(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-11
(54)【発明の名称】音響による粒子の濃縮及び洗浄のためのパラメータ
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20220304BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/12 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20220304BHJP
B01J 19/10 20060101ALI20220304BHJP
B01J 19/00 20060101ALI20220304BHJP
C12N 11/00 20060101ALN20220304BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12M1/42
C12N1/12 C
C12N1/20 A
C12N1/04
B01J19/10
B01J19/00 N
C12N11/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021540440
(86)(22)【出願日】2020-01-21
(85)【翻訳文提出日】2021-09-07
(86)【国際出願番号】 US2020014492
(87)【国際公開番号】W WO2020154334
(87)【国際公開日】2020-07-30
(31)【優先権主張番号】62/794,978
(32)【優先日】2019-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519144901
【氏名又は名称】フロデザイン ソニックス， インク．
【氏名又は名称原語表記】ＦＬＯＤＥＳＩＧＮ ＳＯＮＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100098626
【弁理士】
【氏名又は名称】黒田 壽
(74)【代理人】
【識別番号】100128691
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 弘通
(72)【発明者】
【氏名】ロス－ヨンスル， ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】リプケンス， バルト
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B065
4G075
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC13
4B029DG08
4B033NA02
4B033NA12
4B033NA16
4B033NA17
4B033NB62
4B033ND03
4B033NG02
4B033NG04
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4B033NJ05
4B033NK07
4B065AA01X
4B065AA83X
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4B065AA95X
4B065CA44
4G075AA13
4G075AA27
4G075AA61
4G075AA65
4G075BB01
4G075BB08
4G075BB10
4G075CA23
4G075DA02
4G075DA18
4G075EA05
4G075EB01
4G075EB31
4G075ED15
4G075FA12
4G075FB02
4G075FB04
(57)【要約】
ホスト流体から第２の流体又は粒子を連続的に分離するための多段の音響泳動デバイスが開示されている。多段の音響泳動デバイスを運転する方法も開示されている。システムは、互いに流体的に直列に接続された複数の音響泳動デバイスを含んでもよく、各音響泳動デバイスは、フローチャンバと、複数次元音響定在波を生成することができる超音波トランスデューサと、リフレクタとを含む。システムには、ポンプと流量計を更に含めることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
粒子を洗浄する方法であって、第１の媒体と粒子との初期混合物の初期の粒子密度及び体積を取得することと、
前記初期混合物の前記初期の粒子密度及び体積に基づいて、音響泳動デバイスを使用する音響濃縮洗浄プロセスのパラメータを設定することと、
前記初期混合物を、圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサを含む前記音響泳動デバイスのチャンバに提供することと、
前記粒子の少なくとも一部が、音響定在波内に保持されるように、前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを駆動して前記チャンバ内に前記音響定在波を生成することと、
前記パラメータに従って前記音響泳動デバイスを運転することと、を含む方法。
【請求項2】
請求項１の方法において、生体適合性洗浄液又は緩衝液である第２の媒体を前記チャンバに供給すること、を更に含む方法。
【請求項3】
請求項１の方法において、前記粒子は、細胞である方法。
【請求項4】
請求項１の方法において、前記粒子は、マイクロキャリア／細胞複合体である方法。
【請求項5】
請求項１の方法において、前記初期混合物は、約５０万粒子／ｍＬから約５００万粒子／ｍＬまでの密度を有する方法。
【請求項6】
請求項１の方法において、前記初期混合物中の粒子を濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項7】
請求項７の方法において、前記粒子を、前記初期混合物の体積の約２５分の１から約５０分の１までの濃縮容積に濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項8】
請求項７の方法において、前記初期混合物中の粒子を、前記初期混合物の粒子密度の約２５倍から約５０倍までの高く濃縮された粒子密度に濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項9】
請求項１の方法において、前記フローチャンバの洗浄出力物の細胞密度は、約０．０細胞／ｍＬから約５０万細胞／ｍＬまでである方法。
【請求項10】
請求項１０の方法において、前記洗浄出力物は、濃縮プロセス及び洗浄プロセスからの洗浄出力物である方法。
【請求項11】
請求項１の方法において、洗浄効果を決定するために前記チャンバ上で分光光度計プロセスを実施すること、を更に含む方法。
【請求項12】
細胞培養液から細胞を回収する方法であって、第１の媒体と粒子との初期混合物の初期の粒子密度及び体積を取得することと、
前記初期混合物の前記初期の粒子密度及び体積に基づいて、音響泳動デバイスを使用する音響濃縮洗浄プロセスのパラメータを設定することと、
前記細胞培養液の初期混合物を、フローチャンバ内で複数次元音響定在波を生成するように駆動されるように構成された圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサを含む音響泳動デバイスのフローチャンバに供給することと、
前記フローチャンバ内で複数次元音響定在波を生成するために前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを駆動することと、
前記細胞を濃縮させるために前記複数次元音響定在波内の前記初期混合物から前記細胞を保持することと、
前記パラメータに従って前記音響泳動デバイスを操作することと、を含む方法。
【請求項13】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞の細胞密度が、前記初期混合物の細胞密度よりも約２５倍から約５０倍大きい方法。
【請求項14】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞の体積が、前記初期混合物の体積の２５分の１から約５０分の１である方法。
【請求項15】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞が約３５分以内に得られる方法。
【請求項16】
請求項１２の方法において、前記フローチャンバの洗浄出力物の細胞密度が約０．０細胞／ｍＬから約５０万細胞／ｍＬである、前記濃縮された細胞を洗浄すること、を更に含む方法。
【請求項17】
濃縮洗浄システムであって、ポンプと、
複数のバルブと、
フローチャンバと、
前記フローチャンバに結合され、複数次元音響定在波を生成するように駆動されるように適合された圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサと、
