▶ ヴァロリサシオン・アッシュエスジ・リミテッド・パートナーシップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-22
(54)【発明の名称】細胞特異的転写制御配列及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20220314BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220314BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220314BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220314BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220314BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220314BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220314BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220314BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220314BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220314BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220314BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220314BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220314BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220314BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220314BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220314BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220314BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220314BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220314BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220314BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220314BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20220314BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/86 Z
C07K16/28
C07K16/46
C07K19/00
C12N5/10
A61K35/28
A61K35/17 Z
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/00
A61P29/00
A61P37/06
A61P7/00
C12N15/63 Z
C07K14/705
C12N15/113 Z
C12P21/08
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021542490
(86)(22)【出願日】2020-01-24
(85)【翻訳文提出日】2021-09-01
(86)【国際出願番号】 CA2020050084
(87)【国際公開番号】W WO2020150832
(87)【国際公開日】2020-07-30
(31)【優先権主張番号】62/796,254
(32)【優先日】2019-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】321007081
【氏名又は名称】ヴァロリサシオン・アッシュエスジ・リミテッド・パートナーシップ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】エリー・ハッダド
(72)【発明者】
【氏名】パノジョット・ビフシャ
(72)【発明者】
【氏名】オーレリアン・コラマルティーノ
(72)【発明者】
【氏名】キャシー・ベランド
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA511
4C084ZA512
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZB311
4C084ZB312
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA51
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB31
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
最小プロモーターと、１又は複数の特定の細胞サブタイプにおいて対象核酸を発現する細胞特異的エンハンサーとを含む新規合成発現カセットを開示する。当該合成発現カセットを含むベクター及び宿主細胞もまた開示する。本願はまた、細胞において、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸等である対象核酸を発現し、また上記合成発現カセット、ベクター及び細胞を用いて例えばがん及び遺伝性疾患等である疾患又は症状を治療する方法も開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞において対象核酸を発現する合成発現カセットであって、（ｉ）最小プロモーターと、
（ｉｉ）前記細胞において前記対象核酸を発現するために前記最小プロモーターと作用可能に結合した転写エンハンサーであって、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む転写エンハンサーとを含む、合成発現カセット。
【請求項2】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１記載の合成発現カセット。
【請求項3】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２記載の合成発現カセット。
【請求項4】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１記載の合成発現カセット。
【請求項5】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４記載の合成発現カセット。
【請求項6】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５記載の合成発現カセット。
【請求項7】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１記載の合成発現カセット。
【請求項8】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７記載の合成発現カセット。
【請求項9】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８記載の合成発現カセット。
【請求項10】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１記載の合成発現カセット。
【請求項11】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０記載の合成発現カセット。
【請求項12】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１１記載の合成発現カセット。
【請求項13】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む又は前記ヌクレオチドからなる、請求項１記載の合成発現カセット。
【請求項14】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む又は前記ヌクレオチドからなる、請求項１３記載の合成発現カセット。
【請求項15】
前記転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の前記配列のいずれか１つを含む又は前記配列のいずれか１つからなる、請求項１３記載の合成発現カセット。
【請求項16】
最小プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎｉＣＭＶ）である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項17】
前記最小プロモーターが、配列番号６の配列を含む又は前記配列からなる、請求項１６記載の合成発現カセット。
【請求項18】
前記転写エンハンサーは、前記合成発現カセットにおいて前記最小プロモーターの上流にある、請求項１から１７のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項19】
ポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））シグナルをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項20】
転写終結シグナルをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項21】
最小プロモーター及び転写エンハンサーに対して作用可能に結合した前記対象核酸をさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項22】
選択マーカーをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項23】
前記細胞は幹細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項24】
前記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、組織幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２３記載の合成発現カセット。
【請求項25】
前記細胞は免疫細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項26】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、請求項２５記載の合成発現カセット。
【請求項27】
前記対象核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１から２６のいずれか一項に記載の合成発現カセット。
【請求項28】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の合成発現カセットを含む、ベクター。
【請求項29】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項２８記載のベクター。
【請求項30】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の合成発現カセット又は請求項２８もしくは２９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項31】
前記細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項32】
請求項３０又は３１に記載の前記宿主細胞を含む、組成物。
【請求項33】
細胞によって対象核酸の発現を誘導する方法であって、前記細胞内に、請求項１から２７のいずれか一項に記載の合成発現カセット又は請求項２８もしくは２９に記載のベクターを導入することを含む、方法。
【請求項34】
前記対象核酸が、前記細胞内で欠如した又は欠損したタンパク質をコードする、請求項３３記載の方法。
【請求項35】
前記対象核酸が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項36】
前記細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
対象における疾患、症状又は障害を治療する方法であって、前記対象に対して、請求項３０もしくは３１に記載の細胞又は請求項３２に記載の組成物を有効量で投与することを含む、方法。
【請求項38】
前記疾患、症状又は障害は、タンパク質の発現の欠如又は欠損タンパク質の発現に関連しており、また前記対象核酸が、前記タンパク質の機能的形態をコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項39】
前記疾患、症状又は障害は、抗原の発現と関連しており、また前記対象核酸が、前記抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする、請求項３７記載の方法。
【請求項40】
前記組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３９記載の方法。
【請求項41】
前記疾患、症状又は障害は、がん、自己免疫性もしくは炎症性の疾患、又は感染症である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項42】
前記疾患、症状又は障害は、がんである、請求項４１記載の方法。
【請求項43】
前記がんは、血液がんである、請求項４２記載の方法。
【請求項44】
前記細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記方法は、少なくとも１×１０２、１×１０３又は１×１０４個の細胞を前記対象に投与することを含む、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記方法は、１×１０６～１×１０８個の細胞を前記対象に投与することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項47】
前記細胞は、自己細胞である、請求項３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記細胞は、同種異系細胞である、請求項３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
対象における疾患、症状又は障害の治療に使用する、請求項３０もしくは３１に記載の細胞、又は請求項３２に記載の組成物。
【請求項50】
前記疾患、症状又は障害は、タンパク質の発現の欠如又は欠損タンパク質の発現に関連しており、また対象核酸が、前記タンパク質の機能的形態をコードする、請求項５０記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項51】
前記疾患、症状又は障害は、抗原の発現と関連しており、また前記対象核酸が、前記抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする、請求項５０記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項52】
前記組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項５１記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項53】
前記疾患、症状又は障害は、がん、自己免疫性もしくは炎症性の疾患、又は感染症である、請求項５１又は５２に記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項54】
前記疾患、症状又は障害は、がんである、請求項５３記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項55】
前記がんは、血液がんである、請求項５４記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項56】
前記細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、請求項４９から５５のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項57】
方法は、少なくとも１×１０２、１×１０３又は１×１０４個の細胞を前記対象に投与することを含む、請求項４９から５６のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項58】
前記方法は、１×１０６～１×１０８個の細胞を前記対象に投与することを含む、請求項５７記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項59】
前記細胞は、自己細胞である、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は組成物。
【請求項60】
前記細胞は、同種異系細胞である、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本願は、２０１９年１月２４日出願の米国仮出願シリアル番号第６２／７９６，２５４号の利益を請求し、当該出願はその全体として参照により本明細書において援用する。
本願は、２０１９年１月２４日出願の米国仮出願シリアル番号第６２／７９６，２５４号の利益を請求し、当該出願はその全体として参照により本明細書において援用する。
【0002】
本発明は、概して、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の例えば免疫細胞である特定の細胞のサブタイプにおける遺伝子の標的発現に関し、造血幹細胞（ＨＳＣ）のエンジニアリング及び当該細胞に基づく療法において用いることができる。
【背景技術】
【0003】
所与の細胞のサブタイプ又は組織に形質導入された遺伝子の標的発現は困難である。幹細胞エンジニアリング及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の研究の成長分野では、親細胞から生じる標的集団においてのみ所与のタンパク質を発現する能力が要望されている。しかしながら、従来の／天然のプロモーターを使用すると、サイズと時には特異性とについての技術的な問題に直面する。例えば近年、造血関連障害の遺伝子療法は、強プロモーターの制御下で、ＨＳＣに導入遺伝子を形質導入することに依存している１、２。このタイプのコンストラクトでは、改変した幹細胞を起源とする細胞が、細胞のサブタイプに関係なく新しい遺伝子を発現することとなり、このことは危険な結果につながる可能性がある。
【0004】
種々のがんに対する有望な新規の治療手段として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫細胞療法が出現している。ＣＡＲ免疫細胞療法では、腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現するように患者の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を操作するが、これは、当該抗原を発現する腫瘍細胞の特異的な死滅を許容する。現在この戦略は、強力であるものの通常持続しないものであって、これはインビボでのＴ細胞の枯渇及び操作したＴ細胞の喪失が理由である。さらに、大量のＣＡＲ－Ｔ細胞の注入により、サイトカインの大量放出に起因する高毒性につながり得る（サイトカイン放出症候群）。したがって、血液循環中におけるＣＡＲ改変細胞の継続的且つ進歩的な補給を許容し、また特定の細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）のみに対してＣＡＲの発現を限定するようなアプローチが要望されている。
【0005】
本明細書は、いくつかの文献を参照するものであり、当該内容は、その全体として参照により本明細書で援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国仮出願シリアル番号第６２／７９６，２５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は以下の各項を提供する：
１． 細胞において対象核酸を発現する合成発現カセットであって、
（ｉ）最小プロモーターと、
（ｉｉ）上記細胞において上記対象核酸を発現するために上記最小プロモーターと作用可能に結合した転写エンハンサーであって、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む当該転写エンハンサーとを含む、合成発現カセット。
１． 細胞において対象核酸を発現する合成発現カセットであって、
（ｉ）最小プロモーターと、
（ｉｉ）上記細胞において上記対象核酸を発現するために上記最小プロモーターと作用可能に結合した転写エンハンサーであって、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む当該転写エンハンサーとを含む、合成発現カセット。
【0008】
２． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、項１に記載の合成発現カセット。
【0009】
３． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、項２に記載の合成発現カセット。
【0010】
４． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項１に記載の合成発現カセット。
【0011】
５． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項４に記載の合成発現カセット。
【0012】
６． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項５に記載の合成発現カセット。
【0013】
７． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項１に記載の合成発現カセット。
【0014】
８． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項７に記載の合成発現カセット。
【0015】
９． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項８に記載の合成発現カセット。
【0016】
１０． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項１に記載の合成発現カセット。
【0017】
１１． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項１０に記載の合成発現カセット。
【0018】
１２． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項１１に記載の合成発現カセット。
【0019】
１３． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む又は当該ヌクレオチドからなる、項１に記載の合成発現カセット。
【0020】
１４． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つよりの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む又は当該ヌクレオチドからなる、項１３に記載の合成発現カセット。
【0021】
１５． 転写エンハンサーが、配列番号７～４７に記載の配列のいずれか１つを含む又は当該配列のいずれか１つからなる、項１３に記載の合成発現カセット。
【0022】
１６． 最小プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎｉＣＭＶ）である、項１から１５のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0023】
１７． 最小プロモーターが、配列番号６の配列を含む又は当該配列からなる、項１６に記載の合成発現カセット。
【0024】
１８． 転写エンハンサーは、合成発現カセットにおいて最小プロモーターの上流にある、項１から１７のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0025】
１９． ポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））シグナルをさらに含む、項１から１８のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0026】
２０． 転写終結シグナルをさらに含む、項１から１９のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0027】
２１． 最小プロモーター及び転写エンハンサーに対して作用可能に結合した対象核酸をさらに含む、項１から２０のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0028】
２２． 選択マーカーをさらに含む、項１から２１のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0029】
２３． 細胞は幹細胞である、項１から２２のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0030】
２４． 上記幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、組織幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項２３に記載の合成発現カセット。
【0031】
２５． 細胞は免疫細胞である、項１から２２のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0032】
２６． 免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、項２５に記載の合成発現カセット。
【0033】
２７． 対象核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、項１から２６のいずれか１つに記載の合成発現カセット。
【0034】
２８．項１から２７のいずれか１つに記載の合成発現カセットを含む、ベクター。
【0035】
２９． 上記ベクターは、ウイルスベクターである、項２８に記載のベクター。
【0036】
３０． 項１から２７のいずれか１つに記載の合成発現カセット又は項２８もしくは２９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【0037】
３１． 当該細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、項３０に記載の宿主細胞。
【0038】
３２． 項３０又は３１に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【0039】
３３． 細胞によって対象核酸の発現を誘導する方法であって、上記細胞内に、項１から２７のいずれか１つに記載の合成発現カセット又は項２８もしくは２９に記載のベクターを導入することを含む、方法。
【0040】
３４． 上記対象核酸が、上記細胞内で欠如又は欠損したタンパク質をコードする、項３３に記載の方法。
【0041】
３５． 上記対象核酸が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、項３３又は３４に記載の方法。
【0042】
３６． 当該細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、項３３から３５のいずれか１つに記載の方法。
【0043】
３７． 対象における疾患、症状又は障害を治療する方法であって、上記対象に対して、項３０もしくは３１の細胞又は項３２の組成物を有効量で投与することを含む、方法。
【0044】
３８． 上記疾患、症状又は障害は、タンパク質の発現の欠如又は欠損タンパク質の発現に関連しており、また上記対象核酸が、上記タンパク質の機能的形態をコードする、項３７に記載の方法。
【0045】
３９． 上記疾患、症状又は障害は、抗原の発現と関連しており、また対象核酸が、上記抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする、項３７に記載の方法。
【0046】
４０． 上記組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項３９に記載の方法。
【0047】
４１． 上記疾患、症状又は障害は、がん、自己免疫性もしくは炎症性の疾患、又は感染症である、項３９又は４０に記載の方法。
【0048】
４２． 上記疾患、症状又は障害は、がんである、項４１に記載の方法。
【0049】
４３． がんは、血液がんである、項４２に記載の方法。
【0050】
４４． 当該細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、項３７から４３のいずれか１つに記載の方法。
【0051】
４５． 上記方法は、少なくとも１×１０２、１×１０３又は１×１０４個の細胞を上記対象に投与することを含む、項３７から４４のいずれか１つに記載の方法。
