特表 2022-518139 ｐＨ依存的膜透過性ペプチドを用いた薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-14

(54)【発明の名称】ｐＨ依存的膜透過性ペプチドを用いた薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/64 20170101AFI20220307BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220307BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220307BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220307BHJP

   C07K 16/32 20060101ALN20220307BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20220307BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220307BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220307BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220307BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64 ZNA

A61P43/00 105

A61P35/00

C07K19/00

C07K16/32

C07K14/00

C12N15/13

C12N15/11 Z

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021538954

(86)(22)【出願日】2020-01-03

(85)【翻訳文提出日】2021-09-02

(86)【国際出願番号】 KR2020000116

(87)【国際公開番号】W WO2020141930

(87)【国際公開日】2020-07-09

(31)【優先権主張番号】10-2019-0000836

(32)【優先日】2019-01-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0099364

(32)【優先日】2019-08-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516120445

【氏名又は名称】キム・ソンチョン

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】キム・ソンチョン

【テーマコード（参考）】

4C076

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC50

4C076EE59

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドを用いた薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体を提供する。本発明の薬物運搬体は、特定の標的細胞にのみ選択的に（または特異的に）作用することにより、薬物の副作用は軽減させ、薬物の薬効は増大させることができる効果を有し、抗がん剤、免疫抑制剤、造影剤などの薬物運搬体として有用に使用できる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）標的細胞の標的分子と特異的に結合する領域である細胞標的化領域と、
（ｂ）ｐＨ依存的膜透過性ペプチドと、
が結合して構成される薬物運搬体。

【請求項2】

前記標的分子は、前記標的細胞の表面に存在する抗原または受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項3】

前記標的細胞はがん細胞、非正常細胞または正常細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項4】

前記細胞標的化領域は、前記標的分子と特異的に結合することができる能力を保有している、抗体、抗体断片、アプタマー、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、サイトカインの一部領域であるペプチド、またはリガンドの一部領域であるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項5】

前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、ＧＡＬＡペプチド、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ１５ペプチド、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ２４ペプチド、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ１０８ペプチド、ＬＰペプチド変異体であるＬＰＥ３－１、ＬＰペプチド変異体であるＬＰＨ４ペプチド、またはＡＴＲＡＭペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項6】

前記細胞標的化領域と前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、（ｉ）直接互いに共有的に結合するか、（ｉｉ）非共有的に結合するか、（ｉｉｉ）リンカーを介して結合するか、或いは（ｉｖ）生体適合性高分子を介して結合することを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項7】

前記細胞標的化領域と前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドとはリンカーを介して結合し、
前記リンカーは、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、塩化スルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（ｏｘｉｒａｎｅ）、炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（ａｒｙｌ ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、フルオロフェニルエステル（ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、チオ硫酸塩（ｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、またはビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）の官能基を有することを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項8】

前記細胞標的化領域と前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドとはリンカーを介して結合し、
前記リンカーは、切断可能なリンカーまたは切断可能でないリンカーである、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項9】

前記切断可能なリンカーは、プロテアーゼによって切断可能なリンカー、酸または塩基条件で切断可能なリンカー、あるいは還元または酸化条件で切断可能なリンカーであり、
前記切断可能でないリンカーは、ＭＣＣ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）とＭＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）を含むリンカーであることを特徴とする、請求項８に記載の薬物運搬体。

【請求項10】

前記細胞標的化領域と前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドとはリンカーを介して結合し、
前記リンカーは、２つ以上の官能基を有するリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項11】

前記２つ以上の官能基を有するリンカーは、同種二機能性リンカー、異種二機能性リンカー、又は樹枝型のリンカーであることを特徴とする、請求項１０に記載の薬物運搬体。

【請求項12】

前記細胞標的化領域と前記ｐＨ依存的膜透過性ペプチドとは生体適合性高分子を介して結合することを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項13】

生体適合性高分子は合成高分子または天然高分子であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物運搬体。

【請求項14】

請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の薬物運搬体に薬物が結合した、薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項15】

前記薬物は、薬物運搬体の細胞標的化領域またはｐＨ依存的膜透過性ペプチドと、（ｉ）直接互いに共有的に結合するか、（ｉｉ）非共有的に結合するか、或いは（ｉｉｉ）リンカーを介して結合することを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項16】

前記薬物は、薬物運搬体に、（ｉ）薬物、細胞標的化領域、ｐＨ依存的細胞透過性ペプチドの順に連結されるか、（ｉｉ）細胞標的化領域、薬物、ｐＨ依存的細胞透過性ペプチドの順に連結されるか、或いは（ｉｉｉ）細胞標的化領域－ｐＨ依存的細胞透過性ペプチド－薬物の順に連結されることを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項17】

前記薬物は生体適合性高分子を介して薬物運搬体と結合することを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項18】

前記薬物は、細胞内の細胞質に移動して薬効を発揮する薬物であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項19】

前記薬物は、低分子化合物からなる薬物、遺伝子、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、リボザイム、ウイルス粒子、免疫調節剤、タンパク質または造影剤であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【請求項20】

前記薬物は、細胞毒性抗がん剤であり、
前記細胞毒性抗がん剤は、代謝拮抗剤（Ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）、微細管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）標的化剤（Ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＴｕｂｕｌｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）、アルキル化剤（Ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、有糸分裂阻害剤（Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡインターカレート剤（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ａｇｅｎｔｓ）、又はＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬物運搬体と薬物の複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドを用いた薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体に関する。

【背景技術】

【0002】

特定の臓器、組織、細胞に様々な薬物（低分子細胞毒性抗がん剤、組み換えタンパク質、遺伝子、造影剤など）を伝達するための効果的な薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の開発への関心が高まっている。一般的に、このようなシステムは、特定の細胞に特異的に存在する分子に特異的に強力に結合する物質を使用する。伝統的な剤形とは異なり、標的特異的治療剤は、標的部位に送達された治療剤の生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を最大化するように考案されており、低い副作用で病気を治療しながら治療効果を高めることができることが知られている。このような薬物送達技術は、高付加価値技術であって、全体薬物開発過程でますます重要な部門を占めており、患者の薬物順応度と服用の利便性を向上させる方法としてその活用度が増加している。

【0003】

最近では、様々な薬物（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質）を細胞内に効率よく送達するために膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）、グリコシル化トリテルペノイド（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ）などを利用しようとする試みがある（非特許文献１）。非浸透性薬物送達において薬物として使用し難かった治療用ペプチド、タンパク質及び遺伝子などの巨大分子の体内送達効率を高めることができるため、ＣＰＰペプチドを用いた薬物送達が非常に大きな関心を呼び起こしている。

【0004】

一方、ナノ粒子薬物送達システム（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ、ＮＤＤ）は、過去数十年の間に広範囲に研究されてきたとともに、がん標的治療剤の開発における重要な関心事となった。ＮＤＤは、副作用を改善し且つ治療効果を向上させるために、薬物の生体分布及び薬物動態特性を変更させる。このような肯定的効果は、腫瘍または血管細胞に特異的な結合、向上したＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）効果、腫瘍の固有な病態生理、及び微細環境（例えば、ｐＨ、酸化還元、酵素、または他の刺激などに敏感なナノ粒子）が使用できるＮＤＤの性質に起因する。

【0005】

本発明の薬物は、特定の標的細胞に特異的に薬物を運搬することができる薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体を開示する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Morris et al., Nat. Biotechnol. 19(2001) 1173-1176; Jarver et al., Drug Discov.Today 9(2004) 395-402; Pharmaceuticals 2012, 5, 1177-1209）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、標的細胞にのみ選択的に（または特異的に）作用することにより、薬物の副作用は軽減させ、薬物の効果は増大させることができる薬物運搬体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記薬物運搬体と薬物との複合体を提供することにある。
本発明の別の目的やその他の目的は、以下に提示されるだろう。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記目的を達成するために、本発明の薬物運搬体は、特定の標的細胞の表面に発現される標的分子を特異的に認識して結合する細胞標的化領域（ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、細胞外から細胞内へまたは細胞内エンドソームから細胞質への薬物放出効率（または薬物の送達効率）を高めることができる膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）とが結合された構成を持つ。

【0009】

本発明者らは、以下の実施例から確認されるように、このような構成の薬物運搬体が意図した効果、すなわち、特定の標的細胞にのみ選択的に（または特異的に）作用することにより、薬物の副作用は軽減させ、薬物の放出効率を高めて薬物の有効性は増大させる効果を有するかを評価するために、細胞標的化領域を、標的であるＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）を特異的に認識して結合するアプタマーまたは抗体で構成し、膜透過性ペプチドを、ｐＨ非依存的膜透過活性を有するペプチド（ｐＨ非依存的膜透過性ペプチド）であるメリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、ＬＰ、ハイリンａ１（Ｈｙｌｉｎ ａ１）とｐＨ依存的膜透過活性を有するペプチド（ｐＨ依存的膜透過性ペプチド）であるＬＰＥ３－１、ｐＨＤ２４それぞれで構成して薬物運搬体を製造するとともに、この薬物運搬体を例えばＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡまたはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）など、アポトーシス効果を有する薬物に結合させた薬物運搬体の薬物との複合体を製造して、様々なｐＨ条件でＨＥＲ２を過剰発現するＢＴ－４７４細胞とＨＥＲ２を発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に処理し、薬物の選択的作用性と薬物効果の増大程度を評価した。

【0010】

ここで、ＨＥＲ２は、ヒト上皮細胞成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）系のメンバーであって、乳がん患者の重要なバイオマーカー及び治療標的として知られており（Nature Clinical Practice Oncology, 2006, 3:269-280; World J Clin Oncol. 2017, 8(2):120-134）、ＰＬＫ１は、細胞分裂において中心的な役割を果たす調節者であって（Cell Rep. 2013, 3(6):2021-32）、様々なヒト腫瘍細胞で過剰発現されるので、抗がん治療の重要な標的となっている因子であり（Transl Oncol. 2017, 10(1):22-32）、パクリタキセルは、乳がん、子宮がんなどの抗がん治療剤として広く使用されているジテルペノイド（Ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）系抗がん剤である。

