特表 2022-517491 アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びこれを用いたアルロースの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-09

(54)【発明の名称】アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びこれを用いたアルロースの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/61 20060101AFI20220302BHJP

   C12N 9/90 20060101ALI20220302BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220302BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220302BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220302BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220302BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220302BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20220302BHJP

【ＦＩ】

C12N15/61 ZNA

C12N9/90

C12N15/10 200Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12P19/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021526648

(86)(22)【出願日】2020-09-25

(85)【翻訳文提出日】2021-05-14

(86)【国際出願番号】 KR2020013138

(87)【国際公開番号】W WO2021125514

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】10-2019-0170993

(32)【優先日】2019-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516298272

【氏名又は名称】テサン・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＳＡＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ヒョンソプ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ウンソク

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジハ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ソクス

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050EE10

4B050FF03E

4B050FF14E

4B050LL05

4B064AF02

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA10

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA20

4B065CA27

4B065CA41

(57)【要約】

本発明は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、２１６番目の位置に存在するアミノ酸残基であるグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換された新規なアルロースエピマー化酵素変異体及びこれの様々な用途を提供する。本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの変換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性に非常に優れているため、アルロースの大量生産のための産業化レベルの酵素変換反応時、汚染を防止することができ、生産時間を短縮させることができ、生産コストを節減させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体。

【請求項2】

請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチドは、配列番号１１の塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。

【請求項5】

請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の組換えベクターのいずれかによって形質転換された組換え菌株。

【請求項6】

請求項５に記載の組換え菌株を培養してアルロースエピマー化酵素変異体を発現させる段階、および
前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する段階、
を含むアルロースエピマー化酵素変異体の製造方法。

【請求項7】

請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体を含むアルロースの生産用組成物。

【請求項8】

請求項５に記載の組換え菌株、前記組換え菌株の培養物又は前記組換え菌株の破砕物を含むアルロースの生産用組成物。

【請求項9】

果糖を請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体又は前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法。

【請求項10】

果糖を請求項５に記載の組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物又はこれらのいずれか一つ以上を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アルロースエピマー化酵素変異体等に関するものであって、より詳しくは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロース変換率及び熱安定性が向上されたアルロースエピマー化酵素変異体、及びこれより派生する様々な発明に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番目の炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であって、Ｄ－プシコース（Ｄ－ｐｓｉｃｏｓｅ）とも呼ばれる。Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、砂糖と比較したとき、７０％の甘味度を有するが（Ｏｓｈｉｍａ ２００６）、エネルギーは０．３％しかないので、ダイエット食品の低カロリー甘味料に適用可能な機能性単糖類である（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．、２００２）。また、Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、ブドウ糖の吸収及び血糖を抑制する機能があり、糖尿病患者用飲食品、健康用飲食品などに応用することができ、肝臓における脂質合成に関与する酵素活性の阻害により腹部の脂肪蓄積を抑制することができるので、健康食品などの様々な機能性食品などに用いることができる（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。

【0003】

前記のような特徴により、アルロースは、砂糖に代替できる良いソースであるが、自然界にごく稀に存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、アルロースを効率的に生産する方法が必要である。既存のアルロースの生産方法としては、主に化学的過程を経て生産された。ビリック（Ｂｉｌｉｋ）らは、モリブデン酸イオンの触媒作用を利用して果糖からアルロースに変換する方法を提案した。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）は、１，２：４，５－ジ－δ－イソプロピリデン－ベータ－Ｄ－フラクトピラノース（１，２：４，５－ｄｉ－δ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）から３段階にわたる化学的処理過程でアルロースを生産した。また、ドナー（Ｄｏｎｅｒ）は、エタノールとトリメチルアミンと共に果糖を加熱してアルロースを生産した。しかし、これらの化学的製造方法は、コストがかかるのに対し、その効率は低く、かなりの量の副産物が発生する短所がある。

