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特表2022-518850線維芽細胞成長因子２１変異体、その融合タンパク質とその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-16
(54)【発明の名称】線維芽細胞成長因子２１変異体、その融合タンパク質とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220309BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220309BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220309BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220309BHJP
C07K 14/50 20060101ALI20220309BHJP
C07K 14/575 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220309BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220309BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220309BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/12
C12N15/13
C07K19/00
C07K16/18
C07K14/50
C07K14/575
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021544582
(86)(22)【出願日】2019-11-22
(85)【翻訳文提出日】2021-07-30
(86)【国際出願番号】 CN2019120357
(87)【国際公開番号】W WO2020155807
(87)【国際公開日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】201910093697.4
(32)【優先日】2019-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521173351
【氏名又は名称】北京双因生物科技有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】521173362
【氏名又は名称】段海峰
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】段海峰
(72)【発明者】
【氏名】解晶
(72)【発明者】
【氏名】弓景波
(72)【発明者】
【氏名】薛冰華
(72)【発明者】
【氏名】肖秀孝
(72)【発明者】
【氏名】張群偉
(72)【発明者】
【氏名】崔美蘭
(72)【発明者】
【氏名】▲ホウ▼如梦
(72)【発明者】
【氏名】于▲テイ▼▲テイ▼
(72)【発明者】
【氏名】王瑞
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG13
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA01
4H045DA76
4H045EA23
4H045EA27
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、線維芽細胞成長因子２１変異体、その融合タンパク質とその使用を開示している。前記融合タンパク質には、線維芽細胞成長因子２１変異体、ＧＬＰ－１変異体とＦＣ配列が含まれる。本発明によって提供される融合タンパク質は、高い活性、長い半減期、新しい構造を有し、血糖、体重を有意に減少させ、脂肪代謝を改善することができる。本発明はまた、前記の融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む融合遺伝子、発現コンストラクト、宿主細胞、および前記融合タンパク質、融合遺伝子、発現コンストラクト、宿主細胞または医薬組成物の、肥満、高血脂症、糖尿病及び心血管疾患のための医薬の調製における使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変異体のアミノ酸配列が以下の一般式Ｉで示される：一般式Ｉ
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ１５ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ９４ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ１１４ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ１３０ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＸ１７６Ｓ
ここで、Ｘ１５がＡｒｇまたはＶａｌであり、
Ｘ９４がＬｅｕまたはＡｒｇであり、
Ｘ１１４がＬｅｕまたはＣｙｓであり、
Ｘ１３０がＡｌａまたはＣｙｓであり、
Ｘ１７６がＡｌａまたはＧｌｕであり、
さらに、Ｘ９４とＸ１１４の１つだけのサイトがＬｅｕであり、Ｘ１３０とＸ１７６の多くても１つのサイトがＡｌａであり、
好ましくは、前記変異体のアミノ酸配列が配列番号１～４のいずれか１つに示されることを特徴とするヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体。
【請求項2】
以下の一般式で示される融合タンパク質であって、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ、または
Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ。
ここで、Ｆは、請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体を表し、
Ｇは、ＧＬＰ－１変異体を表し、そのアミノ酸配列が配列番号５に示され、
Ｌは、リンカー配列を表し、
ＦＣは、ヒトまたは動物の免疫グロブリンとそのアイソフォおよび変異体、ヒトまたは動物アルブミンとその変異体またはＰＥＧを表すことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項3】
前記Ｌの一般式が（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎが０～５の整数であり、ＦＣは、ＩｇＧ４ ＦＣフラグメントを表し、好ましくは、前記ＦＣは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含み、
前記融合タンパク質はまた、その他の抗原、機能的アミノ酸配列および／またはシグナルペプチド配列を含み、前記機能的アミノ酸配列がヒスチジンタグまたはＧＳＴタグであり、
より好ましくは、前記融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６～９、１８または２４～２６のいずれか１つに示されることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記融合遺伝子は、請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体または請求項２または３に記載の融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含み、好ましくは、前記線維芽細胞成長因子２１の変異体のコードヌクレオチド配列が配列番号２０～２３のいずれか１つに示される。