【0011】

前記評価の結果、膜透過性ペプチドとしてｐＨ非依存的膜透過性ペプチドであるメリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、ＬＰ、ハイリンａ１（Ｈｙｌｉｎ ａ１）を用いた薬物運搬体は、細胞質や血液などの生体主要組織、及び細胞外環境のｐＨに近いｐＨ７．０でＨＥＲ２を過剰発現するＢＴ－４７４細胞とＨＥＲ２を発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方ともで薬物が作用してアポトーシス効果を誘導することにより、標的であるＨＥＲ２の発現有無による薬物の選択的作用性を示さなかったが、膜透過性ペプチドとしてｐＨ依存的膜透過性ペプチドＬＰＥ３－１、ｐＨＤ２４を用いた薬物運搬体は、ＨＥＲ２を過剰発現するＢＴ－４７４細胞にのみ選択的に作用してアポトーシス効果を誘導し、ＨＥＲ２を発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ではアポトーシス効果をほとんど誘導しなかった。

【0012】

一方、対照群として、ｐＨ依存的膜透過性ペプチド（ＬＰＥ３－１）を除いて単にＨＥＲ２特異的アプタマーまたは抗体を薬物としてのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡまたはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に結合させて構成した薬物運搬体と薬物の複合体も、ＨＥＲ２を過剰発現するＢＴ－４７４細胞にのみ選択的に作用してアポトーシス効果を誘導したが、そのアポトーシス効果においては、ｐＨ依存的膜透過性ペプチド（ＬＰＥ３－１）まで含んでいる前記薬物運搬体と薬物の複合体に比べて著しく低かった。これに対し、以下の実施例が示すように、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドと薬物としてのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡまたはパクリタキセルとの複合体は、ｐＨ７で薬物の選択的作用性もなく、また、薬物のアポトーシス効果も殆ど示さなかった。

【0013】

前述した実験結果は、細胞標的化領域（ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とｐＨ非依存的膜透過性ペプチドで構成された薬物運搬体は、ｐＨ７でそのペプチドが細胞膜に作用して薬物を細胞内に直接送達するのに対し、細胞標的化領域とｐＨ依存的膜透過性ペプチドで構成された薬物運搬体は、そのペプチドがｐＨ７では細胞膜に作用せず、その代わりに細胞標的化領域が標的細胞の標的分子と結合してエンドソームとして細胞内に内在化した後に低いｐＨ（約ｐＨ４～６）のエンドソームまたはリソソームで活性化されて薬物を細胞質に放出するものであることを示唆するといえる。これは、以下の実施例から確認されるように、ｐＨ５．５ではｐＨ依存的膜透過性ペプチドとｐＨ非依存的膜透過性ペプチドの両方とも、このペプチドと細胞標的化領域を含む薬物運搬体を、薬物との複合体の形態で標的細胞に処理されるとき、標的分子であるＨＥＲ２の過剰発現の有無を問わず、ＢＴ－４７４細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方ともで類似な程度のアポトーシス効果を示すことによって裏付けられる。

【0014】

本発明は、前述した内容を総合すると、ある態様において、細胞標的化領域とｐＨ依存的膜透過性ペプチドとが結合された薬物運搬体として把握することができ、他の態様においては、前記薬物運搬体が薬物と結合された薬物運搬体と薬物の複合体として把握することができる。

【0015】

本明細書において、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、約ｐＨ７では膜透過性を示さないが、酸性条件、具体的にはｐＨ４～６．５の間で膜透過性を示すペプチドを意味する。別に定義すれば、約ｐＨ７の細胞外環境条件では細胞膜透過活性を示さないが、酸性条件のエンドソームまたはリソソームでは膜透過活性を示すペプチドを意味する。

【0016】

また、本発明において、細胞標的化領域が選択的に認識して結合する標的細胞の標的分子は、特定の標的細胞の表面に存在する任意の抗原または任意の受容体である。

【0017】

前記特定の細胞は、薬物がその細胞内部に送達される必要のある任意の標的細胞を意味する。この標的細胞は、通常、がん細胞（またはがん幹細胞）である。がん細胞であれば、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳腫瘍、甲状腺がん、白血病、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）疾患、リンパ腫、多発性骨髄腫（血液がん）など、癌腫を問わない。また、がん細胞以外にも、薬物が標的細胞内に送達される必要がある任意の非正常細胞も標的細胞になることができる。このような非正常細胞としては、前立腺肥大症細胞、及び過免疫活性を有する甲状腺細胞、自己免疫疾患に関連する細胞（例えば、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症などに伴って抗体を生産するＢ細胞）などを挙げることができる。また、標的細胞は、正常細胞であってよい。例えば樹枝状細胞、血管の内皮細胞、肺細胞、乳房細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、肝細胞、卵巣細胞などの任意の正常細胞が標的細胞になることができる。このような正常細胞が標的細胞として使用される場合、がん細胞や非正常細胞における薬物効果有無の判断又は確認のための対照群として有用に使用できる。標的細胞は、生きている動物やヒトの組織を構成する体内細胞であるか、或いは培養された動物細胞、培養されたヒト細胞、微生物などの体外細胞であることができる。

【0018】

細胞標的化領域が選択的に認識して結合する標的分子は、標的細胞の表面に存在する任意の抗原または任意の受容体である。この抗原は、好ましくは、標的細胞で非標的細胞に比べて過剰発現される抗原を意味し、特に正常細胞に比べてがん細胞で過剰発現される任意の細胞表面受容体を含む意味である。甲状腺未分化がんや乳がん、肺がんなどに過剰発現される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、甲状腺乳頭がん（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）で過剰発現されるメタスチン（ｍｅｔａｓｔｉｎ）受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、乳がんで過剰発現されるＥｒｂＢ系の受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、乳がんで過剰発現されるヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ＨＥＲ２）、腎乳頭がんで過剰発現されるチロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、食道腺がんで過剰発現れるＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、乳がんなどで過剰発現されるＣＸＣＲ４またはＣＣＲ７、前立腺がんで過剰発現されるエンドセリン－Ａ受容体、直腸がんで過剰発現されるＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、卵巣がんで過剰発現されるＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）などが標的分子であることができる。また、がん幹細胞の表面抗原であるＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６などが標的分子であることができ（Cancer Res, 2005, 65(23):10946-51; Cancer Res, 2007, 67(3): 1030-7）、その他にも、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、ＧＤ２ガングリオシド、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＬＡ－ＤＲ１０（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、ＴＡＬ６（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ Ｌ６）、ＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などがまた標的分子であることができる。

【0019】

本発明において、細胞標的化領域は、標的細胞への選択的な結合を可能にすることにより標的機能を提供する。この細胞標的化領域は、標的細胞の表面に存在する抗原または受容体と特異的に結合してエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導することにより、これと結合する薬物の細胞内への移動を可能にする。

【0020】

抗体、アプタマー、特定の細胞から分泌されて標的細胞である他の細胞の表面受容体に作用することにより、細胞間シグナル伝達の役割を果たすホルモン（例えばエリスロポエチンホルモン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ））、サイトカインまたはケモカイン（例えばＩＬ１３）、標的細胞の表面受容体に結合するＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）などの生体分子であるリガンド、受容体との特異的結合能力を保有したそれらの因子の一部領域であるペプチドなどが、このような細胞標的化領域として利用できる。
代表的に、本発明の薬物運搬体における細胞標的化領域は、抗体またはアプタマーである。

【0021】

細胞標的化領域としての抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体だけでなく、多重特異的抗体（すなわち、２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープを認識する抗体であって、二特異的抗体などをいう）であるか、標的抗原と特異的に結合することが可能な能力を保有する限り、抗体の断片、化学的に修飾された抗体、キメラ抗体（ヒトとマウスのキメラ抗体、ヒトとサルのキメラ抗体など）、免疫原性を低下させたヒト化抗体やヒト抗体などの任意の抗体であることができる。また、抗体断片、化学的に修飾された抗体の様々な形態が当業分野に公知になっており、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた抗体）、Ｆｖ、Ｆａｂ／ｃ（１つのＦａｂと完全なＦｃを有する抗体）などや、抗体をタンパク質切断酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理して得られた抗体断片などを挙げることができる。

【0022】

細胞標的化領域としての抗体は、従来開発されて販売されている抗体、例えば、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、バダツキシマブ（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ）、グレンバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）などを使用することもできる。

【0023】

抗体の製造方法、天然抗体に人為的変形を加えて標的抗原に対する特異性を向上させるか或いは免疫原性を改善させた抗体などに関しては、当業分野に公知になっている様々な文献、例えば、米国特許第４，４４４，８８７号、米国特許第４，７１６，１１１号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，８１４，３１８号、国際公開特許ＷＯ９８／４６６４５号、国際公開特許ＷＯ９８／５０４３３号、国際公開特許ＷＯ９８／２４８９３号、国際公開特許ＷＯ９８／１６６５４号、国際公開特許ＷＯ９６／３４０９６号、国際公開特許ＷＯ９６／３３７３５号、文献［Protein Eng 1994, 7(6):805-814］、文献［Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91:969-973］などを参照することができる。

【0024】

細胞標的化領域としてのアプタマーは、一本鎖ＤＮＡアプタマーまたは一本鎖ＲＮＡアプタマーであることができる。アプタマーは、抗体と同様に、標的抗原などの標的分子に特異的に結合することができる核酸リガンドを意味するが、標的分子と特異的に結合することができれば、アプタマーは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーであってもよい。このような標的分子と特異的に結合することが可能なアプタマーの製造、選別方法などは、すべて当業分野に公知になっており、特にＳＥＬＥＸ技術を利用することができる。このＳＥＬＥＸ技術は、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」の略語と名付けられた技術であって、当該技術については、文献［Science 249 (4968):505-510, 1990］、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，２７０，１６３号、国際特許公開ＷＯ９１／１９８１３などを参照することができ、アプタマーの選別のための具体的な方法や適切な試薬、材料などの使用については、文献［Methods Enzymol 267:275-301, 1996］、文献［Methods Enzymol 318:193-214, 2000］などを参照することができる。アプタマーは、生体内半減期の向上のために糖、リン酸塩及び／又は塩基で変形したものであることができる。このような糖、リン酸塩及び／又は塩基で変形したヌクレオチドは、当業分野にその製造方法を含めて具体的に公知になっている。例えば、糖で変形したヌクレオチドは、その糖のヒドロキシル基（ＯＨ ｇｒｏｕｐ）がハロゲン基、脂肪族基、エーテル基、アミン基などで修飾されたもの、糖としてのリボースまたはデオキシリボース自体がこれに代わることができる糖類似体α－アノマー糖（α－ａｎｏｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅｓ）またはリキソース（ｌｙｘｏｓｅｓ）などのエピマー糖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、ピラノース糖（ｐｙｒａｎｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ）、フラノース糖（ｆｕｒａｎｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ）などで置換されたものを挙げることができる。また、例えば、リン酸塩での変形は、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（ｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（ａｍｉｄａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）に変形したものなどを挙げることができる。ここで、前記ＲまたはＲ’は、Ｈまたは置換もしくは無置換のアルキルなどであり、リン酸塩で変形する場合、その連結基は－Ｏ－、－Ｎ－、－Ｓ－または－Ｃ－となり、このような連結基を介して隣接ヌクレオチドが互いに結合する。

