特表 2022-517957 フレキシブル検出システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-11

(54)【発明の名称】フレキシブル検出システム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6811 20180101AFI20220304BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220304BHJP

   G01N 33/532 20060101ALI20220304BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6811 Z

C12N15/11 Z

G01N33/532 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021539959

(86)(22)【出願日】2020-01-08

(85)【翻訳文提出日】2021-08-25

(86)【国際出願番号】 US2020012813

(87)【国際公開番号】W WO2020146552

(87)【国際公開日】2020-07-16

(31)【優先権主張番号】62/789,935

(32)【優先日】2019-01-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521300175

【氏名又は名称】アコヤ バイオサイエンス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】ケネディー－ダーリン，ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ダクシナムールティ，ガジャラクシュミ

(72)【発明者】

【氏名】マッケリゴン，ブライアン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ05

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR48

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書において、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした抗体を使用して生体試料の構成要素を検出するための方法、キット、および組成物が提供され、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドに部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを介して、検出のための標識されたオリゴヌクレオチドに接続している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料を、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片と接触させるステップ、
前記第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触させるステップ、
前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域を、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、
それにより前記生体試料を前記検出成分と連結させるステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記生体試料が、培養細胞、生体組織、生体液、ホモジネート、および未知の生体試料からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記生体試料が、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウシ由来、ブタ由来、ヒツジ由来、ウサギ由来、サル由来、ミバエ由来、カエル由来、線形動物由来、魚由来、ハムスター由来、モルモット由来、およびウッドチャック由来からなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記生体試料が、動物由来、植物由来、細菌由来、真菌由来、および原生生物由来からなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記生体試料が、ウイルス、ウイルスベクター、およびプリオンからなる群から選択される成分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記生体試料が新鮮であるか、凍結されているか、または固定されている、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記生体試料が表面上に固定化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記表面が、スライド、プレート、ウェル、チューブ、膜、フィルム、またはビーズである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記生体試料が三次元構造物内で固定化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記三次元構造物が、凍結組織、パラフィンブロック、または凍結液体である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗体または抗体断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体または抗体断片が試料の構成要素に特異的である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記試料の前記構成要素が、凍結固定試料、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または脂質である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記第１のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記第１のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記第２のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項34】

前記第２のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項36】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載の方法。

【請求項37】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項38】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項39】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項40】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項41】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項43】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載の方法。

【請求項44】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項45】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項46】

前記第３のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項47】

前記第３のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項48】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項49】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項50】

前記検出成分が、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項51】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項52】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項53】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項54】

前記検出成分が除去され得る、請求項１に記載の方法。

【請求項55】

前記生体試料を前記抗体または抗体断片と接触させる前に、前記試料を表面上に固定化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項56】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域を前記第３のオリゴヌクレオチドと接触させた後に前記検出成分を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項57】

段階的に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項58】

１つまたは複数のステップが同時に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項59】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域を前記第３のオリゴヌクレオチドと接触させた後にレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項60】

第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片、
第１の結合領域および第２の結合領域を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、第３のオリゴヌクレオチド
を含むキット。

【請求項61】

前記抗体または抗体断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項62】

非特異的な結合抗体が、前記試料に結合した前記抗体の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、または４０％未満を構成する、請求項６０に記載のキット。

【請求項63】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項64】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項65】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項66】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項６０に記載のキット。

【請求項67】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項68】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項69】

前記第１のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項70】

前記第１のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項71】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。請求項６０に記載のキット。

【請求項72】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項73】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項６０に記載のキット。

【請求項74】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項75】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項76】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項77】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項78】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項79】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項６０に記載のキット。

【請求項80】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項81】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項82】

前記第２のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項83】

前記第２のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項84】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項85】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項６０に記載のキット。

【請求項86】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項87】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項88】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、請求項６０に記載のキット。

【請求項89】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項90】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項91】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項92】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項６０に記載のキット。

【請求項93】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項６０に記載のキット。

【請求項94】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項95】

前記第３のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項96】

前記第３のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項６０に記載のキット。

【請求項97】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補的である、請求項６０に記載のキット。

【請求項98】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である、請求項６０に記載のキット。

【請求項99】

前記検出成分が、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む、請求項６０に記載のキット。

【請求項100】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項６０に記載のキット。

【請求項101】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項６０に記載のキット。

【請求項102】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する、請求項６０に記載のキット。

【請求項103】

前記検出成分が除去され得る、請求項６０に記載のキット。

【請求項104】

第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片を含む組成物であって、
前記第１のオリゴヌクレオチドが、塩基対を介して、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域に接続され、
前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域が、塩基対を介して、第３のオリゴヌクレオチドに接続され、
前記第３のオリゴヌクレオチドが検出成分を含む、組成物。

【請求項105】

前記抗体または抗体断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項106】

非特異的な結合抗体が、前記試料に結合した前記抗体の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、または４０％未満を構成する、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項107】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項108】

前記第１のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項109】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項110】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項111】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項112】

前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項113】

前記第１のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項114】

前記第１のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項115】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項116】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項117】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項118】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項119】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項120】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項121】

前記第２のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項122】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項123】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項124】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項125】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項126】

前記第２のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項127】

前記第２のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項128】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項129】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項130】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項131】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、請求項１に記載の組成物。

【請求項132】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項133】

前記第３のオリゴヌクレオチドが複数のデオキシリボ核酸を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項134】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項135】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項136】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項137】

前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域が、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項138】

前記第３のオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項139】

前記第３のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項140】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補的である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項141】

前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項142】

前記検出成分が、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項143】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項144】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項145】

前記検出成分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項146】

前記検出成分が除去できる、請求項１０４に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本願は、２０１９年１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８９，９３５号に対する優先権を主張するものであり、この出願は、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

抗体は、生菌を注入したマウスの器官生検における肺炎球菌抗原を可視化するために、１９４２に、組織切片分析において最初に利用された。その時から、免疫組織化学は、臨床診断および基礎研究の主力となっている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本明細書において、生体試料を、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片と接触させるステップ、前記第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触させるステップ、前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域を、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、それにより前記生体試料を前記検出成分に接続によって結合させる方法が提供される。一部の実施形態では、前記生体試料は、培養細胞、生体組織、生体液、ホモジネート、および不明の生体試料からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む。一部の実施形態では、前記生体試料は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウシ由来、ブタ由来、ヒツジ由来、ウサギ由来、サル由来、ミバエ由来、カエル由来、線形動物由来、魚由来、ハムスター由来、モルモット由来、およびウッドチャック由来からなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、前記生体試料は、動物由来、植物由来、細菌由来、真菌由来、および原生生物由来からなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、前記生体試料は、ウイルス、ウイルスベクター、およびプリオンからなる群から選択される成分を含む。一部の実施形態では、前記生体試料は、新鮮であるか、凍結されているか、または固定されている。一部の実施形態では、前記生体試料は、表面上に固定化されている。一部の実施形態では、前記表面は、スライド、プレート、ウェル、チューブ、膜、フィルム、またはビーズである。一部の実施形態では、前記生体試料は、三次元構造内で固定化されている。一部の実施形態では、前記三次元構造は、凍結組織、パラフィンブロック、または凍結液体である。一部の実施形態では、前記抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む。一部の実施形態では、前記抗体または抗体断片は、試料の構成要素に特異的である。一部の実施形態では、試料の前記構成要素は、凍結固定試料、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または脂質である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補

的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である。一部の実施形態では、前記検出成分は、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は除去される。一部の実施形態は、前記生体試料を前記抗体または抗体断片と接触させる前に、前記試料を表面上に固定化するステップをさらに含む。一部の実施形態は、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域を前記第３のオリゴヌクレオチドと接触させた後に前記検出成分を検出することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、段階的に行われる。一部の実施形態では、１つまたは複数のステップが同時に行われる。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域を前記第３のオリゴヌクレオチドと接触させた後にレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが行われる。

【0004】

また、本明細書において、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片；第１の結合領域および第２の結合領域を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド；ならびに検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である、第３のオリゴヌクレオチドを含むキットが提供される。一部の実施形態では、前記抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む。一部の実施形態では、非特異的な結合抗体は、試料に結合した前記抗体の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、または４０％未満を構成する。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である。一部の実施形態では、前記検出成分は、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は除去され得る。

【0005】

また、本明細書において、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片を含む組成物であって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、塩基対を介して、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域に接続しており、前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域が、塩基対を介して、第３のオリゴヌクレオチドに接続しており、前記第３のオリゴヌクレオチドが検出成分を含む、組成物が提供される。一部の実施形態では、前記抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含む。一部の実施形態では、非特異的な結合抗体は、試料に結合した前記抗体の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、または４０％未満を構成する。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第１のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸を含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に部分的に相補的である。一部の実施形態では、前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域に完全に相補的である。一部の実施形態では、前記検出成分は、フルオロフォア、放射性同位体、または比色分析反応を生じさせ得る化合物を含む。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に位置する。一部の実施形態では、前記検出成分は除去され得る。

【0006】

参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0007】

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に述べられている。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用されている例示的実施形態を述べている以下の詳細な説明および添付の図面を参考にすることにより得られる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本明細書の組成物の一部の実施形態を表す概念図であり、１は抗体または抗体断片を表し、２は第１のオリゴヌクレオチドを表し、３は第２のオリゴヌクレオチドを表し、４は第３のオリゴヌクレオチドを表し、５は検出成分を表す。

【図2】本明細書に記載される組成物がどのように見えるかの例を示す図である。変動は、これらに限定されないが、非結合領域、オーバーハング、ループ、または追加のオリゴヌクレオチドを含むことができる。Ａは、第２のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドを標識された第３のオリゴヌクレオチドに接続している例を表し、Ｂは、第３のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である例を表し、Ｃは、第１の結合領域が第１のオリゴヌクレオチドに相補的ではない部分を含む例を表し、Ｄは、第１のオリゴヌクレオチドが二次構造を有することができる例を表し、Ｅは、第１の結合領域が第２のオリゴヌクレオチドの端まで伸びていない例を表し、Ｆは、第２の結合領域に結合する第３のオリゴヌクレオチドのセグメントが第２の結合領域に相補的ではない部分を含む例を表し、Ｇは、第３のオリゴヌクレオチドが二次構造を有することができる例を表し、Ｈは、第１の結合領域が第１のオリゴヌクレオチドの末端に相補的ではない例を表し、Ｉは、第２のオリゴヌクレオチドが環状である例を表し、Ｊは、第２の結合領域に結合する第３のオリゴヌクレオチドのセグメントが第２の結合領域に相補的ではなく二次構造を有するセグメントを含む例を表し、Ｋは、第２の結合領域が第２のオリゴヌクレオチドの末端まで伸びていない例を表し、Ｌは、第３のオリゴヌクレオチドが二次構造を有する例を表し、Ｍは、第１の結合領域も第２の結合領域も第２のオリゴヌクレオチドのどちらかの端まで伸びていない例を表し、Ｎは、第２のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドであり得る例を表し、Ｏは、第３のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖であり得る例を表し、Ｐは、第２のオリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドとして部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを３つ含むことができる例を表し、Ｑは、第２の結合領域が第３のオリゴヌクレオチドに相補的ではない領域によって割り込まれており、第２の結合領域に相補的である第３のオリゴヌクレオチドのセグメントが第２のオリゴヌクレオチドに相補的ではない領域によって割り込まれている例を表す。

【図3】検出成分がフルオロフォアである場合の（ｉ）単一光子励起、（ｉｉ）二重光子励起、および（ｉｉｉ）三重光子励起による検出成分の活性化を示す図である。

【図4】検出成分の考え得る配置を示す図であり、この配置は、第３のオリゴヌクレオチドのどちらかの末端（（ｉ）および（ｉｉ））に、第３のオリゴヌクレオチドの真ん中に（ｉｉｉ）位置する検出成分、第３のオリゴヌクレオチド上の複数の検出成分（ｉｖ）、およびＦＲＥＴ検出システム（（ｖ）および（ｖｉ））を含むことができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書において、生体試料の構成要素の同定のための方法、キット、および組成物が記載されている。簡潔に言えば、生体試料は、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片と接触して、抗体または抗体断片の少なくとも一部が生体試料の構成要素と接触してもよい。抗体または抗体断片は、第１のオリゴヌクレオチドとコンジュゲートしていてもよく、このオリゴヌクレオチドは、第１の結合領域を有することができる。次に、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに接触することができる。一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域は、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触することができる。次に、第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドと接触することができ、第３のオリゴヌクレオチドは、検出成分を含むことができる。このように、生体試料の構成要素は、抗体または抗体断片および複数のオリゴヌクレオチドを介して検出成分に連結され得る。次に、検出成分を検出して、生体試料の構成要素の存在を定性的にまたは定量的に判定することができる。