【0004】

アルロースを生産する生物学的方法としては、微生物の細胞反応を利用してガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、Ｄ－タガトース又はＤ－タリトールなどからアルロースを生産する方法が提案された（Ｋｅｎ Ｉｚｕｍｏｒｉ）。しかし、この方法は、基質が希少糖に属するため、産業的生産に応用するのが難しい。産業化に最も効率的な方法としては、Ｄ－ケトース３－エピマー化酵素群中で果糖をアルロースに変換する酵素を見出す方法である。既存に発表された内容は、クロストリジウム・セルロリチクムＨ（１０）（Ｍｕ ｅｔ ａｌ．、２０１１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２００６）、シュードモナス・チコリ（Ｉｔｏｈ ａｔ ａｌ．１９９４）、リゾビウム・スペロイデス（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００９）に由来するＤ－タガトース３－エピマー化酵素を大腸菌に挿入して形質転換させた後、形質転換された大腸菌で発現されたＤ－タガトース３－エピマー化酵素を用いて果糖からアルロースを生産した。

【0005】

酵素を用いて果糖からアルロースを生産する技術に関連して、大韓民国登録特許公報第１０－０７４４４７９号には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するアルロースエピマー化酵素によるアルロースの生産方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－０８３２３３９号には、果糖をアルロースに変換する活性を有するシノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ＹＢ－５８ ＫＣＴＣ １０９８３ＢＰと、これを用いて果糖をアルロースに変換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１１０６２５３号には、果糖のアルロースへの変換を触媒する活性を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８のアルロース３－エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む大腸菌及びこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３３９４４３号には、リゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物に由来するケトース３－エピメラーゼ（ｋｅｔｏｓｅ ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）及びこれを用いて果糖をアルロースに変換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３１８４２２号には、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｉｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１４７３９１８号には、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを用いて果糖からアルロースを生産する方法が開示されている。

【0006】

しかし、微生物に由来する野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、果糖のアルロースへの変換率が高くなく、特に最適活性温度条件で熱安定性が劣り、産業化に適していない。したがって、微生物に由来する野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの変換率又は熱安定性が向上された新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の開発が必要である。Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体に関連し、大韓民国公開特許公報第１０－２０１４－００２１９７４号には、遺伝子レベルで突然変異を誘導し、高い温度での速やかなアルロースへの変換速度と安定性を示すトレポネーマ・プリミティアＺＡＳ－１に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１２０３８５６号には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来する野生型アルロースエピマー化酵素の変異により収得した熱安定性が向上されたアルロースエピマー化酵素変異体が開示されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来の背景下で見出されたものであり、本発明の第一の目的は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性が向上された新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を提供することにある。

【0008】

本発明の第二の目的は、新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造する方法又は新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造するために必要なさまざまな要素を提供することにある。

【0009】

本発明の第三の目的は、果糖からアルロースを製造する方法又は果糖からアルロースを製造するために必要なさまざまな要素を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の出願人は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを用いて果糖からアルロースを製造する発明について特許出願をして登録を受けている［大韓民国登録特許第１０－１４７３９１８号（２０１４．１２．１１）］。前記フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素は、約６．５～７．０のｐＨの範囲及び約６２～６６℃の温度条件で果糖のアルロースへの変換に対する最大活性を示すが、最適温度条件で反応時間が経つにつれて酵素の活性が急激に低下するため、アルロースを大量生産する産業化の段階でその活用度に限界がある。また、一般的にアルロースを大量生産するための酵素変換反応は、汚染防止のため高温で行われるので、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉ ｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を産業化に適用するためには、熱安定性を大幅に向上させる必要がある。本発明の出願人は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の内在的な問題を認識し、タンパク質構造予測技術を使って、野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、所定位置のアミノ酸配列を置換させた場合、果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性が向上するという点を確認し、本発明を完成した。

【0011】

（空白）

【0012】

前記第一の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を提供する。

【0013】

前記第二の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド又は配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株を提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド又は配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターによって形質転換された組換え菌株を培養し、アルロースエピマー化酵素変異体を発現させる段階と、前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する段階と、を含むアルロースエピマー化酵素変異体の製造方法を提供する。

【0014】

前記第三の目的を解決するために、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド又は配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物又は前記組換え菌株の破砕物を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体又は前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド又は配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物又はこれらのうち、いずれか一つ以上を含む組成物と反応させる段階を含むアルロースの製造方法を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの変換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性に非常に優れているため、アルロースを大量生産するための産業化レベルの酵素変換反応時の汚染を防止することができ、生産時間を短縮させることができ、生産コストを節減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の発明者等がフラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を向上させるために、置換候補として選定した計５個のアミノ酸残基の位置を示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を具体的に説明する。

