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特表2022-518807グリコシル化したＡＧ８５Ａタンパク質を含む結核予防用ワクチン組成物およびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-16
(54)【発明の名称】グリコシル化したＡＧ８５Ａタンパク質を含む結核予防用ワクチン組成物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/04 20060101AFI20220309BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220309BHJP
C07K 14/35 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20220309BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220309BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220309BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20220309BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220309BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220309BHJP
【ＦＩ】
A61K39/04
C12N15/31 ZNA
C07K14/35
C12N15/63 Z
C12N15/82 Z
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P31/06
A61P37/04
A61P43/00 107
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021543360
(86)(22)【出願日】2020-01-23
(85)【翻訳文提出日】2021-09-01
(86)【国際出願番号】 KR2020001230
(87)【国際公開番号】W WO2020159169
(87)【国際公開日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】10-2019-0010431
(32)【優先日】2019-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519142114
【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．
(71)【出願人】
【識別番号】513184264
【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コオペレイション ファウンデーション、ヨンセイ ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】518436032
【氏名又は名称】クラティス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヨン ジク
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ウン－ジュ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ソン ジェ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ホンミン
(72)【発明者】
【氏名】チョ、クァン グ
(72)【発明者】
【氏名】オ、ミョン ヨル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG31
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE02
4B064CE09
4B064DA01
4B065AA11X
4B065AA88X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA03
4B065BA30
4B065BD01
4B065BD15
4B065CA24
4B065CA45
4B065CA46
4C085AA03
4C085BA09
4C085BB11
4C085CC07
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA86
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA20
(57)【要約】
本発明は、グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含む結核予防用ワクチン組成物、前記タンパク質の製造のためのベクター、前記ベクターを用いた形質転換体、および前記形質転換体を用いてグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を生産する方法等に関し、本発明のグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含むワクチン組成物は、結核防御効果に重要なＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を同時に分泌する多機能性Ｔ細胞の増加を誘導する効果があるので、結核予防用ワクチンとして有用に用いることができ、しかも、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、タンパク質の生産に最適化したベクターを用いて植物体で効果的に発現し、高収率で分離することができるので、低コストで大量生産が可能である。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有する、結核予防用ワクチン組成物。
【請求項2】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、結核菌によって感染した肺組織損傷の抑制を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項3】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、肺で結核菌数の減少を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項4】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、ＩＦＮ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、およびＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項5】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、ＩＦＮ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、およびＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号３の塩基配列を含む、ＢｉＰシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項8】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号４の塩基配列を含む、ＨＤＥＬペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項9】
前記ベクターが、配列番号５の塩基配列を含む、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）により認識されて切断される配列をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項10】
前記ベクターが、配列番号６の塩基配列を含む、連結ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項11】