前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列が配列番号１０～１３、１９または２７～２９のいずれか１つに示されることを特徴とする融合遺伝子。
【請求項5】
前記発現コンストラクトは、請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体または請求項２または３に記載の融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含むことを特徴とする発現コンストラクト。
【請求項6】
前記発現コンストラクトは、原核生物の発現コンストラクトまたは真核生物の発現コンストラクトであり、好ましくは、前記原核生物の発現コンストラクトがｐＥＴベクターシリーズであり、
前記真核生物の発現コンストラクトがプラスミドＤＮＡベクター、組換えウィルスベクター、またはレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項５に記載の発現コンストラクト。
【請求項7】
請求項５または６に記載の発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、前記発現コンストラクトが原核生物の発現コンストラクトである場合、前記宿主細胞は、原核生物細胞であり、好もしくは細菌細胞であり、或いは
前記発現コンストラクトが真核生物の発現コンストラクトである場合、前記宿主細胞は、真核生物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項8】
請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体または請求項２または３前記融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項9】
融合タンパク質を調製するための方法であって、請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体または請求項２または３前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程を含む方法。好ましくは、前記調製方法は、以下の工程を含む：
１）請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体或いは請求項２または３に記載の融合タンパク質の核酸配列を構築する。
２）工程１）の核酸配列を含む発現ベクターを構築する。及び
３）工程２）の発現ベクターを宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に用い、宿主細胞で前記核酸配列を発現させる。
より好ましくは、工程３）において、前記宿主細胞がＣＨＯ－Ｓ細胞である。
【請求項10】
請求項１に記載のヒト化線維芽細胞成長因子２１の変異体、または請求項２または３前記融合タンパク質、請求項４に記載の融合遺伝子、請求項５または６に記載の発現コンストラクト、請求項７に記載の宿主細胞または請求項８に記載の医薬組成物の、糖尿病、肥満、高血脂症および心血管疾患のための医薬の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明はバイオ医薬品の分野に属する。具体的には、本発明は、線維芽細胞成長因子２１変異体に関する。更具体的には、本発明はまた、線維芽細胞成長因子２１変異体、ＧＬＰ－１変異体とＦＣ配列が含まれる融合タンパク質とその使用に関する。
〔背景技術〕
現代人の長期の座りがちな生活と過剰なカロリー摂取は、肥満、非アルコール性脂肪肝と２型糖尿病の世界的な蔓延を悪化させている。エネルギー代謝におけるこれらの欠陥は、さらに深刻な心血管疾患、さらには腫瘍を引き起こす可能性がある。現在、肥満やそれに関連する合併症の効果的な治療法は限られており、副作用が少なく、エネルギー代謝の不均衡を是正できる新薬を見つけることが急務となっている。
本発明はバイオ医薬品の分野に属する。具体的には、本発明は、線維芽細胞成長因子２１変異体に関する。更具体的には、本発明はまた、線維芽細胞成長因子２１変異体、ＧＬＰ－１変異体とＦＣ配列が含まれる融合タンパク質とその使用に関する。
〔背景技術〕
現代人の長期の座りがちな生活と過剰なカロリー摂取は、肥満、非アルコール性脂肪肝と２型糖尿病の世界的な蔓延を悪化させている。エネルギー代謝におけるこれらの欠陥は、さらに深刻な心血管疾患、さらには腫瘍を引き起こす可能性がある。現在、肥満やそれに関連する合併症の効果的な治療法は限られており、副作用が少なく、エネルギー代謝の不均衡を是正できる新薬を見つけることが急務となっている。
【0002】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーに属し、重要な代謝調節因子であり、チロシンキナーゼ膜貫通受容体ファミリーのＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲｓ）及びコレセプターβ－ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）を活性化することによってエネルギーと糖脂質代謝のバランスの調節に関与している（Ｓｏｎｏｄａ Ｊ、ＣｈｅｎＭＺ、Ｂａｒｕｃｈ Ａ. Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１７、３０（２）:１～１３）。野生型のヒトＦＧＦ２１は、１８１アミノ酸を含む分泌型ポリペプチドであり、マウスのＦＧＦ２１とのアミノ酸配列相同性が８１%である。ヒトＦＧＦ２１配列のＮセグメント末端はＦＧＦＲｓと相互作用に関与し、Ｃセグメント配列はコレセプターＫＬＢへの結合に不可欠である（Ｍｉｃａｎｏｖｉｃ Ｒ、Ｒａｃｈｅｓ ＤＷ、Ｄｕｎｂａｒ ＪＤ、ら. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００９、２１９（２）: ２２７～２３４）。ＦＧＦ２１は、主にＡＭＰＫ/ＳＩＲＴ１/ＰＧＣ１αを活性化することにより、高血糖を緩和し、トリグリセリドレベルを低下させ、脂質代謝を改善する（Ｃｈａｕ ＭＤ、Ｇａｏ Ｊ、Ｙａｎｇ Ｑ、ら. Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、２０１０、１０７（２８）:１２５５３－１２５５８）。ＦＧＦ２１は、様々な代謝性疾患の治療に効果的な標的であると考えられている。例えば、組換えＦＧＦ２１タンパク質をマウスと被験者の体内に注射すると、血清グルコース、トリグリセリド、コレステロールのレベルを下げ、インスリン感受性を高め、エネルギー代謝を促進し、脂肪肝と肥満を減らすことができる。（Ｈｅｃｈｔ Ｒ、Ｌｉ ＹＳ、Ｓｕｎ Ｊら. ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１２、７（１１）:ｅ４９３４５。Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ Ａ、Ｂｅａｌｓ ＪＭ、Ｍｉｃａｎｏｖｉｃ Ｒら. ＰＬｏＳ Ｏｎｅ. ２０１３。８（３）:ｅ５８５７５）。ＦＧＦ２１は、体内での半減期は非常に短く、霊長類ではわずか０.５～２時間である。また、ＦＧＦ２１はＮ末端のＰ２およびＰ４部位でプロテアーゼＤＰＰＩＶによって血中で容易に切断され、そして線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）はＣ末端のＰ１７１部位で切断され、それによってその活性を失っている（Ｓｏｎｏｄａ Ｊ、Ｃｈｅｎ ＭＺ、Ｂａｒｕｃｈ Ａ. Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１７、３０（２）:１～１３）。これらの問題は、代謝性疾患の治療薬としてのＦＧＦ２１の開発で遭遇する大きな課題である。
【0003】
