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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-15
(54)【発明の名称】ベータ－アレスチン突然変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220308BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220308BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20220308BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220308BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20220308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/47
C07K14/705
C12P21/02 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021543318
(86)(22)【出願日】2020-01-21
(85)【翻訳文提出日】2021-08-20
(86)【国際出願番号】 EP2020051394
(87)【国際公開番号】W WO2020152152
(87)【国際公開日】2020-07-30
(31)【優先権主張番号】19153159.9
(32)【優先日】2019-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521325662
【氏名又は名称】インターアクス バイオテック アー・ゲー
【氏名又は名称原語表記】ＩｎｔｅｒＡｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】ＰＡＲＫ ｉｎｎｏｖＡＡＲＥ， ５２３４ Ｖｉｌｌｉｇｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
(71)【出願人】
【識別番号】501494414
【氏名又は名称】パウル・シェラー・インスティトゥート
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ブノワ メジェール
(72)【発明者】
【氏名】マーティン コンラート オースターマイアー
(72)【発明者】
【氏名】マリア ヴァルトヘーア
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ ベアガー
(72)【発明者】
【氏名】ミリアム ツィマーマン
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG20
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4H045AA10
4H045BA10
4H045BA40
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、アレスチン突然変異体、特にベータ－アレスチンの突然変異体、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体、および本発明の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクターの分野に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
独立して少なくとも２つのアミノ酸が親ベータ－アレスチンと比較して突然変異した突然変異体ベータ－アレスチンであって、前記親ベータ－アレスチンが自然発生ベータ－アレスチンであり、前記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、前記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある、突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項2】
前記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して前記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している、請求項１記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項3】
前記少なくとも３つの突然変異アミノ酸の第３のアミノ酸が、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６Ａ、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択されるアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にある、請求項２記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項4】
前記親ベータ－アレスチンが自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項5】
前記親ベータ－アレスチンが、配列番号１および配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項6】
前記親ベータ－アレスチンが自然発生アレスチン－３であり、好ましくは前記自然発生アレスチン－３が自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットアレスチン－３からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項7】
前記親ベータ－アレスチンが、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から６までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項8】
前記突然変異体ベータ－アレスチンが、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項9】
独立して少なくとも２個かつ最大で４０個のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも２個かつ最大で２０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で１０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で５個のアミノ酸位置が前記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している、請求項１から８までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項10】
独立して少なくとも２個かつ最大で４個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で３個のアミノ酸位置が前記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している、請求項１から９までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項11】
前記突然変異がアミノ酸と異なるアミノ酸との交換であり、前記異なるアミノ酸がグリシン、アラニン、２－アミノ酪酸、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、ノルバリンおよびバリンからなる群から選択され、好ましくは前記異なるアミノ酸がグリシン、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはバリンである、請求項１から１０までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項12】
前記突然変異体ベータ－アレスチンが配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項13】
前記突然変異体ベータ－アレスチンが配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチン。
【請求項14】
突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体であって、好ましくは前記ＧＰＣＲがβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ）である、複合体。
【請求項15】
請求項１から１３までのいずれか１項記載の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アレスチン突然変異体、特にベータ－アレスチンの突然変異体、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体、および本発明の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクターの分野に関する。
【0002】
関連技術
