特表2022-518548メソテリン特異的なキメラ抗原受容体及びこれを発現させるＴ細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-15
(54)【発明の名称】メソテリン特異的なキメラ抗原受容体及びこれを発現させるＴ細胞
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20220308BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20220308BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220308BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220308BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220308BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220308BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220308BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220308BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220308BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220308BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220308BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220308BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220308BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/00
C07K14/705
C12N15/62
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/85 Z
C12N7/01
C12N5/10
C12N5/0783
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021543308
(86)(22)【出願日】2019-12-16
(85)【翻訳文提出日】2021-08-04
(86)【国際出願番号】 KR2019017757
(87)【国際公開番号】W WO2020153605
(87)【国際公開日】2020-07-30
(31)【優先権主張番号】10-2019-0007422
(32)【優先日】2019-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521325547
【氏名又は名称】グリーン クロス セル コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】アン ジョンソン
(72)【発明者】
【氏名】クォン ミソン
(72)【発明者】
【氏名】キム アリン
(72)【発明者】
【氏名】イ ヒョンホ
(72)【発明者】
【氏名】キム オンギョ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
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4C087CA12
4C087NA14
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4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、キメラ抗原受容体及びこれを発現させる免疫細胞に関し、特に、抗メソテリン抗体又はその断片；ＣＤ８αのシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＣＤ２８又はＣＤ８αのヒンジ（ｈｉｎｇｅ）；ＣＤ２８又はＣＤ８αの膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及びＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内信号領域配列を含む細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体、及びこれを発現させる免疫細胞、好ましくはＴ細胞に関する。本発明に係るキメラ抗原受容体及びこれを発現させるＴ細胞は、免疫細胞が優れた抗癌活性効果を示すので、癌治療に効果的に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ＭＳＬＮ）に特異的に結合する結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）。
【請求項2】
さらに、シグナル配列、ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に対する結合ドメインは、次の重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域及び軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含有する抗メソテリン抗体、又はその断片であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体：配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；又は、
配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項4】
前記メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に対する結合ドメインは、次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する抗メソテリン抗体、又はその断片であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体：配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項5】
前記メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に対する結合ドメインは、抗メソテリン抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
前記抗メソテリン抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記シグナル配列は、ＣＤ８αのシグナル配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記ＣＤ８αのシグナル配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項9】
前記ヒンジは、ＣＤ２８又はＣＤ８αのヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含むことを特徴とする、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項10】
前記ＣＤ２８又はＣＤ８αのヒンジ配列は、配列番号１０又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項11】
前記膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、ＣＤ２８又はＣＤ８αの膜貫通ドメインを含むことを特徴とする、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項12】
前記ＣＤ２８又はＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号１２又は配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項13】
前記細胞内ドメインはＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内信号領域配列、又はそれらの組合せからなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項14】
前記細胞内ドメインであるＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内信号領域配列は、配列番号１４、配列番号２０又は配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項15】
前記キメラ抗原受容体は、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項17】
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸のＣＤ８αシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項18】
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸の抗メソテリン抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項19】
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸のＣＤ２８又はＣＤ８αのヒンジをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９又は配列番号１５で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項20】
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸のＣＤ２８又はＣＤ８αの膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１又は配列番号１７で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項21】
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸のＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＣＤ３ζ細胞内信号領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１９、又は配列番号２１で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項22】
キメラ抗原受容体をコードする核酸は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５で表されることを特徴とする、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項23】
請求項１６～２２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項24】
請求項２３に記載の発現ベクターを含むウイルス。
【請求項25】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現させる免疫細胞。
【請求項26】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞である、請求項２５に記載の免疫細胞。
【請求項27】
請求項２５の免疫細胞を含む癌治療用組成物。
【請求項28】
前記癌は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直膓癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、白血病及び他のリンパ球増殖性障害、及び種々の頭頸部癌からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２７に記載の癌治療用組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、メソテリン特異的なキメラ抗原受容体及びこれを発現させるＴ細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、適応性免疫反応（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を媒介する重要な役割を担う細胞である。Ｔ細胞は、抗原を認知できる受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）、補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、及びサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）刺激によって活性化される。また、Ｔ細胞のＴＣＲは、抗原と結合したＭＨＣ分子（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を通じて免疫反応を起こすが、癌細胞は免疫反応を回避するための機序としてＭＨＣ分子の発現を抑制する。Ｔ細胞のこのような特性を用いて免疫細胞治療剤（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ）を開発している。
