特表 2022-519651 織布細胞培養基材

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-24

(54)【発明の名称】織布細胞培養基材

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/04 20060101AFI20220316BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20220316BHJP

【ＦＩ】

C12M3/04 A

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021545834

(86)(22)【出願日】2020-02-04

(85)【翻訳文提出日】2021-10-01

(86)【国際出願番号】 US2020016576

(87)【国際公開番号】W WO2020163329

(87)【国際公開日】2020-08-13

(31)【優先権主張番号】62/801,325

(32)【優先日】2019-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/910,696

(32)【優先日】2019-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】397068274

【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100123652

【弁理士】

【氏名又は名称】坂野 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100175042

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 秀明

(72)【発明者】

【氏名】フェリー，アン ミージン

(72)【発明者】

【氏名】ゴラール，ヴァシリー ニコラエヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ロメオ，ロリ イー

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC02

4B029CC10

4B029CC11

4B029DC07

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC42

4B065CA44

4B065CA45

(57)【要約】

基材を有する細胞培養マトリクスが提供され、上記基材は：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さ；及び上記基材内に形成された、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口を備える。上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とし、また細胞播種、増殖、及び培養のための、均一かつ効率的で拡張可能なマトリクスを提供する。上記基材は、細胞のための高い表面積／体積比と、マトリクスを通る良好な流体流とを提供する、織布ポリマーメッシュ材料から形成できる。上記細胞培養マトリクスを組み込んだバイオリアクターシステム、及び関連する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養マトリクスであって、
前記細胞培養マトリクスは：
多層基材であって、上記多層基材の各基材層は、第１の側部と、前記第１の側部の反対側の第２の側部と、前記第１の側部と前記第２の側部とを隔てる厚さと、前記基材層に形成されて、前記基材層の前記厚さを通過する、複数の開口とを備える、基材
を含み、
前記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、前記基材の前記厚さを通る流れを可能とするように構成される、細胞培養マトリクス。

【請求項2】

前記多層基材は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項3】

前記多層基材は、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項4】

前記多層基材は、１つ以上の繊維を含む前記織布メッシュを含む、請求項３に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項5】

前記１つ以上の繊維は、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの繊維直径を有し；
前記複数の開口は、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、請求項４に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項6】

前記複数の開口は規則的なパターンに配列されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項7】

前記多層基材は、少なくとも１つの第１の基材層及び少なくとも１つの第２の基材層を備え、
前記第１の基材層は、前記第２の基材層に対して所定の位置合わせを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項8】

前記多層基材は、積層構成の複数の前記基材層を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項9】

前記多層基材は、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の前記基材層を含み、前記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項10】

前記多層基材は官能化表面を備え、前記官能化表面は、前記ポリマーメッシュ材料に対する前記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項11】

前記細胞培養マトリクスは、前記ポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを備え、前記コーティングは、前記付着細胞の付着を促進するよう構成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。

【請求項12】

前記官能化表面はプラズマ処理される、請求項１１に記載の細胞培養マトリクス。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、米国特許法第１２０条の下で、２０１９年１０月４日出願の米国仮特許出願第６２／９１０，６９６号、及び２０１９年２月５日出願の米国仮特許出願第６２／８０１，３２５号の優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容は依拠され、その全体が参照により本出願に援用される。

【技術分野】

【0002】

本開示は一般に、細胞を培養するための基材、並びに細胞を培養するためのシステム及び方法に関する。特に本開示は、細胞培養基材、上記基材が組み込まれたバイオリアクターシステム、及び上記基材を用いて細胞を培養する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

バイオプロセッシング業界では、ホルモン、酵素、抗体、ワクチン、及び細胞療法の製造を目的として、細胞の大規模培養が実施される。細胞及び遺伝子療法市場は急速に成長しており、有望な治療が臨床試験に移され、そして迅速に商業化に向かっている。しかしながら、１回の細胞療法の実施には、数十億個の細胞及び数兆個のウイルスが必要となる場合がある。従って、大量の細胞産物を短時間で提供できることは、臨床的成功のために重要である。

【0004】

バイオプロセッシングで使用される細胞の大部分は足場依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）であり、これは即ち、これらの細胞が、成長して機能するために、付着する表面を必要とすることを意味している。伝統的に、付着細胞の培養は、Ｔフラスコ、ペトリ皿、細胞ファクトリー、セルスタック容器、ローラーボトル、及びＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器といった多数の容器フォーマットのうちの１つに組み込まれた、２次元（２Ｄ）細胞付着表面上で実施される。これらのアプローチは、療法又は細胞の大規模製造を可能とするために十分な高さの細胞密度を達成するのが困難であることを含む、重大な欠点を有する場合がある。

