＤを与えられたマウスよりも鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）および精巣上体の白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の脂肪体の重量が著しく低かった。ＷＡＴ貯蔵を減らすには、脂肪分解を強化する必要がある。基礎トリグリセリド（ＴＧ）加水分解を触媒する律速酵素をコードするデスヌトリン（ｄｅｓｎｕｔｒｉｎ）／ＡｔｇｌはＡＭＰＫの直接の標的であり、ＡＭＰＫによるＳ４０６のリン酸化はＡＴＧＬ活性を増加させ、脂肪分解を増加させるはずである。上記のとおり、試験物質－ＨＦＤはｉＷＡＴのｐ－Ｓ４０６ＡＴＧＬレベルとＡｔｇｌｍＲＮＡレベルの両方を増加させた（図７、ＦおよびＧ）。さらに、ミトコンドリアのＦＡ取り込みを増加させるＣｐｔ１ｂ、およびミトコンドリア活性／ＦＡ酸化を増加させるＣｏｘ８ｂも、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を与えられたマウスのｉＷＡＴで増加した（図７Ｇ）。試験物質は、用量依存的に、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）でのＵＣＰ１の発現およびｉＷＡＴでの低レベルＵＣＰ１の発現をわずかに減少させ、試験物質の抗肥満効果の機構としてＷＡＴでの脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）の異所性発現に反することを示している。まとめると、これらのデータは、試験物質が、少なくとも部分的に、ＷＡＴにおける脂肪分解およびＦＡ酸化を増加させることによって肥満を回避するという証拠を提供する。
【0129】
ＢＡＴでＡＭＰＫを活性化すると、ＦＡの取り込み、代謝活性、およびＥＥが増加する。上記のとおり、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、ＢＡＴ脂肪体の重量は試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を与えられたマウスで減少し、ＢＡＴ代謝活性の増加を示している。特に、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）は、ＤＩＯマウスのＢＡＴにおけるＣｄ３６の発現を有意に増加させ、ＦＡの取り込みの向上を示し、ならびにＣｐｔ１ｂの発現を増強し、ＦＡシンターゼ（Ｆａｓ）、ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ１（Ｓｃｄ１）、およびＡｃｃ１をコードする遺伝子の発現を強力に減じ、それらは、組み合わさって、ＢＡＴにおける新規の（ｄｅ ｎｏｖｏ）脂質生成（ＤＮＬ）を減少させ、ミトコンドリアＦＡの取り込み／酸化を増加させるはずである（図７Ｈ）。さらに、最近の結果は、細胞内脂肪分解なしに褐色脂肪で熱が発生する可能性があり、ＢＡＴがＷＡＴ脂肪体での脂肪分解に由来するＦＡを吸収して燃焼できるという証拠を提供している。まとめると、これらの発見は、ＷＡＴとＢＡＴの両方の活性の増加が組み合わさって、試験物質で処理されたＤＩＯマウスのＥＥの増加と脂肪／体重の減少を促進する可能性を残している。
【0130】
ＷＡＴから肝臓への脂肪分解流の増加は脂肪肝を引き起こす可能性がある。しかし、試験物質は用量依存的にヒト初代肝細胞の脂質合成を抑制した。試験物質はまた、肝臓の新規脂質生成（ＤＮＬ）を約４５％減少させた。食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの肝臓において、用量依存的にＣｐｔ１ｂが増加し、Ａｃｃ２、Ｆａｓ、およびＳｃｄ１のｍＲＮＡレベルが減少した。ＤＩＯマウスの脂肪肝を予防および軽減した。
【0131】
試験物質は、心臓のｐＡＭＰＫレベルを増加させ、一回拍出量を増加させ、心臓のグリコーゲンを減少させるが、心肥大を誘発しない。
運動は心臓のＡＭＰＫを活性化し、グルコースの取り込みを増加させ、心臓のグリコーゲンレベルを低下させる。ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、０．８または２ｍｇ／ｇの試験物質－ＨＦＤを７週間与えられたマウスは、心臓のｐＡＭＰＫレベルの有意な増加を示し、心臓のグリコーゲン含有量は用量依存的に減少した（図８Ａ）。別の実験では、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間与えられたマウスの心臓で－ＦＤＧ取り込みの有意な増加が観察された（図８Ｂ）。したがって、試験物質の心臓への影響は、運動の心臓への影響に似ている。ＨＦＤと比較して、０．８または２ｍｇ／ｇで試験物質－ＨＦＤの７週間の投与は、心臓の重量／脛骨の長さの増加を引き起こさなかった（図８Ｃ）。さらに、ＲＤを与えられ、１００、３００、および６００ｍｇ／ｋｇ／日の試験物質で６ヶ月間強制経口投与されたラットは、ビヒクルと比較して心臓／脳重量の増加を示さなかった。したがって、心臓における試験物質を介したＡＭＰＫ活性化は、心肥大を引き起こさなかった。
運動は心臓のＡＭＰＫを活性化し、グルコースの取り込みを増加させ、心臓のグリコーゲンレベルを低下させる。ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、０．８または２ｍｇ／ｇの試験物質－ＨＦＤを７週間与えられたマウスは、心臓のｐＡＭＰＫレベルの有意な増加を示し、心臓のグリコーゲン含有量は用量依存的に減少した（図８Ａ）。別の実験では、ＨＦＤを与えられたマウスと比較して、試験物質－ＨＦＤ（２ｍｇ／ｇ）を２週間与えられたマウスの心臓で－ＦＤＧ取り込みの有意な増加が観察された（図８Ｂ）。したがって、試験物質の心臓への影響は、運動の心臓への影響に似ている。ＨＦＤと比較して、０．８または２ｍｇ／ｇで試験物質－ＨＦＤの７週間の投与は、心臓の重量／脛骨の長さの増加を引き起こさなかった（図８Ｃ）。さらに、ＲＤを与えられ、１００、３００、および６００ｍｇ／ｋｇ／日の試験物質で６ヶ月間強制経口投与されたラットは、ビヒクルと比較して心臓／脳重量の増加を示さなかった。したがって、心臓における試験物質を介したＡＭＰＫ活性化は、心肥大を引き起こさなかった。
【0132】
運動は一回拍出量を増やすことによって心機能を改善する。したがって、本発明者らは、ＲＤ、ＨＦＤ、または試験物質－ＨＦＤを０．８ｍｇ／ｇまたは２ｍｇ／ｋｇで与えられたマウスにおいて、心エコー検査によって左心室（ＬＶ）機能に対する試験物質の効果を調べた。ＲＤと比較して、ＨＦＤは、拡張末期容積と収縮末期容積の両方の有意な減少と、わずかで有意ではない一回拍出量の減少を引き起こした（図８、Ｄ－Ｆ）。試験物質－ＨＦＤは拡張末期容積を正常化し、用量依存的に改善したが、収縮末期容積を完全には回復しなかった（図８、ＤおよびＥ）。重要なことに、試験物質－ＨＦＤ０．８ｍｇ／ｇおよび２ｍｇ／ｇは、ＲＤおよびＨＦＤの両方と比較して１回拍出量の有意な増加（約２０％）を誘発した（図８Ｆ）。特に、これらの麻酔条件下では、ＨＦＤはＲＤと比較して心拍数の有意な増加を引き起こしたが、試験物質－ＨＦＤ、０．８ｍｇ／ｇで正常化し、試験物質－ＨＦＤ、２ｍｇ／ｇで心拍数が減少した（図８Ｇ）。したがって、試験物質は、ＨＦＤによって誘発される拡張末期容積の減少を正常化し、一回拍出量の有意な増加を誘発し、試験物質が左心室（ＬＶ）機能に対する運動の有益な効果を模倣することを示している。
