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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-24
(54)【発明の名称】ＣＬＮ３ポリヌクレオチドのアデノ随伴ウイルス送達
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20220316BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220316BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220316BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220316BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220316BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220316BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220316BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220316BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220316BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220316BHJP
A61K 49/04 20060101ALI20220316BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N7/01 ZNA
C12N15/12
A61K35/76
A61P25/00
A61K38/17
A61K48/00
A61K47/10
A61K47/18
A61K47/02
A61K49/04 210
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021545401
(86)(22)【出願日】2020-02-04
(85)【翻訳文提出日】2021-09-27
(86)【国際出願番号】 US2020016542
(87)【国際公開番号】W WO2020163300
(87)【国際公開日】2020-08-13
(31)【優先権主張番号】62/800,911
(32)【優先日】2019-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】520146112
【氏名又は名称】リサーチ・インスティチュート・アット・ネーションワイド・チルドレンズ・ホスピタル
(71)【出願人】
【識別番号】516046846
【氏名又は名称】オハイオ ステート イノベーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー， キャスリン
(72)【発明者】
【氏名】カスパー， ブライアン ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ファウスト， ケビン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C076BB21
4C076CC01
4C076DD07
4C076DD23Z
4C076DD50Z
4C076EE23
4C076FF68
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC50
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZA011
4C085HH05
4C085KB39
4C085LL13
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA01
(57)【要約】
本開示は、セロイドリポフスチン症ニューロン３（ＣＬＮ３）ポリヌクレオチドの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。本開示は、ニューロンセロイドリポフスチン症またはＣＬＮ３－バッテン病のＣＬＮ３遺伝子治療のためのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶの使用方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）であって、５’から３’の順序で、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーター、および配列番号１の前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｓｃＡＡＶ９ゲノムを含む、自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）。
【請求項2】
前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、配列番号３の前記ヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーター、ＳＶ４０イントロン、および配列番号１の前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項3】
前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、配列番号３の前記配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１の前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列を含む、請求項１に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項4】
２つのＡＡＶ逆方向末端反復をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項5】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項6】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項7】
前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項8】
前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項9】
前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項10】
前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項１～９のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項11】
ｒＡＡＶ９ゲノムが、一本鎖ゲノムを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項12】
第１のＡＡＶ逆方向末端反復配列、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２の逆方向末端反復配列を含む、核酸分子。
【請求項13】
第１のＡＡＶ逆方向末端反復配列、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１の前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項14】
第１のＡＡＶ逆方向末端反復配列、配列番号３の前記ヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１の前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項15】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項16】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項17】
配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項18】
配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項19】
配列番号４の核酸配列を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項20】
前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項21】
請求項１２～２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）。
【請求項22】
前記ｓｃＡＡＶ９が、一本鎖ゲノムを含む、請求項２１に記載のｓｃＡＡＶ９。
【請求項23】
請求項１２～２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ｒＡＡＶ粒子。
【請求項24】
前記ｒＡＡＶ粒子が、一本鎖ゲノムを含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項25】
ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）ウイルス粒子であって、５’から３’の順序で、Ｐ５４６プロモーター、および前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）ウイルス粒子。
【請求項26】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、自己相補的ゲノムを含む、請求項２５に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項27】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、一本鎖ゲノムを含む、請求項２５に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項28】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、前記Ｐ５４６プロモーター、前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項29】
前記Ｐ５４６プロモーターが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項30】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドが、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項31】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項32】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項33】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項34】
前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項35】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＳＶ４０イントロンをさらに含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項36】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＢＧＨポリＡ配列をさらに含む、請求項２５～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
【請求項37】
５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、Ｐ５４６プロモーター、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む核酸分子。
【請求項38】
前記ｒＡＡＶ９が、自己相補的ゲノムを含む、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項39】
前記ｒＡＡＶ９が、一本鎖ゲノムを含む、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項40】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、前記Ｐ５４６プロモーター、前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項41】
前記Ｐ５４６プロモーターが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項42】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドが、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３７または４１に記載の核酸分子。
【請求項43】
前記ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項44】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項45】
前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項46】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３７～４５３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項47】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＳＶ４０イントロンをさらに含む、請求項３７７～４６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項48】
前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列をさらに含む、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項49】
請求項１～１２、２１または２２のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項１２～２０または３７～４８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３～３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、組成物。
【請求項50】
前記賦形剤が、非イオン性低浸透圧性化合物、緩衝剤、ポリマー、塩、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項51】
対象におけるＣＬＮ３－バッテン病を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２、２１もしくは２２のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項１２～２０もしくは３７～４８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３～３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項３７～４８のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４９もしくは請求項５０に記載の組成物、を含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項52】
前記組成物が、髄腔内、脳室内、脳実質内、静脈内、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路を介して投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記組成物が、髄腔内投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項54】
前記組成物が、脳室内投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項55】
前記組成物が、静脈内投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項56】
約１×１０１２～約１×１０１５ｖｇの前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子が投与される、請求項５１または５５に記載の方法。
【請求項57】
約６×１０１３～約１．２×１０１４の前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子が投与される、請求項５１または５６に記載の方法。
【請求項58】
治療が、（ａ）自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、
（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、
（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、
（ｄ）星状細胞増加症の減少または遅延、
（ｅ）ＭＲＩによって測定された脳容積損失の減少または遅延、
（ｆ）発作の発症の減少または遅延、
（ｇ）ＵＢＤＲＳ評価尺度のうちの１つ以上における安定化、進行の減少もしくは遅延、または改善、から選択されるＣＬＮ３－バッテン病の１つ以上の症状を減少させ、前記減少、安定化、または改善が、前記組成物を投与する前の前記対象または未処置のＣＬＮ３－バッテン病患者と比較してである、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子を投与した後、前記対象をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含む、請求項５１～５８に記載の方法。
【請求項60】
ＣＬＮ３疾患の治療を必要とする対象におけるＣＬＮ３疾患を治療する方法であって、請求項１～１２、２１または２２のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項１２～２０または３７～４８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３～３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子を含む組成物を、それを必要とする対象の脳または脊髄に送達することを含む、方法。
【請求項61】
前記組成物が、髄腔内注射、脳室内注射、脳実質内注射、静脈内注射、またはこれらの組み合わせによって送達される、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記組成物の髄腔内注射後に、前記対象をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記組成物が、非イオン性低浸透圧性造影剤を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記非イオン性低浸透圧性造影剤が、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３６３に記載の方法。
【請求項65】