【0005】

培養された細胞の体積密度を高めるために、代替的な方法が提案されている。上記代替的な方法としては、撹拌タンク内で実施されるマイクロキャリア培養が挙げられる。このアプローチでは、マイクロキャリアの表面に付着させた細胞を、一定のせん断応力に供し、増殖及び培養性能に大きな影響を与える。高密度細胞培養システムの別の例は、中空繊維バイオリアクターであり、ここでは、細胞が、繊維間の空間内で増殖するにつれて、巨大な３次元凝集体を形成できる。しかしながら、細胞の成長及びパフォーマンスは、栄養の不足によって大きく阻害される。この問題を軽減するために、これらのバイオリアクターは小型化されており、大規模製造に適していない。

【0006】

足場依存性細胞の高密度培養システムの別の例は、充填層（ｐａｃｋｅｄ‐ｂｅｄ）バイオリアクターシステムである。このタイプのバイオリアクターでは、細胞基材を用いて、付着細胞の付着のための表面を提供する。培地は上記表面に沿って、又は半多孔質基材を通って灌流され、これによって、細胞成長に必要な栄養素及び酸素が供給される。例えば、細胞を捕捉するための支持体又はマトリクスシステムの充填層を内包する充填層バイオリアクターシステムが、既に特許文献１～３に開示されている。充填層マトリクスは通常、基材としての多孔質粒子、又はポリマーの不織布マイクロファイバで作製される。このようなバイオリアクターは、再循環フロースルーバイオリアクターとして機能する。このようなバイオリアクターの重要な問題の１つは、充填層内部の細胞の分布の不均一性である。例えば充填層は、細胞を主に入口領域で捕捉する深さフィルタとして機能して、接種ステップ中に細胞分布の勾配を生み出す。更に、ランダムな繊維の充填によって、充填層の断面の流れ抵抗及び細胞捕捉効率は均一でなくなる。例えば培地は、細胞充填密度が低い領域を通るときには速く流れ、捕捉される細胞の数が多いことによって抵抗が高くなる領域を通るときにはゆっくりと流れる。これにより、栄養素及び酸素が、細胞体積密度が低い領域には効率的に送達され、かつ細胞密度が高い領域が最適以下の培養条件のまま保持される、チャネリング効果が生成される。

【0007】

従来技術で開示されている充填層システムの別の重要な欠点は、培養プロセスの終了時に無傷の生存細胞を効率的に採取できないことである。最終産物が細胞である場合、又はある容器内で細胞集団を成長させた後、更なる集団の成長のために別の容器に移す「シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）」の一部として、バイオリアクターを使用する場合、細胞の採取は重要である。特許文献４は、細胞採取ステップ中の充填層からの細胞の回収の効率を改善するための、バイオリアクターの設計を開示している。これは、充填層マトリクスを緩め、充填層粒子を揺動又は撹拌して、多孔質マトリクスを衝突させることにより、細胞を分離させることに基づいている。しかしながら、このアプローチは面倒であり、また重大な細胞損傷を引き起こして、全体的な細胞生存率を低下させる恐れがある。

【0008】

現在市販されている充填層バイオリアクターの一例は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のｉＣｅｌｌｉｓ（登録商標）である。ｉＣｅｌｌｉｓは、不織布構成のランダムな配向の繊維からなる細胞基材材料の小さなストリップを使用する。これらのストリップを容器に詰めて、充填層を生成する。しかしながら、市場にある同様のソリューションと同様に、このタイプの充填層基材には欠点がある。具体的には、基材ストリップの不均一な充填により、充填層内に視認可能なチャネルが形成され、これは、充填層を通る優先的かつ不均一な培地流及び栄養素の分布につながる。ｉＣｅｌｌｉｓの研究には、「細胞の個数が固定床の上部から底部に向かって増大する、細胞の全体的に不均質な分布」、並びに「細胞成長及び生産の制限につながる、栄養素の勾配」が記載されており、これらは全て、「トランスフェクション効率を損なう可能性がある、細胞の不均等な分布」につながる（非特許文献１）。また研究には、充填層の揺動は分散を改善させることができるが、他の欠点も有することが記載されている（即ち「接種及びトランスフェクション中の、より良好な分散のために必要な揺動は、せん断応力の増大を誘発することになり、これは細胞生存率の低下につながる」；同上）。別の研究には、ｉＣｅｌｌｉｓに関して、細胞の不均一な分布により、バイオマスセンサを用いた細胞集団の監視が困難になることが記載されている（「…細胞が不均一に分布していると、トップキャリアの細胞からのバイオマスシグナルは、バイオリアクターの全体像を示さない可能性がある」；非特許文献２）。