請求項６～１０のいずれかに記載のベクターで形質転換された、結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項12】
前記形質転換体が、植物体であることを特徴とする、請求項１１に記載の結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項13】
前記植物体が、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、ハクサイ、ダイコン、キャベツ、レタス、モモ、ナシ、イチゴ、スイカ、マクワウリ、キュウリ、ニンジンおよびセロリよりなる群から選ばれる１つ以上の双子葉植物；またはイネ、ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビ、エンバクおよびタマネギよりなる群から選ばれる１つ以上の単子葉植物であることを特徴とする、請求項１２に記載の結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項14】
（ａ）請求項１１に記載の形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液からグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を分離および精製する段階と、
を含む、結核予防用ワクチン組成物の生産方法。
【請求項15】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物を個体に投与する段階を含む、結核予防方法。
【請求項16】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物の結核予防用途。
【請求項17】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の、結核予防に用いられるワクチンを製造するための用途。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含む結核予防用ワクチン組成物、前記タンパク質の製造のためのベクター、前記ベクターを用いた形質転換体、および前記形質転換体を用いてグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を生産する方法等に関する。
【0002】
本出願は、２０１９年０１月２８日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－００１０４３１号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
【背景技術】
【0003】
結核は、ＷＨＯで規定した三大感染疾患の一つであり、１８８２年に微生物学者であるロベルト・コッホにより発見され、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって誘発される高い発病率と死亡率を示す致命的な病気である。全世界的に約６千万人の患者が活動性結核に感染し、毎年約５千万から約１億人が新しく結核に感染することが推定されており、少なくとも毎年９００万人以上の新しい結核患者が発生し、年間１５０万人以上が結核で死亡すると知られていた。結核の発病率は、人口１０万人当たり１４６人、結核死亡率は、人口１０万人当たり４９人であり、単一感染病の中で最も多い死亡原因を占めていて、世界的に深刻な保健問題として残っている。
【0004】
一方、上記のような結核予防のためのワクチン製造と関連して、動物タンパク質を大量生産するための医療産業界の要求は、様々な複雑なタンパク質やペプチドを生産するための混合発現系の開発である。寄主生物としては、細菌から酵母、昆虫、哺乳動物と植物細胞のような真核生物がすべて含まれる。ただし、細菌は、相対的に多量のタンパク質を生産できるが、不溶性封入体（インクルージョンボディ）を形成する場合が多く、また、翻訳後修飾工程に限界がある。他方では、真核細胞発現系は、互いに異なる翻訳後工程によって本来意図したタンパク質と同一でないタンパク質を作ることもできるが、タンパク質に糖を接合させることができ、翻訳後工程のプロセスを行うことができる。植物生産システムは、現在外来タンパク質を合成するために商業的に用いられており、植物細胞の翻訳後修飾は、動物細胞で行われるのと非常に類似していて、正確に複合タンパク質（多量体タンパク質）を生成することができる。植物由来の動物タンパク質の場合、グリコシル化（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）するアミノ酸残基は、本来のタンパク質のものと同一に起こる。しかしながら、植物細胞の分泌経路にあるＮ結合グリカンの工程は、動物発現系で生産されたものより多様な形態のグリコシル化が見られるが、糖タンパク質の活性はそのまま維持される場合が多い。
【0005】
現在、植物を用いて開発が試みられるワクチンは、病原性である場合、細菌やウイルスの粘膜感染に必須な接着機能を行うタンパク質と、細菌の毒性を示す毒素タンパク質、ウイルスの構造を成すタンパク質が抗原として主に用いられており、非病原性病気の場合、病気を引き起こす物質や原因物質を生産する主な酵素が抗原として用いられている。今までの研究結果として、植物体に由来する組換え抗原タンパク質は、動物由来のワクチンと同じ機能を有する構造を有していることが報告されていて、これを応用した多様なかつ深度の深い研究が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、グリコシル化したＡｇ８５Ａ抗原タンパク質およびグリコシル化しないＡｇ８５Ａ抗原タンパク質をマウスに免疫接種し、免疫反応および結核に対する防御効能等に対する実験を行った結果、植物細胞で発現してグリコシル化したＡｇ８５Ａの場合、グリコシル化しないＡｇ８５Ａに比べて結核防御効果に優れていることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【0007】
これより、本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有する、結核予防用ワクチン組成物を提供することにある。
【0008】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野における通常の技術者が明らかに理解できる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有する、結核予防用ワクチン組成物を提供する。
【0010】
本発明の一具現例において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、結核菌によって感染した肺組織損傷の抑制を誘導することができる。
【0011】
本発明の他の具現例において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、肺で結核菌数の減少を誘導することができる。
【0012】
本発明のさらに他の具現例において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、ＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）、ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）、およびＩＬ－２（インターロイキン－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することができる。
【0013】
本発明のさらに他の具現例において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、ＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）、ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）、およびＩＬ－２（インターロイキン－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することができる。
