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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-16
(54)【発明の名称】配列特異的なインビボ細胞標的化
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220309BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220309BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20220309BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220309BHJP
C12Q 1/34 20060101ALN20220309BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A61P35/00
A61K38/46
A61K31/7088
C12Q1/34
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021501114
(86)(22)【出願日】2019-03-27
(85)【翻訳文提出日】2020-11-24
(86)【国際出願番号】 IB2019000346
(87)【国際公開番号】W WO2019186275
(87)【国際公開日】2019-10-03
(31)【優先権主張番号】62/652,150
(32)【優先日】2018-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/724,199
(32)【優先日】2018-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520373925
【氏名又は名称】ジーフラス ライフ サイエンシズ，インク．
(71)【出願人】
【識別番号】519001383
【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ アールアンドディービー ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】イン，ソンヨン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ソンファ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ミ，ジン
(72)【発明者】
【氏名】パク，アイデン，ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】リン，チョン，ハク
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドン，ウク
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ヨンドン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジョンジン
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR14
4B063QS02
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DC22
4C084MA02
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
エンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を含む増強された特異的な核酸標的化複合体、および、インビボでの特異的ならびに／あるいは非特異的な核酸の標的分解と、オフターゲットの活性を防ぐためのヌクレアーゼ活性の特異的な一時的な調節との両方を可能にする関連する方法が、本明細書に開示されている。本開示の実施を介して、核酸、および核酸を抱える細胞、例えば、癌細胞または病原体は、インビボで選択的に分解される。
【選択図】図２１
【選択図】図２１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞中で細胞死を選択的に誘導する方法であって、前記方法は：
ａ）配列特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチド、および細胞中の標的核酸と相補的な核酸を含むガイド核酸を、被験体に投与する工程；および、
ｂ）標的核酸を切断する工程であって、それによって、細胞死を誘導する、工程、を含む、方法。
【請求項2】
標的核酸は疾患に関連付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
標的核酸は被験体の癌細胞中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
標的核酸は被験体の正常細胞にはない、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
標的核酸は癌に関連する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
標的核酸はＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
標的核酸はＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
細胞は複数の細胞にある、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
複数の細胞は正常細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
投与後、正常細胞は生きている、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
投与後、正常細胞は増殖する、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
切断する工程は、細胞中の１つ以上の切断部位での切断を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
標的核酸は疾患に関連付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
癌は、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、または子宮頚癌を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項17】
標的核酸は、癌、転座、または癌の進行に関連する配列に特異的な一塩基多型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＥＲ２、ＫＩＦ５Ａ、ＩＲＸ１、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＧＮＰＤＡ２、ＫＣＮＥ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＭＩＭ１１、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＣＤ６８ＳＨＢＧ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、ＣＤＫ８、ＴＲＡＰＰＣ９、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＩＲＰＢ１、ＭＲＣ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＰＯＴＥＢ、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＰＲＤＭ９、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＨＰＶ、ＬＩＮＥ２ （ＭＴ２）、ＣＣＲ５、またはＨＰＲＴ１からなる群から選択された遺伝子の一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
キメラポリペプチドは誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、またはＣａｓ９ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
第１のドメインはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
第１のドメインはＣａｓ９ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
ガイド核酸は、表６と段落［０２６８］、あるいは表７と段落［０２７０］に表記された配列からなる群から選択された配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項30】
第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項31】
標的核酸は被験体の正常細胞にはない、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５２，１５０号、２０１８年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，１９９号、および２０１８年３月２７日に出願された韓国特許出願第ＫＲ １０－２０１８－００３５２９８号の利益を主張するものであり、当該文献はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５２，１５０号、２０１８年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，１９９号、および２０１８年３月２７日に出願された韓国特許出願第ＫＲ １０－２０１８－００３５２９８号の利益を主張するものであり、当該文献はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
分解または細胞死のために特定の細胞を標的とすることは依然として困難なままである。病気でない宿主細胞集団に影響を与えることなく、癌または病原体の細胞集団を標的とすることはしばしば困難である。結果として、とりわけ、弱っている個体だけでなく、一般的に疾病を抱えていると識別される個体にとって、処置レジメンは、有害であり得るか、あるいは処置レジメンの効果に否定的な影響を与え得る、健康への悪影響をもたらす。
【発明の概要】
【0003】
健康を改善し、疾患の少なくとも１つの症状を緩和し、病原体負荷を軽減するために、あるいは、選択的に排除される癌細胞などの特定の細胞を標的とするための核酸標的化に関連する実施形態が本明細書で提供される。本明細書の方法と組成物は、エンドヌクレアーゼ分解とエキソヌクレアーゼ分解の両方のための特定の核酸分子の選択的な標的化に関する。標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲあるいは他の核タンパク質複合体においてガイド核酸分子などのガイド核酸分子による塩基対合を介して同定される。標的核酸は二本鎖切断を導入するために切断される。その後、標的核酸分解は、エキソヌクレアーゼ活性、例えば、エキソヌクレアーゼ活性を介して促進されるか、あるいは、核タンパク質複合体のタンパク質成分に縮合され、これにより、核酸は、エンドヌクレアーゼ的に導入された切断部位から選択的に分解される。加えて、ＣＲＩＳＰＲあるいは他の核タンパク質複合体の非特異的なエキソヌクレアーゼ活性は、誘導される、ｃｒＲＮＡガイド配列特異的なエンドヌクレアーゼ活性によって誘導され、これが細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を非選択的に分解する。
【0004】
さらなる要約は、以下に列挙されるような請求項に対する言及を通じて部分的に得られる。
【0005】
様々な態様において、本開示は、細胞において細胞死を選択的に誘導する方法を提供し、上記方法は：ａ）配列特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインと、細胞中の標的核酸と相補的な核酸を含むガイド核酸とを含むキメラポリペプチドを、被験体に投与する工程；および、ｂ）標的核酸を切断する工程であって、それによって、細胞死を引き起こす、工程、を含む。
【0006】
いくつかの態様では、標的核酸は疾患に関連付けられる。いくつかの態様では、標的核酸は被験体の癌細胞中にある。いくつかの態様では、標的核酸は被験体の正常細胞にはない。いくつかの態様では、標的核酸は癌に関連する配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸はＲＮＡを含む。
【0007】
他の態様では、標的核酸はＤＮＡを含む。いくつかの態様では、標的核酸は染色体異常を含む領域内にある。いくつかの態様では、染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される。いくつかの態様では、細胞は複数の細胞中にある。
【0008】
さらなる態様では、複数の細胞は正常細胞を含む。いくつかの態様では、投与後、正常細胞は生きている。いくつかの態様では、投与後、正常細胞は増殖する。いくつかの態様では、切断する工程は、細胞中の１つ以上の切断部位での切断を含む。複数の態様では、標的核酸は疾患に関連付けられる。複数の態様では、癌は、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、または子宮頚癌を含む。
【0009】
いくつかの態様では、標的核酸は、癌、転座、または癌の進行に関連する配列に特異的な一塩基多型を含む。いくつかの態様では、標的核酸は、以下からなる群から選択された遺伝子の一部を含む：ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＥＲ２、ＫＩＦ５Ａ、ＩＲＸ１、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＧＮＰＤＡ２、ＫＣＮＥ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＭＩＭ１１、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＣＤ６８ＳＨＢＧ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、ＣＤＫ８、ＴＲＡＰＰＣ９、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＩＲＰＢ１、ＭＲＣ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＰＯＴＥＢ、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＰＲＤＭ９、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＨＰＶ、ＬＩＮＥ２（ＭＴ２）、ＣＣＲ５、またはＨＰＲＴ１。
【0010】
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの態様では、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される。いくつかの態様では、第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ ｄｏｍａｉｎ、またはＣａｓ９ドメインを含む。さらなる態様では、第１のドメインはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む。他の態様では、第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む。さらに別の態様では、第１のドメインはＣａｓ９ドメインを含む。いくつかの態様では、ガイド核酸は、表６と段落［０２６８］（国際出願時の英語原文「００３０３」に対応）、あるいは表７と段落［０２７０］（国際出願時の英語原文「００３０５」に対応）に表記された配列からなる群から選択された配列を含む。
【0011】
いくつかの態様では、第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる。いくつかの態様では、第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む。いくつかの態様では、第２のドメインはマングビーン（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、標的核酸は被験体の正常細胞にはない。
【0012】
引用による組み込み
本明細書に記載されるすべての公報、特許、および特許出願は、あたかも個々の公報、特許、または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれると特別かつ個々に示されるかのような同じ程度だけ参照によって本明細書に組み込まれ、当該文献は２０１８年３月２７日に出願された韓国特許出願ＫＲ １０－２０１８－００３５２９８を含み、これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるすべての公報、特許、および特許出願は、あたかも個々の公報、特許、または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれると特別かつ個々に示されるかのような同じ程度だけ参照によって本明細書に組み込まれ、当該文献は２０１８年３月２７日に出願された韓国特許出願ＫＲ １０－２０１８－００３５２９８を含み、これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
本発明の特徴および利点の理解は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図1】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の単鎖および二本鎖核酸エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼ活性の概略図を示す。
【図2】標的と非標的の核酸基質上のＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ活性の概略図を示す。
【図3】インビトロのヌクレアーゼ活性アッセイ結果を描く。
【図4】インビボの毒性アッセイ結果を示す。
【図5】ピューロマイシン抵抗を用いるＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡのトランスフェクションのためのＰＸ４５９プラスミドベクター系を示す。ＰＸ４５９プラスミドベクターマップは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／６２９８８／である。ＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡは、ＢｂｓＩ酵素の切断後で、かつ、標的配列ｄｓＤＮＡ ｏｌｉｇｏの挿入後に、発現される。
【図6A】コピー数多型を標的とするＰＸ４５９プラスミドＤＮＡのｎｅｏｎエレクトロポレーションの６日後の、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株ＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数切断誘導と細胞死を引き出した。図６Ａは細胞の画像を示し、これは、左から右に以下の処置である：ベクターなしのエレクトロポレーションパルスのみ（対照）、野生型のＥＧＦＲ配列を標的とするベクターによるエレクトロポレーション（対照）、および突然変異体配列を標的とするベクターによるエレクトロポレーション。
【図6B】コピー数多型を標的とするＰＸ４５９プラスミドＤＮＡのｎｅｏｎエレクトロポレーションの６日後の、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株ＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数切断誘導と細胞死を引き出した。図６Ｂは、上記の処置の各々の後の細胞の数の棒グラフを示す。
【図7】図８における各サンプルの細胞形態学を確認する微視的なデータを示す。ＮＴ１、ＣＣＲ５、およびとＨＰＲＴ１遺伝子座を標的とする処置では、多くの細胞が生き残った。ＭＴ２、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２遺伝子座を標的とする処置では、ほとんどの細胞が死んだ。
【図8】ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２遺伝子座を標的とする処置を含む、各処置群における細胞生存率のグラフを示す。
【図9】ｌｉｐｏ（リポフェクタミンのみ）、ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２を含む様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトのトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。
【図10】ＮＴ１（陰性対照、ヒトゲノム中に一致した配列はない）とＧＮＰＤＡ２を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトの明視野像と蛍光顕微鏡画像を示す。
【図11】ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＩＲＸ１、およびＡＤＡＭＴＳ１６を含む、様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトのトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。
【図12A】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトのトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。図１２Ａは、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ アッセイを使用するトランスフェクションの２４時間、４２時間、および７２時間後でのパルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２を含む様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトによる細胞のトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。
【図12B】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトのトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。図１２Ｂは、細胞計数による、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２を含む様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを用いる細胞のトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。
【図13】パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２を含む様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトのトランスフェクション後の細胞の明視野像を示し、矢印は生細胞コロニーを指す。
【図14】エレクトロポレーション後の２４時間、４４時間、および５１時間後のパルスのみ、ｐＥＴ２１ａ、ＭＴ２、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＨＢＧ、およびパルスなしを含む様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを用いる細胞のトランスフェクション後の細胞生存率のデータを示す。
【図15C】全ゲノム配列データを用いてＳＫ－ＢＲ－３におけるＥＲＢＢ２の複製領域を示す。図１５Ｃは、Ｎａｔｔｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌから推論された、ＳＫ－ＢＲ－３ ＥＲＢＢ２ ＣＮＶジャンクション配列を示す。
【図16A】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを用いて細胞のエレクトロポレーションからのデータを示す。図１６Ａは、様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを用いる細胞のエレクトロポレーションからのデータを示す。サンプルは、パルスのみ、ＮＴ１、ＭＴ２、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、およびパルスなしを含む。
【図17】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを用いる細胞のエレクトロポレーションからのデータを示す。サンプルは、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＥＲＢＢ２、およびＫＲＴ１６を含む。
【図18A】ＨｅＬａ重複配列を示す。図１８Ａは、Ａｄｅｙ、Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ＨｅＬａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５００、２０７－２１１ （２０１３）からのＨＰＶとＨｅＬａ細胞の組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）データを示す。
【図18B】ＨｅＬａ重複配列を示す。図１８Ｂは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｊ． Ｄ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ ａｎｄ ＨｅＬａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８０、１７２５－１７３３ （１９９９）、Ｌａｎｄｒｙ、Ｊ． Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ａ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｇ３：Ｇｅｎｅｓ｜Ｇｅｎｏｍｅｓ｜ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３、１２１３－２４ （２０１３）、Ａｄｅｙ、Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ＨｅＬａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５００、２０７－２１１ （２０１３）、および、 Ｌｉｕ、Ｙ．，Ｌｕ、Ｚ．，Ｘｕ、Ｒ． ＆ Ｋｅ、Ｙ． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｙ ＨＰＶ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７、５８５２－５８６４ （２０１６）から推論されたＨｅＬａ細胞中のＨＰＶ配列データを示す。
【図18C】ＨｅＬａ重複配列を示す。図１８Ｃは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ、Ａｄｅｙ ｅｔ ａｌ、およびＬｉｕ ｅｔ ａｌに基づく、ＨｅＬａ細胞中のＨＰＶ配列のあいだの反復領域であるＰＣＲ産物の電気泳動ゲル写真を示す。
【図19A】ＨｅＬａＣＮＶまたはＨＰＶ遺伝子を標的とした後のＨｅＬａ細胞死を示す。図１９Ａは、ＣＣＲ５、ＭＴ２、およびＰＲＤＭ９を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いる細胞のエレクトロポレーション後の生細胞数を示す。
【図19B】ＨｅＬａＣＮＶまたはＨＰＶ遺伝子を標的とした後のＨｅＬａ細胞死を示す。図１９Ｂは、ＣＣＲ５、ＭＴ２、ＰＲＤＭ９、およびＨＰＶ＿１を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いる細胞のエレクトロポレーション後の生細胞数を示す。
【図20A】ＨｅＬａＣＮＶまたはＨＰＶ遺伝子を標的とした後のＨｅＬａ細胞死を示す。図２０Ａは、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いる細胞のエレクトロポレーション後の細胞生存率のグラフを示す。サンプルはトランスフェクション後の２４時間、４８時間、および７２時間後の、パルスのみ（ＧＦＰ）、ＣＣＲ５、ＭＴ２、ＨＰＶ＿１、およびＰＲＤＭ９を含む。
【図20B】ＨｅＬａＣＮＶまたはＨＰＶ遺伝子を標的とした後のＨｅＬａ細胞死を示す。図２０Ｂは、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３、ＣＣＲ５、ＭＴ２、およびＨＰＶ＿１のサンプルを用いる、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ アッセイを使用する、ＨＰＶ遺伝子の標的化によるＨｅＬａ細胞死のグラフを示す。
【図21】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いるＨＴ２９細胞のトランスフェクション後の細胞生存率を示す。サンプルはＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＴＲＡＰＰＣ、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、およびＣＤＫ８を含む。
【図22】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いるＨ１５６３細胞のトランスフェクション後の細胞生存率を示す。サンプルはＣＣＲ５、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２を含む。
【図23】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いる細胞のトランスフェクション後の細胞の生存の顕微鏡画像を示す。
【図24】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９を用いる細胞のトランスフェクション後のアネキシン∨定量化による細胞生存率を示す。
【図25】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ系を用いる細胞のトランスフェクション後の細胞の画像を上部に示す。下部には、各処置の細胞生存率のグラフがある。
【図26】ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株ＨＣＣ８２７におけるＣａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断誘導および細胞死を示すＲＮＰ ｎｅｏｎエレクトロポレーションを示している。
【図27】リポフェクションの２日後のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ系のＲＮＰ リポフェクションを示し、ここで、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、腺癌細胞株Ｈ１５６３において複数の切断と細胞死を誘導する。
【図28】様々な遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ系を用いる細胞のエレクトロポレーション後の細胞の画像を上部に示す。下部のグラフは、腺癌細胞株であるＨ１２９９細胞におけるエレクトロポレーション後の細胞生存率を示す。
【図29】ＨＴ－２９細胞においてＣＮＶを標的とした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって測定されるような細胞生存率を示す。
【図30】ＡｓＣｐｆ１＿ｃｒＲＮＡとＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの結合部位ＷＴのための標的配列を示す。
【図31】上部の細胞の画像と下部の各処置群における生細胞の棒グラフとを含む、Ｃａｓ１２ａと単数または複数の標的ｃｒＲＮＡとによる配列特異的な癌細胞死滅効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
病原体細胞、あるいはしばしば癌に関連する異常な成長あるいは増殖を抱える細胞における核酸などの核酸の選択的な標的化に関する組成物と方法が本明細書で開示される。本明細書での開示を通じて、標的核酸は選択的に分解されることで、しばしば個体から排除される。細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡは、非特異的なエキソヌクレアーゼ活性によってさらに分解される。核酸を保護する細胞が選択的に死滅させられるように、排除は細胞死によってしばしば達成される。しかしながら、ウイルス核酸などの細胞外の核酸も、本開示のいくつかの実施形態を介して標的とされる。
【0015】
標的排除は、配列に特異的な核酸検出と、エンドヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼ分解活性の組み合わせによって達成される。組成物と方法はしばしば配列特異的な成分を含む。本明細書の多くの実施形態では、部分は、標的核酸において逆相補的な（しばしば単に「相補的な」とも呼ばれる）塩基配列に対する塩基対合を介して配列特異性を達成するガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡなどのガイド核酸を含む。しかしながら、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、または他のプログラム可能な特異的な配列同定部分などの代替手段も企図される。例示的な実施形態では、配列特異性は、標的核酸分子のセグメントに逆相補的なガイドＲＮＡによって伝達される。
【0016】
標的核酸を同定する際、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ核タンパク質複合体などの核タンパク質複合体のタンパク質成分によって伝達されたエンドヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼ活性の組み合わせを介して、排除が行われる。さらに、核タンパク質複合体のタンパク質成分の非特異的なエキソヌクレアーゼ活性も、標的核酸の同定時に活性化される。非特異的なエキソヌクレアーゼ活性は細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を非特異的に分解し、それによって細胞死を引き起こす。本明細書のエキソヌクレアーゼ活性は、ポリヌクレオチド鎖の末端（ｅｘｏ）から一度に１つヌクレオチドを切断することにより、酵素が働くことを意味する。エンドヌクレアーゼ切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性、あるいは上で議論されるような配列指定部分に関連するか、上記部分により導かれる他のエンドヌクレアーゼ活性によって行われる。こうした活性は、配列指定部分で、上記部分の近くで、または上記部分によって導かれるように、標的核酸を切断し、標的配列を保護する核酸が選択的に切断されるようになる。本明細書のエンドヌクレアーゼ切断は、酵素によるポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合の切断を意味する。
【0017】
分解は、第２の核酸分解活性によりさらに促進される。この活性は、場合によっては、配列特異的であるか、あるいは、配列指定部分によってそれ以外の方法で導かれる。代替的に、活性は、配列とは無関係に、二本鎖切断を標的とするが、上記のエンドヌクレアーゼ活性によって生じる二本鎖または一本鎖の切断は、選択的または非選択的にさらなる分解の標的とされる。
【0018】
本明細書の例示的な複合体および方法では、第２の活性はエキソヌクレアーゼ活性であり、共通のホスホジエステル骨格を有するキメラポリペプチド中でのエンドヌクレアーゼ活性との融合を介するなどして、エンドヌクレアーゼ活性と共同して送達され、エンドヌクレアーゼ活性はエンドヌクレアーゼ切断部位に導かれる。別の実施では、第２の活性の送達のための併用投与または他のメカニズムも企図される。特異的に同定され、特異的にエンドヌクレアーゼ的に切断され、および、さらにエキソヌクレアーゼ活性あるいは配列特異性部分により導かれたＤＮＡ損傷を「増殖する」他の活性に晒される核酸は、進行中の細胞またはウイルスの活性をコードするのに十分な情報をもはやコードすることのないように、頻繁に損傷を受ける。すなわち、本明細書で開示されるような組成物または方法にさらされると、核酸は十分な配列を失った可能性が高く、細胞の機能に必要な少なくとも１つのタンパク質をもはやコードすることがなく、それによって細胞を死滅させる。同様に、本明細書で開示されるような組成物または方法にさらされた核酸は、どれほど多くのコード能力がエンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性によって失われたかに関係なく、宿主細胞によって損傷を受けたとして同定される可能性が高く、細胞は、細胞アポトーシス機構につながる内部のＤＮＡ完全性チェックポイントを介して分解の標的とされる。すなわち、ｃｒＲＮＡガイド配列特異的ヌクレアーゼ活性の活性化によって引き起こされた非特異的エキソヌクレアーゼ活性は、細胞内ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を非特異的に分解し、これが、細胞で致命的な影響を招く。
【0019】
一時的な制御は、酵素学的な不活性化と抗体結合による隔離の少なくとも１つによって、ヌクレアーゼ複合体の一時的な特定の不活性化を介して達成される。一時的な不活性化は、とりわけ、標的核酸が個体から、あるいは個体の特定の部位からほとんどあるいは完全に除去される状況下で、標的となっていない活性のリスクを低減するために、局所的または全身的に、個体からヌクレアーゼを取り除く利点を示唆するものである。
【0020】
上に議論されるように、いくつかの組成物および方法は、核酸認識、エンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性、あるいは本明細書の開示と一致する少なくとも１つに影響を与える処置または組成物の投与を介する活性の一時的な制御を含む。個体は、本開示と一致する方法または投与された組成物に晒され、ヌクレアーゼ活性組成物を不活性化するために後続の組成物または処置を施される。例としては、限定されないが、局所的な熱投与、Ｚｎ２＋イオンまたはその変異体、例えば、ＺｎＳＯ４、あるいは、表４に示されるそれ以外のものまたはその変異体の投与、ヌクレアーゼ活性を不活性化するか、不安定にするか、さもなければ中和する他の組成物の投与、ガイド核酸と安定的に結合して、さらなる分解を導くことができないようにする鋳型を殺す核酸、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と安定的に結合して、標的指向的手法で核酸基質を加工的に分解できないようにするエンドヌクレアーゼを殺す核酸、および、特定の核酸同定または標的分解の原因である複合体に結合および影響を与える（不活性化することを含む）抗体が挙げられる。本明細書の開示の実施を介して、当業者は、エンドヌクレアーゼ切断と切断事象の増殖との両方を介して、特定の核酸の特定の標的化および分解を達成し、実質的な病変、または、場合によっては全核酸あるいは全核酸分子の欠失を含む、致命的な病変が核酸分子に導入される。同様に、当業者は、特定の標的あるいは標的のクラスへ核酸分解活性を導くためにガイドＲＮＡあるいは他のプログラム可能な配列指定部分の選択と、場合によっては、一定の時間が過ぎたあとに個体から活性を取り除くために活性の一時的な停止反応の両方を介して、この活性の特定の制御を達成する。
【0021】
開示の内容。癌はヒトの主要な健康問題である。癌の最も顕著な性質の１つは、無限の増殖であり、このことを利用して、この形質を標的とする抗癌薬を選択および開発されてきた。身体中の高増殖細胞を標的とする治療は、一次化学療法あるいは放射線療法としてしばしば使用される。しかしながら、これらの方法はさらに、有毛細胞と免疫細胞の集団などの身体中で非常に増殖する正常細胞も標的としており、このことは、患者に中程度～重篤な副作用と苦痛をもたらすこともある。身体中の癌細胞を選択的に標的とする高度に特異的な抗癌治療の発展は、大きな利点の潜在的な可能性を患者に与える。
【0022】
近年、患者の免疫系を癌治療に使用する免疫腫瘍学は、抗癌治療中で大きな進歩を成し遂げている。ＣＡＲーＴ細胞療法は、例えば、遺伝子操作あるいは他のアプローチによって細胞膜中で抗原受容体を発現する患者由来の免疫Ｔ細胞を使用する。抗原受容体は、癌細胞中の特定の膜タンパク質を認識して、それを破壊する。しかしながら、癌細胞と抗癌剤との間の生体分子の相互作用の強度は完全な特異性に十分とは言えず、しばしばオフターゲット効果または不完全な標的化を生じさせる。したがって、たとえ標的の癌治療と免疫腫瘍学が従来の癌治療よりも毒性が少ないと考えられていても、それらも依然として副作用があり、抗原指向性の治療はしばしば副作用と寛解の両方と、その後、癌細胞の成長および進行の再発を呈する。さらに、癌細胞中で特定の膜タンパク質を発見することは依然として困難である。
【0023】
既存のアプローチ。標的癌治療は将来性を示し、活発に開発されてきた。標的癌治療は、癌の病原に関与する特定の分子標的または経路を阻害することにより、癌の成長を妨げる抗癌治療である。標的癌治療はしばしば、「分子標的薬物」または「分子標的治療」と呼ばれる。標的治療は現在、抗癌薬の開発の中心となっている。
【0024】
標的アプローチは除去される１つまたは他の細胞型に特異的な標的を必要とする。多くのアプローチは、癌細胞中の総タンパク質の量を正常細胞中のタンパク質の量と比較することにより、特定の標的を同定する。癌細胞中に特異的に存在するか、あるいは、癌細胞により豊富なタンパク質が、潜在的な標的である。より強力な候補は癌病原にとって重要であることが知られている。差動的に発現された標的タンパク質の公知な例は、ヒト上皮増殖因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ－２）である。ＨＥＲ－２はいくつかの癌細胞の表面上で高いレベルで発現される。複数の標的療法は、ＨＥＲ－２を過剰発現する特定の乳房と胃の癌を処置するために承認されている、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を含むＨＥＲ－２に対して開発されてきた。
【0025】
別のアプローチは、癌の進行を引き起こす突然変異タンパク質を検出することである。例えば、細胞成長シグナル伝達タンパク質ＢＲＣＡ１またはＢＲＡＦは、それぞれ多くの乳癌と黒色腫で変化した形態で存在している。多くの標的治療は、これらの突然変異体形態を標的とするために開発され、こうした変化したタンパク質を含む手術不可能な癌または転移性の癌を抱える患者を処置するために承認されている。
【0026】
癌細胞中に特異的に存在する染色体中の異常も潜在的な標的に使用される。こうした染色体異常はしばしば遺伝子融合を生じさせ、結果として、癌進行に極めて重要な役割を果たす融合タンパク質の発現を引き起こす。癌細胞中に特異的に存在するこうした異常な融合タンパク質は、標的療法の開発に使用することができる。
【0027】
イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）は、２つの遺伝子の融合によって形成され、複数の白血病細胞中に存在することが知られており、白血病の進行を引き起こす、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質を標的とする。
【0028】
ほとんどの標的治療は、癌細胞中に特異的に存在する特定のタンパク質または経路を妨げるか中和するために、小分子またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する。小分子候補は通常、（特定の標的タンパク質に対する試験化合物の効果が大規模にスクリーニングされる）ハイスループットスクリーンによって同定される。モノクローナル抗体の産生については、癌細胞の中に特異的に存在する特定の標的タンパク質は、標的に対する抗体を作るように動物を誘導するために動物（通常マウス）を注入するために使用される。その後、これらの抗体は、非標的タンパク質に結合することなく標的に最良に結合するするものを見つけるために試験される。
【0029】
空間時間的に特異的な核酸ベースのアプローチ。癌細胞はしばしば、正常細胞に対して増加した突然変異率を示す。こうした突然変異率の増加は、挿入、欠失、重複、トランスバージョン、または転座などの染色体の変化の少なくとも１つで、あるいは、単一またはわずかな挿入、欠失、あるいは一塩基多型（ＳＮＰ）などの局所的な突然変異で、それ自体を明示することがある。これらの突然変異は必ずしも、腫瘍細胞集団内での活発な分割または転移細胞の原因であるわけではなく、かつ、具体的にそれらを示すわけでもない。しかしながら、これらはしばしば、生じた組織や癌の型次第では、正常細胞中に存在しない特定のゲノム部位上に遺伝子突然変異を含むとして細胞を同定する。ＳＮＰなどのこうした癌に特異的な突然変異は、本明細書で開示されるアプローチにおいて癌に特異的なマーカーに対して使用される。
【0030】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を認識し、細菌適応免疫系の構成要素としてそれらを切断する、核酸ガイド酵素（例えば、ガイドＲＮＡ）である。これらの特異的なＤＮＡ／ＲＮＡ切断系は、インビボでの魅力的な配列特異的なゲノム編集ツールであるとみなされている。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのゲノム編集（ＧＥ）ツールは、疾患治療と農業形質（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｔｒａｉｔ）の分野で将来性を示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体のゲノム編集は、Ｃａｓ１２ａ（または、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４、またはＣａｓ９、あるいはそれ以外のものなどのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質による部位特異的なｄｓＤＮＡ／ＲＮＡ切断と、その後の、細胞修復メカニズムによって達成される。核酸を切断する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼなどの多くの様々なプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、本開示と一致している。核酸を切断するプログラム可能なＣａｓエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１８ Ｎｏｖ １６；３６２（６４１６）：８３９－８４２． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ４２９４． Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｏｃｔ １８． ）に記載され、これは全体として参照によって本明細書に組み込まれる。核酸を切断するプログラム可能なＣａｓエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１９ Ｊａｎ ４；３６３（６４２２）：８８－９１． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１． Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｄｅｃ ６．）に記載され、これは全体として参照によって本明細書に組み込まれる。当業者に知られている他の文献は、広範囲のＣａｓタンパク質を提供し、それらのすべてが本開示と一致しており、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４、またはＣａｓ９のいずれかを含む。配列に特異的な切断を導くためにガイドＲＮＡに結合するか、ガイドＲＮＡによってガイドされるタンパク質、あるいは、さもなければ、切断を引き起こすために配列に特異的なやり方で核酸配列に結合するタンパク質は、本開示に一致している。標的ＤＮＡ／ＲＮＡに対して相補的配列を有するガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体依存性の標的部位切断の配列特異性を与える。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａの員のゲノム編集機能は、ｇＲＮＡガイドＤＮＡ／ＲＮＡ結合によって活性化され、これは、一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を分解する非特異的ヌクレアーゼ活性をその後活性化する（図１）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａの部位特異的なｄｓＤＮＡ／ＲＮＡ切断と非特異的な一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ切断は、別々の活性である。
【0032】
ＣＲＩＳＰＲ複合体に結合するｇＲＮＡガイド標的部位によって活性化される二本鎖と一本鎖のＤＮＡとＲＮＡの両方を標的とするエキソヌクレアーゼ活性の併用投与またはキメラ融合を介するなどしたこのエキソヌクレアーゼ活性の増強は、核酸損傷を増大させ、および、必須の細胞内ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を非特異的および不可逆的に破壊することにより細胞死を誘導することができる。
【0033】
これに応じて、癌細胞あるいは他の標的細胞に存在する特定の標的部位に対するｇＲＮＡガイド結合によって選択的に活性化された非特異的なヌクレアーゼ機能を使用する癌細胞などの細胞を特異的に標的とする、本明細書で言及されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａあるいは他の複合体などの配列特異的な複合体により、これを抱える望ましくないまたは有害な核酸あるいは細胞を特異的に除去し、正常な増殖細胞に対するネガティブな影響を減らすか、取り除くことができる。
【0034】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａなどの核酸配列指向性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのゲノム編集機能は、エンドヌクレアーゼ、は、特定の標的部位に結合するｇＲＮＡガイドＤＮＡ／ＲＮＡによって活性化され、これはその後、一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を分解するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の固有の非特異的ヌクレアーゼ活性を活性化する。付加的なヌクレアーゼ機能のキメラ融合を介してゲノム編集効率を増強したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のｇＲＮＡガイド標的結合によって活性化された強力な非特異的な二本鎖（ｄｓ）／一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼ機能を有する。これらの系は、標的配列を有する分子の特定の切断によって、および、その後、非特異的な一本鎖または二本鎖のエキソヌクレアーゼ活性によって、癌細胞中などで核酸の標的化と分解を促す。作用の完了後、当業者は、タンパク質の望ましくない副作用を消失させるために身体に残っている複合体の機能を取り除くべく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対する特異的な阻害剤および選択的な抗体を投与し得る。
【0035】
本開示の一態様では、ＳＮＰなどの癌細胞に特異的な突然変異は、ＳＮＰなどの特定の突然変異に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体のｇＲＮＡによって認識される。癌細胞のゲノム上のＳＮＰなどの突然変異とｇＲＮＡとの間の配列特異的な結合は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質のゲノム編集機能を活性化し、結果として標的のＤＮＡ／ＲＮＡ切断を生じさせる。この活性化はその後、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および／または、癌細胞において細胞のｄｓとｓｓのＤＮＡ／ＲＮＡ分子を不可逆的に破壊するＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）の固有の非特異的なエキソヌクレアーゼ機能を活性化し、細胞死（図２）を引き起こす。