【0010】

試料
試料は、生体試料であり得る。試料は、新鮮であっても、凍結されていても、固定（例えば、化学的に固定）されていてもよい。試料は、動物、植物、細菌、真菌、または原生生物由来であり得る。一部の場合、試料は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ウサギ、ミバエ、カエル、線虫またはウッドチャックの試料であり得る。試料は、細胞（例えば、単離された細胞、不死化細胞、初代細胞、培養細胞、または組織もしくは生体の細胞）、生体組織、生体液、ホモジネートを含むことができ、または試料は未知の試料であり得る。一部の場合、試料は、病原体を含むことができる。病原体は、培養されていても無培養でもよい。病原体は、試料の感染物であり得る。一部の場合、病原体は、試料を収集した生体の細胞、体液、組織、器官、またはマイクロバイオームの感染物であり得る。一部の場合、試料は、酵母細胞、細菌細胞、ウイルス、ウイルスベクターまたはプリオンである病原体を含むことができる。

【0011】

試料は組織切片であり得る。一部の場合、組織切片とは、対象から入手され、任意選択で、固定された、薄片にされた、および平面表面、例えば、スライドガラス上に乗せられた組織の小片を指すことができる。

【0012】

試料は平面状試料であり得る。一部の場合、試料は、表面上に固定化され得る。一部の場合、表面は、スライド、プレート、ウェル、チューブ、膜、フィルム、またはビーズであり得る。一部の場合、試料は、スライドと接触していてもよい。スライドと接触する試料は、スライドに付着させて、試料が効果的に固定化され得る。これは、例えば、固定によりまたは試料を凍結させることにより達成可能である。同様に、試料は、同じまたは類似する付着技法を使用して別のタイプの表面上に固定化され得る。

【0013】

一部の場合、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片であり得る。ＦＦＰＥとは、組織の小片、例えば、対象から入手され、例えば、ホルマリンもしくはホルムアルデヒド（例えば、リン酸緩衝生理食塩水中３％～５％ホルマリンまたはホルムアルデヒド）またはブアン溶液中で固定され、ワックスに包埋され、薄片に切断され、次にスライドガラス上に乗せられた生検を指すことができる。

【0014】

試料は、非平面状試料であり得る。非平面状試料は、実質的に平らではない試料、例えば、透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイズ硬質イメージング適合性組織ヒドロゲル（Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hydrogel：ＣＬＡＲＩＴＹ）などの屈折率整合技法によって透明にされている全体または一部器官のマウント（例えば、リンパ節、脳、肝臓などの）であり得る。例えば、Roberts et al., J Vis Exp. 2016; (112): 54025を参照されたい。ベンジルアルコール／安息香酸ベンジル（ＢＡＢＢ）またはベンジルエーテルなどの清澄剤を使用して、検体を透明にしてもよい。

【0015】

試料は、アルデヒド、アルコール、酸化剤、水銀剤、ピクリン酸、またはＨＯＰＥ固定液を使用して固定してもよい。一部の例では、試料は、アセトン、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、エタノール、またはメタノールを使用して固定することができる。試料は代わりに、熱固定を使用して固定してもよい。固定は、浸漬または灌流を介して達成してもよい。

【0016】

一部の場合、生体試料は凍結させてもよい。一部の場合、生体試料は、０℃未満、－１０℃未満、－２０℃未満、－３０℃未満、－４０℃未満、－５０℃未満、－６０℃未満、－７０℃未満、または－８０℃未満で凍結させてもよい。

【0017】

一部の場合、生体試料は、三次元の形態で固定化することができる。前記三次元形態は、凍結ブロック、パラフィンブロック、または凍結液体であり得る。例えば、生体試料は、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物での凍結動物組織のブロックであり得る。組織のそのようなブロックは、凍結されていても、固定されていてもよい。一部の場合、組織のブロックは、抗体または抗体断片が接触する表面になり得る表面が露出されるように切断することができる。ブロックは、ブロックの一続きの表面に抗体または抗体断片が接触することができるように薄片にすることができる。そのような場合、三次元であるまたはほぼ三次元データに等しいデータを得ることができる。

【0018】

目的の生物学的特徴
試料は、目的の生物学的特徴を含むことができる。目的の生物学的特徴は、本明細書に記載される方法を使用して測定することができる試料のいかなる部分でも含むことができる。一部の場合、目的の生物学的特徴は、捕捉剤への結合により示すことができる試料の一部を含むことができる。目的の生物学的特徴は、標準化のためなどのハウスキーピング特徴（例えば、アクチン）などの制御特徴、細胞の一部（例えば、核に会合しているタンパク質、核膜、小胞体、ミトコンドリア、細胞膜、または細胞の他の部分）を同定できる特徴、細胞の型（例えば、免疫細胞またはがん細胞などの特定の細胞型で発現される細胞表面マーカーまたはタンパク質）を同定できる特徴、または目的の別の特徴であり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、がん、糖尿病、心臓疾患、肺疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または別のタイプの疾患の疾患マーカーであり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、損傷のマーカーまたは創傷治癒中に存在するマーカーであり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、健康な細胞を示すことができるマーカーであり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、診断、創薬、研究、同定、または最適化目的のための目的の特徴であり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、抗原であり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴は、細胞壁、核、細胞質、膜、ケラチン、筋線維、コラーゲン、骨、タンパク質、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡなど）、脂肪などを含むことができる。目的の生物学的特徴は、例えば、オリゴヌクレオチドに連結されている捕捉剤を使用して、免疫組織学的方法により示すこともできる。

【0019】

試料は、本明細書の方法を使用して検出することができるいくつかの目的の生物学的特徴を含むことができる。一部の場合、本明細書の方法のマルチプレックスな特徴（例えば、捕捉剤を試料上で無傷に保ったままで標識を取り除くことを可能にし、これにより単一の試料上で方法のいくつかのまたは多くの相互作用を可能にする）を使用して、目的の多くの生物学的特徴を検出することができる。一部の場合、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００の目的の生物学的特徴を検出することができる。一部の場合、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００の目的の生物学的特徴を検出することができる。一部の場合、本方法を使用することによって、他の方法、例えば非多重化方法、試料から捕捉剤を取り除かなければならない方法、捕捉剤を試料に固定もしくは架橋させることを含まない方法、増幅のない方法、またはＲＣＡとは異なる増幅方法を有する方法などを使用するよりも、より多くの生物学的特徴を試料において検出することができる。

【0020】

目的の生物学的特徴は、マーカーを含むことができる。マーカーは、細胞の型、疾患状態、病原性、老化、または他の特性に関する情報を提供することができる、タンパク質などの細胞内の分子であり得る。マーカーは、一部の場合、リンパ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、マクロファージ、生殖細胞、幹細胞、神経細胞、がん細胞、健常な細胞、老化細胞、感染細胞、または特定の器官に属する細胞（例えば、心臓細胞、セルトリ細胞、肝細胞、真皮細胞、甲状腺細胞、肺細胞、腸細胞、扁桃腺細胞、筋細胞、骨細胞、桿状体もしくは円錐体などの網膜細胞、または別の器官の細胞）などの細胞の型を知らせることができる。一部の場合、マーカーを使用して病原体を同定できる。

【0021】

マーカーは、疾患マーカーであり得る。疾患マーカーは、所与の疾患状態を有する細胞において、形状、活性、量、位置が変更され得るか、または存在の有無が変更され得るマーカー（例えば、タンパク質）であり得る。例えば、疾患マーカーは、がんマーカー（例えば、乳がんマーカー、膵臓がんマーカー、リンパ腫マーカー、頭頚部がんマーカー、胃がんマーカー、精巣がんマーカー、白血病マーカー、肝細胞がんマーカー、肺がんマーカー、メラノーママーカー、卵巣がんマーカー、甲状腺がんマーカー、または別のタイプのがんのマーカー）、感染性疾患マーカー（例えば、病原体上のマーカーまたは病原体が感染した細胞もしくは組織のマーカーなどの、病原体により引き起こされる疾患のマーカー）、または遺伝性疾患マーカーを含むことができる。

【0022】

マーカーは、診断マーカーであり得る。診断マーカーは、例えば、特定の分子の特徴を有する身体中の特定の生化学物質であり得、その特定の分子の特徴によって、疾患を検出するため、疾患の進行もしくは処置の効果を測定するため、または目的の過程を測定するためにその特定の生化学物質が有用にされる。

【0023】

マーカーは、低レベル表面マーカーなどの低レベルマーカーであり得る。

【0024】

捕捉剤
捕捉剤は、試料に結合することができる分子であり得る。一部の場合、捕捉剤は、試料の目的の生物学的特徴に結合することができる。一部の場合、捕捉剤は、試料の生物学的特徴上の相補的部位に特異的に結合することができる。手短に言えば、目的の生物学的特徴は、本明細書に記載される方法を使用し捕捉剤を使用して検出することができる試料の特徴であり得る。一部の場合、目的の生物学的特徴には、捕捉剤が結合することができる。

【0025】

捕捉剤は、生物学的特徴に結合することができる分子であり得る。一部の場合、捕捉剤は、タンパク質、ペプチド、アプタマー、またはオリゴヌクレオチドを含むことができる。一部の場合、捕捉剤は、抗体またはその抗原結合性断片を含むことができる。一部の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、単離された抗体もしくはその抗原結合性断片、精製された抗体もしくはその抗原結合性断片、組換え抗体もしくはその抗原結合性断片、改変された抗体もしくはその抗原結合性断片、または合成抗体もしくはその抗原結合性断片を含むことができる。本明細書に記載される抗体は、当技術分野で公知である通りに改変することができることは理解されると考えられる。

【0026】

抗体またはその抗原結合性断片である捕捉剤は、可変領域を含むことができる。一部の場合、可変領域は、試料に接触または特異的に結合して目的の生物学的特徴と結合することができる抗体またはその抗原結合性断片の一部を含むことができる。可変領域とは、抗体軽鎖の可変領域、抗体重鎖の可変領域、または抗体軽鎖の可変領域と抗体軽鎖の可変領域の組合せのことである。一部の場合、目的の異なる生物学的特徴に結合する捕捉剤は、アミノ酸配列、タンパク質改変、三次元構造、またはその組合せが異なる可変領域を含むことができる。

【0027】

抗体またはその抗原結合性断片を含む捕捉剤は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｓｃＦＶ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含むことができる抗体または抗体断片を含むことができる。一部の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ラクダ、またはヤギ由来であり得る。一部の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ウサギ、ミバエ、カエル、線虫動物またはウッドチャック抗原に対して惹起できる。一部の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、動物、植物、細菌、真菌、または原生生物の抗原に対して惹起できる。一部の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、ウイルス、ウイルスベクター、またはプリオンに対して惹起できる。

【0028】

一部の場合、方法は、試料を複数の捕捉剤で標識するステップを含んでもよい。このステップは、捕捉剤が試料中の目的の生物学的特徴に結合することができる条件下で揃えて、試料（例えば、スライドグラスなどの平面状表面に乗せたＦＦＰＥ切片）をすべての捕捉剤に接触させるステップを含む。試料中の部位に抗体およびアプタマーを結合させるための方法は、周知であり得る。

【0029】

捕捉剤は、緩衝液中にあってもよい。一部の場合、捕捉剤は、緩衝液中の試料に適用させることができる。捕捉剤を含む緩衝液は、捕捉剤が目的の生物学的特徴に結合できる状態に構成されるまたは折り畳まれることを可能にできる特性を含むことができる。一部の場合、捕捉剤を含む緩衝液は、目的の生物学的特徴への捕捉剤の結合を促進することができる特性を含むことができる。一部の場合、捕捉剤を含む緩衝液は、捕捉剤にとって非破壊である、オリゴヌクレオチドにとって非破壊である、試料にとって非破壊である、または目的の生物学的特徴にとって非破壊であることが可能な特性を含むことができる。

【0030】

捕捉剤は、目的の生物学的特徴に対して特異性を有することができる。一部の場合、捕捉剤は、目的のただ１つの生物学的特徴に対して特異性を有することができる。一部の場合、捕捉剤は、目的の異なる生物学的特徴に対するその捕捉剤の特異性よりも大きい、目的の生物学的特徴に対する特異性を有することができる。一部の場合、捕捉剤は、目的の他の生物学的特徴に対するその特異性よりもはるかに大きい、目的の生物学的特徴の１つに対する特異性を有することができ、この捕捉剤を使用して目的の第１の生物学的特徴を確実に検出することができる。

【0031】

捕捉剤は、試料の構成要素に対する親和性を有することができる。一部の場合、親和性とは、抗体がどれほど迅速にまたはどれほど強力に構成要素に結合することができるかを指すことができる。親和性は、解離定数（Ｋｄ）により記述することもできる。捕捉剤は、１０^－４Ｍ以下、１０^－５Ｍ以下、１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下、１０^－１３Ｍ以下、または１０^－１４Ｍ以下のＫｄを有することができる。一部の場合、捕捉剤は、約１０^－４Ｍ、約１０^－５Ｍ、約１０^－６Ｍ、約１０^－７Ｍ、約１０^－８Ｍ、約１０^－９Ｍ、約１０^－１０Ｍ、約１０^－１１Ｍ、約１０^－１２Ｍ、約１０^－１３Ｍ、または約１０^－１４ＭのＫｄを有することができる。