前記脳または脊髄に送達することが、脳幹への送達を含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記脳または脊髄に送達することが、小脳への送達を含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記脳または脊髄に送達することが、視覚皮質への送達を含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記脳または脊髄に送達することが、運動皮質への送達を含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記脳または脊髄に送達することが、神経細胞、グリア細胞、または両方への送達を含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記脳または脊髄に送達することが、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせへの送達を含む、請求項６０～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
治療が、（ａ）自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少、
（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少、
（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少、
（ｄ）星状細胞増加症の減少、
（ｅ）ＭＲＩによって測定された脳容積損失の減少、
（ｆ）発作の発症の減少、および
（ｇ）ＵＢＤＲＳ評価尺度のうちの１つ以上における安定化、進行の減少、または改善のうちの１つ以上をもたらし、前記減少、安定化、または改善が、前記組成物を送達する前の前記対象または未処置のＣＬＮ３－バッテン病患者と比較してである、請求項６０～７０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８００，９１１号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２０年１月３１日に作成された５３５７６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２６，７０５バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２０年１月３１日に作成された５３５７６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２６，７０５バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、セロイドリポフスチン症ニューロン３（ＣＬＮ３）ポリヌクレオチドの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。本開示は、ニューロンセロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）またはＣＬＮ３－バッテン病のＣＬＮ３遺伝子治療のためのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶの使用方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
ニューロンセロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、一群の重度の神経変性障害である。
【0005】
ＣＬＮ３遺伝子における変異は、若年型ＮＣＬまたはＣＬＮ３－バッテン病を引き起こし（Ｋｉｔｚｍｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００８；１７（２）：３０３－３１２、Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９７；６１：３１０－３１６）、これはまたシュピールマイアー－シェーグレン－フォークト病とも呼ばれている。変異はリソソーム貯蔵クリアランスプロセスを妨害する。現時点で、６７の疾患を引き起こす変異が報告されている。しかしながら、患者の８５％が１．０２ｋｂの欠失についてホモ接合性であり、これはエクソン７およびエクソン８の喪失をもたらす。患者に見られるＣＬＮ３変異は、主にタンパク質（バテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ））の量または機能性の減少を引き起こす。
【0006】
ＣＬＮ３－バッテン病の典型的な発症年齢は４～７歳で、潜伏性であるが急速に進行性の視力喪失を伴う。若年型ＮＣＬを有する子供は、数ヶ月間で通常の視力から失明へと移行するが、その後数年間明暗の認識を維持することができる。認知力および運動機能の低下は通常、攻撃性（８～１０歳）などの行動上の問題、およびその後の発作（１０～１２歳）と共に、次の（７～１０歳）の後に起こる。パーキンソン病の特徴は１１～１３歳の間に発症する。心臓伝導異常は、疾患の後期にある個体において報告されている。ＣＬＮ３－バッテン病に罹患している個体には表現型の多様性が高いが、全員が低視力または進行性失明を共通して有する。さらに、８２人の患者で検証されている統一バッテン病評価尺度（ＵＢＤＲＳ）の物理的なサブスケールは、年間２．８６ポイント（２．２７～３．４５、ｐ＜０．０００１）の着実かつ測定可能な減少を示している。平均生存期間は通常、症状の発症から終末までの１５年間である。
【0007】
ＣＬＮ３－バッテン病に対する治療方針は、疾患を改善するための努力において広範囲にわたっている。これらには、ＡＭＰＡ受容体を標的とするＥＧＩＳ－８３３２およびタラムパネルなどの薬物療法、早期終止変異のリードスルーを可能にする薬物、蓄積された貯蔵物質の破壊を補助する薬物（シスタゴン／システアミン）、さらには免疫抑制療法（ミコフェノール酸、プレドニゾロン）が挙げられる。酵素補充療法および幹細胞療法もまた評価されている。多くの治療手段が研究されてきたが、臨床現場で評価されたものはほとんどない。進行を遅延させるか、または疾患を治癒するのに利用可能なものはない。患者および家族は、症状および緩和ケアを改善するための治療に頼っている。
【0008】
Ｃｌｎ３Δｅｘ７／８マウスモデルは、ＣＬＮ３－バッテン病患者において最も一般的な疾患を引き起こす変異：ＣＬＮ３遺伝子からエクソン７および８を排除する約１ｋｂの変異、を模倣するために２０００年代初頭に作成された（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．２００１；５：７－１０）。この変異は、患者の８５％においてホモ接合型で、さらに患者の１５％において他の対立遺伝子の点変異と組み合わせたヘテロ接合型変異として見られる。エクソンの喪失はフレームシフト変異を生じさせることが予測され、それにより喪失または減少した活性を有する、短い不完全な（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質産物がもたらされる（Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９５ Ｓｅｐ ２２；８２（６）：９４９－５７、Ｋｉｔｚｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００８ Ｊａｎ １５；１７（２）：３０３－１２）。彼らの最初の研究において、Ｃｏｔｍａｎらは、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルがＣＬＮ３疾患のいくつかの側面を首尾よく再現したことを実証した。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８動物は、種々の時点で神経系に自己蛍光貯蔵物質およびＡＴＰシンターゼサブユニットＣを蓄積し、そして１０ヶ月齢から脳内で星状細胞反応性を示した。その後の研究は、小脳におけるグルタミン酸受容体機能の変化を詳述しており、これは加速ロータロッドアッセイにおける運動障害に対応していた（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１）。行動的には、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスは、若年および成熟の両方の時点で特徴付けられており、新生児および若年成体マウスでは神経発達運動遅延が見られ、１０～１２ヶ月齢で歩行および後肢握りの障害が見られた（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｏｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．２００９ Ａｐｒ；８（３）：３３７－３４５）。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスは、機能的視覚障害を有するようには見えないが、１２ヶ月齢の対照と比較した場合、わずかな生存障害を示している（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｓｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２ Ａｐｒ；１９（４）：５１５－２７）。まとめると、最も頻繁なヒト変異を保有するＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルは、ＣＬＮ３－バッテン病と一致する多数の細胞的および行動的変化を示し、それを療法を試験するための適切なモデルにしている。
【0009】
したがって、ＣＬＮ３－バッテン病の治療に対する当該技術分野における必要性が残っている。
【発明の概要】
【0010】
本明細書に提供されるのは、組換えＡＡＶを使用するＣＬＮ３遺伝子治療のための方法および製品である。
【0011】
本明細書に提供されるのは、５’から３’の順序で、Ｐ５４６プロモーター、およびＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶ９ゲノムを含む、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ９ゲノムは、自己相補的ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ９ゲノムは、一本鎖ゲノムを含む。
【0012】
配列番号１に記載のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）が提供され、この中で、ｓｃＡＡＶ９のゲノムは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１に記載のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９０％同一であり得る。
【0013】
また提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｃＡＡＶ９；５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｃＡＡＶ９である。例示的な実施形態では、ｓｃＡＡＶ９は、配列番号４に記載の遺伝子カセットを含むゲノムを有する。
【0014】
配列番号１に記載のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする一本鎖組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｓＡＡＶ９）が提供され、この中で、ｓｓＡＡＶ９のゲノムは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１に記載のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９０％同一であり得る。また提供されるものは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｓＡＡＶ９；５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｓＡＡＶ９である。
【0015】
配列番号４に記載の核酸配列は、図１Ａに提供される遺伝子カセットである。提供されるのは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むｓｃＡＡＶ９ゲノムまたはｓｓＡＡＶ９ゲノムを有するｒＡＡＶ９である。
【0016】
第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子もまた提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９０％同一であり得る。
【0017】
また提供されるのは、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＰ５４６プロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子である。さらに提供されるのは、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１のＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むポリヌクレオチドである。提供されるポリヌクレオチドのいずれにおいても、ＣＬＮ３ポリペプチドは、配列番号２に記載の核酸配列、または配列番号２と少なくとも９０％同一の配列によってコードされ得る。
【0018】
これらのポリヌクレオチドのいずれかを含むｒＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ９、またはｓｓＡＡＶ９が提供される。一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶもまた提供される。
【0019】
さらに提供されるのは、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ９ウイルス粒子であり、ここでｒＡＡＶ９ゲノムは５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。提供されるｒＡＡＶ９粒子は、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。加えて、ｒＡＡＶ９ウイルス粒子は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むＡＡＶ９ゲノムを含み得る。ｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれも、ＳＶ４０イントロン、および／またはＢＧＨポリＡ配列をさらに含み得る。
【0020】
提供されるｒＡＡＶ、ｓｓＡＡＶ、およびｓｃＡＡＶのいずれにおいても、ＡＡＶ逆方向末端反復は、ＡＡＶ２逆方向末端反復であり得る。
【0021】
また提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＰ５４６プロモーター、および配列番号１と少なくとも９０％同一のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む核酸分子である。提供される核酸分子は、自己相補的ゲノムまたは一本鎖ゲノムを含み得る。
【0022】
さらに提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＰ５４６プロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一のＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、ｒＡＡＶ９ゲノムを含む核酸分子である。提供される核酸分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。加えて、核酸分子は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むＡＡＶ９ゲノムを含み得る。提供される核酸分子のいずれも、ＳＶ４０イントロン、および／またはＢＧＨポリＡ配列をさらに含み得る。
【0023】
さらに提供されるのは、本明細書に記載のｓｃＡＡＶ９、本明細書に記載のｓｓＡＡＶ９、本明細書に記載の核酸分子、または本明細書に記載のｒＡＡＶウイルス粒子、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む組成物である。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、非イオン性低浸透圧性化合物、緩衝剤、ポリマー、塩、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはコポリマーである。いくつかの実施形態では、コポリマーはポロキサマーである。例えば、組成物は、非イオン性低浸透圧性化合物を含む薬学的に許容される賦形剤を少なくとも含み得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
【0024】
またさらに提供されるのは、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれか、を含む組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ３－バッテン病の治療方法である。
【0025】
提供される方法のいずれにおいても、組成物、ｒＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ９および／または核酸分子は、髄腔内、脳室内、脳実質内、静脈内、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路を介して投与される。
【0026】
治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかの、ＣＬＮ３－バッテン病の治療を必要とする対象におけるＣＬＮ３－バッテン病の治療用の薬剤の調製のための使用である。
【0027】
またさらに提供されるのは、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む組成物、またはＣＬＮ３－バッテン病の治療を必要とする対象におけるＣＬＮ３－バッテン病を治療するための記載された組成物のいずれかである。
【0028】
髄腔内経路によって投与されるｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９の例示的な用量は、対象あたり約１×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から対象あたり約２×１０１５ｖｇまでであるか、または対象あたり約１×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から対象あたり約１×１０１５ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子までであるか、または対象あたり約１×１０１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から対象あたり約１×１０１４ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子までであるか、または対象あたり約１×１０１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から対象あたり約１×１０１５ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子までである。例えば、約１×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与するか、または約１．５×１０１３のｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与するか、または約３．４×１０１３のｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与するか、または約６×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与するか、または約１．２×１０１４のｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与するか、または約２×１０１４のｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ９ウイルス粒子を対象に投与する。
