特表 2022-518159 ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-14

(54)【発明の名称】ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/074 20100101AFI20220307BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20220307BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220307BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20220307BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220307BHJP

   A61K 35/32 20150101ALI20220307BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20220307BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220307BHJP

【ＦＩ】

C12N5/074

C12N5/077

A61P43/00 105

A61K35/35

A61K35/28

A61K35/32

A61P17/02

A61P17/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021539468

(86)(22)【出願日】2020-01-13

(85)【翻訳文提出日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 EP2020050720

(87)【国際公開番号】W WO2020144381

(87)【国際公開日】2020-07-16

(31)【優先権主張番号】1900287

(32)【優先日】2019-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521296052

【氏名又は名称】ユニバーシティ コート ダジュール

(71)【出願人】

【識別番号】504006489

【氏名又は名称】インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシュ メディカル （インセルム）

(71)【出願人】

【識別番号】518369442

【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（シーエヌアールエス）

(71)【出願人】

【識別番号】521296063

【氏名又は名称】シーエイチユー ド ニース

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ダニ，クリスチアン

(72)【発明者】

【氏名】ドグリオ，アライン

(72)【発明者】

【氏名】ダニ－デイブスン，ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】レタートレ，フィリップ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BA24

4B065BC01

4B065BC41

4B065CA44

4C087AA01

4C087BB63

4C087MA63

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB21

(57)【要約】

本発明の主題は、ヒト脂肪組織幹細胞胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法に関する。この方法は、以下のステップ：ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと、先行するステップで得た混合物を、培養培地において浮遊液で培養するステップと
を含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法であって、以下のステップ：
ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、培養培地中で浮遊培養するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法であって、以下のステップ：
ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、培養培地中で浮遊培養するステップと、
脂肪組織幹細胞の分化を誘導して分化した細胞を得るステップと
を含む、方法。

【請求項3】

分化した細胞が脂肪細胞または骨芽細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

分化した細胞が脂肪細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

細胞外マトリックスの抽出が、非酵素的分離のステップを含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

非酵素的分離のステップを含む細胞外マトリックスの抽出が、コラゲナーゼを含まないことを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

細胞外マトリックスの抽出が、機械的分離のステップを含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出が、以下のステップ：
ヒト脂肪組織を遠心分離して少なくとも２つの個別の分画、すなわち遠心分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ、および間質血管分画を得るステップと、
分画Ａを機械的に分離して、細胞外マトリックスを得るステップと
を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

細胞外マトリックスのコラーゲンが、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンであることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスの混合物の培養が、以下のステップ：
前記混合物を、培養培地を含む浮遊培養のバッグに無菌的に移すステップと、
前記混合物を増幅させて細胞凝集体を形成するステップと、
前記細胞凝集体を機械的に分離するステップと
を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む単離された細胞外マトリックス。

【請求項12】

コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンであることを特徴とする、請求項１１に記載のマトリックス。

【請求項13】

ＩＶ型コラーゲンおよび／またはエラスチンおよび／またはフィブロネクチンおよび／またはラミニンをさらに含むことを特徴とする、請求項１１または１２のうちの１項に記載のマトリックス。

【請求項14】

請求項１１、１２、または１３のうちの１項に記載の細胞外マトリックスと、脂肪組織血管網の内皮細胞および脂肪組織幹細胞を含む間質血管分画とを含む組成物。

【請求項15】

薬理学的な有効な物質をスクリーニングするための、請求項１１、１２、もしくは１３に記載の細胞外マトリックスまたは請求項１４に記載の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用。

【請求項16】

特に形成外科手術および修復手術での細胞療法でそれらを使用するため、より具体的にはリポフィリングのための、請求項１４に記載の組成物の分化した細胞。

【請求項17】

特に形成外科手術および修復手術での細胞療法でそれらを使用するため、より具体的にはリポフィリングのための、請求項１４に記載の組成物の分化した脂肪細胞または骨芽細胞。

【請求項18】

特に形成外科手術および修復手術での細胞療法でそれらを使用するため、より具体的にはリポフィリングのための、請求項１４に記載の組成物の分化した脂肪細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト脂肪組織幹細胞胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法に関する。さらに本発明は、分化した細胞、細胞外マトリックス、細胞外マトリックスおよび間質血管分画の混合物を含む組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法、細胞外マトリックスの使用または細胞外マトリックスおよび間質血管分画の混合物を含む組成物の使用、ならびにそれらを使用するための本発明の方法により得られた分化した細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞療法は、組織または臓器が事故、疾患、または老化により損なわれる場合に、これらの機能を回復させることを目的とする細胞グラフトからなる。これは、いわゆる「治療用」細胞の単回注射により長期間の患者の処置を可能にする。これら細胞は、特に患者自身に由来する多能性幹細胞から得られる。

【0003】

リポフィリングは、身体または顔を再構築するために、身体の一領域から別の領域へ脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌｓまたはａｄｉｐｏｃｙｔｅ）を移動させるための特定の細胞療法技術である。