【0052】
４６． 上記方法は、１×１０６～１×１０８個の細胞を上記対象に投与することを含む、項４５に記載の方法。
【0053】
４７． 上記細胞は、自己細胞である、項３７から４６のいずれか１つに記載の方法。
【0054】
４８． 上記細胞は、同種異系細胞である、項３７から４６のいずれか１つに記載の方法。
【0055】
４９． 対象における疾患、症状又は障害の治療に使用する、項３０もしくは３１に記載の細胞、又は項３２に記載の組成物。
【0056】
５０． 上記疾患、症状又は障害は、タンパク質の発現の欠如又は欠損タンパク質の発現に関連しており、また上記対象核酸が、上記タンパク質の機能的形態をコードする、項５０に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0057】
５１． 上記疾患、症状又は障害は、抗原の発現と関連しており、また対象核酸が、上記抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする、項５０に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0058】
５２． 上記組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項５１に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0059】
５３． 上記疾患、症状又は障害は、がん、自己免疫性もしくは炎症性の疾患、又は感染症である、項５１又は５２に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0060】
５４． 上記疾患、症状又は障害は、がんである、項５３に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0061】
５５． 上記がんは、血液がんである、項５４に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0062】
５６． 当該細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はＢ細胞である、項４９から５５のいずれか１つに記載の使用のための細胞又は組成物。
【0063】
５７． 上記方法は、少なくとも１×１０２、１×１０３又は１×１０４個の細胞を上記対象に投与することを含む、項４９から５６のいずれか１つに記載の使用のための細胞又は組成物。
【0064】
５８． 上記方法は、１×１０６～１×１０８個の細胞を上記対象に投与することを含む、項５７に記載の使用のための細胞又は組成物。
【0065】
５９． 上記細胞は、自己細胞である、項４９から５８のいずれか１つに記載の使用のための細胞又は組成物。
【0066】
６０． 上記細胞は、同種異系細胞である、項４９から５８のいずれか１つに記載の使用のための細胞又は組成物。
【0067】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面を参照しながら、単に例示として与えられる以下のその特定の実施形態の非制限的な記載を一読することでより明らかになることとなる。
【0068】
添付の図面においては以下のとおりである：
【図面の簡単な説明】
【0069】
【図1B】同上。
【図3A】図３は、Ｔ細胞特異的合成プロモーターＣｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶの制御下での、ＧＦＰの発現パターンを評価するためのインビトロ実験の結果を示す。図３Ａ： Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ－細胞）及びＫ５６２（骨髄）細胞株に、対照プロモーター下と合成Ｔ－細胞特異的プロモーター下の比較で、ＧＦＰをコードしたベクターをトランスフェクトした。
【図4】図４は、ＮＫ細胞特異的合成プロモーター（ＮＫ６、配列番号１１）の制御下での、ＧＦＰの発現パターンを評価するためのインビトロ実験の結果を示す。種々の細胞株に、対照プロモーター下と合成ＮＫ－細胞特異的プロモーター下の比較で、ＧＦＰをコードしたベクターをトランスフェクトした。
【図5】図５は、合成ＮＫ細胞特異的（ＮＫｓｐｅ－ＮＫ８、配列番号１４）プロモーター下でのＧＦＰのタイミング及び機能的発現を決定することを目指すインビトロ実験の結果を示す。ＣＤ３４＋細胞のＮＫ細胞（ＮＫ特異的培地でのＯＰ９－ＤＬ４、左側のボックス）への又はＢ細胞（ＯＰ９、右側のボックス）への成熟を許容するインビトロ分化系で、ＧＦＰは、ＮＫ細胞の子孫において早期に発現するが、Ｂ細胞では発現しないということを示したが、これはそのＮＫ細胞特異性を証明している。
【図6】図６は、Ｂ－細胞特異的プロモーター（Ｂ－ｅｎｈ－１、配列番号２３、左パネル）、又は陰性対照としての最小ＣＭＶプロモーター配列（配列番号６、右パネル）の制御下での、ＧＦＰをコードしたレンチウイルスを形質導入した場合のＮａｌｍ６細胞株（Ｂ細胞株）におけるＧＦＰの発現を示す。
【図7A】図７は、Ｃｈｒ１６－４４５のＴ細胞特異的合成プロモーターの制御下での、ＧＦＰの発現パターンを評価するためのインビボ実験の結果を示す。当該合成プロモーターのインビボでの確認は、ヒト胸腺の移植なし（図７Ａ）の又は当該移植あり（ＢＬＴモデル）（図７Ｂ）の亜致死的照射ＮＳＧマウスに、合成プロモーターの制御下でＧＦＰを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を注入することによって評価した。血液分析により、操作されたＨＳＣは、様々な免疫集団を生じることが可能であること、及びＴ細胞のみがＧＦＰタンパク質を発現することが示され、我々のプロモーターの特異性が認められる。
【図7B】同上。
【図8A】図８Ａ～Ｂは、ＮＫ細胞特異的プロモーター（ＮＫ８、配列番号１４）の制御下での、ＧＦＰで修飾したＣＤ３４＋細胞の分化を試験することを目指すインビボ実験の結果を示す。図８Ａは、血液（各左側棒グラフ）、脾臓（各中央棒グラフ）、及び骨髄（各右側棒グラフ）（２匹のヒト化マウスより得られる）においてＧＦＰを発現するヒトＣＤ４５＋細胞の百分率を示す。
【図8B】図８Ｂは、２匹のヒト化マウスの骨髄から単離したヒトＣＤ４５＋細胞におけるＧＦＰの発現を示す。ＮＫ８－細胞特異的プロモーター（配列番号１４）の制御下で、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋でマウスをヒト化した場合に、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）はＧＦＰを発現するが、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３－）又はＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９－）はＧＦＰを発現しないということを、ドットプロットが示している。
【図9】図９は、Ｂ－細胞特異的プロモーター（Ｂ－ｅｎｈ－１、配列番号２３）の制御下での、ＧＦＰで修飾したＣＤ３４＋細胞の分化を試験することを目指すインビボ実験の結果を示す。ＧＦＰ発現は、ヒト化４週後のヒト化マウスの血液中で観察した。細胞は、ｈＣＤ４５＋の発現に基づいてゲートした。Ｂ－細胞特異的プロモーター（配列番号２３、中央線）の制御下で、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋でマウスをヒト化した場合に、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）はＧＦＰを発現するが、単球（ＣＤ１４＋）はＧＦＰを発現しないということを、ドットプロットが示している。非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ、下パネル）の制御下でＧＦＰを発現するＣＤ３４＋でヒト化したマウスは、全てのヒト亜集団（ｈＣＤ４５＋）においてＧＦＰの発現を示し、一方で形質導入されていないＣＤ３４＋（陰性対照）においてはＧＦＰ発現は観察されない。ヒト化後のこの時点（４週）において、マウスの血液中にＴ細胞は存在しない。
【図10A】図１０Ａ～Ｄは、機能的ＣＡＲを発現することに関してＴ－細胞特異的プロモーターの能力を評価するための実験結果を示す。図１０Ａ：ＣＡＲ－ＣＤ３３発現を、非特異的ＳＦＦＶプロモーター又はＴ－細胞特異的プロモーターの制御下でＣＡＲ－ＣＤ３３コンストラクトを一次Ｔ細胞に形質導入した後のフローサイトメトリーで測定した。
【図10B】図１０Ｂ：２：１の比で、ＳＦＦＶ（強）プロモーター又はＴ－細胞特異的プロモーター（Ｔｓｐｅ）の制御下での、ＣＡＲ－ＣＤ３３を発現するＴ－細胞のＣＤ３３＋又はＣＤ３３－のＡＭＬ細胞に対する細胞傷害性である（有意差なし）。＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図10C】図１０Ｃ：Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５（Ｔｓｐｅ）プロモーター下で発現したＣＡＲ－ＣＤ２２が、ＳＦＦＶ（強）プロモーターの細胞傷害性と同様である、ＲＳ４；１１ ＡＬＬ－細胞株に対するＣＡＲ特異的細胞傷害性を結果的にもたらすのに十分強いＣＡＲ発現を誘導した（比は０．５：１／１：１／２：１／４：１）。
【図10D】図１０Ｄ：Ｔ－細胞特異的プロモーター（Ｃｈｒ１６－４４５）（四角）の制御下でＣＡＲ－ＧＤ２を形質導入した一次Ｔ細胞が、非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ、円）を形質導入した一次Ｔ細胞のものと同様のレベルで、ＧＤ２＋ ＮＢ細胞株（ＳＫ－Ｎ－ＤＺ）に対して細胞傷害性を誘導した。対照的に、改変していない一次Ｔ－細胞（菱形）は、標的細胞株を死滅させなかった。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。
【図11A】図１１Ａ～Ｃは、Ｔ－細胞特異的プロモーターが発現されたＴ細胞分化段階を決定することを目指すインビトロ実験の結果を示す。ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞（ＯＰ９－ＤＬ４－、図１１Ａ）への又はＢ細胞（ＯＰ９、図１１Ｂ）への成熟を許容するインビトロ分化系が、ＣＡＲは、Ｔ細胞分化プロセスの早期（ＣＤ１ａＣＤ７＋段階）に発現されるが、Ｂ細胞では発現されないことを示し、そのＴ細胞特異性が確認された。
【図11B】同上。
【図11C】図１１Ｃは、ＣＡＲ－ＣＤ２２がＴ－細胞特異的プロモーター（Ｃｈｒ１６－４４５、各中央棒グラフ）の又は非特異的強プロモーター（ＵＣＯＥ－ＳＦＦＶ、各左側棒グラフ）の制御下で発現した場合の、ＯＰ９－ＤＬ４及びＯＰ９の系で得られる様々な亜集団におけるＣＡＲ－ＣＤ２２の発現率を示す。黒い棒グラフ（左）は、陰性対照としての形質導入されていない細胞で得た結果を示す。ＤＰ：二重陽性。
【図12】図１２は、Ｔ－細胞特異的プロモーター（Ｃｈｒ１６－４４５）の制御下での、ＣＡＲ－ＣＤ２２を形質導入したＣＤ３４＋細胞の分化を試験することを目指すインビボ実験の結果を示す。ＣＡＲ－ＣＤ２２発現は、ヒト化３０週後のＢＬＴマウスの血液のｈＣＤ４５＋細胞において観察した。Ｔ－細胞特異的プロモーター（Ｃｈｒ１６－４４５）（左カラム）の制御下で、ＣＡＲ－ＣＤ２２で修飾したＣＤ３４＋でマウスをヒト化した場合に、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）はＣＡＲ－ＣＤ２２を発現するが、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）又は単球（ＣＤ１４＋）は発現しないことを、ヒストグラムプロットが示している。この発現は、ＣＤ３４＋を形質導入しない場合には観察されなかった（陰性対照、右カラム）。
【図13】実施例２における、配列の組において、高頻度の保存された転写因子結合部位及び結合部位の組み合わせの検出を許容するｏＰＯＳＳＵＭツール（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｏｓｓｕｍ．ｃｉｓｒｅｇ．ｃａ／ｏＰＯＳＳＵＭ３／、Ｋｗｏｎ ＡＴ，Ａｒｅｎｉｌｌａｓ ＤＪ，Ｗｏｒｓｌｅｙ Ｈｕｎｔ Ｒ，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＷＷ．Ｇ３．２０１２ Ｓｅｐ；２（９）：９８７－１００２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ １）を用いて、配列を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0070】
本明細書において別段に規定しない限り、本開示に関して用いる科学技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で別段に要求されない限り、単数形は複数形を含むものとし、また複数形は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の、細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関して用いる又はこれらの技術で用いる技術用語は、当技術分野で周知であり、通常用いられるものである。本開示の方法及び技術は、概して、当技術分野の従来の周知の方法に従って、また別段に示さない限り本明細書の全体にわたって引用し、議論する様々な全般的且つより詳細な参考文献に記載のとおりに、行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。あらゆる酵素反応又は精製技術は、当技術分野で通常達成されるとおりに、又は本明細書に記載のとおりに、製造元の指示に従って実施される。本明細書に記載の、分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学及び製薬化学に関してならびにこれらの実験室的な手順及び技術において用いる技術用語は、当技術分野において周知であり且つ通常用いられるものである。
【0071】
技術を記述する文脈での（特に特許請求の範囲においての）、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の語及び同様の言及の使用は、本明細書において別段に示さない限り、又は文脈で明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーするように解釈する。
【0072】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の語は、別段に記載しない限り、オープンエンドの語として解釈する（すなわち、「～を含むが、これに限定されない」ことを意味する）。
【0073】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別段に記載しない限り、その範囲に当てはまる個々の値それぞれに対して別個に言及する簡略的な方法として機能することを単に意図しており、また個々の値のそれぞれは、本明細書においてあたかも個々に記載されているようにその記載の中に盛り込まれている。その範囲内の値の全てのサブセットもまた、それらが本明細書においてあたかも個々に記載されているようにその記載の中に盛り込まれている。
【0074】
本明細書で提供する、いずれの例及び全ての例、又は例示的な文言（「例えば」、「例えば～等」）の使用は、単に技術をより良好に説明することを意図しており、別段に請求しない限り、本願発明の範囲に対する限定となるものではない。
【0075】
本明細書においては、いずれの文言も、本願発明の手続きに対して不可欠であるとして、請求されていないあらゆる構成要素を示しているとして解釈されるべきでない。
【0076】
本明細書においては、「約」の語は、その通常の意味を有する。「約」の語は、ある値が、その値を決定するために用いるデバイスもしくは方法についての本来の誤差の変動を含むことを示すために、又は例えば記載した値（又は値の範囲）の１０％の範囲内である記載の値に近い値を包含するために、用いる。
【0077】
本発明者は、ある細胞のサブタイプに特異的な手法で、対象遺伝子の発現を標的とする特異的な合成制御因子を設計することによって、従来のプロモーターの使用の代替となる戦略を開発した。この合成制御因子の制御下であるように形質導入された遺伝子を操作することと、このコンストラクトを幹細胞に形質導入することとによって、これら遺伝子的に改変された幹細胞に由来する特異的且つ標的のある細胞サブタイプ（又は細胞サブタイプ）において排他的に遺伝子発現を司ることが可能となったものであり、これは実際の方法を有意に改善する。いくつかの細胞特異的転写エンハンサーの候補が同定された。概念実証として、ヒトＴ細胞集団において特異的に導入遺伝子の発現を誘導したＴ細胞特異的転写エンハンサーの候補を含む第１の「合成制御因子」を設計したが、同様の方法論は、他の細胞特異的プロモーター、特に２種のヒトＮＫ細胞特異的プロモーターと１種のＢ細胞特異的プロモーターとを設計するためにうまく適用された。設計したヒトＴ／ＮＫ／Ｂ細胞特異的プロモーターは、サイズが小さくなったものであり、良好な特異性を示すことから、ヒト遺伝子療法及びＨＳＣエンジニアリングでの使用に受け入れられる。
【0078】
合成発現カセット
したがって、第１の態様においては、本開示は、細胞において対象核酸（例えば、遺伝子、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を発現するための合成発現カセットであって、最小プロモーターと、上記細胞における対象核酸の発現のために上記最小プロモーターと作用可能に結合した転写エンハンサーとを含むものであり、当該転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つよりの、少なくとも５０個の連続した／隣接したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、１５０、２００又は２５０個の連続した／隣接したヌクレオチドと、少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むものである、当該合成発現カセットを提供する。
したがって、第１の態様においては、本開示は、細胞において対象核酸（例えば、遺伝子、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を発現するための合成発現カセットであって、最小プロモーターと、上記細胞における対象核酸の発現のために上記最小プロモーターと作用可能に結合した転写エンハンサーとを含むものであり、当該転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つよりの、少なくとも５０個の連続した／隣接したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、１５０、２００又は２５０個の連続した／隣接したヌクレオチドと、少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むものである、当該合成発現カセットを提供する。
【0079】
「エンハンサー」又は「転写エンハンサー」又は「転写制御因子」の語は、転写因子又は転写活性化因子のための１又は複数の結合部位を含み、また配向依存的且つ位置依存的な手法で、プロモーター（例えば、最小プロモーター）の活性を増加させる、シス作用性配列を指す。転写エンハンサーは、最小プロモーターの上流又は下流に位置し得る。ある実施形態においては、転写エンハンサーは、プロモーターの上流に位置する。
【0080】
ある実施形態においては、転写エンハンサーは、ある細胞型又はサブタイプに特異的な転写エンハンサーであり、すなわち当該転写エンハンサーが、ある特定の細胞型又はサブタイプにおいて、プロモーターの活性（及び対象とするペプチド／タンパク質、又は核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ）の発現もまた）を特異的に増加させる。本明細書で用いる場合、「特異的に増加する」の語は、標的の細胞型又はサブタイプにおける最小プロモーターの活性についての増加が、他の細胞型又はサブタイプにおける増加よりも大きいことを意味する。実施形態においては、転写エンハンサーは、免疫細胞特異的な転写エンハンサーであり、すなわちそれは、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、好中球等である１又は複数の免疫細胞型において、プロモーターの活性を特異的に増加させる。ある実施形態においては、免疫細胞特異的転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つよりの、少なくとも５０個の連続した／隣接したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、１５０、２００又は２５０個の連続した／隣接したヌクレオチドと、少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、また転写増強活性を維持する（すなわち、天然配列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同様又は天然配列よりも良好である転写増強活性を呈する）。ある実施形態においては、免疫細胞特異的転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、また転写増強活性を維持する（すなわち、天然配列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同様又は天然配列よりも良好である転写増強活性を呈する）。
【0081】
さらなる実施形態においては、免疫細胞特異的転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つよりの、少なくとも５０個の連続した／隣接したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、１５０、２００又は２５０個の連続した／隣接したヌクレオチドと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。さらなる実施形態においては、免疫細胞特異的転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0082】
さらなる実施形態においては、免疫細胞特異的転写エンハンサーは、配列番号７～４７に、好ましくは配列番号７～１７及び２３に記載の配列のうちの１つよりの、少なくとも５０個の連続した／隣接したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、１５０、２００又は２５０個の連続した／隣接した残基、を含む又はこれらからなる。
【0083】
配列番号７～４７に記載の配列の一部は、反復のドメイン／モチーフを含む。例えば、配列番号７に記載の配列は、約５０個のヌクレオチドの反復のドメイン／モチーフ（配列：ＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＸ１ＣＴＸ２ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＸ３（配列番号６３）を含み、ここでＸ１はＧ又はＡ、好ましくはＧであり、Ｘ２はＧ又はＣ、好ましくはＧであり、またＸ３はＣ又はＴ、好ましくはＣである。ある実施形態においては、細胞特異的な転写エンハンサーは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８個の反復ドメイン／モチーフを含む。配列番号７～４７に記載の配列のそれぞれに存在する推定反復モチーフの一覧を表ＩＶに示している（配列番号６４～８２、及びＡＡＡＣＣＡＣＡ）。すなわち、ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は、表ＩＶに示すモチーフ（配列番号６４～８２、及びＡＡＡＣＣＡＣＡ）のうちの１又は複数を含む。例えば、配列番号８は、表ＩＶに示すモチーフ＃３（配列番号６６）、＃４（配列番号６７）、＃１７（配列番号８０）、及び２０（ＡＡＡＣＣＡＣＡ）のうちの１又は複数を含む。さらなる実施形態においては、転写エンハンサー配列は、配列番号７～４７のそれぞれについて、表ＩＶに示すモチーフ及び反復を含む。
【0084】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、Ｔ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号７～１０、１３、１４、１８～２２、２４～３１、３３～４３、４５及び４７、好ましくは配列番号７～１０、１３、１４に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。さらなる実施形態においては、合成発現カセットは、Ｔ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号７、９、２７、３３、３４、３６、３７、４２、４３及び４５、好ましくは配列番号７及び９に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。ある実施形態においては、細胞はＣＤ４＋細胞であり、また転写エンハンサーは、配列番号２２、３４、３７、３８、４３、４５及び４７に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0085】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、ＮＫ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号８、１０～１４、１８～２２、２４～２６、２８～３１、３５、３８～４１、４４及び４７、好ましくは配列番号１１、１２及び１４に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0086】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、ＮＫ細胞及びＴ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号８、１０、１３、１４、１８～２１、２２、２４～２６、２８～３１、３５、３８、３９～４１及び４７、好ましくは配列番号８、１０、１３及び１４に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0087】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、Ｂ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号１５～１７、２３、３２、４４及び４６、好ましくは配列番号１５～１７及び２３、またより好ましくは配列番号２３に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0088】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、Ｂ細胞及びＮＫ細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号４４に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0089】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞、好塩基球、及び単球／マクロファージ等の免疫細胞において対象核酸を発現するためのものであり、また転写エンハンサーは、配列番号１４に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0090】
ある実施形態においては、細胞はＣＤ４＋細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞）であり、また転写エンハンサーは、配列番号２２、３４、３７、３８、４３、４５及び４７に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0091】
別の実施形態においては、細胞はＣＤ８＋細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）であり、また転写エンハンサーは、配列番号３３、３５及び３９～４１に記載の配列のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む又は当該配列からなる。
【0092】
ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は、転写制御因子のための１又は複数の結合部位を含む。ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は、少なくとも２つの転写制御因子のための結合部位を含む。ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は、少なくとも３つの転写制御因子のための結合部位を含む。ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は、少なくとも４つの転写制御因子のための結合部位を含む。例えば、配列番号１３に記載の配列は、転写因子ＲＵＮＸ３、ＧＡＴＡ２、ＦＯＳ及びＪＵＮのための結合部位を含み、すなわちある実施形態においては、細胞特異的転写エンハンサーの配列は、これら結合部位のうちの１、２、３又は全てを含む。配列番号７～４７に記載の配列のそれぞれにおける転写因子のための推定結合部位を表Ｖに示す。すなわち、ある実施形態においては、転写エンハンサー配列は表Ｖに示す転写因子のための結合部位のうちの１又は複数を含む。
【0093】