【0032】

捕捉剤は、目的の生物学的特徴上の結合部位で目的の生物学的特徴に結合することができる。そのような結合部位は、例えば、エピトープであり得る。一部の場合、エピトープは、目的の生物学的特徴の一部であり得る。そのような場合、目的の生物学的特徴は、抗原を含むことができる。一部の場合、エピトープは、抗体またはその抗原結合性断片である捕捉剤に結合することができる。そのような場合、抗体またはその抗原結合性断片の可変領域は、目的の生物学的特徴にそのエピトープで結合することができる。

【0033】

一部の場合、捕捉剤は、試料に過剰に適用することができる。

【0034】

一部の場合、捕捉剤を試料に接触させたのち、捕捉剤は、ある時間インキュベートさせておくことができる。一部の場合、捕捉剤は、試料上で、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも３５分、少なくとも４０分、少なくとも４５分、少なくとも５０分、少なくとも５５分、少なくとも６０分、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間インキュベートすることができる。一部の場合、捕捉剤は、試料上で、３０秒以内、１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、３０分以内、３５分以内、４０分以内、４５分以内、５０分以内、５５分以内、６０分以内、１．５時間以内、２時間以内、２．５時間以内、３時間以内、３．５時間以内、４時間以内、４．５時間以内、５時間以内、５．５時間以内、または６時間以内インキュベートすることができる。一部の場合、捕捉剤は、試料上で、３０秒～６時間の間、３０秒～３時間の間、３０秒～６０分の間、３０秒～４５分の間、３０秒～３０分の間、３０秒～１５分の間、３０秒～５分の間、３０秒～１分の間、１分～６時間の間、１分～３時間の間、１分～６０分の間、１分～４５分の間、１分～３０分の間、１分～１５分の間、１分～５分の間、５分～６時間の間、５分～３時間の間、５分～６０分の間、５分～４５分の間、５分～３０分の間、５分～１５分の間、１５分～６時間の間、１５分～３時間の間、１５分～６０分の間、１５分～４５分の間、１５分～３０分の間、３０分～６時間の間、３０分～３時間の間、３０分～６０分の間、３０分～４５分の間、４５分～６時間の間、４５分～３時間の間、４５分～６０分の間、６０分～６時間の間、または６０分～３時間の間インキュベートすることができる。

【0035】

一部の場合、試料を捕捉剤に接触させたのち、捕捉剤は、試料上所与の温度でインキュベートできる。捕捉剤は、試料上、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、または約５５℃でインキュベートできる。一部の場合、捕捉剤は、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、少なくとも２０℃、少なくとも２１℃、少なくとも２２℃、少なくとも２３℃、少なくとも２４℃、少なくとも２５℃、少なくとも２６℃、少なくとも２７℃、少なくとも２８℃、少なくとも２９℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、または少なくとも５５℃の温度でインキュベートできる。一部の場合、捕捉剤は、４℃以下、５℃以下、６℃以下、７℃以下、８℃以下、９℃以下、１０℃以下、１１℃以下、１２℃以下、１３℃以下、１４℃以下、１５℃以下、１６℃以下、１７℃以下、１８℃以下、１９℃以下、２０℃以下、２１℃以下、２２℃以下、２３℃以下、２４℃以下、２５℃以下、２６℃以下、２７℃以下、２８℃以下、２９℃以下、３０℃以下、３５℃以下、４０℃以下、４５℃以下、５０℃以下、または５５℃以下の温度でインキュベートできる。一部の場合、捕捉剤は、４℃～５５℃の間、４℃～５０℃の間、４℃～４５℃の間、４℃～４０℃の間、４℃～３５℃の間、４℃～３０℃の間、４℃～２５℃の間、４℃～２０℃の間、４℃～１５℃の間、４℃～１０℃の間、１０℃～５５℃の間、１０℃～５０℃の間、１０℃～４５℃の間、１０℃～４０℃の間、１０℃～３５℃の間、１０℃～３０℃の間、１０℃～２５℃の間、１０℃～２０℃の間、１０℃～１５℃の間、１５℃～５５℃の間、１５℃～５０℃の間、１５℃～４５℃の間、１５℃～４０℃の間、１５℃～３５℃の間、１５℃～３０℃の間、１５℃～２５℃の間、１５℃～２０℃の間、２０℃～５５℃の間、２０℃～５０℃の間、２０℃～４５℃の間、２０℃～４０℃の間、２０℃～３５℃の間、２０℃～３０℃の間、２０℃～２５℃の間、２５℃～５５℃の間、２５℃～５０℃の間、２５℃～４５℃の間、２５℃～４０℃の間、２５℃～３５℃の間、２５℃～３０℃の間、３０℃～５５℃の間、３０℃～５０℃の間、３０℃～４５℃の間、３０℃～４０℃の間、３０℃～３５℃の間、３５℃～５５℃の間、３５℃～５０℃の間、３５℃～４５℃の間、３５℃～４０℃の間、４０℃～５５℃の間、４０℃～５０℃の間、４０℃～４５℃の間、４５℃～５５℃の間、４５℃～５０℃の間、５０℃～５５℃の間の温度でインキュベートできる。

【0036】

一部の場合、試料を捕捉剤に接触させたのち、過剰な捕捉剤は洗い流すことができる。一部の場合、洗浄ステップは、洗浄緩衝液を使用して実施することができる。洗浄緩衝液は、試料、結合した捕捉剤、または捕捉剤に結合しているオリゴヌクレオチドに有意な影響を及ぼすことなく過剰な捕捉剤を洗い流すことができるいかなる緩衝液であってもよい。一部の場合、洗浄緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはクレブス緩衝液を含むことができる。

【0037】

一部の場合、洗浄緩衝液は、ブロッキング成分を含むことができる。洗浄緩衝液中に見出されるブロッキング成分は、タンパク質ブロッキング成分または核酸ブロッキング成分であり得る。例えば、洗浄緩衝液は、タンパク質ブロッキング成分としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むことができる。別の例として、洗浄緩衝液は、核酸ブロッキング成分として剪断サケＤＮＡを含むことができる。一部の場合、洗浄緩衝液は、１つよりも多いブロッキング成分を含むことができる。一部の場合、洗浄緩衝液は１、２、３、４、５、またはそれよりも多いブロッキング成分を含むことができる。いくつかの洗浄緩衝液は、タンパク質ブロッキング成分と核酸ブロッキング成分の組合せを含むことができる。ブロッキング成分は、本明細書に記載される任意のブロッキング成分またはブロッキング剤を含む、許容可能な任意のブロッキング成分を含むことができる。

【0038】

過剰な捕捉剤は、１回または複数回の洗浄で洗い流すことができる。一部の場合、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、または約６回の洗浄を実施することができる。一部の場合、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回の洗浄を実施することができる。一部の場合、１回以下、２回以下、３回以下、４回以下、５回以下、または６回以下の洗浄を実施することができる。一部の場合、１～６回の間、１～５回の間、１～４回の間、１～３回の間、１～２回の間、２～６回の間、２～５回の間、２～４回の間、２～３回の間、３～６回の間、３～５回の間、３～４回の間、４～６回の間、４～５回の間、または５～６回の間の洗浄を実施することができる。

【0039】

それぞれの洗浄は、約１０秒、約１５秒、約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、または約１５分続けることができる。それぞれの洗浄は、少なくとも１０秒、少なくとも１５秒、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも１０分、または少なくとも１５分続けることができる。一部の場合、洗浄は、１０秒未満の間続けることができる。それぞれの洗浄は、１０秒まで、１５秒まで、３０秒まで、１分まで、２分まで、３分まで、４分まで、５分まで、１０分まで、または１５分まで続けることができる。一部の場合、洗浄は、１５分間よりも多く続けることができる。それぞれの洗浄は、１０秒～１５分の間、１０秒～１０分の間、１０秒～５分の間、１０秒～１分の間、１０秒～３０秒の間、３０秒～１５分の間、３０秒～１０分の間、３０秒～５分の間、３０秒～１分の間、１分～１５分の間、１分～１０分の間、１分～５分の間、５分～１５分の間、５分～１０分の間、または１０分～１５分の間であり得る。

【0040】

洗浄は、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、または約５５℃の温度であり得る。一部の場合、洗浄は、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、少なくとも２０℃、少なくとも２１℃、少なくとも２２℃、少なくとも２３℃、少なくとも２４℃、少なくとも２５℃、少なくとも２６℃、少なくとも２７℃、少なくとも２８℃、少なくとも２９℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、または少なくとも５５℃の温度であり得る。一部の場合、洗浄は、４℃以下、５℃以下、６℃以下、７℃以下、８℃以下、９℃以下、１０℃以下、１１℃以下、１２℃以下、１３℃以下、１４℃以下、１５℃以下、１６℃以下、１７℃以下、１８℃以下、１９℃以下、２０℃以下、２１℃以下、２２℃以下、２３℃以下、２４℃以下、２５℃以下、２６℃以下、２７℃以下、２８℃以下、２９℃以下、３０℃以下、３５℃以下、４０℃以下、４５℃以下、５０℃以下、または５５℃以下の温度であり得る。一部の場合、洗浄は、４℃～５５℃の間、４℃～５０℃の間、４℃～４５℃の間、４℃～４０℃の間、４℃～３５℃の間、４℃～３０℃の間、４℃～２５℃の間、４℃～２０℃の間、４℃～１５℃の間、４℃～１０℃の間、１０℃～５５℃の間、１０℃～５０℃の間、１０℃～４５℃の間、１０℃～４０℃の間、１０℃～３５℃の間、１０℃～３０℃の間、１０℃～２５℃の間、１０℃～２０℃の間、１０℃～１５℃の間、１５℃～５５℃の間、１５℃～５０℃の間、１５℃～４５℃の間、１５℃～４０℃の間、１５℃～３５℃の間、１５℃～３０℃の間、１５℃～２５℃の間、１５℃～２０℃の間、２０℃～５５℃の間、２０℃～５０℃の間、２０℃～４５℃の間、２０℃～４０℃の間、２０℃～３５℃の間、２０℃～３０℃の間、２０℃～２５℃の間、２５℃～５５℃の間、２５℃～５０℃の間、２５℃～４５℃の間、２５℃～４０℃の間、２５℃～３５℃の間、２５℃～３０℃の間、３０℃～５５℃の間、３０℃～５０℃の間、３０℃～４５℃の間、３０℃～４０℃の間、３０℃～３５℃の間、３５℃～５５℃の間、３５℃～５０℃の間、３５℃～４５℃の間、３５℃～４０℃の間、４０℃～５５℃の間、４０℃～５０℃の間、４０℃～４５℃の間、４５℃～５５℃の間、４５℃～５０℃の間、または５０℃～５５℃の間の温度であり得る。

【0041】

一部の場合、生体試料に接触すると、抗体または抗体断片は、生体試料の構成要素に結合され得る。抗体または抗体断片は、生体試料の構成要素に可逆的にまたは不可逆的に結合することができる。抗体または抗体断片が生体試料の構成要素にどのように結合することができるかの例としては、イオン結合または非イオン結合を挙げることができる。

【0042】

抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ポリクローナル抗体（antiboy）、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、またはダイアボディを含むことができる。一部の場合、抗体または抗体断片は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ラクダ、またはヤギ由来であり得る。一部の場合、抗体または抗体断片は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ウサギ、ミバエ、カエル、線虫動物またはウッドチャックの抗原に対して惹起できる。一部の場合、抗体または抗体断片は、動物、植物、細菌、真菌、または原生生物の抗原に対して惹起できる。一部の場合、抗体または抗体断片は、ウイルス、ウイルスベクター、またはプリオンに対して惹起できる。

【0043】

抗体または抗体断片は、試料の構成要素に対して感度を有することができる。一部の場合、試料の構成要素は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または脂質を含むことができる。一部の場合、感度とは、抗体または抗体断片により正しく明白に識別される構成要素の割合を指すことができる。抗体または抗体断片は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の感度を有することができる。

【0044】

抗体または抗体断片は、試料の構成要素に対して特異性を有することができる。一部の場合、試料の構成要素は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または脂質を含むことができる。一部の場合、特異性とは、抗体または抗体断片が他の構成要素よりも所与の構成要素に結合する優先度を指すことができる。抗体または抗体断片は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の特異性を有することができる。

【0045】

抗体または抗体断片は、試料の構成要素に対する親和性を有することができる。一部の場合、親和性とは、抗体がどれほど迅速にまたはどれほど強力に構成要素に結合することができるかを指すことができる。親和性は、解離定数（Ｋｄ）により記述することもできる。抗体または抗体断片は、１０^－４Ｍ以下、１０^－５Ｍ以下、１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下、１０^－１３Ｍ以下、または１０^－１４Ｍ以下の親和性を有することができる。

【0046】

抗体または抗体断片は、生体試料の構成要素の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に結合することができる。一部の場合、生体試料との接触後に結合している抗体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、生体試料の構成要素に結合され得る。一部の場合、非特異的結合抗体は、試料に結合している前記抗体の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、または４０％未満を構成する。一部の場合、試料に結合していない抗体は、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、または６０分までのインキュベーション後に洗い流すことができる。一部の場合、試料に結合していない抗体は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間にわたるインキュベーション後に洗い流すことができる。一部の場合、試料に結合していない抗体は、０．５日、１日、２日、３日、４日または５日の長さにわたるインキュベーション後に洗い流すことができる。

