特表 2022-518729 中枢神経系疾患の治療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-16

(54)【発明の名称】中枢神経系疾患の治療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20220309BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220309BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20220309BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20220309BHJP

   C07K 5/103 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 14/765 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 14/16 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20220309BHJP

   C07K 14/81 20060101ALN20220309BHJP

【ＦＩ】

A61K38/00

A61P25/28

A61K38/38

A61K38/43

C07K5/103

C07K19/00

C07K14/705

C07K14/765

C07K14/16

C07K14/47

C07K14/81

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021541705

(86)(22)【出願日】2020-01-21

(85)【翻訳文提出日】2021-08-31

(86)【国際出願番号】 US2020014338

(87)【国際公開番号】W WO2020150725

(87)【国際公開日】2020-07-23

(31)【優先権主張番号】62/794,147

(32)【優先日】2019-01-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】16/556,957

(32)【優先日】2019-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521317449

【氏名又は名称】エル アンド ジェイ バイオ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】バン，ソクヒー

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ジョン，キュン

(72)【発明者】

【氏名】シン，スン－ウーク

(72)【発明者】

【氏名】リー，クワン，ヒー

(72)【発明者】

【氏名】リー，ホー，ジューン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084DA37

4C084DC01

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZA16

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA56

4H045DA70

4H045EA21

4H045FA74

4H045GA23

4H045GA26

(57)【要約】

本願は、それを必要とする対象の中枢神経系において蛋白質欠損を治療するための方法を開示し、方法は、第１の蛋白質を含む融合ポリペプチドの治療的有効量を対象に全身性に投与することを含み、融合ポリペプチドは、（ａ）第１の蛋白質、（ｂ）インビボで循環系滞留時間の延長をもたらす第２の蛋白質、および（ｃ）血液脳関門通過促進ペプチドを含み、融合ポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする対象の中枢神経系における蛋白質欠損を治療するための方法であって、融合ポリペプチドが（ａ）脳におけるその欠失がアルツハイマー病と相関する第１の蛋白質、（ｂ）インビボで延長された循環系滞留時間をもたらす第２の蛋白質および（ｃ）血液脳関門通過促進ペプチドを含む融合ポリペプチドの治療的有効量を対象に全身的に投与することを含み、融合ポリペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、方法。

【請求項2】

請求項１の方法であって、第１の蛋白質のアミノ酸配列が、第２の蛋白質のアミノ酸配列に共有結合で連結される、方法。

【請求項3】

請求項１の方法であって、第２の蛋白質のアミノ酸配列が、血液脳関門通過促進ペプチドに切断可能に共有結合で連結される、方法。

【請求項4】

請求項３の方法であって、共有結合が、ｐＨ変化により切断可能であるかもしくは導入された切断部位が、グリシル・フェニルアラニル・ロイシル・グリシン（ｇｌｙｃｙｌ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｌｅｕｃｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ；ＧＦＬＧ）である、方法。

【請求項5】

請求項１の方法であって、治療的有効量が、少なくとも約１～１０ｍｇ／体重Ｋｇから成る、方法。

【請求項6】

請求項１の方法であって、第１の蛋白質が、脳におけるアミロイドベータ （Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる蛋白質および／または脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質である、方法。

【請求項7】

請求項６の方法であって、第１の蛋白質が、脳におけるアミロイドベータ （Ａｂｅｔａ）沈着を減少させかつ脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質の２重機能を有する、方法。

【請求項8】

請求項１の方法であって、第１の蛋白質が、シスタチンＣ、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、終末糖化産物に対する可溶性受容体（ｓＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥ－ｖ、またはミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）である、方法。

【請求項9】

請求項８の方法であって、第１の蛋白質が、シスタチンＣまたはＲＡＧＥ－ｖである、方法。

【請求項10】

請求項７の方法であって、第１の蛋白質が、シスタチンＣである、方法。

【請求項11】

請求項１の方法であって、第２の蛋白質が、ヒト血清アルブミンである、方法。

【請求項12】

請求項１の方法であって、血液脳関門通過促進ペプチドが、ｄＴＡＴである、方法。

【請求項13】

請求項１の方法であって、融合ポリペプチドにおいて、第１の蛋白質が、内嗅皮質あるいは海馬におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させ、および／または内嗅皮質あるいは海馬における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質である、方法。

【請求項14】

請求項６の方法であって、第１の蛋白質として脳におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる蛋白質を含む融合蛋白質が、第１の蛋白質として脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質を含む融合蛋白質と共投与されるあるいは逐次的に投与される、方法。

【請求項15】

それを必要とする対象において中枢神経系変性疾患を治療する方法であって、内嗅皮質あるいは海馬におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる第１の蛋白質、および内嗅皮質あるいは海馬における過剰リン酸化タウの濃度を低下させる第２の蛋白質を含む融合ポリペプチドの治療的有効量を対象に全身的に投与することを含み、融合ポリペプチドが、インビボで延長された循環系滞留時間をもたらす蛋白質および血液脳関門通過促進ペプチドを含み、融合ポリペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、方法。

【請求項16】

請求項１５の方法であって、インビボで延長された循環系滞留時間をもたらす蛋白質のアミノ酸配列が、血液脳関門通過促進ペプチドに切断可能に共有結合で連結される、方法。

【請求項17】

請求項１６の方法であって、共有結合が、ｐＨ変化により切断可能であるかもしくは導入された切断部位が、グリシル・フェニルアラニル・ロイシル・グリシン（ｇｌｙｃｙｌ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｌｅｕｃｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ；ＧＦＬＧ）である、方法。

【請求項18】

請求項１５の方法であって、治療的有効量が、少なくとも約１～１０ｍｇ／体重Ｋｇから成る、方法。

【請求項19】

請求項１５の方法であって、疾患が、アルツハイマー病である、方法。

【請求項20】

請求項１５の方法であって、第１の蛋白質が、シスタチンＣ、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、終末糖化産物に対する可溶性受容体（ｓＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥ－ｖ、またはミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）である、方法。

【請求項21】

請求項１５の方法であって、第２の蛋白質が、シスタチンＣ、Ｐｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＰＤＺドメインを欠失したＰｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＴＦＥＢ、またはＳＩＲＴ１である、方法。

【請求項22】

請求項１５の方法であって、インビボで延長された循環系滞留時間をもたらす蛋白質が、ヒト血清アルブミンである、方法。

【請求項23】

請求項１５の方法であって、血液脳関門通過促進ペプチドが、ｄＴＡＴである、方法。

【請求項24】

請求項１５の方法であって、第１の蛋白質が、シスタチンＣまたはＲＡＧＥ－ｖである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は一般に、アルツハイマー病などの中枢神経系疾患を治療するための２重作用性治療システムに関する。

【背景技術】

【0002】

一般的背景と技術の最先端
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経細胞の進行性消失を特徴とする世界的に最もよく見られる神経変性疾患の一つであり、典型的には記憶や学習を含む認知機能の重度の障害に至る。アルツハイマー病の病理学的特徴としては、脳における細胞外アミロイド斑の存在、および神経原線維変化（ＮＦＴ）の形成が挙げられ、これらは神経機能障害および細胞死をもたらす。アルツハイマー病治療薬の開発における最も大きな問題の一つは、充分な血液脳関門（ＢＢＢ）浸透を実現することである（Ｂａｎｋｓ、２０１６）。血液脳関門は、血液と脳の間における分子、イオン、細胞の輸送を制御する保護的接触部位である（Ｐａｔａｂｅｎｄｉｇｅ、２０１３）。抗体などの生体分子のような他の分子は、サイズが大きく、血液脳関門を効率的に通過できない。臨床的には、主要な脳障害の治療に充分な量での血液脳関門を越える治療用蛋白質の浸透を増強する試みは、現在のところ成功していない（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ、２０１０）。これは、アルツハイマー病などの中枢神経系疾患に生体分子を用いることを困難にする。近年、中枢神経系疾患に対し各種の治療用ＢＢＢ担体が開発されており（Ｍａｌａｋｏｕｔｉｋｈａｈ、２０１１）、そのような担体としては化学送達系（Ｂｒｅｗｓｔｅｒ、１９９７；Ｃａｒｅｌｌｉ、１９９６）、担体媒介性輸送（Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉ、２００２；Ｇｙｎｔｈｅｒ、２００８；Ｇｙｎｔｈｅｒ、２００９）、および分子トロイの木馬（Ｂｏａｄｏ、２００７；Ｂｏａｄｏ、２００８；Ｂｏａｄｏ、２００９；Ｂｏａｄｏ、２０１３）などが挙げられる。細胞膜浸透性ペプチド（ＣＰＰ）に媒介される薬剤送達は、脳への送達を強化する一つの方法である。げっ歯類でのインビボの研究は、生体分子との、最も有名なＣＰＰであるＨＩＶ－１トランス作用性トランスクリプター（ＴＡＴ）の連結が、血液脳関門を越える生体高分子の送達を促進できた構築物をもたらすことを明らかにした（Ｃａｏ、２００２；Ｋｉｌｉｃ、２００２；Ｂａｎｋｓ、２００５）。

【0003】

しかし、これらの送達系の治療有効性は、満足のいくものではない。理由は、それらの浸透能および滞留能が限定的であるためである。病変域での薬剤濃度は、治療閾値よりもかなり低い。これらの問題に対処するために、受容体に媒介されるＢＢＢ送達系は、ＢＢＢ浸透有効性を向上させる有力な方略と考えられている。多くの研究者達は、治療に必要とされる濃度で脳へ接近するために、血液脳関門の細胞膜上で過剰発現される特異的受容体の探索に焦点を当ててきた（Ｗａｎｇ、２０１７）。

【0004】

最近、前臨床試験および臨床試験において新規生体分子が、脳に入りアミロイドベータ斑を縮小させることが示された（Ｓｅｖｉｇｎｙ、２０１６；Ｒｅｉｍａｎ、２０１６；Ｃｈａｎｇ、２０１７）。生体分子は、アルツハイマー病治療の優れた手段になるので、その脳送達を促進する新規方略が、必要とされる。内在性輸送系の利用は、脳への薬剤送達の方略において未活用である（Ｂａｎｋｓ、２０１２）。

【0005】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、誤って折り畳まれたアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの細胞外沈着および神経原線維変化（ＮＦＴ、リン酸化タウまたはｐ－タウ）の細胞内形成により特徴付けられるが、これらの病理学的事象を低減する方略は未だ見つかっていない。アルツハイマー病（ＡＤ）の治療薬開発は、血液からのほとんどの治療薬の脳への効率的な取り込みを妨げる血液脳関門（ＢＢＢ）が存在するため、限定される。発明者等は、治療用蛋白質としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合基盤を開発し、これは、ＡβおよびＮＦＴ（ｐ－タウ）を低減するために、ＢＢＢ浸透可能な細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ、ｄＴＡＴ）を含む。

【0006】

微小管結合性タウ蛋白質は、微小管の形成と安定化に関与していると考えられる（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ、２０１３；Ｌｅｅ、２００１）。タウは、リン蛋白質として存在し、健康な大人の脳であってもタウは、少なくとも最少程度にリン酸化されている（Ｓｅｕｂｅｒｔ、１９９５）。しかし、アルツハイマー病を特徴づけるものは、タウ蛋白質に沿う４４１の特異的なアミノ酸配列のうち１９のリン酸化の範囲と一致性であり、結果としてアルツハイマー病の脳で特定のリン酸化パターンおよびリン酸化タウのより大きな負荷をもたらす（Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ、２００２；Ｎｅｄｄｅｎｓ、２０１８；Ｍｅｄｉｎａ、２０１５）。アルツハイマー病と健康な大人の脳の間で、リン酸化タウ負荷の差の程度は、タウのモル数当たりのリン酸のモル数において３～４倍の増加であることが報告されている（Ｋｓｉｅｚａｋ、１９９２）。対のらせん状細線維（ＰＨＦ）へと集合する過剰リン酸化型タウから成る神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）は、アルツハイマー病の剖検Ｂｒａａｋステージ分類システム（ＢｒａａｋとＢｒａａｋ、１９９５；Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ、１９８６；Ｋｏｓｉｋ、１９８６；Ｌｅｅ、１９９１；Ｂｒａａｋ、１９９５）における妥当な病理学的特徴である。もつれは、組織分布的および定量的に臨床症候学と相関することが証明されているアルツハイマー病における唯一の病理学的所見である（Ａｒｒｉａｇａｄａ、１９９２；Ｂｒａａｋ、１９９１；Ｇｏｅｄｅｒｔ、１９９３；Ｂａｌｌａｔｏｒｅ、２００７）。

【0007】

タウの発現は、皮質の髄鞘化されていない軸索で高く、特に海馬を含む辺縁皮質などの記憶固定に関与する脳の領域において高い（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、１９８９）。タウの過剰リン酸化は、微小管からのタウ蛋白質の脱離を引き起こし、それにより微小管を不安定化し軸索内輸送に支障をきたす（Ｂｒａｍｂｌｅｔｔ、１９９３；Ｉｓｈｉｈａｒａ、１９９９）。タウのリン酸化と脱リン酸化は、蛋白質キナーゼ（ＧＳＫ３β、ｃｄＫ５、Ａｋｔ／ＰＫＢ、ＰＫＡ、ＥＲＫ１／２、ＡＭＰＫなど）の活性とホスファターゼ（ＰＰ１、ＰＰ２ＡおよびＰＰ５など）の活性の平衡により制御される（Ｂａｌｌａｔｏｒｅ、２００７；Ｃｈｕｎｇ、２００９；Ｗａｎｇ、２００７）。

【0008】

ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、細胞内の主要エネルギーセンサーであり、かつ代謝制御因子である。ＡＭＰＫは、解糖流束およびミトコンドリア新生の制御を通じて細胞のエネルギー恒常性に関与している（Ｈａｒｄｉｅ、２０１１）。哺乳動物のＡＭＰＫは、触媒性のαサブユニット（イソ型α１およびα２）および制御性のβ（β１およびβ２）ならびにγ（γ１、γ２、γ３）サブユニットが集合したヘテロ３量体複合体である。ＡＭＰＫは、細胞の代謝状態およびその上流のキナーゼにより活性化され、複数のホスファターゼの１つにより阻害される。細胞質ＡＭＰとカルシウム濃度の増加は、神経細胞のＡＭＰＫシグナル伝達の主要な活性化因子である（Ｎａｋａｍｕｒａ、２００１；Ｓａｌｍｉｎｅｎ、２０１１；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、２００９）。アルツハイマー病の発症機序における代謝機能不全およびＡＭＰＫ活性は、タウのリン酸化とアミロイド形成の両方の制御因子として報告されている（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、２０１１；Ｖｉｎｇｔｄｅｕｘ、２０１１）。マウスの初代神経細胞において内在性ＡＭＰＫ活性化は、複数部位におけるタウのリン酸化増加を誘導したことが明らかにされており、ＡＭＰＫ阻害は、タウの急速なリン酸化減少を引き起こした（Ｄｏｍｉｓｅ、２０１６）。