前記ポンプ、前記複数のバルブ、及び前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを制御するためのコントローラであり、音響パワー、流量率、細胞収集サイクル数、細胞数又は細胞濃縮の１つ以上を含むパラメータで構成可能なコントローラと、を含む濃縮洗浄システム。
【請求項18】
請求項１７の濃縮洗浄システムであって、前記フローチャンバは、約２５ｍＬから約７５ｍＬまでの体積を有する濃縮洗浄システム
【請求項19】
請求項１８の濃縮洗浄システムであって、前記フローチャンバは、約４０億細胞から約４００億細胞までの細胞容量を含むことができる、濃縮洗浄システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
治療用細胞を濃縮し、それらをある溶液から別の溶液に移すこと（通常は洗浄と呼ばれる）は、細胞の生産及び使用の複数の段階に関係する２つのプロセスである。細胞処理における物質の洗浄及び分離は、選択した細胞治療の全体的な有効性の重要な部分である。特に、治療用細胞は、もともと成長血清又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような防腐剤に懸濁されている可能性がある。細胞をさらに処理できるようにこれらの液体から細胞を分離することは、そのような細胞物質を使用する全体的な治療プロセスにおいて重要である。一例では、細胞は通常、バイオリアクタから回収され、濃縮され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造などでトランスダクションの前に培地からエレクトロポレーション緩衝液に移される。最終製造段階で細胞を増殖させた後、細胞を濃縮し、目的の用途に応じて適切な溶媒に移す。
【0002】
治療用細胞は、冷蔵及び／又は凍結のプロセスのいずれかを通じてこれらの細胞の生存能力を延長するために、特殊な媒体に保存される。そのような特殊な媒体は、治療用細胞が患者に導入されるときに適合しない可能性がある。従って、治療用細胞及び患者の両方に生体適合性がある緩衝又は洗浄の媒体で治療用細胞を洗浄及び濃縮することが役立つ場合がある。これらの洗浄及び濃縮のプロセスは、従来、遠心分離及び物理的濾過の使用を伴う。洗浄工程は何度も繰り返すことができる。例えば、特殊な媒体（発熱性又はその他の有害性の可能性がある）は、複数の洗浄ステップで完全に除去され、細胞は新しい緩衝又は洗浄の溶液に懸濁される。この洗浄プロセス中に、多くの細胞は遠心分離及び物理的濾過のプロセスによって分解又は破壊される。さらに、濾過プロセスはかなり非効率的であり、バッチ処理のために環境への非滅菌侵入を伴う可能性があり、それにより、細胞培養物は、標的細胞培養物に有害の可能性のある病原体又は外部の細胞の影響にさらされる。さらに、これらの物理的濾過プロセスでは、複数の物理的フィルタを使用することで生物学的廃棄物が生成され、適切な廃棄のために追加の手順が必要になる場合がある。このプロセスのコスト及び適時性はまた、患者に導入するために細胞を準備する迅速又は低コストのプロセスの助けにはならない。
【発明の概要】
【0003】
本開示は、治療用細胞などの粒子のための、より簡単で、より低コストで、より友好的なプロセスで、従来の複数の洗浄ステップを伴う遠心分離及び物理的濾過プロセスを置き換え又は増強する方法及びシステムを提供する。方法／プロセスは、無菌環境及び連続的な形態で実行できる。
【0004】
本明細書には、細胞であってもよい粒子を洗浄する方法が開示される。いくつかの例示的な方法では、第１の媒体と粒子との初期混合物が、音響泳動デバイスのフローチャンバに供給される。第１の媒体は、粒子の将来の用途／使用にとって望ましくないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの防腐剤を含んでもよい。音響泳動デバイスは、圧電材料を含み、フローチャンバ内に複数次元音響定在波を生成するように駆動されるように構成された少なくとも１つの超音波トランスデューサを有する。前記粒子の少なくとも一部は、複数次元音響定在波にトラップされる。前記粒子が複数次元音響定在波に保持されている間に、第２の媒体がフローチャンバを通って流れ、第１の媒体を洗い流す。このように、前記粒子は、第１の媒体が第２の媒体と交換される媒体交換を経験してもよい。
【0005】
いくつかの例では、洗浄プロセスを実行するために使用される第２の媒体の体積は、フローチャンバの体積と同等であってもよい。いくつかの例では、洗浄プロセスを実行するために使用される第２の媒体の体積は、フローチャンバの体積の倍数又はその一部であってもよい。第２の媒体は、生体適合性の洗浄液又は緩衝液であってもよい。
【0006】
粒子は細胞であってもよい。細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯハイブリドーマ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト細胞、調節性Ｔ細胞、ジャーカットＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）、藻類、植物細胞、細菌、又は、ウイルスであってもよい。細胞はマイクロキャリアに付着していてもよい。
【0007】
時として、少なくとも１つの超音波トランスデューサの圧電材料は、複数の圧電素子から形成された圧電アレイの形態である。各圧電素子は、ポッティング材料によって周囲の圧電素子から物理的に分離できる。圧電アレイは、圧電素子を互いに分離する１つ又は複数のチャネルを備えた単結晶上に存在することができる。各圧電素子は、独自の電極ペアに個別に接続することができる。圧電素子は、互いに同相で動作することもできるし、互いに位相をずらして動作することもできる。音響泳動デバイスは、少なくとも１つの超音波トランスデューサを冷却するための冷却ユニットを更に備えてもよい。
【0008】
様々な実施形態において、初期混合物は、約５０万粒子／ｍＬから約５００万粒子／ｍＬの密度を有してもよい。濃縮された液量は、初期混合物の液量の２５分の１乃至約５０分の１であってもよい。濃縮された液量は、初期混合物の粒子密度の２５倍乃至約５０倍の粒子密度を有してもよい。
【0009】
様々な実施形態において、細胞培養液から９０％を超える細胞を回収する方法も開示される。第１の媒体と細胞培養液との初期混合物は、フローチャンバ内に複数次元音響定在波を生成するように駆動されるように構成された圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサを備える音響泳動デバイスのフローチャンバを通して供給される。少なくとも１つの超音波トランスデューサが駆動されて、フローチャンバ内に複数次元音響定在波を生成し、このようにして音響定在波内に細胞培養液を集中させる。初期混合物の初期細胞密度は約５０万細胞／ｍＬ乃至約５００万細胞／ｍＬであり、濃縮された細胞培養液の細胞密度は初期細胞密度の少なくとも２５倍である。
【0010】
いくつかの実施形態において、濃縮された細胞培養液は、初期細胞密度の２５倍乃至約５０倍の細胞密度を有する。他の実施形態では、濃縮された細胞培養液の液量は、初期混合物の液量の２５分の１乃至約５０分の１である。濃縮された細胞培養液は約３５分以内で得ることができる。
【0011】
音響泳動デバイスも開示される。音響泳動デバイスは、流体の流入口、第１の流出口、及び第２の流出口を有するフローチャンバと、フローチャンバの第１の壁に近接し、複数次元音響定在波を生成するように駆動されるのに適している圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサと、前記少なくとも１つの超音波トランスデューサの反対側のフローチャンバの第２の壁上のリフレクタと、前記少なくとも１つの超音波トランスデューサとフローチャンバの第１の壁との間に配置された熱電発電機と、を備えている。
【0012】
音響泳動デバイスは、約２５ｍＬ乃至約７５ｍＬの濃縮容量を有してもよい。音響泳動デバイスは、約４０億乃至約４００億細胞の細胞容量を有してもよい。様々なラインにより、音響泳動デバイスを、その音響泳動デバイスとの間で様々な物質を供給し又は受ける容器に接続することができる。
【0013】
これらと他の非限定的な特性について、以下でより具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
以下は、図面の簡単な説明である。図面の簡単な説明は、本明細書に開示された例示的な実施形態を説明するために提示されるのであり、それと同じことを限定するためではない。
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【図7】図７は、本開示に係る音響泳動プロセスの濃度及び流量率に対する密度低減率（ＰＤＲ）の依存性を示すグラフである。ｘ軸は時間（分）であり、０から４０まで５の間隔で続いている。ｙ軸は透過密度低減率（％）であり、０から１００まで１０の間隔で続いている。円状のデータポイントを有する線は、５×１０６細胞／ｍＬの初期細胞濃度を有する混合物を表している。ｘ字型のデータポイントを有する線は、３×１０６細胞／ｍＬの初期細胞濃度を有する混合物を表している。三角形のデータポイントを有する線は、２０ｍＬ／分の流量率で１×１０６細胞／ｍＬの初期細胞濃度を有する混合物を表している。ひし形のデータポイントを有する線は、１０ｍＬ／分の流量率で１×１０６細胞／ｍＬの初期細胞濃度を有する混合物を表している。