【0036】
治療効果ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体の完了後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓターミネーター、などの、本明細書で示されるようなＺｎＳＯ４あるいはそれ以外のもの、および／または、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼならびに／あるいはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）に対する特異的な抗体は、副作用を最小限に抑えるか、あるいはさもなければ複合体を取り除くために、身体に残っている望ましくないＣＲＩＳＰＲ活性を終了させるべく投与される。
【0037】
これに応じて、本開示の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ機能の特定の活性化を介して、身体における過去に例のない癌細胞に特異的な標的化を達成し、特定の阻害剤と選択的な抗体によってインビボでタンパク質複合体の望ましくない活性の停止を達成する。
【0038】
本明細書で開示されるアプローチの利点。本開示の実行は、癌治療の文脈とそれ以外の箇所の両方で多くの利点を有する。例として、相補的な配列を有するヌクレオチド分子（ＤＮＡ：ＤＮＡあるいはＤＮＡ：ＲＮＡ）間の結合は、リガンド：受容体および抗原：抗体などの他の生体分子間の相互作用と比較して、比較的強く、高度に特異的である。本開示の癌細胞に特異的な治療効果は、本開示の１つの実施の例として、相補的なＤＮＡ：ＲＮＡ結合の高特異性に基づき、したがって、個々の患者あるいは細胞型のニーズについてカスタマイズ可能である。ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体のヌクレアーゼ活性は、細胞中のｇＲＮＡ配列に相補的な細胞のゲノム中のＳＮＰなどの特定の突然変異の存在に依存することがある。したがって、本開示の癌細胞に特異的な治療効果は、現在開発され使用されている他の多くの抗癌治療の効果よりも大きい。
【0039】
例として、細胞標的化は特異的であり、容易に個別化される。癌は発癌の起原と原因に依存して、しばしば特定のマーカーを有する。様々な患者は様々な癌の型を有し得る。したがって、同じ治療は様々な患者で様々な有効性を呈し得る。本明細書に開示される治療用アプローチにおいて、各患者の癌は随意に、各患者における癌または特定の癌細胞の特定のマーカーを同定するために使用される特定のＳＮＰを同定するべく予備的に分析され得る。したがって、この治療に使用されたＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体または他の複合体は、問題となっている特定の癌ゲノムに特異的となるように巧妙に作られ得る。したがって、標的とされ得るのは個体の特定の癌細胞株であるため、患者間の癌細胞での変化の根本的なばらつきによって引き起こされた処置有効性のばらつきは大幅に減少し得る。
【0040】
さらに、標的の選択は、前の癌知識あるいは癌メカニズムによって制限されていない。本開示の実行を通じて、任意の数の配列標的が同定され得る。ＳＮＰおよび癌または他の疾患の進行などの特定の突然変異間には機構的な関連性は必要ない。むしろ、腫瘍集団中の細胞の一部またはすべてと相関するとして同定されたＳＮＰなどの任意の突然変異が標的とされ得る。癌細胞集団がしばしば核酸生殖適合度の減少を特徴とするため、本開示のこの特徴は、分解される細胞を標的とするための機会を著しく増やす。
【0041】
さらに、活性な複合体は容易に取り除かれる。これにより、本開示の配列特異性が一時的な特異性によって補足され、処置レジメンは選択された時間の後に容易に停止または阻害されるようになる。これにより、当業者はさらに、個体の非標的細胞における組成物の持続性によって生じ得るオフターゲット効果を減らすことができる。
【0042】
標的領域。本開示の多くは、本技術の例示的な適用または実施としての癌細胞標的化に関する。しかしながら、当業者は、本開示の範囲と適用可能性が、腫瘍または特定の癌細胞を越えて拡大し、その排除が治療効果あるいは疾病の少なくとも１つの症状の改善に結びつくことがある追加の細胞または核酸を包含することを容易に理解する。
【0043】
伝染病は、例えば、本開示によって本明細書に取り組まれた難題の多くを提示し、同様に、十分な処置を含む症状の改善を受け入れやすい。多くの疾患病原体は、例えば、変化しやすいか、細胞表面タンパク質の検出が困難であるか、あるいは、宿主細胞内に存在するため抗体に基づくアプローチによる同定を複雑にする。同様に、多くの疾患のための小分子処置は、かなりの副作用を含み、しばしば患者のコンプライアンスに影響を与えたり、緩和的、予防的、または予防的な処置レジメンを複雑にしたりする。
【0044】
例えば、マラリア、睡眠病、結核などの病気の原因となる病原体は、治療が困難である。細胞は、抗体ベースの治療または宿主による治療のための表面を持たないか、あるいは、免疫反応を回避するために細胞の表面を急速に変化させる。代替的に、結核細胞は、細胞増殖の特定の段階を標的とする治療薬を、治療コンプライアンスを危うくするほど長い期間投与しなければならないほど、十分にゆっくりと再生する。
【0045】
本明細書の実施により、細胞特異的な標的核酸配列は、細胞またはウイルス性病原体ゲノム中で容易に同定され得る。これらの配列を使用して、当業者は、癌の文脈で想起されるが、本開示から明らかなように、多くの疾患に容易に適用可能である、上記の本開示と一致する方法で、病原体核酸の配列特異的な分解を促進する特定の標的を容易に得ることができる。
【0046】
従って、本開示は、特定の癌細胞、例えば、肺癌または膵臓癌を標的とすることと矛盾しないが、プラスモディウム細胞、トリパノソーマ細胞、トキソプラズマ細胞、日和見酵母または他の細胞、ジアルジア細胞、ブドウ球菌感染症、大腸菌、またはＨＩＶ、インフルエンザ、ＨＰＶ、または任意の数の他の伝達性または遺伝性疾患のようなウイルス性病原体などの広範囲の真核生物、真菌またはウイルス性病原体を標的とすることとも矛盾しない。
【0047】
本開示は、細胞内の１つ以上の位置で切断することにより細胞死を誘導する方法において使用され得るガイドＲＮＡおよびＣａｓ９系の組成物を提供する。特定の実施形態では、細胞は、癌細胞などの疾患細胞であり、健康な細胞と疾患（または癌）細胞を含むより大きな複数の細胞の中にある。本明細書で開示される組成物は、ガイドＲＮＡを癌細胞のみに存在する変異配列に標的とすることにより、癌細胞でのみ細胞死を誘導するために、より大きな複数の細胞に投与され得る。さらに、本明細書で開示されるガイドＲＮＡおよびＣａｓ９組成物は、切断のための複数の部位を標的とし、標的核酸の複数の切断と効率的な細胞死を誘導する。
【0048】
同様に、本開示は、マラリア、トキソプラズマ症、睡眠病、シャーガス病、結核、大腸菌感染症、ストレプトスロート、インフルエンザ、感冒、エイズ、およびその原因物質の不可欠な部分として核酸を有する任意の数の他の疾患などの広範囲の伝染性疾患の症状を改善することと一致している。
【0049】
さらに、本開示の一態様では、１つ以上の標的核酸配列が利用可能である限り、未知の疾患または病原体も同様に対処され得る。したがって、例えば、未知の疾患に苦しんおり、例えば、全サンプルの非標的化シーケンシングによってのみ同定される検出可能な量の未知の生物を有すると同定された個体は、それにもかかわらず、未知の生物のゲノムから選択された標的配列を有する核酸を特異的に標的とするように、ガイド配列核酸複合体または他の配列特異的なヌクレアーゼ部分を設計することによって、排除のための標的とされ得る。被験体は、最初に病原体を決定的に特定することなく疾患に対処するために、本明細書で開示される複合体の投与または方法の実施に応答して、完全な治療を含むの症状の改善についてモニタリングされ得る。
【0050】
組成物および方法に全体的に関連する本開示を提供することで、本明細書に開示された組成物および方法の特定の態様に関連する詳細および変形も提供される。以下の特定の詳細は、本開示の様々な実施形態の全範囲の広い理解を得るために、一般的に適用可能であり、かつ、互いに組み合わせ可能であること、および、本開示は本開示の範囲から逸脱することなく、変形および代替的な組み合わせを可能にするために十分に柔軟であることを理解されたい。
【0051】
配列特異性。上で議論されたように、ある態様において、本開示の実施形態は、本開示のヌクレアーゼ活性を、それ以外のものの排除に対して特定の標的に向けるために、配列指定部分から利益を得る。例示的な実施形態では、配列特異性は、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡなどのガイド核酸を介して伝達される。こうした分子は、標的核酸中の逆相補的な塩基配列に対する塩基対合を介して配列特異性を伝達するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓまたは他の適切な複合体に組み立てられてもよい。標的核酸中の逆相補性塩基配列順序に対になる塩基を通って配列特異性を伝えるために、そのような分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓあるいは他の適切な複合体へ組み立てられ得る。
【0052】
しかしながら、上で議論されたように、多くの代替的な部分が本開示と一致することもある。特に代替的なものは、ＴＡＬＥＮリピートなどの配列特異的または配列認識タンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ヘリックスーループーヘリックスなどの転写因子部分、または他のタンパク質構造を含み得る。このような部分の有益な特徴は、それらが、特定の標的核酸セグメントにヌクレアーゼ活性複合体を導き得るように、基質結合において配列特異性を示すことであり、場合によっては、実質的な同一性を有する代替物を識別し、１つの塩基だけ、またはおそらく塩基メチル化などの１つのエピジェネティック修飾のみだけ異なる。好ましくは、限定されないが、標的配列が同定され得、その後、標的核酸セグメントに対応するように選択された核酸またはタンパク質配列を有する特異性部位が選択され得るように、こうした部分はプログラム可能である。代替的に、核酸特異性を伝達するために特定の構造をプログラミングするよりもむしろ、核酸結合部分の集合が選択され得、当業者は、標的と健全な核酸セグメントとの間で識別するのに十分な核酸特異性を有する部分に到達するように、転写因子核酸部分などの多様な核酸結合部分の中から選択し得る。とりわけ、標的配列が宿主や患者のＤＮＡと大きく異なり、そのばらつきが１塩基または数塩基よりも大きい場合には、特異性部分の選択に大きな柔軟性がある。例えば、複合体が、癌突然変異細胞型ではなく、病原体ゲノムまたは逆転写ウイルスゲノムまたは挿入ウイルスゲノムを標的とすることを意図している場合には、特異性部分は、標的生物自体の転写因子集合から容易に得られる。したがって、本明細書のいくつかの実施形態は、ガイド核酸ではなくポリペプチド特異性因子を含む核酸特異性部分と組み合わせて、本明細書のどこかで開示されるようなエンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を含み得る。
【0053】
本開示の一態様において、標的核酸サイズは、特異性を伝達するために必要な情報量、およびヌクレアーゼ活性が伝達されるシステムに応じて変化し得る。本明細書の主要な例示的な実施形態として提示されるＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）システムの場合、標的核酸サイズ、したがって最小のガイドＲＮＡまたはＤＮＡサイズは、特異性を伝達するために必要なサイズと、核タンパク質複合体へのアセンブリと安定したアニーリングをもたらすために必要なサイズの両方によって制約される。標的領域は、安定したアニーリングを伝達するのに十分な長さでなければならないが、単一塩基の不対合セグメントへのアニーリングを生じさせるほど長いものであってはならない。例として、例示的なガイド核酸は、しばしば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０ヌクレオチドよりも大きな特異性決定領域を有し得る。タンパク質指向性の配列特異性部分の標的領域は、より多くのばらつきを呈し得る。
【0054】
多くの標的配列タイプは、一塩基多型から、完全に非天然の核酸配列を含む配列標的に対する染色体再配列事象を示すジャンクションまで、本開示と一致している。例として、本開示の一態様において、ガイドＲＮＡなどの配列特異性部分によって同定される配列タイプは、一塩基置換、一塩基欠失または挿入、複数塩基置換、挿入、または欠失を含み、しばしば、標的核酸と非標的核酸との間で異ならない配列セグメント（例えば、癌細胞株における一塩基変異に隣接する野生型または健康な配列など）と隣接している。代替的に、いくつかの標的配列は、大きな欠失、１つの配列セグメントが染色体上の別の配列セグメントに挿入されたか、または染色体上の別の配列セグメントに隣接して挿入されたことを示す重複、逆位現象、転座、または他の染色体再配置などの染色体事象をジャンクションにまたがるように選択される。しばしば、事象の一方の側の配列は健康な細胞内の配列に対応しているが、セグメントの互いに対する位置は、癌や他の健康状態に関連する突然変異などの突然変異を示し得る。
【0055】
本開示の一態様では、例として、標的配列は、疾患に相関するものとして選択され得る。癌治療の場合には、標的配列は、腫瘍集団のすべてまたはかなりの部分で発生するとして選択され得る。例えば、標的配列は、腫瘍集団内の活発に増殖する細胞またはそうでなければ危険な細胞を標的とするように、または腫瘍集団全体を標的とするように、または特定の腫瘍集団内および特定の腫瘍集団外の両方の細胞を標的とするように選択されてもよい。標的配列は、場合によっては、疾患に機械論的に関与することもある（例えば、細胞周期チェックポイントの誤制御に関与する突然変異、またはｐ５３、ＲＢ、Ｅ２Ｆ、ＣＤＫ、あるいはサイクリンファミリーメンバー、あるいはｍＴＯＲまたはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路のメンバーなどの成長調節因子などの既知の癌遺伝子における変異など）。しかしながら、本明細書で開示される本開示の一態様では、当業者は、疾患に機械的に関与する標的に限定されず；むしろ、標的細胞集団において特異的に、優勢に、または実質的に相関しているか、または発生していると同定された任意の配列セグメントを標的配列として使用され得る。多くの癌または腫瘍細胞集団が核酸複製の欠陥を示し、その後、突然変異を蓄積することを考えると、本開示は、幅広い範囲の標的を選択することを可能にする。したがって、本開示の一態様では、標的配列の選択は、特定の疾患に関与する遺伝子に対応する配列に限定されないため、非常に容易になり得る。
【0056】
一例として、標的配列は、場合によっては、癌または他の疾患に関与する以前に同定された配列から選択され得る。例えば、公開されている病原体ゲノムは、標的配列のすぐに入手できる情報源であり、さらなる検証なしに、または宿主ゲノムにも存在しないことを確認した後に、選択することができる。同様に、標的配列候補については、公開された癌ゲノム情報はしばしば依存し得る。
【0057】
標的配列の選択に関連する公開情報の例は、以下の表１に提供される。
【0058】
【表1-1】
【0059】
【表1-2】
【0060】
様々なタイプの癌に関連する突然変異のより包括的であるがまだ部分的なリストは、ｗｗｗ．ｍｙｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ のｈｔｔｐｓリンクからアクセス可能なウェブサイトで見られる。
【0061】
代替的に、または、組み合わせて、本開示の一態様では、標的配列は、腫瘍細胞または感染したサンプルの配列決定を介して、ｄｅ ｎｏｖｏで決定される。サンプルが得られ、任意の数の標的化または非標的化シーケンシングアプローチの１以上に晒される。対立遺伝子または突然変異座が同定され、予測された健康または宿主ゲノム配列からの欠失に基づいて、さらなる解析のために選択される。場合によっては、突然変異または対立遺伝子は、腫瘍の増殖または転移に関与する細胞集団など、腫瘍内または腫瘍の部分集合に排他的に存在することが確認される。
【0062】
標的配列選択アプローチは相互に排他的ではない。例えば、場合によっては、治療レジメンは、既知の腫瘍突然変異を標的とするガイドＲＮＡを有する部分の投与を含む。少なくともいくつかの症状が改善されないか、腫瘍形態が実質的な変化を示さないことが観察された場合、または他の副次的な結果が観察された場合、当業者は、後続の腫瘍配列決定によって同定された標的配列セグメントを有する核酸の分解を導くガイドＲＮＡまたは他の配列同定部分を有するヌクレアーゼ複合体の追加投与のために十分な少なくとも１つの標的配列を同定するために、残りの腫瘍組織の配列決定を進めることができる。
【0063】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）システムで使用するためのガイド核酸を提供する。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド内の特定の位置に標的とすることができる。ガイド核酸は、核酸標的化セグメントおよびＣａｓタンパク質結合セグメントから構成され得る。
【0064】
ガイド核酸は、癌に関連するまたは癌に関与する経路を標的とするように設計することができる。本開示の組成物を用いて標的とすることができる経路の非限定的な例としては、アポトーシス、β－カテニン／Ｗｎｔシグナル伝達、細胞周期制御、細胞アーキテクチャおよび微小環境、クロマチンリモデリング／ＤＮＡメチル化、細胞毒性化学療法の作用機序、ＤＮＡ損傷／修復、Ｇタンパク質シグナル伝達、ヘッジホッグシグナル伝達、ホルモンシグナル伝達、免疫チェックポイント、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達、キナーゼ融合、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達、代謝シグナル伝達、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ１／ＭＴＯＲ、タンパク質分解／ユビキチン化、受容体チロシンキナーゼ／成長因子シグナリング、ＲＮＡスプライシング、およびＴＧＦβシグナル伝達などが挙げられる。
【0065】
ガイド核酸は、癌に関連するまたは癌に関与する経路を標的とするように設計することができる。本開示の組成物で標的とすることができる遺伝子の非限定的な例としては、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１が挙げられる。
【0066】
本開示の特定の標的化戦略は、癌細胞においてより豊富に存在し得るコピー数多型（ＣＮＶｓ）を標的とすること、ＣＮＶｓ、逆位、または転座などの構造的変化（ＳＶ）ジャンクションを標的とすることを含み、ここで、ジャンクション配列は、ＳＶ遺伝子座と別の正常遺伝子座にまたがることができ、挿入、欠失、または一塩基多型（ＳＮＰ）などのインデル（挿入／欠失）を標的とすることができ、または細胞に統合されたウイルスＤＮＡ配列などの統合された配列を標的とすることができる。ほとんどの細胞は標的化され得るＣＮＶを有する。ＳＶを有する細胞株の例としては、ＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子領域が挙げられる。インデルを有する細胞株の例としては、ＨＣＣ８２７７のＥＧＦＲ遺伝子とＳＫ－ＢＲ－３のＫＲＴ１６遺伝子が挙げられる。統合された配列の例としては、ＨＰＶ（例えば、ＨｅＬａ細胞におけるＨＰＶ配列）またはＨＢＶなどの統合型腫瘍原性ウイルスによって発現された癌細胞が挙げられる。
【0067】
標的とする癌配列の同定には、ＣＣＬＥとＨａｒｍｏｎｉｚｏｍｅのウェブデータベースから癌細胞株のＳＶ、ＣＮＶ、インデル、およびＳＮＰのデータをダウンロードすることが含まれる。ＣＮＶの期待コピー数（Ｎ）は、コピー数値（Ｖ）から以下のように計算することができる；
【0068】
【化1】
【0069】
ガイド核酸は、特定の細胞株中の特定の遺伝子に関連する以下の標的配列のいずれかを標的とするように設計され得る。表２は、Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡのためのスペーサー配列データ表を示す。ＣＣＬＥデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｄａｔａ）とＨａｒｍｏｎｉｚｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｈａｒｍｏｎｉｚｏｍｅ）からのコピー数。ＣＣＬＥデータベースのインデル。ＵＣＳＣゲノム・ブラウザ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｒｅｄｉｒｅｃｔ＝ｍａｎｕａｌ＆ｓｏｕｒｃｅ＝ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ） 、および、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ）からの標的配列および遺伝子座。＊インデル突然変異データはＨｅＬａ癌細胞株の場合には固定されなかった。
【0070】
【表2-1】
【0071】
【表2-2】
【0072】
【表2-3】
【0073】
ガイドＲＮＡは、特定の遺伝子中に複数回現れる配列を標的とすることができ、それにより、Ｃａｓ９を有するガイドＲＮＡの投与時に複数回の切断をもたらす。言い換えれば、本明細書で開示されたＣａｓ９／ガイドＲＮＡ組成物は、遺伝子中の複数の位置で標的配列の切断を誘導し、細胞死を誘導する。例えば、ガイドＲＮＡは、ＣＣＲ５（特定の細胞に２つの切断部位を有する）、ＨＰＲＴ１（特定の細胞に２つの切断部位を有する）、ＭＴ２（特定の細胞に１００を超える切断部位を有する）、ＳＭＩＭ１１（特定の細胞に４０を超える切断部位を有する）、ＧＮＰＤＡ２（特定の細胞に１２を超える切断部位を有する）、ＳＬＣ１５Ａ５（特定の細胞に１２を超える切断部位を有する）、およびＫＣＮＥ２（特定の細胞に４０を超える切断部位を有する）を標的とするために使用することができる。いくつかの実施形態では、対照はＨＰＲＴ１（ハウスキーピング遺伝子）を含む。ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＳＭＩＭ１１、およびＫＣＮＥ２は、非必須遺伝子であり得る。特定の実施形態では、本明細書で開示されるガイドＲＮＡおよびＣａｓ９組成物は、効率的な細胞死を誘導するために、癌細胞における癌原性および標的変異配列である。
【0074】
本明細書で開示されるガイドＲＮＡおよびＣａｓ９組成物によって標的化され、実施形態によっては、細胞死をもたらす複数の切断を導入することができる細胞としては、肺癌細胞、乳癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸癌細胞、卵巣癌細胞、および膵臓癌細胞が挙げられる。本明細書で開示される組成物および方法と一致する細胞株は、Ｈ１２９９細胞とＨ１５６３細胞を含む。本明細書で開示されるガイドＲＮＡとＣａｓ９組成物は、様々な方法を介して細胞に送達される。組成物は、リポフェクタミンの有無にかかわらず、細胞にエレクトロポレーションすることができ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を用いて細胞に送達することもできる。ガイドＲＮＡとＣａｓ９の組成物は、ＰＸ４５９発現ベクターなどの発現ベクターを使用して送達することもできる。
【0075】
図示的なガイドＲＮＡ配列も、それぞれＣａｓ１２ヌクレアーゼとＣａｓ９ヌクレアーゼを含むポリペプチドとの使用に関して表６と段落［０２６８］、および、表７と段落［０２７０］で提供される。
【0076】
本開示において、ガイド核酸は、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸を指すことができる。一実施形態では、ガイド核酸は、ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡであり得る。別の実施形態では、ガイド核酸は、ＤＮＡであり得る。さらに別の実施形態では、ガイド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができる。さらに別の実施形態では、ガイド核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに別の実施形態では、ガイド核酸は、ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドを含むことができる。本開示の一態様では、ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。
【0077】
本開示の別の態様では、ガイド核酸は、核酸に新規または強化された特徴を提供するための１つ以上の修飾を含むことができる。例として、ガイド核酸は、核酸親和性タグを含むことができる。さらに、ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【0078】
本開示の一態様において、ガイド核酸は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー配列に相補的な核酸標的化領域（例えば、スペーサー領域）を、例えば、５’末端または３’末端の近傍に、含むことができる。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（塩基対合）を介して、プロトスペーサーと配列特異的に相互作用することができる。プロトスペーサー配列は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置することができる。スペーサー領域のヌクレオチド配列は、変化してもよく、ガイド核酸が相互作用し得る標的核酸内の切断のための位置を決定し得る。ガイド核酸のスペーサー領域は、標的核酸内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように設計または修飾され得る。
【0079】
本開示の別の態様において、ガイド核酸は、二重ガイド核酸と呼ぶことができる２つの別々の核酸分子、または単一ガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）と呼ぶことができる１つの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、融合ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む単一ガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む単一ガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含むがｔｒａｃＲＮＡを欠いている単一ガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、非融合ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ガイド核酸である。例示的な二重ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子とｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を含むことができる。例示的な単一ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子を含むことができる。例示的な単一ガイド核酸は、融合ｃｒＲＮＡ様分子とｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を含むことができる。
【0080】
ｃｒＲＮＡは、ガイド核酸の核酸標的化セグメント（例えば、スペーサー領域）と、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖デュプレックスの１／２を形成することができるヌクレオチドのストレッチを含み得る。
【0081】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖デュプレックスの他の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含むことができる。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチに相補的であり、かつ、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチにハイブリダイズして、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合ドメインの二本鎖デュプレックスを形成することができる。
【0082】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてガイド核酸を形成することができる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸認識配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズする一本鎖核酸標的セグメント（例えば、スペーサー領域）を提供することができる。スペーサー領域を含むｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列は、ガイド核酸が使用されることになっている種に特異的であるように設計することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１８～７２ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド核酸の核酸標的化領域（例えば、スペーサー領域）は、約１２ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、ガイド核酸（例えば、スペーサー領域）の核酸標的領域は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、約１２ｎｔ～約１９ｎｔ、約１２ｎｔ～約１８ｎｔ、約１２ｎｔ～約１７ｎｔ、約１２ｎｔ～約１６ｎｔ、または約１２ｎｔ～約１５ｎｔの長さを有することができる。代替的に、ＤＮＡ標的化部分は、約１８ｎｔ～約２０ｎｔ、約１８ｎｔ～約２５ｎｔ、約１８ｎｔ～約３０ｎｔ、約１８ｎｔ～約３５ｎｔ、約１８ｎｔ～約４０ｎｔ、約１８ｎｔ～約４５ｎｔ、約１８ｎｔ～約５０ｎｔ、約１８ｎｔ～約６０ｎｔ、約１８ｎｔ～約７０ｎｔ、約１８ｎｔ～約８０ｎｔ、約１８ｎｔ～約９０ｎｔ、約１８ｎｔ～約１００ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、約２０ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約７０ｎｔ、約２０ｎｔ～約８０ｎｔ、約２０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有することができる。核酸標的化領域の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。核酸標的化領域（例えば、スペーサー配列）の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、ガイド核酸（例えば、スペーサー）の核酸標的化領域は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、２２ヌクレオチド長である。
【0085】
標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）に相補的なガイド核酸のヌクレオチド配列は、例えば、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）に相補的なガイド核酸のヌクレオチド配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４５ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３５ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、約１２ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２０ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ ｎｔの長さを有することができる。
【0086】
プロトスペーサー配列は、関心領域内のＰＡＭを同定することによって、および、プロトスペーサーとしてＰＡＭの上流または下流の望ましい大きさの領域を選択することによって、同定可能である。対応するスペーサー配列は、プロトスペーサー領域の相補的な配列を決定することにより設計可能である。
【0087】
スペーサー配列はコンピュータプログラム（例えば、機械可読コード）を使用して同定することができる。コンピュータープログラムは、予測された融解温度、二次構造形成、および予測されたアニール温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生の頻度、メチル化状況、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。
【0088】
核酸標的化配列（例えば、スペーサー配列）と標的核酸（例えば、プロトスペーサー）との間の相補性の割合は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であり得る。核酸標的化配列と標的核酸との間の相補性の割合は、約２０の隣接するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であり得る。
【0089】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、互いに相補的なヌクレオチド（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）の２つのストレッチを含むことができる。互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチ（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）は、介在するヌクレオチド（例えば、単一のガイド核酸の場合にはリンカー）によって共有結合され得る。互いに相補的なヌクレオチド（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）の２つのストレッチは、ハイブリダイズして、Ｃａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡデュプレックスまたはヘアピンを形成することができ、その結果、ステムループ構造を得ることができる。 ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を介して共有結合することができる。代替的に、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端とｃｒＲＮＡの３’末端を介して共有結合することができる。
【0090】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有することができる。例えば、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有することができる。
【0091】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約６塩基対（ｂｐ）～約５０ｂｐの長さを有することができる。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約６ｂｐ～約４０ｂｐ、約６ｂｐ～約３０ｂｐ、約６ｂｐ～約２５ｂｐ、約６ｂｐ～約２０ｂｐ、約６ｂｐ～約１５ｂｐ、約８ｂｐ～約４０ｂｐ、約８ｂｐ～約３０ｂｐ、約８ｂｐ～約２５ｂｐ、約８ｂｐ～約２０ｂｐ、または約８ｂｐ～約１５ｂｐの長さを有することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約８ｂｐ～約１０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１５ｂｐ、約１５ｂｐ～約１８ｂｐ、約１８ｂｐ～約２０ｂｐ、約２０ｂｐ～約２５ｂｐ、約２５ｂｐ～約３０ｂｐ、約３０ｂｐ～約３５ｂｐ、約３５ｂｐ～約４０ｂｐ、または約４０ｂｐ～約５０ｂｐの長さを有することができる。
【0092】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスは、３６の塩基対の長さを有し得る。タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の割合は、少なくとも約６０％である。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の割合は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の割合は、１００％である。
【0093】
リンカー（例えば、単一のガイド核酸中のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを連結する）は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約２０ｎｔ、または約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約１０ｎｔの長さを有することができる。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ＲＮＡのリンカーは４ｎｔである。
【0094】
上記のように、本開示の態様では、ガイド核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的；蛍光標識での追跡；タンパク質またはタンパク質複合体のための結合部位など）を提供する修飾または配列を含むことができる。そのような修飾の例は、例えば、５’キャップ（７－メチルグアニレート（ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｙｌａｔｅ）キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体によって安定性の調節および／またはアクセシビリティの調節を可能にするため）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡデュプレックス（ヘアピン）を形成する配列；細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的とする修飾または配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびそれらの組み合わせを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質のための結合部位を提供する修飾または配列を含む。
【0095】
本開示の別の態様において、ガイド核酸は、核酸に新規または強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供するために、１つ以上の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾）を含むことができる。ガイド核酸は、核酸親和性タグを含むことができる。ヌクレオシドは、塩基と糖の組み合わせであり得る。ヌクレオチドの塩基部分は、複素環塩基であり得る。そのような複素環塩基の最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドであり得る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結され得る。ガイド核酸を形成する際に、リン酸基は、隣接するヌクレオシド同士を互いに共有結合させることで、線状ポリマー化合物を形成することができる。次いで、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに結合させることで、環状化合物を形成することができる；しかしながら、線状化合物が一般的に好適である。さらに、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有していてもよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を生成するような方法で折り畳まれてもよい。さらに、ガイド核酸内では、リン酸基は、一般に、ガイド核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると称されてもよい。ガイド核酸の結合または骨格は、３’～５’のホスホジエステル結合であり得る。
【0096】
本開示の別の態様において、ガイド核酸は、修飾された骨格および／または修飾されたヌクレオシド間結合を含むことができる。修飾された骨格は、骨格中にリン原子を持つものと、骨格中にリン原子を持たないものとを含み得る。
【0097】
本明細書のリン原子を含む好適な修飾ガイド核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、２’－５’結合アナログ、および１つ以上のヌクレオチド間結合が３’－３’結合、５’－５’結合、または２’－２’－２’結合である逆極性を有するものが挙げられる。逆極性を有する好適なガイド核酸は、３’－最大（ｍｏｓｔ）のヌクレオチド間結合において単一の３’－３’結合（例えば、核酸塩基が欠落しているか、またはその代わりに水酸基を有する、単一逆位ヌクレオシド残基など）を含むことができる。様々な塩（例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩、および遊離酸の形態も含まれ得る。
【0098】
ガイド核酸は、１つ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、とりわけ、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチリミノ）またはＭＭＩ骨格）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、および－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２－で表される）を含むことができる。
【0099】
ガイド核酸は、モルホリノ骨格構造を含むことができる。例えば、核酸は、リボース環の代わりに６員のモルホリノ環を含むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合に取って代わる。
【0100】
ガイド核酸は、例えば、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは、１つ以上の短鎖ヘテロ原子あるいは複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含むことができる。これらは、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルノリノ結合；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホンの骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）の骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；リボアセチル骨格；骨格を含むアルケン；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノとメチレンヒドラジノの骨格；スルフォナートとスルホンアミドの骨格；アミド骨格；ならびに、混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分を有する他のもの、を含む。
【0101】
ガイド核酸は、核酸模倣物を含むことができる。「模倣物」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方が非フラノース基と取り替えられるポリヌクレオチドを含むことを意図し得、フラノース環のみの取り替えは、糖代替物とも呼ばれ得る。適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために、複素環塩基部分または修飾された複素環塩基部分を維持することができる。こうした核酸の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、とりわけ、アミノエチルグリシン骨格と取り替えられ得る。ヌクレオチドを保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合可能である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、アミド部分を含む骨格をＰＮＡに与える、２以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含むことができる。複素環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合することができる。
【0102】
ガイド核酸は、モルホリノ環に結合した複素環塩基を有する結合モルホリノ単位（モルホリノ核酸）を含むことができる。結合基は、モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を結合することができる。非イオン性のモルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を減らすことができる。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、ガイド核酸の非イオン性模倣物であり得る。モルホリノクラス内の様々な化合物は、異なる結合基を使用して結合することができる。ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれ得る。核酸分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環と取り替えられ得る。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護されたホスホロアミダイトモノマーは、ホスホロアミダイト化学を用いるオリゴマー化合物合成のために調製および使用され得る。ＣｅＮＡモノマーの核酸鎖への取り込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を高めることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性を有する核酸補体と複合体を形成することができる。さらなる修飾は、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に結合し、それによって２’－Ｃ，４’－オキシメチレン結合を形成し、それによって二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ２－）基であり得、ここでｎは１または２である。ＬＮＡとＬＮＡのアナログは、相補的な核酸（Ｔｍ＝＋３～＋１０°Ｃ）、３’－エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解性特性を有する非常に高いデュプレックスの熱安定性を示すことがあり得る。
【0103】
ガイド核酸は１つ以上の置換された糖部分を含むことができる。適切なポリヌクレオチドは、以下から選択される糖置換基を含むことができる：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、または、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、または、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、または、Ｎ－アルキニル；あるいは、Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル（ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１－Ｃ１０アルキル、あるいは、Ｃ２－Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。とりわけ適しているのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、および、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここで、ｎとｍは１～約１０である。糖置換基グループは以下から選択可能である：Ｃ１－Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、またはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、ガイド核酸の薬物動態学的特性を向上させるための基、あるいは、ガイド核酸の薬力学的な特性を改善するための基、および、同様の特性を有する他の置換基。適切な修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる、アルコキシアルコキシ基）を含むことができる。さらなる好適な修飾は、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）、および２’－ジメチルアミノエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含むことができる。
【0104】
他の適切な糖置換基は、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ－ＣＨ２ ＣＨ２ ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ２＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフルオロ（Ｆ）を含むことができる。 ２’－糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。好適な２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置、とりわけ、３’末端ヌクレオシド上または２’－５’結合ヌクレオチド中の糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われてもよい。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。
【0105】
ガイド核酸は、核酸塩基（単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ））、およびピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を含むことができる。修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびに、ピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換のウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどを含むことができる。修飾核酸塩基は、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）を含むことができる。
【0106】
複素環塩基部分は、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザアデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、および２－ピリドンと取り替えられるものを含むことができる。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を高めるのに有用であり得る。これらは、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６の置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、０．６－１．２℃で核酸デュプレックスの安定性を増加させることができ、適切な塩基置換（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合）であり得る。