【0025】

本発明の薬物運搬体において、細胞標的化領域は、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドに連結されている。このｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、約ｐＨ７条件の細胞膜には膜透過活性を示さず、細胞標的化領域が標的細胞の標的分子と結合してエンドソームとして細胞に内在化した後に低いｐＨ（ｐＨ４～６）のエンドソームまたはリソソームで活性化されて膜透過活性を示すことにより、薬物を細胞質へ放出する機能を行う。そうすることにより、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドを有する本発明の薬物運搬体は、ｐＨ非依存的膜透過性ペプチドを有する薬物運搬体において標的分子を発現しない非標的細胞に対しても、そのペプチドの膜透過活性によって薬物効果が非選択的に現れる副作用なしに、標的分子が発現される標的細胞に対してのみ選択的に薬物効果が現れることを可能にする。

【0026】

本発明の薬物運搬体において、細胞標的化ドメインと結合することが可能なｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、当業分野に幾つかが公知になっている。例えば、ＧＡＬＡペプチド、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ１５、ｐＨＤ２４、ｐＨＤ１０８と、ＬＰペプチド変異体であるＬＰＥ３－１、ＬＰＨ４及びＡＴＲＡＭペプチドなどがそのようなペプチドである。

【0027】

ＧＡＬＡペプチドに関連しては、文献［J. Am. Chem. Soc., 2015, 137:12199-12202, 2015］を参照することができ、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ１５、ｐＨＤ２４、ｐＨＤ１０８に関連しては、文献［J Am Chem Soc 2017, 139(2): 937-945］を参照することができ、ＬＰペプチド変異体であるＬＰＥ３－１、ＬＰＨ４に関連しては、文献［Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8］を参照することができる。また、ＡＴＲＡＭペプチドに関連しては、文献［Biochemistry 2015, 54:6567-6575］を参照することができる。これらの文献はいずれも、本明細書に引用された他のすべての文献と同様に、本明細書の一部としてみなされる。

【0028】

文献［J. Am. Chem. Soc., 2015, 137:12199-12202, 2015］は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）のＨＡ－２サブユニットのＮ末端領域に由来するペプチドであって、Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａの反復配列で構成されているＧＡＬＡペプチドが、酸性ｐＨではα－ヘリックス構造を形成して細胞膜を透過するが、中性ｐＨでは細胞膜を透過しないことを示す。

【0029】

文献［J. Am. Chem. Soc., 2015, 137:12199-12202, 2015］は、ＭｅｌＰ５ペプチドの変異体であるｐＨＤ１５、ｐＨＤ２４、ｐＨＤ１０８は酸性条件、すなわちｐＨ５前後で高い膜透過活性を示すが、中性条件、すなわちｐＨ７前後では膜透過活性を示さないことを示し、文献［Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8］は、ＬＰペプチドの変異体であるＬＰＥ３－１、ＬＰＨ４がｐＨ５前後で高い膜透過活性を示すが、ｐＨ７．４では膜透過活性を殆ど示さないことを示す。

【0030】

文献［Biochemistry 2015, 54:6567-6575］は、ＡＴＲＡＭペプチドが固形がんの細胞外環境のｐＨと類似する弱酸性ｐＨでのみ膜透過性を示すことを開示する。

【0031】

前記例示されたｐＨ依存的細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列は、下記から確認することができる。
ＬＰＥ３－１：Ｈ２Ｎ－ＧＷＷＬＡＬＡＥＡＥＡＥＡＬＡＬＡＳＷＩＫＲＫＲＱＱ－ＣＯＯＨ（配列番号１）
ＬＰＨ４：ＧＷＷＬＡＬＡＬＡＬＡＬＡＬＡＬＡＳＷＩＨＨＨＨＱＱ－ＣＯＯＨ（配列番号２）
ｐＨＤ１５：Ｈ２Ｈ－ＧＩＧＥＶＬＨＥＬＡＤＤＬＰＤＬＱＥＷＩＨＡＡＱＱＬ－ＣＯＯＨ（配列番号３）
ｐＨＤ２４：Ｈ２Ｎ－ＧＩＧＤＶＬＨＥＬＡＡＤＬＰＥＬＱＥＷＩＨＡＡＱＱＬ－ＣＯＯＨ（配列番号４）
ｐＨＤ１０８：Ｈ２Ｎ－ＧＩＧＥＶＬＨＥＬＡＥＧＬＰＥＬＱＥＷＩＨＡＡＱＱＬ－ＣＯＯＨ（配列番号５）
ＡＴＲＡＭ：ＧＬＡＧＬＡＧＬＬＧＬＥＧＬＬＧＬＰＬＧＬＬＥＧＬＷＬＧＬＥＬＥＧＮ－ＣＯＯＨ（配列番号６）

【0032】

本発明の薬物運搬体において、細胞標的化領域とｐＨ依存的膜透過性ペプチドは、リンカーの媒介なしに直接互いに共有的に結合するか、或いはリンカーを介して共有的に結合することができる。

【0033】

細胞標的化領域が抗体、リガンド、ペプチド、サイトカインなどのタンパク質である場合、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドとの直接的な共有結合は、タンパク質である細胞標的化領域の末端アミノ酸のカルボキシ基（またはアミノ基）とｐＨ依存的ペプチド末端アミノ酸のアミノ基（またはカルボキシ基）を、当業分野に公知になっている方式で化学的に結合させることにより行われることができる。また、このような結合は、これらの結合体を暗号化する組み換え核酸を、適切な発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを適切な宿主微生物（大腸菌やＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞などの動物細胞など）に形質転換させて融合タンパク質の形態で発現させ、分離、精製することにより行われることができる。当業分野では、遺伝子組み換え核酸技術、発現ベクターの構成、選別マーカー遺伝子、形質転換方法、宿主微生物、宿主微生物の培養（培養培地の組成、培養方法、高収率の培養方法、目的タンパク質の分離方法など）はすべて公知になっており、相当な量の文献が蓄積されているため、これらの文献を参照することができる。例えば、文献［Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)］、文献［Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)］、文献［F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Inc. (1994)］、文献［Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques］などを参照することができる。

【0034】

細胞標的化領域がタンパク質であって、ｐＨ依存的ペプチドとの直接的な共有結合を形成する場合、細胞標的化領域の標的との特異的結合性やｐＨ依存的ペプチドの細胞透過性に影響を及ぼさないように、数個または数十個のアミノ酸からなるスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を介在させることができる。このようなスペーサーが介在した本発明の薬物運搬体は、化学反応によって、または前述した組み換え融合タンパク質の製造方法と同様の方法によって製造できる。

【0035】

細胞標的化領域が抗体、リガンド、ペプチド、サイトカインなどのタンパク質である場合、そのタンパク質は、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドと、リンカーの媒介なしに直接水素結合などの静電気的相互作用（ｃｈａｒｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、疎水性相互作用などを介して非共有的に結合することができる。例えば、タンパク質である細胞標的化領域が陰電荷を帯びる表面を有する場合には、陽イオン性を帯びるｐＨ依存的膜透過性ペプチドと静電気的相互作用を介して互いに結合することができる。同様に、タンパク質である細胞標的化領域が疎水性領域を含む場合、疎水性を帯びるｐＨ依存的膜透過性ペプチドと静電気的相互作用を介して結合することができる。

【0036】

細胞標的化領域がアプタマーである場合も、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドと、リンカーの媒介なしに静電気的相互作用（ｃｈａｒｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、疎水性相互作用などを介して非共有的に結合することができる。核酸であるアプタマーは、陰電荷を帯びるため、例えば陽イオン性を帯びるｐＨ依存的ペプチドと静電気的相互作用を介して結合する。

【0037】

本発明の薬物運搬体において、細胞標的化領域とｐＨ依存的ペプチドは、リンカーを介して共有的に結合することもできる。

【0038】

本発明において、リンカーは、ペプチドやリガンド、抗体、抗体断片などのタンパク質のアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）またはスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）や、アプタマーなどの核酸のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）、ヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を介して結合することができる官能基を有する任意のリンカーを使用することができる。

【0039】

このようなリンカーの官能基は、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、塩化スルホニル（ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（ｏｘｉｒａｎｅ）、炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（ａｒｙｌ ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、フルオロフェニルエステル（ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、チオ硫酸塩（ｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、またはビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）などであることができる。

【0040】

リンカーは、プロテアーゼによって切断可能であるか、酸または塩基条件で切断可能であるか、高温又は光照射によって切断可能であるか、或いは還元または酸化条件で切断可能なリンカーであってもよく、これらの条件で切断可能でないリンカーであってもよい。

【0041】

切断可能なリンカーとしては、例えば、酸性条件で切断されるヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）リンカー、プロテアーゼによって切断されるペプチドリンカー、還元条件で切断されるジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）官能基を有するリンカーなどを挙げることができ、切断可能でないリンカーとしては、ＭＣＣ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）リンカー、ＭＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）リンカー、またはその誘導体としてのスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）リンカーやスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ－ｓＭＣＣ）を挙げることができる。

【0042】

また、リンカーは、自壊的リンカー（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）またはトレースレスリンカー（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）であることができる。自壊的リンカーは、例えば、発明の名称が「Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」である米国特許第９，０８９，６１４号に開示されたリンカー、名称が「ＳＥＬＦ－ＩＭＭＯＬＡＴＩＶＥ ＬＩＮＫＥＲＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＭＡＮＤＥＬＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ、ＤＲＵＧ－ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」である国際公開第２０１５／０３８４２６号に開示されたリンカーを挙げることができ、トレースレスリンカーとしては、フェニルヒドラジドリンカー、アリール－トリアゼンリンカー、文献［Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)］に開示されたリンカーなどであることができる。