【0009】

ＰＰ２Ａは、タウのリン酸化過程における最も重要なホスファターゼであり；正常条件下におけるＰＰ２Ａ阻害は、タウの過剰リン酸化を伴う。ＰＰ２Ａのインビボ活性は、内在性阻害蛋白質である阻害因子２（Ｉ２ＰＰ２Ａ；ＳＥＴとしても知られている）により下方制御される（Ｌｉ、１９９６）。アルツハイマー病の脳では、リソゾームのアスパラギンエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）が、Ｉ２ＰＰ２Ａ蛋白質（全長、約３９ｋＤａ）を、活性のある約２０ｋＤａの断片（複数）へと切断する（Ｒｏｓｅｎｍａｎｎ、２０１４；Ｂａｓｕｒｔｏ－Ｉｓｌａｓ、２０１３）。ＰＰ２Ａ活性は、活性化Ｉ２ＰＰ２Ａ断片とＰＰ２Ａの触媒サブユニットの相互作用により阻害される（Ａｒｎａｕｄ、２０１１）。Ｉ２ＰＰ２Ａの断片は、ＰＰ２Ａ活性阻害の原因であり、かつタウの異常な過剰リン酸化の増加を誘導することも報告されている（Ｂａｓｕｒｔｏ－Ｉｓｌａｓ、２０１３）。

【発明の概要】

【0010】

本発明のこのような目的および他の目的は、本発明に関する下記の説明、本明細書の参照図、および付属する特許請求の範囲によってより完全に理解されるであろう。

【0011】

一局面において、本発明は、それを必要とする対象の中枢神経系における蛋白質欠損を治療する方法を対象とし、方法は、対象に治療的有効量の融合ポリペプチドを全身的に投与することを含み、ここで融合ポリペプチドは、以下を含む：（ａ）脳におけるその欠失がアルツハイマー病と相関する、第１の蛋白質；（ｂ）インビボにおいて循環系滞留時間の延長をもたらす、第２の蛋白質；および（ｃ）血液脳関門通過促進ペプチド；ここで、融合ポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。第１の蛋白質のアミノ酸配列は、第２の蛋白質のアミノ酸配列に共有結合で結合されてよい。第２の蛋白質のアミノ酸配列は、血液脳関門通過促進ペプチドに切断可能に共有結合で結合されてよい。共有結合は、ｐＨの変化により切断可能であってよく、あるいは導入切断部位は、グリシル・フェニルアラニル・ロイシル・グリシン（ｇｌｙｃｙｌ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｌｅｕｃｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ；ＧＦＬＧ）であってよい。一局面において、治療的有効量は、少なくとも約１～１０ｍｇ／体重Ｋｇであってよい。

【0012】

別の一局面において、第１の蛋白質は、脳におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる蛋白質であってよく、および／または脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質であってよい。あるいは、第１の蛋白質は、脳におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させ、かつ脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質の２重機能を有してよい。

【0013】

上記の本発明に準拠する一局面において、第１の蛋白質は、シスタチンＣ、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、終末糖化産物に対する可溶性受容体（ｓＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥ－ｖ、またはミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）であってよい。特に、第１の蛋白質は、シスタチンＣまたはＲＡＧＥ－ｖであってよい。さらに、とりわけ、第１の蛋白質は、シスタチンＣであってよい。

【0014】

別の一局面において、第２の蛋白質は、ヒト血清アルブミンであってよい。

【0015】

別の一局面において、血液脳関門通過促進ペプチドは、ｄＴＡＴであってよい。

【0016】

別の一局面において、上記の方法で、第１の蛋白質は、内嗅皮質あるいは海馬におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させ、および／または内嗅皮質あるいは海馬における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質であってよい。

【0017】

特に、第１の蛋白質として脳におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる蛋白質を含む融合蛋白質は、第１の蛋白質として脳における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる蛋白質を含む融合蛋白質と共投与されるか、あるいは逐次投与される。

【0018】

さらに別の一局面において、本発明は、それを必要とする対象において中枢神経系変性疾患を治療する方法を対象とし、方法は、治療的有効量の融合ポリペプチドを対象に全身的に投与することを含み、ここで融合ポリペプチドは、内嗅皮質あるいは海馬におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる第１の蛋白質、および内嗅皮質あるいは海馬における過剰リン酸化タウのレベルを低下させる第２の蛋白質を含み、ここで融合ポリペプチドは、インビボにおける循環系滞留時間の延長をもたらす蛋白質および血液脳関門通過促進ペプチドを含み；ここで、融合ポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。上記の方法において、インビボにおける循環系滞留時間の延長をもたらす蛋白質のアミノ酸配列は、血液脳関門通過促進ペプチドに切断可能に共有結合で結合される。共有結合は、ｐＨの変化により切断可能であってよく、あるいは導入切断部位は、グリシル・フェニルアラニル・ロイシル・グリシン（ｇｌｙｃｙｌ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｌｅｕｃｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ；ＧＦＬＧ）であってよい。一局面において、上記の方法に従い、治療的有効量は、少なくとも約１～１０ｍｇ／ヒトの体重Ｋｇであってよい。疾患は、アルツハイマー病であってよい。特に、第１の蛋白質は、シスタチンＣ、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、終末糖化産物に対する可溶性受容体（ｓＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥ－ｖ、またはミエリン塩基性蛋白質 （ＭＢＰ）であってよい。別の一局面において、上記の本発明に従い、第２の蛋白質は、シスタチンＣ、Ｐｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＰＤＺドメインを欠失したＰｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＴＦＥＢ、またはＳＩＲＴ１であってよい。インビボにおける循環系滞留時間の延長をもたらす蛋白質は、ヒト血清アルブミンであってよい。血液脳関門通過促進ペプチドは、ｄＴＡＴであってよい。かつ、第１の蛋白質は特に、シスタチンＣまたはＲＡＧＥ－ｖであってよい。

【0019】

本発明は、本明細書において下に記載される詳細な説明、および付図からより完全に理解されるであろう。図面は具体例を示すものとして提示され、したがって本発明を限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ヒト血清アルブミン融合蛋白質バージョン１または２を発現するためのｐＯｐｔｉｖｅｃ／ＨＳＡ融合プラスミドの構築物を示す。２シストロン性のｐＯｐｔｉｖｅｃ／ＨＳＡ融合プラスミドは、ＨＳＡ融合蛋白質バージョン１（または２）と選択マーカーＤＨＦＲを含む。クローニング法に用いる制限酵素認識部位は、イタリックで示される。

【図2】ＨＳＡ融合蛋白質（バージョン１）の模式図を示す。模式図は以下を含む：βアミロイド斑またはタウのタングル（Ｔａｕ ｔａｎｇｌｅ）を減少させるためのＭＯＡ（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ；作用機序）蛋白質；ＧＳリンカー（ＧＧＳＡＳ（配列番号１）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２））；ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）；切断可能なリンカー（ＧＦＬＧ）；ハッチング部分はＣＰＰ（細胞浸透性ペプチド）である。ＡＬ０４（８０ｋＤａ）の模式図は、ＭＯＡとしてシスタチンＣ、ＨＳＡ、およびＣＰＰとして改変ＴＡＴペプチドを含む。四角枠の上の番号は、融合蛋白質のＮ末端からのアミノ酸番号を表す。

【図3】ＨＳＡ融合蛋白質（バージョン２、ＡＬ０６～ＡＬ１０）の模式図を示す。βアミロイド斑またはタウのタングル（Ｔａｕ ｔａｎｇｌｅ）を減少させるためのＭＯＡ蛋白質（ＭＯＡ１またはＭＯＡ２）；ＧＳリンカー（ＧＧＳＡＳまたはＧＧＧＳＧＧＧＳ）；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；切断可能なリンカー（ＧＦＬＧ（配列番号３）またはＧＦＬＧＧＧＧＳＡＳ（配列番号４））；細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）。ＡＬ０６（１４５ｋＤａ）、ＡＬ０７（１３５ｋＤａ）、ＡＬ０８（１２９ｋＤａ）、ＡＬ０９（１４４．５ｋＤａ）、ＡＬ１０（１５６ｋＤａ）の模式図は、ＭＯＡ１としてＲＡＧＥ－ＶまたはＲＡＧＥ－Ｖ－Ｃ１；ＭＯＡ２としてＰｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＰＤＺドメインを欠失したＰｔｅｎ－ｌｏｎｇ、またはＴＦＥＢ、ＳＩＲＴ１；担体としてＨＳＡ；およびＣＰＰとして改変ＴＡＴペプチドを含む。四角枠の上の番号は、ＡＬ０４におけるＮ末端からのアミノ酸番号を表す。

【図4】ＨＳＡ融合蛋白質（バージョン２．１、ＡＬ１２）の模式図を示す。構築物は、ベータアミロイド斑（ＭＯＡ１）またはタウのタングル（ＭＯＡ２）を減少させるための作用機序（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ；ＭＯＡ）蛋白質；ＧＳリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；切断可能なリンカー（ＧＦＬＧＧＧＧＳＡＳ）；細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＡＬ１２（８８ｋＤａ）の模式図は、ＭＯＡ１としてＲＡＧＥ－Ｖ；担体としてＨＳＡ；ＭＯＡ２としてＳＩＲＴｌ－エクソン４、およびＣＰＰとして改変ＴＡＴペプチドを含む。四角枠の上の番号は、各ＨＳＡ融合蛋白質におけるＮ末端からのアミノ酸番号を表す。

【図5】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ａ）およびウエスタンブロット（ｂ）による精製ＡＬ０４（８０ｋＤａ）、ＡＬ０７（１３５ｋＤａ）、ＡＬ０８（１２９ｋＤａ）、およびＡＬ１２（８８ｋＤａ）の特徴付けを示す。精製試料は、還元条件下で４～１２％の勾配ゲルにて泳動した；（ａ）ゲルは、クマシーブルーで染色した；（ｂ）各蛋白質を含む勾配ゲルを、精製抗ヒト血清アルブミン抗体を用いるウエスタンブロッティングのためにＰＶＤＦ膜に転写した。

【図6】図６Ａおよび図６Ｂは、ＡＬ０４が未分化ＰＣ１２細胞のＡβ１－４２誘導性細胞死を軽減することを示す。未分化ＰＣ１２細胞でのＡＬ０４の非特異的細胞毒性（Ａ）；ＰＣ１２細胞を、ＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ＴＡＴ）（０．０１μＭ）の存在または非存在下で１０μＭのＡβ１－４２に７２時間曝露した（Ｂ）。細胞生存率を、ＷＳＴ－８（水溶性テトラゾリウム塩）還元アッセイにより評価した。

【図7】ＡＬ０４が、分化ＰＣ１２細胞でＡβ１－４２誘導性細胞死を軽減することを示す。細胞を、ＡＬ０４の存在下または非存在下において可溶性または凝集（エージング処理した）Ａβ１－４２のいずれかで３日間処理した。細胞生存率を、ＷＳＴ－８（水溶性テトラゾリウム塩）還元アッセイにより評価した。＊可溶性Ａβ１－４２、ＤＰＢＳ緩衝液中のＡβ１－４２ペプチド；＊＊凝集Ａβ１－４２、３７℃で３日間エージング処理したＡβ１－４２溶液。

【図8】ヒトＢＢＢモデルを用いたＡＬ０４のＢＢＢ浸透性評価を示す。（Ａ）用量依存的な浸透性を、１μＭおよび１０μＭのＡＬ０４および組み換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を用いて１２０分の時点で評価した。（Ｂ）ＡＬ０４の浸透性を時間経過の３時点（６０分、１２０分、および２４０分）で比較した。

【図9】図９Ａおよび図９Ｂは、ＨＳＡ融合蛋白質が用量依存的に細胞中へ浸透することを示す。ＰＣ１２細胞を、１％馬血清を含むＤＭＥＭ培地中で、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いて分化させた。４日後に、ＮＧＦを除いたＰＣ１２細胞を、様々な濃度（１～５μｇ／ｍｌ）のＡＬ０４ （Ａ）またはＡＬ１２（Ｂ）で２４時間処理した。細胞を、氷冷ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２回すすぎ、溶解した。細胞溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、シスタチンＣ（ＡＬ０４）または抗ヒト血清アルブミン（ＡＬ１２）についてウエスタンブロッティングを行った。

【図10】構築物に関する担体蛋白質および細胞浸透性蛋白質の選択を示す。＊は、ＣＨＯ－Ｓ細胞のウエスタンブロットにより決定した融合蛋白質の一過的発現および品質完全性を示す。＊＊は、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞におけるＭＴＸ（２０００ｎＭ）増幅からＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定された融合蛋白質の安定な発現を示す。Ｆｃ融合蛋白質は、Ｆｃ領域を介して２量体を形成した。

【図11】潜在的治療薬開発のための２重作用性治療薬（バージョン１、２および２．１）のまとめを示す。

【図12】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＰＣ１２細胞におけるＨＳＡ融合蛋白質処置によるＮＧＦが欠乏した過剰リン酸化タウのレベル低下を示す。（Ａ）ＮＧＦ欠乏ＰＣ１２細胞をＡＬ０４、ＡＬ０７、またはＡＬ０８で２４時間処置した時のリン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５）、リン酸化タウ（Ｔｈｒ２３１）、および総タウの代表的なブロット。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして用いた。（Ｂ）総タウに対し正規化した、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５位およびＴｈｒ２３１位でのタウのリン酸化レベルの比の定量分析。

【図13】ＡＬ０４処理が、Ｉ２ＰＰ２Ａ（ホスファターゼＰＰ２Ａの阻害因子）の下方制御を通じてＮＧＦ欠乏時のリン酸化タウのレベルを低下させることを示す。ＰＣ１２細胞を、１％馬血清を含むＤＭＥＭ培地中で、ｌ００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いて分化させた。４日後に、ＮＧＦを欠乏させたＰＣ１２細胞を、様々な濃度（ｌ～１０μｇ／ｍｌ）のＡＬ０４で２４時間処置した。細胞溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、シスタチンＣ（ＡＬ０４）、Ｐ－タウ（Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５）、およびＩ２ＰＰ２Ａについてウエスタンブロッティングを行った。ＧＡＰＤＨを用いて、異なるレーンに添加された蛋白質の量が同一であることを確認した。