【0133】
試験物質は、マウスの微小血管機能と持久力を改善し、犬の血圧を下げる。
微小血管機能と末梢血流の低下は、２型糖尿病に重篤な合併症を引き起こす。内皮細胞および平滑筋細胞におけるＡＭＰＫの活性化は血管拡張を促進し、ＡＭＰＫ活性化因子である５－アミノイミダゾール－４－カルボキシアミド－１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）は筋肉の微小血管灌流を増加させる。したがって、末梢血流に対する試験物質の潜在的な影響を解明するために、レーザードップラーイメージングを使用して、ビヒクルまたは試験物質（４０ｍｇ／ｋｇ／日）を８週間強制投与したＤＩＯマウスの左後足の血液灌流をモニターした。これらの条件下で、体重に影響を与えることなく（ビヒクルを与えたマウスは２４．５から３４ｇに増加し、試験物質を与えたマウスは２５．６から３６．５ｇに増加した）、試験物質は－ビヒクルと比較して－後足の微小血管血流を有意に増加させた（図９、ＡおよびＢ）。試験物質が微小血管の血流を増加させ、それが熱の放散を増加させるという考えを支持して、皮膚表面温度は、試験物質で処理されたザッカーラットにおいて上昇した。
微小血管機能と末梢血流の低下は、２型糖尿病に重篤な合併症を引き起こす。内皮細胞および平滑筋細胞におけるＡＭＰＫの活性化は血管拡張を促進し、ＡＭＰＫ活性化因子である５－アミノイミダゾール－４－カルボキシアミド－１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）は筋肉の微小血管灌流を増加させる。したがって、末梢血流に対する試験物質の潜在的な影響を解明するために、レーザードップラーイメージングを使用して、ビヒクルまたは試験物質（４０ｍｇ／ｋｇ／日）を８週間強制投与したＤＩＯマウスの左後足の血液灌流をモニターした。これらの条件下で、体重に影響を与えることなく（ビヒクルを与えたマウスは２４．５から３４ｇに増加し、試験物質を与えたマウスは２５．６から３６．５ｇに増加した）、試験物質は－ビヒクルと比較して－後足の微小血管血流を有意に増加させた（図９、ＡおよびＢ）。試験物質が微小血管の血流を増加させ、それが熱の放散を増加させるという考えを支持して、皮膚表面温度は、試験物質で処理されたザッカーラットにおいて上昇した。
【0134】
強化された心血管機能は、人間と動物の持久力の改善に関連している。試験物質が持久力を改善できるかどうかを試験するために、体力枯渇までの走行距離をモニターし、さまざまな程度の肥満の交絡効果を回避するために、３０日間、ＲＤを与え、ビヒクルまたは試験物質（２０ｍｇ／ｋｇ／日）を強制投与した、体重を一致させた１４月齢のマウスを使用した。トレッドミル運動は、ビヒクルを与えたマウス（３３．４から３１．４ｇ）および試験物質を与えたマウス（３４．１から３２．２ｇ）で同程度に体重を減少させました。ビヒクルと比較して、試験物質は、体力枯渇までの走行距離としてモニターされた持久力を有意に改善し（図９Ｃ）、血中乳酸レベルの増加を有意に減少させ（図９Ｄ）、酸化的代謝の増加を示している。したがって、ＤＩＯマウスで観察された有益な心血管効果と一致して、試験物質は、ＲＤを与えられた痩せた活動的でない老齢マウスの持久力を改善する。
【0135】
ＡＭＰＫ活性化因子ＡＩＣＡＲは、高血圧ラットの血圧を急激に低下させ、単離した抵抗性動脈を弛緩させることが示されている。たとえば、研究的新薬毒物学パッケージの一部として、試験物質の単回投与後の意識のある犬での遠隔測定研究が行われ、これらの条件下で、試験物質は急激に血圧を低下させた（図９、ＥおよびＦ）。したがって、試験物質は、心臓の１回拍出量を改善し、微小血管灌流を増加させ、血圧を低下させる。
【0136】
概要
ＤＩＯマウスでは、試験物質は骨格筋へのグルコース取り込みを増加させ、β細胞ストレスを減少させ、β細胞の休息を促進した。試験物質は、動物の末梢微小血管灌流を改善し、血圧を低下させた。また、心臓のＡＭＰＫを活性化し、心臓のグルコース取り込みを増加させ、心臓のグリコーゲンレベルを低下させ、マウスのＬＶ一回拍出量を改善したが、マウスまたはラットの心臓重量は増加しなかった。
ＤＩＯマウスでは、試験物質は骨格筋へのグルコース取り込みを増加させ、β細胞ストレスを減少させ、β細胞の休息を促進した。試験物質は、動物の末梢微小血管灌流を改善し、血圧を低下させた。また、心臓のＡＭＰＫを活性化し、心臓のグルコース取り込みを増加させ、心臓のグリコーゲンレベルを低下させ、マウスのＬＶ一回拍出量を改善したが、マウスまたはラットの心臓重量は増加しなかった。
【0137】
実施例２－第ＩＩａ相臨床試験
方法
臨床試験デザイン
画期的新薬であるＡＭＰＫ活性化因子（試験物質；１，０００ｍｇ／日）の探索的概念実証ランダム化、並行群間、二重盲検、プラセボ対照第ＩＩａ相２８日間試験（ＴＥＬＬＵＳ）がメトホルミンを３か月以上服用している６５人の２型糖尿病患者を対象に実施された。これは、単回投与レベルでの試験物質の安全性と空腹時血糖値（ＦＰＧ）に対する試験物質の影響をさらに調査することを目的としている。
方法
臨床試験デザイン
画期的新薬であるＡＭＰＫ活性化因子（試験物質；１，０００ｍｇ／日）の探索的概念実証ランダム化、並行群間、二重盲検、プラセボ対照第ＩＩａ相２８日間試験（ＴＥＬＬＵＳ）がメトホルミンを３か月以上服用している６５人の２型糖尿病患者を対象に実施された。これは、単回投与レベルでの試験物質の安全性と空腹時血糖値（ＦＰＧ）に対する試験物質の影響をさらに調査することを目的としている。
【0138】
ＴＥＬＬＵＳは、ＥｕｄｒａＣＴデータベースプロトコル番号２０１６－００２１８３－１３にリストされている。この研究は、ヘルシンキ宣言を起源とし、国際調和会議（ＩＣＨ）／医薬品の臨床試験の実施の基準（ＧＣＰ）、欧州連合（ＥＵ）臨床試験指令、および該当する地域の規制要件と一致する倫理原則に従って実施された。研究プロトコルは、スウェーデンのウプサラにある地域倫理委員会によって承認された、プロジェクト番号／ＩＤ Ｏ３０４－２０１６－０２。研究関連の手順を実行する前に、インフォームドコンセントフォームに署名し、すべての患者と研究者が個人的に日付を記入した。
【0139】
主な選択基準：メトホルミン単剤療法による３か月以上の安定した２型糖尿病治療を受けている、合併症のない２型糖尿病の１８～８０歳の男性および女性患者。１日目のＦＰＧではなく、６．５％以上および９．０％以下のＨｂＡ１ｃが主要な選択基準として選択された。
【0140】
主な除外基準：心筋梗塞（ＭＩ）、不安定狭心症、脳卒中または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の病歴。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラスＩＩＩ－ＩＶとして定義されるうっ血性心不全。研究者が判断した、身体検査、エコー心電図（ＥＣＧ）、または臨床化学の結果における臨床的に重大な異常。
