▶ アブラハム ジェイ アンド フィリス カッツ コード ブラッド ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-09
(54)【発明の名称】神経学的疾患のための二重幹細胞治療
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20220302BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220302BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220302BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20220302BHJP
A61K 33/00 20060101ALI20220302BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20220302BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20220302BHJP
A61P 25/16 20060101ALN20220302BHJP
A61K 47/04 20060101ALN20220302BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61P43/00 121
A61P25/00
A61K35/15 A
A61K33/00
C12N5/0775 ZNA
C12N5/0789
A61P25/16
A61K47/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021537075
(86)(22)【出願日】2020-01-17
(85)【翻訳文提出日】2021-06-24
(86)【国際出願番号】 US2020014041
(87)【国際公開番号】W WO2020150580
(87)【国際公開日】2020-07-23
(31)【優先権主張番号】62/794,041
(32)【優先日】2019-01-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521174912
【氏名又は名称】アブラハム ジェイ アンド フィリス カッツ コード ブラッド ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ラフリン，メアリー
(72)【発明者】
【氏名】ズウィック，ダニエル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA25
4B065BD39
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC01
4C076DD21
4C086AA01
4C086HA08
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA13
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB34
4C087BB59
4C087BB64
4C087CA04
4C087DA14
4C087MA02
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZA01
4C087ZA02
4C087ZC75
(57)【要約】
造血幹細胞および間葉系間質細胞を対象に投与することを含む、パーキンソン病等のニューロン損傷を治療するための組成物および方法が提供される。臍帯血を含む血液からそのような組成物を生成するための方法もまた提供される。
【選択図】図３Ａ
【選択図】図３Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療有効量の実質的に精製されたＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の第１の組成物および実質的に精製された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の第２の組成物を対象に投与することを含む、必要とする前記対象における損傷したニューロンを治療するための方法。
【請求項2】
前記第１および第２の組成物が、投与前に組み合わされる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＨＳＣおよびＭＳＣが、前記対象に対して自己である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＨＳＣおよびＭＳＣが、前記対象に対して同種異系である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記同種異系ＨＳＣおよびＭＳＣが、ヒト臍帯血由来である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記実質的に精製された組成物が、血液中に天然に見られる他の成分を少なくとも８０％含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ＨＳＣおよびＭＳＣが、前記対象の脳内への定位誘導を介した実質内注射によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ニューロン損傷が、パーキンソン病に起因する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記投与後に前記対象の前記脳を電気的に刺激することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
実質的に精製された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と組み合わせて実質的に精製されたＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、治療上有効な用量の薬学的組成物。
【請求項11】
神経学的疾患を治療するための組成物を生成するための方法であって、血液を提供することと、
ＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の実質的に純粋な組成物を前記血液から単離することと、
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の実質的に純粋な組成物を前記血液から単離することと、
前記実質的に純粋なＣＤ１３３＋ＨＳＣの組成物と、前記実質的に純粋なＭＳＣの組成物とを組み合わせて、神経学的疾患を治療するための組成物を生成することと、を含む、方法。
【請求項12】
前記血液が、ヒト臍帯血である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記ＭＳＣが、単離の前に前記血液中の単核細胞（ＭＮＣ）からさらに培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記実質的に精製された組成物が、前記血液中の他の成分を少なくとも８０％含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
有効量の請求項１０～１４のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、必要とする前記対象における神経学的疾患を治療するための方法。
【請求項16】
前記投与が、前記対象の脳内への定位誘導を介した実質内注射による、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ニューロン損傷が、パーキンソン病に起因する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記投与後に前記対象の前記脳を電気的に刺激することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
投与前に前記組成物中のＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、トンネルナノチューブ形成を促進することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
投与前にＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、有効量の活性酸素種を前記組成物と組み合わせることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項21】
投与前にＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、前記組成物中のＣＤ７３またはＡ２Ａシグナル伝達を活性化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
１型ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ－１ｂ、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、ＴＧＦ－β、ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｅ２Ｆ－１、ＣＲＥＢ、Ｓｐ１、ＨＩＦ１－ａ、Ｓｔａｔ３、または低酸素が、ＣＤ７３シグナル伝達を活性化するために使用される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された米国仮出願第６２／７９４，０４１号の優先権利益を主張するものである。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された米国仮出願第６２／７９４，０４１号の優先権利益を主張するものである。
【0002】
本開示は、概して、パーキンソン病および他の神経学的疾患を治療するための細胞組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
パーキンソン病（ＰＤ）は、１００万人近いアメリカ人に影響を及ぼしている消耗性の神経変性疾患である。１，２ＰＤは、ドーパミンを産生する黒質（ＳＮ）におけるニューロンの段階的変性を伴い、最終的には消耗性の運動障害およびうつ病をもたらす。現在のところ、カルビドパ／レボドパ（Ｓｉｎｅｍｅｔ）の標準的な薬物治療レジメンにより、内因性ドーパミン放出を増強し、ＰＤの症状を緩和することができるが、レボドパで長期的に治療される患者は、ある時点で、通常、薬物治療を開始してから３～５年後に、ジスキネジアを経験する可能性がある。最も重要なことは、レボドパはドーパミン作動性ニューロンの再生を誘導せず、既存の治療法は、長期的に疾患の進行を制御するまたは逆行させる際の有効性が限定されることである。３
【0004】
ＰＤに対する革新的な治療アプローチを開発する必要性がある。幹細胞は、疾患の病因を制御し、潜在的に逆転させる有望な手段を提供する。ＰＤ治療における幹細胞の可能性は、同種異系胎児組織移植を用いたヒト介入概念証明研究が症状およびＰＤ病理を逆転させるという初期の証拠が示された後、３０年超にわたって認識されている。これらのＰＤ患者の死後分析により、同種異系胎児ドーパミン作動性組織移植片が解剖学的に組み込まれ、宿主の線条体投射ニューロンと正常なシナプス接触を形成することができると考えられることが示唆された。４しかし、幹細胞治療の治療効果の根底には、直接的機構および間接的機構の両方が存在すると考えられる。５前臨床研究におけるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ドーパミン作動性ニューロンに分化してそれに置き換わる可能性を示しているが、ｈＥＳＣは倫理的な問題を伴い、幹細胞の両方の供給源が奇形腫形成のリスクを伴う。
【0005】
対照的に、臍帯血（ＵＣＢ）は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣよりも安全であり、より容易に取得される原始幹細胞の豊富な供給源である。癌遺伝子を用いた侵襲的処置もしくは遺伝子操作が必要ではないか、またはＵＣＢ幹細胞に関連する倫理的な問題がなく、Ｗｅｂベースの検索エンジンを介して移植医チームにリンクされた６６万個を超える臨床グレードのＵＣＢ幹細胞移植片の現在の世界的な在庫によって、幹細胞移植を必要とする個々の患者のための最適なＨＬＡマッチおよび細胞用量が保証されている。６ＵＣＢは、バチカンを含む全ての宗教団体によって承認されている。７さらに、ＵＣＢ幹細胞治療によって治療された約４万人のヒトの（３０年を超える）長期的な観察により、患者にはドナー由来の奇形腫形成の証拠がないことが明らかになっている。
【0006】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、動物モデルおよび臨床試験において神経再生能を示している。８，９残念ながら、これまでのところ、ＭＳＣによるＰＤ臨床症状の制御または逆転は実証されていない。１０前臨床インビトロモデルおよびマウスＰＤ前臨床モデルにおける明らかな神経保護能力を考慮すると、ヒトＰＤ臨床試験におけるＭＳＣの相対的な失敗は予想外であった。ＰＤは、しばしば同時に微小血管形成の低下を伴って特に高齢者／個人に影響を与えるため、ＭＳＣ治療単独の１つの限界は、この幹細胞集団が造血幹細胞（ＨＳＣ）と比較して限定的な血管原性効果を有することである。ＰＤの病態生理学は、微小血管変性に一部起因することがますます認識されている。ＵＣＢ由来のＣＤ１３３＋ＨＳＣは、インビトロおよびインビボでロバストな血管形成を引き起こすことが以前に観察されている。１１－１９さらに、ＵＣＢ ＣＤ１３３＋ＨＳＣは、げっ歯類ＰＤモデルにおいて、ＭＳＣと比較した場合に同等の血管原性電位を含む神経保護能力を発揮することが示されている。２０，２１限られた状況において、ＭＳＣ／ＨＳＣは造血幹細胞移植において共移植されていた。２５
【0007】
ある特定の神経学的治療手順では、脳深部刺激（ＤＢＳ）が、細胞または組織移植とＤＢＳとを組み合わせて用いられてきた。２２ＤＢＳ手術を受ける患者は、同じ手術手技中に、頭蓋内に定位的に投与される幹細胞移植片を同時に受けることができる。２３，２４しかしながら、特に、ＤＢＳ単独では一般的に効果が非常に低い高齢者において、ＰＤは血管系の疾患としてますます認識されている。２６－２８
【0008】
したがって、ＰＤおよび他の神経学的疾患のための新しい治療組成物、それらの製造方法、およびそれらを用いた治療方法が必要である。
【発明の概要】
【0009】
実施形態において、本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）および造血幹細胞（ＨＳＣ）を発現する原始ＣＤ１３３を含むＰＤ治療に有用性を有するＵＣＢにおいて再生幹細胞の２つの別個の集団の補完的かつ付加的な神経再生能を特定することに基づいて、パーキンソン病等の神経学的疾患に対する新規の幹細胞治療アプローチを提供する。
【0010】
実施形態において、本発明は、治療有効量の実質的に精製されたＣＤ１３３＋ＨＳＣの第１の組成物および実質的に精製されたＭＳＣの第２の組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象における損傷したニューロンを治療するための方法を提供する。実施形態において、第１および第２の組成物は、投与前に組み合わされる。
【0011】
実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、自己または同種異系であり得る血液から実質的に精製される。実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、ヒト臍帯血、血液、または骨髄から得られる。実施形態において、実質的に精製された組成物は、血液中に天然に見られる成分の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上から単離される。
【0012】
実施形態において、投与は、対象の脳内への定位誘導を介した実質内注射である。実施形態において、ニューロン損傷はパーキンソン病に起因する。
【0013】
実施形態において、方法は、例えば、脳深部刺激（ＤＢＳ）を介して、ＭＳＣ／ＨＳＣ投与後に対象の脳を電気的に刺激することをさらに含む。
【0014】
本発明は、実質的に精製された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と組み合わせて実質的に精製されたＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、治療上有効な用量の薬学的組成物をさらに提供する。
【0015】
本発明は、神経学的疾患を治療するための組成物を生成するための方法であって、血液を提供することと、ＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の実質的に純粋な組成物を血液から単離することと、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の実質的に純粋な組成物を血液から単離することと、実質的に純粋なＣＤ１３３＋ＨＳＣの組成物と、実質的に純粋なＭＳＣの組成物とを組み合わせて、神経学的疾患を治療するための組成物を生成することと、を含む方法をさらに提供する。
【0016】
実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、自己または同種異系であり得る血液から実質的に精製される。実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、ヒト臍帯血、血液、または骨髄から得られる。実施形態において、実質的に精製された組成物は、血液中に天然に見られる成分の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上から単離される。実施形態において、ＭＳＣは、単離の前に、血液中の単核細胞（ＭＮＣ）からさらに培養される。
【0017】
実施形態において、方法は、投与前に組成物中のＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、トンネルナノチューブ形成を促進することを提供する。
【0018】
実施形態において、方法は、投与前にＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、有効量の活性酸素種を組成物と組み合わせることを提供する。
【0019】