【0018】

（空白）

【0019】

本発明の一側面は、果糖をアルロースへ変換させることができる新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体（以下、「アルロースエピマー化酵素変異体」という。）に関するものである。前記アルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち、２１６番目の位置に存在するアミノ酸残基であるグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換されたものであり、野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比べて果糖のアルロースへの変換活性が高く、特に６０℃以上の高温条件で熱安定性に非常に優れている。前記アルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来する野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号７の塩基配列からなる）を鋳型にし、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対にしてＰＣＲを行い、その後に増幅された変異体断片の対を鋳型にし、制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲを行い、アルロースエピマー化酵素変異体のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを製造した後、前記組換え発現ベクターで宿主菌株を形質転換させ、組換え菌株を製造した後、前記組換え菌株を培養して発現させる方法で得ることができる。本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体は、配列番号５のアミノ酸配列からなるが、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、これに限定されない。例えば、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、果糖をアルロースに変換する活性及び６０℃以上の高温で熱安定性が維持される限り、配列番号５のアミノ酸のうちの一部が置換、挿入及び／又は欠失されたものであることができる。前記アミノ酸の置換は、好ましくは、タンパク質の特性が変わらない保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によってなることが好ましい。また、前記アミノ酸の変形は、グリコシル化、アセチル化、ホルホリル化等によりなることができる。また、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、アミノ酸配列上の変異又は数式によって熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加したり、果糖のアルロースへの変換に対する活性が増加したタンパク質を含むことができる。また、本発明によるアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、配列番号５のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであることができる。

【0020】

（空白）

【0021】

本発明の他の側面は、新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造する方法又は新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造するために必要なさまざまな要素に関するものである。前記新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造するために必要な様々な要素としては、ポリヌクレオチド、プライマー対、組換えベクター、組換え菌株などがある。

【0022】

前記ポリヌクレオチドは、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号１１の塩基配列からなる。本発明で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、非変形（ｎｏｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）又は変形された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）すべてのポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味する。前記ポリヌクレオチドは、単一鎖又は二本鎖ＤＮＡ、単一鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単一鎖及び二本鎖ＲＮＡ、単一鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ又はこれらのハイブリッド分子を含むが、これに限定されるものではない。また、前記アルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドの均等範囲は、配列番号１１の塩基配列に対して実質的同一性を有する配列を含む。前記の実質的な同一性は、配列番号１１の塩基配列と、任意の他の配列を最大限に対応できるように整列し、その配列を解析して、前記の任意の他の配列が配列番号１１の塩基配列と７０％以上、９０％以上、又は９８％以上の配列相同性を有することを意味する。当該分野における通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知された遺伝子組換え技術等を利用して、前記ポリヌクレオチドの塩基配列のいずれか又はそれ以上の塩基を置換、付加又は欠失させることにより、前記実質的相同性を有する範囲で同じ活性を有するアルロースエピマー化酵素変異体を暗号化するポリヌクレオチドを製造することができることを容易に理解することができる。このような相同性の比較は、市販のコンピュータプログラムを用いて、２つ以上の配列間の相同性の百分率（％）で計算し、実行することができる。

【0023】

また、前記プライマー対は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを合成するためのものであって、好ましくは、次のような塩基配列を有する順方向プライマーと逆方向プライマーからなる。