【0009】

更に、基材ストリップ内での繊維のランダムな配置、及びｉＣｅｌｌｉｓの充填層毎のストリップの充填のばらつきにより、基材が培養毎に変動するため、顧客が細胞培養の性能を予測するのが困難になる場合がある。更に、ｉＣｅｌｌｉｓの充填された基材により、細胞の効率的な採取が極めて困難又は不可能になる。というのは、細胞が充填層に捕捉されると考えられるためである。

【0010】

ローラーボトルは、取り扱いが容易であること、及び付着面上で細胞を監視できることといったいくつかの利点を有する。しかしながら、製造の観点からすると、主な欠点は、ローラーボトル構成が大面積の製造フロアスペースを占有するにもかかわらず、表面積／体積比が小さいことである。ローラーボトルフォーマットにおいて付着細胞が利用できる表面積を増大させるために、様々なアプローチが使用されてきた。いくつかの解決策が市販製品において実装されているが、ローラーボトルの生産性を更に向上させるための改善の余地がある。伝統的に、ローラーボトルは、吹込み成形プロセスによって単一の構造体として製造される。このような製造の単純さにより、ローラーボトルはバイオプロセッシング産業において経済的な面で利用可能となっている。細胞培養のために利用可能な表面積を増大させるための、いくつかのローラーボトルの修正は、製造プロセスを変更せずに達成可能であるが、修正後のローラーボトルの表面積の増大はわずかしか得られない。ローラーボトルの設計の他の修正により、製造プロセスは大幅に複雑になり、これにより、ローラーボトルがバイオプロセッシング産業において経済的な面で利用できなくなる。従って、ローラーボトルの製造に同一の吹込み成形プロセスを使用しながら、表面積及びバイオプロセッシングの生産性の増大をローラーボトルに提供することが望ましい。

【0011】

初期段階の臨床試験のためのウイルスベクターの製造は、既存のプラットフォームで可能であるが、後期の商業的製造規模に到達するためには、より多数の高品質の製品を製造できるプラットフォームが必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許第４，８３３，０８３号

【特許文献2】米国特許第５，５０１，９７１号

【特許文献3】米国特許第５，５１０，２６２号

【特許文献4】米国特許第９，２７３，２７８号

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｒａｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ２０１６， １１， ２９０‐２９７

【非特許文献2】Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｉｘｅｄ Ｂｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｓｃａｌｅ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ． ２６， Ｎｏ． ８， ２０１５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

細胞分布が均一であり、また採取が容易であり、かつ採取量が増大した、高密度フォーマットでの細胞の培養を可能とする、細胞培養マトリクス、システム、及び方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示のある実施形態によると、細胞培養マトリクスが提供される。上記細胞培養マトリクスは基材を含み、上記基材は：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さ；及び上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口を有する。上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするように構成される。上記基材は、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つとすることができる。上記基材は規則的で整然とした構造を有し、細胞の付着、成長、及び最終的な細胞の放出のための表面を提供する。

【0016】

本開示のある実施形態によると、細胞培養のためのバイオリアクターシステムが提供され、上記システムは：少なくとも１つのリザーバを有する、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスを含み、上記細胞培養マトリクスは、細胞を付着させるために構成された表面を有する複数の織り合わされた繊維を有する、織布基材を含む。

【0017】

１つ以上の実施形態によると、細胞培養システムが提供され、上記システムは、バイオリアクター容器と、上記バイオリアクター容器内に配置され、細胞を培養するために構成された、細胞培養マトリクスとを含む。上記細胞培養マトリクスは基材を含み、上記基材は：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さ；及び上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口を備え、上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするように構成される。

【0018】

１つ以上の実施形態によると、細胞を培養するためのバイオリアクターシステムが提供される。上記システムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを有する、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを含む。上記細胞培養マトリクスは、複数の織布基材を有し、各上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を含む。上記バイオリアクターシステムは、材料を、上記少なくとも１つのリザーバを通して、上記第１の端部から上記第２の端部への流れ方向に流すように構成され、また上記複数の織布基材は、各上記織布基材が他の各上記織布基材に対して略平行となり、また上記流れ方向に対して略垂直となるように、積層される。

【0019】

１つ以上の実施形態によると、細胞を培養するためのバイオリアクターシステムが提供される。上記システムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを有する、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを含み、上記細胞培養マトリクスは、複数の織布基材を含み、各上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を有する。上記バイオリアクターシステムは、材料を、上記少なくとも１つのリザーバを通して、上記第１の端部から上記第２の端部への流れ方向に流すように構成され、また上記複数の織布基材は、各上記織布基材が他の各上記織布基材に対して略平行となり、また上記流れ方向に対して略平行となるように、積層される。