【0047】

固定および架橋
捕捉剤は、試料に固定することができる。一部の場合、目的の生物学的特徴に結合している捕捉剤だけを試料に固定することができる。一部の場合、目的の生物学的特徴に結合している捕捉剤すべてを試料に固定することができる。試料への捕捉剤の固定は、一部の場合、過剰な（例えば、結合していない）捕捉剤を洗い流した後に実施することができる。

【0048】

一部の実施形態では、捕捉剤は、試料に架橋または固定され、それにより、後続のステップの間に捕捉剤が解離するのを防ぎ得る。一部の場合、架橋は、ＲＣＡ反応中にまたは１つもしくは複数の標識の不活化もしくは除去中に捕捉剤が解離するのを防ぐことができる。したがって、試料への捕捉剤の固定または架橋は、ＲＣＡ反応が試料上（溶液中ではなく）で実施されることを可能にでき、読取りの複数の反復が実施されることを可能にすることによりアッセイの多重化を可能にできる。なぜならば、捕捉剤を妨害することなく標識を除去するまたは不活化することができるからである。この架橋ステップは、任意のアミン－アミン架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、グルタル酸ジスクシンイミジル（disuccinimiyllutarate）または類似する作用の別の試薬）を使用して行ってもよいが、所望であれば、種々の他のケミストリーを使用して、試料に捕捉剤を架橋することができる。

【0049】

オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの鎖であり得る分子であり得る。本明細書の方法、キット、および組成物は、３つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドに接触することができ、第２のオリゴヌクレオチドは第３のオリゴヌクレオチドに接触することができる。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、リボ核酸を含むことができる。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸を含むことができる。一部の場合、オリゴヌクレオチドは、ユーザー指定配列を含む、いかなる配列であってもよい。ユーザー指定配列などの配列の一部は、それが別のオリゴヌクレオチドに相補的であり得るように設計することができる。一部の場合、３つのオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの一部が第２のオリゴヌクレオチドの第１の部分に相補的であることができ、第２のオリゴヌクレオチドの第２の部分が第３のオリゴヌクレオチドの一部に相補的であることができるように、ユーザーにより設計されたものであってもよい。

【0050】

オリゴヌクレオチドは、核酸塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、もしくはそれらの組合せ、または相補的ヌクレオチドと確実に塩基対合することができる塩基を含むことができる場合もある。７－デアザ－アデニン、７－デアザ－グアニン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、２－デアザ－２－チオ－グアノシン、２－チオ－７－デアザ－グアノシン、２－チオ－アデニン、２－チオ－７－デアザーアデニン、イソグアニン、７－デアザ－グアニン、５，６－ジヒドロウリジン、５，６－ジヒドロチミン、キサンチン、７－デアザ－キサンチン、ヒポキサンチン、７－デアザ－キサンチン、２，６ジアミノ－７－デアザプリン、５－メチル－シトシン、５－プロピニル－ウリジン、５－プロピニル－シチジン、２－チオ－チミンまたは２－チオ－ウリジンは、そのような塩基の例であるが、他にも多くが公知である。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、またはモルフォリノオリゴマーでもよい。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは、天然のまたは非天然のヌクレオチドまたは連結を含有していてもよい。

【0051】

本明細書では、抗体または抗体断片などの捕捉剤は、抗体または抗体断片の少なくとも一部が生体試料の構成要素と接触しているように、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。次に、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域に接触することができる。次に、第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドに接触することができ、第３のオリゴヌクレオチドは検出成分を含むことができる。

【0052】

一部の場合、オリゴヌクレオチドは、捕捉剤上のいかなる適切な化学的部分を直接使用して捕捉剤にコンジュゲートするまたは結合させることができる。一部の場合、オリゴヌクレオチドは、例えば、ライゲーションにより捕捉剤に酵素的に連結することができる。一部の場合、オリゴヌクレオチドは、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用もしくはその等価物などの非共有結合相互作用を介して、アプタマーもしくは二次抗体を介して、またはロイシンジッパータグ相互作用もしくは同類のものなどのタンパク質－タンパク質相互作用を介して、捕捉剤に間接的に連結することができる。

【0053】

一部の場合、オリゴヌクレオチドは、クリックケミストリー、または類似の方法を使用して捕捉剤に結合させることができる。クリックケミストリーとは、オリゴヌクレオチドおよび捕捉剤などの分子を結合させることが可能なクラスの生体適合性小分子反応を指すことができる。クリック反応はワンポット反応であり得、一部の場合、水によって妨げられない。クリック反応は、最小の副産物、有害ではない副産物を生み出す場合がある、または副産物を生じない場合がある。クリック反応は、大きな熱力学力により駆動することができる。一部の場合、クリック反応は、高収率の単一反応生成物（例えば、捕捉剤にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド）へと急速におよび／または不可逆的に駆動されることができ、高い反応特異性を有することができる。クリック反応は、これらに限定されないが、［３＋２］環化付加、チオール－エン反応、ディールスアルダー反応、逆電子要請型ディールスアルダー反応、［４＋１］環化付加、求核置換、尿素のカルボニルケミストリー様形成（carbonyl-chemistry-like formation）、または炭素－炭素二重結合への付加反応（例えば、ジヒドロキシル化）を含むことができる。

【0054】

一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができる。選択された場合では、第１のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含むことができる。合成ヌクレオチドの例としては、ＲＮＡ類似体またはＤＮＡ類似体を含んでもよい。いくつかの合成ヌクレオチドは、人工核酸を含むことができ、この人工核酸はペプチド核酸、モルフォリノおよびロックド核酸、グリコール核酸、またはトレオース核酸を含んでいてもよい。

【0055】

第１のオリゴヌクレオチドは、適用に適した所与の長さを有することができる。一部の場合、もっと長いオリゴヌクレオチドを選択してもよい。一部の場合、もっと短いオリゴヌクレオチドを選択してもよい。一部の場合、オリゴヌクレオチド長を選択する場合、長所と短所を評価してもよく、それら長所と短所は、融解温度、二次構造、三次構造、親和性、特異性、選択性、費用、または考えられるバーコードの数を含んでいてもよい。

【0056】

一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。

【0057】

一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間であり得る。

【0058】

一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長であり得る。

【0059】

一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖であり得る。一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖であり得る。一部の場合、部分的に二本鎖である領域は、ヌクレオチドの３’末端に、ヌクレオチドの５’末端に、またはヌクレオチドの５’末端と３’末端との間に存在し得る。一部の場合、１つよりも多い二本鎖領域が存在してもよい。いくつかの第１のオリゴヌクレオチドは、二次構造、三次構造を有していてもよい。いくつかの第１のオリゴヌクレオチドは、一本鎖の折り畳みおよび／またはそれ自体とのその相補性が、一本鎖を含む１つまたは複数の二本鎖領域を生成できるように二次構造を有していてもよい。

【0060】

第２のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域で第１のオリゴヌクレオチドと接触することができる。この相互作用は、塩基対合を介して起こり得る。

【0061】

第２のオリゴヌクレオチドの第１結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり得る。一部の場合、第１の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的であり得る。一部の場合、第１の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的であり得る。一部の場合、第１の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間の領域に相補的であり得る。一部の場合、第１の結合領域は、オリゴヌクレオチド全体に相補的であり得る。一部の場合、第１の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドの１００％未満に相補的であり得る。

【0062】

一部の場合、そのような第１の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。一部の場合、そのような第１の結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり得る。一部の場合、そのような第１の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。一部の場合、そのような第１の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間であり得る。一部の場合、そのような第１の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長であり得る。一部の場合、そのような第１の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含むことができる。

【0063】

一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。

【0064】

一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間であり得る。

【0065】

一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長であり得る。

【0066】

一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖であり得る。一部の場合、第１のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖であり得る。一部の場合、部分的に二本鎖である領域は、ヌクレオチドの３’末端に、ヌクレオチドの５’末端に、またはヌクレオチドの５’末端と３’末端との間に存在し得る。一部の場合、１つよりも多い二本鎖領域が存在してもよい。いくつかの第２のオリゴヌクレオチドは、二次構造または三次構造を有していてもよい。いくつかの第２のオリゴヌクレオチドは、一本鎖の折り畳みおよび／またはそれ自体とのその相補性が、一本鎖を含む１つまたは複数の二本鎖領域を生成できるように二次構造を有していてもよい。一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、１つよりも多いオリゴヌクレオチドを含むことができる。一部の場合、オリゴヌクレオチドの鎖は、第１のオリゴヌクレオチドを第３のオリゴヌクレオチドと接続して形成してもよい。

【0067】

第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域で第２のオリゴヌクレオチドと接触することができる。この相互作用は、塩基対合を介して起こることができる。

【0068】

第２のオリゴヌクレオチドの第２結合領域は、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり得る。一部の場合、第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的であり得る。一部の場合、第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的であり得る。一部の場合、第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間の領域に相補的であり得る。一部の場合、第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチド全体に相補的であり得る。一部の場合、第２の結合領域は、第３のオリゴヌクレオチドの１００％未満に相補的であることであり得る。

【0069】

一部の場合、そのような第２の結合領域は、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。一部の場合、そのような第２の結合領域は、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり得る。一部の場合、そのような第２の結合領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。一部の場合、そのような第２の結合領域は、５～１０ヌクレオチド長の間、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間であり得る。一部の場合、そのような第２の結合領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長であり得る。一部の場合、そのような第２の結合領域は、１つまたは複数の合成ヌクレオチドを含むことができる。

【0070】

一部の場合、第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。

【0071】

一部の場合、第３のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の間、１０～５０ヌクレオチド長の間、１０～７０ヌクレオチド長の間、１０～１００ヌクレオチド長の間、２０～５０ヌクレオチド長の間、２０～７０ヌクレオチド長の間、２０～１００ヌクレオチド長の間、３０～５０ヌクレオチド長の間、３０～７０ヌクレオチド長の間、３０～１００ヌクレオチド長の間、４０～７０ヌクレオチド長の間、４０～１００ヌクレオチド長の間、５０～７０ヌクレオチド長の間、５０～１００ヌクレオチド長の間、６０～７０ヌクレオチド長の間、６０～８０ヌクレオチド長の間、６０～９０ヌクレオチド長の間、または６０～１００ヌクレオチド長の間であり得る。

【0072】

一部の場合、第３のオリゴヌクレオチドは、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、または１００以下のヌクレオチド長であり得る。

【0073】

一部の場合、第３のオリゴヌクレオチドは、完全に一本鎖であり得る。一部の場合、第３のオリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖であり得る。一部の場合、部分的に二本鎖である領域は、ヌクレオチドの３’末端に、ヌクレオチドの５’末端に、またはヌクレオチドの５’末端と３’末端との間に存在し得る。一部の場合、１つよりも多い二本鎖領域が存在してもよい。いくつかの第３のオリゴヌクレオチドは、二次構造を有していてもよい。いくつかの第３のオリゴヌクレオチドは、一本鎖の折り畳みおよび／またはそれ自体とのその相補性が、一本鎖を含む１つまたは複数の二本鎖領域を生成できるように二次構造を有していてもよい。一部の場合、第２のオリゴヌクレオチドは、１つよりも多いオリゴヌクレオチドを含むことができる。一部の場合、オリゴヌクレオチドの鎖は、第１のオリゴヌクレオチドを第３のオリゴヌクレオチドと接続して形成してもよい。

【0074】

検出成分
本明細書に記載のように、検出成分は最後のオリゴヌクレオチドに付けられ得る。検出成分の例として、例えば標識を挙げることができる。検出成分は、フルオロフォア、放射性同位体、比色分析反応を生じ得る分子、または磁気粒子であり得る。

【0075】

一部の実施形態では、検出されたシグナルは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって生成され、他の実施形態では、検出はラマン分光法、赤外検出、または磁気／電気的検出によって行われ得る。一部の実施形態では、検出ステップは、限定はされないが、ハイブリダイゼーション連鎖反応、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅等を含む、二次核酸増幅ステップを含み得る。