【0024】

＊順方向プライマーの塩基配列（５’→３’）

【0025】

ＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧ

【0026】

＊逆方向プライマーの塩基配列（５’→３’）

【0027】

ＣＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣ

【0028】

また、前記組換えベクターは、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。前記組換えベクターは、アルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを公知の標準的な方法を使ってクローニングベクターや発現ベクター内に挿入された形態で提供されることができる。本発明で使用される用語「クローニングベクター」は、宿主細胞内にＤＮＡ断片を運び、これを再生産することができる物質として定義される。本発明においてクローニングベクターは、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）をさらに含むことができる。このとき、前記マルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）は、少なくとも一つのエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）制限酵素切断サイト（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含む。また、クローニングベクターは、プロモーターをさらに含むことができる。一例として、本発明においてアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）及び転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置することができる。また、本発明にて使用される用語「発現ベクター」は、適切な宿主内でクローニングされたＤＮＡの転写と翻訳のために必要なＤＮＡ配列として定義される。また、本発明にて使用される用語「発現ベクター」は、個体の細胞内に存在する場合、挿入物が発現されるように、挿入物に作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。前記発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して製造し、精製することができる。前記発現ベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の各種宿主細胞から所望する遺伝子を発現し、所望するタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しながら、自然状態と類似した形態の外来タンパク質を大量に生産することができるベクターが好ましい。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望するタンパク質をコードする遺伝子及び終止コドンターミネーターが含まれていることが好ましい。そのほかにシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、追加発現調節配列、所望する遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、又は複製可能単位などを適宜含むこともできる。「プロモーター」は、転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。また、前記プロモーターには、細胞種特異的又は外部の信号又は製剤によって誘導される調節可能なプロモーター依存遺伝子を発現するようにするのに十分なプロモーター構成が含まれることができ、このような構成は、遺伝子の５’又は３’部分に位置することができる。前記プロモーターには、保存的プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含む。プロモーター配列は、原核生物、真核生物、又はウイルスに由来することができる。本発明にて使用される用語「作動可能に連結された」は、単一ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチド配列の関連性で一つの機能が他のものによって調節されることを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を制御することができる場合（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写調節下にある場合）プロモーターは、コーディング配列と連結されて動作するか、リボソーム結合部位が翻訳を促進させるように位置されていれば、リボソーム結合部位は、コーディング配列に連結されて動作されるものである。コーディング配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に連結されて動作することができる。本発明による組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。

【0029】

また、前記組換え菌株は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換されるか、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターによって形質転換されるものである。本発明にて使用される用語「組換え菌株」は、一つ以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はこれを有する発現ベクターが宿主細胞に導入され、形質転換された細胞を意味する。前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造するための方法としては、一時的な形質転換による感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介性トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン－媒介性トランスフェクション（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン－媒介性トランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを用いる方法、熱衝撃（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法などがあるが、これに限定されるものではない。本発明にて発現ベクターに形質転換することができる宿主細胞としては、原核細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞など、当業界に公知されたものであれば、その種類が大きく制限されず、好ましくは、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常使用される。例えば、前記宿主細胞は、大腸菌であることができる。前記大腸菌としてＢＬ２１、ＪＭ１０９、Ｋ－１２、ＬＥ３９２、ＲＲ１、ＤＨ５α又はＷ３１１０などであることができるが、これに限定されるものではない。このほかにも、前記の宿主細胞としてバチルスサブチルス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、コリネバクテリウムグルタミクムのようなコリネバクテリア属菌株、サルモネラテイフィムリウムなどのサルモネラ属菌株、その他のセラチア・マルセッセンスと様々なシュードモナス属のような腸内菌と菌株などからなる群から選択された菌株を使用してもよい。

【0030】

また、前記アルロースエピマー化酵素変異体の製造方法は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換されるか、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株を培養してアルロースエピマー化酵素変異体を発現させる段階と、前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からスピコースエピマー化酵素を分離する段階とを含む。宿主細胞によるタンパク質の発現は、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、誘導因子であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）等を使用して発現を誘導することができ、誘導時間は、タンパク質の量が最大化となるように調節することができる。本発明にてアルロースエピマー化酵素変異体は、遺伝子組換え菌株の破砕物から回収することができる。タンパク質発現に使用された細胞は、凍結－解凍の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、又は細胞分解剤など、さまざまな物質的又は化学的手段によって破壊されることができ、通常の生化学的分離技術によって分離したり、精製したりすることが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ。１８２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ 、１９９０）。例えば、宿主細胞によって発現されたタンパク質の分離又は精製方法としては、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着親和性クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）など、等電性フォーカス及びこれの様々な変化又は複合方法を含むが、これに限定されない。一方、本発明にて組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離する段階は、好ましくは、ペプチドタグを利用したアフィニティー・クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって実行されることができる。前記ペプチドタグとしては、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｃ－ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）などのように公知の様々なタグを利用することができ、このうち、Ｈｉｓタグであることが好ましい。Ｈｉｓ－タグタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリルトリ酢酸）樹脂のカラム上に特異的にトラップされ、ＥＤＴＡ又はイミダゾールにより溶出されることができる。

【0031】

（空白）

【0032】

本発明のもう一つの側面は、果糖からアルロースを製造する方法又は果糖からアルロースを製造するために必要なさまざまな要素に関するものである。前記果糖からアルロースを製造するために必要な様々な要素としては、アルロース生産用組成物がある。