「最小プロモーター」の語は、プロモーターの最小要素だけ、すなわちＴＡＴＡボックス（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ－Ｈｏｇｎｅｓｓボックスとも呼ばれる）及び転写開始点を含むプロモーターを指し、そしてそれはプロモーター活性を増強する適切に配置された（通常、上流）１又は複数の制御因子（転写エンハンサー）が存在しない状態で遺伝子発現を誘導／駆動する際に不活性（又は活性が乏しい）である。当業者にとって公知である任意の最小プロモーター配列は、本開示の最小プロモーター配列に包含することを想定している。最小プロモーター配列はしばしば、ウイルスに由来するか又は切断型の真核生物プロモーターであり、すなわち最小プロモーターは、プロオピオメラノコルチン最小プロモーター（ＰＯＭＣ）、アデノウイルス最小プロモーター、バキュロウイルス最小プロモーター、ＣＭＶ最小プロモーター、パルボウイルス最小プロモーター、ヘルペスウイルス最小プロモーター、ポックスウイルス最小プロモーター、アデノ関連ウイルス最小プロモーター、セムリキ森林ウイルス最小プロモーター、ＳＶ４０最小プロモーター、ワクシニアウイルス最小プロモーター、又はレトロウイルス最小プロモーターであり得る。最小プロモーターの例としては、ヒトシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ又はｍｉｎｉＴＫ）最小プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ最小プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎｉＣＭＶ）、ＣＭＶ５３（上流のＧＣボックスを付加したｍｉｎＣＭＶ）、サルウイルス４０最小プロモーター（ｍｉｎＳＶ４０）、ＭＬＰ（アデノウイルス後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の－３８から＋６の領域）、ｍｉｎＰ（ＴＡＴＡボックス及び転写開始点から構成される合成最小プロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａ社より）、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５（ヒトｊｕｎＢ遺伝子由来の最小プロモーター）、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、及びスーパーコアプロモーター１（ＳＣＰ１）最小プロモーターが挙げられる（以下の表Ｉを参照）。いくつかの最小プロモーター（「コアプロモーター」と呼ばれることもある）は、Ｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｙ ２０；５（５）：３９５－４０４に記載されている。
【0094】
【表1】
【0095】
２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性は、整列した配列においてそれぞれの位置を比較することによって決定され得る。ヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、当該配列が共有している位置において一致するヌクレオチドの数の関数である。本明細書で用いる場合、配列間における所与の一致率は、最適に整列された配列での配列同一性の度合いを示す。同一性の比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎのｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４等の、種々のアルゴリズム及び配列アラインメント手段、ならびにこれらアルゴリズムのコンピュータを用いた実施（例えば、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐによる、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等）を用いて実行され得る。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズム（公開されている初期設定を用いる）を用いて決定してもよい。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェア／手段は、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して利用可能であり得る。例えばＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ及びＫａｌｉｇｎ等の他の配列アライメント手段が、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）を通して利用可能である。
【0096】
「作用可能に配置する」、「作用可能に連結する」及び「作用可能に結合する」の語は、プロモーター（及び／又はエンハンサー）が、核酸配列に対して、その核酸の転写開始と発現とを制御するように正確な機能的な位置及び配向にあることを意味する。エンハンサーは、プロモーターの転写活性を増加させるために正確な機能的な位置及び配向にあるときに、プロモーター（例えば、最小プロモーター）に対して「作用可能に結合」している。
【0097】
「合成」の語は、発現カセットが、天然に存在しない人工の又は組換えのコンストラクトであること、すなわち、最小プロモーターと転写エンハンサーとの組合せが、細胞の天然のゲノム内に天然に存在しないことを意味する。ある実施形態においては、最小プロモーターは、転写エンハンサーがあることで異種性であり、すなわち最小プロモーターは、その天然環境において転写エンハンサーと通常結合しないものであり、例えばそれらは、細胞の天然のゲノム内において当該遺伝子の発現を制御しない。ある実施形態においては、最小プロモーター及び転写エンハンサーは、異なる細胞型又は異なる有機体（例えば、ウイルスに対して真核細胞）よりのものである。ある実施形態においては、最小プロモーター及び／又は転写エンハンサーは、対象核酸があることで異種性であり、すなわちそれらは、その天然環境において対象核酸と通常結合しない。ある実施形態においては、転写エンハンサーは、ヒト起源のものである。ある実施形態においては、最小プロモーターは、ウイルス起源のものである。
【0098】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、ポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））シグナルをさらに含む。ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルは、対象核酸の適切なポリアデニル化（転写）を生じる。ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの性質は、本発明の実施の成功に極めて重要なものであると思われるものではなく、それゆえに任意のそのような配列を採用してもよい。代表的なｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの例としては、種々の標的細胞において良好に機能するのに都合がよい及び／又はそれがわかっている、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）シグナル及び／又はウシ成長ホルモンｐｏｌｙ（Ａ）シグナルが挙げられる。ある実施形態においては、合成発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後制御因子（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）をさらに含む。こうした因子は、通常、ウイルスベクターにより生じる遺伝子の発現を増加させるために用いられ、ｍＲＮＡ安定性とタンパク質収量を増加させることがわかっている（例えば、Ｌｅｅ，ＹＢ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（１）：３３－７参照）。ある実施形態においては、ＷＰＲＥを、ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルと組み合わせて用いる。別の実施形態においては、ＷＰＲＥが、ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルに替わる。
【0099】
ある実施形態においては、合成発現カセットは、転写終結シグナルをさらに含む。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。すなわち、ある実施形態においては、ＲＮＡ転写の産生を終了する終結シグナルを想定している。
【0100】
ある実施形態においては、合成発現カセットは対象核酸をさらに含む。「対象核酸」又は「対象遺伝子」の語は、対象とする機能的なペプチド又はポリペプチド（タンパク質）（天然の又は修飾されたペプチド／たんぱく質）をコードする核酸を指すために用いる。ある実施形態においては、機能的なペプチド又はポリペプチドは、治療用のペプチド又はポリペプチドであり、すなわち疾患を治療又は予防する目的で対象に投与することが可能であるペプチド又はポリペプチドである。当業者に公知である対象とするペプチド又はポリペプチドをコードする任意の核酸を、合成発現カセットに包含することを想定している。対象とするペプチド又はポリペプチドには、酵素、シグナル伝達分子（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、受容体、成長因子（例えば、サイトカイン）、走化性タンパク質（例えば、ケモカイン）、構造タンパク質（細胞骨格タンパク質）、転写制御因子、細胞接着タンパク質、その抗体又は抗原結合性フラグメント等があり得る。ペプチド又はポリペプチドは、天然に生じる、ペプチド又はポリペプチド、そのフラグメント又はバリアント、そのキメラバージョン等があり得る。
【0101】
ある実施形態においては、対象核酸は、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の組換え受容体をコードする。こうしたＣＡＲは、典型的には、一部の態様ではリンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して、一次活性化シグナルを提供する例えばＴ細胞又はＮＫ細胞活性化ドメイン等である細胞内活性化ドメイン部分に連結した所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する特異性を提供するリガンド結合性ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）等である抗体又は抗体フラグメント）を含む。
【0102】
特定の実施形態においては、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、例えば免疫細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）における一次活性化シグナルを誘導することができる活性化細胞質（細胞内）ドメイン等である活性化細胞質シグナル伝達ドメイン（区別なく、細胞内シグナル伝達領域とも呼ぶ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分の細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞質シグナル伝達ドメイン又はその機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）を含み、ならびに／又は免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0103】
一部の実施形態においては、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、リガンド（例えば、抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合性ドメインをさらに含む。一部の実施形態においては、例えば抗原等であるリガンドは、細胞表面上で発現したタンパク質である。一部の実施形態においては、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、また抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の文脈において細胞表面上で認識される、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原等である処理されたペプチド抗原である。
【0104】
例示的な組換え受容体は、ＣＡＲ及び組換えＴＣＲのみならずエンジニアリング及び細胞に受容体を導入するための方法を含めて、例えば国際特許出願の公開公報の番号、国際公開第２０００／１４２５７号、国際公開第２０１３／１２６７２６号、国際公開第２０１２／１２９５１４号、国際公開第２０１４／０３１６８７号、国際公開第２０１３／１６６３２１号、国際公開第２０１３／０７１１５４号、国際公開第２０１３／１２３０６１号、米国特許出願の公開公報の番号、ＵＳ２００２／１３１９６０号、ＵＳ２０１３／２８７７４８号、ＵＳ２０１３／０１４９３３７号、米国特許の番号：第６，４５１，９９５号、第７，４４６，１９０号、第８，２５２，５９２号、第８，３３９，６４５号、第８，３９８，２８２号、第７，４４６，１７９号、第６，４１０，３１９号、第７，０７０，９９５号、第７，２６５，２０９号、第７，３５４，７６２号、第７，４４６，１９１号、第８，３２４，３５３号、及び第８，４７９，１１８号、及び欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６号に記載されたもの、ならびに／又は、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３ Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８－３９８；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ；２４（５）：６３３－３９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２ Ｍａｒｃｈ １８（２）：１６０－７５に記載されたものが挙げられる。一部の実施形態においては、遺伝子的に操作された抗原受容体としては、米国特許第７，４４６，１９０号に記載のＣＡＲ、及び国際特許出願の公開公報である国際公開第２０１４／０５５６６８号に記載のものが挙げられる。
【0105】
一部の実施形態においては、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）は、例えば１もしくは複数の抗原結合性フラグメント、ドメインもしくは部分、又は１もしくは複数の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子等である、抗原（又はリガンド）に結合する（特異的に結合する）、当該組換え受容体の細胞外部分内の抗原結合性ドメイン又はリガンド結合性ドメインを含む。一部の実施形態においては、ＣＡＲは、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）等である、抗体分子の抗原結合性部分を含む。本明細書の「抗体」の語は、広義の意味で用いられ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、フラグメント抗原結合性（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）フラグメント、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（ＶＨ）領域、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む単鎖抗体フラグメント、ならびに単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）のフラグメント、を含むインタクトな抗体及び機能的（抗原結合性）抗体フラグメントを含む。当該語は、例えば細胞内抗体、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体等である免疫グロブリンの、ならびにヘテロコンジュゲート抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、例えば二重特異性である多特異性の抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖの、遺伝子的に操作された及び／又は他の方法で修飾された形態を包含する。別段に記載しない限り、「抗体」の語は、その機能的な抗体フラグメントを包含するように理解されたい。当該語はまた、ＩｇＧ及びそのサブクラスＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＤを含む任意のクラス又はサブクラスの抗体を含む、インタクトな又は全長の抗体を包含する。
【0106】
一部の実施形態においては、抗原結合性のタンパク質、抗体及びその抗原結合性フラグメントは、全長抗体の抗原を特異的に認識する。一部の実施形態においては、抗体の重鎖及び軽鎖は、全長であり得るか、又は抗原結合性部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））であり得る。他の実施形態においては、抗体の重鎖定常領域は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥより選択され、特に例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４より選択され、より詳細にはＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）である。別の実施形態においては、抗体の軽鎖定常領域は、例えばカッパ又はラムダから選択され、特にカッパである。
【0107】
「可変領域」又は「可変ドメイン」の語は、抗体が抗原に結合する際に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、概して、同様の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つのＣＤＲとを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照）。ＶＨ又はＶＬの単一ドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原を結合する抗体は、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨのドメインのライブラリをスクリーニングするように抗原に結合する抗体から、ＶＬ又はＶＨのドメインを用いて単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
【0108】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態においては、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。
【0109】
抗体フラグメントは、種々の技術によって作製することができ、インタクトな抗体のタンパク質消化のみならず組換え宿主細胞による産生が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態においては、抗体は、例えばペプチドリンカーである合成リンカーにより連結した２以上の抗体領域もしくは抗体鎖を備えるもの等である、例えば天然に生じない、及び／又は天然に生じるインタクトな抗体の酵素消化によっては産生され得ない、配列を含むフラグメント等である組換えにより産生したフラグメントである。一部の実施形態においては、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。
【0110】
「ヒト化」抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、また全て又は実質的に全てのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来するものである抗体である。ヒト化抗体は、随意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいていてもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持しつつ、典型的にはヒトに対する免疫原性が低下するようにヒト化を行った非ヒト抗体のバリアントを指す。一部の実施形態においては、ヒト化抗体内の一部のＦＲ残基は、例えば抗体の特異性又は親和性を保持又は向上するように、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基がそれより生じる抗体）からの対応する残基で置換されている。
【0111】
一部の実施形態においては、ＣＡＲは、細胞表面において発現した、例えばインタクトな抗原等である抗原を特異的に認識する、抗体又は抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。
【0112】
一部の実施形態においては、ＣＡＲは、ＭＨＣ－ペプチド複合体として細胞表面上に存在する、例えば腫瘍関連抗原等である細胞内抗原を特異的に認識する、例えば抗体又は抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）等であるＴＣＲ様抗体を含む。一部の実施形態においては、ＭＨＣ－ペプチド複合体を認識する抗体又はその抗原結合性部分は、例えば抗原受容体等である組換え受容体の一部として細胞上で発現することが可能である。抗原受容体の中には、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の機能的な非ＴＣＲ抗原受容体がある。概して、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して向けられるＴＣＲ様特異性を呈する抗体又は抗原結合性フラグメントを含むＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲとも呼ばれ得る。
【0113】
一部の実施形態においては、組換え受容体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は天然に生じるＴ細胞からクローン化されたＴＣＲを含む。一部の実施形態においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、当該分子が、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができるように、可変のα鎖及びβ鎖（それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られる）もしくは可変のγ鎖及びδ鎖（それぞれＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られる）、又はその機能的フラグメントを含む。一部の実施形態においては、ＴＣＲはαβ形態にある。典型的には、αβ形態及びγδ形態に存在するＴＣＲは、概して構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は、特徴的な解剖学的な位置又は機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞表面上に又は可溶型で存在し得る。概して、ＴＣＲは、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面上に存在するものであり、そこで概してＭＨＣ分子に結合する抗原を認識するのに関与する。一部の実施形態においては、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は短い細胞質側末端を備えることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照）。例えば、一部の実施形態においては、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ－末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端における短い細胞質側末端を保持することができる。一部の実施形態においては、ＴＣＲは、シグナル伝達を介在することに関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する。
【0114】
一部の実施形態においては、標的抗原（例えば、がん／腫瘍の抗原）のためのＴＣＲを特定して、細胞内に導入する。一部の実施形態においては、ＴＣＲをコードする核酸は、例えば公的に入手可能なＴＣＲのＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅等によって、種々の出所より得ることが可能である。一部の実施形態においては、ＴＣＲは、例えば細胞からであって、例えばＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ又は公に入手可能な他の出所等からである、生物学的起源から得られる。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、インビボで単離した細胞から得ることが可能である。一部の実施形態において、高親和性のＴ細胞クローンは、患者から及び単離したＴＣＲから単離することが可能である。一部の実施形態においては、Ｔ細胞は、培養したＴ細胞ハイブリドーマ又はクローンであり得る。一部の実施形態においては、標的抗原のためのＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）を用いて改変した導入遺伝子マウスにおいて生成された。例えば腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１６９－１８０及びＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５７９９－５８０８を参照されたい）。一部の実施形態においては、ファージディスプレイを用いて、ある標的抗原に対するＴＣＲを単離する（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｎａｔ Ｍｅｄ．１４：１３９０－１３９５及びＬｉ（２００５） Ｎａｔ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９－３５４を参照されたい。一部の実施形態においては、ＴＣＲ又はその抗原結合性部分は、対象ＴＣＲの配列の知識から合成により生成することができる。
【0115】
一部の実施形態においては、組換え受容体（例えば、抗体又はその抗原結合性フラグメント等であるＣＡＲ）は、スペーサーであって、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域等であるヒンジ領域ならびに／又はＣＨ１／ＣＬ及び／もしくはＦｃ領域等である、免疫グロブリンの定常領域又はそのバリアントもしくは修飾されたバージョンの少なくとも一部であり得る又は当該少なくとも一部を含み得るスペーサーをさらに含む。一部の実施形態においては、定常領域又は部分は、例えばＩｇＧ４又はＩｇＧ１等であるヒトＩｇＧのものである。一部の態様においては、定常領域の部分は、例えばｓｃＦｖである抗原認識成分と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として機能する。このスペーサーは、スペーサーがない状態と比較して、抗原結合の後で細胞の応答性を増加させる長さのものであり得る。例示的なスペーサーとしては、少なくとも約１０から２２０アミノ酸、約１０から２００アミノ酸、約１０から１７５アミノ酸、約１０から１５０アミノ酸、約１０から１２５アミノ酸、約１０から１００アミノ酸、約１０から７５アミノ酸、約１０から５０アミノ酸、約１０から４０アミノ酸、約１０から３０アミノ酸、約１０から２０アミノ酸、又は約１０から１５アミノ酸を有するものが挙げられ、また列記した範囲のいずれの両終点の間にあるあらゆる整数が含まれる。例示的なスペーサーとしては、ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結したＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＨ３ドメインに連結したＩｇＧ４ヒンジが挙げられる。例示的なスペーサーとしては、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９：３１５３、又はＰＣＴ特許出願公開番号、国際公開第２０１４／０３１６８７号に記載のものが挙げられるが、これに限定されない。
【0116】
抗原／リガンド認識ドメインは、概して、ＣＡＲの場合には例えばＴＣＲもしくはＮＫ受容体複合体等である抗原受容体複合体を介した活性化を、及び／又は別の細胞表面受容体を介したシグナルを、模倣する例えばシグナル伝達成分等である１又は複数の細胞内シグナル伝達成分に連結する。すなわち、一部の実施形態においては、抗原結合性成分（例えば、抗体）は、１又は複数の膜貫通及び細胞内のシグナル伝達ドメインに連結する。一部の実施形態においては、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと融合する。一部の実施形態においては、例えばＣＡＲである受容体におけるドメインのうちの１つと天然に結合する膜貫通ドメインを用いる。一部の例においては、膜貫通ドメインは、当該ドメインの、同一の又は異なる細胞表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を防止して受容体複合体の他の構成部分との相互作用を最小化するように、アミノ酸置換によって選択又は改変される。