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【発明を実施するための形態】
【0051】
本開示は、望ましい実施形態及びそこに含まれる実施例の以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。以下の明細書及び以下の特許請求の範囲では、以下の意味を持つように定義されるいくつかの用語が参照される。
【0052】
以下の説明では、わかりやすくするために特定の用語を使用しているが、これらの用語は、図面で説明するために選択した実施形態の特定の構造のみを指すことを意図しており、開示の範囲を定義又は制限することを意図していない。以下の図面及び以下の説明において、同様の数値指定は同様の機能のコンポーネントを指すことを理解されたい。さらに、図面は原寸に比例していないことを理解されたい。
【0053】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数形の対象を含む。
【0054】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態及び「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の実施形態を含んでもよい。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及び本明細書で使用されるそれらの変形は、名付けられたコンポーネント／ステップの存在を必要とし、他のコンポーネント／ステップの存在を許容するものとして使用されるオープン形式の移行句、用語又は単語であることが意図されている。しかしながら、そのような説明は、列挙されたコンポーネント／ステップから「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」ものとして、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又はプロセスを説明するものとしても解釈されるべきであり、そのような解釈では、名付けられたコンポーネント／ステップと、そこから生じる可能性のある不純物のみの存在が可能となり、他のコンポーネント／ステップは除外される。
【0055】
数値には、同じ数の有効数字に換算したときに同じである数値、及び、数値を決定するために本出願に記載されているタイプの従来の測定技術の実験誤差未満で記載されている数値と異なる数値を例として含むと、理解されるべきである。
【0056】
本明細書に開示されるすべての範囲は、列挙された境界点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を含み、独立して組み合わせることができる（例えば、「２グラムから１０グラムまで」の範囲には、境界点の２グラム及び１０グラムと、すべての中間値が含まれる）。
【0057】
「約（ａｂｏｕｔ）」や「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」などの１つ又は複数の用語によって修飾された値は、指定された正確な値に限定されない場合がある。近似を表す用語は、値を測定するための機器の精度に対応している場合がある。修飾子「約（ａｂｏｕｔ）」は、２つの境界値の絶対値によって定義される範囲を開示するものと見なす必要もある。例えば、「約２から約４まで」という表現は、「２から４まで」の範囲も開示している。
【0058】
本明細書で使用される用語の多くは相対的な用語であることに留意されたい。例えば、「上部（ｕｐｐｅｒ）」及び「下部（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、位置において互いに相対的なものであり、例えば、上部のコンポーネントは所定の方向において下部のコンポーネントよりも高い位置にあるが、これらの用語は、デバイスが反転した場合に変更される可能性がある。「流入口」及び「流出口」という用語は、例えば、流体が流入口を通って構造物に流れ込み、流出口を通って構造物から流れ出すように、所定の構造物に関してそれらを流れる流体に対して相対的なものである。「上流」及び「下流」という用語は、例えば、下流のコンポーネントを流れる前に上流のコンポーネントを流れる流体のように、流体が様々なコンポーネントを通って流れる方向に関して相対的なものである。ループするものにおいては、第１のコンポーネントが第２のコンポーネントの上流側と下流側の両方であると説明され得ることに留意されたい。
【0059】
「水平」と「垂直」という用語は、例えば地面のレベルなどの絶対的な基準に対する相対的な方向を示すために使用される。上向き（ｕｐｗａｒｄｓ）」及び「下向き（ｄｏｗｎｗａｒｄｓ）」という用語もまた、絶対的な基準に対して相対的なものであり、上向きの流れは常に地球の重力に逆らう。
【0060】
本出願では、「同じ桁（ｏｒｄｅｒ）の大きさ」について言及する。大きい方の数値を小さい方の数値で割った商が１以上１０未満の値である場合、２つの数値は同じ桁の大きさになる。
【0061】
本開示の音響泳動技術は、音響定在波を使用して、一次流体又はホスト流体中の物質（粒子又は二次流体など）を濃縮、洗浄、及び／又は、分離する。特に、図１の左上の画像（Ａ）に示すように、超音波トランスデューサＴは、流体内に音響波を生成し、超音波トランスデューサの向かいに配置されたリフレクタＲと相互作用して、音響定在波を生成する。リフレクタＲが図１に示されているが、別のトランスデューサを使用して、音響エネルギを反射及び／又は生成して、音響定在波を形成してもよい。
【0062】
図１の右上の画像（Ｂ）に示すように、ホスト流体及びそのホスト流体に取り込まれた物質が音響定在波を通って上方に流れるとき、音響定在波は、物質（例えば、流体及び／又は粒子を含む二次相物質）をトラップ（維持又は保持）する。物質からの音響フィールドの散乱は、三次元の音響放射力をもたらし、それは三次元のトラッピングフィールドとして機能する。
【0063】
超音波定在波に関連して生成される三次元音響放射力は、本開示では、三次元定在波又は複数次元定在波と呼ばれる。粒子が波長に比べて小さい場合、音響放射力は、物質の粒子体積（半径の３乗など）に比例する。音響放射力は、周波数と音響コントラスト係数に比例する。音響放射力は、音響エネルギ（音圧振幅の２乗など）に比例する。調和励振の場合、力の正弦波の空間変化により、粒子は定在波内の安定した位置に移動する。粒子に加えられる音響放射力が、流体の抗力と浮力及び重力の複合効果よりも強い場合、図１の右上の画像（Ｂ）に示すように、粒子は音響定在波フィールド内にトラップすることができる。
【0064】
図１の左下の画像（Ｃ）に示すように、このトラップは、トラップされた粒子の合体、塊化（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）、強凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ）、弱凝集（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｎｇ）、及び／又はクラスタ化をもたらす。さらに、ビヤークネス（Ｂｊｅｒｋｎｅｓｓ）力などの二次的な粒子間力は、粒子の弱凝集を助ける。
【0065】
粒子が合体、塊化、強凝集、弱凝集、及び／又は、クラスタ化をし続けると、粒子は、粒子クラスタにかかる重力が音響放射力に打ち勝つ特定のサイズに成長する可能性がある。そのようなサイズでは、粒子クラスタは、図１の右下の画像（Ｄ）に示されるように、音響定在波から落ちる可能性がある。
【0066】
望ましくは、超音波トランスデューサは、流体中に三次元又は複数次元の音響定在波を生成し、それが浮遊粒子に横方向の力を加えて軸方向の力を伴い、定在波の粒子のトラップ能力を高める。平面又は一次元の音響定在波は、軸方向又は波の伝播方向に音響力を提供してもよい。平面又は一次元の音響波発生における横方向の力は、軸方向の力よりも２桁小さくてもよい。複数次元音響定在波は、平面音響定在波よりも大幅に大きい横方向の力を提供してもよい。例えば、横方向の力は、複数次元音響定在波の軸方向の力と同じ規模の大きさであってもよい。
【0067】
本開示の音響定在波は、定在波の第１の媒体に懸濁された粒子（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの治療用細胞）をトラップするために使用することができる。そして、第１の媒体を第２の媒体（例えば、生体適合性の洗浄液又は緩衝液）に置き換えることができる。言い換えれば、粒子のホスト流体を置き換えることができる。第１の媒体を第２の媒体に置き換える前に、図２に示すように、音響泳動を使用して、ダイアフィルトレーション・プロセスを実行することができる。