【図14】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＡＬ０４処置が、ＮＧＦ欠乏ＰＣ１２細胞におけるタウとチューブリンの相互作用を増加させることを示す。（Ａ）ＰＣ１２細胞を、１％馬血清を含むＤＭＥＭ培地中で、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いて分化させた。４日後に、ＮＧＦを欠乏させたＰＣ１２細胞を、１μｇ／ｍｌのＡＬ０４の存在下または非存在下で２４時間処置した。細胞をその後、溶解し、抗βチューブリン抗体を用いる免疫沈降に供した。免疫沈降物を、抗タウ抗体で調べた。レーンに添加した溶解物は、総溶解物の１％であり、蛋白質の均一な添加量を示した。細胞溶解物を、総タウ、βチューブリン、およびシスタチンＣ（ＡＬ０４に関して）についてのウエスタンブロッティングに供した。βチューブリンに結合したタウの相対定量を、（Ｂ）に示す。値を、インプットした総タウの総量で正規化し、３回測定の平均＋／－標準誤差として表す。Ｐ＜００１、スチューデントｔ－検定。

【図15】ＡＬ０４が、用量依存的にＡＭＰＫを調節することにより過剰リン酸化タウを減少させることを示す。ＮＧＦ欠乏ＰＣ１２細胞を様々な濃度（１～５μｇ／ｍｌ）のＡＬ０４で２４時間処理した時の、シスタチンＣ（ＡＬ０４）、リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５）、リン酸化ＡＭＰα（Ｔｈｒ１７２）、リン酸化ＡＭＰＫβ（Ｓｅｒｌ８２）、リン酸化ＵＬＫ１（Ｓｅｒ５５５）の代表的なブロットを示す。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして用いた。

【図16】ＡＬ０４での処置が、Ｔｇ２５７６マウスの海馬におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させることを示す。

【図17】ＡＬ０４での処置が、Ｔｇ２５７６マウスの内嗅皮質におけるアミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させることを示す。

【図18】ＡＬ０４での処置が、ＪＮＰＬ３マウスの海馬および内嗅皮質における過剰リン酸化タウのレベルを低下させることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本願は、中枢神経疾患、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病などの神経変性疾患、さらに具体的にはアルツハイマー病を治療するための、血液脳関門を通過する融合ポリペプチドを作成することを開示する。いくつかの実施態様において、少なくとも約１００μｇまたは少なくとも約１ｍｇ／体重Ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのあるいはそれより多い融合ポリペプチドが、人体に腹腔内送達され、投与された量の約０．０１％が脳に局在化すると予想される。いくつかの実施態様において、融合ポリペプチドの治療的有効量は、少なくとも約０．５ｍｇ／体重Ｋｇを含む。いくつかの実施態様において、全身投与は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮、または呼吸器投与である。

【0022】

本明細書中で用いられる「治療」もしくは「治療すること」は、治療的有用性および／または予防的有用性を実現することを含む。治療的有用性は、治療される基礎疾患または病態の根絶または改善を意味する。例えば、アルツハイマー病に罹患している個体において、治療的有用性は、疾患の進行を部分的あるいは完全に停止させること、あるいは疾患を部分的あるいは完全に反転させることを含む。また、治療的有用性は、基礎症状に関連する生理的または心理的症状の一つあるいは複数の根絶または改善より実現され、それにより患者が依然としてその病態の影響を受けているとしても、患者において改善が認められる。処置の予防的有用性は、病態の予防、病態の進行の遅延、（例えば、アルツハイマー病の進行の遅延）、または病態発症の可能性を低下させることを含む。本明細書中で用いられる「治療すること」または「治療」は、予防を含む。

【0023】

本明細書中で用いられる「治療蛋白質」は、融合ポリペプチドの治療活性蛋白質構成要素を意味する。

【0024】

本明細書中で用いられる「融合ポリペプチド」は、ＢＢＢを通過でき治療蛋白質に対し長時間持続する活性をもたらすことができるポリペプチドを創製するために複数の蛋白質構成要素が融合される、ポリペプチド構築物である。

【0025】

本明細書中で用いられる用語「有効量」は、全身性に投与された時に、中枢神経系における有益な、または所望の結果（有益な、または所望の臨床的結果、あるいは改善された認知、記憶、心的状態、または中枢神経系における他の所望の結果など）を達成するのに充分な量であってよい。有効量はまた、予防効果を生じる量であり、例えば、病理学的または望ましくない病態の出現を遅延する、低減する、あるいは回避する量である。そのような病態としては、神経変性が挙げられるが、これに限定されない。有効量は、単回投与あるいは複数回投与で投与されてよい。治療に関して、本発明の組成物の「有効量」は、疾患（例えば、神経障害）の進行を緩徐にする、軽減する、落ち着かせる、反転させる、あるいは遅延させるのに充分な量である。「有効量」は、単独で、あるいは疾病または疾患の治療に用いられる一つまたは複数の薬剤との併用で用いられる、何らかの本発明の組成物である。本発明の意味内での治療薬の「有効量」は、患者の主治医により決定される。そのような量は、当業者が容易に確定でき、本発明に従い投与される場合、治療効果を発揮する。治療的有効量に影響する因子としては、投与される融合ポリペプチドのアルツハイマー病特異的活性、その吸収特性（例えば、脳への取り込み率）、発症からの経過時間、および治療される個体の年齢、体調、他の病態の存在、および栄養状態が挙げられる。さらに、患者が受けている他の薬物治療は、投与する治療薬の治療的有効量の決定に影響を及ぼす。

【0026】

本明細書中で用いられる「対象」または「個体」は、動物、例えば哺乳動物である。いくつかの実施態様において、「対象」または「個体」は、ヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、アルツハイマー病に罹患している。

【0027】

いくつかの実施態様において、融合ポリペプチドを含む医薬組成物は、「末梢に投与され」る、あるいは「末梢投与され」る。本明細書中で用いられるこれらの用語は、個体への、薬剤（例えば、治療薬）の任意の投与様式を指し、ここで投与は中枢神経系への直接投与ではない（すなわち、薬剤を血液脳関門の非脳側と接触させる）。本明細書中で用いられる「末梢投与」は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、経頬、鼻腔内、直腸、経口、非経口、舌下、または経鼻を含む。

【0028】

本明細書において、「薬学的に許容され得る担体」または「薬学的に許容され得る賦形剤」は、組成物を受ける個体にとって害のある抗体の産生をそれ自体が誘導しない、任意の担体を指す。そのような担体は、当業者にとって周知である。薬学的に許容され得る担体／賦形剤に関する詳細な説明は、レミントンの薬剤科学（Ｇｅｎｎａｒｏ、ＡＲ編、第２０版、２０００：ＷｉｌｌｉａｍｓとＷｉｌｋｉｎｓ ＰＡ、ＵＳＡ）に記載されている。薬学的に許容され得る担体の例としては、塩、例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）および有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）が挙げられる。例えば、本発明の組成物は、液体形態で提供されてよく、また０．０１％～１％のポリソルベート８０などの界面活性剤、あるいはマンニトール、ソルビトール、またはトレハロースなどの炭水化物添加剤を含むあるいは含まない、食塩水をベースにした異なるｐＨ（５～８）の水溶液中で製剤化されてよい。通常用いられる緩衝剤としては、ヒスチジン、酢酸、リン酸、またはクエン酸が挙げられる。

【0029】

「組み換え宿主細胞」もしくは「宿主細胞」は、挿入のために用いられる方法（例えば、直接的取り込み、形質導入、Ｆ接合、あるいは組み換え宿主細胞を創製するための当該技術分野で公知の他の方法）に関わらず、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター、例えば、プラスミドとして維持されてよく、あるいは宿主のゲノムに組み込まれてよい。

【0030】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は、本明細書において同義語として用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドを対象とする説明は、ペプチドの説明および蛋白質の説明にも等しく用いられ、その逆も同様である。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸のポリマー並びに、一つあるいは複数のアミノ酸残基が非天然のアミノ酸、例えば、アミノ酸類似体であるアミノ酸のポリマーに対しても用いられる。本明細書中で用いられる場合、これらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により連結される、任意の長さのアミノ酸鎖（完全長の蛋白質を含む）を含む。

【0031】

用語「アミノ酸」は、天然および非天然のアミノ酸、並びに天然のアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０種類の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、およびピロリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同様の基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素）を有する化合物（ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。

【0032】

アミノ酸は、よく知られているアミノ酸の三文字表記、あるいはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する一文字表記のいずれかにより本明細書中において参照される。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に認められているヌクレオチドの一文字コードにより参照される。

【0033】

用語「核酸」は、単一鎖または二重鎖の形態でのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。他で特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有しかつ天然に存在するヌクレオチドに類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を含む。

【0034】

融合ポリペプチドの各種ポリペプチド構成要素を連結する「リンカー」に関し、いくつかの実施態様において、リンカーは、任意の組み合わせまたは順序でグリシン、セリン、および／またはアラニン残基を含む。いくつかの場合において、リンカー中のグリシン、セリン、およびアラニン残基の合算％は、リンカー中の全残基数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの好ましい実施態様において、リンカー中のグリシン、セリン、およびアラニン残基の合算％は、リンカー中の全残基数の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの実施態様において、任意の数のアミノ酸（天然または合成アミノ酸を含む）の組み合わせが、リンカーに用いられてよい。いくつかの実施態様において、３アミノ酸のリンカーが、用いられる。いくつかの実施態様において、リンカーは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列を有する。いくつかの実施態様においては、２アミノ酸のリンカーは、任意の組み合わせまたは順序でグリシン、セリン、および／またはアラニン残基を含む（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ａｌａ－Ａｌａ、Ｓｅｒ－Ａｌａ、またはＡｌａ－Ｓｅｒリンカー）。いくつかの実施態様において、２アミノ酸のリンカーは、１つのグリシン、セリン、および／またはアラニン残基と他の１つのアミノ酸から成る（例えば、Ｓｅｒ－Ｘであり、ここでＸは任意の既知のアミノ酸である）。さらに別のいくつかの実施態様において、２アミノ酸のリンカーは、ｇｌｙ、ｓｅｒ、もしくはａｌａを除く、任意の２つのアミノ酸から成る（例えば、Ｘ－Ｘ）。

【0035】

いくつかの実施態様において、長さが２アミノ酸より長いリンカーが、用いられてよい。そのようなリンカーもまた、本明細書中でさらに説明されるように、任意の組み合わせまたは順序でグリシン、セリン、および／またはアラニン残基を含んでよい。いくつかの実施態様において、リンカーは、１つのグリシン、セリン、および／またはアラニン残基と他のアミノ酸から成る（例えば、Ｓｅｒ－ｎＸであり、ここでＸは任意の既知のアミノ酸であり、ｎはアミノ酸の数である）。さらに別のいくつかの実施態様において、リンカーは、任意の２アミノ酸から成る（例えば、Ｘ－Ｘ）。いくつかの実施態様において、任意の２アミノ酸は、任意の組み合わせまたは順序での、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであり、それらの間に可変数のアミノ酸が介在する。実施態様の一例において、リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙから成る。実施態様の一例において、リンカーは、少なくとも１つのＳｅｒから成る。実施態様の一例において、リンカーは、少なくとも１つのＡｌａから成る。いくつかの実施態様において、リンカーは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＧｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｌａ残基から成る。好ましい実施態様において、リンカーは、任意の組み合わせまたは順序で、繰り返し配列中にＧｌｙおよびＳｅｒを含む（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３または他のバリエーションなど）。

【0036】

本発明での使用のためのリンカーは、当該技術分野で公知の任意の方法を利用して設計できる。例えば、融合蛋白質の操作において最適アミノ酸リンカーを決定するための、公的に入手可能なプログラムが複数存在する。ユーザーが入力した蛋白質の配列および所望のリンカー長に基づき最適リンカーのアミノ酸配列を自動的に生成する、公的に入手可能なコンピュータープログラム（ＬＩＮＫＥＲプログラムなど）を、本発明の方法および組成物に利用してよい。多くの場合、そのようなプログラムは、蛋白質のサブドメインを連結する天然のリンカーにおいて観察される傾向を利用して、蛋白質工学で用いる最適な蛋白質リンカーを予測する。いくつかの場合、そのようなプログラムは、最適リンカーを予測する別の方法を用いる。

【0037】

ペプチドリンカー配列は、プロテアーゼによる切断部位を含んでよい。

【0038】

本明細書中で用いられる「活性」は、生理学的活性（例えば、ＢＢＢを通過する能力および／または治療的活性）または融合ポリペプチドで輸送される目的の蛋白質の酵素活性を含む。

【0039】

本発明の組成物は特に、注射に適する（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内投与の医薬組成物として）。本発明の水性組成物は、有効量の本発明の組成物を含み、それは、薬学的に許容し得る担体または水性媒体中に溶解または分散されてよい。「薬学的にまたは薬理学的に許容し得る」というフレーズは、必要に応じて、動物、例えば、ヒトに投与されたたときに、有害な、アレルギー性の、もしくは他の悪影響を及ぼす反応を生じない、分子実体または組成物を指す。本明細書中で用いられる「薬学的に許容し得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌よび抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いずれかの通常の媒体および薬剤が有効成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が、検討される。補助的な有効成分を組成物中に加えることもできる。

【0040】

注射可能な組成物のための薬学的に許容され得る担体の例としては、塩、例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）および有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）が挙げられる。例えば、本発明の組成物は、液体形態で提供されてよく、また０．０１％～１％のポリソルベート８０などの界面活性剤、あるいはマンニトール、ソルビトール、またはトレハロースなどの炭水化物添加剤を含むあるいは含まない、食塩水をベースにした異なるｐＨ（５～８）の水溶液中で製剤化されてよい。通常用いられる緩衝剤としては、ヒスチジン、酢酸、リン酸、またはクエン酸が挙げられる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含んでよい。微生物作用は、各種の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール；フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）により阻止できる。多くの場合、等張化剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収延長は、組成物中で吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチン）を使用することにより達成し得る。

【0041】

ヒトへの投与のために、製剤は、ＦＤＡおよび他の規制当局標準が要求するような無菌状態、発熱性、一般的安全性、および純度標準を満たす。活性化合物は通常、非経口投与用に製剤化される（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内の経路による注射用に製剤化される）。活性要素または成分を含む水性組成物の調製は、当業者であれば本開示をもとに理解するであろう。典型的には、そのような組成物は、注射可能な製剤（溶液または懸濁液のいずれか）として調製され得る。注射前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製することにおける使用に好適な固体形態もまた、調製でき、調製剤は、乳化されてもよい。

【0042】

無菌注射可能な溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒に組み込むことにより調製され、必要に応じて、その後フィルター滅菌される。一般的に、分散剤は、各種の滅菌活性成分を、基礎分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌媒体中に組み込むことにより調製される。無菌注射可能な溶液の調製のための無菌パウダーの場合、調製法は、あらかじめフィルター滅菌したその溶液から活性成分と任意の所望の付加的成分のパウダーを生成する、真空乾燥および凍結乾燥の技術を含む。

【0043】

製剤時に、溶液は、剤形と適合する様式でかつ本明細書中に記載の基準に基づき治療的に有効であるような量で、全身的に投与される。製剤は、上記の注射可能溶液のタイプなどの、様々な剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども用いてよい。