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質を介した経膜シグナル伝達を媒介する膜受容体のファミリーである。刺激に応答して、ＧＰＣＲがＧタンパク質を活性化してセカンドメッセンジャーの生成を調節し、これが続いて下流のシグナル伝達エフェクターを調整する。シグナル伝達応答を止めるには、ＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）が動員されてＧＰＣＲをリン酸化し、アレスチンが結合するようにする。アレスチン結合は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達を遮断し、受容体を内在化経路に指向することができる。ＧＰＣＲに結合することで、アレスチンはＧＰＣＲシグナル伝達ネットワークを組織化する足場としても働く（Zhou et al., 2017, Identification of Phosphorylation Codes for Arrestin Recruitment by G Protein-Coupled Receptors, Cell 170, pp. 457-469）。ＧＰＣＲ－アレスチン複合体の独特な立体配座がＧＰＣＲと相互作用してＧタンパク質を脱感作し、受容体エンドサイトーシスを媒介することが提唱されている（Cahill et al., Distinct conformations of GPCR-β-arrestin complexes mediate desensitization, signaling, and endocytosis, PNAS 114(10), pp. 2562-2567）。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質を介した経膜シグナル伝達を媒介する膜受容体のファミリーである。刺激に応答して、ＧＰＣＲがＧタンパク質を活性化してセカンドメッセンジャーの生成を調節し、これが続いて下流のシグナル伝達エフェクターを調整する。シグナル伝達応答を止めるには、ＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）が動員されてＧＰＣＲをリン酸化し、アレスチンが結合するようにする。アレスチン結合は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達を遮断し、受容体を内在化経路に指向することができる。ＧＰＣＲに結合することで、アレスチンはＧＰＣＲシグナル伝達ネットワークを組織化する足場としても働く（Zhou et al., 2017, Identification of Phosphorylation Codes for Arrestin Recruitment by G Protein-Coupled Receptors, Cell 170, pp. 457-469）。ＧＰＣＲ－アレスチン複合体の独特な立体配座がＧＰＣＲと相互作用してＧタンパク質を脱感作し、受容体エンドサイトーシスを媒介することが提唱されている（Cahill et al., Distinct conformations of GPCR-β-arrestin complexes mediate desensitization, signaling, and endocytosis, PNAS 114(10), pp. 2562-2567）。
【0003】
アレスチンは、視覚アレスチン、Ｓ抗原または４８ｋＤａタンパク質とも呼ばれるアレスチン－１；β－アレスチン１とも呼ばれるアレスチン－２；β－アレスチン２とも呼ばれるアレスチン－３；および錐体アレスチンまたはＸ－アレスチンとも呼ばれるアレスチン－４等の幾つかのサブタイプを含む小さなタンパク質ファミリーを形成する。アレスチン－１は、最初に発見されたアレスチンであり、光情報伝達におけるその極めて重要な役割から視覚アレスチンと名付けられた。β－アレスチン（ベータ－アレスチン）は、β－アレスチン１（ＡＲＲＢ１遺伝子によってコードされる）およびβ－アレスチン２（ＡＲＲＢ２遺伝子によってコードされる）と称される２つの異なるアイソフォームとして存在する細胞質アダプタータンパク質である。近年、α－アレスチンと称されるアレスチンの別のサブタイプが同定された。α－アレスチンは、それらの視覚／錐体およびβ－アレスチン対応物と構造的に類似しており、脂肪分解および肥満の発症機序を調節することが提唱されている（Ahmadzai et al., Canonical and Noncanonical Signaling Roles of β-Arrestins in Inflammation and Immunity, Advances in Immunology 136, pp. 279-313）。
【0004】
Potter et al., 2002 (Arrestin Variants Display Differential Binding Characteristics for the Phosphorylated N-Formyl Peptide Receptor Carboxyl Terminus, J Biol Chem 277(11), pp. 8970-8978, 2002)では、アレスチンファミリーの様々なメンバーとＧＰＣＲ受容体ファミリーのメンバーであるホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）との相互作用が調べられた。アレスチン－２およびアレスチン－３は、ＦＰＲカルボキシル末端ペプチドにリン酸化依存的に結合したが、アレスチン－１は結合しなかった。切断型アレスチン－２（１～３８２）およびアレスチン－３（１～３９３）は、無傷受容体へのリン酸化非依存的な結合を示す。アレスチン－２の２つの付加的な突然変異体をＦＰＲカルボキシル末端へのそれらの結合親和性について評価した。単一点突然変異体であるアレスチン－２ Ｒ１６９Ｅは、ＦＰＲカルボキシル末端への結合について完全長アレスチンと同様の親和性を示したが、三重点突然変異体であるアレスチン－２ Ｉ３８６Ａ／Ｖ３８７Ａ／Ｆ３８８Ａは、より切断型のアレスチンに近い親和性を示した。
【0005】
発明の概要
本発明者らは、細胞ベースの生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイにおいて実証されるように、ＧＰＣＲ、特にβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ）へのリガンドの動員の増大を示すベータ－アレスチン突然変異体を設計した。野生型（ＷＴ）アレスチン－３と比較して、本発明のアレスチン－３突然変異体による動員は、最大で３０％増大する。
本発明者らは、細胞ベースの生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイにおいて実証されるように、ＧＰＣＲ、特にβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ）へのリガンドの動員の増大を示すベータ－アレスチン突然変異体を設計した。野生型（ＷＴ）アレスチン－３と比較して、本発明のアレスチン－３突然変異体による動員は、最大で３０％増大する。
【0006】
さらに、本発明のベータ－アレスチン突然変異体はバイオセンサーとして機能し、ＷＴベータ－アレスチン突然変異体と比較してより高感度に細胞中のβ２ＡＲイソプロテレノール活性化立体配座を検知することが可能である。本発明のベータ－アレスチン突然変異体、特にアレスチン－３突然変異体は、ＷＴアレスチン－３と比較して細胞中のより少量の活性化受容体を認識することができ（より高い効力）、最高濃度のβ２ＡＲアゴニストを用いた場合に検出される最大シグナルの３０％までの増大を示す（より高い有効性）。
【0007】
加えて、ＧＰＣＲに対する本発明のベータ－アレスチン突然変異体の相対反応性を比較することで、種々の立体配座状態をＢＲＥＴアッセイにおいて区別することができる。ＢＲＥＴアッセイは、アレスチン動員の反応速度測定を可能にし、ＧＰＣＲ立体配座が平衡によって遷移することから、本発明のベータ－アレスチン突然変異体は、かかる変化のモニタリングに適している。アレスチンを刺激後のＧＰＣＲのリン酸化カルボキシ末端により低感度にすることで、特に配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置での突然変異による本発明のベータ－アレスチン突然変異体は、受容体のリン酸化非依存的立体配座を検知することも可能にする。
【0008】
さらに、本発明のベータ－アレスチン突然変異体の細胞における発現レベルを、（例えば融合緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポータータンパク質を用いて）モニタリングした。
【0009】
ヒトＨＥＫ２９３細胞におけるアレスチン－３突然変異体の一貫したより低い発現（ＷＴアレスチン－３と比較して２６％～５５％の範囲）にも拘らず、β２ＡＲへのより強い動員が依然として観察された。この点を考慮に入れて、本発明者らは、本発明のアレスチン－３突然変異体のタンパク質間相互作用の実際の強度は、ＢＲＥＴアッセイによって与えられる実験値を超えるはずであると予測する。
【0010】
このため、第１の態様では、本発明は、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親ベータ－アレスチンと比較して突然変異した突然変異体ベータ－アレスチンであって、上記親ベータ－アレスチンが自然発生ベータ－アレスチンであり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある、突然変異体ベータ－アレスチンを提供する。
【0011】
更なる態様では、本発明は、突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体であって、好ましくは上記ＧＰＣＲがβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ）である、複合体を提供する。
【0012】
更なる態様では、本発明は、本発明のベータ－アレスチンをコードするベクターを提供する。
【0013】
更なる態様では、本発明は、上記複合体または上記複合体の上記ＧＰＣＲの構造の解明のための本発明の突然変異体ベータ－アレスチンまたは本発明の複合体の使用を提供する。
【0014】
更なる態様では、本発明は、薬物スクリーニングのための本発明の突然変異体ベータ－アレスチンまたは本発明の複合体の使用であって、ＧＰＣＲへのアレスチン－３突然変異体の動員を測定する、使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に基づくＢ２ＡＲへのアレスチン－３突然変異体の古典的アレスチン動員アッセイを行い、新規のアレスチン－３突然変異体の動員効率を比較した。β２ＡＲへの野生型アレスチン－３ならびにアレスチン－３突然変異体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのイソプロテレノール誘導性動員の濃度応答曲線を示す。
【図2】オンラインツールＰｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔｐアルゴリズム（マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、条件付き組成スコアマトリックス調整（conditional compositional score matrix adjustment）、米国国立生物工学情報センター）を用いた野生型アレスチン－３（Ｑｕｅｒｙ）とＴ２９９Ａ、Ｉ３８６ＡおよびＲ１６６Ａを有する三重突然変異体Ｂ（Ｓｂｊｃｔ）とのタンパク質配列アラインメントを示す図である。突然変異Ｒ１６６Ａ、Ｔ２９９ＡおよびＩ３８６Ａは空白によって表される。この表示では開始コドン（ＡＴＧ、メチオニン）が除かれていることから、アミノ酸番号が１アミノ酸ずれる。