【0003】
Ｔ細胞がＭＨＣ分子無しで抗原を直接認知できるようにキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を開発している。キメラ抗原受容体は、抗原を認知するｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）部分、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、細胞内に信号を伝達する信号伝達ドメイン（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）で構成されている。Ｔ細胞内にキメラ抗原受容体を人為的に導入させ、Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が、特定の抗原を持つ癌に対して反応できるようにする。現在、米国のＮｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｉｌｅａｄ、Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｅｌｇｅｎｅなどのような多国籍製薬企業では血液癌を適応症にしてＣＡＲ－Ｔ細胞を利用しているが、固形癌に対する研究はまだわずかである。
【0004】
メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）は、４０ｋＤａのサイズを有する細胞表面に発現する糖タンパク質である。一般の組織では低い発現を示すが、中皮癌（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、膵癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）をはじめとする種々の固形癌で過発現が確認され、抗癌標的として研究が進行中である（Ｃｈａｎｇ Ｋ１９９６，Ｒａｆｆｏｔ Ｈ２００４）。これに基づき、Ｎｏｖａｒｔｉｓと協業する米国ペンシルバニア大学のＣａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ博士グループは、メソテリンを標的するマウス由来抗メソテリンのｓｃＦｖを持つキメラ抗原受容体（ｓｓ１ＣＡＲ）研究を進行中である。ｓｓ１ ＣＡＲ ｍＲＮＡをＴ細胞に伝達して一時的に（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）ＣＡＲを発現させて患者に投与したとき、患者から抗マウス抗体反応（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＡＭＡ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が起きたことが確認された（Ｂｅａｔｔｙ ＧＬ ２０１４）。
【0005】
本発明者らは、メソテリンを発現する癌の治療用途に用いることができ、既存の抗マウス抗体反応の問題を解消するために、メソテリンを特異的に標的するヒト由来ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体を作製し、該ヒト由来メソテリン特異的なｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体を発現させるＴ細胞が優れた抗癌効果を示すことを糾明し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、既存のメソテリン結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現させるＴ細胞を用いた抗癌免疫細胞治療における問題点を解決した、高い抗癌効果を示す新しいメソテリン結合ドメインを含むキメラ抗原受容体、該キメラ抗原受容体を発現させるＴ細胞、該免疫細胞を含む癌治療用組成物及びこれを用いた癌治療方法を提供することを目的とする。
【0007】
本発明のさらに他の目的は、癌治療のための前記Ｔ細胞の用途を提供することにある。
【0008】
本発明のさらに他の目的は、癌治療用薬剤の製造のための前記Ｔ細胞の使用を提供することにある。
【0009】
上記の目的を達成するために、本発明は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に特異的に結合する結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
【0010】
本発明に係るメソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に対する結合ドメインは、抗メソテリン抗体又はその断片であることが好ましいが、これに限定されない。
【0011】
本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片は、配列番号４５、５１、又は５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６、５２、又は５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４７、５３、又は５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４８、５４、又は６０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９、５５、又は６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号５０、５６、又は６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする。
【0012】
本発明はまた、メソテリン特異的なキメラ抗原受容体をコードする核酸；前記核酸を含む発現ベクター；及び前記キメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物及びこれを用いた癌治療方法を提供する。
【0013】
本発明はまた、癌治療のための前記免疫細胞の用途を提供する。
【0014】
本発明はまた、癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】本発明の実施例に係る組換えヒトメソテリン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ｒｈＭＳＬＮ）に対するＭＳ５０１ ｓｃＦｖ、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ又はＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖの結合程度を酵素結合免疫沈降分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を用いて示す。
【0016】
【図1B】本発明の実施例に係るＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞に対するＭＳ５０１ ｓｃＦｖ、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ又はＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖの細胞結合程度を流細胞分析を用いて示す。
【0017】
【図2A】本発明の実施例に係るｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に用いられたＣＡＲ構造の模式図である。
【0018】
【図2B】本発明の実施例に係る５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるそれぞれのＣＡＲ発現量を流細胞分析を用いて示す。
【0019】
【図2C】本発明の実施例に係るＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入された５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚの発現率を、メソテリンキメラ抗原受容体発現量とＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）発現量で示す。
【0020】
【図3A】本発明の実施例に係る５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のメソテリンを発現させる標的細胞であるＨｅＬａ（子宮頸癌）細胞、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）細胞、ＣＡＰＡＮ１（膵癌）細胞に対する反応による細胞活性度を流細胞分析を用いて示す。
【0021】
【0022】
【図4A】本発明の実施例に係る５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のメソテリン特異的な反応による細胞活性度を流細胞分析を用いて示す。
【0023】
【0024】
【図5A】本発明の実施例に係るヒトＴ細胞に形質導入された５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚの発現率を流細胞分析を用いて示す。
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【図6A】本発明の実施例に係るｉｎ ｖｉｖｏ実験に用いられたＣＡＲ構造の模式図である。
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明は、メソテリン特異的に結合する結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）及びこれを発現させるＴ細胞に関する。以下、本発明を詳細に説明する。
【0035】
本発明は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に特異的に結合する結合ドメインを含むキメラ抗原受容体に関する。
【0036】
本発明に係るメソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ，ＭＳＬＮ）に対する結合ドメインは、抗メソテリン抗体又はその断片であることが好ましいが、これに限定されない。
【0037】
本発明における抗体の“断片”は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片などを含む意味で使われる。
【0038】
“単一鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【0039】
“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖで強固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【0040】
“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【0041】
本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片は、配列番号４５、５１、又は５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号４６、５２、又は５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４７、５３、又は５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４８、５４、又は６０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４９、５５、又は６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号５０、５６、又は６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする。
【0042】
より具体的には、本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；又は配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むものであり得る。
【0043】
好ましくは、本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片は、配列番号３９、４１、又は４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４０、４２、又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする。
【0044】
より具体的には、本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものであり得る。
【0045】
最も好ましくは、本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれた抗メソテリン抗体又はその断片はｓｃＦｖの形態であり、好ましくは、配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列を含んでよいが、これに限定されない。
【0046】