【0107】
ガイド核酸の修飾は、ガイド核酸の活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強することができる１つ以上の部分またはコンジュゲートをガイド核酸に化学的に結合することを含み得る。これらの部分またはコンジュゲートは、一級または二級のヒドロキシル基などの官能基に共有結合されるコンジュゲート基を含み得る。コンジュゲート基は、限定されないが、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬力学的な特性を増強する基を含む。コンジュゲート基は、限定されないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含み得る。薬物動態学的特性を増強する基は、取り込みを向上させ、劣化に対する抵抗性を増強し、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的特性を増強することができる基は、核酸の取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる基を含むことができる。コンジュゲート部分は、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖など）、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、または、オクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分を含む。
【0108】
修飾は、タンパク質形質導入ドメインまたはＰＴＤ（細胞貫通ペプチド（ＣＰＰＰ））を含むことができる。ＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜に行き渡るのを容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機あるいは無機の化合物を指すことができる。ＰＴＤは、小さな極性分子から大きな巨大分子および／またはナノ粒子までの範囲の別の分子に結合することができ、分子が膜を横断することを促すことができ、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、または細胞質からオルガネラ内への移動を促すことができる。ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合することができる。ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合することができる。ＰＴＤは核酸に共有結合することができる。
【0109】
例示的なＰＴＤは、限定されないが、最小限のペプチドタンパク質導入ドメイン；細胞内への侵入を指示するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０－５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン、ショウジョウバエ・アンテナペディアタンパク質伝達ドメイン、切断されたヒトカルシトニンペプチド、ポリリジン、およびトランスポータン、３アルギニン残基から５０アルギニン残基までのアルギニンホモポリマーを含むことができる。ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）であり得る。ＡＣＰＰは、一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に切断可能なリンカーを介して接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含むことができ、これは、正味の電荷をほぼゼロに減らすことができ、それにより、細胞への接着と取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンは放出され得、局所的にポリアルギニンとその固有の接着性をアンマスクし、それにより、膜を横断するようにＡＣＰＰを「活性化」することができる。
【0110】
本開示の例示的なキメラポリペプチドは、部位特異的なエンドヌクレアーゼまたはそのドメインなどのヌクレアーゼを含む。本開示に適した非限定的な例示的な部位特異的なエンドヌクレアーゼは、限定されないが、クラス１のＣａｓポリペプチド、クラス２のＣａｓポリペプチド、タイプＩのＣａｓポリペプチド、タイプＩＩのＣａｓポリペプチド、タイプＩＩＩのＣａｓポリペプチド、タイプＩＶのＣａｓポリペプチド、タイプＶのＣａｓポリペプチド、および、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドまたはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；レコンビナーゼ；フリパーゼ；トランスポサーゼ；アルゴヌート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核生物アルゴヌート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴヌート（ａＡｇｏ）、および真核生物アルゴヌート（ｅＡｇｏ））；これらの任意の誘導体；これらの任意の変異体；およびこれらの任意の断片を含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、部位特異的なエンドヌクレアーゼの１つ以上のドメインを含む。本開示の使用に適したドメインの非限定的な例は、ガイド核酸認識または結合ドメイン；ＤＮａｓｅドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｂＣドメイン、およびＨＮＨヌクレアーゼドメインなどのヌクレアーゼドメイン；ＤＮＡ結合ドメイン；ＲＮＡ結合ドメイン；ヘリカーゼドメイン；タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン；および、二量化ドメインを含み得る。ガイド核酸認識または結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用する。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含む。代替的に、ヌクレアーゼドメインは、触媒活性を欠いているか、触媒活性が減少した突然変異ヌクレアーゼドメインであり得る。部位特異的なエンドヌクレアーゼは、様々な部位特異的なエンドヌクレアーゼタンパク質のキメラであってもよく、例えば、異なるＣａｓタンパク質からのドメインを含み得る。
【0112】
場合によっては、本開示の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、タンパク質の野生型の形態である。代替的に、部位特異的なエンドヌクレアーゼは、野生型の形態の修飾版であり、例えば、タンパク質の野生型の形態と比較して欠失、挿入、置換、変異、突然変異、融合、キメラ、またはこれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸の変化を含む。
【0113】
場合によっては、本開示の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、野生型の例示的な部位特異的なエンドヌクレアーゼと少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【0114】
場合によっては、本開示の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメイン、例えば、野生型の部位特異的なエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインと少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0115】
配列に特異的な切断を導くためにガイドＲＮＡに結合するか、ガイドＲＮＡによってガイドされるタンパク質、あるいは、さもなければ、非特異的な切断を引き起こすために配列に特異的なやり方で核酸配列に結合するタンパク質は、本開示に一致している。前記タンパク質は、プログラム可能なＣａｓエンドヌクレアーゼなどのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む。場合によっては、本開示の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓポリペプチドまたはそのドメインを含む。本開示を用いる使用に適している非限定的な例示的なＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（または、Ｃａｓ１２ａ）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（または、Ｃａｓ１３ａ）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａｌ 、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃｓｎｌ、Ｃｓｘｌ２、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓｌＯ、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ 、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕｌ９６６；これらの任意の誘導体；これらの任意の変異体；および、これらの任意の断片を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、本開示の部位特異的なエンドヌクレアーゼは、標的特異的活性に加えて、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性またはプロミスキュラーゼ活性を含む。非特異的な活性は、部位特異的なエンドヌクレアーゼによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化され得る。誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含む非限定的な例示的部位特異的なエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３、Ｃ１３ａ、およびＣａｓ１３ｂが挙げられ得る。
【0117】
場合によっては、部位特異的なエンドヌクレアーゼは、その任意の誘導体；その任意の変異体；およびその任意の断片を含むＣａｓ９ポリペプチドを含み得る。Ｃａｓ９は、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質として分類される。例示的なＣａｓ９ポリペプチドは、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９であり、本明細書ではＳｐＣａｓ９と呼ばれ、１，３６８個のアミノ酸で構成される。Ｃａｓ９は、２つのエンドヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨとＲｕｂＣ、および、認識ローブ（ＲＥＣ）ドメインを有することを特徴とする。ＨＮＨドメインは、ガイドＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖を切断する。ＲｕｖＣ様ドメインは、ガイドＲＮＡとＣａｓ９の複合体によって形成されるワトソン－クリック塩基対合を介して、他の非相補的なＤＮＡ鎖を切断する。
【0118】
場合によっては、Ｃａｓ９タンパク質は突然変異を含む。例えば、ＲｕｖＣドメインの１０番目のアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換すると、ＲｕｖＣ依存性ヌクレアーゼ機能が除去され、ＨＮＨ依存性エンドヌクレアーゼ機能のみが残る。ニカーゼとして知られるＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体は、標的部位での一本鎖ニックを生成するために使用することができる。さらなる置換突然変異、すなわち、Ｃａｓ９ Ｈ８４０ＡのＨＮＨドメインの８４０番目のアミノ酸におけるヒスチジン（Ｈ）からアラニン（Ａ）への変化は、すべてのヌクレアーゼ活性を欠いた不活化Ｃａｓ９タンパク質を生成する。突然変異Ｄ１０ＡとＨ８４０Ａを含む不活性化Ｃａｓ９は、配列特異的な結合機能を保持し、例えば、アクチベーターまたはリプレッサードメインのいずれかとフレーム内で融合した場合に、機能的な転写因子として機能することができる。
【0119】
配列に特異的な切断を導くためにガイドＲＮＡに結合するか、ガイドＲＮＡによってガイドされるタンパク質、あるいは、さもなければ、非特異的な切断を引き起こすために配列に特異的なやり方で核酸配列に結合するタンパク質は、本開示に一致している。前記タンパク質は、プログラム可能なＣａｓエンドヌクレアーゼなどのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む。本開示と一致するプログラム可能なＣａｓエンドヌクレアーゼの例としては、Ｃａｓ１２ａ（または、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４、Ｃａｓ９、あるいはそれ以外のものが挙げられる。場合によっては、部位特異的なエンドヌクレアーゼは、その任意の誘導体；その任意の変異体；およびその任意の断片を含むＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）を含み得る。Ｃａｓ１２ａは、約１，３００のアミノ酸を有するクラスＩＩ、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター・タンパク質として分類される。Ｃａｓ１２ａはＣａｓ９より小さい。Ｃａｓ１２ａはＲＥＣとＲｕｖＣのドメインなどの２つの主要なドメインを含む。Ｃａｓ１２ａはＣａｓ９などのようにＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。Ｃａｓ１２ａは、Ｔの豊富な（５’－ＴＴＴＮ－３’）ＰＡＭからすぐ下流の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を切断する。Ｃａｓ１２ａは、Ｔの豊富なＰＡＭから離れて、４－５ｎｔ長の５’－オーバーハング２０ヌクレオチドを生成する。場合によっては、Ｃａｓ１２ａによって生成された粘着末端は、ＨＲの間にＤＮＡ置換の効率を増強する。
【0120】
場合によっては、部位特異的なエンドヌクレアーゼはＣａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）を含み得る。代替的に、場合によっては、部位特異的なエンドヌクレアーゼはＣａｓ１３ｂを含み得る。Ｃａｓ１３は、目標認識後の乱雑なＲＮＡ活性の付随的な効果を示す、ＲＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼである。
【0121】
場合によっては、Ｃａｓポリペプチドなどの部位特異的なエンドヌクレアーゼは、生物である化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来であり得る。代替的に、多数の真菌または他の微生物が、Ｃａｓポリペプチドなどの部位特異的なエンドヌクレアーゼのための適切な供給源であり得る。供給源の生物は、そのコードされたタンパク質のＧＣバイアスまたはコドンバイアス、最適成長温度（これはしばしば酵素最適活性に対応する）、利用可能性、調節部位の存在、または他の関連する基準などの任意の数の基準によって選択される。以下の非限定的な例のいずれかが、部位特異的なエンドヌクレアーゼの供給源として使用するのに適している：レプトトリキア・ワデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）、レプトトリキア・シャヒイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカスｓｐ．、黄色ブドウ球菌、ノカルディオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチナエ・スピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ヴィリドクロモ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍ）遺伝子、ストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニチレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、マイクロシーラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナスｓｐ．（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスフェラ・ワツゥオニ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテスｓｐ．（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．） 、アセトハロビウム・アラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アモニフェクス・デジェンシ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンディダートゥス・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリディオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルドゥス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワツゥオニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナバリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストックｓｐ．（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルトロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラｓｐ．（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リングビアｓｐ．（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリアｓｐ．（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）。他の供給源生物は、本開示の本明細書に一致している。
【0122】
本開示のいくつかの例示的なキメラポリペプチドは、エキソヌクレアーゼまたはそのドメインを含むことができる。本開示の使用に適したエキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、５’－３’エキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、および５’－３’アルカリ性エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼが挙げられる。表３は、本開示のキメラポリペプチドを生成するための部位特異的エンドヌクレアーゼとの融合に適した例示的なエキソヌクレアーゼを示す。
【0123】
【表3】
【0124】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含む。本開示による使用に適した５’－３’エキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｘＢなどの原核生物、およびＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼドメイン；Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、またはラムダバクテリオファージなどのバクテリオファージ；および、Ｘｒｎ１またはＥｘｏ１ ５’－エキソヌクレアーゼなどの真核生物に由来するものが挙げられる場合によっては、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を含むキメラポリペプチドで達成される突然変異効率は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を含むキメラポリペプチドで達成される突然変異効率よりも大きい。
【0125】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、ＲｅｃＪまたはその触媒ドメインを含み得る。ＲｅｃＪは、約６０ｋＤの加工性の単量体エキソヌクレアーゼである。ＲｅｃＪは、Ｍｇ２＋を必要とする反応において、５’－３’の極性でｓｓＤＮＡを分解し、その結果、ＤＮＡをモノヌクレオチドに分解する。ＲｅｃＪヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質によって結合され得る３’オーバーハング尾部を有するｓｓＤＮＡを生成することができる。場合によっては、ＲｅｃＪは末端の５’リン酸を必要とせず、５’ＯＨで終わるＤＮＡを平等によく消化する。場合によっては、ＲｅｃＪは平滑末端化ｄｓＤＮＡに対していかなる活性も持たない。場合によっては、ＲｅｃＪは、結合して分解を開始するための少なくとも６つの不対塩基を必要とする。いったんｓｓＤＮＡ－尾部分子に結合すると、ＲｅｃＪは限定的な範囲でｄｓＤＮＡ領域に消化され得るが、ほとんどの場合、ｄｓ／ｓｓＤＮＡ境界で消化を終了する。ＲｅｃＪは、一本鎖ギャップからの分解に特化しており、その後、二本鎖末端からの３’ｓｓＤＮＡ尾部組換え分子の生成を生じさせる。ＲｅｃＪは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性によって生成された５’オーバーハングｓｓＤＮＡを除去し、インデル突然変異率を高めることができる。場合によっては、ＲｅｃＪは、例えば、Ｃｐｆ１などの部位特異的なエンドヌクレアーゼのＣ末端に連結するのに適している。なぜなら、ＲｅｃＪは、Ｃｐｆ１によって生成される５’オーバーハングを噛み砕くことができるからである。
【0126】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、ＲｅｃＥまたはその触媒ドメインを含み得る。ＲｅｃＥ（エクソヌクレアーゼＶＩＩＩまたはエクソＶＩＩＩとしても知られている）は、加工性のＭｇ２＋依存性の５’－３’エクソヌクレアーゼ活性を有する。ＲｅｃＥは、ラムダエキソヌクレアーゼと機能的に等価なものである。ＲｅｃＥの例示的な供給源は大腸菌である。ＲｅｃＥは約８６６個のアミノ酸から構成される。ＲｅｃＥは５’から３’方向に二本鎖ＤＮＡを切断する。ＲｅｃＥは、そのエキソヌクレアーゼ活性のために５’ホスフェートを必要とする。場合によっては、ＲｅｃＥは、Ｃａｓ９などの部位特異的なエンドヌクレアーゼによって生成されるｄｓＤＮＡの平滑末端に優先的に作用する。
【0127】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エクソヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含み得る。Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｔ５－ｅｘｏ）は２７６のアミノ酸タンパク質である。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを分解する。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、５’終端からの、あるいは線形または円形のｄｓＤＮＡのギャップおよびニックにおけるヌクレオチド切除を開始することができる。いくつかのＴ５エキソヌクレアーゼ部分は、スーパーコイルの円形のｄｓＤＮＡを分解しない。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などの部位特異的なエンドヌクレアーゼによって生成された二重鎖破損から３’－オーバーハングを生成することによって、インデル突然変異およびＨＲを増強することができる。
【0128】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、ラムダエクソヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含み得る。ラムダエクソヌクレアーゼはエクソヌクレアーゼＩＶに属し、ヌクレオシド５’－ホスフェートを生成するために、５’－から３’の方向にエクソヌクレアーゼ切断を有する。ラムダエクソヌクレアーゼは、平滑末端化された５’－リン酸化されたｄｓＤＮＡを好む。ラムダエクソヌクレアーゼは、ニックやギャップでＤＮＡの消化を開始することができない。ラムダエクソヌクレアーゼは、Ｃａｓ９によって生成された平滑末端から３’オーバーハングを生成することにより、インデル突然変異率およびＨＲの両方を増強することができる。
【0129】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エクソヌクレアーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩのエクソヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、プロテアーゼスブチリシンによるＤＮＡポリメラーゼＩの切断は、小さな断片と大きな断片（Ｋｌｅｎｏｗ断片としても知られている）を生成する。 本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼＩの小さな断片と呼ばれる小さな断片は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と、５’フラップ（デュプレックス鎖から伸長する５’オーバーハング）エンドヌクレアーゼ活性を含み、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＭＥとして使用するのに適している。より大きな断片は、５’→３’ポリメラーゼ活性と、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む。
【0130】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含み得る。本開示の用途に適している３’－５’エキソヌクレアーゼの非限定的な例は、ＴＲＥＸ２などのＴＲＥＸ、マングビーン（Ｍｕｎｇｂｅａｎ ）ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、およびＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼを含み得る。
【0131】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、ＴＲＥＸまたはその触媒ドメインを含み得る。ＴＲＥＸ酵素はＴＲＥＸ１またはＴＲＥＸ２であり得る。ＴＲＥＸ２は自律性の真核生物のエキソヌクレアーゼであり、これは２７９のアミノ酸タンパク質である。ＴＲＥＸ１とＴＲＥＸ２タンパク質は、３’切断活性を有するホモダイマーを形成する。ＴＲＥＸ１とＴＲＥＸ２は一本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、ＤＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＥｘｏＩ、およびＥｘｏＸの細菌のイプシロンサブユニットと構造上、最も密接に関連する。
【0132】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含み得る。マングビーンヌクレアーゼは、緑豆、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）の芽から単離された３５５のアミノ酸タンパク質である。マングビーンヌクレアーゼは、遊離単鎖の５’－末端を有するｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのフラップ構造から段階的にヌクレオチドを切断する。場合によっては、マングビーンエキソヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、またはニックされたデュプレックスＤＮＡのインタクトな鎖を消化しない。マングビーンヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ の特異的分解を触媒し、５’－Ｐ 末端を有するモノおよびオリゴヌクレオチドを生成する。場合によっては、マングビーンエキソヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などの部位特異的なエンドヌクレアーゼによって生成される５’および３’の一本鎖オーバーハングを除去することによって、インデル突然変異を増加させる。
【0133】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、エクソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ１）またはその触媒ドメインを含み得る。エクソヌクレアーゼＩは、Ｍｇ２＋依存性の３’－５’の一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する８４６のアミノ酸タンパク質である。エクソヌクレアーゼＩはｄｓＤＮＡをモノヌクレオチドに消化する。エクソヌクレアーゼＩは、ＤｎａＱスーパーファミリーのメンバーであり、その構造は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の３’－５’エクソヌクレアーゼ活性部位に類似している。場合によっては、エクソヌクレアーゼＩは、Ｃａｓ９などの部位特異的なエンドヌクレアーゼによって生成される二本鎖切断末端の一本鎖オーバーハングを除去することによって、インデル突然変異を増加させる。
【0134】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）またはその触媒ドメインを含み得る。エクソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの３’－ヒドロキシル末端からモノヌクレオチドを段階的に除去することを触媒する。エクソヌクレアーゼＩＩＩの例示的な基質は、平滑末端であるか、または陥凹３’末端である。場合によっては、エクソヌクレアーゼＩＩＩは、切断に抵抗性であり得る一本鎖ギャップを生成するためにデュプレックスＤＮＡ中のニックでも作用する。というのも、エクソヌクレアーゼＩＩＩはしばしば３’オーバーハング末端上で活性ではないこともあり、４塩基またはそれ以上の長さの伸長部は切断に対して抵抗性であることが多いからである。エクソヌクレアーゼＩＩＩは、１つの３’－オーバーハング耐性末端と１つの５’－オーバーハングまたは平滑末端を有する線状分子から一方向性の欠失を生じさせる。エクソヌクレアーゼＩＩＩの活性は、ＤＮＡらせん構造に部分的に依存し、配列依存性を示す（Ｃ＞Ａ＝Ｔ＞Ｇ）。エクソヌクレアーゼＩＩＩは、ＲＮａｓｅ Ｈ、３’－ホスファターゼ、およびＡＰエンドヌクレアーゼ活性も含むことができる。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼＩＩＩは、Ｃａｓ９の３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を促進することにより、インデル突然変異を増加させる。
【0135】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、エクソヌクレアーゼＶＩＩまたはその触媒ドメインを含み得る。エクソヌクレアーゼＶＩＩ（ＥｘｏＶＩＩ）は、５’－ホスホモノヌクレオチドを得るために５’－３’または３’－５’方向のいずれかから一本鎖ＤＮＡを切断する。エクソヌクレアーゼＶＩＩは、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインも含む。場合によっては、エクソヌクレアーゼＶＩＩは、Ｃａｓ９生成破断末端によって生成された一本鎖オーバーハングを除去することにより、インデル突然変異を増加させる。
【0136】
例示的なキメラポリペプチドにおいて、エキソヌクレアーゼは、ＲｅｃＢＣＤエクソヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含み得る。ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼは、Ｍｇ２＋依存性のＲｅｃＢドメイン、ＲｅｃＣドメイン、およびＲｅｃＤドメインを含み、これらはｄｓＤＮＡをほどき、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを分解する。ＲｅｃＢＣＤは、５’－ホスホモノヌクレオチドを生成するために、５’－３’または３’－５’方向のいずれかからｓｓＤＮＡを切断する。場合によっては、ＲｅｃＢＣＤは、Ｃａｓ９に基づく二本鎖切断で生成された一本鎖オーバーハングを除去することにより、インデル突然変異を増加させる。
【0137】
別の例では、エキソヌクレアーゼは、エクソヌクレアーゼｔまたはその触媒ドメインを含み得る。エクソヌクレアーゼＴ（Ｅｘｏ Ｔ）は、２つのマグネシウムイオンの結合のための４つの酸性ＤＥＤＤ残基（Ｄ２３、Ｅ２５、Ｄ１２５、およびＤ１８６）と、３’－ヒドロキシル末端の活性部位で機能するためのヒスチジン残基（Ｈ１８１）とを含むＤＥＤＤｈドメインを有する、ＤｎａＱ様３’－５’エクソヌクレアーゼのメンバーである、２１５アミノ酸タンパク質を含む。エクソヌクレアーゼＴは、バルジ、バブル、およびＹ構造化ＤＮＡを含む構造化ＤＮＡの３’末端をトリミングする。
【0138】
投与経路。ヌクレアーゼリボ核タンパク複合体は、本明細書中の本開示と一致する多くの投与経路を介して投与することができる。投与は、場合によっては、消化吸収に対して耐性を有するように構成された製剤の経口投与を介する全身性である。代替的に、全身投与は、注射を介して、または点滴を介して製剤を血流に導入するなどによる複合体の吸入または静脈内投与を介して達成される。
【0139】
局所投与も本明細書の本開示と一致し得る。組成物は、注射され、例えば、軟膏の一部として、またはパッチの成分として、患部細胞の部位に局所的に投与される。
【0140】
投与は、標的とされる核酸の種類によって影響を受けることが多い。黒色腫、扁平上皮癌、皮膚感染症、または他のアクセス可能な表面疾患は、随意に局所投与または全身投与に晒される。触知可能な腫瘍は、腫瘍部位またはその近傍で、事前に組み立てられた複合体の局所投与または注射に晒されるか、または全身投与に晒され得る。同様に、肺を含む疾患は、吸入により、または全身投与により対処され得る。内部疾患、遠隔組織を含む疾患、または癌細胞集団が単一部位に局在化されることが予想されないような転移が疑われる状態は、少なくともいくつかの全身送達を含む送達経路を使用して対処される可能性が高い。
【0141】
さらに、本開示の一態様において、投与は、送達プラットフォームとしてナノ粒子を使用することによって行われてもよい。一例として、投与は、例えば、非免疫性の全身投与のために、例えば、ＰＥＧ化金ナノ粒子、アニオン性金ナノ粒子、および特定のポリマーを使用することによって行われてもよく、投与は、例えば、脂質ベースのナノ粒子、および、免疫、ワクチン、ならびに免疫刺激が望ましい他の用途のための特定のポリマーを使用することによって行われてもよい。送達プラットフォームの各々において、有効な医薬成分（ＡＰＩ）とナノ担体の両方の免疫毒性が検討され、特定の用途のための適切な送達システムが選択され得る。すなわち、免疫調節が望ましい場合には、免疫反応性の担体が使用され、免疫活性が望ましくない場合には、免疫反応性の担体は使用されない。このように、ナノテクノロジーで製剤化された薬剤が前臨床免疫毒性試験に基づいて、本開示のために開発および使用されてもよく、例えば、Ｄｏｂｒｏｖｏｌｓｋａｉａ Ｍ， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５ Ｄｅｃ ２８； ２２０（０ ０）： ５７１－５８３ （ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４６８８１５３／）で入手可能である。当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0142】
さらに、同時あるいは順番に実施される、単一の疾患に対処するための投与の複数の回路は本開示に一致している。
【0143】
ヌクレアーゼ活性の一時的な制御。上述のように、ヌクレアーゼ配列特異性は、投与のオフターゲットまたは他の副作用をさらに減らすために、ヌクレアーゼ活性の一時的な制御を随意に伴う。本開示の態様では、一時的な制御は、酵素学的な不活性化と抗体結合による隔離の少なくとも１つによって、ヌクレアーゼ複合体の一時的な特定の不活性化によって達成される。一時的な不活性化は、とりわけ、標的核酸が個体から、あるいは個体の特定の部位からほとんどあるいは完全に除去される状況下で、標的となっていない活性のリスクを低減するために、局所的または全身的に、個体からヌクレアーゼを取り除く利点を示唆するものである。
【0144】
上に議論されるように、いくつかの組成物および方法は、核酸認識、エンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性、あるいは本明細書の本開示と一致する他の活性の少なくとも１つに影響を与える処置または組成物の投与を介する活性の一時的な制御を含む。個体は、本開示と一致する方法または投与された組成物に晒され、ヌクレアーゼ活性組成物を不活性化するために同時または後続の組成物または処置を施される。例示的な不活性化組成物は、限定されないが、配列同定またはヌクレアーゼ活性に影響を与えるＺｎＳＯ４または他のイオン性または非イオン性分子を含む。こうした組成物の投与は、局所的または全身的にインタクトのままでもヌクレアーゼ活性が低下するように、ヌクレアーゼ活性に影響を与える。
【0145】
例によって、本開示で使用される「クエンチャー溶液」または「ストッパー溶液」は、ヌクレアーゼ活性を阻害する組成物を含み得、クエンチャー溶液は、例えば、ＺｎＳＯ４または他のイオン性または非イオン性モジュールなどを含み得る。例えば、特定の用途に応じて、クエンチャー溶液は、本明細書に添付された表４に示されるように、利用可能な様々なクエンチャー溶液から選択されてもよく、将来のクエンチャー溶液のための可能な組み合わせ表を提供する。表４において、縦は、金属カチオンにイオン結合することができる１２のアニオン（例えば、サルフェート、ニトレート、塩化物、アンモニウム、シトレート、アルセナート、ホスフェート、リン酸アンモニウム、カルボネート、フッ化物、オキサレート、水酸化物）を表し、横は７つの金属イオン（例えば、アルミニウム、亜鉛、鉄、鉛、銅、銀、および金）を表す。アニオンと金属イオンとの間の各組み合わせは、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）の性能を終了させるための有望なクエンチャーである。８４のクエンチャー溶液はすべて、７つの金属と１２の陰イオンから生成される。反応性の低い金属カチオン、アルミニウム、亜鉛、鉄、鉛、銅、銀、および金は、ＤＮＡ切断反応を実行するためにＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）エンドヌクレアーゼ活性の重要な補因子である、マグネシウムを置換することができる。アニオンは、マグネシウムに結合することによってＣａｓ９タンパク質からマグネシウムを枯渇させるために利用可能である。
【0146】
表４は、金属（例えば、アルミニウム、亜鉛、鉄、鉛、銅、銀、および金）が、以下のアニオン：のいずれかと組み合わされ得ることを例証する：サルフェート（ＳＯ４）、ニトレート（ＮＯ３）、塩化物（Ｃｌ）、アンモニウム（ＮＨ４）、シトレート（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、アルセナート（ＡｓＯ４）、ホスフェート（ＰＯ４）、リン酸アンモニウム（ＮＨ４）３ＰＯ４、カーボネート（ＣＯ３）、フッ化物（Ｆ）、オキサレート（Ｃ２Ｏ４）、および水酸化物（ＯＨ）。
【0147】
【表4】
【0148】
さらなる実施形態は、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）複合体などのヌクレアーゼを安定的に結合して、標的指向的手法で核酸基質を加工的に分解できないようにするエンドヌクレアーゼを殺す核酸を含む。
【0149】
本開示の一態様において、ヌクレアーゼ核タンパク質複合体の不活性化および隔離の両方は、少なくとも１つの複合体結合抗体の投与によって達成され得る。こうした抗体は、様々な実施形態において、基質結合を遮断または障害し、エンドヌクレアーゼ活性を遮断または妨害し、エキソヌクレアーゼ活性を遮断または妨害し、あるいは組織内の核酸の近傍から除去されるようにリボ核複合体を隔離し得る。これに応じて、抗体は、特定の核酸の同定または標的化された分解の原因である複合体に結合または影響を与える（不活性化することを含む）こともある。
【0150】
いくつかの実施形態では、こうした組成物は、注射、局所投与、またはヌクレアーゼとの同時投与のいずれかによって、随意に当該技術分野で知られている時間遅延放出機構を用いて、選択的な核酸分解の標的とされている腫瘍の部位に局所的に投与されてもよい。代替的に、または、組み合わせて、こうした組成物は全身的に投与されるか、随意に、放出されるために、あるいは、限定された範囲の組織での活性に利用可能になるように、隔離される。
【0151】
代替的に、または、組み合わせて、ヌクレアーゼの局所的な不活性化は、腫瘍または他のヌクレアーゼ活性部位における局所的な熱投与によって達成される。様々な場合の熱投与は、核酸塩基対合効率を低下させ、ヌクレアーゼリボタンパク質複合体の安定性を低下させ、またはヌクレアーゼリボ核タンパク質活性を低下させ得る。
【0152】
同時投与および進行中のモニタリングまたは治療レジメン。本明細書に開示されたヌクレアーゼ組成物、例えばリボ核タンパク質複合体は、単独の処置レジメンの一部として、または少なくとも１つの追加の処置レジメンと組み合わせて、個体に投与される。とりわけ、特定の癌を有することが疑われるかまたは診断された個体はしばしば、一次処置として標準治療化学療法または放射線療法を投与され、および、後続処置または二次処置として本明細書で開示されるような組成物を投与される。こうした処置は、場合によっては、一次処置からの結果の欠損に対処するために、あるいは、腫瘍または疾患細胞の除去の可能性を高め、寛解後の再発の可能性を減少させるための確認処置として機能するために行われる。
【0153】
本明細書で開示されるような特定のヌクレアーゼの投与は、場合によっては、従来の処置の利点を伝えるような条件下であるが、最先端の処置の副作用を減少させる投与量で、最先端の処置と従来の処置と並行して行われることも企図される。
【0154】
外科的介入などの非医薬的処置レジメンと連動した、または、上記処置レジメンの後の組成物の投与も、抗生物質レジメン、運動レジメン、または食事の変更と組み合わせた投与のように企図される。
【0155】
代替的に、場合によっては、本明細書に記載のヌクレアーゼ組成物は、現在癌治療薬として使用されている化学療法または放射線療法治療レジメンにしばしば伴う副作用を改善または除去するために、最先端の処置または初期の処置として投与される。
【0156】
ＤＮＡ二本鎖切断修復の阻害剤と組み合わせた組成物の投与も本明細書において企図されている。使用について企図される阻害剤は、低分子阻害剤および巨大分子阻害剤、例えば、ＢＲＣＡ遺伝子またはＢＲＣＡ経路などのＤＮＡ二本鎖切断修復に関連する遺伝子を標的とするガイド核酸を含むリボ核タンパク質を含んでいる。阻害剤は、本開示の組成物の投与と同時に、上記投与の前または後に、投与可能である。
【0157】
本明細書に記載の組成物は、単回投与として、または多投与レジメンの一部として投与される。多投与レジメンは、他の出力の中でもとりわけ、細胞増殖、疾患細胞数、腫瘍増殖、あるいは疾患または癌症状の改善に対する影響を評価するために、治療効果の継続的なモニタリングを伴うことが多い。したがって、処置レジメンは、継続的な有効性の結果を考慮して調整されることが多い。好ましくない処置結果は、様々な方法で、処置量の増加、処置効果の増加、またはヌクレアーゼ処置レジメンへのさらなる標的の変更または追加によって対処される。添付の処置組成物の追加または変更も企図され、本明細書の開示と一致する。
【0158】
上述したように、複数の処置レジメンはまず、既知の標的配列を対象にした組成物を採用し、処置の結果が癌の除去につながることが見られない場合には、腫瘍または他の癌組織の配列決定を通してデノボで同定された標的配列に切り替えるか、上記標的配列を補充する。
【0159】
表５ａは、ハンドルおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する例示的なｇＲＮＡ配列と、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを用いて得られた例示的な出力情報を示す。表５ｂは、ハンドル、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する例示的なｇＲＮＡ配列、およびＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて得られた例示的な出力情報を示す。表６と段落［０２６８］は、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを含むキメラポリペプチド）を、癌、例えば、肺癌または膵臓癌に関連する標的核酸に誘導するために使用することができる例示的なガイドＲＮＡ配列を列挙している。表７と段落［０２７０］は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むキメラポリペプチド）を、癌、例えば、肺癌または膵臓癌に関連する標的核酸に誘導するために使用することができる例示的なガイドＲＮＡ配列を列挙している。参照配列（例えば、野生型、健康型、または非癌性）からの変異を、表５－７の下線部に示す。
【0160】
図面に戻って以下を参照する。
【0161】
図１において、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）複合体は、ｇＲＮＡガイド標的部位結合によって活性化され、これがその後、非特異的ヌクレアーゼ機能を活性化することが示されている。ＤＮＡ／ＲＮＡの分解は、癌細胞の解体を生じさせる。図１は、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）複合体と標的核酸（例えば、ｄｓＤＮＡとｓｓＲＮＡ）の概略図を示す。各概略図において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の一部は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流であり、かつこれに隣接する標的配列にアニーリングする。
【0162】
上部で、二本鎖ＤＮＡに対する作用を示す。標的配列が同定され、標的配列との結合によって二本鎖切断をもたらすエンドヌクレアーゼ切断が行われ、エキソヌクレアーゼ活性が切断を増幅して核酸分子において実質的な病変を形成して、細胞死を生じさせる。
【0163】
下部では、複合体がリボ核酸分子中の標的配列を同定する。複合体が活性化され、ＲＮＡ分子が分解される。
【0164】
図２では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）の非特異的なヌクレアーゼ機能の活性化が癌細胞で観察される。ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）複合体は、異質な細胞集団を有する個体に投与される。この集団では、突然変異は細胞増殖に関連すると同定される。この突然変異を抱える細胞は分解の標的とされる。標的突然変異を同定するガイドＲＮＡを抱えるリボ核タンパク質複合体がアセンブルされ、個体に投与される。左では、いかなる標的配列も同定されず、細胞核酸分解が生じないため、突然変異を欠いている（標的配列がない）細胞は影響を受けていないことが分かる。右では、突然変異（癌特異的配列）を抱える細胞が核酸分解にさらされることが分かる。ガイドＲＮＡは標的の突然変異を同定し、核酸を切断するようエンドヌクレアーゼ活性を導く。ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）の非特異的ヌクレアーゼ機能は、ゲノム中にｇＲＮＡの相補的な標的配列を含む癌細胞において特異的に活性化される。癌細胞中の非特異的ヌクレアーゼ活性は、細胞の二本鎖および一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を破壊して、細胞死の誘導を引き起こす。
【0165】
図３では、インビトロの切断アッセイの結果が示される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａリボ核タンパク質複合体は、ヒトＤＨＣＲ７を標的とするガイドｃｒＲＮＡのまわりでアセンブルされる。ｃｒＲＮＡは、ＤＨＣＲ７を含むｄｓＤＮＡ＃１を標的とするが、標的配列を欠いている核酸であるｄｓＤＮＡ＃２を標的としない。２４時間後（右から２番目のレーン）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａがその標的ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＃１）を切断することによって活性化されたとき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａは、非標的ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＃２）のｄｓＤＮＡも共役的に分解していることがわかる。しかしながら、標的ｄｓＤＮＡ＃１への結合によってあらかじめ活性化されなかったＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ複合体は、ｄｓＤＮＡ＃２の分解の欠如によって見られるような、実質的にさほど非特異的ではない分解活性を示す（中央レーン）。
【0166】
図４において、ヒト細胞に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（ＦｎＣｐｆ１－ＢＰＮＬＳ）の細胞毒性効果のインビボ切断開裂アッセイの結果を示す。左側は、０から３．５まで０．５刻みでＹ軸に細胞生存率を示し、Ｘ軸に（左から右に）未処置、リポフェクタミン＋Ｃｐｆ１、リポフェクタミン＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（１００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（１００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（２００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ）、およびＣｐｆ１（２００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ）を含む処置群を示すグラフである。各処置群内には３つのバーがあり、左から右に、２４時間の時点、４８時間の時点、７２時間の時点を示している。右側は、０．０００から３．５００まで０．５００刻みでＹ軸に細胞生存率を示し、Ｘ軸に（左から右に）未処置、リポフェクタミン＋Ｃｐｆ１、リポフェクタミン＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（１００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（１００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１（２００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ）、およびＣｐｆ１（２００ｎｇ）＋ｓｇＲＮＡ）を含む処置群を示すグラフである。各処置群内には３つのバーがあり、左から右に、２４時間の時点、４８時間の時点、７２時間の時点を示している。
【0167】
図５はピューロマイシン抵抗を用いるＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡのトランスフェクションのためのＰＸ４５９プラスミドベクター系を示す。左から右に、Ｕ６プロモーター、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ、ｇＲＮＡスキャフォールド、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリのβ－アクチン・プロモーター、ハイブリッド・イントロン、３ｘＦＬＡＧ、ＳＶ４０ ＮＬＳ、コザック配列、Ｃａｓ９、ヌクレオプラスミン ＮＬＳ、Ｔ２Ａ、ＰｕｒｏＲ、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ｆ１ ｏｒｉ、ＡｍｐＲプロモーター、ＡｍｐＲ、およびｏｒｉが示されている。