【0029】
処置のための方法、薬剤または組成物は、処置前の対象または未処置のＣＬＮ３－バッテン病患者と比較して、（ａ）自己蛍光性貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、（ｄ）星状細胞増加症の減少または遅延、（ｅ）ＭＲＩにより測定した脳容積損失の減少または遅延、（ｆ）発作の発症の減少または遅延、ならびに（ｇ）ＣＬＮ３バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）評価尺度またはハンブルク運動および言語尺度のうちの１つ以上の安定化、進行の減少もしくは遅延、または改善のうちの１つ以上を対象にもたらす。対象は、本明細書に開示されるｒＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９、またはｓｃＡＡＶもしくは核酸分子を投与した後に、トレンデレンベルク体位に保持され得る。
【0030】
またさらに提供されるのは、本明細書に開示されるｒＡＡＶウイルスのいずれか１つ、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む組成物、または本明細書に記載の組成物のいずれかもしくは本明細書に記載の薬剤のいずれかを、治療を必要とする患者の脳または脊髄に送達することを含む、治療を必要とする対象におけるＣＬＮ３疾患を治療する方法である。
【0031】
提供される方法または使用のいずれにおいても、組成物または薬剤は、髄腔内、脳室内、脳実質内、または静脈内注射、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。提供される方法のいずれも、本明細書に開示される組成物、ｒＡＡＶ９ウイルス粒子もしくはｓｃＡＡＶまたは核酸分子の髄腔内注射後に、患者をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含み得る。
【0032】
提供される方法または使用のいずれにおいても、組成物または薬剤は、非イオン性低浸透圧性造影剤を含み得る。例えば、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性低浸透圧性造影剤を含む。
【0033】
投与される組成物または薬剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
【0034】
提供される方法または使用のいずれにおいても、組成物または薬剤が脳または脊髄に送達されるとき、組成物は脳幹に送達されてもよく、または小脳に送達されてもよく、または視覚皮質に送達されてもよく、または運動皮質に送達されてもよい。さらに、提供される方法または使用のいずれにおいても、組成物または薬剤が脳または脊髄に送達されるとき、組成物は神経細胞、グリア細胞、またはその両方に送達されてもよい。例えば、脳または脊髄に送達することは、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせなどの神経系の細胞への送達を含む。
【0035】
組成物または薬剤の方法、使用もしくは投与は、処置前の対象または未処置の対象と比較して、（ａ）自己蛍光性貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、（ｄ）星状細胞増加症の減少または遅延、（ｅ）ＭＲＩにより測定した脳容積損失の減少または遅延、（ｆ）発作の発症の減少または遅延、ならびに（ｇ）ＣＬＮ３バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）評価尺度またはハンブルク運動および言語尺度のうちの１つ以上の安定化、進行の減少もしくは遅延、または改善のうちの１つ以上を対象にもたらす。
【0036】
本明細書中の見出しは、読者の便宜のためであり、限定的であることを意図しない。
【0037】
本明細書における「ｍａｙ」および「ｃａｎ」の使用は、請求項内に含まれる様々な実施形態を説明するためのものであり、請求項の範囲についての不確実性を示すためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子カセットの概略図（図１Ａ）およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の産生に使用されるプラスミド構築物ｐＡＡＶ．Ｐ５４６．ＣＬＮ３．ＫＡＮの概略図（図１Ｂ）を提供する。ＡＡＶ２由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）構造間にＰ５４６プロモーターの制御下でヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡを挿入した。ＳＶ４０イントロン（ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡの上流）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリＡ）ターミネーター配列（ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡの下流）は、ｍＲＮＡプロセシングを助け、導入遺伝子発現を増強する。プラスミド構築物ｐＡＡＶ．Ｐ５４６．ＣＬＮ３．ＫＡＮの配列を配列番号５に記載する。このゲノムは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質にパッケージングされている。
【図2】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を注射したＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおけるヒトＣＬＮ３転写産物の存在を示す画像を提供する。
【図3】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を注射したＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおける注射後２ヶ月でのＡＳＭ蓄積の早期減少を示すグラフを提供する。示されている全てのグラフのｙ軸は、ＡＳＭ蓄積の総面積を表す。黒い棒は、野生型マウス（ＷＴ－ＰＢＳ）を表し、薄い灰色の棒は、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスを表し、濃い灰色マウスは、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスを表す。
【図4】ＰＢＳ注射野生型マウス（「ＷＴ」）、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３」）、およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３－ＡＡＶ」）における様々な脳領域において、注射後４ヶ月および６ヶ月でＡＳＭの蓄積が著しく減少することを示す、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を注射したＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスのグラフを提供する。
【図5】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３のＩＣＶ投与により、４ヶ月齢および６ヶ月齢のＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの脳におけるミトコンドリアタンパク質ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの異常なリソソーム蓄積が減少したことを示す画像およびグラフを提供する。ＡＴＰシンターゼサブユニットＣについて染色され、６ヶ月の時点でＤＡＢ染色によって可視化された凍結組織切片の代表的な画像が、上のパネルに提供される。下パネルのグラフは、ＰＢＳ注射ＷＴ（「ＷＴ」）、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３」）、およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３－ＡＡＶ」）マウスの、皮質の体性感覚１バレル野（Ｓ１ＢＦ）における注射後４ヶ月（４Ｍ）および６ヶ月（６Ｍ）での、ならびに後内側腹側核／後外側腹側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ）における注射後４ヶ月および６ヶ月でのサブユニットＣの蓄積の定量化を提供する。Ｎ＝５であり、未処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８動物とｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物との間、ならびに野生型動物間で、ｐ≦０．０００１であり、注射後４ヶ月および６ヶ月でのＳＩＢＦにおける野生型と処置されたＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウス間でｐ≦０．５である。
【図6】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３のＩＣＶ投与が、４ヶ月齢および６ヶ月齢のＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの脳における星状細胞増加症を減少させたことについての画像およびグラフを提供する。上部：活性化星状細胞のマーカーとしてＧＦＡＰについて染色し、ＤＡＢ染色で可視化した固定組織切片の代表的な画像（６ヶ月時点）である。下部：ＰＢＳ注射ＷＴ（「ＷＴ」）、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３」）、およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３－ＡＡＶ」）マウスの注射後４ヶ月および６ヶ月でのＧＦＡＰ陽性領域の定量化である。各群および時点についてＮ＝５である。Ｓ１ＢＦ＝バレル皮質。ＶＰＭ／ＶＰＬ＝後内側腹側核／後外側腹側核。
【図7】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ｈＣＬＮ３のＩＣＶ投与が、４ヶ月齢および６ヶ月齢のＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの脳におけるミクログリアの活性化を減少させたことについての画像およびグラフを提供する。上部：活性化ミクログリアのマーカーとしてＣＤ６８について染色し、ＤＡＢ染色で可視化した固定組織切片の代表的な画像（６ヶ月時点）である。下部：ＰＢＳ注射ＷＴ（「ＷＴ」）、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３」）、およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（「ＣＬＮ３－ＡＡＶ」）マウスの注射後４ヶ月および６ヶ月でのＣＤ６８陽性領域の定量化である。各群および時点についてＮ＝５である。Ｓ１ＢＦ＝バレル皮質。ＶＰＭ／ＶＰＬ＝後内側腹側核／後外側腹側核。
【図8】注射後１８ヶ月までの野生型およびＰＢＳまたは処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスのロータロッド分析を示すグラフを提供する。両性別の全てのマウス（上部パネル）、雄のみ（中央パネル）、雌のみ（下部パネル）である。
【図9】注射後１８ヶ月までの野生型およびＰＢＳまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７８マウスのモリス水迷路の遂行能力を示すグラフを提供する。全てのマウス（上部パネル）、雄のみ（中央パネル）、雌のみ（下部パネル）である。
【図10】ポールクライミングアッセイにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスおよびＰＢＳ処置マウスの遂行能力を示すグラフである。ポールクライミングアッセイでは、マウスを垂直なポールの上に向けて置き、マウスが向きを変えて下降する時間と共に落下する回数が、バランスおよび敏捷性を測定する。全てのマウス（上部パネル）、雄のみ（中央パネル）、雌のみ（下部パネル）である。
【図11】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスが、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較して、垂直ポールからの落下頻度が低いことを示すグラフを提供する。マウスを垂直なポールの上に向けて置き、向きを変えようとしながら落下した回数の計数値を、バランスおよび敏捷性について測定する。全てのマウス（上部パネル）、雄のみ（中央パネル）、雌のみ（下部パネル）である。
【図12】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰの注射から３週間後の、様々な脳領域ならびに末梢マウス組織におけるＧＦＰタンパク質の免疫蛍光ウエスタンブロット検出を示す画像を提供する。
【図13】３×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の髄腔内腰椎注射から１２週間後の４歳のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ）の様々な脳領域におけるヒトＣＬＮ３の発現の逆転写定量的ＰＣＲを示すグラフを提供する。これらの値は、腰髄４～７中のＣＬＮ３タンパク質のレベルに対して正規化した。
【図14】ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子カセットの核酸配列（配列番号４）を提供する。ＡＡＶ２ ＩＴＲ核酸配列はイタリック体で示されており（５’ＩＴＲは配列番号６として記載され、３’ＩＴＲは配列番号９として記載されている）、Ｐ５４６プロモーター核酸配列（配列番号３））は一重線で下線が引かれており、ＳＶ４０イントロン核酸配列（配列番号７）は二重線で下線が引かれており、ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡ配列の核酸配列（配列番号２）は太字で示されており、ＢＧＨポリＡターミネーターの核酸配列（配列番号８）は点線で下線を引かれている。
【図15】全長のＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の核酸配列（配列番号５）を提供する。
【図16】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置により、２４ヶ月齢までのｑＰＣＲで測定したＣｌｎ３Δ７／８マウスの大脳皮質および脊髄におけるｈＣＬＮ３転写産物の発現レベルが上昇することを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、各月の通常の一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【図17】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置により、２４ヶ月齢までのＲＮＡｓｃｏｐｅ（赤色蛍光）で測定したＣｌｎ３Δ７／８マウスの脳全体に安定したｈＣＬＮ３転写産物が産生されることを示す画像を提供する。２０倍で撮影した画像。
【図18】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８マウスの脳の２つの領域でＡＳＭの蓄積を防止および減少したことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、各月の通常の一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。２０倍で撮影した画像。
【図19】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８マウスの脳の２つの領域で大量のサブユニットＣ蓄積（ＡＳＭの構成要素）を防止したことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、各月の通常の一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。２０倍で撮影した画像。
【図20】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８の脳の２つの領域で星状細胞の活性化（ＧＦＡＰ＋）を防止したことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、各月の通常の一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。２０倍で撮影した画像。
【図21】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、時点に応じて、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８の脳の２つの領域でかなりのミクログリアの活性化（ＣＤ６８＋）を防止したことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、各月の通常の一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。２０倍で撮影した画像
【図22】ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３処置が、６ヶ月齢および１２ヶ月齢のＣｌｎ３Δ７／８マウスの様々なバッテン病の病状を予防するのに同様に効果的であることを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図23】２４ヶ月齢まで測定したＣｌｎ３Δ７／８に赤血球異常がないことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、通常の二元配置分散分析
【図24】２４ヶ月齢まで測定したＣｌｎ３Δ７／８マウスに白血球異常がないデータを提供する。平均±ＳＥＭ、通常の二元配置分散分析
