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特表2022-517803Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質標的
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-10
(54)【発明の名称】Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質標的
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220303BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220303BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220303BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220303BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220303BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 D
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021541248
(86)(22)【出願日】2020-01-15
(85)【翻訳文提出日】2021-09-10
(86)【国際出願番号】 EP2020050861
(87)【国際公開番号】W WO2020148310
(87)【国際公開日】2020-07-23
(31)【優先権主張番号】19152337.2
(32)【優先日】2019-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ヤーガジア，ラヴィ
(72)【発明者】
【氏名】パンディア，ニクヒル・ヤナーク
(72)【発明者】
【氏名】ダンクリー，トーマス・ピーター・ジョン
(72)【発明者】
【氏名】コスタ，ヴェロニカ
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB30
2G045DA36
2G045FB03
(57)【要約】
本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質標的およびｕｂｅ３ａ発現を調節する化合物に対する標的関与のバイオマーカーとしてのそれらの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を測定するための方法であって、ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、ステップと、を含む、方法。
【請求項2】
ステップｂ）で測定された前記タンパク質のタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を測定するための請求項１または２に記載の方法であって、ａ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、ステップと、を含む、方法。
【請求項4】
ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法であって、ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、ステップと、を含む、方法。
【請求項5】
前記タンパク質が、ＴＣＡＦ１およびＰＥＧ１０から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記組織試料が、血液試料、血漿試料、またはＣＳＦ試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記タンパク質発現レベルが、ウエスタンブロッティング、ＭＳ、またはイムノアッセイを使用して測定される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＵＢＥ３Ａ調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＵＢＥ３Ａ調節因子が、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、または１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を同定するためのスクリーニング方法であって、ａ）試験化合物で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、ステップと、を含む、方法。
【請求項11】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節のためのバイオマーカーとしての、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、およびＴＣＡＦ１からなる群から選択されるタンパク質の使用。
【請求項12】
前記タンパク質が、ＴＣＡＦ１およびＰＥＧ１０から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記ＵＢＥ３Ａの調節が、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子によるものである、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項14】
前記ＵＢＥ３Ａバイオマーカーのタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項15】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項16】
前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項17】
前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子が、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、または１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質レベルが増加または減少すると、タンパク質発現レベルが調節される新規バイオマーカー、および薬物開発におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