【0043】

また、リンカーは、同種二機能性リンカー（２以上の同じ反応性官能基を有するリンカー）または異種二機能性リンカー（２以上の異なる反応性官能基を有するリンカー）であってもよい。

【0044】

同種二機能性リンカーは、例えば、３’，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）などを挙げることができる。

【0045】

異種二機能性リンカーは、アミン反応性及びスルフヒドリル反応性クロスリンカー、カルボニル反応性及びスルフヒドリル反応性クロスリンカー、アミン反応性及び光反応性クロスリンカー、スルフヒドリル反応性及び光反応性クロスリンカーなどを挙げることができるが、アミン反応性及びスルフヒドリル反応性クロスリンカーとしては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性－長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢｓ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）などを挙げることができ、カルボニル反応性及びスルフヒドリル反応性クロスリンカーとしては、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ_２Ｃ_２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などを挙げることができ、アミン反応性及び光反応性クロスリンカーとしては、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨｓ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨｓ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨｓ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ρ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯｓ）などを挙げることができ、スルフヒドリル反応性及び光反応性クロスリンカーとしては、例えば、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミドなどを挙げることができる。

【0046】

一部の態様において、リンカーは、樹枝型（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｔｙｐｅ）のリンカーである。樹脂型のリンカーは、分枝状、多機能性連結部を有し、そのようなリンカーとしては、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーを挙げることができる。

【0047】

当業分野では、上記に例示したリンカー以外にも、本発明に適用可能な数多くのリンカーが相当な数の文献を通じて公知になっている。それらの文献として、具体的には、文献［Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibodydrug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013)］、文献［Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)］、文献［Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779］、文献［Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329］文献［Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073］、文献［Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125］、文献［Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218］、文献［Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214］などや、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第８，２８８，３５２号、米国特許第８，６０９，１０５号、米国特許第８，６９７，６８８号、米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号、米国特許公開第２０１３／０２８９１９号、米国特許公開第２０１４／２８６９７０号、米国特許公開第２０１３／０３０９２５６号、米国特許公開第２０１５／０３７３６０号、米国特許公開第２０１４／０２９４８５１号、国際特許公開ＷＯ２０１５／０５７６９９号、国際特許公開ＷＯ２０１４／０８０２５１号、国際特許公開ＷＯ２０１４／１９７８５４号、国際特許公開ＷＯ２０１４／１４５０９０号、国際特許公開ＷＯ２０１４／１７７０４２号などを参照することができる。

【0048】

本発明の薬物運搬体は、他の態様において、細胞標的化領域とｐＨ依存的膜透過性ペプチドが、生体適合性高分子を介してまたはキャリアにして結合されることもできる。
生体適合性高分子は、生体組織又は血液と接触して組織を壊死させるか或いは血液を凝固させない組織適合性（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）及び血液適合性（ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を持っている高分子を意味する。
好ましくは、本発明に適した生体適合性高分子キャリアは、合成ポリマーまたは天然ポリマーである。

【0049】

本発明の好適な具現例によれば、前記生体適合性高分子としての合成ポリマーは、ポリエステル、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（β－ヒドロキシ酸）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－バリレート、ＰＨＢＶ）、ポリ（３－ヒドロキシプロプリオネート、ＰＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート、ＰＨＨ）、ポリ（４－ヒドロキシ酸）、ポリ（４－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（４－水酸化吉草酸）、ポリ（４－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（エステルアミド）、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド、ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリホスホエステル、ポリホスホエステルウレタン、ポリ（アミノ酸）、ポリシアノアクリレート、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（チロシンカーボネート）、ポリカーボネート、ポリ（チロシンアリレート）、ポリアルキレンオキサレート、ポリホスファゼン、ＰＨＡ－ＰＥＧ、エチレンビニルアルコールコポリマー（ＥＶＯＨ）、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレンとエチレン－アルファオレフィンコポリマー、スチレン－イソブチレン－スチレントリブロックコポリマー、アクリルポリマー及びコポリマー、ビニルハライドポリマー及びコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリビニルエーテル、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニリデンハライド、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンクロリド、ポリフルオロアルケン、ポリペルフルオロアルケン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリビニル芳香族、ポリスチレン、ポリビニルエステル、ポリビニルアセテート、エチレン－メチルメタクリレートコポリマー、アクリロニトリル－スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂とエチレン－ビニルアセテートコポリマー、ポリアミド、アルキド樹脂、ポリオキシメチレン、ポリイミド、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸－ｃｏ－マレイン酸またはポリアミノアミンである。

【0050】

好ましくは、前記生体適合性ポリマーとしての天然ポリマーは、キトサン、デキストラン、セルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、イヌリン、澱粉またはグリコーゲンである。また、好ましくは、本発明に適した生体適合性高分子は、デンドリマー構造を有するポリマーである。例えば、ポリアミノアミンのデンドリマーが、本発明で生体適合性高分子として使用できる。

【0051】

生体適合性高分子を、本発明でのように薬物などのキャリアとして使用するのと関連しては、当業分野にかなりの文献が公知になっており、さらに具体的なものは、これらの文献を参照することができる。これらの文献としては、文献［Kiran Dhaliwal, "Biodegradable Polymers and their Role in Drug Delivery Systems" Biomedical Journal of Scientific & Technical Research, 2018, 11(1):8315-8320］、文献［Avnesh Kumari, et al., "Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems" Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 75(1):1-18］、文献［Kumaresh S Soppimath, et al., "Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices" Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2001, 70(1):1-20］などを例示することができる。

【0052】

本発明は、他の態様において、前述した薬物運搬体と薬物とが結合された、薬物運搬体と薬物の複合体に関する。本発明の薬物運搬体と薬物の複合体において、薬物は、薬物運搬体の細胞標的化領域又はｐＨ依存的細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有的に結合するか、或いはリンカーを介さずに非共有的に結合することができる。

【0053】

本発明の薬物運搬体と薬物の複合体は、具体的に、図１に示すように、薬物－細胞標的化領域－ｐＨ依存的細胞透過性ペプチドの順に連結されるか、或いは細胞標的化領域－薬物－ｐＨ依存的細胞透過性ペプチドの順に連結されるか、或いは細胞標的化領域－ｐＨ依存的細胞透過性ペプチド－薬物の順に連結された形態であることができる。また、図１に示すように、生体適合性高分子を介して薬物、細胞標的化領域及びｐＨ依存的細胞透過性ペプチドが任意の順に結合されることもできる。

【0054】

本発明の薬物運搬体と薬物の複合体において、薬物を薬物運搬体に結合させるためのリンカーは、本発明の薬物運搬体に関連して例示したリンカーを、薬物に応じて適切なものを選択して使用することができる。例えば、薬物に、アルデヒド反応基を有するリンカーを連結し、薬物運搬体の抗体（細胞標的化領域）のＮ末端のアミノ基に結合させることができる。

【0055】

薬物運搬体と薬物の結合に使用されるリンカーは、標的細胞の外で安定的であって切断されず、標的細胞内の酸性条件であるエンドソームまたはリソソームでも切断されないリンカーであることが好ましい。このようなリンカーは、標的細胞の外で安定的であって切断されないことにより、薬物が細胞内に移動するようにし、酸性条件であるエンドソームまたはリソソームで切断されないことにより、エンドソームまたはリソソームから細胞質へ移動することができるようにする。

【0056】

本発明の薬物運搬体と薬物の複合体において、薬物は、薬物運搬体に非共有的に結合することもできる。例えば、核酸にインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）されて効果を発揮する、抗がん剤の一種であるドキソルビシンなどのインターカレート剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ａｇｅｎｔｓ）は、薬物運搬体の細胞標的化領域としてアプタマーを使用する場合にアプタマーに非共有的にインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）方式で結合することができる。アプタマーは、オリゴヌクレオチド分子であるので、ヌクレオチド塩基の塩基スタッキング（ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ）があり、この塩基スタッキングの間に薬物がインターカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）方式で結合することができる。

【0057】

本発明の薬物運搬体と薬物の複合体において、薬物は、それが細胞内に移動して効果を発揮することができる薬物であれば、特別な制限はない。そのような薬物は、細胞毒性抗がん剤などの任意の低分子化合物からなる薬物、組み換えタンパク質、ｓｉＲＮＡなどの任意のバイオ医薬品であることができる。また、薬物は、効能の面で抗炎症剤、鎮痛剤、抗関節炎剤、鎮痙剤、抗うつ剤、抗精神病薬物、精神安定剤、抗不安剤、麻薬拮抗剤、抗パーキンス病薬、コリン作動性アゴニスト、抗がん剤、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、免疫促進剤、抗ウイルス剤、抗生剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛剤、ホルモン剤、冠状血管、血管拡張剤、避妊薬、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管疾患治療剤、造影剤などの診断剤などであることができる。

【0058】

本発明において、薬物は、好ましくは、細胞毒性抗ガン剤である。細胞毒性抗がん剤は、代謝拮抗剤（Ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）、微細管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）標的化剤（Ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＴｕｂｕｌｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）、アルキル化剤（Ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、有糸分裂阻害剤（Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡインターカレート剤（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ ａｇｅｎｔｓ）、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などに大別できるが、代謝拮抗剤としては、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などの葉酸（Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）誘導体、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）などのプリン（Ｐｕｒｉｎｅ）誘導体、アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）などのピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）誘導体、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）などが当業分野に公知になっており、微細管標的化剤としては、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ドラスタチンなどのアウリススタチン系の薬物、メイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）などが当業分野に公知になっており、アルキル化剤としては、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（Ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）などのアルキルスルホネート（Ａｌｋｙｌ Ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）製剤、ベンダムスチン（Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）などのナイトロジェンマスタード（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ）誘導体、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ヘプタプラチン（Ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）などの白金（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）製剤などが当業分野に公知になっている。また、有糸分裂阻害剤（Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）としては、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などのタキサン（Ｔａｘａｎｅ）製剤、ビンフルニン（Ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）などのビンカアルカリド（Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｉｄｓ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）などのポドフィロトキシン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）誘導体などが当業分野に公知になっており、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）としては、カリケミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）などが公知になっており、ＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ ａｇｅｎｔ）としては、ＰＢＤ二量体などが公知になっている。また、ＤＮＡインターカレート剤としては、ドキソルビシンなどが当業分野に公知になっており、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤としては、ＳＮ－２８などが当業分野に公知になっている。