【0168】
図６Ａには細胞を示す一連の３つの画像がある。各画像の上には、左から右に処置群の記載があり、それぞれ、パルスのみ、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０－ＥＧＦＲ＿ＷＴ、および、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０－ＥＧＦＲ＿Ｅ２である。パルスのみ群を用いる左端の画像には多くの細胞があり、右端の画像と比較して、全体としてより多くの生細胞を示している。ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０－ＥＧＦＲ＿ＷＴ群を用いる中央の画像には、右端の画像と比較して、さらにより多くの生細胞がある。実験群、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０－ＥＧＦＲ＿Ｅ２を用いる右の画像は、左と中央の画像と比較して、より少ない細胞を含み、より多くの細胞死を示している。
【0169】
図６Ｂは、ＨＣＣ８２７細胞数比較（６ｄｐｔ）と題したグラフであり、ｘ軸は、左からパルスのみ、ＥＧＦＲ＿ＷＴ、およびＥＧＦＲ＿Ｅ２を含む３つの治療法を示している。Ｙ軸は細胞数を示しており、０から５０００００００まで５００００刻みで表示している。各処置群はさらに、エラーバーを介してエラーを示す。
【0170】
図７は、細胞の２列の顕微鏡画像を示す。パネルの左上３枚の画像は、生存している多くの細胞を示し、左からＮＴ１、ＣＣＲ５、およびＨＰＲＴ１である。パネルの右上の画像と下のすべての画像は、ほとんどの細胞が死んでいることがわかった画像を示している。右上の画像はＭＴ２サンプルを示す。パネルの下列は、左から右に、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２を示す。
【0171】
図８は、左から右に、ｘ軸上で遺伝子座を標的とするプラスミドを含む様々な処置群を示すグラフである。この群は、左から右に、ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２である。ｙ軸は、１ウェルあたりの生きている細胞ｘ１０４の数を示し、０．５刻みで０から４の範囲である。各バーの上には、１ウェルあたりの生きている細胞ｘ１０４の正確な数を示しており、左から右に、３．３６、３．６７、３．５２、１．６８、０．８９、１．４２、１．８６、および０．７６である。
【0172】
図９は、ｘ軸上で左から右に様々な処置群を示す棒グラフである。これらの群は、左から右に、Ｌｉｐｏ、ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２である。ｙ軸は、１ウェルあたりの生きている細胞ｘ１０４の数を示し、０．５０刻みで０．００から３．５０の範囲である。各バーの上には、１ウェルあたりの生きている細胞ｘ１０４の正確な数を示しており、左から右に、３．０２、１．７２、２．３３、１．５０、０．４３、０．０４、０．０２、および０．０４である。
【0173】
図１０は、上列にＮＴ１サンプルを示しており、左から右へ、明視野像、少数の赤い斑点のあるヨウ化プロピジウム死細胞染色、および多くの青い斑点のあるＮｕｃＢｌｕｅ生細胞染色試薬を示している。下列段はＧＮＰＤＡ２サンプルを示しており、左から右に、明視野像、赤い斑点の多いヨウ化プロピジウム死細胞染色、青い斑点の多いＮｕｃＢｌｕｅ生細胞染色試薬を示している。
【0174】
図１１は、ｘ軸上で左から右に、様々な処置群を示す棒グラフである。これらの群は、左から右に、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＩＲＸ１、およびＡＤＡＭＴＳ１６である。ｙ軸は、１ウェルあたりの生きている細胞ｘ１０４の数を示し、１刻みで０から８の範囲である。各バーの上に、１ウェルあたりの生存している細胞ｘ１０４の正確な数があり、左から右に、７．３３、３．８１、３．１７、２．７、および２．９３である。上に示されたグラフの表題は、Ｈ１５６３に特異的なＣＮＶテストである。
【0175】
図１２Ａは棒グラフを示し、これはＸ軸上で左から右へ、試験された様々な時点を示しており、２４時間、４２時間、および７２時間である。各時点内で、試験された５つのグループが５つのバーとして示されており、左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１－１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２である。ｙ軸は、０．００から１５０００．００までの５０００．００刻みのスケールバーを示す。グラフの表題はＡ５４９＿Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ｇｌｏである。
【0176】
図１２Ｂは、Ａ５４９＿計数という表題の棒グラフである。ｙ軸は、左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２の様々な処置群を示す。ｙ軸は、細胞数（ｘ１０４）を示しており、２刻みで０から８の範囲である。
【0177】
図１３は、左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５、およびＭＴ２である、様々な処置後の細胞を示す顕微鏡画像を示している。ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、およびＣＣＲ５の画像は、生細胞を指す矢印を含む。
【0178】
図１４は、Ａ５４９＿ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏと題された最初の試験を描いた棒グラフを示しており、Ｘ軸上では、左から右に、試験された様々な時点を示しており、２４時間、４４時間、および５１時間である。各時点内で、試験された様々な群がバーで示され、左から右に、パルスのみ、ｐＥＴ２１ａ、ＭＴ２、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＨＢＧ、およびパルスなしである。ｙ軸は、０から７０００までの範囲の発光を１０００刻みで示す。
【0179】
図１５Ａは、Ｎａｔｔｅｓｔａｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （Ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２８， １１２６－１１３５ （２０１８）．）からのＳＫ－ＢＲ－３ ＥＲＢＢ２領域全ゲノム配列データの３つのグラフを示す。３つのグラフの左に表示されているのはスケールバーであり、下が１０Ｍｂｐ、上が０．１Ｍｂｐを示す。一番上のグラフは、インデルのない１７番染色体とＥＲＢＢ２を示し、３７．８４Ｍから３７．８９Ｍの領域を０．０１Ｍ刻みで示している。真ん中のグラフは、３７Ｍから３８．５Ｍまでの領域を０．５Ｍ刻みでスケーリングしたものであり、小さなＳＣＮＡがないことを示している。下のグラフは２０Ｍから８０Ｍの領域を１０Ｍ刻みでスケーリングしたものであり、多くの遺伝子が見られる。矢印は大きなＳＣＮＡを示している。３つのグラフすべてのｙ軸は１００刻みで０から６００までの範囲である。
【0180】
図１５Ｂは、左から右に、ｃｈｒｏｍ１、ｐｏｓ１、鎖１、ｃｈｒｏｍ２、ｐｏｓ２、および鎖２を示す表である。ｃｈｒｏｍ１の下には、１７、変異名（ｖａｒｉａｎｔ＿ｎａｍｅ）、および２２７９０がある。ｐｏｓ１の下は２６６５４１３５、変異型（ｖａｒｉａｎｔ＿ｔｙｐｅ）、およびＤＵＰがあり、鎖１の下は“－”、ｓｐｌｉｔ、および３７があり、ｃｈｒｏｍ２の下は１７、サイズ、および４８４１４０５２があり、ｐｏｓ２の下は７５０６８１８７、ＣＮＶ＿カテゴリー、および一致があり、鎖２の下は “＋”、カテゴリー、およびソロ（ｓｏｌｏ）がある。
【0181】
図１５Ｃは、Ｎａｔｔｅｓｔａｄらから推定されたＳＫ－ＢＲ－３ ＥＲＢＢ２のＣＮＶサンクション配列を示す。左には、この配列の下で、ｃｈｒ１７：７５，０５８，１８８－７５，０６８，１８７があり、すぐ右にはｃｈｒ１７：２６，６５４，１３５－２６，６６４，１３４がある。これらの２つの領域にまたがっているのは、６０ｂｐの接合領域である。接合領域内には、ＥＲＢＢ２ ＣＴ５、ＥＲＢＢ２ ＣＴ７、およびＥＲＢＢ２ ＣＴ６がある。
【0182】
図１６Ａは、ＳＫＢＲ３＿ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏと題された棒グラフを示しており、Ｘ軸上では、左から右に、試験された様々な時点を示しており、２４時間、４２時間、および４８時間である。各時点内で、試験された様々な群がバーで示され、左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＭＴ２、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、およびパルスなしである。軸は、０から４０００までの範囲の発光を１０００刻みで示す。
【0183】
図１６Ｂは棒グラフを示し、図１６Ａのグラフに関する生データである。Ｘ軸は、左から右に、試験された様々な時点を示し、２４時間、４２時間、および４８時間である。各時点内で、試験された様々な群がバーで示され、左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、およびパルスなしである。軸は、０から４０００までの範囲の値を５００刻みで示す。
【0184】
図１７は、左から右に、Ｘ軸上で、パルスのみ、ＮＴ１、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＥＲＢＢ２、およびＫＲＴ１６を含む試験された様々な群を示す棒グラフを示している。ｙ軸は、細胞数（ｘ１０^５）を示しており、５刻みで０から１５である。
【0185】
図１８は、ＡｄｅｙらからのＨＰＶとＨｅＬａ細胞の組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）データを示す。紫はＨｅＬａ（ＨｅｐＢパネルに表示され、ＨｅｐＡパネルの上に表示される）、緑はＨＰＶ（ＨｅｐＡパネルでは下に表示される）である。信号の強さは濃淡の色で示されている。左上のキーは説明文を示しており、上列では紫色の濃淡、下列では緑色の濃淡を示している、説明文の上列は、左から右に、４倍、３４倍、および１３倍を示している。説明文の下列は、左から右に、３０倍、１２倍、および３倍を示す。
【0186】
図１８Ｂは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、Ｌａｎｄｒｙら、Ａｄｅｙら、およびＬｉｕらから推測されるＨｅＬａ細胞におけるＨＰＶ配列データを示す。図で示されているのは、ヒト染色体である。左から右に、以下の領域：１Ｘ、３Ｘ、および６Ｘを示す。反復数をＸ、開いている配列のみを矢印で示している。図の下の文章は、特定の領域のアノテーションを示しており、左から右に、ヒト２ａ、ＨＰＶ７、ＨＰＶ４、ヒト１、ヒト３、ＨＰＶ６、ＨＰＶ４、およびヒト１である。
【0187】
【0188】
図１９Ａは、細胞計数と題されたグラフを示し、Ｘ軸は、左から右に、ＣＣＲ５、ＭＴ２、およびＰＲＤＭ９を含む試験された様々な群を示している。ｙ軸は、０から２００００までの生細胞数を２０００刻みで示している。
【0189】
図１９Ｂは、細胞計数と題されたグラフを示しており、Ｘ軸は左から右に、ＣＣＲ５、ＭＴ２、ＰＲＤＭ９、およびＨＰＶ＿１を含む試験された様々な群を示している。ｙ軸は、０から３５０００までの生細胞数を５０００刻みで示す。
【0190】
図２０Ａは、Ｃｅｌｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏと題されたグラフを示し、ｘ軸上で、左から右に、２４時間、４８時間、および７２時間を含む試験された様々な時点を示す。各時点内で、様々な群が試験され、左から右に、パルスのみ（ＧＦＰ）、ＣＣＲ５、ＭＴ２、ＨＰＶ＿１、およびＰＲＤＭ９である。ｙ軸は、０から６０００までの範囲の発光シグナルを１０００刻みで示している。
【0191】
図２０Ｂは、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏと題されたグラフを示す。ｙ軸は、０から１００までの相対的な発光シグナルを２０刻みで示し、ｘ軸は、（左から右へ）ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３、ＣＣＲ５、ＭＴ２、およびＨＰＶ１である、試験された様々な群を示す。
【0192】
図２１は、Ｘ軸上で試験された様々な群を示すグラフを示す。ｘ軸上で左から右に、ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１、ＭＴ２、ＴＲＡＰＰＣ、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、およびＣＤＫ８が示されている。ｙ軸は、０．００から６０．００までの細胞数（ｘ１０＾４ 細胞／ウェル）を１０．００刻みで示している。
【0193】
図２２は、クロスチェック（１５６３中の１２９９のターゲット）と題されたグラフを示す。ｘ軸は、左から右に、ＣＣＲ５、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２である、試験された様々な群を示す。ｙ軸は、０から１４までの細胞数（１ウェルあたりｘ１０＾４の細胞）を２刻みで示している。各グループについて表示されているバーでは、１ウェルあたりの生きている細胞（ｘ１０＾４）の正確な数が表示されており、左から右に、７．３３、１０．７、１３、１２、および３．７である。
【0194】
図２３は、細胞の顕微鏡画像を示す。上列は、左から右に、ＳＭＩＭ１１ Ｈ１５６３とＧＮＰＤＡ２ Ｈ１５６３を示す。右下の列は、左から右に、ＳＬＣ１５Ａ５ Ｈ１５６３とＫＣＮＥ２ Ｈ１５６３を示す。
【0195】
図２４はグラフであり、ｘ軸は左から右に、パルスのみ、ＮＴ１、ＣＣＲ５、ＫＣＮＥ２、ＧＮＰＤＡ２、ＳＭＩＭ１１、およびＳＬＣ１５Ａ５を示している。Ｙ軸は、０から１４０００までの発光を２０００刻みで示している。グラフは、Ｈ１２９９＿ＡｎｎＶ＋と題されている。
【0196】
図２５は、左から右に、パルスのみ、ＰＸ４５９－ＥＧＦＲ＿ＷＴ、ＰＸ４５９－ＣＣＲ５、ＰＸ４５９－ＥＧＦＲ＿Ｅ２、ＰＸ４５９－ＲｅｃＪ－ＣＣＲ５、およびＰＸ４５９－ＲｅｃＪ－ＥＧＦＲ＿Ｅ２の顕微鏡画像を示している。下部は、左から右へ、パルスのみ、ＰＸ４５９－ＥＧＦＲ＿ＷＴ、ＰＸ４５９－ＣＣＲ５、ＰＸ４５９－ＥＧＦＲ＿Ｅ２、ＰＸ４５９－ＲｅｃＪ－ＣＣＲ５、およびＰＸ４５９－ＲｅｃＪ－ＥＧＦＲ＿Ｅ２を示すグラフである。ｙ軸は、０から４００００までの範囲のライブセルシグナル（発光）を５００００刻みで示す。ｙ軸は、０から４００００までの生細胞数を５０００刻みで示す。
【0197】
図２６はグラフを示し、これは、ｘ軸上で、左から右に、パルスのみ、Ｃａｓ９－ＧＦＰのみ、ｓｇＲＮＡのみ、およびＥＧＦＲ＿Ｅ２ ＲＮＰを示している。Ｙ軸は、－８０から２０までの細胞数変化％を２０刻みで示している。上に示すグラフのタイトルは、エレクトロポレーションの２４時間後の生細胞シグナルである。
【0198】
図２７は、４８時間の時点でのＨ１５６３細胞生存率アッセイのグラフを示す。ｘ軸は、左から右に、パルスのみ、ｓｇＲＮＡのみ、およびＭＴ２ ＲＮＰを示す。Ｙ軸は、０から１５０までの生細胞シグナル（発光）を５０刻みで示している。グラフの上に示されているタイトルは、Ｈ１５６３細胞生存率アッセイ（４８ｈｐｔ）である。
【0199】
図２８は上で細胞の明視野画像を示し、左から右に、モック（Ｃａｓ９ＧＦＰのみ）、モック（ｓｇＲＮＡのみ）、単一標的（ＣＣＲ５ ＲＮＰ）、複数標的（ＧＮＰＤＡ２ ＲＮＰ）、複数標的（ＳＭＩＭ１１ ＲＮＰ）を示している。左下は、ｘ軸上で左から右に、モック（Ｃａｓ９ＧＦＰのみ）、モック（ｓｇＲＮＡのみ）、単一標的（ＣＣＲ５ ＲＮＰ）、複数標的（ＧＮＰＤＡ２ ＲＮＰ）、および複数標的（ＳＭＩＭ１１ ＲＮＰ）を示し、ｙ軸に０から２５０００までの生細胞シグナル（発光）を５０００刻みで示したグラフである。右下のグラフは、ｘ軸上で左から右に、モック（Ｃａｓ９ＧＦＰのみ）、モック（ｓｇＲＮＡのみ）、単一標的（ＣＣＲ５ ＲＮＰ）、複数標的（ＭＴ２）を示している。ｙ軸は、０から２００００までの生細胞シグナル（発光）を５０００刻みで示す。
【0200】
図２９は、パルスのみ、ＮＴ１（非標的）、ＭＴ２、ＣＤＫ８、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、およびＴＲＡＰＰＣ９の処置群をｘ軸上に（左から右へ）示した棒グラフである。Ｙ軸は発光を示し、０から１４００までの範囲を２００刻みで示す。
【0201】
図３０は、ＡｓＣｐｆ１＿ｃｒＲＮＡとＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの結合部位ＷＴの標的配列を示す。標的結合領域の左にはＵ６プロモーター領域の末端があり、配列の下列にはＣＭＶエンハンサー領域の開始がある。
【0202】
図３１は、上に、左から右に、Ｃａｓ１２ａ－ＥＧＦＲ ＷＴ、Ｃａｓ１２ａ－ＣＣＲ５、およびＣａｓ１２ａ－ＥＧＦＲ Ｅ２である、様々な処置群の細胞の明視野画像を示している。下部は、Ｘ軸上で、左から右に、Ｃａｓ１２ａ－ＥＧＦＲ ＷＴ、Ｃａｓ１２ａ－ＣＣＲ５、およびＣａｓ１２ａ－ＥＧＦＲ Ｅ２の様々な処置群を示す棒グラフである。ｙ軸は、０から４５００までの範囲の生細胞シグナル（発光）を５００刻みで示す。
【0203】
番号付けした実施形態
以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列を詳述する。場合によっては、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は、非限定的である。その他の場合において、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は限定されている。特徴の組み合わせのその他の順列も考慮される。特に、これらの番号を付けた実施形態の各々は、列挙されるような順序とは無関係に、前述または後述の番号を付けた実施形態に依存するものとして、またはそれらに関連するものとして考慮される。本明細書に列挙されるいくつかの方法は、以下の要素ａ、ｂ、およびｃまですべてを含む。上記方法は、追加の要素をさらに含んでもよい。１．細胞死を誘導する組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含み、ここで、標的核酸は疾患に関連する、組成物。２．上記疾患は癌である、実施形態１に記載の組成物。３．癌は肺癌または膵臓癌である、実施形態２に記載の組成物。４．標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含む、実施形態１に記載の組成物。５．標的核酸は上記疾患に関連する配列である、実施形態１に記載の組成物。６．標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１に記載の組成物。７．染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態５に記載の組成物。８．標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１に記載の組成物。９．標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、およびＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１に記載の組成物。１０．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。１１．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態１０に記載の組成物。１２．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、あるいはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。１３．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。１４．ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に表記される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１に記載の組成物。１５．ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分はＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１に記載の組成物。１６．ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の組成物。１７．第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１に記載の組成物。１８．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、第１のドメインによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態１７に記載の組成物。１９．第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。２０．キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１に記載の組成物。２１．キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１に記載の組成物。２２．第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１に記載の組成物。２３．第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１に記載の組成物。２４．キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態１に記載の組成物。２５．ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１に記載の組成物。２６．上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２７．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２８．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２９．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３０．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３１．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３２．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。３３．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態１に記載の組成物。３４．細胞死を誘導するための方法であって、上記方法は、細胞中の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドと接触させ、それにより、細胞死を誘導する工程を含む、方法。３５．上記細胞は癌細胞である、実施形態３４に記載の方法。３６．上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態３４に記載の方法。３７．上記疾患は癌である、実施形態３６に記載の方法。３８．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態３６に記載の方法。３９．上記標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含む、実施形態３４に記載の方法。４０．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３４に記載の方法。４１．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３４に記載の方法。４２．上記標的核酸は、転座、癌に特異的な一塩基多型、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態３４に記載の方法。４３．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３４に記載の方法。４４．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。４５．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態４４に記載の方法。４６．キメラポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。４７．細胞中の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施例４６に記載の方法。４８．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３４に記載の方法。４９．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態５８に記載の方法。５０．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、またはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５１．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５２．ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３４に記載の方法。５３．上記ガイド核酸は、第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態３４に記載の方法。５４．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する、実施形態３４に記載の方法。５５．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態３４に記載の方法。５６．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態５５に記載の方法。５７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ４ドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３４に記載の方法。５９．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３４に記載の方法。６０．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３４に記載の方法。６１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３４に記載の方法。６２．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態３４に記載の方法。６３．上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。６４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体またはＺｎＳＯ４の少なくとも１つを被験体に投与することにより実施される、実施形態６３に記載の方法。６５．組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）正常細胞の第１染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも５つの塩基を含む、第１の部分と、正常細胞の第２染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも５つの塩基を含む、第２の部分とを含む、ガイド核酸と、を含む、組成物。６６．上記第１の部分はＢＣＲ遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第２の部分は、ＡＢＬ遺伝子の一部に相補性を含む、実施形態６５に記載の組成物。６７．上記第１の部分はＴＥＬ遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第２の部分はＡＭＬ遺伝子の一部に相補性を有する、実施形態６５に記載
の組成物。６８．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態６５に記載の組成物。６９．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態６５に記載の組成物。７０．上記第１のドメインがＣａｓ９ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７１．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７２．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７３．第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態６５に記載の組成物。７４．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態７３に記載の組成物。７５．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ１ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７６．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態６５に記載の組成物。７７．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態６５に記載の組成物。７８．上記第２のドメインは、切断された末端切除活性を有するドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７９．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態６５に記載の組成物。８０．上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態６５に記載の組成物。８１．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態６５に記載の組成物。８２．上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８３．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８４．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８５．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８６．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８７．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８８．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態６５に記載の組成物。８９．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態６５に記載の組成物。９０．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、前記方法は、被験体の標的核酸を、実施形態６５～８９のいずれか１つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。９１．上記標的核酸は、第１染色体の一部と第２染色体の一部とを含む染色体転座の領域にある、実施形態９０に記載の方法。９２．上記標的核酸は、上記ガイド核酸の第１の部分および第２の部分にハイブリダイズする、実施形態９０に記載の方法。９３．上記組成物を被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例９０に記載の方法。９４．上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例９０に記載の方法。９５．上記停止させる工程は、キメラポリペプチドに特異的な抗体を被験体に投与することにより実施される、実施形態９０に記載の方法。９６．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を被験体に投与することにより実施される、実施形態９０に記載の方法。９７．病原体を標的とするための組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）病原体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物。９８．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態９７に記載の組成物。９９．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態９７に記載の組成物。１００．上記病原体はウイルスである、実施形態９７に記載の組成物。１０１．上記病原体は細菌である、実施形態９７に記載の組成物。１０２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態９７に記載の組成物。１０３．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１０２に記載の組成物。１０４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０５．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０６．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０７．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態９７に記載の組成物。１０８．上記第１のドメインの誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１０７に記載の組成物。１０９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１１０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態９７に記載の組成物。１１１．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態９７に記載の組成物。１１２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態９７に記載の組成物。１１３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態９７に記載の組成物。１１４．上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態９７に記載の組成物。１１５．上記ガイド核酸は宿主核酸に結合しない、実施形態９７に記載の組成物。１１６．上記組成物は、経口投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１７．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１８．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１９．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２０．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２１．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２２．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態９７に記載の組成物。１２３．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態９７に記載の組成物。１２４．被験体の病原体を標的とするための方法であって、上記方法は、上記被験体の病原体の標的核酸を、実施形態９７～１２３のいずれか１つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。１２５．キメラポリペプチドは上記標的核酸を切断する、実施形態１２４に記載の方法。１２６．上記組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例１２４に記載の方法。１２７．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１２４に記載の方法。１２８．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１２４に記載の方法。１２９．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１２４に記載の方法。１３０．疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体にリボ核タンパク質複合体を投与することを含み、上記リボ核タンパク質複合体は：（ｉ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドと；（ｉｉ）上記被験体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、方法。１３１．上記疾患は癌である、実施形態１３０に記載の方法。１３２．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態１３０に記載の方法。１３３．上記標的核酸は、上記疾患に関連する配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１３４．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態１３０に記載の方法。１３５．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態１３０に記載の方法。１３６．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態１３０に記載の方法。１３７．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態１３０に記載の方法。１３８．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１３０に記載の方法。１３９．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態１３８に記載の方法。１４０．上記標的核酸は転座を含む、実施形態１３９に記載の方法。１４１．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４２．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４３．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４４．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１３０に記載の方法。１４５．上記ポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４６．上記ポリペプチドによって、標的核酸を含む細胞中の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４７．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４８．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１４７に記載の方法。１４９．上記ポリペプチドはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５０．上記ポリペプチドはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５１．上記ポリペプチドはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５２．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１５３．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１３０に記載の組成物。１５４．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａ
ａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１３０に記載の組成物。１５５．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１３０に記載の方法。１５６．上記ポリペプチドは、上記配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態１５５に記載の方法。１５７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１５６に記載の方法。１５８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１５６に記載の方法。１５９．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１５６に記載の方法。１６０．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１５６に記載の方法。１６１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１５６に記載の方法。１６２．上記ポリペプチドによる標的核酸の切断後、上記被験体の上記ポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１３０に記載の方法。１６３．上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１３０に記載の方法。１６４．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を被験体に投与することにより実施される、実施形態１３０に記載の方法。１６５．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を、被験体に施す工程と；ｂ）上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと接触させる工程と、を含む、方法。１６６．上記療法は免疫療法である、実施形態１６５に記載の方法。１６７．上記免疫療法はＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、実施形態１６６に記載の方法。１６８．上記免疫療法はトラスツズマブ１６９を投与することを含む、実施形態１６６に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態１６５に記載の方法。１７０．上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態１６９に記載の方法。１７１．ａ）とｂ）の組み合わせは、ａ）単独またはｂ）単独の治療効果と比較して、増強された治療効果をもたらす、実施形態１６５に記載の方法。１７２．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態１６５に記載の方法。１７３．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態１６５に記載の方法。１７４．上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態１６５に記載の方法。１７５．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態１６５に記載の方法。１７６．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態１６５に記載の方法。１７７．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１６５に記載の方法。１７８．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態１７７に記載の方法。１７９．上記標的核酸は転座を含む、実施形態１７７に記載の方法。１８０．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８１．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８２．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８３．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。１８４．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１８３に記載の方法。１８５．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８６．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８７．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有し、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８８．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。１８９．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１６５に記載の方法。１９０．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１６５に記載の方法。１９１．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１６５に記載の方法。１９２．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９３．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９４．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９５．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１６５に記載の方法。１９６．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１９５に記載の方法。１９７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１９５に記載の方法。１９８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１６５に記載の方法。１９９．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１６５に記載の方法。２００．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１６５に記載の方法。２０１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１６５に記載の方法。２０２．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態１６５に記載の方法。２０３．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。２０４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２０３に記載の方法。２０５．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２０３に記載の方法。２０６．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）第１の時点で上記被験体の第１の健康状態を定量化する工程と；ｂ）化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を上記被験体に投与する工程と；ｃ）上記療法の後の第２の時点で、上記被験体の第２の健康状態を定量化する工程と；ｄ）上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとの含むキメラポリペプチドと接触させる工程と；ｅ）接触させた後の第３の時点で、上記被験体の第３の健康状態を定量化する工程と、を含む、方法。２０７．上記第１の健康状態、上記第２の健康状態、または上記第３の健康状態を定量化する工程は、生検、画像検査、遺伝子検査、腫瘍分子プロファイリング、臨床検査、あるいは核酸配列決定の１つ以上の使用を含む、実施形態２０６に記載の方法。２０８．上記療法は免疫療法である、実施形態２０６に記載の方法。２０９．上記免疫療法はＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、実施形態２０８に記載の方法。２１０．上記免疫療法はトラスツズマブ２１１を投与することを含む、実施形態２０８に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態２０６に記載の方法。２０５．上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態２１１に記載の方法。２１３．上記被験体の上記第３の健康状態は、上記第１の健康状態および上記第２の健康状態よりも良好である、実施形態２０６に記載の方法。２１４．上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態２０６に記載の方法。２１５．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態２０６に記載の方法。２１６．上記標的核酸は癌に関連する配列を含む、実施形態２０６に記載の方法。２１７．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２０６に記載の方法。２１８．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２０６に記載の方法。２１９．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２０６に記載の方法。２２０．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２０６に記載の方法。２２１．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２１９に記載の方法。２２２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２３．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２４．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２５．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２２６．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２２５に記載の方法。２２７．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態２２５に記載の方法。２２８．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態２２５に記載の方法。２２９．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、