【0020】

１つ以上の実施形態によると、細胞を培養するためのバイオリアクターシステムが提供される。上記システムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを有する、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを含む。上記細胞培養マトリクスは、織布基材を含み、上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を備え、上記織布基材は、上記少なくとも１つのリザーバ内に、巻かれた構成で配置され、これにより、円筒状細胞培養マトリクスが提供され、上記織布基材の表面が、上記円筒状細胞培養マトリクスの長手方向軸に対して平行となる。

【0021】

別の実施形態によると、バイオリアクター内で細胞を培養する方法が提供される。上記方法は、中に細胞培養チャンバを有するバイオリアクター容器と、上記細胞培養チャンバ内に配置された細胞培養マトリクスとを提供するステップを含む。上記細胞培養マトリクスは、上記細胞培養マトリクス上で細胞を培養するために提供される。上記細胞培養マトリクスは基材を含み、上記基材は：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さ；及び上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口を有する。上記方法は更に：細胞を上記細胞培養マトリクス上に播種するステップ；上記細胞を上記細胞培養マトリクス上で培養するステップ；及び上記細胞を培養する上記ステップの産物を採取するステップを含む。上記基材の上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】本開示の１つ以上の実施形態による、細胞培養基材の３次元モデルの斜視図

【図1B】図１Ａの基材の２次元平面図

【図1C】図１Ｂの基材の先Ａ‐Ａに沿った断面図

【図2A】いくつかの実施形態による細胞培養基材の例

【図2B】いくつかの実施形態による細胞培養基材の例

【図2C】いくつかの実施形態による細胞培養基材の例

【図3A】１つ以上の実施形態による多層細胞培養基材の斜視図

【図3B】１つ以上の実施形態による多層細胞培養基材の平面図

【図4】１つ以上の実施形態による、図３Ｂの多層細胞培養基材の線Ｂ‐Ｂに沿った断面図

【図5】１つ以上の実施形態による、図４の多層細胞培養基材の線Ｃ‐Ｃに沿った断面図

【図6】１つ以上の実施形態による細胞培養システムの概略図

【図7】１つ以上の実施形態による細胞培養システムの概略図

【図8】１つ以上の実施形態による、巻かれた円筒構成の細胞培養マトリクス

【図9】１つ以上の実施形態による、巻かれた円筒構成の細胞培養マトリクスを組み込んだ細胞培養システム

【図10A】１つ以上の実施形態による細胞培養システムの概略図

【図10B】１つ以上の実施形態による細胞培養システムの詳細概略図

【図11A】１つ以上の実施形態による、細胞培養システムで細胞を培養するためのプロセスフローチャート

【図11B】１つ以上の実施形態による、細胞培養システムの灌流流量を制御するための操作

【図12】１つ以上の実施形態による、細胞培養基材上の染色済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真

【図13A】図１２の基材上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞成長及び増殖データを示すグラフ

【図13B】図１２及び１３Ａからの細胞の生存率を示す棒グラフ

【図14A】静止条件下で播種されたバイオリアクターからの染色済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む細胞培養基材の層の写真

【図14B】細胞タンブリング法（ｃｅｌｌ ｔｕｍｂｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）で播種されたバイオリアクターからの染色済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む細胞培養基材の層の写真

【図15】１つ以上の実施形態による、広がった細胞培養基材を含む細胞培養システムの概略断面図

【図16】１つ以上の実施形態による、多層細胞培養基材を含むローラーボトルスタイルの細胞培養容器の断面図

【図17A】１つ以上の実施形態による、細胞播種中に低い回転速度を用いた、ローラーボトルスタイルの細胞培養システムでの播種の後の、染色済み細胞を含む細胞培養基材の写真

【図17B】１つ以上の実施形態による、細胞播種中に比較的高い回転速度を用いた、ローラーボトルスタイルの細胞培養システムでの播種の後の、染色済み細胞を含む細胞培養基材の写真

【図18A】１つ以上の実施形態による、播種及び成長後であるが細胞の採取の前の、染色済み細胞を含む細胞培養マトリクスからのディスクの写真

【図18B】１つ以上の実施形態による、細胞の採取後の図１８Ａからのディスクの写真

【図19A】ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋと比較した、本開示の実施形態による２つの例に関する、採取された全細胞の実験結果

【図19B】ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋと比較した、本開示の実施形態による２つの例に関する、容器あたりの全ゲノムコピーの実験結果

【図19C】ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋと比較した、本開示の実施形態による２つの例に関する、表面積あたりのゲノムコピーの実験結果