【図25】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスは、１２ヶ月齢の性別に基づいて、海馬のＣＡ３領域で異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図26】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、複数の時点で性別に基づいて、梨状皮質（ＰＩＲＣ）にわずかに異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図27】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、複数の時点で性別に基づいて、網様視床核（ＲＴＮ）に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図28】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、体性感覚皮質に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図29】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、視床のＶＰＭ／ＶＰＬに異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図30】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図31】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、歯状回（ＤＧ）の多形層に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図32】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、手綱（Ｈａｂ）に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図33】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、背内側核（ＭＤ）で異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示すデータを提供する。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図34】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、性別に基づく脳梁膨大後部皮質（Ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ Ｃｏｒｔｅｘ）（ＲＳＣ）のサブＣ蓄積レベルに差がないことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図35】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、６ヶ月で性別に基づいて、体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ）で異なるレベルの活性化ミクログリア（ＣＤ６８＋）を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図36】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、性別に基づいて、ＶＰＭ－ＶＰＬ、視床で異なるレベルのミクログリア（ＣＤ６８＋）活性化を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図37】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、性別に基づいて、背内側核（ＭＤ）で異なるレベルの活性化ミクログリア（ＣＤ６８＋）を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図38】ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、性別に基づいて、内側下核（Ｓｕｂｍｅｄｉａｌ Ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＳＭ）で異なるレベルの活性化ミクログリア（ＣＤ６８＋）を示すことを示す。平均±ＳＥＭ、テューキーの事後検定を伴う通常の二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本開示は、ＣＬＮ３－バッテン病を治療するための方法および製品を提供する。本方法は、遺伝子送達ベクターとしてｒＡＡＶを使用して対象にＣＬＮ３ポリヌクレオチドを送達することを伴う。
【0040】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さであり、ウイルスそれ自体またはその誘導体を指すように使用することができる。この用語は、他に特定されない限り、全てのサブタイプおよび天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶの血清型はそれぞれ特定のクレードと関連しており、そのメンバーは血清学的および機能的類似性を共有している。したがって、ＡＡＶはクレードによって称されてもよい。例えば、ＡＡＶ９配列は「クレードＦ」配列と呼ばれる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）。本開示は、特定のクレード、例えばクレードＦ内の任意の配列の使用を企図する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１２ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ－１３ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ＡＡＶ－Ｂ１ゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。
【0041】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的である固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。天然のＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを置換することができるプロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと接触させる。場合によっては、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性でない。
【0042】
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、野生型ＡＡＶウイルスまたはウイルス粒子を指す。「ＡＡＶ」、「ＡＡＶウイルス」、および「ＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えＡＡＶウイルスまたは組換え感染性のカプセル化ウイルス粒子を指す。「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶウイルス」、および「ｒＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0043】
「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾されている天然のＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、天然のｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を除去するために修飾されている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは内因性５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来するＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端に隣接した目的の導入遺伝子（例えばＣＬＮ３をコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは「遺伝子カセット」を含む。例示的な遺伝子カセットを図１Ａおよび配列番号４の核酸配列に記載する。ｒＡＡＶゲノムは、本明細書で「ｓｃＡＡＶゲノム」と呼ばれる自己相補的（ｓｃ）ゲノムであり得る。あるいは、ｒＡＡＶゲノムは、本明細書で「ｓｓＡＡＶゲノム」と呼ばれる一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。
【0044】
「ｓｃＡＡＶ」という用語は、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。「ｓｓＡＡＶ」という用語は、一本鎖ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。
【0045】
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。ＣＬＮ３ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ＣＬＮ３活性（例えば、リソソーム自己蛍光貯蔵物質のクリアランスの増加、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少、ならびに例えば治療前の患者と比較して治療した場合の患者における星状細胞およびミクログリアの活性化の減少のうちの少なくとも１つ）を有するポリペプチドをコードする。
【0046】
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、場合によっては、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチドであり、ＣＬＮ３活性（例えば、リソソーム自己蛍光貯蔵物質のクリアランスの増加、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少、ならびに例えば治療前の患者と比較して治療した場合の患者における星状細胞およびミクログリアの活性化の減少のうちの少なくとも１つ）を有するポリペプチドをコードする。
【0047】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＣＬＮ３活性を有するポリペプチドをコードし、かつストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列、またはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃での０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
【0048】
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＣＬＮ３ポリヌクレオチドは、遺伝子カセットを形成するために標的細胞内で機能的である転写制御要素（プロモーター、エンハンサおよび／またはポリアデニル化シグナル配列が含まれるが、これらに限定されない）に作動可能であるように結合されている。プロモーターの例は、ニワトリβアクチンプロモーターおよびＰ５４６プロモーターである。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時型プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない追加のプロモーターが本明細書で企図される。本明細書にさらに提供されるのは、Ｐ５４６転写促進活性を有するプロモーターである、配列番号３に記載のＰ５４６プロモーター配列、および配列番号３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のプロモーター配列である。転写制御因子の他の例は、組織特異的制御因子、例えば、ニューロン内での特異的発現を可能にするか、または星状細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターもまた企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞中で発現されたときにＣＬＮ３ ＲＮＡ転写産物のプロセシングを容易にするためのイントロン配列を含んでもよい。このようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の組立およびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。「産生」という用語は、充填細胞によるｒＡＡＶ（感染性のカプセル化されたｒＡＡＶ粒子）の産生プロセスを指す。
【0049】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれアデノ随伴ウイルスの複製タンパク質およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。
【0050】
ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶに対する様々なこのようなヘルパーウイルスは、当該技術分野において既知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含し得るが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらはＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手可能である。
【0051】
「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされている機能を指す。本明細書中に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでプロデューサー細胞に提供することによることを含む多くの方法で提供され得る。
【0052】
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。本明細書に企図されるｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲ）内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスを導出するのに好適な任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、およびＡＡＶ－Ｂ１が挙げられるが、これらに限定されない。上記に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。キャプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。本明細書中の修飾キャプシドもまた企図され、グリコシル化および脱アミド化などの種々の翻訳後修飾を有するキャプシドを含む。アスパラギンまたはグルタミン側鎖を脱アミド化してアスパラギン残基をアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸残基に変換すること、およびグルタミンをグルタミン酸またはイソグルタミン酸に変換することは、本明細書に提供されるｒＡＡＶキャプシドにおいて企図される。例えば、Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２６（１２）：２８４８－２８６２（２０１８）を参照されたい。本明細書中の修飾キャプシドはまた、治療を必要とする罹患組織および臓器にｒＡＡＶを指向させる標的化配列を含むと企図される。
【0053】
本明細書に提供されるＤＮＡプラスミドは、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を用いて感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に導入される。パッケージングされるべきｒＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶを産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶ粒子の産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々な実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えｒＡＡＶの送達を増強するために修飾され得る。キャプシドタンパク質に対する修飾は、一般的に当該技術分野において既知である。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＵＳ２００５／００５３９２２およびＵＳ２００９／０２０２４９０を参照されたい。
【0054】
パッケージング細胞を生成する方法は、ｒＡＡＶの産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ｒＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されてもよい。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられ得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【0055】
ｒＡＡＶ粒子の生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ粒子産生に関する文書の部分を特に強調する。
【0056】
本明細書でさらに提供されるのは、感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するパッケージング細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）であり得る。
【0057】
本開示のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（例えば、感染性キャプシド化ｒＡＡＶ粒子）も本明細書に提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。ｒＡＡＶゲノムは自己相補的（ｓｃ）ゲノムであり得る。ｓｃゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｃＡＡＶと称される。ｒＡＡＶゲノムは一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｓＡＡＶと称される。
【0058】
本明細書に提供される例示的なｒＡＡＶは、「ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３」と命名されるｓｃＡＡＶである。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３ ｓｃＡＡＶは、Ｐ５４６プロモーターの制御下にあるヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡを含むｓｃＡＡＶゲノムを含む（配列番号３）。ｓｃＡＡＶゲノムはまた、ＳＶ４０イントロン（ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡの上流）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリＡ）ターミネーター配列（ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡの下流）を含む。このｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子カセットの配列を配列番号４に記載する。ｓｃＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージ化されており、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１つのＩＴＲはＰ５４６プロモーターの上流にあり、他のＩＴＲはＢＧＨポリＡターミネーター配列の下流にある）を含む。
【0059】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含み得る。
【0060】
ｒＡＡＶを含む組成物もまた提供される。組成物は、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。組成物は、対象とした異なるポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｓｃＡＡＶまたはｓｓＡＡＶである。
【0061】