【0141】
臨床試験化合物
医薬品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）を遵守した５ｋｇの試験物質のバッチは、インドのカルナータカ州バンガロールにあるＡｎｔｈｅｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄによって製造された。懸濁液は、リン酸緩衝液中の２％メチルセルロース中の試験物質２０ｍｇ／ｍｌで構成されている。色が活性製品と一致する２％メチルセルロース懸濁液をプラセボとして使用した。試験物質およびプラセボ懸濁液は、スウェーデンのソルナにあるＲｅｃｉｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＡＢによって製造、包装、およびラベル付けされた。
医薬品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）を遵守した５ｋｇの試験物質のバッチは、インドのカルナータカ州バンガロールにあるＡｎｔｈｅｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄによって製造された。懸濁液は、リン酸緩衝液中の２％メチルセルロース中の試験物質２０ｍｇ／ｍｌで構成されている。色が活性製品と一致する２％メチルセルロース懸濁液をプラセボとして使用した。試験物質およびプラセボ懸濁液は、スウェーデンのソルナにあるＲｅｃｉｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＡＢによって製造、包装、およびラベル付けされた。
【0142】
臨床方法論
６５人の患者が当該物質またはプラセボのいずれかによる治療に無作為に（１：１）割り当てられた。スクリーニングのための訪問（訪問１）は、無作為化および治験薬（ＩＭＰ）投与開始前の３週間以内に実施された。患者は１日目（訪問２）に無作為化され、試験物質またはプラセボ（１：１）のいずれかによる２８日間の治療に割り当てられた。クリニックへの試験用訪問は、無作為化および治療開始後７、１４、２１、２８、２９および４０日（訪問３～８）に実施された。患者は、空腹時血糖値の分析用のサンプルが収集される前に絶食状態を確保するために、１日目と２８日目の前夜（それぞれ－１日目と２７日目）から研究クリニックに収容された。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンは、スクリーニング後であって１日目前、および治療終了後に、標準化された方法に従って、スウェーデンのウプサラにある大学病院で実施された。ウプサラのＡｎｔａｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌがデータ分析を行った。取得したスキャンの臨床読み取りは、Ａｎｔａｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌの放射線科医によって行われた。放射線科医によって臨床的に重要な所見が認められた場合、研究者にその所見が通知された。研究者は、標準的な医学的／臨床的判断に従って所見を評価および処理することになっていた。
６５人の患者が当該物質またはプラセボのいずれかによる治療に無作為に（１：１）割り当てられた。スクリーニングのための訪問（訪問１）は、無作為化および治験薬（ＩＭＰ）投与開始前の３週間以内に実施された。患者は１日目（訪問２）に無作為化され、試験物質またはプラセボ（１：１）のいずれかによる２８日間の治療に割り当てられた。クリニックへの試験用訪問は、無作為化および治療開始後７、１４、２１、２８、２９および４０日（訪問３～８）に実施された。患者は、空腹時血糖値の分析用のサンプルが収集される前に絶食状態を確保するために、１日目と２８日目の前夜（それぞれ－１日目と２７日目）から研究クリニックに収容された。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンは、スクリーニング後であって１日目前、および治療終了後に、標準化された方法に従って、スウェーデンのウプサラにある大学病院で実施された。ウプサラのＡｎｔａｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌがデータ分析を行った。取得したスキャンの臨床読み取りは、Ａｎｔａｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌの放射線科医によって行われた。放射線科医によって臨床的に重要な所見が認められた場合、研究者にその所見が通知された。研究者は、標準的な医学的／臨床的判断に従って所見を評価および処理することになっていた。
【0143】
治験薬の最初の投与後に始まり、または悪化した場合、いかなる所見も基礎的事象または有害事象として報告された。ふくらはぎの筋肉の微小血管機能を評価するために使用される方法（酸素化の代用）には、反応性充血の前、間および後の動的ＭＲＩ検査のＴ２＊測定が含まれる（参考文献４）。６５人の患者がプラセボ群に３２人、試験物質群に３３人に無作為に割り付けられ、そして５９人の患者が研究を完了した（２つの群でそれぞれ２８人と３１人）。ＭＲＩ検査をスクリーニング後、１日目の前に実施する必要があったため、１日目のＦＰＧではなく６．５％以上９．０％以下のＨｂＡ１ｃを選択基準として使用した。その後、ベースラインで広範囲のＦＰＧ値が＜７および＞１３．３ｍｍｏｌ／ｌ（＜１２６～＞２４０ｍｇ／ｄｌ）の両方で観察され（１３．３ｍｍｏｌ／ｌ（２４０ｍｇ／ｄｌ）は、制御不能な高血糖を表す）１日目でＦＰＧが７ｍＭを超え１３．３ｍＭ未満の２型糖尿病患者における１日目と比較した２８日目のＦＰＧの変化の事後の統計分析を必要とした。
【0144】
結果
試験物質は、メトホルミン投与の２型糖尿病患者の血糖恒常性を改善する。
前臨床の動物種における試験物質の有益な代謝および心臓血管効果に基づいて、試験物質が臨床開発のために選択され、ラットおよびイヌにおける毒物学的研究および第Ｉ相安全性臨床試験が無事に終了した。したがって、メトホルミンで安定している６５人の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者を対象に、ＴＥＬＬＵＳと呼ばれる２８日間の概念実証第ＩＩａ相臨床試験が実施された。安全性とは別に、ＦＰＧ、インスリン、血圧をモニターし、ふくらはぎの筋肉の微小血管灌流をＭＲＩで検査した。
試験物質は、メトホルミン投与の２型糖尿病患者の血糖恒常性を改善する。
前臨床の動物種における試験物質の有益な代謝および心臓血管効果に基づいて、試験物質が臨床開発のために選択され、ラットおよびイヌにおける毒物学的研究および第Ｉ相安全性臨床試験が無事に終了した。したがって、メトホルミンで安定している６５人の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者を対象に、ＴＥＬＬＵＳと呼ばれる２８日間の概念実証第ＩＩａ相臨床試験が実施された。安全性とは別に、ＦＰＧ、インスリン、血圧をモニターし、ふくらはぎの筋肉の微小血管灌流をＭＲＩで検査した。