実施形態において、方法は、投与前にＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、組成物中のＣＤ７３またはＡ２Ａシグナル伝達を活性化することを提供する。１型ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ－１ｂ、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、ＴＧＦ－β、ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｅ２Ｆ－１、ＣＲＥＢ、Ｓｐ１、ＨＩＦ１－ａ、Ｓｔａｔ３、または低酸素が、ＣＤ７３シグナル伝達を活性化するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A】ＨＳＣが、損傷したドーパミン作動性ニューロンのＭＳＣによって媒介される再生を増強することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、固定し、Ｔｕｊ１および早期損傷マーカーである切断カスパーゼ３について染色し、ＡｐｏＴｏｍｅ．２を装備したＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｚ１で可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図1B】ＨＳＣが、損傷したドーパミン作動性ニューロンのＭＳＣによって媒介される再生を増強することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、固定し、Ｔｕｊ１および早期損傷マーカーである切断カスパーゼ３について染色し、ＡｐｏＴｏｍｅ．２を装備したＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｚ１で可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図2A】二重幹細胞が、分泌された可溶性因子を介してニューロンを保護することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、通常の分化培地またはＭＳＣ馴化培地で４８時間培養し、図１に示すように染色および可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図2B】二重幹細胞が、分泌された可溶性因子を介してニューロンを保護することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、通常の分化培地またはＭＳＣ馴化培地で４８時間培養し、図１に示すように染色および可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図3A】ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣが損傷したドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリアを供与することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで前標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、ニューロンへのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの移動を蛍光顕微鏡により監視した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図3B】ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣが損傷したドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリアを供与することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで前標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、ニューロンへのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの移動を蛍光顕微鏡により監視した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図3C】ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣが損傷したドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリアを供与することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで前標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、ニューロンへのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの移動を蛍光顕微鏡により監視した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【図4A】ＵＢＣ ＣＤ１３３＋ＨＳＣが、ニューロン再生における重要なプロセスである神経突起伸長を増強することを示す。
【図4B】ＵＢＣ ＣＤ１３３＋ＨＳＣが、ニューロン再生における重要なプロセスである神経突起伸長を増強することを示す。
【図4C】ＵＢＣ ＣＤ１３３＋ＨＳＣが、ニューロン再生における重要なプロセスである神経突起伸長を増強することを示す。
【図5】二重幹細胞が神経突起伸長調節物質Ｔｕｊ１の発現を増強することを示す。
【図6】パラクリン機構自体が再生に寄与し得る程度を示す。
【図7】ＨＳＣはまた、損傷したドーパミン作動性ニューロンにＴＮＴを介してミトコンドリアを移動させることを示す。
【図8】ＲＯＳをブロックすることにより６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷が低減することを示す。
【図9A】ＣＤ７３が損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生を媒介することを示す。
【図9B】ＣＤ７３が損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生を媒介することを示す。
【図10A】ＴＮＴ形成および二重ＭＳＣ＋ＨＳＣからのミトコンドリア移動が、損傷したドーパミン作動性ニューロンからのシグナルによって能動的に誘導されることを示す。
【図10B】ＴＮＴ形成および二重ＭＳＣ＋ＨＳＣからのミトコンドリア移動が、損傷したドーパミン作動性ニューロンからのシグナルによって能動的に誘導されることを示す。
【図11】ＲＯＳをブロックすることにより６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷が低減することを示す。
【図12】ＣＤ７３がＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動を媒介することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明は、単一のＵＣＢ臨床グレード移植片（したがって、ＨＬＡおよびＫＩＲが同一である）に由来するＭＳＣおよびＨＳＣ（ＭＳＣ／ＨＳＣ）を含む二重幹細胞治療に関する本発明の実施形態の基礎を成す再生療法における細胞間相互作用の複雑さを認識し、ドーパミン作動性ニューロンおよび支持細胞の再生を介してＰＤの病態生理学を制御するまたは逆転させるための補完的な再生効果を有する。
【0022】
本発明の第２の態様は、脳深部刺激（ＤＢＳ）のために電極の留置を経験している薬物療法に失敗した対象において、定位誘導下でＵＣＢ二重幹細胞移植片を注射することを含む、ＰＤの二重幹細胞治療の実施形態を提供する。ＤＢＳは、薬物で症状を十分に制御することができないＰＤ患者に有効であることが示されている。本発明は、養子投与されたＵＣＢ二重幹細胞の神経再生機能を改善するための刺激を提供するために、電極および二重ＵＣＢ ＭＳＣ／ＨＳＣ幹細胞移植片注射後に経時的に投与される低用量の電流を提供する。
【0023】
本発明の第３の態様は、神経新生を増強するＵＣＢ由来のＭＳＣ／ＨＳＣの補完的機構を用いたＰＤ治療に対する幹細胞治療アプローチの実施形態を提供する。本発明は、インビトロで、損傷したドーパミン作動性ニューロンへのミトコンドリアの移動を実証する。
【0024】
実施形態において、本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）および造血幹細胞（ＨＳＣ）を発現する原始ＣＤ１３３を含むＰＤ治療に可能性を有するＵＣＢにおいて再生幹細胞の２つの別個の集団の補完的かつ付加的な神経再生能を特定することに基づいて、パーキンソン病等の神経学的疾患に対する新規の幹細胞治療アプローチを提供する。
【0025】
実施形態において、本発明は、治療有効量の実質的に精製されたＣＤ１３３＋ＨＳＣの第１の組成物および実質的に精製されたＭＳＣの第２の組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象における損傷したニューロンを治療するための方法を提供する。実施形態において、第１および第２の組成物は、投与前に組み合わされる。
【0026】
実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、自己または同種異系であり得る血液から実質的に精製される。実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、ヒト臍帯血、血液、または骨髄から得られる。実施形態において、実質的に精製された組成物は、血液中に天然に見られる成分の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上から単離される。
【0027】
実施形態において、投与は、対象の脳内への定位誘導を介した実質内注射である。実施形態において、ニューロン損傷はパーキンソン病に起因する。
【0028】
実施形態において、方法は、例えば、脳深部刺激（ＤＢＳ）を介して、投与後に対象の脳を電気的に刺激することをさらに含む。
【0029】
本発明は、実質的に精製された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と組み合わせて実質的に精製されたＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、治療上有効な用量の薬学的組成物をさらに提供する。
【0030】
本発明は、神経学的疾患を治療するための組成物を生成するための方法であって、血液を提供することと、ＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の実質的に純粋な組成物を血液から単離することと、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の実質的に純粋な組成物を血液から単離することと、実質的に純粋なＣＤ１３３＋ＨＳＣの組成物と、実質的に純粋なＭＳＣの組成物とを組み合わせて、神経学的疾患を治療するための組成物を生成することと、を含む方法をさらに提供する。ＰＤの治療のために等、細胞間のミトコンドリア移動を促進するための方法および組成物も提供される。
【0031】
実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、自己または同種異系であり得る血液から実質的に精製される。実施形態において、ＨＳＣおよびＭＳＣは、ヒト臍帯血、血液、または骨髄から得られる。実施形態において、実質的に精製された組成物は、血液中に天然に見られる成分の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上から単離される。実施形態において、ＭＳＣは、単離の前に、血液中の単核細胞（ＭＮＣ）からさらに培養される。
【0032】
ある特定の実施形態において、方法および製造ステップは、ＣＤ１３３ ＨＳＣ選択後にロバストなＵＣＢ ＭＳＣの伸長を確実なものにし、それによってヒトＰＤ治療に好適な細胞用量で単一のＵＣＢ臨床グレード移植片からの二重幹細胞治療用細胞集団を可能にする単純な新規技術を含む。
【0033】
本発明は、投与前に組成物中のＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進するために、トンネルナノチューブ形成を促進することを更に提供する。本発明は、有効量の活性酸素種を組成物と組み合わせることにより、投与前にＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進することを提供する。
【0034】
本発明は、組成物中のＣＤ７３またはＡ２Ａシグナル伝達経路を促進することにより、ＨＳＣおよびＭＳＣから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を促進することをさらに提供する。１型ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ－１ｂ、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、ＴＧＦ－β、ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｅ２Ｆ－１、ＣＲＥＢ、Ｓｐ１、ＨＩＦ１－ａ、Ｓｔａｔ３、または低酸素が、ＣＤ７３シグナル伝達を促進するために使用され得る。
【0035】
本発明の要素またはその好ましい実施形態（複数可）を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は、１つまたは複数の要素が存在することを意味することが意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【0036】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」ことを含むことを理解されたい。
【0037】
本開示全体を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲だけではなく、その範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の具体的に開示される部分範囲だけではなく、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
【0038】
本明細書で使用される場合、「約」は当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。当業者に明確でない用語の使用がある場合、それが使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【0039】
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、ヒト患者が好ましい、治療される動物対象を意味する。
【0040】
本明細書で使用される場合、「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」または「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」は、細胞または細胞集団が数を増加させる能力を指す。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ＭＳＣ」という用語は、単核細胞に由来し得る間葉系間質細胞を包含する。ＭＳＣを得るための技術は当該技術分野において周知であり、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／６８４，８５４号にさらに記載される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」という用語は、ＣＤ１３３＋表現型を発現する造血幹細胞を包含する。
【0043】
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」または「実質的に純粋な」は、第１の物質が天然に見られるもの等の、第２の物質の集団の近傍から除去された第１の物質の集団の特徴を指し、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くものではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くものではない。しかしながら、第２の物質の集団から「実質的に精製された」第１の物質の集団は、第１および第２の物質の非分離混合物と比較して測定できるほどに低い含有量の第２の物質を有する。一態様では、第２の物質の少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれよりも多くが、第１の物質から除去される。
【0044】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な」は、ニューロン損傷に関連する症状を治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分な細胞の量を指す。方法に関して使用される場合、該方法は、異常応答に関連する症状を治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分に有効である。例えば、疾患に関して有効な量は、疾患の発症を阻止もしくは予防するのに十分な量であるか、あるいは疾患病態が開始された場合、疾患を緩和し、改善し、安定化し、逆転させるかもしくは遅延させる、またはそうでなければ疾患の病理学的結果を軽減するのに十分な量である。いずれの場合においても、有効量は、単回用量または分割用量で与えられ得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、患者の異常状態に関連する症状の少なくとも改善を包含し、改善は、パラメータの大きさ、例えば、治療される状態に関連する症状の少なくとも軽減を指すために広義に使用される。そのため、「治療」はまた、疾患、障害、もしくは病理学的状態、または少なくともそれに関連する症状が、患者がその状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状に罹患しなくなるように、完全に阻害される（例えば、起こることを防ぐ）または停止される（例えば、終了される）状況も含む。
【0046】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣおよびＣＤ１３３＋ＨＳＣは、例えばヒトを含む様々な動物源に由来する臍帯血を含む血液から得ることができる。したがって、いくつかの実施形態は、本発明で使用される細胞の供給源として、単一の同種異系ドナーからヒト臍帯血を提供することを含む。
【0047】
いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ１３３＋細胞は臍帯血中の他の細胞から実質的に分離されて、精製されたＣＤ１３３＋ＨＳＣ細胞組成物を形成する。ＣＤ１３３＋ＨＳＣを血液から分離／精製する方法は、当該技術分野で周知であり、以下の実施例にさらに記載される。技術として、単純な遠心分離手順を用いて生存可能な単核細胞を血液から単離するためのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配分離、およびＣＤ１３３＋細胞を単核細胞から分離するための親和性分離が挙げられる。例示的な親和性分離技術は、例えば、磁気分離（例えば、抗体コーティングされた磁気ビーズ）および蛍光活性化細胞選別を含み得る。実質的に精製されたＣＤ１３３＋ＨＳＣは、培養中にさらに増殖させることができる。いくつかの実施形態において、得られる組成物の細胞の少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上は、ＣＤ１３３＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３３＋ＨＳＣの純度は、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上と等しいかまたはそれを上回る。
【0048】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、残りの臍帯血中の他の細胞および材料から実質的に精製される。ＭＳＣの分離／精製する方法は、当該技術分野で周知であり、以下の実施例にさらに記載されている。技術は、他の細胞から細胞を分離するための、磁気細胞選別（例えば、抗体コーティングされた磁気ビーズ）および蛍光活性化細胞選別等の親和性分離方法を含むことができる。１つの非限定的な例では、磁気分離キットを使用して細胞が精製される。実質的に精製されたＭＳＣは、培養中にさらに増殖させることができる。いくつかの実施形態において、細胞の実質的に精製された組成物の細胞の少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上。いくつかの実施形態において、細胞の純度は、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上と等しいかまたはそれらを上回る。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が実質的に精製される。
【0049】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣが除去された血液中の残りの細胞を培養して増殖された単核細胞組成物を形成する。したがって、実施形態において、培養された単核細胞組成物を増殖させて、より大きなＭＳＣの集団を生成する。増殖ステップは、当該技術分野で周知の培養技術および条件を使用することができる。ある特定の実施形態において、培養中の細胞を約１日～約３ヶ月間維持することによって細胞を増殖させる。さらなる実施形態において、約２日間～約２ヶ月、約４日間～約１ヶ月、約５日間～約２０日間、約６日間～約１５日間、約７日間～約１０日間、および約８日間～約９日間、細胞を培養中で増殖させる。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、任意の好適な供給源（例えば、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯血、臍帯組織）に由来し得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、培養された細胞は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、２００、３００、５００、または少なくとも８００倍増殖する。いくつかの実施形態において、増殖した細胞を含む組成物は、臨床的に適切な数または集団の細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約１０３、約１０４、約１０５細胞、約１０６細胞、約１０７細胞、約１０８細胞、約１０９細胞、約１０１０細胞以上を含む。いくつかの実施形態において、組成物中に存在する細胞の数は、組成物が意図される最終的な使用、例えば、疾患または状態または条件、患者の状態（例えば、サイズ、体重、健康等）、および当業者が容易に理解する他の健康関連パラメータに依存するであろう。加えて、いくつかの実施形態において、臨床的に適切な数の細胞を、累積的に所望の投与と等しいか、またはそれを超える複数の注入、例えば、１０９または１０１０細胞に割り当てることができる。
【0051】
実質的に精製された細胞は、直ちに使用することができる。実質的に精製された細胞はまた、液体窒素温度で凍結して長期間にわたって保存することができ、解凍して使用することができる。細胞は、例えば、培地、グルコース等と組み合わせて、ＤＭＳＯおよび／またはＦＣＳ中に保管されてもよい。
【0052】
いくつかの実施形態において、治療上有効な量の臍帯血由来のＭＳＣおよびＨＳＣを含む組成物は、薬学的に許容される担体を用いて対象に投与され得る。投与経路は、疾患標的組織（例えば、脳）内に直接、または血管内（静脈内もしくは動脈内）への定位誘導を介した実質内注射を含むがこれらに限定されない、任意の好適な手段を含み得る。いくつかの実施形態において、選択される特定の投与方法は、特定の治療、患者の病態または状態、対象に投与される他の薬物または治療薬の性質または投与経路等に依存する。
【0053】
いくつかの実施形態において、約１０５～１０１１細胞が、５ｍｌ～１リットル、５０ｍｌ～２５０ｍｌ、５０ｍｌ～１５０、および典型的には１００ｍｌの体積で投与され得る。いくつかの実施形態において、体積は治療される障害、投与経路、患者の状態、病態等に依存する。細胞は、例えば、用量を滴定するために、選択された時間間隔にわたって単回用量またはいくつかの用量で投与することができる。
【0054】
一態様において、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示される臍帯血由来間葉系間質細胞および造血幹細胞を投与することによって、対象における異常な神経学的疾患、例えば、パーキンソン病を調節することを対象とする。
【0055】
本明細書に開示される間葉系間質細胞および造血幹細胞を含む臍帯血由来細胞を使用して、多種多様な神経学的障害の症状を治療、緩和もしくは改善するか、または抑制することができる。いくつかの実施形態において、神経学的障害は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、筋萎縮症、進行性球麻痺、ハンチントン病、フリートライヒ運動失調症、およびアルツハイマー病が含まれるが、これらに限定されない。
【0056】
これらの方法は、患者における応答が所望される様々な異なる状態および状況の治療に使用される。例として、限定するものではないが、本明細書に開示されるようなＨＳＣおよびＭＳＣを含む組成物は、ＰＤの影響を受ける中脳の領域である黒色付近の細胞の脳深部刺激のために電極を設置するための手順等の関連する手術中に投与され得る。上述のように、食品医薬品局は、１９９７年に本態性振戦およびパーキンソン病（ＰＤ）の治療としてＤＢＳを承認した。この手術では、脳深部刺激のための微小電極を配置し、脳の特定の部分に電気インパルスを送る神経刺激装置と呼ばれる医療機器を移植する。典型的には、複数の電極を有する薄いリードが、視床下部、視床中間腹側核、または視床下核に移植され、電気パルスが治療的に使用される。インプラントからのリードは、胸部の皮膚の下の神経刺激装置まで延在する。ＤＢＳは、高周波電気インパルスを脳の特定の領域に送ることにより脳細胞および神経伝達物質の生理学に影響を及ぼし、そうすることで症状を軽減するか、ＰＤ薬物によって誘発される副作用を直接的に軽減するか、薬物の減少を可能にするか、または薬物レジメンをより寛容にすることができる。
【0057】
いくつかの実施形態において、細胞を、薬学的に許容される担体、例えば、人工ゲル、または凝固血漿中に、または当該技術分野で既知の他の制御放出機構を利用することによって投与することが便利である。実施形態において、本発明は、解凍され、組み合わされ、損傷した神経組織に適用される２つの凍結成分で提供され得る。実施形態において、組み合わされたＨＳＣおよびＭＳＣは、損傷組織内にインビボで適用した１～５分以内、または１～２分以内にゲル化または固化する。
【0058】
カスパーゼ３は、ドーパミン作動性ニューロンの損傷および再生の定量的尺度である。具体的には、細胞死から救出できる段階の損傷の早期指標である。したがって、カスパーゼ３切断を低減する治療薬は、ニューロン再生を促進するための強力な候補である。本発明は、開示される治療法の治療有効性を定量的に評価するために、切断カスパーゼ３の発現の測定を提供する。
【0059】
損傷後の神経突起伸長は、ドーパミン作動性ニューロン再生の定量的尺度である。神経突起は、ドーパミンを含む細胞間のシグナル伝達に重要なニューロン細胞体からの延伸部である。カスパーゼ３切断に加えて、神経突起損傷は、６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）、低酸素、および他の傷害によるニューロン損傷の特徴である。したがって、神経突起伸長を誘導する治療薬は、ニューロン再生の有望な候補である。
【0060】
６－ＯＨＤＡは、ミトコンドリア機能障害および神経突起損傷を含むドーパミン作動性ニューロンの損傷の特徴を誘発する毒性代謝産物である。したがって、６－ＯＨＤＡドーパミン作動性神経損傷モデルは、幹細胞の治療有効性の定量的評価を可能にする。さらに、低酸素誘発性の損傷モデルは、治療有効性を評価するために使用することもできる。具体的には、ガス制御された低酸素チャンバー内でニューロンをインキュベートすることにより、切断カスパーゼ３および神経突起伸長等の損傷マーカーによって測定することができるドーパミン作動性ニューロンの損傷を誘導する。これらの損傷モデルを使用して、本発明は、二重細胞ＭＳＣ＋ＨＳＣ治療薬の増強された治療有効性を示している。
【0061】
本発明は、ＭＳＣおよびＨＳＣの同時投与により、同等の細胞用量のいずれかの幹細胞集団単独と比べて驚くほどかなりの程度までニューロンのアポトーシスを有意に逆転させ、神経突起形成を増強することを提供する。
【0062】
ドーパミン作動性機能のＭＳＣおよびＨＳＣ媒介による回復は、以下を含むがこれらに限定されない機構によって媒介される：１）パラクリン機構を介したＭＳＣおよびＨＳＣの付加的神経栄養および血管新生効果、２）損傷したドーパミン作動性ニューロンへのミトコンドリアの移動を含む直接的な細胞間相互作用。以前の研究で、神経保護において重要な役割を果たすトロンボスポンジンを含むＵＣＢ－ＭＳＣ由来因子が特定されている。４３ＵＣＢ ＭＳＣ馴化培地は、６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷からドーパミン作動性ニューロンを救出するのに十分であり、パラクリン作用機序を支持する。
【0063】
神経再生機能を媒介する直接的な細胞間相互作用に関して、多くの研究は、ミトコンドリア機能障害がＰＤの病因において重要な役割を果たすことを示しており、実際に、いくつかの報告は、効果的なニューロンの救出は、治療幹細胞から損傷したニューロンへのミトコンドリアの供与を促進する直接的な細胞間接触に依存することを示唆している。４４－５４本発明は、ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣの両方がそれぞれ、損傷したドーパミン作動性ニューロンと密接な関連を形成してミトコンドリアを供与することを示し、ＵＣＢ ＭＳＣ／ＨＳＣ神経再生におけるそれらの潜在的な付加的利益がさらに示唆される。本発明は、ミトコンドリア移動が、トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）を介して起こることを示す。ＴＮＴは、ＨＳＣにおいて以前には観察されなかった。本発明はさらに、活性酸素種（ＲＯＳ）を、ＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動を駆動する主要な機構として特定し、ＣＤ７３シグナル伝達がＴＮＴ形成、ミトコンドリア移動、およびニューロン再生を媒介することを明らかにする。本発明はまた、パラクリン効果と比較して、細胞間相互作用が再生プロセスにおいてより大きな役割を果たすことも示す。
【0064】
ＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動は、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質としても知られるＭ－Ｓｅｃ、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅファミリーＲａｃ１およびＣｄｃ４２を含むアクチン重合因子、ならびにそれらの下流エフェクターであるＷＡＶＥおよびＷＡＳＰ等の化合物によって、また、ＤｕＰｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０００４３）に記載されるように、ＨｅＬａおよびＨＥＫ細胞株における白血球特異的転写産物１（ＬＳＴ１）タンパク質の発現によって誘導することができる。ＴＮＴおよびミトコンドリア移動はまた、Ｄｅｓｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：９４８４（２０１８）に記載されるように、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリン類似体などの化合物、ならびに細胞ストレス応答を引き起こす他の薬剤によっても誘導することができる。ＴＮＴおよびミトコンドリア移動は、Ｏｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１１１１８（２０１８）に記載されるように、サイトカラシンＢ、およびヌクレオシド類似体、例えば、シタラビン（シトシンアラビノシド、ＡｒａＣ）によって阻害することができる。さらに、サイトカラシンＤは、細胞透過性であり、アクチン阻害剤である。サイトカラシンＤは、Ｓａｅｎｚ－ｄｅ－Ｓａｎｔａ－Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７に示されるように、ＴＮＴ形成の有意な減少を引き起こし得る。Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１７）、Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．（２０１７）も参照されたい。
【0065】
Ｔｒｅｇは、ミトコンドリア移動を促進するアピラーゼ（ＣＤ３９）およびエクト－５’－ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）を発現する。ＣＤ３９／ＣＤ７３は、１型ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ－１ｂ、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、ＴＧＦ－β、ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｅ２Ｆ－１、ＣＲＥＢ、Ｓｐ１、ＨＩＦ１－ａ、Ｓｔａｔ３、および低酸素を使用することによって上方制御され得る。Ｂｅａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）、Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ（２０１２）、Ｒｅｇａｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）、Ｓｙｎｎｅｓｔｖｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００２）、Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（２００３）、Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００９）、およびＣｈａｌｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１２）を参照されたい。Ｃｈａｌｍｉｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１２）に記載されるように、Ｇｆｉ－１は、ＣＤ３９／ＣＤ７３発現を抑制する。ＣＤ３９／ＣＤ７３はまた、ＰＯＭ１（Ｅ－ＮＴＰＤａｓｅｓ阻害剤）、およびアデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸塩等の遮断抗体または薬理学的阻害剤を使用して阻害してもよい。
【0066】
本発明は、ＨＳＣおよびＭＳＣが、血管新生促進因子および神経栄養因子の分泌、ならびにミトコンドリア移動を介して、補完的な神経再生効果を発揮することを提供する。本発明はまた、神経突起成長の促進および神経突起成長調節物質Ｔｕｊ１のレベルの増強におけるＨＳＣの新規の役割を特定する。
【実施例】
【0067】
実施例１．ＵＢＳからのＭＳＣおよびＨＳＣ精製とエクスビボ増殖
この実施例の目的は、臍帯血から単核細胞を単離し、臍帯血回収バッグの内面に結合した可能性がある潜在的な間葉系間質細胞を単離し、同じユニットからＣＤ１３３＋造血幹細胞を単離するための例示的な手順を説明することである。
この実施例の目的は、臍帯血から単核細胞を単離し、臍帯血回収バッグの内面に結合した可能性がある潜在的な間葉系間質細胞を単離し、同じユニットからＣＤ１３３＋造血幹細胞を単離するための例示的な手順を説明することである。
【0068】
臍帯血用のチューブが５０ｍＬファルコンチューブの内側にあることを確認し、血液がチューブ内に自然に流れるようにバッグを適切な角度で持ち上げる。各チューブに５０ｍＬを流し入れる。２５ｍＬの血液を２５ｍＬのＰＢＳで希釈する（血液／ＰＢＳの１：１希釈）。希釈後、チューブを３～４回上下逆さまにして混合する。１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配培地を５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅチューブにピペッティングする。ピペット先端をチューブの底付近の頂点に当てる。チューブの底をゆっくりと満たし、気泡が存在しないことを確認する。２５ｍＬの希釈した血液－ＰＢＳ混合物を、Ｆｉｃｏｌｌを含む５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅチューブに非常にゆっくりピペッティングする。ピペット先端をチューブの側面に当て、混合物をチューブ内にゆっくりと放出して、血液がＳｅｐｍａｔｅチューブの底部分に入らないようにする。ＳｅｐＭａｔｅチューブを垂直に保つ。
【0069】