【0076】

一部の場合では、検出成分は除去され得る。除去は、洗浄により、切断により、酵素反応により、分解により、化学的な変更により、または他の手段により達成され得る。

【0077】

本発明の方法で有用である好適な識別可能な蛍光標識対としては、Ｃｙ－３とＣｙ－５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｑｕａｓａｒ ５７０とＱｕａｓａｒ ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖａｔｏ ＣＡ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５とＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＢＯＤＩＰＹ Ｖ－１００２とＢＯＤＩＰＹ Ｖ１００５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＰＯＰＯ－３とＴＯＴＯ－３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、およびＰＯＰＲ０３とＴＯＰＲ０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が挙げられる。さらなる好適な識別可能な検出可能標識は、Kricka et al.（Ann Clin Biochem. 39:114-29, 2002）、Ried et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. 1992: 89: 1388- 1392）およびTanke et al.（Eur. J. Hum. Genet. 1999 7:2-11）ならびにその他に見出され得る。一部の実施形態では、３または４個の識別可能な色素が使用され得る。目的の特定の蛍光色素としては：キサンテン色素、例えば、フルオロセインおよびローダミン色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６－カルボキシフルオレセイン（一般に略語ＦＡＭおよびＦにより公知）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、およびローダミン１１０；シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、ＢＯＤＩＰＹ色素およびキノリン色素が挙げられる。本出願で通常使用される目的の特定のフルオロフォアとしては：ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒｌ １０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ナフトフルオレセイン（Napthofluorescein）、テキサスレッド、Ｃｙ３、およびＣｙ５等が挙げられる。一部の実施形態では、プローブの各サブセット内で、フルオロフォアは、それらが互いに識別可能であるように、すなわち互いに独立して検出可能であるように、選択され得、このことは、標識が混合される場合でさえも、標識が独立して検出および測定され得ることを意味する。言い換えると、各標識に対して存在する標識の量（例えば、蛍光の量）は、それらの標識が同じ場所に局在する場合（例えば、同じチューブ内または切片の同じ領域内）でさえも別々に検出可能である。

【0078】

標識は、例えば、プロ－フルオロフォア、二次活性化可能なフルオロフォア、蛍光タンパク質、可視染色、多染性バーコード、マスタグ（例えば、同位体または規定したサイズのポリマー）、標識フリー検出のための構造タグ、放射線感受性タグ（ＴＨｚカメラによって活性化される）、放射性タグ、または例えば特定の波長でのみ光を吸収する光吸収タグであり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアを送達する酵素を送達し得るか、またはシグナルの酵素的な増幅が起こり得る。一部の場合では、標識の検出可能なシグナルは、一部の場合では蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ラマン分光法、赤外検出、または磁気／電気的検出によって生成され得る。

【0079】

一部の場合では、検出成分は、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。ＨＰＲは、西洋ワサビの根に見出され得る酵素であり得る。ＨＰＲは金属酵素であり得る。一部の場合では、ＨＲＰはいくつかのアイソフォームの１つで存在し得る。時には、アイソフォームはＣ型であり得る。

【0080】

検出成分がＨＲＰである場合、検出は、ＨＲＰの酵素活性を検出することによって達成され得る。一部の場合では、これはＨＲＰを、酸化され得る基質（これは有機基質であり得る）に曝露することによって達成され得る。一部の場合では、基質はＨＲＰによって酸化され得、時には酸化した基質が検出され得る。一部の実施形態では、有機基質であり得る基質の酸化は過酸化水素により得、ここで、ＨＲＰは過酸化水素による基質の酸化を触媒することができる。一部の例では、検出は、視覚的、または分光光度的であり得、またはカメラを使用して、もしくは他の検出手段によって実施され得る。

【0081】

一部の場合では、天然のＨＲＰを模倣する物質が検出成分であり得る。例えば、ＨＲＰ様人工酵素が使用され得る。例えば、ＨＲＰを模倣する物質は、酸化鉄ナノ粒子またはヘミン含有複合体であり得る。

【0082】

検出成分は、最後のオリゴヌクレオチドの任意の位置に局在し得る。一部の場合では、検出成分は、最後のオリゴヌクレオチドの３’末端にあり得る。一部の場合では、検出成分は、最後のオリゴヌクレオチドの４’末端にあり得る。一部の場合では、検出成分は、最後のオリゴヌクレオチドの３’末端と４’末端との間にあり得る。

【0083】

一部の場合では、最後のオリゴヌクレオチドはフルオロフォアである検出成分を含み、最後のオリゴヌクレオチドはクエンチャーをさらに含み得る。一部の場合では、最後のオリゴヌクレオチドは、未結合の場合、二次構造を有することができ、この二次構造はフルオロフォアの近くにクエンチャーを運び得る。フルオロフォアへのクエンチャーの接近は、そのフルオロフォアからのシグナルの検出を妨げ得る。第２のオリゴヌクレオチドと塩基対形成すると、最後のオリゴヌクレオチドは構造変化を受けることができ、フルオロフォアからクエンチャーを空間的に分けることができ、フルオロフォアから生じる蛍光シグナルの検出を可能にし得る。

【0084】

リンカー
本明細書の組成物では、異なる分子が１つまたは複数のリンカーを介して接続され得る。例えば、捕捉剤がリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合され得る。

【0085】

リンカーは、直接結合、すなわち酸素もしくは硫黄のような原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨのようなユニット、または原子の鎖、例えば置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール、を含むことができ、ここで１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な連結基、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロ複素環によって中断もしくは終結されてよく、式中Ｒ１は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。

【0086】

一部の場合では、リンカーは核酸リンカーであり得る。「核酸リンカー」は、化合物の２つの部分、例えば標識部分に親和性分子を接続する核酸であり得る。核酸リンカーは、一本鎖、完全に二本鎖、または部分的に二本鎖であり得る。核酸リンカーは任意の長さであり得る。例えば、核酸リンカーは１ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長であり得る。核酸リンカーが二本鎖である場合、リンカーは約６～約１００連続塩基対の二本鎖領域を含み得る。しかしながら、二重鎖領域は、二重の鎖の１つまたは両方において１つまたは複数の一本鎖領域によって中断され得る。さらに、二本鎖核酸リンカーは、二本鎖領域の１つまたは両方の末端において一本鎖オーバーハングを含み得る。さらに、核酸リンカーは、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸修飾物を含み得る。核酸リンカーは、非核酸リンカーによって化合物に結合され得る。

【0087】

一部の場合では、リンカーは、核酸リンカーではない任意のリンカーであり得る「非核酸リンカー」であり得る。

【0088】

リンカーは、分子を共有結合または非共有結合により連結し得る。したがって、一部の実施形態では、捕捉剤およびオリゴヌクレオチドは、非核酸リンカーを使用して互いに共有結合により連結され得る。例えば、捕捉剤およびオリゴヌクレオチドは、結合、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＳＭＣＣ）リンカー、スルホ－ＳＭＣＣリンカー、スクシンイミジル－６－ヒドラジノ－ニコチンアミド（Ｓ－ＨｙＮｉｃ）リンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド（Ｓ－４ＦＢ）リンカー、ビスアリールヒドラゾン結合（Ｓ－ＨｙＮｉｃ／Ｓ－４ＦＢ反応から）、ゼロ長ペプチド結合（直接親和性分子および核酸上の－ＣＯＯＨと－ＮＨ_２の間の結合）、スペーサーにおける２つのペプチド結合（２つの－ＮＨ_２基の架橋からの結合）、トリアゾール結合（「クリック」反応からの結合）、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート（phsophothioate）結合、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるリンカーを介して互いに共有結合により連結され得る。別の例では、プローブおよび標識は、結合、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＳＭＣＣ）リンカー、スルホ－ＳＭＣＣリンカー、スクシンイミジル－６－ヒドラジノ－ニコチンアミド（Ｓ－ＨｙＮｉｃ）リンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド（Ｓ－４ＦＢ）リンカー、ビスアリールヒドラゾン結合（Ｓ－ＨｙＮｉｃ／Ｓ－４ＦＢ反応からの結合）、ゼロ長ペプチド結合（直接親和性分子および核酸の－ＣＯＯＨと－ＮＨ_２の間の結合）、スペーサーにおける２つのペプチド結合（２つの－ＮＨ_２基の架橋からの結合）、トリアゾール結合（「クリック」反応からの結合）、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート（phsophothioate）結合、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるリンカーを介して互いに共有結合により連結され得る。

【0089】

実験条件および方法
実験ワークフローの試料の概要は、生体試料を、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片と接触させるステップ、第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触させるステップ、前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域を、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、それにより前記生体試料を前記検出成分に接続によって結合させるステップ、を含み得る。実験ワークフローは、連続的であってよく、一部の場合ではステップは組み合わされてよい。

【0090】

生体試料は、本明細書に記載の方法の前にまたは本明細書に記載の方法の一部として入手または調製され得る。生体試料の非限定的な例としては、組織、細胞、または器官が挙げられ得る。

【0091】

一部の場合では、タンパク質ブロッキング剤は、捕捉剤の適用前に試料に適用され得る。

【0092】

捕捉剤（または複数の捕捉剤）は、試料上でインキュベートされ得る。捕捉剤は、本明細書に記載のように、各捕捉剤が異なるオリゴヌクレオチドに連結されるように、オリゴヌクレオチドに連結され得る。一部の場合では、一度に１つの捕捉剤が同時に試料とインキュベートされ得る。一部の場合では、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の捕捉剤が同時に試料とインキュベートされ得る。一部の場合では、すべての捕捉剤が同時に試料とインキュベートされ得る。

【0093】

捕捉剤は、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、または約６時間インキュベートされ得る。一部の場合では、捕捉剤は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間インキュベートされ得る。一部の場合では、捕捉剤は、１分間以下、２分間以下、５分間以下、１０分間以下、２０分間以下、３０分間以下、１時間以下、２時間以下、３時間以下、４時間以下、５時間以下、または６時間以下インキュベートされ得る。一部の場合では、捕捉剤は、１分間と６時間の間、１分間と５時間の間、１分間と４時間の間、１分間と３時間の間、１分間と２時間の間、１分間と１時間の間、１分間と３０分間の間、１分間と２０分間の間、１分間と１０分間の間、１分間と５分間の間、１分間と２分間の間、２分間と６時間の間、２分間と５時間の間、２分間と４時間の間、２分間と３時間の間、２分間と２時間の間、２分間と１時間の間、２分間と３０分間の間、２分間と２０分間の間、２分間と１０分間の間、２分間と５分間の間、５分間と６時間の間、５分間と５時間の間、５分間と４時間の間、５分間と３時間の間、５分間と２時間の間、５分間と１時間の間、５分間と３０分間の間、５分間と２０分間の間、５分間と１０分間の間、１０分間と６時間の間、１０分間と５時間の間、１０分間と４時間の間、１０分間と３時間の間、１０分間と２時間の間、１０分間と１時間の間、１０分間と３０分間の間、１０分間と２０分間の間、２０分間と６時間の間、２０分間と５時間の間、２０分間と４時間の間、２０分間と３時間の間、２０分間と２時間の間、２０分間と１時間の間、２０分間と３０分間の間、３０分間と６時間の間、３０分間と５時間の間、３０分間と４時間の間、３０分間と３時間の間、３０分間と２時間の間、３０分間と１時間の間、１時間と６時間の間、１時間と５時間の間、１時間と４時間の間、１時間と３時間の間、１時間と２時間の間、２時間と６時間の間、２時間と５時間の間、２時間と４時間の間、２時間と３時間の間、３時間と６時間の間、３時間と５時間の間、３時間と４時間の間、４時間と６時間の間、４時間と５時間の間、または５時間と６時間の間インキュベートされ得る。

【0094】

捕捉剤とのインキュベーション後、試料を洗浄して過剰な捕捉剤を除去することができる。洗浄は、一定量の時間の間、試料に緩衝液を適用してその緩衝液を除去するステップを含み得る。一部の場合では、洗浄は、試料の回旋、振盪、揺動、または振動によるなど、穏やかな撹拌を含み得る。洗浄は、少なくとも５０μＬ、少なくとも１００μＬ、少なくとも５００μＬ、少なくとも１ｍＬ、少なくとも５ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも３０ｍＬ、少なくとも４０ｍＬ、または少なくとも５０ｍＬの緩衝液を試料に適用するステップを含み得る。洗浄は、５０μＬ以下、１００μＬ以下、５００μＬ以下、１ｍＬ以下、５ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、２０ｍＬ以下、３０ｍＬ以下、４０ｍＬ以下、または５０ｍＬ以下の緩衝液を試料に適用するステップを含み得る。一部の場合では、洗浄は、５０μＬと５０ｍＬの間、５０μＬと４０ｍＬの間、５０μＬと３０ｍＬの間、５０μＬと２０ｍＬの間、５０μＬと１０ｍＬの間、５０μＬと５ｍＬの間、５０μＬと１ｍＬの間、５０μＬと５００μＬの間、５０μＬと１００μＬの間、１００μＬと５０ｍＬの間、１００μＬと４０ｍＬの間、１００μＬと３０ｍＬの間、１００μＬと２０ｍＬの間、１００μＬと１０ｍＬの間、１００μＬと５ｍＬの間、１００μＬと１ｍＬの間、１００μＬと５００μＬの間、５００μＬと５０ｍＬの間、５００μＬと４０ｍＬの間、５００μＬと３０ｍＬの間、５００μＬと２０ｍＬの間、５００μＬと１０ｍＬの間、５００μＬと５ｍＬの間、５００μＬと１ｍＬの間、１ｍＬと５０ｍＬの間、１ｍＬと４０ｍＬの間、１ｍＬと３０ｍＬの間、１ｍＬと２０ｍＬの間、１ｍＬと１０ｍＬの間、１ｍＬと５ｍＬの間、５ｍＬと５０ｍＬの間、５ｍＬと４０ｍＬの間、５ｍＬと３０ｍＬの間、５ｍＬと２０ｍＬの間、５ｍＬと１０ｍＬの間、１０ｍＬと５０ｍＬの間、１０ｍＬと４０ｍＬの間、１０ｍＬと３０ｍＬの間、１０ｍＬと２０ｍＬの間、２０ｍＬと５０ｍＬの間、２０ｍＬと４０ｍＬの間、２０ｍＬと３０ｍＬの間、３０ｍＬと５０ｍＬの間、３０ｍＬと４０ｍＬの間、または４０ｍＬと５０ｍＬの間の緩衝液を試料に適用するステップを含み得る。洗浄緩衝液は、任意の許容される緩衝液であり得る。一部の場合では、洗浄緩衝液は、例えば捕捉剤が入っている同じ緩衝液、またはＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、またはＴＢＳ－Ｔのような別の緩衝液であり得る。洗浄ステップは、少なくとも１０秒間、少なくとも３０秒間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、または少なくとも１５分間続き得る。洗浄ステップは、最長１０秒まで、最長３０秒まで、最長１分まで、最長２分まで、最長３分まで、最長４分まで、最長５分まで、最長１０分まで、または最長１５分まで続き得る。洗浄ステップは、１０秒間と１５分間の間、１０秒間と１０分間の間、１０秒間と５分間の間、１０秒間と３０秒間の間、３０秒間と１５分間の間、３０秒間と１０分間の間、３０秒間と５分間の間、３０秒間と１分間の間、１分間と１５分間の間、１分間と１０分間の間、１分間と５分間の間、５分間と１５分間の間、５分間と１０分間の間、または１分間と１５分間の間続き得る。洗浄ステップは、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上実施され得る。