【0068】
図２において、例えば、１×１０６細胞／ｍＬ未満の低い細胞密度を有する初期混合物から始めて、音響泳動を使用して、初期混合物の体積を、例えば、２０分の１から最大１００分の１又はそれ以上までを例示として含む、少なくとも１０分の１に減らすことができる。細胞濃度は、２０倍から最大１００倍以上又はそれ以上までを含む、少なくとも１０倍まで増加させることができる。この初期低減プロセスは、第１の減量ステップ（Ａ）である。次に、第２の媒体（例えば、生体適合性の洗浄液又は緩衝液）を導入して、ステップ（Ｂ）に示すように、第１の媒体を少なくとも部分的に置き換えることができる。次に、細胞と第２の媒体との新しい混合物を、音響泳動による減量ステップ（Ｃ）にかけることができる。この一連の操作は、「ダイアフィルトレーション」プロセスと呼ばれる。
【0069】
図３は、粒子／細胞が音響定在波にトラップされて音響泳動デバイスに保持される単一ステップのプッシュスルー・プロセスを示している。そして、第２の媒体（例えば、生体適合性の洗浄液又は緩衝液）を音響泳動デバイスに流して、第１の媒体を効果的に「洗い流す」。プッシュスルー・プロセスを使用すると、第１の媒体の９０％以上（最大９９％以上を含む）を粒子／細胞から除去できる。プッシュスルー・プロセスは、図２のダイアフィルトレーション・プロセスよりも少ない緩衝液及び少ない時間を使用する連続的なシングルユースプロセスとして使用することができる。プロセスの供給液量は５００ｍＬ～３Ｌ、処理時間は６０分未満、流入する供給密度は１ｍＬあたり約１００万細胞（１Ｍ／ｍＬ）未満から１ｍＬあたり約４，０００万細胞（４０Ｍ／ｍＬ）までである。このプロセスは細胞の生存率に影響を与えず、最終濃縮液量は１Ｍ／ｍＬで７ｍＬ未満、４０Ｍ／ｍＬで５０ｍＬ未満である。１Ｍ／ｍＬの開始濃度からの濃縮係数は１５倍、例えば１０５ｍＬから７ｍＬであり、４０Ｍ／ｍＬの開始濃度からの濃縮係数は１４０倍、例えば７Ｌから５０ｍＬである。
【0070】
図４は、左から右及び上から下に、（青色に染色された）第２の媒体混合物がデバイスに流入し、（赤色に染色された）第１の媒体を徐々に置き換える前に、音響泳動デバイスにトラップされている細胞の進行を示す６枚の写真を示している。図４では、１５０ｍＬの供給液量が、第２の媒体のための８０ｍＬのエレクトロポレーション媒体洗浄とともに使用された。濃縮物は１０ｍＬ／分の流量率で抜き取った。これらの写真に見られるように、時間の経過とともに、第１の媒体が第２の媒体に置き換えられる。
【0071】
図５は、約１．５×１０６細胞／ｍＬの供給細胞密度を有する混合物について、２．２３４ＭＨｚの固定周波数で動作する音響泳動デバイスの性能を示すグラフである。見てわかるように、デバイスは、約３５分間で９５％を超える透過密度低減率（ＰＤＲ）を達成し、同じ時間で０．１０×１０６細胞／ｍＬ未満の透過細胞密度を達成した。
【0072】
本開示の音響泳動デバイス及びシステムの圧電トランスデューサは、単一モノリシック圧電材料にすることもできるし、圧電材料のアレイから作成することもできる。圧電材料は、セラミック材料、結晶、又はＰＺＴ－８（チタン酸ジルコン酸鉛）などの多結晶である。
【0073】
音響泳動デバイスの濃縮効率を試験した。まず、１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有するＴ細胞懸濁液を使用した。約５００～１０００ｍＬの供給液量を、１０～１５ｍＬ／分の流量率で使用した。結果は図６にグラフで示されている。このデバイスは、１０分間のテストで、１０倍から２０倍までの間の濃縮係数、９０％の細胞回収率、７７％のウォッシュアウト効率（つまり、第２の媒体によって置き換えられた第１の媒体の液量）を示した。１０°Ｃの温度上昇が観察された。
【0074】
次に、酵母混合物を使用して、密度低減率（ＰＤＲ）の濃度及び流量率に対する依存性をテストした。結果は図７にグラフで示されている。ここに見られるように、より高い初期細胞濃度は一般により大きなＰＤＲをもたらした。さらに、さまざまな流量率（２０ｍＬ／ｍｉｎ～１０ｍＬ／ｍｉｎ）は、ＰＤＲに影響を与えなかった。
【0075】
音響泳動デバイスの濃縮効率は、より高い細胞密度で再度テストされた。５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有するＴ細胞懸濁液を使用した。１０００ｍＬの供給液量を、１０～１５ｍＬ／分の流量率で使用した。結果は図８にグラフで示されている。このデバイスは、１時間にわたるテストで、１０倍を超える濃縮係数、９０％の細胞回収率、７７％のウォッシュアウト効率を示した。１０°Ｃの温度上昇が再び観察された。
【0076】
テスト中に、超音波トランスデューサのアクティブ冷却により、スループットと効率が向上し、パワーが増加することも発見された。そのため、トランスデューサのアクティブ冷却を行うための冷却ユニットが開発された。図９Ａは、完全に組み立てられた状態の、冷却ユニットを含む音響泳動デバイス７０００を示している。図９Ｂは、部分的に分解された図における様々なコンポーネントを備えたデバイス７０００を示している。ここで図９Ｂを参照すると、デバイスは、フローチャンバ７０１０の反対側の壁に超音波トランスデューサ７０２０及びリフレクタ７０５０を有する。リフレクタ７０５０は、フローチャンバ７０１０の内部が見えるように、透明な材料で作ることができることに留意されたい。超音波トランスデューサは、フローチャンバの第１の壁の近くにある。リフレクタは、フローチャンバの第２の壁に近接しているか、又は、フローチャンバの第２の壁を構成することができる。冷却ユニット７０６０は、超音波トランスデューサ７０２０とフローチャンバ７０１０との間に配置されている。冷却ユニット７０６０は、超音波トランスデューサ７０２０に熱的に結合されている。この図では、冷却ユニットは熱電発電機の形態をしており、ゼーベック効果を利用して熱流束（つまり温度差）を電気エネルギに変換し、フローチャンバから熱を取り除く。言い換えれば、音響泳動デバイスを運転させている間、望ましくない廃熱から電気を生成することができる。
【0077】
フローチャンバの様々な流入口及び流出口（例えば、流体の入口、濃縮液の流出口、透過液の流出口、再循環の流出口、ブリード／ハーベストの流出口）は、ここには示されていないことに留意されたい。冷却ユニットは、超音波トランスデューサを冷却するために使用することができ、デバイスを連続的に運転して処理と再循環を長期間繰り返す場合（例えば、灌流）に特に有利である。
【0078】
あるいは、冷却ユニットを使用して、フローチャンバ７０１０を流れる流体を冷却することもできる。目的とする用途では、細胞培養液は室温（～２０°Ｃ）付近、最大で約２８°Ｃに維持する必要がある。これは、細胞がより高い温度を経験すると、それらの代謝率が増加するためである。但し、冷却ユニットがないと、細胞培養液の温度が３４°Ｃまで上昇する可能性がある。
【0079】
これらのコンポーネントはモジュール式であり、互いに個別に変更又は切り替えることができる。従って、特定のコンポーネントに新しい修正又は変更が加えられた場合、システムの残りの部分は同じままで、そのコンポーネントを置き換えることができる。
【0080】
目標は、約１リットル（Ｌ）～約２Ｌの容量を有する培養バッグで約１００万細胞／ｍＬの密度から始め、このバッグを約２５ｍＬ～約３０ｍＬの容量に濃縮してから、約１時間（又はそれ以下）以内に増殖媒体を洗浄又は交換することである。望ましくは、システムは、ガンマ線を照射されたときに安定している物質で作ることができる。
【0081】
トランスデューサに冷却ユニットを備えることの利点は、図１０及び図１１に見ることができる。図１０は、アクティブ冷却がない場合（例えば、トランスデューサの冷却ユニットがない場合）の音響泳動デバイスの温度プロファイルをグラフで示している。図１０に示すように、フィードとコア（例えば、トランスデューサ）との間の温度差は８．６°Ｃであった。図１１は、アクティブ冷却を備えた場合（例えば、トランスデューサ用の冷却ユニットを備えた場合）の音響泳動デバイスの温度プロファイルをグラフで示している。図１１に示すように、アクティブ冷却を使用することにより、フィードとコアとの間の温度差は６．１°Ｃに低下した。