【0117】
一部の実施形態における膜貫通ドメインは、天然の又は合成による起源のいずれかに由来する。当該起源が天然である場合、一部の態様におけるドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３ イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖に由来するもの（すなわち、これらのうち少なくとも膜貫通領域を含む）を含む。あるいは、一部の実施形態における膜貫通ドメインは、合成による。一部の態様においては、合成膜貫通ドメインは、例えばロイシン及びバリン等である主として疎水性の残基を含む。一部の態様においては、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に存在することとなる。
【0118】
細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然抗原受容体を介したシグナルを、共刺激受容体と組み合わせた当該受容体を介したシグナルを、及び／又は共刺激受容体単独を介したシグナルを、模倣する又はそれに近似するものがある。一部の実施形態においては、例えば長さが２から１０アミノ酸のリンカーである短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーであって、例えばグリシン－セリンのダブレットであるグリシン及びセリンを含むもの等である当該リンカーが存在して、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成する。
【0119】
例えばＣＡＲである受容体は、概して、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分を含む。一部の実施形態においては、受容体は、Ｔ－細胞の活性化及び細胞傷害性を介在するＴＣＲ ＣＤ３鎖等、例えばＣＤ３ ζ鎖である、ＴＣＲ複合体の細胞内成分を含む。すなわち、一部の態様においては、ＣＡＲは、１又は複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結する。一部の実施形態においては、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／又は他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態においては、例えばＣＡＲである受容体は、例えばＦｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５又はＣＤ１６等である１又は複数のさらなる分子の部分をさらに含む。一部の態様においては、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激により作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲ又はＣＤ３ ζ、ＦｃＲガンマ又はＦｃＲベータに由来するものが挙げられる。一部の実施形態においては、ＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、又はＣＤ３ ζに由来する配列を含む。一部の実施形態においては、完全な活性化を促すために、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０及びＩＣＯＳ等の共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン等である二次的な又は共刺激的なシグナルを生成するための成分もまた、ＣＡＲ内に含まれる。一部の態様においては、追加的なＣＡＲは、同一の細胞内において発現されて、二次的な又は共刺激的なシグナルを生成するための成分を提供する。一部の場合においては、ＣＡＲは、第１代、第２代及び／又は第３代のＣＡＲと呼ぶ。一部の態様においては、第１代のＣＡＲは、抗原が結合すると抗原受容体（例えば、ＣＤ３鎖）により誘導されるシグナルを単独で提供するものである；一部の態様においては、第２代のＣＡＲは、当該シグナル及び共刺激シグナルを提供するものであり、例えばＣＤ２８又はＣＤ１３７等である共刺激受容体よりの細胞内シグナル伝達ドメインを含むもの等である；一部の態様においては、一部の態様における第３代のＣＡＲが、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
【0120】
一部の実施形態においては、ＣＡＲもしくは他の抗原受容体は、マーカーをさらに含み得、又は当該細胞は、例えば切断型の細胞表面受容体等であって例えば切断型のＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）等である受容体を発現する細胞の形質導入もしくはエンジニアリングを確認するために用い得る、例えば代替マーカー等のマーカーをさらに発現し得る。一部の態様においては、マーカーは、ＣＤ３４の全てもしくは部分（例えば、切断型）、ＮＧＦＲ、又は上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）を含む。一部の実施形態においては、上記マーカーをコードする核酸は、例えばＴ２Ａである切断可能なリンカー配列等であるリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結する。国際公開第２０１４／０３１６８７号を参照されたい。一部の実施形態においては、Ｔ２Ａリボソームスイッチで分離されるＣＡＲ及びＥＧＦＲｔをコードするコンストラクトの導入により、当該同一のコンストラクトからの２つのタンパク質を発現することができるため、ＥＧＦＲｔを、当該コンストラクトを発現する細胞を検出するマーカーとして用いることが可能である。一部の実施形態においては、マーカー及び随意にリンカー配列は、公開された特許出願である国際公開第２０１４／０３１６８７号に開示されるいずれかとすることが可能である。例えば、マーカーは、例えばＴ２Ａ切断可能リンカー配列等であるリンカー配列に連結していてもよい、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）とすることが可能である。
【0121】
キメラ受容体によって標的にされ得る抗原の中には、養子細胞療法を介して標的とされる疾患、症状又は細胞型の文脈において発現されるものがある。疾患及び症状の中には、がん及び腫瘍を含む、増殖性の、腫瘍性の及び悪性の疾患及び障害があり、該がん及び腫瘍には、血液がん、例えばリンパ腫、白血病、及び／又は骨髄腫（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄性白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫）等である免疫系のがんが挙げられる。
【0122】
一部の実施形態においては、抗原（又はリガンド）はポリペプチドである。一部の実施形態においては、炭水化物又は他の分子である。一部の実施形態においては、抗原（又はリガンド）は、正常な又は非標的の細胞又は組織と比較して、例えば腫瘍／がん又は病原性の細胞である疾患又は障害の細胞上で、選択的に発現又は過剰発現される。その他の実施形態においては、抗原は、正常な細胞上で発現し、及び／又は改変された細胞上で発現する。
【0123】
一部の実施形態においては、抗原（又はリガンド）は、腫瘍抗原又はがんマーカーである。ある実施形態においては、抗原は、インテグリン（例えば、αｖβ６インテグリン、αｖβ３インテグリン、インテグリンβ７）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、ＣＡＩＸ又はＧ２５０としても知られる）、がん－精巣抗原、がん／精巣抗原ＩＢ（ＣＴＡＧ、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＬＡＧＥ－２としても知られる）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、上皮細胞成長因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、切断型上皮細胞成長因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮細胞成長因子受容体変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；Ｆｃ受容体ホモログ５又はＦＣＲＨ５としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸塩結合たんぱく質（ＦＢＰ）、葉酸塩受容体アルファ、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢダイマー、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチ反復配列含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ、５Ｔ４としても知られる）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、ガレクチン（ガレクチン－１、ガレクチン－７）、病原体特異的抗原、又はユニバーサルタグに結合する、及び／もしくはビオチン化分子に結合する、及び／もしくはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは例えば細菌及び寄生生物等の他の病原体により発現する分子に結合する抗原である。一部の実施形態における受容体により標的化される抗原は、例えばいくつかの公知のＢ細胞マーカーのいずれか等である、Ｂ細胞悪性腫瘍に結合する抗原を含む。一部の実施形態においては、受容体により標的化される抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ３０である。ある実施形態においては、複数の抗原を標的とする複数の組換え受容体を用いる。さらなる実施形態においては、２つの抗原を標的とする２つの組換え受容体を用いる。
【0124】
ベクター／プラスミド
ある実施形態においては、合成発現カセットは、プラスミド又はベクター内に含まれる。すなわち、本開示はまた、本明細書に記載の合成発現カセットを含むベクター又はプラスミドに関する。「ベクター」の語は、核酸（例えば、本明細書において規定する合成発現カセット）を、そこで複製することが可能である細胞への導入のために挿入することができるキャリアを指すために用いられるものである。「発現ベクター」又は「核酸ベクター」の語は、転写可能な遺伝子産物、ならびに特定の宿主細胞において操作可能に連結したコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す「調節」又は「制御」配列の少なくとも一部をコードする核酸又は「発現カセット」を含有するベクターを指す。発現ベクターは、転写及び翻訳を司る制御配列に加えて、同様に他の機能をもたらす核酸配列を含有し得る。
ある実施形態においては、合成発現カセットは、プラスミド又はベクター内に含まれる。すなわち、本開示はまた、本明細書に記載の合成発現カセットを含むベクター又はプラスミドに関する。「ベクター」の語は、核酸（例えば、本明細書において規定する合成発現カセット）を、そこで複製することが可能である細胞への導入のために挿入することができるキャリアを指すために用いられるものである。「発現ベクター」又は「核酸ベクター」の語は、転写可能な遺伝子産物、ならびに特定の宿主細胞において操作可能に連結したコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す「調節」又は「制御」配列の少なくとも一部をコードする核酸又は「発現カセット」を含有するベクターを指す。発現ベクターは、転写及び翻訳を司る制御配列に加えて、同様に他の機能をもたらす核酸配列を含有し得る。
【0125】
ある実施形態においては、ベクターは、選択マーカー又はレポータータンパク質をコードする核酸をさらに含む。選択マーカー又はレポーターは、本明細書において、選択マーカー又はレポーターがない細胞から選択マーカーを含有する細胞を容易に同定、単離及び／又は選択することを許容する、発現したときに同定可能な特徴（例えば、検出可能なシグナル、選択剤に対する抵抗性）を細胞に対して与える、ポリペプチドをコードする核酸を指すために規定する。本開示のベクターにおける選択マーカーとして、当業者にとって公知の任意の選択マーカー又はレポーターを包含することを想定している。例えば、選択マーカーは、薬剤選択マーカー、酵素、又は免疫マーカーであり得る。選択マーカー又はレポーターの例としては、薬剤抵抗性（例えば、カナマイシン／ジェネテシン抵抗性）を与えるポリペプチド、例えばアルカリホスファターゼ及びチミジンキナーゼ等の酵素、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ｄｉｓｃｏｓｏｍａ由来のｃｉｔｒｉｎｅ及び赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）等の生物発光及び蛍光タンパク質、それに対して検出される高親和性の抗体又はリガンドが存在する又は従来の方法で産生することができる膜結合タンパク質、ならびにとりわけ赤血球凝集素（ＨＡ）又はＭｙｃよりの抗原タグドメインに適切に融合する膜結合タンパク質を含む融合タンパク質、が挙げられるがこれに限定されない。選択マーカー又はレポータータンパク質をコードする核酸は、対象核酸と同一のプロモーター／エンハンサーの制御下にあり得るか、又は異なるプロモーター／エンハンサーの制御下にあり得る。
【0126】
ある実施形態においては、ベクターは、１又は複数の起源の複製部位（しばしば「ｏｒｉ」と名づけられる）、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（多重クローニング部位、ＭＣＳ）、及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素等の追加要素を含み得る。
【0127】
ある実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。本明細書で用いる場合、「ウイルスベクター」の語は、組換えウイルスであって、細胞を形質導入して、該細胞内にそれらの遺伝子材料を導入することができる組換えウイルスを指す。ある実施形態においては、ウイルスベクターは、遺伝子療法用途で用いるのに好適である。遺伝子療法で用いられ得るウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス）、アルファウイルス、及びワクシニアウイルス（ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ））が挙げられる。ある実施形態においては、ベクターは、レンチウイルスベクターである。当業者には明らかになるように、「レンチウイルスベクター」の語は、核酸の伝達を介在するレンチウイルス粒子を指すために用いる。レンチウイルス粒子は、典型的には、様々なウイルス成分を含み、また核酸に加えて宿主細胞成分を含むこともある。特定の態様においては、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」の語は、レンチウイルス伝達プラスミド及び／又は感染性レンチウイルス粒子を指すために用いる。
【0128】
ある実施形態においては、レンチウイルスベクターは、偽型レンチウイルスベクターである。偽型レンチウイルスベクターは、他のエンベロープウイルスに由来するエンベロープタンパク質（糖タンパク質、ＧＰ）を保持するベクター粒子からなる。当該粒子は、エンベロープタンパク質の由来となるウイルスのトロピズムをもつ。偽型レンチウイルスベクターのために広く用いられる糖タンパク質のひとつは、水疱性口内炎ウイルスＧＰ（ＶＳＶ－Ｇ）であり、これは得られる偽型の非常に広いトロピズムと安定性に起因する。偽型レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知であり、いくつかの例としては、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７－３９８に記載されている。当該ベクターには、リッサウイルスＧＰ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ＧＰ、アルファウイルスＧＰ（例えば、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルスＧＰ）、フィロウイルスＧＰ（例えば、マールブルグウイルス及びＥｂｏｌａ ＺａｉｒｅウイルスＧＰ）、ガンマレトロウイルスＧＰ（例えば、エコトロピックＭＬＶ、両栄養性４０７０Ａ ＭＬＶ、１０Ａ１ ＭＬＶ、異種栄養性ＮＺＢ ＭＬＶ、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、テナガザル白血病（ＧＡＬＶ）ウイルス、ＲＤ１ １４ ＧＰ）、水疱性口内炎ウイルスＧ型（ＶＳＶ－Ｇ）、麻疹ウイルスレンチウイルスベクター（ＭＶ－ＬＶ）、ヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）－ＬＶ及びバキュロウイルスＧＰ（ＧＰ６４）で偽型にしたレンチウイルスベクターが含まれる。
【0129】
ある実施形態においては、ベクターは、例えばセンダイウイルス又はベクター等である、エピソームに保持されたウイルスベクター又は非組み込みベクター（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）である。当該ベクターは、ゲノムに組み込まれていないが、ベクター内側の足場／マトリックス付着領域の存在に起因して細胞分裂によりエピソームに保持される（例えば、Ｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ａｐｒ １７；３８７（５）：１２３９－４９；及びＨａａｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．２０１０；１０：２０を参照）。
【0130】
別の実施形態においては、ベクターは、非ウイルスベクターであり、例えば、ヌードＤＮＡ、リポソーム、ポリメライザー（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｒ）又は分子コンジュゲートである。
【0131】
細胞
別の態様においては、本開示は、本明細書に記載する合成発現カセット又はベクター／プラスミドを含む細胞（宿主細胞、改変された細胞）を提供する。ある実施形態においては、細胞は、一次細胞、例えば、脳／神経細胞、末梢血細胞（例えば、Ｂ又はＴリンパ球、単球、ＮＫ細胞）、臍帯血細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、又は肺（ｌｕｎｇ／ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）の細胞である。ある実施形態においては、細胞は、骨髄細胞、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。さらなる実施形態においては、細胞は、例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はＮＫ細胞等である免疫細胞である。
別の態様においては、本開示は、本明細書に記載する合成発現カセット又はベクター／プラスミドを含む細胞（宿主細胞、改変された細胞）を提供する。ある実施形態においては、細胞は、一次細胞、例えば、脳／神経細胞、末梢血細胞（例えば、Ｂ又はＴリンパ球、単球、ＮＫ細胞）、臍帯血細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、又は肺（ｌｕｎｇ／ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）の細胞である。ある実施形態においては、細胞は、骨髄細胞、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。さらなる実施形態においては、細胞は、例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はＮＫ細胞等である免疫細胞である。
【0132】
ある実施形態においては、細胞は、幹細胞である。本明細書で用いる場合、「幹細胞」の語は、機能的な成熟細胞へと分化させることができるような多能性を有する細胞を指す。幹細胞には、未分化造血細胞、前駆細胞、及び、それ自身を再生し且つその細胞の由来となる特定の細胞型及び組織（例えば、筋肉幹細胞、皮膚幹細胞、脳又は神経幹細胞、間葉系幹細胞、肺幹細胞、肝臓幹細胞）を生じることが可能である人体内の種々の組織に存在する未分化細胞である成熟幹細胞が含まれる。
【0133】
ある実施形態においては、当該細胞は、未分化造血細胞である。本明細書で用いる場合、「未分化造血細胞」の語は、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、巨核球産生血小板、血小板）、及び単球（例えば、単球、マクロファージ）等である骨髄及びリンパ系統の機能的な成熟血液細胞へと分化させることができる多能性を有する細胞であって、それらの多能性を保持しつつ再生する能力（自己複製）がある場合もあり、ない場合もある、当該細胞を指すために用いられる。当該細胞は、「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」を包含するが、これは例えば顆粒球、赤血球、血小板及び単球等である機能的な成熟細胞へと細胞を分化させることができる多能性と、それらの多能性を保持しつつ再生する能力（自己複製）との両方を有する細胞であるのみならず、自己複製能を有していない多能性造血性細胞である。また当該細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）を包含するが、これは胚盤胞、早期の着床前胚、の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。ある実施形態においては、細胞集団はＥＳＣを含む。別の実施形態においては、細胞集団はＨＳＣを含む。ＨＳＣは、造血性の起源の細胞を含有する、身体又は体内器官より得られ得る。当該起源には、未分画の骨髄（大腿、臀部、肋骨、胸骨及び他の骨よりの）、臍帯血、末梢血、肝臓、胸腺、リンパ、及び脾臓が含まれる。前述の未精製又は未分画の血液産物の全ては、当業者に公知の方法でＨＳＣの特性を有する細胞について富化され得る。ＨＳＣは、それらのサイズが小さいこと、系列（ｌｉｎ）マーカーが欠如していること、例えばローダミン１２３（ローダミンＤＵＬＬ、ｒｈｏ０とも呼ばれる）又はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２等の生体染色色素で低染色性であること（ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、ならびにその多くが、例えばＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５及びｃ－キット等である分化系統のクラスターに属するものであるそれら表面上の種々の抗原マーカーが存在すること／不在であること、によって表現型的に同定される。
【0134】
ある実施形態においては、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ｉＰＳＣの語は、細胞を「リプログラミング」する適切なファクターを用いて成熟細胞より直接生成することができる多能性幹細胞を指す。
【0135】
ある実施形態においては、細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。
【0136】
本明細書に記載する合成発現カセット又はベクター／プラスミドは、細胞内に核酸を導入する標準技術、例えばトランスフェクション、形質導入、又は形質転換を用いて、細胞内に導入され得る。ある実施形態においては、ベクターはウイルスベクターであり、また細胞はベクターにより形質導入される。本明細書において用いる場合、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」の語は、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス）から細胞ゲノム（例えば、造血細胞ゲノム）への遺伝物質の安定的な移行を指す。当該語はまた、ウイルスベクター中に存在する対象遺伝子の一過性発現又はエピソーム発現につながる、非組み込みウイルスベクターの細胞内への導入もまた包含する。
【0137】
ウイルスは、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、又はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、当技術分野で周知の技術を用いて、細胞を感染させるために用い得る。例えば、例えばＣＤ３４＋細胞又は幹細胞である細胞を、エキソビボで形質導入する場合、ベクター粒子が、１０５個の細胞当たり１×１０５～１００又は５０×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも相当する、概して１～１００又は１～５０の感染効率（ＭＯＩ）のオーダーでの用量を用いて、当該細胞とインキュベートされ得る。もちろんこれには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５及び５０ＭＯＩに相当するベクター量が含まれる。
【0138】
形質導入前、形質導入中、及び／又は形質導入後に、細胞の維持、成長、又は増殖に好適な培地で、細胞を培養してもよい。細胞集団の培養条件は、様々な因子、特に開始細胞集団に依存して変動することとなる。好適な培養培地及び条件は、当技術分野で周知である。培養は、組成の観点で、天然培地、半合成培地又は合成培地で実行してよく、また形状の観点で、固形培地、半固形培地、又は液体培地であってもよく、また例えば幹細胞培養等である細胞培養に用いられる、１又は複数の成長因子を添加してもよい任意の栄養培地であってもよい。当該培地は、典型的には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖類等を含む。培養液においては、その場合に必要であれば、他の化学的成分又は生物学的成分を、単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。培地に組み込む当該成分は、ウシ胎仔血清、ヒト血清、ウマ血清、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、種々のビタミン、種々のアミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、種々のサイトカイン、種々の成長因子等であり得る。幹細胞を増殖する方法に適したこうした基本培地の例としては、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標） Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カナダ国バンクーバー）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標） Ｈ３０００－Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カナダ国バンクーバー）、ＣｅｌｌＧｒｏ（商標）、ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（商標）社、ドイツ連邦共和国フライブルク）、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）社）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｈ１２ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（アルファ改変イーグル最小必須培地）、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｉｓｏｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）社）、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標） １０（Ｃａｍｂｒｅｘ（登録商標）社）、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標） １５（Ｃａｍｂｒｅｘ（登録商標）社）、及びＳｔｅｍｌｉｎｅ（商標） ＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）社）が挙げられるが、これに限定されない。
【0139】
形質導入後、形質導入された細胞を、それらの維持、成長及び／又は増殖に好適な条件下で培養することができる。特定の態様においては、形質導入された細胞は、移植前に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間培養する。
【0140】