ブレーキをオンにして（加速は９にプログラムし、減速は６にプログラムする）、４０分間遠心分離する（２４００ｒｐｍ（１２００×ｇ）［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ］。遠心分離後（ＲＢＣが底部に残る）、上層をピペットで除去する。上層は、血漿とともにバフィーコートを含む。この画分を他のチューブの層と合わせて、５０ｍＬファルコンチューブに入れる。これらのチューブを１２００ｒｐｍで８分間遠心分離する。液体を吸引すると、ペレットがチューブの底に残る。
【0070】
ＭＮＣを１×ＰＢＳで洗浄し（最大５０ｍＬを加える）、１２００ｒｐｍで８分間遠心沈殿する。液体を吸引し、ＭＮＣを１×ＰＢＳで再び洗浄し、１２００ｒｐｍで８分間遠心沈殿する。有核赤血球の濃度に応じて、ＡＣＫ溶解緩衝液を使用してＲＢＣを溶解することができる。５ｍＬの緩衝液をピペッティングしてペレットを懸濁させる。５分後、チューブを１２００ｒｐｍで８分間遠心沈殿する。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２つのチューブ１およびチューブ２に分割し、１２００ｒｐｍで８分間遠心沈殿する。２０％ＨＳを含む１０ｍＬのＩＭＤＭに細胞ペレット１を懸濁し、１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で細胞ペレット２を懸濁して、細胞をカウントする。１０μｌの細胞懸濁液を取り、エッペンドルフチューブに加える。チューブに９０μｌのＩＭＤＭを加える。最後に、１００μｌのトリパンブルー染色を同じチューブに加える。この混合物１０μｌ全てを血球計数器に加え、細胞をカウントする。
【0071】
細胞懸濁液１については、以下のステップに従う。細胞懸濁液２については、ＣＤ１３３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用して細胞懸濁液を染色する。
【0072】
細胞懸濁液１については、細胞密度が１×１０６細胞／ｃｍ２となるように２５ｃｍ２フラスコ内に播種する。フラスコＡとフラスコＢの２つがある。Ａは、この手順を通して得られたこれらのＭＮＣのみを含む。Ｂは、臍帯血バッグから得られた細胞とともにＭＮＣを含む。このプロセスについては、以下にさらに詳述される。Ａと表示された細胞を、適切なサイズのフラスコ内で細胞密度１×１０６細胞／ｃｍ２を維持するのに適切な体積のＩＭＤＭを用いて、２０％ＨＳを含むＩＭＤＭに播種する。３７℃および５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターに細胞を入れる。
【0073】
臍帯血バッグから血液を排出した後、３０ｍＬシリンジで臍帯血バッグに１５０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを加える。シリンジの先端を臍帯血ユニットチューブの内側に配置し、液体を注ぎ入れる。Ａｃｃｕｔａｓｅは３７℃で加熱するべきではなく、冷蔵庫で一晩解凍する。１５０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ緩衝液を加えた後、臍帯血ユニットのチューブの端部にＰａｒａｆｉｌｍを巻く（液体がバッグから出ないことを確実にするため）。臍帯血バッグを滅菌輸送容器に入れ、次いで、振盪機に１０００ｒｐｍで１０分間入れる。このプロセスは、室温で行われる。臍帯血バッグを５０ｍＬファルコンチューブに流し入れる。臍帯血バッグのチューブを５０ｍＬファルコンチューブに入れ、ファルコンチューブが満たされるまでバッグを再び持ち上げる。臍帯血バッグへのＡｃｃｕｔａｓｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの注入を繰り返し、１０分間振盪して排出する。臍帯血バッグを２回ＰＢＳですすいだ後（１００ｍＬ）、全ての細胞を確実に回収する。
【0074】
ＰＢＳすすぎ液と、Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒとを含む両方のファルコンチューブを１２００ｒｐｍで８分間遠心沈殿する。液体を吸引し、細胞を単一の５０ｍＬファルコンチューブ内で合わせる。これらの細胞をＰＢＳ中で洗浄し、８分間１２００ｒｐｍで遠心沈殿する。細胞ペレットを、新鮮な４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充した完全ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ、２０％ＨＳ、１００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭグルタミン）に懸濁させる。これらの細胞を上記のＢと表示されたＭＮＣ細胞に加える。これらの細胞を適切なサイズのフラスコおよび濃度で完全ＩＭＤＭ＋ＦＧＦに播種し、深さで１×１０６細胞／ｃｍ２を維持する。７２～１２０時間後に培地をフラスコに加える。１２０～１６８時間後に培地を交換する。光顕微鏡下で細胞を頻繁に検査する。
【0075】
ＭＳＣの培養および凍結保存のために、フラスコから培地を吸引する。５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで３分間、インキュベーターで処理する。フラスコをすすいで細胞を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心沈殿する。液体を吸引する。細胞培養のために２０％ＨＳを含む完全ＩＭＤＭ培地に細胞ペレットを再懸濁させるか、または９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存するために細胞を調製する。細胞は、ＭＳＣ表現型特性を失い始めるので、約５回を超えて継代させてはならない。
【0076】
ＣＤ１３３＋ＨＳＣ単離の場合、細胞密度を１０８細胞／ｍＬに調整する。ＦｃＢｌｏｃｋの１：１１希釈液および１：１１のＣＤ１３３マイクロビーズを加える。（氷上ではなく）冷蔵庫内で３０分間インキュベートする。細胞を５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心沈殿する。液体を吸引する。ＭＡＣＳ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁し、希少な細胞型についてＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｏｓｓｅｌｄｓプログラムを使用してＣＤ１３３単離を行い、ＣＤ１３３陽性画分（ｐｏｓ１）およびＣＤ１３３陰性細胞（ｎｅｇ）の両方を回収する。単離された細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心沈殿する。液体を吸引する。実験で新鮮なＨＳＣを使用するために、完全ＩＭＤＭ培地（ＦＧＦを含まない）に細胞ペレットを再懸濁し、実験で使用する約１～２日前まで培養する。凍結保存のために、９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ中に細胞を再懸濁し、１０６細胞／バイアルを凍結させる。
【0077】
ＣＤ１３３＋ＨＳＣ増殖のために、ＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｏｓｓｅｌｄｓプログラムによって単離された陽性画分中のＣＤ１３３＋ＨＳＣを、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、およびＳＣＦをそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌ補充した１ｍＬの培養培地に２４ウェルプレートのウェル当たり２５０，０００～１，０００，０００細胞でそれらを播種することにより増殖させる。２～３日ごとに、細胞を上下にピペッティングして、接着の弱い細胞を剥離させ、１：５の比率で１０日間継代培養する。エクスビボ増殖の１０日目に、ＣＤ１３３＋細胞について細胞を再選択する（ＳＯＰ ＣＤ１３３ ＨＳＣ単離後）。ＣＤ１３３細胞単離後、特徴付けのためにアリコートを除去する（フローサイトメトリーによるＣＤ１３３＋ＨＳＣ純度のＳＯＰ特徴付け）。残りの細胞を９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存し、１０６細胞／バイアルを凍結させる。
【0078】
期待される結果は、臍帯血１００ｍＬ当たり１億～２億の単核細胞が得られることである。バッグ内洗浄細胞を含むように処理された６０～８０％の臍帯血ユニットは、間葉系間質細胞を生成する。脊髄血ＭＮＣの４０％のみがＭＳＣを生成する。これらのＭＳＣを、コンフルエントに増殖させ、継代させ、ＦＡＣＳおよびＭＬＲ抑制アッセイによって分析する。ＭＮＣ画分に加えられる臍帯血バッグから得られた細胞を含む細胞調製物は、それ自体で、播種されたＭＮＣ画分を含む細胞調製物よりもＭＳＣを生成する可能性が高い。臍帯血１００ｍＬ当たり５０万～１００万のＣＤ１３３＋ＨＳＣが得られる。エクスビボ増殖の１０日後に、５５×１０６細胞が得られた（初期の１０６個のＣＤ１３３選択ＨＳＣの５５倍の増殖）。５５×１０６増殖細胞の１５％がＣＤ１３３を発現するため、ＣＤ１３３ ＨＳＣの総収率は、約１０ｘ１０６細胞である。
【0079】
実施例２．神経突起伸長促進におけるＨＳＣの新規役割
神経突起は、ニューロンの正常な機能ならびにニューロン間の接続および通信において重要な役割を果たすニューロン細胞体からの延伸部である。低酸素または６－ＯＨＤＡ等の環境毒素によるニューロン損傷の特徴は、神経突起網の圧密化および神経突起の分解として現れる、神経突起への損傷である。神経突起伸長は、再生に寄与する重要なプロセスであり、顕微鏡分析によって定量化することができる。ＭＳＣは神経成長促進因子を分泌するが、ＭＳＣは神経突起伸長にわずかな利点を示したに過ぎない。ＨＳＣが神経突起伸長に及ぼす影響は研究されていないが、ＨＳＣは、神経突起伸長を促進することが示されている、ＳＤＦ－１を含むタンパク質を分泌する。本発明は、損傷後に、ＨＳＣが神経突起伸長を増強することができることを開示する。
神経突起は、ニューロンの正常な機能ならびにニューロン間の接続および通信において重要な役割を果たすニューロン細胞体からの延伸部である。低酸素または６－ＯＨＤＡ等の環境毒素によるニューロン損傷の特徴は、神経突起網の圧密化および神経突起の分解として現れる、神経突起への損傷である。神経突起伸長は、再生に寄与する重要なプロセスであり、顕微鏡分析によって定量化することができる。ＭＳＣは神経成長促進因子を分泌するが、ＭＳＣは神経突起伸長にわずかな利点を示したに過ぎない。ＨＳＣが神経突起伸長に及ぼす影響は研究されていないが、ＨＳＣは、神経突起伸長を促進することが示されている、ＳＤＦ－１を含むタンパク質を分泌する。本発明は、損傷後に、ＨＳＣが神経突起伸長を増強することができることを開示する。
【0080】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、ＵＣＢ ＭＳＣおよび／またはＣＤ１３３＋ＨＳＣと１０：１のＬＵＨＭＥＳ：ＭＳＣ＋ＨＳＣ比で共培養し、７２時間インキュベートした。次いで、３日後、カスパーゼ３／Ｔｕｊ１共染色のために細胞を処理した。細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡で撮像し、ＡｐｏＴｏｍｅ．２を装備したＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸対物レンズでＺスタック画像を収集した。図４Ａは、ｚスタック画像の３Ｄ再構成を表し、データは、３つの独立した実験を代表するものである。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して、マンホイットニーＵ検定により統計学的有意性を決定した。
【0081】
神経突起経路をトレースし、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ ３６０神経突起分析ソフトウェアを使用して神経突起面積を測定した。各神経突起の面積を各画像フィールドで測定し、データは、少なくとも４つの画像フィールドからの平均、合計、または最大神経突起面積を表す。図４Ｂ～図４Ｃのデータは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験からの平均＋／－標準偏差を表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して、独立ｔ検定により統計学的有意性を決定した。
【0082】
神経毒素処理による損傷は、全体的な神経突起面積を減少させ、神経突起の面積および長さが非損傷ニューロンにおいて観察されるレベルまで完全に回復することによって示されるように、ＨＳＣは、毒素誘発性損傷後の神経突起伸長を著しく増強する。ＭＳＣは、場合によっては神経突起の回復の助けとなるが、全体的なＨＳＣは、損傷後の神経突起伸長に対して有意により大きな再生上の利点を有する。
【0083】
実施例３．二重ＭＳＣおよびＨＳＣ細胞治療
この実施例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍを介してネットワーク化された臨床グレードＵＣＢのグローバルＵＣＢ在庫検索に基づいて各患者に最適なＨＬＡ適合を提供することで、同種異系ＵＣＢ由来二重幹細胞（ＭＳＣ／ＣＤ１３３＋ ＨＳＣ）による生物学的療法を提供する。
この実施例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍを介してネットワーク化された臨床グレードＵＣＢのグローバルＵＣＢ在庫検索に基づいて各患者に最適なＨＬＡ適合を提供することで、同種異系ＵＣＢ由来二重幹細胞（ＭＳＣ／ＣＤ１３３＋ ＨＳＣ）による生物学的療法を提供する。
【0084】
図１Ａ～図１Ｂは、ＨＳＣが、損傷したドーパミン作動性ニューロンのＭＳＣによって媒介される再生を増強することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ＨＳＣとともに６時間共培養し、固定し、Ｔｕｊ１および早期損傷マーカーである切断カスパーゼ３について染色し、ＡｐｏＴｏｍｅ．２を装備したＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｚ１で可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【0085】
ＭＳＣおよびＨＳＣの単離および培養：ヒトＵＣＢを、クエン酸デキストロースを含む回収バッグ中に回収した（Ａｌｌｅｇｉａｎｃｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。単核細胞を、ＳｅｐＭａｔｅ－５０チューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）密度勾配遠心分離により単離した。ＨＳＣ単離のために、ＭＮＣを、製造業者のプロトコルに従ってＣＤ１３３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識した。標識されたＣＤ１３３＋ＨＳＣを、Ｐｏｓｓｅｌｄｓプログラムを使用してＡｕｔｏＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で単離した。収率は、日常的にＵＣＢユニット当たり１０６細胞であり、フローサイトメトリーによるＣＤ１３３染色によって純度を日常的に評価し、９０％超となるようにした。ＨＳＣを、実験で使用するまで凍結保存した。２０％ヒト血清（Ａｂｎｏｖａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを含み、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を新たに補充したＩＭＤＭ培地でＭＮＣを培養することによりＭＳＣを作製した。培地を２～３日ごとに交換し、１０ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ７５組織培養フラスコ内で継代培養した。３～４週間の培養後、細胞を凍結保存し、実験で使用するまで保管した。ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣを解凍し、実験で使用する前に１～２日休ませた。
【0086】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内に１０継代未満で維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番カバーグラス（Ｃｅｌｌｖｉｓ）にウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞を１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで示された期間処理し、１回洗浄し、ＵＣＢ幹細胞の示された組み合わせをニューロンとの直接共培養に加えた。６時間後、細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズで撮像した。図１Ａは、構造化照明のためにＡｐｏＴｏｍｅ．２で取得したｚスタックの３Ｄ再構成を表す。切断カスパーゼ３陽性Ｔｕｊ１＋ニューロンの割合を、蛍光画像からの手動計数によって決定した。データは、少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均＋／－標準偏差を表し、３つの独立した実験を代表するものである。
【0087】
図２Ａ～図２Ｂは、二重幹細胞（ＣＤ１３３＋ＨＳＣおよびＭＳＣ）が、分泌された可溶性因子を介してニューロンを保護することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、通常の分化培地またはＭＳＣ馴化培地で４８時間培養し、図１に示すように染色および可視化した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【0088】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番カバーグラス（Ｃｅｌｌｖｉｓ）にウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞を１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、示される培地（分化培地、または５日間培養したＵＣＢ ＭＳＣから回収したＭＳＣ馴化培地）中で３日間インキュベートした。次いで、細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズで撮像した。図２Ａは、構造化照明のためにＡｐｏＴｏｍｅ．２で取得したｚスタックの３Ｄ再構成を表す。切断カスパーゼ３陽性Ｔｕｊ１＋ニューロンの割合を、蛍光画像からの手動計数によって決定した。データは、少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞３０細胞の分析の平均＋／－標準偏差を表し、２つの独立した実験からのデータが示される。
