特表2022-519342抗ベータ１インテグリンヒト化抗体及びこれを含む癌治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-23
(54)【発明の名称】抗ベータ１インテグリンヒト化抗体及びこれを含む癌治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220315BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220315BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220315BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220315BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220315BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220315BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220315BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20220315BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220315BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220315BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20220315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P35/00
A61P1/04
A61P11/00
A61P15/00
G01N33/574 A
C12P21/08
C12Q1/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021540155
(86)(22)【出願日】2020-01-08
(85)【翻訳文提出日】2021-07-08
(86)【国際出願番号】 KR2020000353
(87)【国際公開番号】W WO2020145669
(87)【国際公開日】2020-07-16
(31)【優先権主張番号】10-2019-0003213
(32)【優先日】2019-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0002048
(32)【優先日】2020-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521302906
【氏名又は名称】エスジー メディカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジ チョル
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジョンチャン
(72)【発明者】
【氏名】ミン，ソン－ウォン
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ヒョン ソン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA14
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
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4B063QS33
4B063QS38
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
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4B064CC06
4B064CC12
4B064CC24
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4B064DA14
4B065AA91Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
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4B065BC03
4B065BC07
4B065BD14
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA661
4C084ZA811
4C084ZB261
4C085AA14
4C085AA16
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA51
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、ベータ１インテグリンを抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片に関する。また、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。本発明の単一クローン抗体は、癌細胞の増殖及び血管新生を抑制し、細胞自滅死を効果的に誘導するので、癌の予防又は治療に有用に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベータ１インテグリン（ｂｅｔａ１ｉｎｔｅｇｒｉｎ）を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片であって、該単一クローン抗体又はその断片は、カバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）による下記のアミノ酸置換を含むことを特徴とする単一クローン抗体又はその断片：ａ）配列目録第１配列の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）においてＡ９Ｓ、Ｉ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ、Ｋ６６Ｒ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ及びＱ８１Ｅのアミノ酸置換；及び
ｂ）配列目録第２配列の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）においてＶ１１Ｌ、Ｆ３６Ｙ及びＲ３９Ｋのアミノ酸置換。
【請求項2】
前記単一クローン抗体又はその断片は、配列目録第３配列の重鎖可変領域及び配列目録第４配列の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその断片。
【請求項3】
前記単一クローン抗体又はその断片は、単一鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその断片。
【請求項4】
請求項１の単一クローン抗体又はその断片を含む多重特異抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は抗体－薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）。
【請求項5】
請求項１の単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子。
【請求項6】
請求項５の核酸分子を含むベクター。
【請求項7】
請求項６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項8】
請求項１の単一クローン抗体又はその断片、請求項５の核酸分子又は請求項６のベクターを含む、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項9】
前記癌は、細胞毒性化学療法（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｔｈｅｒａｐｙ）に耐性ができたことを特徴とする、請求項８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項10】
前記癌は、肺癌、乳癌又は大腸癌であることを特徴とする、請求項８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項11】
請求項１の単一クローン抗体又はその断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたベータ１インテグリン（ｂｅｔａ１ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の定量方法。
【請求項12】
下記の段階を含むベータ１インテグリン（ｂｅｔａ１ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法：（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）請求項１の単一クローン抗体又はその断片を前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたベータ１インテグリンの発現量が、正常群サンプル中に含まれたベータ１インテグリンの発現量よりも高いか否か確認する段階。
【請求項13】
前記ベータ１インテグリンの過発現による疾患は癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
請求項１の単一クローン抗体又はその断片を含むベータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）定量キット。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、癌細胞の成長、分化、侵入及び転移に関連した生化学的信号を伝達するベータ１インテグリンに特異的に結合する抗体に関し、より詳細には、本発明の抗体は、ベータ１インテグリンの信号伝達機能を抑制させることによって、ベータ１インテグリンが過発現する様々な癌（例えば、非小細胞肺癌）の診断及び治療用途に用いることができる。
本発明は、癌細胞の成長、分化、侵入及び転移に関連した生化学的信号を伝達するベータ１インテグリンに特異的に結合する抗体に関し、より詳細には、本発明の抗体は、ベータ１インテグリンの信号伝達機能を抑制させることによって、ベータ１インテグリンが過発現する様々な癌（例えば、非小細胞肺癌）の診断及び治療用途に用いることができる。
【0002】
［背景技術］
２０１８年度の世界癌発病は１，８００万件であり、死亡は９００万件と推算される。男性の５人に１人及び女性の６人に１人が生涯で癌にかかることがあり、男性の８人に１人と女性の１１人に１人が癌で死亡すると知られている。全世界の癌診断後５年以内の生存者総数は４，３８０万人と推算される（Ｐｒｅｓｓ ＲｅｌｅａｓｅＮ゜２６３，ＷＨＯ，Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８）。肺癌は、乳癌及び大腸癌とともに発病率が最も高い３大癌である。２０１８年世界的癌統計（Ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）によれば、全世界の肺癌発生者は２１０万人、死亡者は１８０万人であり、全体癌死亡者の１／５である１８．４％と予測される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｂｓｅｒｖａｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｖａ ２０１８ ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｇｈｏ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｅｎ／．Ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｊｕｎｅ ２１，２０１８）。
２０１８年度の世界癌発病は１，８００万件であり、死亡は９００万件と推算される。男性の５人に１人及び女性の６人に１人が生涯で癌にかかることがあり、男性の８人に１人と女性の１１人に１人が癌で死亡すると知られている。全世界の癌診断後５年以内の生存者総数は４，３８０万人と推算される（Ｐｒｅｓｓ ＲｅｌｅａｓｅＮ゜２６３，ＷＨＯ，Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８）。肺癌は、乳癌及び大腸癌とともに発病率が最も高い３大癌である。２０１８年世界的癌統計（Ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）によれば、全世界の肺癌発生者は２１０万人、死亡者は１８０万人であり、全体癌死亡者の１／５である１８．４％と予測される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｂｓｅｒｖａｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｖａ ２０１８ ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｇｈｏ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｅｎ／．Ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｊｕｎｅ ２１，２０１８）。