【図3】ヒト野生型アレスチン－３（ＡＲＲＢ２＿ＨＵＭＡＮ）とマウス、ラットおよびウシ相同アレスチン－３タンパク質との配列アラインメントを示す図である。濃い灰色：同一の残基；薄い灰色：側鎖の極性およびサイズの点で類似した残基；強調表示なし：異なる残基；「－」：他の配列への挿入。全体として非常に高い相同性（９１．９２％）が３８７個の同一の残基、１５個の類似した残基および７個の異なる残基で全配列において見られた。分析は、Soeding, J. el al., Protein homology detection be HMM-HMM comparison, Bioinformatics 21, pp. 951-960に記載されるようにデフォルトの遷移マトリックスＧｏｎｎｅｔおよびＨＨａｌｉｇｎアルゴリズムを用いるプログラムｃｌｕｓｔａｌ－ｏｍｅｇａによってそのデフォルト設定で行った。
【図4】２つのアイソフォームアレスチン－２（ＡＲＲＢ２＿ＨＵＭＡＮ）およびアレスチン－３（ＡＲＲＢ１＿ＨＵＭＡＮ）のアラインメントを示す図である。濃い灰色：同一の残基；薄い灰色：側鎖の極性およびサイズの点で類似した残基；強調表示なし：異なる残基；「－」：他の配列への挿入。全体として７３．４７％の相同性が３１３個の同一の残基、６３個の類似した残基および３３個の異なる残基で全配列において見られた。分析は、Soeding, J. el al., Protein homology detection be HMM-HMM comparison, Bioinformatics 21, pp. 951-960に記載されるようにデフォルトの遷移マトリックスＧｏｎｎｅｔおよびＨＨａｌｉｇｎアルゴリズムを用いるプログラムｃｌｕｓｔａｌ－ｏｍｅｇａによってそのデフォルト設定で行った。
【0016】
発明の詳細な説明
他に規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
他に規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0017】
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語または「含む（include）」という語、ならびに「含む（comprises/includes）」および「含んでいる（comprising/including）」等の変化形は、要素、規定の整数、工程またはそれらの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、規定の整数、工程またはそれらの群を除外することを意味しないと理解されるものとする。
【0018】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかに他の指定がない限り、複数の指示対象を含む。
【0019】
「約」または「およそ」という用語は、数値に関連して使用される場合、指定の数値より０～１０％小さい下限を有し、指定の数値より０～１０％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することが意図される。「約」または「およそ」という用語は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±３％または最も好ましくは±０％（それぞれ所与の数値を指す）を意味する。本発明の実施形態のそれぞれにおいて、「約」が削除されている場合がある。本明細書で開示される値の全範囲が、範囲を規定する値を含む、上記範囲内に含まれるあらゆる値を指し、含むものとする。
【0020】
「自然発生」という用語は、本明細書で使用される場合、全体またはその一部が合成ではなく、天然に存在するまたは産生されることを意味する天然起源の配列を指す。より好ましくは、「自然発生」という用語は、本明細書で使用される場合、配列全体が合成ではなく、天然に存在するまたは産生されることを意味する天然起源の配列を指す。
【0021】
「ベータ－アレスチン」という用語は、好ましくはアレスチン－２（β－アレスチン１）およびアレスチン－３（β－アレスチン２）を含む。より好ましくは、「ベータ－アレスチン」という用語は、アレスチン－２およびアレスチン－３のみを指す。「ベータ－アレスチン」という用語は、完全なおよび切断型のベータ－アレスチンを含む。典型的にかつ好ましくは、アレスチン－２およびアレスチン－３という用語は、古典的配列を指す。
【0022】
「突然変異した」、「突然変異」および「突然変異体」という用語は、本明細書で区別なく使用される。典型的にかつ好ましくは、上記突然変異アミノ酸または突然変異は、１つのアミノ酸と１つ以上のアミノ酸との交換、挿入、欠失またはそれらの組合せである。最も好ましくは、上記突然変異アミノ酸または突然変異は、単一アミノ酸と異なる単一アミノ酸との交換である。
【0023】
突然変異したまたは突然変異体ベータ－アレスチンは、親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは、典型的にかつ好ましくは自然発生ベータ－アレスチンである。突然変異したまたは突然変異体アレスチン－３は、親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは、典型的にかつ好ましくは自然発生アレスチン－３である。
【0024】
アレスチン－３のアミノ酸位置は、本明細書で、好ましくは構造アラインメントによってヒトアレスチン－３（配列番号１）に対してアラインメント（またはマッピング）される。本明細書で使用される場合、「対応するアミノ酸残基」または「にアミノ酸位置が対応する」という表現は、配列番号１のヒトアレスチン－３中の所与のアミノ酸残基に対してアラインメントされるベータ－アレスチン中のアミノ酸残基を指す。典型的にかつ好ましくは、構造アラインメントを、Schroedinger, LLCのソフトウェアであるＰｙＭＯＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０組み込みアラインメントアルゴリズムを用いて行う。典型的にかつ好ましくは、アラインメントは構造アラインメントである。ウシアレスチン－３に基づくかかるアラインメントの一例は、Zhan, X. et al,, 2011 (“Crystal Structure of Arrestin-3 Reveals the Basis of the Difference in Receptor Binding Between Two Non-visual Subtypes”, J. Mol. Biol. 406(3), pp. 467-478)（Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ）に説明され、本願の図２、図３および図４にも示される。典型的にかつ好ましくは、アラインメントは、標準アルゴリズムパラメーターを用いたタンパク質間ＢＬＡＳＴを用いて行われる。好ましい標準パラメーターは、閾値１０、ワードサイズ３、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコストＥｘｉｓｔｅｎｃｅ １１／Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １、条件付き組成スコアマトリックス調整、フィルターおよびマスキングなしである。
【0025】
「Ｇタンパク質共役受容体」という用語（ＧＰＣＲ）は、典型的にかつ好ましくは、クラスＡ（または１）（ロドプシン様）、クラスＢ（または２）（セクレチン受容体ファミリー）、クラスＣ（または３）（代謝型グルタミン酸／フェロモン）、クラスＤ（または４）（真菌接合フェロモン受容体）、クラスＥ（または５）（サイクリックＡＭＰ受容体）、クラスＦ（または６）（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）の受容体を指す。より好ましくは、ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。より好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。上記アドレナリン受容体は、典型的にかつ好ましくは、アルファ１Ａ（ＡＤＲＡ１Ａ、Ａ１ＡＡ）、アルファ１Ｂ（ＡＤＲＡ１Ｂ、Ａ１ＡＢ）、アルファ１Ｄ（ＡＤＲＡ１Ｄ、Ａ１ＡＤ）、アルファ２Ａ（ＡＤＲＡ２Ａ、Ａ２ＡＡ）、アルファ２Ｂ（ＡＤＲＡ２Ｂ、Ａ２ＡＢ）、アルファ２Ｃ（ＡＤＲＡ２Ｃ、Ａ２ＡＣ）、ベータ１（ＡＤＲＢ１、Ｂ１ＡＲ）、ベータ２（ＡＤＲＢ２、Ｂ２ＡＲ）、ベータ３（ＡＤＲＢ３、Ｂ３ＡＲ）を含む。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0026】
第１の態様では、本発明は、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親ベータ－アレスチンと比較して突然変異した突然変異体ベータ－アレスチンであって、上記親ベータ－アレスチンが自然発生ベータ－アレスチンであり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある、突然変異体ベータ－アレスチンに言及する。
【0027】
好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３である。好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットアレスチン－３からなる群から選択される。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１もしくは配列番号７～９のいずれか１つ、または配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0028】
好ましくは、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親アレスチン－３と比較して突然変異した突然変異体アレスチン－３であり、ここで、上記親アレスチン－３は自然発生アレスチン－３であり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある。より好ましくは、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親アレスチン－３と比較して突然変異した突然変異体アレスチン－３であり、ここで、上記親アレスチン－３は自然発生アレスチン－３であり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある。
【0029】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンであり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあり、任意に、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、第３のアミノ酸位置でアミノ酸が突然変異している。好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がさらにより好ましい。
【0030】