【0014】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；以下、ＣＢＭ３という）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0015】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号３の塩基配列を含む、ＢｉＰシグナルペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0016】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号４の塩基配列を含む、ＨＤＥＬペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0017】
本発明の一具現例において、前記ベクターは、配列番号５の塩基配列を含む、エンテロキナーゼにより認識されて切断される配列をさらに含むことができる。
【0018】
本発明の他の具現例において、前記ベクターは、配列番号６の塩基配列を含む、連結ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことができる。
【0019】
また、本発明は、前記ベクターで形質転換された結核予防用ワクチン製造用形質転換体を提供する。
【0020】
本発明の一具現例において、前記形質転換体は、植物体でありうる。
【0021】
本発明の他の具現例において、前記植物体は、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、ハクサイ、ダイコン、キャベツ、レタス、モモ、ナシ、イチゴ、スイカ、マクワウリ、キュウリ、ニンジンおよびセロリよりなる群から選ばれる１つ以上の双子葉植物；またはイネ、ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビ、エンバクおよびタマネギよりなる群から選ばれる１つ以上の単子葉植物でありうる。
【0022】
また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液からグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を分離および精製する段階と、を含む、結核予防用ワクチン組成物の生産方法を提供する。
【0023】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物を個体に投与する段階を含む、結核予防方法を提供する。
【0024】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物の結核予防用途を提供する。
【0025】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の、結核予防に用いられるワクチンを製造するための用途を提供する。
【発明の効果】
【0026】
本発明のグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含むワクチン組成物は、結核防御効果に重要なＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を同時に分泌する多機能Ｔ細胞の増加を誘導する効果があるので、結核予防用ワクチンとして有用に用いることができ、しかも、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、前記タンパク質の生産に最適化したベクターを用いて植物体で効果的に発現し、高収率で分離することができるので、低コストで大量生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明者らは、グリコシル化したＡｇ８５Ａ抗原タンパク質およびグリコシル化しないＡｇ８５Ａ抗原タンパク質をマウスに免疫接種し、免疫反応および結核に対する防御効能等に対する実験を行った結果、植物細胞で発現してグリコシル化したＡｇ８５Ａの場合、グリコシル化しないＡｇ８５Ａに比べて結核防御効果に優れていることを実験的に確認し、本発明を完成した。
【0029】
本発明の一実施例では、植物で発現するＡｇ８５Ａ発現ベクターを用いて生産されたタンパク質を分離、精製して、グリコシル化したＡｇ８５Ａを植物で生産可能であることを確認した（実施例１参照）。
【0030】
本発明の他の実施例では、植物で生産されたＡｇ８５Ａタンパク質がグリコシル化したかを確認するために、ウェスタンブロットを行い、その結果、グリカンの切断を確認して、植物発現Ａｇ８５Ａタンパク質がグリコシル化したことを確認した（実施例２参照）。
【0031】
本発明のさらに他の実施例では、結核菌を感染させたマウスを用いて肺細胞でＩＦＮ－γの分泌を測定した結果、持続的なＩＦＮ－γの分泌を確認して、グリコシル化したＡｇ８５Ａのワクチン抗原として可能性を打診した（実施例３参照）。
【0032】
本発明のさらに他の実施例では、グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の免疫原性を調査した結果、グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質で免疫したマウスの場合、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２を同時に分泌するＴ細胞の割合が増加することを確認した（実施例４参照）。
【0033】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0034】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を提供する。
【0035】
本発明において使用される用語「Ａｇ８５Ａ」は、広範囲に研究されている抗原の１つであり、タンパク質だけでなく、ＤＮＡワクチンとしても有効な効果を示していると知られている。
【0036】
本発明において使用される用語「グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、細胞（真核生物）のタンパク質翻訳後プロセスであり、Ｎ－グリコシル化とＯ－グリコシル化に分けられ、これは、付く官能基によって異なり、細胞で生成されたタンパク質にラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）等の糖が付くプロセスをあわせて「グリコシル化」という。グリコシル化プロセスで糖鎖がタンパク質に連結されると、タンパク質が「フォールディング」プロセスを経て立体的な構造物を形成し、これは、タンパク質が分解されずに、長期間維持されうる安定性を付与する。また、タンパク質に付いた糖鎖が細胞膜で細胞膜タンパク質となって抗原と同じ効果を示すことがある。上記のようにグリコシル化したタンパク質を糖タンパク質といい、代表的な糖タンパク質には、免疫反応で重要な役割をする抗体等がある。本発明に使用された配列番号１のアミノ酸配列を用いてグリコシル化有無の予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）を動作させてみた結果、２０３番目のＡｓｐａｒａｇｉｎｅ（Ｎ）でＮ－グリコシル化が起こることが予測されたが（図８参照）、これに制限されるものではなく、本発明と同等な効果を有する範囲内で変形が可能である。
【0037】
本発明の他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有する、結核予防用ワクチン組成物を提供する。
【0038】
本発明において使用される用語「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくは、ウイルス、化合物質、細菌、花粉、癌細胞、エビ等またはこれらの一部のペプチドまたはタンパク質であるが、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これに制限されない。
【0039】
本発明において使用される用語「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」とは、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であり、感染症の予防のためにヒトや動物に注射したり経口投与することによって、生体に免疫ができるようにする免疫原をいう。前記動物は、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、豚、牛、馬、犬、ヤギ 、羊等を指すが、これらに制限されない。