【0089】
図３Ａ～図３Ｃは、ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣが損傷したドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリアを供与することを示す。分化の６日目に、ＬＵＨＭＥＳドーパミン作動性ニューロンを１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで処理し、様々な用量のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで前標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびａｕｔｏＭＡＣＳにより選択したＣＤ１３３＋ ＨＳＣとともに６時間共培養し、ニューロンへのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの移動を蛍光顕微鏡により監視した。データは、平均＋／－ＳＤ、マンホイットニーＵ検定を表す。
【0090】
ＭＳＣおよびＨＳＣの単離および培養：ヒトＵＣＢを、クエン酸デキストロースを含む回収バッグ中に回収した（Ａｌｌｅｇｉａｎｃｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。単核細胞を、ＳｅｐＭａｔｅ－５０チューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）密度勾配遠心分離により単離した。ＨＳＣ単離のために、ＭＮＣを、製造業者のプロトコルに従ってＣＤ１３３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識した。標識されたＣＤ１３３＋ＨＳＣを、Ｐｏｓｓｅｌｄｓプログラムを使用してＡｕｔｏＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で単離した。収率は、日常的にＵＣＢユニット当たり１０６細胞であり、フローサイトメトリーによるＣＤ１３３染色によって純度を日常的に評価し、９０％超となるようにした。ＨＳＣを、実験で使用するまで凍結保存した。２０％ヒト血清（Ａｂｎｏｖａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを含み、４０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を新たに補充したＩＭＤＭ培地でＭＮＣを培養することによりＭＳＣを作製した。培地を２～３日ごとに交換し、１０ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ７５組織培養フラスコ内で継代培養した。３～４週間の培養後、細胞を凍結保存し、実験で使用するまで保管した。ＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣを解凍し、実験で使用する前に１～２日休ませた。ニューロンとの共培養の直前に、ＭＳＣおよびＨＳＣを３７℃で３０分間、５０ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで標識した。細胞を洗浄し、ニューロンと共培養した。
【0091】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番カバーグラス（Ｃｅｌｌｖｉｓ）にウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞を１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで示された期間処理し、１回洗浄し、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで標識したＵＣＢ幹細胞の示された組み合わせをニューロンとの直接共培養に加えた。０または２４時間後、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズで細胞を撮像した。データは、ＩｍａｇｅＪで定量化され、染色されていないニューロンに存在するバックグラウンド染色に正規化された、ニューロン中のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ染色の平均蛍光強度を表す。
【0092】
実施例４．二重幹細胞は、神経突起伸長調節物質Ｔｕｊ１の発現を増強する
図５は、二重幹細胞が神経突起伸長調節物質Ｔｕｊ１の発現を増強することを示す。ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、２４ウェルプレートを低酸素チャンバー（Ｃ－Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）に入れ、細胞を、酸素コントローラー（Ｐ１５ Ｏ２コントローラー、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）を使用して送達される５．２５％の二酸化炭素と９４．７５％の窒素とからなるカスタムガス混合物を使用して送達される５％酸素に２４時間曝露する。２４時間後、プレートを低酸素チャンバーから取り出し、ＰＫＨ２６で標識したＵＣＢ ＭＳＣおよび／またはＵＣＢ ＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１３３－ＨＳＣと示される比率で共培養し、７２時間インキュベートする。
図５は、二重幹細胞が神経突起伸長調節物質Ｔｕｊ１の発現を増強することを示す。ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、２４ウェルプレートを低酸素チャンバー（Ｃ－Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）に入れ、細胞を、酸素コントローラー（Ｐ１５ Ｏ２コントローラー、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）を使用して送達される５．２５％の二酸化炭素と９４．７５％の窒素とからなるカスタムガス混合物を使用して送達される５％酸素に２４時間曝露する。２４時間後、プレートを低酸素チャンバーから取り出し、ＰＫＨ２６で標識したＵＣＢ ＭＳＣおよび／またはＵＣＢ ＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１３３－ＨＳＣと示される比率で共培養し、７２時間インキュベートする。
【0093】
次いで、３日後、カスパーゼ３／Ｔｕｊ１共染色のために細胞を処理した。細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズで撮像した。全ての画像をスタックに組み合わせ、半径５０でバックグラウンド減算を適用することにより全ての画像を同じ様式で処理してＩｍａｇｅＪのバックグラウンドを除去した（画像は図示せず）。データは、少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均＋／－標準誤差を表し、３つの独立した実験を代表するものである。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して、マンホイットニーＵ検定により統計学的有意性を決定した。
【0094】
これらのデータは、二重ＭＳＣ＋ＨＳＣ処理が、ドーパミン作動性ニューロン損傷後のＴｕｊ１の発現を著しく増強することを実証する。これらのデータに基づいて、二重幹細胞治療の主な利点は、ドーパミン作動性ニューロン再生における不可欠なプロセスである神経突起伸長に不可欠なＴｕｊ１を含む因子の発現増強を提供することである。
【0095】
実施例５．作用機序ＭＳＣおよびＨＳＣは、パラクリン因子および細胞間相互作用の両方を介して再生を促進する。
以前の研究では、再生の機構について相反する見解が示された。幹細胞は、神経保護を支持し得る因子を分泌することができる。図６および図２Ｂは、パラクリン機構自体が再生にどの程度貢献できるかを示す。具体的には、ＭＳＣ単独の培養物から回収した培地（ＭＳＣ馴化培地またはＭＳＣ ＣＭと称される）が、神経毒素で損傷させたニューロンの再生を促進することができるかどうかを調査した。ニューロンを最初に神経毒素処理によって損傷させ、その後、通常のニューロン培地またはＭＳＣ馴化培地で培養し、切断カスパーゼ３発現により以下に詳細に再生を測定した。
以前の研究では、再生の機構について相反する見解が示された。幹細胞は、神経保護を支持し得る因子を分泌することができる。図６および図２Ｂは、パラクリン機構自体が再生にどの程度貢献できるかを示す。具体的には、ＭＳＣ単独の培養物から回収した培地（ＭＳＣ馴化培地またはＭＳＣ ＣＭと称される）が、神経毒素で損傷させたニューロンの再生を促進することができるかどうかを調査した。ニューロンを最初に神経毒素処理によって損傷させ、その後、通常のニューロン培地またはＭＳＣ馴化培地で培養し、切断カスパーゼ３発現により以下に詳細に再生を測定した。
【0096】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を１００ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、ＵＣＢ ＭＳＣおよび／またはＣＤ１３３＋ ＨＳＣと１０：１のＬＵＨＭＥＳ：ＭＳＣ＋ＨＳＣ比で共培養し、７２時間インキュベートした。次いで、３日後、カスパーゼ３／Ｔｕｊ１共染色のために細胞を処理した。細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＡｐｏＴｏｍｅ．２を装備したＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸対物レンズで撮像した（画像は図示せず）。データは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験からの少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均の平均＋／－標準偏差を表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して、マンホイットニーＵ検定により統計学的有意性を決定した。
【0097】
ＭＳＣは、再生を促進するタンパク質の混合物（ＭＳＣ馴化培地と称される）を分泌することができる。しかしながら、興味深いことに、ＭＳＣ馴化培地自体は（すなわち、ＭＳＣ自体の不在下では）、６－ＯＨＤＡ処理後にニューロンを完全に再生するのに十分ではない。ＭＳＣ馴化培地中で６－ＯＨＤＡで処理されたニューロンは、ＭＳＣ培地の不在下で６－ＯＨＤＡ処理されたニューロンと比較するとより低いレベルのカスパーゼ３を示すが、それは未処理ニューロンほど低くはない。さらに、ＭＳＣ馴化培地は、損傷後のロバストな神経突起伸長を促進しない。
【0098】
再生に対するパラクリン機構および直接細胞接触機構の寄与を評価するために、損傷したニューロンを幹細胞と直接共培養した後と、間接的なトランスウェルを使用して共培養した後の再生（切断カスパーゼ３発現の低減、および神経突起伸長の増加）を比較した。トランスウェルを用いた共培養では、分泌されたパラクリン分子の移動を可能にするが、直接細胞接触は防止する０．２ｕｍの細孔膜によって幹細胞がニューロンから隔てられる。直接比較では、ＬＵＨＭＥＳ細胞と直接共培養したＭＳＣ（直接的な細胞間接触を可能にする）は、トランスウェルで間接的に共培養したＭＳＣ（パラクリン／分泌因子のみを可能にする）と比較して著しく増強された再生を支持した。これらのデータは、直接的な細胞間接触が、再生において間接的なパラクリン機構と比べてより顕著な役割を果たすという主張を支持するものである。
【0099】
実施例６．直接的な細胞間相互作用によって媒介されるニューロン再生の根底にある作用機序は、ＴＮＴである。
トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）を介したＭＳＣミトコンドリア移動は、ドーパミン作動性ニューロン再生の根底にある重要な作用機序である。ＨＳＣはまた、ミトコンドリアを移動させてドーパミン作動性ニューロンの損傷を低減することもできるが、これは、ＨＳＣにおいて以前に記載されたことがなく、ＭＳＣにおいてのみ観察される機構である。
トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）を介したＭＳＣミトコンドリア移動は、ドーパミン作動性ニューロン再生の根底にある重要な作用機序である。ＨＳＣはまた、ミトコンドリアを移動させてドーパミン作動性ニューロンの損傷を低減することもできるが、これは、ＨＳＣにおいて以前に記載されたことがなく、ＭＳＣにおいてのみ観察される機構である。
【0100】
損傷したドーパミン作動性ニューロンの存在下で、ＭＳＣはＴＮＴを突出させてミトコンドリア移動を容易にする（データは図示せず）。ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を示された濃度の６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、ＰＫＨ２６／Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで共標識したＵＣＢ ＭＳＣと３：１のＬＵＨＭＥＳ：ＭＳＣ比で共培養し、２４時間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸漬対物レンズで細胞のＺスタック画像を収集した。
【0101】
ＰＫＨ２６／Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎによる共標識のために、ＭＳＣをＰＢＳ中で洗浄し、ＰＫＨ２６染色キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＰＫＨ２６で染色した。ＭＳＣを０．１ｍＬの希釈剤Ｃに再懸濁した。２ｕｌのＰＫＨ２６色素を１ｍＬの希釈剤Ｃに希釈し、０．１ｍＬをＭＳＣに加えた。５分後、ＭＳＣ培地（ＩＭＤＭ完全培地中の１０％ＨＳ）の添加により標識をクエンチした。細胞を、ＭＳＣ培地中で２回洗浄し、ＬＵＨＭＥＳ完全培地中に再懸濁した。その後、３７℃で３０分間、細胞を２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで標識した。細胞を完全ＬＵＨＭＥＳ培地中で２回洗浄し、ＬＵＨＭＥＳ分化培地に再懸濁した。次いで、示された比率でＭＳＣをＬＵＨＭＥＳ細胞と共培養した。
【0102】
驚くべきことに、ＨＳＣはまた、図７に示すように、ＴＮＴを介して、損傷したドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリアを移動させる。色素漏出の懸念を回避する蛍光ミトコンドリアタンパク質（ＭｉｔｏＧＦＰ）を発現するように操作した遺伝子組み換えＨＳＣを作製した。幹細胞由来のＭｉｔｏＧＦＰで標識したミトコンドリアが、幹細胞／ニューロンの共培養中に損傷したニューロンに移動されるかどうかを評価するために実験を行った。
【0103】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を示された濃度の６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、３５０ｎＭのサイトカラシンＢの存在下または不在下で、ＭｉｔｏＧＦＰで標識したＵＣＢ幹細胞と３：１のＬＵＨＭＥＳ：幹細胞比で共培養し、２４時間インキュベートした。次いで、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸漬対物レンズで細胞を撮像した。Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡、６０倍油浸漬対物レンズで細胞のＺスタック画像を収集した。
【0104】
幹細胞におけるＭｉｔｏＧＦＰタンパク質発現のために、ＵＣＢ ＣＤ１３３＋ＨＳＣにＭｉｔｏＧＦＰレンチウイルスを形質導入した。レンチウイルスは、ｐＬＹＳ－ＭｉｔｏＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ）およびレンチウイルスエンベロープおよびパッケージングプラスミド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の３つのプラスミドトランスフェクションにより生成し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ濃縮試薬を使用して回収および濃縮した。ウイルスを遠心分離し、ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、使用まで－８０℃で保管した。ウイルス作製時に、幹細胞にＭｉｔｏＧＦＰレンチウイルスを形質導入した。細胞を解凍し、形質導入前に２４時間休ませた。その後、１００ｕｌの完全ＨＳＣ培地に懸濁した１００，０００個のトリパンブルー陰性の生存細胞を丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移した。幹細胞にＭｉｔｏＧＦＰレンチウイルスを加え、スピノキュレーションにより細胞を形質導入した。プレートを、室温で２時間、９３２×ｇで回転させた。その後、１００ｕｌの完全培地を各ウェルに滴下して加え、細胞を組織培養インキュベーターに入れた。２４時間後、蛍光顕微鏡によりＭｉｔｏＧＦＰの発現を評価したところ、約５％の細胞に蛍光が観察された。細胞を１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで処理して、ピューロマイシン誘発性細胞死に対する耐性を付与するピューロマイシン耐性遺伝子を担持するＭｉｔｏＧＦＰレンチウイルスを保有する細胞を選択した。２４～４８時間のピューロマイシン選択後、ＭｉｔｏＧＦＰ＋細胞の割合を約２０％に増加させ、細胞を共培養実験に利用した。
【0105】
ミトコンドリアに局在する遺伝的にコードされたミトコンドリア蛍光タンパク質を用いて標識した、ＨＳＣ由来のミトコンドリアは、損傷したニューロンにおいて検出され得る。ＨＳＣは実際に、損傷したニューロンにミトコンドリアを移動させる。ＨＳＣによる損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動は、これまでに観察または公表されていない。
【0106】
直接的な細胞間相互作用を介したトンネルナノチューブ（ＴＮＴ）によるミトコンドリア移動は、損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生における二重ＭＳＣ＋ＨＳＣの重要な作用機序である。ミトコンドリア機能障害は損傷の根底にある重要な機構であるため、二重ＭＳＣ＋ＨＳＣから健康なミトコンドリアを得るための損傷したニューロンからのシグナルによってミトコンドリア移動が積極的に誘導され、再生の重要な機構としてのミトコンドリア機能を回復させることができると推論された。健康なドーパミン作動性ニューロンと６－ＯＨＤＡで損傷させたドーパミン作動性ニューロンに対するミトコンドリア移動を比較することによって、ミトコンドリア移動がニューロン損傷によって特異的に誘発されるかどうかを決定するために実験を行った。