【0003】
肺癌は、大きく、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）と非小細胞性肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ；ＮＳＣＬＣ）とに区分する。ＮＳＣＬＣは、癌細胞のサイズと形態によって扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌（ｌａｒｇｅ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）に分類される。２０１８年国家癌情報センターによれば、２０１７年肺癌全体発生件数２４，２３５件中に癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が８６．６％、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）が０．２％を占めており、癌腫ではＮＳＣＬＣが７８％を占める程度にその比率が高かった。
【0004】
ＮＳＣＬＣは、非常にヘテロジニアスな癌形態（ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅ）であって、抗癌剤に対する反応性が非常に低いため、現在も治療剤開発のニーズがある癌腫である。１９５０年代から肺癌に対する遺伝学的、組織学的研究があったにもかかわらず、２０００年代初期まではプラチナ（ｐｌａｔｉｎｕｍ）ベースの細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ）の併用治療（ｄｏｕｂｌｅｔ ｔｈｅｒａｐｙ）を主に用いた。これは、シスプラチンとパクリタキセル、ゲムシタビン、ドセタキセルのいずれか一つとの複合剤、又はカルボプラチンとパクリタキセルとの複合剤を使用するものである。このような治療方法は、全身的な副作用の他に薬剤耐性も伴い、効果的でなかった。
【0005】
その後に登場した薬物が、ＥＧＦＲ、ＲＡＳ、ＡＬＫの遺伝的変異体に対して特異的に作用する標的治療剤である。ＥＧＦＲ変異体を有する患者群に対してはエルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）があるが、ＲＡＳ変異体については、このようなＥＧＦＲ ＴＫＩに抵抗性を示すことが知られた。ＡＬＫ変異体の場合も同様にＥＧＦＲ ＴＫＩに抵抗性を示すか、ザーコリ（クリゾチニブ）が効果を示すことが知られている。抗体治療剤の場合、既存に他の適応症に用いられていたセツキシマブ（ＥＧＦＲターゲット）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦターゲット）、Ａｄｏ－トラスツズマブ（ＨＥＲ２）などが肺癌治療剤として許可を受けたが、大きな効果が得られておらず、最近に台頭するＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１をターゲットとする免疫抗癌剤の場合、その反応性が約２０～３０％にしか至らず、依然として新規な治療剤開発のニーズがある。
【0006】
ＥＧＦＲ ＴＫＩの場合、ＥＧＦＲ変異体患者群に対して約７０％の高い反応率を示すが、その殆どが１年以内に薬物抵抗性を示す。その原因としては、抵抗性突然変異（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、遺伝子増殖（ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ｂｙ－ｐａｔｈｗａｙの活性化などを挙げることができる。すなわち、ＥＧＦＲ ＴＫＩによってＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍなどの突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）が新しく発生するか、或いはＨＥＲ２又はＭＥＴ増幅などの様々な信号伝達体系の異常が発生する方式で薬物抵抗性が誘発される。
【0007】
他の重要な薬物抵抗性の原因は、べータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）過発現である。べータ１インテグリンは、細胞外環境、特に、成長、分化、侵入及び悪性細胞の転移潜在力と関連した生化学的信号を伝達する物質として知られてきた（Ｊｕｌｉａｎｏ ＲＬ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，１９９３；４（５）：２７７－２８３．）。しかし、べータ１インテグリンの異常発現は、腫瘍抑制及び進行に影響を及ぼし、べータ１インテグリンの増加は、腫瘍細胞の生存を促進し、種々の腫瘍細胞類型において化学療法に耐性を付与することが知られており（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ ＰＳ，Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｔ，Ｗｏｎｇ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．ＥＣＭ ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２００６；１３（１０）：１７７６－１７８８．；Ａｏｕｄｊｉｔ Ｆ，Ｖｕｏｒｉ Ｋ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１；２０（３６）：４９９５－５００４．；Ｍｏｒｏｚｅｖｉｃｈ ＧＥ，Ｋｏｚｌｏｖａ ＮＩ，Ｐｒｅｏｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｉｎ ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ），２００６；７１（５）：４８９－４９５．）、放射能治療に対する抵抗性に関連した物質として知られている（Ｐａｒｋ ＣＣ，Ｚｈａｎｇ ＨＪ，Ｙａｏ ＥＳ，Ｐａｒｋ ＣＪ，Ｂｉｓｓｅｌｌ ＭＪ．Ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８；６８（１１）：４３９８－４０５．）。また、ベバシズマブを使用する血管形成を抑制する癌治療に対する抵抗と関連があると知られている（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ＷＳ，ＤｅＬａｙ Ｍ，Ｊａｈａｎｇｉｒｉ Ａ，Ｐａｒｋ ＣＣ，Ａｇｈｉ ＭＫ．β１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１３；７３（１０）：３１４５－５４．）。べータ１インテグリンスライス細胞（Ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｌｅｎｃｅｄ ｃｅｌｌ）の場合、プラチン系列のシスプラチン及びＥＧＦＲ ＴＫＩ薬物であるゲフィチニブに対する敏感度が高くなったという報告がある（Ｍｏｒｅｌｌｏ Ｖ，Ｃａｂｏｄｉ Ｓ，Ｓｉｇｉｓｍｕｎｄ Ｓ，Ｃａｍａｃｈｏ－Ｌｅａｌ ＭＰ，Ｒｅｐｅｔｔｏ Ｄ，Ｖｏｌａｎｔｅ Ｍ，Ｐａｐｏｔｔｉ Ｍ，Ｔｕｒｃｏ Ｅ，Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ Ｐ．β１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ＥＧＦＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１１；３０：４０８７－４０９６．）。
【0008】
したがって、既存の肺癌治療剤の抵抗性の解決という医学的未充足需要を解決するために、その原因物質を初期に無力化させるような新しい薬物の必要性が台頭しており、その薬物は既存の薬物治療剤と併用する使用法が必要な状況である。
【0009】
上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に関する理解を増進させるためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならない。
【0010】
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明者らは、ベータ１インテグリンに特異的に結合して癌細胞自滅能が極大化した新規抗体を発掘しようと鋭意努力した。その結果、Ｐ５抗体の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによって抗癌活性を極大化できることを確認し、本発明を完成するに至った。
［発明が解決しようとする課題］
本発明者らは、ベータ１インテグリンに特異的に結合して癌細胞自滅能が極大化した新規抗体を発掘しようと鋭意努力した。その結果、Ｐ５抗体の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによって抗癌活性を極大化できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0011】
したがって、本発明の目的は、ベータ１インテグリンを抗原として認識し、それに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供することにある。
【0012】
本発明の他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片を含む多重特異抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は抗体－薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子を提供することにある。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。
【0016】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたベータ１インテグリンの定量方法を提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片を含むベータ１インテグリン定量キットを提供することにある。
【0019】
本発明のさらに他の目的は、ベータ１インテグリンの過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供することにある。
【0020】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってさらに明確になる。
【0021】
［課題を解決するための手段］
本発明の一態様によれば、本発明は、ベータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。
本発明の一態様によれば、本発明は、ベータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。
【0022】
本発明者らは、ベータ１インテグリンに特異的に結合して信号伝達過程を阻害する新規抗体を発掘しようと鋭意努力した結果、既存抗体の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによって、抗癌活性の極大化した新規抗体を発掘した。
【0023】
ベータ１インテグリンは、細胞外環境、特に、成長、分化、侵入及び悪性細胞の転移潜在力と関連した生化学的信号を伝達する物質として知られており、ベータ１インテグリンの異常発現は、腫瘍抑制及び進行に影響を及ぼす。また、ベータ１インテグリンの増加は、腫瘍細胞の生存を促進し、種々の腫瘍細胞類型において化学療法に耐性を付与すると知られている（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ ＰＳ，Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｔ，Ｗｏｎｇ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．ＥＣＭ ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２００６；１３（１０）：１７７６－１７８８．；Ａｏｕｄｊｉｔ Ｆ，Ｖｕｏｒｉ Ｋ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１；２０（３６）：４９９５－５００４．；Ｍｏｒｏｚｅｖｉｃｈ ＧＥ，Ｋｏｚｌｏｖａ ＮＩ，Ｐｒｅｏｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｉｎ ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃ），２００６；７１（５）：４８９－４９５）。