【0004】

今日までに、特定の脂肪部位に存在する脂肪細胞のみが、細胞療法、特にリポフィリングに使用されている。しかしながら、状況に応じて、患者から入手可能な脂肪細胞の量は、限定的であり得る。たとえば、患者が低すぎるボディマス指数を有するか化学療法を経験したことがある場合、患者は、リポフィリングを行うために十分な脂肪組織を有さない場合がある。

【0005】

この状況では、自家脂肪細胞を産生させる必要があり、よって、特にリポフィリングのために大量の治療グレードの脂肪細胞を得るための細胞増幅方法が必要である。

【0006】

脂肪組織サンプルから脂肪細胞前駆細胞を単離し増幅させるための標準的な手法は、酵素による分離、次いで培養ディッシュのプラスチックに結合させることによりそれを２次元（２Ｄ）で増幅させることを含む。この手法は費用が高く、時間がかかり、コンタミネーションのリスクを増加させる多くの取り扱い作業を必要とする。さらにこれは、組織の三次元構造の破壊、ならびに、グラフトの血管形成および脂肪細胞の生理機能の両方にとって重要な役割を果たす内皮細胞などの目的の細胞型の喪失を誘導する。

【0007】

機械的なプロセスに基づくことが最も多い脂肪組織の非酵素的分離は、脂肪細胞前駆細胞の単離を可能にする。この種の分離は、コストがはるかに少なく、より迅速な代替方法として出現しつつあり、治療グレードの生産基準に従う製品の製造にとって明白な利点を有する（外部の生成物への曝露または夾雑物の低減）。他方で、今日までに記載された非酵素的な分離方法は、得られた脂肪細胞前駆細胞の数が酵素による分離と比較して少ないため、満足のいくものではない。その上これは、培養ディッシュ上でのそれらの２Ｄ増幅を必要とする。さらに、内皮細胞、細胞外マトリックス、および脂肪組織の三次元構造は、プロセスの終了時に失われる。

【0008】

その中に脂肪細胞前駆細胞を播種し、よって、脂肪組織の構造を最良に再構成する試みにおいて、異なる合成マトリックスが提案されている。またこのマトリックスは、移植の前にｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪細胞前駆細胞を非脂肪（本質的に骨または軟骨性の）細胞種へと方向付けるように作用する。また脱細胞された脂肪組織もまた、前駆細胞の分化を増大させ、脂肪組織の構造をより良好に模倣するために提案されている。これら全ての種のマトリックスの製造は、酵素反応または長期間の化学的処置を含む多くのステップを必要とする。さらに、脱細胞された組織は、定義により、これらの内因性細胞を失い、同様に、ネイティブマトリックスに固定される治療上重要な因子を失い、これによりこの種のマトリックスの臨床上の価値を低減する。（以前に酵素的分離により単離された）脂肪細胞前駆細胞に関して濃縮され、次に２Ｄ増幅を行った脱細胞されていない脂肪組織は、近年、良好な骨の再構築のためのマトリックスとして提案されている。この生体マトリックスの生成に要する時間は長く、３週間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養を必要とし、脂肪細胞前駆細胞を増幅させない。著者らは、単に、骨修復に関する利点を強調していた。

【0009】

３次元（３Ｄ）の浮遊培養は、組織の構造および内因的な品質を保持することを本質的に可能にするため、標準的な２Ｄ方法に対して選択される代替方法を表す。この利点は、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪組織を最良に模倣する関連のヒトモデルがないことが、２型糖尿病および心血管疾患などの肥満および関連する代謝性疾患を対処するために有効な新規医療品の開発のための前臨床試験における主要な制限であるため、重要である。さらに３Ｄ培養は、取り扱い作業およびコンタミネーションのリスクを減少させる閉鎖的な系において実現可能である。

【発明の概要】

【0010】

上記の観点から、本発明により対処される技術的問題は、治療グレードの大量のヒト脂肪組織幹細胞または分化した細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで得ることである。

【0011】

この技術的問題に対する本発明の解決策の第１の目的は、ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法であって、以下のステップ：
ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、培養培地中で浮遊培養するステップと
を含む、方法である。

【0012】

よって細胞外マトリックスの存在により可能となった間質血管分画の浮遊培養は、３Ｄ増幅が可能であり、大量の細胞に対するアクセスを与え、夾雑物のリスクを増加させる取り扱い作業を制限する。

【0013】

好適には、細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的分離のステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的分離のステップを含み；－間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの別個の分画、すなわち遠心分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ、および間質血管分画を得るステップと；分画Ａを機械的に分離して細胞外マトリックスを得るステップとを含み；細胞外マトリックスのコラーゲンはＩ型コラーゲンまたはＩＩＩ型コラーゲンであり；ならびに前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下のステップ：前記混合物を、培養培地を含む浮遊培養のバッグに無菌的に移すステップと；前記混合物を増幅させて細胞凝集体を形成するステップと；前記細胞凝集体を機械的に分離するステップとを含む。

【0014】

第２の目的によれば、本発明は、分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法であって、以下のステップ：ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含むステップと；前記血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと；先行するステップで得た混合物を、培養培地において浮遊培養するステップと；脂肪組織幹細胞の分化を誘導して分化した細胞を得るステップとを含む、方法に関する。