【0107】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を示された濃度の６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、小麦胚芽凝集Ｏｒｅｇｏｎ ４８８／２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで共標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびＨＳＣと３：１のＬＵＨＭＥＳ：ＭＳＣ＋ＨＳＣ比で共培養し、４時間インキュベートした。ＭＳＣおよびＨＳＣを、ＰＢＳ中の２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで１５分間標識した。最後の５分間に、１ｕｇ／ｍｌの小麦胚芽凝集集Ｏｒｅｇｏｎ ４８８を加えた。次いで、細胞をＭＳＣ培地で２回洗浄し、ニューロンと４時間共培養した。その後、細胞を、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸漬対物レンズで撮像した（図１０Ａ～図１０Ｂ）。
【0108】
これらの実験は、ＴＮＴ形成、ならびにＭＳＣおよびＨＳＣからドーパミン作動性ニューロンへのミトコンドリアの移動を誘導するためには、ニューロン損傷が必要であることを示す。これらのデータは、ＴＮＴ形成および二重ＭＳＣ＋ＨＳＣからのミトコンドリア移動が、損傷したドーパミン作動性ニューロンによってＭＳＣおよびＨＳＣに伝達されるシグナルを必要とする能動的なプロセスであることを実証するものである。
【0109】
実施例７．損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＲＯＳ蓄積は、ＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動を誘発する主要な機構である
直接的な細胞間相互作用によるミトコンドリア移動は、ＭＳＣおよびＨＳＣからミトコンドリアを運ぶＴＮＴを呼び出すためにミトコンドリア経路の活性化を必要とする能動的プロセスである。驚くべきことに、損傷したニューロンにおけるＲＯＳの上方制御は、治療細胞からのＴＮＴの突出およびミトコンドリアの移動を開始する活性化事象である。この機構の裏付けとして、損傷したニューロンをＭＳＣおよびＨＳＣと共培養することにより、損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＲＯＳが減少する。
直接的な細胞間相互作用によるミトコンドリア移動は、ＭＳＣおよびＨＳＣからミトコンドリアを運ぶＴＮＴを呼び出すためにミトコンドリア経路の活性化を必要とする能動的プロセスである。驚くべきことに、損傷したニューロンにおけるＲＯＳの上方制御は、治療細胞からのＴＮＴの突出およびミトコンドリアの移動を開始する活性化事象である。この機構の裏付けとして、損傷したニューロンをＭＳＣおよびＨＳＣと共培養することにより、損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＲＯＳが減少する。
【0110】
図８は、ＲＯＳをブロックすることにより６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷が低減することを示す。ＲＯＳ蓄積は、ドーパミン作動性ニューロンの６－ＯＨＤＡ誘発性損傷の間の重要な早期事象である。ＲＯＳ蓄積がニューロン損傷に寄与するかどうかを決定するために以下の実験を行った。この実験では、ＲＯＳ産生の阻害剤であるＹＣＧ０６３が、顕微鏡で、損傷したニューロンのアネキシンＶ染色によって測定されるように、６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷をブロックするかどうかを調べた。
【0111】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞をＲＯＳ阻害剤の存在下または不在下で、５０ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、示されるように３日間培養した。次いで、細胞をアネキシンＶ－ＦＩＴＣ（１：１０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびヨウ化プロピジウム（１：１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４１倍対物レンズで撮像した（画像は図示せず）。データは、１つの実験からの少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均＋／－標準偏差を表す。
【0112】
ドーパミン作動性ニューロンにおける６－ＯＨＤＡ誘発性ＲＯＳの阻害は、アネキシンＶ染色によって測定される６－ＯＨＤＡ誘発性ニューロン損傷を有意に低減した。これらのデータは、ＲＯＳ蓄積が、ドーパミン作動性ニューロンの６－ＯＨＤＡ誘発性損傷の根底にある重要な機構であることを実証するものである。
【0113】
ＲＯＳ蓄積は、ドーパミン作動性ニューロンの６－ＯＨＤＡ誘発性損傷の間の重要な早期事象である。ＲＯＳ蓄積がニューロン損傷に寄与するかどうかを決定するために実験を行った。この実験では、ＲＯＳ産生の阻害剤であるＹＣＧ０６３が、図１１によって示されるように、顕微鏡で、損傷したニューロンのアネキシンＶ染色によって測定されるように、６－ＯＨＤＡ誘発性の損傷をブロックするかどうかを調べた。
【0114】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞をＲＯＳ阻害剤の存在下または不在下で、５０ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、示されるように３日間培養した。次いで、細胞をアネキシンＶ－ＦＩＴＣ（１：１０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびヨウ化プロピジウム（１：１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４１倍対物レンズで撮像した（画像は図示せず）。データは、１つの実験からの少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均＋／－標準偏差を表す。
【0115】
ドーパミン作動性ニューロンにおける６－ＯＨＤＡ誘発性ＲＯＳの阻害は、アネキシンＶ染色によって測定される６－ＯＨＤＡ誘発性ニューロン損傷を有意に低減した。これらのデータは、ＲＯＳ蓄積が、ドーパミン作動性ニューロンの６－ＯＨＤＡ誘発性損傷の根底にある重要な機構であることを実証するものである。
【0116】
実施例８．二重幹細胞が直接的な細胞間接触によって媒介される損傷したＰＤドーパミン作動性ニューロンの再生に及ぼす有益な効果の根底にある主要な機構の同定
以前の一連の実験は、直接的な細胞間接触が、パラクリン機構よりも幹細胞再生機構においてより重要な役割を果たすことを示した。さらに、ニューロンＲＯＳの増加がニューロン損傷に寄与することが見出された。ＲＯＳの増加は、ＭＳＣからニューロンを含む損傷した細胞型への健康なミトコンドリアの移動を刺激するＭＳＣへのシグナルとしての役割を果たし得ることが報告されている。この機構は、特に、ミトコンドリア機能障害が損傷の根底にある重要な機構である損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生において重要な役割を果たし得る。ＭＳＣと損傷した細胞型との間のミトコンドリア移動は主に、顕微鏡で観察することができる細いトンネルナノチューブ（ＴＮＴ）の形成を介して生じる。ＭＳＣが、ＴＮＴ形成を介して、蛍光標識したミトコンドリアを損傷したニューロンに移動させることができることが示された。ＣＤ７３シグナル伝達の阻害剤を用いて、ＣＤ７３シグナル伝達がＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動のための重要なシグナルであるかどうかを決定するために以下の実験を行った。
以前の一連の実験は、直接的な細胞間接触が、パラクリン機構よりも幹細胞再生機構においてより重要な役割を果たすことを示した。さらに、ニューロンＲＯＳの増加がニューロン損傷に寄与することが見出された。ＲＯＳの増加は、ＭＳＣからニューロンを含む損傷した細胞型への健康なミトコンドリアの移動を刺激するＭＳＣへのシグナルとしての役割を果たし得ることが報告されている。この機構は、特に、ミトコンドリア機能障害が損傷の根底にある重要な機構である損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生において重要な役割を果たし得る。ＭＳＣと損傷した細胞型との間のミトコンドリア移動は主に、顕微鏡で観察することができる細いトンネルナノチューブ（ＴＮＴ）の形成を介して生じる。ＭＳＣが、ＴＮＴ形成を介して、蛍光標識したミトコンドリアを損傷したニューロンに移動させることができることが示された。ＣＤ７３シグナル伝達の阻害剤を用いて、ＣＤ７３シグナル伝達がＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動のための重要なシグナルであるかどうかを決定するために以下の実験を行った。
【0117】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした３５ｍｍの１．５番ガラス底皿（Ｃｅｌｌｖｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ番号Ｄ３５－２０－１．５－Ｎ）にウェル当たり３０万細胞で細胞を再播種した。分化の６日目に、細胞を示された濃度の６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、ＣＤ７３阻害剤（５０ｕｍ）の存在下または不在下で、ＰＫＨ２６／Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで共標識したＵＣＢ ＭＳＣと３：１のＬＵＨＭＥＳ：ＭＳＣ比で共培養し、８時間インキュベートした。ＭＳＣおよびＨＳＣのＰＫＨ２６標識は、前述のように行った。その後、ＭＳＣおよびＨＳＣを、ＰＢＳ中の５００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで１５分間標識した。次いで、細胞をＭＳＣ培地で２回洗浄し、４時間インキュベートした。細胞をその後、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の６０倍油浸対物レンズで撮像した（画像は図示せず）。ＭＳＣ／ＨＳＣ Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで標識したミトコンドリアの損傷したニューロンへの移動を、ＩｍａｇｅＪで個々のニューロンについてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ蛍光強度を測定することによって評価した。データは平均＋／－ＳＤを表す。
【0118】
図１２に示すように、これらの実験は、ＣＤ７３シグナル伝達の阻害がＴＮＴ形成を著しくブロックし、ＭＳＣおよびＨＳＣから損傷したドーパミン作動性ニューロンへのミトコンドリアの移動を低減することを示す。これらのデータは、ＣＤ７３シグナル伝達がＴＮＴ形成および損傷したドーパミン作動性ニューロンへのミトコンドリア移動にとって必要な重要な経路であることを実証するものである。
【0119】
ミトコンドリア移動は、ＭＳＣおよびＨＳＣからミトコンドリアを運ぶＴＮＴを呼び出すためにミトコンドリア経路の活性化を必要とする能動的プロセスである。先に示されたように、損傷したニューロンにおけるＲＯＳ蓄積は、驚くべきことに、治療細胞からのＴＮＴの突出およびミトコンドリアの移動を開始する活性化事象である。この機構の裏付けとして、損傷したニューロンをＭＳＣおよびＨＳＣと共培養することにより、損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＲＯＳが減少することが示された。
【0120】
ＲＯＳは、ミトコンドリア機能障害を誘発し、ＣＤ７３を含むミトコンドリアシグナル伝達経路を変化させる。ＣＤ７３シグナル伝達は、アクチン細胞骨格の再編成に関連している。本発明は、ＣＤ７３の活性化がＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動に重要であることを開示する。本発明は、損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＣＤ７３の有意な上方制御を含むＲＯＳの上方制御が、ミトコンドリアシグナル伝達経路に影響を与えることを驚くべきことに見出した。さらに、本発明は、驚くべきことに、ＣＤ７３が、ドーパミン作動性ニューロン再生に寄与するＴＮＴの突出およびミトコンドリア移動を媒介することを示す。驚くべきことに、ＣＤ７３の阻害は、ミトコンドリア移動を５０％減少させる。さらに、本発明は、カスパーゼ活性化および神経突起伸長によって測定されるように、ＣＤ７３阻害が、ＭＳＣおよびＨＳＣによる損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生をブロックすることを明らかにする。
【0121】
パーキンソン病の多因子損傷モデル（低酸素または６－ＯＨＤＡ誘発性損傷後）において、保護的役割を果たす炎症トリガーとして関与しているＣＤ３９およびＣＤ７３タンパク質がニューロンにおいて上方制御されるかどうかを調べるために以下の実験を行った（データは図示せず）。
【0122】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンの２４ウェルプレートにウェル当たり３００，０００細胞で細胞を再播種した。６－ＯＨＤＡによる損傷のために、分化の６日目に、細胞を５０ｕＭの６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、４時間または２４時間インキュベートした。低酸素による損傷のために、２４ウェルプレートを低酸素チャンバー（Ｃ－Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）に入れ、細胞を、酸素コントローラー（Ｐ１５ Ｏ２コントローラー、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ）を使用して送達される５．２５％の二酸化炭素と９４．７５％の窒素とからなるカスタムガス混合物を使用して送達される５％酸素に２４時間曝露する。４時間または２４時間後、プレートを低酸素チャンバーから取り出した。次いで、全ての試料を、以下のようにフローサイトメトリー染色のために処理した：組織培養インキュベーター中、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを５分間使用してＬＵＨＭＥＳニューロンを２４ウェルプレートから解離する。次いで、細胞をすすぎ、５ｍｌピペットを使用して表面からそれらを剥離させ、加温完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と混合した。次いで、細胞を１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各条件につき、１００，０００個の細胞をＰ１０００で再懸濁してＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ ＢＳＣ／ＰＢＳ）中の細胞塊を破壊し、氷上で３０分間、ヒトＣＤ３９ ＰＥ－ＣＦ５９４またはＣＤ７３ ＰＥ－Ｃｙ７抗体（ＢＤ）を使用して染色する。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）を使用してチューブ当たり１００００事象を分析した。データをＦＡＣＳアナライザーソフトウェアで分析した（データは図示せず）。
【0123】
この実験は、ＣＤ７３が、ドーパミン作動性ニューロンの低酸素誘発性損傷および毒素誘発性損傷の両方の後に上方制御され、隣接するＭＳＣおよびＨＳＣからのＴＮＴ突出およびミトコンドリア移動を誘発することを示す。損傷したドーパミン作動性ニューロンへのＴＮＴ突出およびミトコンドリアの移動を活性化するＣＤ７３の役割は、事前に観察または公表されていない。
【0124】
本発明は、ＣＤ７３が損傷したドーパミン作動性ニューロンの再生を媒介することをさらに示す。上記の実験の所見は、幹細胞が損傷したニューロン上でＣＤ７３を上方制御することを実証した。ＣＤ７３またはＡ２Ａ受容体活性がＭＳＣまたはＨＳＣ媒介性再生に関与するかどうかを調べるために以下の実験を行った。この目的のために、切断カスパーゼ３発現によって測定されるように、ＣＤ７３またはＡ２Ａ受容体活性の阻害剤がニューロンの再生をブロックするかどうかを評価した。
【0125】
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）（１×Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）中の、５０ｕｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコーティングしたＴ２５組織培養フラスコ内で１０継代未満に維持した。実験のために、ＴｒｙＰＬＥを使用してＬＵＨＭＥＳ細胞を解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした６ウェル組織培養処理プレート中にウェル当たり７×１０５細胞で播種した。翌日、培地を分化培地（１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）、および２ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ｂＦＧＦを欠く完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地）と交換した。分化の２日目に、新鮮な分化培地中のポリオルニチン／フィブロネクチンでプレコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり３０万細胞で再播種した。分化の６日目に、細胞を示された濃度の６－ＯＨＤＡで４５分間処理し、洗浄し、ＰＫＨ２６で標識したＵＣＢ ＭＳＣおよびＵＣＢ ＣＤ１３３＋ＨＳＣと示された比率で共培養し、７２時間インキュベートした。次いで、細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、ウサギ切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：４００）およびマウスＴｕｊ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：４００）で、一晩４℃で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間室温で染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡の４０倍対物レンズで撮像した（画像は図示せず）。全ての画像をスタックに組み合わせ、半径５０でバックグラウンド減算を適用することにより全ての画像を同じ様式で処理してＩｍａｇｅＪのバックグラウンドを除去し、ノイズを除去するためにスペックル除去した。データは、１つの実験からの少なくとも４つの画像フィールドからのｎ＞５０細胞の分析の平均の平均＋／－標準偏差を表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアを使用して、マンホイットニーＵ検定により統計学的有意性を決定した。