【0033】

前記アルロース生産用組成物の一例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を含む。また、前記アルロース生産用組成物の他の例は、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドに形質転換されるか、配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、又は前記組換え菌株の破砕物を含む。この時、前記アルロース生産用組成物は、好ましくは、マンガンイオン、ニッケルイオン及びコバルトイオンからなる群から選択される１種以上をさらに含むことができ、より好ましくは、ニッケルイオン又はコバルトイオンをさらに含むことができる。本発明による新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、金属イオンにより活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）特性を示し、前記酵素による反応をニッケルイオン又はコバルトイオンのような特定の金属イオンの存在下で行うことにより、アルロースの生産収率を増加させることができる。

【0034】

また、前記果糖からアルロースを製造する方法の一例は、果糖を配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチド又は配列番号５のアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物又はこれらのいずれか一つ以上を含む組成物と反応させる段階を含む。また、前記果糖からアルロースを製造する方法は、金属イオンを添加する段階をさらに含むことができ、金属イオンの種類は、前述した通りである。一例として、前記金属イオンは、基質である果糖に添加されるか、酵素変異体と果糖の混合物に添加されることができる。また、他の例として、前記金属イオンは、酵素変異体が固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記酵素変異体が固定化された担体と果糖の混合物に添加されるか（果糖添加後）、若しくは果糖添加時に果糖と混合物の形態で添加されることができる。組み換え菌株を用いる場合、前記金属イオンが培養物に添加されるか、金属イオンが添加された培養培地で培養することもできる。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、前記アルロースエピマー化酵素変異体又は前記組換え菌株は、好ましくは、担体に固定化される。前記担体は、固定された酵素の活性が長期間維持することができる環境を造成することができるものであって、酵素固定化の用途で使用することができる公知のすべての担体から選択することができる。例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を用いることができる。アルギン酸ナトリウムは、海藻の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であり、マンヌロン酸（β－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）とグルロン酸（α－Ｌ－ｇｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が組成されており、含有量の面では、ランダムにベータ－１，４結合をなして形成されており、菌株又は酵素を安定的に固定することができ、アルロース収率の面で有利であることができる。一例として、アルロースの収率をより向上させるために１．５～４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、好ましくは約２．５％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を組換え菌株の固定化に使用することができる。また、前記果糖からアルロースを製造する方法で反応温度は６０～７０℃、好ましくは６０～６７℃、酵素変異体の安定性及び最大活性を考慮したとき、より好ましくは６２～６５℃の範囲であり、反応ｐＨは６．５～８、好ましくは６．５～７．５、より好ましくは６．５～７の範囲である。また、前記果糖からアルロースを製造する方法で果糖の濃度は、特に制限されないが、生産性ないし経済性を考慮したとき、全体の反応物を基準に１～７５％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、４～３５％（ｗ／ｗ）であることがより好ましい。また、前記果糖からアルロースを製造する方法で使用される酵素変異体の濃度は、全体の反応物基準で０．００１～０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０２～０．０５ｍｇ／ｍｌであることができる。また、遺伝子組換え菌株を用いて、果糖からアルロースを製造する場合、前記組換え菌株の宿主菌株は、食品学的に安全な菌株であることが好ましい。前記食品学的に安全な菌株は、一般的に安全と認められるＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）級菌株を意味し、例えば、サッカロマイセス属菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バシラス属菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）などから選択されることができる。前記菌株は、飼料、医薬品及び食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。これらの菌株は、遺伝子操作及び大量培養に容易であったり、様々な工程条件で高い安定性を有する菌株である。さらに、これらの菌株は、他の細菌に比べて相対的に堅い細胞膜構造を保有しているので、高い糖濃度などによる浸透圧の影響下でも菌体が安定した状態で存在する生物学的特性を示す。前記ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）級菌株の具体的な例としては、サッカロマイセスセレブシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、パチルスサブチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などがある。

【0035】

（空白）

【0036】

以下、本発明を実施例を通じてより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。

【0037】

（空白）

【実施例】

【0038】

実施例１：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変換率及び熱安定性向上のためのアミノ酸置換位置探索