【0024】
本明細書において、用語“抗体”とは、免疫グロブリン分子のいずれかの類型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）でよく、いずれかの下位類型の抗体（例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；及びマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）でよい。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、様々なアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が存在してよく、本明細書において用語“抗体”は、一般に知られたアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）を含む。また、本明細書において用語“抗体”は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であるか、そのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）類型であってよい（例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のハイブリッド）。
【0025】
本明細書において用語“単一クローン抗体”又は“モノクローナル抗体”とは、特定エピトープに対する単一結合特異性（ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示す抗体を意味する。
【0026】
本明細書において前記単一クローン抗体は、その断片を含む意味で使われ、前記断片は、好ましくは、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味する。前記断片は、当業界に知られた様々な方法を用いて製造可能である。例えば、パパイン（Ｆａｂ断片の生産）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を製造することができる。
【0027】
本明細書において、用語“断片”は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単一鎖抗体、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、又はモノマーのＶＨ又はＶＬドメインを含むｓｄＡｂでよく、前記断片については当業界によく知られている。
【0028】
本発明の一実施例によれば、前記単一クローン抗体又はその断片は、単一鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）である。
【0029】
本発明の単一クローン抗体又はその断片は、好ましくは、配列目録第３配列の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）及び／又は配列目録第４配列の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むことができる。
【0030】
ＶＨドメイン、又は１つ又はそれ以上のＣＤＲは、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。また、ＶＬドメイン、又は１つ又はそれ以上のＣＤＲは、軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）重鎖及び全長軽鎖が結合して全長抗体を構成する。
【0031】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を含む多重特異抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は抗体－薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）を提供する。
【0032】
多重特異抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、二重特異抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び三重特異抗体（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む２個以上の抗原を標的とする抗体又はその断片を意味する。例えば、二重特異抗体は、抗体の２個のアーム（ａｒｍ）のうち、一つのアーム（ａｒｍ）は、本発明に係るベータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に対する抗体又はその抗原結合断片を含み、他のアーム（ａｒｍ）は、ベータ１インテグリン以外の抗原を含む形態を意味する。
【0033】
抗体－薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）は、前記抗体又はその断片と薬物との結合体を意味し、ターゲット細胞に薬物を伝達するまでに薬物が抗体に安定的に結合していなければならず、ターゲットに伝達された後、薬物は抗体から遊離していなければならない。本発明において、前記抗体又はその断片と薬物（抗癌剤など）とが結合（例えば、共有結合、ペプチド結合など）し、接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は融合タンパク質（薬物がタンパク質である場合）の形態で使用されてよい。
【0034】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0035】
本発明の核酸分子は、単離したもの又は組み換えられたものであってよく、単一鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他、対応する相補性配列も含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が単離した核酸分子と理解できる。単離した核酸分子は、別個断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるときに“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡはポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現するとき、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーはポリペプチド配列の転写に影響を与えるとき、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は翻訳を促進するように配置されるときにコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダの場合、隣接して同一リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって使用する。
【0036】
本明細書において用語“ベクター”とは、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
【0037】
本明細書において用語“発現ベクター”とは、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能も提供する核酸配列が含まれてもよい。
【0038】
本明細書において、用語“宿主細胞”とは、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、ベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてよく、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達されたり導入される過程を意味する。
【0039】
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、イースト（ｙｅａｓｔ）、動物又はヒト細胞（ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞など）を挙げることができるが、これに制限されるものではない。
【0040】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記ベクターを含む組成物を提供する。
【0041】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物である。
【0042】
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記核酸分子を含むベクター；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【0043】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。
【0044】
本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されず、好ましくは、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）及び急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）などのようなリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、横紋筋肉腫（Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ ｔｕｍｏｒｓ）及び軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａｓ）などのような小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）及び精巣癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）などのような成人における通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）を含め、多数の癌を治療するように投与されてよく、より好ましくは、ベータ１インテグリンを過発現する癌細胞による癌の治療のために投与されてよい。
【0045】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、これらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などもさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【0046】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。
【0047】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
【0048】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されたり、或いは多回容量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【0049】
本発明の薬剤学的組成物は、単独の療法で用いられてもよく、他の通常の細胞毒性化学療法（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｔｈｅｒａｐｙ）又は放射療法と共に用いられてもよいが、このような併用療法を実施する場合には、より効果的に癌治療ができる。特に、ベータ１インテグリンは、様々な癌において細胞毒性化学療法に対する耐性の原因になると知られているので（Ｐａｒｋ ＣＣ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，６６（３）：１５２６－３５）、前記細胞毒性化学療法に耐性ができた癌の治療においてより有意な結果を得ることができる。
【0050】
本発明の組成物と共に使用されてよい細胞毒性化学療法剤は、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ダコミチニブ（ｄａｃｏｍｉｔｉｎｉｂ）、カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）、ネラチニブ（ｎｅｒａｔｉｎｉｂ）、イコチニブ（ｉｃｏｔｉｎｉｂ）、ペリチニブ（Ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂuｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。
【0051】
本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