【0044】

投与される医薬組成物の適切な量、治療回数、および単位用量は、本明細書中に記載の融合ポリペプチドの中枢神経系取り込み特性および治療の対象（対象の状態と所望の効果）により異なる。いずれにしても、投与責任者が、対象毎に適切な用量を決定する。

【0045】

経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、または散剤の形態を取る。ある特定の実施態様において、経口医薬組成物は、不活性な希釈剤または同化可能な可食担体を含む、あるいは硬または軟ゼラチンカプセルに封入されてよく、あるいは錠剤へと圧縮されてよく、あるいは食事の食物と直接組み合わされてよい。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と組み合わされ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハーなどの形態で用いられてよい。そのような組成物および製剤は、少なくとも０．１％の活性成分を含んでよい。組成物および製剤のパーセンテージは、勿論、変更され、便宜的には１ユニットの重量にして約２％～約７５％、または約２５％～６０％の範囲であってよい。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られる量である。

【0046】

錠剤、トローチ、丸薬、カプセル剤などは、以下のものをさらに含んでよい：トラガントガム、アカシアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤：コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびショ糖、乳糖またはサッカリンなどの甘味剤が添加されてよく、あるいはペパーミント、冬緑油、またはチェリー香味剤などの矯味矯臭剤が添加されてよい。単位用量形態がカプセル剤の場合、それは、上記の種類の材料に加えて、液体性担体を含んでよい。他の各種材料がコーティング剤として存在してよく、あるいは単位剤形の物理的形状を変更するために存在してよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセル剤は、シェラック、砂糖またはその両方でコートされていてもよい。エリキシル剤のシロップは、活性化合物、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチレンおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレイバーなどの着色剤および矯味矯臭剤を含んでよい。いくつかの実施態様において、経口医薬組成物は、活性成分を胃の環境から保護するために腸溶性コートされてよく、腸溶性コーティングの方法と製剤化は、当該技術分野で周知である。

【0047】

２重作用性治療（ＤＡＴ）
本発明は、患者に対して２重作用性を有する、本明細書に記載の構築物を投与することにより、中枢神経系疾患、特に、アルツハイマー病を治療する方法を対象とする。そのような２重作用性治療は、脳において（ｉ）アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる分子および／または（ｉｉ）過剰リン酸化タウのレベルを低下させる分子、を発現する構築物を投与することを含む。両方の構成要素が、単一の構築物から発現されてよい。

【0048】

あるいは、本発明は、複数の構築物を投与することによる中枢神経系疾患、特に、アルツハイマー病を治療する方法も対象とし、ここで各構築物は、脳において（ｉ）アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させるおよび／または（ｉｉ）過剰リン酸化タウのレベルを低下させる分子のいずれかを含む。そのような構築物は、共投与されよく、または逐次投与されてよく、それにより患者に対し２重作用性を示す。そのような２重作用性治療は、本明細書に記載されるような、脳において（ｉ）アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）沈着を減少させる、および／または（ｉｉ）過剰リン酸化タウのレベルを低下させる分子を提供することを含む。

【0049】

ＡＬ０４の活性
アミロイドベータの蓄積は、アルツハイマー病の発症中の神経機能障害や神経細胞脱落にしばしば関係づけられている（Ｈｅｎｓｌｅｙ、１９９４）。本研究において、本発明者らはまず、ヒト血清アルブミン融合蛋白質（ＡＬ０４、ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）がＰＣ１２細胞をＡβ１－４２誘導毒性から保護し得るか否かを調べた。本発明者らの結果は、１０μＭのＡβ１－４２が細胞生存率を有意に低下させたことを示した。

【0050】

第２の一連の実験において、本発明者らは、ＰＣ１２細胞をＮＧＦに供し、それらが分化した後、細胞を、ＡＬ０４の存在下または非存在下で７２時間、Ａβ１－４２で処理した。未分化細胞で観察されたように、ＡＬ０４は、Ａβ１－４２の存在下で有意な保護効果を発揮した。しかし、保護率（パーセンテージ）は、分化ＰＣ１２細胞がＡβ１－４２に対し、より低い感受性を示すため、未分化細胞の場合より低かった。

【0051】

臨床利用から前臨床試験まで、アルツハイマー病治療に用いられるいくつかの薬剤は、輸送系を活用することが知られている。アルツハイマー病治療に承認された薬剤のわずか２群の１つである、ドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）および、おそらく他のコリンエステラーゼ阻害剤は、有機陽イオン輸送体（コリンの輸送体である可能性が最も高い）によりＢＢＢを越えて輸送される（Ｋａｎｇ、２００５；Ｋｉｍ、２０１０））。ＢＢＢ浸透がアルツハイマー病治療の治療生体分子の重要因子であるか否かという概念の実証として、本発明者らは初めて本明細書において、ＨＩＶ－１トランス作用性トランスクリプター（ｄＴＡＴ）ペプチドの縦列反復配列を含むＨＳＡを基盤とした治療生体分子、およびインビトロ・ヒトＢＢＢモデルにおけるその効果を報告する。本発明者らは、ｄＴＡＴが、ＢＢＢを越える高分子量蛋白質の送達を促進する役割を果たすことを、発見した。

【0052】

本発明者らのＨＳＡ融合基盤の利点は、下記のように列挙できる： （１）ＨＳＡは、送達シャトルにｐＨ依存性ＦｃＲｎ再循環／トランスサイトーシスを付与し、その結果インビボでの大幅に延長された循環系滞留時間を有する（Ｓａｎｄ、２０１５）；（２）中枢神経系に進入するｄＴＡＴの機序は主に、密着結合蛋白質の発現を低下させる、およびその分布あるいはｄＴＡＴと内皮細胞表面のへパラン硫酸プロテオグリカンの間の相互作用を変化させることによる、ＢＢＢの一時的破壊である（Ａｎｄｒａｓ、２００５；Ｘｕ、２０１２；Ｚｈｏｎｇ、２０１２；Ｔｏｓｃｈｉ、２００１）；（３）構築物中のモデル蛋白質コアは、任意の種類の活性蛋白質により置換されてよく、このような活性蛋白質としては、シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、クロモゾーム１０のホスファターゼおよびテンシン類似体（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ；Ｐｔｅｎ）、終末糖化産物に対する可溶性受容体（ｓＲＡＧＥ）、またはミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）が挙げられ、これらは、送達系にアルツハイマー病および他の中枢神経系疾患に対する付加的な治療効果を付与する（Ｓｕｎｄｅｌｏｆ、２００８；ｖａｎ Ｋａｓｔｅｒｅｎ、２０１１；Ｂａｓｕｒｔｏ－Ｉｓｌａｓ、２０１３；Ｔｉｚｏｎ、２０１０；Ｓａｇａｒｅ、２０１３；Ｚｈａｏ、２０１６；Ｚｈａｎｇ、２００６；Ｚｏｎｇ、２０１０；Ｌｉａｏ、２００９）。

【0053】

要約すると、本発明者らは初めて、ＡＬ０４などのｄＴＡＴを有するヒト血清アルブミン融合蛋白質が、Ａβ１－４２処理したＰＣ１２細胞において有害効果に対する阻害効果を発揮することを、明らかにした。本発明者らは、ＡＬ０４のｄＴＡＴが、インビトロ・モデル・ヒトＢＢＢを通過する高分子量蛋白質の送達を促進する役割を果たすこと、およびそれがインビボ・モデルの代替として概念実証の有用なツールであることを、見いだした。ヒト血清アルブミン融合蛋白質が、神経保護および血液脳関門透過性を有意に改善でき、したがってアルツハイマー病治療の薬剤開発に関する有用な基盤を提供することが、示される。

【0054】

ＡＬ０４の読み枠は、以下の核酸配列（２２１１塩基）およびアミノ酸配列（７３７アミノ酸残基）を有する。

ｔｃｃａｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇｃｇｇｃｃｃｃａｔｇｇａｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｇｃｇｔｇａ
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ｔｇｃｃｔｔｔｇｔｇｇａｇａａｇｔｇｃｔｇｔａａｇｇｃｔｇａｃｇａｔａａｇｇａｇａｃａｔｇｃｔｔｔｇｃｃｇａｇｇａｇｇｇｃａａｇａａｇｃｔｇ
ｇｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｃａｇｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｔｃｃｔｇｇｇａｔａｃｇｃｔａｇｇａａｇｇｃｔｇｃｔａｇｇｃａｇｇｃｃｃ
ｇｇｇｃｔｔａｔｇｃｔａｇｇａａｇｇｃｔｇｃｔａｇａｃａｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃｇｇｃ （配列番号５）

ＡＬ０４のアミノ酸配列（７３７アミノ酸）

ＳＳＰＧＫＰＰＲＬＶＧＧＰＭＤＡＳＶＥＥＥＧＶＲＲＬＤＦＡＶＧＥＹＮＫＡＳＮＤＭＹＨＳＲＬＱＶＶＲＲＫＱＩＶＡＧＶ
ＮＹＦＬＤＶＥＬＧＲＴＴＣＴＫＴＱＰＮＬＤＮＣＰＦＨＤＱＰＨＬＫＲＫＡＦＣＳＦＱＩＹＡＶＰＷＱＧＴＭＴＬＳＫＳＴＣＱＤＡ
ＧＧＳＡＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡ
ＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬ
ＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＦＴＥＣＣＱＡＤＫＡ
ＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶ
ＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮ
ＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴ
ＴＬＥＫＣＣＷＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬ ＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶ
ＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＰＪＶＩＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫ
ＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨ
ＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＩＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＳＱＡＬＧＬＧＦＬＧＹＡＲＫＡ
ＲＱＡＲＹＡＲＫＡＲＱＡＲＧ （配列番号６）

【0055】

本研究において、本発明者らは、ＰＣ１２細胞におけるＡβ１－４２誘導毒性を改善するだけでなくリン酸化タウのレベルも低下させる、ＡＬ０４の治療的可能性を調べた。ＰＣ１２細胞株は、アルツハイマー病における神経損傷および神経毒性を評価する一般的インビトロ・モデルとして利用されてきた。さらに、ＰＣ１２細胞は、ハイスループットを提供しかつ成熟神経表現型を保持できる（Ｔａｎ、１９９９）。神経成長因子（ＮＧＦ）に誘導されるＰＣ１２細胞の生化学と形態は、ニューロンに類似しており、ＰＣ１２細胞は、Ａβペプチドに対し、またＮＧＦ欠乏状態に対しても特に感受性が高い。さらに、複数の報告は、Ａβ１－４２がＰＣ１２細胞において細胞毒性および細胞死を誘導するのみならず、ＲＯＳの過剰産生とミトコンドリア機能不全も引き起こすことを示唆している（Ｈｅｎｓｌｅｙ、１９９４）。したがって、本発明者らの実験で用いられるＰＣ１２細胞は、ＡＬ０４が、Ａβが誘導する細胞毒性およびＮＧＦ欠乏に対する保護を提供するか否かを明らかにするための妥当なアプローチを提供する。

【0056】

ＨＳＡは、血液中を循環する最も豊富な蛋白質の一つである。ＨＳＡは、血流中で半減期が長いこと、毒性がないこと、および細胞内取り込みが容易であるため、治療薬の担体蛋白質として利用されている（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ、２００３；Ａｎｄｅｒｓｅｎ、２０１４）。本発明者らは、シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１クラスターＩＶ（ＬＲＰ１－Ｃ４）、クロモゾーム１０のホスファターゼおよびテンシン類似体（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ；Ｐｔｅｎ）、終末糖化産物受容体の可溶型（ｓＲＡＧＥ）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）などを含む１０種を超える対象蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）を選択し、これらは、細線維形成の阻止によりＡβ除去またはｐ－タウ減少のいずれかにおいて重要な役割を果たし、クリアランスを促進できるであろう。ＨＳＡ融合蛋白質産生細胞株を開発するために、本発明者らは、ＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４、ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）および選択マーカーであるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含む発現ベクターｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を構築した。安定に形質導入されたＤＨＦＲ欠損細胞（ＤＧ４４細胞）およびメトトレキサート（ＭＴＸ；ＤＨＦＲ阻害剤）で増幅した細胞のプールを、作成した。本発明者らは、精製したＡＬ０４蛋白質を用いて概念実証を試験した。ＡＬ０４は、褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞においてＡβ誘導細胞死を低減し、ＮＧＦ欠乏で誘導されるタウ過剰リン酸化を減少させ、内在性タウ－チューブリン相互作用を改善した。本発明者らは、細胞系のインビトロ・ヒトＢＢＢモデルを利用して、血液脳関門を通る高分子量蛋白質ＡＬ０４（８０ＫＤａ）の透過性を評価した。このＢＢＢを通過するヒト血清アルブミン融合蛋白質基盤は、アルツハイマー病治療の薬剤開発に有用である。

【0057】

ＨＳＡ融合蛋白質の治療効果は、細胞中への融合蛋白質の良好な送達に依存する。本発明者らは、ヒト血清アルブミン融合蛋白質（ＡＬ０４、ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ＣＰＰ；ＡＬ１２、ＲＡＧＥ（Ｖ）－ＨＳＡ－ＳＩＲＴｌ（エクソン４）－ＣＰＰ）が、分化したＰＣ１２細胞内へ浸透し得るかを調べた。本発明者らは、異なるバージョンのＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４またはＡＬ１２）が容易にＰＣ１２細胞内へ浸透し、またそれらの生物学的活性を効果的に細胞内へ送達できることを明らかにした。

【0058】

本研究において、本発明者らは、ＮＧＦ欠乏下で、ＮＧＦ欠乏が誘導するタウの過剰リン酸化におけるヒト血清アルブミン融合治療薬（ＡＬ０４）の役割を調べるために、分化したＰＣ１２細胞を用いた。未分化ＰＣ１２細胞において、タウは低いレベルで発現され、一方でＮＧＦによる刺激は、３日間の処理後に始まるタウの発現の増加をもたらした（Ｄｒｕｂｉｎ、１９８５；Ｈａｎｅｍａａｉｊｅｒ、１９９１）。タウは、ＮＧＦ誘導軸索伸張の後期段階における微小管安定化に必要であることが知られている（Ｂｒａｎｄｔ、１９９５；Ｈａｎｅｍａａｉｊｅｒ、１９９１）。Ｔｈｒ２０５位およびＴｈｒ２３１位でリン酸化されたタウ（ｐ－タウ）の量がアルツハイマー病の脳およびマウスのモデルで増加することが、報告されている（Ｗａｎｇ、２０１３）。本発明者らは、ＡＬ０４処置が、ＰＣ１２細胞においてＮＧＦ欠乏が誘導するタウ過剰リン酸化を低減するか否かを調べた。本発明者らは、ｐ－タウＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５およびｐ－タウＴｈｒ２３１のレベルがＮＧＦ欠乏ＰＣ１２細胞においてかなり増加することを、観察した（非提示データ）。ＡＬ０４の存在下で、本発明者らは、Ｓｅｒ２０２位、Ｔｈｒ２０５位、およびＴｈｒ２３１位でリン酸化されたタウのレベルが劇的に低下することを、観察した。ＰＰ２Ａ活性が、活性化Ｉ２ＰＰ２Ａ断片とＰＰ２Ａの触媒サブユニットの相互作用により阻害されることが、報告されている（Ａｒｎａｕｄ、２０１１）。ＡＬ０４処置が約２０ｋＤａのＩ２ＰＰ２Ａ断片のレベル、さらにはｐ－タウＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５およびｐ－タウＴｈｒ２３１のレベルも低下させるので、これらの結果は、ＡＬ０４（シスタチンＣを含む）がＩ２ＰＰ２Ａの下方制御を通じてタウの脱リン酸化に関連するＰＰ２Ａ活性の制御に影響を与えることを、示唆している。