【0145】
２型糖尿病患者は、ＴＥＬＬＵＳ研究に含まれるために、治療開始前にＭＲＩ検査を実施して合格する必要があった。したがって、１日目のＦＰＧではなく、スクリーニング時にＨｂＡ１ｃが６．５％以上および９．０％以下を選択基準として使用した。したがって、１日目にＦＰＧ範囲が＞７～＜１３．３ｍｍｏｌ／ｌ（＞１２６～＜２４０ｍｇ／ｄｌ）の患者の事後分析を実施した。ここで、１３．３ｍｍｏｌ／ｌ（２４０ｍｇ／ｄｌ）は制御不能な高血糖を表す。１日目と比較した２８日目のＦＰＧの平均の絶対値の減少は、プラセボ群で－０．１０ｍＭ、試験物質群で－０．６０ｍＭであった（図１０、ＡおよびＢ）。ウィルコクソンの順位和検定では、プラセボ群と比較して、試験物質群のＦＰＧに統計的に有意な絶対的（Ｐ＝０．０１０）および相対的（Ｐ＝０．０１８）減少があり、混合モデルＡＮＯＶＡ二元配置分散分析の絶対変化はＰ＝０．０４９、および混合モデルＡＮＯＶＡ一元配置分散分析の相対変化はＰ＝０．０３７であった。プラセボ群ではなく、試験物質群内のウィルコクソン検定では、１日目と比較して２８日目でＦＰＧの有意な絶対的（Ｐ＝０．０００２）（図１０Ａ）および相対的（Ｐ＝０．０００３）減少があった。ＤＩＯマウスでは、試験物質＋メトホルミンによる２週間の治療後に空腹時血糖の有意な低下が観察され、治療期間と共に有効性が増加する（図２Ｇ）。したがって、２型糖尿病患者のＦＰＧに対する試験物質の効果は、観察するのに少なくとも２週間かかる可能性がある。上記の通り、試験物質群内のＦＰＧの有意な減少は、２１日目から２８日目までの間に発生し（図１０Ｂ）、これはＤＩＯマウスの対応する１４日間の時間枠と一致している（図２Ｇ）。さらに、試験物質の血漿ｔ１／２が長いため、２型糖尿病患者では１４日目まで血漿定常状態濃度に到達しない。特に、プラセボ群ではなく、試験物質群内のウィルコクソン検定では、１日目と比較して２８日目にＨＯＭＡ－ＩＲの統計的に有意な絶対的（Ｐ＝０．００９７）および相対的（Ｐ＝０．０１７）両方の減少が観察された（図１０Ｃ）。したがって、試験物質は、メトホルミンの投与を受ける２型糖尿病患者の血糖恒常性を改善した。
【0146】
試験物質は、メトホルミンを投与される２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉における末梢微小血管灌流を増加させる。
２型糖尿病は重度の微小血管合併症に関連し、試験物質はマウスの末梢微小血管灌流を増加させたので、ＴＥＬＬＵＳ研究において充血性微小血管灌流がＭＲＩおよび動的Ｔ２＊定量化（局所磁場不均一性によって引き起こされる横緩和の時定数）により、２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉においてスクリーニング時および２７～２９日目にモニターされた。得られたＴ２＊値の時間グラフを個別に分析し、自動カーブフィッティングにより一連のパラメータを抽出した。文献と比較して予想したとおり、ＴＥＬＬＵＳ試験の患者の末梢循環状態は、ベースラインでは全体として低下しておらず、強力な介入効果の徴候は期待できなかった。それにもかかわらず、二元配置分散分析でベースラインと比較した２８日目では、プラセボ群と比較して試験物質群でΔ－Ｔ２＊（Ｐ＝０．０２６）に統計的に有意な増加があり、これは最小虚血値とピーク充血値との差として明確化され、充血性灌流の増加を示した。さらに、ウィルコクソン検定では、ベースラインと比較して、２８日目のプラセボ群ではなく試験物質群の充血性灌流の増加率として定義されるＴ２＊勾配の有意な相対的増加があった（Ｐ＝０．０１２）。ただし、末梢循環が比較的低下している被験者では、ピークの画定が不十分であり、反応性充血に従うピーク特性を正しく特定することが困難であった。したがって、事後分析では、画像ノイズと信号ドリフトが多くの被験者にわたって平均化され、有意差検定がノンパラメトリックリサンプリング手法である順列検定によって実行されたため、代替として群レベルでカーブフィッティングが実行された。これらの条件下で、プラセボ群と比較して、試験物質群のベースラインと比較して、２８日目にΔ－Ｔ２＊（Ｐ＝０．０３７）およびＴ２＊勾配（Ｐ＝０．０２４）の両方に有意な増加があった。したがって、試験物質は、ベースラインと比較して、２８日目のＴ２＊勾配およびΔ－Ｔ２＊の変化によって評価されるように、メトホルミンを投与される２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉における微小血管灌流を増加させることが見出された（表４）。
２型糖尿病は重度の微小血管合併症に関連し、試験物質はマウスの末梢微小血管灌流を増加させたので、ＴＥＬＬＵＳ研究において充血性微小血管灌流がＭＲＩおよび動的Ｔ２＊定量化（局所磁場不均一性によって引き起こされる横緩和の時定数）により、２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉においてスクリーニング時および２７～２９日目にモニターされた。得られたＴ２＊値の時間グラフを個別に分析し、自動カーブフィッティングにより一連のパラメータを抽出した。文献と比較して予想したとおり、ＴＥＬＬＵＳ試験の患者の末梢循環状態は、ベースラインでは全体として低下しておらず、強力な介入効果の徴候は期待できなかった。それにもかかわらず、二元配置分散分析でベースラインと比較した２８日目では、プラセボ群と比較して試験物質群でΔ－Ｔ２＊（Ｐ＝０．０２６）に統計的に有意な増加があり、これは最小虚血値とピーク充血値との差として明確化され、充血性灌流の増加を示した。さらに、ウィルコクソン検定では、ベースラインと比較して、２８日目のプラセボ群ではなく試験物質群の充血性灌流の増加率として定義されるＴ２＊勾配の有意な相対的増加があった（Ｐ＝０．０１２）。ただし、末梢循環が比較的低下している被験者では、ピークの画定が不十分であり、反応性充血に従うピーク特性を正しく特定することが困難であった。したがって、事後分析では、画像ノイズと信号ドリフトが多くの被験者にわたって平均化され、有意差検定がノンパラメトリックリサンプリング手法である順列検定によって実行されたため、代替として群レベルでカーブフィッティングが実行された。これらの条件下で、プラセボ群と比較して、試験物質群のベースラインと比較して、２８日目にΔ－Ｔ２＊（Ｐ＝０．０３７）およびＴ２＊勾配（Ｐ＝０．０２４）の両方に有意な増加があった。したがって、試験物質は、ベースラインと比較して、２８日目のＴ２＊勾配およびΔ－Ｔ２＊の変化によって評価されるように、メトホルミンを投与される２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉における微小血管灌流を増加させることが見出された（表４）。
【0147】
【表4】
【0148】