【0082】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、マイクロキャリアを細胞から濃縮、洗浄、及び分離するための４つのステップ（オプションの第５のステップを伴う）のプロセスを示している。プロセスの第１のステップは、本明細書に記載されているような音響泳動デバイスにおいて、付着した細胞を有するマイクロキャリアを濃縮することを含む。マイクロキャリア及び付着細胞は、バイオリアクタから付着細胞を有するマイクロキャリアを受け取ることにより、音響泳動デバイスに導入することができる。バイオリアクタでは、マイクロキャリアと細胞は第１の媒体（例えば、バイオリアクタ内で細胞を生存可能に保つために使用される成長血清又は防腐剤）に懸濁される。第１の媒体に囲まれた細胞が付着したマイクロキャリアは、音響泳動デバイスで生成された音響定在波によって濃縮される。第２のステップでは、細胞が付着した濃縮マイクロキャリアを第２の媒体で洗浄して、第１の媒体（例えば、バイオリアクタ成長血清又は防腐剤）を除去する。次に、第３のステップは、酵素を含む第３の媒体を音響泳動デバイスに導入して、第２の媒体の酵素作用を介して細胞をマイクロキャリアから分離する。特定の実施形態では、トリプシンは、マイクロキャリアから細胞を酵素的に分離するために使用される酵素である。次に、複数次元音響定在波を使用して、細胞をマイクロキャリアから分離することができる。通常、この分離は、分離された細胞が第３の媒体を通過する間に、マイクロキャリアを複数次元音響定在波にトラップすることによって行われる。但し、必要に応じて、代わりに細胞をトラップすることもできる。最後に、分離された細胞は、必要に応じて、濃縮し、再度洗浄してもよい。
【0083】
マイクロキャリアは、複数次元音響定在波に集中してトラップ／保持された後、合体、塊化、強凝集、弱凝集、及び／又はクラスタ化して臨界サイズになり、その時点でマイクロキャリアは重力沈降の増強により音響定在波から落下する。マイクロキャリアは、音響定在波の下にある音響泳動デバイスのコレクタに落下して、フローチャンバから除去することができる。
【0084】
図１３は、音響泳動デバイスにおけるＳｏｌｏＨｉｌｌマイクロキャリア及びＴ細胞の存在を、４倍の倍率で示している。画像の一番上の段は、音響泳動前のフィード内のマイクロキャリアと細胞を示している。下の段の画像は、細胞が音響泳動によって分離された後の透過液中のマイクロキャリアと細胞を示している。音響泳動の適用によるマイクロキャリアの数の違いは、デバイス内でマイクロキャリアをトラップし、そこから細胞を分離するためにデバイスを使用することの実現可能性を証明している。この技術の実現可能性とその結果は、図１４の画像によってさらに証明される。図１４は、左から右へ、濃縮及び１回目、２回目及び３回目の洗浄の後の供給液中（画像の上段）及び透過液（画像の下段）中のマイクロキャリア及び細胞の顕微鏡画像を示している。
【0085】
音響泳動による濃縮、洗浄及び分離のプロセスのテストは、そのプロセスが細胞治療及びマイクロキャリアのアプリケーションに適切であることを示した。濃縮ステップ及び洗浄ステップは、９９％を超える効率で実行され、例えばマイクロキャリアから細胞を分離する分離ステップは、９８％を超える効率で実行された。
【0086】
図１５～図１７は、自身のバルブを通る流体の流れを制御するソレノイドピンチバルブを備えた使い捨ての音響泳動デバイス２８１０を含む音響泳動システム／プロセス２８００の他の例示的な実施形態を示している。図１５の左側を起点として、このシステムは、供給タンク２８２０、洗浄タンク２８３０及び吸気口２８０５を備える。吸気口２８０５は、吸気バルブ２８０４を通って延びている。供給ライン２８２１は、供給タンク２８２０から延びている。吸気口と供給ライン２８２１は、Ｙコネクタによって、供給セレクタバルブ２８０１に通じる共通の供給ライン２８１１に一緒に結合されている。洗浄ライン２８３１は、洗浄タンク２８３０から延びており、供給セレクタバルブ２８０１にも通じている。供給セレクタバルブ２８０１は、一度に１つのラインのみを開くことを可能にする（バルブ２８０２、２８０３もこのように動作する）。洗浄ライン２８３１及び供給ライン２８１１は、供給セレクタバルブ２８０１の下流のＹコネクタによって、入力ライン２８１２に一緒に結合されている。入力ライン２８１２は、ポンプ２８０６を通過して、供給セレクタバルブ２８０１の下流で音響泳動デバイス２８１０の上流にある流入セレクタバルブ２８０２に通じている。流入セレクタバルブ２８０２は、供給ポート２６０２又は洗浄／排出ポート２６０４のいずれかを介して音響泳動デバイス２８１０への供給又は洗浄の流入を選択的に制御する。供給ライン２８１３は、流入セレクタバルブ２８０２から供給ポート２６０２まで延びている。洗浄ライン２８１４は、流入セレクタバルブ２８０２から共通ライン２８１５に延びており、洗浄／排出ポート２６０４に通じている。
【0087】
図１５の右側には、流出セレクタバルブ２８０３が、音響泳動デバイス２８１０の下流に配置され、そこからの流体の流出を制御する。廃棄ライン２８１６は、廃棄ポート２６０８から流出セレクタバルブ２８０３を通り、続いて廃棄タンク２８５０まで延びている。共通ライン２８１５は、ドレンライン２８１７に通じており、ドレンライン２８１７は、次に、流出セレクタバルブ２８０３を通過し、続いて濃縮タンク２８４０に通じている。これらのタンク２８４０、２８５０は、例えば、収集バッグであってもよい。それにより、流出セレクタ２８０３は、濃縮タンク及び廃棄タンクへの流体の流れを選択的に制御する。
【0088】
濃縮及び廃棄のラインの端部で収集バッグを使用すると、細胞及び細胞物質の濃縮、洗浄、及び／又は分離が起こり得る密閉された一次環境が有利に作成され、細胞／細胞培養／細胞物質が、有害な可能性のある侵入、病原体、又は外部の細胞の影響にさらされるのを防ぐのに役立つ。
【0089】
図１５は、システムを通る供給物質の流路も示している。この例示的な実施形態では、供給セレクタバルブ２８０１は、供給タンク２８２０からの供給が流れるように、下部が開いた状態（及び上部が閉じた状態）に操作される。流入セレクタバルブ２８０２は、供給物質が供給ポート２６０２を介して音響泳動デバイス２８１０に入るように、上部が開いた状態（及び下部が閉じた状態）に操作される。また、流出セレクタバルブ２８０３も、供給物質の流体／第１の媒体が廃棄タンク２８５０に流れるように、上部が開いた状態（及び下部が閉じた状態）に操作される。本明細書で詳細に説明したように、供給物質（例えば、マイクロキャリア又は細胞）中のターゲット粒子は、複数次元音響定在波の作用によって音響泳動デバイス２８１０にトラップされる。
【0090】
図１５に示すシステムは、ポリカーボネートとステンレス鋼で構成される音響要素を備えている。チューブは、細胞処理に滅菌溶着の供給バッグを使用できる１／８インチのＰＶＣ薄肉チューブである。使い捨てのパルスレスポンプヘッドＮａｏＳｔｅｄｉ２×２．５ｍＬが使用される。チューブ、音響要素及びポンプは二重袋に入れられ、ガンマ線が照射される。このシステムは、プライミング、再循環、濃縮、媒体交換、洗浄、及び／又は収集を含むプロセスを可能にする。例示のシステムは、最大３Ｌの供給で動作し、総細胞容量は約４０億細胞であり、最終的な濃縮液量は約６ｍＬ～約５０ｍＬであるが、他の実装例ではシステムのパラメータ範囲を大きくしたり小さくしたりできる。
【0091】
図１６は、システムを通る洗浄物質の流路を示している。供給セレクタバルブ２８０１は、洗浄タンク２８３０から洗浄物質が流れるように、上部が開いた状態（及び下部が閉じた状態）に操作される。流入セレクタバルブ２８０２は、下部が開いた状態（及び上部が閉じた状態）に操作され、流出セレクタバルブ２８０３は、上部が開いた状態（及び下部が閉じた状態）に操作される。結果として、洗浄物質は、洗浄液の流入口として作動する洗浄／排出ポート２６０４を介して音響泳動デバイス２８１０に入る。閉じた状態の流出セレクタバルブ２８０３は、洗浄物質が濃縮タンク２８４０に入ることを防ぐことに注目されたい。次に、洗浄物質は、音響泳動デバイス２８１０を通過し、第１の媒体（例えば、バイオリアクタ血清又は防腐剤）を除去することができる。次に、洗浄物質は、廃棄ポート２６０８を介して流れ出て、廃棄タンク２８５０に流れる。ターゲット粒子は、音響泳動デバイス２８１０にトラップされたままである。
【0092】
図１７は、システムの排出（例えば、ターゲット粒子の収集）を示している。吸気バルブ２８０４が開いている。供給セレクタバルブ２８０１は、下部が開いた状態（及び上部が閉じた状態）に操作され、流入セレクタバルブ２８０２は、上部が開いた状態（及び下部が閉じた状態）に操作されるため、空気は、供給ポート２６０２を介して音響泳動デバイス２８１０に入る。空気は、一般に、音響泳動デバイス２８１０からターゲット粒子のクラスタを取り除くのを助ける。流出セレクタバルブ２８０３は、下部が開いた状態（及び上部が閉じた状態）に操作される。ターゲット粒子は、洗浄／排出ポート２６０４から共通ライン２８１５を通って、ドレンライン２８１７を通り、続いて濃縮タンク２８４０に流れる。
【0093】
細胞培養液の濃縮と洗浄は、工業用の生物学的製品の製造に有益である。本開示のシステムは、より大きなボリュームを処理するために継続的に改善及びスケールアップすることができる。
【0094】
いくつかの例では、本開示の音響泳動デバイスは、約２５ｍＬ～約７５ｍＬの範囲の濃縮液量を有してもよい。デバイスは、約４０億～約４００億の細胞、又は、約４０億～約８０億の細胞、又は、約２００億～約４００億の細胞、又は、約１６０億～約３５０億の細胞、の総細胞容量を有してもよい。音響泳動デバイスに出入りする流体は、約１億６０００万細胞／ｍＬ～約６億７０００万細胞／ｍＬ、又は、約１億６０００万細胞／ｍＬ～約３億２０００万細胞／ｍＬ、又は、約２億６０００万細胞／ｍＬ～約５億３５００万細胞／ｍＬ、又は、約３億５００万細胞／ｍＬ～約６億７０００万細胞／ｍＬ、又は、約５０万細胞／ｍＬ～約５００万細胞／ｍＬ、の細胞密度を有してもよい。