より好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、独立して少なくとも２つのアミノ酸が親アレスチン－３と比較して突然変異した突然変異体アレスチン－３であり、好ましくは、上記親アレスチン－３は自然発生アレスチン－３であり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第１のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記少なくとも２つの突然変異アミノ酸の第２のアミノ酸が配列番号１のヒトアレスチン－３中のＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあり、任意に、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、第３のアミノ酸位置でアミノ酸が突然変異している。好ましくは、上記親アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。より好ましくは、上記親アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がより好ましい。
【0031】
好ましくは、上記の任意の第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の位置Ｒ１６６、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択される。より好ましくは、上記の任意の第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６またはＤ２９８である。さらにより好ましくは、上記の任意の第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６である。
【0032】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。上記親ベータ－アレスチンは、好ましくは配列番号１のいずれか１つまたは配列番号６～１２のいずれか１つのものである。別の好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0033】
好ましい実施形態では、上記少なくとも３つの突然変異アミノ酸の第３のアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６Ａ、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択されるアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にある。好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0034】
好ましい実施形態では、上記少なくとも３つの突然変異アミノ酸の第３のアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６Ａ、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択されるアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0035】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸が、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がさらにより好ましい。
【0036】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。より好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体であり、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記ベータ－アレスチンは配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0037】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の位置Ｒ１６６、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択される。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0038】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６に相当するアミノ酸位置にあり、上記第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の位置Ｒ１６６、Ｄ２９８およびＲ３９３からなる群から選択され、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。より好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0039】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にあり、上記第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６またはＤ２９８である。別の好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ１６６に相当するアミノ酸位置にある。別の好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＤ２９８に相当するアミノ酸位置にある。別の好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0040】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にあり、上記第３のアミノ酸位置は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中のＲ１６６またはＤ２９８であり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。別の好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ１６６に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。別の好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＤ２９８に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。別の好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ３９３に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３突然変異体である。より好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0041】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも４つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも４つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、第３のアミノ酸位置のＲ１６６、Ｄ２９８またはＲ３９３、および第４のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0042】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも４つのアミノ酸が独立して親アレスチン－３と比較して突然変異しており、上記少なくとも４つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、第３のアミノ酸位置のＲ１６６、Ｄ２９８またはＲ３９３、および第４のアミノ酸位置に相当するアミノ酸位置にあり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３である。より好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0043】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも２つのアミノ酸が独立して、自然発生ベータ－アレスチンである親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある（二重突然変異体Ｔ２９９＋Ｉ３８６）。好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは好ましくは自然発生アレスチン－３であり、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にある（二重突然変異体Ｔ２９９＋Ｉ３８６）。
【0044】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置のＲ１６６、Ｄ２９８またはＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置のＲ１６６、Ｄ２９８またはＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0045】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置のＲ１６６またはＤ２９８に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置のＲ１６６またはＤ２９８に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0046】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ１６６に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ１６６に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0047】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＤ２９８に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＤ２９８に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0048】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