【図20A】本開示の１つ以上の実施形態による、密に充填された構成における、モデル化された多層織布メッシュ細胞培養基材の平面図

【図20B】本開示の１つ以上の実施形態による、図２０Ａの多層織布メッシュ細胞培養基材の側面断面図

【図21A】本開示の１つ以上の実施形態による、緩く充填された構成における、モデル化された多層織布メッシュ細胞培養基材の平面図

【図21B】本開示の１つ以上の実施形態による、図２１Ａの多層織布メッシュ細胞培養基材の側面断面図

【図22A】図２０Ａ及び２０Ｂに示されている点線容積内の、モデル化された空の空間

【図22B】図２１Ａ及び２１Ｂに示されている点線容積内の、モデル化された空の空間

【図23】本開示の１つ以上の実施形態による、表５からの様々なメッシュ試料Ａ～Ｆの写真

【図24】図２３からの織布メッシュ試料Ａ～Ｆの透過率の棒グラフ

【図25】図２３からの試料Ａ～Ｃを用いた圧力降下試験の結果

【図26】本開示の１つ以上の実施形態による、シードトレインプロセスの概略図

【図27A】本開示の１つ以上の実施形態による、織布メッシュ基材を用いたバイオリアクターの流れ均一性モデル

【図27B】図２７Ａの流れ均一性モデルの拡大図

【図28】織布及び不織布細胞培養基材の透過率測定値の棒グラフ

【図29A】流れ方向に対して９０°で整列された不織布メッシュ基材片の周囲の、シミュレーションされた流速

【図29B】流れ方向に対して４５°で整列された不織布メッシュ基材片の周囲の、シミュレーションされた流速

【図30A】全ての近隣の基材片との間に１ｍｍの空隙を有する不織布メッシュ基材片の周囲の、シミュレーションされた流速

【図30B】全ての近隣の基材片との間に１ｍｍの空隙を有する粗織布メッシュの周囲の、シミュレーションされた流速

【図31】異なる複数の細胞培養基材試料の滞留時間分布を測定するための実験設定の概略図

【図32】織布及び不織布細胞培養基材に関して、染料濃度の変化を、滞留時間分布測定中の時間に対して示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0023】

本開示の様々な実施形態を、図面が存在する場合は図面を参照して、詳細に説明する。様々な実施形態に対する言及は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。更に、本明細書に記載のいずれの例は限定的なものではなく、ただ単に、請求対象の発明の多数の可能な実施形態の一部を説明するものである。

【0024】

本開示の実施形態は：細胞培養基材；並びに上記基材を組み込んだ細胞培養又はバイオリアクターシステム；並びに上記基材及びバイオリアクターシステムを用いて細胞を培養する方法に関する。

【0025】

従来の大規模細胞培養バイオリアクターでは、様々なタイプの充填層バイオリアクターが使用されてきた。これらの充填層は通常、付着又は懸濁細胞を保持し、成長及び増殖をサポートするための、多孔質マトリクスを内包する。充填層マトリクスは、高い表面積／体積比を提供し、従って細胞密度を他のシステムよりも高くすることができる。しかしながら、充填層は多くの場合深さフィルタとして機能し、細胞がマトリクスの繊維内に物理的に捕捉されるか、又は引っかかる。よって、充填層を通る細胞接種材料の直線状の流れにより、細胞は充填層内で不均質に分布することになり、これは、充填層の深さ又は幅を通る細胞密度のばらつきにつながる。例えば、細胞密度は、バイオリアクターの入口領域では高く、バイオリアクターの出口に近づくほど有意に低くなる可能性がある。このような充填層内での細胞の不均一な分布は、バイオプロセス製造におけるこのようなバイオリアクターの拡張性及び予測可能性を著しく妨げ、細胞の成長又はウイルスベクターの産生に関して、充填層の単位面積又は体積あたりの効率の低下をもたらす可能性さえある。

【0026】

従来技術において開示されている充填層バイオリアクターに見られる別の問題は、チャネリング効果である。充填された不織布繊維のランダムな性質により、充填層のいずれの所与の断面における局所的な繊維密度は均一にならない。培地は、繊維密度が低い（充填層透過率が高い）領域を迅速に流れ、繊維密度が高い（充填層透過率が低い）領域をはるかにゆっくりと流れる。このようにしてもたらされる、充填層にわたる不均一な培地の灌流は、チャネリング効果を生成し、これは、栄養素及び代謝物の有意な勾配として出現し、全体的な細胞培養及びバイオリアクターの性能に悪影響を及ぼす。培地の灌流が少ない領域に位置する細胞は、飢餓状態となり、栄養素の欠乏又は代謝物中毒によって死に至ることも多い。細胞の採取は、不織布繊維質足場を充填したバイオリアクターを使用する場合に見られる更に別の問題である。充填層が深さフィルタとして機能するため、細胞培養プロセスの最後に放出された細胞は、充填層内に捕捉され、細胞の回収率が極めて低くなる。これにより、生きた細胞が産物となるバイオプロセスにおける、このようなバイオリアクターの利用が制限される。このように、上記不均一性によって、複数のエリアの、流れ及びせん断への曝露が異なるものとなり、これは使用可能な細胞培養エリアを効果的に減少させて、不均一な培養を引き起こし、トランスフェクションの効率及び細胞の放出を妨げる。