【0015】

好適には、分化した細胞は、脂肪細胞または骨芽細胞、好ましくは脂肪細胞であり；細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的分離のステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的分離のステップを含み；間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して少なくとも２つの別個の分画、すなわち遠心分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ、および間質血管分画を得るステップと；分画Ａを機械的に分離して細胞外マトリックスを得るステップとを含み；細胞外マトリックスのコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンであり；ならびに間質血管分画および前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下のステップ：前記混合物を、培養培地を含む浮遊培養のバッグに無菌的に移すステップと；前記混合物を増幅させて細胞凝集体を形成するステップと；前記細胞凝集体を機械的に分離するステップとを含む。

【0016】

第３の目的によれば、本発明は、上記に定義した方法により得ることができる単離された細胞外マトリックスであって、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、単離された細胞外マトリックスに関する。

【0017】

好適には、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンであり；細胞外マトリックスは、フィブロネクチンをさらに含む。

【0018】

第４の目的によれば、本発明は、上記に定義される細胞外マトリックスおよび間質血管分画の混合物を含む組成物であって、細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含み、間質血管分画が脂肪組織血管網の内皮細胞および脂肪組織幹細胞を含む、組成物に関する。

【0019】

好適には、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンであり；細胞外マトリックスは、フィブロネクチンをさらに含む。

【0020】

第５の目的によれば、本発明は、肥満および関連する代謝性疾患に対して薬理学的な有効な物質をスクリーニングするための上記に定義される細胞外マトリックスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用または上記に定義される組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0021】

第５の目的によれば、本発明は、細胞療法、特に形成外科手術および修復手術での細胞療法でそれらを使用するため、より具体的にはリポフィリングのために意図された上記に定義される方法により得られた分化した細胞に関する。

【0022】

本発明は、添付の図面を参照して起草されたた以下の非限定的な説明を読むことにより、より良好に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】図１Ａは、本発明に係る、細胞外マトリックスおよび間質血管分画を抽出し（ステップ１～３）、それらを共培養する（ステップ４）ための必要かつ十分なステップを概略的に表す。

【図1B】図１Ｂは、本発明に係る、細胞外マトリックス（Ｍ１～Ｍ４）および間質血管分画細胞集団（Ｃ１～Ｃ３）を順次抽出し（ステップ１～５）、それらを共培養する（ステップ６）ための方法のより詳細な略図を表す。

【図2】図２は、大部分が内皮型細胞からなる、増殖因子を補充した内皮細胞増殖培地培養培地（ＥＧＭ＋）中の浮遊培養での細胞集団Ｃ１を表す。

【図3A】図３Ａは、接着培養での細胞集団Ｃ１のＣＤ３１＋（内皮細胞マーカー）免疫蛍光標識を示す。

【図3B】図３Ｂは、接着培養での細胞集団Ｃ１のＰＤＧＦＲａ＋（脂肪細胞幹細胞マーカー）免疫蛍光標識を示す。

【図4】図４は、ＣＤ３１＋内皮細胞からなる毛細管型血管網の形成およびＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞からなる凝集体の存在を示すＥＧＭ＋培養培地中の浮遊培養での細胞集団Ｃ２を示す。

【図5】図５は、ＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞からなる凝集体の存在を示す、ＥＧＭ＋培養培地中の浮遊培養での細胞集団Ｃ３の顕微鏡画像である。

【図6A】図６Ａは、ＣＤ３１＋内皮細胞およびＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞の相対的な比率を決定することを可能にする、細胞集団Ｃ２およびＣ３の定量的ＰＣＲを表す。

【図6B】図６Ｂは、細胞集団Ｃ２の脂肪細胞の分化能を示す蛍光顕微鏡画像である；核（濃灰色）脂肪滴（薄灰色）。

【図6C】図６Ｃは、蛍光顕微鏡画像を介して、細胞集団Ｃ３の脂肪細胞の分化能を示す；核（濃灰色）脂肪滴（薄灰色）。

【図7】図７は、マトリックスＭ１の線維状の型を、顕微鏡において特徴付ける。

【図8】図８は、マトリックスＭ２が、マトリックスの型；線維状の型およびコラーゲンを多く含む型の観点から不均一であることを顕微鏡により示す。

【図9】図９は、マトリックスＭ３の線維状の型を示す顕微鏡画像である。

【図10A】図１０Ａは、マトリックスＭ２が、コラーゲンを多く含む型であることを蛍光顕微鏡により示す；ピクロシリウスレッドで標識したコラーゲン（薄灰色）および核の標識（白色）。

【図10B】図１０Ｂは、マトリックスＭ３が、線維状の型であることを蛍光顕微鏡により示す；ピクロシリウスレッドで標識したコラーゲン（薄灰色および白色の線維）および核の標識（白色）。

【図11A】図１１Ａは、マトリックスＭ４を含む機械的分離後の分画Ａの遠心分離した脂肪組織の写真である。

【図11B】図１１Ｂは、マトリックスＭ４における、オイルレッドＯ染色による成熟脂肪細胞（薄灰色）およびＩ型コラーゲン標識によるコラーゲンを多く含むマトリックス（非常に薄い灰色）を、蛍光顕微鏡により明らかにする。