【0059】

また、薬物は、遺伝子、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、リボザイム、ウイルス粒子、免疫調節剤、タンパク質、造影剤などであってもよい。より具体的には、薬物は、網膜芽細胞腫の腫瘍サプレッサ遺伝子の変異体であるＲｂ９４をコードする遺伝子、腫瘍細胞でのみアポトーシスを誘導するアポプチンをコードする遺伝子であることができ、治療標的となるＨＥＲ－２などに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列：５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＣＴ－３’）であることができ、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ－ＤＴＰＡ物質などの診断造影剤であることもできる。

【0060】

本発明の薬物運搬体と薬物との複合体は、薬学的に許容される担体を含むことにより、当業分野に公知になっている通常の方法で投与経路に応じて経口用剤形または非経口用剤形の薬学的組成物に製造できる。ここで、「薬学的に許容される担体」は、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。

【0061】

前記担体は、特にこれに限定されないが、経口投与の場合には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。

【0062】

本発明の組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与の場合には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などに剤形化することができる。

【0063】

製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。

【0064】

また、本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤よりなる群から選ばれるいずれかの剤形を持つことができる。

【0065】

また、前記組成物は、薬学的分野で通常の方法によって、患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、好ましくはペプチド医薬品の投与に有用な製剤に剤形化させ、当業分野における通常使用される投与方法を用いて経口、または皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む非経口投与経路によって投与できるが、これらに限定されるものではない。

【0066】

また、前記結合体は、生理食塩水または有機溶媒のように薬学的に許容される様々なキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して使用でき、安定性又は吸水性を増加させるためにグルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）またはグルタチオンなどの抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート物質（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、低分子タンパク質または他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）が薬剤として使用できる。

【0067】

薬学的組成物の製剤化に関連しては、当業分野に公知になっており、具体的に文献［Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)］などを参照することができる。前記文献は、本明細書の一部としてみなされる。

【0068】

本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重症度、投与経路に応じて１日０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であることができる。投与は、１日１回または数回に分けて行われることができる。このような投与量は、いずれの側面であれ、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。

【発明の効果】

【0069】

前述したように、本発明によれば、特定の標的細胞にのみ選択的に（または特異的に）作用することにより、薬物の副作用は軽減させ、薬物の薬効は増大させることができる薬物運搬体、及びそれと薬物の複合体を提供することができる。本発明の薬物運搬体は、抗がん剤、免疫抑制剤、造影剤などの薬物運搬体として有用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1】本発明によって製造される薬剤運搬体と薬物の複合体の構成を図式化して示すものである。ＣＴＤは細胞標的化ドメインを意味し、ＤＲＤは膜透過性ペプチドであって薬物放出ドメインを意味し、Ｄｒｕｇは薬物を意味する。

【図2】ＬＰＥ３－１ペプチドを使用したときのＨＰＬＣ分析結果とポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動画像である。

【図3】ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体、及びそれらの結合体のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動画像である。

【図4】ＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に、薬物運搬体と薬物の複合体としてＨＥＲ２ Ａｐ、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ及びＬＰＥ３－１からなる複合体を処理した結果の画像である。

【図5】ＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する、５種の薬物運搬体と薬物の複合体の処理によるアポトーシスを調査した結果である。

【図6】それぞれＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する、ＨＥＲ２ Ａｐ、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ及びＬＰＥ３－１からなる薬物運搬体と薬物の複合体の処理時間によるアポトーシス誘導効果を示す結果である。

【図7】それぞれＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する、ＨＥＲ２ Ａｐ、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ及びＬＰＥ３－１からなる薬物運搬体と薬物の複合体の処理濃度によるアポトーシス誘導効果を示す結果である。

【図8】ｐＨ７．０の条件で、ＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する、５種の薬物運搬体と薬物の複合体の処理によるアポトーシス程度をミトコンドリア膜電位変化測定によって得た結果である。

【図9】ｐＨ５．５の条件で、ＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する、５種の薬物運搬体と薬物の複合体の処理によるアポトーシス程度をミトコンドリア膜電位変化測定によって得た結果である。

【図10】ＨＥＲ２が過剰発現するＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に様々な対照群の薬物運搬体を処理したときのアポトーシス程度を示す結果である。

【図11】ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に試験群薬物運搬体を処理したときの処理時間別のアポトーシス程度を示す結果である。

【図12】ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に試験群薬物運搬体を処理したときの処理時間別のアポトーシス程度を示す結果である。

【図13】ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に試験群の薬物運搬体を処理したときの処理濃度別のアポトーシス程度を示す結果である。

【図14】ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に試験群の薬物運搬体を処理したときの処理濃度別のアポトーシス程度を示す結果である。

【発明を実施するための形態】

【0071】

以下、本発明を実施例を参照して説明する。しかし、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0072】

＜実施例１＞薬物放出性に優れたペプチドの選定のための薬物運搬体の製造
＜実施例１－１＞薬物運搬体の製造のための材料の準備
本実施例で製造される薬物運搬体は、細胞標的化ドメイン（ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、ＣＴＤ）と薬物（ｄｒｕｇ）と薬物放出誘導性を有するペプチド（ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＤＲＤ）とが結合された構造（ＣＴＤ／薬物／ＤＲＤ）を持つ。

【0073】

ＣＴＤはＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）特異的アプタマー（ＨＥＲ２＿Ａｐ）を使用し、薬物はＰＬＫ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）に特異的なｓｉＲＮＡを使用し、薬物放出誘導性を有するペプチドは下記表１の５種のペプチドを使用した。

【0074】

【表1】

【0075】

前記ＨＥＲ２は、ヒト上皮細胞成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）系のメンバーであって、乳がん患者の重要なバイオマーカー及び治療標的として知られている（Nature Clinical Practice Oncology, 2006, 3:269-280; World J Clin Oncol. 2017, 8(2):120-134）。本実施例では、ＨＥＲ２を標的分子にして製作されたＨＥＲ２に特異的なアプタマー（Varmira K. et al., Nucl Med Biol. 2013, 40(8):980-6）をＣＴＤとして使用した。また、前記ＰＬＫ１は、細胞分裂において中心的な役割をする調節者であって（Cell Rep. 2013, 3(6):2021-32）、様々なヒト腫瘍細胞で過剰発現されるため、抗がん治療の重要な標的となっている因子である（Transl Oncol. 2017, 10(1):22-32）。本実施例では、ＰＬＫ１を治療の標的とするＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ（Song WJ. et al.,Small, 2010, 6(2):239-246）を薬物として使用した。

【0076】

本実施例の薬物運搬体を製造するために、まず、ＨＥＲ２特異的アプタマー（ＨＥＲ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｔａｍｅｒ、ＨＥＲ２ Ａｐ）配列、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）配列（下記配列番号１０における下線付きの塩基配列）、及びＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ）を指示する配列を有する、下記配列番号１０の一本鎖核酸ＤＮＡ（ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ；韓国、バイオニア社製）、また、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ）を指示する下記配列番号１１の一本鎖核酸ＤＮＡ（韓国、バイオニア社製）をそれぞれ注文製作する一方、また、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ）を指示する下記配列番号１２の一本鎖核酸ＤＮＡ（米国、ＢｉｏＳｙｎｈｅｓｉｓ社製）と前記表１のペプチド（米国、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ社製）をそれぞれ注文製作した。

【0077】

ＨＥＲ２ Ａｐ－スペーサー－ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ：ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＡＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＴ－ＴＴＴＴ－ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＴ（配列番号１０）
ＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ＿ＳＳ：ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＴ（配列番号１１）
ＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ＿ＡＳ：ＴＡＡ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＴＣ ＴＴＣ Ａ（配列番号１２）

【0078】

＜実施例１－２＞ＨＥＲ２特異的アプタマーとＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡセンス鎖との接合体の製造
ＨＥＲ２特異的アプタマーとＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡセンス鎖との接合体であるＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳの製造のために、まず、前記注文製作した配列番号１０のＤＮＡ一本鎖核酸を鋳型として、Ｔ７プロモーター配列（下記配列番号１３における下線付きの塩基配列）がある下記配列番号１３の順方向プライマーと配列番号１４の逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行うことによりＰＣＲ産物を得、次にこれを鋳型として２’－Ｆ－置換ピリミジンを用いてＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ(登録商標)Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国、Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）で体外転写を行うことにより、ＨＥＲ２ Ａｐ－スペーサー－ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体を製造した。前記接合体は、２’－Ｆ－置換ピリミジンを含んでいるＲＮＡ転写体であって、自然状態のＲＮＡよりも生体内安定性が高い。

【0079】

Ｔ７プロモーターがある順方向プライマー：ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡ ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＧＧ ＧＡＡ（配列番号１３）
逆方向プライマー：ＡＡＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＴＴ（配列番号１４）
上記において、ＰＣＲは、１，０００ｐｍｏｌｅｓの一本鎖核酸ＤＮＡ（配列番号１０）、２５００ｐｍｏｌｅｓ ＰＣＲのプライマー対、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、０．１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（米国、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ製）を用いて行い、ＰＣＲ増幅物をＱＩＡｑｕｉｃｋ－ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製カラム（米国、ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．製）で精製した。

【0080】

また、上記において、２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡの製造は、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国、Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を用いて体外転写で合成し、精製して準備した。具体的には、２００ｐｍｏｌｅｓの二本鎖ＤＮＡ ＰＣＲ増幅物、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、４％ＰＥＧ ８０００、５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドである１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、３ｍＭ ２’Ｆ－ＣＴＰ、３ｍＭ ２’Ｆ－ＵＴＰを３７℃で６～１２時間反応させて行った。結果物をＢｉｏ－Ｓｐｉｎ ６クロマトグラフィーカラム（米国、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で精製した。

【0081】

＜実施例１－３＞ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とペプチドの接合体（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド）の製造
本実施例において、オリゴヌクレオチドであるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と、表１の５種の各ペプチドとを接合させてＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とペプチドとの接合体であるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチドを製造した。このために、アミノ官能基を反応性の高いアルデヒド官能基に転換させる試薬である、化学式１のＳ－４ＦＢリンカーまたは化学式２のＳ－ＳＳ－４ＦＢリンカーを含む抗体オリゴヌクレオチドオールインワン接合キット（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、米国、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社製）を使用した。

