(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-23
(54)【発明の名称】切断多価多量体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20220315BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220315BHJP
A01K 67/027 20060101ALN20220315BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12P21/08
C07K16/28
A61K39/395 D
A61K39/395 N
C12N15/13
A01K67/027
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021532958
(86)(22)【出願日】2019-12-30
(85)【翻訳文提出日】2021-06-09
(86)【国際出願番号】 NL2019050880
(87)【国際公開番号】W WO2020141974
(87)【国際公開日】2020-07-09
(31)【優先権主張番号】62/786,806
(32)【優先日】2018-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510340757
【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】コルネリス・アドリアーン・デ・クライフ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4C085AA13
4C085BB31
4C085CC22
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、２つ以上の結合ドメインを含む切断多価多量体であって、各結合ドメインが、異なる抗原又はエピトープに結合し、当該結合ドメインのうちの２つがヒンジ領域により対合され、多量体は、ＣＨ２又はＣＨ３領域を欠いている、切断多価多量体に関する。本発明は、２つ以上のジスルフィド架橋を含むそれぞれのＣ末端又はその付近で対合されている２つのポリペプチドであって、当該ポリペプチドの各々が、可変領域を含む、可変結合ドメインを含み、各可変領域は、抗原上の同じ又は異なる、抗原又はエピトープに結合する、ポリペプチドを更に含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
３つ以上の結合ドメインを含み、Ｎ末端及びＣ末端を有する２つ以上の重鎖領域を含む、多価多量体であって、前記多量体が、前記Ｃ末端で前記重鎖領域のうちの２つを対合するヒンジ領域を含む、多価多量体。
【請求項2】
３つ以上のヒト重鎖可変領域を含み、２つが前記ヒンジ領域で対合されており、前記対合が、１つ以上のジスルフィド架橋を含む、請求項１に記載の多価多量体。
【請求項3】
各重鎖領域が、ＣＨ１ドメインを含む、請求項１又は２に記載の多価多量体。
【請求項4】
２つ以上の重鎖領域が、共通可変領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多価多量体。
【請求項5】
前記２つ以上の重鎖領域が、ヒト軽鎖領域と対合されており、前記軽鎖領域は共通軽鎖である、請求項１～３のいずれか一項に記載の多価多量体。
【請求項6】
前記共通軽鎖が、ＣＬドメインを含む、請求項５に記載の多価多量体。
【請求項7】
前記共通軽鎖が、配列番号１の配列を含む、請求項５又は６に記載の多価多量体。
【請求項8】
前記多量体が３つのＦａｂドメイン（Ｆａｂ１、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３）を含み、各々が、可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と対合されている可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ１）を含む重鎖を含み、Ｆａｂ２及びＦａｂ３は、Ｆａｂ２の重鎖可変領域及びＦａｂ３のＣＨ１ドメインにおいてリンカーにより接続され、前記Ｆａｂ１及びＦａｂ３は、Ｆａｂ１の前記重鎖及びＦａｂ３の前記重鎖の前記Ｃ末端に存在する少なくとも２つのジスルフィド結合を含むヒンジにより対合されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の多価多量体。
【請求項9】
Ｆａｂ２及びＦａｂ３を接続する前記リンカーが、配列番号２～２５の配列を含み、又は前記配列番号２～２５の少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項８に記載の多価多量体。
【請求項10】
前記リンカーのアミノ酸配列が、天然に生じる配列を含む、又は天然に生じる配列に由来する配列を含む、請求項８又は９に記載の多価多量体。
【請求項11】
前記リンカーが、中央ヒンジ領域配列を含む、請求項１０に記載の多価多量体。
【請求項12】
前記リンカーが、上部及び下部ヒンジ配列を含む、請求項１０に記載の多価多量体。
【請求項13】
前記リンカーが、らせん形成配列を含む、請求項１０に記載の多価多量体。
【請求項14】
前記２つ以上の重鎖領域の前記可変領域が、異なるエピトープに特異的に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の多価多量体。
【請求項15】
前記多量体が、少なくとも２つの異なる抗原に結合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の多価多量体。
【請求項16】
多価多量体の製造方法であって、共通軽鎖可変領域及び未再構成重鎖可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物を、２つ以上の抗原で免疫化することと、
前記２つ以上の抗原に特異的に結合する、前記共通軽鎖可変領域及び再構成重鎖抗体鎖を含む、抗体のパネルを得ることと、
前記２つ以上の抗原に特異的に結合する、前記共通軽鎖可変領域及び２つ以上の再構成重鎖をコードする、核酸を宿主細胞に組み込むことであって、前記再構成重鎖のうちの２つが、ジスルフィド架橋の形成により対合可能なＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む、組み込むことと、
前記宿主細胞を、前記共通軽鎖及び２つ以上の再構成重鎖を含む無傷の多価多量体の発現をもたらす条件下で培養することであって、前記再構成重鎖のうちの２つが、前記２つの再構成重鎖の各々の前記ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間でジスルフィド架橋により対合される、培養することと、
前記無傷の多価多量体を、前記２つの再構成重鎖の各々から前記ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断する酵素により処理し、前記２つの再構成重鎖のジスルフィド架橋による前記対合を維持して、前記多価多量体を形成することと、を含む、方法。
【請求項17】
ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む、前記２つの重鎖が、相補的な修飾を含み、ヘテロ二量体化を促進する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記修飾が、免疫グロブリンＣＨ２又はＣＨ３領域にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記相補的な修飾が、孔修飾、静電修飾、又はＤＥＫＫ修飾したノブを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記２つの重鎖のうちの第１の重鎖が、前記２つの重鎖のうちの第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインと二量体化する第１のＣＨ３ドメインを含み、そのうちの前記第１のＣＨ３は、３５１位及び３６６位又はそれに対応する位置にアミノ酸残基リジンを含み、そのうちの前記第２のＣＨ３は、３５１位又はそれに対応する位置にアスパラギン酸のアミノ酸残基、及び３６８位又はそれに対応する位置にグルタミン酸のアミノ酸残基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記共通可変領域が、その生殖細胞系列中の、再構成可変鎖核酸配列を含むトランスジェニックげっ歯類によってコードされる核酸から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記酵素をタグ付けし、前記酵素を抗タグ親和性カラムにより除去することによって、前記多価多量体を回収することを更に含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法によって製造された、又は得ることが可能な、多価多量体。
【請求項24】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の多価多量体に組み立てることが可能なポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む、細胞。
【請求項25】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の多価多量体と、医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項26】
医療上の適応症に罹患している対象の治療方法であって、治療有効量の、請求項１～１５のいずれか一項に記載の多価多量体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項27】
治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の多価多量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ末端でヒンジにより対合されている２つ以上の結合ドメインを有する多価多量体、及びこのような多価多量体の作製方法に関する。本発明は更に、２つ以上のエピトープ又は抗原に結合することが可能な多価多量体の構成ポリペプチドに関するものであり、このようなポリペプチドは、ジスルフィド架橋を含む共有結合により対合されている。
【背景技術】
【0002】
２つの抗原又は２つのエピトープに結合することが可能な二重特異性抗体などの多価抗体は、当該技術分野において既知である。このような多価結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、又は組換えＤＮＡ技術を含む様々な技術を使用して生成することができる。
【0003】
抗体は、典型的には、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含む４つのタンパク質で構成される多量体であり、重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）、及び３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成され、軽鎖は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）から構成される。典型的には、軽鎖は、非共有相互作用の影響を通じて、更にはジスルフィド結合により重鎖と対合する。２つの重鎖は、ヒンジ領域でジスルフィド結合により、及び２つのＣＨ３ドメイン間の界面でのアミノ酸相互作用を通じて、対合する。ＶＨとＶＬとの対合により、抗原結合ドメインを形成し、典型的には、可変性は、相補性決定領域又はＣＤＲである、ＶＨ及びＶＬドメイン内の３つの表面ループ形成領域において見出される。
【0004】
２つの異なる抗原、又は同じ抗原内の２つの異なるエピトープに結合し得る、二重特異性抗体などの２つの異なる結合ドメインを有する抗体など、特定の多価フォーマットは、当該技術分野において既知である。このようなフォーマットでは、多価多量体が、１つの抗原を発現する正常な細胞を標的化することも、又はより低いレベルで１つの抗原を発現するこのような正常な細胞を標的化することもなく、腫瘍細胞などの２つの抗原又はエピトープを発現する細胞又は標的を選択的に標的化することを可能にする調整された結合の使用を可能にし得る。同様に、多価多量体上に、二重特異性抗体などの２つの異なる結合ドメインを有することにより、異なる抗原の結合が可能となり、それにより、当該多価多量体を使用して、単一細胞又は２つの相互作用する細胞上の阻害分子及び刺激分子の両方を標的化することができ、その結果、多価多量体の効力が高まる。多価フォーマットはまた、腫瘍にリダイレクトされ得る、例えば免疫調節細胞といった細胞をリダイレクトするために使用され得る。
【0005】
特定の多価抗体が当該技術分野において記載されてきたが、当該技術分野では、多価抗体フォーマットの効率的な製造を可能にし、一連の抗原に対するその結合ドメインを容易に作製及び効率的かつ安定的に多価多量体に変換でき、そして、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を含むＦｃ領域を（部分的に若しくは全体的に）欠くフォーマットをはじめとする、多岐にわたる抗原及びエピトープに結合することが可能な、新たなフォーマット及び新たなリンカー及びそのようなフォーマットを製造するための方法論が必要とされている。
【0006】
Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）ｎ（但し、ｎ＝２以上）フォーマットなどのＦｃを欠く多重特異性フォーマットを生成することにより、既存の多重特異性抗体に対して効果をもたらすことができる。例えば、免疫調節細胞の結合又はリダイレクティングが、このような細胞及び対象とする抗原を標的化することによって望まれ得る場合、このような標的部分上のＦｃ構成要素の存在は、特定の用途に関して、効力に悪影響を及ぼすことがある。
【0007】
同様に、Ｆ（ａｂ’）ｎ多重特異的フォーマットは、固体腫瘍を浸潤する可能性のため、及び／又はこのような特徴により投与レジメンに効果を得ることができる短い半減期を提供するためになど、より小さいサイズが好ましい完全長フォーマットと比較して望ましい場合がある。重要なことに、異なる標的を有する３つ以上の結合ドメインを含有するＦ（ａｂ’）ｎを遺伝子操作することは、従来から、時間がかかり、非効率的であり、及び／又はコストがかかっている。例えば、様々な方法を通じてＦ（ａｂ’）２部分を生成することは当該技術分野において既知であり、治療用途のためのこのような部分の均質なバッチの大量生産をもたらすことが目標である場合、これらの各々には欠点がある。
【0008】
当該技術分野において既知のＦ（ａｂ’）２を生成する１つの方法は、化学的手段によるものであった。Ｎｉｓｏｎｏｆｆ及びＲｉｖｅｒｓは、化学的な対合の製造を数十年前に採用した。Ｎｉｓｏｎｏｆｆ Ａ，Ｒｉｖｅｒｓ ＭＭ（１９６１）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ９３：４６０。その後、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性化学試薬を使用する様々な方法が開発されてきた。今日まで、治療用多重特異的Ｆ（ａｂ’）ｎ候補の開発のためのアプローチとして効率的に又は実行可能に使用することができる化学的方法論は、このような化学的手段によって生じることがある時間、コスト、低量、及び不均一性により、存在しない。同様に、Ｆ（ａｂ’）ｎ部分の化学合成のこのような手段もまた、２つのＦａｂドメインを対合する合成手段の使用によって不利であり、これによると、治療用途の使用に関する別個の懸念、及び製造の問題を引き起こす。
【0009】
例えば、Ｆ（ａｂ’）２は、ｏ－ＰＤＭを使用して作製することができる。抗体「Ａ」のＦａｂ’断片をｏ－ＰＤＭと反応させることにより、ビシナルジチオールがｏ－ＰＤＭ（Ｒ）と錯形成し、ｏ－ＰＤＭに結合したＳＨ基のうちの１つが、残っている遊離マレイミド基と結合する。Ｆａｂ Ａ－ｏ－ＰＤＭを遊離Ｆａｂ’「Ｂ」断片と反応させて、２つのＦａｂ間でチオエーテル結合を得る。これらの生成の合成手段に関連する困難性には、このような実体を均質になるまで精製することの困難性、並びに免疫原性及びインビボでの安定性の欠如につながる可能性があるヒト抗体のヒンジ領域の変更なしにこのような部分を構築することの困難性が含まれることに留意されたい。
【0010】
実際に、このような人工抗体は、２０００年代中に生成され、化学的に対合されているＦａｂを用いた臨床試験は、様々な種類の癌の治療に関して行われたが、この概念は、それらの実現可能性の欠如などにより、取り下げられたと見られる。
【0011】
Ｆ（ａｂ’）２部分を生成する別の手段は、パパインなどの非特異的プロテアーゼによるＩｇＧの部分的なタンパク質分解消化によっていた。このような酵素は、重鎖を対合するジスルフィド結合を含有する、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域を切断することができるばかりでなく、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の部位の下方も切断することができる。このような技術は、未消化のＩｇＧの存在、過剰消化、及び再現性の欠如に悩まされている。このような非特異的プロテアーゼの使用はまた、完全長抗体の消化によってＦｃを切断することによる、Ｆ（ａｂ’）２部分を生成する手段として採用されている。これらの技術ではまた、時間がかかり、ＩｇＧ特異的な最適化及びプロテアーゼの阻害、又はそれらの分解を防止するためのＦａｂの精製も必要とされている。更に、これらの消化は、過剰に消化された部分、不十分に消化された部分、及び切断部位に関して精度のない部分の異種集団につながり、研究及び治療用途のためのこのような部分の使用を非実用的にしてきた。上部ヒンジ領域のみが切断されるように、及び、切断される抗体の構造及び柔軟性に応じて生じることがある代替の部位で更に切断されないように、パパイン消化を制御することは困難であった。したがって、２つ以上の結合ドメインを有する多価抗体のパパインによる消化は、特定の用途には不十分であり、実行不可能である。同様に、ペプシンは、無傷のＦ（ａｂ’）２を得ることを目標として、ヒンジ領域の下方で抗体を切断するために採用されている。ペプシンによる欠点は、パパインと同様であった。
【0012】
最近、酵素は、完全長の免疫グロブリンのＦｃから離れたＦａｂ部分を切断して、個々のＦａｂ部分又はＦ（ａｂ’）２を生成することが可能であると文献に記載された。このような酵素は、アビディティ対親和性の差を評価すること、又は所与の多量体の分子量若しくは構成部分の組成を分析することをはじめとする、限定的な特性決定用途について記載されている。
【0013】