－少なくとも２つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも２つのアミノ酸は、配列番号１のヒトアレスチン－３中のＩ３８６およびＴ２９９に相当するアミノ酸位置にあるか、または
－少なくとも３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチン、好ましくは自然発生ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６および第３のアミノ酸位置のＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0049】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも３つのアミノ酸が独立して、自然発生ベータ－アレスチンである親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記少なくとも３つのアミノ酸は、それぞれ配列番号１のヒトアレスチン－３中の第１のアミノ酸位置のＴ２９９、第２のアミノ酸位置のＩ３８６、および第３のアミノ酸位置のＲ１６６、Ｄ２９８またはＲ３９３に相当するアミノ酸位置にある。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0050】
好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチン、または上記自然発生ベータ－アレスチンのいずれか１つと８０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは、自然発生ヒトベータ－アレスチンまたは自然発生ヒトベータ－アレスチンと８０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である。またさらに好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒトベータ－アレスチンである。別の好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３、または上記自然発生アレスチン－３のいずれか１つと８０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、自然発生ヒトベータ－アレスチンまたは自然発生ヒトベータ－アレスチンと８０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質である。またさらに好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は自然発生ヒトベータ－アレスチンである。好ましくは、上記自然発生ベータ－アレスチンまたはアレスチン－３のいずれか１つと８０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有する上記タンパク質は、ＧＰＣＲに対してリガンド結合能を保持する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはβ２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0051】
更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットベータ－アレスチンと比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、ヒトアレスチンがより好ましい。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットアレスチン－３と比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、ヒトアレスチンがより好ましい。
【0052】
更なる好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは、自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットベータ－アレスチンと比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記突然変異体アレスチン－３は、自然発生ヒト、ウシ、マウスまたはラットアレスチン－３と比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、ヒトアレスチン－３がより好ましい。
【0053】
別の好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。本発明の更なる好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは突然変異体アレスチン－３であり、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３である。本発明の更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、上記ベータ－アレスチンはアレスチン－３であり、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチン－３がより好ましい。
【0054】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１のいずれか１つまたは配列番号６～１２のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有する。別の好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１のいずれか１つまたは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有する。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、上記突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１のいずれか１つまたは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0055】
好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１もしくは配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号６～１２のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、配列番号１もしくは配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１のいずれか１つまたは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１、または配列番号１と８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、配列番号１もしくは配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号７～９のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有する上記アミノ酸配列、または配列番号１のいずれか１つもしくは配列番号６～１２のいずれか１つと８０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列は、ＧＰＣＲに対するリガンド結合能を保持する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0056】
更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列と比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、配列番号１または６がより好ましい。更なる好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列と比較した場合に８０％～１００％、より好ましくは８５％～１００％、さらにより好ましくは９０％～１００％、さらにより好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であり、配列番号１がより好ましい。
【0057】
好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記親ベータ－アレスチンは親アレスチン－３であり、上記親アレスチン－３は、配列番号１または配列番号７～９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0058】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、少なくとも２個かつ最大で８０個のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも２個かつ最大で４０個のアミノ酸位置、さらに好ましくは少なくとも２個かつ最大で２０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で１０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で５個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で４個のアミノ酸位置、最も好ましくは少なくとも２個かつ最大で３個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。
【0059】