本明細書で提供される組成物は、ｒＡＡＶと、薬学的に許容される１つまたは複数の賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量および濃度で不活性であり、リン酸塩［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、クエン酸塩、もしくは他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、ポロキサマー１８８などのコポリマー、プルロニック（例えば、プルロニックＦ６８）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、またはイオキシランなどの非イオン性低浸透圧性化合物を含有する薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧性化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性：約１８０ｍｇｌ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法による重量オスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐのおよび３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、ならびに３７℃で約１．１６４の比重のうちの１つ以上を有することができる。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
【0062】
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの投薬量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、投与の時間、治療目標、個体、および標的とされる細胞型に応じて異なることになり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投薬量は、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１．１×１０１３、約１．２×１０１３、約１．３×１０１３、約１．５×１０１３、約２×１０１３、約２．５×１０１３、約３×１０１３、約３．４×１０１３、約３．５×１０１３、約４×１０１３、約４．５×１０１３、約５×１０１３、約６×１０１３、約１×１０１４、約１．２×１０１４、約２×１０１４、約３×１０１４、約４×１０１４、約５×１０１４、約１×１０１５、約１×１０１６まで、またはそれ以上の総ウイルスゲノムを含む。約１×１０１１～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２～約１×１０１４ｖｇ、約１×１０１３～約６×１０１４ｖｇ、および約６×１０１３～約１．２×１０１４ｖｇの投薬量も企図される。本明細書中に例示される用量は、６×１０１３ｖｇである。本明細書に例示される他の用量は１．２×１０１４である。
【0063】
標的細胞（神経系の細胞、神経細胞またはグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない）にｒＡＡＶを形質導入する方法が提供される。神経系の細胞は、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせを含む。
【0064】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による機能性ポリペプチドの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、標的細胞へのＣＬＮ３ポリヌクレオチドの投与／送達を指すように使用される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチドまたはＲＮＡの持続的発現をもたらす。したがって、本開示は、髄腔内、脳室内、脳実質内、または静脈内経路、またはこれらの任意の組み合わせによって、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを対象に投与／送達する方法を提供する。髄腔内送達は、脳または脊髄のくも膜の下の空間への送達を指す。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は槽内投与による。
【0065】
髄腔内投与が本明細書に例示される。これらの方法は、標的細胞（神経細胞および／またはグリア細胞を含むが、これらに限定されない）に本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶウイルス粒子は、患者の脳および／または脊髄に投与もしくは送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脳に送達される。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質、視覚皮質、小脳、および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ニューロンまたは下位運動ニューロンに送達される。ポリヌクレオチドは、神経細胞およびグリア細胞に送達され得る。グリア細胞は、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、または星状細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シュワン細胞に送達される。
【0066】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、患者は、ｒＡＡＶの投与後トレンデレンベルク体位（低頭位（ｈｅａｄ ｄｏｗｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ））に保持される（例えば、約５、約１０、約１５または約２０分間）。例えば、患者は、低頭位で約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、または約９０～約１８０度傾けられてもよい。
【0067】
本明細書で提供される方法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数用量をそれを必要とする対象（例えば、ヒト患者を含むが、これに限定されない動物）に投与する工程を含む。用量がＣＬＮ３－バッテン病の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量がＣＬＮ３－バッテン病の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または減少）する用量であり、疾患の進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的または完全な）をもたらす用量であり、および／または生存を延長させる用量である。処置前の対象と比較して、または未処置の対象と比較して、本明細書で提供される方法は、ＣＬＮ３バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）またはハンブルク運動および言語尺度のうちの１つ以上の安定化、進行の減少、または改善をもたらす。ＵＢＤＲＳ評価尺度（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００５ ６５（２）：２７５－２７９）［ＵＢＤＲＳ身体評価尺度、ＵＢＤＲＳ発作評価尺度、ＵＢＤＲＳ行動評価尺度、ＵＢＤＲＳ能力評価尺度、ＵＢＤＲＳ症状発現順序、およびＵＢＤＲＳ臨床全般印象（ＣＧＩ）を含む］、小児の生活の質の尺度（ＰＥＤＳＱＯＬ）は、運動機能、言語機能、認知機能、および生存を量る。処置前の対象と比較して、または未処置の対象と比較して、本明細書で提供される方法は、以下の：自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、星状細胞増加症の減少または遅延、およびＭＲＩによって測定された脳容積損失の減少または遅延のうちの１つ以上をもたらし得る。
【0068】
併用療法も提供される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療または連続治療のいずれかを含む。本明細書に記載の方法と標準的な薬物療法との組み合わせが特に企図される。さらに、本発明に従って使用するための組成物の組み合わせ（例えば、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３と本明細書に開示される造影剤との組み合わせ）（同時治療または連続治療のいずれか）が具体的に企図される。
【0069】
出生後の送達を必要とする対象への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達も企図される。
【実施例】
【0070】
以下の実施例は特定の実施形態を説明するが、当業者には変形および修正が発生するであろうことが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。
【0071】
実施例では、Ｐ５４６プロモーターの制御下でＣＬＮ３ ｃＤＮＡを保有する自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３と命名）を産生した。Ｐ５４６プロモーターは、ＭｅＣＰ２プロモーターの短縮型であり、ニューロンおよび星状細胞の両方において中程度のレベルで導入遺伝子の発現を可能にする。この遺伝子治療ベクターの有効性を、ヒト患者に最も頻繁に見られる変異を有するＣＬＮ３Δｅｘ７／８ノックインマウスモデルにおいて試験した。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の安全性および有効性を、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８ノックインマウスモデル、野生型マウス、および非ヒト霊長類においてインビボで評価した。マウスおよび非ヒト霊長類からのデータは、視床、海馬、線条体、扁桃体、髄質、および小脳などの深部脳構造を含む脳および脊髄全体にわたる星状細胞およびニューロンの効率的な形質導入を明らかに実証している。
【0072】
実施例１
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の産生
２つのＮｏｔ１制限部位の間のヒトＣＬＮ３のオープンリーディングフレーム（配列番号２）を含むＤＮＡを、Ｅｕｒｏｆｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡによって合成し、次いで、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースの産生プラスミドに挿入した。ＡＡＶ２ ＩＴＲ間に挿入されたＣＬＮ３ ＤＮＡを示すプラスミド構築物の概略図［５’ＩＴＲは、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８－１２５４（２００１）で以前に記載されたように修飾され、ｓｃＡＡＶが生成された］を図１に示す。プラスミド構築物はまた、Ｐ５４６プロモーター、ＳＶ４０キメライントロン、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含む。
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の産生
２つのＮｏｔ１制限部位の間のヒトＣＬＮ３のオープンリーディングフレーム（配列番号２）を含むＤＮＡを、Ｅｕｒｏｆｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡによって合成し、次いで、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースの産生プラスミドに挿入した。ＡＡＶ２ ＩＴＲ間に挿入されたＣＬＮ３ ＤＮＡを示すプラスミド構築物の概略図［５’ＩＴＲは、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８－１２５４（２００１）で以前に記載されたように修飾され、ｓｃＡＡＶが生成された］を図１に示す。プラスミド構築物はまた、Ｐ５４６プロモーター、ＳＶ４０キメライントロン、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含む。
【0073】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を、ＨＥＫ２９３細胞中のアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と共に、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースの産生プラスミドと、前述の（［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）］Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを用いて、一過性トリプルプラスミドトランスフェクション法により、ｃＧＭＰ条件下で産生した。ウイルスを２つの塩化セシウム密度勾配精製工程により精製し、ＰＢＳに対して透析して、ウイルスの凝集を防ぐために０．００１％プルロニック－Ｆ６８と配合し、４℃で保存した。全てのｓｃＡＡＶ調製物を、Ｔａｑ－Ｍａｎ技術を使用した定量的ＰＣＲによって滴定した。ｓｃＡＡＶの純度は、４～１２％ドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動および銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。
【0074】
実施例２
ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおけるＣＳＦ送達ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の長期有効性試験
細胞標的化および発現
マウスにおけるウイルス導入ヒトＣＬＮ３の発現および体内分布を確認するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を１×ＰＢＳおよび０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中に配合するか、または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８中に配合し、生後３６時間以内に脳室内（ＩＣＶ）注射により、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスに投与し、発現を様々な時点で監視した。等量のＰＢＳを注射した野生型マウスおよびＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスを対照とした。有効投与量は、ＮＣＨウイルスベクターコアタイター（ｔｉｔｅｒ）を使用して２．２×１０１０ｖｇ／マウスであった。
ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおけるＣＳＦ送達ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の長期有効性試験
細胞標的化および発現
マウスにおけるウイルス導入ヒトＣＬＮ３の発現および体内分布を確認するために、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を１×ＰＢＳおよび０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中に配合するか、または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８中に配合し、生後３６時間以内に脳室内（ＩＣＶ）注射により、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスに投与し、発現を様々な時点で監視した。等量のＰＢＳを注射した野生型マウスおよびＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスを対照とした。有効投与量は、ＮＣＨウイルスベクターコアタイター（ｔｉｔｅｒ）を使用して２．２×１０１０ｖｇ／マウスであった。
【0075】
詳細な脳内分布プロファイルを得るために、ＲＮＡｓｃｏｐｅインサイチューハイブリダイゼーション技術を使用して、脳、頸髄、胸髄、および腰髄中のヒトＣＬＮ３ ｍＲＮＡを特異的に特定した。この技術は、ｓｃＡＡＶ９によってコードされるヒト導入遺伝子のみを検出するために、ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションを特異的プローブと使用することを伴う。強いシグナルは、ＰＢＳ注射対照においてシグナルがなかったことと比較して、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３で注射したＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの特に皮質（領域Ａ～Ｃ）で、注射後４ヶ月および６ヶ月の時点で観察された。分析は、ＡＡＶ９送達ＣＬＮ３導入遺伝子が、皮質、視床、後脳、小脳、および脊髄を含む脳の様々な領域において適切なレベルで発現されることを実証した。小脳において、シグナルは、プルキンエニューロンにおいて特に強かった。導入遺伝子の発現は、４ヶ月および６ヶ月の時点で、逆転写ＰＣＲによって脳および脊髄の全領域においても検出された（図２）。
【0076】
まとめると、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスからの組織に対して行われた逆転写ＰＣＲデータおよびＲＮＡｓｃｏｐｅ分析は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の単回ＩＣＶ注射が、脳および脊髄全体における注射後最長６ヶ月のヒトＣＬＮ３の標的化および発現の成功をもたらしたことを確認した。これは、ＣＬＮ３－バッテン病の病因に不釣り合いに関与している細胞を特異的に標的とするためのｓｃＡＡＶ９のＩＣＶ媒介送達の妥当性を確認する。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルにおける発現データは、定量的ＲＴ－ＰＣＲによるヒト導入遺伝子の検出のために同じプライマーを使用して野生型マウスにおける研究においてさらに確認された。
【0077】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の送達後の病理の改善
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積はバッテン病の進行に対する特徴的な組織学的マーカーである（Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ－Ｍｏｌ Ｂａｓｉｓ Ｄｉｓ．２０１５；１８５２（１０）：２２３７－２２４１、Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ；７（１）：７９－９１、Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００６；２７：５７６－５８８）。ＡＳＭの蓄積は、バッテン病の多くの形態に対する疾患進行の強力な指標である（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；３６（３７）：９６６９－９６８２、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。本明細書では、ＡＳＭの減少が治療の成功の指標として使用されることが企図される。ＡＳＭは、ＣＬＮ３－バッテン病の最も早期に検出可能な疾患の徴候の１つであり、２ヶ月齢までにＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの多数の脳領域ですでに見られた（図３）。
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積はバッテン病の進行に対する特徴的な組織学的マーカーである（Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ－Ｍｏｌ Ｂａｓｉｓ Ｄｉｓ．２０１５；１８５２（１０）：２２３７－２２４１、Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ；７（１）：７９－９１、Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００６；２７：５７６－５８８）。ＡＳＭの蓄積は、バッテン病の多くの形態に対する疾患進行の強力な指標である（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；３６（３７）：９６６９－９６８２、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。本明細書では、ＡＳＭの減少が治療の成功の指標として使用されることが企図される。ＡＳＭは、ＣＬＮ３－バッテン病の最も早期に検出可能な疾患の徴候の１つであり、２ヶ月齢までにＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの多数の脳領域ですでに見られた（図３）。