アンジェルマン症候群は、重度の知的および発達障害、睡眠障害、てんかん発作、ぎくしゃくした動き、ＥＥＧ異常、頻繁な笑いまたは笑顔、および深刻な言語障害を特徴とする。アンジェルマン症候群は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子、ひいては母性遺伝染色体１５ｑ１１．２上のタンパク質の欠失または不活性化によって引き起こされる神経遺伝学的障害である。一方、Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、染色体１５ｑ１１－１３．１の重複に起因する臨床的に同定可能な症候群である。Ｄｕｐ１５ｑ症候群では、ＵＢＥ３Ａの過剰発現がある。アンジェルマン症候群（ＡＳ）では、Ｅ３ユビキチンリガーゼＵＢＥ３Ａのニューロン喪失が、過剰な重度の神経障害をもたらす。
【0003】
ＵＢＥ３Ａのニューロン喪失はＡＳを引き起こすが、下流の分子および細胞機能障害の知識は不足している。関連するＵＢＥ３Ａ基質の同定は、健康および疾患におけるＵｂｅ３ａ機能の役割のより良い理解をもたらし、ＵＢＥ３Ａ機能をモニターするための薬物およびバイオマーカーの両方の発見を支援する。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質レベルが増加または減少し、さらに一部がＵＢＥ３Ａとタンパク質複合体を形成している場合に、タンパク質発現が調節される新規バイオマーカーに関する。これらには、タンパク質ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤが含まれる。ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０は、ＧＡＧカプシドドメインを含むＬＴＲレトロトランスポゾン由来遺伝子であり、ＰＥＧ１０はエキソソーム中に見出される。本発明はさらに、アンジェルマン症候群、１５ｑｄｕｐ症候群、および他の自閉症スペクトラム障害を含む、ＵＢＥ３Ａを標的とする疾患のための医薬処置のための、これらのタンパク質に基づくＵＢＥ３Ａ活性の検出のための医薬バイオマーカーおよび方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】タンパク質ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤを含む新規Ｕｂｅ３ａ標的の同定。
【図1A】対照（対照１）およびＡＳ株（患者１、３）から出発し、対照株ではＵＢＥ３ＡセンスターゲティングＬＮＡ（センス）処理を行い、ＡＳ株ではＵＢＥ３Ａ ＡＴＳターゲティングＬＮＡ処理を行い、神経分化の過程にわたって２週間または６週間処理を行った神経分化の実験計画の概略図。
【図1B】ＴＭＴ－ＭＳ３実験のために使用した細胞溶解物に対するＵＢＥ３Ａのウエスタンブロッティング（上）。２週間および６週間のＬＮＡ処理を伴い、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒから得られたＵＢＥ３Ａの、スケール化された存在量のプロットは、ＬＮＡ処理のＵＢＥ３Ａノックダウンおよび回復を明らかにする。
【図1C】対照およびＡＳ株におけるＵＢＥ３Ａレベルに関して逆調節されたタンパク質の、スケール化された存在量のヒートマップ（ＡＳ ｄｅｌ、ＡＳ ｐｔ）。
【図2】ＳＲＭによるＵＢＥ３Ａ標的としてのＰＥＧ１０およびＴＣＡＦ１の確認 対照およびＡＳ細胞におけるＵＢＥ３Ａ、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２特異的ペプチド、ＰＥＧ１０－ＲＦ１ペプチド、およびＴＣＡＦ１のＳＲＭ定量化。ＮＡは無処理を指し、ＮＴは非標的ＬＮＡ処理、センス：ＵＢＥ３ＡセンスＬＮＡ処理、およびＡＴＳ：ＵＢＥ３Ａ ＡＴＳ ＬＮＡ処理を指す。（対照用の株ｎ＝２、ＡＳ用ｎ＝３、それぞれ３つの分化）
【図3】ウエスタンによるＵＢＥ３Ａ標的としてのＰＥＧ１０の確認。処理なし（ＮＡ）、非標的化ＬＮＡ処理（ＮＴ）、およびセンス／ＡＴＳ処理のいずれかを伴う、対照およびＡＳニューロンの溶解物におけるＵＢＥ３Ａ、ＰＥＧ１０、およびＡＣＴＢについてのウエスタンブロッティングはそれぞれ、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２アイソタイプについての堅固なＵＢＥ３Ａ依存的逆関係を示す。
【図4A】対照およびＡＳニューロンにおけるＰＥＧ１０ ＲＦ１／２、対照ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａノックダウン（Ｓｅｎｓｅ）、ならびにＡＳニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ回復（ＡＴＳ）の代表的な免疫染色。
【図4B】対照におけるＰＥＧ１０強度、ならびに対照およびＡＳニューロンにおけるＡＳ ＨｕＣＤ陽性ニューロンの定量化（データ点は、対照およびＡＳ細胞の２つの独立した神経分化からの個々のニューロンであり、Ｐ値は、Ｄｕｎｎの多重比較検定に基づいて多重比較のために調整される）。
【図5A】左：ＵＢＥ３Ａノックダウン（センス）ありおよびなしにおいて、プロテアソーム阻害（ＭＧ１３２、１０ｍＭ）の時間経過（０、４、および８時間）でのＵＢＥ３ＡおよびＰＥＧ１０発現のウエスタンブロッティング分析。右：プロテアソーム阻害によるＵＢＥ３ＡおよびＰＥＧ１０ ＲＦ１／２発現の定量化。（ｎ＝３の独立した実験、Ｐ値：Ｄｕｎｎの多重比較検定、多重検定用に調整）
【図5B】対照、ＡＳ、およびＡＳ＋ＡＴＳ処理におけるプロテアソーム阻害（ＭＧ１３２、１０ｍＭ、６時間）処理下でのＵＢＥ３Ａ ＩＰのウエスタンブロッティング分析。赤色の点は、ＭＧ１３２処理によって安定化されたＰＥＧ１０－ＵＢＥ３Ａ複合体を表す。
【図5C】左：プロテアソーム阻害（ＭＧ１３２、１０ｍＭ、６時間）を伴う、対照、ＡＳ、ＡＳ＋ＡＴＳ処理におけるＰＥＧ１０ ＩＰによるＰＥＧ１０ユビキチン化のウエスタンブロッティング分析。右：ＰＥＧ１０ユビキチン化の定量化。（ｎ＝３の独立した実験、Ｐ値：Ｄｕｎｎの多重比較検定、多重検定用に調整、）
【図6A】ＩＰＳＣニューロンからの細胞外小胞（ＥＶ）の単離のためのスキーム。
【図6B】ＡＳ細胞由来のＥｖにおけるＰＥＧ１０ ＲＦ１／２およびＴＳＧ１０１の代表的な免疫ＥＭ測定（倍率：１５，０００倍、インサート４倍ズーム、スケールバー：２００ｎｍ）。
【図6C】対照およびＡＳ細胞からのＰＥＧ１０ ＲＦ１／２陽性Ｅｖの定量化（ｎ＝３の独立したＥＶ調製物、ｐ値：マン・ホイットニー検定）。