【0082】

【化1】

化学式１

【化2】

化学式２

【0083】

まず、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ）を指示する前記配列番号１２の一本鎖核酸ＤＮＡを鋳型として用いて、５’末端にアミノ基が付着し且つ２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ）を注文製作した（韓国、バイオニア社製）。

【0084】

次に、前記ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳの凍結乾燥物に抗体オリゴヌクレオチドオールインワン接合キット（米国、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社製）の１００μｌのＯｌｉｇｏＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して０．５ ＯＤ２６０／μｌのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ溶液を準備した。このＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ溶液に対して、オリゴ脱塩用スピンカラムで脱塩工程を行った。この脱塩されたＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ＿ＡＳ溶液に、ＤＭＦに溶けたＳ－４ＦＢ溶液を添加して、０．５ ＯＤ２６０／μｌのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ溶液となるようにして、室温で２時間反応させてＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳのアミノ官能基に、アルデヒド官能基を持つＳ－４ＦＢリンカーが連結されるように誘導した。この反応が終結すると、上述のように脱塩工程を行い、結果物を収集した。

【0085】

その後、前記表１のペプチド（米国、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ社製）を、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ５．４９）緩衝溶液を用いて７．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。また、前記Ｓ－４ＦＢリンカーで変形したＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳを５０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）溶媒に溶かして２．５ｍｇ／ｍｌとなるようにした。その後、前記二つの溶液を、ペプチドとＳ－４ＦＢリンカーで変形したＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ ＡＳとのモル比が１：９となるように混合した。

【0086】

前記混合反応溶液にＮａＣＮＢＨ_３（Ｓｉｇｍａ社製、米国）を最終２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で１２時間徐々に攪拌させながら反応させた。反応していないペプチド、Ｓ－４ＦＢリンカー、及び変形したＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳを分離するために、セファデックスＧ－２５カラム（米国、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）またはリソースフェニルカラム（米国、ＧＥヘルスケア社製）を使用した。このような過程でＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳがＬＰＥ３－１などのペプチドのアミノ末端に選択的に結合された形態を製造した。このように製造されたＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体を、ＨＰＬＣ分析し、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動法とＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色によって確認した（図２）。ちなみに、図２はペプチドとしてＬＰＥ３－１ペプチドを使用したときの結果であって、図２のＡはＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳとＬＰＥ３－１ペプチドとの反応混合物のＨＰＬＣ分析結果であり、図２のＢは精製された接合体のＨＰＬＣ分析結果であり、図２のＣはＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのＡＳ（１）、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡのＡＳとＬＰＥ３－１ペプチドとの反応混合物（２）、及び精製された接合体（３）のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動画像である。

【0087】

＜実施例１－４＞薬物運搬体の製造
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体との間に二本鎖を形成して本発明の薬物運搬体を製造した。
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体との間に二本鎖結合体を形成するために、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸）で、前記製造した５０μＭ ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体と５０μＭ ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体を９５℃で３分間熱変性させ、２０℃で徐々に冷却させてＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体との結合体の形成を誘導した。

【0088】

このように形成されたＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体との結合体を、上述のようにオリゴ脱塩用スピンカラムで脱塩させ、０．２２μｍの滅菌ろ過膜でミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）遠心分離を行って精製した後、前記結合体の形成を、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と臭化エチジウム染色によって確認した（図３）。

【0089】

図３において、一番目のカラムは分子量マーカーであり、二番目のカラムはＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体試料、三番目のカラムはＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体の未精製反応混合物としてＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体を含む試料、四番目のカラムはＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体との反応混合物を精製してＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体が除去された試料を分析した結果である。

【0090】

＜実施例２＞薬物放出性に優れたペプチドの選定
＜実施例２－１＞アポトーシスの測定

【0091】

前記実施例１において、前記表１の５種類のペプチドを用いて製造された薬物運搬体のアポトーシス効能は、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色法、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸ分析法及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（米国、ＢＤ社製）を用いて調査した。

【0092】

ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞とＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１２ウェルプレートにウェル当り１０^５個で接種し、培養して３７℃の細胞培養器で２４時間安定化過程を予め行った。その後、アポトーシスを誘導するために、実施例１で製造した５種類の薬物運搬体を添加して培養した。７２時間培養が終わる４０分前に、ＰＩとＨｏｅｃｈｓｔをそれぞれ１μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に処理した。サンプルプレートは、ＨＣＳ（Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）システム（米国、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でリアルタイムにて分析した。アポトーシスの初期指標であるｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸに対して、処理された細胞を、２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）とＨｏｅｃｈｓｔ染料で３０分間固定させた後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過性に作り、ウシ血清アルブミン（米国、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）とマウス抗－ヒトｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸ（米国、Ａｂｃｏｍ；１：１００の希釈）を添加して室温で１時間反応させた後、ウサギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製；１：１００の希釈）を添加した。各過程の後に、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄した。最後に、サンプルプレートを分析し、イメージをＨＣＳシステムで分析した。

【0093】

正常的に生きている細胞は、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸとＰＩに対して陰性であるが、初期死滅過程の細胞は、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸに対しては陽性であり、ＰＩに対しては陰性である。後期死滅過程の細胞は、ＰＩに対して陽性反応を示す（図４参照）。

【0094】

図４はＨＥＲ２が過剰発現する細胞ＢＴ－４７４とＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の培養溶液に、前記製造したＨＥＲ２標的化薬物運搬体を処理して確認した結果であり、ＨＥＲ２標的化薬物運搬体を処理した場合、ＨＥＲ２が過剰発現される細胞株であるＢＴ－４７４は、ＰＩに対して陽性であって後期死滅過程であり、ＨＥＲ２が発現しない細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ２ＡＸに対しては陽性であって死滅初期段階であることが分かる。このような結果は、本発明のＨＥＲ２標的化薬物運搬体が、ＨＥＲ２陰性細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞よりはＨＥＲ２陽性細胞株ＢＴ－４７４にさらに多く流入してアポトーシスを誘導することを示す。

【0095】

一方、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた分析のために、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞とＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、９６ｗｅｌｌ培養容器に準備した後、３７℃の細胞培養器で２４時間安定化過程を前もって行った。その後、７２時間の間、実施例１で製造した５種類の薬物運搬体を５０ｎＭ処理してアポトーシスを誘導した。前記処理した細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で１Ｘ結合緩衝液に懸濁し、その後、１００μｌの溶液（１×１０^５細胞／ｍｌ）を５ｍｌの培養チューブに移し、５μｌのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと５μｌのＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）を添加した。溶液を柔らかくボルデキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）し、室温（２５℃）の暗所で１５分間培養した。その後、４００μｌの１Ｘ結合バッファを各チューブに添加し、１時間以内にフローサイトメトリー分析で分析した。細胞の二重蛍光シグナルは、マイクロキャピラリーフローサイトメトリー計測器（米国、ＢＤ社製）を用いて分析した。

【0096】

このように５０ｎＭの処理濃度とｐＨ７．０で５種類の薬物運搬体の抗腫瘍能力（アポトーシス効果）を調べて図５に示した。図５を参照すると、５種類の薬物運搬体のうち、ｐＨ非依存的膜透過性ペプチドであるメリチン、ＬＰまたはＨｙｌｉｎ ａ１で構成された薬物運搬体は、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞の両方ともで高いアポトーシス効果を誘導し、ｐＨ依存的膜透過性ペプチドであるＬＰＥ３－１とｐＨＤ２４で構成された薬物運搬体はいずれも、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対しては殆どアポトーシス効果を誘導しないのに対し、過剰発現するＢＴ－４７４細胞では高いアポトーシス効果を誘導した。

【0097】

ｐＨ７．０でＨＥＲ２ Ａｐ、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ及びＬＰＥ３－１からなる薬物運搬体の処理時間及び処理濃度によるアポトーシス誘導効果を図６及び図７に示したが、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のアポトーシスには殆ど影響がないが、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株には、処理時間及び処理濃度に応じて増加することを観察することができた。

【0098】

これらの結果は、特定の細胞の標的に特異的なアプタマーなどのドメインを、ｐＨ依存的膜透過活性を有するｐＨＤ２４、ＬＰＥ３－１などのペプチドと一緒に薬物運搬体として使用する場合、生体環境である約ｐＨ７で標的分子を発現する細胞に対してのみ薬物が特異的に効果を示すことにより、薬物副作用を軽減させる効果を出すことができることを示すといえる。

【0099】

＜実施例２－２＞ミトコンドリア膜電位変化の測定
Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国、ＢＤ社製）を用いてミトコンドリア膜電位の変化を検知するのに使用した。細胞サンプルの準備は、前記アポトーシス分析の場合と同様である。１ｍｌの細胞溶液（１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１５ｍｌの培養チューブに移し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、０．５ｍｌのＪＣ－１溶液を添加し、室温（２５℃）の暗所で１５分間培養した。沈殿物を１ｍｌの１ｘアッセイバッファで８００ｒｐｍにて５分間洗浄した後、再遠心分離した。この過程を２回繰り返し行った後、０．５ｍｌの１ｘアッセイバッファを加えて沈殿物を再懸濁した。最後に、０．５ｍＬ溶液の二重蛍光シグナルは、マイクロキャピラリーフローサイトメトリー（ｍｉｃｒｏ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（米国、ＢＤ社製）を用いて分析した。また、細胞培養培地のｐＨは、必要に応じて酸又はアルカリ溶液で調整した。

【0100】

Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔは、細胞のミトコンドリア膜電位の変化を測定し、その結果をアポトーシスと表示し、アポトーシスは、しばしばΔΨの脱分極に関連して、ＦＬ－２チャンネルでＪＣ－１蛍光が減少した細胞数が増加する。つまり、アポトーシス集団は、しばしば陰性対照群よりも低い赤色蛍光シグナル強度（ＦＬ－２軸）を示す。一部のアポトーシスシステムにおいて、ＦＬ－１で測定された緑色蛍光のレベルの変化がまた観察された。

【0101】

ｐＨ依存的放出を確認するために、５種類の薬物運搬体を処理した後、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞とＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のミトコンドリア膜電位の変化測定によって得られたアポトーシス程度を調査した結果を、図８及び図９に示した。