【0078】
蛍光画素面積の自動定量化は、２ヶ月齢のｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて体性感覚皮質および視床における蓄積ＡＳＭの有意な減少を確認した。この初期の時点で、運動皮質および視覚皮質におけるＡＳＭ蓄積のより高い変動性が、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて見られたので、分析の統計的検出力は、これら２つの領域についてより低かった。注射後４ヶ月および６ヶ月で、４つの脳領域全てが、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較してＡＳＭ蓄積の非常に有意な減少を示した（図４）。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスを野生型動物と比較すると、わずかに高いＡＳＭレベルは、注射後４ヶ月でｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの体性感覚および視覚皮質において見出されたが、一方、運動皮質および視床において野生型とｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間に有意差は見られなかった。注射後６ヶ月で、全ての領域が野生型マウスおよびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて匹敵する低レベルのＡＳＭを示し、これはＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較してはるかに低く、ＡＳＭ蓄積における長期持続性および高効率減少を確認した（ｐ≦０．０００１）。ＰＢＳとｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物との間の（群あたりＮ＝１０）、注射後４ヶ月での視覚皮質（ｐ≦０．００１）、注射後６ヶ月での運動皮質（ｐ≦０．００１）以外の全てについてｐ≦０．０００１であった。
【0079】
ミトコンドリアタンパク質ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積
野生型およびＣＬＮ３Δｅｘ７／８ＰＢＳ注射マウスまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射マウスの脳組織を、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積について分析した。健康な個体では、このタンパク質は、ミトコンドリア膜の呼吸鎖の一部であるが、バッテン病を患っている患者では、このタンパク質はリソソーム内に異常に蓄積する（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスでは、野生型動物と比較して、視床の後内側腹側核および後外側腹側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ領域）においてサブユニットＣの蓄積が４ヶ月齢までに明らかになり、これは、ＮＣＬマウスモデルでは多くの場合早期に影響を受ける脳領域である（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６）。未処置動物は、体性感覚皮質および視床のＶＰＭ／ＶＰＬ領域に蓄積したＡＴＰシンターゼサブＣについて強いシグナルを示したが、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物は、注射後４ヶ月および６ヶ月の両方での野生型動物に匹敵する最小のシグナルを示した（図５）（ＰＢＳとｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物との間でｐ≦０．０００１）。
野生型およびＣＬＮ３Δｅｘ７／８ＰＢＳ注射マウスまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射マウスの脳組織を、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積について分析した。健康な個体では、このタンパク質は、ミトコンドリア膜の呼吸鎖の一部であるが、バッテン病を患っている患者では、このタンパク質はリソソーム内に異常に蓄積する（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスでは、野生型動物と比較して、視床の後内側腹側核および後外側腹側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ領域）においてサブユニットＣの蓄積が４ヶ月齢までに明らかになり、これは、ＮＣＬマウスモデルでは多くの場合早期に影響を受ける脳領域である（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６）。未処置動物は、体性感覚皮質および視床のＶＰＭ／ＶＰＬ領域に蓄積したＡＴＰシンターゼサブＣについて強いシグナルを示したが、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物は、注射後４ヶ月および６ヶ月の両方での野生型動物に匹敵する最小のシグナルを示した（図５）（ＰＢＳとｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物との間でｐ≦０．０００１）。
【0080】
グリア細胞および星状細胞の活性化
貯蔵物質の異常な蓄積およびＡＴＰシンターゼサブＣの蓄積に加えて、ヒト患者および動物モデルの両方における疾患進行の他の組織学的マーカーには、星状細胞およびミクログリアの活性化が含まれる（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。特に、反応性ミクログリアは、ＣＬＮ３－バッテン病の後期におけるニューロン細胞死の主な原因であり得る、ＩＬ１－β２６などの炎症誘発性メディエーターを放出するようにプライミングされる。活性化星状細胞は、４ヶ月および６ヶ月の時点でグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について染色することによって、視床のＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質切片において特定された。体性感覚皮質については、体性感覚皮質の皮質層ＩＶ内のバレル皮質で定量化を行った。注射後６ヶ月の代表的な画像を図６に示す。
貯蔵物質の異常な蓄積およびＡＴＰシンターゼサブＣの蓄積に加えて、ヒト患者および動物モデルの両方における疾患進行の他の組織学的マーカーには、星状細胞およびミクログリアの活性化が含まれる（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。特に、反応性ミクログリアは、ＣＬＮ３－バッテン病の後期におけるニューロン細胞死の主な原因であり得る、ＩＬ１－β２６などの炎症誘発性メディエーターを放出するようにプライミングされる。活性化星状細胞は、４ヶ月および６ヶ月の時点でグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について染色することによって、視床のＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質切片において特定された。体性感覚皮質については、体性感覚皮質の皮質層ＩＶ内のバレル皮質で定量化を行った。注射後６ヶ月の代表的な画像を図６に示す。
【0081】
ＧＦＡＰ陽性領域の処置後４ヶ月および６ヶ月の定量化は、星状細胞の活性化が、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較して、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの両方の脳領域において有意に減少したことを示している（図６）。これらの脳領域におけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおけるＧＦＡＰ染色のレベルは、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較してはるかに低かったが、これらは、分析されたほとんどの領域について、注射後４ヶ月および６ヶ月の両方で野生型レベルを超えたままであった。
【0082】
グリア活性化はまた、活性化ミクログリアのマーカーとして抗ＣＤ６８染色を使用して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質切片において決定した。ＣＤ６８は、食作用などの炎症誘発性機能についてプライミングされた細胞においてアップレギュレーションされるリソソームタンパク質である（Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；２３０：１６９－１７２）。星状細胞で観察されたものと同様に、グリア活性化は、４ヶ月後に、ＰＢＳ注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比べて、ＡＡＶ９注射ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスのＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質領域において有意に減少した（図７）。体性感覚皮質において、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３による処置は、ＣＤ６８染色を野生型マウスに匹敵するレベルまで減少させた。６ヶ月の時点で、ＶＰＭ／ＶＰＬ領域において、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較してｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置のＣＤ６８染色のレベルに有意な改善は見られなかったが、それでもなおｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスの体性感覚皮質における反応性グリアの有意な減少が見られた（図７）。
【0083】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の送達後の行動の改善
ヒトＣＬＮ３－バッテン病患者では、運動機能障害および認知機能障害などの神経障害が、ＣＬＮ３－バッテン病（遅発性小児性バッテン病）などの早期発症型疾患変種と比較して非常に遅れて明らかになり、これは短く不完全なＣＬＮ３タンパク質の残存機能に起因する可能性がある（Ｋｉｔｚｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００８ Ｊａｎ １５；１７（２）：３０３－１２）。この表現型の遅延はまた、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルにも存在する。２ヶ月齢から開始し、２ヶ月間隔で継続するｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の有効性試験では、マウスは、運動機能および協調運動を試験するための加速ロータロッドアッセイおよびポールクライミング、ならびに学習および記憶を評価するためのモリス水迷路を含む、一連の行動試験パラダイムを受けた。現在、動物は注射後１０ヶ月間追跡調査されており、研究は進行中である。このマウスモデルを特徴付けるこれまでの刊行物は、神経発達行動の初期遅延、それに続く正常化、およびその後の生後１０～１２ヶ月頃からの低下を示している（Ｏｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．２００９ Ａｐｒ；８（３）：３３７－３４５）。
ヒトＣＬＮ３－バッテン病患者では、運動機能障害および認知機能障害などの神経障害が、ＣＬＮ３－バッテン病（遅発性小児性バッテン病）などの早期発症型疾患変種と比較して非常に遅れて明らかになり、これは短く不完全なＣＬＮ３タンパク質の残存機能に起因する可能性がある（Ｋｉｔｚｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００８ Ｊａｎ １５；１７（２）：３０３－１２）。この表現型の遅延はまた、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスモデルにも存在する。２ヶ月齢から開始し、２ヶ月間隔で継続するｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の有効性試験では、マウスは、運動機能および協調運動を試験するための加速ロータロッドアッセイおよびポールクライミング、ならびに学習および記憶を評価するためのモリス水迷路を含む、一連の行動試験パラダイムを受けた。現在、動物は注射後１０ヶ月間追跡調査されており、研究は進行中である。このマウスモデルを特徴付けるこれまでの刊行物は、神経発達行動の初期遅延、それに続く正常化、およびその後の生後１０～１２ヶ月頃からの低下を示している（Ｏｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．２００９ Ａｐｒ；８（３）：３３７－３４５）。
【0084】
ロータロッド分析は、注射後１８ヶ月までの野生型およびＰＢＳまたは処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの間の統計的な有意差を示さなかった。
【0085】
ロータロッドアッセイを２ヶ月毎に行った。マウスを加速ホイール上に置いて、マウスが落下するまでの時間を測定した。各時点において、マウスを午前中に訓練し、試験を午後に４時間後に行った。以前に公表された（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；３６（３７）：９６６９－９６８２）データとは異なり、注射後１８ヶ月まで野生型マウスおよびＰＢＳ ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの遂行能力に有意差は観察されなかった。しかしながら、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスに対し雌ＷＴマウスでは、注射後２ヶ月で落下するまでの潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）における有意差が観察された。以前のデータと比較したこの矛盾は、試験プロトコルの設計および／またはハウジングの環境要因にある可能性が最も高い。この研究で使用されている現在のプロトコルは、各時点で１日にのみ動物を試験しているのに対し、以前に公表されたデータは４日間にわたって試験を繰り返していた。さらに、この研究で使用されたプロトコルは、以前に公表されたデータと比較してわずかに低い開始速度（４０ｒｐｍに対し３６ｒｐｍ）および午前の訓練と午後の試験期間との間のより長い時間間隔で行われた（２時間の休息に対し４時間の休息）。さらに、午前中の訓練の設定も異なっていた：以前の研究では、マウスは５分間、午前中だけ５ｒｐｍで回転する車輪で訓練されたが、現在の研究の動物は、２秒毎に０．３ｒｐｍまでの車輪の加速をもたらす午後のテストで適用されたのと全く同じ設定で行われた。まとめると、記載した設定を用いて、注射後１８ヶ月までに、野生型動物と比較して、未処置マウスまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスでは、加速ロータロッドホイールを保持する能力の障害は観察されなかった（図８の上部パネル）。
【0086】
モリス水迷路分析は、注射後２、４、１６、および１８ヶ月での、野生型とＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間に統計的に有意な差を示した。
【0087】
モリス水迷路試験では、動物を、隠れたプラットフォームを含む水で満たされたプールに置いた。訓練の後、方向定位のために環境の手がかりを使って隠されたプラットフォームを見つけるのに動物がかかった時間を、学習および記憶能力の兆候として測定した。注射後２ヶ月および４ヶ月で、野生型動物とＰＢＳまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間に統計的差異が観察され、これは疾患のこの時点で学習および記憶がこの試験で測定可能であるよう損なわれたことを示し、その結果、動物が隠れたプラットフォームを見つけるまでの潜時が生じた。さらに、１６ヶ月および１８ヶ月で、野生型と、ＰＢＳまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間で、潜時におけるより有意な統計的差異を観察した（図９、左上パネル）。１６ヶ月での潜時の増加はまた、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスについての水泳速度の増加と相関していた（図９、右上パネル）。加えて、性別で分類すると、１６ヶ月および１８ヶ月で雄の野生型動物とｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間に潜時の統計的差異を観察した（図９、左中央パネル）が、一方ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８雄マウスの水泳速度は、１６ヶ月で有意に減少した（図９、右中央パネル）。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置雌ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスは、１８ヶ月で、野生型またはＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスと比較して有意に増加した潜時を示した（図９、左下パネル）が、一方、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８雄マウスの水泳速度は、１６ヶ月で有意に増加した（図９、右下パネル）。
【0088】
ポールクライミングアッセイは、ＰＢＳ注射動物と比較して、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８の改善された遂行能力を示した。
【0089】
ポールクライミングテストは、マウスを上向きにして置いたときにマウスが垂直ポール上で向きを変えるのに要する時間間、ならびに下向きにして置いたときにポールを下降する時間を測定する。さらに、向きを変えようとするか、または下降しようとしている間にポールから落下する回数も測定されることがある。この試験は、協調運動およびバランス能力を評価する。
【0090】
注射後１０ヶ月および１２ヶ月で、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３動物は、ＰＢＳ処置動物と比較して、ポールの下降が有意に速かった（図１０、左上パネル）。注射後１０ヶ月および１２ヶ月で、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８動物がポールを下降するのに要する時間において統計的に有意な差が見られたが、一方野生型とｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８とでは区別できなかった（図１０、左上のパネル）。動物が上向きから下向きに向きを変えるのにかかる時間に関して、２つの統計的に有意な差が見られた。２ヶ月および１６ヶ月齢で、野生型動物は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３およびＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの両方と比較して有意に早く向きを変えた。この差は、野生型と比較して差が見られなかった雌（図１０、左下パネル）と比較して雄マウス（図１０、左中央パネル）においてより顕著であった。２ヶ月および１６ヶ月の時点は、このパラメーターの違いが研究群間で観察された唯一の時点であった（図１０、左上パネル）。