【0040】
本発明において使用される用語「ワクチン組成物」は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチン等を混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等を使用でき、頻用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等を使用できる。また、追加的に、従来知られている「免疫抗原補強剤（アジュバント）」をさらに含むことができる。前記アジュバントは、当該技術分野において知られているものであれば、いずれのものでも制限なく使用できるが、例えばフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバントまたは不完全アジュバントをさらに含むことで、その免疫性を増加させることができる。
【0041】
本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。
【0042】
本発明によるワクチン組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。本願に使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明のワクチン組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。
【0043】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体の状態等を考慮して選択される。特異な副作用なしに個体に免疫保護反応を誘導するのに要する量は、免疫原として使用された組換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様になりうる。一般的に、それぞれの用量は、本発明の組換えタンパク質の滅菌溶液１ｍｌ当たり０．１～１０００μｇのタンパク質、好ましくは、０．１～１００μｇを含有する。ワクチン組成物の場合には、必要に応じて初期用量に引き続いて任意に繰り返された抗原刺激を行うことができる。
【0044】
本発明において使用される用語「免疫抗原補強剤（アジュバント）」とは、一般的に抗原に対する体液および／または細胞免疫反応を増加させる任意の物質を指す。
【0045】
本発明において使用される用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明によるグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の投与によって結核を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0046】
本発明において「結核」は、眼結核、皮膚結核、副腎結核、腎臓結核、副睾丸結核、リンパ節結核、喉頭結核、中耳結核、腸結核、多剤耐性結核、肺結核、胆嚢結核、骨結核、咽喉結核、リンパ節結核、肺虚、乳房結核および脊椎結核を含み、これらに制限されない。
【0047】
本発明において「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、本発明によるグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の投与によって結核を未然に防止すること、軽減させること、または治療することを含む意味である。
【0048】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物を個体に投与する段階を含む、結核予防方法を提供する。
【0049】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有するワクチン組成物の結核予防用途を提供する。
【0050】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の、結核予防に用いられるワクチンを製造するための用途を提供する。
【0051】
本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明のグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を投与できる対象をいい、その対象には制限がない。
【0052】
本明細書において、「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明のワクチン組成物を提供することを意味する。
【0053】
本発明において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、結核菌によって感染した肺組織損傷の抑制を誘導することができる。
【0054】
本発明において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、肺で結核菌数の減少を誘導することができる。
【0055】
本発明において、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、ＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）、ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）、およびＩＬ－２（インターロイキン－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌する多機能性Ｔ細胞の増加を誘導することができ、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞でありうるが、これらに制限されるものではない。
【0056】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0057】
本発明において使用される用語「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを指すものであり、好ましくは、グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を発現できるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞へ塩基の導入および／または移入のための任意の媒介物をいい、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（レプリコン）であり得、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス等）をいう。本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および翻訳の終結を調節する配列、ターミネータ等を含むことができ、より好ましくは、タンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５′ＵＴＲ部位遺伝子等をさらに含むことができ、前記プロモーターには、一例として、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーター等が含まれ得、前記ターミネータは、一例として、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータ等であるが、前記例は、例示に過ぎず、これらに制限されない。
【0058】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号３の塩基配列を含む、ＢｉＰシグナルペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0059】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号４の塩基配列を含む、ＨＤＥＬペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクターを提供する。
【0060】
本発明において、前記ベクターは、配列番号５の塩基配列を含む、エンテロキナーゼにより認識されて切断される配列をさらに含むことができる。