好ましい実施形態では、少なくとも２個かつ最大で４０個のアミノ酸位置、さらに好ましくは少なくとも２個かつ最大で２０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で１０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で５個のアミノ酸位置が、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。上記親ベータ－アレスチンは自然発生ベータ－アレスチンである。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0060】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは突然変異体アレスチン－３であり、少なくとも２個かつ最大で８０個のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも２個かつ最大で４０個のアミノ酸位置、さらに好ましくは少なくとも２個かつ最大で２０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で１０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で５個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で４個のアミノ酸位置、最も好ましくは少なくとも２個かつ最大で３個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３である。好ましい実施形態では、少なくとも２個かつ最大で４０個のアミノ酸位置、さらに好ましくは少なくとも２個かつ最大で２０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で１０個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で５個のアミノ酸位置が、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は、配列番号１または７～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0061】
更なる好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立して少なくとも２個かつ最大で４個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で３個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。更なる好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立して少なくとも２個かつ最大で４個のアミノ酸位置、さらにより好ましくは少なくとも２個かつ最大で３個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は、配列番号１または７～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0062】
更なる好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、ちょうど２つまたはちょうど３つのアミノ酸が独立して上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。更なる好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立してちょうど４個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。さらに非常に好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立してちょうど２個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。さらに非常に好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、独立してちょうど３個のアミノ酸位置が上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。より好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットベータ－アレスチンからなる群から選択され、ヒトベータ－アレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記親ベータ－アレスチンは、配列番号１または配列番号６～１２のいずれか１つからなる群から選択され、配列番号１または６がより好ましい。
【0063】
更なる好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンにおいて、ちょうど２つまたはちょうど３つのアミノ酸が独立して親ベータ－アレスチンと比較して突然変異しており、上記親ベータ－アレスチンは自然発生アレスチン－３であり、好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は、配列番号１または７～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。更なる好ましい実施形態では、上記の本発明のベータ－アレスチン突然変異体において、独立してちょうど４個のアミノ酸位置が、自然発生アレスチン－３である上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。さらに非常に好ましい実施形態では、上記の本発明のベータ－アレスチン突然変異体において、独立してちょうど２個のアミノ酸位置が、自然発生アレスチン－３である上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。さらに非常に好ましい実施形態では、上記の本発明のベータ－アレスチン突然変異体において、独立してちょうど３個のアミノ酸位置が、自然発生アレスチン－３である上記親ベータ－アレスチンと比較して突然変異している。より好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は自然発生ヒト、ウシ、マウスおよびラットアレスチン－３からなる群から選択され、ヒトアレスチンがより好ましい。さらにより好ましくは、上記自然発生アレスチン－３は配列番号１、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択され、配列番号１がさらにより好ましい。
【0064】
好ましい実施形態では、上記突然変異アミノ酸または突然変異は、単一アミノ酸と異なる単一アミノ酸との交換であり、上記異なるアミノ酸はグリシン、アラニン、２－アミノ酪酸、２－アミノヘプタン酸、ｔｅｒｔロイシン、ジエチルアラニン、ホモロイシン、３－メチル－ｌ－アロイソロイシン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、バリン、ビニルグリシンおよび２－アリル－グリシンからなる群から選択される。より好ましくは、上記異なるアミノ酸はグリシン、アラニン、２－アミノ酪酸、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、ノルバリンおよびバリンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、上記異なるアミノ酸はグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンである。またさらにより好ましくは、上記異なるアミノ酸はアラニンである。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基が既にアラニンである場合、これがグリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンに置き換えられることが好ましい。
【0065】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％、より好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0066】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択される配列を有する。
【0067】
好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれか１つと８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％、より好ましくは９５％～１００％、さらにより好ましくは９９％～１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0068】
より好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列を有する。
【0069】
好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号２または配列番号４の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号２の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号３の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号４の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号５の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１３の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１４の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１５の配列を有する。好ましい実施形態では、上記の本発明の突然変異体ベータ－アレスチンは、配列番号１６の配列を有する。
【0070】
更なる態様では、当該発明は、本発明のベータ－アレスチン突然変異体を含む組成物に関する。
【0071】
更なる態様では、当該発明は、突然変異体ベータ－アレスチンおよびＧＰＣＲの組合せに関する。
【0072】
好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0073】
更なる態様では、当該発明は、突然変異体ベータ－アレスチンおよびＧＰＣＲの組合せを含む組成物に関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。上記組合せにおいて、上記突然変異体ベータ－アレスチンおよび上記ＧＰＣＲは、互いに結合していなくても、または互いに結合していてもよい。突然変異体ベータ－アレスチンおよびＧＰＣＲの組合せを含む上記組成物では、上記突然変異体ベータ－アレスチンおよび上記ＧＰＣＲは、互いに結合していなくても、互いに結合していても、または互いに部分的に結合し、かつ部分的に結合していなくてもよい。
【0074】
更なる態様では、当該発明は、突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体に関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0075】
更なる態様では、当該発明は、突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体を含む組成物に関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。複合体において、上記突然変異体ベータ－アレスチンおよび上記ＧＰＣＲは互いに結合している。