したがって、Ｆａｂ領域（Ｆ（ａｂ’）ｎ）を対合又は架橋する天然（非化学的に合成された）ヒンジを有し、かつ効率的で均質に生成することができる、Ｆｃの全て又は一部分を欠いている、切断多価多量体の製造のため、２つ以上のヒト可変領域及びリンカーを有する多価抗原結合多量体について新規で有用なフォーマットが必要とされている。抗原を標的化することが可能であり、治療用途に使用することが可能な、Ｆｃ領域を欠いている、切断多価多量体の生成が、本明細書に記載される。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、２つ以上の結合ドメインを含む多価多量体であって、各結合ドメインが、異なる抗原若しくはエピトープ又は同じ抗原若しくはエピトープに結合し、当該結合ドメインのうちの２つがヒンジ領域により対合され、多量体は、ＣＨ２又はＣＨ３領域を含む定常ドメインを欠いている、多価多量体を対象とする。
【0015】
本発明は、ジスルフィド架橋を含むそれぞれのＣ末端又はその付近で対合されている２つのポリペプチドであって、当該ポリペプチドの各々が、可変領域を含み、各可変領域は、抗原上の同じ又は異なる、抗原又はエピトープに結合する、ポリペプチドを更に含む。当該結合ドメインは、好ましくは、可変領域と対合され、結合ドメイン、典型的にはＶＬ－ＣＬと対合されているＶＨ－ＣＨ１Ｌを形成し、ＶＬ又はＶＨは、多量体の各結合ドメインにおいて共有されている共通鎖である。
【0016】
一実施形態では、多価多量体は、可変領域（ＶＨ１）の短いアームと、２つの可変領域（ＶＨ２及びＶＨ３）を含む長いアームとを含む、３つ以上のヒト重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、各重鎖は、ｓｃＦｖを含む。別の実施形態では、各重鎖領域は、ＣＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、各重鎖可変領域は、共通軽鎖（ＶＬｃ）と対合されている。別の実施形態では、共通軽鎖は、ＶＬ－ＣＬを含む。別の実施形態では、共通軽鎖は、配列番号１の配列を含む。別の実施形態では、多量体の各重鎖は、共通可変領域（ＶＨｃ）を含む。
【0017】
一実施形態では、可変領域、好ましくは重鎖可変領域のうちの２つは、可変領域及びＣＨ１ドメインにより連結されている（図１中の破線線を参照のこと）。別の実施形態では、可変領域は、ポリペプチドリンカーにより連結されている。別の実施形態では、ポリペプチド上の可変領域を接続するリンカーは、配列番号２～２５を含む群から選択される配列を含み、又は当該配列のうちの１つと少なくとも約８５％の同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、リンカーは、短い、長い、帯電している、剛性である、又は柔軟性である。別の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、天然に生じる配列を含む、又は天然に生じる配列に由来する配列を含む。別の実施形態では、リンカーは、中央ヒンジ領域配列を含む。別の実施形態では、リンカーは、上部及び下部ヒンジ配列を含む。別の実施形態では、リンカーは、らせん形成配列を含む。
【0018】
別の実施形態では、２つ以上の当該重鎖可変領域のうちの２つは、それぞれのＣ末端又はその付近で互いに対合（二量体化）され、好ましくは２つ以上のジスルフィド架橋を含み、当該ジスルフィド架橋は、ＣＨ１とＣＨ２領域との間に存在する天然ＩｇＧ抗体のジスルフィド架橋と同じ、又は実質的に同じである。ヒンジジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのサブクラスのうちで変化し、これらの各々は、本明細書に記載の本発明に包含されることが理解される（Ｐａｐａｄｅａ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋ１９８９）。
【0019】
一実施形態では、多量体の各可変領域は、異なるエピトープに特異的に結合する。
【0020】
別の実施形態では、多価多量体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合する。
【0021】
本発明はまた、多価多量体の製造方法であって、
２つ以上の標的に特異的に結合する、共通軽可変領域及び再構成重鎖を含む、抗体のパネルを得ることと、
共通軽鎖可変領域及び２つ以上の再構成重鎖をコードする核酸を宿主細胞に組み込むことであって、当該再構成重鎖のうちの２つが、対合可能なＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む、組み込むことと、
宿主細胞を、共通軽鎖及び２つ以上の再構成重鎖を含む無傷の多価多量体の発現をもたらす条件下で培養することであって、当該再構成重鎖のうちの２つが、当該２つの再構成重鎖の各々のＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間で対合される、培養することと、
無傷の多価多量体を、当該２つの再構成重鎖の各々からＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断する酵素により処理し、当該２つの再構成重鎖の対合を維持して、多価多量体を形成することと、を含む、方法を対象とする。
２つ以上の標的に特異的に結合する、共通軽可変領域及び再構成重鎖を含む、抗体のパネルを得ることと、
共通軽鎖可変領域及び２つ以上の再構成重鎖をコードする核酸を宿主細胞に組み込むことであって、当該再構成重鎖のうちの２つが、対合可能なＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む、組み込むことと、
宿主細胞を、共通軽鎖及び２つ以上の再構成重鎖を含む無傷の多価多量体の発現をもたらす条件下で培養することであって、当該再構成重鎖のうちの２つが、当該２つの再構成重鎖の各々のＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間で対合される、培養することと、
無傷の多価多量体を、当該２つの再構成重鎖の各々からＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断する酵素により処理し、当該２つの再構成重鎖の対合を維持して、多価多量体を形成することと、を含む、方法を対象とする。
【0022】
本明細書に開示される別の実施形態では、抗体のパネルは、共通軽鎖可変領域及び未再構成重鎖可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物を、標的で免疫化することによって得られる。
【0023】
本明細書に開示される別の実施形態では、対合は、２つ以上のジスルフィド架橋によっている。
【0024】
一実施形態では、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む２つの当該再構成重鎖の重鎖定常領域は、ヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。別の実施形態では、修飾は、免疫グロブリンＣＨ２又はＣＨ３領域にある。別の実施形態では、修飾は、それぞれの２つの重鎖に対して、孔修飾、静電修飾、又はＤＥＫＫ修飾したノブである。別の実施形態では、宿主細胞によって発現された多量体は、第２のＣＨ３ドメインと二量体化する第１のＣＨ３ドメインを含み、ＥＵ付番に従い、第１の方は、３５１位及び３６６位又はそれに対応する位置にアミノ酸残基リジンを含み、第２の方は、３５１位又はそれに対応する位置にアスパラギン酸のアミノ酸残基、及び３６８位又はそれに対応する位置にグルタミン酸のアミノ酸残基を含む。
【0025】
別の実施形態では、宿主細胞には、異なる抗原に結合することが可能な２つ以上の異なる軽鎖可変領域をコードする核酸が組み込まれ、２つ以上の重鎖可変領域は共通であり、それにより、多重特異的多量体の、２つ以上の抗原又はエピトープに結合する能力には、軽鎖可変領域の異なる結合特異性が寄与する。
【0026】
一実施形態では、共通可変領域は、再構成可変鎖をコードする生殖細胞系列中の核酸を含む、トランスジェニック動物、好ましくはげっ歯類によってコードされる核酸から得られたか又はそれに基づく核酸によってコードされる核酸によって、コードされる。
【0027】
一実施形態では、方法は、多価多量体を回収することを更に含む。
【0028】
一実施形態では、当該２つの重鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを切断する酵素は、親和性クロマトグラフィーによって取り出すことができるようにタグ付けされ、次いで、酵素、多価多量体、及び定常ドメイン断片の混合物が精製される。更なる実施形態では、酵素は帯電しており、それにより、多価多量体と切断された定常ドメインとの混合物から、電荷に基づくクロマトグラフィーにより取り出すことができる。
【0029】
本発明はまた、本発明の方法によって製造された、又は得ることが可能な、多価多量体を対象とする。
【0030】
本発明はまた、本発明の多価多量体に組み立てることが可能な、ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を対象とする。
【0031】
本発明はまた、本発明の多価多量体と、医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤とを含む、医薬組成物を対象とする。
【0032】
本発明はまた、医療上の適応症に罹患している対象の治療方法であって、治療有効量の、本発明の多価多量体を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
【0033】
本発明はまた、治療に使用するための、本発明の多価多量体を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1a】上述の多価多量体の例示的なフォーマットを示している。
【図1b】本明細書に開示される本発明の例示的なフォーマットを示している。本明細書に開示される本発明の多価多量体は、２つ以上のジスルフィド架橋によりそれぞれのＣ末端で対合されている２つのポリペプチドを含む。
【図2a】還元及び非還元条件下でのＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図2b】還元及び非還元条件下でのＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図2c】還元及び非還元条件下でのＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図2d】還元及び非還元条件下でのＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図2e】還元及び非還元条件下でのＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。
【図3】本明細書に開示される方法によって生成された二重特異性Ｆ（ａｂ’）２の効力を実証する、ヘレグリン依存性ＭＣＦ－７増殖アッセイである。
【図4a】共通軽鎖、異なる抗原に結合することが可能な３つの別個の再構成重鎖を含む、先に開示された例示的な多重特異的フォーマットを示しており、当該別個の重鎖のうちの２つは、ＤＥＫＫヘテロ二量体化により対合されている。参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１９０３２７号を参照する。
【図4b】本明細書に開示される本発明の例示的な多価多量体を示しており、４ｂ１ではＦ（ａｂ’）３を含み、２つの重鎖が、２つのジスルフィド架橋によりそれぞれのＣ末端で対合されている。また、４ｂ２では２Ｆａｂ’が示されており（重鎖を対合するジスルフィド架橋が切断され、２つのＦａｂが本明細書に記載のリンカーによって接続されている）、４ｂ３ではＦａｂが示されている。本明細書に記載のように、２Ｆａｂ’及びＦａｂは、三価多量体が、それぞれの重鎖ごとにＣＨ１とＣＨ２との間の領域で切断されるときに製造される。この図は限定的ではなく、追加の結合ドメインが、ＶＬ又はＶＨ領域のいずれかのＮ末端領域にリンカーを追加し、同族ドメインと対合して追加の結合ドメインを形成することが可能なＣＨ１－ＶＨ又はＣＬ－ＶＬドメインを接続することによって、ベースＦ（ａｂ’）２部分にモジュール式フォーマット中で追加され得る。
【図5a】還元及び非還元条件下での三価ＩｇＧ分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）３多量体の順調な製造を示している。
【図5b】還元及び非還元条件下での三価ＩｇＧ分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）３多量体の順調な製造を示している。
【図5c】還元及び非還元条件下での三価ＩｇＧ分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）３多量体の順調な製造を示している。
【図5d】還元及び非還元条件下での三価ＩｇＧ分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）３多量体の順調な製造を示している。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、２つ以上の可変領域を含む多価多量体のための新規でモジュール式のフォーマットであって、可変領域のうちの２つが、それぞれのＣ末端で、当該可変領域を天然ＩｇＧ抗体におけるように対合する２つ以上のジスルフィド架橋を含み、当該多価多量体は、２つ以上の異なる抗原又はエピトープに結合することが可能な、フォーマットに基づくものである。当該多価多量体は、抗体Ｆｃ領域（ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含む）を欠いており、また、当該多価多量体がＦ（ａｂ’）ｎ（但し、ｎ＝２以上）を含むように、製造することができる。
【0036】
本明細書に記載のＦ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）ｎを含む多価多量体は、同じ抗原又は異なる抗原に結合することができ、ＩｇＧのペプシン消化後に得られたＦａｂ’断片の還元及び再酸化によっては得られず、むしろ、ＤＥＫＫ遺伝子操作後にジスルフィド架橋によってＦ（ａｂ’）ｎポリペプチドを接続する天然ヒンジを無傷で完全に残す、Ｆｃの酵素切断をはじめとする、ヘテロ二量体化対合後に得られるので、これらの多価多量体は、従来のＦ（ａｂ’）２などの典型的な抗体断片とは異なる。これらの多価多量体は、任意選択的に、各結合ドメインにおいて共通鎖（重鎖又は軽鎖のいずれか）を含み、リンカーを使用して、２つ以上の当該結合ドメインを結合させる。
【0037】
これらの多価多量体は、より短い半減期という潜在的利点を有し、これは、体内での蓄積が少なくなることに関連する場合があり、それにより、それらの分解産物から生じ得るリスクを低減することができ、また、抗体濃度に対する迅速な調節は、例えば、治療用多価多量体が臨床的効力を有するが、身体からの迅速なクリアランスを必要とする場合、有益な場合がある。また、多価多量体は、（ｓｃＦｖ）２、ジ－ｓｃＦｖ、及びダイアボディ部分などの結合ドメインを対合するための合成成分を含有する、無傷の抗体又は抗体結合断片よりも、免疫原性が低い場合がある。Ｆ（ａｂ’）ｎ部分の本明細書に開示される発明は、新規で容易に製造可能なものであり、Ｆａｂなどの各結合ドメインにおいて共通鎖を有しており、安定性を増すＣＨ１／ＣＬ対合を含むと共に、リンカーにより２つ以上のＦａｂを接続しており、当該リンカーは、好ましくは、本明細書に記載の方法において使用されるタンパク質分解酵素によって認識されるモチーフを含まない。
【0038】
定義
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又はそれとの配列相同性を共有する。抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又はそれとの配列相同性を共有する。抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
【0039】
したがって、本明細書で使用するとき、「結合特異性」は、個々の抗体結合部位の、抗原決定基と反応する能力を指す。典型的には、本発明の多量体の結合部位は、Ｆａｂドメインに位置し、重鎖及び／又は軽鎖の超可変領域から構築される。
【0040】
「親和性」は、単一抗原結合部位とその抗原との間の相互作用の強度である。本発明の多量体の抗原に対する単一抗原結合部位は、解離定数（ＫＤ）で表すことができる。典型的には、治療用途のための抗体は、最大１×１０１０Ｍ又は更により高い親和性を有し得る。
【0041】
「抗原」は、宿主生物において（抗体を産生するために）免疫応答を誘導することが可能である、及び／又は抗体によって標的化されることが可能である分子である。分子レベルにおいて、抗原は、抗体の抗原結合部位によって結合される能力を特徴とする。また、抗原の混合物も「抗原」とみなすことができ、すなわち、当業者であれば、場合により、腫瘍細胞の溶解物、又はウイルス粒子が「抗原」として示されてもよく、その一方で、このような腫瘍細胞溶解物又はウイルス粒子の調製物は、多くの抗原決定基（例えばエピトープ）を含むことについて認識するであろう。抗原は、少なくとも１つ、但し多くの場合、より多くのエピトープを含む。
【0042】
「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位である。エピトープは、タンパク質の３次フォールディングによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成することができる（それぞれ、いわゆる直鎖及び立体構造エピトープ）。連続的な直鎖アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露された際に保持される一方で、３次フォールディングにより形成されたエピトープでは、その構造が、典型的には、変性溶媒により処理された際に失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的コンフォメーションにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含んでもよい。
【0043】