【0095】

捕捉剤は、試料と架橋され得る。そのような架橋は、続くステップ中に捕捉剤が解離するのを防ぎ得る。そのような架橋ステップは、任意のアミン－アミン架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタル酸ジスクシンイミジル（disuccinimiyllutarate）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または類似する作用の別の試薬）を使用して行われ得るが、所望であれば、様々な他のケミストリーを使用して捕捉剤を試料に架橋することができる。

【0096】

一部の場合では、核酸ブロッキング剤が試料に適用され得る。サケ精子ＤＮＡまたは別の市販品など、任意の許容される核酸ブロッキング剤がこのステップで使用され得る。

【0097】

一部の場合では、核酸ブロッキング剤は、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、または約４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、核酸ブロッキング剤は、少なくとも４℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、または少なくとも４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、核酸ブロッキング剤は、４℃以下、１０℃以下、１５℃以下、２０℃以下、２５℃以下、３０℃以下、３５℃以下、４０℃以下、または４５℃以下でインキュベートされ得る。一部の場合では、核酸ブロッキング剤は、４℃と４５℃の間、４℃と４０℃の間、４℃と３５℃の間、４℃と３０℃の間、４℃と２５℃の間、４℃と２０℃の間、４℃と１５℃の間、４℃と１０℃の間、１０℃と４５℃の間、１０℃と４０℃の間、１０℃と３５℃の間、１０℃と３０℃の間、１０℃と２５℃の間、１０℃と２０℃の間、１０℃と１５℃の間、１５℃と４５℃の間、１５℃と４０℃の間、１５℃と３５℃の間、１５℃と３０℃の間、１５℃と２５℃の間、１５℃と２０℃の間、２０℃と４５℃の間、２０℃と４０℃の間、２０℃と３５℃の間、２０℃と３０℃の間、２０℃と２５℃の間、２５℃と４５℃の間、２５℃と４０℃の間、２５℃と３５℃の間、２５℃と３０℃の間、３０℃と４５℃の間、３０℃と４０℃の間、３０℃と３５℃の間、３５℃と４５℃の間、３５℃と４０℃の間、または４０℃と４５℃の間でインキュベートされ得る。

【0098】

一部の場合では、ブロッキングステップは、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、または約６０分間続き得る。一部の場合では、ブロッキングステップは、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、または少なくとも６０分間続き得る。一部の場合では、ブロッキングステップは、１０分以下、２０分以下、３０分以下、４０分以下、５０分以下、または６０分以下続き得る。一部の場合では、ブロッキングステップは、１０分間と６０分間の間、１０分間と５０分間の間、１０分間と４０分間の間、１０分間と３０分間の間、１０分間と２０分間の間、２０分間と６０分間の間、２０分間と５０分間の間、２０分間と４０分間の間、２０分間と３０分間の間、３０分間と６０分間の間、３０分間と５０分間の間、３０分間と４０分間の間、４０分間と６０分間の間、４０分間と５０分間の間、または５０分間と６０分間の間続き得る。

【0099】

第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片は、第１の緩衝液中にあり得る。

【0100】

第２のオリゴヌクレオチドは、この第２のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする機会を持つように、試料上でインキュベートされ得る。

【0101】

一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、または約４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも４℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、または少なくとも４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、４℃以下、１０℃以下、１５℃以下、２０℃以下、２５℃以下、３０℃以下、３５℃以下、４０℃以下、または４５℃以下でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、４℃と４５℃の間、４℃と４０℃の間、４℃と３５℃の間、４℃と３０℃の間、４℃と２５℃の間、４℃と２０℃の間、４℃と１５℃の間、４℃と１０℃の間、１０℃と４５℃の間、１０℃と４０℃の間、１０℃と３５℃の間、１０℃と３０℃の間、１０℃と２５℃の間、１０℃と２０℃の間、１０℃と１５℃の間、１５℃と４５℃の間、１５℃と４０℃の間、１５℃と３５℃の間、１５℃と３０℃の間、１５℃と２５℃の間、１５℃と２０℃の間、２０℃と４５℃の間、２０℃と４０℃の間、２０℃と３５℃の間、２０℃と３０℃の間、２０℃と２５℃の間、２５℃と４５℃の間、２５℃と４０℃の間、２５℃と３５℃の間、２５℃と３０℃の間、３０℃と４５℃の間、３０℃と４０℃の間、３０℃と３５℃の間、３５℃と４５℃の間、３５℃と４０℃の間、または４０℃と４５℃の間でインキュベートされ得る。

【0102】

一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、または約６０分間試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、または少なくとも６０分間試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、１０分以下、２０分以下、３０分以下、４０分以下、５０分以下、または６０分以下試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、１０分間と６０分間の間、１０分間と５０分間の間、１０分間と４０分間の間、１０分間と３０分間の間、１０分間と２０分間の間、２０分間と６０分間の間、２０分間と５０分間の間、２０分間と４０分間の間、２０分間と３０分間の間、３０分間と６０分間の間、３０分間と５０分間の間、３０分間と４０分間の間、４０分間と６０分間の間、４０分間と５０分間の間、または５０分間と６０分間の間、試料上でインキュベートされ得る。

【0103】

第２のオリゴヌクレオチドは、第２の緩衝液中にあり得る。一部の場合では、第２の緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。

【0104】

第３のオリゴヌクレオチドは、この第３のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする機会を持つように、試料上でインキュベートされ得る。

【0105】

一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、または約４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも４℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、または少なくとも４５℃でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、４℃以下、１０℃以下、１５℃以下、２０℃以下、２５℃以下、３０℃以下、３５℃以下、４０℃以下、または４５℃以下でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、４℃と４５℃の間、４℃と４０℃の間、４℃と３５℃の間、４℃と３０℃の間、４℃と２５℃の間、４℃と２０℃の間、４℃と１５℃の間、４℃と１０℃の間、１０℃と４５℃の間、１０℃と４０℃の間、１０℃と３５℃の間、１０℃と３０℃の間、１０℃と２５℃の間、１０℃と２０℃の間、１０℃と１５℃の間、１５℃と４５℃の間、１５℃と４０℃の間、１５℃と３５℃の間、１５℃と３０℃の間、１５℃と２５℃の間、１５℃と２０℃の間、２０℃と４５℃の間、２０℃と４０℃の間、２０℃と３５℃の間、２０℃と３０℃の間、２０℃と２５℃の間、２５℃と４５℃の間、２５℃と４０℃の間、２５℃と３５℃の間、２５℃と３０℃の間、３０℃と４５℃の間、３０℃と４０℃の間、３０℃と３５℃の間、３５℃と４５℃の間、３５℃と４０℃の間、または４０℃と４５℃の間でインキュベートされ得る。

【0106】

一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、または約６０分間試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、または少なくとも６０分間試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、１０分以下、２０分以下、３０分以下、４０分以下、５０分以下、または６０分以下試料上でインキュベートされ得る。一部の場合では、第３のオリゴヌクレオチドは、１０分間と６０分間の間、１０分間と５０分間の間、１０分間と４０分間の間、１０分間と３０分間の間、１０分間と２０分間の間、２０分間と６０分間の間、２０分間と５０分間の間、２０分間と４０分間の間、２０分間と３０分間の間、３０分間と６０分間の間、３０分間と５０分間の間、３０分間と４０分間の間、４０分間と６０分間の間、４０分間と５０分間の間、または５０分間と６０分間の間、試料上でインキュベートされ得る。

【0107】

第３のオリゴヌクレオチドは、第３の緩衝液中にあり得る。一部の場合では、第３の緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。

【0108】

一部の場合では、第１の緩衝液は、第２の緩衝液と同じ、または実質的に同じであり得る。一部の場合では、第２の緩衝液は、第３の緩衝液と同じ、または実質的に同じであり得る。一部の場合では、第１の緩衝液は、第３の緩衝液と同じ、または実質的に同じであり得る。

【0109】

一部の場合では、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体は、第２のオリゴヌクレオチドと同じ緩衝液中にあってよく、その緩衝液は第１の代替の緩衝液であり得る。一部の場合では、第１の代替の緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。

【0110】

一部の場合では、第２のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドと同じ緩衝液中にあってよく、その緩衝液は第２の代替の緩衝液であり得る。一部の場合では、第２の代替の緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。

【0111】

一部の場合では、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体は、同じ緩衝液中にあってよく、その緩衝液は共通の緩衝液であり得る。一部の場合では、共通の緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。

【0112】

非限定的な例のプロトコールは、以下のように進行され得る。第１の緩衝液中の、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片の容積は、先に調製した試料上に重層され得る。インキュベーション時間が経過した後、一部の場合では、容積は洗い流され得る。一部の例では、洗浄に使用する緩衝液は、ＰＢＳ、ＰＢＳ－Ｔ、ＴＢＳ、ＴＢＳ－Ｔ水、生理食塩水、またはＫｒｅｂ緩衝液を含み得る。一部の場合では、洗浄に使用する緩衝液は、第１の緩衝液と同じ緩衝液であってよいが、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片を含まない。

【0113】

上記と類似のプロトコール中の任意のステップのインキュベーション時間は、最長１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、または６０分であり得る。上記と類似のプロトコール中の任意のステップのインキュベーション時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間であり得る。上記と類似のプロトコール中の任意のステップのインキュベーションは、約就業時間、約終夜、約週末、約１週間、または約１カ月続き得る。

【0114】

一部の適用のため、１つより多くの抗体または抗体断片が使用され得る。そのような場合では、異なる抗体または抗体断片が使用され得る。一部の場合では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の異なる抗体もしくは抗体断片が使用され得る。抗体または抗体断片は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％配列が異なり得る。一部の場合では、抗体または抗体断片は、１％と１０％の間、１％と２０％の間、１％と３０％の間、１％と４０％の間、５％と１０％の間、５％と２０％の間、５％と３０％の間、５％と４０％の間、１０％と２０％の間、１０％と３０％の間、または３０％と４０％の間異なり得る。

【0115】

一部の場合では、各異なる抗体または抗体断片は固有の第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。各第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上の塩基対が他の第１のオリゴヌクレオチドと異なり得る。一部の場合では、第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％他の第１のオリゴヌクレオチドと異なり得る。各第１のオリゴヌクレオチドは、他の第１のオリゴヌクレオチドと同じであり得る、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上の塩基対を有し得る。他の第１のオリゴヌクレオチドと同じである塩基対を有する第１のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上他の第１のオリゴヌクレオチドと同じである塩基対を有し得る。

【0116】

読み取り
試料は、１つまたは複数の捕捉剤の結合パターンを決定するために読み取られ得る。一部の場合では、試料は、各捕捉剤の結合パターンを決定するために読み取られ得る。そのような結合パターンは、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲートしている捕捉剤の空間情報を示し、次いで目的の生体特徴の空間情報を示し得る。

【0117】

そのような結合パターンを決定する方法は、試料を読み取り、そこから前のステップでハイブリダイズした捕捉剤の各サブセットの結合パターンが決定され得る（すなわち、異なる生体特徴に結合した異なる捕捉剤の結合パターン）画像を得るステップを含み得る。このステップは、任意の便利な読み取り方法を使用して行うことができ、一部の実施形態では、例えば、異なるプローブのハイブリダイゼーションが、各フルオロフォアに適切なフィルターを備えた、または複数のフルオロフォアを観察するために設置した二重または三重の帯域通過フィルターを使用することにより、蛍光顕微鏡を使用して別々に読み取られ得る（例えば、米国特許第５，７７６，６８８号を参照）。