幹細胞を維持及び／又は増殖する培養条件は、当技術分野で周知である。典型的には、培養条件は、概して幹細胞増殖の技術分野で公知の、サイトカイン及び成長因子のような因子を使用することを含む。こうしたサイトカイン及び成長因子は、生物学的製剤又は小分子とすることが可能であり、またそれらには、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＩＴ３－Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン、及びそのアナログが含まれるが、これに限定されない。本明細書で用いる場合、「アナログ」には、天然に生じる形態として生物活性を有するサイトカイン及び成長因子の任意の構造的バリアントが含まれ、天然に生じる形態と比較して生物学的活性が増強又は減少しているバリアント、又はＴＰＯ受容体に対するアゴニスト抗体等のサイトカイン受容体アゴニスト（例えば、国際公開第２００７／１４５２２７号等に詳説されるＶＢ２２Ｂ ｓｃ（Ｆｖ）２）が挙げられるが、これに限定されない。サイトカイン及び成長因子の組み合わせは、最終分化した細胞の産生を制限しつつ、幹細胞を維持／増殖するように選択する。１つの特定の実施形態においては、１又は複数のサイトカイン及び成長因子は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ及びＴＰＯからなる群から選択される。
【0141】
Ｂ－細胞刺激因子２としても知られるヒトＩＬ－６又はインターロイキン－６は、（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ａｎｎ．ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１，２００５）で記載されており、また市販されている。ｃ－ｋｉｔリガンドとしても知られるヒトＳＣＦもしくは幹細胞ファクター、マスト細胞成長因子、又は造血幹細胞因子（Ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）は、（Ｓｍｉｔｈ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＴＡ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１０５（３）：１４３，２００１）で記載されており、また市販されている。ＦＬとも呼ばれるＦｌｔ３－Ｌ又はＦＬＴ－３リガンドは、ｆｌｔ３－受容体に結合する因子である。それは記載されているものであり（Ｈａｎｎｕｍ Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７２）：６４３－８）、また市販されている。巨核球（ｍｅｇａｋａｒａｙｏｃｙｔｅ）成長因子（ＭＧＤＦ）又はｃ－Ｍｐｌリガンドとしても知られる、ＴＰＯ又はトロンボポエチンは記載されているものであり（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ Ｋ（２００６）．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４（１９）：２０３４－４５）、また市販されている。
【0142】
上記において言及した化学的成分及び生物学的成分は、当該成分を培地に添加することによってのみならず、培養に用いられる基材又は支持体の表面上に当該成分を固定することによって、明確に言えば、使用するある成分を、適切な溶媒中に溶解して、得られた溶液で基材又は支持体を被覆して、その後過剰な当該成分を洗い流すことによって、使用され得る。使用する当該成分は、この成分に結合する物質で予め被覆される基材又は支持体に添加してもよい。
【0143】
幹細胞は、例えばペトリ皿、フラスコ、プラスチック袋、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）バッグ等である、動物細胞培養に通常用いられる培養容器中で、随意に細胞外マトリックス又は細胞接着分子で予め被覆した後で、培養してもよい。当該被覆のための材料としては、Ｉ型～ＸＩＸ型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン１～１２、窒素、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンウィルブランド因子、オステロポニン、フィブリノーゲン、種々のエラスチン、種々のプロテオグリカン、種々のカドヘリン、デスモコリン（ｄｅｓｍｏｃｏｌｉｎ）、デスモグレイン、種々のインテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル（登録商標）、ポリ－Ｄ－リシン、ポリ－Ｌ－リシン、キチン、キトサン、セファロース（登録商標）、アルギン酸ゲル、ヒドロゲル又はそのフラグメントがあり得る。こうした被覆材料は、人工的に修飾したアミノ酸配列を有する組換え材料であり得る。幹細胞は、培地組成、ｐＨ等を機械的に制御して高密度培養を得ることが可能であるバイオリアクターを用いて培養してもよい（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｒ Ｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：６７６０，１９９１；Ｋｏｌｌｅｒ Ｍ Ｒ，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２１：６５３，１９９８；Ｋｏｌｌｅｒ，Ｍ Ｒ，Ｂｌｏｏｄ，８２：３７８，１９９３；Ａｓｔｏｒｉ Ｇ，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，３５（１） １０１，２００５）。
【0144】
その後細胞集団を洗浄して、本発明の化合物もしくは組成物及び／又は細胞培養の任意の他の成分を除去して、そして短期間使用の培地に適切な細胞懸濁培地中で、又は例えば凍結保存に好適な培地であって例えば４０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭである長期間保存の培地中で、再懸濁させることができる。培養後の細胞のための凍結保存を調製する他の方法もまた、当業者は利用可能である。
【0145】
組成物
別の態様においては、本開示は、本明細書に記載する合成発現カセット、ベクター又は細胞を含む組成物を提供する。組成物は、例えば緩衝液、生理食塩水、防腐剤等の１又は複数の担体又は賦形剤を含んでもよい。ある実施形態においては、組成物は、少なくとも１の薬理学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書で用いる場合、「賦形剤」は、当技術分野におけるその通常の意味を有するものであり、活性成分（薬剤）そのものではない任意の成分である。賦形剤としては、例えば、結合剤、潤滑剤、希釈剤、充填剤、粘稠化剤、崩壊剤、可塑剤、剤皮、バリア層製剤、潤滑剤、安定化剤、遅延放出剤及び他の成分が挙げられる。本明細書で用いる場合、「薬理学的に許容できる賦形剤」は、活性成分の生物学的活性の有効性と干渉せず、また対象にとって毒性とならない、すなわち賦形剤の一種であるか及び／又は対象にとって毒性とならない量で使用する、任意の賦形剤を指す。賦形剤は当技術分野で周知である（例えば、Ｌｏｙｄ Ｖ Ａｌｌｅｎ，ＪｒによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０１２，２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；ＲｏｗｅらによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２０１２，７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照）。医薬組成物は、所望の純度である活性成分を１又は複数の随意の薬理学的に許容できる担体、賦形剤及び／又は安定剤と混合することによる、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて調製され得る。賦形剤は、例えば静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、関節内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、槽内、腹腔内、鼻腔内又は肺内（例えば、エアロゾル）の投与である、任意の経路による組成物の投与に対して選択され得る。ある実施形態においては、医薬組成物は、例えば溶液、懸濁液、又は乳剤として、局所注射、カテーテル投与、全身注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、又は非経口投与を含めた、注射用に製剤化される。
別の態様においては、本開示は、本明細書に記載する合成発現カセット、ベクター又は細胞を含む組成物を提供する。組成物は、例えば緩衝液、生理食塩水、防腐剤等の１又は複数の担体又は賦形剤を含んでもよい。ある実施形態においては、組成物は、少なくとも１の薬理学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書で用いる場合、「賦形剤」は、当技術分野におけるその通常の意味を有するものであり、活性成分（薬剤）そのものではない任意の成分である。賦形剤としては、例えば、結合剤、潤滑剤、希釈剤、充填剤、粘稠化剤、崩壊剤、可塑剤、剤皮、バリア層製剤、潤滑剤、安定化剤、遅延放出剤及び他の成分が挙げられる。本明細書で用いる場合、「薬理学的に許容できる賦形剤」は、活性成分の生物学的活性の有効性と干渉せず、また対象にとって毒性とならない、すなわち賦形剤の一種であるか及び／又は対象にとって毒性とならない量で使用する、任意の賦形剤を指す。賦形剤は当技術分野で周知である（例えば、Ｌｏｙｄ Ｖ Ａｌｌｅｎ，ＪｒによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０１２，２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；ＲｏｗｅらによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２０１２，７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照）。医薬組成物は、所望の純度である活性成分を１又は複数の随意の薬理学的に許容できる担体、賦形剤及び／又は安定剤と混合することによる、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて調製され得る。賦形剤は、例えば静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、関節内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、槽内、腹腔内、鼻腔内又は肺内（例えば、エアロゾル）の投与である、任意の経路による組成物の投与に対して選択され得る。ある実施形態においては、医薬組成物は、例えば溶液、懸濁液、又は乳剤として、局所注射、カテーテル投与、全身注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、又は非経口投与を含めた、注射用に製剤化される。
【0146】
一部の実施形態における医薬組成物は、一部の態様においては選択したｐＨに緩衝されてもよい、例えば等張水溶液、懸濁剤、乳剤、分散剤又は粘稠組成物である、滅菌液調製物として提供される。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘稠組成物及び固体組成物よりも、調製しやすい。さらに、液体組成物は、特に注射により投与するのにいくらか好都合である。その一方で、粘稠組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすように、適切な粘度範囲内で調製され得る。液体組成物又は粘稠組成物は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びその好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒であり得る担体を含み得る。
【0147】
滅菌注射剤は、溶媒中に、例えば滅菌の水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖等である好適な担体、希釈剤又は賦形剤との混合物中に、細胞を組み込むことによって調製され得る。組成物はまた、凍結乾燥することができる。組成物は、所望の投与経路及び調製に応じて、例えば湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤、又は粘度増強添加剤、防腐剤、香味剤、色素等の補助剤を含むことが可能である。一部の態様においては、標準的なテキストに従って、好適な調製物を調製してもよい。
【0148】
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び緩衝剤を含めて、組成物の安定性及び無菌性を増強する種々の添加剤を添加することが可能である。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の、種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の作用の防止を確実にすることができる。注射可能な医薬品形態の持効性吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンである、吸収を遅らせる薬剤の使用によってもたらすことができる。
【0149】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスが挙げられ、当該マトリックスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルである造形品の形態である。
【0150】
インビボ投与に用いようとする製剤は、概して無菌である。例えば滅菌ろ過膜を通したろ過によって、無菌性を容易に達成することができる。
【0151】
方法／使用
本開示はまた、細胞によって対象遺伝子の発現を誘導する方法に関し、当該方法は、上記細胞に本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを導入することを含む。本開示はまた、細胞によって対象遺伝子の発現を誘導するために、本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを使用することに関する。ある実施形態においては、細胞は、一次細胞、例えば、脳／神経細胞、末梢血細胞（例えば、Ｂ又はＴリンパ球、単球、ＮＫ細胞）、臍帯血細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、又は肺（ｌｕｎｇ／ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）の細胞である。ある実施形態においては、細胞は、骨髄細胞、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。さらなる実施形態においては、細胞は、例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はＮＫ細胞等である免疫細胞である。
本開示はまた、細胞によって対象遺伝子の発現を誘導する方法に関し、当該方法は、上記細胞に本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを導入することを含む。本開示はまた、細胞によって対象遺伝子の発現を誘導するために、本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを使用することに関する。ある実施形態においては、細胞は、一次細胞、例えば、脳／神経細胞、末梢血細胞（例えば、Ｂ又はＴリンパ球、単球、ＮＫ細胞）、臍帯血細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、又は肺（ｌｕｎｇ／ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）の細胞である。ある実施形態においては、細胞は、骨髄細胞、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。さらなる実施形態においては、細胞は、例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はＮＫ細胞等である免疫細胞である。
【0152】
ある実施形態においては、対象遺伝子は、細胞内で欠損した又は欠如したタンパク質をコードする。ある実施形態においては、対象遺伝子は、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の組換え受容体をコードする。ある実施形態においては、対象遺伝子は、分化ファクター（細胞のリプログラミングのための）をコードする。
【0153】
本開示はまた、対象において疾患、症状又は障害を治療する方法に関し、当該方法は、本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを含む細胞を投与することを含む。本開示はまた、対象において疾患、症状又は障害を治療する方法で、本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを含む細胞を使用することに関する。本開示はまた、対象において疾患、症状又は障害を治療するための医薬の製造方法で、本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを含む細胞を使用することに関する。ある実施形態においては、疾患、症状又は障害は、タンパク質の発現の不在又は欠損（例えば、変異した）タンパク質の発現と関連し、また合成発現カセット又はベクターが、機能的な（例えば、天然の）タンパク質をコードする核酸を含む（例えば、遺伝子療法）。
【0154】
タンパク質の発現の不在又は欠損（例えば、変異した）タンパク質の発現と関連した疾患／障害（例えば、遺伝性疾患／障害）の例としては、例えばウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）（Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１（６１４８））、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１（６１４８））、白血球付着欠乏症（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ＣＧＤ、ファンコニー貧血、副腎白質ジストロフィー、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型等のある血液病及びリソソーム蓄積症、ならびに例えば重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）及びアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症等の免疫不全症が挙げられる。
【0155】
治療対象の疾患又は症状は、抗原の発現が、疾患の症状又は障害の病因と関連及び／又は関与する、例えば当該疾患、症状又は障害を引き起こす、悪化させる又はその他の方法で関与するもののいずれかであり得る。例示的な疾患及び症状としては、細胞の悪性腫瘍もしくは形質転換（例えば、がん）、自己免疫もしくは炎症性の疾患（例えば、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、及び／又は移植に関連する疾患もしくは症状）、又は例えば細菌、ウイルスもしくは他の病原菌が引き起こす感染症と関連する疾患もしくは症状が挙げられ得る。特定の実施形態においては、例えばＣＡＲである組換え受容体が、当該疾患又は症状と関連する抗原に特異的に結合する。ある実施形態においては、疾患、症状又は障害は、がん又は感染症であり、また合成発現カセット又はベクター内に存在する対象とする核は、腫瘍細胞又は感染細胞により発現した抗原を認識する、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等である組換え受容体をコードする。腫瘍は、固形腫瘍又は血液学的な腫瘍（血腫）であり得る。ある実施形態においては、がんは、例えばリンパ腫、白血病、及び／又は骨髄腫（例えば、Ｂ－細胞、Ｔ－細胞及び骨髄性白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫）等である血液がんである。感染症は、ウイルス性、細菌性、寄生虫性（例えば、原生動物性）、又は真菌性の感染症等の任意の病原性感染が引き起こす疾患であり得、例えばヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症である。
【0156】
細胞（本明細書に記載の合成発現カセット又はベクターを含む改変された細胞）又はそれを含む組成物は、例えば養子Ｔ細胞療法又は幹細胞療法等である養子細胞療法を介して、治療しようする特定の疾患又は症状を有する対象又は患者に対して投与され得る。養子細胞療法のために改変された細胞を投与する方法は公知であり、また当該方法は、提供の方法及び組成物とともに用いてもよい。例えば、養子Ｔ細胞療法は、例えばＧｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開公報第２００３／０１７０２３８号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５）に記載されている。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｎａｔ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３；Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８を参照されたい。
【0157】
本明細書において用いる場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」等のその文法的なバリエーション）は、疾患もしくは状態もしくは障害、又は症状、有害な影響もしくは結果、又はそれに関連する表現型が、完全に又は部分的に回復もしくは軽減することを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患のあらゆる直接又は間接的な病理上の結果の縮小、転移の予防、病状悪化の速度の低下、病状の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が挙げられるがこれに限定されない。当該語は、疾患の完全な治癒、又はあらゆる症状の完全な除去、又は全ての症状もしくは結果に対する効果を示唆するものではない。
【0158】
一部の実施形態においては、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法又は幹細胞療法は、自家移植によって実行され、ここで当該細胞は、細胞療法を受けるための対象から又は当該対象由来の試料から単離される及び／又は他の方法で調製される。すなわち、一部の態様においては、細胞は、治療の必要がある、例えば患者である対象に由来するものであり、当該細胞は、単離及び処理した後にその同じ対象に投与する。
【0159】
一部の実施形態においては、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法又は幹細胞療法は、同種移植によって実行され、ここで当該細胞は、例えば第１の対象である細胞療法を受けるための対象又は最終的に細胞療法を受ける対象、以外の対象から単離される及び／又は他の方法で調製される。当該実施形態においては、細胞はその後、同じ種の、例えば第２の対象である異なる対象に投与する。一部の実施形態においては、第１の対象及び第２の対象は、遺伝子的に同じである。一部の実施形態においては、第１の対象及び第２の対象は、遺伝子的に類似である。一部の実施形態においては、第２の対象は、第１の対象と同一のＨＬＡクラス又は上位タイプを発現する。細胞は、任意の好適な手段によって投与することができる。投薬すること及び投与は、投与が短期間であるか長期間であるか否かに一部依存し得る。種々の投薬スケジュールは、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含むが、これに限定されない。
【0160】
ある実施形態においては、細胞又は細胞のサブタイプの個々の集団は、約１００万から約１０００億個の細胞の範囲で及び／又は体重１キログラム当たりの細胞の量で、例えば１００万から約５０億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、又は先述の値のうちのいずれか２つで規定される範囲で）、例えば約１０００万個から約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、又は先述の値のうちのいずれか２つで規定される範囲）等で、また一部の場合においては、約１億個の細胞から約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）、又はこれらの範囲の間にある任意の値で及び／又は体重１キログラム当たりで、対象に投与される。投与量は、特徴、特に疾患もしくは障害及び／又は患者及び／又は他の治療に依存して変動し得る。
【0161】
一部の実施形態においては、例えば、対象がヒトである場合、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する細胞、幹細胞、Ｔ細胞、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の用量は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４又は１×１０５個の細胞、例えば約１×１０６から１×１０８個の範囲の当該細胞、例えば２×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７又は１×１０８個又は合計の当該細胞等であるか、又は先述の値のいずれか２つの間の範囲である。
【0162】
一部の実施形態においては、細胞は、例えば、抗体、又は改変された細胞、又は受容体、又は例えば細胞傷害性薬物もしくは治療薬等の薬剤等の、別の治療的介入と同時に又は任意の順序で当該別の治療的介入と連続的に、併用療法の一部として投与される。一部の実施形態においては、細胞は、同時に又は任意の順序で連続的のいずれかで、１もしくは複数の追加的な治療薬と同時投与されるか又は別の治療的介入と共に同時に施与される。一部の文脈においては、細胞は、細胞集団が、１もしくは複数の追加的な治療薬の効果を増強する又はその逆であるように、時間的に十分に近づけて別の療法と同時に施与する。一部の実施形態においては、細胞は、１又は複数の追加的な治療薬の前に投与する。一部の実施形態においては、細胞は、１又は複数の追加的な治療薬の後に投与する。一部の実施形態においては、１又は複数の追加的な薬剤は、例えば持続性を増強するために、ＩＬ－２等であるサイトカインを含む。一部の実施形態においては、当該方法は、化学療法剤の投与を含む。
【0163】
当該細胞は、治療しようとする疾患に応じて、例えば他の化学療法、免疫療法、放射線療法、又は手術等の他の療法と組み合わせて用いてもよい。
【0164】
一部の実施形態においては、合成発現カセットは、調査手段として、例えばレポーター手段として、又は市販の検出方法において、用いる（アッセイ開発）。例えば、合成発現カセットは、レポータータンパク質をコードする核酸に操作可能に連結していてもよく、例えば対象遺伝子が特定の細胞型の細胞によって取り込まれて発現されたことを確認するために、特定の細胞型において該対象遺伝子の発現を検出するために用いられ得る。「レポータータンパク質」の語は、例えば蛍光及び発光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ）等である容易に特定及び測定され得るタンパク質のみならず、基材（例えば、ルシフェラーゼ）から検出可能な産物を生成することができる酵素を指す。合成発現カセットはまた、例えば標的細胞での対象遺伝子の発現の効果を評価するために、インビトロで対象遺伝子の細胞特異的発現に用いられ得る。
【0165】
発明を実施するための形態
本発明について、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。
本発明について、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。
【0166】
実施例１：材料及び方法
実験計画
合成による特異的プロモーター（エンハンサー＋最小ＣＭＶプロモーター）を生成するための実験戦略を、はじめにコンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で特異的エンハンサー配列を選択すること、ＰＣＲで配列を増幅すること、及びその後最小プロモーター、すなわちＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）の上流に内在性エンハンサー配列をクローニングすること、とした５。発現パターンアッセイを通して当該合成プロモーター（エンハンサー＋ｍｉｎＣＭＶ）の特異性を確認するために、該合成プロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の上流にクローニングした。機能的使用の概念実証として、上記合成プロモーターを、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の上流にクローニングした。
実験計画
合成による特異的プロモーター（エンハンサー＋最小ＣＭＶプロモーター）を生成するための実験戦略を、はじめにコンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で特異的エンハンサー配列を選択すること、ＰＣＲで配列を増幅すること、及びその後最小プロモーター、すなわちＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）の上流に内在性エンハンサー配列をクローニングすること、とした５。発現パターンアッセイを通して当該合成プロモーター（エンハンサー＋ｍｉｎＣＭＶ）の特異性を確認するために、該合成プロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の上流にクローニングした。機能的使用の概念実証として、上記合成プロモーターを、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の上流にクローニングした。