用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、任意の生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列（又はその機能的断片）を含み、特に明記されない限り、重鎖可変ドメイン（又はその機能的断片）を含む。用語「重鎖可変ドメイン」は、特に明記されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ及びＦＲ、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端まで）、可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識することが可能な、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。本発明で使用することができる軽鎖としては、例えば、同族軽鎖によって選択的に結合されたエピトープに選択的に結合しないものが挙げられる。
【0044】
用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、任意の生物由来の、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、又はＶＬ（又はその機能的断片）、及び免疫グロブリン定常ドメイン、又はＣＬ（又はその機能的断片）配列を含む。特に明記されない限り、用語「軽鎖」は、ヒトのカッパ、ラムダ、及びこれらの組み合わせから選択される軽鎖を含み得る。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的には、特に明記されない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、全長軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメイン、及び軽鎖定常ドメインを含む。本発明で使用することができる軽鎖としては、同族重鎖によって選択的に結合されたエピトープに選択的に結合しないものが挙げられる。
【0045】
多価多量体の発明に使用するのに好適な軽鎖には、既存の抗体ライブラリ（ウェットライブラリ又はｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で最も一般的に採用されている軽鎖をスクリーニングすることにより特定できるものなどの共通軽鎖が含まれ、当該軽鎖は、重鎖のエピトープ結合ドメインの親和性及び／又は選択性を実質的に阻害しないばかりでなく、一連の重鎖と対合するのにも好適である。例えば、好適な軽鎖は、そのゲノムに組み込まれた共通軽鎖を含むトランスジェニックげっ歯類などのトランスジェニック動物由来のものを含み、これは、抗原への曝露時に重鎖に多様性を有する共通軽鎖抗体の大きなパネルを生成するために使用することができる。多価多量体の発明に使用するのに好適な重鎖は、同様に共通重鎖を含んでもよい。
【0046】
本発明による用語「共通軽鎖」は、同一であっても、又はいくつかのアミノ酸配列の相違を有してもよい軽鎖であって、本発明の多量体の結合特異性が影響を受けない、すなわち、その相違は機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない、軽鎖を指す。
【0047】
例えば、本明細書において使用される共通鎖の定義の範囲内で、同一ではないがなお機能的に同等である可変鎖を調製又は発見することが可能である（例えば、保存的アミノ酸変化、同族鎖と対合する場合に結合特異性に寄与しないか、又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入及び試験することにより）。したがって、このような変異体は、異なる同族鎖を結合し、機能的抗原結合ドメインを形成することも可能である。したがって、本明細書で使用するとき、用語「共通軽鎖」は、同一であっても、又はいくつかのアミノ酸配列の相違を有してもよく、重鎖との対合後に得られた抗体の結合特異性を保持する、軽鎖を指す。特定の共通軽鎖とこのような機能的に同等である変異体との組み合わせは、用語「共通軽鎖」に包含される。
【0048】
用語「天然ヒンジ領域」は、免疫グロブリンクラスの重鎖の中央部分における非修飾の柔軟性ドメイン間領域であって、これらの２つの鎖をジスルフィド結合によって連結する、領域を指す。
【0049】
ヒンジ領域は、免疫グロブリンクラスの重鎖の中央部分（すなわち、ＦａｂをＦｃに接続する部分）における柔軟性アミノ酸伸張であり、これらの２つの重鎖をジスルフィド結合により対合する。これは、システイン及びプロリンアミノ酸が豊富であり、任意の他の免疫グロブリン領域とほとんど類似しない。
【0050】
「Ｆａｂドメイン」は、可変領域を含む結合ドメイン、典型的には、対合されている重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む結合ドメインを意味する。Ｆａｂドメインは、定常軽ドメイン（ＣＬ）及びＶＬドメインと対合されているＣＨ１及びＶＨドメインを含む、定常領域ドメインを含み得る。このような対合は、例えば、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいてジスルフィド架橋による共有結合として行ってもよい。
【0051】
「修飾Ｆａｂドメイン」は、ＣＨ１及びＶＨドメインを含む結合ドメインを意味し、ＶＨはＶＬドメインと対合されており、ＣＬドメインは存在しない。あるいは、修飾Ｆａｂドメインは、ＣＬドメイン及びＶＬドメインを含む結合ドメインであり、ＶＬはＶＨドメインと対合されており、ＣＨ１ドメインは存在しない。ＣＨ１又はＣＬ領域が対合されていない形態で存在し得るように、疎水性の領域の長さを除去又は低減することが必要であり得る。一本鎖抗体を自然に発現する動物の種、例えば、ラマ若しくはラクダなどのラクダ科動物、又はサメ由来のＣＨ１領域を使用してもよい。修飾Ｆａｂドメインの他の例としては、定常領域、ＣＨ１又はＣＬであって、その同族領域及び／又は可変領域が対合されておらず、及び／又は可変領域ＶＨ若しくはＶＬが存在し、それはその同族領域と対合するものではないものが挙げられる。
【0052】
本明細書で使用するとき、「無傷の」抗体は、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）であっても、そのアミノ酸配列変異体であってもよい。
【0053】
用語「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡが導入された細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞を指すばかりでなく、このような細胞の子孫を指す。特定の修飾が、変異又は環境の影響のいずれかにより後続世代で生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。一実施形態では、宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞が挙げられる。一実施形態では、真核細胞としては、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞が挙げられる。別の実施形態では、宿主細胞としては、原核細胞株、大腸菌；哺乳類細胞株、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、及びＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株、Ｓｆ９；並びに真菌細胞サッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
本明細書で使用するとき、用語「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」は、標的細胞の生存力に影響を及ぼすように活性化され得る、哺乳類免疫系内の細胞の自然なレパートリー内の細胞を指す。免疫エフェクター細胞は、リンパ系細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、又はＢ細胞を含むが、骨髄系細胞もまた、免疫エフェクター細胞、例えば、単球又はマクロファージ、樹状細胞、及び好中球顆粒球とみなすことができる。好ましいエフェクター細胞としては、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は好中球顆粒球が挙げられる。
【0055】
本明細書において、核酸又はアミノ酸配列について言及する場合、「パーセント（％）同一性」は、最適な比較目的のために配列をアラインメントした後、選択された配列中の残基と同一である候補配列中の残基の百分率として定義される。核酸配列を比較する配列同一性パーセントは、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ１０．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用し、修正ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）、ｓｗｇａｐｄｎａｒｎｔスコアマトリックス、１５のギャップオープンペナルティ、及び６．６６のギャップ伸長ペナルティを採用して決定される。アミノ酸配列は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ１１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用し、れは、修正ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．１９９４）、ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２スコアマトリックス、１０のギャップオープンペナルティ、及び０．１のギャップ伸長ペナルティを採用して、アライメントされる。
【0056】
本明細書において、用語「接続された」は、一次アミノ酸配列においてペプチド結合によって互いに接合されているドメインを指す。例えば、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む可変領域部分の重鎖は、追加の結合ドメインＶＨ－ＣＨ１（又はある追加の結合ドメインに対する、ある追加の結合ドメイン）の重鎖に、リンカーにより接続され得（ＣＨ１で追加の結合ドメインの重鎖を可変領域部分のＶＨ領域に接続する）、これは一緒に１つのポリペプチド鎖を構成する。同様に、ＣＨ１ドメインは、可変重領域に接続されてもよく、ＣＬドメインは可変軽領域に接続されてもよい。用語「リンカー」は、２つのポリペプチドを連結するために使用される、アミノ酸残基、又はペプチド結合により接合された２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを意味する。
【0057】
「対合」は、本発明の多価多量体を構成するポリペプチド間での、それらが多量体化することができるような相互作用を指す。例えば、追加の結合ドメインは、軽鎖領域（ＶＬ－ＣＬ）と対合された重鎖領域（ＶＨ－ＣＨ１）を含んでもよく、ＣＨ１及びＣＬは対合して当該結合ドメインを形成する。同様に、可変領域ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを各々が含む、２つの重鎖ポリペプチドは、ＩｇＧ１（又は、例えば、ＩｇＧ３におけるように、より多くのジスルフィド結合）の場合に起きるように、２つ以上のジスルフィド結合形成により、各ポリペプチドの対応するＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間で一緒に対合されてもよい。２つの重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインで更に対合されてもよい。本明細書に記載のように、抗体ドメイン（例えば、重鎖及び軽鎖）の対合は、非共有相互作用により、またジスルフィド結合により更に生じ得、本明細書に開示される技術及び当該技術分野において既知の方法によって遺伝子操作することができる。
【0058】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、「含む（comprise）」、「含む（include）」、及び「有する（having）」という単語、並びに「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、及び「含む（including）」などの変形は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの単語は、文脈によって許される場合、具体的に列挙されていない他の要素又は整数の可能な包含を伝えることを意図している。
【0059】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、２つ以上の（すなわち、１つ又は少なくとも１つ）文法的対象の物品を指すために使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味し得る。
【0060】
多価多量体の異なるフォーマット
本発明は、切断多価多量体であって、その単複の標的に、その２つ以上の結合ドメインにより結合することが可能な、切断多価多量体を提供する。本発明の多価多量体は、抗原に結合することが可能な、２つ以上の可変領域又はその一部分を含んでもよい。重要なことに、多量体は、Ｆｃ領域の全て又は一部分、好ましくはＦｃ全体を欠いている。本明細書に開示される本発明の多量体は、ヒンジ、好ましくは天然ヒンジ、より好ましくは２つ以上のジスルフィド結合を含むヒンジによりそれぞれのＣ末端で対合されている、２つの重鎖領域を含む。
本発明は、切断多価多量体であって、その単複の標的に、その２つ以上の結合ドメインにより結合することが可能な、切断多価多量体を提供する。本発明の多価多量体は、抗原に結合することが可能な、２つ以上の可変領域又はその一部分を含んでもよい。重要なことに、多量体は、Ｆｃ領域の全て又は一部分、好ましくはＦｃ全体を欠いている。本明細書に開示される本発明の多量体は、ヒンジ、好ましくは天然ヒンジ、より好ましくは２つ以上のジスルフィド結合を含むヒンジによりそれぞれのＣ末端で対合されている、２つの重鎖領域を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、多量体は、１つ以上の追加の結合ドメインを含む。一実施形態では、多量体は、ＶＬ－ＣＬ領域と対合されているＶＨ－ＣＨ１領域を含むＦａｂドメインを含む。
【0062】
したがって、当該多価多量体は、３つのＶＨ領域、及び３つのＶＬ領域を含んでもよい。ＶＨ又はＶＬのいずれかは、同族鎖の再構成可変領域と対合されている共通可変領域（ＶＨｃ若しくはＶＬｃ）であってもよく、又はエピトープ又は抗原に対する結合特異性が非共通鎖によって付与されているものであってもよい。例えば、３つのＶＬ領域は、共通鎖（ＶＬｃ）であってもよく、各ＶＨ領域（ＶＨ１～ＶＨ３）は、再構成可変領域を含んでもよく、当該ＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３領域は、同じエピトープに結合しても、又は３つの異なるエピトープに結合してもよい。図１ａに示されるように、ＶＨ１は、短いアームを指すのに使用され、ＶＨ２及びＶＨ３は、長いアームを指すのに使用され、ＶＨ２は、それぞれのＣ末端でＶＨ１と対合されている内部アームであり、ＶＨ３は遠位アームを指すのに使用される。
【0063】
多価多量体は、共通軽鎖（ＶＬｃ）及び３つの重鎖可変領域（ＶＨ１～ＶＨ３）を含み、ＶＬｃ－ＣＬと対合されているＶＨ３－ＣＨ１から構成される追加のＦａｂドメインは、ＶＨ２領域又はＶＬｃと、追加のＦａｂドメインのＣＨ１又は追加のＦａｂドメインのＣＬとの間に位置決めされたリンカーにより、可変領域に接続されてもよい。
【0064】
別の実施形態では、多価多量体を構成する個々のポリペプチドで、同じタンパク質内で重鎖及び軽鎖を混合することができる。本発明の多価多量体は、修飾Ｆａｂドメインを含んでもよい。修飾Ｆａｂドメインは、修飾ＣＨ１を含んでもよく、それにより、ＣＬと対合する必要性がなくなる。例えば、ＣＨ１は、ラクダ科ＣＨ１であってもよく、又はラクダ科ＣＨ１に基づいてもよく、又は当該技術分野において既知の技術を介して疎水性残基を欠くように修飾されてもよい。各ＶＨ又はＶＬは、共通可変領域であっても、再構成可変領域であってもよい。
【0065】
本発明の多価多量体は、ＣＨ１との対合を必要としない修飾Ｆａｂドメインを含んでもよい。例えば、ＣＬは、疎水性領域を除去するように遺伝子操作され得る。修飾Ｆａｂドメインの各ＶＨ又はＶＬは、共通可変領域であっても、再構成可変領域であってもよい。追加の修飾Ｆａｂドメインは、可変領域部分のＶＬと修飾ＦａｂドメインのＣＬとの間に位置決めされたリンカーにより、可変領域部分に接続されてもよい。修飾ＦａｂドメインのＶＨ及びＶＬは、システイン架橋により対合されてもよい。本発明の多価多量体は、ＣＨ１との対合を必要としない修飾ＣＬを含む修飾Ｆａｂドメインを含んでもよい。
【0066】
多価多量体の生成
一実施形態では、多価多量体は、無傷の多価抗体の酵素消化、又は、当該多価多量体のポリペプチドの天然ヒンジ若しくは対合を無傷で残す特定の領域での当該多価抗体の切断によって、製造することができる。無傷の抗体は、全長免疫グロブリン、例えば、全長ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ部分であってもよいが、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１であってもよい。
一実施形態では、多価多量体は、無傷の多価抗体の酵素消化、又は、当該多価多量体のポリペプチドの天然ヒンジ若しくは対合を無傷で残す特定の領域での当該多価抗体の切断によって、製造することができる。無傷の抗体は、全長免疫グロブリン、例えば、全長ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ部分であってもよいが、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１であってもよい。
【0067】
多価多量体の重鎖は、当業者に既知の技術、例えば、無傷の抗体のＣＨ３領域におけるＤＥＫＫ修飾の遺伝子操作を通じて優先的に対合するように設計されてもよい。重鎖のヘテロ二量体化を推進するためのＣＨ３領域における遺伝子操作について示す、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５７９５４号及びＤｅ Ｎａｒｄｉｓ Ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（３５）１４７０６－１４７１７を参照のこと。本発明において使用することができるヘテロ二量体化を推進するための代替的なアプローチとしては、ノブインホールフォーマット（国際公開第１９９８／０５０４３１号）、及び電荷遺伝子操作の使用（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，ＪＢＣ ２０１０，ｖｏｌ ２８５，ｐｐ １９６３７－１９６４６）、及び当該技術分野において既知の他の好適な技術が挙げられる。
【0068】
多価多量体フォーマットに使用するためのリンカー