【0052】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、単一クローン抗体又はその断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたベータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の定量方法を提供する。
【0053】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を含むベータ１インテグリン（ｂｅｔａ１ｉｎｔｅｇｒｉｎ）定量キットを提供する。
【0054】
本発明の単一クローン抗体又はその断片は、ベータ１インテグリンに特異的に結合するため、これを利用すれば、サンプル中に含まれたベータ１インテグリンの量が正確に測定可能である。
【0055】
本発明の定量方法及び／又はキットによれば、抗原抗体結合反応を用いて前記抗体に対する抗原を分析することによってベータ１インテグリンの量を定量することができ、前記抗原抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）及び免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群から選ばれるものを用いることが好ましいが、これに制限されない。
【0056】
抗原－抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、及びガラスでできたスライドガラス（Ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）からなる群から選ばれるものを用いることができるが、これに制限されない。
【0057】
前記２次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識されることが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（Ｐｏｌｙ Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｂ－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（Ｄｙｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つの標識体を用いることができる。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに制限されない。
【0058】
本発明のさらに他の態様によれば、下記の段階を含むベータ１インテグリン（ｂｅｔａ１ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）前記単一クローン抗体又はその断片を前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＬＰＡ２の発現量が正常群サンプル中に含まれたベータ１インテグリンの発現量よりも高いか否か確認する段階。
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）前記単一クローン抗体又はその断片を前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたＬＰＡ２の発現量が正常群サンプル中に含まれたベータ１インテグリンの発現量よりも高いか否か確認する段階。
【0059】
前記ベータ１インテグリンの過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法に関する説明のうち、上述した本発明の定量方法及び／又はキットに関する説明と同じ部分はその部分を参考するものとする。
【0060】
ベータ１インテグリンの変形された発現は、腫瘍抑制及び進行に影響を及ぼし、ベータ１インテグリンの増加は、腫瘍細胞の生存を促進し、種々の腫瘍細胞類型において化学療法に耐性を付与するため（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ ＰＳ，Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｔ，Ｗｏｎｇ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．ＥＣＭ ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２００６；１３（１０）：１７７６－１７８８．；Ａｏｕｄｊｉｔ Ｆ，Ｖｕｏｒｉ Ｋ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１；２０（３６）：４９９５－５００４．；Ｍｏｒｏｚｅｖｉｃｈ ＧＥ，Ｋｏｚｌｏｖａ ＮＩ，Ｐｒｅｏｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｉｎ ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃ），２００６；７１（５）：４８９－４９５．）、前記ベータ１インテグリンの発現量を正常人のそれと比較することによって、ベータ１インテグリンの過発現による疾患の診断のための情報を提供することができる。
【0061】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ベータ１インテグリンの過発現による疾患は、癌である。
【0062】
［発明の効果］
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、ベータ１インテグリンを抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、ベータ１インテグリンを抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。
【0063】
（ｉｉ）また、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【0064】
（ｉｉｉ）本発明の単一クローン抗体は、癌細胞の増殖及び血管新生を抑制し、細胞自滅死を効果的に誘導するので、癌の予防又は治療に有用に用いることができる。
【0065】
［図面の簡単な説明］
［図１］本発明のＧＰ５単クローン抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
［図１］本発明のＧＰ５単クローン抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【0066】
【0067】
［図３］本発明のＧＰ５単クローン抗体の組換えヒトベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ａ）、組換えマウスベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ｂ）及びベータ１インテグリンに対する特異度（図３Ｃ）を示す結果である。
【0068】
［図４］非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の表面からベータ１インテグリンの発現を確認した結果である。
【0069】
【0070】
【0071】
［図７］ゲフィチニブ耐性非小細胞肺癌細胞株であるＰＣ９ＧＲにおいて本発明のＧＰ５単クローン抗体がゲフィチニブと併用されたとき、ゲフィチニブの反応性を、親細胞であるＰＣ９に現れるレベルに向上させる結果である（図７Ａ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲの表面からベータ１インテグリンの発現を確認した結果；図７Ｂ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲにおいてゲフィチニブとＧＰ５単クローン抗体が併用された時に誘導される細胞自滅能の程度を示す結果）。
【0072】
［図８］非小細胞肺癌細胞株が移植されたマウスモデルにおいて本発明のＧＰ５抗体の抗癌活性を示す結果である（図８Ａ：腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）比較；図８Ｂ：腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ）比較）。
【0073】
【0074】
［発明を実施するための形態］
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0075】
〔実施例〕
＜実施例１＞Ｐ５の癌細胞殺傷能改良及びヒト化
本発明者らは、Ｐ５（Ｋｉｍ ＭＹ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ，２０１６，３０（３）：２１７－２４）に比べて癌細胞殺傷能の増加したヒト化抗体を開発するために次のような実験を行った。
＜実施例１＞Ｐ５の癌細胞殺傷能改良及びヒト化
本発明者らは、Ｐ５（Ｋｉｍ ＭＹ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ，２０１６，３０（３）：２１７－２４）に比べて癌細胞殺傷能の増加したヒト化抗体を開発するために次のような実験を行った。
【0076】
Ｐ５の改良のために、重鎖可変領域の４個のＦＲ（ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、ＨＦＲ４）と軽鎖可変領域の４個のＦＲ（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、ＬＦＲ４）に、次のような方式で突然変異を導入した：
１）具体的に、ＨＦＲ１はＩＧＨＶ７－４－１＊０３、ＨＦＲ２はＩＧＨＶ４－３０－４＊０６、ＨＦＲ３はＩＧＨＶ１－６９－２＊０１、ＨＦＲ４はＩＧＨＪ６＊０１の配列を利用し、アミノ酸の物理化学的性質の類似性又は非類似性を考慮して親抗体と異なるアミノ酸を置換した。このような方法で置換されたアミノ酸は、ＩＧＨＶ７－４－１＊０３ではＩ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ；ＩＧＨＶ４－３０－４＊０６ではＲ４０Ｈ、Ｈ４３Ｋ；ＩＧＨＶ１－６９－２＊０１ではＫ６６Ｒ、Ａ６７Ｖ、Ｆ６９Ｉ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ７９Ｙ、Ｑ８１Ｅ、Ｔ８３Ｒ、Ｓ８７Ｔ；及びＩＧＨＪ６＊０１ではＳ１０８Ｔであった。このように置換された重鎖可変領域をさらにＩＧＨＶ１－２＊０２を用いてアラインメントを行った後、最も性能に優れると予想される突然変異を選別した。
１）具体的に、ＨＦＲ１はＩＧＨＶ７－４－１＊０３、ＨＦＲ２はＩＧＨＶ４－３０－４＊０６、ＨＦＲ３はＩＧＨＶ１－６９－２＊０１、ＨＦＲ４はＩＧＨＪ６＊０１の配列を利用し、アミノ酸の物理化学的性質の類似性又は非類似性を考慮して親抗体と異なるアミノ酸を置換した。このような方法で置換されたアミノ酸は、ＩＧＨＶ７－４－１＊０３ではＩ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ；ＩＧＨＶ４－３０－４＊０６ではＲ４０Ｈ、Ｈ４３Ｋ；ＩＧＨＶ１－６９－２＊０１ではＫ６６Ｒ、Ａ６７Ｖ、Ｆ６９Ｉ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ７９Ｙ、Ｑ８１Ｅ、Ｔ８３Ｒ、Ｓ８７Ｔ；及びＩＧＨＪ６＊０１ではＳ１０８Ｔであった。このように置換された重鎖可変領域をさらにＩＧＨＶ１－２＊０２を用いてアラインメントを行った後、最も性能に優れると予想される突然変異を選別した。
【0077】
２）また、ＬＦＲ１はＩＧＫＶ２－１８＊０１、ＬＦＲ２はＩＧＫＶ２－１８＊０１、ＬＦＲ３はＩＧＫＶ２－２８＊０１、ＬＦＲ４はＩＧＫＪ２＊０１を用いてアミノ酸を次のように置換した：ＩＧＫＶ２－１８＊０１ではＡ８Ｐ、Ｖ１１Ｌ、Ｔ１４Ｎ、Ｓ１８Ｐ、Ｖ１９Ａ；ＩＧＫＶ２－１８＊０１ではＲ３９Ｋ；ＩＧＫＶ２－２８＊０１では存在しなく；ＩＧＫＪ２＊０１ではＬ１０６Ｉ。このように置換された軽鎖可変領域をさらにＩＧＫＶ２Ｄ－２９＊０２を用いてアラインメントを行った後、最も性能に優れると予想される突然変異を選別した。
【0078】
３）上記のような過程により選別された突然変異位置は、次の通りである：
１．重鎖可変領域：Ａ９Ｓ、Ｉ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ、Ｋ６６Ｒ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｑ８１Ｅ
２．軽鎖可変領域：Ｖ１１Ｌ、Ｆ３６Ｙ、Ｒ３９Ｋ
（抗体ドメインのアミノ酸残基番号は、当業界において通常用いられるカバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１では同一のＥＵ指数番号に従う。）によってナンバリングした。）
ヒト化重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）と結合し、ヒト化軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖定常領域（Ｃｋａｐｐａ）と結合して最終的にヒト化を完了した。