【0126】
ＰＫＨ２６標識のために、ＭＳＣをＰＢＳ中で洗浄し、ＰＫＨ２６染色キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＰＫＨ２６で染色した。ＭＳＣを０．１ｍＬの希釈剤Ｃに再懸濁した。２ｕｌのＰＫＨ２６色素を１ｍＬの希釈剤Ｃに希釈し、０．１ｍＬをＭＳＣに加えた。５分後、ＭＳＣ培地（ＩＭＤＭ完全培地中の１０％ＨＳ）の添加により標識をクエンチした。細胞を、ＭＳＣ培地中で２回洗浄し、ＬＵＨＭＥＳ完全培地中に再懸濁した。次いで、示された比率でＭＳＣをＬＵＨＭＥＳ細胞と共培養した。
【0127】
図９Ａ～図９Ｂによって要約されるように、ＣＤ７３およびＡ２Ａ受容体の阻害剤は、それぞれ、ＭＳＣまたはＨＳＣのいずれかによる再生を著しく損なった。これらのデータは、養子細胞ＭＳＣ／ＨＳＣ神経再生の主要な機構が、直接的な細胞間相互作用を必要とし、任意のかなりの程度まではパラクリン機構を介して媒介されないことを示す。さらに、直接的な細胞間相互作用を介したニューロン再生の主要な機構は、受動的な事象ではなく、むしろ能動的であり、さらに、ＭＳＣ／ＨＳＣからのＴＮＴ突出およびミトコンドリア移動を開始するシグナル伝達経路は、損傷したドーパミン作動性ニューロンにおけるＲＯＳの即時上方制御、ならびにＣＤ７３およびＡ２Ａ受容体の活性化を含む。
【0128】
本発明は、１）ＭＳＣおよびＨＳＣの相乗的な神経栄養および血管新生効果、ならびに２）幹細胞治療とＤＢＳとを組み合わせることによって、ドーパミン作動性機能および運動障害のＭＳＣおよびＨＳＣ媒介による部分回復を提供する。
【0129】
本発明は、ＭＳＣおよびＨＳＣの併用投与がインビトロでのニューロン生存に利益をもたらし、それらを実行可能な細胞治療の前臨床候補として確立することを提供する。本発明は、ＰＤドーパミン作動性細胞損傷のインビトロモデル系において神経保護を増強する方法として、組み合わせたＭＳＣ／ＨＳＣ治療を提供する。記載されるデータおよび図に示されるように、モデル神経毒素６－ＯＨＤＡは、早期損傷マーカーであるカスパーゼ３の活性化を誘導し、ＬＵＨＭＥＳニューロンにおける神経突起の構造的完全性を損なう。ニューロン損傷後のＵＣＢ ＭＳＣの添加は、ニューロンのカスパーゼ活性化を著しく低減し、神経突起構造の保存を増強する。それにもかかわらず、ＭＳＣ単独では、ニューロン損傷を完全に抑制することはできない。しかしながら、興味深いことに、ＨＳＣをＭＳＣと一緒に加えると、ニューロン保護が劇的に増強される。再生は、パラクリン機構と直接的な細胞間相互作用の両方を介して行われる。直接的な細胞間相互作用は、ＭＳＣおよびＨＳＣからニューロンへのＴＮＴおよびミトコンドリア移動を介する。ＲＯＳは、ＴＮＴ形成およびミトコンドリア移動を駆動する主要な機構である。ＣＤ７３シグナル伝達は、ＴＮＴ形成、ミトコンドリア移動、およびニューロン再生を媒介する。
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１４．Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １０，１０５－１０７（２００８）．
１５．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｌ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．ＵＣ ｂｌｏｏｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ９，４－１３（２００７）．
１６．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．＆Ｐｏｍｐｉｌｉ，Ｖ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４２，９１２－９２０（２００７）．
１７．Ｇｒｅｃｏ，Ｎ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ６６０，２９－５２（２０１０）．
１８．Ｔｓｅ，Ｗ．，Ｂｕｎｔｉｎｇ，Ｋ．Ｄ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５，２７９－２８４（２００８）．
１９．Ｔｓｅ，Ｗ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｐｔｉｏｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ，３７７－３８３（２００５）．
２０．Ｉｎｄｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｒｏｔｅｎｏｎｅ－ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ９１，６２－７２（２０１３）．
２１．Ｌｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＭＰＴＰ－ｍｉｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １８，９７０－９８１（２０１３）．
２２．ｖａｎ Ｈｏｒｎｅ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｕｒｇｅｒｙ：１－ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ，ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１－１２（２０１８）．
２３．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ３０，１９０－１９５（２０１５）．
２４．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｒｇｉｎｇ ＤＢＳ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：”ｈｙｂｒｉｄ” ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｓ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３，１５０５１（２０１６）．
２５．Ｆｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｐｉｎｈｏ，Ｓ．，Ｌｕｃａｓ，Ｄ．＆Ｓｃｈｅｉｅｒｍａｎｎ，Ｃ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｋｅｙｓｔｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ａｎｄ ａ ｓｔｅｐｐｉｎｇ－ｓｔｏｎｅ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３１，２８５－３１６（２０１３）．
２６．Ｔｈａｎｖｉ，Ｂ．，Ｌｏ，Ｎ．＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ－－ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ｐｅｏｐｌｅ．Ａｇｅ ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ ３４，１１４－１１９（２００５）．
２７．Ｇｕｐｔａ，Ｄ．＆Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ，Ａ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：ｗｈａｔ ｍａｋｅｓ ｉｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ？Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ８７，８２９－８３６（２０１１）．
２８．ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｌｓｔ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｍａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：Ｔｈｅ ＲＵＮ ＤＭＣ ｓｔｕｄｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８５，１５６９－１５７７（２０１５）．
２９．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７，１－６（２００１）．
３０．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ－ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４４，１８１５－１８２２（２００１）．
３１．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５１，２２６５－２２７５（２００４）．
３２．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｏｓｔ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，２１５－２１９（１９９８）．
３３．Ｌｏｔｈａｒｉｕｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，３８８８４－３８８９４（２００２）．
３４．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｄ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＬＵＨＭＥＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１９，９５７－９７１（２０１１）．
３５．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｍ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｈ．Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＬＵＨＭＥＳ ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ３５，９４５－９５６（２０１４）．
３６．Ｈａｒｒｉｓ，Ｇ．，Ｈｏｇｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｔ．＆Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｌ．３Ｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＵＨＭＥＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｌａｙｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ７３，１１ ２３ １１－１１ ２３ ２８（２０１７）．
３７．Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ＬＵＨＭＥＳ ３Ｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ９０，２７２５－２７４３（２０１６）．
３８．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｃｕｅｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ８，３５４（２０１８）．
３９．Ａｃｑｕｉｓｔａｐａｃｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｐｒｏｇｒａｍ ａｄｕｌｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏｗａｒｄ ａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐａｒｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２９，８１２－８２４（２０１１）．
４０．Ｂａｂｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｒｏ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ＭＭＳＣ）ｔｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３（２０１８）．
４１．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１６，４０６２７８９（２０１６）．
４２．Ｃｈｏ，Ｙ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｖｉｒｔｕａｌｌｙ ｎｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｔＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７，ｅ３２７７８（２０１２）．
４３．Ｈａｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｃｕｅ ｉｎｊｕｒｅｄ Ｈ９ｃ２ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｐｏｒｔｓ １３，１５１７－１５２４（２０１６）．
４４．Ｌｉｎ，Ｈ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃａｐｔｕｒｅｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ２２，３１－４４（２０１５）．
４５．Ｍａｈｒｏｕｆ－Ｙｏｒｇｏｖ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｅｎｓｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｄａｍａｇｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｃｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２４，１２２４－１２３８（２０１７）．
４６．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｋｈｌｅ，Ｊ．，Ｇｒｉｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｅ．＆Ｖｉｇｎａｉｓ，Ｍ．Ｌ．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｂｏｔｈ ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅｒｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ，１－２５（２０１８）．
４７．Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１１（２０１８）．
４８．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｏｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５３５，５５１－５５５（２０１６）．
４９．Ｄｕ，Ｆ．，Ｙｕ，Ｑ．，Ｃｈｅｎ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．＆Ｙａｎ，Ｓ．Ｓ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ Ａｔｔｅｎｕａｔｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １０，３６６－３７４（２０１８）．
５０．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗ．Ｄ．＆Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｗ．Ｄ．，Ｊｒ．Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ １１，１１６－１２８（１９９０）．
５１．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｌｏｃｋ－Ｆａｃｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ（２０１６）．
参考文献：
１．Ｗｒｉｇｈｔ Ｗｉｌｌｉｓ，Ａ．，Ｅｖａｎｏｆｆ，Ｂ．Ａ．，Ｌｉａｎ，Ｍ．，Ｃｒｉｓｗｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．＆Ｒａｃｅｔｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ｅｔｈｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＵＳ Ｍｅｄｉｃａｒｅ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｒｉｅｓ．Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ３４，１４３－１５１（２０１０）．