本発明の多価多量体は、１つ以上の可変領域を接続する、１つ以上のリンカーを含んでもよい。リンカーは、リンカーが接続される結合ドメインと共に、多価多量体の機能性を少なくとも部分的に決定する。
本発明の多価多量体は、１つ以上の可変領域を接続する、１つ以上のリンカーを含んでもよい。リンカーは、リンカーが接続される結合ドメインと共に、多価多量体の機能性を少なくとも部分的に決定する。
【0069】
リンカーは、ヒンジ配列を含んでもよく、又はヒンジ配列に基づく配列を含んでもよい。したがって、好適なリンカーのアミノ酸配列は、天然に生じる配列を含んでもよく、又は天然に生じる配列に由来する、若しくはそれに基づく配列を含んでもよい。このような配列の使用は、本発明の多価抗体の展開可能性に役立ち得、及び／又は低免疫原性を確保するのに役立ち得る。本出願の目的のために、リンカーは、Ｆｃから、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）ｎを切断するために使用される任意の酵素の酵素認識部位を含有しておらず、それにより、酵素は、結合ドメイン間の結合を同様に切断することが好ましい。例えば、共通軽鎖（ＶＬｃ）及び３つの重鎖可変領域（ＶＨ１～ＶＨ３）を含む、３つのＦａｂドメインを含む、切断多価多量体が製造される場合、ＶＬｃ－ＣＬと対合されたＶＨ３－ＣＨ１をＶＨ１若しくはＶＨ２領域又はＶＬｃ領域に接続するリンカーは、Ｆｃを、Ｆａｂ、２Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）３から切断することが可能な酵素により認識されるアミノ酸モチーフを含まないことが好ましい。
【0070】
したがって、１つ以上の追加の結合ドメインを２つ以上の可変領域に接続するのに好適なリンカーは、ＩｇＧ又はＩｇＡヒンジ配列由来であってもよい。リンカー領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、又はＩｇＧ４ヒンジ領域に基づいてもよい。
【0071】
典型的には、使用されるヒンジ領域の種類は、リンカーが接続される追加のＦａｂドメインの定常領域、例えばＣＨ１の種類と一致する。すなわち、リンカーが、ＩｇＧ１ヒンジ領域由来の配列又は複数の配列に基づく場合、当該リンカーが接続している追加のＦａｂドメインのＣＨ１は、ＩｇＧ１由来のＣＨ１である。
【0072】
抗体のリンカーは、上部、中央、若しくは下部ヒンジ領域、又はこのような領域のサブセットに基づいてもよい。
【0073】
ＩｇＧ１ヒンジ領域は、配列：
を有する。
【化1】
【0074】
上部ヒンジ領域は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号３）として定義される。
【0075】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ（配列番号２７）として定義される。
【0076】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２８）として定義される。
【0077】
したがって、本発明の多量体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上を含んでもよく、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に由来する、若しくはそれらに基づく配列を含んでもよい。
【0078】
ＩｇＧ２ヒンジ領域は、配列：
を有する。
【化2】
【0079】
上部ヒンジ領域は、ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号３０）として定義される。
【0080】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ（配列番号２７）として定義される。
【0081】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＰＶＡＧ（配列番号３１）として定義される。
【0082】
したがって、本発明の多量体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上を含んでもよく、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に由来する、若しくはそれらに基づく配列を含んでもよい。
【0083】
ＩｇＧ３ヒンジ領域は、配列：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号３２）を有する。
【0084】
上部ヒンジ領域は、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号７）として定義される。
【0085】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号３３）として定義される。
【0086】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号３４）として定義される。
【0087】
ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号３５）を有する。
【0088】
上部ヒンジ領域は、ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号２）として定義される。
【0089】
中央ヒンジ領域は、ＣＰＳＣＰ（配列番号３６）として定義される。
【0090】
下部ヒンジ領域は、ＡＰＥＦＬＧＧ（配列番号３４）として定義される。
【0091】
コンセンサス配列ＣＸＸＣを有する中央領域は、野生型ＩｇＧと関連して両方のＩｇＧ重鎖を接続し、剛性である。これらのジスルフィド架橋は、本出願には必須ではなく、したがって、リンカーは中央ヒンジ配列を含み、好ましくはＣＸＸＣコンセンサス中の一方又は両方のＣｙｓ残基は、例えば、Ｓｅｒ残基で置換される。したがって、一実施形態では、ＣｘｘＣは、ＳｘｘＳであってもよい。
【0092】
本発明の多価多量体に使用するのに好適なリンカーは、中央ヒンジ配列に由来する、又はそれに基づくもの、例えば中央ヒンジ配列を含むが、下部及び／若しくは上部ヒンジ配列を含まない配列に由来する、又はそれに基づくものであってもよい。本発明の多価多量体に使用するのに好適なリンカーは、上部ヒンジ配列に由来する、又はそれに基づくもの、例えば上部ヒンジ配列を含むが、下部及び／若しくは中央ヒンジ配列を含まない配列に由来する、又はそれに基づくものであってもよい。本発明の多価多量体に使用するのに好適なリンカーは、中央ヒンジ配列を含まないもの、例えば下部及び上部ヒンジ配列の組み合わせを含む配列のものであってもよい。
【0093】
したがって、本発明の多量体では、リンカーは、これらの配列のうちの１つ以上、及び／又はこれらの配列のうちの１つ以上に由来する、若しくはそれに基づくに基づく配列を含んでもよい。リンカーは、本質的に中央ヒンジ領域配列からなるか、若しくはこのような配列に基づいていてもよく、又は本質的に上部及び下部ヒンジ領域配列からなるか、若しくはこのような配列に基づいていてもよい。
【0094】
本発明の多量体に使用するのに好適なリンカーは、中に０～５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）が作製される、本明細書に記載の任意のリンカー配列のアミノ酸配列を含む配列を参照して定義することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に記載のリンカー配列に関して、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）を含むアミノ酸配列を含む。
【0095】
好適なリンカーは、約７～約２９アミノ酸長、例えば約１０～約２０アミノ酸長であってよい。しかし、好適なリンカーは、短いリンカー、例えば約７～約１０のアミノ酸長であってもよく、又は長いリンカー、例えば約２０～約２９アミノ酸長であってもよい。
【0096】
リンカーは、Ｉｇヒンジ領域を含んでもよく、又はリンカーと同じサブクラスのＣＨ１領域に接続されたＩｇＧヒンジ領域に由来する、若しくはそれに基づく配列を含んでもよく、共通軽鎖の共有結合のためのシステインを含んでもよい。
【0097】
本発明の多量体に使用するのに好適なリンカーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、若しくはＩｇＧ４ヒンジ領域に由来していてもよく、又はそれに基づいていてもよい。
【0098】
（Ｇ４Ｓ）ｎ配列が使用される場合、好ましくは、それは、ＩｇＧ以外のアイソタイプ又はＩｇＧ１以外のサブクラス由来のヒンジ配列と組み合わせて使用され、ＣＨ１領域を含む。
【0099】
本発明の多量体では、リンカーは剛性であっても柔軟性であってもよく、荷電配列を含んでもよく、直線状であっても屈曲していてもよい。
【0100】
本発明の目的のための剛性配列は、約１．０１５以下のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有する配列である。部分的に柔軟性の配列は、約１．０１５～約１．０４のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有するものである。本発明の目的のための柔軟性配列は、少なくとも約１．０１５のＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｚ柔軟性予測を有する配列である（Ｋａｒｐｌｕｓ ＰＡ，Ｓｃｈｕｌｚ ＧＥ．タンパク質中の鎖の柔軟性予測－ペプチド抗原の選択のためのツールＮａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ １９８５；７２：２１２－３；（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｂｃｅｌｌ／）。柔軟性予測は、配列に沿った７つの残基の連続したウィンドウにわたって計算され（１残基刻み）、ウィンドウごとに予測される「柔軟性」指数が得られる。リンカー配列全体にわたる全体的な柔軟性は、配列全体にわたって平均として与えられる。
【0101】
ＩｇＧヒンジ領域内のＣｙｓ残基の除去又は置換により、Ｃｙｓ残基をセリン（Ｓｅｒ）と置換することなどによって、そのヒンジに基づくリンカーをより柔軟にすることができる。あるいは、リンカーは、らせん形成配列の存在を考慮して剛性リンカーであってもよい。したがって、中央ヒンジ領域、例えば、保存されたＣＰＰＣＰ（配列番号９０）モチーフは、らせん形成配列、例えば（ＥＡＡＡＫ）２（配列番号９１）によって置換されてもよく、これは、リンカー中に短い剛性のらせんをもたらす。したがって、本発明の多量体では、リンカーは、例えばアミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ）２（配列番号９１）を含む、らせん形成配列を含んでもよい。このような配列の使用は、剛性を加えるのに役立ち得る。
【0102】
本発明のリンカーは、配列番号４～６、８～１２、若しくは１４～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこれらのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性、好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９８％の配列同一性、より好ましくは、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0103】
例えば、本発明の多価多量体に使用するのに好適なリンカーは、中に０～５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）が作製される、配列番号２～２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む配列を参照して定義することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号４～６、８～１２、又は１４～２５に記載の配列に関して、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は付加（又はこれらの組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含む。
【0104】
本発明の多価多量体に使用するのに好適なリンカーは、配列番号２～２５のいずれか１つのアミノ酸配列、又はこれらのいずれか１つに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して約９８％の配列同一性、例えば、これらのいずれか１つに対して少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列を参照して定義することができる。
【0105】
【表1】
【0106】
追加の結合ドメインの領域と対合するためのリンカーの使用
本明細書で使用されるリンカーによって、１つ以上の可変領域を少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続することができる。加えて、少なくとも１つの追加の結合ドメインがＦａｂドメインであるか、又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対合から構成される場合、リンカーによって、共有結合により、典型的にはジスルフィド架橋により、重鎖及び軽鎖を対合することができる。したがって、リンカーによって可変領域を接続する場合、それは、ポリペプチドの一次アミノ酸配列の一部、例えば、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ１を形成する。対照的に、リンカーによって２つの可変ドメインを対合する場合、それにより、例えば、別個のポリペプチドを構成する、２つの可変ドメイン間で接点、共有結合、例えば、ジスルフィド結合を作ることによって、これらのドメインを一緒に架橋する。
本明細書で使用されるリンカーによって、１つ以上の可変領域を少なくとも１つの追加の結合ドメインに接続することができる。加えて、少なくとも１つの追加の結合ドメインがＦａｂドメインであるか、又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対合から構成される場合、リンカーによって、共有結合により、典型的にはジスルフィド架橋により、重鎖及び軽鎖を対合することができる。したがって、リンカーによって可変領域を接続する場合、それは、ポリペプチドの一次アミノ酸配列の一部、例えば、ＶＨ１－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ１を形成する。対照的に、リンカーによって２つの可変ドメインを対合する場合、それにより、例えば、別個のポリペプチドを構成する、２つの可変ドメイン間で接点、共有結合、例えば、ジスルフィド結合を作ることによって、これらのドメインを一緒に架橋する。
【0107】
ジスルフィド架橋は、リンカー中のシステイン残基と追加の結合ドメイン（複数可）の可変領域との間に形成されてもよい。リンカーによって引き起こされるこのような対合は、共通軽鎖及び対応する再構成重鎖可変領域を含むＦａｂドメイン、又は共通重鎖及び対応する再構成軽鎖可変領域を含むＦａｂドメイン、を含む追加の結合ドメインに適用することができる。
【0108】
表２は、リンカー配列がＣＨ１及びＶＨ２領域にどのように接続され得るかを示す。
【0109】
【表2】
【0110】
なお、リンカー（上記において下線を付した）の後のＶＨ２配列は、使用される特定の可変領域に応じて、変化してもよい。他の実施形態では、リンカーの後の配列は、共通軽鎖を含む軽鎖可変領域であってもよい。
【0111】
多価性及び多重特異性
２つ以上の可変ドメインが異なる抗原に結合する場合、第１の抗原及び第２の抗原は、１つの細胞又は異なる細胞型に位置する２つの異なる分子又は部分であってもよい。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害を媒介する２つの結合ドメインを含む抗体は、新たなクラスの抗体治療薬である。これは、標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）及びエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ）の抗原結合特異性を１分子中で組み合わせることによって得ることができる（例えば、国際公開第２０１４／０５１４３３号を参照のこと）。本発明の多量体は、少なくとも２つの結合ドメインを含む。３つ以上の結合ドメインを含む多価多量体は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の腫瘍関連抗原を標的化して、正常細胞に対する有害細胞の特異的標的化を可能にし得る。例えば、多価多量体の１つの結合ドメイン又は２つの結合ドメインは、異常な（腫瘍）細胞上の抗原に結合し得、一方で、多価多量体の第２又は第３の結合ドメインは、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の方向付けられた殺傷を引き起こし得る免疫エフェクター細胞上の抗原に結合し得る。あるいは、多価多量体の２つの結合ドメインは、腫瘍細胞で発現される同一の抗原又は異なる抗原上の２つの異なるエピトープに特異的に結合し得、一方で、これらのアームの親和性は、１つの抗原のみを発現する細胞への結合を軽減するために、又は多価多量体の１つの結合ドメインのみが結合する場合に弱められる。あるいは、本発明の多価多量体の３つの結合ドメインは、３つの異なる抗原又は同一の抗原に、但し、免疫エフェクター細胞の異なるエピトープで結合し得る。
２つ以上の可変ドメインが異なる抗原に結合する場合、第１の抗原及び第２の抗原は、１つの細胞又は異なる細胞型に位置する２つの異なる分子又は部分であってもよい。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害を媒介する２つの結合ドメインを含む抗体は、新たなクラスの抗体治療薬である。これは、標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）及びエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ）の抗原結合特異性を１分子中で組み合わせることによって得ることができる（例えば、国際公開第２０１４／０５１４３３号を参照のこと）。本発明の多量体は、少なくとも２つの結合ドメインを含む。３つ以上の結合ドメインを含む多価多量体は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の腫瘍関連抗原を標的化して、正常細胞に対する有害細胞の特異的標的化を可能にし得る。例えば、多価多量体の１つの結合ドメイン又は２つの結合ドメインは、異常な（腫瘍）細胞上の抗原に結合し得、一方で、多価多量体の第２又は第３の結合ドメインは、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の方向付けられた殺傷を引き起こし得る免疫エフェクター細胞上の抗原に結合し得る。あるいは、多価多量体の２つの結合ドメインは、腫瘍細胞で発現される同一の抗原又は異なる抗原上の２つの異なるエピトープに特異的に結合し得、一方で、これらのアームの親和性は、１つの抗原のみを発現する細胞への結合を軽減するために、又は多価多量体の１つの結合ドメインのみが結合する場合に弱められる。あるいは、本発明の多価多量体の３つの結合ドメインは、３つの異なる抗原又は同一の抗原に、但し、免疫エフェクター細胞の異なるエピトープで結合し得る。