【0039】

フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を向上させるために、タンパク質構造予測に基づいてアミノ酸置換位置を選定した。前記フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素（又はＤ－プシコース３－エピマー化酵素）は、本願発明の出願人が以前に出願して登録を受けた大韓民国登録特許第１０－１４７３９１８号（２０１４．１２．１１）に開示されている。前記フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、中性以下のｐＨ条件で果糖のアルロースへの変換について最大活性を有し、短い時間高収率で果糖からアルロースの大量生産が可能であるが、汚染防止などのために高温条件で酵素反応を進行させる場合、活性が急激に減少する問題がある。本発明の発明者らは、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を向上させるために、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列に基づいてホモロジーモデリング手法を用いてタンパク質構造を予測し、アミノ酸置換の位置を探索した。前記ホモロジーモデリングは、Ｒｏｂｅｔｔａサーバーを利用して行われ、タンパク質構造予測及び解析は、Ｃｏｏｔ、ＰｙＭｏｌ、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアプログラムを用いて行われた。Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の３次元構造モデルの解析を通じて化学結合変化時の変換率及び熱安定性の向上と関連すると予想される計５個のアミノ酸残基の位置及び前記位置に置換されるアミノ酸残基を選定した。図１は、本発明の発明者らがフラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を向上させるために、置換候補として選定した計５個のアミノ酸残基の位置を示すものである。図１における「Ｉ２１」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２１番目の位置に存在するイソロイシン（Ｉｌｅ）を示し、「Ａ８２」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、８２番目の位置に存在するアラニン（Ａｌａ）を示し、「Ｌ１３３」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、１３３番目の位置に存在するロイシン（Ｌｅｕ）を示し、「Ｇ２１６」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）を示し、「Ａ２７６」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２７６番目の位置に存在するアラニン（Ａｌａ）を示す。また、後述するように、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２１番目の位置に存在するイソロイシン（Ｉｌｅ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換し、配列番号２のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｉ２１Ｃを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち、８２番目の位置に存在するアラニン（Ａｌａ）をアルギニン（Ａｒｇ）に置換し、配列番号３のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ａ８２Ｒを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち、１３３番目の位置に存在するロイシン（Ｌｅｕ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換し、配列番号４のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｌ１３３Ｄを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換して、配列番号５のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｇ２１６Ｓを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち、２７６番目の位置に存在するアラニン（Ａｌａ）をアルギン酸（Ａｒｇ）に置換して、配列番号６のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ａ２７６Ｒを作製した。

【0040】

（空白）

【0041】

実施例２：フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の過発現のための組換えベクター及び組換え菌株の作製

【0042】

フラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素の野生型ポリヌクレオチドを基盤とするｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ方法を用いて、酵素変異体５種（Ｉ２１Ｃ、Ａ８２Ｒ、Ｌ１３３Ｄ、Ｇ２１６Ｓ、Ａ２７６Ｒ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。

【0043】

まず、フラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素変異体をコードする遺伝子を作製するために、下記表１に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１００μＭのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が添加された反応液に、表１のプライマーであるオリゴヌクレオチド１ｐＭ、テンプレート（鋳型）として利用されるフラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素の野生型ポリヌクレオチド（配列番号７）１００ｎｇを混合し、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、ＪＡＰＡＮ）を用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｂｉｎｏｎｅｅｒ）１ユニットの存在下に２５～３０周期でＰＣＲ反応を行った。

【0044】

【表1】

【0045】

プライマーの組み合わせを通じて変異体断片を増幅させた後、それぞれの対を鋳型にし、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲを通じて最終的に酵素変異体５種（Ｉ２１Ｃ、Ａ８２Ｒ、Ｌ１３３Ｄ、Ｇ２１６Ｓ、Ａ２７６Ｒ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。下記表２に制限酵素認識部位の配列を導入するために用いられたプライマーの塩基配列を示した。

【0046】

【表2】

【0047】

配列番号８の塩基配列は、酵素変異体Ｉ２１Ｃのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号９の塩基配列は、酵素変異体Ａ８２Ｒのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１０の塩基配列は酵素変異体Ｌ１３３Ｄのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１１の塩基配列は、酵素変異体Ｇ２１６Ｓのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１２の塩基配列は、酵素変異体Ａ２７６Ｒのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示す。配列番号８～１２の塩基配列は、酵素変異体のアミノ酸配列に直接対応する塩基配列で構成されており、便宜上、制限酵素認識部位の配列は省略した。

【0048】

それから、作製されたポリヌクレオチド断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて、発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同じ制限酵素部位に挿入して組換え発現ベクターの５種を作製した。また、熱衝撃（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ参照）を用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組換え発現ベクターを導入させて形質転換し、組換え大腸菌５種を作製した。作製した組換え大腸菌に６０％グリセリン溶液を添加し、酵素発現のための培養を行う前に－７０℃で凍結保存した。