【0059】

本明細書中に記載のタウ蛋白質に関する変異部位は、下の配列番号７のものである。

【0060】

ヒト・タウ：微小管結合タウ蛋白質イソ型２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９０１．２）、４４１アミノ酸
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴ
ＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤ
ＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮ
ＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ
ＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳ
ＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫ
ＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ
ＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ （配列番号７）

【0061】

複数の研究が、タウの主要部位のリン酸化はタウの正常機能に強い影響を与え、かつその病理学的役割に寄与する可能性があるという証拠を提示している（Ｋｓｉｅｚａｋ－Ｒｅｄｉｎｇ、１９９２；Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ、２００２）。Ｔｈｒ－２３１位でのタウのリン酸化が、微小管に対するその親和性を低下させることも示されている（Ｃｈｏ、２００４；Ｓｅｎｇｕｐｔａ、１９９８；Ｌｉｎ、２００７）。本発明者らは、ＡＬ０４処置が、リン酸化タウレベルを低下させることにより微小管－タウ相互作用を安定化させることも観察している。本発明者らの研究はＡＬ０４処置に伴うタウのリン酸化低減の原因となるシグナル伝達経路を明らかにしないが、一見したところＡＭＰＫ活性の阻害により媒介され、ＡＬ０４での処置は、インビボでタウ凝集とタングル形成を阻害する。最新報告において、本発明者らは、ＡＬ０４処置からのリン酸化ＵＬＫ１（Ｕｎｃ５１様キナーゼ１、Ｓｅｒ５５５位）の減少を観察し、このことは、ＡＬ０４がＡＭＰＫシグナル伝達経路を通じて自食作用を制御する可能性を示唆する。ＡＭＰＫは、自食作用を開始させる蛋白質キナーゼのリン酸化により自食作用の活性化を直接的に媒介し、その直接の基質（ＵＬＫ１のＳ５５５位を含む）をリン酸化することが、報告されている（Ｅｇａｎ、２０１１；Ｋｉｍ、２０１１）。

【0062】

結論として、本発明者らの所見は、ＡＬ０４が、ＮＧＦ欠乏状態下におけるリン酸化タウの減少に対する有意な保護効果を有することを示している。これらのインビトロ研究によれば、ＡＬ０４の保護効果は、タウキナーゼ活性（ＡＭＰＫ）、ＰＰ２Ａ活性を調節すること、およびタウ－チューブリン相互作用を安定化することを介している可能性がある。タウキナーゼおよびＰＰ２Ａはアルツハイマー病におけるＮＦＴ形成に重要な役割を演じるので、これらのデータは、ＡＬ０４がタウのリン酸化を変更し、それによりアルツハイマー病の脳におけるＮＦＴ蓄積に潜在的に影響を与え得ることを示唆している。

【0063】

本明細書中に記載のように、治療的有効量の融合ポリペプチドを全身的に投与することによりＢＢＢを越えて中枢神経系に有効用量の治療ポリペプチドを送達するための方法が、本明細書に記載される。融合ポリペプチドの送達に適した全身用量は、本明細書中に記載のように、その中枢神経系取り込み特性およびその比活性に基づく。治療蛋白質の欠損に苦しむ対象への融合ポリペプチドの全身的投与は、中枢神経系への治療蛋白質の非侵襲的送達への効果的なアプローチである。

【0064】

融合ポリペプチドの治療的有効全身用量である融合ポリペプチド量は、本明細書中に記載のように、部分的には、投与される融合ポリペプチドの中枢神経系取り込み特性（例えば、中枢神経系で取り込まれる全身的に投与される用量のパーセンテージ）に依存する。

【0065】

いくつかの実施態様において、全身的に投与された融合ポリペプチドの１％（つまり、約０．３％、０．４％、０．４８％、０．６％、０．７４％、０．８％、０．９％、１．０５、１．１、１．２、１．３％、１．５％、２％、２．５％、３％、または約０．３％～約３％の範囲のいずれかの％）が、ＢＢＢを越えて末梢血から取り込まれた結果として脳に送達される。いくつかの実施態様において、全身的に投与された融合ポリペプチド用量の少なくとも０．５％，（つまり、約０．３％、０．４％、０．４８％、０．６％、０．７４％、０．８％、０．９％、１．０５、１．１、１．２、１．３％、１．５％、２％、２．５％、３％、または約０．３％～約３％の範囲のいずれかの％）が、全身的投与後の２時間以内に、またはそれより短い時間で、つまり、１．８、１．７、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、０．９、０．８、０．６、０．５、もしくは約０．５～約２時間の他の期間で脳に送達される。

【0066】

したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、ＢＢＢを越える融合ポリペプチドの量が、少なくとも３ｎｇの治療蛋白質／対象の脳における蛋白質ｍｇ（例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、または３～５０ｎｇの他の任意の値（ｎｇ）の治療蛋白質／対象の脳における蛋白質ｍｇ）であるように、治療的有効量の融合ポリペプチドを全身的に投与する方法を提供する。

【0067】

一局面において、１００μｇのＡＬ０４がマウスに投与される場合、ＢＢＢ浸透率が０．０１％であると仮定すれば、１０ｎｇのＡＬ０４がマウス脳の蛋白４０ ｍｇに送達され得、ここでマウス脳の重量は４００ｍｇであり、その総蛋白質量は４０ｍｇである。これを、ヒトに外挿することもできる。

【0068】

いくつかの実施態様において、治療的に有効な全身性用量は、脳当たり少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００ユニット、あるいは脳当たり約５０～２５００ユニットの治療蛋白質活性の任意の他の全身性用量値を含む。

【0069】

他のいくつかの実施態様において、治療的に有効な全身性用量は、体重Ｋｇ当たり少なくとも約１０ユニットの治療蛋白質活性、少なくとも約１０、１２、１５、１８、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０ユニット、あるいは任意の他のユニット数を含む。

【0070】

当業者であれば、融合ポリペプチドの治療的に有効な全身性用量の総量は、部分的に、その比活性に依存することを理解するであろう。いくつかの実施態様において、融合ポリペプチドの比活性は、蛋白質ｍｇ当たり少なくとも１０Ｕ、少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０Ｕ、もしくは約１０ユニット～約５０ユニットの任意の他の比活性値である。

【0071】

したがって、融合ポリペプチドの比活性および治療される対象の体重を考慮すれば、融合ポリペプチドの全身性用量は、少なくとも５ｍｇ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、１２５、または約５ｍｇ～約１２５ｍｇの融合ポリペプチドの任意の他の値であり得る。

【0072】

本明細書中で用いられる用語「全身的投与」または「末梢投与」は、中枢神経系へ直接投与されない（つまり、物理的浸透またはＢＢＢの破壊を含まない）任意の投与法を含む。「全身的投与」としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬、経皮、直腸、経肺胞（吸入）、または経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるように、任意の適切な融合ポリペプチドを利用できる。

【0073】

融合ポリペプチドは、併用療法の一部として投与されてよい。併用療法は、アルツハイマー病に罹患した患者において典型的に見られる症状を治療する、または軽減するための他の療法と組み合わせた、本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物が、中枢神経系疾患についての他の方法または組成物と組み合わせて利用される場合、本発明の組成物および付加的な方法または組成物の任意の組み合わせを用いてよい。したがって、例えば、本発明の組成物の利用が、中枢神経系疾患の他の治療薬剤と組み合わされるならば、両者は、同時に、連続的に、時間的に重複して、類似の頻度で、同じ頻度で、または異なる頻度などで、投与されてよい。いくつかの場合では、中枢神経系疾患治療の他の薬剤の１つまたはそれ以上と本発明の組成物を組み合わせて含む組成物を用いる。

【0074】

いくつかの実施態様において、組成物（例えば、融合ポリペプチド）は、同じ製剤内であるいは個別の組成物としてのいずれかで、他の医薬と共に患者に共投与される。

【0075】

本発明はその範囲において、本明細書中に記載の特定の実施態様によって限定を受けるものではない。実際に、本明細書中に記載のものに加えて本発明の様々な変更は、当業者にとっては上述の説明および付属する図面から明らかであろう。そのような変更は、付属する特許請求の範囲に含まれるものと解される。以下の実施例は本発明を具体的に説明する目的で示されるものであって、限定するものではない。

【0076】

実施例
実施例１：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合蛋白質を発現するｐＯｐｔｉｖｅｃｔｏｒの構築
プラスミドｐＯｐｔｉＶｅｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を、発現ベクターとして用いた。コドン最適化合成遺伝子ｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔに注文した；これらの配列は以下である：ヒト血清アルブミン（ＮＭ＿０００４７７）、対象蛋白質：ＭＯＡ１またはＭＯＡ２として、シスタチンＣ、ＮＭ＿００００９９．３；Ｐｔｅｎ－ｌｏｎｇ、ＮＭ＿００１３０４７１８；終末糖化産物受容体 （ＲＡＧＥ）、ＮＭ＿００１１３６．４；ヒト転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）、ＮＭ＿００７１６２．２；ＳＩＲ１＿ヒトＮＡＤ依存性蛋白質脱アセチル化酵サーチュイン－１（ＳＩＲＴ１）、ＮＭ＿０１２２３８．５、およびＣＰＰとしてｄＴＡＴ（タンデムリピートＴＡＴ、ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｐ０４６０８のＴＡＴ ＨＶ１Ｈ２）。プラスミドを、制限酵素ＸｂａＩ、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）で処理した。ＤＮＡ断片の分離を、０．８％アガロースゲルでの電気泳動により行った。本発明者らは、ゲルからのＤＮＡ断片溶出に サーモ・ゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ））を使用した。次に、生成した断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ、ＵＳＡ））で互いにつなぎ合わせて、発現ベクターｐＯｐｔｉＶｅｃ－ＡＬ０００を作成した。

【0077】

本発明者らは、高純度の単離プラスミドＤＮＡの形質導入に、プラスミド・ミディ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ））を利用した。発現ベクターの適正な構築を、制限酵素分析により確認した。遺伝子およびその隣接領域の両方のヌクレオチド配列を、配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＵＳＡ）により確認した。

【0078】

実施例２：ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞株の培養
細胞培養を、温度３７℃および湿度９５％にて、８％のＣＯ_２雰囲気中、速度１２５ｒｐｍで作動するＣＯ_２インキュベーターにおいて、１２５ｍＬの三角フラスコ中で行った。再播種を、０．３～０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬの密度に、３～４日毎に行った。本発明者らは、８ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＣＤ－ＤＧ４４（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）血清不含培地を用いた。細胞数計測および細胞生存率分析を、自動細胞計数装置、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ ＡｕｔｏＴ４（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いてトリパンブルーでの染色後に行った。

【0079】

実施例３：安定細胞株の開発
形質導入に先立ち、発現ベクタープラスミドを、制限酵素ＦｓｐＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を用いて直線状にした。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞株を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に従い、直線状ｐＯｐｔｉＶｅｃ－ＡＬ０００で形質導入した。形質導入７２時間後、形質導入細胞を、８ｍＭのＬ－グルタミンを含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）培地（完全選択培地）を用いてヒポキサンチンとチミジン（ＨＴ）の非存在下での増殖について選択した。選択培地を、選択細胞の生存率が９０％より高くなるまで０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬの密度で３～４日毎に交換し、その後、２５０ｎＭから２μＭまでの段階的に増加させた濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む完全培地中で２～３回のゲノム増幅を行った。ＨＳＡ融合蛋白質産生を、ヒトアルブミン定量ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて選択／増幅培地での培養の最後に調べた。

【0080】

実施例４：ＡＬ０４のフラスコ振盪培養
２０００ｎＭのＭＴＸで増幅した細胞を、０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの生細胞密度で、８ｍＭのＬ－グルタミンを含む１５０ｍｌのＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を含む５００ｍｌ使い捨て三角フラスコで、それらの生存率が９０％より高くなるまで培養した。細胞密度および細胞生存率を、トリパンブルー色素排除法で自動細胞計測装置、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ ＡｕｔｏＴ４（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いて１日おきに測定した。１０日目もしくは細胞生存率が９０％より低下した時点で、培養物を、蛋白質精製のために収集した。

【0081】

実施例５：ＡＬ０４の精製
ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞から分泌されたヒト血清アルブミン融合蛋白質を含む培地を、濾過（０．２μｍフィルター）した後、ブルーダイ親和性クロマトグラフィー、次いでイオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に説明すると、濾過融合蛋白質を含む培地を、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡化したブルーＨＰカラム（ＧＥ）に添加した。このカラムを、平衡化緩衝液で洗浄して非結合蛋白質を除去し、結合した融合蛋白質を、カラム容積の１０倍容量の溶出緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０＋１．０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。溶出画分を、カットオフ分子量４０ｋＤａの遠心脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。さらなる精製のために、オン交換カラムクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＱＦＦ（ＧＥ））を行った。メーカーの説明書にしたがい、融合蛋白質を含む画分を集め、ＰＢＳ中で透析した。精製した蛋白質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、それは９０％を超える純度であった。ヒト血清アルブミン融合蛋白質を次に、フィルター（０．２μｍ）濾過で滅菌し、－８０°Ｃで保存した。蛋白質濃度を、ブラッドフォード法（Ｔｈｅｒｍｏ）で決定した。

【0082】

実施例６：ヒトアルブミンのＥＬＩＳＡ定量
９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）を、重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液（ｐＨ９．０）で１：１００に希釈した精製ヤギ抗ヒトアルブミン・コーティング抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）で４℃にて一晩コートした。ブロッキングを、１時間ＴＢＳ緩衝液中で調製した１％ウシ血清アルブミンを用いて行った。インキュベーション後、プレートを、ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）で５回洗浄し、試料と対照を、試料緩衝液（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液）で希釈し、１００μＬの各試料を、コートしたウェルに直接添加した。検量線を、試料緩衝液で希釈した基準ヒト血清（Ｂｅｔｈｙｌの供給）を用いて、６．５、１２．５、２５、５０、１００、２００、および４００ｎｇ／ｍＬで作成した。マイクロプレートを、室温で１時間１００μＬの希釈試料と標準を添加して、インキュベートした。次に、プレートを、ＴＢＳＴ緩衝液で５回洗浄し、試料緩衝液で１：１０００００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトアルブミン検出抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）１００μＬとインキュベートした。マイクロプレートを、１時間、インキュベートした。プレートを５回洗浄した後、ｌ００μｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｂｅｔｈｙｌ）を加え、プレートを、１５分間、室温で暗所にて呈色させ、反応を、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｂｅｔｈｙｌ）で停止させた。最後に、吸光度を、プレートリーダー（ＢｉｏＴＥＫ）で４５０ｎｍにて測定した。各測定を、３重で行い、ＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）蛋白質濃度を、検量線の直線部から内挿した。