【図6D】対照およびＡＳ溶解物におけるＰＥＧ１０およびその結合タンパク質ならびに選択されたＥＶマーカーのＬＣ－ＭＳヒートマップ（値は、Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔから得られた遺伝子レベル強度であり、３つの独立した溶解物およびＥＶ調製物の平均である）。
【図6E】溶解物およびＥｖについて等しい総タンパク質を負荷した、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２およびＡＴＸＮ１０、ならびにＥＶマーカーの免疫ブロッティング分析。
【発明を実施するための形態】
【0006】
第１の態様では、本発明は、組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を測定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、およびＴＣＡＦ１、ＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照試料中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照試料中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、ステップと、を含む、方法を提供する。
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、およびＴＣＡＦ１、ＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照試料中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照試料中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、ステップと、を含む、方法を提供する。
【0007】
本発明の方法のある実施形態では、ステップｂ）で測定されたタンパク質のタンパク質発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する。
【0008】
特定の実施形態では、方法は、組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を測定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
ａ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
【0009】
特定の実施形態では、方法は、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
【0010】
特定の実施形態では、タンパク質は、ＴＣＡＦ１およびＰＥＧ１０から選択される。
【0011】
特定の実施形態では、組織試料は、血液試料、血漿試料、またはＣＳＦ試料である。
【0012】
特定の実施形態では、タンパク質発現レベルは、ウエスタンブロッティング、ＭＳ、またはイムノアッセイを使用して測定される。
【0013】
特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0014】
特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、または１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子である。
【0015】
第２の態様では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）試験化合物で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
ａ）試験化合物で処理された、動物または細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１種のタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップであって、前記対照中の前記少なくとも１種のタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１種のタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、ステップと、を含む、方法に関する。
【0016】
第３の態様では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節のためのバイオマーカーとしての、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＰＰＩＤからなる群から選択されるタンパク質の使用に関する。
【0017】
本発明の使用の特定の実施形態では、タンパク質は、ＴＣＡＦ１およびＰＥＧ１０から選択される。
【0018】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａの調節は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子によるものである。
【0019】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａバイオマーカーのタンパク質発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する。
【0020】
本発明の使用の特定の実施形態では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法を提供する。
【0021】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0022】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子は、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、または１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの誘導因子である。
【0023】
定義