【0049】

（空白）

【0050】

実施例３：フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の発現及び精製

【0051】

下記表３の組成（培地１Ｌ基準）を有するタンパク質発現用培地１５０ｍｌが収容された１Ｌ容量のフラスコに実施例２で作製した組換え大腸菌１ｍｌを接種し、振とう培養機で３２℃の温度条件及び１４０ｒｐｍの振とう条件を維持しながら、２４ｈｒの間培養した。培地に含まれた１％ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）でアルロースエピマー化酵素変異体の過発現を誘導した。

【0052】

【表3】

【0053】

その後、過発現されたアルロースエピマー化酵素変異体を、以下のような方法で分離した。まず、組換え大腸菌の培養液を４１００×ｇ及び４℃の条件で約１５分間遠心分離して上澄み液を除去し、組換え大腸菌の菌体を回収した。それから、回収された組換え大腸菌の菌体をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ第一リン酸カリウム、３００ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭイミダゾール含有）に懸濁させた後、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で処理して細胞を破砕した。次いで、細胞破砕液を１５，８１４×ｇ及び４℃の条件で約１０分間遠心分離して細胞ペレットを除去し、上澄み液のみを回収した。その後、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）アフィニティークロマトグラフィカラム及び脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）カラムを用いて回収した上澄み液からアルロースエピマー化酵素変異体を含有した精製酵素液を分離した。

【0054】

（空白）

【0055】

実施例４：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を確認

【0056】

フラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素の野生型及び変異体の果糖のアルロースへの変換率及び熱安定性を確認するために、酵素を高温に一定時間の間露出させた後、果糖のアルロースへの変換活性が減少する程度を分析した。具体的には、実施例３で収得した精製酵素液（酵素濃度１ｍｇ／ｍｌ）を６２℃の恒温水槽で０ｈｒ、１ｈｒ及び２ｈｒの間保管して熱処理した。その後、４％（ｗ／ｗ）果糖及び１ｍＭ硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ_４）の金属イオンが含まれた５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に熱処理された精製酵素液を酵素濃度が２５ｕｇ／ｍｌになるように添加し、振とう恒温水槽（ＶＳ－１２０５ＳＷ１、ビジョン科学）を用いて、７０℃の温度条件及び１２０ｒｐｍの振とう条件で２５分間反応させた。それから、反応生成液の温度を４℃に下げて反応を停止させ、１６，６００×ｇ及び４℃の条件で遠心分離して上澄み液を回収した。その後、糖分析カラム（Ｂｅｎｓｏｎ、アメリカ）が取り付けられた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ＳＰ９３０Ｄ ｐｕｍｐ、ヨングリン機器製；ＭＩＤＡＳオートサンプラ、Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ社製）及び屈折率検出器（２４１４ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、上澄み液内のアルロース濃度及び果糖濃度を測定し、測定された結果から果糖のアルロースへの変換率を計算した後、変換率を酵素活性の指標として使用した。

【0057】

以下の表４にフラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素の野生型及び変異体を熱処理したときの熱処理条件別、果糖のアルロースへの変換率を示した。

【0058】

【表4】

【0059】

前記表４に示すようにフラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素変異体のうち、Ｉ２１Ｃ、Ａ８２Ｒ、Ｌ１３３Ｄは、フラボニフラクター・プラウティに由来するアルロースエピマー化酵素の野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較したとき、熱処理の可否にかかわらず、果糖のアルロースへの変換活性がより低かった。また、アルロースエピマー化酵素変異体Ａ２７６Ｒは、アルロースエピマー化酵素の野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較したとき、熱処理をしていない場合には、果糖のアルロースへの変換活性が少し高かったが、熱処理によって果糖のアルロースへの変換活性が著しく減少した。その反面、アルロースエピマー化酵素変異体Ｇ２１６Ｓは、アルロースエピマー化酵素の野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と比較したとき、熱処理と関係なしに果糖のアルロースへの変換活性がより高く、特に顕著に向上された熱安定性を示した。

【0060】

（空白）

【0061】

以上のように、本発明を前記の実施例を通じて説明したが、本発明が必ずしもこれのみに限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で種々の変形実施が可能であることはもちろんである。したがって、本発明の保護範囲は、本発明に添付された特許請求の範囲に属するすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。

【図1】

【配列表】

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【国際調査報告】