【0076】
更なる態様では、当該発明は、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクターに関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0077】
更なる態様では、当該発明は、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクターを含む組成物に関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0078】
更なる態様では、当該発明は、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンおよび本発明の突然変異体ベータ－アレスチンをコードするベクターを含む組成物に関する。
【0079】
更なる態様では、本発明は、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲと本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとの複合体の構造の解明のための本発明の突然変異体ベータ－アレスチンまたは本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体の使用に関する。好ましくは、上記ＧＰＣＲはロドプシン様受容体、より好ましくはサブファミリーＡ１７のロドプシン様受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはアドレナリン受容体である。さらにより好ましくは、上記ＧＰＣＲはベータ－２アドレナリン受容体である。好ましくは、上記ベータ－２アドレナリン受容体は古典的自然発生ヒト、マウス、ラットまたはウシベータ－２アドレナリン受容体である。
【0080】
本発明のベータ－アレスチン突然変異体は、ＧＰＣＲと上記ベータ－アレスチン突然変異体との複合体を安定させる。好ましい実施形態では、上記ベータ－アレスチン突然変異体は、ＧＰＣＲをリガンド誘導活性化状態に安定させる。ＧＰＣＲと本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとの複合体は、例えばタンパク質結晶化または他の手段によるＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ－アレスチン複合体の構造の解明に適した特性を有する。好ましい実施形態では、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲとベータ－アレスチン突然変異体との複合体の解明された構造が、コンピューターによる薬物候補の設計およびスクリーニングに用いられる。
【0081】
更なる態様では、本発明は、薬物スクリーニング、好ましくはコンピューターによる薬物スクリーニングのための本発明の突然変異体ベータ－アレスチンまたは本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体の使用に関する。好ましい実施形態では、上記ＧＰＣＲはβ２ＡＲである。好ましい実施形態では、本発明の突然変異体ベータ－アレスチンとＧＰＣＲとの複合体は、本発明のベータ－アレスチン突然変異体によって安定する。好ましくは、上記の本発明のベータ－アレスチン突然変異体は、ＧＰＣＲをリガンド誘導活性化状態に安定させることが可能である。ＧＰＣＲのかかる活性状態は、β２ＡＲによって例示的に示される（Rasmussen et al., Structure of a Nanobody-Stabilized Active State of the Beta2-Adrenoceptor, Nature, 2011、Rasmussen et al., Crystal Structure of the Beta2-Adrenergic Receptor-Gs Protein Complex, Nature, 2011）。かかる安定化ＧＰＣＲ／突然変異体ベータ－アレスチン複合体は、無細胞および細胞ベースのアッセイにおいて薬物スクリーニングに用いられる。好ましい実施形態では、薬物スクリーニングは、無細胞および細胞ベースのアッセイに基づく。上記の本発明のベータ－アレスチン突然変異体は、ＢＲＥＴアッセイにおいて明らかなようにＧＰＣＲ、好ましくはβ２ＡＲへのベータ－アレスチン動員の有効性および効力を増大させることが可能である（実施例１、表１）。動員値の増大は、特にアレスチンを本質的に低効率で動員し、低いシグナル対ノイズ比をもたらすＧＰＣＲ型についてシグナル対ノイズ比を増大させるために、細胞ベースおよび無細胞のアレスチン動員アッセイにおいて有用であり得る。好ましい実施形態では、ＧＰＣＲへの本発明のベータ－アレスチン突然変異体の動員の効率を測定する。
【0082】
配列
配列番号１：ヒト野生型（ｗｔ）アレスチン－３
【化1】
【0083】
【化2】
【0084】
【化3】
【0085】
【化4】
【0086】
【化5】
【0087】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【0088】
【化14】
【0089】
【化15】
【0090】
【化16】
【0091】
【表1】
【0092】
実施例
実施例１－生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイにおけるβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ、Ｂ２ＡＲ）への野生型アレスチン－３ならびにアレスチン－３二重および三重突然変異体の動員
材料および方法：
位置Ｒ１６６Ａ、Ｄ２９８およびＲ３９３のＨＥ細胞を、ポリ－Ｌ－リジンコーティング白色９６ウェルプレートに１ウェル当たり約２５０００細胞の密度で播種した。２４時間後に、細胞をＢＲＥＴドナー構築物（９０ｎｇ／ウェルのＲＬｕｃ８β２ＡＲ）および１０ｎｇのＢＲＥＴアクセプター構築物（１０ｎｇ／ウェルのＧＦＰ－アレスチン－３ ＷＴまたは突然変異体Ａ、Ｂ、ＣもしくはＤ）でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ThermoFisher）を用いて一過性にコトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日に、細胞培養培地を新鮮培地と交換した。さらに２４時間後に、細胞培養培地をアッセイバッファー（ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＢＲＥＴドナーＲＬｕｃ８によって触媒され、発光（λｍａｘ＝４１０ｎｍ）を生じる５ｍＭの細胞透過性基質Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ４００Ａ（Cayman Chemical）で細胞を処理した。ＢＲＥＴ測定は、光モジュール（ＢＲＥＴ２ ｐｌｕｓ、５１５～３０、４１０～８０）を備えるプレートリーダーＰｈｅｒａＳｔａｒ ＦＳＸ（BMG Biotech）において行った。ｔ＝４．５分で、イソプロテレノール（Tocris Bioscience）を漸増濃度で細胞に添加した（１０ｐＭ～１０μＭ）。ＢＲＥＴ比は、Ｒｌｕｃ８／Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ４００Ａによって放出される光強度（４１０ｎｍ）に対するＧＦＰによって放出される光強度（５１５ｎｍ）の比率を算出することで決定した。ＢＲＥＴ比ベースライン（イソプロテレノール刺激前）を減算し、曲線下面積（ＡＵＣ）（１９．５分のイソプロテレノール刺激）を算出し、イソプロテレノール濃度に対してプロットした。ＢＲＥＴシグナルをＧＦＰ－アレスチン－３ ＷＴ（１００％に設定）に対する動員のパーセントとして表し、効力（ｐＥＣ５０±ＳＤ）および有効性（Ｅｍａｘ±ＳＤ）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（San Diego，California，USA）において非線形回帰から算出した。最大有効性（Ｅｍａｘ）を全ての突然変異体についてそれらのそれぞれのＷＴアレスチン－３の１０μＭイソプロテレノール条件（１００％に設定）に対して正規化した。決定係数Ｒ２は０～１の範囲とすることができ、実験値（印、図１）と非線形回帰分析（曲線、図１）との間のフィッティングの品質を表す。実験は２回の独立実験において技術的反復で行った。
実施例１－生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイにおけるβ２－アドレナリン受容体（β２ＡＲ、Ｂ２ＡＲ）への野生型アレスチン－３ならびにアレスチン－３二重および三重突然変異体の動員
材料および方法：
位置Ｒ１６６Ａ、Ｄ２９８およびＲ３９３のＨＥ細胞を、ポリ－Ｌ－リジンコーティング白色９６ウェルプレートに１ウェル当たり約２５０００細胞の密度で播種した。２４時間後に、細胞をＢＲＥＴドナー構築物（９０ｎｇ／ウェルのＲＬｕｃ８β２ＡＲ）および１０ｎｇのＢＲＥＴアクセプター構築物（１０ｎｇ／ウェルのＧＦＰ－アレスチン－３ ＷＴまたは突然変異体Ａ、Ｂ、ＣもしくはＤ）でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ThermoFisher）を用いて一過性にコトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日に、細胞培養培地を新鮮培地と交換した。さらに２４時間後に、細胞培養培地をアッセイバッファー（ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＢＲＥＴドナーＲＬｕｃ８によって触媒され、発光（λｍａｘ＝４１０ｎｍ）を生じる５ｍＭの細胞透過性基質Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ４００Ａ（Cayman Chemical）で細胞を処理した。ＢＲＥＴ測定は、光モジュール（ＢＲＥＴ２ ｐｌｕｓ、５１５～３０、４１０～８０）を備えるプレートリーダーＰｈｅｒａＳｔａｒ ＦＳＸ（BMG Biotech）において行った。ｔ＝４．５分で、イソプロテレノール（Tocris Bioscience）を漸増濃度で細胞に添加した（１０ｐＭ～１０μＭ）。ＢＲＥＴ比は、Ｒｌｕｃ８／Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ４００Ａによって放出される光強度（４１０ｎｍ）に対するＧＦＰによって放出される光強度（５１５ｎｍ）の比率を算出することで決定した。ＢＲＥＴ比ベースライン（イソプロテレノール刺激前）を減算し、曲線下面積（ＡＵＣ）（１９．５分のイソプロテレノール刺激）を算出し、イソプロテレノール濃度に対してプロットした。ＢＲＥＴシグナルをＧＦＰ－アレスチン－３ ＷＴ（１００％に設定）に対する動員のパーセントとして表し、効力（ｐＥＣ５０±ＳＤ）および有効性（Ｅｍａｘ±ＳＤ）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（San Diego，California，USA）において非線形回帰から算出した。最大有効性（Ｅｍａｘ）を全ての突然変異体についてそれらのそれぞれのＷＴアレスチン－３の１０μＭイソプロテレノール条件（１００％に設定）に対して正規化した。決定係数Ｒ２は０～１の範囲とすることができ、実験値（印、図１）と非線形回帰分析（曲線、図１）との間のフィッティングの品質を表す。実験は２回の独立実験において技術的反復で行った。