【0167】
特異的プロモーター配列の設計
特定の細胞型に特異的であり、かつ転写開始部位の上流に位置する、エンハンサー配列をコンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で選択した。そのために、コンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）での選択方法は、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＡＮｎｏｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ”ＦＡＮＴＯＭ５データベース（ＲＩＫＥＮにより作製）３、４に基づいた。このＦＡＮＴＯＭ５データベースは、人体の全域にわたる全ての細胞型において実際上活性である遺伝子の組、及び遺伝子が読み取られる場所を決定するゲノム領域であるものを、系統的に、正確に調査してきた。したがって、このデータベースは、様々なサブタイプの活性エンハンサー配列を大量に含んでいる。このデータを参照して、エンハンサーを選択するために、ヒトエンハンサーのためのＰｒＥＳＳＴｏ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｌｉｄｅｒ Ｓｅｌｅｃｔｏｒ Ｔｏｏｌ）を用いた（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｈａｎｃｅｒ．ｂｉｎｆ．ｋｕ．ｄｋ／ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．ｐｈｐ）。ＰｒＥＳＳＴｏは、スライダーに基づいて、多数の細胞又は組織のうちの１つにおいて発現したエンハンサーの選択を可能にする。
特定の細胞型に特異的であり、かつ転写開始部位の上流に位置する、エンハンサー配列をコンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で選択した。そのために、コンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）での選択方法は、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＡＮｎｏｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ”ＦＡＮＴＯＭ５データベース（ＲＩＫＥＮにより作製）３、４に基づいた。このＦＡＮＴＯＭ５データベースは、人体の全域にわたる全ての細胞型において実際上活性である遺伝子の組、及び遺伝子が読み取られる場所を決定するゲノム領域であるものを、系統的に、正確に調査してきた。したがって、このデータベースは、様々なサブタイプの活性エンハンサー配列を大量に含んでいる。このデータを参照して、エンハンサーを選択するために、ヒトエンハンサーのためのＰｒＥＳＳＴｏ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｌｉｄｅｒ Ｓｅｌｅｃｔｏｒ Ｔｏｏｌ）を用いた（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｈａｎｃｅｒ．ｂｉｎｆ．ｋｕ．ｄｋ／ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．ｐｈｐ）。ＰｒＥＳＳＴｏは、スライダーに基づいて、多数の細胞又は組織のうちの１つにおいて発現したエンハンサーの選択を可能にする。
【0168】
特異的なエンハンサー配列を選択する第１のステップは、ＦＡＮＴＯＭ５データベースでレポートされたＣａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）スコアに基づいた。対象細胞型（Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の百分率を選択し、すなわちＴ細胞は６０％、ＮＫ細胞は３０％とした。細胞型ごとの百分率の数は、全細胞からのＣＡＧＥタグの計数に対して相対的な、所与の細胞集団におけるＣＡＧＥタグの割合を指す。百分率の数は、以下の「最低下限（ｌｏｗｅｓｔ ｂｏｕｎｄ）」の値、すなわち当該細胞型に関する設定値以上の発現率を有するエンハンサーのみを戻した。百分率は、結果ボックス内のヒット数に従って選択した。平均で、当該百分率は、２０ヒット未満であるように設定した。
【0169】
次いで以下の基準に基づいて、同定されたエンハンサー配列候補を選択した：
・対象細胞集団（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を表す、試料中のハイスコア（０．１５ｔａｇ／ｍｉｌｌｉｏｎを超える）
・全ての他の集団に関してのロースコア（０．１５ｔａｇ／ｍｉｌｌｉｏｎ未満）
・ＰｒｅＳＳＴｏで規定されるような、所与の集団においてのみ有意に高頻度である
・対象細胞集団（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を表す、試料中のハイスコア（０．１５ｔａｇ／ｍｉｌｌｉｏｎを超える）
・全ての他の集団に関してのロースコア（０．１５ｔａｇ／ｍｉｌｌｉｏｎ未満）
・ＰｒｅＳＳＴｏで規定されるような、所与の集団においてのみ有意に高頻度である
【0170】
選択されたエンハンサー配列候補を、その後、ＵＣＳＣゲノムブラウザーツールを通して利用可能である、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータに基づいて確認した（Ｋｅｎｔ ＷＪ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ ａｔ ＵＣＳＣ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｎ；１２（６）：９９６－１００６ － ＰｒＥＳＳＴｏツールの中の「Ｖｉｅｗ ｉｎ ＵＣＳＣ」タブ経由で又はｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙにおける、選択された配列に対して特に利用可能なリンク）。対象系統に関連する（例えば、造血系におけるＰＯＵ２Ｆ２、Ｔ細胞に関するＧＡＴＡ３）、又は活性領域の示唆である（例えば、ＰＯＬＲ２Ａ）、転写因子固定部位の存在を解析した。選択されたエンハンサーの近傍（２０００～３０００ｂｐの範囲内）にこうした部位が存在することは、転写的に活性である領域の示唆であると考えられた７。
【0171】
さらなるバイオインフォマティック解析を用いて、残りの候補制御領域に対して、以下の細胞特異的エピジェネティック特性（ＥＮＣＯＤＥデータベース）を用いてよりストリンジェントな選択基準を課した：（１）クロマチンアクセシビリティ（すなわち、ＤＮａｓｅ－ｓｅｑ、ＦＡＩＲＥ－ｓｅｑ）及び（２）非活性のエンハンサー領域からの分化活性のヒストン修飾（Ｈ３Ｋ２７ａｃに関するＣｈｉＰ－Ｓｅｑ）。説明の目的のために、Ｂ細胞特異的なエンハンサー候補を選択するために以下の戦略を用いた。Ｂ－細胞特異的制御領域（すなわち、他においてはそうではなく、Ｂ細胞のゲノム領域において特異的であるＣＡＧＥシグナル）を選択するＰｒＥＳＳＴｏツールを用いた後で、それら候補制御領域のゲノムの座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を、Ｇａｌａｘｙバイオインフォマティックウェブポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇ／、Ｅｎｉｓ Ａｆｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６，Ｉｓｓｕｅ Ｗ１，２ Ｊｕｌｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ Ｗ５３７－Ｗ５４４）に送信した。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞、単球及び／又は好中球及び／又はＣＤ３４＋細胞である、対象とするヒト細胞型に関して、クロマチンアクセシビリティ（ＦＡＩＲＥ－Ｓｅｑ又は／及びＤＮａｓｅ－Ｓｅｑ）及びＨ３Ｋ２７ａｃ修飾（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）のために、ＥＮＣＯＤＥから得られたエピゲノムのデータをＧａｌａｘｙポータルにアップロードするために、同じ手順を続けた。次のステップは、Ｂ細胞特異的Ｈ３Ｋ２７Ａｃ富化ピークの存在について、ＰｒＥＳＳＴｏにより発見したＢ細胞制御領域のアンサンブルを交差することであり、これはリストを活性なＨ３Ｋ２７Ａｃシグネチャーを示すＣＡＧＥ領域に制限する。その後、後者の領域を、Ｂ細胞におけるオープンクロマチンの存在（ＤＮＡ－ｓｅｑピークの発生）に関して調べるが、これはＣＡＧＥ Ｂ細胞エンハンサーを、付随するＨ３Ｋ２７Ａｃ修飾（転写活性のエピジェネティックシグネチャー；活性なエンハンサーと強い相関）に加えてＢ細胞中のオープンクロマチン状態のエビデンスを示すものに制限する。さらに、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球及びＣＤ３４＋細胞等である、望まれない細胞型におけるクロマチンオープニング及びＨ３Ｋ２７アセチル化のエビデンスを示す領域を連続的に除去するように、後者リストのパージを行った。得られた最終的なリストは、転写因子結合、高頻度のＤＮＡモチーフの発生（ＭＥＭＥツール）、及び公知の細胞特異的遺伝子の近さのさらなる解析を含めた、ｔａｇシグナルの強度及び細胞特異性に関するＣＡＧＥデータベースにおいて人手により進められた。
【0172】
クローニングのためのエンハンサー増幅
上記した方法論を用いて選択したら、エンハンサー配列候補を、細胞株（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株又はＮＫ９２細胞）のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、その後クローニングプラスミド内に挿入した。ＰＣＲプライマーを設計するために、ＰＣＲ単位複製配列サイズを最小限にすることを目指して、１８から２２個のヌクレオチドの一対のプライマーは、同様の融点を有し、且つ少なくとも１０個のヌクレオチドのエンハンサー配列から離間している。当該ＰＣＲプライマーの特異性は、ＵＣＳＣゲノムブラウザーツールを用いて確認した。当該プライマーは、有効な切断を可能にするために、無作為に選択された６ｂｐの制限酵素部位を付加するように設計した（表ＩＩの小文字）。
上記した方法論を用いて選択したら、エンハンサー配列候補を、細胞株（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株又はＮＫ９２細胞）のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、その後クローニングプラスミド内に挿入した。ＰＣＲプライマーを設計するために、ＰＣＲ単位複製配列サイズを最小限にすることを目指して、１８から２２個のヌクレオチドの一対のプライマーは、同様の融点を有し、且つ少なくとも１０個のヌクレオチドのエンハンサー配列から離間している。当該ＰＣＲプライマーの特異性は、ＵＣＳＣゲノムブラウザーツールを用いて確認した。当該プライマーは、有効な切断を可能にするために、無作為に選択された６ｂｐの制限酵素部位を付加するように設計した（表ＩＩの小文字）。
【0173】
表ＩＩは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ抽出物からのエンハンサー配列を増幅するように設計した全ＰＣＲプライマー（大文字）、それらの並置した制限部位（小文字）、及びそれらのＰＣＲ増幅条件を列記している。ＰＣＲは、製造元の指示（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州）に従って、Ｑ５ポリメラーゼを用いて行った。増幅条件は以下のとおりであった：
変性：９８℃を３０秒間；
増幅（３５サイクル）：９８℃を１０秒間／Ｔｍ℃＊を３０秒間／７２℃を３０秒間；及び
伸長：７２℃で２分
＊反応ごとの適切なＴｍは表Ｉに示している）。
変性：９８℃を３０秒間；
増幅（３５サイクル）：９８℃を１０秒間／Ｔｍ℃＊を３０秒間／７２℃を３０秒間；及び
伸長：７２℃で２分
＊反応ごとの適切なＴｍは表Ｉに示している）。
【0174】
【表2】
【0175】
ＰＣＲ産物の長さは、アガロースゲルで確認して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標） ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ連邦共和国）を用いて精製した。その後ＰＣＲ産物を、クローニングのために対応する制限酵素（表１を参照）で消化した。
【0176】
コンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で選択されたエンハンサーより合成プロモーターを作製するためのクローニング戦略
選択され且つＰＣＲ増幅されたエンハンサーから特異的なプロモーターを生成するために、内在性エンハンサー配列を、最小プロモーター、すなわちＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ：ＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ ＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣ ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣ、配列番号６）の上流でクローニングした５。発現パターンアッセイを通して当該合成プロモーター（エンハンサー＋ｍｉｎＣＭＶ）の特異性を確認するために、該合成プロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の上流にクローニングした。これら試験を実行するために、適切な制限酵素で消化したｐＥＮＴＲ１ａベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、＃１１８１３－０１１）の骨格を用いて、ｐＥＮＴＲ１ａベクターの自己ライゲーションを防止するために、組換えシュリンプアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州）で処理した。Ｔ３リガーゼ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州）を用いたライゲーション反応を行って、最終プラスミドを作製した。
選択され且つＰＣＲ増幅されたエンハンサーから特異的なプロモーターを生成するために、内在性エンハンサー配列を、最小プロモーター、すなわちＣＭＶ最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ：ＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ ＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣ ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣ、配列番号６）の上流でクローニングした５。発現パターンアッセイを通して当該合成プロモーター（エンハンサー＋ｍｉｎＣＭＶ）の特異性を確認するために、該合成プロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子の上流にクローニングした。これら試験を実行するために、適切な制限酵素で消化したｐＥＮＴＲ１ａベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、＃１１８１３－０１１）の骨格を用いて、ｐＥＮＴＲ１ａベクターの自己ライゲーションを防止するために、組換えシュリンプアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州）で処理した。Ｔ３リガーゼ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州）を用いたライゲーション反応を行って、最終プラスミドを作製した。
【0177】
Ｔｅｎｈ（Ｃｈｒ１６－４４５）に関する詳細なクローニング戦略を、図１Ａ～Ｂ（経緯を下から上に示す）に示している。簡潔には、ｐＥＮＴＲ１ａ ｇａｔｅｗａｙプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社、＃１１８１３－０１１）内に、ｐＩＲＥＳ２－ＡｃＧＦＰ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ社）よりのＩＲＥＳ－ＧＦＰ配列を挿入することによって、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを得た。ｍｉｎＣＭＶをまた、（ＣｌｏｎＴｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ社）から切断し、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ酵素を用いて挿入して、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ｍｉｎＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを得た。次いでＩＲＥＳ配列を、この配列が合成プロモーターの機能及び特異性に干渉するのを防ぐために、消化ＸｈｏＩ－ＮｃｏＩによって除去し、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰを作製した。ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルを、ｍＲＮＡを安定化するようにＧＦＰの下流に挿入し、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを作製した。ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）配列を、鋳型としてプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社 ＃４５４６１）を用いてＰＣＲで増幅した。このｐＥＮＴＲ１Ａ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡプラスミドは、全てのエンハンサー配列をクローニングして、インビトロでの発現パターン解析実験を実施するために用いたプラスミドであった。上記のように、選択されたエンハンサーのＰＣＲ単位複製配列を、適切な制限酵素（表ＩＩに列記した）を用いて消化して、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ内のｍｉｎＣＭＶ配列の上流に挿入した。プラスミドを配列決定して、コンストラクトが設計した配列に対応することを確かめた。
【0178】
次いで、インビボで及び／又はＮＫ細胞において発現パターン試験を実施するために、レンチウイルス粒子を産生した。当該粒子を産生するために、最初にｐＨＲ－ＳＩＮベクター骨格を用いた。クローニング戦略を、図２に示している。簡潔には、ｐＨＲ－ＳＩＮ－ＳＦＦＶ－ＧＦＰベクター（親切にもフランス国Ｅｌｓ Ｖｅｒｏｈｅｙｅｎ氏により与えられた）内に元々含まれる脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）－ＧＦＰ配列が欠如しているｐＨＲ－ＳＩＮ－Ｄｅｓｔベクターは、ＳＦＦＶ－ＧＦＰフラグメントを置換するようにｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ／ＴＯ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ社、＃１７２９３）から増幅されたＬＲクローニング部位（ａｔｔＢ１／ａｔｔＢ２）を導入することによって生成した。このプラスミドを用いて、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲクロナーゼキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ国）を用いて、製造元の指示に従い、ｐＥＮＴＲ１ａ（上記に記載）よりの「ＥＮＨ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ」配列を挿入した。ウイルス粒子を産生するために、このベクターを、３種の他のもの、パッケージング酵素を提供するｐ８．９１と、ＣＤ３４＋形質導入を最適化する麻疹ウイルスタンパク質をコードする２つのベクターｐＨδ３０及びｐＦδ２４と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）内に同時トランスフェクトした８、９。ＮＫ細胞トランスフェクションに関しては、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｐＢａＥＶベクター、親切にもＥｌｓ Ｖｅｒｏｈｅｙｅｎ氏により与えられた）をもつレンチウイルス粒子を産生した１０。
【0179】
Ｔｅｎｈ（Ｃｈｒ１６－４４５）、ＮＫｓｐｅ（ＮＫ６）及びＢｅｎｈ（Ｂ１、配列番号２３）のインビトロにおける確認
コンストラクトの特異性を評価するために、ベクターを、種々の造血系起源のヒト細胞株内にトランスフェクトした。まず、Ｔｅｎｈ（Ｃｈｒ１６－４４５）に関しては、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｔ細胞株、ＡＴＣＣ ＩＢ－１５２）及びＫ－５６２細胞（赤血球系骨髄細胞株、ＣＣＬ－２４３）をトランスフェクトした。ｐＥＮＴＲ１Ａ－Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡは、製造元の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ国）を用いてトランスフェクトした。ＧＦＰシグナルは、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＩＩ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）で解析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞のみにおいて、ＧＦＰが発現されたことが観察された。これら知見を、次いで一次ヒト細胞において確認した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（同意書がある健常な対照から得た（ＲＥＢ＃３５２７））を、Ｌｏｎｚａ社のヒト単球のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを用いて電気穿孔によって遺伝子導入（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、そしてＧＦＰを発現する亜集団を、フローサイトメトリーで同定した。抗ＣＤ１９抗体を用いてＢ細胞（抗ＣＤ１９ ＰＥクローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を同定し、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞（抗ＣＤ３ ＰＥクローンＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を同定し、また抗ＣＤ１４抗体を用いて単球（抗ＣＤ１４ ＡＰＣ－Ｃｙ７、クローンＨＣＤ１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を同定した。
コンストラクトの特異性を評価するために、ベクターを、種々の造血系起源のヒト細胞株内にトランスフェクトした。まず、Ｔｅｎｈ（Ｃｈｒ１６－４４５）に関しては、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｔ細胞株、ＡＴＣＣ ＩＢ－１５２）及びＫ－５６２細胞（赤血球系骨髄細胞株、ＣＣＬ－２４３）をトランスフェクトした。ｐＥＮＴＲ１Ａ－Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡは、製造元の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ国）を用いてトランスフェクトした。ＧＦＰシグナルは、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＩＩ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）で解析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞のみにおいて、ＧＦＰが発現されたことが観察された。これら知見を、次いで一次ヒト細胞において確認した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（同意書がある健常な対照から得た（ＲＥＢ＃３５２７））を、Ｌｏｎｚａ社のヒト単球のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを用いて電気穿孔によって遺伝子導入（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、そしてＧＦＰを発現する亜集団を、フローサイトメトリーで同定した。抗ＣＤ１９抗体を用いてＢ細胞（抗ＣＤ１９ ＰＥクローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を同定し、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞（抗ＣＤ３ ＰＥクローンＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を同定し、また抗ＣＤ１４抗体を用いて単球（抗ＣＤ１４ ＡＰＣ－Ｃｙ７、クローンＨＣＤ１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を同定した。
【0180】
ＮＫｓｐｅエンハンサー（ＮＫ６）の特異性を試験するために、類似の戦略を用いた。ベクターは、様々な造血系起源の細胞株内に、ｐＥＮＴＲ１ａ－ＮＫ６－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡがトランスフェクトされた。この実験に関しては、ＮＫ－９２（ＮＫ細胞株、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２４０７）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株、ＡＴＣＣ ＩＢ－１５２）、６９７（Ｂ細胞株、ＤＳＭＺ ＡＣＣ４２）及びＫ－５６２（骨髄細胞系列、ＣＣＬ－２４３）の細胞がトランスフェクトされた。
【0181】
Ｂ細胞特異的エンハンサー（Ｂｅｎｈ、配列番号２３）がＢ細胞株においてタンパク質の発現を誘導する能力について、Ｂｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードするＢａＥＶレンチウイルス粒子をＮａｌｍ６細胞株（Ｂ細胞株、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２７３）に形質導入することによって試験した。ＧＦＰ発現パターンを、抗ＣＤ１９抗体共染色Ｂ細胞（抗ＣＤ１９ ＰＥクローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてフローサイトメトリーによって解析した。
【0182】
Ｔ細胞特異的な（Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５）、ＮＫ細胞特異的な（ＮＫ８）、及びＢ細胞特異的なプロモーターコンストラクトのインビボにおける確認
ＧＦＰ発現パターンがインビボで同様であったか否かを評価するために、臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）に、Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＣＡＲ－ＣＤ２２－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ又はＢｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡのいずれかをコードする麻疹又はＢａＥＶのレンチウイルス粒子を形質導入した。臍帯血は、母親の同意書がある研究のためのＣＨＵ Ｓａｉｎｔｅ－Ｊｕｓｔｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋ ｏｆ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄより得た。簡潔には、２００μＬの濃縮した麻疹レンチウイルス粒子を、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、米国）を含有した１２ウェルプレート中で、３７℃で４時間、被覆した。５ｎＭのラパマイシン及び３μＭのＣＩＨＲ９９０２１を含有した１５０μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ社、カナダ国）中の２５０，０００個の精製したＣＤ３４＋ ＨＳＣを加えて、ｓｔｅｍ性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を維持した１２。次いで当該プレートを、１時間１，０００ｇで遠心分離して、その後７００μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ／ラパマイシン／ＣＩＨＲ９９０２１培地を加えた。細胞を３日間培養して、次いでマウスに注射した。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧマウス）を、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所より取得し（＃００５５５７）、特定の無菌条件下で、飼育及び維持した。マウスは、２Ｇｙでのガンマ線照射により前準備した。レンチウイルス粒子と接触させた１０５個のＣＤ３４＋細胞を、７～１１週齢のＮＳＧマウスに静脈注射（ＩＶ）した。