【0102】

５０ｎＭの処理濃度とｐＨ７．０で２４時間の間に、メリチン、ＬＰ、Ｈｙｌｉｎ ａ１、ＬＰＥ３－１及びｐＨＤ２４を用いた薬物運搬体の処理で、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるミトコンドリア膜電位の変化から確認したアポトーシス効果は、メリチン、Ｈｙｌｉｎ ａ１及びＬＰ運搬体の場合には平均２２．０％、ＬＰＥ３－１とｐＨＤ２４運搬体の場合には平均６．０％であった（図８参照）。ＨＥＲ２遺伝子を過剰発現するＢＴ－４７４細胞におけるミトコンドリア膜電位の変化から確認したアポトーシス効果は、メリチン、Ｈｙｌｉｎ ａ１及びＬＰ運搬体の場合には平均２３．０％であり、ＬＰＥ３－１及びｐＨＤ２４運搬体の場合には平均２８．０％であった（図８参照）。

【0103】

５０ｎＭの処理濃度とｐＨ５．５でＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のミトコンドリア膜電位の変化から確認したアポトーシス効果は、メリチン、Ｈｙｌｉｎ ａ１及びＬＰ運搬体の場合には平均２５．０％であり、ＬＰＥ３－１及びｐＨＤ２４運搬体の場合には平均２７．０％であり、ＨＥＲ２遺伝子を過剰発現するＢＴ－４７４細胞のミトコンドリア膜電位の変化から確認したアポトーシス効果は、メリチン、Ｈｙｌｉｎ ａ１及びＬＰ運搬体の場合には平均２５．０％であり、ＬＰＥ３－１及びｐＨＤ２４運搬体の場合には平均２８．０％であった（図９参照）。

【0104】

このようなＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによるアポトーシス分析の結果は、前記実施例２－１のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで分析した結果と類似の様相であることが分かった。

【0105】

前記実施例の結果は、ｐＨ依存的膜透過活性を有するペプチドを、特定の細胞の標的を認識するドメインと共に使用する場合、標的を発現する細胞にのみ作用することにより、標的を発現しない細胞に作用することによる副作用軽減などの効果を出すことができることを示唆するといえる。

【0106】

＜実施例３＞パクリタキセルなどを含む薬物運搬体の製造
＜実施例３－１＞試験群薬物運搬体の製造
本実施例で製造された薬物運搬体は、（１）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１、（２）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１、（３）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１、及び（４）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１である。

【0107】

ここで、ＨＥＲ２ ＡｂはＨＥＲ２に特異的な抗体を意味し、ＰＡＸはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を意味する。パクリタキセルは、乳がん、子宮がんなどの抗がん治療剤として広く使用されているジテルペノイド（Ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）系抗がん剤である。

【0108】

３．１．１ ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１の製造
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体は、ＣＴＤである、ＨＥＲ２に対する特異的結合力を有し且つ２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡアプタマー、薬物であるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、及びＤＲＤであるＬＰＥ３－１ペプチドから構成された薬物運搬体であり、前記実施例１と同様の方法で製造した。

【0109】

３．１．２ ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１の製造
ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１は、ＣＴＤである、ＨＥＲ２に対する特異的抗体（米国、ＡＢＣＡＭ社製）、薬物であるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、及びＤＲＤであるＬＰＥ３－１ペプチドから構成された薬物運搬体である。
まず、ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳの接合体を製作するために、２’－Ｆ－置換ピリミジンを含み且つ５’末端にアミノ基が導入された、下記配列番号１５の配列を有するＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳを注文製作した（米国、ＢｉｏＳｙｎｈｅｓｉｓ社製）。
ＵＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＵＣＡ ＣＣＣ ＵＣＣ ＵＵＡ ＵＵ（配列番号１５）

【0110】

次に、凍結乾燥させた前記ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳに、抗体オリゴヌクレオチドオールインワン接合キット（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、米国、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社製）のオリゴ再懸濁溶液（Ｏｌｉｇｏ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して０．５ ＯＤ２６０／μｌの溶液を準備した。前記製造したＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ溶液を、オリゴ脱塩用スピンカラム（赤キャップ）で脱塩工程を行った。前記脱塩されたＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ溶液に、ＤＭＦに溶けたＳ－ＳＳ－４ＦＢ溶液を添加して０．５ ＯＤ２６０／μｌのオリゴ溶液となるようにして、室温で２時間反応させてＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳのアミノ官能基にＳ－ＳＳ－４ＦＢリンカーが連結されるように誘導した。この変形反応が終結すると、脱塩工程を実行し、収集した。

【0111】

その次に、ＨＥＲ２ Ａｂを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．４９）で約７．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。前記Ｓ－ＳＳ－４ＦＢリンカーで変形したＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ＿ＳＳを５０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）溶媒に溶かして２．５ｍｇ／ｍｌとなるようにした。
その後、前記二つの溶液を、ＨＥＲ２ ＡｂとＳ－ＳＳ－４ＦＢリンカーで変形したＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳとのモル比が１：９となるように混合した。

【0112】

前記反応溶液にＮａＣＮＢＨ_３（Ｓｉｇｍａ社製、米国）を最終２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で１２時間ゆっくりと攪拌させながら反応させた。反応していないＨＥＲ２＿Ａｂ、Ｓ－ＳＳ－４ＦＢリンカーと変形したＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳを分離するために、セファデックスＧ－２５カラム（米国、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）またはリソースフェニルカラム（米国、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用した。このような過程でＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳがＨＥＲ２ Ａｂのアミノ末端に選択的に結合された形態を製造した。

【0113】

ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１の接合体は、前記実施例１に記載された方法で製造した。
ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳの接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１の接合体とを結合させて二本鎖結合体を生成するために、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸）で前記製造した５０μＭのＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳの接合体と５０μＭのＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１の接合体を９５℃で３分間熱変性させ、２０℃で徐々に冷却してＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ＿ＳＳの接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１の接合体との結合体を形成することを誘導した。

【0114】

こうして得られた二本鎖結合体を脱塩させ、０．２２μｍの滅菌ろ過膜でミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）遠心分離を行って精製した後、前記結合体の形成を、非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と臭化エチジウム染色によって確認した（結果図面を提示せず）。二本鎖結合体の量は、λ＝２６０ｎｍで計算されたモル吸収係数に基づいて分光光度計で測定し、ＲＰＨＰＬＣによるＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１構造である薬物運搬体の純度分析を行った。

【0115】

３．１．３ ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１の製造
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体は、ＣＴＤである、ＨＥＲ２に対する特異的結合力を有し且つ２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡアプタマー（ＨＥＲ２ Ａｐ）、パクリタキセル（ＰＡＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）、及びＤＲＤであるＬＰＥ３－１ペプチドから構成された薬物運搬体である。

【0116】

本実施例では、まず、ＨＥＲ２ ＡｐとＬＰＥ３－１ペプチドとを接合させ、ここにＰＡＸを結合させて製造した。

【0117】

１） ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体の製造
まず、ＨＥＲ２ Ａｐは、スペーサー（下線付きの塩基配列）と２’－Ｆ－置換ピリミジンを含む配列番号１６のＲＮＡであって、実施例１と同様の方法で製造した。
ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＵＡＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＵ－ＵＵＵＵ（塩基配列１６）
次いで、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体は、実施例１のＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体の製造方法と同様の製造方法で製造するが、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳの代わりにＨＥＲ２ Ａｐを用いて製造した。

【0118】

その後、下記ＰＡＸに導入されるマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）と反応性を有するチオール（ｔｈｉｏｌ）官能基をＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体に導入するために、まず、２ｍｇのＳＰＤＰ（米国、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を３２０μＬのＤＭＳＯに溶かして２０ｍＭ ＳＰＤＰ試薬溶液を準備した。１．０ｍＬのＰＢＳ－ＥＤＴＡに溶けた２～５ｍｇのＡｐ－Ｐに２５μＬの２０ｍＭ ＳＰＤＰ溶液を添加して、常温で３０分間反応させた。脱塩カラムをＰＢＳ－ＥＤＴＡで平衡化し、緩衝液を交換して反応副産物及び過量の非反応ＳＰＤＰ試薬を除去した。

【0119】

２３ｍｇのＤＴＴをＰＢＳ－ＥＤＴＡに溶解させて１５０ｍＭ ＤＴＴ溶液を作った。ＳＰＤＰで改質されたタンパク質１ｍＬあたり０．５ｍＬのＤＴＴ溶液を添加して（最終濃度５０ｍＭ ＤＴＴ）３０分間反応させた。脱塩カラムをＰＢＳ－ＥＤＴＡで平衡化し、ＤＴＴを除去するために、タンパク質を脱塩した。

【0120】

２）マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）が導入されたＰＡＸの合成
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体とＰＡＸとの接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のために、リンカー（４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いて、チオール（Ｔｈｉｏｌ）官能基と反応性がある（ｒｅａｃｔｉｖｅ）マレイミド官能基をＰＡＸに導入した。

【0121】

ＰＡＸ１ｇ（１．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、４－マレイミド酪酸２１０ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１４０ｍｇ（２．３４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４８０ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を１００ｍｌの丸底フラスコ（Ｒｏｕｎｄ ｆｌａｓｋ）に仕込み、塩化メチレン（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）５０ｍｌを入れた後、常温で攪拌して反応させた。

【0122】

反応の進行は、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法を用いて観察し、反応が終わると、蒸留水（ＤＷ）５０ｍｌを加えて振とうした（Ｗｏｒｋ ｕｐ）。（Ｒｆ Ｖａｌｕｅ＝０．４３、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）

【0123】

有機溶媒層を集めて硫化マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆｉｄｅ）で水分を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて分離した。ヘキサン：酢酸エチル＝１：１のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを介して得た物質を濃縮して、マレイミドが導入されたＰＡＸの化合物を６２０ｍｇ得た。

【0124】

３）マレイミドが導入されたＰＡＸとチオール（Ｔｈｉｏｌ）官能基が導入されたＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体との結合体の製造
前記合成したマレイミドが導入されたＰＡＸ１００ｍｇ（９８ｍｏｌ、１ｅｑ）と、前記合成したチオール（Ｔｈｉｏｌ）官能基が導入されたＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１ペプチド接合体１００ｍｇ（４８ｍｏｌ、２ｅｑ）をそれぞれ１ｍｌ ＤＭＳＯに溶かした後、二つの溶液を混合した。ここにＤＩＰＥＡ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ）２～３滴を入れた後、Ｖｏｒｔｅｘで５分間反応させた。反応の終結は、Ｅｌｍａｎ試薬で確認し、黄色が消えると、得られた混合物に冷却ジエチルエーテル（Ｃｏｏｌｉｎｇ ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）を加えた後、遠心分離して得られた化合物を沈殿させた。Ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認し、凍結して粉末（ｐｏｗｄｅｒ）にした。