【0093】
結果：
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に基づくアレスチン動員アッセイを行い、Ｂ２ＡＲに対するアレスチン－３二重および三重突然変異体と野生型アレスチン－３との動員効率を比較した。それぞれのアレスチンのイソプロテレノール誘導性動員の濃度応答曲線を図１に示す。二重突然変異体Ａ（黒の三角）、三重突然変異体Ｂ（白抜きの丸）およびＣ（黒塗りのひし形）は全て、非修飾アレスチン－３（野生型アレスチン－３、半分黒の四角）と比較してＢ２ＡＲへの動員有効性の増大を示す。さらに、試験した突然変異体は、非修飾アレスチン－３よりも強くＢ２ＡＲへと動員された（表１も参照されたい）。これにより、配列番号１においてアミノ酸位置Ｔ２９９Ａ、Ｉ３８６Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ２９８ＡおよびＲ３９３Ａでアラニンに置き換えられたアミノ酸がアレスチン－３とＢ２ＡＲとの相互作用において重要な役割を果たすことが明らかに示される。
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に基づくアレスチン動員アッセイを行い、Ｂ２ＡＲに対するアレスチン－３二重および三重突然変異体と野生型アレスチン－３との動員効率を比較した。それぞれのアレスチンのイソプロテレノール誘導性動員の濃度応答曲線を図１に示す。二重突然変異体Ａ（黒の三角）、三重突然変異体Ｂ（白抜きの丸）およびＣ（黒塗りのひし形）は全て、非修飾アレスチン－３（野生型アレスチン－３、半分黒の四角）と比較してＢ２ＡＲへの動員有効性の増大を示す。さらに、試験した突然変異体は、非修飾アレスチン－３よりも強くＢ２ＡＲへと動員された（表１も参照されたい）。これにより、配列番号１においてアミノ酸位置Ｔ２９９Ａ、Ｉ３８６Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ２９８ＡおよびＲ３９３Ａでアラニンに置き換えられたアミノ酸がアレスチン－３とＢ２ＡＲとの相互作用において重要な役割を果たすことが明らかに示される。
【0094】
動員応答は、２つの薬理学的パラメーター：効力および有効性によって規定することができる。概して、有効性（Ｅｍａｘ）は、化合物／薬物から期待される最大効果の尺度である。効力は概して、化合物の活性の尺度であり、所与の強度の効果をもたらすのに必要とされる化合物の量として規定される。効力は、ＥＣ５０値として与えられることが多く、その化合物の最大効果の５０％をもたらすのに必要とされる化合物の量を規定する。より簡単な説明のために、モル濃度でのＥＣ５０の負の対数であるｐＥＣ５０値を示す。
【0095】
アレスチン動員アッセイでは、ＥｍａｘによりＢ２ＡＲへの野生型または突然変異体アレスチン－３タンパク質のイソプロテレノール誘導性動員の最大量が説明される。ｐＥＣ５０は、Ｂ２ＡＲへのアレスチン動員の最大半量効果をもたらすのに必要とされるイソプロテレノール濃度を規定する。β２ＡＲへの野生型ならびに二重および三重アレスチン－３突然変異体の動員のｐＥＣ５０およびＥｍａｘ値を表１に示す。効力（ｐＥＣ５０）は、各アレスチンについてアレスチン－３の完全な動員または効率（Ｅｍａｘ）の半分を得るのに必要とされるイソプロテレノールのモル濃度を表す。ＷＴアレスチン－３について測定された効力は６．８±０．０２または１５８．５ｎＭであり、二重突然変異体Ｂについて測定された効力は７．３±０．０６または５０．１ｎＭである。二重突然変異体Ａが最高の動員応答を示す（ｐＥＣ５０＝７．１±０．０３、Ｅｍａｘ １３１．５±１．８２）。野生型アレスチン－３と比較して、この突然変異体は約３０％増大したアレスチン動員の有効性を示す。
【0096】
【表2】
【0097】
論考
本発明者らは、野生型アレスチン－３と比較した場合により高いＢ２ＡＲへの動員の有効性および効力の両方を示すアレスチン－３突然変異体を開発したが（表１および図面を参照されたい）、それらのうち１つが動員効率の３０％の増大を示す（二重突然変異体Ａ）。本発明者らは、アミノ酸を或る特定の位置で、例えばアラニンまたは他のアミノ酸に置き換えることで、アレスチン－３突然変異体が受容体に動員される前に「予め活性化され」、野生型アレスチン－３とは異なる基本立体配座を示すと結論付けた。言い換えると、アレスチン－３突然変異体の活性化機序は、非修飾アレスチン野生型タンパク質よりもエネルギー需要が低い。本発明者らは、β２ＡＲへのアレスチンの動員が、この追加の活性化段階を除くことによって促進されると仮定する。これにより、低いアレスチン動員能力を示すＧＰＣＲへのアレスチン動員応答、例えばアレスチンとの弱い一時的な相互作用しか受けないことが知られ、アレスチン動員応答を測定することが困難であり得るクラスＡのＧＰＣＲによる応答を検出することが可能となる。さらに、例えば結晶化または他の手段によるＧＰＣＲの、特にその活性立体配座での、ＧＰＣＲ単独またはＧＰＣＲ－アレスチン複合体としての精製または構造の解明を容易にするために、この新規の「より強いアレスチン動員因子」を用いてβ２ＡＲまたは他の任意のＧＰＣＲを安定させることができる。
本発明者らは、野生型アレスチン－３と比較した場合により高いＢ２ＡＲへの動員の有効性および効力の両方を示すアレスチン－３突然変異体を開発したが（表１および図面を参照されたい）、それらのうち１つが動員効率の３０％の増大を示す（二重突然変異体Ａ）。本発明者らは、アミノ酸を或る特定の位置で、例えばアラニンまたは他のアミノ酸に置き換えることで、アレスチン－３突然変異体が受容体に動員される前に「予め活性化され」、野生型アレスチン－３とは異なる基本立体配座を示すと結論付けた。言い換えると、アレスチン－３突然変異体の活性化機序は、非修飾アレスチン野生型タンパク質よりもエネルギー需要が低い。本発明者らは、β２ＡＲへのアレスチンの動員が、この追加の活性化段階を除くことによって促進されると仮定する。これにより、低いアレスチン動員能力を示すＧＰＣＲへのアレスチン動員応答、例えばアレスチンとの弱い一時的な相互作用しか受けないことが知られ、アレスチン動員応答を測定することが困難であり得るクラスＡのＧＰＣＲによる応答を検出することが可能となる。さらに、例えば結晶化または他の手段によるＧＰＣＲの、特にその活性立体配座での、ＧＰＣＲ単独またはＧＰＣＲ－アレスチン複合体としての精製または構造の解明を容易にするために、この新規の「より強いアレスチン動員因子」を用いてβ２ＡＲまたは他の任意のＧＰＣＲを安定させることができる。
【0098】
実施例２－突然変異体アレスチン－３の発現レベルのモニタリング
材料および方法：
実施例１のプロトコルに従い、アレスチン－３突然変異体をｅＧＦＰプローブと融合させた。構築物の発現レベルを、光モジュールＦＩ ４８５ ５２０を用いるプレートリーダー（例えばＢＲＥＴ測定の前）においてＧＦＰ蛍光を測定することによって決定した。
材料および方法：
実施例１のプロトコルに従い、アレスチン－３突然変異体をｅＧＦＰプローブと融合させた。構築物の発現レベルを、光モジュールＦＩ ４８５ ５２０を用いるプレートリーダー（例えばＢＲＥＴ測定の前）においてＧＦＰ蛍光を測定することによって決定した。
【0099】
結果：
全てのアレスチン－３突然変異体が、表３に示されるように細胞においてＷＴアレスチン－３と比較してより低く発現される（２６％～５５％）。ＢＲＥＴアッセイとは対照的に、ＧＦＰ蛍光は４８５ｎｍでのランプフラッシュによって誘導され、同じプレートリーダーで各ウェルについて測定した。値を２回のアッセイで平均し、ＷＴに対して正規化した。ヒトＨＥＫ２９３細胞におけるアレスチン－３突然変異体の一貫したより低い発現（ＷＴアレスチン－３と比較して４０％～６５％の範囲、表３を参照されたい）にも拘らず、β２ＡＲへのより強い動員が依然としてアレスチン－３突然変異体で観察された。この点を考慮に入れると、本発明のアレスチン－３突然変異体のタンパク質間相互作用の実際の強度は、ＢＲＥＴアッセイによって与えられる実験値を超えるはずであり、すなわちＢ２ＡＲへのアレスチン－３突然変異体の動員能力は、それらのより低い発現レベルに対して値を補正すると、さらに高いようである。
全てのアレスチン－３突然変異体が、表３に示されるように細胞においてＷＴアレスチン－３と比較してより低く発現される（２６％～５５％）。ＢＲＥＴアッセイとは対照的に、ＧＦＰ蛍光は４８５ｎｍでのランプフラッシュによって誘導され、同じプレートリーダーで各ウェルについて測定した。値を２回のアッセイで平均し、ＷＴに対して正規化した。ヒトＨＥＫ２９３細胞におけるアレスチン－３突然変異体の一貫したより低い発現（ＷＴアレスチン－３と比較して４０％～６５％の範囲、表３を参照されたい）にも拘らず、β２ＡＲへのより強い動員が依然としてアレスチン－３突然変異体で観察された。この点を考慮に入れると、本発明のアレスチン－３突然変異体のタンパク質間相互作用の実際の強度は、ＢＲＥＴアッセイによって与えられる実験値を超えるはずであり、すなわちＢ２ＡＲへのアレスチン－３突然変異体の動員能力は、それらのより低い発現レベルに対して値を補正すると、さらに高いようである。
【0100】
論考：
細胞におけるタンパク質発現は予測可能ではない。例えば、二重突然変異体Ａでは２つのアラニン突然変異をＷＴアレスチン－３に付加することで発現が７４％減少したが、三重突然変異体Ｃ中の別の突然変異により発現が３６％から５５％にまで増大した。
細胞におけるタンパク質発現は予測可能ではない。例えば、二重突然変異体Ａでは２つのアラニン突然変異をＷＴアレスチン－３に付加することで発現が７４％減少したが、三重突然変異体Ｃ中の別の突然変異により発現が３６％から５５％にまで増大した。
【0101】
細胞における発現レベルの測定は、厳密なタンパク質間親和性が効力、有効性、さらには発現レベルと相関するため、タンパク質間動員を分析する際に不可欠である。アレスチン－３突然変異体におけるより低い発現プロファイルにも拘らず、突然変異体Ａ、ＢおよびＣについてより高い動員プロファイルが検出された。このため、β２ＡＲ－アレスチン－３突然変異体複合体の見掛けの親和性は、化学量論的条件で行われることから結晶学的研究では悪化する。
【0102】
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】