１．重鎖可変領域：Ａ９Ｓ、Ｉ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ、Ｋ６６Ｒ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｑ８１Ｅ
２．軽鎖可変領域：Ｖ１１Ｌ、Ｆ３６Ｙ、Ｒ３９Ｋ
（抗体ドメインのアミノ酸残基番号は、当業界において通常用いられるカバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１では同一のＥＵ指数番号に従う。）によってナンバリングした。）
ヒト化重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）と結合し、ヒト化軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖定常領域（Ｃｋａｐｐａ）と結合して最終的にヒト化を完了した。
【0079】
最終的にヒト化された抗体をＧＰ５と命名し、その塩基配列を表１に、置換された塩基配列に関する内容は図１に示した。
【0080】
【表1】
【0081】
Ｐ５及びＧＰ５重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
前記表で、太字はアミノ酸置換位置を表す（カバットナンバリングシステムに従うＡ９Ｓ、Ｉ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ、Ｋ６６Ｒ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｑ８１Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｆ３６Ｙ、Ｒ３９Ｋ）
＜実施例２＞ＧＰ５クローンの完全抗体転換及び発現／精製
実施例１で開発したＧＰ５可変領域のＤＮＡをｓｃＦｖ形態に合成し（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）、ＰＣＲ方法によって完全抗体（ｆｕｌｌ ＩｇＧ）に転換した。まず、ｓｃＦｖを含むｐＵＣベクター（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）から重鎖及び軽鎖の可変領域と定常領域の切片を、下記表２のＶＨ、ＣＨ及びＶＬ、ＣＫプライマー組合せを用いてＰＣＲで得た。得られた抗体の可変領域と定常領域を使用し、下記表２のＨＣ及びＬＣプライマー組合せを用いてＰＣＲを行ってＧＰ５の重鎖及び軽鎖を確保した。重鎖は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）酵素で処理し、同様に同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＣＭＶベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、米国）にライゲーションした。また、軽鎖は、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）酵素で処理し、同様に同一の制限酵素でｐＣＭＶベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドは、ＤＨ５α大腸菌コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）に熱衝撃を加えて形質転換し、コロニーを得た後、大量培養してプラスミドを得た。
前記表で、太字はアミノ酸置換位置を表す（カバットナンバリングシステムに従うＡ９Ｓ、Ｉ２０Ｖ、Ｔ２５Ｓ、Ｓ３０Ｔ、Ｋ６６Ｒ、Ｓ７５Ｔ、Ｎ７６Ｄ、Ｑ８１Ｅ、Ｖ１１Ｌ、Ｆ３６Ｙ、Ｒ３９Ｋ）
＜実施例２＞ＧＰ５クローンの完全抗体転換及び発現／精製
実施例１で開発したＧＰ５可変領域のＤＮＡをｓｃＦｖ形態に合成し（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）、ＰＣＲ方法によって完全抗体（ｆｕｌｌ ＩｇＧ）に転換した。まず、ｓｃＦｖを含むｐＵＣベクター（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）から重鎖及び軽鎖の可変領域と定常領域の切片を、下記表２のＶＨ、ＣＨ及びＶＬ、ＣＫプライマー組合せを用いてＰＣＲで得た。得られた抗体の可変領域と定常領域を使用し、下記表２のＨＣ及びＬＣプライマー組合せを用いてＰＣＲを行ってＧＰ５の重鎖及び軽鎖を確保した。重鎖は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）酵素で処理し、同様に同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＣＭＶベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、米国）にライゲーションした。また、軽鎖は、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）酵素で処理し、同様に同一の制限酵素でｐＣＭＶベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドは、ＤＨ５α大腸菌コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）に熱衝撃を加えて形質転換し、コロニーを得た後、大量培養してプラスミドを得た。
【0082】
【表2】
【0083】
ＧＰ５完全抗体クローニング時に用いられるプライマーリスト
完全抗体に転換させた重鎖と軽鎖のそれぞれのプラスミドを、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、フリースタイル２９３発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で３７℃の温度、８％ＣＯ２そして５５％湿度の条件で７日間培養した。発現した細胞培養液を４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過された上澄液は４℃でプロテインＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、中国）レジン１ｍｌに結合誘導した。結合したレジンは、１０ｃｖ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄後に、１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ ２．７）溶液を溶出した後、１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）で中和させた。ｐＨ ７．２～７．４のＰＢＳにバッファ交換（ｂｕｆｆｅｒ ｃｈａｎｇｅ）を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、精製された抗体の軽鎖及び重鎖のサイズ及び純度を確認し、その結果を図２Ａに示した。精製されたＧＰ５単クローン抗体は、軽鎖及び重鎖の理論的計算値と一致する分子量及び高い純度が確認できた。また、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）により、精製された抗体の均質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を確認した結果、９５％の均質性を示し、その結果を図２Ｂに示した。
完全抗体に転換させた重鎖と軽鎖のそれぞれのプラスミドを、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、フリースタイル２９３発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で３７℃の温度、８％ＣＯ２そして５５％湿度の条件で７日間培養した。発現した細胞培養液を４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過された上澄液は４℃でプロテインＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、中国）レジン１ｍｌに結合誘導した。結合したレジンは、１０ｃｖ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄後に、１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ ２．７）溶液を溶出した後、１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）で中和させた。ｐＨ ７．２～７．４のＰＢＳにバッファ交換（ｂｕｆｆｅｒ ｃｈａｎｇｅ）を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、精製された抗体の軽鎖及び重鎖のサイズ及び純度を確認し、その結果を図２Ａに示した。精製されたＧＰ５単クローン抗体は、軽鎖及び重鎖の理論的計算値と一致する分子量及び高い純度が確認できた。また、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）により、精製された抗体の均質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を確認した結果、９５％の均質性を示し、その結果を図２Ｂに示した。
【0084】
＜実施例３＞ＧＰ５単クローン抗体のべータ１インテグリン（ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に対する結合力分析
前記実施例２で製作したＧＰ５単クローン抗体のべータ１インテグリンに対する結合力を直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）で確認した。ＧＰ５単クローン抗体がヒト化抗体で、Ｐ５がマウス抗体であることから、直接の結合力比較のためにペロキシダーゼラベリングキットＮＨ２（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２）（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を用いて各抗体にＨＲＰを標識した。直接ＥＬＩＳＡは、５０μｌのＰＢＳに１μｇ／ｍｌで組換えヒトベータ１インテグリン（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）及び組換えマウスベータ１インテグリン（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、米国）を希釈して９６ウェル免疫プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に入れ、４℃で一晩保管して吸着させた。３％ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国）が含まれた緩衝溶液で３７℃で１時間反応させた後、逐次濃度（０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１００、３００、１０００ｎＭ）に希釈したそれぞれのＨＲＰが標識された抗体を、ウェル当たり５０μｌずつ処理した。抗原に抗体が結合し得るように３７℃で２時間反応させた後、０．５％ツイン２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を５０μｌずつ各ウェルに分注して３０分間発色させた。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。
前記実施例２で製作したＧＰ５単クローン抗体のべータ１インテグリンに対する結合力を直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）で確認した。ＧＰ５単クローン抗体がヒト化抗体で、Ｐ５がマウス抗体であることから、直接の結合力比較のためにペロキシダーゼラベリングキットＮＨ２（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２）（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を用いて各抗体にＨＲＰを標識した。直接ＥＬＩＳＡは、５０μｌのＰＢＳに１μｇ／ｍｌで組換えヒトベータ１インテグリン（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国）及び組換えマウスベータ１インテグリン（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、米国）を希釈して９６ウェル免疫プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に入れ、４℃で一晩保管して吸着させた。３％ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国）が含まれた緩衝溶液で３７℃で１時間反応させた後、逐次濃度（０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１００、３００、１０００ｎＭ）に希釈したそれぞれのＨＲＰが標識された抗体を、ウェル当たり５０μｌずつ処理した。抗原に抗体が結合し得るように３７℃で２時間反応させた後、０．５％ツイン２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を５０μｌずつ各ウェルに分注して３０分間発色させた。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。