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、グルカゴンペプチドファミリーのメンバーであり、内因性のインクレチンであり、グルコースの輸送と代謝のプロセスに関与している（Ｌｅｅ Ｓ、Ｌｅｅ ＤＹ. Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１７、２２（１）：１５－２６）。人体には２つの形態のＧＬＰ－１がある。ＧＬＰ－１（７－３６）は主に膵臓組織から分泌され、ＧＬＰ－１（７－３７）は主に腸から分泌される。ＧＬＰ－１は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）を活性化することにより、下流のｃＡＭＰ依存性シグナル伝達経路を活性化する。ＧＬＰ－１受容体アゴニストも現在、２型糖尿病の治療の人気のある標的であり、ノボノルディスクのリラグルチドやイーライリリーのデュラグルチドなど、様々な薬剤が２型糖尿病の治療での臨床使用が承認されている。これらのＧＬＰ－１受容体作動薬は、体重を減らす効果もあるが、主に食欲を抑制し、摂食量を制御することによって達成され、それは患者の生活の質を低下させる。（Ｇｌａｅｓｎｅｒ Ｗ、Ｖｉｃｋ ＡＭ、Ｍｉｌｌｉｃａｎ Ｒ、ら. Ｄｉａｂｅｔｅｓ/Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０、２６（４）：２８７－２９６）。
【0004】
融合タンパク質の研究はここ数年でかなりの進歩を遂げましたが、その究極の臨床応用の輝かしい展望がますます見られている。しかし、一般的に言えば、野生型タンパク質配列に基づいて融合タンパク質を直接調製すると、その空間構造に影響を与え、その活性に影響を与える。出願番号ＣＮ２０１２８００５７８１９.０の特許出願は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２１）と、その変異体を含む対象の代謝プロファイルを改善することが知られている他の代謝調節因子を含む新しいタンパク質が開示されている。また、代謝状態を含む、ＦＧＦ２１関連疾患、ＧＬＰ－１関連疾患、およびエキセンディン－４関連疾患の治療方法も開示されている。しかしながら、その発明により得られた融合タンパク質の活性があまり高くないため、実際の臨床使用においては頻繁に投与する必要があり、臨床コンプライアンスをさらに改善する必要がある。
【0005】
したがって、より高い活性およびより良好なコンプライアンスを有するＦＧＦ２１関連疾患の治療薬が依然として必要とされている。
〔発明の概要〕
そこで、本発明の目的は、先行技術の欠点を考慮して、ＧＬＰ－１およびＦＧＦ２１活性の両方を有する融合タンパク質を提供することであり、本発明はまた、タンパク質の調製方法およびその使用を提供する。本発明によって提供されるタンパク質は、肥満、高脂血症、糖尿病、ならびに心血管および脳血管疾患を含む代謝性疾患の治療または予防に使用される。従来技術と比較して、本発明によって提供される融合タンパク質は、高い活性、長い半減期、新しい構造を有し、血糖、血中脂肪、体重を有意に減少させ、脂肪代謝を改善することができる。
〔発明の概要〕
そこで、本発明の目的は、先行技術の欠点を考慮して、ＧＬＰ－１およびＦＧＦ２１活性の両方を有する融合タンパク質を提供することであり、本発明はまた、タンパク質の調製方法およびその使用を提供する。本発明によって提供されるタンパク質は、肥満、高脂血症、糖尿病、ならびに心血管および脳血管疾患を含む代謝性疾患の治療または予防に使用される。従来技術と比較して、本発明によって提供される融合タンパク質は、高い活性、長い半減期、新しい構造を有し、血糖、血中脂肪、体重を有意に減少させ、脂肪代謝を改善することができる。
【0006】
具体的には、本発明の目的は以下の態様を提供することである。
【0007】
一態様では、本発明は、ヒト化線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）の変異体を提供し、前記変異体のアミノ酸配列が以下の一般式Ｉで示される：
一般式Ｉ
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ１５ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ９４ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ１１４ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ１３０ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＸ１７６Ｓ
ここで、Ｘ１５がＡｒｇまたはＶａｌであり、Ｘ９４がＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ１１４がＬｅｕまたはＣｙｓであり、Ｘ１３０がＡｌａまたはＣｙｓであり、Ｘ１７６がＡｌａまたはＧｌｕであり、
さらに、Ｘ９４とＸ１１４の１つだけのサイトがＬｅｕであり、Ｘ１３０とＸ１７６の多くても１つのサイトがＡｌａであり、
好ましくは、そのアミノ酸配列が配列番号１～４のいずれか１つに示される。
一般式Ｉ
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ１５ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ９４ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ１１４ＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ１３０ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＸ１７６Ｓ
ここで、Ｘ１５がＡｒｇまたはＶａｌであり、Ｘ９４がＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ１１４がＬｅｕまたはＣｙｓであり、Ｘ１３０がＡｌａまたはＣｙｓであり、Ｘ１７６がＡｌａまたはＧｌｕであり、
さらに、Ｘ９４とＸ１１４の１つだけのサイトがＬｅｕであり、Ｘ１３０とＸ１７６の多くても１つのサイトがＡｌａであり、
好ましくは、そのアミノ酸配列が配列番号１～４のいずれか１つに示される。
【0008】
別の一態様では、本発明は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質が以下の一般式で示される通りである。
【0009】
Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ、またはＧ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ。
【0010】
ここで、Ｇは、本発明のヒト化ＦＧＦ２１の変異体を表す。
【0011】
Ｇは、ＧＬＰ－１変異体（ＧＬＰ－１ｖ）を表す、そのアミノ酸配列が配列番号５に示されている。
【0012】
Ｌは、リンカー配列を表す。
【0013】
ＦＣは、ヒトまたは動物の免疫グロブリンとそのアイソフォおよび変異体、ヒトまたは動物アルブミンとその変異体またはＰＥＧを表す。
【0014】
本発明に記載の融合タンパク質によれば、前記Ｌの一般式が（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎが０～５の整数であり、好ましくは、ｎが３であり、
好ましくは、ＦＣは、ＩｇＧ４ＦＣフラグメントを表す。より好ましくは、前記ＦＣは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、ＦＣは、ＩｇＧ４ＦＣフラグメントを表す。より好ましくは、前記ＦＣは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む。
【0015】
本発明に記載の融合タンパク質によれば、前記融合タンパク質はまた、その他の抗原、機能的アミノ酸配列および／またはシグナルペプチド配列を含む。好ましくは、前記機能的アミノ酸配列がヒスチジンタグまたはＧＳＴタグである。