【0083】

実施例７：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の準備
８μｇの精製ＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）蛋白質を、４％～１２％勾配ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。ゲルをクマシーブリリアントブルーＧ－２５０（Ｔｈｅｒｍｏ）で染色し水ですすいだ後、ＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）蛋白質のバンドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる蛋白質同定／分析（ＢｉｏＳｙｎ）用にゲルから切り出した。Ｎ末端配列決定用試料の準備として、電気泳動完了後に、蛋白質ブロッティングを、１０％メタノールを含むＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液中で１００Ｖ、９０分間、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写することにより行った。転写したＰＶＤＦ膜を、ＤＤＨ_２Ｏで３回洗浄し、ポンソーＳ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色し、次いでＤＤＨ_２Ｏ中で脱色した。染色したＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）蛋白質バンドを、Ｎ末端配列決定（ＢｉｏＳｙｎ、ＵＳＡ）用に膜から切り出した。

【0084】

実施例８：ＰＣ１２細胞のＡβ１－４２に関する毒性アッセイ
Ａβ１－４２（ＡｎａＳｐｅｃ、ＵＳＡ）を、０．１％ＮＨ_４ＯＨを含むＤＰＢＳに溶解して、１ｍＭストック溶液とした。一部を－８０℃で保存し、ペプチド凝集のために３７℃で３日間、予備インキュベート（エージング処理）した。

【0085】

ラット褐色細胞腫細胞株（ＰＣ１２）は、古典的なインビトロ神経内分泌細胞モデルである。初代神経細胞と異なり、未分化ＰＣ１２細胞は、生存に神経成長因子（ＮＧＦ）を必要としないが、非常に長い軸索の伸張を生じることにより、および他の神経特異的変化（コリン作動性受容体の発現増加など）を起こすことによりそれに応答する（Ｊｕｍｂｌａｔｔ、１９８２；Ａｍｙ、１９８３）。ＮＧＦ処理したＰＣ１２細胞は、多くの分化神経細胞的特徴を示す。ＰＣ１２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５％（ｖ／ｖ）熱不活化馬血清（ＨＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した後、加湿５％ＣＯ_２雰囲気下にて３７℃で培養した。細胞を、集めて各種の実験に用いた、あるいはそれらが８０％プレート表面被覆率（コンフルエンス）に達すると継代した。実験前に、ＰＣ１２細胞を、ポリ－Ｄ－リジンで予めコートした９６穴プレートの１００μｌ中にウェル当たり１５０００の細胞数で播種して、細胞をプレートのウェルに付着させた。未分化細胞での実験では、９６穴プレートを用い、薬剤処理を、細胞播種２４時間後直ちに開始した。ＮＧＦ刺激した（神経分化した）ＰＣ１２細胞を、１％馬血清および１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地中で少なくとも６日間増殖させた。Ａβ１－４２媒介毒性効果を、ＷＳＴ－８還元アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて調べた。簡単に説明すると、細胞を、異なるＡＬ０４濃度（０、０．０１、０．１、１、および１０μＭ）でのＡＬ０４および／またはＡβ１－４２（１０μＭ）の非存在下または存在下において、３７℃でさらに３日間処置した。このインキュベーション期間後に、１０μｌのＷＳＴ－８ストック溶液を添加し、インキュベーションを、さらに３～４時間継続した。生細胞中のデヒドロゲナーゼ活性により生成されたＷＳＴ－８－ホルマザンのＡ４５０を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴＥＫ、ＵＳＡ）を用いて測定した（対照波長：６３０ｎｍ）。

【0086】

実施例９：ＡＬ０４のＢＢＢ透過性アッセイ
インビトロ・ヒトＢＢＢモデル（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ＵＳＡ）を、初代ヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）、ヒト脳周皮細胞（ＨＢＰＣ）、およびヒト脳星状膠細胞（ＨＢＡＣ）の共培養を用いることにより確立した。インビトロ・ヒトＢＢＢモデルキットは、２つの側面（管腔側、血液側／反管腔側、脳側）を有し１２個のトランスウェル・インサート（ポリエステル膜、０．４μｍ孔、直径１２ｍｍ、インサートの増殖面積：１．１２ｃｍ^２）から成る。ＨＢＰＣを、インサートの底面側で培養し、ＨＢＥＣを、インサートの上面側上で単層にし、ＨＢＡＣを、１２ウェル培養プレート（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ＵＳＡ）の底部で培養した。インビトロＢＢＢモデルを、メーカーの説明書にしたがい４日間、活性化した。簡単に説明すると、トランスウェル・インサートの管腔側および反管腔側（下側、脳側）の両側からの培地を、１日おきに交換した。輸送実験の前に、反管腔側を、透過性アッセイ培地で満たした。透過性アッセイでは、精製ＡＬ０４または組み換え型ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、トランスウェル・インサートの管腔側（０．３ｍｌ）に添加して最終濃度を１またはｌ０μＭにした。培養を、オービタルシェイカー（１００ｒｐｍ）を用いて３７℃で行った。試料（１５０μｌ）を、６０、１２０、および２４０分の時点で反管腔側から採取（１．２ｍｌ）し、即座に新鮮な透過性アッセイ培地と交換した。輸送されたＡＬ０４またはｒＨＳＡの濃度を、ヒトアルブミン定量ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）により測定し、検量線法を用いて分析した。透過係数（Ｐｅ、ｃｍ・ｓ^－１）を、式：Ｐｅ ＝（ＶＡ／（Ａｘｃ_０））ｘ（ｄＱ／ｄｔ）を用いて計算し、ここでＶＡは、血液側（インサートの内面）でのアッセイ緩衝液の容量であり、Ａは、インサートの表面容積（１．１２ｃｍ^２）であり、ｃ_０は、血液側へ加えた蛋白質試料の初濃度であり、ｄＱ／ｄｔは、特定時間において脳側で輸送された蛋白質試料の濃度である。精製ＡＬ０４または組み換え型ＨＳＡの透過係数（Ｐｅ、ｃｍ・ｓ^－１）を、他に記載の方法（Ｐｒａｄｅｓ、２０１５；Ｎａｋａｇａｗａ、２００９）で計算した。

【0087】

実施例１０：結果
実施例１０．１：組み換え型ＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４）のための遺伝子構築物とベクターの設計
最初の段階で、最適化コドン組成でヒト血清アルブミン、対象蛋白質（例えば、ＭＯＡ１またはＭＯＡ２としてシスタチンＣ、Ｐｔｅｎ－ｌｏｎｇ）、およびｄＴＡＴをコードする遺伝子を、合成した。遺伝子配列を、公開されている情報源（ＮＣＢＩ、米国国立生物工学情報センターおよびＵｎｉＰｒｏｔ、ユニバーサル蛋白質リソース）から取得した。ｐＯｐｔｉＶｅｃプラスミドベクターを、ヒト血清アルブミン、対象蛋白質（例えば、ＭＯＡ１またはＭＯＡ２としてシスタチンＣ、Ｐｔｅｎ－ｌｏｎｇ）、およびｄＴＡＴの各遺伝子の担体として用いた（図１～図４）。

【0088】

実施例１０．２：ＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４）の生産
懸濁後、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞を、直線化した発現ベクター、Ｏｐｔｉｖｅｃ－ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴで形質導入し、ヒトアルブミン定量ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて培養上清中で検出した。形質導入ＣＨＯ細胞を次に、８ｍＭのＬ－グルタミンを含むＣＤ Ｏｐｔｉ ＣＨＯ培地中で選択およびＭＴＸ増幅した。組み換え型蛋白質の高濃度産生を達成するために、生物薬剤業界で広く利用されている哺乳動物細胞発現系であるメトトレキサート（ＭＴＸ）増幅系（Ｎｇ、２０１２）を、用いた。ＭＴＸによる増幅過程の間、ヒトアルブミンとして培養上清中で増加したＡＬ０４（Ｏｐｔｉｖｅｃ－ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）の発現を、ＥＬＩＳＡで定量した。２０００ｎＭのＭＴＸ濃度での細胞プールを次に、ＡＬ０４発現培養に適応させた。

【0089】

実施例１０．３：精製ＡＬ０４蛋白質の特徴付け
ＡＬ０４蛋白質の同一性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により確認した（図５）。精製したＡＬ０４蛋白質バンドのサイズ（完全長）は、ブルーカラムクロマトグラフィーからの溶出液中で還元条件下にて約８０ｋＤａであると示された。ブルーカラムから精製したＡＬ０４蛋白質の信頼性を確認するために、蛋白質を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（Ｂｉｏｓｙｎ）に供した。ＡＬ０４に対応する少なくとも６９個の固有ペプチドが、９２％の蛋白質範囲で検出された。ＡＬ０４蛋白質のＮ末端を確認するために、特有なペプチドであるＳＳＰＧＫＰＰＲＬＶを、試料中で観察した（非提示データ）。分析は、シグナルペプチドが、分泌された成熟蛋白質から正しく切断されたことも確認した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析およびＮ末端配列決定に基づいて、本発明者らは、ブルーカラムから精製したＡＬ０４蛋白質が、発現配列と同一であったことを確認した。

【0090】

実施例１０．４：Ａβ１－４２誘導細胞毒性に対するＡＬ０４（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）の保護効果
本発明者らは、ＰＣ１２細胞培養において可能性のあるＡＬ０４の非特異的細胞毒性を調べた。細胞生存率における変化は、ＡＬ０４を０．０１μＭ、０．１μＭ、および１μＭで単独でインキュベートした場合観察されなかったが、１０μＭのＡＬ０４ほどの高い濃度は、細胞生存率を低下させた（図６Ａ）。インビトロ研究は、シスタチンＣが、Ａβの構造上重要であるＡβの中央ドメインに結合し、Ａβ凝集体形成を阻害しＡβ誘導毒性を防止することを、明らかにした（Ｊｕｓｚｃｚｙｋ、２００９；Ｔｉｚｏｎ、２０１０）。本発明者らは、シスタチンＣを含むＡＬ０４がＡβ誘導毒性を阻害するか否かを調べた。１０μＭのＡβ１－４２のみでのＰＣ１２細胞の処理は、コントロール細胞（Ａβ１－４２非存在）と比較して可溶性のｌ０μＭのＡβ１－４２で２０％へと細胞生存率の顕著な減少をもたらした。しかしながら、ＡＬ０４の存在下で、Ａβ１－４２誘導性細胞死は、レスキューされた（図６Ｂ）。

【0091】

未分化ＰＣ１２細胞と同様に、神経成長因子（ＮＧＦ）処理した（分化した）ＰＣ１２細胞は、それらが可溶性のまたは凝集したＡβ１－４２による処理（１０μＭ）のいずれかに３日間曝露された場合に、細胞生存率の約４０％低下を示した。一見したところ、０．０１μＭのＡＬ０４単独は、分化したＰＣ１２細胞においていかなる悪影響も引き起こさなかった。総合すれば、これらのデータは、ＡＬ０４ がＡβ１－４２誘導性細胞毒性に対し細胞を保護できることを示している（図７）。ＡＬ０４がＡβ凝集、プラーク形成、および神経毒性を効果的に阻止することは、明白である。

【0092】

実施例１０．５：ＡＬ０４のＢＢＢ透過性の評価
本発明者らは、本研究において、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓから購入した市販のインビトロ・ヒトＢＢＢモデルを利用した。本発明者らは、ＢＢＢ透過性アッセイを、１～１０μＭの濃度を用いて行った。このアッセイ後に、本発明者らは、ヒトアルブミン定量ＥＬＩＳＡを用いて脳側からのＡＬ０４濃度を測定し、実施例９に記載の式により計算される透過係数（Ｐｅ）を推定した。送達基盤（ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴ）のＡＬ０４中のＴＡＴペプチドの融合を確かめるため、ＢＢＢモデルを介するＡＬ０４およびＴＡＴを含まない組み換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の透過率を、比較した。それによりＴＡＴ蛋白質がＢＢＢを妨害する複数の機序が、提示されており、そのような機序としては、密着結合蛋白質発現の低下、内皮における血管透過性誘導、および再局在化が挙げられる（Ａｎｄｒａｓ、２００５；Ｘｕ、２０１２；Ｚｈｏｎｇ、２０１２；Ｔｏｓｃｈｉ、２００１）。

【0093】

図８Ａに示されるように、用量依存性の結果は、ＡＬ０４はモデルＢＢＢを越えて輸送されたことを明らかにした。ｄＴＡＴを含むＡＬ０４は、ｒＨＳＡよりも高い透過性でＢＢＢモデルを介して脳側へ輸送される傾向がある。本発明者らはまた、１μＭおよび１０μＭのＡＬ０４のＢＢＢモデルを介する透過性におよぼすアッセイ時間の影響を評価した。本発明者らは、３つの異なるアッセイ時間（６０、１２０、および２４０分）で透過性を比較した。図８Ｂは、これらのＰｅは１２０分まで徐々に増加するが、１０μＭのＡＬ０４のＰｅは２４０分でわずかに減少する傾向のあることを示した。