【0085】
その結果、本発明によって開発されたＧＰ５単クローン抗体は、組換えヒトベータ１インテグリン及び組換えマウスベータ１インテグリンに対してＰ５と同等レベルの優れた結合力を示すことが確認できた（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【0086】
また、ＧＰ５単クローン抗体のべータ１インテグリンに対する特異性を確認するために、様々なインテグリンに対する結合力を直接ＥＬＩＳＡで確認した。５０μｌのＰＢＳに１μｇ／ｍｌで組換えヒトαＶβ１インテグリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、αＶβ３インテグリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、αＶβ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、αＶβ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、αＶβ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、α５β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）及びα２ｂβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）をそれぞれ希釈して９６ウェル免疫プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に入れ、４℃で一晩保管して吸着させた。３％ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、米国）が含まれた緩衝溶液で３７℃で１時間反応させた後、逐次濃度（０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１００、３００、１０００ｎＭ）に希釈したＧＰ５単クローン抗体を、ウェル当たり５０μｌずつ処理した。抗原に抗体が結合し得るように３７℃で２時間反応させ、０．５％ツイン２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、ＰＢＳで１：３０００の比率に希釈したＨＲＰが標識された抗ヒトＦｃ ＩｇＧをウェル当たり５０μｌずつ二次抗体で処理した。３７℃で１時間反応させた後、０．５％ツイン２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を５０μｌずつ各ウェルに分注し、３０分間発色させた。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図３Ｃに示した。
【0087】
その結果、本発明によって開発されたＧＰ５単クローン抗体は、インテグリンのα鎖とは関係なくβ鎖がベータ１であるインテグリンにのみ特異的に結合した（図３Ｃ）。
【0088】
以上のように、前記方法で改良したＧＰ５単クローン抗体は、通常の抗体ヒト化時に発生する結合力低下が見られず、べータ１インテグリンに対する特異性を示した。したがって、親抗体と同様に、非小細胞肺癌を含む様々な癌治療用抗体の性能が期待できる。
【0089】
＜実施例４＞非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株においてべータ１インテグリンの発現確認
本発明者らは、非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株においてべータ１インテグリンの発現を確認するために下記のように実験を行った。
本発明者らは、非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株においてべータ１インテグリンの発現を確認するために下記のように実験を行った。
【0090】
サンプル当たり５×１０５個の非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、１０μｇ／ｍｌ濃度のＧＰ５単クローン抗体が含有又は非含有されたＰＢＳで懸濁し、４℃で１時間培養した。培養液を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後に、ＰＢＳ２００μｌで洗浄し、３，０００ｒｐｍで５分間さらに遠心分離した。ＰＢＳを用いて１：２００の比率に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を細胞に処理し、遮光した状態で４℃で３０分間培養した。蛍光染色された細胞をＰＢＳで洗浄後にＰＢＳ５００μｌで懸濁し、ＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて分析し、その結果を図４に示した。
【0091】
ＦＡＣＳ評価の結果、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の細胞の表面にべータ１インテグリンが過発現していることが確認できた（図４）。
【0092】
＜実施例５＞ＧＰ５単クローン抗体の癌細胞株において細胞自滅死、細胞成長抑制能及び抗癌効果機序分析
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、べータ１インテグリンが発現している非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株において細胞自滅死を誘発できるかどうかを調べるために下記のように実験を行った。
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、べータ１インテグリンが発現している非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株において細胞自滅死を誘発できるかどうかを調べるために下記のように実験を行った。
【0093】
まず、実験前日に２４ウェルプレートに１０％ウシ血清（ＧＩＢＣＯ、米国）が含まれたＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６をウェル当たり５×１０４個ずつ１ｍｌとなるように分注し、３７℃、５％ＣＯ２条件で一晩培養した。
【0094】
翌日、培養液を取り除き、ＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）にＰ５及びＧＰ５単クローン抗体をそれぞれ１０又は２０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、４８時間３７℃、５％ＣＯ２条件で反応させた。陰性対照群には新鮮なＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）のみを満たした。反応が終わるとＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）で細胞をはがした後、ＥＰチューブに入れてＰＢＳでさらに洗浄した。その後、３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、集められた細胞ペレットを、７－ＡＡＤを用いるＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キット（ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ７－ＡＡＤ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）により、流細胞分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で流細胞分析を行い、その結果を図５に示した。
【0095】
その結果、本発明のＧＰ５単クローン抗体はＰ５に比べて優れた細胞自滅能があることが確認でき、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９では濃度依存的に細胞自滅能効果を示した（図５Ａ）。
【0096】
また、本発明者らは、本発明のＧＰ５単クローン抗体がべータ１インテグリンが発現している非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株において細胞成長を抑制できるかどうかを調べるために下記のように実験を行った。
【0097】
まず、実験前日に、１２ウェルプレートに、１０％ウシ血清（ＧＩＢＣＯ、米国）が含まれたＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）で非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６をウェル当たり１×１０５個ずつ１ｍｌとなるように分注し、３７℃、５％ＣＯ２条件で一晩培養した。
【0098】
翌日、培養液を取り除き、ＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）にＧＰ５単クローン抗体をそれぞれ１０、２０又は５０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で反応させた。陰性対照群には新鮮なＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）のみを満たした。反応が終わると培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後に、４％パラホルムアルデヒド（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、韓国）をウェル当たり２００μｌ処理し、４℃で１０分間反応して細胞を固定した。固定された細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、米国）をウェル当たり３００μｌ処理した後、オービタルシェーカーで３０分間反応した。その後、３次蒸留水を用いて洗浄液に紫色が出ない時まで洗浄した後、乾燥させた。乾燥したプレートに１％ドデシル硫酸ナトリウム（ａｍｒｅｓｃｏ、米国）をウェル当たり３００μｌ処理して細胞を溶かした。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図５Ｂに示した。
【0099】
その結果、本発明のＧＰ５単クローン抗体は、優れた細胞成長抑制能があることが確認でき、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６において濃度依存的に細胞成長抑制能効果を示した（図５Ｂ）。
【0100】
そして、本発明者らは、ＧＰ５単クローン抗体の抗癌機序を確認するために、下記のような実験を行った。
【0101】
べータ１インテグリンは、癌細胞の生存及び成長と関係するＡｋｔ経路及びＥＲＫ経路を活性化させると知られているので（Ｂｌａｎｄｉｎ ＡＦ，Ｒｅｎｎｅｒ Ｇ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．β１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｏ ｄｉｓｒｕｐｔ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５；６：２７９．）、べータ１インテグリンが誘導する信号経路に対するＧＰ５単クローン抗体の抑制能を免疫ブロット分析で確認した。まず、ＧＰ５単クローン抗体２０μｇ／ｍｌが４８時間処理された又は非処理されたＡ５４９細胞ペレットを確保した後、文献（Ｌｅｅ ＭＳ，Ｌｅｅ ＪＣ，Ｃｈｏｉ ＣＹ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ｂ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ）、２００８；２７（１）：１８－２４）に記載された過程によってウェスタンブロットを行った。このとき、一次抗体として、ＡＫＴ、ｐＡＫＴ、ＥＲＫ、ｐＥＲＫ（１：１０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）及びβ－アクチン（１：３０００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を使用し、二次抗体として、ＨＲＰが標識された抗ウサギＩｇＧ（１：５０００希釈；Ａｂｃａｍ、英国）又はＨＲＰが標識された抗マウスＩｇＧ（１：５０００希釈；Ａｂｃａｍ、英国）を使用した。前記ブロットを、増強した化学発光システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いてメーカーの指針に従って視角化し、その結果を図５Ｃに示した。図５Ｃに見られるように、ＧＰ５単クローン抗体で処理されたＡ５４９細胞においてｐＡＫＴ及びｐＥＲＫの発現が顕著に減少した。