【0016】
好ましくは、前記融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６～９、１８または２４～２６のいずれか１つに示される通りである。
【0017】
別の一態様では、本発明は、融合遺伝子を提供し、ここで、前記融合遺伝子は本発明に記載のヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む。前記ＦＧＦ２１の変異体のコードヌクレオチド配列が配列番号２０～２３のいずれか１つに示される。
【0018】
前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列が配列番号１０～１３、１９または２７～２９のいずれか１つに示される通りである。
【0019】
別の一態様では、本発明は、発現コンストラクトを提供し、ここで、前記発現コンストラクトは、本発明に記載のヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む。
【0020】
本発明に記載の発現コンストラクトによれば、前記発現コンストラクトは、原核生物の発現コンストラクトであり、好ましくは、前記原核生物の発現コンストラクトがｐＥＴベクターシリーズである。
【0021】
または前記発現コンストラクトが真核生物の発現コンストラクトであり、好ましくは、前記真核生物の発現コンストラクトがプラスミドＤＮＡベクターであり、好ましくはｐＶＡＸ１ベクターとｐＳＶ１.０ベクターである。組換えウィルスベクターは、好ましくは組換えワクシニアウィルスベクター、組換えアデノウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウィルスベクターである。或いはレトロウイルスベクターであり、好ましくはＨＩＶウィルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
【0022】
別の一態様では、本発明は、宿主細胞を提供し、ここで、前記宿主細胞は本発明に記載の発現コンストラクトを含む。
【0023】
好ましくは、前記発現コンストラクトが原核生物の発現コンストラクトである場合、前記宿主細胞は、原核生物細胞であり、好もしくは細菌細胞であり、または前記発現コンストラクトが真核生物の発現コンストラクトである場合、前記宿主細胞は、真核生物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞である。
【0024】
別の一態様では、本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明に記載のヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質を含む。
【0025】
別の一態様では、本発明は、ヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質の調製方法を提供し、前記方法には、前記の融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程を含む。
【0026】
好ましくは、前記調製方法は、以下の工程を含む。
【0027】
１）前記ヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質の核酸配列を構築する。
【0028】
２）工程１）の核酸配列を含む発現ベクターを構築する。
【0029】
３）工程２）の発現ベクターを宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に用い、宿主細胞で前記核酸配列を発現させる。及び
４）工程３）で発現したタンパク質を精製する。
４）工程３）で発現したタンパク質を精製する。
【0030】
より好ましくは、工程３）において、前記宿主細胞がＣＨＯ－Ｓ細胞である。
【0031】
本発明はまた、前記ヒト化ＦＧＦ２１の変異体または融合タンパク質、融合遺伝子、発現コンストラクト、に記載の宿主細胞または医薬組成物の、糖尿病、肥満、高血脂症および心血管疾患のための医薬の調製における使用を提供する。
【0032】
本発明のヒト化ＦＧＦ２１の変異体（ＦＧＦ２１ｖ）Ｆｖ２、Ｆｖ３、Ｆｖ４とＦｖ５のアミノ酸配列が配列番号１、２、３と４に示される通りである。
【0033】
Ｆｖ２配列番号１
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
Ｆｖ３配列番号２
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
Ｆｖ４配列番号３
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＲＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
Ｆｖ５配列番号４
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
本発明のヒト化ＦＧＦ２１の変異体（ＦＧＦ２１ｖ）Ｆｖ２、Ｆｖ３、Ｆｖ４とＦｖ５のヌクレオチド配列が配列番号２０、２１、２２と２３に示される通りである。
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
Ｆｖ３配列番号２
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
Ｆｖ４配列番号３
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＲＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
Ｆｖ５配列番号４
ＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
本発明のヒト化ＦＧＦ２１の変異体（ＦＧＦ２１ｖ）Ｆｖ２、Ｆｖ３、Ｆｖ４とＦｖ５のヌクレオチド配列が配列番号２０、２１、２２と２３に示される通りである。
【0034】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する：
本発明の実施形態では、低密度リポタンパク質欠損マウスの正常なマウスグルコース負荷モデルを用いて、陽性対照薬としてデュラグルチドを使用して、本発明の融合タンパク質の活性を評価した。結果は、本発明の融合タンパク質が高脂血症の治療に対して良好な治療効果を有し、そしてその利点がより明白であることを示している。
〔図面の簡単な説明〕
以下、本発明の実施形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。
本発明の実施形態では、低密度リポタンパク質欠損マウスの正常なマウスグルコース負荷モデルを用いて、陽性対照薬としてデュラグルチドを使用して、本発明の融合タンパク質の活性を評価した。結果は、本発明の融合タンパク質が高脂血症の治療に対して良好な治療効果を有し、そしてその利点がより明白であることを示している。
〔図面の簡単な説明〕
以下、本発明の実施形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。
【0035】
図１：ｐｃＤＮＡ３.４－融合タンパク質のプラスミドマップ。
【0036】
図２：ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化および総ＡＭＰＫに対する野生型ＧＦタンパク質とその変異体の影響。ｃｏｎは薬物で治療されていない細胞である。*はｃｏｎと比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。**はｃｏｎと比較して非常に有意差があることを表す（ｐ値<０.００１）。##はＧＦと比較して非常に有意差があることを表す（ｐ値<０.００１）。
【0037】