【0061】
本発明において、前記ベクターは、配列番号６の塩基配列を含む、連結ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことができる。
【0062】
本発明において、前記ベクターは、ＣＢＭ３をコードする遺伝子、連結ペプチドをコードする遺伝子、エンテロキナーゼ切断部位、およびＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子が順次に連結されて構成され、前記ＣＢＭ３の３′末端には、植物細胞から小胞体に目的タンパク質をターゲッティングすることができるＢｉＰシグナルペプチドをコードする遺伝子が連結され得、前記目的タンパク質暗号化遺伝子のカルボキシル末端には、ベクターが小胞体に保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）されるようにするＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）をコードする遺伝子が連結され得るが、これらに制限されるものではない。
【0063】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質発現ベクターで形質転換された結核予防用ワクチン製造用形質転換体を提供する。
【0064】
本発明において使用される用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡによって生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であり、好ましくは、本発明の組換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは、大腸菌、サルモネラ、バチルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物等であるが、これらに制限されない。前記形質転換体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、トランスフェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法、超音波処理法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）媒介形質転換方法等の方法で製造できるが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。
【0065】
本発明において、形質転換体は、好ましくは、植物体である。植物で有用物質を生産することは、様々な長所があるが、１）生産コストを格別的に低減することができ、２）従来一般的な方法（動物細胞や微生物で合成してタンパク質を分離精製する）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、癌遺伝子、腸毒素等）を根本的に排除することができ、３）商品化段階でも動物細胞や微生物とは異なって、種子としてシードストック管理が可能であるという点から有利である。また、４）当該物質の需要が急増する場合、大量生産に要する設備技術や費用の点から、従来の動物細胞システムに比べて絶対的に有利なので、最短期間に高まった需要に応じた供給が可能であるという長所がある。このように植物体を形質転換させ、これから有用物質を生産する方法が注目を浴びる背景は、植物体のタンパク質合成経路にある。哺乳動物のタンパク質合成には、翻訳後修飾プロセスが必須であり、植物体は、真核生物タンパク質の合成経路を有しているので、哺乳動物で発現するタンパク質とほぼ類似したタンパク質を生産することができる。
【0066】
本発明において、前記植物体は、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、ハクサイ、ダイコン、キャベツ、レタス、モモ、ナシ、イチゴ、スイカ、マクワウリ、キュウリ、ニンジンおよびサラリーよりなる群から選ばれる１つ以上の双子葉植物；またはイネ、ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビ、エンバクおよびタマネギよりなる群から選ばれる１つ以上の単子葉植物でありうるが、これらに制限されるものではない。
【0067】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液からグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を分離および精製する段階と、を含む、結核予防用ワクチン組成物の生産方法を提供する。
【0068】
一方、下記表１に、本発明において用いられた配列を整理した。
【0069】
【表1】
【0070】
以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0071】
［実施例１．植物発現Ａｇ８５Ａ発現ベクターの作製およびタンパク質の分離精製］
（１－１．ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａ植物発現ベクターの作製）
植物体でＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａを発現できるように組換え植物発現ベクターを作製した。より詳しくは、ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質を小胞体に移動できるように、ＢｉＰシグナルペプチドを用いて目的タンパク質を小胞体に移動できるようにし、融合タンパク質が小胞体に蓄積され得るようにカルボキシル末端にＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）を結合し、小胞体に保持した。Ａｇ８５Ａをコードする遺伝子の前方に融合タンパク質の分離に要するＣＢＭ３と連結ペプチドをコードする配列、そしてエンテロキナーゼにより認識されて切断される配列を結合させた後、植物発現ベクターであるｐＣＡＭＢＩＡ １３００に挿入して、組換えベクターを製造した（図１参照）。
（１－１．ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａ植物発現ベクターの作製）
植物体でＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａを発現できるように組換え植物発現ベクターを作製した。より詳しくは、ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質を小胞体に移動できるように、ＢｉＰシグナルペプチドを用いて目的タンパク質を小胞体に移動できるようにし、融合タンパク質が小胞体に蓄積され得るようにカルボキシル末端にＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）を結合し、小胞体に保持した。Ａｇ８５Ａをコードする遺伝子の前方に融合タンパク質の分離に要するＣＢＭ３と連結ペプチドをコードする配列、そしてエンテロキナーゼにより認識されて切断される配列を結合させた後、植物発現ベクターであるｐＣＡＭＢＩＡ １３００に挿入して、組換えベクターを製造した（図１参照）。
【0072】
（１－２．植物発現ベクターの一過性発現）
上記の実施例１－１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４に電気穿孔法（エレクトロポレーション法）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリウムを５ｍｌのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種して、２８℃の条件で６時間振とう培養した。
上記の実施例１－１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４に電気穿孔法（エレクトロポレーション法）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリウムを５ｍｌのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種して、２８℃の条件で６時間振とう培養した。
【0073】