【0118】

一部の場合、別の目的の生体特徴が標識と会合するのと同時に、標識と会合する目的の各生体特徴は、同じ反復中に読み取られ得る。同じ反復中に読み取られる標識は、異なり得る。２つの標識は、読み取り媒体を使用して検出したときに、それらが互いに区別可能である場合、異なると考えられ得る。例えば、２つの蛍光分子は、顕微鏡を使用して画像化したときに、例えば、励起波長、発光波長、強度、または一部の他の特徴により、それらのシグナルが互いに区別可能である場合、異なると考えられ得る。

【0119】

各読み取りは、捕捉剤のサブセットの結合のパターンを示す試料の画像を生成し得る。一部の実施形態では、方法は、少なくとも２つの画像を解析するステップ、比較するステップ、または重ね合わせるステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、方法は、すべての画像を重ね合わせ、すべての捕捉剤の試料への結合のパターンを示す画像を生成するステップをさらに含み得る。使用した画像解析モジュールは、各フルオロフォアからのシグナルを変換し、補助(false)カラー画像を複数生成し得る。画像解析モジュールは、補助カラー画像を複数重ね合わせ（例えば、各画素で補助カラーを重ねる）、多重の補助カラー画像を得ることができる。多重画像（例えば、重み付けしないまたは重み付けする）は、単一の補助カラーへと変換され、例えば、特定の捕捉剤の結合によって特徴付けられる目的の生体特徴を表すことができる。補助カラーは、ユーザーからの手動の入力に基づき、特定の捕捉剤または捕捉剤の組合せに割り当てられ得る。特定の態様では、画像は、例えば、核区画において、目的の特徴と会合する標識の強度にのみ関連する補助カラーを含み得る。画像解析モジュールは、強度および／またはシグナル強度または補助カラーのコントラストを調整（例えば正規化）するようにさらに設定され、畳み込み演算（例えば、強度または補助カラーのぶれまたは先鋭化）を実施し、または画像を増強する任意の他の好適な演算を実施することができる。画像解析モジュールは、上記の演算のいずれかを実施し、連続画像から得られる画素を揃え、および／または連続画像から得られる画素にわたる強度または補助カラーをぼやけさせるもしくは滑らかにすることができる。

【0120】

一部の実施形態では、試料の画像は、ｚ方向の異なる焦点平面で取ることができる。これらの光切片を使用して、試料の三次元画像を再構築することができる。光切片は、共焦点顕微鏡を使用して取ることができるが、他の方法も公知である。画像解析方法は、コンピューター上で実施することができる。ある特定の実施形態では、多目的のコンピューターが、本明細書に開示の方法およびプログラムの機能性の配置に構成され得る。そのようなコンピューターのハードウェアアーキテクチャは当業者に周知であり、１つまたは複数のプロセッサ（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、内部または外部データ保存媒体（例えばハードディスクドライブ）を含むハードウェア構成成分を含み得る。コンピューターシステムは、グラフィカル情報を処理してディスプレイ手段にアウトプットするための１つまたは複数のグラフィックボードも含み得る。上記の構成成分は、コンピューター内のバスを介して好適に相互接続され得る。コンピューターは、モニター、キーボード、マウス、ネットワーク等のような多目的の外部構成成分と通信するための好適なインターフェースをさらに含み得る。一部の実施形態では、コンピューターは、並列処理することができ、または並列もしくは分配計算のために構成されたネットワークの一部であり、本方法およびプログラムの処理力を増大させることができる。一部の実施形態では、記録媒体から読み出されたプログラムコードは、コンピューターに搭載された拡張ボード、またはコンピューターに接続された拡張ユニットに備えられたメモリーに書き込まれ得、そして拡張ボードまたは拡張ユニットに備えられたＣＰＵ等は、プログラムコードの命令に従って、一部またはすべての演算を実際に実行して、以下に記載の機能を達成できる。他の実施形態では、方法は、クラウドコンピューティングシステムを使用して実行され得る。これらの実施形態では、データファイルおよびプログラミングが、プログラムを実行し、ユーザーにアウトプットを返すクラウドコンピューターにエクスポートされ得る。

【0121】

不活性化および除去
標識は不活性化または除去され得る。不活性化または除去は、方法の多重化を可能することができ、不活性化または除去ステップがない場合よりも、より多くの複数の目的の生体特徴が検出できる。

【0122】

試料の読み出し後、方法は、複数の捕捉剤およびそれらの会合したオリゴヌクレオチドを依然として試料に結合させたまま、オリゴヌクレオチドと会合した（すなわちハイブリダイズした）標識を不活性化または除去するステップを含み得る。試料と会合した標識は、様々な方法によって除去または不活性化され得、その方法としては、限定はされないが、変性（この場合、標識およびその全体で結合するオリゴヌクレオチドが放出され得る、および洗い流され得る）、プローブの結合を切断すること（この場合、標識およびオリゴヌクレオチドの一部が放出され得る、および洗い流され得る）、標識が結合したオリゴヌクレオチド（第３のオリゴヌクレオチド）と、それとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（第２のオリゴヌクレオチド）との両方を切断し、洗い流され得る断片を放出すること、またはオリゴヌクレオチドと標識の間の結合を切断すること（この場合、標識が放出され得る、および洗い流され得る）、制限酵素を使用することによるなどオリゴヌクレオチドを切断すること（この場合、オリゴヌクレオチドと標識は洗い流され得る）、または標識自体を不活性化すること（例えば、標識における結合を切断し、それにより標識がシグナルを生成するのを防ぐこと、またはクエンチャーを標識へと導き、シグナルの検出を防ぐこと）が挙げられる。上述のような許容される除去方法では、他の抗体に結合した非ハイブリダイズオリゴヌクレオチド（例えば、まだ検出されない目的の生体特徴に結合する抗体）が無傷のままであり、次のサイクルで使用される標識したプローブのセットに自由にハイブリダイズできる。一部の実施形態では、蛍光は、光ベースの漂白、過酸化水素ベースの漂白、または切断可能リンカーを介してヌクレオチドに連結したフルオロフォアの切断（例えば、切断試薬としてＴＣＥＰを使用する）により不活性化され得る。

【0123】

一部の実施形態では、除去するステップは、変性により、試料からハイブリダイズしたプローブを除去することにより行われ、他の捕捉剤およびそれらが会合したオリゴヌクレオチドは、試料に依然として結合したままにされる。他の実施形態では、除去するステップは、変性により行われず、他の捕捉剤（すなわちプローブにハイブリダイズしない捕捉剤）およびそれらが会合したオリゴヌクレオチドは、試料に依然として結合したままにされる。これらの実施形態では、標識は、試料と会合する捕捉剤－３つのオリゴヌクレオチド－標識複合体における少なくとも１つの結合、または標識からオリゴヌクレオチドを連結するリンカーを切断することによって除去され得、それによりオリゴヌクレオチドから標識が放出される。この切断は、酵素的、化学的、または光への曝露を介して実施され得る。あるいは、標識は、光漂白により、または標識の化学的な変更により不活性化され得る。

【0124】

除去ステップが、変性により試料からハイブリダイズしたヌクレオチドを除去することにより実施されない場合、様々な化学ベース、酵素触媒または光誘導切断方法が使用され得る。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それらが化学物質または光への曝露により断片化され得るように、化学的または光切断可能な結合を含有し得る。一部の実施形態では、二重鎖（それらが二本鎖であるため）が、例えば制限酵素または二本鎖ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ（フラグメンターゼ）により切断され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ウラシル残基（ＵＳＥＲによって切断され得る）を含有し得る、またはミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼを使用して切断され得るミスマッチを含有するヘアピンを含有し得る。これらの実施形態の一部では、切断後、標識を含有するオリゴヌクレオチドの断片のＴｍは、オリゴヌクレオチドと塩基対形成を維持するのに不十分な高さであり、そのため断片がオリゴヌクレオチドから解離し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドと標識は、光切断可能または化学的に切断可能なリンカーによって接続され得る。このリンカーの切断は、試料から標識を放出し得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡであってよく、オリゴヌクレオチドはＲＮＡｓｅを使用して分解され得る。一部の実施形態では、酵素的に切断可能な結合が使用され得る。例えば、エステルはエステラーゼによって切断され、グリカンはグリカーゼによって切断され得る。あるいは、標識自体は、標識を改変することによって不活性化され得る。一例では、色素は光漂白され得るが、他の方法が公知である。

【0125】

一部の実施形態では、試料の読み出し後、方法は、変性により（すなわち、オリゴヌクレオチドから標識したプローブを非アニーリングし、それらを洗い流すことにより）、試料からハイブリダイズした第３のオリゴヌクレオチドを除去するステップを含み、捕捉剤およびそれらが会合したオリゴヌクレオチドが依然として試料に結合したままにされる。このステップは、任意の好適な化学変性剤、例えばホルムアミド、ＤＭＳＯ、尿素、またはカオトロピック剤（例えば、塩化グアニジウム等）を使用して、ｔｏｅｈｏｌｄ放出戦略を使用して（例えば、Kennedy-Darling, Chembiochem. 2014 15: 2353-2356を参照）、または熱、塩基、トポイソメラーゼまたは一本鎖結合剤（例えば、ＳＳＢＰ）を使用して行われ得る。このステップはまた、より優れた親和性を有するオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡ）のハイブリダイゼーションを通して達成され得る。一部の場合では、プローブは、少なくとも１分間（例えば１～５分間）、試料を７０％～９０％ホルムアミド（例えば、７５％～８５％ホルムアミド）中でインキュベートし、その後の洗浄によって除去され得る。この変性ステップは、必要であれば、すべてのハイブリダイズしたプローブが除去されるように繰り返され得る。明らかであるように、このステップは酵素的に実施されない、すなわちＤＮＡｓｅまたは制限酵素のようなヌクレアーゼを使用しないし、例えば任意のプローブもしくはオリゴヌクレオチドにおけるいずれかの共有結合の切断も、例えば試料からのいずれの捕捉剤の除去も生じない。このステップでは、プローブ／オリゴヌクレオチド二重鎖の鎖は互いに分けられ（すなわち、変性され）、溶液中で遊離している分けられたプローブは洗い流され、捕捉剤およびそれらの会合したオリゴヌクレオチドは、無傷で、もとあった場所に残される。

【0126】

切断可能な結合が使用される場合（例えば、オリゴヌクレオチド中で、またはオリゴヌクレオチドを標識に接続するために使用される場合）、切断可能なリンカーは、抗体に結合したオリゴヌクレオチドにおける結合を切断せずに、刺激（例えば、光またはその環境の変化）を使用して選択的に切断可能にすることができる。一部の実施形態では、切断可能な結合は、ジスルフィド結合であり得、このジスルフィド結合は還元剤（例えば、βメルカプトエタノールまたは別の好適な還元剤）を使用して容易に切断され得る。用いられ得る好適な切断可能な結合としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：塩基での切断可能部位、例えばエステル、特にコハク酸（例えば、アンモニアまたはトリメチルアミンによって切断可能）、第四級アンモニウム塩（例えば、ジイソプロピルアミンによって切断可能）、およびウレタン（水酸化ナトリウム水溶液によって切断可能）；酸での切断可能部位、例えばベンジルアルコール誘導体（トリフルオロ酢酸を使用して切断可能）、テイコプラニンアグリコン（トリフルオロ酢酸、続いて塩基によって切断可能）、アセタールおよびチオアセタール（トリフルオロ酢酸によっても切断可能）、チオエーテル（例えば，ＨＦまたはクレゾールによって切断可能）およびスルホニル（トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、チオアニソール等によって切断可能）；求核試薬での切断可能部位、例えばフタルアミド（置換したヒドラジンによって切断可能）、エステル（例えば、三塩化アルミニウムによって切断可能）；およびワインレブアミド（水素化アルミニウムリチウムによって切断可能）；ならびに他のタイプの化学的な切断可能部位として挙げられる、ホスホロチオエート（銀または水銀イオンによって切断可能）およびジイソプロピルジアルコキシシリル（フッ素イオンによって切断可能）。他の切断可能な結合は当業者に明らかであり、または関連文献および論文に記載される（例えば、Brown (1997) Contemporary Organic Synthesis 4(3); 216-237）。一部の実施形態では、切断可能な結合は、酵素によって切断され得る。

【0127】

特定の実施形態では、光切断可能（「ＰＣ」）リンカー（例えば、ｕｖ切断可能リンカー）が用いられ得る。使用のための好適な光切断可能リンカーとしては、Guillier et al（Chem Rev. 2000 Jun 14;100(6):2091-158）に記載のように、オルトニトロベンジル系リンカー、フェナシルリンカー、アルコキシベンゾインリンカー、アレーンクロム錯体リンカー、ＮｐＳＳＭｐａｃｔリンカーおよびピバロイルグリコールリンカーが挙げられ得る。本発明の方法で用いられ得る例示的な連結基は、上記のGuillier et al、およびOlejnik et al.（Methods in Enzymology 1998 291:135-154）に記載され、米国特許第６，０２７，８９０号；Olejnik et al.（Proc. Natl. Acad Sci, 92:7590-94）；Ogata et al.（Anal. Chem. 2002 74:4702-4708）；Bai et al. （Nucl. Acids Res. 2004 32:535-541）；Zhao et al.（Anal. Chem. 2002 74:4259-4268）；およびSanford et al.（Chem Mater. 1998 10:1510-20）にさらに記載され、Ａｍｂｅｒｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；ＮＨＳ－ＰＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ）、Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｌｌｓｈｉｌｌ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入可能である。