最後に、治療に反応したのがベースラインでの灌流が比較的低い被験者であるかどうかを解明するために、ベースラインでのピークまでの時間（ＴＴＰ）に基づいて、試験物質群とプラセボ群を半分に分割した。短いＴＴＰおよび長いＴＴＰは、それぞれ充血性灌流の速度が比較的高い場合と低い場合を表す。次に、ベースライン時のＭＲＩ（ＭＲＩ１）と治療終了時のＭＲＩ（ＭＲＩ２）と比較して、順列分析で調査した。この層別分析から、試験物質群のベースラインでの灌流速度が比較的低い（長いＴＴＰ）被験者で、ＴＴＰの有意な短縮（Ｐ＝０．０４３）とΔ－Ｔ２＊の増加（Ｐ＝０．０３４）が観察された。しかし、ＴＴＰが短い被験者では観察されず、プラセボ群のベースラインでＴＴＰが短い被験者と長い被験者のどちらにも違いはなかった（図１０Ｄ）。したがって、試験物質は、ベースラインでの灌流速度が比較的低い２型糖尿病患者のふくらはぎの筋肉における充血性微小血管灌流を優先的に増加させる。
【0149】
試験物質は、メトホルミンの投与を受ける２型糖尿病患者の血圧を下げる。
微小循環は末梢血管抵抗を調節し、心拍出量と組み合わせて動脈血圧を決定する。ＡＩＣＡＲは自然発症高血圧ラットの血圧を急激に低下させ、この試験物質は犬の血圧を急激に低下させた（図９、ＥおよびＦ）。上記のとおり、収縮期血圧（－５．８ｍｍＨｇ）および拡張期血圧（－３．８ｍｍＨｇ）の平均の絶対値の低下が、試験物質群の１日目と比較して２８日目に観察されたが、他方、プラセボ群では、それぞれ、＋１．２ｍｍＨｇおよび＋０．９ｍｍＨｇのわずかな上昇が観察された。プラセボ群ではなく試験物質群内でのウィルコクソン検定では、収縮期血圧（Ｐ＝０．０３０）および拡張期血圧（Ｐ＝０．００９）の両方で統計的に有意な絶対的低下があり、収縮期血圧（Ｐ＝０．０３６）および拡張期血圧（Ｐ＝０．０１４）の相対的低下（図１０Ｅ）があった。一元配置分散分析では、プラセボ群と比較して、試験物質群で収縮期血圧（Ｐ＝０．０４７）および拡張期血圧（Ｐ＝０．０４４）に統計的に有意な相対的低下が見られた。ベースラインと比較して、２８日目にどちらの群でも平均心拍数に有意な変化は観察されなかった：プラセボ、－０．４８；試験物質、－１．６ｂｐｍ。したがって、試験物質は、２型糖尿病患者の収縮期血圧と拡張期血圧を低下させる。したがって、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、微小血管灌流、および血圧に対する試験物質の効果は、動物から２型糖尿病患者に援用される。
微小循環は末梢血管抵抗を調節し、心拍出量と組み合わせて動脈血圧を決定する。ＡＩＣＡＲは自然発症高血圧ラットの血圧を急激に低下させ、この試験物質は犬の血圧を急激に低下させた（図９、ＥおよびＦ）。上記のとおり、収縮期血圧（－５．８ｍｍＨｇ）および拡張期血圧（－３．８ｍｍＨｇ）の平均の絶対値の低下が、試験物質群の１日目と比較して２８日目に観察されたが、他方、プラセボ群では、それぞれ、＋１．２ｍｍＨｇおよび＋０．９ｍｍＨｇのわずかな上昇が観察された。プラセボ群ではなく試験物質群内でのウィルコクソン検定では、収縮期血圧（Ｐ＝０．０３０）および拡張期血圧（Ｐ＝０．００９）の両方で統計的に有意な絶対的低下があり、収縮期血圧（Ｐ＝０．０３６）および拡張期血圧（Ｐ＝０．０１４）の相対的低下（図１０Ｅ）があった。一元配置分散分析では、プラセボ群と比較して、試験物質群で収縮期血圧（Ｐ＝０．０４７）および拡張期血圧（Ｐ＝０．０４４）に統計的に有意な相対的低下が見られた。ベースラインと比較して、２８日目にどちらの群でも平均心拍数に有意な変化は観察されなかった：プラセボ、－０．４８；試験物質、－１．６ｂｐｍ。したがって、試験物質は、２型糖尿病患者の収縮期血圧と拡張期血圧を低下させる。したがって、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、微小血管灌流、および血圧に対する試験物質の効果は、動物から２型糖尿病患者に援用される。
【0150】
まとめ
上記のとおり、メトホルミンで治療を受ける２型糖尿病患者を対象とした２８日間の概念実証第ＩＩａ相臨床試験では、試験物質は空腹時血糖値（ＦＰＧ）とインスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ－ＩＲ）を低下させ、また、それは十分に許容できるものであった。試験物質は、２型糖尿病患者の末梢微小血管灌流を改善し、血圧を低下させた。したがって、動物における主要な代謝および血管への効果は、２型糖尿病患者に援用された。
上記のとおり、メトホルミンで治療を受ける２型糖尿病患者を対象とした２８日間の概念実証第ＩＩａ相臨床試験では、試験物質は空腹時血糖値（ＦＰＧ）とインスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ－ＩＲ）を低下させ、また、それは十分に許容できるものであった。試験物質は、２型糖尿病患者の末梢微小血管灌流を改善し、血圧を低下させた。したがって、動物における主要な代謝および血管への効果は、２型糖尿病患者に援用された。
【0151】
参考文献
１．Ａｈｒｅｎ Ｂ， Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｃｈｅｕｒｉｎｋ ＡＪ， Ｍｕｌｄｅｒ Ｈ，Ｍｙｒｓｅｎ Ｕ， ａｎｄ Ｓｕｎｄｌｅｒ Ｆ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃａｒｂａｃｈｏｌ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１９９７； ４６（１）：９７－１０６．
２．Ｌｙ ＰＴ， Ｃａｉ Ｆ， ａｎｄ Ｓｏｎｇ Ｗ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ ＶｉｓＥｘｐ． ２０１１５３）．
３．Ｓｔｅｎｅｂｅｒｇ Ｐ， Ｒｕｂｉｎｓ Ｎ， Ｂａｒｔｏｏｖ－Ｓｈｉｆｍａｎ Ｒ， Ｗａｌｋｅｒ ＭＤ， ａｎｄ Ｅｄｌｕｎｄ Ｈ． Ｔｈｅ ＦＦＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲ４０ ｌｉｎｋｓ ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ， ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ， ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２００５； １（４）：２４５－５８．
４．Ｊａｃｏｂｉ Ｂ， Ｂｏｎｇａｒｔｚ Ｇ， Ｐａｒｔｏｖｉ Ｓ， Ｓｃｈｕｌｔｅ ＡＣ， Ａｓｃｈｗａｎｄｅｎ Ｍ， Ｌｕｍｓｄｅｎ ＡＢ， Ｄａｖｉｅｓ ＭＧ， Ｌｏｅｂｅ Ｍ， Ｎｏｏｎ ＧＰ， Ｋａｒｉｍｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ＢＯＬＤ ＭＲＩ： ｆｒｏｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｔｏ ｉｔｓ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１２； ３５（６）：１２５３－６５．