【0102】
その結果、本発明のＧＰ５単クローン抗体は、べータ１インテグリンが活性化させる癌細胞の生存及び成長と関係するＡＫＴ経路及びＥＲＫ経路を抑制することによって細胞自滅能効果及び細胞成長抑制能効果を奏することができる。
【0103】
したがって、上記の結果から、本発明のＧＰ５単クローン抗体は、非小細胞肺癌を含む様々な癌に対して治療効果があることが分かった。ＧＰ５単クローン抗体の細胞自滅能効果がＰ５に比べて優れている結果は、効率的な改良がなされたことを意味する。
【0104】
＜実施例６＞ＧＰ５単クローン抗体の癌細胞におけるべータ１インテグリンの内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）分析
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株においてべータ１インテグリンの内在化を誘導する効果を確認するために、下記のような実験を行った。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を処理してＴ７５フラスコ（ＳＰＬ、韓国）からはがした非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を５×１０５個ずつＥＰチューブに入れて３５００ｒｐｍで５分間遠心分離後に、ＰＢＳで洗浄した。その後、ＰＢＳを用いてＰ５又はＧＰ５単クローン抗体を１０μｇ／ｍｌとなるように希釈した後、１００μｌを処理した。４℃で１時間反応させた後、３７℃で非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９は０、４０、６０、８０、９０、１２０及び１５０分ずつそれぞれ反応を持続し、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６は、１２０分間反応を持続した。反応が終わった後、ＰＢＳで洗浄し、Ｐ５が処理されたＥＰチューブには、ＦＩＴＣが標識され抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）を１：１００の比率にＰＢＳで希釈して１００μｌ処理し、ＧＰ５単クローン抗体が処理されたＥＰチューブには、ＦＩＴＣが標識された抗ヒト抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を１：２００の比率にＰＢＳで希釈して１００ｕｌを処理した。３０分間遮光して４℃で反応後に、ＰＢＳで洗浄し、流細胞分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で流細胞分析を行い、その結果を図６に示した。図６Ａは、３７℃で非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を１２０分反応させた結果であり、図６Ｂは、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９を３７℃で反応させた時間帯別結果をグラフで示したものである。その結果、Ｐ５が処理されたＡ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ１１６細胞に比べて、ＧＰ５単クローン抗体が処理されたＡ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ１１６細胞の表面においてべータ１インテグリンが大きく減少した（図６）。
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、非小細胞肺癌を含む様々な癌細胞株においてべータ１インテグリンの内在化を誘導する効果を確認するために、下記のような実験を行った。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を処理してＴ７５フラスコ（ＳＰＬ、韓国）からはがした非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を５×１０５個ずつＥＰチューブに入れて３５００ｒｐｍで５分間遠心分離後に、ＰＢＳで洗浄した。その後、ＰＢＳを用いてＰ５又はＧＰ５単クローン抗体を１０μｇ／ｍｌとなるように希釈した後、１００μｌを処理した。４℃で１時間反応させた後、３７℃で非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９は０、４０、６０、８０、９０、１２０及び１５０分ずつそれぞれ反応を持続し、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６は、１２０分間反応を持続した。反応が終わった後、ＰＢＳで洗浄し、Ｐ５が処理されたＥＰチューブには、ＦＩＴＣが標識され抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）を１：１００の比率にＰＢＳで希釈して１００μｌ処理し、ＧＰ５単クローン抗体が処理されたＥＰチューブには、ＦＩＴＣが標識された抗ヒト抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を１：２００の比率にＰＢＳで希釈して１００ｕｌを処理した。３０分間遮光して４℃で反応後に、ＰＢＳで洗浄し、流細胞分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で流細胞分析を行い、その結果を図６に示した。図６Ａは、３７℃で非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を１２０分反応させた結果であり、図６Ｂは、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９を３７℃で反応させた時間帯別結果をグラフで示したものである。その結果、Ｐ５が処理されたＡ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ１１６細胞に比べて、ＧＰ５単クローン抗体が処理されたＡ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＴ１１６細胞の表面においてべータ１インテグリンが大きく減少した（図６）。
【0105】
これは、べータ１インテグリンに対するＧＰ５単クローン抗体の結合が細胞膜のべータ１インテグリン内在化を誘導することを意味する。また、このような結果は、ＧＰ５単クローン抗体が、非小細胞肺癌細胞の他にべータ１インテグリンが過発現した細胞にも結合して内在化できることを提示する。Ｐ５と比較してＧＰ５単クローン抗体が示す優れた抗癌活性は、このような内在化効果によるものと説明でき、これは本発明による改良の効果である。
【0106】
＜実施例７＞ＧＰ５単クローン抗体のゲフィチニブ耐性細胞株において細胞自滅死分析
べータ１インテグリンが様々な癌において細胞毒性化学療法（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｔｈｅｒａｐｙ）に対する耐性の原因になると知られているので（Ｐａｒｋ ＣＣ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，６６（３）：１５２６－３５）、本発明者らは、細胞毒性化学療法に使用されるゲフィチニブに対する耐性が現れた非小細胞肺癌細胞株においてＧＰ５単クローン抗体の単独又はゲフィチニブとの併用使用時に細胞自滅死誘導の程度を確認するために下記のように実験を行った。
べータ１インテグリンが様々な癌において細胞毒性化学療法（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｔｈｅｒａｐｙ）に対する耐性の原因になると知られているので（Ｐａｒｋ ＣＣ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，６６（３）：１５２６－３５）、本発明者らは、細胞毒性化学療法に使用されるゲフィチニブに対する耐性が現れた非小細胞肺癌細胞株においてＧＰ５単クローン抗体の単独又はゲフィチニブとの併用使用時に細胞自滅死誘導の程度を確認するために下記のように実験を行った。
【0107】
まず、ゲフィチニブ耐性非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９ＧＲと親細胞である非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９のべータ１インテグリンの発現を確認するために、実施例４のような方法で実験を行った。
【0108】
ＦＡＣＳ評価の結果、親細胞である非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９に比べて、ゲフィチニブ耐性非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９ＧＲにおいて、ＧＰ５単クローン抗体がべータ１インテグリンに結合して現れるピークが右にさらに移動した。このことから、親細胞であるＰＣ９に比べてＰＣ９ＧＲにおいてべータ１インテグリンがより多く発現することが確認できた（図７Ａ）。
【0109】
ＰＣ９細胞株とＰＣ９ＧＲ細胞株においてＧＰ５単クローン抗体単独又はゲフィチニブとの併用使用時に細胞自滅死誘導能を確認するために、実験前日に、１２ウェルプレートに１０％ウシ血清（ＧＩＢＣＯ、米国）が含まれたＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）にＰＣ９細胞株及びＰＣ９ＧＲ細胞株をそれぞれウェル当たり１×１０５個ずつ１ｍｌとなるように分注し、３７℃５％ＣＯ２条件で一晩培養した。
【0110】
翌日、培養液を取り除き、ＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）にゲフィチニブ（Ｓｉｇｍａ、米国）及びＧＰ５単クローン抗体をそれぞれ２又は１０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で反応させた。陰性対照群には新鮮なＲＰＭＩ培地（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）のみを満たした。反応が終わるとＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）で細胞をはがした後、ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳでさらに洗浄した。その後、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、集められた細胞ペレットを、７－ＡＡＤを用いるＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）を用いて、流細胞分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で流細胞分析を行い、その結果を図７Ｂに示した。図７Ｂに見られるように、親細胞であるＰＣ９においてゲフィチニブによる細胞自滅死が５０％以上現れたが、ＰＣ９ＧＲでは３０％程度と示された。また、ＰＣ９ＧＲでＧＰ５単クローン抗体がゲフィチニブと併用される時、細胞自滅死が５０％程度と示された。
【0111】
その結果、親細胞であるＰＣ９に比べて、ゲフィチニブ耐性細胞株であるＰＣ９ＧＲにおいてゲフィチニブの反応性が低くなっていることが確認でき、ゲフィチニブとＧＰ５単クローン抗体の併用時に、ＰＣ９ＧＲで低くなったゲフィチニブに対する反応性が、ＰＣ９細胞株レベルへと回復することが確認できた（図７Ｂ）。
【0112】
このような結果は、本発明のＧＰ５単クローン抗体が、抗癌剤耐性の原因となるべータ１インテグリンの遮断によって抗癌剤に対する耐性を抑制できることを意味する。
【0113】
＜実施例８＞非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９異種移植モデル（ｈｕｍａｎ Ａ５４９ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）におけるＧＰ５単クローン抗体抗癌活性分析
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、非小細胞肺癌細胞株の移植されたヌードマウスにおいて抗癌活性を示すか否かを調べるために下記のように実験を行った。
本発明者らは、Ｐ５と本発明のＧＰ５単クローン抗体が、非小細胞肺癌細胞株の移植されたヌードマウスにおいて抗癌活性を示すか否かを調べるために下記のように実験を行った。
【0114】