本発明に係るキメラ抗原受容体は、メソテリンに特異的に結合する結合ドメインの他、さらにシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＳＰ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインから選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする。
【0047】
本発明に係るキメラ抗原受容体に含有可能なシグナル配列はＣＤ８αシグナル配列が好ましいが、これに限定されず、ＣＤ８αシグナル配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むことができる。
【0048】
本発明に係るシグナル配列、及びメソテリンに特異的に結合する結合ドメインは、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインを構成する。細胞外ドメインは主信号が伝達される部位であって、細胞膜の外部に存在し、メソテリンを特異的に認識するためのドメインである。
【0049】
本発明に係るキメラ抗原受容体に含有可能な膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）は、前記細胞外ドメインと前記細胞内信号伝達ドメインを細胞膜の間に連結可能な如何なるものも使用可能である。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン及び／又はＣＤ８α由来の膜貫通ドメインからなり、前記ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン及び／又はＣＤ８α由来の膜貫通ドメインの全体又は一部を含むものでよい。
【0050】
好ましくは、前記膜貫通ドメインは、配列番号１２及び／又は１８で表されるアミノ酸配列を含んでよいが、これに限定されない。
【0051】
本発明の一実施例によれば、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインはスぺーサドメインで連結されてよい。
【0052】
好ましくは、前記スぺーサドメインは、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）ドメインであり得る。本発明に係るキメラ抗原受容体に含有可能なスぺーサドメインは、ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／又はＣＤ８α由来のヒンジドメインを含んでよく、前記ＣＤ２８由来のヒンジドメイン及び／又はＣＤ８α由来のヒンジドメインの全体又は一部を含むものでよい。ＣＤ２８及びＣＤ８αとして全体又は一部を含むものであり得る。
【0053】
好ましくは、前記ヒンジドメインは、配列番号１０及び／又は１６で表されるアミノ酸配列であるが、これに限定されない。
【0054】
具体的な一実施例によれば、ＭＳ５０１ ｓｃＦｖを含む様々な組合せのＣＡＲ構造を用いたインビボ（ｉｎ－ｖｉｖｏ）実験において、ＭＳ５０１ ｓｃＦｖをＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメインと連結した組合せ（５０１（８Ｈ）２８ｚ及び５０１（２８Ｈ）２８ｚ）が他の組合せ（５０１（８Ｈ）ｚ及び５０１（８Ｈ）ＢＢｚ）に比べて腫瘍のサイズを減少させる、予期せぬ優れた抗癌効果を示し、特に、ヒンジ領域としてＣＤ２８を組合せたとき（５０１（２８Ｈ）２８ｚ）、ＣＤ８αヒンジを使用したとき（５０１（８Ｈ）２８ｚ）に比べて著しく抗癌効果を示した。
【0055】
本発明の一実施例によれば、前記細胞内信号伝達ドメインは、Ｔ細胞の細胞膜内側、すなわち、細胞質に位置することになる部分であり、細胞外ドメインに結合した抗体が標的抗原に結合した時、免疫細胞の免疫反応を活性化させる部位を意味する。
【0056】
本発明に係るキメラ抗原受容体は、２個以上の細胞内信号伝達ドメインを含むものであり得る。２個以上の細胞内信号伝達ドメインを含む場合には、細胞内信号伝達ドメインが互いに直列に連結されてよい。本発明に係るキメラ抗原受容体に含有可能な細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ２８由来の細胞内信号伝達ドメイン、又は４－１ＢＢ由来の細胞内信号伝達ドメインがＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメインと連結されたものでよく、好ましくは、配列番号１４、２０及び／又は２２で表されるアミノ酸配列を含んでよいが、これに限定されない。
【0057】
具体的な一実施例によれば、本発明に係るキメラ抗原受容体は、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６からなる群から選ばれる一つ以上のアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するそれの変異体を含むものであり得る。
【0058】
また、本発明は、上述した本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。本発明の抗原受容体をコードするポリヌクレオチド（核酸）はコドン最適化によって変形されてよいが、これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因することであり、ポリペプチド又はその変異体断片をコードする多数のヌクレオチド配列が存在するということは、通常の技術者によく理解できよう。これらのポリヌクレオチド（核酸）の一部は任意の自然発生型遺伝子のヌクレオチド配列と最小相同性を有する。
【0059】
特に、コドン活用法の相違から、可変的なポリヌクレオチド（核酸）、例えば、ヒト、霊長類及び／又は哺乳動物のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチド（核酸）が好ましい。
【0060】
本発明の一実施例によれば、前記核酸配列は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５からなる群から選ばれる一つ以上のヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するその変異体を含むものであり得る。
【0061】
本発明に係るキメラ抗原受容体に含まれる、ＣＤ８αシグナル配列をコードする核酸配列は配列番号７；ｓｃＦｖをコードする核酸配列は配列番号１、３、又は５；ＣＤ２８ヒンジ又はＣＤ８αヒンジをコードする核酸配列は配列番号９又は１５；ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする核酸配列は配列番号１１又は１７；ＣＤ２８細胞内信号ドメイン、４－１ＢＢ細胞内信号ドメイン又はＣＤ３ζ細胞内信号ドメインをコードする核酸配列は配列番号１３，１９又は２１；で表されることを特徴とし得るが、これに限定されない。
【0062】
本発明はまた、前記核酸を含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含むウイルスに関する。
【0063】
本発明の用語“ベクター”とは、他の核酸分子を転移又は輸送できる核酸分子を意味する。転移した核酸は、一般にベクター核酸分子に連結されるが、例えば、ベクター核酸分子内に挿入される。ベクターは、細胞における自律的複製を指示する配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡ内への統合を可能にするのに十分な配列を含んでもよい。前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに制限されない。
【0064】
本発明において、“ウイルス”とは、癌の治療などに用いるために、本発明のキメラ抗原受容体を発現させるように遺伝的に変形されたものを意味する。“遺伝的に変形された”とは、細胞において全体遺伝子材料にＤＮＡ又はＲＮＡの形態で外部遺伝子材料を付加することを意味する。
【0065】
また、本発明は、前述した本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を提供し、該免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞であってよいが、これに限定されず、好ましくはＴ細胞である。
【0066】
したがって、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）又はＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）であることを特徴とし得る。
【0067】
本発明において、前記Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）及び末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0068】
本発明の免疫細胞は、メソテリンを発現させる腫瘍細胞に対して毒性を示すものであり得る。一実施例によれば、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が膵癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞、子宮頸癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）細胞、中皮腫（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）細胞又は卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）細胞に対して毒性を示すことができる。例えば、前記膵癌細胞、子宮頸癌細胞、中皮腫細胞又は卵巣癌細胞はメソテリンを発現させるものであってよい。
【0069】
また、本発明は、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む癌治療用組成物に関する。
【0070】
本発明において、“癌”と“腫瘍”は同じ意味で使われ、典型的に、調節されていない細胞の成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態のことを指すか意味する。
【0071】
癌（又は腫瘍）の例は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含むが、これに限定されない。より好ましい癌の例は、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、肺の扁平細胞癌腫、腹膜癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直膓癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、中皮腫、白血病及び他のリンパ球増殖性障害、及び種々の頭頸部癌を含む。本発明において、前記癌は、好ましくはメソテリン－陽性癌であり、膵癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、子宮内膜癌及び中皮腫からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0072】
本発明の治療用組成物は、癌の予防又は治療のための組成物であり、本発明の用語、“予防”は、本発明の組成物の投与によって癌を抑制させたり或いは進行を遅延させるあらゆる行為を意味し、“治療”とは、癌の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。
【0073】
前記組成物には本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞の数が、治療対象内の腫瘍細胞（例えば、膵癌、子宮頸癌、中皮腫又は卵巣癌）数の１倍～１０倍で含まれることが好ましいが、これに限定されない。
【0074】
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を含む薬学組成物には、薬剤学的に許容される賦形剤がさらに含まれてもよい。このような賦形剤の例には、界面活性剤、好ましくはポリソルベート系の非イオン性界面活性剤；中性緩衝塩水、リン酸塩緩衝塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトールなどの糖又は糖アルコール類；グリシン、ヒスチジンなどのアミノ酸、タンパク質、又はポリペプチド；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；浸透剤；補助剤；及び保存剤が含まれてよいが、これに限定されない。
【0075】
本発明の一実施例によれば、本発明の薬学組成物は、１回投与量内に前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の数が治療対象内の前記腫瘍細胞、例えば膵癌細胞、子宮頸癌細胞、中皮腫細胞又は卵巣癌細胞数の１倍～１０倍で含まれたものであり得る。
【0076】
また、本発明は、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を対象体に投与する段階を含む癌治療方法及び腫瘍転移の予防及び治療方法を提供する。
【0077】
本発明はまた、癌治療のための前記免疫細胞の用途に関する。
【0078】
本発明はまた、癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用に関する。
【0079】
前記対象体は腫瘍を持つ哺乳類でよく、具体的にはヒトであり得るが、これに限定されない。
【0080】