配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態２２５に記載の方法。２３０．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２３１．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２０６に記載の方法。２３２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２０６に記載の方法。２３３．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２３２に記載の方法。２３４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３５．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３６．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３７．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２０６に記載の方法。２３８．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２３７に記載の方法。２３９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２４０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２０６に記載の方法。２４１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２０６に記載の方法。２４２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２０６に記載の方法。２４３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２０６に記載の方法。２４４．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態２０６に記載の方法。２４５．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２４６．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２４５に記載の方法。２４７．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２４５に記載の方法。２４８．被験体におけるポリペプチドの活性を停止させるための方法であって、上記方法は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドを用いて、上記被験体の標的核酸を切断する工程と；ｂ）上記被験体のポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。２４９．上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５０．上記停止させる工程は、上記被験体にＺｎＳＯ４を投与することを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５１．上記被験体は疾患を患っている、実施形態２４８に記載の方法。２５２．上記疾患は癌である、実施形態２５１に記載の方法。２５３．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態２５１に記載の方法。２５４．上記標的核酸は上記疾患に関連する配列を含む、実施形態２５１に記載の方法。２５５．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５６．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５７．上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態２４８に記載の方法。２５８．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態２４８に記載の方法。２５９．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２４８に記載の方法。２６０．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２４８に記載の方法。２６１．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２６０に記載の方法。２６２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６３．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６４．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６５．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２４８に記載の方法。２６６．上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６７．上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６８．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６９．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２４８に記載の方法。２７０．上記ポリペプチドはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７１．上記ポリペプチドはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７２．上記ポリペプチドはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７３．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２４８に記載の方法。２７４．上記ポリペプチドは、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態２４８に記載の方法。２７５．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７６．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２４８に記載の方法。２７７．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２４８に記載の方法。２７８．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２４８に記載の方法。２７９．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２４８に記載の方法。２８０．２つ以上の核酸を標的とするための組成物であって、上記組成物は、ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）２つ以上のガイド核酸であって、ここで、上記ガイド核酸はそれぞれ、細胞の異なる標的核酸に相補的な配列を含む、２つ以上のガイド核酸とを含む、組成物。２８１．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８２．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８３．上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８４．上記疾患は癌である、実施形態２８３に記載の組成物。２８５．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態２８３に記載の組成物。２８６．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８７．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８８．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８９．上記細胞は癌細胞である、実施形態２８０に記載の組成物。２９０．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２８０に記載の組成物。２９１．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２９０に記載の組成物。２９２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９３．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２９１に記載の組成物。２９４．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９５．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される、遺伝子の一部を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９６．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９７．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２９６に記載の組成物。２９８．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９９．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３００．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０１．上記第１のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２８０に記載の組成物。３０２．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインの上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３０１に記載の組成物。３０３．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０４．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２８０に記載の組成物。３０５．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２８０に記載の組成物。３０６．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０７．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０８．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２８０に記載の組成物。３０９．上記組成物は１つ以上のリボ核タンパク質複合体
を含み、ここで、各リボ核タンパク質複合体は、上記キメラポリペプチドおよび上記２つ以上のガイド核酸の１つガイド核酸を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１０．上記組成物は、経口投与のために製剤化される実施形態２８０に記載の組成物。３１１．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１２．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１３．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１４．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１５．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１６．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１７．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１８．疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体の標的核酸を、実施形態２８０～３１７のいずれか１つの組成物と接触させる工程を含む、方法。３１９．上記疾患は癌である、実施形態３１８に記載の方法。３２０．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態３１８に記載の方法。３２１．キメラポリペプチドによって標的核酸を切断する工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２２．細胞死を誘導する工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２３．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態３２３に記載の方法。３２５．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態３２３に記載の方法。３２６．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）上記被験体から生体サンプルを得る工程と；ｂ）上記生体サンプル中の核酸の配列情報を決定する工程と；ｃ）上記配列情報から標的核酸を同定する工程であって、上記標的核酸は、癌に関連している、工程と；ｄ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインとエキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドを含むリボ核タンパク質複合体と、上記標的核酸の一部に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物を投与する工程と；ｅ）上記被験体の癌細胞のキメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程と；ｆ）上記キメラポリペプチドによる癌細胞の他の核酸を非特異的に切断し、それによって、上記癌細胞の細胞死を引き起こす、工程と；ｇ）上記被験体にターミネーターを投与し、それによって、上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。３２７．上記生体サンプルは、血液、血漿、唾液、体液、腫瘍サンプル、生検サンプル、無細胞核酸を含むサンプル、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態３２６に記載の方法。３２８．上記決定する工程は、配列決定することをさらに含む、実施形態３２６に記載の方法。３２９．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３２６に記載の方法。３３０．上記ターミネーターは、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体である、実施形態３２６に記載の方法。３３１．上記ターミネーターはＺｎＳＯ４である、実施形態３２６に記載の方法。３３２．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態３２６に記載の方法。３３３．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態３２６に記載の方法。３３４．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３２６に記載の方法。３３５．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３３４に記載の方法。３３６．上記標的核酸は転座を含む、実施形態３３４に記載の方法。３３７．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態３２６に記載の方法。３３８．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態３２６に記載の方法。３３９．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３２６に記載の方法。３４０．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態３２６に記載の方法。３４１．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３２６に記載の方法。３４２．上記非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３４１に記載の方法。３４３．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４４．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４５．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４６．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３２６に記載の方法。３４７．上記第１のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態３２６に記載の方法。３４８．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３４７に記載の方法。３４９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３５０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３２６に記載の方法。３５１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３２６に記載の方法。３５２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３２６に記載の方法。３５３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３２６に記載の方法。３５４．細胞中の細胞死を選択的に誘導する方法であって、上記方法は：ａ）配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドと、上記細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を投与する工程と；ｂ）上記標的核酸を切断し、それによって、細胞死を誘導する工程と、を含む、方法。３５５．上記標的核酸は疾患に関連している、実施形態３５４に記載の方法。３５６．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態３５４に記載の方法。３５７．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３５４に記載の方法。３５８．上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態３５４に記載の方法。３５９．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態３５４に記載の方法。３６０．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態３５４に記載の方法。３６１．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３５４に記載の方法。３６２．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３６１に記載の方法。３５３．上記細胞は複数の細胞中にある、実施形態３５４に記載の方法。３６４．上記複数の細胞は正常細胞を含む、実施形態３６４に記載の方法。３６５．投与後に、上記正常細胞は生きている、実施形態３６４に記載の方法。３６６．投与後に、上記正常細胞は増殖する、実施形態３６４に記載の方法。３６７．上記切断は、前記細胞内の１つ以上の切断部位で切断することを含む、実施形態３６４に記載の方法。３６８．上記疾患は癌である、実施形態３５５に記載の方法。３６９．上記癌は肺癌または膵臓癌を含む、実施形態３６８に記載の方法。３７０．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を有する、実施形態３５４に記載の方法。３７１．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＥＲ２、ＫＩＦ５Ａ、ＩＲＸ１、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＧＮＰＤＡ２、ＫＣＮＥ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＭＩＭ１１、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＣＤ６８ＳＨＢＧ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、ＣＤＫ８、ＴＲＡＰＰＣ９、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＩＲＰＢ１、ＭＲＣ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＰＯＴＥＢ、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＰＲＤＭ９、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＨＰＶ、ＬＩＮＥ２（ＭＴ２）、ＣＣＲ５、またはＨＰＲＴ１からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３５４に記載の方法。３７２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３５４に記載の方法。３７３．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３７２に記載の方法。３７４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、またはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７５．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７６．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７７．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７８．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３５４に記載の方法。３７９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３８０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３５４に記載の方法。３８１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３５４に記載の方法。３８２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３５４に記載の方法。３８３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３５４に記載の方法。３８４．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３６４に記載の方法。
以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列を詳述する。場合によっては、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は、非限定的である。その他の場合において、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は限定されている。特徴の組み合わせのその他の順列も考慮される。特に、これらの番号を付けた実施形態の各々は、列挙されるような順序とは無関係に、前述または後述の番号を付けた実施形態に依存するものとして、またはそれらに関連するものとして考慮される。本明細書に列挙されるいくつかの方法は、以下の要素ａ、ｂ、およびｃまですべてを含む。上記方法は、追加の要素をさらに含んでもよい。１．細胞死を誘導する組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含み、ここで、標的核酸は疾患に関連する、組成物。２．上記疾患は癌である、実施形態１に記載の組成物。３．癌は肺癌または膵臓癌である、実施形態２に記載の組成物。４．標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含む、実施形態１に記載の組成物。５．標的核酸は上記疾患に関連する配列である、実施形態１に記載の組成物。６．標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１に記載の組成物。７．染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態５に記載の組成物。８．標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１に記載の組成物。９．標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、およびＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１に記載の組成物。１０．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。１１．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態１０に記載の組成物。１２．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、あるいはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。１３．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。１４．ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に表記される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１に記載の組成物。１５．ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分はＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１に記載の組成物。１６．ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の組成物。１７．第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１に記載の組成物。１８．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、第１のドメインによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態１７に記載の組成物。１９．第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１に記載の組成物。２０．キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１に記載の組成物。２１．キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１に記載の組成物。２２．第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１に記載の組成物。２３．第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１に記載の組成物。２４．キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態１に記載の組成物。２５．ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１に記載の組成物。２６．上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２７．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２８．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態１に記載の組成物。２９．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３０．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３１．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態１に記載の組成物。３２．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。３３．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態１に記載の組成物。３４．細胞死を誘導するための方法であって、上記方法は、細胞中の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドと接触させ、それにより、細胞死を誘導する工程を含む、方法。３５．上記細胞は癌細胞である、実施形態３４に記載の方法。３６．上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態３４に記載の方法。３７．上記疾患は癌である、実施形態３６に記載の方法。３８．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態３６に記載の方法。３９．上記標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含む、実施形態３４に記載の方法。４０．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３４に記載の方法。４１．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３４に記載の方法。４２．上記標的核酸は、転座、癌に特異的な一塩基多型、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態３４に記載の方法。４３．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３４に記載の方法。４４．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。４５．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態４４に記載の方法。４６．キメラポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。４７．細胞中の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施例４６に記載の方法。４８．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３４に記載の方法。４９．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態５８に記載の方法。５０．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、またはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５１．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５２．ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３４に記載の方法。５３．上記ガイド核酸は、第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態３４に記載の方法。５４．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する、実施形態３４に記載の方法。５５．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態３４に記載の方法。５６．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態５５に記載の方法。５７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ４ドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３４に記載の方法。５８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３４に記載の方法。５９．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３４に記載の方法。６０．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３４に記載の方法。６１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３４に記載の方法。６２．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態３４に記載の方法。６３．上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例３４に記載の方法。６４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体またはＺｎＳＯ４の少なくとも１つを被験体に投与することにより実施される、実施形態６３に記載の方法。６５．組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）正常細胞の第１染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも５つの塩基を含む、第１の部分と、正常細胞の第２染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも５つの塩基を含む、第２の部分とを含む、ガイド核酸と、を含む、組成物。６６．上記第１の部分はＢＣＲ遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第２の部分は、ＡＢＬ遺伝子の一部に相補性を含む、実施形態６５に記載の組成物。６７．上記第１の部分はＴＥＬ遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第２の部分はＡＭＬ遺伝子の一部に相補性を有する、実施形態６５に記載
の組成物。６８．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態６５に記載の組成物。６９．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態６５に記載の組成物。７０．上記第１のドメインがＣａｓ９ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７１．第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７２．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７３．第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態６５に記載の組成物。７４．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態７３に記載の組成物。７５．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ１ドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７６．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態６５に記載の組成物。７７．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態６５に記載の組成物。７８．上記第２のドメインは、切断された末端切除活性を有するドメインを含む、実施形態６５に記載の組成物。７９．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態６５に記載の組成物。８０．上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態６５に記載の組成物。８１．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態６５に記載の組成物。８２．上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８３．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８４．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８５．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８６．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８７．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態６５に記載の組成物。８８．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態６５に記載の組成物。８９．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態６５に記載の組成物。９０．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、前記方法は、被験体の標的核酸を、実施形態６５～８９のいずれか１つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。９１．上記標的核酸は、第１染色体の一部と第２染色体の一部とを含む染色体転座の領域にある、実施形態９０に記載の方法。９２．上記標的核酸は、上記ガイド核酸の第１の部分および第２の部分にハイブリダイズする、実施形態９０に記載の方法。９３．上記組成物を被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例９０に記載の方法。９４．上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例９０に記載の方法。９５．上記停止させる工程は、キメラポリペプチドに特異的な抗体を被験体に投与することにより実施される、実施形態９０に記載の方法。９６．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を被験体に投与することにより実施される、実施形態９０に記載の方法。９７．病原体を標的とするための組成物であって、上記組成物は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）病原体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物。９８．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態９７に記載の組成物。９９．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態９７に記載の組成物。１００．上記病原体はウイルスである、実施形態９７に記載の組成物。１０１．上記病原体は細菌である、実施形態９７に記載の組成物。１０２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態９７に記載の組成物。１０３．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１０２に記載の組成物。１０４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０５．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０６．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１０７．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態９７に記載の組成物。１０８．上記第１のドメインの誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１０７に記載の組成物。１０９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態９７に記載の組成物。１１０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態９７に記載の組成物。１１１．上記キメラポリペプチドは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態９７に記載の組成物。１１２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態９７に記載の組成物。１１３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態９７に記載の組成物。１１４．上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態９７に記載の組成物。１１５．上記ガイド核酸は宿主核酸に結合しない、実施形態９７に記載の組成物。１１６．上記組成物は、経口投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１７．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１８．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１１９．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２０．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２１．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態９７に記載の組成物。１２２．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態９７に記載の組成物。１２３．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態９７に記載の組成物。１２４．被験体の病原体を標的とするための方法であって、上記方法は、上記被験体の病原体の標的核酸を、実施形態９７～１２３のいずれか１つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。１２５．キメラポリペプチドは上記標的核酸を切断する、実施形態１２４に記載の方法。１２６．上記組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例１２４に記載の方法。１２７．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１２４に記載の方法。１２８．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１２４に記載の方法。１２９．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１２４に記載の方法。１３０．疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体にリボ核タンパク質複合体を投与することを含み、上記リボ核タンパク質複合体は：（ｉ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドと；（ｉｉ）上記被験体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、方法。１３１．上記疾患は癌である、実施形態１３０に記載の方法。１３２．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態１３０に記載の方法。１３３．上記標的核酸は、上記疾患に関連する配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１３４．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態１３０に記載の方法。１３５．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態１３０に記載の方法。１３６．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態１３０に記載の方法。１３７．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態１３０に記載の方法。１３８．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１３０に記載の方法。１３９．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態１３８に記載の方法。１４０．上記標的核酸は転座を含む、実施形態１３９に記載の方法。１４１．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４２．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４３．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１３０に記載の方法。１４４．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１３０に記載の方法。１４５．上記ポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４６．上記ポリペプチドによって、標的核酸を含む細胞中の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４７．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１３０に記載の方法。１４８．誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１４７に記載の方法。１４９．上記ポリペプチドはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５０．上記ポリペプチドはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５１．上記ポリペプチドはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態１３０に記載の方法。１５２．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１３０に記載の方法。１５３．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１３０に記載の組成物。１５４．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａ
ａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１３０に記載の組成物。１５５．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１３０に記載の方法。１５６．上記ポリペプチドは、上記配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態１５５に記載の方法。１５７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１５６に記載の方法。１５８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１５６に記載の方法。１５９．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１５６に記載の方法。１６０．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１５６に記載の方法。１６１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１５６に記載の方法。１６２．上記ポリペプチドによる標的核酸の切断後、上記被験体の上記ポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１３０に記載の方法。１６３．上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態１３０に記載の方法。１６４．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を被験体に投与することにより実施される、実施形態１３０に記載の方法。１６５．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を、被験体に施す工程と；ｂ）上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと接触させる工程と、を含む、方法。１６６．上記療法は免疫療法である、実施形態１６５に記載の方法。１６７．上記免疫療法はＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、実施形態１６６に記載の方法。１６８．上記免疫療法はトラスツズマブ１６９を投与することを含む、実施形態１６６に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態１６５に記載の方法。１７０．上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態１６９に記載の方法。１７１．ａ）とｂ）の組み合わせは、ａ）単独またはｂ）単独の治療効果と比較して、増強された治療効果をもたらす、実施形態１６５に記載の方法。１７２．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態１６５に記載の方法。１７３．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態１６５に記載の方法。１７４．上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態１６５に記載の方法。１７５．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態１６５に記載の方法。１７６．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態１６５に記載の方法。１７７．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態１６５に記載の方法。１７８．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態１７７に記載の方法。１７９．上記標的核酸は転座を含む、実施形態１７７に記載の方法。１８０．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８１．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８２．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態１６５に記載の方法。１８３．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。１８４．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態１８３に記載の方法。１８５．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８６．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８７．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有し、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態１８３に記載の方法。１８８．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。１８９．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態１６５に記載の方法。１９０．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態１６５に記載の方法。１９１．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１６５に記載の方法。１９２．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９３．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９４．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態１６５に記載の方法。１９５．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態１６５に記載の方法。１９６．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態１９５に記載の方法。１９７．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態１９５に記載の方法。１９８．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態１６５に記載の方法。１９９．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態１６５に記載の方法。２００．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態１６５に記載の方法。２０１．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１６５に記載の方法。２０２．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態１６５に記載の方法。２０３．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例１６５に記載の方法。２０４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２０３に記載の方法。２０５．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２０３に記載の方法。２０６．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）第１の時点で上記被験体の第１の健康状態を定量化する工程と；ｂ）化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を上記被験体に投与する工程と；ｃ）上記療法の後の第２の時点で、上記被験体の第２の健康状態を定量化する工程と；ｄ）上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとの含むキメラポリペプチドと接触させる工程と；ｅ）接触させた後の第３の時点で、上記被験体の第３の健康状態を定量化する工程と、を含む、方法。２０７．上記第１の健康状態、上記第２の健康状態、または上記第３の健康状態を定量化する工程は、生検、画像検査、遺伝子検査、腫瘍分子プロファイリング、臨床検査、あるいは核酸配列決定の１つ以上の使用を含む、実施形態２０６に記載の方法。２０８．上記療法は免疫療法である、実施形態２０６に記載の方法。２０９．上記免疫療法はＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、実施形態２０８に記載の方法。２１０．上記免疫療法はトラスツズマブ２１１を投与することを含む、実施形態２０８に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態２０６に記載の方法。２０５．上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態２１１に記載の方法。２１３．上記被験体の上記第３の健康状態は、上記第１の健康状態および上記第２の健康状態よりも良好である、実施形態２０６に記載の方法。２１４．上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態２０６に記載の方法。２１５．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態２０６に記載の方法。２１６．上記標的核酸は癌に関連する配列を含む、実施形態２０６に記載の方法。２１７．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２０６に記載の方法。２１８．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２０６に記載の方法。２１９．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２０６に記載の方法。２２０．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２０６に記載の方法。２２１．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２１９に記載の方法。２２２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２３．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２４．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態２０６に記載の方法。２２５．上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２２６．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２２５に記載の方法。２２７．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態２２５に記載の方法。２２８．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態２２５に記載の方法。２２９．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は、
配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態２２５に記載の方法。２３０．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２３１．上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２０６に記載の方法。２３２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２０６に記載の方法。２３３．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２３２に記載の方法。２３４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３５．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３６．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２３７．上記第１のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２０６に記載の方法。２３８．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２３７に記載の方法。２３９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２０６に記載の方法。２４０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２０６に記載の方法。２４１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２０６に記載の方法。２４２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２０６に記載の方法。２４３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２０６に記載の方法。２４４．上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態２０６に記載の方法。２４５．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例２０６に記載の方法。２４６．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２４５に記載の方法。２４７．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態２４５に記載の方法。２４８．被験体におけるポリペプチドの活性を停止させるための方法であって、上記方法は：ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドを用いて、上記被験体の標的核酸を切断する工程と；ｂ）上記被験体のポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。２４９．上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５０．上記停止させる工程は、上記被験体にＺｎＳＯ４を投与することを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５１．上記被験体は疾患を患っている、実施形態２４８に記載の方法。２５２．上記疾患は癌である、実施形態２５１に記載の方法。２５３．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態２５１に記載の方法。２５４．上記標的核酸は上記疾患に関連する配列を含む、実施形態２５１に記載の方法。２５５．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５６．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２４８に記載の方法。２５７．上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態２４８に記載の方法。２５８．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態２４８に記載の方法。２５９．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２４８に記載の方法。２６０．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２４８に記載の方法。２６１．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２６０に記載の方法。２６２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６３．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６４．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態２４８に記載の方法。２６５．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２４８に記載の方法。２６６．上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６７．上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６８．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２４８に記載の方法。２６９．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２４８に記載の方法。２７０．上記ポリペプチドはＣａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７１．上記ポリペプチドはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７２．上記ポリペプチドはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７３．上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２４８に記載の方法。２７４．上記ポリペプチドは、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態２４８に記載の方法。２７５．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２４８に記載の方法。２７６．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２４８に記載の方法。２７７．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２４８に記載の方法。２７８．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２４８に記載の方法。２７９．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２４８に記載の方法。２８０．２つ以上の核酸を標的とするための組成物であって、上記組成物は、ａ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含む、キメラポリペプチドと；ｂ）２つ以上のガイド核酸であって、ここで、上記ガイド核酸はそれぞれ、細胞の異なる標的核酸に相補的な配列を含む、２つ以上のガイド核酸とを含む、組成物。２８１．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８２．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８３．上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２８４．上記疾患は癌である、実施形態２８３に記載の組成物。２８５．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態２８３に記載の組成物。２８６．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８７．上記ガイド核酸は第１の部分と第２の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧｇｔａａｔｔｔｃｔａｃｔａａｇｔｇｔａｇａｔに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８８．上記ガイド核酸は、第１の部分と、第２の部分と、第第３の部分とを含み、ここで、上記第１の部分は、配列：ａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含み、上記第２の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第３の部分は配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃに対して少なくとも約８５％の配列同一性を含む、実施形態２８３に記載の組成物。２８９．上記細胞は癌細胞である、実施形態２８０に記載の組成物。２９０．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態２８０に記載の組成物。２９１．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態２９０に記載の組成物。２９２．上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９３．上記標的核酸は転座を含む、実施形態２９１に記載の組成物。２９４．上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９５．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される、遺伝子の一部を含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９６．キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９７．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態２９６に記載の組成物。２９８．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。２９９．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３００．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０１．上記第１のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態２８０に記載の組成物。３０２．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインの上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３０１に記載の組成物。３０３．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０４．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態２８０に記載の組成物。３０５．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態２８０に記載の組成物。３０６．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０７．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態２８０に記載の組成物。３０８．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態２８０に記載の組成物。３０９．上記組成物は１つ以上のリボ核タンパク質複合体
を含み、ここで、各リボ核タンパク質複合体は、上記キメラポリペプチドおよび上記２つ以上のガイド核酸の１つガイド核酸を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１０．上記組成物は、経口投与のために製剤化される実施形態２８０に記載の組成物。３１１．上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１２．上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１３．上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１４．上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１５．上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態２８０に記載の組成物。３１６．上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１７．上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態２８０に記載の組成物。３１８．疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体の標的核酸を、実施形態２８０～３１７のいずれか１つの組成物と接触させる工程を含む、方法。３１９．上記疾患は癌である、実施形態３１８に記載の方法。３２０．上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態３１８に記載の方法。３２１．キメラポリペプチドによって標的核酸を切断する工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２２．細胞死を誘導する工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２３．上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施形態３１８に記載の方法。３２４．上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態３２３に記載の方法。３２５．上記停止させる工程は、ＺｎＳＯ４を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態３２３に記載の方法。３２６．癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は：ａ）上記被験体から生体サンプルを得る工程と；ｂ）上記生体サンプル中の核酸の配列情報を決定する工程と；ｃ）上記配列情報から標的核酸を同定する工程であって、上記標的核酸は、癌に関連している、工程と；ｄ）配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインとエキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドを含むリボ核タンパク質複合体と、上記標的核酸の一部に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物を投与する工程と；ｅ）上記被験体の癌細胞のキメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程と；ｆ）上記キメラポリペプチドによる癌細胞の他の核酸を非特異的に切断し、それによって、上記癌細胞の細胞死を引き起こす、工程と；ｇ）上記被験体にターミネーターを投与し、それによって、上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。３２７．上記生体サンプルは、血液、血漿、唾液、体液、腫瘍サンプル、生検サンプル、無細胞核酸を含むサンプル、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態３２６に記載の方法。３２８．上記決定する工程は、配列決定することをさらに含む、実施形態３２６に記載の方法。３２９．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３２６に記載の方法。３３０．上記ターミネーターは、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体である、実施形態３２６に記載の方法。３３１．上記ターミネーターはＺｎＳＯ４である、実施形態３２６に記載の方法。３３２．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態３２６に記載の方法。３３３．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態３２６に記載の方法。３３４．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３２６に記載の方法。３３５．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３３４に記載の方法。３３６．上記標的核酸は転座を含む、実施形態３３４に記載の方法。３３７．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態３２６に記載の方法。３３８．上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態３２６に記載の方法。３３９．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、またはＨＥＲ２からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３２６に記載の方法。３４０．上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態３２６に記載の方法。３４１．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３２６に記載の方法。３４２．上記非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３４１に記載の方法。３４３．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４４．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４５．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３４６．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３２６に記載の方法。３４７．上記第１のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質ドメインである、実施形態３２６に記載の方法。３４８．上記第１のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第１のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３４７に記載の方法。３４９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３２６に記載の方法。３５０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３２６に記載の方法。３５１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３２６に記載の方法。３５２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３２６に記載の方法。３５３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３２６に記載の方法。３５４．細胞中の細胞死を選択的に誘導する方法であって、上記方法は：ａ）配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む第１のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第２のドメインとを含むキメラポリペプチドと、上記細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を投与する工程と；ｂ）上記標的核酸を切断し、それによって、細胞死を誘導する工程と、を含む、方法。３５５．上記標的核酸は疾患に関連している、実施形態３５４に記載の方法。３５６．上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態３５４に記載の方法。３５７．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３５４に記載の方法。３５８．上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態３５４に記載の方法。３５９．上記標的核酸はＲＮＡを含む、実施形態３５４に記載の方法。３６０．上記標的核酸はＤＮＡを含む、実施形態３５４に記載の方法。３６１．上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態３５４に記載の方法。３６２．上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態３６１に記載の方法。３５３．上記細胞は複数の細胞中にある、実施形態３５４に記載の方法。３６４．上記複数の細胞は正常細胞を含む、実施形態３６４に記載の方法。３６５．投与後に、上記正常細胞は生きている、実施形態３６４に記載の方法。３６６．投与後に、上記正常細胞は増殖する、実施形態３６４に記載の方法。３６７．上記切断は、前記細胞内の１つ以上の切断部位で切断することを含む、実施形態３６４に記載の方法。３６８．上記疾患は癌である、実施形態３５５に記載の方法。３６９．上記癌は肺癌または膵臓癌を含む、実施形態３６８に記載の方法。３７０．上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を有する、実施形態３５４に記載の方法。３７１．上記標的核酸は、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＡＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＥＲ２、ＫＩＦ５Ａ、ＩＲＸ１、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＧＮＰＤＡ２、ＫＣＮＥ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＭＩＭ１１、ＤＡＣＨ２、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＣＤ６８ＳＨＢＧ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ１６、ＬＩＮＣ００５３６、ＴＲＰＳ１、ＣＤＫ８、ＴＲＡＰＰＣ９、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＳＩＲＰＢ１、ＭＲＣ１、ＡＴＰ１１Ａ、ＰＯＴＥＢ、ＨＥＲＣ２Ｐ２、ＰＲＤＭ９、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＨＰＶ、ＬＩＮＥ２（ＭＴ２）、ＣＣＲ５、またはＨＰＲＴ１からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態３５４に記載の方法。３７２．上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態３５４に記載の方法。３７３．上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態３７２に記載の方法。３７４．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメイン、Ｃａｓ１２ａドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃａｓ１２ｃドメイン、Ｃａｓ１２ｄドメイン、Ｃａｓ１２ｅドメイン、Ｃａｓ１２ｆドメイン、Ｃａｓ１２ｇドメイン、Ｃａｓ１２ｈドメイン、Ｃａｓ１２ｉドメイン、Ｃａｓ１３ａドメイン、Ｃａｓ１３ｂドメイン、Ｃａｓ１４ドメイン、またはＣａｓ９ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７５．上記第１のドメインは、Ｃａｓ１２ａ（またはＣｐｆ１）ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７６．上記第１のドメインはＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７７．上記第１のドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３７８．上記ガイド核酸は、表６および段落［０２６８］または表７および段落［０２７０］に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態３５４に記載の方法。３７９．上記第２のドメインは、ＲｅｃＥドメイン、ＲｅｃＪドメイン、Ｔ５ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、ＲｅｃＢＣＤドメイン、ＤＮＡポリメラーゼＩ小断片ドメイン、ＥｘｏＩドメイン、ＥｘｏＩＩドメイン、ＥｘｏＶＩＩドメイン、Ｅｘｏ Ｔドメイン、Ｔｒｅｘ１ドメイン、またはＴｒｅｘ２ドメインを含む、実施形態３５４に記載の方法。３８０．上記キメラポリペプチドは３’ＯＨオーバーハングを生成する、実施形態３５４に記載の方法。３８１．上記キメラポリペプチは陥凹３’ＯＨを露出させる、実施形態３５４に記載の方法。３８２．上記第２のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態３５４に記載の方法。３８３．上記第２のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態３５４に記載の方法。３８４．上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態３６４に記載の方法。
【実施例】
【0204】
実施例１．癌の文脈における例示的な実施。
【0205】
個体の腫瘍組織を試験して、適切な標的が存在するか否かを判定する。患者の癌検体の全ゲノム配列分析を使用して、正常細胞と比較して十分な特異性を示すＳＮＰまたは他の突然変異を同定する。
【0206】
癌に特異的なＳＮＰに相補的な配列を有する複数のｇＲＮＡ分子を合成する。これらの合成されたｇＲＮＡは、インビボで癌細胞のＳＮＰを特異的に認識し、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）のゲノム編集および非特異的ヌクレアーゼ活性の活性化を誘導する。
【0207】
ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）のゲノム編集および非特異的なヌクレアーゼ機能の癌細胞特異的な活性化は、エクスビボ系において予備的に、標的ＤＮＡ切断およびヌクレアーゼ活性アッセイを使用して検証される。あらかじめアセンブルされたｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）（ＣＲＩＳＰＲを含む）タンパク質複合体の選択されたセットを、患者に投与する。
【0208】
あらかじめアセンブルされたｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）の選択されたセットの投与により、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体は細胞へと侵入し、ゲノムＤＮＡをスクリーニングして、その細胞内の相補的なＳＮＰ配列を検出する。ＳＮＰまたは他の突然変異配列を含有していない正常細胞では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体は活性化されず、その結果、標的とされた細胞核酸あるいは標的とされていない細胞核酸の分解が、ほとんど、あるいはまったく起こらない。しかし、ｇＲＮＡに相補的なＳＮＰあるいは他の突然変異配列を含有している癌細胞では、ゲノム編集機能は活性化され、その後、ＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体の非特異的ヌクレアーゼ活性が活性化される。
【0209】
活性化されたゲノム編集機能は、癌特異的ＳＮＰまたは他の突然変異または突然変異配列を抱える（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）核酸を除去する。その後、活性化された非特異的ヌクレアーゼ機能は、細胞の二本鎖および一本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡ分子を分解し、癌特異的様式で細胞死を引き起こす（図２を参照）。
【0210】
投与レジメンの後に、リボ核タンパク質複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）のターミネーターを投与して、被験体の身体に残るＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体の活性を除去することができる。その後、抗Ｃａｓの抗体を投与して、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）のタンパク質の効果を中和する。治療完了後のＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）－ｇＲＮＡ複合体のこの停止プロセス（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）は、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ ＰＬＵＳ（商標）のオフターゲット活性によって引き起こされる、いかなる潜在的副作用も最小限に抑える。
【0211】
実施例２：代表的なＣａｓ９核酸およびタンパク質。
多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は本明細書の開示と一致している。例示的なＣａｓ配列であるＳｐｙＣａｓ９の配列が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は本明細書の開示と一致している。例示的なＣａｓ配列であるＳｐｙＣａｓ９の配列が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
【0212】
＞ＮＣ＿００２７３７．２：８５４７５１－８５８８５７化膿連鎖球菌Ｍ１ ＧＡＳ
【0213】
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【0214】
＞ＳｐｙＣａｓ９タンパク質
【0215】
ＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ
【0216】
実施例３：Ｃａｓ９の代表的な代替物－ＦｎＣｐｆ１核酸およびタンパク質。
例示的なＣａｓ代替物であるＣｐｆ１が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
例示的なＣａｓ代替物であるＣｐｆ１が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
【0217】
＞ＦｎＣｐｆ１，ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＣＰ００９６３３．１
【0218】
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【0219】
＞ＦｎＣｐｆ１，ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＣＰ００９６３３．１タンパク質配列
【0220】
ＭＳＩＹＱＥＦＶＮＫＹＳＬＳＫＴＬＲＦＥＬＩＰＱＧＫＴＬＥＮＩＫＡＲＧＬＩＬＤＤＥＫＲＡＫＤＹＫＫＡＫＱＩＩＤＫＹＨＱＦＦＩＥＥＩＬＳＳＶＣＩＳＥＤＬＬＱＮＹＳＤＶＹＦＫＬＫＫＳＤＤＤＮＬＱＫＤＦＫＳＡＫＤＴＩＫＫＱＩＳＥＹＩＫＤＳＥＫＦＫＮＬＦＮＱＮＬＩＤＡＫＫＧＱＥＳＤＬＩＬＷＬＫＱＳＫＤＮＧＩＥＬＦＫＡＮＳＤＩＴＤＩＤＥＡＬＥＩＩＫＳＦＫＧＷＴＴＹＦＫＧＦＨＥＮＲＫＮＶＹＳＳＮＤＩＰＴＳＩＩＹＲＩＶＤＤＮＬＰＫＦＬＥＮＫＡＫＹＥＳＬＫＤＫＡＰＥＡＩＮＹＥＱＩＫＫＤＬＡＥＥＬＴＦＤＩＤＹＫＴＳＥＶＮＱＲＶＦＳＬＤＥＶＦＥＩＡＮＦＮＮＹＬＮＱＳＧＩＴＫＦＮＴＩＩＧＧＫＦＶＮＧＥＮＴＫＲＫＧＩＮＥＹＩＮＬＹＳＱＱＩＮＤＫＴＬＫＫＹＫＭＳＶＬＦＫＱＩＬＳＤＴＥＳＫＳＦＶＩＤＫＬＥＤＤＳＤＶＶＴＴＭＱＳＦＹＥＱＩＡＡＦＫＴＶＥＥＫＳＩＫＥＴＬＳＬＬＦＤＤＬＫＡＱＫＬＤＬＳＫＩＹＦＫＮＤＫＳＬＴＤＬＳＱＱＶＦＤＤＹＳＶＩＧＴＡＶＬＥＹＩＴＱＱＩＡＰＫＮＬＤＮＰＳＫＫＥＱＥＬＩＡＫＫＴＥＫＡＫＹＬＳＬＥＴＩＫＬＡＬＥＥＦＮＫＨＲＤＩＤＫＱＣＲＦＥＥＩＬＡＮＦＡＡＩＰＭＩＦＤＥＩＡＱＮＫＤＮＬＡＱＩＳＩＫＹＱＮＱＧＫＫＤＬＬＱＡＳＡＥＤＤＶＫＡＩＫＤＬＬＤＱＴＮＮＬＬＨＫＬＫＩＦＨＩＳＱＳＥＤＫＡＮＩＬＤＫＤＥＨＦＹＬＶＦＥＥＣＹＦＥＬＡＮＩＶＰＬＹＮＫＩＲＮＹＩＴＱＫＰＹＳＤＥＫＦＫＬＮＦＥＮＳＴＬＡＮＧＷＤＫＮＫＥＰＤＮＴＡＩＬＦＩＫＤＤＫＹＹＬＧＶＭＮＫＫＮＮＫＩＦＤＤＫＡＩＫＥＮＫＧＥＧＹＫＫＩＶＹＫＬＬＰＧＡＮＫＭＬＰＫＶＦＦＳＡＫＳＩＫＦＹＮＰＳＥＤＩＬＲＩＲＮＨＳＴＨＴＫＮＧＳＰＱＫＧＹＥＫＦＥＦＮＩＥＤＣＲＫＦＩＤＦＹＫＱＳＩＳＫＨＰＥＷＫＤＦＧＦＲＦＳＤＴＱＲＹＮＳＩＤＥＦＹＲＥＶＥＮＱＧＹＫＬＴＦＥＮＩＳＥＳＹＩＤＳＶＶＮＱＧＫＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＡＹＳＫＧＲＰＮＬＨＴＬＹＷＫＡＬＦＤＥＲＮＬＱＤＶＶＹＫＬＮＧＥＡＥＬＦＹＲＫＱＳＩＰＫＫＩＴＨＰＡＫＥＡＩＡＮＫＮＫＤＮＰＫＫＥＳＶＦＥＹＤＬＩＫＤＫＲＦＴＥＤＫＦＦＦＨＣＰＩＴＩＮＦＫＳＳＧＡＮＫＦＮＤＥＩＮＬＬＬＫＥＫＡＮＤＶＨＩＬＳＩＤＲＧＥＲＨＬＡＹＹＴＬＶＤＧＫＧＮＩＩＫＱＤＴＦＮＩＩＧＮＤＲＭＫＴＮＹＨＤＫＬＡＡＩＥＫＤＲＤＳＡＲＫＤＷＫＫＩＮＮＩＫＥＭＫＥＧＹＬＳＱＶＶＨＥＩＡＫＬＶＩＥＹＮＡＩＶＶＦＥＤＬＮＦＧＦＫＲＧＲＦＫＶＥＫＱＶＹＱＫＬＥＫＭＬＩＥＫＬＮＹＬＶＦＫＤＮＥＦＤＫＴＧＧＶＬＲＡＹＱＬＴＡＰＦＥＴＦＫＫＭＧＫＱＴＧＩＩＹＹＶＰＡＧＦＴＳＫＩＣＰＶＴＧＦＶＮＱＬＹＰＫＹＥＳＶＳＫＳＱＥＦＦＳＫＦＤＫＩＣＹＮＬＤＫＧＹＦＥＦＳＦＤＹＫＮＦＧＤＫＡＡＫＧＫＷＴＩＡＳＦＧＳＲＬＩＮＦＲＮＳＤＫＮＨＮＷＤＴＲＥＶＹＰＴＫＥＬＥＫＬＬＫＤＹＳＩＥＹＧＨＧＥＣＩＫＡＡＩＣＧＥＳＤＫＫＦＦＡＫＬＴＳＶＬＮＴＩＬＱＭＲＮＳＫＴＧＴＥＬＤＹＬＩＳＰＶＡＤＶＮＧＮＦＦＤＳＲＱＡＰＫＮＭＰＱＤＡＤＡＮＧＡＹＨＩＧＬＫＧＬＭＬＬＧＲＩＫＮＮＱＥＧＫＫＬＮＬＶＩＫＮＥＥＹＦＥＦＶＱＮＲＮＮ
【0221】
実施例４：様々なリボ核タンパク質ヌクレアーゼ複合体で使用されるエキソヌクレアーゼ。
多くのエキソヌクレアーゼは本明細書の開示に一致している。エキソヌクレアーゼの部分的なリストが以下に提供されるが、他のものも本明細書の開示と一致している。
多くのエキソヌクレアーゼは本明細書の開示に一致している。エキソヌクレアーゼの部分的なリストが以下に提供されるが、他のものも本明細書の開示と一致している。
【0222】
＞エキソリボヌクレアーゼ Ｔ
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【0223】
＞ＴＲＥＸ２
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【0224】
＞ＴＲＥＸ１
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【0225】
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【0228】
＞エキソデオキシリボヌクレアーゼ Ｉ
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【0229】
＞エキソデオキシリボヌクレアーゼ ＩＩＩ
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【0231】
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【0232】
＞ＲｅｃＥ
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【0233】
＞Ｔ５
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【0234】
＞ラムダエキソヌクレアーゼ
ＭＴＰＤＩＩＬＱＲＴＧＩＤＶＲＡＶＥＱＧＤＤＡＷＨＫＬＲＬＧＶＩＴＡＳＥＶＨＮＶＩＡＫＰＲＳＧＫＫＷＰＤＭＫＭＳＹＦＨＴＬＬＡＥＶＣＴＧＶＡＰＥＶＮＡＫＡＬＡＷＧＫＱＹＥＮＤＡＲＴＬＦＥＦＴＳＧＶＮＶＴＥＳＰＩＩＹＲＤＥＳＭＲＴＡＣＳＰＤＧＬＣＳＤＧＮＧＬＥＬＫＣＰＦＴＳＲＤＦＭＫＦＲＬＧＧＦＥＡＩＫＳＡＹＭＡＱＶＱＹＳＭＷＶＴＲＫＮＡＷＹＦＡＮＹＤＰＲＭＫＲＥＧＬＨＹＶＶＩＥＲＤＥＫＹＭＡＳＦＤＥＩＶＰＥＦＩＥＫＭＤＥＡＬＡＥＩＧＦＶＦＧＥＱＷＲ
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【0235】
＞エキソヌクレアーゼＶＩＩ小ユニット
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【0236】
＞エキソヌクレアーゼＶＩＩ大ユニット
ＭＬＰＳＱＳＰＡＩＦＴＶＳＲＬＮＱＴＶＲＬＬＬＥＨＥＭＧＱＶＷＩＳＧＥＩＳＮＦＴＱＰＡＳＧＨＷＹＦＴＬＫＤＤＴＡＱＶＲＣＡＭＦＲＮＳＮＲＲＶＴＦＲＰＱＨＧＱＱＶＬＶＲＡＮＩＴＬＹＥＰＲＧＤＹＱＩＩＶＥＳＭＱＰＡＧＥＧＬＬＱＱＫＹＥＱＬＫＡＫＬＱＡＥＧＬＦＤＱＱＹＫＫＰＬＰＳＰＡＨＣＶＧＶＩＴＳＫＴＧＡＡＬＨＤＩＬＨＶＬＫＲＲＤＰＳＬＰＶＩＩＹＰＡＡＶＱＧＤＤＡＰＧＱＩＶＲＡＩＥＬＡＮＱＲＮＥＣＤＶＬＩＶＧＲＧＧＧＳＬＥＤＬＷＳＦＮＤＥＲＶＡＲＡＩＦＴＳＲＩＰＶＶＳＡＶＧＨＥＴＤＶＴＩＡＤＦＶＡＤＬＲＡＰＴＰＳＡＡＡＥＶＶＳＲＮＱＱＥＬＬＲＱＶＱＳＴＲＱＲＬＥＭＡＭＤＹＹＬＡＮＲＴＲＲＦＴＱＩＨＨＲＬＱＱＱＨＰＱＬＲＬＡＲＱＱＴＭＬＥＲＬＱＫＲＭＳＦＡＬＥＮＱＬＫＲＴＧＱＱＱＱＲＬＴＱＲＬＮＱＱＮＰＱＰＫＩＨＲＡＱＴＲＩＱＱＬＥＹＲＬＡＥＴＬＲＡＱＬＳＡＴＲＥＲＦＧＮＡＶＴＨＬＥＡＶＳＰＬＳＴＬＡＲＧＹＳＶＴＴＡＴＤＧＮＶＬＫＫＶＫＱＶＫＡＧＥＭＬＴＴＲＬＥＤＧＷＩＥＳＥＶＫＮＩＱＰＶＫＫＳＲＫＫＶＨ
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【0237】
実施例５．インビトロでのリボ核タンパク質特異性アッセイ。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ複合体をＤＨＣＲ７核酸ガイドのまわりでアセンブルした。標的配列を含むＤＮＡ＃１および非標的対照であるＤＮＡ＃２に対して、活性を分析した。出力をゲル電気泳動によって測定して、「切断されたＤＮＡ＃１」バンドの存在によって証明されるエンドヌクレアーゼ活性と、バンドの不在によって証明されるエキソヌクレアーゼ活性とについて検定する。活性を、図３の１．５時間（上）および２４時間の（下）で分析する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ複合体をＤＨＣＲ７核酸ガイドのまわりでアセンブルした。標的配列を含むＤＮＡ＃１および非標的対照であるＤＮＡ＃２に対して、活性を分析した。出力をゲル電気泳動によって測定して、「切断されたＤＮＡ＃１」バンドの存在によって証明されるエンドヌクレアーゼ活性と、バンドの不在によって証明されるエキソヌクレアーゼ活性とについて検定する。活性を、図３の１．５時間（上）および２４時間の（下）で分析する。
【0238】
左から結果を見ると、ＤＮＡラダーと、それに続くＤＮＡ＃１とＤＮＡ＃２のみを有する核酸対照が見られる。レーン３では、活性を示す基質を有する、アセンブルされたリボ核タンパク質複合体が見られる。１．５時間では、エンドヌクレアーゼ活性がＤＮＡ＃１切断バンドの存在により明白であるが、２４時間では、エンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の組み合わせが、切断されたＤＮＡ＃１バンドと切断されていないＤＮＡ＃１バンドの両方を除去している。レーン４は、活性な標的配列分子（この場合、ＤＮＡ＃１）によって活性化されているガイドＲＮＡを有する、アセンブルされた複合体の不在下で、オフターゲットのエンドヌクレアーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性が生じないことを示す。レーン５は、オフターゲットのエンドヌクレアーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性が、アセンブルされていない複合体の存在下にでは生じないことを示す。レーン６では、活性化した複合体が、１．５時間ではなく２４時間で、非特異的なヌクレアーゼ活性を示すことが見られる。レーン７は、ガイドＲＮＡを欠く複合体がエキソヌクレアーゼ活性を示さないことを示す。
【0239】
これらの結果は、癌または病原体の細胞中などにおいて、標的核酸の特異的分解をもたらすために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質複合体において配列特異性および時間的特異性の両方を有する利点を示している。
【0240】
実施例６．インビボのリボ核タンパク質特異性アッセイ。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、特定のヌクレアーゼ活性依存性様式で、細胞に対する細胞毒性効果を有しているか否かを調べるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼでトランスフェクトされたヒトの不死化細胞の生存率を時間依存性様式で評価した。ヌクレアーゼの特異的な標的化活性を誘導するために、２つのｃｒＲＮＡ（ヒトＤＨＣＲ７遺伝子を特異的に標的とする非常に特異的なもの（ＤＨＣＲ７）と、イネ萎縮（ｒｉｃｅ ｄｗａｒｆ）５遺伝子に特異的であり、かつヒトゲノム中の配列に部分的に結合する第２のガイド（ＯｓＤｗａｒｆ５＿１））を使用した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、特定のヌクレアーゼ活性依存性様式で、細胞に対する細胞毒性効果を有しているか否かを調べるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼでトランスフェクトされたヒトの不死化細胞の生存率を時間依存性様式で評価した。ヌクレアーゼの特異的な標的化活性を誘導するために、２つのｃｒＲＮＡ（ヒトＤＨＣＲ７遺伝子を特異的に標的とする非常に特異的なもの（ＤＨＣＲ７）と、イネ萎縮（ｒｉｃｅ ｄｗａｒｆ）５遺伝子に特異的であり、かつヒトゲノム中の配列に部分的に結合する第２のガイド（ＯｓＤｗａｒｆ５＿１））を使用した。
【0241】
ヒーラー細胞およびＨＥＫ２９３の細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ、２つのｃｒＲＮＡ（ＤＨＣＲ７およびＯｓＤｗａｒｆ５＿１）、あるいはそれらのＲＮＰ複合体でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後に、ＷＳＴ－１試薬を使用する細胞生存率アッセイによって、細胞生存率を評価した。結果を図４に示す。
【0242】
その結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ単独あるいはｃｒＲＮＡ単独でトランスフェクトされた細胞の生存率が、トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後のすべてにおいて変化しなかったことを示し、このことは、ヌクレアーゼ単独またはｃｒＲＮＡ単独では細胞への毒作用を有していないことを示唆している。これに対して、ｃｒＲＮＡガイドＤＮＡ標的化活性を有するＲＮＰ複合体でトランスフェクトされた細胞の生存率が、トランスフェクションの７２時間後に急激に減少し、このことは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａが、特異的なＤＮＡ標的化ヌクレアーゼ活性に応じて、細胞に対して細胞毒性であることを示唆している。特異的なｃｒＲＮＡおよびそれほど特異的ではないｃｒＲＮＡの両方が、細胞に対して同様の毒作用を有している。