図３：ＨＥＫ２９３－ＧＬＰ１Ｒ/β－ｋｌｏｔｈｏ/ＣＲＥ－ルシフェラーゼ細胞におけるルシフェラーゼの発現に対する様々なタンパク質の影響。（Ａ）様々なＧＧＦｖｎタンパク質のＥＣ５０値と対応するＧＦｖｎタンパク質の比較、ｎ＝２－５。（Ｂ）Ｇ、ＧＦｖ５とＧＧＦｖ５のＥＣ５０値の比較。
【0038】
図４：ｌｄｌｒ－/－マウス体重（Ａ）及び摂食量（Ｂ）に対するＧＦｖ５とＧＧＦｖ５の影響。*はｃｏｎ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。#はＧ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。$はＧＦｖ５と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。
【0039】
図５：ＧＦｖ５とＧＧＦｖ５対ｌｄｌｒ－/－小血脂の影響。*はｃｏｎ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。#はＧ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。$はＧＦｖ５と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明は、好ましい実施形態および実施例を通じてさらに詳細に説明される。これらの説明を通じて、本発明の特徴および利点がより明確になるであろう。
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明は、好ましい実施形態および実施例を通じてさらに詳細に説明される。これらの説明を通じて、本発明の特徴および利点がより明確になるであろう。
【0040】
ここで、の「例示的」は、「例、実施形態または例示性としての役割を果たす」である。本明細書で「例示的」として記載される任意の実施形態は、他の実施形態よりも優れている、またはより優れていると解釈される必要はない。
【0041】
特に指定のない限り、以下の実施例で使用される試薬はすべて分析グレードの試薬であり、通常のチャネルから市販されている。
【0042】
実施例１本発明の融合タンパク質の調製
前記融合タンパク質は、本発明の従来の技術的手段を使用して調製され、具体的には、以下の工程を含む。ｐｃＤＮＡ３.４－ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ., Ｌｔｄ.ら購入）を用いて融合タンパク質を含むｐｃＤＮＡ３.４プラスミドを構築し、プラスミドマップが図１に示される。該プラスミドを使用してＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞をトランスフェクトし、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｉｎｖｉｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ., Ｌｔｄ.ら購入）によりタンパク質を発現させた。
前記融合タンパク質は、本発明の従来の技術的手段を使用して調製され、具体的には、以下の工程を含む。ｐｃＤＮＡ３.４－ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ., Ｌｔｄ.ら購入）を用いて融合タンパク質を含むｐｃＤＮＡ３.４プラスミドを構築し、プラスミドマップが図１に示される。該プラスミドを使用してＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞をトランスフェクトし、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｉｎｖｉｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ., Ｌｔｄ.ら購入）によりタンパク質を発現させた。
【0043】
本発明の融合タンパク質は、以下の方法による精製後に得られ、上清を０．２２μｍのフィルター膜で濾過して細胞破片を除去した。ｐｒｏｔｅｉｎ ＡアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を５カラム容量の平衡化バッファー（５.６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１４.４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２）で処理し、次に、上清をロードし、サンプルの完了後、緩く結合した汚染物質をバッファー（５.６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１４.４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０.５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２）でベースラインまで洗浄した。次に、溶離液５０ｍＭクエン酸/クエン酸ナトリウムバッファー（０.０２％Ｔｗｅｅｎ－８０+５%マンニトールを含む、ｐＨ３.２）を使用してタンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８.０）でｐＨを７.０に調整した。精製したサンプルを０.２２μｍフィルターでろ過し、滅菌して４℃で保存した。
【0044】
具体的には、本発明の融合タンパク質は、一般式Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５を有する。そのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６～９に示されている。ヌクレオチド配列が配列番号１０～１３に示されている。
【0045】
Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２配列番号６（ここで、太字の部分はＧＬＰ－１変異体のアミノ酸配列であり、斜体の太字の部分はリンカー配列のアミノ酸配列であり、下線の部分はＦｃのアミノ酸配列である）。
【0046】
【化1】
【0047】
Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３配列番号７（ここで、太字の部分はＧＬＰ－１変異体のアミノ酸配列であり、斜体の太字の部分はリンカー配列のアミノ酸配列であり、下線の部分はＦｃのアミノ酸配列である）。
【0048】
【化2】
【0049】
Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４配列番号８（ここで、太字の部分はＧＬＰ－１変異体のアミノ酸配列であり、斜体の太字の部分はリンカー配列のアミノ酸配列であり、下線の部分はＦｃのアミノ酸配列である）。
【0050】
【化3】
【0051】
Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５配列番号９（ここで、太字の部分はＧＬＰ－１変異体のアミノ酸配列であり、斜体の太字の部分はリンカー配列のアミノ酸配列であり、下線の部分はＦｃのアミノ酸配列である）。
【0052】
【化4】
【0053】
さらに、本発明者は、野生型Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ融合タンパク質を調製し、そのアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。
【0054】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
そのヌクレオチド配列が配列番号１５に示されている。
そのヌクレオチド配列が配列番号１５に示されている。
【0055】
ここで、使用されるシグナルペプチドのヌクレオチド配列が配列番号１６に示されている。
【0056】
ＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴ
実施例２ ＨｅｐＧ２細胞のＡＭＰＫシグナル経路に対する本発明の融合タンパク質の影響