１．Ａｈｒｅｎ Ｂ， Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ Ｅ，Ｓｃｈｅｕｒｉｎｋ ＡＪ， Ｍｕｌｄｅｒ Ｈ，Ｍｙｒｓｅｎ Ｕ， ａｎｄ Ｓｕｎｄｌｅｒ Ｆ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃａｒｂａｃｈｏｌ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１９９７； ４６（１）：９７－１０６．
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４．Ｊａｃｏｂｉ Ｂ， Ｂｏｎｇａｒｔｚ Ｇ， Ｐａｒｔｏｖｉ Ｓ， Ｓｃｈｕｌｔｅ ＡＣ， Ａｓｃｈｗａｎｄｅｎ Ｍ， Ｌｕｍｓｄｅｎ ＡＢ， Ｄａｖｉｅｓ ＭＧ， Ｌｏｅｂｅ Ｍ， Ｎｏｏｎ ＧＰ， Ｋａｒｉｍｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ＢＯＬＤ ＭＲＩ： ｆｒｏｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｔｏ ｉｔｓ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１２； ３５（６）：１２５３－６５．
【0152】
実施例３－ＡＭＰＫ活性化因子＋ＳＧＬＴ２阻害剤
試験化合物
この研究で使用された試験物質は次のとおりである。
（Ａ）４－クロロ－Ｎ－［２－［（４－クロロフェニル）メチル］－３－オキソ－１，２，４－チアジアゾール－５－イル］ベンズアミド（本明細書では「化合物１」と呼ぶ）（Ａｎｔｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（バンガロール、インド）によって合成および精製された。）、および
（Ｂ）カナグリフロジン。
試験化合物
この研究で使用された試験物質は次のとおりである。
（Ａ）４－クロロ－Ｎ－［２－［（４－クロロフェニル）メチル］－３－オキソ－１，２，４－チアジアゾール－５－イル］ベンズアミド（本明細書では「化合物１」と呼ぶ）（Ａｎｔｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（バンガロール、インド）によって合成および精製された。）、および
（Ｂ）カナグリフロジン。
【0153】
動物と管理
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社（ドイツ）から購入した。すべての動物は、１２：１２時間の明暗サイクル（午前６時に点灯）および２１℃の一定温度で、ｔｈｅ Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設（Ｕｍｅａ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ＵＣＣＢ）に飼育された。動物には固有の識別番号が耳に付けられ、５匹のマウスのグループは、科学的手順で使用される動物の飼育および世話に関する実施基準の要件を遵守する透明なポリカーボネートケージで飼育された。敷料には木材チップを使用し、環境を充実させた。動物は、研究の開始前に、１５週間新しい環境に順応させた。動物は、収容および研究期間中、水道水への自由なアクセスを許された。順応期間中、動物は標準的なペレット飼料（ＣＲＭ（Ｅ）Ｒｏｄｅｎｔ、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ、Ｓｗｅｄｅｎ）を与えられた。研究の開始時に、標準的な食餌は非常に高脂肪の食餌（ｖＨＦＤ； Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．）に変えられ、およびこの食餌は研究期間全体を通して維持された。すべての手順は、ウメオ地域のｔｈｅ Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓによって承認された。
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社（ドイツ）から購入した。すべての動物は、１２：１２時間の明暗サイクル（午前６時に点灯）および２１℃の一定温度で、ｔｈｅ Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設（Ｕｍｅａ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ＵＣＣＢ）に飼育された。動物には固有の識別番号が耳に付けられ、５匹のマウスのグループは、科学的手順で使用される動物の飼育および世話に関する実施基準の要件を遵守する透明なポリカーボネートケージで飼育された。敷料には木材チップを使用し、環境を充実させた。動物は、研究の開始前に、１５週間新しい環境に順応させた。動物は、収容および研究期間中、水道水への自由なアクセスを許された。順応期間中、動物は標準的なペレット飼料（ＣＲＭ（Ｅ）Ｒｏｄｅｎｔ、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｃａｎｂｕｒ ＢＫ、Ｓｗｅｄｅｎ）を与えられた。研究の開始時に、標準的な食餌は非常に高脂肪の食餌（ｖＨＦＤ； Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．）に変えられ、およびこの食餌は研究期間全体を通して維持された。すべての手順は、ウメオ地域のｔｈｅ Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓによって承認された。
【0154】
生化学的分析のための試薬と材料
超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｎｏ．９００８０、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ．）、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）テストストリップ（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．）、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）２血糖値計（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ）、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＣＢ３００カリウム－ＥＤＴＡバイアル（カタログ番号１６．４４４、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）。