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別段示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「全長」、未処理のタンパク質、および細胞中での処理から生じるタンパク質の任意の形態、ならびに天然タンパク質に由来するペプチドを包含する。この用語はまた、天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントを包含する。表２に示すアミノ酸配列は、本発明のバイオマーカータンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別段示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「全長」、未処理のタンパク質、および細胞中での処理から生じるタンパク質の任意の形態、ならびに天然タンパク質に由来するペプチドを包含する。この用語はまた、天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントを包含する。表２に示すアミノ酸配列は、本発明のバイオマーカータンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
【0024】
本発明では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子とは、ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを低下または増強することができる分子を指す。ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを低下させることができる調節因子をＵＢＥ３Ａ阻害剤と称し、ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを増強することができる調節因子をＵＢＥ３Ａエンハンサーと称する。ＵＢＥ３Ａ調節因子は、ｍＲＮＡ干渉ＲＮＡ分子であり得る。別の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない、任意の種類のＲＮＡであり得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。本発明に適したｄｓＲＮＡ分子の設計および作出は、特にＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、およびＷＯ０１／３４８１５を参照して、当業者の技術の範囲内である。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと同一の約１９～２３個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。「ｓｈＲＮＡ」という用語は、同じＲＮＡ分子上の相補的配列と約５０ヌクレオチド未満が対合し、その配列および相補的配列が少なくとも約４～１５ヌクレオチドの不対合領域（２つの塩基相補的領域によって生成されるステム構造上で一本鎖ループを形成）によって分離されているｓｉＲＮＡ分子を指す。十分に確立されたｓｉＲＮＡ設計基準がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅら、２００１を参照されたい）。
【0025】
ＵＢＥ３Ａ調節因子は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、基本的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間デュプレックス構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間のデュプレックス）を形成できることが理解される。
【0026】
「対照試料」という用語は、ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理されていない試料を指す。例えば、対照試料は、ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理されていない細胞培養物の試料であるか、または細胞培養物が、ＵＢＥ３Ａ調節因子でない化合物で処理されている（陰性対照）。
【0027】
結果
ＡＳ患者および健常対照のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンに対して、タンパク質プロファイリングを行った。ＵＢＥ３Ａおよびタンパク質ならびに経路を、患者株にわたって脱調節した。ＡＳＯを使用して、センス転写物またはアンチセンス転写物をそれぞれノックダウンすることによって、対照株のＵＢＥ３Ａタンパク質を減少させるか、または患者株のＵＢＥ３Ａタンパク質を回復させることにより、これらのタンパク質のサブセットを相互に調節した。これらのＵＢＥ３Ａ依存性タンパク質には、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＰＰＩＤ、およびＴＣＡＦ１が含まれる。ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０は、エキソソームの生理学において機能を有し得る、ＧＡＧカプシドドメインを含むＬＴＲレトロトランスポゾン由来遺伝子のＬＴＲである。
ＡＳ患者および健常対照のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンに対して、タンパク質プロファイリングを行った。ＵＢＥ３Ａおよびタンパク質ならびに経路を、患者株にわたって脱調節した。ＡＳＯを使用して、センス転写物またはアンチセンス転写物をそれぞれノックダウンすることによって、対照株のＵＢＥ３Ａタンパク質を減少させるか、または患者株のＵＢＥ３Ａタンパク質を回復させることにより、これらのタンパク質のサブセットを相互に調節した。これらのＵＢＥ３Ａ依存性タンパク質には、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＰＰＩＤ、およびＴＣＡＦ１が含まれる。ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０は、エキソソームの生理学において機能を有し得る、ＧＡＧカプシドドメインを含むＬＴＲレトロトランスポゾン由来遺伝子のＬＴＲである。
【0028】
図１：タンパク質ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＦＡＭ１２７Ａ、ＦＡＭ１２７Ｂ、ＦＡＭ１２７Ｃ、ＰＥＧ１０、ＰＰＩＤ、およびＴＣＡＦ１を含む新規Ｕｂｅ３ａ標的の同定
【0029】