１０%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地でＨｅｐＧ２細胞（軍事医学科学院より贈与）を９０％を超えるコンフルエンシーまで培養し、細胞を消化して再懸濁し、ウェルあたり２.５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳを含む２ｍＬのＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、３７°Ｃ、５%ＣＯ２飽和湿度で７０％－８０％飽和まで一晩インキュベートした。元の培地は廃棄され、新しい予熱された無血清ＤＭＥＭ培地と交換された。６時間培養した後、１００ｎＭ精製された野生型融合タンパク質Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ（ＧＦ）と４種類の変異体Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２（ＧＦｖ２）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３（ＧＦｖ３）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４（ＧＦｖ４）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５（ＧＦｖ５）を添加し、細胞を２４時間処理した後、培養上清を捨て、細胞を消化して収集し、予冷したＰＢＳで細胞を１回洗浄し、１％ＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ溶解バッファーで（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋａｎｇｗｅｉ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ. から購入）細胞を溶解して、取引書に従って総細胞タンパク質を抽出した。１５μＬの総タンパク質を採取して、イムノブロッティングにより細胞内の総ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα抗体）とリン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）抗体）（抗体はすべてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入）の発現レベルを検出した。
実施例２ ＨｅｐＧ２細胞のＡＭＰＫシグナル経路に対する本発明の融合タンパク質の影響
１０%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地でＨｅｐＧ２細胞（軍事医学科学院より贈与）を９０％を超えるコンフルエンシーまで培養し、細胞を消化して再懸濁し、ウェルあたり２.５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳを含む２ｍＬのＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、３７°Ｃ、５%ＣＯ２飽和湿度で７０％－８０％飽和まで一晩インキュベートした。元の培地は廃棄され、新しい予熱された無血清ＤＭＥＭ培地と交換された。６時間培養した後、１００ｎＭ精製された野生型融合タンパク質Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ（ＧＦ）と４種類の変異体Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２（ＧＦｖ２）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３（ＧＦｖ３）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４（ＧＦｖ４）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５（ＧＦｖ５）を添加し、細胞を２４時間処理した後、培養上清を捨て、細胞を消化して収集し、予冷したＰＢＳで細胞を１回洗浄し、１％ＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ溶解バッファーで（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋａｎｇｗｅｉ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ. から購入）細胞を溶解して、取引書に従って総細胞タンパク質を抽出した。１５μＬの総タンパク質を採取して、イムノブロッティングにより細胞内の総ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫα抗体）とリン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）抗体）（抗体はすべてＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入）の発現レベルを検出した。
【0057】
結果を図２に示している。野生型のＧＦ融合タンパク質と４種類のＧＦ変異体で処理した後、ＨｅｐＧ２細胞のＡＭＰＫのリン酸化レベルは対照群（ｃｏｎ）よりも有意に高く（ｐＡＭＰＫ/ＡＭＰＫの比率が増加）、タンパク質がすべて活性タンパク質であることを示している。ここで、変異体ＧＦｖ３とＧＦｖ５で処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化レベルは、ＧＦタンパク質よりも有意に高く、変異後のこれら２つのタンパク質が野生型タンパク質よりも高い活性を持っていることを示している。
【0058】
実施例３ ＧＦ融合タンパク質とその変異体によるＧＬＰ１受容体とＦＧＦ２１受容体の活性化の比較
ＧＬＰ１ＲとＦＧＦ２１コレセプター（β－ｋｌｏｔｈｏ）およびＣＲＥ－ルシフェラーゼ誘導性発現システムを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＧＬＰ１Ｒ/β－ｋｌｏｔｈｏ/ＣＲＥ－ルシフェラーゼ）を、１０%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で９０％を超えるコンフルエンシーまで培養し、細胞を消化して再懸濁し、ウェルあたり４×１０４個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳを含む１００ｍＬのＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、３７°Ｃ、５%ＣＯ２飽和湿度で一晩インキュベートした。２日目に、異なる濃度勾配（０、０.００１、０.０１、０.１、１、１０、１００ｎＭ）の野生型融合タンパク質Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ（ＧＦ）と４種類の変異体Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２（ＧＦｖ２）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３（ＧＦｖ３）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４（ＧＦｖ４）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５（ＧＦｖ５）を加え、細胞を６～８時間処理した後、培養上清を廃棄し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、取引書に従って細胞を溶解し、ルシフェラーゼの発現を検出した（単一のルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｕａｎｐｉｎｇｈａｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ. から購入）。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析して、ＧＦタンパク質のＥＣ５０値を表１に示している。結果から、４つの変異体のＥＣ５０値がすべて野生型融合タンパク質ＧＦよりも低いことを示し、２つの受容体を同時に活性化するのにより効果的であることを示している。その中で、変異体ＧＦｖ５のＥＣ５０値が最も小さく、その活性が最も高いことを示している。