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞又はこれを含む組成物は、経口投与、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内投与（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｏｏｎ）、直腸内投与（Ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、鼻内投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などで投与されてよいが、これに限定されない。
【0081】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を詳細に説明するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲はこれらの実施例に例示したものに限定されない。
【0082】
実施例１：方法及び試薬
１．１ 細胞株及び細胞株培養
ヒトＴ－系細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト膵癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ２、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、ヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３、ヒト膵癌細胞株ＣＡＰＡＮ１、ヒト中皮腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手して使用した。Ｊｕｒｋａｔ及び形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞は、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で保持された。ＭＩＡ ＰａＣａ２は、１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で保持された。ＨｅＬａは、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ＯＶＣＡＲ３は、２０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ＣＡＰＡＮ１は、２０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＩＭＤＭ（ＡＴＣＣ）で保持された。ＮＣＩ－Ｈ２２６は、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ヒト胚腎臓線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ＡＴＣＣから入手して使用し、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。メソテリン過発現ヒト膵癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮは、MOGAM研究所（ＧＣ緑十字、Ｋｏｒｅａ）から入手して使用した。ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮは、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）及び２００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ）（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。
１．１ 細胞株及び細胞株培養
ヒトＴ－系細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト膵癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ２、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、ヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３、ヒト膵癌細胞株ＣＡＰＡＮ１、ヒト中皮腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ２２６は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手して使用した。Ｊｕｒｋａｔ及び形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞は、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で保持された。ＭＩＡ ＰａＣａ２は、１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で保持された。ＨｅＬａは、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ＯＶＣＡＲ３は、２０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ＣＡＰＡＮ１は、２０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＩＭＤＭ（ＡＴＣＣ）で保持された。ＮＣＩ－Ｈ２２６は、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ＧＩＢＣＯ）で保持された。ヒト胚腎臓線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ＡＴＣＣから入手して使用し、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。メソテリン過発現ヒト膵癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮは、MOGAM研究所（ＧＣ緑十字、Ｋｏｒｅａ）から入手して使用した。ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮは、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）及び２００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ）（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で保持された。
【0083】
１．２ ヒトＴ細胞分離及び培養
機関生命倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ，ＩＲＢ，Ｋｏｒｅａ）の承認下に供与者を募集し、末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）をフィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離した。分離されたＰＢＭＣは直ちに凍結させた。解凍したＰＢＭＣは、陰性選択（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）方法でＥａｓｙ ｓｅｐ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，ＣＡ）キット（Ｋｉｔ）でヒトＴ細胞を分離した。ヒトＴ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マグネチックビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄ，ＧＩＢＣＯ）と１：３に混ぜて２０～２４時間活性化させた。ヒトＴ細胞及び形質転換されたヒトＴ細胞は、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）及び５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ １５（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で保持された。
機関生命倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ，ＩＲＢ，Ｋｏｒｅａ）の承認下に供与者を募集し、末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）をフィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離した。分離されたＰＢＭＣは直ちに凍結させた。解凍したＰＢＭＣは、陰性選択（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）方法でＥａｓｙ ｓｅｐ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，ＣＡ）キット（Ｋｉｔ）でヒトＴ細胞を分離した。ヒトＴ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マグネチックビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄ，ＧＩＢＣＯ）と１：３に混ぜて２０～２４時間活性化させた。ヒトＴ細胞及び形質転換されたヒトＴ細胞は、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）及び５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ １５（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で保持された。
【0084】
１．３ 組換えヒトメソテリンに対するｓｃＦｖの結合確認
次の過程を経て、組換えヒトメソテリンに本発明に係るｓｃＦｖが結合することを確認した。
（ｉ）ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質を９６ウェル免疫プレートに２００ｎｇ／ｍｌで２４時間コートした。
（ｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｉｇｍａ）溶液で１時間ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。
（ｉｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトメソテリンタンパク質で２時間処理した。
（ｉｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、組換えヒトメソテリン探知抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書にしたがって希釈してウェルに分注した後、１時間処理した。
（ｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）で３０分間処理した。
（ｖｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１５分間処理した。
（ｖｉｉ）停止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を処理し、４５０ｎｍ吸光度で測定した。
次の過程を経て、組換えヒトメソテリンに本発明に係るｓｃＦｖが結合することを確認した。
（ｉ）ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質を９６ウェル免疫プレートに２００ｎｇ／ｍｌで２４時間コートした。
（ｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｉｇｍａ）溶液で１時間ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。
（ｉｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトメソテリンタンパク質で２時間処理した。
（ｉｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、組換えヒトメソテリン探知抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書にしたがって希釈してウェルに分注した後、１時間処理した。
（ｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）で３０分間処理した。
（ｖｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１５分間処理した。
（ｖｉｉ）停止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を処理し、４５０ｎｍ吸光度で測定した。
【0085】
１．４ メソテリン過発現細胞との結合確認
ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質のメソテリン過発現細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮに対する結合の程度を確認した。ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌでＦＡＣＳ緩衝溶液に浮遊して準備した。ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質をそれぞれ１μｇ処理した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、抗６ｘＨｉｓタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）試料は、抗メソテリン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で染色した。染色された細胞の発現比率及び平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏTMソフトウェアで分析した。
ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質のメソテリン過発現細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮに対する結合の程度を確認した。ＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌでＦＡＣＳ緩衝溶液に浮遊して準備した。ＭＳ５０１ ｓｃＦｖタンパク質、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖタンパク質及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖタンパク質をそれぞれ１μｇ処理した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、抗６ｘＨｉｓタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）試料は、抗メソテリン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で染色した。染色された細胞の発現比率及び平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏTMソフトウェアで分析した。
【0086】
１．５ キメラ抗原受容体構築
本発明のキメラ抗原受容体を作製するために、表１に記載の構成をＳＯＥ－ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって人工的に合成した。さらにいうと、（１）細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ８αのシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ｓｃＦｖ配列（ＭＳ５０１ ｓｃＦｖ配列、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ配列又はＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖ配列）、ＣＤ２８のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）又はＣＤ８αのヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、（２）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ２８、ＣＤ８αの膜貫通ドメイン、（３）細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）はＳＯＥ－ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって人工的に合成した。遺伝子組換え結果物は、直接配列分析（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。これらはＮｈｅ１及びＥｃｏＲＩで切断された後、３世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクター（ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）であるＥＦ１α－ＭＣＳベクターのＮｈｅ１及びＥｃｏＲＩサイトに挿入（ｌｉｇａｔｉｏｎ）された。
本発明のキメラ抗原受容体を作製するために、表１に記載の構成をＳＯＥ－ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって人工的に合成した。さらにいうと、（１）細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ８αのシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ｓｃＦｖ配列（ＭＳ５０１ ｓｃＦｖ配列、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ配列又はＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖ配列）、ＣＤ２８のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）又はＣＤ８αのヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、（２）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ２８、ＣＤ８αの膜貫通ドメイン、（３）細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）はＳＯＥ－ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって人工的に合成した。遺伝子組換え結果物は、直接配列分析（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。これらはＮｈｅ１及びＥｃｏＲＩで切断された後、３世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクター（ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）であるＥＦ１α－ＭＣＳベクターのＮｈｅ１及びＥｃｏＲＩサイトに挿入（ｌｉｇａｔｉｏｎ）された。
【0087】
本発明の実施例に係るキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を表１に整理した。本発明の実施例に係る全てのＣＡＲのドメインは互いに直列に（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）連結され、また、インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で連結されたものである。５０１（２８Ｈ）２８ｚは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０１ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン（４３９－７５９ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０２９８８．１）；及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。５０３（２８Ｈ）２８ｚは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０３ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン（４３９－７５９ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０２９８８．１）；及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；Ｃ２Ｇ４ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン（４３９－７５９ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０２９８８．１）；及びヒトＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。５０１（８Ｈ）Δは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０１ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ８αのヒンジ、膜貫通ドメイン（１２９２－１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。５０１（８Ｈ）ｚヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０１ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ８αのヒンジ、膜貫通ドメイン（１２９２－１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。５０１（８Ｈ）ＢＢｚは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０１ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ８αのヒンジ、膜貫通ドメイン（１２９２－１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）とヒト４－１ＢＢ由来の細胞内信号伝達ドメイン（９０１－１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１５６１．５）；及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。５０１（８Ｈ）２８ｚは、ヒトＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０－９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ＭＳ５０１ ＩｇＧのｓｃＦｖドメイン（韓国出願番号：１０－２０１５－０１３５７５５）；ヒトＣＤ８αのヒンジ（１２９２－１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７６８．６）；ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン（５５６－７５９ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０２９８８．１）；及びＣＤ３ζ由来の細胞内信号伝達ドメイン（２９９－６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７３４．３）と停止コドンＴＧＡが連結されたものである。
【0088】
【表1】
【0089】
本発明の実施例に係るキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）及びその製造に用いられたドメインの配列の情報を、表２及び表３に整理した。
【0090】
【表2】
【0091】
【表3】
【0092】
本発明の実施例に係るキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）の製造に用いられたｓｃＦｖ可変領域の重鎖、軽鎖、及びＣＤＲの配列目録を表４及び表５に整理した。
【0093】
【表4】
【0094】
【表5】
【0095】
１．６ ウイルス生産及び遺伝子伝達
遺伝子伝達のために、２９３Ｔ細胞を用いて偽型ＶＳＶＧレンチウイルス（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ－ＶＳＶＧ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を製造した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｐＣＤＨ１－ＭＳＣＶ－ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクト－ＥＦ１α－ｃｏｐＧＦＰベクター、ＥＦ１α－ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクトベクター又はｐＣＤＨ１－ＭＳＣＶ－ＥＦ１α－ｃｏｐＧＦＰ対照群ベクター；及びＨＩＶベースｐＰＡＣＫＨ１レンチウイルスパッケージキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）された。ベクター伝達のためにリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクトは次の通りである；５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ、５０１（８Ｈ）Δ、５０１（８Ｈ）ｚ、５０１（８Ｈ）ＢＢｚ又は５０１（８Ｈ）２８ｚ。形質転換４８時間後に、レンチウイルスを含有する細胞上澄液（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収穫した。上澄液は、０．４５μｍフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。１０，６００ｒｐｍで９０分間、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）してウイルスを１，５００倍濃縮した。濃縮されたウイルスは、－８０℃で保管した。