Ｕｂｅ３ａタンパク質レベルの変化に応答して調節されるタンパク質を同定するために、本発明者らは、Ｕｂｅ３ａ ＡＴＳ標的配列をノックダウンすることによって、対照ＩＰＳＣ由来ニューロンにおけるＵｂｅ３ａノックダウンおよびＡＳ株におけるＵｂｅ３ａ発現の増加を行った。細胞ペレットを、ＴＭＴ－ＳＰＳ－ＭＳ３定量を使用して、タンパク質発現プロファイリングにさらに供した。ＴＭＴ－ＭＳ３データをｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１で分析し、結果の表をさらに統計分析に供し、対照ニューロンにおけるＵｂｅ３ａノックダウン時に上方制御されるタンパク質およびＡＳ細胞におけるＵｂｅ３ａの回復時に下方制御されるタンパク質についてフィルタにかけることによって、Ｕｂｅ３ａレベルの変化時に調節されるタンパク質を得た（図１）。
【0030】
図２：ＳＲＭによるＵＢＥ３Ａ標的としてのＰＥＧ１０およびＴＣＡＦ１の確認
【0031】
選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（Ｄｕｎｋｌｅｙら）を、以下のタンパク質のそれぞれにマッピングする固有のペプチド（各タンパク質について少なくとも１つのペプチド）を使用して、ショートリストに挙げられたタンパク質、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＤＳＴ、ＨＥＲＣ２、ＵＣＨＬ５、ＨＥＲＣ１、ＭＣＦ２Ｌ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、ＵＢＥ３Ａに対して設定した。ＳＲＭは、上と同じ処理（対照細胞におけるＵｂｅ３ａノックダウンおよびＡＳ細胞におけるＵｂｅ３ａの回復）の後、２つの対照株および３つのＡＳ株を使用して行った。図２は、ＵＢＥ３Ａレベルの変化に対して逆調節を示す、ＵＢＥ３Ａ、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１の棒グラフを示す。
【0032】
図３：ＷＢによるＵＢＥ３Ａ標的としてのＰＥＧ１０およびＴＣＡＦ１の確認
【0033】
ＰＥＧ１０が、ＵＢＥ３Ａによる制御に関して何らかのアイソフォーム特異性を示すかどうかを判定するために、本発明者らは、対照およびＡＳ細胞におけるＰＥＧ１０およびＵＢＥ３Ａに対して、ウエスタンブロッティングを行った。ＰＥＧ１０アイソフォームＲＦ１／２は、ＵＢＥ３Ａ依存的様式で最も劇的に制御されることが観察されたが、ＰＥＧ１０ ＲＦ１は、ＵＢＥ３Ａレベルの変化時にほとんど変化しなかった（図３）。
【0034】
図４：免疫細胞化学を使用して、ＰＥＧ１０がＵＢＥ３Ａによって制御されることの実証
【0035】
図４Ａ：ＲＦ １／２を特異的に認識する抗体を使用して、本発明者らは、ＰＥＧ１０発現がニューロン特異的（ＨｕＣＤと共局在）であり、ＵＢＥ３Ａノックダウン時に上昇し、ＡＳニューロンにおいて上昇し、ＵＢＥ３Ａの回復によって復活することを確認した。ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２は、神経細胞体における大部分が拡散した染色を示す。
【0036】
図４Ｂ：対照におけるＰＥＧ１０強度、ならびに対照およびＡＳニューロンにおけるＡＳ ＨｕＣＤ陽性ニューロンの定量化（データ点は、対照およびＡＳ細胞の２つの独立した神経分化からの個々のニューロンであり、Ｐ値は、Ｄｕｎｎの多重比較検定に基づいて多重比較のために調整される）。
【0037】
図５：ＰＥＧ１０およびＵＢＥ３Ａは、タンパク質複合体を形成することができ、ＰＥＧ１０は、ユビキチン化依存的にＵＢＥ３Ａによって制御されることの実証。
【0038】
ＵＢＥ３Ａ下方制御時のＰＥＧ１０の過剰発現が、プロテアソーム依存性であるかどうかを評価するために、本発明者らは、対照ニューロンおよびＵＢＥ３Ａノックダウン（センス）時において、プロテアソーム阻害（ＭＧ１３２）時間の増加の下で、ＰＥＧ１０の免疫ブロッティングを行った（図５Ａ）。抗Ｋ４８ Ｕｂによる免疫ブロッティングにより、ＭＧ１３２処理によるポリユビキチン化タンパク質の確実な増加が明らかになった（図５Ａ、上）。ＭＧ１３２処理は、ＭＧ１３２処理の８時間以内にＵＢＥ３Ａ発現を有意には変化させなかった。予想通り、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２の発現は、ＵＢＥ３Ａノックダウンで増加した。ＭＧ１３２の４および８時間では、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２発現の確実な増加が観察されたが、ＵＢＥ３Ａノックダウン下では、ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２の大幅な増加は観察されなかった（図５Ａ、右側の定量）。次に、本発明者らは、標準（ＤＭＳＯ）またはＭＧ１３２処理下の、対照、ＡＳ、およびＵＢＥ３Ａを回復させた（ＡＳ＋ＡＴＳ）細胞におけるＵＢ３Ａに対して、免疫沈降を行い、続いて、ＵＢＥ３ＡおよびＰＥＧ１０に対してウエスタンブロッティングを行った。対照細胞ではＵＢＥ３ＡのＰＥＧ１０濃縮は見られなかったが、ＡＳ細胞の残留ＵＢＥ３Ａは、ＰＥＧ１０への結合を示し、これはＡＴＳ処理で減少した。プロテアソーム阻害下において、本発明者らは、すべての条件下でＰＥＧ１０－ＵＢＥ３Ａ複合体の濃縮を観察した（図５Ｂ、赤色の星印）。これに一致して、ＰＥＧ１０ ＩＰ－ＷＢは、ＭＧ１３２処理の対照ニューロンにおいてＰＥＧ１０ポリユビキチン化スメアを示し、これは、高いＰＥＧ１０レベルにもかかわらずＡＳニューロンにおいて減少し、ＵＢＥ３Ａ復活（ＡＴＳ ＬＮＡ）によって復活した（図５Ｃ）。
【0039】
図６：ＰＥＧ１０は、アンジェルマンニューロンから細胞外小胞に分泌される。
【0040】
ウイルスと同様に、ＰＥＧ１０を細胞外小胞（ＥＶ）中に分泌することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、対照およびＡＳニューロンから細胞外小胞を単離した（図６Ａ）。図６Ｂ：免疫電子顕微鏡（免疫ＥＭ）を使用して、本発明者らは、ＡＳニューロン由来のＥＶにおいて、標準的なＥＶマーカーＴＳＧ１０１およびＰＥＧ１０ ＲＦ１／２の存在を確認した。図６Ｃ：免疫ＥＭを使用して、対照およびＡＳニューロン由来のＥＶの定量化により、対照の６．２６（±１．６８ｓ．ｅ．ｍ）とは対照的に、ＡＳ ＥＶの２０．７３（±１．２７ｓ．ｅ．ｍ）パーセントが、ＰＥＧ１０に対して陽性であることが明らかになった。図６Ｄ：次に、対照およびＡＳ細胞溶解物ならびに対応するＥＶ画分に対して、データ非依存的取得（ＤＩＡ）質量分析を行った。ＤＩＡ分析により、ＡＳ細胞溶解物およびＥＶにおけるＰＥＧ１０の有意な上方制御（Ｌｏｇ２ ＦＣ＝０．９９および０．８０、Ａｄｊ．