ＧＦＰ発現パターンがインビボで同様であったか否かを評価するために、臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）に、Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、Ｔｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＣＡＲ－ＣＤ２２－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ又はＢｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡのいずれかをコードする麻疹又はＢａＥＶのレンチウイルス粒子を形質導入した。臍帯血は、母親の同意書がある研究のためのＣＨＵ Ｓａｉｎｔｅ－Ｊｕｓｔｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋ ｏｆ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄより得た。簡潔には、２００μＬの濃縮した麻疹レンチウイルス粒子を、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、米国）を含有した１２ウェルプレート中で、３７℃で４時間、被覆した。５ｎＭのラパマイシン及び３μＭのＣＩＨＲ９９０２１を含有した１５０μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ社、カナダ国）中の２５０，０００個の精製したＣＤ３４＋ ＨＳＣを加えて、ｓｔｅｍ性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を維持した１２。次いで当該プレートを、１時間１，０００ｇで遠心分離して、その後７００μＬのＳｔｅｍＳｐａｎ／ラパマイシン／ＣＩＨＲ９９０２１培地を加えた。細胞を３日間培養して、次いでマウスに注射した。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧマウス）を、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所より取得し（＃００５５５７）、特定の無菌条件下で、飼育及び維持した。マウスは、２Ｇｙでのガンマ線照射により前準備した。レンチウイルス粒子と接触させた１０５個のＣＤ３４＋細胞を、７～１１週齢のＮＳＧマウスに静脈注射（ＩＶ）した。
【0183】
改変されたＴ－子孫の成熟がヒト胸腺で発生しているより生理学的な背景においてＴ－細胞特異的プロモーターの活性を試験するために、一群のマウスはまた、予め培養されたヒト胸腺の３片を四頭筋に移植した１３。胸腺片は、Ｓａｉｎｔｅ－Ｊｕｓｔｉｎｅ病院組織倫理審査委員会による研究プロトコルの承認（及びドナーよりの十分な説明に基づく同意書）の後で、心臓手術手順より取得した（胸腺は、当該手術のために除去される）。胸腺片（２～５ｍｍ３）は、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５と１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補ったＨａｍ’ｓ Ｆ－１２ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘ １Ｘ培地（Ｆ１２）中で、ＧｅｌＦｏａｍスポンジ及び０．８μｍのアイソポア膜の上で１０日間培養した１３、１４。
【0184】
マウスは、規則正しく飼育して、ヒト細胞の再構成を観察した。再構成及びＧＦＰ発現は、抗マウスＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン３０Ｆ１１）、抗ヒトＣＤ４５－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＨＩ３１）、抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ（クローンＨＩＢ１９）、抗ヒトＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＨＣＤ１４）、及び抗ヒトＣＤ３－ＡＰＣ（クローンＨＩＴ３ａ）（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社より）を用いてフローサイトメトリーにより解析した。マウスはいずれもＣＨＵ Ｓａｉｎｔｅ－Ｊｕｓｔｉｎｅ研究センターの動物施設において維持した。
【0185】
Ｔ－特異的プロモーターコンストラクト（Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５）の機能的な確認
Ｔｅｎｈ－プロモーターの治療用途の可能性を評価するために、ｅＧＦＰ配列を、ＣＡＲ－ＣＤ３３又はＣＡＲ－ＣＤ２２をコードする配列で置換した。ゲムツズマブオゾガマイシンモノクローナル抗体１５（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＳｃＦｖ配列を合成して、当該配列を第２代のＣＡＲコンストラクト（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）内にクローニングすることによって、ＣＡＲ－ＣＤ３３を生成した。ＣＡＲ－ＣＤ２２コンストラクトは、２８ｚ及びＢＢｚに融合したｍ９７１ ＳｃＦｖ配列に基づいた（Ｈａｓｏ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（７）：１１６５－１１７４）。ＣＡＲ－ＧＤ２コンストラクトは、第２代ＣＡＲコンストラクト（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）内にクローニングした１４ｇ２ａ ＳｃＦｖ配列（Ｌｏｕｉｓ ＣＵ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８：６０５０－６）に基づいた。ＶＳＶｇレンチウイルス粒子を産生するために、コンストラクトを、ｐＨＲＳＩＮベクター内にクローニングし、また粒子を、上記に記載したようにＨＥＫ２９３において産生した。
Ｔｅｎｈ－プロモーターの治療用途の可能性を評価するために、ｅＧＦＰ配列を、ＣＡＲ－ＣＤ３３又はＣＡＲ－ＣＤ２２をコードする配列で置換した。ゲムツズマブオゾガマイシンモノクローナル抗体１５（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＳｃＦｖ配列を合成して、当該配列を第２代のＣＡＲコンストラクト（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）内にクローニングすることによって、ＣＡＲ－ＣＤ３３を生成した。ＣＡＲ－ＣＤ２２コンストラクトは、２８ｚ及びＢＢｚに融合したｍ９７１ ＳｃＦｖ配列に基づいた（Ｈａｓｏ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（７）：１１６５－１１７４）。ＣＡＲ－ＧＤ２コンストラクトは、第２代ＣＡＲコンストラクト（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）内にクローニングした１４ｇ２ａ ＳｃＦｖ配列（Ｌｏｕｉｓ ＣＵ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８：６０５０－６）に基づいた。ＶＳＶｇレンチウイルス粒子を産生するために、コンストラクトを、ｐＨＲＳＩＮベクター内にクローニングし、また粒子を、上記に記載したようにＨＥＫ２９３において産生した。
【0186】
一次Ｔ細胞は、健常なドナーの１０ｍｌ血液試料から単離した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）により単離して、そしてＴ細胞を、Ｔ細胞富化キット（＃１９０５１、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ国）を用いて精製した。次いで５０万（５００，０００）個のＴ細胞を、３０Ｕ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－２及び１：１の比でのダイナビーズ（１２．５μＬ／ウェル；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補った９００μＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で培養した。２日目に、１００μＬの濃縮したレンチウイルス粒子を、８μｇ／ｍＬのプロタミン硫酸塩と共に加えて、翌６日間の間培養した。組換えヒトＩＬ－２（３０Ｕ／ｍＬ）を、１日置きに加えた。Ｔ細胞表面におけるＣＡＲ－ＣＤ３３の発現は、可溶性ＣＤ３３－Ｆｃキメラタンパク質（Ｓｉｇｌｅｃ３／ＣＤ３３ Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミシガン州）を用いて検証し、そしてフローサイトメトリーによって、ポリクローナル抗ＩｇＧ ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて二次染色によって検出した。同様にＣＡＲ－ＣＤ２２発現の検出は、２μｌのＳｉｇｌｅｃ２（ＣＤ２２）－Ｆｃキメラ（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）と共に細胞を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄して、抗Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ社）、抗ＣＤ５６－ＡＰＣ及び抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色することによって、行われた。ＣＡＲ－ＧＤ２の検出は、抗マウスＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ社 １１５－０６５－００６）を用いて４℃で３０分間、洗浄して、その後ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色して、行われた。
【0187】
次いでＣＡＲ－ＣＤ３３形質導入Ｔ細胞の機能性について、天然ＣＤ３３＋（ＡＴＣＣ社 ＃ＣＣＬ－２４０）又はＣＤ３３－ ＨＬ－６０細胞株（ＣＲＩＳＰ技術を用いて生成した）に対して細胞傷害性アッセイで評価した。同様に、ＣＡＲ－ＣＤ２２形質導入Ｔ細胞の機能性について、ＲＳ４；１１（ＣＤ２２を発現するＢ－ＡＬＬ細胞株、ＡＴＣＣ社 ＃ＣＲＬ－１８７３）に対して細胞傷害性アッセイで試験し、そしてＣＡＲ－ＧＤ２形質導入Ｔ細胞の機能性について、ＧＤ２を発現するＳＫ－Ｎ－ＤＺ神経芽腫細胞株（ＡＴＣＣ社、ＣＲＬ－２１４９）に対して評価した。簡潔には、ＨＬ－６０（ＣＡＲ－ＣＤ３３のため）、ＲＳ４；１１（ＣＡＲ－ＣＤ２２のため）又はＳＫ－Ｎ－ＤＺ（ＣＡＲ－ＧＤ２のため）の標的細胞を、細胞膜を安定に染色する長い脂肪族末端を備える膜標識色素ＰＫＨ２６で染色した。エフェクターＴ細胞と共にインキュベーション後、生存する標的の絶対計数を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数用ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）の使用のみならず生存色素（７－ＡＡＤ）の使用により、算出した。簡潔には、２×１０６個の標的細胞を、ＲＰＭＩ １６４０又はＤ－ＰＢＳ中で２回洗浄し、１００μＬのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃ中で再懸濁して、その後１００μＬのＰＫＨ２６（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｃ中で８μＭ）を加えて、また細胞を室温で５分間インキュベートした。染色は、ＦＢＳを添加することにより停止した。次いで細胞を、様々な比のエフェクター：標的（１：８、１：４、１：２、１：１、２：１、４：１）で蒔き、２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を回収し、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色し、そしてフローサイトメトリーで解析した。以下のとおり細胞障害性を算出した：特異的溶解率％＝１００－［（エフェクター細胞とインキュベーション後のＰＫＨ２６＋ ７－ＡＡＤ－標的の絶対計数）／（単独でのインキュベーション後のＰＫＨ２６＋ ７－ＡＡＤ－標的の絶対計数）×１００］。
【0188】
Ｔ－特異的プロモーターコンストラクト（Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５）下でのＣＡＲのインビトロでのＴ－細胞分化中の発現の動態
まず、臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ（商標）、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）に、上記したＴｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＣＡＲ－ＣＤ２２－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードしたＢａＥＶレンチウイルス粒子を形質導入した。ＣＤ３４＋細胞子孫によるＣＡＲの発現を試験するために、改変されたＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９－ＤＬ４細胞又はＯＰ９（ＤＬ４を含まず）と共に共培養して、ＣＤ３４＋からそれぞれＴ細胞及びＢ細胞への分化を誘導した（Ｌａ Ｍｏｔｔｅ－Ｍｏｈｓ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５（４）：１４３１－９．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｏｃｔ １９）。細胞は、アルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、２０％のＨｙＣｌｏｎｅ（商標） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（商標）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｒｐｏｔｅｃｈ社）、５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）及び８００ｕＭのＬ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（シグマ社）、を含有する培地で共培養した。細胞を２週間共培養して、培地は週に２回交換し、またフィーダー細胞（ＯＰ９又はＯＰ９－ＤＬ４）を毎週交換した。異なる亜集団におけるＣＡＲ発現を、以下の２つの抗体パネルを用いたフローサイトメトリーで評価した：１）抗ＣＤ１ａ－ＢＶ４２１（クローンＨＩ４９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ７－ＦＩＴＣ（クローンＭ－Ｔ７０１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＣＤ４５－ＰｅＣｙ７（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ３４－ＡＰＣ（クローン５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）；及び、２）抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ４５－ＰｅＣｙ７（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）。いずれのパネルにおいても、ＣＡＲ－ＣＤ２２発現の検出は、２μｌのＳｉｇｌｅｃ２（ＣＤ２２）－Ｆｃキメラ（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）と共に４℃で３０分間インキュベートし、洗浄して、抗Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ社）で染色することで行われ、またＤＡＰＩを生存染色として用いた。
まず、臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ（商標）、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）に、上記したＴｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＣＡＲ－ＣＤ２２－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードしたＢａＥＶレンチウイルス粒子を形質導入した。ＣＤ３４＋細胞子孫によるＣＡＲの発現を試験するために、改変されたＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９－ＤＬ４細胞又はＯＰ９（ＤＬ４を含まず）と共に共培養して、ＣＤ３４＋からそれぞれＴ細胞及びＢ細胞への分化を誘導した（Ｌａ Ｍｏｔｔｅ－Ｍｏｈｓ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５（４）：１４３１－９．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｏｃｔ １９）。細胞は、アルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、２０％のＨｙＣｌｏｎｅ（商標） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（商標）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｒｐｏｔｅｃｈ社）、５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）及び８００ｕＭのＬ－アスコルビン酸２リン酸塩（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（シグマ社）、を含有する培地で共培養した。細胞を２週間共培養して、培地は週に２回交換し、またフィーダー細胞（ＯＰ９又はＯＰ９－ＤＬ４）を毎週交換した。異なる亜集団におけるＣＡＲ発現を、以下の２つの抗体パネルを用いたフローサイトメトリーで評価した：１）抗ＣＤ１ａ－ＢＶ４２１（クローンＨＩ４９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ７－ＦＩＴＣ（クローンＭ－Ｔ７０１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＣＤ４５－ＰｅＣｙ７（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ３４－ＡＰＣ（クローン５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）；及び、２）抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ４５－ＰｅＣｙ７（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）。いずれのパネルにおいても、ＣＡＲ－ＣＤ２２発現の検出は、２μｌのＳｉｇｌｅｃ２（ＣＤ２２）－Ｆｃキメラ（５０ｍｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）と共に４℃で３０分間インキュベートし、洗浄して、抗Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ社）で染色することで行われ、またＤＡＰＩを生存染色として用いた。
【0189】
ＮＫ８プロモーターの特異性の評価
ＮＫ８プロモーターの特異性もまた、ＮＫ細胞の分化に好適な条件で、ＯＰ９共培養系において評価した（Ｂｅｃｋ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００９，１５（９）：１０２６－３７）。臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ（商標）、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）を、上記したＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードしたＢａＥＶレンチウイルス粒子で形質導入した。形質導入した細胞を、ＯＰ９細胞と共培養したが、ＮＫ細胞の分化のためにＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して、上記のとおりに行った。ＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーで評価した。細胞亜集団を同定するために、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の共染色を行った。
ＮＫ８プロモーターの特異性もまた、ＮＫ細胞の分化に好適な条件で、ＯＰ９共培養系において評価した（Ｂｅｃｋ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００９，１５（９）：１０２６－３７）。臍帯血から単離したヒトＨＳＣ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｔｌｒａＰｕｒｅ（商標）、ミルテニーバイオテック社（ＭｉｌｔｅｎｙＩ Ｂｉｏｔｅｃ）、ドイツ国）を、上記したＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードしたＢａＥＶレンチウイルス粒子で形質導入した。形質導入した細胞を、ＯＰ９細胞と共培養したが、ＮＫ細胞の分化のためにＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して、上記のとおりに行った。ＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーで評価した。細胞亜集団を同定するために、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の共染色を行った。
【0190】
実施例２：プロモーター配列の試験及び確認
第１のステップは、Ｔ細胞のための合成プロモーターを作製するための特異的なエンハンサーを同定することとした。上記した基準を満たした５種のエンハンサー配列候補を同定した（Ｃｈｒ１６－４４５（配列番号７）；Ｃｈｒ１４－５９１（配列番号１３）；Ｃｈｒ８－４３８（配列番号８）；Ｃｈｒ８－２３０（配列番号９）；Ｃｈｒ１２－１９９（配列番号１０）。それらのうち、各確認ステップが確実であったためＣｈｒ１６－４４５配列を徹底的に調べた。この配列は、表ＩＩＩに詳しいが、高度に反復したモチーフを含有し、また、Ｔ細胞においてのみ有意に過剰発現される（Ｔ細胞においてｔａｇｓ／ｍｉｌｌｉｏｎスコアが０．５１１である）。それは１６番染色体に位置し（位置８８５３６８８３－８８５３７３２７）、そして４４５ヌクレオチド長である。エンハンサー配列の上流２．５ｋｂ内に、例えばＧａｔａ１、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＯＵ２Ｆ２及びＭＹＣ等の転写因子のための２３個の推定結合部位が同定され、それが転写的に活性な領域に位置しているという説得力のある証拠を提供している。
第１のステップは、Ｔ細胞のための合成プロモーターを作製するための特異的なエンハンサーを同定することとした。上記した基準を満たした５種のエンハンサー配列候補を同定した（Ｃｈｒ１６－４４５（配列番号７）；Ｃｈｒ１４－５９１（配列番号１３）；Ｃｈｒ８－４３８（配列番号８）；Ｃｈｒ８－２３０（配列番号９）；Ｃｈｒ１２－１９９（配列番号１０）。それらのうち、各確認ステップが確実であったためＣｈｒ１６－４４５配列を徹底的に調べた。この配列は、表ＩＩＩに詳しいが、高度に反復したモチーフを含有し、また、Ｔ細胞においてのみ有意に過剰発現される（Ｔ細胞においてｔａｇｓ／ｍｉｌｌｉｏｎスコアが０．５１１である）。それは１６番染色体に位置し（位置８８５３６８８３－８８５３７３２７）、そして４４５ヌクレオチド長である。エンハンサー配列の上流２．５ｋｂ内に、例えばＧａｔａ１、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＯＵ２Ｆ２及びＭＹＣ等の転写因子のための２３個の推定結合部位が同定され、それが転写的に活性な領域に位置しているという説得力のある証拠を提供している。
【0191】
同様に、２個の可能性のあるＮＫ－特異的エンハンサー配列を選択したが（ＮＫ６及びＮＫ２０－表ＩＩＩａを参照）、そのうち一方（ＮＫ６）が、予備データにおいて一貫したパターンの発現を結果としてもたらした。この配列は、６番染色体に位置し、３７９ヌクレオチド長であり、また高度に反復するモチーフを含有する。それは、ＮＫ細胞においてのみ有意に過剰発現した（ＮＫ細胞でのｔａｇスコアは０．７１９）。この配列は、２ｋｂ未満の配列内に１９の転写因子結合部位を有する。２０番染色体に位置した第２のＮＫ特異的候補（ＮＫ２０）は、ＮＫ細胞においてｔａｇスコアが１．８２３である。
【0192】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方において導入遺伝子の発現を誘導することとなるエンハンサー配列は、細胞障害性細胞の遺伝子療法の文脈において関心がもたれているであろう。推定のＴ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター配列は、１４番染色体、位置６１８０４５２４－６１８０５１１５（５９１個のヌクレオチド）において同定された。そのｔａｇｓ／ｍｉｌｌｉｏｎスコアは、Ｔ細胞（６．６２９）及びＮＫ細胞（３．３２７）において高く、これら２種の細胞サブタイプにおいてのみ有意な発現がある。４個の転写結合部位－ＲＵＮＸ３、ＧＡＴＡ２、ＦＯＳ及びＪＵＮ－は、エンハンサー配列そのものの範囲内に位置する。
【0193】
また、選択基準に適合した１番染色体、３番染色体、１０番染色体及び１３番染色体において位置する、Ｂ細胞に関する４個の推定特異的エンハンサーも同定された（Ｂ－ｓｐｅ候補＃１、２、３及び４－表ＩＩＩａを参照）。
【0194】
最後に、異なる細胞型に関するいくつかの他の候補エンハンサーも同定された（表ＩＩＩｂ）。
【0195】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【0196】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【0197】
表ＩＩＩａ及びＩＩＩＢに列記したエンハンサー候補をさらに特徴付けるために、バイオインフォマティックス解析を行った。はじめに、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ（ＭＥＭＥ）ツール（Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｌ．Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅｌｋａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２８－３６，ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９４）を用いて配列を解析して、エンハンサー候補の配列内の反復モチーフを同定した。結果を表ＩＶに示している。
【0198】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【0199】
モチーフＩＤの配列
１．ＣＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡ（配列番号６４）
２．ＧＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＡＣＴＧＣＣ（配列番号６５）
３．ＹＳＣＣＴＹＣＣＣＣＷＣＣＹＣＹＴＹＣＣＨ（配列番号６６）
４．ＡＡＡＡＤＡＡＡＮＡＡＡＲＷＡ（配列番号６７）
５．ＹＴＧＧＫＧＧＳＨＲＧＧＳＧＫＳＴＧＴＧ（配列番号６８）
６．ＣＴＣＶＧＶＳＣＤＧＧＮＤＧＣＣＨＧＧＣＨＭＡＮＶＣＣＧＧＧＣＣＷＧＢＢＢＣＧＣＧＧＶＳＧ（配列番号６９）
７．ＴＣＷＳＴＫＴＴＣＴＧ（配列番号７０）
８．ＧＴＧＤＭＡＳＧＴＧＣＣＴＧ（配列番号７１）
９．ＧＣＡＧＣＣＲＣＣＹＣＲＣＫＧＫＣＴＧＡＧ（配列番号７２）
１０．ＣＣＣＣＴＧＣＲＧＡＧＣＡＹＲＧＧＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣ（配列番号７３）