【0091】
追加の統計的に有意な差は、ポールからの落下の平均回数において見られ、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８の雄および雌マウスは、野生型およびｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物と比べて、より頻繁に落下した（図１１）。上部グラフ：ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物とＰＢＳ処置動物との間で落下の回数において、有意差が２ヶ月目に見られた。統計的に有意な差もまた、注射後１６ヶ月で野生型マウスとＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスとの間で観察した。中央グラフ：雄のみである。ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスは、注射後１６ヶ月で最大の統計的有意性を伴って、他の処置群よりも頻繁にポールから落下した。下部グラフ：雌については、注射後８ヶ月で落下における差は有意であったが、この傾向は研究全体を通して見られた。各処置群についてＮ＝５（５Ｍ／５Ｆ）であった。興味深いことに、ポールからの落下における差は、１８ヶ月全体にわたって見られ、早い時点（４ヶ月）ならびに８ヶ月および１６ヶ月で統計的に有意であった。８ヶ月時点で、この差は雌においてのみ統計的に有意であったが、明らかな傾向は雄においても存在し、雄では注射後１６ヶ月で統計的に有意であった。一般に、ＰＢＳ処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８の雄は、他の処置群よりも頻繁にポールから落下した。
【0092】
まとめると、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３による処置が、ＡＳＭ物質、ならびにＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積（両方ともＣＬＮ３－バッテン病の進行の主要な特徴である）を防止するという強力な証拠がある。これらのデータは、グリア（星状細胞およびミクログリア）活性化における強力な減少と相関している。疾患経過の早い段階ではあるが、行動表現型の改善への最初の傾向が明らかになってきている：ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３処置ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスは、より速く動いて落下しにくかったために、ＰＢＳ処置動物と比べて、垂直ポールを下降することでより能力が高かった。全体として、これらのデータはこの疾患の治療戦略としてのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子治療を支持している。
【0093】
実施例３
マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰを用いた発現研究
Ｐ５４６プロモーターは、ニワトリ－ベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターと同様の様式でＣＮＳ全体にわたって導入遺伝子の発現を可能にする。２つのプロモーターを並べて比較するために、生後１日目に、マウスに１×ＰＢＳおよび０．００１％の％プルロニックＦ６８または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８中に配合したｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのいずれかを、動物あたり５×１０１０ウイルスゲノムで注射した。３週間後、動物を犠死させ、脳を蛍光解剖顕微鏡下に直接置いた。蛍光画像から、ＧＦＰ分布は類似しているが、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを受容した動物と比較してｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰを受容した動物において蛍光レベルが低いことが明らかであって、Ｐ５４６プロモーターが、ＣＢＡプロモーターと比べて、導入遺伝子のより適度な発現レベルをもたらすことを確認した。
マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰを用いた発現研究
Ｐ５４６プロモーターは、ニワトリ－ベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターと同様の様式でＣＮＳ全体にわたって導入遺伝子の発現を可能にする。２つのプロモーターを並べて比較するために、生後１日目に、マウスに１×ＰＢＳおよび０．００１％の％プルロニックＦ６８または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８中に配合したｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰのいずれかを、動物あたり５×１０１０ウイルスゲノムで注射した。３週間後、動物を犠死させ、脳を蛍光解剖顕微鏡下に直接置いた。蛍光画像から、ＧＦＰ分布は類似しているが、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを受容した動物と比較してｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰを受容した動物において蛍光レベルが低いことが明らかであって、Ｐ５４６プロモーターが、ＣＢＡプロモーターと比べて、導入遺伝子のより適度な発現レベルをもたらすことを確認した。
【0094】
別のマウスにｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰを注射し、２００日間生存させた。２００日後、動物を犠死させ、全脳矢状切片をＧＦＰ発現について染色した。注射後の２００日目であっても、ＧＦＰ導入遺伝子の広範な発現が、皮質、海馬、中脳、髄質、扁桃体、および小脳を含む脳全体にわたって観察され、さらにＰ５４６プロモーターがＣＮＳ遺伝子治療のための優れた候補であることを示唆する。
【0095】
ＧＦＰ蛍光およびＧＦＰ免疫蛍光染色からのデータは、様々な組織および脳領域からのウエスタンブロットデータによってさらに裏付けられた。ＧＦＰ発現は、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰで処置したマウス（ｎ＝３）でリカーシステムを用いる蛍光ウエスタンブロットで、注射後３週間目に容易に検出可能であったが、一方対照として使用されたＰＢＳ注射動物（ｎ＝１）ではバンドは検出されなかった。導入遺伝子発現は、全脳溶解物、ならびに皮質、髄質、中脳、海馬、小脳および脊髄を含む領域特異的溶解物において明らかであった。
【0096】
さらに、ＧＦＰ発現は、心臓および肝臓でも確認されたが、肺および脾臓はほとんどまたはまったく転写産物発現を示さなかった（図１２）。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＧＦＰによるウエスタンブロットデータは、マウスおよび非ヒト霊長類安全性研究からの発現データと一致し、ここでは非常に類似した発現プロファイルが見られた。さらに、脳および末梢臓器におけるこの発現パターンは、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰで見られるパターンに匹敵する。
【0097】
まとめると、免疫染色およびウエスタンブロット技術を用いたマウスにおける広範な発現分析は、Ｐ５４６プロモーターが、強力なＣＢＡプロモーターと比較してより適度な発現レベルを可能にしながら、神経系全体にわたって非常に類似かつ長期持続的発現プロファイルをもたらすことを示している。
【0098】
実施例４
非ヒト霊長類におけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を用いた発現研究
３．４×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の単回用量を、１×ＰＢＳおよび０．００１％のプルロニックＦ６８中に入れ、３匹の３～４歳のカニクイザルに投与した。
非ヒト霊長類におけるｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を用いた発現研究
３．４×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の単回用量を、１×ＰＢＳおよび０．００１％のプルロニックＦ６８中に入れ、３匹の３～４歳のカニクイザルに投与した。
【0099】
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３を注射したカニクイザルの脳組織における標的化分析では、ヒトＣＬＮ３導入遺伝子に特異的であり、かつ内因性非ヒト霊長類ＣＬＮ３ ＲＮＡと交差反応しないプライマーを使用して、標的をＲＮＡレベルに関して分析した。注射の１２週間後に犠死させたカニクイザルの１匹の様々な脳領域からの組織における逆転写定量的ＰＣＲは、脊髄、皮質、視床、線条体、小脳、および網膜の全てのレベルでヒトＣＬＮ３の発現を明らかにし、さらにＰ５４６プロモーターによるｓｃＡＡＶ９の広範な到達および脳ならびに脊髄全体の転写産物の発現を強調した（図１３）。注目すべきことに、ベクター由来のヒトＣＬＮ３の検出に使用されるプライマーは、内因性のＮＨＰ ＣＬＮ３転写産物と交差反応しない。したがって、ゼロへの正規化は不可能であったため、生理食塩水を注射した動物または注射していない動物に対してではなく１に設定した腰髄に見られるベクター由来ＣＬＮ３ ＲＮＡレベルに対して正規化を行った。アクチンを正規化遺伝子として使用した。
【0100】
まとめると、非ヒト霊長類からのデータは、単回髄腔内腰椎注射後に、ｓｃＡＡＶ９が神経系を通過し、ＣＮＳの広い領域に到達する可能性が高いことを証明している。注目すべきことに、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３の髄腔内注射によって処置された全ての非ヒト霊長類は、治療によく耐え、注射後６ヶ月までのいかなる時点でも、いずれの動物においても有害作用は観察されなかった。
【0101】
実施例５
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子治療の臨床試験
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３は、ＣＬＮ３－バッテン病のヒト患者に髄腔内で送達されるであろう。
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子治療の臨床試験
ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３は、ＣＬＮ３－バッテン病のヒト患者に髄腔内で送達されるであろう。
【0102】
臨床試験用のｓｃＡＡＶは、実施例１に記載されているようにｃＧＭＰ条件下で、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクション法を利用して、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ臨床製造施設により製造される。
【0103】
参加のために選択された患者は、遺伝子型によって決定されるＣＬＮ３疾患と診断された３～１０歳であろう。第１のコホート（ｎ＝３）は、患者あたり６×１０１３ｖｇの総ｓｃＡＡＶの一回限りの遺伝子導入用量を受けるであろう。ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ３は、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８トリス（ｐＨ８．０）中に２０ｍＭで配合され、腰椎嚢のくも膜下棘腔に至る突起間への腰椎穿刺によって挿入された髄腔内カテーテルを介して一度に送達されるであろう。安全性は、臨床的根拠に基づき、かつ安全性ラベルを検討することにより評価されるであろう。遺伝子導入後３０日目の安全性データの検討を可能にするために、各被験者の登録の間に最低４週間があるであろう。安全性の懸念がなければ、注射後１ヶ月で第３の被験者が評価された後、４人の追加被験者の第２のコホートが登録されることになる。コホート２における各被験者（ｎ＝４）は、１．２×１０１４ｖｇの総ｓｃＡＡＶの漸増用量を受けることになる。次の被験者への投与の前に、５つの時点（１、２、７、１４、および２１日目）からの安全性分析の検討ならびにＤＳＭＢ検討を可能にするために、コホート１の完了からコホート２の開始までの間に少なくとも６週間のウィンドウがあるであろう。
【0104】
疾患進行は、ＵＢＤＲＳ尺度（上記の発明を実施するための形態において言及した）および小児生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用する生活の質に対する治療の影響、および長期生存の可能性を用いて測定されるであろう。
【0105】
全ての患者が３年間の試験を完了したときに、有効性に関する一次分析が評価されるであろう。有効性を決定する根拠は、ＣＬＮ３－バッテン病のために特別に開発された確立された統一バッテン病評価尺度（ＵＢＤＲＳ）に基づいて、疾患の安定化または進行の減少によるものであろう。３年間の試験期間の終了時に、ＦＤＡガイダンスに従って、患者を５年間にわたって毎年監視するであろう。
【0106】
実施例６
Ｃｌｎ３Δ７／８マウスモデルでの追加研究
実施例で記載されているように、２匹の野生型（ＷＴ）およびＣｌｎ３Δ７／８マウスに、生後１日目に脳室内（ＩＣＶ）注射を介してＰＢＳ、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３、またはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３遺伝子治療のいずれかを投与した。この研究では、マウスに５ｘ１０１０ｖｇ／動物（４μＬ容量）を投与した。
Ｃｌｎ３Δ７／８マウスモデルでの追加研究
実施例で記載されているように、２匹の野生型（ＷＴ）およびＣｌｎ３Δ７／８マウスに、生後１日目に脳室内（ＩＣＶ）注射を介してＰＢＳ、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３、またはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３遺伝子治療のいずれかを投与した。この研究では、マウスに５ｘ１０１０ｖｇ／動物（４μＬ容量）を投与した。
【0107】
注射の方法とタイミングは、ＣＬＮ３－バッテン病患者に関連する特定のニューロン集団をターゲットにするように選択された。動物は、手順中に低体温によって鎮静され、完全に回復するまで監視され、以前に記載されたように遺伝子型が決定された（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８、およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＴＪ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ １８２５７：Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ Ａｓｓａｙを参照されたい）。
【0108】
統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行い、詳細は図の凡例に記載されている。一般に、二元配置分散分析は適切な事後検定で使用され、外れ値はＲＯＵＴ法で除去された（Ｑ＝０．１～１％）。必要に応じて、対応のないｔ検定を使用した。
【0109】
脳におけるｈＣＬＮ３転写産物の発現と分布
定量的ＰＣＲを実施して、処置したマウスの脳内のｈＣＬＮ３転写産物を測定した。全ＲＮＡおよびｃＤＮＡは以前に記載されたように生成された（Ｃａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１９を参照されたい）。２＾－デルタ－デルタＣｔ法を使用して、ハウスキーピング対照としてＧａｐｄｈに正規化されたヒトＣＬＮ３転写産物の相対的な遺伝子発現を計算した。ｈＣＬＮ３フォワードプライマー配列：ＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号１１）、ｈＣＬＮ３リバースプライマー配列：ＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧ（配列番号１２）。
定量的ＰＣＲを実施して、処置したマウスの脳内のｈＣＬＮ３転写産物を測定した。全ＲＮＡおよびｃＤＮＡは以前に記載されたように生成された（Ｃａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１９を参照されたい）。２＾－デルタ－デルタＣｔ法を使用して、ハウスキーピング対照としてＧａｐｄｈに正規化されたヒトＣＬＮ３転写産物の相対的な遺伝子発現を計算した。ｈＣＬＮ３フォワードプライマー配列：ＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号１１）、ｈＣＬＮ３リバースプライマー配列：ＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧ（配列番号１２）。
【0110】
図１６に示すように、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置により、２４ヶ月齢までのｑＰＣＲで測定した場合、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの大脳皮質および脊髄におけるｈＣＬＮ３転写産物の発現レベルが上昇した。したがって、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３の単回の新生児ＩＣＶ投与は、ｈＣＬＮ３の持続的かつ十分に標的化された発現をもたらす。
【0111】
加えて、ＲＮＡｓｃｏｐｅを実行して、処置したマウスの脳内のＣＬＮ３転写産物を検出した。マウスをＣＯ２安楽死させ、心臓をＰＢＳで灌流した。脳を収集し、１ｍｍの矢状脳ブロックに配置した。脳を正中線と正中線の３ｍｍ右でスライスした。３ｍｍの矢状片を－５０°Ｃのイソペンタンで瞬間冷凍し、１６μｍのクリオスタットで切片化し、スライド上に配置した。次に、スライドをメーカーが推奨するプロトコル（ＡＣＤＢｉｏマニュアル３２０２９３および３２０５１３）に従って処理した。切片は、ヒト特異的ＣＬＮ３プローブ（ＡＣＤＢｉｏカタログ番号４７０２４１）で標識され、これはマウスとヒトＣＬＮ３の間の相同性がほとんどないＣＬＮ３遺伝子の領域（領域６３１－１７１１）の２０個のダブルＺペアで構成されていた。スライドを、ｈＣＬＮ３プローブに５５０ｎｍフルオロフォアをタグ付けしたＡｍｐ４－ＦＬ－ＡｌｔＣを使用して、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ（ＡＣＤＢｉｏカタログ番号３２０８５０）で蛍光標識し、スライドをＤＡＰＩで対比染色して核を標識した。組織切片を、退色防止封入剤（Ｄａｋｏ ｆａｒａｍｏｕｎｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してカバースリップの下のスライドにマウントした。スライドを、画像化前に暗所に保管した。切片を、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウェア（ｖ４．２０）を備えたＮｉｋｏｎ ＮｉＥ顕微鏡を使用して画像化および分析した。
【0112】