【図11C】図１１Ｃは、ＣＤ３１免疫標識により、マトリックスＭ４におけるＣＤ３１＋内皮細胞により形成される毛細管構造を示す；核標識（濃灰色）。

【図11D】図１１Ｄは、マトリックスＭ４におけるＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞血管網（薄灰色のドット）の存在を示す；核標識（濃灰色）。

【図12】図１２は、増殖細胞の核において、Ｅｄｕ、すなわち５－エチニル（ｅｔｈｙｌｎｙｌ）－２’－デオキシウリジンを組み込むことにより、本発明に係る細胞外マトリックスにおいて内因性細胞が、ＥＧＭ＋培地中の浮遊培養で増殖し続けていることを示す；核（濃灰色）、増殖細胞（白色） マトリックス自家蛍光（薄灰色）。

【図13】図１３は、本発明の細胞外マトリックスと共培養した外因性脂肪組織幹細胞が、これら脂肪組織幹細胞およびマトリックスに存在する内因性細胞から構成される構造を形成することを示す；３日間の共培養後に撮影された画像、核（濃灰色）、コラーゲン（薄灰色）、外因性脂肪組織幹細胞（薄灰色／白色）。

【図14A】図１４Ａは、細胞外マトリックスを含まない脂肪組織幹細胞および内皮細胞の浮遊液での細胞培養の間の細胞増殖を伴わない細胞凝集体の形成を示す；１０日間の共培養の後に撮影された画像；核（濃灰色）、増殖細胞の核（非常に薄い灰色）。

【図14B】図１４Ｂは、本発明の細胞外マトリックスと共培養した浮遊液での脂肪組織幹細胞および内皮細胞の増殖能を示す；１０日間の共培養後に撮影された画像；Ｅｄｕ標識による核（濃灰色）、コラーゲンマトリックス（薄灰色）、増殖細胞の核（白色）；

【図15A】図１５Ａは、本発明の細胞外マトリックスの存在下（右）及び非存在下（左）での浮遊培養により得られた分化した細胞集団におけるＣＤ３１内皮細胞マーカーの発現のレベルを示す。

【図15B】図１５Ｂは、本発明の細胞外マトリックスの存在下（右）及び非存在下（左）での浮遊培養により得られた分化した細胞集団におけるＰＤＧＦＲａ脂肪細胞幹細胞の発現のレベルを示す。

【図15C】図１５Ｃは、本発明の細胞外マトリックスの存在下（右）及び非存在下（左）での浮遊培養により得られた分化した細胞集団におけるＰＬＮ１成熟脂肪細胞マーカーの発現のレベルを示す。

【図15D】図１５Ｄは、本発明の細胞外マトリックスの存在下（右）及び非存在下（左）での浮遊培養により得られた分化した細胞集団におけるアディポネクチン成熟脂肪細胞マーカーの発現のレベルを示す。

【図16】図１６は、本発明の細胞外マトリックスの存在下での増幅および分化後の間質血管分画の蛍光顕微鏡による画像を表す；核（濃灰色）、成熟脂肪細胞（薄灰色）、コラーゲン性マトリックス（中程度の灰色）。

【図17】図１７Ａおよび１７Ｂは、本発明による増殖能の活性化を示す画像である。図１７Ａでは、分離されていない脂肪組織は、増殖細胞を示していない。図１７Ｂでは、組成は増殖細胞を示しており、増殖細胞の核は、この図面では白色で表されている。

【図18】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、および１８Ｄは、単離された間質血管分画（ＳＶＦ）において濃縮されたジペプチジルペプチダーゼー４の発現、および単離されたマトリックスにおいて濃縮されたＩＣＡＭ１の発現を示す。

【図19】図１９Ａおよび１９Ｂはそれぞれ、本発明に係る増幅された組成物におけるＭ１型およびＭ２型のマクロファージの存在を示す。

【図20】図２０は、本発明に係る細胞外マトリックスにおける特定のタンパク質の存在、および毛細管血管網の保存を示す写真のセットを含む。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明を行うために、脂肪組織が供給される。

【0025】

本発明の第１の目的は、ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法であって、以下のステップ：ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画と、前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスとを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと、
前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと、
先行するステップで得た混合物を、培養培地中の浮遊培養で培養するステップと
を含む、方法である。またこの方法は、本明細書中以下で（ｅｘ ｖｉｖｏでの脂肪細胞の増殖のための：ｆｏｒ Ｅｘ ｖｉｖｏ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）「ＥｘＡｄＥｘ法」とも呼ばれる。

【0026】

本発明によれば、「間質血管分画」は、ヒト脂肪組織サンプルに存在する細胞を表す。この間質血管分画は、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含む。

【0027】

本発明によれば、「細胞外マトリックス」は、生物活性マトリックス、すなわち脂肪組織の異なるタンパク質および内因性細胞を含むマトリックスを表す。この細胞外マトリックスは３Ｄ細胞増幅、すなわち、３次元での細胞の増殖を可能にする。また本発明の細胞外マトリックスは、本明細書中以下で「ＥｎｄｏＳｔｅｍ－Ｍａｔｒｉｘ」または「ＥｎｄｏＳｔｅｍ ｍａｔｒｉｘ」とも呼ばれる。