Ｐ＝０）が確認されたが、ＰＥＧ１０は、主要ＥＶメーカー（ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ８１、およびＣＤ６３）のように、溶解物よりもＥＶにおいて選好的には濃縮されなかった。ＰＥＧ１０結合パートナーであることが確認されたタンパク質のうち、ＴＣＡＦ１はＡＳ溶解物およびＥＶにおいて上昇し、ＡＴＸＮ１０はＡＳニューロン由来のＥＶにおいて選択的に上昇した一方、ＲＴＬ８ＣはＡＳ溶解物において上昇を示したが、ＥＶでは上昇を示さなかった。図６Ｅ：次に、本発明者らは、ＷＢを使用してＥＶにおけるＰＥＧ１０ ＲＦ１／２の発現および濃縮を確認した。ＰＥＧ１０ ＲＦ１／２はＥＶ中に分泌され、ＥＶ中で断片化を示す（図４Ｍ）。ＤＩＡの結果と一致して、ＴＳＧ１０１およびＡｌｉｘ（ＰＤＣＤ６ＩＰ）はＥＶにおいて濃縮され、ＡＴＸＮ１０はＡＳ ＥＶにおいて選択的に濃縮された。したがって、ＰＥＧ１０は、その結合パートナーである、ＡＴＸＮ１０、ＴＣＡＦ１、およびＦＡＭ１２７Ａ／ＲＴＬ８ＣをＥＶに動員する。
【0041】
材料および方法
ＩＰＳＣから得られたＮＳＣを、Ｃｏｓｔａら、２０１６に従ってニューロンに分化させた。
ＩＰＳＣから得られたＮＳＣを、Ｃｏｓｔａら、２０１６に従ってニューロンに分化させた。
【0042】
ＴＭＴ－ＭＳ３－ＳＰＳ分析のためのＬＮＡ処理および試料調製：
対照試料から得られたニューロンを、１および５μＭのＵＢＥ３Ａセンス配列ターゲティングＬＮＡ５’－ＴＴＴＡｃａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔａａＣＡ－３’（配列番号３５）で処理し、ＡＳ細胞を、特許（ＷＯ２０１７０８１２２３Ａ１）に基づいて、ＵＢＥ３Ａアンチセンスターゲティング配列５’－ＣＴｔｔｃｃａｔｔｔａｔｔｔｃｃＡＴＴＴ－３’（配列番号３６）で処理した。神経分化の４２日目の細胞を収集し、Ｇｙｇｉの論文に従って試料調製に供した。条件を６回のＴＭＴｘ１０ ｐｌｅｘの実行に無作為化し、各ＴＭＴｘ１０ ｐｌｅｘの実行は２つのプール試料を含んだ。標識化後、試料をプールし、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８カラム（０．５ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｓ－３μｍ粒径、１２ｎｍ細孔径）のＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、塩基性逆相分画に供した。試料の分画は、以下の勾配を使用して、１２μｌ／分で行った。２～２３％の緩衝液Ｂで５分間、２３～３３％の緩衝液Ｂで２５分間、３３～５３％の緩衝液Ｂで３０分間、５３～１００％の緩衝液Ｂで５分間、および１００％の緩衝液Ｂで５分間。１分間で１００％の緩衝液Ｂから２％の緩衝液Ｂに交換し、続いて１４分間、２％の緩衝液Ｂによってカラムを平衡化する。それぞれ約２６μｌの体積からなる４分～８４分の合計３６個の画分を、９６ウェルサンプルプレートに収集する。
対照試料から得られたニューロンを、１および５μＭのＵＢＥ３Ａセンス配列ターゲティングＬＮＡ５’－ＴＴＴＡｃａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔａａＣＡ－３’（配列番号３５）で処理し、ＡＳ細胞を、特許（ＷＯ２０１７０８１２２３Ａ１）に基づいて、ＵＢＥ３Ａアンチセンスターゲティング配列５’－ＣＴｔｔｃｃａｔｔｔａｔｔｔｃｃＡＴＴＴ－３’（配列番号３６）で処理した。神経分化の４２日目の細胞を収集し、Ｇｙｇｉの論文に従って試料調製に供した。条件を６回のＴＭＴｘ１０ ｐｌｅｘの実行に無作為化し、各ＴＭＴｘ１０ ｐｌｅｘの実行は２つのプール試料を含んだ。標識化後、試料をプールし、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８カラム（０．５ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｓ－３μｍ粒径、１２ｎｍ細孔径）のＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、塩基性逆相分画に供した。試料の分画は、以下の勾配を使用して、１２μｌ／分で行った。２～２３％の緩衝液Ｂで５分間、２３～３３％の緩衝液Ｂで２５分間、３３～５３％の緩衝液Ｂで３０分間、５３～１００％の緩衝液Ｂで５分間、および１００％の緩衝液Ｂで５分間。１分間で１００％の緩衝液Ｂから２％の緩衝液Ｂに交換し、続いて１４分間、２％の緩衝液Ｂによってカラムを平衡化する。それぞれ約２６μｌの体積からなる４分～８４分の合計３６個の画分を、９６ウェルサンプルプレートに収集する。
【0043】
分画後、試料を乾燥させ、酸性化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計でデータを取得した。装置をデータ依存型取得モードで動作させて、最大注入時間（ＩＴ）５０ｍｓで２Ｅ５の自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）目標値を用いて、分解能１２０，０００（ｍ／ｚ２００において）で３５０～１４００ｍ／ｚの質量範囲にわたってＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ１スキャンを収集する。ｍ／ｚ４４５．１２００２で周囲空気ヘキサシクロジメチルシロキサンを使用して、データをその場で較正した。各ＭＳ１スキャンの間に、３秒間、ｍ／ｚ０．７の四重極型単離、ＡＧＣターゲット１Ｅ４、最大ＩＴ ５０ｍｓ、３５％の衝突エネルギー、およびターボスキャン速度でのイオントラップ読み出しを使用して、最小強度５Ｅ３を有する、２～６の電荷状態を有するＮ個の最も強い前駆イオンを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）のためにモノアイソトープで選択した。１０ｐｐｍの低および高質量許容度を使用して、７５秒間の１回の出現後に前駆イオンを除外する。従属スキャンは、前駆体ごとに単一の電荷状態で実行された。ＴＭＴレポーターイオンは、同期前駆体選択（ＳＰＳ）、ｍ／ｚ２のＭＳ四重極型単離ウィンドウ、６５％の正規化された衝突エネルギーでの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、および分解能５０ｋ（ｍ／ｚ２００において）、スキャン範囲ｍ／ｚ１００～５００、ＡＧＣターゲット５Ｅ４、および最大ＩＴ １０５ｍｓを有するＯｒｂｉｔｒａｐでの読み出しを使用して、生成される。ＳＰＳ前駆体を選択するための質量範囲は、ｍ／ｚ４０（低）および５（高）の許容誤差を有するＭＳ２前駆体、およびそれからの任意のＴＭＴ中性損失を除いて、ｍ／ｚ４００～２０００であった。ＳＰＳ前駆体の数は、１０に設定される。