【0027】

既存の細胞培養ソリューションのこれらの及びその他の問題に対処するために、本開示の実施形態は、足場依存性細胞のための効率的で高収率の細胞培養、及び細胞産物（例えばタンパク質、抗体、ウイルス粒子）の産生を可能とする、細胞成長基材、上記基材のマトリクス、及び／又は上記基材を用いた充填層システムを提供する。実施形態は、均一な細胞の播種及び培地／栄養素の灌流、並びに効率的な細胞の採取を可能とする、多孔質基材材料の整然とした規則的なアレイから作製された、多孔質細胞培養マトリクスを含む。実施形態はまた、実施形態の均一なパフォーマンスを犠牲にすることなく、細胞の播種及び成長、並びに／又は細胞産物の採取が可能な基材及びバイオリアクターを用いた、プロセス開発規模から完全な生産の規模へ拡張可能な細胞培養ソリューションを可能とする。例えばいくつかの実施形態では、バイオリアクターは、プロセス開発規模から生産の規模へ容易に拡張でき、この生産の規模全体にわたって、基材の単位表面積あたりのウイルスゲノム数（ＶＧ／ｃｍ^２）は同等である。本明細書に記載の実施形態は、採取及び拡張が容易であるため、同一の細胞基材上で複数の規模で細胞集団を成長させるための効率的なシードトレインにおいて使用できる。更に、本明細書に記載の実施形態は、表面積が大きな細胞培養マトリクスを提供し、この大きな表面積は、本明細書に記載の他の特徴と共に、高収率細胞培養ソリューションを可能とする。いくつかの実施形態では、例えば本明細書に記載の細胞培養基材及び／又はバイオリアクターは、バッチあたり１０^１６～１０^１８個のウイルスゲノム（ＶＧ）を産生できる。

【0028】

一実施形態では、マトリクスは、細胞を付着させて増殖させるための、構造的に定義された表面積を備え、これは良好な機械的強度を有し、また充填層又は他のバイオリアクターに組み付けたときに、極めて均一な、相互接続された多数の流体ネットワークを形成する。特定の実施形態では、機械的に安定した非分解性の織布メッシュを、付着細胞の産生をサポートするための基材として使用できる。本明細書で開示される細胞培養マトリクスは、高体積密度フォーマットでの、足場依存性細胞の付着及び増殖をサポートする。このようなマトリクスの均一な細胞播種は、細胞又はバイオリアクターの他の産物の効率的な採取と同様に達成可能である。更に、本開示の実施形態は、接種ステップ中の均一な細胞分布を提供して、本開示のマトリクス上での付着細胞のコンフルエントな単層又は多層を達成するために、細胞培養をサポートし、また、栄養素の拡散の制限及び代謝物濃度の上昇を伴う、大型の及び／又は制御できない３Ｄ細胞凝集物の形成を回避できる。よって、上記マトリクスは、バイオリアクターの動作中の拡散の制限を排除する。更に上記マトリクスにより、バイオリアクターからの細胞の採取を容易かつ効率的にすることができる。１つ以上の実施形態の、構造的に定義されたマトリクスは、バイオリアクターの充填層からの、完全な細胞回収及び一貫した細胞採取を可能にする。

【0029】

いくつかの実施形態によると、治療用タンパク質、抗体、ウイルスワクチン、又はウイルスベクターのバイオプロセッシング産生のためのマトリクスを有するバイオリアクターを用いた、細胞培養の方法も提供される。

【0030】

細胞培養バイオリアクターに使用されている既存の細胞培養基材（即ちランダムに並べられた繊維の不織布基材）とは対照的に、本開示の実施形態は、定義され整然とした構造を有する細胞培養基材を含む。この定義され整然とした構造により、一貫した、また予測可能な、細胞培養結果を実現できる。更に、基材は粗い（ｏｐｅｎ）多孔質構造を有し、これにより、細胞の捕捉が防止され、充填層を通る均一な流れが可能となる。この構造により、細胞の播種、栄養素の送達、細胞の成長、及び細胞の採取を改善できる。１つ以上の特定の実施形態によると、上記マトリクスは、薄いシート状の構造を有する基材材料で形成され、上記構造は、比較的小さな厚さによって隔てられた第１の側部及び第２の側部を有し、従ってシートの厚さは、基材の第１及び第２の側部の幅及び／又は長さに比べて小さい。更に、複数の孔又は開口が、基材の厚さを通って形成される。開口と開口の間の基材材料は、細胞を基材材料の表面に、略２次元（２Ｄ）表面であるかのように接着させることができる一方で、基材材料の周囲の、及び開口を通る、適切な流体流を可能とするような、サイズ及びジオメトリのものである。いくつかの実施形態では、基材はポリマー系材料であり：成形ポリマーシート；厚さを通るようにパンチングされた開口を有するポリマーシート；融合してメッシュ状層となった多数のフィラメント；３Ｄ印刷された基材；又は織られてメッシュ層となった複数のフィラメントとして形成できる。マトリクスの物理的構造は、足場依存性細胞の培養のために、高い表面／体積比を有する。様々な実施形態によると、マトリクスは、均一な細胞の播種及び成長、均一な培地の灌流、並びに効率的な細胞の採取のために、本明細書に記載の特定の方法で、バイオリアクター内に配設又は充填できる。