【0128】

反復方法
本明細書では、方法は、繰り返されるステップを含み得る。一部の場合では、これは、方法の繰り返しステップを含み得る。これは、ステップを繰り返さずに達成され得るよりも、より多くの複数の目的の生体特徴の検出を可能にし得る。

【0129】

標識の除去または不活性化後、試料は、さらなる標識（複数可）を含む標識したオリゴヌクレオチドの異なるセット（すなわち、第３のオリゴヌクレオチド（複数可）または第２のオリゴヌクレオチド（複数可）と第３のオリゴヌクレオチド（複数可）のセット（複数可））とハイブリダイズされ得る。試料は、再読み出しされ、ごく最近ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド（複数可）のそれぞれと会合した捕捉剤の結合パターンを示す画像を生成し得る。このようにして、試料の読み出しの異なる反復では、目的の別の生体特徴が検出され得る。試料が読み出された後、標識（複数可）は、例えば、変性、不活性化、または別の方法（上記のように）によって試料から除去され、ハイブリダイゼーションおよび読出しステップは、捕捉剤の別の異なるサブセットと会合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、識別可能な標識されたオリゴヌクレオチドの別の異なるセットを用いて繰り返され得る。言い換えると、方法は、ハイブリダイゼーション、標識除去または不活性化を繰り返すステップ、および標識したオリゴヌクレオチドの異なるサブセットで複数回読み出すステップを含むことができ、各サブセットのプローブは識別可能に標識され、各繰返しは標識の除去、例えば変性または別の方法に続けられ（最後の繰返しを除く）、試料の複数の画像を生成でき、各画像は、標識したオリゴヌクレオチドのサブセットと対応する。ハイブリダイゼーション／読み出し／標識除去または不活性化ステップは、所望の目的の生体特徴が解析されるまで繰り返され得る。

【0130】

使用したヌクレオチド配列は、非特異的吸着または内在性ゲノム配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）への結合のいずれかによるバックグラウンド染色を最小にするように選択され得る。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液は、非特異的吸着または内在性ゲノム配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）への結合または他のレポーター配列への結合のいずれかによるバックグラウンド染色を最小にするように設計され得る。

【0131】

上記の標識方法に加えて、上記の方法を実施する前または後のいずれかに、試料は、細胞染色を使用して染色され得る。これらの実施形態では、染色剤は、例えば、ファロイジン、ガドジアミド、アクリジンオレンジ、ビスマルクブラウン、バルミン、クマシーブルー、ブレシルバイオレット（bresyl violet）、ブリスタルバイオレット（brystal violet）、ＤＡＰＩ、ヘマトキシリン、エオシン、臭化エチジウム、酸性フクシン、ヘマトキシリン、ヘキスト染色剤、ヨウ素、マラカイトグリーン、メチルグリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、オスミウム酸（正式名：四酸化オスミウム）、ローダミン、サフラニン、リンタングステン酸、四酸化オスミウム、四酸化ルテニウム、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛（ＩＩ）、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン銀、塩化金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ラウニル、硝酸ラウニル、硫酸バナジル、またはそれらの任意の誘導体であり得る。染色剤は、タンパク質またはタンパク質の１類、リン脂質、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、小器官（例えば、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、核膜または他の小器官）、または細胞の区画（例えば、サイトゾル、核区画、または他の区画）などの目的の任意の特徴に対して特異的であり得る。染色剤は、細胞内もしくは細胞外構造のコントラストまたは画像化を向上させ得る。一部の実施形態では、試料は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色され得る。

【0132】

キット
また、本明細書において、上記の方法を実施するための試薬を含有し得るキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体または抗体断片、第１の結合領域および第２の結合領域を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域が、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的であり得る、第２のオリゴヌクレオチド、ならびに検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の結合領域が、前記第３のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的であり得る、第３のオリゴヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、検出成分は、第３のオリゴヌクレオチドに予め結合されてよく、他の実施形態では、検出成分は、第３のオリゴヌクレオチドに後から結合されてよい。

【0133】

キットは、標識したプローブの結合により試料を画像化するための説明書を含み得る。一部の場合では、そのようなキットは、画像化プロトコールの多重化を可能にする説明書および／または試薬を含み得る。例えば、キットは、標識を化学的に除去する、不活性化する、クエンチする、切断する、または脱ハイブリダイズするための説明書および／または試薬を含み得る。

【0134】

上記の成分において、キットは、キットの成分を使用して本発明の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。本発明の方法を実施するための説明書は、通常、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等のような基材に印刷され得る。そのため、説明書は、キットまたはそれらの成分の容器のラベルに添付文書（すなわち、包装物または分包物と一緒にされたもの）等としてキットに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピューター読み出し可能な保存媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットに存在しないが、リモートソースから、例えば、インターネットを介して説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書が概説され得る、および／またはそこから説明書がダウンロードされ得る、ウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。

【0135】

上記の成分に加えて、キットは、キットの成分を使用して本発明の方法を実施するための説明書、すなわち試料解析のための説明書をさらに含み得る。本発明の方法を実施するための説明書は、通常、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等のような基材に印刷され得る。そのため、説明書は、キットまたはそれらの成分の容器のラベルに添付文書（すなわち、包装または分包と一緒にされたもの）等としてキットに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピューター読み出し可能な保存媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットに存在しないが、リモートソースから、例えば、インターネットを介して説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書が概説され得る、および／またはそこから説明書がダウンロードされ得る、ウェブアドレスを含むキットであり得る。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。

【実施例】

【0136】

[実施例１]
スライド上に固定された組織（issue）中の構成要素検出
一部の実施形態では、生体試料、例えば、組織の薄片または複数の培養細胞をスライド上に固定することができる。スライド上に乗せられた後、試料は、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる抗体または抗体断片と接触させることができる。オリゴヌクレオチドは、抗体または抗体断片、オリゴヌクレオチド、生体試料の完全性、ならびに抗体または抗体断片、オリゴヌクレオチド、および生体試料の間の任意の相互作用を維持することができる適切な緩衝液の容積中に存在することができる。一部の場合、過剰な抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片と試料との間の結合を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、適切な洗浄緩衝液で洗い流すことができる。これに続いて、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域が第１のオリゴヌクレオチドと対合することができるように、第２のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。第２のオリゴヌクレオチドは、すべての存在する構成要素の完全性を維持することができる適切な緩衝液の容積中に存在することができる。一部の場合、過剰な第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間の結合を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、適切な洗浄緩衝液で洗い流すことができる。これに続いて、第２のオリゴヌクレオチドは、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域と対合することができる。第３のオリゴヌクレオチドは、すべての存在する構成要素の完全性を維持することができる適切な緩衝液の容積中に存在することができる。過剰な第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドとの間の結合を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、適切な洗浄緩衝液で洗い流すことができる。このようにして、生体試料の構成要素は、抗体または抗体断片に接続され、第１のオリゴヌクレオチドに接続され、第２のオリゴヌクレオチドに接続され、第３のオリゴヌクレオチドに接続され、検出要素に接続されることができる。したがって、検出構成要素の検出を実施して、生体試料の構成要素を検出できる。

【0137】

[実施例２]
もっと長い鎖
一部の場合、方法は、第２のオリゴヌクレオチドを除いて、実施例１における方法と類似していてもよい。そのような方法では、追加の１、２、３、４、５、またはそれよりも多いオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの後でおよび第３のオリゴヌクレオチドの前に試料と一緒にインキュベートして、第２のオリゴヌクレオチドを構成することができるオリゴヌクレオチドの鎖を形成することができる。一部の場合、これは、第１のオリゴヌクレオチドと接触する前に、第２のオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの鎖として複数のオリゴヌクレオチドを含むことができるように、予め実施してもよい。

【0138】

[実施例３]
三次元構成要素検出
一部の実施形態では、試料は、組織の凍結ブロックなどの三次元試料でもよい。そのような実施形態では、構成要素の三次元検出を達成することができる。これはいくつかの方法により達成でき、この方法には本明細書に記載される２つのタイプの方法を含まれ得る。

【0139】

第１のタイプの方法では、組織のブロックは、ミクロトームを用いて上から下に薄片を作製することができる。第１の薄片を作製した後、方法は、生体試料を、試料のブロックの表面から直接、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体断片と接触させるステップ、続いて第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触させるステップ、続いて第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域を、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含み、それにより生体試料を検出成分に接続によって結合させる。一部の場合、検出成分は、例えば、カメラを使用して検出することができる。検出に続いて、新しい薄片を作製することができ、この方法を繰り返すことができる。方法は、これらのステップを、試料のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％で実施すると完全であると見なすことができる。この方法を完了すると、それぞれの薄片からのデータは、三次元データセットを生成するように組み合わせることができ、これらのデータセットは、試料中の検出された構成要素の位置を三次元で示すことができる。

【0140】

第２のタイプの方法では、組織のブロックを、薄片をスライドに移せるようにミクロトームを用いて上から下に薄片を作製することができる。次に、スライド上の薄片は、生体試料を、第１のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている抗体断片と接触させるステップ、続いて第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドの第１の結合領域と接触させるステップ、続いて第２のオリゴヌクレオチドの第２の結合領域を、検出成分を含む第３のオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、それにより生体試料を検出成分に接続によって結合させるステップを含む方法に供することができる。一部の場合、検出成分は、例えば、カメラを使用して検出することができる。検出に続いて、同じ組織のブロック由来の薄片を含有する他のスライドについてこの方法を繰り返すことができる。方法は、これらのステップを、試料のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％で実施すると完全であると見なすことができる。この方法を完了すると、それぞれの薄片からのデータは、三次元データセットを生成する様式で組み合わせることができ、これらのデータセットは、試料中の検出された構成要素の位置を三次元で示すことができる。

【0141】

いずれかのタイプの方法および追加の類似するタイプの方法では、薄片は、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約１５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１０００μｍの厚さであり得る。一部の場合、一部の薄片では方法を実施せずに除去することができるので、薄片はスキップすることができる。薄片のスキップは、薄片が目的の領域と交差していない場合、時間の制約のせいで、もっと低い分解能でも許容できる場合、または他の理由で生じ得る。薄片がスキップされた場合、一部の場合、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、少なくとも１１の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、または少なくとも２０の薄片をスキップしてもよい。一部の場合、薄片は、試料全体で一様にスキップしてもよい。一部の場合、試料のある特定の部分は、他の部分よりも多くのスキップされた薄片を有していてもよい。一部の場合、薄片が全くスキップされなくてもよい。一部の場合、薄片をスキップするかどうかの決定は、前の薄片の分析後に行ってもよい。

【0142】

[実施例４]
構成要素検出とそれに続くレーザーキャプチャーマイクロダイセクション
一部の場合、本明細書の方法は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を方法と併せて実施することができるように、行ってもよい。そのような場合、方法は、ＬＣＭ用に設計された特化スライド上で実施してもよい。一部の場合、試料のうちシグナルのない領域は、ＬＣＭを使用してキャプチャーし得る。一部の場合、試料のうちシグナルがある領域は、ＬＣＭを使用してキャプチャーし得る。一部の場合、試料のうち閾値より上のシグナルがある領域は、ＬＣＭを使用してキャプチャーし得る。一部の場合、試料のうち閾値より下のシグナルがある領域は、ＬＣＭを使用してキャプチャーし得る。一部の場合、試料のうち第１の閾値より上で第２の閾値より下のシグナルがある領域は、ＬＣＭを使用してキャプチャーし得る。

【0143】

ＬＣＭを使用してキャプチャーされた組織を、さらに分析することができる。一部の場合、このさらなる分析は、クロマトグラフ分析、例えば、ＨＰＬＣ、ＧＣＭＳ、ＬＣＭＳ、もしくは他のクロマトグラフ法、ウェスタンブロッティング、遺伝子型判定、ＰＣＲ分析、または他の分析技法を含むことができる。

【0144】

[実施例５]
ＨＲＰを使用する構成要素検出
一部の場合、本明細書の方法は、検出成分としてＨＲＰを使用して実施してもよい。そのような場合、方法は、本明細書に記載される通りに実施することができる。検出ステップに到達すると、ＨＲＰを有機基質および過酸化水素に曝露することができる。一部の場合、基質は、ルミノールであり得る。基質がルミノールである場合、発光を検出することができる。基質がＡＢＴＳ、ＯＰＤ、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ、ホモバニリン酸、ＴＭＢ、ＡＥＣ、ＤＡＢである場合、検出は比色分析であり得る。

【0145】

本発明の好ましい実施形態が明らかにされ本明細書に記載されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。今や、数多くの変形形態、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者には浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替形態を、本発明を実行する際に用い得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定しており、これにより、これら特許請求の範囲内の方法および構成ならびにその均等物が包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】