超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｎｏ．９００８０、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ．）、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）テストストリップ（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．）、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）２血糖値計（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ）、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＣＢ３００カリウム－ＥＤＴＡバイアル（カタログ番号１６．４４４、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）。
【0155】
実験のセットアップ：
２３週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＨＦＤを与えて、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を促進し、以下を１日１回強制経口投与した。ビヒクル（リン酸緩衝液ｐＨ７．３、２％ｗ／ｖメチルセルロース；ｎ＝１１）、カナグリフロジン１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１４）、７５ｍｇ／ｋｇの化合物１（ｎ＝１４）、ならびにカナグリフロジン１０ｍｇ／ｋｇおよびｄａ７５ｍｇ／ｋｇの化合物１の組み合わせ（ｎ＝１５）。治療の２週間後、空腹時（６時間）の血糖値と血漿インスリンレベル（尾静脈の血液サンプルで測定）を分析した。研究を通して、食物摂取量と体重をモニターした。
２３週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＨＦＤを与えて、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を促進し、以下を１日１回強制経口投与した。ビヒクル（リン酸緩衝液ｐＨ７．３、２％ｗ／ｖメチルセルロース；ｎ＝１１）、カナグリフロジン１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１４）、７５ｍｇ／ｋｇの化合物１（ｎ＝１４）、ならびにカナグリフロジン１０ｍｇ／ｋｇおよびｄａ７５ｍｇ／ｋｇの化合物１の組み合わせ（ｎ＝１５）。治療の２週間後、空腹時（６時間）の血糖値と血漿インスリンレベル（尾静脈の血液サンプルで測定）を分析した。研究を通して、食物摂取量と体重をモニターした。
【0156】
生化学的分析
尾静脈から血液サンプルをカリウム－ＥＤＴＡバイアルに収集し、血漿を遠心分離によって分離し、分析するまで－２０℃で保存した。血漿インスリンは、マウスインスリンＥＬＩＳＡ（超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット）で測定された。ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）２血糖値計（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ）を使用して、尾静脈血中のグルコース濃度を分析した。
尾静脈から血液サンプルをカリウム－ＥＤＴＡバイアルに収集し、血漿を遠心分離によって分離し、分析するまで－２０℃で保存した。血漿インスリンは、マウスインスリンＥＬＩＳＡ（超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット）で測定された。ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）２血糖値計（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ）を使用して、尾静脈血中のグルコース濃度を分析した。
【0157】
データ分析
図に示されている結果は、平均±群あたりの動物数の平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。対照群と３つの治療群の間の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析され、Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。
図に示されている結果は、平均±群あたりの動物数の平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。対照群と３つの治療群の間の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析され、Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。
【0158】
結果
結果を図１１に示す。化合物１とＳＧＬＴ２阻害剤の組み合わせにより、空腹時血糖、空腹時血漿インスリン、およびＨＯＭＡ－ＩＲの結果が統計的に有意に（＊＊＊）減少した。化合物１のみで、空腹時血漿インスリンおよびＨＯＭＡ－ＩＲ結果に統計的に有意な（＊＊＊）減少を示した。ＳＧＬＴ２阻害剤は、空腹時血糖、空腹時血漿インスリン、およびＨＯＭＡ－ＩＲの結果をより少ない程度で低下させた。
結果を図１１に示す。化合物１とＳＧＬＴ２阻害剤の組み合わせにより、空腹時血糖、空腹時血漿インスリン、およびＨＯＭＡ－ＩＲの結果が統計的に有意に（＊＊＊）減少した。化合物１のみで、空腹時血漿インスリンおよびＨＯＭＡ－ＩＲ結果に統計的に有意な（＊＊＊）減少を示した。ＳＧＬＴ２阻害剤は、空腹時血糖、空腹時血漿インスリン、およびＨＯＭＡ－ＩＲの結果をより少ない程度で低下させた。
【0159】
結論
ＳＧＬＴ２阻害剤は、腎機能障害のある２型糖尿病患者では抗血糖効果を示さないため、この群の患者では禁忌である。しかし、化合物１とカナグリフロジンの組み合わせは、食事誘発性肥満マウスの高血糖、高インスリン血症、インスリン抵抗性を強力かつ相乗的に低下させることがわかっており（図１１）、これら２つのクラスの化合物の組み合わせが、強力にグルコース恒常性を改善し、かつ２型糖尿病患者の糖尿病性腎疾患を予防する両方の可能性があることを示している。重度のインスリン抵抗性糖尿病（肥満（ＢＭＩ約３５）、インスリン抵抗性、高インスリン血症）を患う２型糖尿病患者のサブグループは、糖尿病性腎疾患を発症するリスクが５倍高く、現在有効な治療が不足している。これらの患者は、特に、式Ｉの化合物とＳＧＬＴ２阻害剤とのそのような併用療法から利益を得る可能性がある。
ＳＧＬＴ２阻害剤は、腎機能障害のある２型糖尿病患者では抗血糖効果を示さないため、この群の患者では禁忌である。しかし、化合物１とカナグリフロジンの組み合わせは、食事誘発性肥満マウスの高血糖、高インスリン血症、インスリン抵抗性を強力かつ相乗的に低下させることがわかっており（図１１）、これら２つのクラスの化合物の組み合わせが、強力にグルコース恒常性を改善し、かつ２型糖尿病患者の糖尿病性腎疾患を予防する両方の可能性があることを示している。重度のインスリン抵抗性糖尿病（肥満（ＢＭＩ約３５）、インスリン抵抗性、高インスリン血症）を患う２型糖尿病患者のサブグループは、糖尿病性腎疾患を発症するリスクが５倍高く、現在有効な治療が不足している。これらの患者は、特に、式Ｉの化合物とＳＧＬＴ２阻害剤とのそのような併用療法から利益を得る可能性がある。