【0028】

脂肪組織の細胞外マトリックスのタンパク質は、コラーゲンを含む。このコラーゲンは、Ｉ型およびＩＩＩ型である。脂肪組織の細胞外マトリックスのタンパク質は、フィブロネクチンをさらに含む。

【0029】

細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的分離のステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的分離のステップを含む。本発明の「機械的分離」は、細胞外マトリックスの構造をインタクトなまま保つことを可能にするが、対して酵素的消化は、一般的に、これを破壊するコラゲナーゼを含む。よって機械的分離は、細胞外マトリックスの「脈管構造」およびマイクロ構造を維持するのを助け、よって、細胞外マトリックスはｉｎ ｖｉｖｏでの脂肪組織の機構と同様の機構を有する。

【0030】

間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して少なくとも２つの個別の分画、すなわち遠心分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ、および間質血管分画を得るステップと；分画Ａを機械的に分離して細胞外マトリックスを得るステップとを含む。

【0031】

ヒト脂肪組織を遠心分離するステップはさらに、供給されるヒト脂肪組織に含まれる油、血液、および麻酔液を除去することを可能にする。またこのステップは、供給されるヒト脂肪組織の事前の洗浄から得られる生理食塩水を除去することも可能にする。

【0032】

特定の実施形態では、間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して、少なくとも２つの個別の分画を得るステップであって、分画Ａが、遠心分離した細胞外マトリックスを含み、分画Ｂが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含む、ステップと；分画Ａを機械的に分離して、分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ’を得るステップと；分画Ａ’を遠心分離して少なくとも細胞外マトリックス、ならびにヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含む分画Ｂ’を得るステップと；分画ＢおよびＢ’を混合して間質血管分画を得るステップとを含む。

【0033】

この実施形態では、ヒト脂肪組織を遠心分離するステップは、供給されるヒト脂肪組織に含まれる油、血液、および麻酔液を除去することをさらに可能にする。またこのステップは、供給されるヒト脂肪組織の事前の洗浄から得られる生理食塩水を除去することを可能にする。分画Ａ’を遠心分離することはさらに、全ての油および生理食塩水の残渣を除去することを可能にする。この分画Ａ’を遠心分離するステップは任意である。

【0034】

前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下のステップ；前記混合物を、培養培地を含む浮遊培養のバッグに無菌的に移すステップと；前記混合物を増幅させて細胞凝集体を形成するステップと；前記細胞凝集体を機械的に分離するステップとを含む。

【0035】

本発明に係る、「無菌的」に移すことは、好ましくは閉鎖的な系で行われる移動である。この無菌的移動は、細胞培養の間の混入物質の数を制限することを可能にする。増幅の間形成される凝集体の機械的分離は、系を開口することを必要とせず、よって、環境由来のエレメントによる培養の潜在的夾雑物に対する細胞性生成物の曝露を制限する。

【0036】

一実施形態では、浮遊培養のバッグの中の培養培地は、ＥＧＭ＋培地である。この培養培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性増殖因子（Ｂａｓｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＦＧＦ２）、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子１６５、アスコルビン酸、ヘパリン、およびヒドロコルチゾンによって強化された、内皮細胞（ＥＧＭ）を増殖させるための基本培地（ＥＧＭ＋）を含む。ＥＧＭ＋培地はまた、脂肪細胞幹細胞を、それらの脂肪細胞への分化能を変化させることなく、増幅させることを可能にする。

【0037】

本発明の方法は、１０超、好適には２０超、特に３０超、好ましくは３５超の増幅係数での脂肪組織幹細胞の数の増幅を可能にする。増幅係数は、前記細胞外マトリックスの存在下で単離されたＳＶＦを培養した後に得られた細胞の数と、本発明の前の細胞の数との間の比率である。実施例２に記載される特定の実施形態では、本発明の方法は、８日間で３６の増幅係数を有する。

【0038】

第２の目的によれば、本発明は、分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法であって、以下のステップ；上記に定義されるヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のステップと；脂肪組織幹細胞の分化を誘導して分化した細胞を得るステップとを含む。

【0039】

したがって、より具体的には、分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅のための方法は、以下のステップ：ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含むヒト脂肪組織の間質血管分画、および前記ヒト脂肪組織の細胞外マトリックスを抽出するステップであって、前記細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、ステップと；前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスを混合するステップと；先行するステップで得た混合物を、培養培地中で浮遊培養するステップと；脂肪組織幹細胞の分化を誘導して分化した細胞を得るステップとを含む。

【0040】

本発明によれば、分化した細胞は、脂肪細胞または骨芽細胞である。好ましくは、分化した細胞は、脂肪細胞である。

【0041】

分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法は、脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅に関連するステップを含み、脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法の上記に提供した詳細は、同様に、分化した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法にも当てはまる。

【0042】

特に、細胞外マトリックスの抽出は、非酵素的分離のステップを含み、特に細胞外マトリックスの抽出は、機械的分離のステップを含む。

【0043】

一実施形態では、間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して少なくとも２つの個別の分画、すなわち遠心分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ、および間質血管分画を得るステップと：分画Ａを機械的に分離して細胞外マトリックスを得るステップとを含む。