図１７に示すように、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置により、２４ヶ月齢までのＲＮＡｓｃｏｐｅ（赤色蛍光）で測定した場合、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの脳全体に安定したｈＣＬＮ３転写産物が生成する。定量的ＰＣＴおよびＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイにより、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６の単回の、新生児のＩＣＶ投与が、ｈＣＬＮ３の持続的かつ十分に標的化された発現をもたらすことを確認する。ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子治療は、２４ヶ月齢までの脳および脊髄全体でｈＣＬＮ３遺伝子発現を増加させる。
【0113】
古典的なバッテン病の病理
ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３の投与が、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの脳における古典的なバッテン病の病状を予防したかどうかを判断するために、ＩＣＶ投与後に貯蔵物質の蓄積（ＡＳＭ）とグリア反応性を調べた。野生型およびＣＬＮ３Δ７／８マウスを、ＣＯ２安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、組織を４％ＰＦＡで固定した。固定された脳を、５０μｍのビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００８）で切片化した。切片を、標準的な蛍光抗体法およびＤＡＢ染色プロトコルで処理した。一次抗体には、抗ＣＤ６８（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１９５７、１：２０００）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、Ｚ０３３４、１：８０００）、および抗ＡＴＰシンターゼサブユニットＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１２４３、１：１０００）が含まれていた。二次抗体には、抗ラットおよび抗ウサギビオチン化が含まれていた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＢＡ－９４００、１：２０００）。切片を、２０倍のＡｐｅｒｉｏスライド走査型顕微鏡を使用して画像化および分析した。画像を、視床のＶＰＭ／ＶＰＬと体性感覚皮質の２／３層から抽出し、各動物の複数の組織から複数の画像が撮影された。免疫反応性の総面積は、ＩｍａｇｅＪの閾値分析を使用して定量化した。
ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３の投与が、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの脳における古典的なバッテン病の病状を予防したかどうかを判断するために、ＩＣＶ投与後に貯蔵物質の蓄積（ＡＳＭ）とグリア反応性を調べた。野生型およびＣＬＮ３Δ７／８マウスを、ＣＯ２安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、組織を４％ＰＦＡで固定した。固定された脳を、５０μｍのビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００８）で切片化した。切片を、標準的な蛍光抗体法およびＤＡＢ染色プロトコルで処理した。一次抗体には、抗ＣＤ６８（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１９５７、１：２０００）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、Ｚ０３３４、１：８０００）、および抗ＡＴＰシンターゼサブユニットＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１２４３、１：１０００）が含まれていた。二次抗体には、抗ラットおよび抗ウサギビオチン化が含まれていた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＢＡ－９４００、１：２０００）。切片を、２０倍のＡｐｅｒｉｏスライド走査型顕微鏡を使用して画像化および分析した。画像を、視床のＶＰＭ／ＶＰＬと体性感覚皮質の２／３層から抽出し、各動物の複数の組織から複数の画像が撮影された。免疫反応性の総面積は、ＩｍａｇｅＪの閾値分析を使用して定量化した。
【0114】
図１８は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８マウスの脳の２つの領域でＡＳＭの蓄積を防止および減少することを示している。図１９は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８マウスの脳の２つの領域で、おおむね大量のサブユニットＣの蓄積（ＡＳＭの構成要素）を防止したことを示している。図２０は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８の脳の２つの領域で星状細胞の活性化（ＧＦＡＰ＋）をおおむね防止することを示している。図２１は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置が、時点に応じて、２４ヶ月齢までのＣｌｎ３Δ７／８の脳の２つの領域でミクログリアの活性化（ＣＤ６８＋）を防止することを示している。したがって、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３は、記憶物質の蓄積やグリア反応性を含む、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの脳における古典的なバッテン病の病状を予防した。図２２は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３処置が、６ヶ月齢および１２月齢のＣｌｎ３Δ７／８マウスの様々なバッテン病の病状を予防するのに同様に効果的であることを示している。
【0115】
加えて、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３による処置は、ＩＣＶ投与後２４ヶ月まで測定した場合、赤血球（ＣＢＣ）異常または白血球（ＷＢＣ）異常を引き起こさなかった。図２３は、次のＣＢＣパラメーターのデータを提供する：ＲＢＣ数、ヘモグロビン、ヘマトクリット値、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＲＢＣ分布、血小板数、および平均血小板容積。図２４は、次のＷＢＣパラメーターのデータを提供する：ＷＢＣ数、リンパ球数パーセント、単球パーセント、顆粒パーセント。
【0116】
ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３遺伝子治療は、ＡＳＭ、サブユニットＣ、ＧＦＡＰおよびＣＤ６８の発現を含む、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの２４ヶ月齢までのＣＬＮ３－バッテン病の細胞の特徴の多くを予防する。加えて、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３遺伝子治療は、ＡＳＭ、サブユニットＣ、ＧＦＡＰ、ＣＤ６８の発現など、Ｃｌｎ３Δ７／８マウスの２４ヶ月齢までのＣＬＮ３－バッテン病の細胞の特徴の多くを予防する。
【0117】
実施例７
Ｃｌｎ３Δ７／８マウスモデルにおける性に基づく組織病理学的分析
実施例２に記載されるように、野生型（ＷＴ）およびＣｌｎ３Δ７／８マウスに、生後１日目に脳室内（ＩＣＶ）注射を介して、ＰＢＳ、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３、またはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３遺伝子治療のいずれかを投与した。この研究では、マウスに５ｘ１０１０ｖｇ／動物（４μＬ容量）を投与した。
Ｃｌｎ３Δ７／８マウスモデルにおける性に基づく組織病理学的分析
実施例２に記載されるように、野生型（ＷＴ）およびＣｌｎ３Δ７／８マウスに、生後１日目に脳室内（ＩＣＶ）注射を介して、ＰＢＳ、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３、またはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ３遺伝子治療のいずれかを投与した。この研究では、マウスに５ｘ１０１０ｖｇ／動物（４μＬ容量）を投与した。
【0118】
野生型およびＣＬＮ３Δ７／８マウスを、ＣＯ２安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、組織を４％ＰＦＡで固定した。固定された脳を、５０μｍのビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００８）で切片化した。切片を、標準的な蛍光抗体法およびＤＡＢ染色プロトコルで処理した。一次抗体には、抗ＣＤ６８（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１９５７、１：２０００）および抗ＡＴＰシンターゼサブユニットＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１２４３、１：１０００）が含まれていた。二次抗体には、抗ラットおよび抗ウサギビオチン化が含まれていた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＢＡ－９４００、１：２０００）。切片を、２０倍のＡｐｅｒｉｏスライド走査型顕微鏡を使用して画像化および分析した。画像は次の領域から抽出された：海馬のＣＡ２／ＣＡ３領域、海馬歯状回の多形層、扁桃体基底外側部、手綱、視床網様体核、視床後外側腹側核／後内側腹側核、視床背内側および内側下領域、梨状皮質、脳梁膨大後部皮質、および体性感覚皮質の２／３層で、各動物の複数の組織から複数の画像が撮影されている。免疫反応性の総面積は、ＩｍａｇｅＪの閾値分析を使用して定量化した。
【0119】
図２５は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、１２ヶ月齢で性別に基づいて、海馬のＣＡ３領域に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。１２ヶ月齢で、処置された雌のＣｌｎ３Δ７／８マウスは野生型よりも有意に多くのサブＣを蓄積したが、処置された雄におけるサブＣ蓄積は野生型と異ならなかった。ただし、この違いは、分析された他のどの時点でも見られなかった。
【0120】
図２６は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、複数の時点で性別に基づいて、梨状皮質（ＰＩＲＣ）でわずかに異なるレベルのサブＣ蓄積を示したことを示す。１２ヶ月齢で、処置された雌の変異体ＣＬＮ３マウスは野生型よりも有意に多くのサブＣを蓄積し、ＡＡＶ処置はＰＢＳ変異体レベル未満の蓄積を妨げなかったが、処置された雄のサブＣ蓄積は野生型と異ならなかった。しかしながら、この相関関係は分析された他のどの時点でも見られず、処置された雌のサブＣ蓄積が野生型と有意差がなく、未処置の変異マウスよりも有意に低かった１８ヶ月齢の所見と一致しなかった。１８ヶ月齢で、処置を受けた雄のサブＣ蓄積は、ＷＴレベルよりも大幅に高くなる。
【0121】
図２７は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスが、複数の時点の性別に基づいて、網様視床核（ＲＴＮ）で異なるレベルのサブＣ蓄積を示したことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌の変異体ＣＬＮ３マウスは野生型よりも有意に多くのサブＣを蓄積したが、処置された雄におけるサブＣの蓄積は野生型と異ならなかった。１２ヶ月齢で、処置された雄は野生型レベルのままであったが、処置された雌は野生型マウスと未処置の変異マウスの両方よりも有意に多くのサブＣを有している。処置された雌の変異体と未処置の変異体との間のこの違いは１８ヶ月では存在せず、サブＣはＷＴよりも有意に高かったが、雄と雌の両方で未処置の変異体よりも有意に低かった。
【0122】
図２８は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、体性感覚皮質で異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。１２ヶ月齢では、ＡＡＶによる処置は、未処置の変異体の雌と比較してサブＣ蓄積を減少させなかったが、処置された雄におけるサブＣ蓄積は防止され、野生型と異ならなかった。ただし、この違いは、分析された他のどの時点でも見られなかった。
【0123】
図２９は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、視床のＶＰＭ／ＶＰＬに異なるレベルのサブＣ蓄積を示したことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌は未処置の変異体の雌よりも有意に少ないサブＣを蓄積したが、野生型の雌よりも有意に多かった。この違いは１２ヶ月から１８ヶ月まで続いたが、分析したどの時点でも野生型と処置された雄との間に違いはなかった。
【0124】
図３０は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、１２ヶ月で性別に基づいて、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）で異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。１２ヶ月齢で、ＡＡＶは処置された雌の動物におけるサブＣ蓄積を有意に防止しなかった。１８ヶ月の時点で、処置された雌のサブＣ蓄積は野生型よりも有意に高いままであったが、未処置の雌よりも低かった。１８ヶ月までに、処置された雄は、野生型の雄よりも有意に多くのサブＣを有し始め、雌群で見られたものと同様の結果になった。
【0125】
図３１は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、歯状回（ＤＧ）の多形層に異なるレベルのサブＣ蓄積を示したことを示す。１２ヶ月齢で、処置された雌は、野生型の雌および未処置の変異体の雌の両方よりも有意に多くのサブＣを蓄積したように見えた。生の画像（図示せず）は、閾値処理の結果に影響を与える可能性のある歯状回の多形層を取り囲む暗くなった顆粒細胞層を明らかにした。この暗い部分は、この群にのみ存在し、１２ヶ月の時点でのみ存在した。この増加は、雌では１８ヶ月で見られなくなったが、処置された雄では１８ヶ月で、野生型雄よりも多くのサブＣ蓄積を示し始めた。
【0126】
図３２は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置マウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、手綱に異なるレベルのサブＣ蓄積を示すことを示す。１２ヶ月齢で、処置された雌は未処置の変異体の雌よりも有意に少ないサブＣを蓄積したが、野生型の雌よりも有意に多かった。この違いは１８ヶ月でも見られたが、分析したどの時点でも野生型と処置された雄との間に違いはなかった。
【0127】
図３３は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、１２ヶ月および１８ヶ月で性別に基づいて、背内側核に異なるレベルのサブＣ蓄積を示したことを示す。１２ヶ月齢で、処置された雌は未処置の変異体の雌よりも有意に少ないサブＣを蓄積したが、野生型の雌よりも有意に多かった。この違いは１８ヶ月でも見られたが、分析したどの時点でも野生型と処置された雄との間に違いはなかった。
【0128】
図３４は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、性別に基づいて脳梁膨大後部皮質（ＲＳＣ）のサブＣ蓄積レベルに差がないことを示す。分析したどの時点でも、野生型と処置された雄との間に違いはなかった。
【0129】
図３５は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、６ヶ月で性別に基づいて、体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ）で異なるレベルの活性化ミクログリア（ＣＤ６８＋）を示したことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌は野生型および未処置の雌と比較してミクログリアの活性化が増加したが、処置された雄は野生型よりも高いが未処置よりは低い。１２ヶ月齢と１８ヶ月齢で性差は見られなかった。
【0130】
図３６は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、性別に基づいてＶＰＭ－ＶＰＬ、視床で異なるレベルのミクログリア活性化を示すことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌は野生型および未処置の雌と比較してミクログリアの活性化が増加するが、処置された雄は野生型よりも高いが未処置よりは低い。この違いは１２ヶ月においても見られる。同様のことが１８ヶ月の雌群でも見られるが、処置された雄はこの時点で野生型と有意差はなかった。
【0131】
図３７は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３マウスが、性別に基づいて背内側核（ＭＤ）で異なるレベルの活性化ミクログリア（ＣＤ６８＋）を示すことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌は野生型および未処置の雌と比較してミクログリアの活性化が増加し、処置された雄は野生型よりも高かったが、未処置の雄と異ならなかった。１２ヶ月齢および１８ヶ月齢の両方で、処置された雄は野生型よりもミクログリアの活性化が高く、未処置の雄よりも活性化が低かったが、処置は雌には影響を与えなかったようである。
【0132】
図３８は、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３で処置されたマウスが、性別に基づいて、内側下核（ＳＭ）で異なるレベルの活性化ミクログリアを示したことを示す。６ヶ月齢で、処置された雌は野生型および未処置の雌と比較してミクログリアの活性化が増加したが、処置された雄は未処置の雄と有意差はなく、どちらも野生型よりも活性が高かった。１２ヶ月までに、処置はどちらの性においてもミクログリアの活性化の程度に影響を与えないようであった。１８ヶ月までに、処置された雄はミクログリアの活性化が野生型レベルに減少したが、処置された雌は未処置の雌と同程度に活性化されたままであった。
【0133】
前述のデータは、ｓｃＡＡＶ９．ｐ５４６．ＣＬＮ３処置動物が、Ｃｌｎ３Δ７／８マウス脳のいくつかの領域でＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積およびＣＤ６８＋ミクログリアの活性化に関し性別に基づいて病状が異なることを示す。性別による病理学的差異の違いは、雌特有のものであるように思われる。１２ヶ月の時点で、違いの大部分が最も一貫して見られ、多くは１２ヶ月でのみ示され、１８ヶ月で示されなくなる。
【0134】
本明細書では本発明の好ましい実施形態を示し、記載してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思い付くであろう。本明細書に記載の実施形態に対する様々な代替形態を採用してもよいことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
【0135】
本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】