遺伝子伝達のために、２９３Ｔ細胞を用いて偽型ＶＳＶＧレンチウイルス（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ－ＶＳＶＧ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を製造した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｐＣＤＨ１－ＭＳＣＶ－ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクト－ＥＦ１α－ｃｏｐＧＦＰベクター、ＥＦ１α－ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクトベクター又はｐＣＤＨ１－ＭＳＣＶ－ＥＦ１α－ｃｏｐＧＦＰ対照群ベクター；及びＨＩＶベースｐＰＡＣＫＨ１レンチウイルスパッケージキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）された。ベクター伝達のためにリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。ＭＳＬＮ ＣＡＲコンストラクトは次の通りである；５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ、５０１（８Ｈ）Δ、５０１（８Ｈ）ｚ、５０１（８Ｈ）ＢＢｚ又は５０１（８Ｈ）２８ｚ。形質転換４８時間後に、レンチウイルスを含有する細胞上澄液（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収穫した。上澄液は、０．４５μｍフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。１０，６００ｒｐｍで９０分間、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）してウイルスを１，５００倍濃縮した。濃縮されたウイルスは、－８０℃で保管した。
【0096】
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）を用いて５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度に調節し、５ ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）又は１０ ＭＯＩレンチウイルスを添加した。１，８００ｇ及び３２℃で９０分間遠心分離した。遠心分離後に、上澄液を取り除き、新しい培地（ｆｒｅｓｈ ｍｅｄｉａ）に入れ換えた。その後、細胞は、３７℃及び５％ ＣＯ２条件の加湿インキュベーターに保管した。対照群細胞は、ベクターだけで形質導入された。
【0097】
ヒトＴ細胞は、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）及び５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５（ＬＯＮＺＡ）培地で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で浮遊させた。５ ＭＯＩ又は１０ ＭＯＩレンチウイルスを８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に添加した。１，８００ｇ及び３２℃で９０分間遠心分離した。遠心分離後に、上澄液を取り除き、新しい培地（ｆｒｅｓｈ ｍｅｄｉａ）に入れ換えた。その後、細胞は、３７℃及び５％ ＣＯ２条件の加湿インキュベーターに放置した。対照群細胞は、ベクターだけで形質導入された。
【0098】
１．７ ＭＳＬＮ ＣＡＲを含む受容体発現及びＴ細胞活性マーカー分析
５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、対照群ベクター形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、抗ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｆ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、抗ＣＤ６９（ＢＤ）ｈＡｂｓで染色した。染色された細胞の発現比率及び平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで測定し、ＦｌｏｗＪｏTMソフトウェアで分析された。
５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、対照群ベクター形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、抗ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｆ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、抗ＣＤ６９（ＢＤ）ｈＡｂｓで染色した。染色された細胞の発現比率及び平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで測定し、ＦｌｏｗＪｏTMソフトウェアで分析された。
【0099】
５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、及び対照群ベクター形質導入されたヒトＴ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、抗ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｆ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。染色された細胞の発現比率及び平均蛍光強度（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで測定し、ＦｌｏｗＪｏTMソフトウェアで分析した。
【0100】
１．８ ＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の標的細胞活性能確認
次の過程を経て、ＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の標的細胞、すなわち、メソテリンを発現させる癌細胞に対する活性能を確認した。
（ｉ）標的細胞は、９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分配した。
（ｉｉ）効果細胞（５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、対照群ベクター形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、様々なＥ／Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｏ－ｔａｒｇｅｔ）比率条件で添加した。
（ｉｉｉ）２４時間後に、プレートは２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μＬの上澄液を収集し、遠心分離された細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、活性マーカーを分析した。細胞毒性アッセイの完了した試料は、－２０℃で保管した。
次の過程を経て、ＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の標的細胞、すなわち、メソテリンを発現させる癌細胞に対する活性能を確認した。
（ｉ）標的細胞は、９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分配した。
（ｉｉ）効果細胞（５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、対照群ベクター形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、様々なＥ／Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｏ－ｔａｒｇｅｔ）比率条件で添加した。
（ｉｉｉ）２４時間後に、プレートは２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μＬの上澄液を収集し、遠心分離された細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、活性マーカーを分析した。細胞毒性アッセイの完了した試料は、－２０℃で保管した。
【0101】
１．９ カルセイン放出細胞毒性アッセイ
次の過程を経てＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性を確認した。
（ｉ）標的細胞は、１０μＭカルセインアセトキシメチルエステル（Ｃａｌｃｅｉｎ－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ；ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｎｔ ｄｙｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３０分間標識（ｌａｂｅｌ）した。
（ｉｉ）洗浄後に、標識された標的細胞を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分配した。
（ｉｉｉ）効果細胞（５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、及び対照群ベクター形質導入されたヒトＴ細胞）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、様々なＥ／Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｏ－ｔａｒｇｅｔ）比率条件で添加した。
（ｉｖ）４時間後に、プレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μＬの上澄液を収集し、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ３，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で刺激波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍでカルセイン放出を測定した。細胞毒性アッセイの完了した試料は、－２０℃で保管した。
次の過程を経てＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性を確認した。
（ｉ）標的細胞は、１０μＭカルセインアセトキシメチルエステル（Ｃａｌｃｅｉｎ－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ；ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｎｔ ｄｙｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３０分間標識（ｌａｂｅｌ）した。
（ｉｉ）洗浄後に、標識された標的細胞を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分配した。
（ｉｉｉ）効果細胞（５０１（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたヒトＴ細胞、及び対照群ベクター形質導入されたヒトＴ細胞）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、様々なＥ／Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｏ－ｔａｒｇｅｔ）比率条件で添加した。
（ｉｖ）４時間後に、プレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μＬの上澄液を収集し、蛍光マイクロプレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ３，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で刺激波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍでカルセイン放出を測定した。細胞毒性アッセイの完了した試料は、－２０℃で保管した。
【0102】
１．１０ サイトカイン測定のための酵素結合免疫沈降分析
－２０℃で保管された上澄液においてサイトカイン測定のための酵素結合免疫沈降分析（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。
（ｉ）捕獲抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書（Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＣｏＡ）にしたがって希釈して９６ウェルプレートに２４時間コートした。
（ｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｉｇｍａ）溶液で１時間ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。
（ｉｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、試料を２時間処理した。
（ｉｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、探知抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書にしたがって希釈してウェルに分注した後に２時間処理した。
（ｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）で２０分間処理した。
（ｖｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２０分間処理した。
（ｖｉｉ）停止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を処理し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
－２０℃で保管された上澄液においてサイトカイン測定のための酵素結合免疫沈降分析（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。
（ｉ）捕獲抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書（Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＣｏＡ）にしたがって希釈して９６ウェルプレートに２４時間コートした。
（ｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、１％ ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｉｇｍａ）溶液で１時間ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。
（ｉｉｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、試料を２時間処理した。
（ｉｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、探知抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を分析証明書にしたがって希釈してウェルに分注した後に２時間処理した。
（ｖ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）で２０分間処理した。
（ｖｉ）洗浄溶液でウェルを洗浄した後、基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２０分間処理した。
（ｖｉｉ）停止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を処理し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0103】
１．１１ 異種移植マウスモデル確立及びＭＳＬＮ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍能力評価
生命倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ，ＧＣ緑十字、Ｋｏｒｅａ）の承認下にインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）を行った。６週齢雌ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から入手して使用した。ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＧＩＢＣＯ）に５×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で浮遊させた。浮遊した細胞と同じ容量のマトリゲル基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍａｔｒｉｘ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を添加した。マウスの右横腹にＮＣＩ－Ｈ２２６を５×１０６ｃｅｌｌｓ皮下注射した。
生命倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ，ＧＣ緑十字、Ｋｏｒｅａ）の承認下にインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）を行った。６週齢雌ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）から入手して使用した。ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＧＩＢＣＯ）に５×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で浮遊させた。浮遊した細胞と同じ容量のマトリゲル基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍａｔｒｉｘ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を添加した。マウスの右横腹にＮＣＩ－Ｈ２２６を５×１０６ｃｅｌｌｓ皮下注射した。
【0104】
腫瘍のサイズが２００～２５０ｍｍ３に到達したとき、用意しておいた５０１（８Ｈ）Δ、５０１（８Ｈ）ｚ、５０１（８Ｈ）ＢＢｚ、５０１（８Ｈ）２８ｚ又は５０１（２８Ｈ）２８ｚで形質導入されたヒトＴ細胞を、腫瘍内に５日間隔で２回注射した。マウスは、グループ別１０匹を使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞が注射した後、２日～３日ごとに腫瘍のサイズと体重を測定した。各グループ別４匹は、最初の腫瘍内注射後２０日目にＩＡＣＵＣ規定に従う処置方法によって腫瘍組織を収穫（Ｈａｒｖｅｓｔ）した。収穫した腫瘍組織は、電子秤で重さを測定した。腫瘍組織を細かく切ってＰＢＳで洗浄し、上澄液を、ＩＦＮ－γサイトカインＥＬＩＳＡに使用した。マウスは、最初に腫瘍内ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射してから６０日間追跡観察し、腫瘍の長軸の長さが１５ｍｍ以上の場合又は体重が２０％以上減った場合、死亡したと見なした。
【0105】
実施例２:メソテリン特異的なＣＡＲを発現させるＪｕｒｋａｔ細胞及びヒトＴ細胞の癌免疫治療剤としての評価
２．１ メソテリンを特異的に標的するｓｃＦｖ評価
ＭＳ５０１ ＩｇＧ、ＭＳ５０３ ＩｇＧ及びＣ２Ｇ４ ＩｇＧは、既存の特許（MOGAM研究所、ＧＣ緑十字、ＫＯＲＥＡ）で発明され、メソテリン特異的な結合ができると知られている。本発明者らは、ＭＳ５０１ ＩｇＧ、ＭＳ５０３ ＩｇＧ及びＣ２Ｇ４ ＩｇＧをｓｃＦｖ形態で作製し、ｓｃＦｖ形態においても組換えヒトメソテリンに結合することを免疫沈降分析で確認した（図１Ａ）。メソテリンを過発現させる細胞株に上記のｓｃＦｖタンパク質を結合させ、流細胞分析によって、メソテリン過発現細胞株に６８％以上結合することを確認した（図１Ｂ）。
２．１ メソテリンを特異的に標的するｓｃＦｖ評価
ＭＳ５０１ ＩｇＧ、ＭＳ５０３ ＩｇＧ及びＣ２Ｇ４ ＩｇＧは、既存の特許（MOGAM研究所、ＧＣ緑十字、ＫＯＲＥＡ）で発明され、メソテリン特異的な結合ができると知られている。本発明者らは、ＭＳ５０１ ＩｇＧ、ＭＳ５０３ ＩｇＧ及びＣ２Ｇ４ ＩｇＧをｓｃＦｖ形態で作製し、ｓｃＦｖ形態においても組換えヒトメソテリンに結合することを免疫沈降分析で確認した（図１Ａ）。メソテリンを過発現させる細胞株に上記のｓｃＦｖタンパク質を結合させ、流細胞分析によって、メソテリン過発現細胞株に６８％以上結合することを確認した（図１Ｂ）。
【0106】
２．２ メソテリン特異的なＣＡＲの発現確認と発現維持能評価
ＭＳ５０１ ｓｃＦｖ、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖはＣＤ８αのシグナル配列；ＣＤ２８のヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン；ＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインと結合させた［表１］（図２Ａ）。組み換えられたキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）遺伝子は、ＭＳＣＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってＪｕｒｋａｔ細胞で発現した。使用されたレンチウイルス量は、１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を用いて検出された。流細胞分析により、Ｊｕｒｋａｔ細胞でＣＡＲが５５％以上の効率で形質導入されたことが確認された（図２Ｂ）。２～３日に１回流細胞分析により、５０日以上ＣＡＲ発現が維持されたことを確認し、細胞外増殖にも、形質導入されたＣＡＲ遺伝子の発現が持続できることを立証した（図２Ｃ）。
ＭＳ５０１ ｓｃＦｖ、ＭＳ５０３ ｓｃＦｖ及びＣ２Ｇ４ ｓｃＦｖはＣＤ８αのシグナル配列；ＣＤ２８のヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン；ＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインと結合させた［表１］（図２Ａ）。組み換えられたキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）遺伝子は、ＭＳＣＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってＪｕｒｋａｔ細胞で発現した。使用されたレンチウイルス量は、１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を用いて検出された。流細胞分析により、Ｊｕｒｋａｔ細胞でＣＡＲが５５％以上の効率で形質導入されたことが確認された（図２Ｂ）。２～３日に１回流細胞分析により、５０日以上ＣＡＲ発現が維持されたことを確認し、細胞外増殖にも、形質導入されたＣＡＲ遺伝子の発現が持続できることを立証した（図２Ｃ）。
【0107】
２．３ メソテリン特異的なＣＡＲを発現させるＪｕｒｋａｔ細胞の活性増加
メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は、中皮癌、子宮癌、膵癌などの癌腫で過発現し、癌の進行に関連するものと知られていることから、本発明者らは、メソテリンを標的するキメラ抗原受容体を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞の抗癌効果活性の有無を試験した。試験に先立ち、形質導入されていないＪｕｒｋａｔ細胞（Ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）とベクターだけで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｍｏｃｋ）において、Ｔ細胞を活性化させると知らされたＰＭＡ及びＰＨＡを用いてＪｕｒｋａｔ細胞の活性を確認した。ＰＭＡ及びＰＨＡを処理したとき、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性が増加した（図３Ａ）。
メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は、中皮癌、子宮癌、膵癌などの癌腫で過発現し、癌の進行に関連するものと知られていることから、本発明者らは、メソテリンを標的するキメラ抗原受容体を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞の抗癌効果活性の有無を試験した。試験に先立ち、形質導入されていないＪｕｒｋａｔ細胞（Ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）とベクターだけで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｍｏｃｋ）において、Ｔ細胞を活性化させると知らされたＰＭＡ及びＰＨＡを用いてＪｕｒｋａｔ細胞の活性を確認した。ＰＭＡ及びＰＨＡを処理したとき、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性が増加した（図３Ａ）。
【0108】
メソテリン特異的なキメラ抗原受容体をコードする遺伝子を組み換え、レンチウイルスを用いて遺伝子をＪｕｒｋａｔ細胞に伝達した。５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ メソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞において、キメラ抗原受容体発現率が、５０３（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞に比べて優れていた（図２Ｃ）。メソテリンの発現が高いと知らされたＨｅＬａ、ＯＶＣＡＲ３及びＣＡＰＡＮ１細胞とキメラ抗原受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を球培養し、本発明のメソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の活性を評価した。メソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞から、Ｔ細胞活性マーカーであるＣＤ６９が発現することを確認し、特に、ＭＳ５０１とＭＳ５０３メソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞から、ＣＤ６９が高いレベルで発現した（図３Ａ）。また、標的細胞反応によるサイトカインも分泌することを確認したが、この場合、５０１（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞において最大量のサイトカインが分泌された（図３Ｂ）。このことから、本発明のメソテリン特異的なキメラ抗原受容体を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞のうち、ＭＳ５０１メソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞５０１（２８Ｈ）２８ｚが、ＭＳ５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞に比べてより高い活性を示すことを確認した。