【0044】

さらなる実施形態では、間質血管分画および細胞外マトリックスの抽出は、以下のステップ：ヒト脂肪組織を遠心分離して少なくとも２つの個別の分画を得るステップであって、分画Ａが、遠心分離した細胞外マトリックスを含み、分画Ｂが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含む、ステップと；分画Ａを機械的に分離して、分離された細胞外マトリックスを含む分画Ａ’を得るステップと；分画Ａ’を遠心分離して少なくとも細胞外マトリックス、ならびにヒト脂肪組織血管網の内皮細胞およびヒト脂肪組織幹細胞を含む分画Ｂ’を得るステップと；分画ＢおよびＢ’を混合して間質血管分画を得るステップとを含む。

【0045】

細胞外マトリックスのコラーゲンは、ピクロシリウスレッド染色により検出されるＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンを含む。

【0046】

前記間質血管分画および前記細胞外マトリックスの混合物の培養は、以下のステップ：前記混合物を、培養培地を含む浮遊培養のバッグに無菌的に移すステップと；前記混合物を増幅させて細胞凝集体を形成するステップと；前記細胞凝集体を機械的に分離するステップとを含む。

【0047】

第３の目的によれば、本発明は、上記に定義される方法により得ることができる単離された細胞外マトリックスであって、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含む、単離された細胞外マトリックスに関する。

【0048】

コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンである。細胞外マトリックスは、フィブロネクチンをさらに含む。

【0049】

第４の目的によれば、本発明は、上記に定義される細胞外マトリックスおよび間質血管分画の混合物を含む組成物であって、細胞外マトリックスが、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞、ヒト脂肪組織幹細胞、およびコラーゲンを含み、間質血管分画が、脂肪組織血管網の内皮細胞および脂肪組織幹細胞を含む、組成物に関する。

【0050】

コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンである。細胞外マトリックスは、フィブロネクチンをさらに含む。

【0051】

第５の目的によれば、本発明は、肥満および２型糖尿病および心血管疾患などの関連する代謝性疾患に対して薬理学的な有効な物質をスクリーニングするための、上記に定義される細胞外マトリックスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用または上記に定義される組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

【0052】

第５の目的によれば、本発明は、細胞療法、特に形成外科手術および修復手術での細胞療法でそれらを使用するため、より具体的にはリポフィリングのために意図された上記に定義される方法により得られた分化した細胞、またはそれらの使用に関する。

【0053】

形成外科手術および修復手術での使用の場合、細胞外マトリックスは、定義により、脂肪組織を得る患者に特異的な細胞を含む自家マトリックスである。

【0054】

リポフィリングでの使用では、本発明の方法で得られる分化した細胞は、脂肪細胞である。

【0055】

実施例
実施例１．機械的抽出
ａ）プロセスの間に細胞およびマトリックスの集団を特徴付けるための機械的抽出
ヒトのドナー由来の脂肪組織のサンプルからの、間質血管分画および細胞外マトリックスの機械的抽出は、以下のステップにより行うことができる（図１Ｂ）：
１．－２０ｋＰａの陰圧下での２ｍｍのＣｏｌｅｍａｎカニューレを備えた１０ｃｃの無菌性シリンジでの吸引による脂肪組織のサンプリング
２．異なる相を分離するために、シリンジを、回収チューブにおいて１６００ｒｃｆ（相対的な遠心分離の力）で３分間遠心分離する。油の分画および血液および麻酔液の分画を除去する。ペレット状の分画を保持する。
３．１単位の生理食塩水を、シリンジに注射した後、撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートする。シリンジを、回収チューブにおいて１６００ｒｃｆで３分間遠心分離する。生理食塩水の分画および油の分画を除去する。ペレット状の分画を保持する。
４．シリンジを、Ｔｕｌｉｐ（登録商標）型のコネクターにより別のメーカーのルアーロック型のシリンジに接続して、乳化による組織の分離を行う。３つの種類のＴｕｌｉｐ（登録商標）コネクター、２．４ｍｍ、１．４ｍｍ、および１．２ｍｍを、３０の経路に連続して使用する。
５．１単位の生理食塩水をシリンジに注射した後、撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベーションする。シリンジを、回収チューブにおいて１６００ｒｃｆで３分間遠心分離する。生理食塩水の分画および油の分画を除去する。ペレット状の分画を保持する。
６．事前に血液細胞を除去したシリンジの中身および回収チューブの中身を、増殖期のため３７℃のＥＧＭ＋培養培地を含む培養バッグに無菌性の接続を介して移す。

【0056】

組織を分離する上記のステップ４において、Ｔｕｌｉｐ（登録商標）のブランド以外のブランドのコネクターを使用することができる。使用されるコネクターの数は、１～５である。使用されるこれらコネクターを介した経路の数は、１０～５０である。

【0057】

ｂ）得られた細胞集団の特徴付け
上述の方法は、間質血管分画を３つの細胞集団へと順次抽出することを可能にする。これらの細胞集団は、特に光学顕微鏡および蛍光顕微鏡により特徴付けられる。