ＧＬＰ１ＲとＦＧＦ２１コレセプター（β－ｋｌｏｔｈｏ）およびＣＲＥ－ルシフェラーゼ誘導性発現システムを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＧＬＰ１Ｒ/β－ｋｌｏｔｈｏ/ＣＲＥ－ルシフェラーゼ）を、１０%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で９０％を超えるコンフルエンシーまで培養し、細胞を消化して再懸濁し、ウェルあたり４×１０４個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、１０％ＦＢＳを含む１００ｍＬのＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、３７°Ｃ、５%ＣＯ２飽和湿度で一晩インキュベートした。２日目に、異なる濃度勾配（０、０.００１、０.０１、０.１、１、１０、１００ｎＭ）の野生型融合タンパク質Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆ（ＧＦ）と４種類の変異体Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２（ＧＦｖ２）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３（ＧＦｖ３）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４（ＧＦｖ４）、Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５（ＧＦｖ５）を加え、細胞を６～８時間処理した後、培養上清を廃棄し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、取引書に従って細胞を溶解し、ルシフェラーゼの発現を検出した（単一のルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｕａｎｐｉｎｇｈａｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ. から購入）。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析して、ＧＦタンパク質のＥＣ５０値を表１に示している。結果から、４つの変異体のＥＣ５０値がすべて野生型融合タンパク質ＧＦよりも低いことを示し、２つの受容体を同時に活性化するのにより効果的であることを示している。その中で、変異体ＧＦｖ５のＥＣ５０値が最も小さく、その活性が最も高いことを示している。
【0059】
【表1】
【0060】
実施例４ 新しい構造のＧＧＦ融合タンパク質の発現・構築とその活性の分析
４種類のＧＦ変異体に基づいて、新しい構造融合タンパク質ＧＧＦｖ２、ＧＧＦｖ３、ＧＧＦｖ４、ＧＧＦｖ５を発現して構築する。
４種類のＧＦ変異体に基づいて、新しい構造融合タンパク質ＧＧＦｖ２、ＧＧＦｖ３、ＧＧＦｖ４、ＧＧＦｖ５を発現して構築する。
【0061】
具体的には、新しい構造の融合タンパク質は、一般式Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２（ＧＧＦｖ２）、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３（ＧＧＦｖ３）、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４（ＧＧＦｖ４）、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５（ＧＧＦｖ５）を有する。そのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４～２６と１８に示されている。ヌクレオチド配列は配列番号２７～２９と１９に示されている。
【0062】
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２アミノ酸配列は配列番号２４に示されている。
【0063】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３アミノ酸配列は配列番号２５に示されている。
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３アミノ酸配列は配列番号２５に示されている。
【0064】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４アミノ酸配列は配列番号２６に示されている。
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４アミノ酸配列は配列番号２６に示されている。
【0065】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＲＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５アミノ酸配列は配列番号１８に示されている。
Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５アミノ酸配列は配列番号１８に示されている。
【0066】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＶＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＣＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＣＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＧＳＱＧＲＳＰＳＹＥＳ
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２ヌクレオチド配列が配列番号２７に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３ヌクレオチド配列が配列番号２８に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４ヌクレオチド配列が配列番号２９に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５ヌクレオチド配列が配列番号１９に示されている。
ここで、Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ２ヌクレオチド配列が配列番号２７に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ３ヌクレオチド配列が配列番号２８に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ４ヌクレオチド配列が配列番号２９に示されている。Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｌ－Ｆｃ－Ｌ－Ｆｖ５ヌクレオチド配列が配列番号１９に示されている。
【0067】