【0095】
以下の実施例は、本開示のデバイス及びプロセスを説明するために提供される。実施例は単に例示的なものであり、そこに記載されている物質、条件又はプロセスパラメータに開示を限定することを意図するものではない。
〔実施例〕
〔実施例〕
【0096】
ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を濃縮する本開示の音響泳動システムの能力を試験した。ジャーカットＴ細胞の直径は１１マイクロメートル（μｍ）から１４μｍである。音響泳動デバイスを使用し、ベックマン・コールターのＶｉ－ＣＥＬＬ Ｘをさまざまな試験条件で使用して細胞密度低減を測定した。
【0097】
第１のトライアルＡでは、Ｔ細胞を濃縮し、透過液の細胞密度を測定した。点線は供給細胞密度を示している。望ましくは、透過液中の細胞密度は可能な限り低く、細胞が濃縮物中に保持されていることを示している。図１８のグラフは、経時的なトライアルＡの結果を示している。結果は、透過液中の細胞密度が０．０～２０万細胞／ｍＬと非常に低く、ほとんどの細胞が濃縮液中にあることを示している。結果は、８０％から９９％までの間の高い透過低減率も示している。
【0098】
第２のトライアルＢでは、Ｔ細胞を濃縮し、透過液の細胞密度を測定した。点線は供給細胞密度を示している。図１９は、経時的な結果を示している。結果は良好な性能を示しており、透過細胞密度は１分後に１０万細胞／ｍＬ未満であり、２分後には９５％以上の透過低減が見られる。
【0099】
第３のトライアルＣでは、Ｔ細胞を濃縮して洗浄した。濃縮は最初の１８分間行われ、その後、洗浄が行われた。図２０は、経時的な結果を示している。点線は供給細胞密度を示している。縦の実線は、集中システムボリュームがいつ処理されたかを示している（合計３つのボリュームが処理された）。このグラフには、（透過液だけでなく）濃縮物と透過液に関するデータが含まれていることに注意されたい。濃縮から得られたすべての細胞は、洗浄を通して維持され、例えば、濃縮された細胞は、洗浄プロセスの追加によって失われなかった。下記の表１は、これら３つのトライアルに関する追加情報を示している。ジャーカットＴ細胞では９０％を超える保持率と回復率が得られた。
【表1】
【0100】
濃縮された細胞を完全に洗浄するために使用された液体の量を追跡した。液体の量の追跡は、例えば、細胞培養液のトランスダクション又はトランスフェクションの前に細胞培養液からエレクトロポレーション緩衝液を除去するなどの用途で有用である。
【0101】
表２は、低生存細胞密度（「１ＬＥ」、１～５×１０６／ｍＬ（１～５Ｅ６ｍＬ－１））の音響濃縮洗浄（ＡＣＷ）の液量低減に対する入力、出力、及びパフォーマンスの実験値を示している。図２１は、１ＬＥ処理後のＴ細胞の最初の培養液の生存細胞密度（ＶＣＤ）と生存率を示している。各１ＬＥ実験の細胞を、１×１０６／ｍＬ（１Ｅ６ｍＬ－１）、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で２回、再播種（ｒｅ－ｓｅｅｄ）し、２４時間後にカウントした。
【表2】
【0102】
すべてのテストは仕様に従って実行され、１時間以内に５～７ｍＬの濃縮液量が得られた。処理された液量は約１１００ｍｌで、細胞密度は１．８～２．５×１０６／ｍｌ（１．８～２．５Ｅ６ｍｌ－１）であった。処理された細胞の総数は１９億～２８億（１．９～２．８Ｂ）細胞の範囲であり、細胞生存率は９９％を超えていた。濃縮後、収集した細胞濃縮液量は５．８～６．９ｍｌで変化し、細胞密度は２４３～３５７×１０６／ｍｌ（２４３～３５７Ｅ６ｍｌ－１）であった。これは、細胞生存率の顕著な低下がなく、１４億～２１億（１．４～２．１Ｂ）の細胞の回収を表している。従って、生存細胞の回収率は７３～８４％であり、これは、１６０乃至１８７の液量低減係数、及び１３５乃至１４３の範囲の細胞密度濃縮係数を構成する。処理時間は約５０分であった。
【0103】
表３は、高生存細胞密度（「１ＬＨ」、１０～４０×１０６／ｍＬ（１０～４０Ｅ６ｍＬ－１））のＡＣＷの液量低減に対する入力、出力及びパフォーマンスの実験値を示している。図２２は、３０ｍＬ／分の流量率で高細胞密度１ＬＨの要素を使用した生存細胞回収率（ＶＣＲ）に対するパワーの影響を示している。
【表3】
【0104】
処理された液量は約９５０ｍｌで、生存細胞密度は３１×１０６／ｍｌ（３１Ｅ６ｍｌ－１）から３９×１０６／ｍｌ（３９Ｅ６ｍｌ－１）までで、細胞生存率が９８％を超える２９０億～３８０億（２９～３８Ｂ）細胞の細胞数の範囲に対応する。細胞濃縮液量は平均４９ｍｌであった。処理時間は３１～３６分であった。
【0105】
５Ｗ（ワット）のテストでは、６２％という低い細胞回収率が得られた。８Ｗに増やすと、パフォーマンスが目的の範囲（７８～８６％の細胞回収率）に向上したが、１０Ｗに増やすと、細胞回収率（８３％）は向上しなかった。明確な結論を出すには、各パワーレベルでさらに再現が必要であるが、これらの結果は、８０％以上のＶＣＲを有するには８Ｗを超えるパワーが必要であることを示唆している。液量低減係数は約１９であり、細胞濃縮係数は１２（５Ｗ）から１７（８Ｗ）の範囲であった。１ＬＨ実験中に得られた最終細胞濃度の４７０～５９０×１０６／ｍＬ（４７０～５９０Ｅ６ｍＬ－１）は、浮遊細胞株のデッドエンド遠心分離プロセスのペレット濃度（２００～６００×１０６／ｍＬ（２００～６００Ｅ６ｍＬ－１））に匹敵する。
【0106】
図２３は、２つの典型的な音響定在波フィールドと、低細胞濃度濃縮／洗浄用途（１ＬＥ）及び高細胞密度濃縮／洗浄用途（１ＬＨ）のプロセスフロー図を示している。各シナリオで、圧電トランスデューサは右側にあり、そのマルチモーダル変位パターンの１つで励振される。１ＬＨの場合はフラット平面リフレクタが使用され、１ＬＥの場合はファセットリフレクタが使用される。トランスデューサのマルチモードと組み合わされたフラット平面リフレクタは、複数次元定在波を設定し、強い横方向の振幅勾配を持つ３つの平行な定在波を生成する。音響放射力は、音圧振幅の勾配に比例する。従って、このセットアップには、細胞をトラップするのに十分なトラッピングポテンシャルがあるが、十分なサイズの細胞クラスタを生成して、これらの細胞クラスタの継続的な重力沈降をもたらす。これは、図２４の右側に概略的に示されている。細胞のこの連続的な分離は、高細胞密度の細胞培養液の濃縮／洗浄単位の運転を実行する場合、例えば、細胞が音響定在波フィールドから除去される場合に有用である。一方、小細胞密度の細胞培養液の場合、処理される細胞の総数は、すべての細胞が音響定在波にトラップされて保持されるような数である。従って、目標は定在波フィールドのトラッピングポテンシャルを最大化することである。この目標は、ファセットリフレクタを使用することで達成できる。図２５の左側の１ＬＥを参照すると、これらのファセットは、音響波を反射及び散乱し、細胞がトラップされる場所で、より多くのより強力な音響放射ポテンシャル井戸を生成し、音響フィールドがアクティブである間、又は、音響フィールドがオフになるまで、安定しない小さなクラスタを形成する。
【0107】
低細胞濃度のための複数次元音響濃縮洗浄（ＡＣＷ）が図２３及び図２４（左側のデバイス、１ＬＥ、１～５×１０６細胞／ｍＬ（１～５Ｅ６細胞ｍＬ－１）に示されており、高細胞濃度のための複数次元音響濃縮洗浄が同図（右側のデバイス、１ＬＨ、＞１０×１０６細胞／ｍＬ（１０Ｅ６細胞ｍＬ－１））に示されている。設計の断面図は、１ＬＥ及び１ＬＨのデバイスで確立された音響圧力フィールド、トランスデューサの変位プロファイル、及び細胞分離を実現するためのトラッピングとクラスタ形成の原理を表している。デバイスには、下部にコレクタドレインを備えている（図示せず）。
【0108】
濃縮／洗浄単位の運転の起動時に、再循環を使用して定在波の初期クラスタを生成する。例えば、クラスタの播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）を実行する。初期クラスタが形成されると、二次音響放射力によりトラップ効率が向上し、それによって、より大きなクラスタは、入ってくる細胞に引力を及ぼす。
【0109】
図２５は、ＡＣＷデバイスにおけるＴ細胞濃縮プロセスの様々な段階：（ａ）音響フィールドにおけるＴ細胞のトラップ及びコレクタにおけるＴ細胞の沈降、（ｂ）音響フィールドがオフにされた後のＴ細胞クラスタの沈降、（ｃ）コレクタからのＴ細胞の最初の排出、（ｄ）コレクタからのＴ細胞の排出の最終段階、の写真を示している。生存細胞回収率（ＶＣＲ（％））は、供給に対する濃縮物に存在する生存細胞のバランスに従って計算される（下記の導出を参照）。これらの実験の焦点は濃度効率を実証することであったため、これらの試験では洗浄残留物は計算されなかった。
【数1】
【0110】