【0125】

３．１．４ ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１の製造
ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体は、ＣＴＤである、ＨＥＲ２に特異的な抗体（ＨＥＲ２ Ａｂ）、薬物であるパクリタキセル（ＰＡＸ）、及びＤＲＤであるＬＰＥ３－１ペプチドから構成された薬物運搬体である。
本実施例においても、まず、ＨＥＲ２ ＡｂとＬＰＥ３－１ペプチドとを接合させ、ここにＰＡＸを結合させて製造した。

【0126】

ＨＥＲ２ ＡｂとＬＰＥ３－１ペプチドとを接合させるために、１０ｍｇ／ｍｌのＨＥＲ２ Ａｂと１０ｍｇ／ｍｌ ＬＰＥ３－１ペプチドを０．１Ｍ ＭＥＳ（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ５）にそれぞれ溶かした。また、ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を１０ｍｇ／ｍｌで蒸留水に溶かした。前記ＬＰＥ３－１ペプチド溶液と前記ＨＥＲ２ Ａｂ溶液とを混合し、ここに前記ＥＤＡＣ溶液を添加した。次に、室温で２～３時間反応させてＨＥＲ２ ＡｂとＬＰＥ３－１ペプチドとの接合を誘導した。脱塩（すなわち、Ｃｅｌｌｕ Ｓｅｐ透析を使用）及び適切な緩衝液の交換（一般的にはＰＢＳ#ＵＰ３０７１５）をして保存した。
ＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１接合体のチオール（ｔｈｉｏｌ）官能基化は、前記実施例３．１．３と同様の方法でＳＰＤＰ試薬などを用いて行った。
次に、前記実施例３．１．３で製造したマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）が導入されたＰＡＸと、前記チオール官能基が導入されたＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１接合体とを、前記実施例３．１．３と同様に反応させて、最終的にＨＥＲ２＿Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体を製造した。

【0127】

＜実施例３－２＞対照群薬物運搬体の製造
本実施例で製造された薬物運搬体は、前記実施例３－１で製造された試験群薬物運搬体の対照群薬物運搬体として製造されたものであり、具体的に、（１）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１、（２）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１、（３）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、（４）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ、（５）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１＿ｓｉＲＮＡ、（６）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ、（７）ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、及び（８）ＬＰＥ３－１／ＰＡＸを製造した。

【0128】

（１）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１の製造
前記実施例３．１．３と同様の方法で製造した。

【0129】

（２）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１の製造
前記実施例３．１．４と同様の方法で製造した。

【0130】

（３）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡの製造
ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡは、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳとＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳの二本鎖結合体であって、前記実施例１と同様の方法で製造するが、ただし、二本鎖結合体の形成反応でＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ペプチド接合体の代わりにＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳを使用した。

【0131】

（４）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸの製造
チオール官能基が導入され、ＨＥＲ２に対する２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＳＨ－ＨＥＲ２ Ａｐを注文製作した（米国、ＢｉｏＳｙｎｈｅｓｉｓ社製）。
マレイミド官能基が導入されたＰＡＸの製造は、前記実施例３．１．３と同様の方法で行った。
前記マレイミド官能基が導入されたＰＡＸと前記ＳＨ－ＨＥＲ２＿Ａｐとの接合は、前記実施例３．１．３と同様の方法で行った。

【0132】

（５）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡの製造
ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡは、ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳとの二本鎖結合体であり、前記実施例３．１．２と同様の方法で製造するが、ただし、二本鎖結合体の形成反応でＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳ／ＬＰＥ３－１接合体の代わりにＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳを使用した。

【0133】

（６）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸの製造
ＨＥＲ２ Ａｂのチオール官能基の導入は、前記実施例３．１．３と同様の方法で行うが、ただし、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１接合体の代わりにＨＥＲ２＿Ａｂを用いて行った。
次に、マレイミド官能基が導入されたＰＡＸと前記チオール官能基が導入されたＨＥＲ２ Ａｂとの接合は、前記実施例３．１．３と同様の方法で行った。

【0134】

（７）ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡの製造
ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡは、ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ２＿ｓｉＲＮＡ＿ＳＳ接合体とＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ＿ＡＳとの二本鎖結合体であって、まず、ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ２ ｓｉＲＮＡ＿ＳＳの接合体は、購入したＬＰＥ３－１ペプチドと注文製作した５’にアミノ基があるＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＳＳ（米国、ＢｉｏＳｙｎｈｅｓｉｓ社製）を用いて、実施例３．１．３で提示したＨＥＲ２－Ａｐ／ＬＰＥ３－１接合体の製造方法と同様の方法で行った。次に、ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ ＡＳと前記実施例１と同様の方法で二本鎖結合体を形成させた。

【0135】

（８）ＬＰＥ３－１／ＰＡＸの製造
ＬＰＥ３－１のチオール官能基の導入は、前記実施例３．１．３と同様の方法で行うが、ただし、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１接合体の代わりにＬＰＥ３－１ペプチドを用いて行った。その後、前記実施例３．１．３と同様の方法で、マレイミド官能基が導入されたＰＡＸと前記チオール官能基が導入されたＬＰＥ３－１ペプチドとを接合させた。

【0136】

＜実施例４＞パクリタキセルを含む薬物運搬体の抗がん活性

【0137】

抗がんの活性を確認するための細胞株は、前記実施例２と同様にＢＴ－４７４とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を使用した。
抗がん活性の確認に使用された薬物運搬体は、前記実施例３－１で製造された４種の試験群薬物運搬体である（１）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１、（２）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１、（３）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１及び（４）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１と、前記実施例３－２で製造した８種の対照群薬物運搬体である（１）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１、（２）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１、（３）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、（４）ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ、（５）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、（６）ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ、（７）ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ及び（８）ＬＰＥ３－１／ＰＡＸである。

【0138】

抗がん活性の確認は、前記薬物運搬体の処理濃度によるがん細胞株でのアポトーシス程度を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（米国、ＢＤ社製）で測定して確認した。

【0139】

ＢＴ－４７４細胞株とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を、９６ウェル培養容器に準備した後、３７℃の細胞培養器で２４時間安定化過程を予め行った。その後、７２時間の間に試験群の薬物運搬体と対照群の薬物運搬体を濃度別に処理し、実施例２と同様の方法でアポトーシス程度を測定した。

【0140】

５０ｎＭの処理濃度とｐＨ７．０で７２時間培養する場合、対照群薬物運搬体のＢＴ－４７４細胞株とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対するアポトーシス程度を無処理群対比百分率で図１０に示し、５０ｎＭまたは１μＭの処理濃度とｐＨ７．０で試験群薬物運搬体の処理時間別のＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に対するアポトーシス程度を無処理群対比百分率で図１１及び図１２に示し、ｐＨ７で７２時間培養する場合、試験群薬物運搬体の処理濃度別のＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に対するアポトーシス程度を無処理群対比百分率で図１３及び図１４に示した。

【0141】

図１０を参照すると、対照群薬物運搬体のうち、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＬＰＥ３－１、ＨＥＲ２ Ａｂ／ＬＰＥ３－１は、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株とＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の両方ともで抗がん効果がなかったのに対し、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ、ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸはいずれも、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株でのみ抗がん効果があった。また、ＬＰＥ３－１／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、ＬＰＥ３－１／ＰＡＸは、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４及びＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方ともに抗がん効果がなかった。このような対照群薬物運搬体のアポトーシスに対する結果は、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４細胞株に、ＨＥＲ２に特異的なアプタマーまたは抗体が結合してエンドソームとして細胞に内在化し、エンドソームが酸化して一部の薬物運搬体が細胞質へ放出されて４５～６２％のアポトーシスを示すことを示唆する。

【0142】

また、図１１乃至図１４から確認されるように、４種の試験群薬物運搬体はいずれも、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株には抗がん効能が殆どなかった（資料を提示せず）、ＢＴ－４７４細胞株に４種の試験群薬物運搬体に対する抗がん活性を確認した結果、薬物がＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡで構成されたＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１とＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体は、培養時間に比例してがん細胞アポトーシス効果が高くなったが（図１１）、また、ＥＣ５０（５０％アポトーシスに該当する濃度）が１０ｎＭ以上投与区間では最大７８％のアポトーシスを示した（図１３）。薬物がＰＡＸで構成されたＨＥＲ２ Ａｐ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１とＨＥＲ２ Ａｂ／ＰＡＸ／ＬＰＥ３－１薬物運搬体も、培養時間に比例してがん細胞アポトーシス効果が高くなり（図１２）、ＥＣ５０が１００ｎＭ以上投与区間で現れ、最大７７％、７５％アポトーシスを観察した（図１４）。

【0143】

前記実施例で提示された抗がん活性確認実験の結果は、細胞標的化ドメインがある試験群薬物運搬体が、ＨＥＲ２遺伝子が過剰発現するＢＴ－４７４に大きな抗がん効果があり、ＨＥＲ２遺伝子が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に抗がん効果が殆どないため、少量の抗がん剤（ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ、パクリタキセル）で、特定の標的分子がある細胞に制限的に大きな抗がん効果を出すことができることを意味し、これにより、抗がん剤治療の副作用の軽減及び抗がん剤の効果増大を達成することができることを示唆するといえる。

【0144】

また、これらの結果は、細胞標的化ドメイン（ＣＴＤ）、薬物及び薬物放出ドメイン（ＤＲＤ）で構成された試験群薬物運搬体の投与の場合は、対照群薬物運搬体の投与と比較して少ない濃度でも薬物の効果を示すことができることを意味するといえる。

【0145】

本発明は、その一部の特別な具体例を参照して説明及び例示され、当業者は、本発明の思想及び範囲を逸脱することなく、方法またはプロトコルの様々な改造（ａｄａｐｔｉｏｎ）、変化、変形、置換、削除または付加が行われ得るものと理解するだろう。よって、本発明は、下記の請求の範囲によって定義され、それらの請求項は、合理的な範囲で広く解釈されるべきものと意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2022518139000001.app

【国際調査報告】