【0243】
同様にトランスフェクトされた細胞の生存率が、トランスフェクションの２４時間後および４８時間後に変化しなかった（ＨＥＫ２９３）か、あるいはわずかに減少し（ヒーラー）、このことは、毒性が、細胞に影響するのに一定期間を必要とすることを示唆している。
【0244】
細胞中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによる標的配列の二重鎖ＤＮＡ切断が、トランスフェクションの２４時間後から４８時間後で増大し、その後、細胞毒性の非特異的ヌクレアーゼ活性を誘導することを考えれば、トランスフェクションの７２時間後に示される毒性は、ヌクレアーゼ非依存性間接効果ではなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａの特異的なヌクレアーゼ活性に関連した機能によって、その毒性が引き起こされることを示唆している。
【0245】
まとめると、上記結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼが細胞に対して細胞毒性を保有し、それは、ｃｒＲＮＡ－媒介性の特異的な配列標的化活性に依存することを示唆している。
【0246】
上記結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に対する時間的制約は、７２時間で観察されるオフターゲット毒性を減少させることにより、特異性を高めることをさらに再強調している。
【0247】
アッセイのための実験条件は以下の通りであった。ヒト細胞トランスフェクションヒーラーおよびＨＥＫ２９３の細胞を、３７°Ｃ、５％のＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補足されたＤｕｌｂｅｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。２．５Ｘ１０４の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。１．２ｎＭ（１００ｎｇ）あるいは２．４ｎＭ（２００ｎｇ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、および、１．２ｎＭ（２５ｎｇ）あるいは２．４ｎＭ（５０ｎｇ）のｃｒＲＮＡを使用して、ＲＮＰ複合体を形成した。ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびＲＮＰ複合体のそれぞれの組み合わせを、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩＮＣ．）を使用して、細胞にトランスフェクトした。簡潔に言えば、１つの管において、ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびＲＮＰ複合体のそれぞれの組み合わせを、室温（ＲＴ）で、５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の１．７μｌのリポフェクタミンＣａｓ Ｐｌｕｓ試薬を用いて５分間インキュベートした。別の管では、０．３μｌのリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ試薬を５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと混合し、室温で５分間インキュベートした。２つの溶液を混合し、室温でさらに１０分間インキュベートした。その後、混合した溶液を、９６ウェルプレートの１つのウェル内の細胞に直接加えた。トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後に、ＷＳＴ－１試薬を使用して細胞生存率を評価した。
【0248】
細胞生存率アッセイの１０μｌのＷＳＴ－１試薬（Ｒｏｃｈｅ ＃０５０１５９４４０１）を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。上記プレートを、３７°Ｃ、５％のＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートした。各ウェルの培地の体積は１００μｌであった。盲検としてのバックグラウンド対照に対するサンプルの吸光度は、４２０～４８０ｎｍの波長で、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＭＥＧＡ ＥＬＩＳＡリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。
【0249】
実施例７．インビボでの細胞の標的化。
個体は癌に苦しんでいると識別される。癌は腫瘍に局在する場合がある。腫瘍は配列決定され、および、腫瘍細胞の少なくとも一部に対応するものとして、多くの突然変異が同定される。
個体は癌に苦しんでいると識別される。癌は腫瘍に局在する場合がある。腫瘍は配列決定され、および、腫瘍細胞の少なくとも一部に対応するものとして、多くの突然変異が同定される。
【0250】
さらに、腫瘍細胞の大部分に存在する突然変異を同定し、それを使用して標的配列を特定する。その後、ガイドＲＮＡを合成して標的配列を同定し、リボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。その後、上記複合体を患者に投与し、症状改善と腫瘍のサイズの減少とを観察する。
【0251】
実施例８．継続処置。
実施例７の個体は、持続的な腫瘍成長を含むいくつかの症状を示し続けることがある。そのような場合では、処置されて減少した腫瘍を、再配列決定することができる。標的配列はもはや存在しないが、さらなる突然変異が同定され得ることが観察される。
実施例７の個体は、持続的な腫瘍成長を含むいくつかの症状を示し続けることがある。そのような場合では、処置されて減少した腫瘍を、再配列決定することができる。標的配列はもはや存在しないが、さらなる突然変異が同定され得ることが観察される。
【0252】
したがって、腫瘍細胞の大部分に存在する突然変異を同定し、それを、標的配列を特定するために使用する。その後、ガイドＲＮＡを合成して標的配列を同定し、リボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。その後、上記複合体を患者に投与し、症状改善と腫瘍のサイズの減少とを観察する。
【0253】
実施例９．継続処置。
別の例として、患者は白血病に苦しんでいる。上記患者に、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）の処置を施す。何らかの症状改善が観察されるが、疾患の進行は継続し、上記患者は、上記処置のいくつかの副作用に苦しむ。
別の例として、患者は白血病に苦しんでいる。上記患者に、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）の処置を施す。何らかの症状改善が観察されるが、疾患の進行は継続し、上記患者は、上記処置のいくつかの副作用に苦しむ。
【0254】
そのような場合では、癌細胞を配列決定する。ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質のコード化能力をもたらすゲノム再編成が生じたことが観察され得る。
【0255】
その後、ガイドＲＮＡは、ＢＣＲ－ＡＢＬジャンクションを標的とするように意図される。すなわち、ガイドＲＮＡを合成して標的配列を同定し、リボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。その後、そのアセンブルした複合体を患者に投与し、症状の改善と白血病の寛解とを観察する。
【0256】
実施例１０．ガイド核酸設計。
この実施例では、癌などの疾患に関連する核酸を標的とするガイド核酸を設計するための、例示的な方法が説明される。
この実施例では、癌などの疾患に関連する核酸を標的とするガイド核酸を設計するための、例示的な方法が説明される。
【0257】
この実施例に使用されたデータソースは以下のものを含む：
１．ヒト参照ゲノム配列（例えば、ｈｇ１９、ＧＲＣｈ３７）
２．癌細胞株百科事典（ＣＣＬＥ）からの癌細胞株の突然変異情報
３．ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）中に表記される４１０の癌突然変異（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター－実用的な癌標的の統合された突然変異プロファイリング）。
１．ヒト参照ゲノム配列（例えば、ｈｇ１９、ＧＲＣｈ３７）
２．癌細胞株百科事典（ＣＣＬＥ）からの癌細胞株の突然変異情報
３．ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）中に表記される４１０の癌突然変異（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター－実用的な癌標的の統合された突然変異プロファイリング）。
【0258】
入力値は、ＣＣＬＥ突然変異情報、標的遺伝子ＩＤ、標的遺伝子配列、ｇＲＮＡハンドル配列、ｃｒＲＮＡ長さ（Ｎ）、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列、およびＰＡＭ位置（上流あるいは下流）を含んでいた。
【0259】
ガイド核酸設計－ＣＣＬＥ（癌細胞株百科事典）モデル細胞株中の突然変異位置を、ヒト参照ゲノム配列において検索した。突然変異位置の約３０の塩基対の上流および下流であった核酸領域の配列情報を決定した。ＰＡＭ配列を標的領域において検索した。ＰＡＭ配列およびｃｒＲＮＡ配列の位置を決定した。ｃｒＲＮＡ配列は突然変異位置を含んでいた。ｃｒＲＮＡのＰＡＭ配列と突然変異位置との間の距離を計算した。ｃｒＲＮＡ配列とガイドＲＮＡハンドル配列を組み合わせることにより、ガイドＲＮＡ配列を設計した。
【0260】
上記方法から得られた、設計されたガイドＲＮＡに関連する出力情報は、以下のものを含んでいた：
１．遺伝子ＩＤ：ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ識別子
２．遺伝子記号：ＨＵＧＯ欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）の遺伝子命名法
３．ヒトゲノムアセンブリバージョン（ＧＲＣｈ）：ゲノム・リファレンス・コンソーシアム・ヒトゲノム・ビルド（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ）のヒトゲノムアセンブリのバージョン
４．染色体数：標的遺伝子が位置する染色体対の数
５．突然変異開始位置：ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の開始位置
６．突然変異終了位置：ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の終了位置
７．突然変異クラス：突然変異のクラス
８．突然変異型：突然変異の型（例えば、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）、ジヌクレオチド多型（ＤＮＰ））
９．参照配列：標的遺伝子座中のヒトリファレンスゲノムの配列
１０．突然変異配列：標的遺伝子座中の癌細胞株のゲノムの配列
１１．アミノ酸変化：ヌクレオチド突然変異によるアミノ酸変化
１２．癌細胞株名：突然変異を有する癌細胞株の名称
１３．腫瘍の起原の組織：癌細胞株が由来するか、または初めに分離された組織
１４．Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ（ＥＮＳＴ ＩＤ）：Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースからの標的遺伝子転写物識別子
１５．ｃｒＲＮＡ配列：癌細胞株の標的突然変異遺伝子座から抽出されたｃｒＲＮＡ配列。ＰＡＭ配列が含まれており、配列の長さは入力ｃｒＲＮＡ長さに応じて変わる。
１６．突然変異とＰＡＭとの間の距離：ｃｒＲＮＡにおける突然変異からＰＡＭまでの距離。ＰＡＭがｃｒＲＮＡの上流にある場合、ＰＡＭの最終位置は位置０になり、ＰＡＭ中の突然変異は負の位置になり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置になる。Ｃａｓ９の場合には、ＰＡＭがｃｒＲＮＡの下流にある。したがって、ＰＡＭの第１位は位置０であり、ＰＡＭ中の突然変異は負の位置であり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置である。
１７．突然変異の長さ：参照配列と突然変異配列の長さの差
１８．参照標的配列：標的遺伝子座の参照配列からの±１０ヌクレオチド配列
１９．突然変異標的配列：標的遺伝子座の癌細胞株突然変異配列からの±１０ヌクレオチド配列。
２０．ガイドＲＮＡ配列（表５ａおよび６）：ハンドルを有するｇＲＮＡ配列およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列
ガイドＲＮＡ配列（表５ｂおよび７）：ハンドルを有するｇＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列。
１．遺伝子ＩＤ：ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ識別子
２．遺伝子記号：ＨＵＧＯ欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）の遺伝子命名法
３．ヒトゲノムアセンブリバージョン（ＧＲＣｈ）：ゲノム・リファレンス・コンソーシアム・ヒトゲノム・ビルド（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ）のヒトゲノムアセンブリのバージョン
４．染色体数：標的遺伝子が位置する染色体対の数
５．突然変異開始位置：ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の開始位置
６．突然変異終了位置：ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の終了位置
７．突然変異クラス：突然変異のクラス
８．突然変異型：突然変異の型（例えば、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）、ジヌクレオチド多型（ＤＮＰ））
９．参照配列：標的遺伝子座中のヒトリファレンスゲノムの配列
１０．突然変異配列：標的遺伝子座中の癌細胞株のゲノムの配列
１１．アミノ酸変化：ヌクレオチド突然変異によるアミノ酸変化
１２．癌細胞株名：突然変異を有する癌細胞株の名称
１３．腫瘍の起原の組織：癌細胞株が由来するか、または初めに分離された組織
１４．Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ（ＥＮＳＴ ＩＤ）：Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースからの標的遺伝子転写物識別子
１５．ｃｒＲＮＡ配列：癌細胞株の標的突然変異遺伝子座から抽出されたｃｒＲＮＡ配列。ＰＡＭ配列が含まれており、配列の長さは入力ｃｒＲＮＡ長さに応じて変わる。
１６．突然変異とＰＡＭとの間の距離：ｃｒＲＮＡにおける突然変異からＰＡＭまでの距離。ＰＡＭがｃｒＲＮＡの上流にある場合、ＰＡＭの最終位置は位置０になり、ＰＡＭ中の突然変異は負の位置になり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置になる。Ｃａｓ９の場合には、ＰＡＭがｃｒＲＮＡの下流にある。したがって、ＰＡＭの第１位は位置０であり、ＰＡＭ中の突然変異は負の位置であり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置である。
１７．突然変異の長さ：参照配列と突然変異配列の長さの差
１８．参照標的配列：標的遺伝子座の参照配列からの±１０ヌクレオチド配列
１９．突然変異標的配列：標的遺伝子座の癌細胞株突然変異配列からの±１０ヌクレオチド配列。
２０．ガイドＲＮＡ配列（表５ａおよび６）：ハンドルを有するｇＲＮＡ配列およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列
ガイドＲＮＡ配列（表５ｂおよび７）：ハンドルを有するｇＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列。
【0261】
以下の表５ａは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼとともに使用されるこの実施例を使用して得られた、例示的な出力情報を示す。参照配列からの変化（例えば、野生型、健康型、非癌性）は、下線が引かれたテキストで示される。
【0262】
【表5】
【0263】
以下の表５ｂは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとともに使用されるこの実施例を使用して得られた、例示的な出力情報を示す。参照配列の変化（例えば、野生型、健康型、非癌性）は、下線が引かれたテキストで示される。
【0264】
【表6-1】
【0265】
【表6-2】
【0266】
実施例１１．癌を標的とするためのガイド核酸。
多くのガイドＲＮＡ配列は、本明細書の開示と一致している。
多くのガイドＲＮＡ配列は、本明細書の開示と一致している。
【0267】
表６および段落［０２６８］は、実施例１０に記載される方法を使用して決定された例示的なガイドＲＮＡ配列を表記しており、それらを使用して、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを含むキメラポリペプチド）を、癌、例えば、肺癌あるいは膵臓癌に関連する標的核酸に誘導することができる。参照配列の変化（例えば、野生型、健康型、非癌性）は、下線が引かれたテキストで示される。
【0268】
表６. Cas12を含むポリペプチドのための例示的ガイドRNA配列
CRISPR gRNA ID: GF-CCELg12-1 : [crRNA配列] : crRNA sequence: TTTCCTCACTGGCTTCAGCGATTCCACA : LbgRNA: AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagat CTCACTGGCTTCAGCGATTCCACA : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 29123 : Symbol: ANKRD11 : Ensembl_Transcript_ID: ENST00000301030.4 : GRCh: 37 : Chr: 16 : [標的癌突然変異情報] : mut_start: 89351168 : mut_end: 89351168 : mut_class: Silent : mut_type: SNP : ref_seq: C : mut_seq: T : mut_aa: p.K594K : mutation info source: CCLE : ref_target(-10 +10): GCTCCTGCCTCTTCCTCACTG : mut_target(-10 +10): GCTCCTGCCTTTTCCTCACTG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1573 : cancer_type: LUNG : PAM_dist: -3 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg12-2 : [crRNA配列] : crRNA sequence: TTTTCCTCACTGGCTTCAGCGATTCCAC : LbgRNA: AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagat CCTCACTGGCTTCAGCGATTCCAC : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 29123 : Symbol: ANKRD11 : Ensembl_Transcript_ID: ENST00000301030.4 : GRCh: 37 : Chr: 16 : [標的癌突然変異情報] : mut_start: 89351168 : mut_end: 89351168 : mut_class: Silent : mut_type: SNP : 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【0269】
表７および段落［０２７０］は、実施例１０に記載される方法を使用して決定された、例示的なガイドＲＮＡ配列を表記しており、それらを使用して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むキメラポリペプチド）を、癌、例えば、肺癌あるいは膵臓癌に関連する標的核酸に誘導することができる。参照配列の変化（例えば、野生型、健康型、非癌性）は、下線が引かれたテキストで示される。
【0270】
表７. Cas9を含むポリペプチドのための例示的ガイドRNA配列
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cgactcactataggTACTTGGACTTAGCTCTGGTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7046 : Symbol: TGFBR1 : Ensembl Transcript ID: ENST00000374994.4 : GRCh: 37 : Chr: 9 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 101904835 : mut end: 101904835 : mut class: Nonsense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: T : mut aa: p.Q275* : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): TACTTGGACTCAGCTCTGGTT : mut target(-10 +10): TACTTGGACTTAGCTCTGGTT : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1573 : cancer type: LUNG : PAM dist: 10 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-919 : [crRNA配列] : crRNA sequence: ACACGCACCTCAAAGCTGTTCGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggACACGCACCTCAAAGCTGTTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577138 : mut end: 7577138 : mut class: Missense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: G : mut aa: p.R267P : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): AAAGCTGTTCCGTCCCAGTAG : mut target(-10 +10): AAAGCTGTTCGGTCCCAGTAG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1437 : cancer type: LUNG : PAM dist: -1 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-920 : [crRNA配列] : crRNA sequence: ACTGGGACCGAACAGCTTTGAGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggACTGGGACCGAACAGCTTTGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577138 : mut end: 7577138 : mut class: Missense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: G : mut aa: p.R267P : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): AAAGCTGTTCCGTCCCAGTAG : mut target(-10 +10): AAAGCTGTTCGGTCCCAGTAG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1437 : cancer type: LUNG : PAM dist: 12 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-921 : [crRNA配列] : crRNA sequence: GGTACAGTCAGAGCCAACCCAGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggGGTACAGTCAGAGCCAACCCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577610 : mut end: 7577610 : mut class: Splice Site : mut type: SNP : ref seq: T : mut seq: C : mut aa: - 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ol: EPHA7 : Ensembl Transcript ID: ENST00000369303.4 : GRCh: 37 : Chr: 6 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 93956546 : mut end: 93956546 : mut class: Frame Shift Del : mut type: DEL : ref seq: G : mut seq: - : mut aa: p.P897fs : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): CAGACTATTTGGGTTTCGAAT : mut target(-10 +10): CAGACTATTT-GGTTTCGAAT : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH460 : cancer type: LUNG : PAM dist: 0 : indel length: 1 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-227 : [crRNA配列] : crRNA sequence: TGCTGCAAGCCCTGTGCCCGAGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggTGCTGCAAGCCCTGTGCCCGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 2064 : Symbol: ERBB2 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269571.5 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 37868282 : mut end: 37868282 : mut class: Missense Mutation : mut type: SNP : ref seq: A : mut seq: T : mut aa: p.S335C : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): TGAGAAGTGCAGCAAGCCCTG : mut target(-10 +10): 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【0271】
実施例１２．肺癌のインビボでの細胞標的化。
個体は肺癌に苦しんでいると識別される。個体の肺癌細胞に関連する配列情報を決定し、肺癌に対応する突然変異を同定する。
個体は肺癌に苦しんでいると識別される。個体の肺癌細胞に関連する配列情報を決定し、肺癌に対応する突然変異を同定する。
【0272】
その後、表６および段落［０２６８］の配列を含むガイドＲＮＡを合成し、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドを有するリボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。代替的に、または組み合わせて、表７および段落［０２７０］の配列を含むガイドＲＮＡを合成し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドを有するリボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。その後、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９、あるいはその両方を含む上記複合体を個体に投与し、症状の改善および腫瘍の減少を観察する。
【0273】
実施例１２．膵臓癌のインビボでの細胞標的化。
個体は膵臓癌に苦しんでいると識別される。個体の癌細胞に関連する配列情報を決定し、癌に対応する突然変異を同定する。
個体は膵臓癌に苦しんでいると識別される。個体の癌細胞に関連する配列情報を決定し、癌に対応する突然変異を同定する。
【0274】
その後、表６および段落［０２６８］の配列を含むガイドＲＮＡを合成し、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドを有するリボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。代替的に、または組み合わせて、表７および段落［０２７０］の配列を含むガイドＲＮＡを合成し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドを有するリボ核タンパク質複合体へとアセンブルする。その後、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９、あるいはその両方を含む上記複合体を個体に投与し、症状の改善および腫瘍の減少を観察する。
【0275】
実施例１３．小分子併用療法。本明細書中の実施例のいずれかの個体に、ＤＮＡ二重鎖切断修復の小分子阻害剤を投与して、ゲノム編集効率を増強する。上記阻害剤は、例えば、ＢＲＣＡ経路またはＢＲＣＡ遺伝子に関連する、二重鎖切断修復に関与する遺伝子を標的とすることができる。投与後に、症状の改善および疾患の寛解が個体において観察される。
【0276】
実施例１４．高分子併用療法。
本明細書中の実施例のいずれかの個体に、ＤＮＡ二重鎖切断修復の高分子阻害剤を投与して、ゲノム編集効率を増強する。ガイドＲＮＡは、例えば、ＢＲＣＡ経路またはＢＲＣＡ遺伝子に関連する、二重鎖切断修復に関与する遺伝子を標的とするように設計される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａなどのＣａｓヌクレアーゼと共に個体に投与される。併用療法を施すと、症状の改善および肺癌の寛解が個体において観察される。
本明細書中の実施例のいずれかの個体に、ＤＮＡ二重鎖切断修復の高分子阻害剤を投与して、ゲノム編集効率を増強する。ガイドＲＮＡは、例えば、ＢＲＣＡ経路またはＢＲＣＡ遺伝子に関連する、二重鎖切断修復に関与する遺伝子を標的とするように設計される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａなどのＣａｓヌクレアーゼと共に個体に投与される。併用療法を施すと、症状の改善および肺癌の寛解が個体において観察される。
【0277】
実施例１５．ＰＸ４５９プラスミドＤＮＡを用いた腺癌の処置。
突然変異体特異ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９発現ベクター（ＰＸ４５９、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６２９８８）を使用して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌ゲノム中の複数の切断を誘導した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターを送達するために、肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を電気穿孔した。ＨＣＣ８２７はそのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の１８を超えるコピーがある。ガイドＲＮＡを、ＨＣＣ８２７細胞株中の１８を超える遺伝子座を標的とするように設計した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒ（Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ）において再懸濁した。５００ｎｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現を有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）下で電気穿孔した。細胞を増殖培地において６日間回復させ、計数した。図６では、ＣＮＶを標的とするＰＸ４５９プラスミドＤＮＡのｎｅｏｎエレクトロポレーションの６日後の、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株であるＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死が示される。ベクターを用いず、あるいは野生型のＥＧＦＲ配列を標的とするベクターを用いて電気穿孔された対照群と比較して、ＨＣＣ８２７特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。上記結果は、実験群（ＥＧＦＲ＿Ｅ２）が８３％の細胞死を示したことをさらに示した。上記結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させることを示していた。
突然変異体特異ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９発現ベクター（ＰＸ４５９、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６２９８８）を使用して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌ゲノム中の複数の切断を誘導した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターを送達するために、肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を電気穿孔した。ＨＣＣ８２７はそのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の１８を超えるコピーがある。ガイドＲＮＡを、ＨＣＣ８２７細胞株中の１８を超える遺伝子座を標的とするように設計した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒ（Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ）において再懸濁した。５００ｎｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現を有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）下で電気穿孔した。細胞を増殖培地において６日間回復させ、計数した。図６では、ＣＮＶを標的とするＰＸ４５９プラスミドＤＮＡのｎｅｏｎエレクトロポレーションの６日後の、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株であるＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死が示される。ベクターを用いず、あるいは野生型のＥＧＦＲ配列を標的とするベクターを用いて電気穿孔された対照群と比較して、ＨＣＣ８２７特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。上記結果は、実験群（ＥＧＦＲ＿Ｅ２）が８３％の細胞死を示したことをさらに示した。上記結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させることを示していた。
【0278】
実施例１６．薬物処置を伴わないＨ１２９９トランスフェクション。
Ｈ１２９９細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表８に記載されるように各ウェルへと導入した。
Ｈ１２９９細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表８に記載されるように各ウェルへと導入した。
【0279】
【表7】
【0280】
メーカーによって提供されるプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００試薬を使用することにより、細胞プレーティングから２４時間後にトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの７２時間後、すべての上清を吸引により廃棄し、細胞を５００μＬの１ＸＰＢＳで優しく洗浄した。トリプシン処理により細胞を収集し、生細胞の数をトリパンブルー染色およびｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて計数した。全ゲノム中で２つの切断のみを作る標的であるＣＣＲ５、ＨＰＲＴ１と、ヒトゲノム中に一致した配列がないＮＴ１は、同様の細胞生存率を示した。これに対して、１００を超える遺伝子座で複数の切断を作ると知られているＭＴ２は、ＮＴ１に対して約５０％の細胞生存率を示した。Ｈ１２９９細胞株が特異的に増幅した遺伝子座（ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、およびＫＣＮＥ２）は、ＭＴ２と同様の細胞生存率を示すが、ＳＭＩＭ１１およびＫＣＮＥ２は、細胞死のより高い誘導を示し、ＮＴ１に対して約２５％の細胞生存率を有していた。
【0281】
実施例１７．薬物処置を伴わないＨ１２９９トランスフェクション－２。
２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０＾５の細胞として、Ｈ１２９９細胞を蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表９に記載されるように各ウェルへと導入した。
２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０＾５の細胞として、Ｈ１２９９細胞を蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表９に記載されるように各ウェルへと導入した。
【0282】
【表8】
【0283】
メーカーによって提供されるプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００試薬を使用することにより、細胞プレーティングから２４時間後にトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの４８時間後、すべての上清を吸引により廃棄し、細胞を５００μＬの１ＸＰＢＳで優しく洗浄した。トリプシン処理により細胞を収集し、生細胞の数をトリパンブルー染色およびｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて計数した。全ゲノム中に２つの切断を作る標的であるＣＣＲ５は、リポフェクションのみの対照に対して８０％の細胞生存率を示した。ハウスキーピング遺伝子中に２つの切断を作るＨＰＲＴ１は、より多くの毒性を示し、約５０％の細胞が生存していた。ヒトゲノム中に一致した配列がないＮＴ１は、リポフェクションのみと比較して、５７％の細胞生存率を示した。しかし、１００を超える遺伝子座において複数の切断部位を有するＭＴ２は、リポフェクションのみの対照に対して約１４％の細胞生存率を示した。Ｈ１２９９細胞株で特異的に増幅された遺伝子座標的（ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＫＣＮＥ２）は、確実に計数されなかった総細胞死を示したが、リポフェクションのみと比較して、５７％の細胞生存率を示した。２つのサンプル（ＮＴ１、ＧＮＰＤＡ２）も、ＮｕｃＢｌｕｅ生細胞染色試薬（青、生細胞と死細胞を染色）およびヨウ化プロピジウム死細胞染色試薬（赤、死細胞のみを染色）を使用することによって画像化し、図１０において一貫した結果を示した。
【0284】
実施例１８－Ｈ１５６３トランスフェクション。
Ｈ１５６３細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１０に記載されるように各ウェルへと導入した。
Ｈ１５６３細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１０に記載されるように各ウェルへと導入した。
【0285】
【表9】
【0286】
メーカーによって提供されるプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００試薬を使用することにより、細胞プレーティングから２４時間後にトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処置し、細胞を７２時間選択した。トランスフェクションの４８時間後、すべての上清を吸引により廃棄し、細胞を５００μＬの１ＸＰＢＳによって優しく洗浄した。トリプシン処理により細胞を収集し、生細胞の数をトリパンブルー染色およびｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて計数した。全ゲノム中に２つの切断を有する標的であるＣＣＲ５は、最も高い細胞生存率を示し、ＨＰＲＴ１はその５２％を示した。複数の切断を作る標的（ＭＴ２、ＩＲＸ１、およびＡＤＡＭＴＳ１６）は、互いに同様の細胞生存率を示した。ＭＴ２は、ＣＣＲ５に対して４３％の細胞生存率を示し、Ｈ１５６３株で特異的に増幅された標的は、非常にはるかに多くの毒性を示した。ＡＤＡＭＴＳ１６は４０％の細胞生存率を結果としてもたらし、ＩＲＸ１は、ＣＣＲ５と比較して、３７％の生存していた細胞を結果としてもたらした。
【0287】
実施例１９：複数の標的２によるＡ５４９細胞の細胞死。
図１２－図１３は、複数の標的２によるＡ５４９細胞の細胞死を示す。５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ発現ＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＡ５４９（膵臓）細胞へと導入した。培養したＡ５４９細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータに移し、電気ショックを与えた。対照として、ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ１、および１つのコピーを有するＣＣＲ５、ならびに電気ショックのみの条件を追加した。電気ショックによりＤＮＡ導入した後に、細胞を２４ウェルに蒔くことを２回繰り返し、９６ウェルに蒔くことを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４２、および７２時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２４１）を９６ウェルプレートに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒ機器上に置いて、２分間振盪させ、室温で１０分間反応させた。その後、発光の程度を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２（複数の標的２）条件では、２０～５０％の細胞死が経時的に誘導された。加えて、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、およびＨＥＲＣ２Ｐ２の３つのＣＮＶ標的は、ＭＴ２と同様の細胞死を誘導し、ならびに、ＳＨＢＧ２ ＣＮＶ標的は、対照条件と比較して、７０～８０％の細胞死を誘導した。ＤＮＡ導入の２４時間後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを２４ウェルに加え、ほぼ細胞死の時点で、細胞培養培地を変更することにより細胞を回復させた。５～７日間の回復後、細胞を各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色して、生存細胞の数を決定した。ＤＮＡが導入された後、ピューロマイシンを用いて細胞を選択し、その後、顕微鏡で観察して、細胞の数を測定した。細胞計数の結果と同様に、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５標的化処置は、細胞の５０％より多くを回復させたが、ＭＴ２標的化処置では、９０％の細胞死が観察され、および、細胞の１０％のみが回復した。したがって、Ａ５４９細胞において、Ｃａｓ９タンパク質を使用して、ＣＮＶ標的ＤＮＡ切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
図１２－図１３は、複数の標的２によるＡ５４９細胞の細胞死を示す。５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ発現ＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＡ５４９（膵臓）細胞へと導入した。培養したＡ５４９細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータに移し、電気ショックを与えた。対照として、ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ１、および１つのコピーを有するＣＣＲ５、ならびに電気ショックのみの条件を追加した。電気ショックによりＤＮＡ導入した後に、細胞を２４ウェルに蒔くことを２回繰り返し、９６ウェルに蒔くことを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４２、および７２時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２４１）を９６ウェルプレートに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒ機器上に置いて、２分間振盪させ、室温で１０分間反応させた。その後、発光の程度を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２（複数の標的２）条件では、２０～５０％の細胞死が経時的に誘導された。加えて、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、およびＨＥＲＣ２Ｐ２の３つのＣＮＶ標的は、ＭＴ２と同様の細胞死を誘導し、ならびに、ＳＨＢＧ２ ＣＮＶ標的は、対照条件と比較して、７０～８０％の細胞死を誘導した。ＤＮＡ導入の２４時間後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを２４ウェルに加え、ほぼ細胞死の時点で、細胞培養培地を変更することにより細胞を回復させた。５～７日間の回復後、細胞を各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色して、生存細胞の数を決定した。ＤＮＡが導入された後、ピューロマイシンを用いて細胞を選択し、その後、顕微鏡で観察して、細胞の数を測定した。細胞計数の結果と同様に、ＨＰＲＴ１、ＣＣＲ５標的化処置は、細胞の５０％より多くを回復させたが、ＭＴ２標的化処置では、９０％の細胞死が観察され、および、細胞の１０％のみが回復した。したがって、Ａ５４９細胞において、Ｃａｓ９タンパク質を使用して、ＣＮＶ標的ＤＮＡ切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
【0288】
実施例２０：エレクトロポレーション＿Ｌｏｎｚａ：Ａ５４９（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ）、ＣＮＶ標的によるＡ５４９細胞の細胞死。
Ａ５４９（膵臓）細胞を、エレクトロポレーションにより、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および個々のＣＮＶの標的ｇＲＮＡをコード化するＤＮＡでトランスフェクトした。培養したＡ５４９細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータに移し、電気ショックを受けさせた。対照として、ｐＥＴ２１ａベクター大腸菌においてタンパク質を発現することができる条件、電気ショックのみの条件、および処置を追加しなかった。電気ショックによるＤＮＡ導入後に、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに加えることを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４４、および５１時間後、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を各々のウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は、細胞中のＡＴＰの量に基づく代謝を含み、吸光度により生細胞の程度を決定する方法である。結果として、３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２（標的２）条件において、２０～５０％の細胞死が経時的に誘導された。加えて、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、およびＨＥＲＣ２Ｐ２の３つのＣＮＶ標的は、ＭＴ２条件と同様の程度の細胞死を観察し、ＳＨＢＧ ＣＮＶ標的は、対照条件と比較して、７０～８０％の細胞死を誘導した。したがって、Ａ５４９細胞において、Ｃａｓ９タンパク質を使用して、ＣＮＶの標的ＤＮＡ切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
Ａ５４９（膵臓）細胞を、エレクトロポレーションにより、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および個々のＣＮＶの標的ｇＲＮＡをコード化するＤＮＡでトランスフェクトした。培養したＡ５４９細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータに移し、電気ショックを受けさせた。対照として、ｐＥＴ２１ａベクター大腸菌においてタンパク質を発現することができる条件、電気ショックのみの条件、および処置を追加しなかった。電気ショックによるＤＮＡ導入後に、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに加えることを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４４、および５１時間後、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を各々のウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は、細胞中のＡＴＰの量に基づく代謝を含み、吸光度により生細胞の程度を決定する方法である。結果として、３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２（標的２）条件において、２０～５０％の細胞死が経時的に誘導された。加えて、ＣＤ６８、ＤＡＣＨ２、およびＨＥＲＣ２Ｐ２の３つのＣＮＶ標的は、ＭＴ２条件と同様の程度の細胞死を観察し、ＳＨＢＧ ＣＮＶ標的は、対照条件と比較して、７０～８０％の細胞死を誘導した。したがって、Ａ５４９細胞において、Ｃａｓ９タンパク質を使用して、ＣＮＶの標的ＤＮＡ切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
【0289】
実施例２１：ＣＮＶ標的によるＳＫＢＲ３細胞の細胞死。