１ＬＥの用途では、Ｔ細胞の最初の培養液と固定プロセスパラメータを使用して、３回（１ＬＥ－１、－２、－３として指定された実験）実行された。無菌環境で濃縮を行うために、音響要素が組み立てられ、二重袋に入れられ、ガンマ線が照射された。プロセスパラメータは、３０ｍＬ／ｍｉｎ（～２Ｌ／ｈｒ）の公称流量率と、チャンネルあたり２．２４ＭＨｚ／４０Ｗの音響駆動条件であった。１ＬＥシステムの効率は、音響定在波を生成した細胞の数によって向上するため、濃縮ステップの前に再循環期間が必要である。廃棄物を供給に再循環させることで、細胞がシステムに入り、音響によって保持され、最初の保持されていない細胞を廃棄物の流れに失うことなく、徐々に効率が向上する。ジャーカットＴ細胞を使用した以前のテストに基づいて、再循環モードの時間は１５分に選択された。これは、この細胞密度範囲の供給に対して、システムがその時点で約８０％効率的だからである。図２６は、２×１０６／ｍＬ（２Ｅ６ｍｌ－１）のオーダーの初期細胞濃度での３回の１ＬＥ実験（３０ｍＬ／分）の時間に対する廃棄ＶＣＤ（×１０６／ｍＬ（Ｅ６ｍｌ－１））の関係を示し、３Ｄ音響定在波を取り込むための１５分の再循環期間の有用性を示している（１ＬＥ－３などのより高い細胞密度で、同じ流量率の場合、音響定在波はより速く生成される）。
【0111】
１ＬＨ ＡＣＷは、生存細胞の回収への影響を評価するために、異なるパワーで運転された。３０ｍＬ／ｍｉｎ（～２Ｌ／ｈｒ）の固定流量率を使用して、入力供給仕様で４つのテストを実行した。第１のテストは、５Ｗのパワーレベルで実行された。第２と第３のテストは８Ｗで実行され、第４のテストではパワーを１０Ｗに増加した。第４のテストの廃棄物は、２段階のＡＣＷ（つまり、直列の２つの音響要素）の動作をシミュレートするために、同じ要素を介して再処理された。より高い供給細胞密度では、トランスデューサのパワーが大幅に低減される。つまり、１ＬＨの場合は５～１０Ｗ、１ＬＥの場合は４０Ｗであるため、システムを冷却する必要がない。
【0112】
図２７は、Ｔ細胞濃縮及び洗浄システム５００での操作のプロセスフロー図を示している。濃縮及び洗浄操作の一般的な処理時間は、６０～９０分の範囲である。音響濃縮洗浄（ＡＣＷ）装置５１０は、細胞生成物５３０及び洗浄緩衝液５２０の入力を有する。洗浄緩衝液５２０は、約３００ｍＬから約６００ｍＬまでの範囲の液量を有してもよい。細胞生成物５３０は、２Ｌの液量の４００億個の細胞で構成されてもよい。ＡＣＷデバイス５１０は、生成物５４０及び廃棄物５５０の出力を有する。生成物５４０は、約５から約１００ｍＬの範囲の液量を有してもよい。廃棄物５５０は、浮遊細胞、細胞破片及び緩衝液から構成されてもよい。
【0113】
ＡＣＷデバイス５１０の運転は、図２７に示すようなプロトコルで実施される。運転は、細胞生成物５３０をＡＣＷデバイス５１０の内部音響チャンバに流すことなどによって、ＡＣＷデバイス５１０がプライミングされることから始まる。細胞生成物５３０中の細胞物質は、プライミング段階中に音響チャンバ内に蓄積する傾向があり、ＡＣＷデバイス５１０がより高い効率で動作することを可能にする。ＡＣＷデバイス５１０の出力は、入力（図示せず）に再循環させることができる。従って、細胞が音響チャンバ内の音響波にトラップされ、トラップ効率が向上するにつれて、ＡＣＷデバイス５１０がプライミングされている間に細胞の内容物を失わないように、音響チャンバを通過する細胞を入力に戻すことができる。
【0114】
ＡＣＷデバイス５１０がプライミングされると、再循環経路が閉じられ、追加の細胞生成物５３０が音響チャンバに流される。細胞生成物５３０がプライミングされた音響チャンバに流入すると、追加の細胞が音響波にトラップされ、一方、媒体は音響チャンバから廃棄物５５０に流出する。
【0115】
すべての細胞が音響チャンバの音響波に集められると、洗浄緩衝液５２０が音響チャンバに流れ込み、これにより、音響チャンバ内の前の媒体が洗い流され、廃棄物５５０に送られる。その時点で、細胞は洗浄及び濃縮され、音響チャンバから取り出されて生成物５４０に提供され得る。
【0116】
図２８は、処理された数十億の細胞に対する生存可能な細胞の回収率を示すバブルグラフである。処理された生存細胞の合計がｘ軸にプロットされ、対応する生存細胞の回収率がｙ軸にプロットされる。バブルグラフのバブルのサイズは、約０．７５～約２Ｌの範囲の処理液量を表している。バブルグラフの結果は、処理時間が６０～９０分のジャーカットＴ細胞を使用した濃縮洗浄操作の結果である。１Ｌの媒体で１０億個の細胞が処理され、９２+／－３％の生存細胞回収率が得られ、出力液量は５～６ｍＬであった。
【0117】
図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄ、２９Ｅは、図２７及び図２８に示されるような音響濃縮洗浄操作のプロセスマップを示している。プロセスマップは、音響パワー、流量率、細胞収集サイクル数、細胞数、細胞濃度の操作パラメータをグラフ化したものである。図３０は、洗浄緩衝液のチャンバ容量の関数として、透過液中の総タンパク質濃度の低減を示すグラフである。５つのチャンバ容量が細胞を通過した後、最終的な総タンパク質含有量は９９％低減している。
【0118】
図３１は、バイオリアクタ６１０内の細胞凝集体から単細胞を除去するためのＡＣＷデバイス５００のアプリケーションを示している。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）は、バイオリアクタ６１０内で凝集する可能性があり、このプロセスはやや非効率的かもしれない。このようなプロセスは、ｈＰＳＣ凝集体の成長及び分化並びに最終生成物の品質に影響を与える可能性のある単細胞の集団の生成につながる可能性がある。ＡＣＷデバイス５００を使用して、バイオリアクタ内に細胞凝集体を保持しながら、そのような単細胞を除去することができる。このアプリケーションでは、凝集体と単細胞がＡＣＷデバイス５００に提供され、ＡＣＷデバイス５００の音響チャンバ内の音響定在波に大きな凝集体がトラップされる。より小さな単細胞は、音響波を通過し、音響チャンバを出て廃棄物６２０に送られる。より大きな凝集体は、音響波に集められ、バイオリアクタ６１０に戻すことができる。時間の経過とともに、凝集体が維持されながら単細胞がバイオリアクタ６１０から除去され、それにより、凝集体が濃縮され、バイオリアクタ６１０内の単細胞が枯渇する。
【0119】
図３２は、ｈＰＳＣ保持率と音響パワーとの関係を示すグラフである。グラフでは、音響パワーは約５Ｗから約３０Ｗの間で変化されている。グラフに示されているように、最大の凝集体保持率は３０Ｗで発生した。保持された凝集体の検査は、それらの形態がＡＣＷデバイス５００での処理中に変化しなかったことを示している。
【0120】
図３３は、バイオリアクタ内の凝集体の集団からの単細胞の除去を示す棒グラフである。２ＬのバイオリアクタをＡＣＷデバイス５００に接続し、３０Ｗ及び毎分６０ｍＬで稼働させ、凝集体を５分ごとにバイオリアクタに戻した。棒グラフは、バイオリアクタの内容物がＡＣＷデバイス５００を介して処理されたときに、バイオリアクタに保持される凝集体の割合が増加することを示している。保持された凝集体の検査は、音響処理後の初期形態が同じままであることを示した。総回収率は８５％であった。
【0121】
図３４は、音響濃縮洗浄処理の２つのグラフを示しており、１つは細胞増殖と処理時間との関係をグラフ化したものであり（左側）、もう１つは音響濃縮洗浄処理後のＴ細胞集団の変化をグラフ化したものである。音響濃縮洗浄デバイスで処理されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の初期培養液は、通常の増殖速度（３０時間の倍加時間）で増殖する。細胞の生存率は高レベルに維持され、灌流されたＸｕｒｉバイオリアクタ培養液で３０倍の増殖を実現できる（左のグラフ）。右のグラフは、音響濃縮洗浄デバイスで処理する前後におけるＴ細胞の生存率及び表現型のｎ＝２ドナー比較を示している。音響濃縮洗浄デバイスによる処理の後、細胞表面マーカーの発現に有意な変化は観察されていない。
【0122】
図３５は、典型的なＴ細胞表面マーカーを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示しており、その発現は、音響濃縮洗浄処理後も変化しないままである。この処理により、９０％の平均細胞回収率と９９％のタンパク質洗浄が可能になり、入力液量は１～２Ｌ、出力液量は５～１２０ｍＬになる。１００～５００Ｍ／ｍＬの出力ＶＣＤは、１～４０Ｍ／ｍＬの入力ＶＣＤで得られる。生存率の低下は観察されず、Ｔ細胞の割合は変化せず、ＣＤ８／ＣＤ４の比率は変化しなかった。
【0123】
図３６は、プロセスのいくつかのポイントで本開示の濃縮洗浄デバイスを使用するエンドツーエンドの細胞治療生産プロセスを示している。濃縮洗浄デバイスを使用して、元の血液製剤中の顆粒球、赤血球、血小板を減らすことができる。親和性細胞の選択に続いて、濃縮洗浄デバイスを使用して、得られたＴ細胞を収集及び洗浄することができる。Ｔ細胞の活性化に続いて、トランスダクション／トランスフェクションステップの前に、Ｔ細胞を再び濃縮及び洗浄することができる。濃縮洗浄デバイスは、トランスダクション／トランスフェクションステップの後、細胞増殖の前に使用してもよい。細胞増殖後、濃縮洗浄デバイスを使用して、増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞を収集及び洗浄することができる。汚染細胞の除去又は所望細胞の選択を行う親和性細胞の選択ステップに続いて、別の濃縮洗浄プロセスを使用することができる。