上記のように培養されたアグロバクテリウムは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、インフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー（１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ））に６００ｎｍの波長でＯ．Ｄ．１．０の濃度でさらに懸濁させた。アグロバクテリウム懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉の裏面に注入する方法でアグロ－インフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。
【0074】
（１－３．Ａｇ８５Ａ分離精製）
上記の実施例１－２で準備したニコチアナ・ベンサミアナ１０ｇにタンパク質抽出緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×プロテアーゼインヒビター）５０ｍＬを添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離して、タンパク質抽出液を回収した。タンパク質抽出液に水和させた微結晶セルロース１０ｇを添加した後、１時間４℃でよく混合し、ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質が微結晶セルロースに結合されるようにした。ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質が結合した微結晶セルロースは、１３，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して回収した後、５０ｍＬの洗浄緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、１０ｍＬのエンテロキナーゼ反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）にさらに懸濁させた。懸濁液にエンテロキナーゼを２０単位程度添加し、２８℃で４時間反応させた後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を通じてエンテロキナーゼとＡｇ８５Ａを含む反応液をセルロースから分離した。そして、反応液からエンテロキナーゼを除去するために、反応液にＳＴＩ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを入れ、４℃で１時間反応させた後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を通じてＳＴＩ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しない分離精製されたＡｇ８５Ａを得た。
上記の実施例１－２で準備したニコチアナ・ベンサミアナ１０ｇにタンパク質抽出緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×プロテアーゼインヒビター）５０ｍＬを添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離して、タンパク質抽出液を回収した。タンパク質抽出液に水和させた微結晶セルロース１０ｇを添加した後、１時間４℃でよく混合し、ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質が微結晶セルロースに結合されるようにした。ＣＢＭ３融合Ａｇ８５Ａタンパク質が結合した微結晶セルロースは、１３，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して回収した後、５０ｍＬの洗浄緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、１０ｍＬのエンテロキナーゼ反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）にさらに懸濁させた。懸濁液にエンテロキナーゼを２０単位程度添加し、２８℃で４時間反応させた後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を通じてエンテロキナーゼとＡｇ８５Ａを含む反応液をセルロースから分離した。そして、反応液からエンテロキナーゼを除去するために、反応液にＳＴＩ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを入れ、４℃で１時間反応させた後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を通じてＳＴＩ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しない分離精製されたＡｇ８５Ａを得た。
【0075】
［実施例２．植物発現Ａｇ８５Ａタンパク質のグリコシル化確認］
Ａｇ８５Ａのグリコシル化の有無を確認するために、Ｅｎｄｏ－Ｈ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０７０２Ｓ）とＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０７０４Ｓ）を使用した。Ｅｎｄｏ－Ｈ処理のために、分離精製されたＡｇ８５Ａタンパク質１μｇを１μＬの１０Ｘ（倍数）糖タンパク質変性（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）バッファー（５％ ＳＤＳ、４００ｍＭ ＤＴＴ）と混合し、蒸留水を満たして、最終体積を１０μＬになるように製造した。前記反応液を沸騰水で１０分間放置して変性させた後、氷の上にしばらく載置して軽く冷却した後、１０×グリコバッファー（Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ）３（５００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ６）２μＬとＥｎｄｏ－Ｈ酵素１μＬ、および７μＬの蒸留水をそれぞれ反応液に追加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＮＧａｓｅ Ｆの処理は、前記変性プロセスのＥｎｄｏ－Ｈと同じ方法で進め、１０Ｘグリコバッファー（Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ）２（５００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）２μＬと１０％ＮＰ－４０ ２μＬ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素１μＬ、および蒸留水５μＬを入れ、最終体積を２０μＬとして、同一に３７℃で１時間反応させた。反応を終えたタンパク質は、処理しないタンパク質と同時にウェスタンブロットを行い、この際、抗体は、Ａｇ８５Ａ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１９３４９９）を使用した。
Ａｇ８５Ａのグリコシル化の有無を確認するために、Ｅｎｄｏ－Ｈ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０７０２Ｓ）とＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０７０４Ｓ）を使用した。Ｅｎｄｏ－Ｈ処理のために、分離精製されたＡｇ８５Ａタンパク質１μｇを１μＬの１０Ｘ（倍数）糖タンパク質変性（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）バッファー（５％ ＳＤＳ、４００ｍＭ ＤＴＴ）と混合し、蒸留水を満たして、最終体積を１０μＬになるように製造した。前記反応液を沸騰水で１０分間放置して変性させた後、氷の上にしばらく載置して軽く冷却した後、１０×グリコバッファー（Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ）３（５００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ６）２μＬとＥｎｄｏ－Ｈ酵素１μＬ、および７μＬの蒸留水をそれぞれ反応液に追加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＮＧａｓｅ Ｆの処理は、前記変性プロセスのＥｎｄｏ－Ｈと同じ方法で進め、１０Ｘグリコバッファー（Ｇｌｙｃｏｂｕｆｆｅｒ）２（５００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）２μＬと１０％ＮＰ－４０ ２μＬ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素１μＬ、および蒸留水５μＬを入れ、最終体積を２０μＬとして、同一に３７℃で１時間反応させた。反応を終えたタンパク質は、処理しないタンパク質と同時にウェスタンブロットを行い、この際、抗体は、Ａｇ８５Ａ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１９３４９９）を使用した。