【0058】

本明細書においてＣ１と呼ばれるステップ２で得られた細胞集団は、大部分がＣＤ３１＋内皮型細胞から構成される（図２および図３）

【0059】

本明細書においてＣ２と呼ばれるステップ３で得られた細胞集団は、３Ｄで維持される際に毛細血管型の血管網を形成するＣＤ３１＋内皮型細胞およびＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞から構成される（図４および図６Ａ）。細胞集団Ｃ２は、成熟脂肪細胞への分化能を有する（図６Ｂ）。

【0060】

本明細書においてＣ３と呼ばれるステップ５で得られた細胞集団は、浮遊液において球体を形成できるＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞から構成される（図５および図６Ａ）。細胞集団Ｃ３は、成熟脂肪細胞への分化能を有する（図６Ｃ）。

【0061】

ｃ）本方法の異なるステップの間に得たマトリックスＭ１～Ｍ４の特徴付け
本明細書においてＭ１と呼ばれるステップ２で得られたマトリックスは、線維状の型である（図７）。

【0062】

本明細書においてＭ２と呼ばれるステップ３で得られたマトリックスは、線維状の型およびコラーゲンを多く含む型である（図８）。コラーゲンは、ピクロシリウスレッドで検出され、これによってコラーゲンの杆状構造を見ることが可能となる（図１０Ａ）。このマトリックスは、内因性細胞を含む。

【0063】

本明細書においてＭ３と呼ばれる、ステップ５で得られ、回収チューブで単離されたマトリックスは、線維状の型である（図９および図１０Ｂ）。このマトリックスはまた、内因性細胞も含む。単離したマトリックス由来のコラーゲンは、図１０Ｂにおいて、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンの線維を染色するピクロシリウスレッドで検出される。得られた赤い染色（図１０Ｂではグレイスケール）は、コラーゲンが組織化されたままであること、すなわちコラーゲンが常にαヘリックス二次構造およびトリプルヘリックス４次構造を有することを表している。これは、分解されない。実際に、組織化されていないコラーゲンは、ピクロシリウスレッドにより緑色に染色される。

【0064】

本明細書においてＭ４と呼ばれる、ステップ５で得られシリンジに含まれるマトリックスは、大部分が成熟脂肪細胞およびＩ型コラーゲンフレームワークから構成される（図１１Ｂ）。マトリックスＭ４はまた、ＣＤ３１＋内皮細胞（図１１Ｃ）およびＰＤＧＦＲａ＋脂肪組織幹細胞ネットワーク（図１１Ｄ）により形成される毛細血管構造から構成される。

【0065】

図１Ａは、ステップ２で集団Ｃ１およびＣ２ならびにマトリックスＭ１およびＭ２を回収するための方法を示す。ステップ３では、集団Ｃ３ならびにマトリックスＭ３およびＭ４が、まとめてグループ化されている。

【0066】

実施例２：細胞の増殖および分化
脂肪組織幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増大させ、および脂肪組織を模倣する環境で分化させる方法は、以下のステップを含む：
１．集団Ｃ１～Ｃ３ならびにいわゆるＥｎｄｏＳｔｅｍ－ＭａｔｒｉｘのマトリックスＭ１～Ｍ４を含む実施例１で得られた最終生成物を、バッグ中で浮遊培養し、ＥＧＭ＋増殖培地において、５％ＣＯ_２にて、３７℃で２４時間撹拌しながら維持し、次に、好ましくは撹拌しながら、同じ条件下で維持する。
２．ＥＧＭ＋増殖培地を、２日ごとに５０％交換する。
３．５日目および１０日目に、チューリップアセンブリにおける２つのシリンジまたは２つのバッグの中を通過させることによる閉鎖的な系での培養物の機械的分離を行う。
４．１４日目に、ＥＧＭ＋増殖培地を、２５０μＭのデキサメタゾン；５００μＭのＩＢＭＸ；１μＭのロシグリタゾン；２μＭのＴ３および２．５μｇ／ｍｌのインスリンで強化されたＥＧＭ＋で構成される分化混合物Ｉと交換する。
５．１７日目に、分化培地Ｉを、１μＭのロシグリタゾン；２μＭのＴ３および２．５μｌのインスリンで強化されたＥＧＭ＋で構成される分化培地ＩＩと交換する。

【0067】

実施例３．マトリックスの増殖能の特徴付け
本発明のいわゆるＥｎｄｏＳｔｅｍ－Ｍａｔｒｉｘ細胞外マトリックスを、異なる特異的マーカーの存在下で、特に蛍光顕微鏡により特徴付ける。よって、増殖細胞を、生物活性であることを条件として、ＤＮＡ複製期の間、図１２に示されるように、本発明のＥｎｄｏＳｔｅｍ－Ｍａｔｒｉｘマトリックスに蛍光Ｅｄｕ（５－エチニル（ｅｔｈｙｌｎｙｌ）－２’－デオキシウリジン）を組み込むことにより検出した。実際に、図１２は、マトリックス中の内因性細胞が、増幅期の間増殖し続けていることを示している。

【0068】

さらに、図１３は、本発明の細胞外マトリックスとの３日間の共培養後の脂肪組織幹細胞の存在を示している。よって細胞外マトリックスは、間質血管分画を増殖させるための物質を供給することを可能にし；添加される脂肪組織幹細胞は、浮遊液においてＥｎｄｏＳｔｅｍ－Ｍａｔｒｉｘに結合し得る。