【0094】

実施例１１：２重作用性治療基盤（ヒト血清アルブミン融合蛋白質）のための設計
実施例１１．１：材料と方法
本研究では、シスタチンＣ配列を選択してバージョン１のＨＳＡ融合蛋白質－ＣＰＰ基盤を試験した。大型構造物であるＨＳＡのＨＳＡ融合蛋白質基盤バージョン１への影響を回避するために、リンカー（ＧＧＳＡＳ）を、シスタチンＣとＨＳＡの間に挿入した。切断可能なリンカー（ＧＦＬＧ）をＨＳＡとＣＰＰの間に挿入し、これはＨＳＡ融合蛋白質の浸透からのＣＰＰの解放を促進する可能性がある（図１）。ＨＳＡ融合蛋白質基盤バージョン２（ＭＯＡ１－ＨＳＡ－ＭＯＡ２－ＣＰＰ：ＡＬ０６、ＡＬ０７、ＡＬ０８、ＡＬ０９、ＡＬ１０）において、４種の異なる蛋白質配列を選択した。終末糖化産物に対する受容体のＶドメイン（ＲＡＧＥ－Ｖ、ＡＬ１０についてＲＡＧＥ－Ｖ＆Ｃ１ドメイン）を、バージョン２でＡｂｅｔａを低減するための作用機序１（ＭＯＡ１）として用いた。異なる３種の蛋白質を、バージョン２基盤でそれぞれ、リン酸化タウのレベルを低下させる負荷のための作用機序２（ＭＯＡ２）として用いた：Ｐｔｅｎ－Ｌｏｎｇ（ＡＬ０６について）、ＰＤＺドメイン欠失型Ｐｔｅｎ－Ｌｏｎｇ（ＡＬ０９およびＡＬ１０について）；はＡＬ０７についてＴＦＥＢ（転写因子ＥＢ、自食作用およびリソゾーム内分解の主要制御因子）；ＡＬ０８についてＳＩＲＴ１（タウタングルを脱アセチル化しかつプロテアソーム分解の目印をつける、サイレント接合型情報調節因子２ホモローグ１）。バージョン２では、様々なリンカーを用いた：ＧＳリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）を、ＭＯＡ１とＨＳＡの間に挿入した；ＧＳリンカー／切断可能なリンカー（ＧＦＬＧＧＧＧＳＡＳ）を、ＨＳＡとＭＯＡ２の間に挿入した；切断可能なリンカー（ＧＦＬＧ）を、ＭＯＡ２とＣＰＰの間に挿入した（図３）。ＨＳＡ融合蛋白質基盤バージョン２．１（ＭＯＡ１－ＨＳＡ－ＭＯＡ２－ＣＰＰ：ＡＬ１２）では、ＲＡＧＥ－Ｖドメインを、Ａｂｅｔａを減らすための作用機序１（ＭＯＡ１）として用い、かつ５２アミノ酸（ＳＩＲＴ１の触媒ドメインの一部である、ＳＩＲＴ１のエクソン４）を、リン酸化タウを減らすためのＭＯＡ２として用いた。バージョン２．１では、ＧＳリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）を、ＭＯＡ１とＨＳＡの間；ＭＯＡ２とＣＰＰの間に挿入した。ＧＳリンカー／切断可能なリンカー（ＧＦＬＧＧＧＧＳＡＳ）を、ＨＳＡとＭＯＡ２の間に挿入した。本発明者等は、ＨＳＡと他の融合部分との間の立体障害を避けるために、様々なリンカーを用いた（図４）。

【0095】

実施例１２：ウエスタンブロット
ＰＣ１２細胞を、１％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地中で１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いて分化させた。４日後に、ＮＧＦを欠乏させたＰＣ１２細胞を、様々な濃度（０～１０μｇ／ｍｌ）のＡＬ０４（または、ＡＬ０７、ＡＬ０８、ＡＬ１２）で２４時間処理した。細胞を、他に記載されるように（Ｂａｎｇ、２０１２）、氷冷ＤＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２回すすぎ、溶解緩衝液で溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび免疫ブロットに供した。下記の抗体を用いた：Ｔａｕ４６（総タウ）、リン酸化ＡＭＰＫａ（Ｔｈｒ１７２）、ＡＭＰＫｏｃ、リン酸化ＡＭＰＫｐ（Ｓｅｒｌ８２）、ＡＭＰＫｐ、リン酸化ＵＬＫ１（Ｓｅｒ５５５）、β３－チューブリン、シスタチンＣ、ＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。リン酸化タウ（ＡＴ８：Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５、Ｔｈｅｒｍｏ）、リン酸化タウ（ＰＨＦ－６：Ｔｈｒ２３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ヒトアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）。スーパーシグナルウエストピコ化学発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を、シグナル検出に用いた。リン酸化タウおよび総タウの定量を、画像解析ソフトウエア（ＮＩＨ）を用いる濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）により行った。各時点におけるリン酸化タウのレベルを、同じ試料からの総タウ濃度に対し正規化し、それぞれの正規化値を、最大値（これを１００％とする）のパーセンテージとして表した。統計的有意性を、スチューデントｔ－検定により決定した。

【0096】

実施例１３：免疫沈降（ＩＰ）
処理した細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５％グリセロール、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）中で溶解した。総蛋白質（１０００μｇ）を、４℃で１６時間、示されるように５μｇのβ３－チューブリン抗体と反応させ、さらに３時間、６０μＬのＴｒｕｅＢｌｏｔ抗ウサギＩｇ免疫沈降ビーズ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で沈降させた。免疫沈降したビーズを、溶解緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳを添加した試料緩衝液を、加えた。試料を、前に記載されるように（Ｂａｎｇ、２０１４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し免疫ブロッティングにより分析した。タウブロットの免疫沈降物については、マウスＴｒｕｅＢｌｏｔ ＵＬＴＲＡ抗マウスＩｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を、スーパーシグナルウエストピコ化学発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）による検出に用いた。結合したタウと添加したタウのシグナルの定量を、画像解析ソフトウエア（ＮＩＨ）を用いる濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）により行った。統計的有意性を、スチューデントｔ－検定により決定した。

【0097】

実施例１４：結果
実施例１４．１：精製したＡＬ０４（８０ｋＤａ）、ＡＬ０７（１３５ｋＤａ）、ＡＬ０８（１２９ｋＤａ）、およびＡＬ１２（８８ｋＤａ）の特徴付け
ＡＬ０４（バージョン１）、ＡＬ０７および ＡＬ０８（バージョン２）、およびＡＬ１２（バージョン２．１）を、発現させ、ブルーダイ親和性クロマトグラフィー、次にイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製した蛋白質を、濃縮し、限外ろ過スピンカラムを用いて緩衝液をＰＢＳに交換し、次にブラッドフォード蛋白質アッセイを用いて定量した。ＡＬ０４およびＡＬ１２の純度は、クマシーブルー染色で９０％を超える。ＡＬ０７およびＡＬ０８の純度を、クマシー染色およびウエスタンブロットの両方により確認し、ここでクマシー染色ゲルにおける主要なバンドは、ヒトアルブミン抗体を用いるウエスタンブロットから観察されたものと一致する（図５および図１１）．

【0098】

実施例１４．２：ＡＬ０４またはＡＬ１２のいずれかは、用量依存的に分化ＰＣ１２細胞中へ浸透する
新しい方略が常に、機能蛋白質またはペプチドを細胞内に送達するために評価されているが、それらは、臨床モデルに転用するには、未だ総合的な効率および安全性を欠いている（Ｚｈａｎｇ、２０１２）。受容体媒介性および飲食作用経路を含む、複数の細胞内在化様式が役割を果たしていることが示されている（Ｇｒａｄｉｓｈａｒ、２００５）。そこで、本発明者らは、ＡＬ０４またはＡＬ１２が細胞内に浸透するかどうかを調べた。細胞を、２４時間ＮＧＦ欠乏下で、様々な濃度（０～５μｇ／ｍｌ）のＡＬ０４またはＡＬ１２のいずれかで処理した。ウエスタンブロット分析を用いて、分化ＰＣ１２細胞内へのＨＳＡ融合蛋白質の浸透の程度を評価した。図９に示すように、ＡＬ０４またはＡＬ１２蛋白質は、用量依存的に分化ＰＣ１２細胞内へ浸透する（図９）。これは、異なるバージョンのＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４、シスタチンＣ－ＨＳＡ－ＣＰＰ；ＡＬ１２、ＲＡＧＥ（Ｖ）－ＨＳＡ－ＳＩＲＴｌ（エクソン４）－ＣＰＰ）が、ＰＣ１２細胞内へ容易に浸透し、かつそれらの生物学的活性を細胞内に効率的に送達し得たことを示す。

【0099】

実施例１４．３：ＨＳＡ融合蛋白質（ＡＬ０４、ＡＬ０７、およびＡＬ０８）は、ＮＧＦ欠乏ＰＣ１２細胞においてタウのリン酸化状態に影響を与える
ＡＬ０７およびＡＬ０８は、Ａｂｅｔａを低減する一般的な作用因子であるＲＡＧＥ－Ｖ、ならびにリン酸化タウを低減する作用因子としてＴＦＥＢおよびＳＩＲＴ１を含む。分化したＰＣ１２細胞を、２４時間それぞれ、１μｇ／ｍｌのＡＬ０４、または２μｇ／ｍｌのＡＬ０４、ＡＬ０７、ＡＬ０８で処理した。細胞を、溶解し、総細胞溶解物（２０μｇ／レーン）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。タウのエピトープの相対レベルを、下記の抗体を用いる免疫ブロッティングにより決定した：総タウの測定基準である、ｔａｕ－４６；タウ蛋白質上のリン酸化されたＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５残基を認識する、ＡＴ８；タウ蛋白質上のリン酸化されたＴｈｒ２３１残基を認識する、ＰＨＦ－６。ＡＬ０４、ＡＬ０７、およびＡＬ０８の投与は、Ｔｈｒ２３１位におけるタウのリン酸化を減少させたが、ＡＬ０４のみが、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５位におけるｐ－タウの減少をもたらした。ＡＬ０７およびＡＬ０８による処置は、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５位におけるタウのリン酸化を低減できなかった。Ｔａｕ－４６抗体により測定される、総タウ値は、ＡＬ０４処置により変化しなかったが、総タウ値は、ＡＬ０７処置およびＡＬ０８処置によりわずかに増加した。免疫ブロット分析の結果は、Ｔｈｒ２３１位におけるホスホキナーゼの総タウ蛋白質に対する比がＡＬ０４、ＡＬ０７またはＡＬ０８による処置で減少する（図１２）という証拠を提示し、一方でＡＬ０４処置からのＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５位でのホスホキナーゼの総蛋白質に対する比における有意な減少が、見られる。

【0100】

実施例１４．４：ＡＬ０４は、Ｉ２ＰＰ２Ａ（ＰＰ２Ａホスファターゼの阻害因子）の下方調節によりＮＧＦ欠乏でのリン酸化タウのレベルを減少させる
ＰＰ２Ａ活性は、アルツハイマー病では低下しており、タウの神経原線維病変の原因であると考えられている。Ｉ２ＰＰ２Ａは、大人のヒトの脳のホスホセリン／ホスホスレオニンタウ蛋白質ホスファターゼ活性の約７０％を占めるホスファターゼ（Ｌｉｕ、２００５）であるＰＰ２Ａの強力な阻害因子であるといわれている。シスタチンＣはＡＥＰの阻害因子なので（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ、１９９９；ｖａｎ Ｋａｓｔｅｒｅｎ、２０１１）、ＡＬ０４（シスタチンＣを含む）は、Ｉ２ＰＰ２Ａの下方制御を通じてタウの脱リン酸化に関与するＰＰ２Ａ活性の制御に影響を与える可能性がある。そこで、本発明者らは、ＡＬ０４処置がＩ２ＰＰ２Ａの切断（活性化）を阻害するかどうかを調べた。本発明者らは、分化したＰＣ１２細胞を、ＮＧＦ欠乏下で、１～１０μｇ／ｍｌのＡＬ０４で２４時間処置した。図１３に示されるように、ＡＬ０４処置は、Ｉ２ＰＰ２Ａの約２０ｋＤａの活性化断片のレベルを低下させた。本発明者らはまた、ＡＬ０４処置が、用量依存的にＰ－タウＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５のレベルを有意に低下させることも見いだした。同様に、Ｐ－タウＴｈｒ２３１のレベルも、非処置細胞と比較してＡＬ０４で処置した細胞でわずかに低下されることを示した。Ｔａｕ－４６抗体により測定した総タウのレベルは、ＡＬ０４処置により変化しかった。ＧＡＰＤＨでは変化が見られなかった。これらの結果は、ＡＬ０４が、Ｉ２ＰＰ２Ａの下方制御を通じてＰＰ２Ａ活性をレスキューすることにより、ＮＧＦ欠乏が誘導するタウの過剰リン酸化レベルを低下させることを示唆した。

【0101】

実施例１４．５：チューブリン－タウ相互作用に及ぼす低下するタウのリン酸化の効果
タウは、神経発生における微小管動態の制御において重要な役割を担っている。タウの主要部位におけるリン酸化は、タウの正常機能に大きな影響を与え、かつその病理学的役割に影響する可能性があることが示されている（Ｃｈｏ、２００４；Ｓｅｎｇｕｐｔａ、１９９８；Ｌｉｎ、２００７）。本発明者らは次に、ＮＧＦ欠乏が誘導するタウの過剰リン酸化がチューブリン結合の変化に必要であるか否かを、ＡＬ０４の存在または非存在下で試験することにより調べた。本発明者らは、ＡＬ０４処置はタウ－チューブリン結合レベルを、非処置において得られるレベルと比べて２倍増加させる（図１４）ことを見いだし、これは、ＡＬ０４がリン酸化タウのレベルを低下させることを通じてＮＧＦ欠乏により低下した微小管－タウ相互作用を回復することを示している。

【0102】

実施例１４．６：ＡＬ０４は、用量依存的にタウキナーゼ（ＡＭＰＫ）を調節することにより過剰リン酸化タウを減少させる
ＡＬ０４処置はリン酸化タウを減少させるので、本発明者らは、ＡＬ０４処置がタウのリン酸化に関与する可能性のある複数のキナーゼの活性化も変化させるかどうかを調べた。アルツハイマー病の脳およびマウスの初代神経細胞中の内在性ＡＭＰＫの活性化は、複数部位においてタウリン酸化の増加を引き起こし、ここでＡＭＰＫ阻害はタウリン酸化の急速な低下をもたらした（Ｖｉｎｇｔｄｅｕｘ、２０１１；Ｄｏｍｉｓｅ、２０１６）。そこで、本発明者らは、ＡＬ０４に起因するＮＧＦ欠乏により誘導される過剰リン酸化タウの減少とＡＭＰＫシグナル伝達経路が関与している可能性について調べた。ＡＭＰＫ活性化はα１およびα２サブユニットの活性化ループにおけるＴｈｒｌ７２位のリン酸化を要求するので、ＡＭＰＫ活性を、リン酸化ＡＭＰＫの発現レベルを検出するウエスタンブロットにより調べた（Ｂａｎｇ、２０１２；Ｂａｎｇ、２０１４）。本発明者らは、下記の実験を行った。まず、ＡＭＰＫ活性化触媒性αサブユニット、ｐ－ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）および制御性サブユニットβ１に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。図１５に示されるように、ｐ－ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）およびｐ－ＡＭＰＫβ１（Ｓｅｒ１８２）のレベル低下が、用量依存的に観察され、ＡＬ０４処置がＡＭＰＫ活性を低下させたことを示唆する。次に、本発明者らは、ＡＭＰＫ依存性基質であり自食作用の制御因子であるＵＬＫ１（Ｅｇａｎ、２０１１；Ｋｉｍ、２０１１；Ｇｕｈａ、２０１９）を調べ、ＡＬ０４での細胞の処置後にＡＭＰＫに依存様式でＳｅｒ５５５位でのＵＬＫ１リン酸化が大きく低下したことを認めた。特に、これらの細胞におけるｐ－ＵＬＫ１（Ｓｅｒ５５５）のレベルの低下は、２種の真のＡＭＰＫ基質、すなわちＡＣＣおよびＲａｐｔｏｒのそれと類似していた（非提示データ）。ＧＡＰＤＨは変化しなかった。ＡＬ０４処置は、タウキナーゼとして知られるＡＭＰＫを調節（不活性化）する可能性があり、ＰＣ１２細胞におけるリン酸化タウのレベル低下に寄与することが示唆される。