【0109】
本発明に係る３種のメソテリン受容体５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞のメソテリン特異的な活性を確認するために、ＭＩＡ ＰａＣａ２細胞又はＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞を、それぞれメソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞と共培養した後、活性を評価した。メソテリンを過発現させた細胞であるＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞とメソテリン受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を球培養後に、５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞において高いレベルでＣＤ６９が発現した。中でも特に、５０１（２８Ｈ）２８ｚと５０３（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞が、Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞と比較してより高いレベルでＣＤ６９を発現させた（図４Ａ）。また、サイトカイン分泌能を用いてＪｕｒｋａｔ細胞の活性を確認するために、ＩＬ－２の量をＥＬＩＳＡで評価した。５０１（２８Ｈ）２８ｚ、５０３（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞においてＩＬ－２サイトカインが分泌されることを確認し、特に、５０１（２８Ｈ）２８ｚが形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞においてより多量のＩＬ－２が分泌された（図４Ｂ）。このことから、本発明のメソテリン受容体を発現させるＪｕｒｋａｔ細胞がメソテリンに特異的に活性を示すことを確認した。
【0110】
２．４ ヒトＴ細胞でメソテリン特異的なＣＡＲの発現確認評価
５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞を５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較したとき、ＭＳＬＮ ＣＡＲ発現維持能に劣り（図２Ｃ）、標的細胞と球培養したとき、活性マーカーの発現に比べてサイトカイン分泌能が不足することを確認した（図３Ａ及び図３Ｂ）。本発明者らは、以降の実験では５０３（２８Ｈ）２８ｚを除外した。組み換えられたキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）遺伝子は、ＭＳＣＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってヒトＴ細胞で発現した。使用されたレンチウイルス量は５～１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を使用して検出した。流細胞分析により、ヒトＴ細胞でＣＡＲが８０％以上の効率で形質導入されたことが確認された（図５Ａ）。
５０３（２８Ｈ）２８ｚ形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞を５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較したとき、ＭＳＬＮ ＣＡＲ発現維持能に劣り（図２Ｃ）、標的細胞と球培養したとき、活性マーカーの発現に比べてサイトカイン分泌能が不足することを確認した（図３Ａ及び図３Ｂ）。本発明者らは、以降の実験では５０３（２８Ｈ）２８ｚを除外した。組み換えられたキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）遺伝子は、ＭＳＣＶプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってヒトＴ細胞で発現した。使用されたレンチウイルス量は５～１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を使用して検出した。流細胞分析により、ヒトＴ細胞でＣＡＲが８０％以上の効率で形質導入されたことが確認された（図５Ａ）。
【0111】
２．５ メソテリン特異的なＣＡＲを発現させるヒトＴ細胞の抗癌能力評価
本発明に係る２種のメソテリンキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）を発現させるヒトＴ細胞のメソテリン特異的な抗癌能力を評価するために、ＭＩＡ ＰａＣａ２細胞又はＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞をそれぞれ、メソテリン受容体が形質導入されたヒトＴ細胞と球培養した後、標的細胞殺害能を評価した。メソテリン受容体を発現させるヒトＴ細胞がＭＩＡ ＰａＣａ２細胞に対して殺害能を示すことはなかったが、メソテリンを発現させるＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞では殺害能が確認された（図５Ｂ）。また、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌能から、メソテリンＣＡＲが形質転換されたヒトＴ細胞の活性を確認した（図５Ｃ）。このことから、本発明のメソテリン受容体を発現させるヒトＴ細胞がメソテリン特異的に抗癌能を示すことを確認した。
本発明に係る２種のメソテリンキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）を発現させるヒトＴ細胞のメソテリン特異的な抗癌能力を評価するために、ＭＩＡ ＰａＣａ２細胞又はＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞をそれぞれ、メソテリン受容体が形質導入されたヒトＴ細胞と球培養した後、標的細胞殺害能を評価した。メソテリン受容体を発現させるヒトＴ細胞がＭＩＡ ＰａＣａ２細胞に対して殺害能を示すことはなかったが、メソテリンを発現させるＭＩＡ ＰａＣａ２－ＭＳＬＮ細胞では殺害能が確認された（図５Ｂ）。また、ＩＦＮ－γサイトカイン分泌能から、メソテリンＣＡＲが形質転換されたヒトＴ細胞の活性を確認した（図５Ｃ）。このことから、本発明のメソテリン受容体を発現させるヒトＴ細胞がメソテリン特異的に抗癌能を示すことを確認した。
【0112】
メソテリンの発現が高いと知らされたＯＶＣＡＲ３及びＣＡＰＡＮ１細胞と、本発明に係る２種のメソテリンキメラ抗原受容体（５０１（２８Ｈ）２８ｚ又はＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ）が形質導入されたヒトＴ細胞を球培養し、標的細胞殺害能を評価した。メソテリンキメラ抗原受容体を発現させるヒトＴ細胞がＯＶＣＡＲ３及びＣＡＰＡＮ１細胞に対して殺害能を有することが確認された（図５Ｂ）。
【0113】
２．６ 様々な組合せを有するメソテリン特異的なＣＡＲのスクリーニングとマウスモデルにおける癌免疫治療剤としての評価
Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質転換されたヒトＴ細胞を５０１（２８Ｈ）２８ｚヒトＴ細胞と比較したとき、メソテリンを発現させる標的細胞に対する殺害能が不足することを確認した（図５Ｄ）。本発明者らは、以降の実験ではＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚを除外した。様々な組合せを有するメソテリン特異的なＣＡＲ候補群のスクリーニングのために、さらに、ＭＳ５０１ ｓｃＦｖに基づいてキメラ抗原受容体５０１（８Ｈ）Δ、５０１（８Ｈ）ｚ、５０１（８Ｈ）ＢＢｚ、５０１（８Ｈ）２８ｚ又は５０１（２８Ｈ）２８ｚ遺伝子を組み換えた。［表１］（図６Ａ）。組み換えられたＣＡＲ遺伝子は、ＥＦ１αプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってヒトＴ細胞において発現した。使用されたレンチウイルス量は５～１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を用いて検出した。流細胞分析でＣＡＲ陽性比率を確認し、ＣＡＲ陽性細胞数を計算した。
Ｃ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚ形質転換されたヒトＴ細胞を５０１（２８Ｈ）２８ｚヒトＴ細胞と比較したとき、メソテリンを発現させる標的細胞に対する殺害能が不足することを確認した（図５Ｄ）。本発明者らは、以降の実験ではＣ２Ｇ４（２８Ｈ）２８ｚを除外した。様々な組合せを有するメソテリン特異的なＣＡＲ候補群のスクリーニングのために、さらに、ＭＳ５０１ ｓｃＦｖに基づいてキメラ抗原受容体５０１（８Ｈ）Δ、５０１（８Ｈ）ｚ、５０１（８Ｈ）ＢＢｚ、５０１（８Ｈ）２８ｚ又は５０１（２８Ｈ）２８ｚ遺伝子を組み換えた。［表１］（図６Ａ）。組み換えられたＣＡＲ遺伝子は、ＥＦ１αプロモーターを有するレンチウイルスベクターによってヒトＴ細胞において発現した。使用されたレンチウイルス量は５～１０感染倍数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）であった。各ＣＡＲは、抗Ｆ（ａｂ）２抗体を用いて検出した。流細胞分析でＣＡＲ陽性比率を確認し、ＣＡＲ陽性細胞数を計算した。
【0114】
ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞が異種移植（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）されたマウスの腫瘍サイズが２００～２５０ｍｍ３に到達した時、様々な組合せを有するメソテリン特異的なＣＡＲで形質転換されたヒトＴ細胞を腫瘍内注射し、マウスモデルにおける抗癌能力を２ヶ月間評価し、腫瘍内注射される前の腫瘍サイズに対比したサイズの増加及び減少を比率で示した（図６Ｂ）。様々な組合せを有するメソテリン特異的なキメラ抗原受容体で形質転換されたヒトＴ細胞のうち、５０１（２８Ｈ）２８ｚ構造のメソテリン特異的なキメラ抗原受容体で形質転換されたヒトＴ細胞を腫瘍内注射したとき、終了時点で腫瘍のサイズがＰＢＳ対照群に比べて２７０％減少したことを確認した。５０１（８Ｈ）２８ｚグループと比較したとき、５０１（２８Ｈ）２８ｚグループで腫瘍サイズが１５０％減少することを確認した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を最初に腫瘍内注射して２０日目に、各グループ別４匹から腫瘍組織を分離し、グループ別相対的な腫瘍組織の重さを比較した（図６Ｃ）。５０１（２８Ｈ）２８ｚグループにおいて腫瘍の重さが他のグループと比較して最も軽いことを確認し、抗癌効果に優れていることを示した。また、腫瘍内ＩＦＮ－γサイトカイン分泌能から、５０１（２８Ｈ）２８ｚで形質転換されたヒトＴ細胞の活性による抗癌効果を確認した（図６Ｄ）。メソテリン特異的なＣＡＲで形質転換されたヒトＴ細胞を腫瘍内注射し、それによる副作用を体重変化で示した（図６Ｅ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞注射後に副作用がないことを確認した。終了時点でマウスモデルの生存率を確認して示した（図６Ｆ）。ＰＢＳグループ２９％生存率；Ｍｏｃｋグループ１１％生存率；５０１（８Ｈ）Δグループ１７％生存率；５０１（８Ｈ）ｚグループは０％生存率；５０１（８Ｈ）ＢＢｚグループは３３％生存率；５０１（８Ｈ）２８ｚグループは５０％生存率を示すのに対し、５０１（２８Ｈ）２８ｚグループは１００％生存率を示した。
【0115】
上の実験結果は、本発明がメソテリン特異的な癌免疫細胞治療剤として利用可能であり、本発明のメソテリンキメラ抗原受容体のうち、ＭＳ５０１メソテリン受容体を用いたＴ細胞がより優れた抗癌効果を示すことができ、特に、５０１（２８Ｈ）２８ｚ構造を有するとき、優れた抗癌効果を示すことができるという事実を示す。。
【産業上の利用可能性】
【0116】
本発明に係るキメラ抗原受容体は、メソテリン特異的な標的効率に優れる他、発現持続率にも優れるという長所があり、また、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させるＴ細胞は、癌細胞に対する細胞毒性に優れており、癌治療のための免疫細胞治療に有用に利用可能である。
【0117】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないという点が明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されると言えよう。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【配列表】
【国際調査報告】