【0124】
上記の方法、システム、及びデバイスは例である。様々な構成では、必要に応じて、いろいろな手順又はコンポーネントを省略、置換、又は追加してもよい。例えば、代替構成では、これらの方法は、記載されている順序とは異なる順序で実行してもよく、いろいろなステップを追加、省略、又は組み合わせてもよい。また、特定の構成に関して説明された機能は、他の様々な構成で組み合わせてもよい。構成の異なる態様及び要素は、同様の方法で組み合わせてもよい。また、技術は進化しているため、要素の多くは例であり、開示又はクレームの範囲を制限するものではない。
【0125】
構成例（実装を含む）を完全に理解できるように、具体的な詳細が説明に記載されている。ただし、構成はこれらの具体的な詳細なしで実行されてもよい。例えば、よく知られているプロセス、構造、及び手法は、構成が不明瞭になるのを避けるために、不必要な詳細なしで示されている。この説明は、構成例のみを提供し、特許請求の範囲、適用可能性、又は構成を制限するものではない。むしろ、構成の前述の説明は、説明された技法を実装するための説明を提供する。本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく、要素の機能及び配置に様々な変更を加えることができる。
【0126】
また、構成は、フロー図又はブロック図として示されるプロセスとして説明されてもよい。それぞれが操作を順次プロセスとして説明してもよいが、操作の多くは並行して実行することも、同時に実行することもできる。また、操作の順序を変更してもよい。プロセスには、図に含まれていない追加のステージ又は機能が含まれてもよい。
【0127】
いくつかの例示的な構成を説明したが、本開示の精神から逸脱することなく、様々な修正、代替構造、及び同等物を使用してもよい。例えば、上記の要素は、より大きなシステムのコンポーネントであってもよく、他の構造又はプロセスが、本発明の適用よりも優先されるか、さもなければ修正されてもよい。また、上記の要素が考慮される前、最中、又は後に、多くの操作が行われてもよい。従って、上記の説明は、特許請求の範囲を拘束するものではない。
【0128】
値が第１の閾値を超える（又は、上回る）という記述は、その値が第１の閾値よりわずかに大きい第２の閾値を満たすか又は超えるという記述と同等であり、例えば、関連するシステムの分解能において第２の閾値が第１の閾値よりも１つ高い値であるという記述と同等である。値が第１の閾値よりも小さい（又は、その範囲内にある）という記述は、その値が第１の閾値よりわずかに小さい第２の閾値以下であるという記述と同等であり、例えば、関連するシステムの分解能において第２の閾値が第１の閾値より１つ低い値であるという記述と同等である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図29D】
【図29E】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
粒子を洗浄する方法であって、第１の媒体と粒子との初期混合物の初期の粒子密度及び体積を取得することと、
前記初期混合物の前記初期の粒子密度及び体積に基づいて、音響泳動デバイスを使用する音響濃縮洗浄プロセスのパラメータを設定することと、
前記初期混合物を、圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサを含む前記音響泳動デバイスのチャンバに提供することと、
前記粒子の少なくとも一部が、音響波によって少なくとも部分的に生成された音響フィールド内に保持されるように、前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを駆動して前記チャンバ内に前記音響波を生成することと、
前記パラメータに従って前記音響泳動デバイスを運転することと、を含む方法。
【請求項2】
請求項１の方法において、生体適合性洗浄液又は緩衝液である第２の媒体を前記チャンバに供給すること、を更に含む方法。
【請求項3】
請求項１の方法において、前記粒子は、細胞である方法。
【請求項4】
請求項１の方法において、前記粒子は、マイクロキャリア／細胞複合体である方法。
【請求項5】
請求項１の方法において、前記初期混合物は、約５０万粒子／ｍＬから約５００万粒子／ｍＬまでの密度を有する方法。
【請求項6】
請求項１の方法において、前記初期混合物中の粒子を濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項7】
請求項１の方法において、前記粒子を、前記初期混合物の体積の約２５分の１から約５０分の１までの濃縮容積に濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項8】
請求項７の方法において、前記初期混合物中の粒子を、前記初期混合物の粒子密度の約２５倍から約５０倍までの高く濃縮された粒子密度に濃縮すること、を更に含む方法。
【請求項9】
請求項１の方法において、前記チャンバの洗浄出力物の細胞密度は、約０．０細胞／ｍＬから約５０万細胞／ｍＬまでである方法。
【請求項10】
請求項９の方法において、前記洗浄出力物は、濃縮プロセス及び洗浄プロセスからの洗浄出力物である方法。
【請求項11】
請求項１の方法において、洗浄効果を決定するために前記チャンバ上で分光光度計プロセスを実施すること、を更に含む方法。
【請求項12】
細胞培養液から細胞を回収する方法であって、第１の媒体と粒子との初期混合物の初期の粒子密度及び体積を取得することと、
前記初期混合物の前記初期の粒子密度及び体積に基づいて、音響泳動デバイスを使用する音響濃縮洗浄プロセスのパラメータを設定することと、
前記細胞培養液の初期混合物を、フローチャンバ内で複数次元音響波を生成するように駆動されるように構成された圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサを含む音響泳動デバイスのフローチャンバに供給することと、
前記フローチャンバ内で複数次元音響波を生成するために前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを駆動することと、
前記細胞を濃縮させるために前記複数次元音響波によって少なくとも部分的に生成された音響フィールド内の前記初期混合物から前記細胞を保持することと、
前記パラメータに従って前記音響泳動デバイスを操作することと、を含む方法。
【請求項13】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞の細胞密度が、前記初期混合物の細胞密度よりも約２５倍から約５０倍大きい方法。
【請求項14】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞の体積が、前記初期混合物の体積の２５分の１から約５０分の１である方法。
【請求項15】
請求項１２の方法において、前記濃縮された細胞が約３５分以内に得られる方法。
【請求項16】
請求項１２の方法において、前記フローチャンバの洗浄出力物の細胞密度が約０．０細胞／ｍＬから約５０万細胞／ｍＬである、前記濃縮された細胞を洗浄すること、を更に含む方法。
【請求項17】
濃縮洗浄システムであって、ポンプと、
複数のバルブと、
フローチャンバと、
前記フローチャンバに結合され、複数次元音響波を生成するように駆動されるように適合された圧電材料を含む少なくとも１つの超音波トランスデューサと、
前記ポンプ、前記複数のバルブ、及び前記少なくとも１つの超音波トランスデューサを制御するためのコントローラであり、音響パワー、流量率、細胞収集サイクル数、細胞数又は細胞濃縮の１つ以上を含むパラメータで構成可能なコントローラと、を含む濃縮洗浄システム。
【請求項18】
請求項１７の濃縮洗浄システムであって、前記フローチャンバは、約２５ｍＬから約７５ｍＬまでの体積を有する濃縮洗浄システム。
【請求項19】
請求項１８の濃縮洗浄システムであって、前記フローチャンバは、約４０億細胞から約４００億細胞までの細胞容量を含むことができる、濃縮洗浄システム。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0075】
音響泳動デバイスの濃縮効率は、より高い細胞密度で再度テストされた。５×１０
６
細胞／ｍＬの細胞密度を有するＴ細胞懸濁液を使用した。１０００ｍＬの供給液量を、１０～１５ｍＬ／分の流量率で使用した。結果は図８にグラフで示されている。このデバイスは、１時間にわたるテストで、１０倍を超える濃縮係数、９０％の細胞回収率、７７％のウォッシュアウト効率を示した。１０°Ｃの温度上昇が再び観察された。
【国際調査報告】