【0103】

実施例１５：Ｔｇ２５７６およびＪＮＰＬ３マウスを用いた海馬および内嗅の実験の説明
ヒトのアルツハイマー病では、疾病の進行に伴う記憶障害は、新規記憶形成に重要でありアルツハイマー病で最も影響を受けやすい領域である、内嗅皮質（ＥＣ）および海馬の病理学的変化に起因する可能性がある（Ｋｎｏｗｌｅｓ、１９９８；Ａｌｖａｒｅｚ、１９９５；Ｂａｎｎｅｒｍａｎ、２００１；Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ、２００４）。海馬は、次の亜領域から成る：歯状回（ＤＧ）、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、および鉤状回。海馬および内嗅皮質は、スウェーデン型２重変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）（Ｈｓｉａｏ、１９９６；Ｓｕ、１９９８；Ｒｅｉｌｌｙ、２００３；Ｄｏｎｇ、２００７；Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ、２０１２；Ｘｕ、２０１５）を有するヒトＡＰＰを過剰発現する、Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ沈着の主要部位であることが報告されており、またＰ３０１Ｌ変異（Ｌｅｗｉｓ、２０００；Ｌｉｎ、２００３；Ａｃｋｅｒ、２０１３；Ｖｉｔａｌｅ、２０１８）を有するヒトのタウを発現する、ＪＮＰＬ３マウスにおいても病的タウ（オリゴマー／凝集リン酸化タウを含む神経原線維変化）を示す。アルツハイマー病（ＡＤ）に対するＡＬ０４の有効性を評価するために、本発明者らは、ＡＬ０４が、それぞれ、Ｔｇ２５７６およびＪＮＰＬ３マウスの海馬および内嗅皮質におけるアミロイドベータ（ＡＰ）および／または過剰リン酸化タウの蓄積を減少させるかどうかを調べた。ＡＬ０４処置によるＡβ沈着または過剰リン酸化タウの変化を、免疫組織化学アッセイを用いてコントロール（ＰＢＳを注射した）動物と比較する。

【0104】

実施例１５．１：動物および処置
本研究に用いた９～１０月齢のメスＴｇ２５７６マウスおよび３～４月齢のＪＮＰＬ３マウスを、タコニックファームズ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、ノーブルライフサイエンス社（Ｎｏｂｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．；Ｓｙｋｅｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の動物実験委員会により承認されたプロトコル（承認番号：ＮＬＳ－５１１）にしたがい維持し取り扱った。本研究の全ての動物実験は、エルアンドジェーバイオサイエンス社（Ｌ＆Ｊ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）が立案し、ノーブルライフサイエンス社が実施した。Ｔｇ２５７６マウスを、２ヶ月間毎週腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇのＡＬ０４またはＰＢＳのいずれかで処置した。ＪＮＰＬ３マウスを、６ヶ月２週間毎に腹腔内注射により５ｍｇ／ｋｇのＡＬ０４またはＰＢＳのいずれかで処置した。処置後、動物を、イソフルレンで麻酔し、脳を、取り出した。脳を、脳の半分のみを免疫組織化学分析用に解剖するように、正中線（矢状）で分割した。

【0105】

実施例１５．２：組織学および免疫組織化学分析
脳を、さらに２４時間、後固定した後、標準のプロトコルを用いてパラフィン包埋した。冠状断切片（５μｍ）を、ミクロトームで切り出し、以下の１次抗体を用いる免疫組織化学処理を行った：６Ｅ１０（ヒトＡβの残基１～１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５００）、ＡＴ８（リン酸化タウＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５、Ｔｈｅｒｍｏ、１：１０００）およびＨＴ７（総タウ、Ｔｈｅｒｍｏ、１：１０００）。１次抗体とのインキュベーション後に、切片を、ＰＢＳ中で洗浄し、次に切片を、２次抗体（ＨＲＰ結合；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、１：１０００）または蛍光ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ抗体（Ａｌｅｘａ（４８８結合；Ｔｈｅｒｍｏ、１：１０００）とインキュベートした。Ｔｇ２５７６マウスの脳試料におけるＡβ沈着もしくはＪＮＰＬ３マウスの脳における総タウの検出のために、ＨＲＰ結合抗体で処理したスライドを、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）とインキュベートし、すすぎ、ヘマトキシリンで対比染色した。ＤＡＢ発色について、スライドを、光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。蛍光スライドを、核染色のためにＤＡＰＩと５分間インキュベートした。ＪＮＰＬ３マウスの脳試料におけるリン酸化タウの免疫蛍光を、励起フィルター３４０（ＤＡＰＩは青）および４８８（ｐ－タウは緑）で共焦点顕微鏡（Ｚｅｎ２、Ｚｅｉｓｓ）を用いて可視化した。組織学／免疫組織化学および画像解析はそれぞれ、エルアンドジェーバイオサイエンス社（Ｌ＆Ｊ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）が立案し、ヒストサーブ（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖｅ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）およびＣＶＰａｔｈ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）が実施した。

【0106】

実施例１６：結果
実施例１６．１：ＡＬ０４は、Ｔｇ２５７６マウスの海馬および内嗅皮質においてアミロイドベータ沈着を減少させる。
アミロイドカスケード仮説に基づき、Ａβ蓄積および凝集は、アルツハイマー病発症の病理学的および臨床的症状を誘発する（Ｗａｌｓｈ、２０１２；Ｈａｒｄｙ、１９９２；Ｈａｒｄｙ、２００２）。以前の研究は、Ａβ蓄積が、Ｔｇ２５７６マウスの脳で起こり行動障害を発症させたことを報告している（Ｈｓｉａｏ、１９９６）。内嗅皮質から海馬歯状回へのニューロン投射である有孔質路の変化が、記憶障害に関連することが知られている（Ｈｙｍａｎ、１９８４；Ｈｙｍａｎ、１９８６；Ｇｏｍｅｚ－Ｉｓｌａ、１９９６；ｖａｎ Ｓｔｒｉｅｎ、２００９）。そこで、発明者らは、ＡＬ０４処置が、Ｔｇ２５７６マウスの海馬および内嗅皮質におけるＡβの蓄積を減少させるかどうかを調べた。月齢９～１０ヶ月で開始して、Ｔｇ２５７６マウスは、ＰＢＳまたはＡＬ０４（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの腹腔内注射を毎週受けた。動物は、総計８回の投与を受け、９週目に屠殺された。ＡＬ０４処置は、耐容性良好であった。アミロイドβ前駆蛋白質（ＡβＰＰ）は、α－およびβ－セクレターゼにより切断される。抗体６Ｅ１０は、Ａβドメインの最初の１６残基を認識し、したがって理論的には完全長のＰＡＰＰ、Ｃ９９（β－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）消化による１５ＫＤａのＡＰＰ断片）およびＡβ（Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ、２０１２）を標識する。１１～１２月齢のＰＢＳ処置したＴｇ２５７６マウスでは、６Ｅ１０（図１６）が、海馬のＣＡ１、ＣＡ３、およびＤＧ亜領域の部分に高密度沈着（褐色）の存在を示す。また、ＰＢＳ処置した動物の内嗅皮質において、６Ｅ１０は、強く標識し、細胞外Ａβ沈着を示唆する（図１７）。対照的に、ＡＬ０４処置したＴｇ２５７６マウスの海馬の各亜領域（ＣＡ１、ＣＡ３、およびＤＧ）および内嗅皮質においてＡβ蓄積の減少が認められた（図１６および図１７）．これらの結果は、ＡＬ０４が、ヒトＡＰＰ変異体を含むＴｇ２５７６マウスの海馬および内嗅皮質においてＡβ蓄積を減少させることを示している。

【0107】

実施例１６．２：ＡＬ０４は、ＪＮＰＬ３マウスの海馬において過剰リン酸化タウを減少させる
アルツハイマー病および他の神経変性疾患において、タウは、過剰リン酸化され微小管から解離され、神経細胞体および樹状突起においてリン酸化タウ凝集および神経原線維変化形成をもたらす。これらの神経原線維変化（ＮＦＴ）は、ＡＴ８（ｐ－タウＳ２０２／Ｔ２０５）、ＡＴ１００、およびＰＨＦｌ（ｐ－タウＳ３９６／４０４）などのセリンおよびスレオニン抗体／対らせん状細線維（ＰＨＦ）上の複数のリン酸化タウにより、よく認識される（Ｌｅｗｉｓ、２０００；Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ、２００２；Ｌａｃｅ、２００９）。

【0108】

ＮＦＴ形成は、タウオパチーモデルにおける病理学的症状と密接に関連している（Ｂｒａａｋ、１９９１、１９９７；Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ、１９９７；Ｒｕｂ、２０００；Ｓａｓｓｉｎ、２０００；Ｌｅｗｉｓ、２０００； Ｌａｃｅ、２００９）。ヒトにおいて前頭側頭葉認知症を引き起こすヒト変異タウＰ３０１Ｌを発現する、ＪＮＰＬ３マウスは、早ければ４．５ヶ月にはＮＦＴを形成し、後期には進行性の運動機能低下を起こす（Ｌｅｗｉｓ、２０００）。本発明者らは、ＡＬ０４処置が、ＪＮＰＬ３マウスの海馬および内嗅皮質においてリン酸化タウのレベルを低下させることができるかどうかを調べた。月齢３～４ヶ月で開始して、ＪＮＰＬ３マウスは、６ヶ月間ＰＢＳまたはＡＬ０４（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの腹腔内注射を２週毎に受けた。動物は、総計１２回の投与を受け、２５週目に屠殺された。

【0109】

過剰リン酸化タウのレベルを低下させる概念の実証として、ＡＴ８（リン酸化タウ、Ｓ２０２／Ｔ２０５）免疫蛍光分析を、海馬のＣＡ１／ＣＡ３からＤＧの亜領域および内嗅皮質で行った。海馬および内嗅皮質、有孔質路は、記憶形成において主たる役割を果たし、タウ病変、認知症、および老化の比較的初期におこる軽度の認認識機能障害において損傷を受けやすい領域である（ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋ、１９９１；Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ、１９９７；Ｔｕｌｖｉｎｇ、１９９８；Ｂｒａａｋ、２００６；Ｌａｃｅ、２００９）。

【0110】

本発明者らは、ＰＢＳ処置した９～１０月齢の動物の海馬にリン酸化タウ（Ｓ２０２／Ｔ２０５）陽性細胞を認めた（図１８）。リン酸化タウ（Ｓ２０２／Ｔ２０５）の存在は、軸索のタウが異常にリン酸化されることを示唆し、海馬への投射における軸索機能障害が、老化によく見られる初期変化である可能性を提起する（Ｌａｃｅ、２００９）。対照的に、リン酸化タウ（Ｓ２０２／Ｔ２０５）レベルの有意な低下が、ＡＬ０４処置した９～１０月齢のマウスの海馬亜領域ＣＡ１およびＣＡ３ならびに内嗅皮質で検出された（図１８）。これらの結果は、ＡＬ０４が、ＪＮＰＬ３マウスの海馬および内嗅皮質においてＮＦＴ（過剰リン酸化タウ）を減少させ、またＣＡ１、ＣＡ３、および歯状回を含む海馬亜領域内のタウの病理学的重症度の拡大を軽減することを示唆した。

【0111】

シスタチンＣは、アルツハイマー病の発症において神経保護の役割を果たし、治療薬として臨床的な妥当性を有する（Ｌｉ、１９９６；Ｔｉｚｏｎ、２０１０）。アルツハイマー病治療薬候補としての、シスタチンＣを含む２重作用性治療（ＤＡＴ）基盤の担体および／またはＣＰＰの選択に関する調査を、図１０で要約する。ＡＬ０４構築物の４種の改変体（ＡＬ０４－１～ＡＬ０４－４と名付ける）は、Ｆｃまたは担体蛋白質としてＨＳＡ（インビボで長期存在する蛋白質としても知られている）を含み、ＣＰＰとしてｄＮＰ２（Ｌｉｍ、２０１５）またはｄＴＡＴを含み、実施例１１．１に記載されるように作成された。これらの構築物を用いることにより、蛋白質発現を、一過的なおよび安定な発現についてそれぞれＣＨＯ－Ｓ細胞またはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞のいずれかで調べた（非提示データ）。ＣＰＰとしてｄＴＡＴを有するＦｃまたはＨＳＡのいずれかを含む構築物は、ｄＮＰ２を含む同様の構築物よりも高い蛋白質発現を示した。さらに、ｄＴＡＴとのＨＳＡ融合物は、Ｆｃ融合構築物よりも一過的なおよび安定な発現の両方において発現がよいことが観察された（非提示データ）。Ｆｃ融合蛋白質がヒトＰＢＭＣから炎症性サイトカイン放出を誘導したという、好ましくない免疫細胞活性化が報告された（Ｅｄｗａｒｄｓ、２０１４）。ＣｙｓＣ－ＨＳＡ－ｄＴＡＴは、アルツハイマー病治療薬の開発におけるＤＡＴ基盤の適切な構築物であることが示唆される。ＤＡＴ基盤を、アルツハイマー病治療の治療薬候補である（バージョン１および２）７種の異なる構築物の作成に用い、それらの発現および精製の概要を、図１１に示す。７種の異なる構築物を、実施例１１．１に記載されるように作成し、それらの発現と精製工程を、検討した。ウエスタンブロットまたはクマシー染色により決定されたＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞中での一過的発現およびＭＴＸを用いる遺伝子増幅（非提示データ）を含む融合蛋白質発現のレベルは、分子量に依存した。ＡＬ０６（１４５ｋＤａ）、ＡＬ０９（１４４．５ｋＤａ）、およびＡＬ１０（１５６ｋＤａ）は、ほとんど蛋白質を発現せず、ＭＴＸ／ＤＨＦＲ遺伝子増幅法により蛋白質を産生できなかった。各融合蛋白質の品質を調べるため、蛋白質を、実施例５に記載されるように精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（非提示データ）。ＡＬ０７およびＡＬ０８蛋白質は、それらが精製の過程で分解したので、部分的に精製された（図５）。図１１は、ＡＬ０４（８０ｋＤａ）およびＡＬ１２（８８ｋＤａ）が、蛋白質の発現および精製のために好ましい構築物であることを示す。

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本明細書中に引用する参考文献はすべて、それらの全体が参照として組み入れられる。

【0112】

当業者であれば、本明細書中に具体的に記載される本発明の特定の実施態様と同等な多くの態様に気づくであろうし、あるいはまた、通常の実験以上のものを用いずとも、そのような態様を確認できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【手続補正書】

【提出日】2021-11-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022518729000001.app

【国際調査報告】