【0069】

図１４Ｂを参照すると、間質血管分画は、本発明のＥｎｄｏＳｔｅｍ Ｍａｔｒｉｘ上でのその培養により増幅される。反対に、図１４Ａを参照すると、間質血管分画が細胞外マトリックスを含まない浮遊液で培養される場合、増殖を伴わない細胞凝集体が観察される。よって本発明の細胞外マトリックスは、添加される脂肪組織幹細胞の増幅能を有する。

【0070】

実施例１のステップで得られた異なるマトリックスＭ１～Ｍ４の細胞増幅能を検証した。その結果、約１０^４個の脂肪組織幹細胞が、超低接着表面（Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ：ＵＬＡ）ウェルにおいて異なるマトリックスＭ１～Ｍ４の存在下で浮遊し続けた。８日後に、細胞を、トリプシン／ＥＤＡを用いてマトリックスから剥がした後、計測した。得られた値を、以下の表１に示す。

【表1】

【0071】

上記の表において、個々のマトリックスＭ１～Ｍ４の特定の例での増幅係数は、細胞外マトリックスの存在下での培養後に得られた細胞の数と、細胞外マトリックスの非存在下で得られた細胞の数との間の比率である。

【0072】

マトリックスＭ２およびＭ４は、高い脂肪組織幹細胞の増幅能を有する。得られたマトリックスＭ２の体積は、Ｍ４の体積と比較して非常に小さい（図１１Ａ）。マトリックスＭ４は、本発明で定義される細胞外マトリックスを示す。

【0073】

異なる細胞マーカー（ＣＤ３１内皮細胞マーカー、ＰＤＧＦＲａ＋脂肪細胞幹細胞マーカー、および２つのＰＬＮ１およびアディポネクチン成熟脂肪細胞のマーカー）の発現レベルを、本発明の細胞外マトリックス上での間質血管分画の浮遊培養後に分析した。図１５は、本発明の細胞外マトリックスを含まない間質血管分画の浮遊培養から得られた細胞のこれらの発現レベルの比較を示す。この試験は、ヒト脂肪組織血管網の内皮細胞（図１５Ａ）およびヒト脂肪組織幹細胞（図１５Ｂ）の増幅を示す。この試験はまた、本発明の細胞外マトリックスにより誘導される優れた分化能を証明することを可能にする（図１５Ｃおよび１５Ｄ）。よって、本発明の細胞外マトリックス上で３Ｄにて増幅された脂肪組織幹細胞は、脂肪細胞へのその分化能を保持している。

【0074】

図１６は、本発明の細胞外マトリックスの存在下での間質血管分画の増幅および分化の後の核、成熟脂肪細胞、およびコラーゲン性マトリックスの存在を証明する。よって、本発明の細胞外マトリックスの存在下での分化は、脂肪組織のｉｎ ｖｉｖｏでの構造的な組織機構を保持することを可能にする。

【0075】

分離されていない脂肪組織は、外植片と等価であり得て、ｅｘ ｖｉｖｏで短期間生存し続けることに留意されたい。よって特に図１２に示されるように、分離により単離されたマトリックスは、分離されていない組織とは異なるように、増殖細胞を含む。図１７Ａおよび１７Ｂは、分離されていない組織（図１７Ａ）および単離されたマトリックス（図１７Ｂ）での細胞増殖を比較することを可能にする。図１７Ａでは、分離されていない脂肪組織は、増殖細胞を示さない。図１７Ｂでは、組成は、増殖細胞を示す。実際に、この図面は、増殖細胞の核を白色で示す。

【0076】

洗浄（ｗａｓｈ）により液体を遠心分離することによって本発明により単離された細胞は、マーカーＤＰＰ４により分子的に特徴付けられることに留意されたい。ＤＰＰ４は、高い増殖能を有し、脂肪組織の間質性細網に位置するプレ脂肪細胞前駆細胞を標識するマーカーである。これら細胞は、本発明に係る組成物において増殖能を有する。これら細胞が従来技術の方法により行われる洗浄後に除去されることに留意することは重要である。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、ＤＰＰ４の発現は、単離されたＳＶＦ分画において濃縮される。マトリックスは、少量発現する。他方で、図１８Ｃおよび１８Ｄに示されるように、ＩＣＡＭ１の発現は、単離されたマトリックスで濃縮される。本組成物において増幅を有する細胞は、添加されたＤＰＰ４を発現する細胞である。

【0077】

さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで脂肪組織がマクロファージを含むこと、および本発明に係る増幅された組成物が、図１９Ａに示されるようにＭ１型のマクロファージの存在を維持し、図１９Ｂに示されるようにＭ２型のマクロファージの存在を維持することに留意されたい。図１９Ａでは、Ｍ１型のマクロファージは、マーカーＩＬ－１ｂにより検出され、図１９Ｂでは、Ｍ２型のマクロファージは、ＭＲＣ１により検出される。

【0078】

最後に、図２０に示されるように、本発明に係る単離されたマトリックスは、細胞外マトリックスのタンパク質、すなわち、特にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンを含む。ＣＤ３１内皮細胞の標識は、毛細血管網が保持されていることを示している。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【国際調査報告】