【図1】
【図2A-2D】
【図2E-2I】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-6C】
【図6D-6H】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-10C】
【図10D】
【図10E】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-11-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖尿病を治療する方法に用いるための剤であって、式Ｉの化合物、【化1】
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを含み、前記方法は前記剤を必要とする対象に投与することを含み、前記対象が、重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定される、剤。
【請求項2】
前記方法が２型糖尿病を治療する方法である、請求項１に記載の剤。
【請求項3】
前記対象が肥満である、請求項１または請求項２に記載の剤。
【請求項4】
前記対象が少なくとも３０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する、請求項３に記載の剤。
【請求項5】
前記対象が少なくとも１．４ｎｍｏｌ／Ｌ、任意に少なくとも１．５ｎｍｏｌ／Ｌの血中Ｃペプチド濃度を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項6】
前記対象が糖尿病性腎疾患に対する感受性の高いリスクを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項7】
前記対象が糖尿病性腎疾患を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項8】
前記対象の体重が減少する、請求項１～７のいずれか一項に記載の剤。
【請求項9】
前記対象の腎血行動態が改善される、請求項１～８のいずれか一項に記載の剤。
【請求項10】
前記対象がヒトである、請求項１～９のいずれか一項に記載の剤。
【請求項11】
前記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが、経口、経鼻、非経口、または吸入によって投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の剤。
【請求項12】
前記式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが、約１～約２０００ｍｇの範囲の１日量で対象に投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の剤。
【請求項13】
（Ａ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグと、（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグとの組み合わせ。
【請求項14】
薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と混合されている、請求項１３に記載の組み合わせを含む医薬製剤。
【請求項15】
キットオブパーツであって、（Ａ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および薬学的に許容される補助剤、希釈剤もしくは担体を含む組成物と、
（Ｂ）ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および薬学的に許容される補助剤、希釈剤もしくは担体を含む組成物と、を含み、
構成要素（Ａ）および（Ｂ）は、互いに組み合わせて投与するのに適した形態でそれぞれ提供される、キットオブパーツ。
【請求項16】
医薬品に使用するための請求項１３に記載の組み合わせ、請求項１４に記載の医薬製剤、または請求項１５に記載のキットオブパーツ。
【請求項17】
前記方法において、ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグもまた前記対象に投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の剤。
【請求項18】
前記方法において、前記式Ｉの化合物および前記ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤が、前記対象に連続して、別々に、および／または同時に投与される、請求項１７に記載の剤。
【請求項19】
前記ナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤は、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボネート、レモグリフロジンエタボネート、エルツグリフロジンおよびソタグリフロジン、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグからなる群から選択される、請求項１３に記載の組み合わせ、請求項１４に記載の医薬製剤、請求項１５に記載のキットオブパーツ、請求項１６に記載の使用のための組み合わせもしくは医薬製剤、または請求項１７もしくは請求項１８に記載の剤。
【請求項20】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１３～１５および１９のいずれか一項に記載の組み合わせ、医薬製剤またはキットオブパーツの使用。
【請求項21】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１３もしくは請求項１９に記載のナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用であって、前記薬剤は、請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグによっても治療される対象に投与される、使用。
【請求項22】
重度のインスリン抵抗性糖尿病を有すると特定された対象における糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用であって、前記薬剤は、請求項１３もしくは請求項１９に記載のナトリウム－グルコース輸送タンパク質２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグによっても治療される対象に投与される、使用。
【国際調査報告】