非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９を１匹当たりに５×１０６個ずつ雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ＳＬＣ、日本）の横腹皮下に接種した。１週当たりに２回ずつマウスの重さを測定し、‘幅×幅×長さ／２’の式を用いて腫瘍体積を計算した。癌細胞接種７日後に腫瘍体積が約８０ｍｍ３に達したとき、マウスを群当たりに６匹ずつ無作為抽出した。群当たりＰＢＳ（陰性対照群）、Ｐ５又はＧＰ５単クローン抗体１ｍｇ／ｋｇ、シスプラチン（Ｓｉｇｍａ、米国）２．５ｍｇ／ｋｇの容量でマウスの腹腔に週２回、５週間投与した。併用処理群は、Ｐ５又はＧＰ５単クローン抗体１ｍｇ／ｋｇとシスプラチン（Ｓｉｇｍａ、米国）２．５ｍｇ／ｋｇをマウスの腹腔に週に２回、５週間投与した。その後、３週間は抗体及びシスプラチン投与無しで週に２回ずつ腫瘍のサイズ及び体重を測定した。各薬物投与による腫瘍体積を算出し、その結果を図８Ａに示した（矢印（↓）：投与時点、＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）による比較の結果、Ｐ＜０．０５、＊＊＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．００１）。また、実施例９のためにマウスを犠牲死させて摘出した癌組織写真を、図８Ｂに示した。
【0115】
図８Ａ及び図８Ｂに示すように、本発明のＧＰ５単クローン抗体は、単独投与時にＰ５に比べて優れた抗癌活性があることが確認でき、既存の非小細胞肺癌の治療剤として知られているシスプラチンに比べても優れた抗癌活性を示した。また、ＧＰ５単クローン抗体とシスプラチンを併用投与したとき、単独投与したときに比べて抗癌活性に優れることが確認でき、薬物投与が中断された後にも腫瘍の体積が増加しなかった。したがって、ＧＰ５単クローン抗体は、単独投与又は併用投与のいずれにおいても、Ｐ５及びシスプラチン単独投与に比べて抗癌効能が増加することを確認した。
【0116】
＜実施例９＞免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）による組織病理学的研究（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ）
免疫組織化学染色はロクウォンバイオ融合研究財団で行い、組織病理学的分析はエスジーメディカル（株）で行った。実験終了時点（Ｄａｙ ６０）に全てのマウスは組織処理及び免疫組織化学染色、組織学的分析のために犧牲死させた。実験動物を深く麻酔させた状態で改服して心臓から採血した後、組織を摘出し、摘出した組織は４％ホルムアルデヒド溶液に固定した後、パラフィンで包埋した。組織切片は、腫瘍の最も大きい部分で４μｍ厚に薄切りし、パラフィンを除去した後、再水和した。免疫ペロキシダーゼ標識のために細胞内のペロキシダーゼを０．３％ Ｈ２Ｏ２に１５分間露出して抑制した。その後、抗原復旧のために抗原復旧液（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＴＥ ｐＨ ９．０）（Ｓｉｇｍａ、米国）に入れ、圧力クッカー（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｏｋｅｒ）（Ｂｉｏ ＳＢ、米国）で３０分間加熱した。非特異性免疫反応排除のためにブロッキング溶液に２０分間露出させた。
免疫組織化学染色はロクウォンバイオ融合研究財団で行い、組織病理学的分析はエスジーメディカル（株）で行った。実験終了時点（Ｄａｙ ６０）に全てのマウスは組織処理及び免疫組織化学染色、組織学的分析のために犧牲死させた。実験動物を深く麻酔させた状態で改服して心臓から採血した後、組織を摘出し、摘出した組織は４％ホルムアルデヒド溶液に固定した後、パラフィンで包埋した。組織切片は、腫瘍の最も大きい部分で４μｍ厚に薄切りし、パラフィンを除去した後、再水和した。免疫ペロキシダーゼ標識のために細胞内のペロキシダーゼを０．３％ Ｈ２Ｏ２に１５分間露出して抑制した。その後、抗原復旧のために抗原復旧液（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＴＥ ｐＨ ９．０）（Ｓｉｇｍａ、米国）に入れ、圧力クッカー（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｏｋｅｒ）（Ｂｉｏ ＳＢ、米国）で３０分間加熱した。非特異性免疫反応排除のためにブロッキング溶液に２０分間露出させた。
【0117】
腫瘍の細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）程度を評価するために、ヒトＫｉ６７に対する一次ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、英国）を使用してＫｉ６７の免疫組織化学染色を行った。ブロッキング溶液を処理した組織切片上に希釈した一次抗体を１時間常温で反応させて抗原－抗体反応複合体を形成した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ標識ポリマー抗ウサギ（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ）（Ｄａｋｏ、米国）を用いて抗原－抗体反応複合体にＨＲＰ標識された２次抗体を結合させた後、液体ＤＡＢ＋基質発色システム（Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｄａｋｏ、米国）を用いて３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として発色した。ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ、米国）染色は、ＤＡＢ染色の対照染色として行った。イメージは、ｉｘ７１光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）を用いて観察した。Ｋｉ６７染色部位の比率は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて計算し、その結果を図９Ａに示した（＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．０５、＊＊＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．００１）。
【0118】
腫瘍血管の変化を評価するために、マウスＣＤ３１に対する一次ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、英国）を用いてＣＤ３１の免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色は、上のＫｉ６７染色と同じ過程で行った。イメージは、ｉｘ７１光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）を用いて観察した。ＣＤ３１染色部位の比率は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて計算し、その結果を図９Ｂに示した（＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．０５、＊＊＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．００１）。
【0119】
腫瘍の細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）程度を評価するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ｄＵＴＰニック末端ラベリング（ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ）染色をＡｐｏｐＴａｇペルオキシダーゼインサイチュ・アポトーシス検出キット（ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）を用いて行った。発色は、液体ＤＡＢ＋基質発色システム（Ｄａｋｏ、米国）を用いて行った。ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）染色は、ＤＡＢ染色の対照染色として行った。イメージは、ｉｘ７１光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）を用いて観察した。細胞自滅死部位の比率は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて計算し、その結果を図９Ｃに示した（＊：陰性対照群とのスチューデントのｔ検定による比較の結果、Ｐ＜０．０５）。
【0120】
免疫化学組織染色の結果、陰性対照群においてＫｉ６７及びＣＤ３１発現が最も高く（図９Ａ及び図９Ｂ）、ＴＵＮＥＬ染色された細胞はほとんど観察されなかった（図９Ｃ）。これは、陰性対照群において癌細胞増殖及び新生血管増殖が活発になされていることを意味する。ＧＰ５単クローン抗体単独投与群において、Ｐ５単クローン抗体単独投与群に比べてＫｉ６７及びＣＤ３１の発現は低く（図９Ａ及び図９Ｂ）、ＴＵＮＥＬ染色されたた細胞はより多く観察された（図９Ｃ）。これは、ＧＰ５単クローン抗体はＰ５に比べて癌細胞増殖及び血管新生を抑制し、細胞自滅死を誘導する効果がより大きいということを意味する。また、このような効果は、ＧＰ５単クローン抗体とシスプラチンの単独投与時に比べて併用投与時に一層大きくなることが確認できた（図９Ａ、図９Ｂ及び図９Ｃ）。これは、ＧＰ５単クローン抗体は癌細胞増殖を抑制し、血管新生を抑制し、細胞自滅死を誘導して抗癌効果を示すことを意味する。また、シスプラチンとの併用によって増加した抗癌活性は、このような効果が極大化しながら現れることを意味する。
【0121】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、それに本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるといえよう。
【図面の簡単な説明】
【0122】
【図1】本発明のＧＰ５単クローン抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図3A】本発明のＧＰ５単クローン抗体の組換えヒトベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ａ）、組換えマウスベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ｂ）及びベータ１インテグリンに対する特異度（図３Ｃ）を示す結果である。
【図3B】本発明のＧＰ５単クローン抗体の組換えヒトベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ａ）、組換えマウスベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ｂ）及びベータ１インテグリンに対する特異度（図３Ｃ）を示す結果である。
【図3C】本発明のＧＰ５単クローン抗体の組換えヒトベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ａ）、組換えマウスベータ１インテグリンに対する結合力（図３Ｂ）及びベータ１インテグリンに対する特異度（図３Ｃ）を示す結果である。
【図4】非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の表面からベータ１インテグリンの発現を確認した結果である。
【図7A】ゲフィチニブ耐性非小細胞肺癌細胞株であるＰＣ９ＧＲにおいて本発明のＧＰ５単クローン抗体がゲフィチニブと併用されたとき、ゲフィチニブの反応性を、親細胞であるＰＣ９に現れるレベルに向上させる結果である（図７Ａ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲの表面からベータ１インテグリンの発現を確認した結果；図７Ｂ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲにおいてゲフィチニブとＧＰ５単クローン抗体が併用された時に誘導される細胞自滅能の程度を示す結果）。
【図7B】ゲフィチニブ耐性非小細胞肺癌細胞株であるＰＣ９ＧＲにおいて本発明のＧＰ５単クローン抗体がゲフィチニブと併用されたとき、ゲフィチニブの反応性を、親細胞であるＰＣ９に現れるレベルに向上させる結果である（図７Ａ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲの表面からベータ１インテグリンの発現を確認した結果；図７Ｂ：ＰＣ９とＰＣ９ＧＲにおいてゲフィチニブとＧＰ５単クローン抗体が併用された時に誘導される細胞自滅能の程度を示す結果）。
【図8A】非小細胞肺癌細胞株が移植されたマウスモデルにおいて本発明のＧＰ５抗体の抗癌活性を示す結果である（図８Ａ：腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）比較；図８Ｂ：腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ）比較）。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【配列表】
【国際調査報告】