【0076】
その結果、図２に示されたように、Ｅｎｄｏ－ＨまたはＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を使用した場合、いずれも、ウェスタンブロットを行ったとき、糖鎖がないもののバンドが現れており、グリカンが切断されたことを確認した。
【0077】
［実施例３．Ｇ－Ａｇ８５Ａの結核抗原としての潜在力検証］
結核菌に感染したマウス肺細胞を用いて当該抗原が実際に結核菌の感染時に抗原として作用するか、ワクチン候補物質としての可能性があるかを調べてみるために、ＩＦＮ－γの分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）程度を調査した。まず、Ｂｅｉｊｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＨＮ８７８結核菌２００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）をエアロゾルルートでマウスに感染させ、それぞれ４週または１２週後に非感染対照群と共に、それぞれマウス６匹ずつを犠牲にして、肺細胞（５×１０５細胞）を分離し、大腸菌で生産した非グリコシル化Ａｇ８５Ａ（以下、ＮＧ－Ａｇ８５Ａという）および植物で生産したグリコシル化Ａｇ８５Ａ（以下、Ｇ－Ａｇ８５Ａという）をそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた後、反応液の上澄み液に分泌されたインターフェロン－γをＥＬＩＳＡキットで測定した。
結核菌に感染したマウス肺細胞を用いて当該抗原が実際に結核菌の感染時に抗原として作用するか、ワクチン候補物質としての可能性があるかを調べてみるために、ＩＦＮ－γの分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）程度を調査した。まず、Ｂｅｉｊｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＨＮ８７８結核菌２００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）をエアロゾルルートでマウスに感染させ、それぞれ４週または１２週後に非感染対照群と共に、それぞれマウス６匹ずつを犠牲にして、肺細胞（５×１０５細胞）を分離し、大腸菌で生産した非グリコシル化Ａｇ８５Ａ（以下、ＮＧ－Ａｇ８５Ａという）および植物で生産したグリコシル化Ａｇ８５Ａ（以下、Ｇ－Ａｇ８５Ａという）をそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた後、反応液の上澄み液に分泌されたインターフェロン－γをＥＬＩＳＡキットで測定した。
【0078】
その結果、図３に示されたように、植物発現Ａｇ８５Ａ（Ｇ－Ａｇ８５Ａ）は、結核菌感染後４週後あるいは１２週後のマウス肺細胞に作用してＩＦＮ－γを持続的に分泌すること、大腸菌発現Ａｇ８５Ａ（ＮＧ－Ａｇ８５Ａ）に比べてその量が有意なレベルに増加したことを確認した。これは、Ａｇ８５Ａが結核菌感染に対する免疫原性を有する抗原であり、ＮＧ－Ａｇ８５ＡとともにＧ－Ａｇ８５Ａのワクチン抗原として可能性が示唆された。
【0079】
［実施例４．Ｇ－Ａｇ８５Ａの免疫原性調査］
（４－１．免疫原性実験設計）
植物発現グリコシル化結核抗原Ｇ－Ａｇ８５Ａの免疫性調査のために、ＢＣＧ、ＮＧ－Ａｇ８５Ａ、およびＧ－Ａｇ８５Ａでマウスを２週間隔で３回免疫した。最終免疫接種４週（結核菌の攻撃接種２週前）後と、攻撃接種後４週、および１２週後にそれぞれマウスを犠牲にして（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、免疫反応および防御効能を調査した（図４参照）。
（４－１．免疫原性実験設計）
植物発現グリコシル化結核抗原Ｇ－Ａｇ８５Ａの免疫性調査のために、ＢＣＧ、ＮＧ－Ａｇ８５Ａ、およびＧ－Ａｇ８５Ａでマウスを２週間隔で３回免疫した。最終免疫接種４週（結核菌の攻撃接種２週前）後と、攻撃接種後４週、および１２週後にそれぞれマウスを犠牲にして（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、免疫反応および防御効能を調査した（図４参照）。
【0080】
（４－２．免疫後、抗原特異的多機能Ｔ細胞誘導）
多機能Ｔ細胞は、結核菌を防御するのに重要な宿主の構成要素の１つとして知られており、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を全部分泌するＴ細胞である。これと関連して、最終免疫接種４週後に各グループ別に６匹のマウスを屠殺して、各肺細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ）を分離し、ＮＧ－Ａｇ８５ＡまたはＧ－Ａｇ８５Ａ抗原タンパク質を５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた。反応後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、および／またはＩＬ－２を分泌するＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ－Ｔ細胞は、サイトメトリーで分析し、この際、ＣＤ４＋とＣＤ８＋に対するゲーティング結果を確認した。
多機能Ｔ細胞は、結核菌を防御するのに重要な宿主の構成要素の１つとして知られており、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を全部分泌するＴ細胞である。これと関連して、最終免疫接種４週後に各グループ別に６匹のマウスを屠殺して、各肺細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ）を分離し、ＮＧ－Ａｇ８５ＡまたはＧ－Ａｇ８５Ａ抗原タンパク質を５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた。反応後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、および／またはＩＬ－２を分泌するＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ－Ｔ細胞は、サイトメトリーで分析し、この際、ＣＤ４＋とＣＤ８＋に対するゲーティング結果を確認した。
【0081】
【0082】
（４－３．植物発現抗原Ｇ－Ａｇ８５Ａの結核防御効能）
最終免疫接種４週後にＨＮ８７８結核菌２００ＣＦＵでマウスを感染させた後、４週後および１２週後にマウスを犠牲にして、肺組織の病変を目視検査し、肺と脾臓細胞でＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を調査した。
最終免疫接種４週後にＨＮ８７８結核菌２００ＣＦＵでマウスを感染させた後、４週後および１２週後にマウスを犠牲にして、肺組織の病変を目視検査し、肺と脾臓細胞でＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を調査した。
【0083】
その結果、図６ａに示されたように、目視の所見でもＢＣＧやＮＧ－Ａｇ８５Ａ群に比べてＧ－Ａｇ８５Ａ群の肺組織の損傷程度が軽微であり、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン－エオジン）染色法による観察でも、Ｇ－Ａｇ８５Ａ群の組織損傷程度がさらに軽微であることを確認したところ、Ｇ－Ａｇ８５Ａの防御効果がさらに良好であることを確認し、特に感染後１２週後には、防御効果が目視で明確に確認されるほどの効果差異が現れることを確認した。