【0031】

本開示の実施形態は、バッチあたり約１０^１４個超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０^１５個超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０^１６個超のウイルスゲノム、バッチあたり約１０^１７個超のウイルスゲノム、又はバッチあたり約ｇ１０^１６個超のウイルスゲノムという規模でウイルスゲノムを産生できる実用的なサイズの、ウイルスベクタープラットフォームを達成できる。いくつかの実施形態では、産生は、バッチあたり約１０^１５～約１０^１８個以上のウイルスゲノムである。例えばいくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの収量は、バッチあたり約１０^１５～約１０^１６個のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１６～約１０^１９個のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１６～１０^１８個のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１７～約１０^１９個のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１８～約１０^１９個のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１８個以上のウイルスゲノムとすることができる。

【0032】

更に、本開示の実施形態は、細胞培養基材への細胞の付着及び成長だけでなく、培養した細胞の、生存状態での採取も可能にする。生存細胞を採取できないことは、現行のプラットフォームの重大な欠点であり、これにより、生産能力のために十分な数の細胞の構築及び維持が困難となる。本開示の実施形態のある態様によると、８０％～１００％、又は約８５％～約９９％、又は約９０％～約９９％の生存率での、細胞培養基材からの生存細胞の採取が可能である。例えば、採取される細胞のうち、少なくとも８０％が生存しているか、少なくとも８５％が生存しているか、少なくとも９０％が生存しているか、少なくとも９１％が生存しているか、少なくとも９２％が生存しているか、少なくとも９３％が生存しているか、少なくとも９４％が生存しているか、少なくとも９５％が生存しているか、少なくとも９６％が生存しているか、少なくとも９７％が生存しているか、少なくとも９８％が生存しているか、又は少なくとも９９％が生存している。細胞は、例えばトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ、又はＡｃｃｕｔａｓｅを用いて、細胞培養基材から放出させることができる。

【0033】

図１Ａ及び１Ｂはそれぞれ、本開示の１つ以上の実施形態の一例による細胞培養基材１００の、３次元（３Ｄ）斜視図及び二次元（２Ｄ）平面図を示す。細胞培養基材１００は、第１の方向に延在する第１の複数の繊維１０２と、第２の方向に延在する第２の複数の繊維１０４とからなる、織布メッシュ層である。基材１００の織られた繊維は、複数の開口１０６を形成し、これは１つ以上の幅又は直径（例えばＤ_１、Ｄ_２）によって画定できる。上記開口のサイズ及び形状は、織りのタイプ（例えばフィラメントの数、形状、及びサイズ；交差するフィラメント間の角度等）に基づいて変更できる。織布メッシュは、マイクロスケールでは、２次元シート又は層として特性決定できる。しかしながら、織布メッシュを綿密に検査すると、メッシュの交差する繊維の上下による３次元構造が明らかになる。よって図１Ｃに示されているように、織布メッシュ１００の厚さＴは、単一の繊維の厚さ（例えばｔ_１）よりも厚くなり得る。本明細書中で使用される場合、厚さＴは、織布メッシュの第１の側部１０８と第２の側部１１０との間の最大厚さである。理論によって束縛されることを望むものではないが、基材１００の３次元構造は、付着細胞の培養のための大きな表面積を提供し、またメッシュの構造的剛性により、均一な流体流を可能とする、一貫した予測可能な細胞培養マトリクス構造を提供できるため、有利であると考えられる。

【0034】

図１Ｂでは、開口１０６は、対向する繊維１０２の間の距離として定義される直径Ｄ_１、及び対向する繊維１０４の間の距離として定義される直径Ｄ_２を有する。Ｄ_１及びＤ_２は、織りのジオメトリに応じて、等しくても等しくなくてもよい。Ｄ_１及びＤ_２が等しくない場合、大きい方を大直径、小さい方を小直径と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ある開口の直径は、該開口の最も幅が広い部分を指してよい。特段の記載がない限り、本明細書中で使用される開口直径は、ある開口の対向する側部にある平行な繊維の間の距離を指すことになる。