精製された４種類のＧＧＦｖタンパク質について、ＨＥＫ２９３－ＧＬＰ１Ｒ/β－ｋｌｏｔｈｏ/ ＣＲＥ－ルシフェラーゼ細胞を用いて、ＧＬＰ１受容体とＦＧＦ２１受容体の活性化を評価した。具体的な方法は実施例３を参照する。図３Ａに示すように、４種類のＧＧＦｖタンパク質のＥＣ５０値はすべて、対応するＧＦｖタンパク質と比較して減少しており、新しい構造の融合タンパク質の活性が改善され、ＧＧＦｖ５の活性が最も改善されたことを示している。図３Ｂに示すように、ＧＧＦｖ５とＧＦｖ５のＥＣ５０値は両方とも薬物デュラグルチド（Ｇ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）より低く、ＧＧＦｖ５の値は最小であり、最も高い活性を示している。
【0068】
実施例５ 高脂血症モデルマウスにおける二機能性タンパク質の生物学的活性の検証
４～８週齢の２４匹の低密度リポタンパク質欠損マウス（Ｌｄｌｒ－/－マウス）（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.から購入）に対して、高脂肪食（６０％脂肪を含む、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｏａｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.から購入）で２週間飼育した後、高脂血症モデルマウスを作成した。マウスは、ランダムな体重に応じて４つのグループに分けられた：対照群（ｃｏｎ、生理食塩水）、Ｇ群（デュラグルチド）、ＧＦｖ５群（ＧＦｖ５タンパク質）、ＧＧＦｖ５群（ＧＧＦｖ５タンパク質）、各グループに６匹のマウスであった。各群の投与方法は皮下注射であり、投与量は週２回２０ｎｍｏｌ/ｋｇであった。毎週マウスのランダムな体重を量り、記録した。４週間の治療後、血清生化学的指標をテストした。マウスの眼球から採血し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離し、サンプルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｔｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.に送られ、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）インジケーターの検出を行った。
４～８週齢の２４匹の低密度リポタンパク質欠損マウス（Ｌｄｌｒ－/－マウス）（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.から購入）に対して、高脂肪食（６０％脂肪を含む、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｏａｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.から購入）で２週間飼育した後、高脂血症モデルマウスを作成した。マウスは、ランダムな体重に応じて４つのグループに分けられた：対照群（ｃｏｎ、生理食塩水）、Ｇ群（デュラグルチド）、ＧＦｖ５群（ＧＦｖ５タンパク質）、ＧＧＦｖ５群（ＧＧＦｖ５タンパク質）、各グループに６匹のマウスであった。各群の投与方法は皮下注射であり、投与量は週２回２０ｎｍｏｌ/ｋｇであった。毎週マウスのランダムな体重を量り、記録した。４週間の治療後、血清生化学的指標をテストした。マウスの眼球から採血し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離し、サンプルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｔｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.に送られ、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）インジケーターの検出を行った。
【0069】
図４の結果から、３種類の薬剤を４週間治療した後、マウスの体重はＧＧＦｖ５群<ＧＦｖ５群<Ｇ群の順であり、すべてはｃｏｎ群マウスの体重よりも有意に小さく、ＧＦｖ５群の体重もＧ群よりも有意に小さかった。ＧＧＦｖ５群の体重は、３週間の治療後に対照群及びＧ群と有意に異なり、４週間後のＧＦｖ５群との有意差も顕著であり、４週間の観察期間中、マウス群全体の体重は投与前の体重と比較してほとんど増加しなかった。（体重の増加率が－０.４８±２.２３％である）。治療過程でいくつかのグループのマウスの摂餌量を観察したところ、Ｇ群マウスの摂餌量がｃｏｎ群マウスよりも有意に低かったことを除けば、ＧＧＦｖ５群とＧＦｖ５群の摂餌量は対照群と有意差はなかった。これは、２群のマウスと対照群の体重差が食餌の減少によるものではなく、マウスの体重に対する薬物Ｇの効果が食餌の減少に関連している可能性が高いことを示している。これらは、高脂肪食の条件下で、ＧＦｖ５およびＧＧＦｖ５薬物がマウスの体重増加をうまく制御でき、ＧＧＦｖ５の効果がより優れていることを示している。
【0070】
図５の結果は、ｃｏｎ群のマウスと比較して、Ｇ群のマウスの血清中のトリグリセリド（ＴＧ）が大幅に減少し、ＧＦｖ５群のコレステロール（ＣＨＯＬ）とＴＧは大幅に減少し、ＧＧＦｖ５群のＣＨＯＬ、ＴＧと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ－Ｃ）は大幅に減少した。また、ＧＧＦｖ５群のＣＨＯＬ、ＴＧとＬＤＬ－ＣはすべてＧ群よりも有意に低く、ＧＧＦｖ５群のＴＧとＬＤＬ－ＣもＧＦｖ５群のマウスとは有意に異なっている。これは、高脂血症の治療におけるＧＦｖ５とＧＧＦｖ５の優れた治療効果を完全に示しており、ＧＧＦｖ５の利点はより明白である。
【0071】
本発明の特定の実施形態の上記の説明は、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の精神から逸脱しない限り、本発明に従って様々な変更または修正を行うことができる。それらは、本発明の添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】ｐｃＤＮＡ３.４－融合タンパク質のプラスミドマップ。
【図2】ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化および総ＡＭＰＫに対する野生型ＧＦタンパク質とその変異体の影響。ｃｏｎは薬物で治療されていない細胞である。*はｃｏｎと比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。**はｃｏｎと比較して非常に有意差があることを表す（ｐ値<０.００１）。##はＧＦと比較して非常に有意差があることを表す（ｐ値<０.００１）。
【図3】ＨＥＫ２９３－ＧＬＰ１Ｒ/β－ｋｌｏｔｈｏ/ＣＲＥ－ルシフェラーゼ細胞におけるルシフェラーゼの発現に対する様々なタンパク質の影響。（Ａ）様々なＧＧＦｖｎタンパク質のＥＣ５０値と対応するＧＦｖｎタンパク質の比較、ｎ＝２－５。（Ｂ）Ｇ、ＧＦｖ５とＧＧＦｖ５のＥＣ５０値の比較。
【図4】ｌｄｌｒ－/－マウス体重（Ａ）及び摂食量（Ｂ）に対するＧＦｖ５とＧＧＦｖ５の影響。*はｃｏｎ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。#はＧ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。$はＧＦｖ５と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。
【図5】ＧＦｖ５とＧＧＦｖ５対ｌｄｌｒ－/－小血脂の影響。*はｃｏｎ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。#はＧ群と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。$はＧＦｖ５と比較した有意差を表す（ｐ値<０.０５）。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】