【0084】
また、肺と脾臓組織を破砕して培養し、菌を計数することで、ｌｏｇ１０ＣＦＵで計算し、統計分析に活用した。
【0085】
その結果、図６ｂに示されたように、感染４週後、肺では非接種群に比べてＢＣＧ、ＮＧ－Ａｇ８５Ａ、およびＧ－Ａｇ８５Ａの全部で有意なＣＦＵ減少を確認し、脾臓でも、上記３種類接種群の全部が、非接種に比べてＣＦＵ減少を示すことを確認した。感染１２週後、肺では、Ｇ－Ａｇ８５Ａ接種群が最も低いＣＦＵを示し、最も高い防御効果があることを確認し、脾臓でも、Ｇ－Ａｇ８５Ａ群がＮＧ－Ａｇ８５Ａ群に比べてさらに良好な効果を示すことを確認した。
【0086】
（４－４．感染４週後に抗原特異的多機能Ｔ細胞誘導）
マウスに結核菌を感染させ、肺組織に感染抑制のためのＴ細胞反応が定着する時点である感染４週後に、各グループ別に６匹のマウスを犠牲にして、各肺細胞（５×１０５細胞）を分離し、ＮＧ－Ａｇ８５ＡまたはＧ－Ａｇ８５Ａ抗原タンパク質を５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた。反応後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、および／またはＩＬ－２を分泌するＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ－Ｔ細胞をサイトメトリーで分析し、この際、ＣＤ４＋とＣＤ８＋に対してゲーティングした結果を確認した。
マウスに結核菌を感染させ、肺組織に感染抑制のためのＴ細胞反応が定着する時点である感染４週後に、各グループ別に６匹のマウスを犠牲にして、各肺細胞（５×１０５細胞）を分離し、ＮＧ－Ａｇ８５ＡまたはＧ－Ａｇ８５Ａ抗原タンパク質を５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１２時間反応させた。反応後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、および／またはＩＬ－２を分泌するＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ－Ｔ細胞をサイトメトリーで分析し、この際、ＣＤ４＋とＣＤ８＋に対してゲーティングした結果を確認した。
【0087】
その結果、図７ａ～図７ｃに示されたように、Ｇ－Ａｇ８５Ａ免疫した場合、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞は、ポリサイトカインの分泌比率がＮＧ－Ａｇ８５Ａグループに比べて有意なレベルに増加したことを確認し、特に結核防御効果に重要なＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２を同時に分泌するＣＤ４＋ＣＤ４４＋多機能性Ｔ細胞が有意な水準に増加したことを確認した。
【0088】
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明によるグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質は、結核予防用ワクチンとして有用に用いることができ、しかも、前記タンパク質の生産に最適化したベクターを用いて植物体で効果的に発現し、高収率で分離することができるので、低コストで大量生産が可能なものと期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を含有する、結核予防用ワクチン組成物。
【請求項2】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、結核菌によって感染した肺組織損傷の抑制を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項3】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、肺で結核菌数の減少を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項4】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、ＩＦＮ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、およびＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項5】
前記グリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質が、ＩＦＮ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、およびＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）よりなる群から選ばれた２以上のサイトカインを同時に分泌するＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の増加を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の結核予防用ワクチン組成物。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号３の塩基配列を含む、ＢｉＰシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項8】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質をコードする遺伝子と、配列番号２の塩基配列を含む、セルロース結合モジュール３（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ３；ＣＢＭ３）をコードする遺伝子と、配列番号４の塩基配列を含む、ＨＤＥＬペプチドをコードする遺伝子と、を含む、結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項9】
前記ベクターが、配列番号５の塩基配列を含む、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）により認識されて切断される配列をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項10】
前記ベクターが、配列番号６の塩基配列を含む、連結ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の結核予防用ワクチン発現ベクター。
【請求項11】
請求項６～１０のいずれかに記載のベクターで形質転換された、結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項12】
前記形質転換体が、植物体であることを特徴とする、請求項１１に記載の結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項13】
前記植物体が、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、ハクサイ、ダイコン、キャベツ、レタス、モモ、ナシ、イチゴ、スイカ、マクワウリ、キュウリ、ニンジンおよびセロリよりなる群から選ばれる１つ以上の双子葉植物；またはイネ、ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビ、エンバクおよびタマネギよりなる群から選ばれる１つ以上の単子葉植物であることを特徴とする、請求項１２に記載の結核予防用ワクチン製造用形質転換体。
【請求項14】
（ａ）請求項１１に記載の形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液からグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質を分離および精製する段階と、
を含む、結核予防用ワクチン組成物の生産方法。
【請求項15】
配列番号１のアミノ酸配列を含むグリコシル化したＡｇ８５Ａタンパク質の、結核予防に用いられるワクチンの製造のための使用。
【国際調査報告】