２．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．ｏｒｇ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ－Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ：Ｃａｕｓｅｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．［ｏｎｌｉｎｅ］Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．ｏｒｇ／Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ－Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ／Ｃａｕｓｅｓ－ａｎｄ－Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－［Ａｃｃｅｓｓｅｄ １０ Ｏｃｔ ２０１８］．（２０１８）．
３．Ｐｏｅｗｅ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ３，１７０１３（２０１７）．
４．Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．＆Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｈｏｗ ｄｉｄ ｉｔ ｈａｐｐｅｎ？Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ７，Ｓ２１－Ｓ３１（２０１７）．
５．Ｆｕ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ ４，５９７（２０１５）．
６．Ｎａｇａｍｕｒａ－Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．＆Ｈｅ，Ｈ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅｉｒ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ．Ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ６，１９５－２０２（２０１４）．
７．Ｊｏｒｄｅｎｓ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｉｇｉｏｕｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌａｗ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９，４９７－５１１（２０１２）．
８．Ｇｕｇｌｉａｎｄｏｌｏ，Ａ．，Ｂｒａｍａｎｔｉ，Ｐ．＆Ｍａｚｚｏｎ，Ｅ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６５，５１－６０（２０１７）．
９．Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｔ．，Ｋａｍｅｄａ，Ｍ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｔａｊｉｒｉ，Ｎ．＆Ｄａｔｅ，Ｉ．Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２６，１５５１－１５５９（２０１７）．
１０．Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，Ａ．＆ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｃ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ １７，１１－２２（２０１５）．
１１．Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １０２，１９９－２０９（２０００）．
１２．Ｆｉｎｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｒｓｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １２，５８５－５９３（２００６）．
１３．Ｆｉｎｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＣＤ１３３（＋）ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １２，６７－７８（２０１０）．
１４．Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １０，１０５－１０７（２００８）．
１５．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｌ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．ＵＣ ｂｌｏｏｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ９，４－１３（２００７）．
１６．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．＆Ｐｏｍｐｉｌｉ，Ｖ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４２，９１２－９２０（２００７）．
１７．Ｇｒｅｃｏ，Ｎ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ６６０，２９－５２（２０１０）．
１８．Ｔｓｅ，Ｗ．，Ｂｕｎｔｉｎｇ，Ｋ．Ｄ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５，２７９－２８４（２００８）．
１９．Ｔｓｅ，Ｗ．＆Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｐｔｉｏｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ，３７７－３８３（２００５）．
２０．Ｉｎｄｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｒｏｔｅｎｏｎｅ－ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ９１，６２－７２（２０１３）．
２１．Ｌｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＭＰＴＰ－ｍｉｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １８，９７０－９８１（２０１３）．
２２．ｖａｎ Ｈｏｒｎｅ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｕｒｇｅｒｙ：１－ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ，ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１－１２（２０１８）．
２３．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ３０，１９０－１９５（２０１５）．
２４．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｒｇｉｎｇ ＤＢＳ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：”ｈｙｂｒｉｄ” ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｓ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３，１５０５１（２０１６）．
２５．Ｆｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｐｉｎｈｏ，Ｓ．，Ｌｕｃａｓ，Ｄ．＆Ｓｃｈｅｉｅｒｍａｎｎ，Ｃ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｋｅｙｓｔｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ａｎｄ ａ ｓｔｅｐｐｉｎｇ－ｓｔｏｎｅ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３１，２８５－３１６（２０１３）．
２６．Ｔｈａｎｖｉ，Ｂ．，Ｌｏ，Ｎ．＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ－－ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ｐｅｏｐｌｅ．Ａｇｅ ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ ３４，１１４－１１９（２００５）．
２７．Ｇｕｐｔａ，Ｄ．＆Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ，Ａ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：ｗｈａｔ ｍａｋｅｓ ｉｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ？Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ８７，８２９－８３６（２０１１）．
２８．ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｌｓｔ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｍａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：Ｔｈｅ ＲＵＮ ＤＭＣ ｓｔｕｄｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８５，１５６９－１５７７（２０１５）．
２９．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７，１－６（２００１）．
３０．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ－ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４４，１８１５－１８２２（２００１）．
３１．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５１，２２６５－２２７５（２００４）．
３２．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｏｓｔ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，２１５－２１９（１９９８）．
３３．Ｌｏｔｈａｒｉｕｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，３８８８４－３８８９４（２００２）．
３４．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｄ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＬＵＨＭＥＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１９，９５７－９７１（２０１１）．
３５．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｍ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｈ．Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＬＵＨＭＥＳ ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ３５，９４５－９５６（２０１４）．
３６．Ｈａｒｒｉｓ，Ｇ．，Ｈｏｇｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｔ．＆Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｌ．３Ｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＵＨＭＥＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｌａｙｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ７３，１１ ２３ １１－１１ ２３ ２８（２０１７）．
３７．Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ＬＵＨＭＥＳ ３Ｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ９０，２７２５－２７４３（２０１６）．
３８．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｃｕｅｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ８，３５４（２０１８）．
３９．Ａｃｑｕｉｓｔａｐａｃｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｐｒｏｇｒａｍ ａｄｕｌｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏｗａｒｄ ａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐａｒｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２９，８１２－８２４（２０１１）．
４０．Ｂａｂｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｒｏ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ＭＭＳＣ）ｔｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３（２０１８）．
４１．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１６，４０６２７８９（２０１６）．
４２．Ｃｈｏ，Ｙ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｖｉｒｔｕａｌｌｙ ｎｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｔＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７，ｅ３２７７８（２０１２）．
４３．Ｈａｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｃｕｅ ｉｎｊｕｒｅｄ Ｈ９ｃ２ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｐｏｒｔｓ １３，１５１７－１５２４（２０１６）．
４４．Ｌｉｎ，Ｈ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃａｐｔｕｒｅｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ２２，３１－４４（２０１５）．
４５．Ｍａｈｒｏｕｆ－Ｙｏｒｇｏｖ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｅｎｓｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｄａｍａｇｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｃｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２４，１２２４－１２３８（２０１７）．
４６．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，Ｎａｋｈｌｅ，Ｊ．，Ｇｒｉｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｅ．＆Ｖｉｇｎａｉｓ，Ｍ．Ｌ．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｂｏｔｈ ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅｒｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ，１－２５（２０１８）．
４７．Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１１（２０１８）．
４８．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｏｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５３５，５５１－５５５（２０１６）．
４９．Ｄｕ，Ｆ．，Ｙｕ，Ｑ．，Ｃｈｅｎ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．＆Ｙａｎ，Ｓ．Ｓ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ Ａｔｔｅｎｕａｔｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １０，３６６－３７４（２０１８）．
５０．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗ．Ｄ．＆Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｗ．Ｄ．，Ｊｒ．Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ １１，１１６－１２８（１９９０）．
５１．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｌｏｃｋ－Ｆａｃｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ（２０１６）．
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】