【0112】
同様に、３つ以上の結合ドメインを含む多価多量体は、リガンド又は酵素などの機能的標的に結合し得、生物学的応答を誘発するか、又は標的の機能を遮断し、阻害性又はアゴニスト性の細胞活性をもたらす。本発明の多価多量体の少なくとも１つの結合ドメインは、可変領域部分の結合ドメインにリンカーによって接続される。
【0113】
可変領域のうちの少なくとも１つの結合ドメインがＦａｂドメインである場合、これは、例えば、ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１の形態をとることができ、リンカーにより、１つの可変領域の重鎖を少なくとも１つの追加の結合ドメイン、好ましくはＦａｂドメインに接続する。
【0114】
あるいは、これは、例えば、ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＬの形態をとることができ、リンカーにより、１つの可変領域の軽鎖を少なくとも１つの追加の結合ドメイン、好ましくはＦａｂドメインに接続する。
【0115】
Ｆａｂドメインなどの追加の結合ドメインは、２つの可変領域に各々別個のリンカーによって接続することができる。追加の可変領域又は追加の結合ドメインを接続する２つ以上のリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。更に、リンカーは、結合ドメインの同族鎖の対合を可能にし得る。
【0116】
本発明の多量体が２つ以上のリンカーを含む場合、それらのリンカーは同じであっても異なっていてもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。後者の状況の一例は、多価多量体が３つのリンカーを含み、これらのうちの２つは同じであり、第３のリンカーは（他の２つと）異なるという状況である。
【0117】
更に、別の可変領域にリンカーによって接続された可変領域は、それ自体が、本明細書に記載のリンカーによって接続された可変領域に付着されてもよく、他の可変領域は、追加の結合ドメインにリンカーを通じて接続し、その可変領域を第２の追加の結合ドメインにリンカーを通じて接続することなどにより、モジュール式に伸長し得る。
【0118】
このようにして、本発明の多量体は、２つ、３つ、又はそれ以上のエピトープに結合することが可能であり得る。
【0119】
本発明の多量体は、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原に結合することが可能であり得る。
【0120】
本発明の多量体は、１つの抗原上の異なるエピトープに結合することが可能な、２つ以上のＦａｂドメインなどの２つ以上の可変領域を含んでもよい。
【0121】
一実施形態では、本発明の多量体は、少なくとも２つのＦａｂが異なる、３つ以上のＦａｂドメインなどの少なくとも３つの結合ドメインを含む。
【0122】
本発明の別の態様は、少なくとも３つのＦａｂドメインを含む多価多量体を含み、したがって、典型的には全て互い異なる３つのエピトープに結合することが可能である。
【0123】
本発明の多量体はまた、多重特異性であってもよい。多価は、抗体が、少なくとも２つの結合ドメインを有し、したがって少なくとも２つの抗原結合部位を有することを示す。多重特異性は、抗体が、少なくとも２つの異なるエピトープ、例えば、同じ抗原上の２つの異なる抗原又は２つのエピトープに結合することが可能であることを示す。三重特異性は、抗体が、３つの異なるエピトープに結合することが可能であることを示す。四重特異性は、抗体が、４つの異なるエピトープなどに結合することが可能であることを示す。
【0124】
本発明の多量体は、同じ標的上に位置する標的エピトープに結合し得る。これは、１つのエピトープのみが標的化されている状況と比較して、当該標的分子の（生物学的）機能のより効率的な拮抗作用を可能にし得る。例えば、本発明の多量体は、抗原細胞上、例えば、成長因子受容体上、又は腫瘍細胞が増殖するのに重要な可溶性分子上に存在する２つ、３つ、又はそれ以上のエピトープに同時に結合し得、それにより、制御されていない増殖をもたらすいくつかの独立したシグナル伝達経路を効果的に遮断する。
【0125】
本発明の少なくとも２つの多量体の任意の組み合わせは、成長因子受容体又は可溶性分子などの標的分子上に存在する、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のエピトープに同時に結合し得る。本発明の少なくとも２つの多量体の組み合わせでは、２つの多量体は、少なくとも１つの共通結合ドメインを共有し得る。
【0126】
標的部分は、可溶性部分であってもよく、又は膜結合部分であってもよく、又は結合時に内在化する細胞表面上に存在する部分であってもよい。
【0127】
標的エピトープは、異なる部分、例えば２つ（すなわち、第１の部分上の２つ以上の標的エピトープ及び第２の部分上の１つ以上の標的エピトープ）又は３つの異なる部分上（すなわち、３つの部分の各々で少なくとも１つの標的エピトープ）に位置し得る。この場合、異なる標的部分の各々は、可溶性部分若しくは膜結合部分、又は結合時に内在化する細胞表面上に存在する部分のいずれかであってもよい。一実施形態では、異なる標的部分は可溶性部分である。あるいは、少なくとも１つの標的部分は可溶性部分であり、一方で少なくとも１つの標的部分は膜結合部分である。更に別の代替例では、全ての標的部分は膜結合部分である。一実施形態では、異なる標的部分は同じ細胞上で発現されるが、他の実施形態では、異なる標的部分は異なる細胞上で発現される。
【0128】
非限定的な例として、本発明の任意の多量体、又は本発明の多量体と追加の抗体との任意の組み合わせは、複数の膜結合受容体を同時に遮断するのに、腫瘍細胞のサイトカイン又は成長因子などの複数の可溶性分子を中和するのに、又は異なるウイルス血清型若しくはウイルス株を中和するのに好適な場合がある。
【0129】
一実施形態では、少なくとも１つの標的エピトープは、腫瘍細胞上に位置してもよい。あるいは、又はそれに加えて、少なくとも標的エピトープは、エフェクター細胞の表面上に位置してもよい。これは、例えば、腫瘍細胞殺傷のためのＴ細胞又はＮＫ細胞の動員に好適である。例えば、本発明の多量体は、免疫エフェクター細胞上に位置する標的分子に特異的に結合することによって、免疫エフェクター細胞、好ましくはヒト免疫エフェクター細胞を動員することが可能であり得る。更なる実施形態では、当該免疫エフェクター細胞は、本発明の多量体の標的分子への結合時に活性化される。エフェクター機構の動員は、例えば、Ｔ細胞受容体又はＦｃガンマ受容体などの細胞傷害性トリガー分子に結合し、それにより下流の免疫エフェクター経路又は免疫エフェクター細胞を活性化することが可能な、本発明による方法によって製造されたＩｇ様分子を投与することにより免疫調節された細胞傷害のリダイレクトを包含し得る。
【0130】
共通可変領域
本発明の多価多量体では、２つ以上の結合ドメイン（可変領域）の各々において共通鎖を使用することができる。記載のように、一実施形態では、多価多量体は、１つの抗原に結合する第１の重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせ、及び第２の抗原に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせを有する。各々の追加の結合ドメインはまた、抗原上の更なるエピトープに結合する追加のＶＨ／ＶＬの組み合わせを含んでもよい。
本発明の多価多量体では、２つ以上の結合ドメイン（可変領域）の各々において共通鎖を使用することができる。記載のように、一実施形態では、多価多量体は、１つの抗原に結合する第１の重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせ、及び第２の抗原に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせを有する。各々の追加の結合ドメインはまた、抗原上の更なるエピトープに結合する追加のＶＨ／ＶＬの組み合わせを含んでもよい。
【0131】
一実施形態では、多価多量体は、２つの重鎖（一方又は両方が１つ以上の追加のＣＨ１及びＶＨドメインを含む）、並びに各々ＣＨ１及びＶＨドメインと対合する軽鎖、を含む。一実施形態では、２つの重鎖は適合性ヘテロ二量体化ドメインを有し、軽鎖は共通軽鎖である。別の実施形態では、多量体は、２つの軽鎖（一方又は両方が１つ以上の追加のＣＬ及びＶＬドメインを含む）、並びに各々ＣＬ及びＶＬドメインと対合する重鎖可変領域、を含み、重鎖可変領域は、共通重鎖可変領域を含む。
【0132】
多価多量体が共通軽鎖を含み、当該軽鎖は、２つ以上の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む宿主細胞内で発現される場合、当該軽鎖は、各々の利用可能な重鎖（又はＣＨ１－ＶＨ１領域）と対合することにより、少なくとも３つの機能的抗原結合ドメインを形成することが可能である。
【0133】
機能的抗原結合ドメイン（可変領域）は、抗原上のエピトープに特異的に結合することが可能である。一実施形態では、共通軽鎖は、製造された全ての重鎖（又はＣＨ１－ＶＨ１領域）と対合することが可能であり、それにより、不整合の重鎖及び軽鎖の誤対合は回避され、又は多価多量体よりも著しく低い比で作られる。
【0134】
一実施形態では、本発明の多価多量体は、一連の重鎖可変領域と組み合わせて機能的抗原結合ドメインを有する多量体を形成することができる共通軽鎖（可変領域）を有する。（国際公開第２００４／００９６１８号、同第２００９／１５７７７１号）。
【0135】
本発明の多価多量体に使用するための共通軽鎖（可変領域）は、好ましくはヒト軽鎖である。一実施形態では、共通軽鎖（可変領域）は、生殖細胞系列配列を有する。一実施形態では、生殖細胞系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収率、及び溶解度を有する、軽鎖可変領域である。好ましい生殖細胞系列軽鎖は、ヒトＩｇＶカッパ１－３９＊０１／ＩＧＪカッパ１＊０１及びヒト定常領域（配列番号１）である。共通軽鎖可変領域をコードする核酸は、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶカッパ１－３９＊０１／ＩＧＪカッパ１＊０１（配列番号６２）である。共通軽鎖は、好ましくは、０～５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、配列番号６３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号６４のヒト軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。共通軽鎖は、軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含んでもよい。共通軽鎖（配列番号１）をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するのに使用される細胞系に対してコドン最適化され得る。コード核酸は、生殖細胞系列核酸配列から逸脱し得る。
【0136】
本発明の多価抗体に使用するための共通軽鎖（可変領域）は、ラムダ軽鎖であり得、したがってこれもまた本発明の文脈内で提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本発明の共通軽鎖は、カッパ又はラムダ軽鎖定常領域を含み得る。一実施形態では、カッパ軽鎖の定常領域が使用され、好ましくは、当該共通軽鎖は、生殖細胞系列軽鎖、好ましくは、ＩｇＶＫＩ－３９遺伝子セグメントを含む再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶＫｌ－３９＊０１／ＩＧＪＫＩ＊０１である。当業者は、「共通」がまた、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指すことも認識するであろう。当該軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない変異（欠失、置換、付加）が存在する。
【0137】
ＩｇＶκ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９、ＩＧＫＶ１３９、ＩＧＫＶ１－３９とも呼ばれる。この遺伝子についての外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１－３９の好ましいアミノ酸配列は、配列番号６５で示される。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。共通軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域に連結することが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の多価多量体において使用される軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１又はＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１を含む。好ましい実施形態では、多価多量体中の共通軽鎖はＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である。
【0138】
共通軽鎖を産生する細胞は、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１及びラムダ定常領域に融合された前述の軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。本明細書で生殖系列配列を参照する場合、一実施形態では、可変領域は、生殖系列配列である。
【0139】
本発明の多価多量体に使用するための好ましい共通軽鎖は、配列番号１に記載の配列を含むものである。
【0140】
本発明の多価抗体に使用するための共通鎖はまた、重鎖であってもよく、したがって、これもまた本発明の文脈において提供される。共通重鎖は、二重特異性抗体を作製するために当該技術分野において使用されており、本明細書では３つ以上の結合ドメインを含む多価多量体を作製する際に使用することができ、当該結合ドメインのうちの２つ以上は、当該技術分野において既知の共通重鎖を含む。例えば、重鎖可変ドメインが全てのライブラリメンバーに関して同じであり、したがって、多様性が軽鎖可変ドメインに基づく抗体ライブラリの使用である。このようなライブラリは、例えば、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５６１９号、及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５７７８０号に記載されており、これらは各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。共通重鎖を有する結合ドメインを生成するこれらの及び他の技術は、当業者によって作られ得、本発明では、本明細書に開示される新規なフォーマットを有する多価抗体を製造するために採用することができる。
【0141】
切断多価多量体の製造
一実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の重鎖可変領域及び共通軽鎖可変領域をコードする核酸と共トランスフェクションされて多価多量体を産生し得、当該重鎖可変領域のうちの２つは、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３を含む定常領域を含み、これらは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該２つの重鎖は各々、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。あるいは、本発明の多価多量体は、２つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物により個々の細胞の共トランスフェクションによって製造することができ、２つの共通重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３を含む、定常領域を含み、これらは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該２つの重鎖は各々、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の重鎖可変領域及び共通軽鎖可変領域をコードする核酸と共トランスフェクションされて多価多量体を産生し得、当該重鎖可変領域のうちの２つは、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３を含む定常領域を含み、これらは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該２つの重鎖は各々、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。あるいは、本発明の多価多量体は、２つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物により個々の細胞の共トランスフェクションによって製造することができ、２つの共通重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３を含む、定常領域を含み、これらは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジでの対合によりヘテロ二量体化が可能であり、当該２つの重鎖は各々、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を切断することが可能なタンパク質分解酵素によって認識される当該ヒンジの下方で、アミノ酸配列を含む。
【0142】