１１．ＴＧＫＣＣＴＣＴＭＣＣＣＡＣＭ（配列番号７４）
１２．ＧＣＣＹＴＢＨＴＧＴＹＡＳＲＣＡＭＡＡＳＭ（配列番号７５）
１３．ＳＷＭＴＧＡＣＡＣＭＣＴＧＴＧＫＧＴＧＴＧＭＳＹＹＷＧＭＭＳＹＣＡＳＹＷＧ（配列番号７６）
１４．ＡＣＹＴＫＣＴＧＣＷＣＷＧＣＣＴＴＭＴＴＴ（配列番号７７）
１５．ＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣ（配列番号７８）
１６．ＡＧＧＨＡＧＣＡＶＡＧＫＣＡＣＣＣＴＣ（配列番号７９）
１７．ＴＢＴＧＧＣＧＡＧＢＣＤＣＣＴＴＮＧＮＨＴＴＣＷＧＹＧＢＧＣＣＨＣＡＣＴ（配列番号８０）
１８．ＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号８１）
１９．ＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＣ（配列番号８２）
２０．ＡＡＡＣＣＡＣＡ
＊モチーフ１及び２は、それぞれ配列番号７及び配列番号１１において高度に反復する（表内の太字）
１．ＣＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡ（配列番号６４）
２．ＧＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＡＣＴＧＣＣ（配列番号６５）
３．ＹＳＣＣＴＹＣＣＣＣＷＣＣＹＣＹＴＹＣＣＨ（配列番号６６）
４．ＡＡＡＡＤＡＡＡＮＡＡＡＲＷＡ（配列番号６７）
５．ＹＴＧＧＫＧＧＳＨＲＧＧＳＧＫＳＴＧＴＧ（配列番号６８）
６．ＣＴＣＶＧＶＳＣＤＧＧＮＤＧＣＣＨＧＧＣＨＭＡＮＶＣＣＧＧＧＣＣＷＧＢＢＢＣＧＣＧＧＶＳＧ（配列番号６９）
７．ＴＣＷＳＴＫＴＴＣＴＧ（配列番号７０）
８．ＧＴＧＤＭＡＳＧＴＧＣＣＴＧ（配列番号７１）
９．ＧＣＡＧＣＣＲＣＣＹＣＲＣＫＧＫＣＴＧＡＧ（配列番号７２）
１０．ＣＣＣＣＴＧＣＲＧＡＧＣＡＹＲＧＧＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣ（配列番号７３）
１１．ＴＧＫＣＣＴＣＴＭＣＣＣＡＣＭ（配列番号７４）
１２．ＧＣＣＹＴＢＨＴＧＴＹＡＳＲＣＡＭＡＡＳＭ（配列番号７５）
１３．ＳＷＭＴＧＡＣＡＣＭＣＴＧＴＧＫＧＴＧＴＧＭＳＹＹＷＧＭＭＳＹＣＡＳＹＷＧ（配列番号７６）
１４．ＡＣＹＴＫＣＴＧＣＷＣＷＧＣＣＴＴＭＴＴＴ（配列番号７７）
１５．ＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣ（配列番号７８）
１６．ＡＧＧＨＡＧＣＡＶＡＧＫＣＡＣＣＣＴＣ（配列番号７９）
１７．ＴＢＴＧＧＣＧＡＧＢＣＤＣＣＴＴＮＧＮＨＴＴＣＷＧＹＧＢＧＣＣＨＣＡＣＴ（配列番号８０）
１８．ＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号８１）
１９．ＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＣ（配列番号８２）
２０．ＡＡＡＣＣＡＣＡ
＊モチーフ１及び２は、それぞれ配列番号７及び配列番号１１において高度に反復する（表内の太字）
【0200】
次に、配列の組において、高頻度の保存された転写因子結合部位及び結合部位の組み合わせの検出を許容するｏＰＯＳＳＵＭツール（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｏｓｓｕｍ．ｃｉｓｒｅｇ．ｃａ／ｏＰＯＳＳＵＭ３／、Ｋｗｏｎ ＡＴ，Ａｒｅｎｉｌｌａｓ ＤＪ，Ｗｏｒｓｌｅｙ Ｈｕｎｔ Ｒ，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＷＷ．Ｇ３．２０１２ Ｓｅｐ；２（９）：９８７－１００２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ １）を用いて、配列を解析した。結果を表Ｖ及び図１３に示している。
【0201】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表6-5】
【表6-6】
【表6-7】
【表6-8】
【表6-9】
【表6-10】
【表6-11】
【0202】
実施例３：Ｔ細胞特異的プロモーターコンストラクト（Ｃｈｒ１６－４４５、配列番号７）のインビトロでの確認
Ｔ細胞特異的合成プロモーターは、上記の同定された選択されたエンハンサー配列及び例えばＣＭＶ等の最小プロモーターを並置することによって作製した。ｐＥＮＴＲ１Ａ－Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターを、Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）及び骨髄細胞株（Ｋ５６２）内にトランスフェクトし、そしてＧＦＰ発現は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞株においてのみフローサイトメトリーによって検出された。反対に、Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶプロモーターの代わりに、非特異的強プロモーター（脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター）をコードするベクターでトランスフェクトした場合、いずれの細胞株もＧＦＰを発現した（図３Ａ）。その後、ヒトＰＢＭＣにＴ細胞特異的合成プロモーターをトランスフェクトして、そしてＧＦＰタンパク質がＴ細胞においてのみ発現し、単球又はＢ細胞では発現せず（図３Ｂ）、一方で当該ＰＢＭＣに非特異的プロモーターをトランスフェクトした場合に、全ての細胞型がＧＦＰを発現したことが観察された。
Ｔ細胞特異的合成プロモーターは、上記の同定された選択されたエンハンサー配列及び例えばＣＭＶ等の最小プロモーターを並置することによって作製した。ｐＥＮＴＲ１Ａ－Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターを、Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）及び骨髄細胞株（Ｋ５６２）内にトランスフェクトし、そしてＧＦＰ発現は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞株においてのみフローサイトメトリーによって検出された。反対に、Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶプロモーターの代わりに、非特異的強プロモーター（脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター）をコードするベクターでトランスフェクトした場合、いずれの細胞株もＧＦＰを発現した（図３Ａ）。その後、ヒトＰＢＭＣにＴ細胞特異的合成プロモーターをトランスフェクトして、そしてＧＦＰタンパク質がＴ細胞においてのみ発現し、単球又はＢ細胞では発現せず（図３Ｂ）、一方で当該ＰＢＭＣに非特異的プロモーターをトランスフェクトした場合に、全ての細胞型がＧＦＰを発現したことが観察された。
【0203】
実施例４：ＮＫ特異的プロモーターコンストラクト（ＮＫ６、配列番号１１）のインビトロでの確認
ＮＫ細胞株（ＮＫ９２）、骨髄細胞株（Ｋ５６２）、Ｂ細胞株（６９７）及びＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ＮＫ６－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターをトランスフェクトした。ＮＫ６合成プロモーターは、ＮＫ９２細胞においてのみＧＦＰ発現を誘導し、一方でＳＦＦＶ強プロモーターが、全ての細胞株において結果としてＧＦＰ発現をもたらし（図４）、ＮＫ６プロモーターの特異性が確認された。
ＮＫ細胞株（ＮＫ９２）、骨髄細胞株（Ｋ５６２）、Ｂ細胞株（６９７）及びＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）に、ｐＥＮＴＲ１Ａ－ＮＫ６－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡベクターをトランスフェクトした。ＮＫ６合成プロモーターは、ＮＫ９２細胞においてのみＧＦＰ発現を誘導し、一方でＳＦＦＶ強プロモーターが、全ての細胞株において結果としてＧＦＰ発現をもたらし（図４）、ＮＫ６プロモーターの特異性が確認された。
【0204】
実施例５：別のＮＫ特異的プロモーターコンストラクト（ＮＫ８、配列番号１４）のインビトロでの確認
ＮＫ８配列の特異性は、ＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡもしくはＳＦＦＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを形質導入したＣＤ３４＋細胞又は形質導入していないＣＤ３４＋細胞を含むＯＰ９共培養系で試験した。ＧＦＰ発現は、ＮＫ８形質導入細胞を含有するウェル中での共培養後に回収された、ＮＫ細胞で観察されたが、Ｂ細胞では観察されなかった（図５）。非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）を形質導入した細胞は、ＮＫ細胞及びＢ細胞両方のＧＦＰの発現につながり、一方で形質導入されていない細胞はＧＦＰ陽性ではなかった。これら結果は、ＮＫ８系合成プロモーターがＮＫ細胞に対して特異的であるという有力な証拠となる。
ＮＫ８配列の特異性は、ＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡもしくはＳＦＦＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを形質導入したＣＤ３４＋細胞又は形質導入していないＣＤ３４＋細胞を含むＯＰ９共培養系で試験した。ＧＦＰ発現は、ＮＫ８形質導入細胞を含有するウェル中での共培養後に回収された、ＮＫ細胞で観察されたが、Ｂ細胞では観察されなかった（図５）。非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）を形質導入した細胞は、ＮＫ細胞及びＢ細胞両方のＧＦＰの発現につながり、一方で形質導入されていない細胞はＧＦＰ陽性ではなかった。これら結果は、ＮＫ８系合成プロモーターがＮＫ細胞に対して特異的であるという有力な証拠となる。
【0205】
実施例６：Ｂ細胞特異的プロモーターコンストラクト（配列番号２３）のインビトロでの確認
Ｂ細胞株（Ｎａｌｍ６）に、Ｂｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードするＢａＥＶ－ＬＶ粒子を形質導入した。Ｂ細胞特異的合成プロモーターは、Ｂ細胞においてＧＦＰの発現を誘導することを示したが（図６）、これはこのプロモーターが、Ｂ細胞特異的な手法で対象タンパク質の発現を誘導することが可能であるということを示唆する。
Ｂ細胞株（Ｎａｌｍ６）に、Ｂｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶ－ＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをコードするＢａＥＶ－ＬＶ粒子を形質導入した。Ｂ細胞特異的合成プロモーターは、Ｂ細胞においてＧＦＰの発現を誘導することを示したが（図６）、これはこのプロモーターが、Ｂ細胞特異的な手法で対象タンパク質の発現を誘導することが可能であるということを示唆する。
【0206】
実施例７：Ｔ－特異的プロモーターコンストラクト（Ｃｈｒ１６－４４５）のインビボでの確認
ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ Ｔ細胞特異的プロモーター又は非特異的ＳＦＦＶプロモーターを形質導入して、ヒト胸腺の共移植をするＮＳＧマウス又は共移植しないＮＳＧマウス（ｈｕＮＳＧ及びＢＬＴのモデル、方法を参照）に移植した。いずれのモデルにおいても、ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の成長が観察され、一方でＣＤ３４＋細胞に我々のＣｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ Ｔ細胞特異的プロモーターを形質導入した場合にＧＦＰを発現したヒト細胞は他になかった（図７Ａ、Ｂ）。対照的に、ＣＤ３４＋に非特異的強プロモーターＳＦＦＶを形質導入した場合には、全ての系統でＧＦＰを発現した（図７Ｃ）。これら結果はまた、操作されたＨＳＣは、骨髄系（単球）及びリンパ系（Ｔ及びＢ細胞）の両方の種々の系統に分化できるということも示す。
ヒトＣＤ３４＋細胞に、Ｃｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ Ｔ細胞特異的プロモーター又は非特異的ＳＦＦＶプロモーターを形質導入して、ヒト胸腺の共移植をするＮＳＧマウス又は共移植しないＮＳＧマウス（ｈｕＮＳＧ及びＢＬＴのモデル、方法を参照）に移植した。いずれのモデルにおいても、ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の成長が観察され、一方でＣＤ３４＋細胞に我々のＣｈｒ１６－４４５－ｍｉｎＣＭＶ Ｔ細胞特異的プロモーターを形質導入した場合にＧＦＰを発現したヒト細胞は他になかった（図７Ａ、Ｂ）。対照的に、ＣＤ３４＋に非特異的強プロモーターＳＦＦＶを形質導入した場合には、全ての系統でＧＦＰを発現した（図７Ｃ）。これら結果はまた、操作されたＨＳＣは、骨髄系（単球）及びリンパ系（Ｔ及びＢ細胞）の両方の種々の系統に分化できるということも示す。
【0207】
実施例８：ＮＫ－特異的プロモーターコンストラクト（ＮＫ８）のインビボでの確認
ヒトＣＤ３４＋細胞に、ＧＦＰ発現を駆動するＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶを形質導入して、インビボでＮＫ細胞特異的プロモーターの特異性を調べた。ＧＦＰを発現するヒトＮＫ細胞は、マウスの血液、脾臓及び骨髄で見られた（図８Ａ、Ｂ）。対照的に、同じマウスから回収したヒトＢ細胞及びＴ細胞でＧＦＰを発現したものはごくわずかであり、このことがＮＫ８合成特異的プロモーターの特異性の証拠となる。
ヒトＣＤ３４＋細胞に、ＧＦＰ発現を駆動するＮＫ８－ｍｉｎＣＭＶを形質導入して、インビボでＮＫ細胞特異的プロモーターの特異性を調べた。ＧＦＰを発現するヒトＮＫ細胞は、マウスの血液、脾臓及び骨髄で見られた（図８Ａ、Ｂ）。対照的に、同じマウスから回収したヒトＢ細胞及びＴ細胞でＧＦＰを発現したものはごくわずかであり、このことがＮＫ８合成特異的プロモーターの特異性の証拠となる。
【0208】
実施例９：Ｂ細胞特異的プロモーターコンストラクト（配列番号２３）のインビボでの確認
ヒトＣＤ３４＋細胞に、ＧＦＰ発現を駆動するＢｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶを形質導入して、インビボでＢ細胞特異的プロモーターの特異性を調べた。ヒト化４週後に、血液中に循環するヒト細胞を、フローサイトメトリーで解析した。この時点では、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）及び単球（ＣＤ１４＋）のみが、ヒト化マウスにおいて成長している。非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）が全ての細胞サブタイプにおいてＧＦＰ発現を誘導した一方で、ＧＦＰ陽性細胞は、Ｂ細胞集団でのみ見られた（図９）。これら結果は、Ｂ細胞合成特異的プロモーターは、Ｂ細胞集団においてのみ特異的に誘導されることを示唆する。
ヒトＣＤ３４＋細胞に、ＧＦＰ発現を駆動するＢｅｎｈ－ｍｉｎＣＭＶを形質導入して、インビボでＢ細胞特異的プロモーターの特異性を調べた。ヒト化４週後に、血液中に循環するヒト細胞を、フローサイトメトリーで解析した。この時点では、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）及び単球（ＣＤ１４＋）のみが、ヒト化マウスにおいて成長している。非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）が全ての細胞サブタイプにおいてＧＦＰ発現を誘導した一方で、ＧＦＰ陽性細胞は、Ｂ細胞集団でのみ見られた（図９）。これら結果は、Ｂ細胞合成特異的プロモーターは、Ｂ細胞集団においてのみ特異的に誘導されることを示唆する。
【0209】
実施例１０：Ｔ－特異的プロモーターコンストラクト（Ｃｈｒ１６－４４５）の機能的な確認
当該コンストラクトの治療上の可能性について、ＣＡＲ－ＣＤ３３、ＣＡＲ－ＣＤ２２又はＣＡＲ－ＧＤ２を用いた細胞傷害性アッセイを介して探索した。ＣＡＲ－ＣＤ３３、ＣＡＲ－ＣＤ２２又はＣＡＲ－ＧＤ２をコードする配列を、非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）の制御下又は合成Ｔ－細胞特異的プロモーター（Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５）の制御下に置いた。それがもつ機能的導入遺伝子の発現を駆動する能力は、一次Ｔ細胞にＣＡＲを形質導入して、そしてＣＤ３３を発現するもしくはしないヒトＡＭＬ細胞株に対して、ＣＤ２２を発現するヒトＡＬＬ細胞株（ＲＳ４；１１）に対して、又はＧＤ２＋神経芽細胞腫（ＮＢ）－細胞株（ＳＫ－Ｎ－ＤＺ）に対して細胞傷害性アッセイを実施することによって、評価した。非特異的ＳＦＦＶプロモーター又はＴ－細胞特異的プロモーターの制御下でのＣＡＲ－ＣＤ３３コンストラクトを形質導入した一次Ｔ細胞は、フローサイトメトリーで確認したとおりＣＡＲ－ＣＤ３３発現を示した（図１０Ａ）。細胞傷害性実験の結果は、ＣＡＲ－ＣＤ３３コンストラクトが、その発現を特異的Ｔ細胞プロモーターが駆動している場合でさえも、ＣＤ３３＋ ＡＭＬ細胞の溶解を有効に引き起こしたということを示す（図１０Ｂ）。ＣＤ３３－細胞（右方側棒グラフ）において測定された非特異的な溶解は最小限であり、またＣＡＲが介在する溶解よりも有意に低かった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。同様に、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーター下で発現したＣＡＲ－ＣＤ２２が、ＳＦＦＶ（強）プロモーターの細胞傷害性と同様である、ＲＳ４；１１ ＡＬＬ－細胞株に対するＣＡＲ特異的細胞傷害性を誘導するのに十分強いＣＡＲ発現を誘導した（図１０Ｃ）。同様に、図１０Ｄに示す結果は、固形腫瘍の文脈において、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターコンストラクト下で発現したＣＡＲ－ＧＤ２がまた、形質導入されていない一次Ｔ細胞より有意に高く（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、また非特異的強プロモーターＳＦＦＶにより駆動されるＣＡＲ－ＧＤ２のレベルに匹敵するレベルで、標的溶解を誘導したことを示す。
当該コンストラクトの治療上の可能性について、ＣＡＲ－ＣＤ３３、ＣＡＲ－ＣＤ２２又はＣＡＲ－ＧＤ２を用いた細胞傷害性アッセイを介して探索した。ＣＡＲ－ＣＤ３３、ＣＡＲ－ＣＤ２２又はＣＡＲ－ＧＤ２をコードする配列を、非特異的強プロモーター（ＳＦＦＶ）の制御下又は合成Ｔ－細胞特異的プロモーター（Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５）の制御下に置いた。それがもつ機能的導入遺伝子の発現を駆動する能力は、一次Ｔ細胞にＣＡＲを形質導入して、そしてＣＤ３３を発現するもしくはしないヒトＡＭＬ細胞株に対して、ＣＤ２２を発現するヒトＡＬＬ細胞株（ＲＳ４；１１）に対して、又はＧＤ２＋神経芽細胞腫（ＮＢ）－細胞株（ＳＫ－Ｎ－ＤＺ）に対して細胞傷害性アッセイを実施することによって、評価した。非特異的ＳＦＦＶプロモーター又はＴ－細胞特異的プロモーターの制御下でのＣＡＲ－ＣＤ３３コンストラクトを形質導入した一次Ｔ細胞は、フローサイトメトリーで確認したとおりＣＡＲ－ＣＤ３３発現を示した（図１０Ａ）。細胞傷害性実験の結果は、ＣＡＲ－ＣＤ３３コンストラクトが、その発現を特異的Ｔ細胞プロモーターが駆動している場合でさえも、ＣＤ３３＋ ＡＭＬ細胞の溶解を有効に引き起こしたということを示す（図１０Ｂ）。ＣＤ３３－細胞（右方側棒グラフ）において測定された非特異的な溶解は最小限であり、またＣＡＲが介在する溶解よりも有意に低かった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。同様に、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーター下で発現したＣＡＲ－ＣＤ２２が、ＳＦＦＶ（強）プロモーターの細胞傷害性と同様である、ＲＳ４；１１ ＡＬＬ－細胞株に対するＣＡＲ特異的細胞傷害性を誘導するのに十分強いＣＡＲ発現を誘導した（図１０Ｃ）。同様に、図１０Ｄに示す結果は、固形腫瘍の文脈において、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターコンストラクト下で発現したＣＡＲ－ＧＤ２がまた、形質導入されていない一次Ｔ細胞より有意に高く（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、また非特異的強プロモーターＳＦＦＶにより駆動されるＣＡＲ－ＧＤ２のレベルに匹敵するレベルで、標的溶解を誘導したことを示す。
【0210】
実施例１１：Ｔ－特異性プロモーターコンストラクト（Ｃｈｒ１６－４４５）下でのＣＡＲのＴ－細胞分化中の発現の動態
インビトロでの胸腺の分化を模倣するＯＰ９－ＤＬ４細胞を用いて、またＣＡＲ－ＣＤ２２コンストラクトを用いて、特異的プロモーターが、Ｔ－細胞分化プロセスの早期において（ＣＤ７＋ＣＤ１＋段階ですぐに）、ＣＡＲ－ＣＤ２２の発現を誘導したことが観察された（図１１Ａ）。対照として、ＨＳＣ改変細胞をＯＰ９細胞と共に共培養したが、これによりＢ細胞分化が結果的に生じ、そして検出されたＣＡＲ発現はなかった（図１１Ｂ）。このデータが、Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５合成プロモーターの特異性をさらに証明する。図１１Ｃに示す結果は、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターは、以下のＴ細胞分化の全ての段階において活性であることを示す：ｐｒｏ－Ｔ、ＣＤ７＋、ＣＤ７＋ＣＤ１ａ＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性のみならずＣＤ４＋及びＣＤ８＋の一重陽性Ｔ細胞において。Ｃｈｒ１６－４４５を逆向きで挿入した場合に同様の結果が得られたが、これによりこの配列が転写エンハンサーの当該特徴を共有することが確認された（すなわち、配向により影響を受けない）。
インビトロでの胸腺の分化を模倣するＯＰ９－ＤＬ４細胞を用いて、またＣＡＲ－ＣＤ２２コンストラクトを用いて、特異的プロモーターが、Ｔ－細胞分化プロセスの早期において（ＣＤ７＋ＣＤ１＋段階ですぐに）、ＣＡＲ－ＣＤ２２の発現を誘導したことが観察された（図１１Ａ）。対照として、ＨＳＣ改変細胞をＯＰ９細胞と共に共培養したが、これによりＢ細胞分化が結果的に生じ、そして検出されたＣＡＲ発現はなかった（図１１Ｂ）。このデータが、Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５合成プロモーターの特異性をさらに証明する。図１１Ｃに示す結果は、Ｔｅｎｈ Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターは、以下のＴ細胞分化の全ての段階において活性であることを示す：ｐｒｏ－Ｔ、ＣＤ７＋、ＣＤ７＋ＣＤ１ａ＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性のみならずＣＤ４＋及びＣＤ８＋の一重陽性Ｔ細胞において。Ｃｈｒ１６－４４５を逆向きで挿入した場合に同様の結果が得られたが、これによりこの配列が転写エンハンサーの当該特徴を共有することが確認された（すなわち、配向により影響を受けない）。
【0211】
実施例１２：Ｔ－特異的プロモーターコンストラクト下での、ＣＡＲを形質導入したＣＤ３４＋細胞のインビボでのＴ－細胞分化
ＣＡＲを形質導入したＣＤ３４＋細胞のインビボでのＴ細胞分化を、形質導入したＣＤ３４＋細胞をヒト胎児胸腺も一緒に移植したマウス（ＢＬＴモデル）において評価した。ヒト化３０週後のマウスの血液試料は、Ｔ細胞がその表面においてＣＡＲ－ＣＤ２２を発現したことを示す（図１２）。先の知見と一致して、Ｂ細胞及び単球はＧＦＰを発現しなかった。Ｃｈｒ１６－４４５を逆向きで挿入した場合に、再び同様の結果が得られた。これら結果により、Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターの特異性が確認されるが、これはまた胸腺選択が、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の成長と干渉していないことを示唆する。
ＣＡＲを形質導入したＣＤ３４＋細胞のインビボでのＴ細胞分化を、形質導入したＣＤ３４＋細胞をヒト胎児胸腺も一緒に移植したマウス（ＢＬＴモデル）において評価した。ヒト化３０週後のマウスの血液試料は、Ｔ細胞がその表面においてＣＡＲ－ＣＤ２２を発現したことを示す（図１２）。先の知見と一致して、Ｂ細胞及び単球はＧＦＰを発現しなかった。Ｃｈｒ１６－４４５を逆向きで挿入した場合に、再び同様の結果が得られた。これら結果により、Ｔ－特異的／Ｃｈｒ１６－４４５プロモーターの特異性が確認されるが、これはまた胸腺選択が、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の成長と干渉していないことを示唆する。
【0212】
本発明はその特定の実施形態により本明細書において上記に説明したが、これは添付の特許請求の範囲において規定されるように主題の発明の趣旨及び性質から逸脱することなしに変形することが可能である。特許請求の範囲においては、「～含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の文言は、オープンエンドの語として用い、実質的に「～を含むがこれに限定されない」の句と同等である。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別段に文脈が明記しない限り、対応する複数形を含める。
【0213】
参考文献
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28. Haso W, Lee DW, Shah NN, et al. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood 2013;121:1165-74.
29. Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 2015;385:517-28.
30. Fitzgerald JC, Weiss SL, Maude SL, et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Crit Care Med 2017;45:e124-e131.
31. Teachey DT, Lacey SF, Shaw PA, et al. Identification of Predictive Biomarkers for Cytokine Release Syndrome after Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Discov 2016;6:664-79.
32. Jena B, Maiti S, Huls H, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS One 2013;8:e57838.
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26. Maude SL, Frey N, Shaw PA, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 2014;371:1507-17.
27. Grupp SA, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med 2013;368:1509-18.
28. Haso W, Lee DW, Shah NN, et al. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood 2013;121:1165-74.
29. Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 2015;385:517-28.
30. Fitzgerald JC, Weiss SL, Maude SL, et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Crit Care Med 2017;45:e124-e131.
31. Teachey DT, Lacey SF, Shaw PA, et al. Identification of Predictive Biomarkers for Cytokine Release Syndrome after Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Discov 2016;6:664-79.
32. Jena B, Maiti S, Huls H, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS One 2013;8:e57838.
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】