【0044】
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ上でのデータ分析：
１．取得後、Ｍａｓｃｏｔサーバー２．６．１（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）に接続したＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１を使用して、生データを処理した。
２．処理ワークフローは、酵素としてトリプシン／Ｐを使用してＵｎｉＰｒｏｔヒトタンパク質データベースに対してＭＳ２データを検索し、それぞれ最大２回の切断ミスならびに１０ｐｐｍおよび０．５Ｄａの前駆体および断片イオンの許容を可能にする。
３．カルバミドメチル化システイン（＋５７．０２１４６Ｄａ）、ＴＭＴ１０標識リジン、およびペプチドＮ末端（＋２２９．１６２９３Ｄａ）を静的修飾として設定する。
４．酸化メチオニン（＋１５．９９４９２Ｄａ）およびアセチル化タンパク質Ｎ末端（＋４２．０１０５７Ｄａ）を動的修飾として設定する。
５．ｑ値閾値に基づいて標的ＦＤＲを０．０１に設定したＰｅｒｃｏｌａｔｏｒを使用して、デコイデータベース検索を実行した。
６．ＨＣＤ－ＭＳ３データに対して、３ｍｍｕのピーク積分を用い、最も信頼できるセントロイドの許容を使用して、レポーターイオンの定量を行った。
７．レポーターイオン強度は、製造業者の仕様を使用して、異なるＴＭＴ試薬の同位体不純物を補正するように調整される。
８．ＰＳＭをペプチドおよびタンパク質にグループ化するためのコンセンサスワークフローを定義した。
９．ペプチドＦＤＲは、０．０１のｑ値閾値を設定し、ソフトウェアがグループ化のためにＰＳＭ ｑ値を自動的に選択することを可能にすることによって制御される。
１０．最小６アミノ酸長の高信頼性の固有ペプチドをタンパク質にグループ分けし、タンパク質ＦＤＲも０．０１に設定した。
１１．ペプチドおよびタンパク質の定量は、各チャネルのＳ／Ｎを合計し、各値を最も高いＴＭＴチャネルの総強度で正規化することによって行った。個々のペプチドおよびタンパク質Ｓ／Ｎを平均１００にスケール化し、統計分析のために高いＦＤＲ信頼性タンパク質定量強度のみを保持する。
１．取得後、Ｍａｓｃｏｔサーバー２．６．１（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）に接続したＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１を使用して、生データを処理した。
２．処理ワークフローは、酵素としてトリプシン／Ｐを使用してＵｎｉＰｒｏｔヒトタンパク質データベースに対してＭＳ２データを検索し、それぞれ最大２回の切断ミスならびに１０ｐｐｍおよび０．５Ｄａの前駆体および断片イオンの許容を可能にする。
３．カルバミドメチル化システイン（＋５７．０２１４６Ｄａ）、ＴＭＴ１０標識リジン、およびペプチドＮ末端（＋２２９．１６２９３Ｄａ）を静的修飾として設定する。
４．酸化メチオニン（＋１５．９９４９２Ｄａ）およびアセチル化タンパク質Ｎ末端（＋４２．０１０５７Ｄａ）を動的修飾として設定する。
５．ｑ値閾値に基づいて標的ＦＤＲを０．０１に設定したＰｅｒｃｏｌａｔｏｒを使用して、デコイデータベース検索を実行した。
６．ＨＣＤ－ＭＳ３データに対して、３ｍｍｕのピーク積分を用い、最も信頼できるセントロイドの許容を使用して、レポーターイオンの定量を行った。
７．レポーターイオン強度は、製造業者の仕様を使用して、異なるＴＭＴ試薬の同位体不純物を補正するように調整される。
８．ＰＳＭをペプチドおよびタンパク質にグループ化するためのコンセンサスワークフローを定義した。
９．ペプチドＦＤＲは、０．０１のｑ値閾値を設定し、ソフトウェアがグループ化のためにＰＳＭ ｑ値を自動的に選択することを可能にすることによって制御される。
１０．最小６アミノ酸長の高信頼性の固有ペプチドをタンパク質にグループ分けし、タンパク質ＦＤＲも０．０１に設定した。
１１．ペプチドおよびタンパク質の定量は、各チャネルのＳ／Ｎを合計し、各値を最も高いＴＭＴチャネルの総強度で正規化することによって行った。個々のペプチドおよびタンパク質Ｓ／Ｎを平均１００にスケール化し、統計分析のために高いＦＤＲ信頼性タンパク質定量強度のみを保持する。
【0045】
統計分析：
各ｐｌｅｘに２つのプールされた試料を用いて、６回の１０ｐｌｅｘＴＭＴ実行で試料を分析した。データに注釈を付け、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン２．１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で正規化した。各チャネルの合計強度の最大値に対し、ペプチドレベルで正規化を行った。共通のプールされた試料を使用して、ＩＲＳ法で６回のＴＭＴ－ｐｌｅｘにわたって正規化した：各タンパク質についてスケーリングファクターを計算して、それらの参照値をプール試料の幾何平均に調整した。次いで、これらを使用して、Ｐｌｕｂｅｌｌら、２０１７に従って、各ＴＭＴ実験の残りの試料中の各タンパク質の存在量をスケール化した。各タンパク質に対し、線形モデルにフィッティングさせ、分散を緩和するために経験ベイズ法を適用（Ｐｈｉｐｓｏｎら、２０１６）することによって、ｌｉｍｍａ（Ｒｉｔｃｈｉｅら、２０１５）を使用してタンパク質の示差的存在量を計算した。異なる条件を、ｍｕｌｔｃｏｍｐ（Ｈｏｔｈｏｒｎら、２００８）およびｌｓｍｅａｎｓ（ＲｕｓｓｅｌおよびＬｅｎｇｔｈら２０１６）で差異を計算することによって比較した。偽発見率（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、およびＨｏｃｈｂｅｒｇ１９９５）を制御することによって、複数の試験のために、計算されたｐ値を調整した。全ての計算は、Ｒ（Ｒ Ｃｏｒｅ ｔｅａｍ、２０１８）で行った。