本発明の多価多量体はまた、対象とする２つ以上の抗原で共通可変鎖を有するトランスジェニック動物を免疫化することによって製造することもできる。対象とする抗原に特異的に結合する、共通可変鎖及び再構成抗体鎖を含む抗体のパネルは、トランスジェニック動物から得られる。次いで、共通鎖及び可変結合鎖をコードする核酸は、無傷の多価抗体を産生する宿主細胞に組み込まれる。次いで、多価多量体が形成される。当該多価多量体は、共通軽鎖及び２つ以上の可変結合鎖を含んでもよく、好ましくは、当該可変結合鎖のうちの２つは、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３を含む重鎖であり、当該重鎖は、典型的にはＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の２つ以上のジスルフィド架橋から構成されるヒンジによって対合される。次いで、多価多量体は、残っている当該重鎖から重鎖のＣ末端でＣＨ２及び／又はＣＨ３領域を除去する酵素によって切断され、ヒンジは、多価多量体の重鎖を典型的には２つ以上のジスルフィド結合によって対合する。
【0143】
ヘテロ二量体である抗体の製造を優先するための、いくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞は、それぞれのホモ二量体の産生よりもヘテロ二量体の産生を優先する。このことは、典型的には、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化（すなわち、１つの重鎖を第２の重鎖と組み合わせる二量体化）を優先するように、重鎖の重鎖定常領域、好ましくはＣＨ３領域をコードする核酸によって達成される。好ましい実施形態では、本発明の多量体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。
【0144】
この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖（Ａ及びＢ）と共通軽鎖との共発現は、３つの異なる抗体種、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢをもたらすであろう。ＡＡ及びＢＢは、２つのホモ二量体抗体の表記であり、ＡＢはヘテロ二量体抗体の表記である。所望のヘテロ二量体産物（ＡＢ）の百分率を増加させるために、ＣＨ３遺伝子操作を採用することができ、又は言い換えれば、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。
【0145】
本明細書で使用するとき、用語「適合性ヘテロ二量体化ドメイン」は、遺伝子操作ドメインＡ’が遺伝子操作ドメインＢ’を有するヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた同様になり、Ａ’－Ａ’間及びＢ’－Ｂ’間のホモ二量体化が減少するように遺伝子操作された、タンパク質ドメインを指す。
【0146】
米国特許出願番号第１３／８６６，７４７号（現在、米国特許第９，２４８，１８１号として発行）、米国特許出願番号第１４／０８１，８４８号（現在、米国特許第９，３５８，２８６号として発行）、国際公開第２０１３／１５７９５３号、及び同第２０１３／１５７９５４号に、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して多価抗体を製造するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を有利に採用することができる。具体的には、本発明の多量体は、好ましくは、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを製造するために、第１及び第２の重鎖の定常領域において残基を含む。好ましい残基は、第１のＣＨ３ドメイン中の、若しくはそれに対応する位置（「ＫＫ－変異体重鎖」）での、アミノ酸Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ付番）（但し、第１の文字は野生型ＣＨ３ドメインの残基に対応し、第２の文字は、ヘテロ二量体対合において優先的に遺伝子操作することが可能なＣＨ３によってコードされる残基に対応する）、並びに第２のドメイン中の、若しくはそれに対応する位置（「ＤＥ－変異体」重鎖）での、アミノ酸Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅであり、又はその逆も同様である。ＤＥ－変異体及びＫＫ－変異体が優先的に対合してヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することは、本発明者らの米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号の特許、並びに国際公開第２０１３／１５７９５４号で以前に実証された。ＤＥ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３－ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力により、生じないか、又は無視可能な量でのみ生じる。
【0147】
多価多量体を形成するために多量体化するタンパク質を発現することが可能な本発明の好ましい宿主細胞では、宿主細胞は、３つのタンパク質をコードする核酸で形質転換される。Ｎ末端からＣ末端までの順に、コードされたタンパク質は、ＶＨ３－ＣＨ１－－－ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１のタンパク質を含み、リンカーは、Ｎ末端からＣ末端までの方向で、ＣＨ１及びＶＨ２を第１のタンパク質上に接続（「－－－」によって表記）し、第２のコードされたタンパク質は、ＶＬｃ－ＣＬを含み、第３のコードされたタンパク質は、ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第１及び第３のコードされたタンパク質のＣＨ１ドメインは、第２のコードされたタンパク質のＣＬと対合し、第１及び第３のタンパク質のコードされたＣＨ３領域は、それぞれ、第１のＣＨ３タンパク質若しくはそれに対応する位置でアミノ酸Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ付番）をコードし、第３のタンパク質若しくはそれに対応する位置でアミノ酸Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅをコードし、又はその逆も同様である。あるいは、当該第１及び第３のタンパク質は、これらのタンパク質の各々のＣＨ３ドメインの効率的な対合を引き起こす他の適合性ヘテロ二量体化ドメインを含む。
【0148】
当該タンパク質をコードする核酸は、本発明の多価多量体を生成するために、１つ以上のベクター上に存在し得る。当該タンパク質をコードする当該核酸は、宿主細胞のゲノムに、好ましくは、高発現、及び遺伝子サイレンシングの非存在又は減少について既知の染色体領域で、安定的に更に組み込まれてもよい。
【0149】
本発明の宿主細胞は、全発現免疫グロブリンに基づいて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の純度の本発明の多価多量体にて、多価多量体を産生することが可能である。
【0150】
本発明の宿主細胞は、多価多量体を産生することが可能であり得、産生される多価多量体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％は、全ての結合部位に対して同族の共通鎖と対合した可変再構成領域を含む。
【0151】
本発明の宿主細胞は、多価多量体を産生することが可能であり得、発現した共通鎖の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％は多価多量体と対合しており、遊離した会合していないタンパク質ではない。
【0152】
多価多量体を、二量体化された２つの重鎖のヒンジの下方で当該多量体を切断するタンパク質分解酵素に曝露した際、得られた本発明の切断多価多量体は、元のタンパク質の濃度の少なくとも約５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％超、最大９０％超が本発明の切断多価多量体に変換されて、得ることが可能である。
【0153】
非ヒト動物
本明細書に記載の方法及び組成物は、好適な方法から得られる、それに由来する、又はそれに基づいて、結合ドメインを有する好適な多価結合タンパク質を作製することを可能にする。好適な方法としては、ファージディスプレイ法（ファージディスプレイシステムにおいて生成された生殖細胞系列配列の修飾を含む）、及び当該技術分野において既知の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を挙げることができる。特に有用な方法は、遺伝子組換え非ヒト動物に、体細胞組換えの自然なプロセス、及び親和性成熟により、共通軽鎖と会合して発現することができる好適な重鎖可変ドメインを作製させることである。
本明細書に記載の方法及び組成物は、好適な方法から得られる、それに由来する、又はそれに基づいて、結合ドメインを有する好適な多価結合タンパク質を作製することを可能にする。好適な方法としては、ファージディスプレイ法（ファージディスプレイシステムにおいて生成された生殖細胞系列配列の修飾を含む）、及び当該技術分野において既知の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を挙げることができる。特に有用な方法は、遺伝子組換え非ヒト動物に、体細胞組換えの自然なプロセス、及び親和性成熟により、共通軽鎖と会合して発現することができる好適な重鎖可変ドメインを作製させることである。
【0154】
一実施形態では、本発明の多価多量体において使用される可変ドメインは、生殖細胞系列内に再構成されていない重鎖可変遺伝子座を含み、単一の再構成ヒト軽鎖可変ドメインを発現する非ヒトトランスジェニック動物、例えば、げっ歯類などの共通軽鎖哺乳動物の重鎖及び軽鎖可変領域から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく。このような非ヒトトランスジェニック動物は、抗原への曝露時に、共通軽鎖と対合した多様な体細胞再構成重鎖可変領域を発現し、次いで、それを使用して、多価抗体の産生のために宿主細胞に効率的に形質転換することが可能な、当該トランスジェニック動物から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく重鎖可変領域をコードする核酸配列を発達させることができる。
【0155】
特に、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変ドメインを発現するように遺伝子操作された免疫化共通軽鎖動物の好適なＢ細胞由来のヒト可変領域配列は、本発明の多価多量体の潜在的ＶＨドメインの供給源として使用され得る。当該動物由来のＢ細胞は、様々な実施形態において、多価多量体が結合する抗原である、１つ以上の対象とする抗原で免疫化される。当該動物の細胞、組織、又は血清、脾臓又はリンパ材料をスクリーニングして、対象とする抗原に関する所望の特性、例えば、高親和性、低親和性、遮断能、活性化、内在化、又は他の特性を示す重鎖可変ドメイン（又はそれらを発現するＢ細胞）を得る。当該トランスジェニック動物における抗原刺激に応答して生成される重鎖可変ドメインのほぼ全てが、好ましくは１つ以下、又は２つ以下のＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖の発現と共に作られるので、重鎖可変領域は、トランスジェニック動物において発現される共通軽鎖ドメインで発現及び会合することが可能である。
【0156】
一態様では、本明細書に記載のエピトープ結合タンパク質が提供され、ヒトＶＬ及びＶＨ配列は、対象とするエピトープを含む抗原で免疫化されている、本明細書に記載のトランスジェニックマウス、及び／又は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５７７７１号に開示されているトランスジェニック動物のＢ細胞から得られる核酸に基づいて核酸によりコードされる。
【0157】
核酸配列、ポリペプチド、ベクター、及び細胞
本発明は、本発明の多価多量体の組み立てに使用することができるポリペプチド又はリンカーをコードする核酸配列、このような核酸配列を含むベクター、本発明の多価多量体を産生することが可能な細胞、及びこのような細胞を使用してこのような多価多量体を調製する方法を、更に提供する。
本発明は、本発明の多価多量体の組み立てに使用することができるポリペプチド又はリンカーをコードする核酸配列、このような核酸配列を含むベクター、本発明の多価多量体を産生することが可能な細胞、及びこのような細胞を使用してこのような多価多量体を調製する方法を、更に提供する。
【0158】
本発明による多価抗体は、典型的には、本発明の多量体を形成するように一緒に組み立てるポリペプチドをコードする核酸配列を発現する細胞によって産生される。
【0159】
したがって、本発明は、配列番号２～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むリンカー、又はそれらのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性、それらのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９０％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９５％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９８％の配列同一性、例えばそれらのいずれかと少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
【0160】
本発明は、ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ベースとするリンカー－ＶＨ２－ＣＨ１を含む、ポリペプチドを更に提供する。
【0161】
特定の実施形態では、ＶＨ３及びＶＨ２は、同じエピトープに結合する。特定の実施形態では、ＶＨ３及びＶＨ２は、同じ抗原に、但し異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、ＶＨ３及びＶＨ２は、別個のエピトープ及び抗原に結合する。
【0162】
また、このようなリンカー又はポリペプチドをコードする核酸配列、及びこのような核酸配列を含むベクターも、本発明によって提供される。
【0163】
記載のポリペプチドを作製するために採用される核酸配列は、任意の好適な発現ベクター内に配置されてもよく、適切な状況では、単一の宿主細胞内の２つ以上のベクター内に配置されてもよい。
【0164】
概して、可変ドメインをコードする核酸配列は、適切なリンカー及び／又は定常領域でクローニングされ、配列は、発現に好適な細胞株において好適な発現構築物内のプロモーターと作動可能に連結して配置される。
【0165】
多価多量体の発現
組換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において記載されている。本発明の多量体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましく、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くこと、又はそれを低減することが知られている、遺伝子座を標的化し得る。
組換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において記載されている。本発明の多量体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましく、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くこと、又はそれを低減することが知られている、遺伝子座を標的化し得る。
【0166】
本発明の多量体として組み立てるポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るために、このような発現を推進することが可能な配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結され得ることが、当業者には周知である。機能的な連結は、ポリペプチド又はその前駆体をコードする核酸配列が、これらの配列がポリペプチド又はその前駆体の発現を推進することができるように、発現を推進することが可能な配列に連結されていることを説明することを意味する。有用な発現ベクターは、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡベクターシリーズが、当該技術分野において利用可能である。対象とするポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写及び翻訳を調節する配列を参照して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、発現と呼ばれる対象とするポリペプチドを産生するのに有用である。発現を推進する配列としては、プロモーター、エンハンサーなど、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。これらは、宿主細胞において機能することにより、それらに機能的に連結された核酸配列の発現を推進することが可能である必要がある。プロモーターは、構成的であるか又は調節されていてもよく、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物源、又は人工的に設計されたものを含む様々な供給源から得ることができる。
【0167】
本発明の核酸配列の発現は、天然プロモーター若しくはその誘導体由来、又は完全に異種プロモーター由来であってもよい。真核細胞において発現するためのいくつかの周知の多用されるプロモーターは、ウイルス由来のプロモーター、例えば、アデノウイルス、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターはまた、例えばメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子ｌａ（ＥＦ－ｌａ）プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどの真核細胞に由来し得る。宿主細胞における本発明の核酸配列の発現を推進することが可能な任意のプロモーター又はエンハンサー／プロモーターは、本発明において好適である。一実施形態では、発現を推進することが可能な配列は、ＣＭＶプロモーター由来の領域、好ましくはＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターのヌクレオチド－７３５～＋９５を含む領域を含む。当業者であれば、本発明において使用される発現配列が、インスレーター、マトリックス付着領域、ＳＴＡＲエレメントなどの発現を安定化又は向上させることができるエレメントと好適に組み合わせられ得ることを認識するであろう。これにより、発現の安定性及び／又はレベルを向上させることができる。