乳癌細胞株であるＳＫＢＲ３を、エレクトロポレーションによって、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および各ＣＮＶ標的ｇＲＮＡを発現するＤＮＡで処理した。培養したＳＫＢＲ３細胞を、１ＸＰＢＳで洗浄し、その後、トリプシン－ＥＤＴＡで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、電気ショックのみの条件、および処置がない条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるＤＮＡ導入後、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに挿入することを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４２、および４８時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を９６ウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定された。結果として、３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２条件において、３０％の細胞死が誘導された。加えて、２つのＣＮＶ標的であるＥＲＢＢ２とＫＲＴ１６は、対照条件と比較して、４０～５０％の細胞死を誘導した。電気ショックによるＤＮＡ導入後、細胞を２４ウェルに入れることを２回繰り返した。ＤＮＡの導入の４８時間後に、細胞を２４ウェルの各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色し、生細胞の数を測定した。結果として、対照条件と比較して、ＭＴ２条件において４０％の細胞死が誘導され、２つの種類のＥＲＢＢ２とＫＲＴ１６のＣＮＶ標的は、対照条件と比較して４０～５０％の細胞死を誘導した。したがって、ＳＫＢＲ３細胞の２つのＣＮＶにおいて、Ｃａｓ９タンパク質を使用した標的ＤＮＡ切断の誘導によって、細胞死が誘導されたことが確認された。
乳癌細胞株であるＳＫＢＲ３を、エレクトロポレーションによって、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および各ＣＮＶ標的ｇＲＮＡを発現するＤＮＡで処理した。培養したＳＫＢＲ３細胞を、１ＸＰＢＳで洗浄し、その後、トリプシン－ＥＤＴＡで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、電気ショックのみの条件、および処置がない条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるＤＮＡ導入後、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに挿入することを３回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４、４２、および４８時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を９６ウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定された。結果として、３つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２条件において、３０％の細胞死が誘導された。加えて、２つのＣＮＶ標的であるＥＲＢＢ２とＫＲＴ１６は、対照条件と比較して、４０～５０％の細胞死を誘導した。電気ショックによるＤＮＡ導入後、細胞を２４ウェルに入れることを２回繰り返した。ＤＮＡの導入の４８時間後に、細胞を２４ウェルの各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色し、生細胞の数を測定した。結果として、対照条件と比較して、ＭＴ２条件において４０％の細胞死が誘導され、２つの種類のＥＲＢＢ２とＫＲＴ１６のＣＮＶ標的は、対照条件と比較して４０～５０％の細胞死を誘導した。したがって、ＳＫＢＲ３細胞の２つのＣＮＶにおいて、Ｃａｓ９タンパク質を使用した標的ＤＮＡ切断の誘導によって、細胞死が誘導されたことが確認された。
【0290】
実施例２２：子宮頚癌の処置のための、ヒーラーＣＮＶあるいはＨＰＶ遺伝子の標的化。
図１８Ａに示されるのは、Ａｄｅｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ＨｅＬａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５００， ２０７－２１１ （２０１３））からの、ヒーラーゲノムにおけるＨＰＶ複製遺伝子座マップである。紫はヒーラーを示し、緑はＨＰＶを示す。ＦＩＧを示された。図１８Ｂは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＣａＳｋｉ， ＳｉＨａ ａｎｄ ＨｅＬａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８０， １７２５－１７３３ （１９９９））， Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ａ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｇ３：Ｇｅｎｅｓ｜Ｇｅｎｏｍｅｓ｜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３， １２１３－２４ （２０１３））， Ａｄｅｙ， ａｎｄ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｙ ＨＰＶ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７， ５８５２－５８６４ （２０１６））から推論される、ヒーラー細胞中のＨＰＶ配列領域である。反復数がＸとして標識され、開いている配列のみが矢印として標識される。図１８Ｃに示されるのは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｌａｎｄｒｙ、ＡｄｅｙとＬｉｕに基づいた、ヒーラー細胞におけるＨＰＶ配列間の反復領域を示すＰＣＲ産物の電気泳動ゲルである。
図１８Ａに示されるのは、Ａｄｅｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ＨｅＬａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５００， ２０７－２１１ （２０１３））からの、ヒーラーゲノムにおけるＨＰＶ複製遺伝子座マップである。紫はヒーラーを示し、緑はＨＰＶを示す。ＦＩＧを示された。図１８Ｂは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＣａＳｋｉ， ＳｉＨａ ａｎｄ ＨｅＬａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８０， １７２５－１７３３ （１９９９））， Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ａ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｇ３：Ｇｅｎｅｓ｜Ｇｅｎｏｍｅｓ｜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３， １２１３－２４ （２０１３））， Ａｄｅｙ， ａｎｄ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｙ ＨＰＶ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７， ５８５２－５８６４ （２０１６））から推論される、ヒーラー細胞中のＨＰＶ配列領域である。反復数がＸとして標識され、開いている配列のみが矢印として標識される。図１８Ｃに示されるのは、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｌａｎｄｒｙ、ＡｄｅｙとＬｉｕに基づいた、ヒーラー細胞におけるＨＰＶ配列間の反復領域を示すＰＣＲ産物の電気泳動ゲルである。
【0291】
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現する６００ｎｇのＤＮＡベクターを、子宮頚癌モデル細胞（ヒーラー細胞）の２ｘ１０５の細胞において電気穿孔した。ヒーラー細胞を調製するために、フラスコから培地を取り除き、細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、および、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで処理して、フラスコからヒーラー細胞を脱離させた。細胞計数を実施し、適切な数の細胞を新しい管に移し、細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、細胞をＬｏｎｚａ ＳＥ緩衝液で再懸濁し、ＤＮＡベクターと混合した。その混合物をエレクトロポレータ（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）に移し、エレクトロポレーションを行った。コピー数が１である非必須遺伝子ＣＣＲ５を標的とするプラスミドを陰性対照として使用し、１００の非必須遺伝子（ＭＴ２）を標的とするプラスミドの混合物を陽性対照として使用した。実験群では、８回複製された非必須遺伝子ＰＲＤＭ９を標的とするプラスミドと、ヒーラー細胞において３０回複製されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子とが標的とされた。エレクトロポレーションによるＤＮＡ導入の２４時間後、培地を取り除き、０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンと取り替え、トランスフェクトされたヒーラー細胞を選択した。ピューロマイシン選択の３日後に、培地を標準的な培地と取り替え、細胞を３～４日間培養し、細胞を計数した。図１９は、各群の細胞生存率のグラフを示す。データは、陰性対照であるＣＣＲ５と比較して、ＭＴ２を標的とすることで、最大５０％の細胞死を誘導したことを実証した。加えて、ＰＲＤＭ９とＨＰＶ＿１配列を標的とすることで、ＭＴ２の標的化と同様の、あるいはＭＴ２の標的化より多くの細胞死を誘導した。したがって、ヒーラー細胞特異的ＣＮＶ＆ＨＰＶ遺伝子は、Ｃａｓ９によって切断され、細胞死が誘導された。
【0292】
上述されるのと同じ方法を使用して、図２０を生成した。エレクトロポレーションの２４、４８、および７２時間後、代謝を受ける生細胞の量を、発光吸光度の測定によりＡＴＰを定量化するＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ２．０を使用して測定した。ＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ）を使用し、コピー数が１である非必須遺伝子ＣＣＲ５を陰性対照として使用した。１００の非必須遺伝子（ＭＴ２）を標的とするプラスミドの混合物を、陽性対照として使用した。実験群では、プラスミドは８回複製された非必須遺伝子ＰＲＤＭ９と、ヒーラー細胞において３０回複製されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子とを標的とした。図２０Ａは、各時点における、各処置群についての発光シグナル、あるいはＡＴＰレベルのグラフを示す。ヒーラー細胞では、同様の発光シグナルがパルスのみ（ＧＦＰ）とＣＣＲ５との間にあることが、データにより示された。陰性対照であるＣＣＲ５と比較して、ＭＴ２の標的化により最大５０％の細胞死を誘導した。加えて、ＰＲＤＭ９とＨＰＶ＿１配列を標的とすることで、ＭＴ２条件の標的化と同様の、あるいはＭＴ２条件の標的化よりも多くの細胞死を誘導した。ＨＰＶ遺伝子を標的化した後のヒーラー細胞死を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって以下のように評価した。上述されるのと同じ方法を使用して図２０Ｂを生成した。陰性対照として、コピー数が１である非必須遺伝子ＣＣＲ５を標的とするためにプラスミドを使用し、１００の非必須遺伝子（ＭＴ２）を標的とするプラスミドの混合物を陽性対照として使用した。非ヒト配列を標的とする、非標的陰性対照（ＮＴ１）を加えた。ＮＴ１対照は、２０ｍｅｒのスペーサーを有し、ＮＴ２／ＮＴ３はそれぞれ１０ｍｅｒ、５ｍｅｒのスペーサーを有する。実験群として、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子を標的とするプラスミドを使用し、それは、ヒーラー細胞において３０回複製される。エレクトロポレーションの使用によるＤＮＡ導入の２４時間後に、培地を取り除き、０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンと取り替え、トランスフェクトされたヒーラー細胞を選択した。ピューロマイシン選択の３日後に、培地を標準的な培地と取り替え、１０日間培養した。代謝を受ける生細胞の相対量をＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏによって計算した。実験の結果として、ヒーラー細胞において、ＣＣＲ５は、スペーサー配列が５ｍｅｒであるＮＴ３と比べて、７５％の発光シグナルを示した。さらに、ＭＴ２の標的化は、ＮＴ３と比べて最大９９．５％の細胞死を誘導した。加えて、ＨＰＶ＿１配列を標的とすることで、ＣＣＲ５条件と比べて最大約９０％の細胞死を誘導した。したがって、ヒーラー細胞特異的ＨＰＶ遺伝子がＣａｓ９によって切断されると、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏによって検出されるように、細胞死が誘導された。
【0293】
実施例２３：結腸癌関連遺伝子を標的とするＨＴ２９トランスフェクション。
ＨＴ２９細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１１に記載されるように各ウェルへと導入した。
ＨＴ２９細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞で蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１１に記載されるように各ウェルへと導入した。
【0294】
【表10】
【0295】
メーカーのプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００試薬を使用することにより、細胞プレーティングから２４時間後の時点でトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処理し、細胞を９０時間目に選択した。トランスフェクションの効率が低いため、ほぼ全細胞死を観察し、少数の生き延びた細胞は、１２日目に通常の完全なＭｃＣＯＹ培地によって回復した。トランスフェクションの４８時間後、すべての上清を吸引により廃棄し、細胞を５００μＬの１ＸＰＢＳにより優しく洗浄した。トリプシン処理により細胞を収集し、生細胞の数をトリパンブルー染色およびｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて計数した。図２１は、処置群あたりの生細胞数を示す。全ゲノム中で２つの切断のみを作る標的であるＣＣＲ５、ヒトゲノム中に一致した配列がないＮＴ１は、同様の高いレベルの細胞生存率を示した。しかし、ハウスキーピング遺伝子中で２つの切断を作るＨＰＲＴ１は、ＮＴ１と比較して、約５０％の細胞生存率を示した。複数の切断を作る標的、特に、ＭＴ２、ＴＲＡＰＰＣ９、およびＣＤＫ８は、重度の細胞死を示し、回復された細胞をほとんど示さないか、あるいは全く示さなかった。ＬＩＮＫ００５３６およびＴＲＰＳ１は、ＮＴ１と比較して、それぞれ１８％と２０％の細胞生存率を示した。
【0296】
実施例２４：標的クロスチェック（１５６３における１２９９の標的）。
図１３に示されるＨ１５６３トランスフェクションと平行して、図２２を実施した。Ｈ１５６３細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞として蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１２に記載されるように各ウェルへと導入した。
図１３に示されるＨ１５６３トランスフェクションと平行して、図２２を実施した。Ｈ１５６３細胞を、２４ウェルプレート中の１ウェル当たり１．５ｘ１０５の細胞として蒔き、５００ｎｇのプラスミドを下記の表１２に記載されるように各ウェルへと導入した。
【0297】
【表11】
【0298】
メーカーのプロトコルに従って、リポフェクタミン３０００試薬を使用することにより、細胞プレーティングから２４時間後にトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処置し、細胞を７２時間目に選択した。トランスフェクションの４８時間後、すべての上清を吸引により廃棄し、細胞を５００μＬの１ＸＰＢＳにより優しく洗浄した。トリプシン処理により細胞を収集し、生細胞の数をトリパンブルー染色およびｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｓｓを用いて計数した。図２２は、各処置群における生細胞のグラフを示す。Ｈ１２９９株特異的ＣＮＶ標的であるＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５、ＫＣＮＥ２を、Ｈ１５６３において試験した。その試験では、それらは全ゲノム中２つの切断を作っただけであった。予想通りに、ＳＭＩＭ１１、ＧＮＰＤＡ２、ＳＬＣ１５Ａ５は、ＣＣＲ５と比較して、悪影響を示さなかった。ＫＣＮＥ２は細胞死効果を示した。この現象は、顕微鏡画像においても確認された（図２３）。
【0299】
実施例２５：Ｈ１２９９細胞中のリポフェクション、アネキシンＶの正の決定（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）による死細胞の決定。
トランスフェクションの１日前に、肺癌細胞株であるＨ１２９９細胞を、１．３×１０４で白い９６ウェルプレートに蒔いた。その次の日、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および各ＣＮＶ標的ｇＲＮＡをコード化するＤＮＡを、リポソームを使用して導入した。０．３μＬのリポソーム試薬Ｉを、５μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭと混合して、管１を作成した。各実験条件で、０．２μＬのリポソーム試薬ＩＩを、５μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭおよび５００ｎｇのＤＮＡと混合して、管２を作成した。管２を管１と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１１μＬのリポソームとＤＮＡの混合物を９６ウェルに加えた。３時間後に、ＡｎｎＶ試薬を加え、発光の程度をリポフェクションの２４時間後に測定した。この方法は、アポトーシスが生じる際に、細胞外膜（ｏｕｔｅｒ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ）に露出したＰＳ（ホスファチジルセリン）部位にＡｎｎＶを加える場合の発光の程度に従って、アポトーシスの程度を測定する。その結果、Ｈ１２９９細胞の４つのＣＮＶにおいてＣａｓ９タンパク質を使用することによって、標的ＤＮＡ切断が誘導された際に、３０％～４０％の細胞死率が観察された。細胞膜をＰＳに露出して、アポトーシスを誘導した。図２４は、各処置群についての細胞死を示す発光のグラフを示す。
トランスフェクションの１日前に、肺癌細胞株であるＨ１２９９細胞を、１．３×１０４で白い９６ウェルプレートに蒔いた。その次の日、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および各ＣＮＶ標的ｇＲＮＡをコード化するＤＮＡを、リポソームを使用して導入した。０．３μＬのリポソーム試薬Ｉを、５μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭと混合して、管１を作成した。各実験条件で、０．２μＬのリポソーム試薬ＩＩを、５μＬのｏｐｔｉ－ＭＥＭおよび５００ｎｇのＤＮＡと混合して、管２を作成した。管２を管１と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１１μＬのリポソームとＤＮＡの混合物を９６ウェルに加えた。３時間後に、ＡｎｎＶ試薬を加え、発光の程度をリポフェクションの２４時間後に測定した。この方法は、アポトーシスが生じる際に、細胞外膜（ｏｕｔｅｒ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ）に露出したＰＳ（ホスファチジルセリン）部位にＡｎｎＶを加える場合の発光の程度に従って、アポトーシスの程度を測定する。その結果、Ｈ１２９９細胞の４つのＣＮＶにおいてＣａｓ９タンパク質を使用することによって、標的ＤＮＡ切断が誘導された際に、３０％～４０％の細胞死率が観察された。細胞膜をＰＳに露出して、アポトーシスを誘導した。図２４は、各処置群についての細胞死を示す発光のグラフを示す。
【0300】
実施例２６：ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株であるＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死、ヒトコドン最適化Ｒｅｃ Ｊタンパク質による殺細胞効果の増強。
突然変異体特異的ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９発現ベクター（ＰＸ４５９、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６２９８８）を使用して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌ゲノムにおいて複数の切断を誘導した。Ｃａｓ９－ＲｅｃＪタンパク質を発現するベクターをクローン化し、ここで、Ｃａｓ９配列は、３’末端でヒトコドン最適化Ｒｅｃ Ｊ配列と隣接していた。肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターの送達のために電気穿孔した。ＨＣＣ８２７細胞は、そのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノムにおいて、突然変異配列の１８を超えるコピーが存在する。ガイドＲＮＡを、ＨＣＣ８２７細胞株において１８を超える遺伝子座を標的とするように設計した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を満たすまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。５００ｎｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現を有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。細胞を増殖培地において４日間回復させて、計数した。図２５の下部は、各処置群における生細胞のグラフを示す。ベクターを用いず、または野生型のＥＧＦＲ配列を標的とするベクターを用いて、または単一の遺伝子座を標的とするベクター（ＣＣＲ５）を用いて電気穿孔された対照群と比較して、ＨＣＣ８２７特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。ＥＧＦＲ＿Ｅ２実験群において３３％の細胞死が観察された。さらに、Ｃａｓ９ＲｅｃＪタンパク質は、複数の切断の効果を増強しただけではなく、単一の遺伝子座標的化ガイドＲＮＡに細胞死滅能力を与えたことも確認された。その結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させたことを示し、その効果は、ヒトコドン最適化Ｒｅｃ Ｊタンパク質で増強された。ＣＣＲ５群において５０％の細胞死を観察し、ＥＧＦＲ＿Ｅ２群において８０％の細胞死を観察した。Ｃａｓ９－ＲｅｃＪ構築物を使用することで、対照と比較して、細胞死効率を５倍増大させた。
突然変異体特異的ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９発現ベクター（ＰＸ４５９、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６２９８８）を使用して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌ゲノムにおいて複数の切断を誘導した。Ｃａｓ９－ＲｅｃＪタンパク質を発現するベクターをクローン化し、ここで、Ｃａｓ９配列は、３’末端でヒトコドン最適化Ｒｅｃ Ｊ配列と隣接していた。肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターの送達のために電気穿孔した。ＨＣＣ８２７細胞は、そのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノムにおいて、突然変異配列の１８を超えるコピーが存在する。ガイドＲＮＡを、ＨＣＣ８２７細胞株において１８を超える遺伝子座を標的とするように設計した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を満たすまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。５００ｎｇのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現を有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。細胞を増殖培地において４日間回復させて、計数した。図２５の下部は、各処置群における生細胞のグラフを示す。ベクターを用いず、または野生型のＥＧＦＲ配列を標的とするベクターを用いて、または単一の遺伝子座を標的とするベクター（ＣＣＲ５）を用いて電気穿孔された対照群と比較して、ＨＣＣ８２７特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。ＥＧＦＲ＿Ｅ２実験群において３３％の細胞死が観察された。さらに、Ｃａｓ９ＲｅｃＪタンパク質は、複数の切断の効果を増強しただけではなく、単一の遺伝子座標的化ガイドＲＮＡに細胞死滅能力を与えたことも確認された。その結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させたことを示し、その効果は、ヒトコドン最適化Ｒｅｃ Ｊタンパク質で増強された。ＣＣＲ５群において５０％の細胞死を観察し、ＥＧＦＲ＿Ｅ２群において８０％の細胞死を観察した。Ｃａｓ９－ＲｅｃＪ構築物を使用することで、対照と比較して、細胞死効率を５倍増大させた。
【0301】
実施例２６：様々な送達方法。
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構築物を投与するための様々な送達方法を示す。
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構築物を投与するための様々な送達方法を示す。
【0302】
ＨＣＣ８２７細胞中のＲＮＰのｎｅｏｎエレクトロポレーション。図２６は、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌細胞株であるＨＣＣ８２７における、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死を示す。突然変異体特異的ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ９ ＲＮＰ）を使用して、ＥＧＦＲ突然変異体肺癌ゲノム中の複数の切断を誘導した。肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を、Ｃａｓ９ ＲＮＰの送達のために電気穿孔した。ＨＣＣ８２７はそのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の１８を超えるコピーがある。ガイドＲＮＡを、ＨＣＣ８２７細胞株中の１８を超える遺伝子座を標的とするように設計した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。１．２μＭのＲＮＰを有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。細胞を増殖培地において２４時間回復させて、計数した。完全なＲＮＰを用いずに電気穿孔した対照群と比較して、ＨＣＣ８２７特異的突然変異を標的とするＲＮＰを用いて電気穿孔した実験群は、標的とされていないＲＮＰと比較して、細胞の数が３分の１に有意に減少した。その結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させたことを示していた。
【0303】
Ｈ１５６３細胞におけるＣａｓ９構築物のリポフェクション。図２７は、腺癌細胞株であるＨ１５６３におけるＣａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死を示す。ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ９ ＲＮＰ）を使用して、ヒトゲノムにおいて１００を超える遺伝子座を標的とした。肺腺癌細胞株であるＨ１５６３を、Ｃａｓ９ ＲＮＰの伝達のために電気穿孔した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。１．２μＭのＲＮＰを有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１２００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。その後、細胞を増殖培地において４８時間回復させて、計数した。標的とされていないＲＮＰを用いて電気穿孔した対照群と比較して、複数の遺伝子座を標的とするＲＮＰを用いて電気穿孔した実験群は、細胞が３０％有意に少なかった。上記結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させることを示していた。
【0304】
Ｎｅｏｎエレクトロポレーションの２日後のＨ１２９９ ＲＮＰ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）。図２８は、腺癌細胞株であるＨ１２９９におけるＣａｓ９ガイドＲＮＡ由来の複数の切断の誘導および細胞死を示す。突然変異体特異的ガイドＲＮＡを有するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ９ ＲＮＰ）を使用して、Ｈ１２９９肺癌細胞株中の複数の切断を誘導した。Ｈ１２９９ゲノムにおける高いコピー数多型（ＣＮＶ）を有する遺伝子を検索し、ならびに、ＧＮＰＤＡ２（＞１２のコピー、癌遺伝子）およびＳＭＩＭ１１（＞４０のコピー、非必須遺伝子）を、Ｃａｓ９標的として選択した。ヒトゲノムにおける１００を超える遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ＭＴ２）を設計して、それを実験に使用した。肺腺癌細胞株であるＨ１２９９を、Ｃａｓ９ ＲＮＰの伝達のために電気穿孔した。ＧＦＰ標識Ｃａｓ９タンパク質を使用して、トランスフェクションを検証した。ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。１．２μＭのＲＮＰを有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。その後、細胞を増殖培地において４８時間回復させて、計数した。完全なＲＮＰを用いずに電気穿孔した対照群と比較して、Ｈ１２９９ゲノムにおいて複数の遺伝子座を標的とするＲＮＰを用いて電気穿孔した実験群は、細胞の数が有意に少なかった。ＧＮＰＤＡ２実験群において７１％の細胞死を観察し、ＳＭＩＭ１１実験群において４０％の細胞死を観察し、ＭＴ２実験群において３３％の細胞死を観察した。その結果は、Ｃａｓ９および標的特異的ガイドＲＮＡによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させたことを示していた。
【0305】
実施例２７：ＣＮＶの標的化によるＨＴ－２９細胞の細胞死。
ＣＮＶおよびＭＴ２を標的とするにより、ＨＴ－２９（結腸癌細胞株）における特異的な死滅を分析すること。ＨＴ－２９細胞を、エレクトロポレーションにより、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および個々のＣＮＶの標的ｇＲＮＡを発現するＤＮＡで導入した。培養したＨＴ－２９細胞を、１ＸＰＢＳで洗浄し、その後、トリプシン－ＥＤＴＡで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、および電気ショックのみの条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるＤＮＡ導入後、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに挿入することを４回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を９６ウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。結果として、３つの対照条件と比較して、ＴＲＡＰＰＣ９およびヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２条件において、３０％の細胞死が誘導された。加えて、図２９に示されるように、３つのＣＮＶ標的であるＣＤＫ８、ＬＩＮＣ００５３６、およびＴＲＰＳ１は、２０～４５％の細胞死を誘導した。
ＣＮＶおよびＭＴ２を標的とするにより、ＨＴ－２９（結腸癌細胞株）における特異的な死滅を分析すること。ＨＴ－２９細胞を、エレクトロポレーションにより、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、および個々のＣＮＶの標的ｇＲＮＡを発現するＤＮＡで導入した。培養したＨＴ－２９細胞を、１ＸＰＢＳで洗浄し、その後、トリプシン－ＥＤＴＡで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、１ＸＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬ／各条件で、Ｌｏｎｚａ ＳＦ緩衝液で再懸濁し、それを各ＤＮＡと混合した。細胞とＤＮＡの混合物をＬｏｎｚａ エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないＮＴ１（非標的）、および電気ショックのみの条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるＤＮＡ導入後、各条件ごとに、細胞を９６ウェルに挿入することを４回繰り返した。ＤＮＡ導入の２４時間後に、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を９６ウェルに加えた。プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ ｏｍｅｇａ ｒｅａｄｅｒに置いて、２分間振盪させた。室温で１０分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のＡＴＰの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。結果として、３つの対照条件と比較して、ＴＲＡＰＰＣ９およびヒトゲノム中の１００を超える部位を標的とするＭＴ２条件において、３０％の細胞死が誘導された。加えて、図２９に示されるように、３つのＣＮＶ標的であるＣＤＫ８、ＬＩＮＣ００５３６、およびＴＲＰＳ１は、２０～４５％の細胞死を誘導した。
【0306】
実施例２８：Ｃａｓ１２ａおよび単一あるいは複数の標的ｃｒＲＮＡによる、配列特異的癌細胞の死滅効果。
Ｃａｓ１２ａ発現ベクターを、高いＣＮＶ突然変異配列（ＥＧＦＲ＿Ｅ２）あるいは非ＣＮＶ ＷＴ配列（ＣＣＲ５）を標的とするｃｒＲＮＡと共に使用した。ＨＣＣ８２７ゲノムにおける＞１８の切断あるいは１つの二重切断のいずれかをそれぞれ誘導するように、ｃｒＲＮＡを設計した。肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を、Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ発現ベクターの送達のために電気穿孔した。ＨＣＣ８２７はそのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の１８を超えるコピーがある。使用したＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列は、ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡａＡＣＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＧＣＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＴＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＡＧＧＣＴＡＴＣＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＧＡＴＣＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡｔＣＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＡｇＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＣＧＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＴＡＣＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＧＧＴＴＴＴＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴＡＣＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧＡｇＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＧＡＡＣＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡｔＣＧＧＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＧＴＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＣＡＧＴＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＣＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＴＡＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＴＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＧＧであり、および、その対応するタンパク質配列は、ＭＧＫＮＱＮＦＱＥＦＩＧＶＳＰＬＱＫＴＬＲＮＥＬＩＰＴＥＴＴＫＫＮＩＴＱＬＤＬＬＴＥＤＥＩＲＡＱＮＲＥＫＬＫＥＭＭＤＤＹＹＲＮＶＩＤＳＴＬＨＶＧＩＡＶＤＷＳＹＬＦＳＣＭＲＮＨＬＲＥＮＳＫＥＳＫＲＥＬＥＲＴＱＤＳＩＲＳＱＩＨＮＫＦＡＥＲＡＤＦＫＤＭＦＧＡＳＩＩＴＫＬＬＰＴＹＩＫＱＮＳＥＹＳＥＲＹＤＥＳＭＥＩＬＫＬＹＧＫＦＴＴＳＬＴＤＹＦＥＴＲＫＮＩＦＳＫＥＫＩＳＳＡＶＧＹＲＩＶＥＥＮＡＥＩＦＬＱＮＱＮＡＹＤＲＩＣＫＩＡＧＬＤＬＨＧＬＤＮＥＩＴＡＹＶＤＧＫＴＬＫＥＶＣＳＤＥＧＦＡＫＡＩＴＱＥＧＩＤＲＹＮＥＡＩＧＡＶＮＱＹＭＮＬＬＣＱＫＮＫＡＬＫＰＧＱＦＫＭＫＲＬＨＫＱＩＬＣＫＧＴＴＳＦＤＩＰＫＫＦＥＮＤＫＱＶＹＤＡＶＮＳＦＴＥＩＶＴＫＮＮＤＬＫＲＬＬＮＩＴＱＮＡＮＤＹＤＭＮＫＩＹＶＶＡＤＡＹＳＭＩＳＱＦＩＳＫＫＷＮＬＩＥＥＣＬＬＤＹＹＳＤＮＬＰＧＫＧＮＡＫＥＮＫＶＫＫＡＶＫＥＥＴＹＲＳＶＳＱＬＮＥＶＩＥＫＹＹＶＥＫＴＧＱＳＶＷＫＶＥＳＹＩＳＳＬＡＥＭＩＫＬＥＬＣＨＥＩＤＮＤＥＫＨＮＬＩＥＤＤＥＫＩＳＥＩＫＥＬＬＤＭＹＭＤＶＦＨＩＩＫＶＦＲＶＮＥＶＬＮＦＤＥＴＦＹＳＥＭＤＥＩＹＱＤＭＱＥＩＶＰＬＹＮＨＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＫＱＥＫＹＲＬＹＦＨＴＰＴＬＡＮＧＷＳＫＳＫＥＹＤＮＮＡＩＩＬＶＲＥＤＫＹＹＬＧＩＬＮＡＫＫＫＰＳＫＥＩＭＡＧＫＥＤＣＳＥＨＡＹＡＫＭＮＹＹＬＬＰＧＡＮＫＭＬＰＫＶＦＬＳＫＫＧＩＱＤＹＨＰＳＳＹＩＶＥＧＹＮＥＫＫＨＩＫＧＳＫＮＦＤＩＲＦＣＲＤＬＩＤＹＦＫＥＣＩＫＫＨＰＤＷＮＫＦＮＦＥＦＳＡＴＥＴＹＥＤＩＳＶＦＹＲＥＶＥＫＱＧＹＲＶＥＷＴＹＩＮＳＥＤＩＱＫＬＥＥＤＧＱＬＦＬＦＱＩＹＮＫＤＦＡＶＧＳＴＧＫＰＮＬＨＴＬＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＲＤＩＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＶＱＫＰＶＩＨＫＣＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＩＴＥＳＧＴＴＲＶＱＳＩＰＥＳＥＹＭＥＬＹＲＹＦＮＳＥＫＱＩＥＬＳＤＥＡＫＫＹＬＤＫＶＱＣＮＫＡＫＴＤＩＶＫＤＹＲＹＴＭＤＫＦＦＩＨＬＰＩＴＩＮＦＫＶＤＫＧＮＮＶＮＡＩＡＱＱＹＩＡＧＲＫＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＭＹＧＲＩＬＥＱＫＳＦＮＬＶＥＱＶＳＳＱＧＴＫＲＹＹＤＹＫＥＫＬＱＮＲＥＥＥＲＤＫＡＲＱＳＷＫＴＩＧＫＩＫＥＬＫＥＧＹＬＳＳＶＩＨＥＩＡＱＭＶＶＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＮＹＧＦＫＲＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＳＫＬＮＹＬＡＤＫＳＱＡＶＤＥＰＧＧＩＬＲＧ
ＹＱＭＴＹＶＰＤＮＩＫＮＶＧＲＱＣＧＩＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＩＮＡＦＫＲＤＶＶＳＴＮＤＡＫＥＮＦＬＭＫＦＤＳＩＱＹＤＩＥＫＧＬＦＫＦＳＦＤＹＫＮＦＡＴＨＫＬＴＬＡＫＴＫＷＤＶＹＴＮＧＴＲＩＱＮＭＫＶＥＧＨＷＬＳＭＥＶＥＬＴＴＫＭＫＥＬＬＤＤＳＨＩＰＹＥＥＧＱＮＩＬＤＤＬＲＥＭＫＤＩＴＴＩＶＮＧＩＬＥＩＦＷＬＴＶＱＬＲＮＳＲＩＤＮＰＤＹＤＲＩＩＳＰＶＬＮＫＮＧＥＦＦＤＳＤＥＹＮＳＹＩＤＡＱＫＡＰＬＰＩＤＡＤＡＮＧＡＦＣＩＡＬＫＧＭＹＴＡＮＱＩＫＥＮＷＶＥＧＥＫＬＰＡＤＣＬＫＩＥＨＡＳＷＬＡＦＭＱＧＥＲＧであった。ＥＧＦＲ＿ＷＴ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｇｇａｇａｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｃｔｔａａｔｔｃｃであり、ＣＣＲ５ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｔｇｃａｃａｇｇｇｔｇｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔであり、ＥＧＦＲ＿Ｅ２ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｇｇａｇａｔｇｔｃｔｔｇａｔａｇｃｇａｃｇｇｇａであった。ＡｓＣｐｆ１ハンドルは、Ｔａａｔｔｔｃｔａｃｔｃｔｔｇｔａｇａｔであった。
Ｃａｓ１２ａ発現ベクターを、高いＣＮＶ突然変異配列（ＥＧＦＲ＿Ｅ２）あるいは非ＣＮＶ ＷＴ配列（ＣＣＲ５）を標的とするｃｒＲＮＡと共に使用した。ＨＣＣ８２７ゲノムにおける＞１８の切断あるいは１つの二重切断のいずれかをそれぞれ誘導するように、ｃｒＲＮＡを設計した。肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を、Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ発現ベクターの送達のために電気穿孔した。ＨＣＣ８２７はそのＥＧＦＲ遺伝子中にＥ２突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の１８を超えるコピーがある。使用したＣａｓ１２ａ ＤＮＡ配列は、ＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡａＡＣＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＧＣＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＴＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＡＧＧＣＴＡＴＣＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＧＡＴＣＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡｔＣＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＡｇＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＣＧＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＴＡＣＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＧＧＴＴＴＴＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴＡＣＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧＡｇＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＧＡＡＣＣＧＧＡＣＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡｔＣＧＧＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＡＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＧＴＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＣＡＧＴＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＣＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＴＡＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＴＣＧＧＡＴＴＡＴＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＧＧＧであり、および、その対応するタンパク質配列は、ＭＧＫＮＱＮＦＱＥＦＩＧＶＳＰＬＱＫＴＬＲＮＥＬＩＰＴＥＴＴＫＫＮＩＴＱＬＤＬＬＴＥＤＥＩＲＡＱＮＲＥＫＬＫＥＭＭＤＤＹＹＲＮＶＩＤＳＴＬＨＶＧＩＡＶＤＷＳＹＬＦＳＣＭＲＮＨＬＲＥＮＳＫＥＳＫＲＥＬＥＲＴＱＤＳＩＲＳＱＩＨＮＫＦＡＥＲＡＤＦＫＤＭＦＧＡＳＩＩＴＫＬＬＰＴＹＩＫＱＮＳＥＹＳＥＲＹＤＥＳＭＥＩＬＫＬＹＧＫＦＴＴＳＬＴＤＹＦＥＴＲＫＮＩＦＳＫＥＫＩＳＳＡＶＧＹＲＩＶＥＥＮＡＥＩＦＬＱＮＱＮＡＹＤＲＩＣＫＩＡＧＬＤＬＨＧＬＤＮＥＩＴＡＹＶＤＧＫＴＬＫＥＶＣＳＤＥＧＦＡＫＡＩＴＱＥＧＩＤＲＹＮＥＡＩＧＡＶＮＱＹＭＮＬＬＣＱＫＮＫＡＬＫＰＧＱＦＫＭＫＲＬＨＫＱＩＬＣＫＧＴＴＳＦＤＩＰＫＫＦＥＮＤＫＱＶＹＤＡＶＮＳＦＴＥＩＶＴＫＮＮＤＬＫＲＬＬＮＩＴＱＮＡＮＤＹＤＭＮＫＩＹＶＶＡＤＡＹＳＭＩＳＱＦＩＳＫＫＷＮＬＩＥＥＣＬＬＤＹＹＳＤＮＬＰＧＫＧＮＡＫＥＮＫＶＫＫＡＶＫＥＥＴＹＲＳＶＳＱＬＮＥＶＩＥＫＹＹＶＥＫＴＧＱＳＶＷＫＶＥＳＹＩＳＳＬＡＥＭＩＫＬＥＬＣＨＥＩＤＮＤＥＫＨＮＬＩＥＤＤＥＫＩＳＥＩＫＥＬＬＤＭＹＭＤＶＦＨＩＩＫＶＦＲＶＮＥＶＬＮＦＤＥＴＦＹＳＥＭＤＥＩＹＱＤＭＱＥＩＶＰＬＹＮＨＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＫＱＥＫＹＲＬＹＦＨＴＰＴＬＡＮＧＷＳＫＳＫＥＹＤＮＮＡＩＩＬＶＲＥＤＫＹＹＬＧＩＬＮＡＫＫＫＰＳＫＥＩＭＡＧＫＥＤＣＳＥＨＡＹＡＫＭＮＹＹＬＬＰＧＡＮＫＭＬＰＫＶＦＬＳＫＫＧＩＱＤＹＨＰＳＳＹＩＶＥＧＹＮＥＫＫＨＩＫＧＳＫＮＦＤＩＲＦＣＲＤＬＩＤＹＦＫＥＣＩＫＫＨＰＤＷＮＫＦＮＦＥＦＳＡＴＥＴＹＥＤＩＳＶＦＹＲＥＶＥＫＱＧＹＲＶＥＷＴＹＩＮＳＥＤＩＱＫＬＥＥＤＧＱＬＦＬＦＱＩＹＮＫＤＦＡＶＧＳＴＧＫＰＮＬＨＴＬＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＲＤＩＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＶＱＫＰＶＩＨＫＣＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＩＴＥＳＧＴＴＲＶＱＳＩＰＥＳＥＹＭＥＬＹＲＹＦＮＳＥＫＱＩＥＬＳＤＥＡＫＫＹＬＤＫＶＱＣＮＫＡＫＴＤＩＶＫＤＹＲＹＴＭＤＫＦＦＩＨＬＰＩＴＩＮＦＫＶＤＫＧＮＮＶＮＡＩＡＱＱＹＩＡＧＲＫＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＭＹＧＲＩＬＥＱＫＳＦＮＬＶＥＱＶＳＳＱＧＴＫＲＹＹＤＹＫＥＫＬＱＮＲＥＥＥＲＤＫＡＲＱＳＷＫＴＩＧＫＩＫＥＬＫＥＧＹＬＳＳＶＩＨＥＩＡＱＭＶＶＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＮＹＧＦＫＲＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＳＫＬＮＹＬＡＤＫＳＱＡＶＤＥＰＧＧＩＬＲＧ
ＹＱＭＴＹＶＰＤＮＩＫＮＶＧＲＱＣＧＩＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＩＮＡＦＫＲＤＶＶＳＴＮＤＡＫＥＮＦＬＭＫＦＤＳＩＱＹＤＩＥＫＧＬＦＫＦＳＦＤＹＫＮＦＡＴＨＫＬＴＬＡＫＴＫＷＤＶＹＴＮＧＴＲＩＱＮＭＫＶＥＧＨＷＬＳＭＥＶＥＬＴＴＫＭＫＥＬＬＤＤＳＨＩＰＹＥＥＧＱＮＩＬＤＤＬＲＥＭＫＤＩＴＴＩＶＮＧＩＬＥＩＦＷＬＴＶＱＬＲＮＳＲＩＤＮＰＤＹＤＲＩＩＳＰＶＬＮＫＮＧＥＦＦＤＳＤＥＹＮＳＹＩＤＡＱＫＡＰＬＰＩＤＡＤＡＮＧＡＦＣＩＡＬＫＧＭＹＴＡＮＱＩＫＥＮＷＶＥＧＥＫＬＰＡＤＣＬＫＩＥＨＡＳＷＬＡＦＭＱＧＥＲＧであった。ＥＧＦＲ＿ＷＴ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｇｇａｇａｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｃｔｔａａｔｔｃｃであり、ＣＣＲ５ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｔｇｃａｃａｇｇｇｔｇｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔであり、ＥＧＦＲ＿Ｅ２ ｃｒＲＮＡ配列は、Ｇｇａｇａｔｇｔｃｔｔｇａｔａｇｃｇａｃｇｇｇａであった。ＡｓＣｐｆ１ハンドルは、Ｔａａｔｔｔｃｔａｃｔｃｔｔｇｔａｇａｔであった。
【0307】
ＲＰＭＩ－１６４０（１０％のウシ胎仔血清）を使用して、細胞を、７５Ｔフラスコにおいて面積の約５０％を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、および、最後に、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション緩衝液Ｒにおいて再懸濁した。５００ｎｇのＣａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ発現を有する１５０，０００の細胞を、１０μＬのＮｅｏｎピペットチップに充填し、および、最適化された条件（１３００Ｖ、２０ミリセカンド、２パルス）で電気穿孔した。その後、細胞を増殖培地において６日間回復させ、発光を使用して細胞の量を測定した。ＨＣＣ８２７がそのゲノム中に対応する配列を有していない対照群（ＥＧＦＲ＿ＷＴ）と比較して、ＣＣＲ５標的化サンプルは７６％の死亡率を示し、ＥＧＦＲ＿Ｅ２標的化サンプルは８３％の死亡率を示した。その結果は、Ｃａｓ１２ａの使用が、二重切断あるいは複数の切断由来の癌細胞死を誘導することができ、および、その効果は、カスタマイズされたｃｒＲＮＡ設計によって制御することができることを示した。
【0308】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者には思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【国際調査報告】