各ｐｌｅｘに２つのプールされた試料を用いて、６回の１０ｐｌｅｘＴＭＴ実行で試料を分析した。データに注釈を付け、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン２．１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で正規化した。各チャネルの合計強度の最大値に対し、ペプチドレベルで正規化を行った。共通のプールされた試料を使用して、ＩＲＳ法で６回のＴＭＴ－ｐｌｅｘにわたって正規化した：各タンパク質についてスケーリングファクターを計算して、それらの参照値をプール試料の幾何平均に調整した。次いで、これらを使用して、Ｐｌｕｂｅｌｌら、２０１７に従って、各ＴＭＴ実験の残りの試料中の各タンパク質の存在量をスケール化した。各タンパク質に対し、線形モデルにフィッティングさせ、分散を緩和するために経験ベイズ法を適用（Ｐｈｉｐｓｏｎら、２０１６）することによって、ｌｉｍｍａ（Ｒｉｔｃｈｉｅら、２０１５）を使用してタンパク質の示差的存在量を計算した。異なる条件を、ｍｕｌｔｃｏｍｐ（Ｈｏｔｈｏｒｎら、２００８）およびｌｓｍｅａｎｓ（ＲｕｓｓｅｌおよびＬｅｎｇｔｈら２０１６）で差異を計算することによって比較した。偽発見率（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、およびＨｏｃｈｂｅｒｇ１９９５）を制御することによって、複数の試験のために、計算されたｐ値を調整した。全ての計算は、Ｒ（Ｒ Ｃｏｒｅ ｔｅａｍ、２０１８）で行った。
【0046】
ＵＢＥ３Ａ標的の選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）
表１に示す２６種の標的ペプチドに対応する、Ｌ‐［Ｕ‐１３Ｃ，Ｕ‐１５Ｎ］ＲまたはＬ‐［Ｕ‐１３Ｃ，Ｕ‐１５Ｎ］Ｋのいずれかを含む同位体標識ペプチド（未精製）を合成し（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、それらの配列をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで確認した。２つの対照および３つのＡＳニューロンからの細胞ペレットを、３つの独立した分化においてＬＮＡ処理に供し、プレオミクスキット（Ｐｒｅｏｍｉｃｓ ＧｍＢＨ）を使用して溶液中での消化に供した。５０ｆｍｏｌのプールされたペプチドミックスを各試料に添加し、Ｄｕｎｋｌｅｙら、２０１５に従ってＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）で測定および分析した。データをＳｋｙｌｉｎｅ上で処理し、内因性ペプチド存在量を、ＡＣＴＢに対して正規化された重質参照標準を使用して補正した。図２は、選択されたタンパク質、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＵＢＥ３Ａの存在量を表す。
表１に示す２６種の標的ペプチドに対応する、Ｌ‐［Ｕ‐１３Ｃ，Ｕ‐１５Ｎ］ＲまたはＬ‐［Ｕ‐１３Ｃ，Ｕ‐１５Ｎ］Ｋのいずれかを含む同位体標識ペプチド（未精製）を合成し（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、それらの配列をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで確認した。２つの対照および３つのＡＳニューロンからの細胞ペレットを、３つの独立した分化においてＬＮＡ処理に供し、プレオミクスキット（Ｐｒｅｏｍｉｃｓ ＧｍＢＨ）を使用して溶液中での消化に供した。５０ｆｍｏｌのプールされたペプチドミックスを各試料に添加し、Ｄｕｎｋｌｅｙら、２０１５に従ってＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）で測定および分析した。データをＳｋｙｌｉｎｅ上で処理し、内因性ペプチド存在量を、ＡＣＴＢに対して正規化された重質参照標準を使用して補正した。図２は、選択されたタンパク質、ＰＥＧ１０、ＴＣＡＦ１、およびＵＢＥ３Ａの存在量を表す。
【0047】
【表1】
【0048】
ＰＥＧ１０およびＵＢＥ３Ａのウエスタンブロッティング．
ニューロン細胞に対するウエスタンブロッティングのために、ペレットをＲＩＰＡ溶解緩衝液と４℃で２０分間インキュベートすることによって、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９９００）中で変性させ、超音波処理し、還元（１０×ＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＰ０００４）および４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料溶解緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１０７４７）を使用した変性に供し、９５℃で煮沸した。
ニューロン細胞に対するウエスタンブロッティングのために、ペレットをＲＩＰＡ溶解緩衝液と４℃で２０分間インキュベートすることによって、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９９００）中で変性させ、超音波処理し、還元（１０×ＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＰ０００４）および４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料溶解緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１０７４７）を使用した変性に供し、９５℃で煮沸した。
【0049】
試料を４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５６７８０８４）で分離し、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ブロッターを使用してＰＶＤＦ膜上にＢｉｏｒａｄ湿式転写を使用して湿式転写に供した。転写後、ＰＶＤＦ膜をトリス緩衝食塩水－０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ－Ｔ）中の５％ミルクを使用してブロッキングし、１：５００希釈でＵＢＥ３Ａ（Ｅ６ＡＰ抗体、Ａ３００－３５２Ａ－Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）／ＰＥＧ１０（抗ＰＥＧ１０抗体［１Ｅ２－Ｆ１２－Ｃ１２］（ａｂ１３１１９４）｜Ａｂｃａｍ）抗体とインキュベートし、Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋（Ｂｉｏｒａｄ）システムを使用してＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ＤＡＫＯ）を用いて検出した。
【0050】
【表2】
【0051】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【配列表】
【国際調査報告】