【0168】
組換え核酸配列を発現させるのに好適な任意の細胞を使用して、本発明の多量体を生成することができる。好ましくは、当該細胞は懸濁増殖に適合される。
【0169】
本発明の多価多量体は、典型的には、本発明の好適な細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することによって、宿主細胞において発現させることができる。好ましくは、当該細胞は、無血清培地中で培養される。本発明の多量体は、細胞から回収することができ、又は好ましくは、当業者に概ね知られている方法によって細胞培養培地から回収することができる。
【0170】
回収後、無傷の抗体を処理して、抗体からＦｃドメイン（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）を切断する。本発明の多量体は、当該技術分野において既知の方法を使用することによって回収することができる。このような方法としては、沈降、遠心分離、濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、カチオン及び／又はアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。リンカー配列をベースとするものなど、親和性クロマトグラフィーを、本発明の多価多量体を分離する手段として使用することができる。
【0171】
切断多価多量体の効率的な生成
当該技術分野では、Ｆ（ａｂ’）２の製造のため、酵素消化及び化学的結合を採用してきた。例えば、抗体の親和性対アビディティ結合は、Ｆ（ａｂ’）２と比較したとき、Ｆａｂの生成及び標的との比較を通じて、一価の標的物により抗原との結合が二価標的物よりも少なくなるかどうかについて試験し、及び二価性がアビディティにつながるかどうかを理解することで、分析されてきた。化学コンジュゲーション及びタンパク質分解消化によりＦ（ａｂ’）２部分を生成する従来方法は、非効率的であること、不安定又は潜在的に免疫原性部分の生成、並びにこのような部分の分離及び使用を非実用的にする抗体断片の不均質混合物の生成により、研究及び治療用途にとってつまらないものであった。Ｆｃの特異的切断が可能な酵素の使用と組み合わせて本明細書に記載の技術により高純度で発現された、新規な多価多量体フォーマットの出現によって、ペプシン消化から観察されるＣ末端不均一性を排除することによる、当該切断多価多量体の産物の高濃度の生成が可能である。
当該技術分野では、Ｆ（ａｂ’）２の製造のため、酵素消化及び化学的結合を採用してきた。例えば、抗体の親和性対アビディティ結合は、Ｆ（ａｂ’）２と比較したとき、Ｆａｂの生成及び標的との比較を通じて、一価の標的物により抗原との結合が二価標的物よりも少なくなるかどうかについて試験し、及び二価性がアビディティにつながるかどうかを理解することで、分析されてきた。化学コンジュゲーション及びタンパク質分解消化によりＦ（ａｂ’）２部分を生成する従来方法は、非効率的であること、不安定又は潜在的に免疫原性部分の生成、並びにこのような部分の分離及び使用を非実用的にする抗体断片の不均質混合物の生成により、研究及び治療用途にとってつまらないものであった。Ｆｃの特異的切断が可能な酵素の使用と組み合わせて本明細書に記載の技術により高純度で発現された、新規な多価多量体フォーマットの出現によって、ペプシン消化から観察されるＣ末端不均一性を排除することによる、当該切断多価多量体の産物の高濃度の生成が可能である。
【0172】
Ｆ（ａｂ’）ｎ又は（修飾Ｆ（ａｂ’）ｎ）を含む多価多量体は、任意の好適な酵素的切断及び／又は消化技術を使用して任意の完全長多量体（例えば、モノクローナル多重特異性抗体全体）から得られるように、本明細書に記載の方法に関連して製造することができる。特定の実施形態では、抗体断片は、ヒンジの下方の特定の部位でヒトＩｇＧ１を切断し、無傷のＦ（ａｂ’）ｎ多量体を残す、ＩｄｅＳプロテアーゼ、すなわちストレプトコッカス・ピオゲネスのＩｇＧ分解酵素で切断することにより得ることができ、Ｆ（ａｂ’）ｎの一方の側の重鎖が、それらのそれぞれのＣ末端で他方の側の重鎖と対合され、対合は２つ以上のジスルフィド架橋を含む。（図４ｂ１）。
【0173】
あるいは、Ｆｃ領域を欠いている多価多量体は、ヒンジ（ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣ）（配列番号９２）の上方の特定の部位でヒトＩｇＧ１を消化する、無傷のＦａｂ（図４ｂ２）、２Ｆａｂ’（図４ｂ３）、及びＦｃ（図４ｂ４）断片を生成する、ポルフィロモナス・ジンジバリス由来のシステインプロテアーゼを使用することにより得ることができる。可変ドメイン及び定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）を含む重鎖の発現を通じてこの技術によって形成することができる多量体は、本明細書に記載のリンカーによって追加の可変ドメインに接続され、又は軽鎖と対合され、これは、本明細書に記載のリンカーによって追加の可変ドメインに接続され、ポルフィロモナス・ジンジバリス由来などのタンパク質分解酵素が、当該重鎖の定常ドメインを切断し、いくつの結合ドメインが長いアーム上に存在するかに応じて、無傷の切断２Ｆａｂ’又はより多くの結合ドメインの多量体を残す。
【0174】
本明細書に記載の宿主細胞及びヘテロ二量体化技術を使用することにより、二重特異性部分及び多重特異性部分の効率的な生成は、Ｆｃ領域（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）が除去された大型バッチで起こすことができ、Ｆ（ａｂ’）ｎ部分の高濃度のプールを生成することで効率的な研究及び潜在的な治療用途が可能になり、サイレンシング（例えば、非存在）Ｆｃ、より短い半減期、及びより小さいサイズに関連する効果をもたらす。
【0175】
タンパク質分解酵素の除去
必須ではないが、切断多価多量体の生成時にタンパク質分解酵素を除去することが好ましい場合がある。固定化酵素（例えば、アガロースに固定化）の使用もまた、好ましい場合がある。酵素の除去は、酵素の末端（好ましくはＮ末端）に存在するＨＩＳ－ＮｉＮＴＩ、ビオチン－アビジン、又はＶＳＶ／ＦＬＡＧ －抗ＶＳＶ／ＦＬＡＧタグなどのタグを含むタンパク質分解酵素を使用することなど、当該技術分野において既知の様々な手段によって達成することができ、酵素を抗タグ親和性カラムによって除去することを可能にする。Ｆｃなどの抗体断片はまた、親和性クロマトグラフィー法を用いて単離することができる。同様に、タンパク質分解酵素は、電荷クロマトグラフィーによって除去することができ、又は電荷クロマトグラフィーによって後で除去することができるよう、強められた電荷を有する修飾酵素を製造することができる。
必須ではないが、切断多価多量体の生成時にタンパク質分解酵素を除去することが好ましい場合がある。固定化酵素（例えば、アガロースに固定化）の使用もまた、好ましい場合がある。酵素の除去は、酵素の末端（好ましくはＮ末端）に存在するＨＩＳ－ＮｉＮＴＩ、ビオチン－アビジン、又はＶＳＶ／ＦＬＡＧ －抗ＶＳＶ／ＦＬＡＧタグなどのタグを含むタンパク質分解酵素を使用することなど、当該技術分野において既知の様々な手段によって達成することができ、酵素を抗タグ親和性カラムによって除去することを可能にする。Ｆｃなどの抗体断片はまた、親和性クロマトグラフィー法を用いて単離することができる。同様に、タンパク質分解酵素は、電荷クロマトグラフィーによって除去することができ、又は電荷クロマトグラフィーによって後で除去することができるよう、強められた電荷を有する修飾酵素を製造することができる。
【0176】
あるいは、本発明の多価多量体の混合物、タンパク質分解酵素、及び定常ドメイン断片は、タンパク質分解酵素を変性させることが可能なｐＨ条件又は温度条件に曝露することができるが、多価多量体対合を実質的に阻害せず、それにより、目的の多価多量体を損傷することなく、酵素の不活性化及び分離を促進する。
【0177】
医薬組成物及び使用方法
また、本発明の多量体と、医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む医薬組成物が、本発明によって提供される。
また、本発明の多量体と、医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む医薬組成物が、本発明によって提供される。
【0178】
したがって、本発明は、治療によってヒト又は動物の身体の処置に使用するための、本明細書に記載の多価多量体を提供する。
【0179】
医学的病態に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の多価多量体をヒト又は動物に投与することを含む、方法が、本発明によって更に提供される。
【0180】
患者に投与されるべき本発明による多量体の量は、典型的には、治療用ウィンドウ内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容不可能な程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる多価多量体の量が少なくなるほど、治療用ウィンドウは、典型的には大きくなる。したがって、低用量で十分な治療効果を発揮する本発明による多価多量体が好ましい。
【0181】
先行技術として示される特許文献又は他の事項への本明細書での言及は、その文書若しくは事項が既知であったこと、又はそれが有する情報が、特許請求の範囲のいずれかの優先日における共通の全般知識の一部であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0182】
本明細書に記載の各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0183】
実施例１．多価多量体の無傷の抗体対応物に対する比較
５つの異なる抗体（ＰＧ６０５８ｐ０２（ＨＥＲ３ ＩｇＧ Ｆｃ ＷＴ）配列番号６６及び６７；ＰＧ３００４ｐ０４（ＨＥＲ２ ＩｇＧ Ｆｃ ＷＴ）配列番号６８及び６９；二重特異性ＰＢ１１２４７ ＭＦ６０５８（ＨＥＲ３）ｘＭＦ３００４（ＨＥＲ２）Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｆｃ ＷＴ ＤＥＫＫ（米国特許出願公開第２０１７／００５８０３５号）配列番号６６～６９；ＰＧ１３３７（ＴＴ ＩｇＧ ＦｃＷＴ）配列番号７０及び７１；ＰＢ４２４８（ＴＴｘＴＴ）Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｆｃ ＷＴ ＤＥＫＫ（国際公開第２０１７／０６９６２８号）を、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ Ｆａｂキット及びＦａｂＲＩＣＡＴＯＲキット（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を使用して消化し、それぞれＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を生成した。抗体配列を表３に示す。
５つの異なる抗体（ＰＧ６０５８ｐ０２（ＨＥＲ３ ＩｇＧ Ｆｃ ＷＴ）配列番号６６及び６７；ＰＧ３００４ｐ０４（ＨＥＲ２ ＩｇＧ Ｆｃ ＷＴ）配列番号６８及び６９；二重特異性ＰＢ１１２４７ ＭＦ６０５８（ＨＥＲ３）ｘＭＦ３００４（ＨＥＲ２）Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｆｃ ＷＴ ＤＥＫＫ（米国特許出願公開第２０１７／００５８０３５号）配列番号６６～６９；ＰＧ１３３７（ＴＴ ＩｇＧ ＦｃＷＴ）配列番号７０及び７１；ＰＢ４２４８（ＴＴｘＴＴ）Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）Ｆｃ ＷＴ ＤＥＫＫ（国際公開第２０１７／０６９６２８号）を、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ Ｆａｂキット及びＦａｂＲＩＣＡＴＯＲキット（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を使用して消化し、それぞれＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を生成した。抗体配列を表３に示す。
【0184】
【表3】
【0185】
４０単位及び２００単位のＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素を、２ｍＭのシステイン（弱い還元剤）の存在下、３７℃で２時間、１００μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬのＨＥＲ２／ＨＥＲ３多価抗体と共にインキュベートした。４０単位及び２００単位のＦａｂＲＩＣｒＡＴＯＲ ＬＥもまた、還元剤を添加せずに３７℃で２時間、１００μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬのＨＥＲ２／ＨＥＲ３多価抗体と共にインキュベートした。次いで、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＣＨ１親和性カラム（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を使用して、両方の反応物を精製した。ＩｇＧ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２の濃度を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌセンサを使用してＯｃｔｅｔで測定した。これを以下の表４に示す。
【0186】
【表4】
【0187】
純度もまた、図２ａ～図２ｅに示されるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により測定した。図２ａ～図２ｅに示されるように、未精製のＦａｂ消化物及びそれらのフロースルーサンプル（Ｆｃ）の両方が、非還元性ゲルにおいて部分的に減少して見える。これは、切断緩衝液中の弱い還元剤（２ｍＭのシステイン）によって引き起こされた可能性が高い。非還元条件下では、Ｆ（ａｂ’）２反応物中にＦｃは観察されていない。代わりに、「ハーフＦｃ’バンド」が見え、これは、切断酵素が、２つの重鎖を接続するヒンジシステインの下方を切断するためである。したがって、「粗」Ｆ（ａｂ’）２断片の非還元性ゲルは、Ｆ（ａｂ’）２については９７ｋＤａの予想バンドサイズ、ハーフＦｃ断片については２５ｋＤａを辛うじて上回る予想バンドサイズを与える。
【0188】
無傷のＩｇＧ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の、ＭＣＦ７細胞に結合する能力を、ＦＡＣＳ分析によって分析した。ＭＣＦ７細胞は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の両方を発現するので選択された。
【0189】
【表5】
【0190】
表５に見られるように、生成されたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、それらの結合特性を保持しており、ＩｇＧ及び対応するＦ（ａｂ’）２断片は、同様の親和性によって結合する。Ｆａｂ断片もまた、予想されるとおり、より低い親和性によってであるが、結合する。このことは、ＰＢ１１２４７（ＭＦ６０５８（ＨＥＲ３）ｘＭＦ３００４（ＨＥＲ２））Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）を使用して生成されたＦ（ａｂ’）２断片中のＨＥＲ２及びＨＥＲ３アームの両方が利用可能であり機能的であることを示している。
【0191】
ＩｇＧ又はｂｉｃｌｏｎｉｃｓ由来のＦ（ａｂ’）２断片の、機能的活性を保持する能力については、ヘレグリン依存性ＭＣＦ－７増殖アッセイを使用して測定した。抗体ＰＧ３００４（Ｈｅｒ２）、ＰＧ６０５８（Ｈｅｒ３）、ＰＧ１３３７（ＴＴ）、ＭＦ６０５８（ＨＥＲ３）ｘＭＦ３００４（ＨＥＲ２）Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（登録商標）Ｆｃ ＷＴ ＤＥＫＫ（米国特許出願公開第２０１７／００５８０３５号）及びＭＦ１３３７ｘＭＦ１３３７）（ＴＴｘＴＴ）、並びに上記抗体の、ヒンジの下方で切断可能な酵素への曝露時に製造されたＦ（ａｂ’）２断片（粗５００μｇ／ｍＬの反応混合物及び精製Ｆ（ａｂ’）２断片の両方）を、９点片対数滴定シリーズで、１００％遮断対照としての１０μｇ／ｍＬ（Ｏｃｔｅｔで測定したとき）から下げていって試験した。スタウロスポリン（１：２００）を１００％遮断対照として使用した。各プレート上に、ヘレグリンなしの２つのウェル、ヘレグリンありであるが阻害剤なしの２つのウェル、及び１：２００のスタウロスポリンありの２つのウェル（最大阻害）を入れた。図３に示されるように、ＰＢ１１２４７Ｆ（ａｂ’）２断片は、増殖アッセイにおいて、それらの対応するＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の程度に機能的であり、精製又は未精製Ｆ（ａｂ’）２活性の間に明確な差異がない。
【0192】
実施例２．三価ＩｇＧ分子由来のＦ（ａｂ’）３の製造
Ｆ（ａｂ’）ｎ断片（Ｆ（ａｂ’）３、２Ｆａｂ’、及びＦａｂ断片を含む）を多価多量体から生成する能力も、分析した。図４に示されるように、Ｆ（ａｂ’）３と、２Ｆａｂ’又はＦａｂ断片との両方が、選択されたプロテアーゼ（例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ又はＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ）に基づいて生成される。異なる抗原結合特性及び共通軽鎖を含む以下の三価多量体、すなわち、ＰＴ２３１０３ｐ０９（配列番号７２及び７３の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ１５（配列番号７４及び７５の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０４（配列番号７６及び７７の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０８（配列番号７８及び７９の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０３（配列番号８０及び８１の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ１１（配列番号８２及び８３の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；及びＰＴ２３１０３ｐ１２（配列番号８４及び８５の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）を分析した。各ＰＴは、ＭＦ１３３７（破傷風トキソイド）配列番号７０及び７１をＶＨ３の位置（頂部の長いアーム）で含み、ＭＦ１１２２（フィブリノーゲン）配列番号８６及び８７をＶＨ２の位置（内部の長いアーム）で含み、ＭＦ１０２５（サイログロブリン）配列番号８８及び８９をＶＨ１の位置（短いアーム）で含み、各ＶＨがｃＬＣと対合されている、以下の三価多量体をコードする。図４を参照のこと。三価多量体配列を表６に示す。
Ｆ（ａｂ’）ｎ断片（Ｆ（ａｂ’）３、２Ｆａｂ’、及びＦａｂ断片を含む）を多価多量体から生成する能力も、分析した。図４に示されるように、Ｆ（ａｂ’）３と、２Ｆａｂ’又はＦａｂ断片との両方が、選択されたプロテアーゼ（例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ又はＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ）に基づいて生成される。異なる抗原結合特性及び共通軽鎖を含む以下の三価多量体、すなわち、ＰＴ２３１０３ｐ０９（配列番号７２及び７３の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ１５（配列番号７４及び７５の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０４（配列番号７６及び７７の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０８（配列番号７８及び７９の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ０３（配列番号８０及び８１の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；ＰＴ２３１０３ｐ１１（配列番号８２及び８３の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）；及びＰＴ２３１０３ｐ１２（配列番号８４及び８５の重鎖ＶＨ２－リンカー－ＣＨ１－ＶＨ３配列を有する）を分析した。各ＰＴは、ＭＦ１３３７（破傷風トキソイド）配列番号７０及び７１をＶＨ３の位置（頂部の長いアーム）で含み、ＭＦ１１２２（フィブリノーゲン）配列番号８６及び８７をＶＨ２の位置（内部の長いアーム）で含み、ＭＦ１０２５（サイログロブリン）配列番号８８及び８９をＶＨ１の位置（短いアーム）で含み、各ＶＨがｃＬＣと対合されている、以下の三価多量体をコードする。図４を参照のこと。三価多量体配列を表６に示す。
【0193】
【表6-01】
【表6-02】
【表6-03】
【表6-04】
【表6-05】
【0194】
各酵素反応について、４００μＬの最終反応体積中２００μｇ／ｍＬのＩｇＧを、１０倍希釈還元緩衝液中で、８０単位のＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ ＬＥ又は８０単位のＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮのいずれかと共にインキュベートし、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＴ２３１０３ｐ０９、ＰＴ２３１０３ｐ０１５、ＰＴ２３１０３ｐ０４について、２５０μＬの反応混合物を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＣＨ１カラムを使用するＦ（ａｂ’）ｎの精製に使用した。Ｆｃ及び酵素を含有するフロースルーを、溶出画分と共に回収した。得られた全てのＦ（ａｂ’）ｎ調製物のタンパク質濃度を、Ａ２８０ｎｍで測定した。表７は、各消化物のタンパク質濃度を示している。
【0195】
【表7】
【0196】
粗抽出物で得られたＦ（ａｂ’）３の百分率は、ＰＴ２３１０３ｐ０９、ＰＴ２３１０３ｐ１５、及びＰＴ２３１０３ｐ０４について、５５～７４％の範囲であった。消化粗抽出物について、全タンパク質濃度を多価多量体の出発物質に対して分析し、これは、全ての多価多量体を有する場合に、タンパク質の１００％を占める結果になるものであった。分子量（Ｄａ）に対して濃度（ｍｇ／ｍＬ）を分析することにより、また、多価多量体、切断多価多量体、及び切断Ｆｃの、表８に示される値を有する分子量により多価多量体の出発物質と比較して、収率パーセントを計算する。
【0197】
【表8】
【0198】
抗体断片の特異的結合を確認するのに、破傷風、フィブリノーゲン、及びサイログロブリンに対する特異的結合を測定するためのＥＬＩＳＡ反応を行った。生成された切断多価多量体、Ｆａｂ、及び非消化ＩｇＧを、２μｇ／ｍＬでコーティングされた破傷風トキソイド、１０μｇ／ｍＬでコーティングされたフィブリノーゲン、又は１０μｇ／ｍＬでコーティングされたサイログロブリンに対する滴定範囲で、結合について試験した。２．５μｇ／ｍＬでコーティングされたｈｕＥＧＦＲ－Ｆｃの陰性対照を使用した。各精製部分：Ｆ（ａｂ’）３、Ｆａｂ及び２Ｆａｂ’について、７．５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を分析し、ＰＧ１３３７ｐ３２４を陰性対照及び陽性対照の両方として含めた。結合Ｆ（ａｂ’）ｎの検出を、１／２０００希釈で、ＣＨ－１検出抗体を使用して実施した。
【0199】
表９に示されるように、全てのサンプル（非消化、粗、及び精製Ｆａｂ）は、ＶＨ３の位置で、又はＦ（ａｂ’）３の「長いアーム」上の頂部位置で破傷風トキソイドへの結合を保持していた（図４を参照のこと）。結合シグナル（４５０ｎｍでの吸収）は、非消化サンプルと消化サンプルとで非常に類似している。
【0200】
【表9】
【0201】
次に、三価切断多量体を、Ｆ（ａｂ’）３の長いアームの内部位置であるＶＨ２の位置に位置する、フィブリノーゲン結合について分析した（図４を参照のこと）。ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ Ｆ（ａｂ’）３消化サンプル（非消化、粗、び精製Ｆａｂ）は全て、フィブリノーゲンへの結合を保持していた（表１０）。結合シグナル（４５０ｎｍでの吸収）は、非消化サンプルと消化サンプルとで非常に類似していた。ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ ２Ｆａｂ’（図４を参照のこと）では、結合は保持されていたが、リンカーＩｇＧ１Ｇ４Ｓ、ＩｇＧ２ＡＭＨ、ＩｇＧ２ＡＨ、及びＩｇＧ２ＢＨでは減少した。したがって、リンカーＩｇＧ１Ｈ、ＩｇＧ１ＭＨ、及びＩｇＧ１ＵＨによるＩｇＧは全て、フィブリノーゲンへの結合を失った。
【0202】
【表10】
【0203】
三価多量体を、ＶＨ１、すなわち、Ｆ（ａｂ’）３の短いアーム位置に位置するサイログロブリン結合についても分析した（図４を参照のこと）。ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ Ｆ（ａｂ’）３サンプル（非消化、粗、び精製Ｆａｂ）は全て、サイログロブリンへの結合を保持していた（表１１）。結合シグナル（４５０ｎｍでの吸収）は、非消化サンプルと消化サンプルとで非常に類似していた。このＦａｂは三価切断多量体における、ＶＨ１、短いアームの位置にあり、酵素消化により影響を受けなかった。ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮでは、サンプル（非消化、粗、び精製Ｆａｂ）の全てが、サイログロブリンへの結合を保持していた。結合シグナル（４５０ｎｍでの吸収）は、非消化サンプルと消化サンプルとで非常に類似していた。
【0204】
【表11】
【0205】
断片産生を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動法によっても確認した。図５（ａ～ｄ）に示されるように、Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒは、各三価の切断多価多量体の（Ｆａｂ’）３断片の生成によく作用した。ＰＴ２３１０３ｐ０９については、非処理ＩｇＧ（非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ））は、適切なタンパク質バンドを示した。還元及び非還元条件下の両方で、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物中にＦｃは観察されなかった。代わりに、「ハーフＦｃ」バンドが観察され、これは、この酵素が、２つの重鎖を接続するヒンジシステインの下方を切断し、２つのＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドがもたらされるためである。未精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物及びそのフロースルーサンプル（Ｆｃ）の両方が、非還元性ゲルにおいて減少して見えた。これは、切断緩衝液中に存在する弱い還元剤（２ｍＭのシステイン）によって引き起こされた可能性が高く、これにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時にジスルフィド結合の減少をもたらす。精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物中に、予想された断片が見えている（図５ａ）。
【0206】
ＰＴ２３１０３ｐ１５については、非処理ＩｇＧ（ＮＲ及びＲ）も適切に見えた。ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲサンプルは、適切なタンパク質バンドを示した。還元及び非還元条件下の両方で、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物中にＦｃは観察されなかった。代わりに、「ハーフＦｃ」バンドが観察され、これは、この酵素が、２つの重鎖を接続するヒンジシステインの下方を切断し、２つのＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドがもたらされるためである。未精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物及びそのフロースルーサンプル（Ｆｃ）の両方が、非還元性ゲルにおいて減少して見えた。これは、切断緩衝液中で弱い還元剤（２ｍＭのシステイン）によって引き起こされた可能性が高く、これにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時にジスルフィド結合の減少をもたらす。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物中、３つのバンドは５０ｋＤａ前後で現れる。これらの３つのバンドは、Ｆ（ａｂ’）３の３つの単一のＦａｂを表しており、リンカーの部分が長いアームからの２つのＦａｂとこれらのＦａｂに接続されたヒンジの部分との間にあるので、異なる高さで動く。還元条件下では、全てのタンパク質が、ＶＬ－ＣＬ又はＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの高さで、ほぼ２５ｋＤａにて動いた。ＥＬＩＳＡでのフィブリノーゲンに対する結合能力は、粗反応物及び精製反応物の両方で失われたが、ＥＬＩＳＡでの破傷風及びサイログロブリンに対する結合能力は、依然として失われていなかった。（図５ｂ）。
【0207】
ＰＴ２３１０３ｐ０４については、非処理ＩｇＧ（ＮＲ及びＲ）は、適切に見えた。全てのＦａｂＲＩＣＡＴＯＲサンプルが、適切なタンパク質バンドを示した。非還元条件下では、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物中にＦｃは観察されなかった。代わりに、「ハーフＦｃ」バンドが見え、これは、この酵素が、２つの重鎖を接続するヒンジシステインの下方を切断し、２つのＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドがもたらされるためである。未精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物及びそのフロースルーサンプル（Ｆｃ）の両方が、非還元性ゲルにおいて減少して見えた。これは、切断緩衝液中で弱い還元剤（２ｍＭのシステイン）によって引き起こされた可能性が高く、これにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時にジスルフィド結合の減少をもたらす。精製ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物中に、予想された断片が見えていた（図５ｃ）。
【0208】
ＰＴ２３１０３ｐ０８、ＰＴ２３１０３ｐ０３、ＰＴ２３１０３ｐ１１、及びＰＴ２３１０３ｐ１２については、非処理ＩｇＧ（ＮＲ及びＲ）が適切に見えた。全てのＦａｂＲＩＣＡＴＯＲサンプルが、適切なタンパク質バンドを示した。非還元条件下では、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物中にＦｃは観察されなかった。代わりに、「ハーフＦｃ」バンドが見え、これは、この酵素が、２つの重鎖を接続するヒンジシステインの下方を切断し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時にジスルフィド結合の減少をもたらすためである。粗ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物は、非還元性ゲルにおいて減少して見えた。これは、切断緩衝液中で弱い還元剤（２ｍＭのシステイン）によって引き起こされた可能性が高く、これにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル調製時にジスルフィド結合の減少をもたらす。ＰＴ２３１０３ｐ０８及びＰＴ２３１０３ｐ０３サンプルについては、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物は、予想のとおりにＦ（ａｂ’）３を示しているが、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ反応物は２Ｆａｂ’断片を示さず、代わりに、単一のＦａｂ断片におおよそ相当する、より小さいバンドが特定された。ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲで消化したＰＴ２３１０３ｐ１１及びＰＴ２３１０３ｐ１２については、Ｆ（ａｂ’）３が生成する。ＰＴ２３１０３ｐ１１及びＰＴ２３１０３ｐ１２については、消化されたＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによって、予想のとおりに２Ｆａｂ’断片を生成するが、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮで消化されたときに特定の成分が減少する（図５ｄ）。還元は、使用される時間又は試薬を調整することによって容易に軽減し得ることが理解される。
【0209】
まとめると、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲで消化した反応物では、全てのサンプルが、予想されたタンパク質バンドを示した。非還元条件下では、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ反応物中にＦｃは観察されていない。代わりに、「ハーフＦｃ」バンド又は「ＣＨ２－ＣＨ３」バンドが見え、これは、酵素が、２つの重鎖を接続するシステイン架橋の下方を切断し、２つのＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドがもたらされるためである。
【0210】
２Ｆａｂ’を生成するＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮで消化した反応物については、いくつかのリンカー中に存在する配列（ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣ）（配列番号９２）は、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによって認識され、以下の三価分子については、リンカー配列は類似している。
【化3】
【0211】
したがって、これらのサンプル中の２Ｆａｂ’は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルと相関する２つの別個のＦａｂに切断された可能性が高い。これらのサンプルでは、遊離リンカーは、結合部位の妨げになることがあり、これによりフィブリノーゲンへの結合の損失を説明することができる。
【0212】
まとめると、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲは良好に作用し、本明細書に開示される方法により、高濃度で、特定の結合が維持された切断三価多量体（Ｆ（ａｂ’）３）が生成され、各々のＦａｂにおいて共通軽鎖を有する、ＤＥＫＫなどのヘテロ二量体化により対合された切断多重特異性多量体（Ｆ（ａｂ’）ｎ）を高濃度で容易に生成することができるということが達成される。一方で、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素を使用することによる２Ｆａｂ’断片の生成は、修飾ＩｇＧ１ヒンジ配列ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＳＰＰＳ（配列番号９３）を欠いているリンカーに作用した。
【0213】
したがって、本明細書に開示される教示を用いると、当業者であれば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ酵素の使用によることなどで、実質的に純粋な切断多価（及び多重特異性）多量体を製造することができる。あるいは、多価多量体を使用することは、追加の結合ドメインが本明細書に開示される教示に従ってＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮにより認識されるモチーフを欠いているリンカーによって当該多量体に接続される場合、当業者が、ｎＦａｂ’及びＦａｂの混合物を製造することを可能にするものである。但し、ｎは２以上であり、ｎＦａｂ’は、本明細書に記載のリンカーにより１つ以上の追加の可変ドメインに接続された可変ドメインを含む重鎖で構成され、又は本明細書に記載のリンカーにより１つ以上の追加の可変ドメインに接続される軽鎖と対合される。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【配列表】
【国際調査報告】