【0035】

複数の繊維１０２のうちのある所与の繊維は、厚さｔ_１を有し、複数の繊維１０４のうちのある所与の繊維は、厚さｔ_２を有する。図１Ａに示されているような円形断面、又は他の３次元断面を有する繊維の場合、厚さｔ_１及びｔ_２は、繊維断面の最大直径又は厚さである。いくつかの実施形態によると、複数の繊維１０２は全て同一の厚さｔ_１を有し、複数の繊維１０４は全て同一の厚さｔ_２を有する。更に、ｔ_１及びｔ_２は等しくてもよい。しかしながら１つ以上の実施形態では、複数の繊維１０２が複数の繊維１０４とは異なる場合等には、ｔ_１及びｔ_２は等しくない。更に、複数の繊維１０２及び複数の繊維１０４がそれぞれ、２つ以上の異なる厚さ（例えばｔ_１ａ、ｔ_１ｂ等、及びｔ_２ａ、ｔ_２ｂ等）の繊維を含んでいてもよい。実施形態によると、厚さｔ_１及びｔ_２は、その上で培養される細胞のサイズに比べて大きいため、繊維は、細胞を基準に考えるとほとんど平坦に近い表面を提供し、これにより、繊維のサイズが小さな（例えば細胞の直径のスケールである）他のいくつかのソリューションに比べて、良好な細胞の付着及び成長を実現できる。図１Ａ～１Ｃに示されているような、織布メッシュの３次元的性質により、細胞の付着及び増殖に利用可能な繊維の２Ｄ表面積は、同等の平坦な２Ｄ表面上での付着のための表面積よりも大きくなる。

【0036】

１つ以上の実施形態では、繊維は：約５０μｍ～約１０００μｍ；約１００μｍ～約７５０μｍ；約１２５μｍ～約６００μｍ；約１５０μｍ～約５００μｍ；約２００μｍ～約４００μｍ；約２００μｍ～約３００μｍ；又は約１５０μｍ～約３００μｍの直径を有してよい。マイクロスケールレベルでは、細胞と比較した場合の繊維のスケール（例えば繊維直径が細胞より大きいこと）により、モノフィラメント繊維の表面が、付着細胞が付着して増殖するための２Ｄ表面に近いものとして提示される。繊維を織って、約１００μｍ×１００μｍ～約１０００μｍ×１０００μｍの開口を有するメッシュとすることができる。いくつかの実施形態では、上記開口は：約５０μｍ～約１０００μｍ；約１００μｍ～約７５０μｍ；約１２５μｍ～約６００μｍ；約１５０μｍ～約５００μｍ；約２００μｍ～約４００μｍ；又は約２００μｍ～約３００μｍの直径を有してよい。フィラメント直径及び開口直径のこれらの範囲は、いくつかの実施形態の例であり、全ての実施形態によるメッシュの、可能な特徴部分のサイズを制限することを意図したものではない。繊維直径と開口直径との組み合わせは、例えば細胞培養マトリクスが多数の隣接するメッシュ層（例えば個別の複数の層の積層体、又は巻かれた１つのメッシュ層）を含む場合に、基材を通る効率的で均一な流体流を提供するように選択される。

【0037】

繊維直径、開口直径、及び織りのタイプ／パターンといった因子は、細胞の付着及び成長に利用可能な表面積を決定することになる。更に、細胞培養マトリクスが、重なった基材の積層体、ロール、又は他の構成を含む場合、細胞培養マトリクスの充填密度は、充填層マトリクスの表面積に影響を及ぼすことになる。充填密度は、基材材料の充填厚さ（例えば１層の基材に必要な空間）によって変化し得る。例えば、細胞培養マトリクスのある積層体が、ある特定の高さを有する場合、この積層体の各層は、該積層体全体の高さを該積層体内の層の数で除算することによって決定される充填厚さを有する、と言うことができる。充填厚さは、繊維直径及び織りに基づいて変化するが、積層体内の隣接する層の位置合わせに基づいても変化し得る。例えば、織られた層の３次元的な性質により、隣接する層が互いに対する位置合わせに基づいて適応できる、ある程度の量の相互連結又は重なりが存在する。第１の位置合わせでは、隣接する層を密に並べることができるが、第２の位置合わせでは、上側の層の最下点と下側の層の最上点とが直接接触している場合等には、隣接する層の重なりがゼロになる場合がある。特定の用途において、細胞培養マトリクスを、（例えば高い透過率が優先される場合に）低い密度での層の充填、又は（例えば基材の表面積の最大化が優先される場合に）高い密度での充填によって、提供することが望ましい場合がある。１つ以上の実施形態によると、充填厚さは：約５０μｍ～約１０００μｍ；約１００μｍ～約７５０μｍ；約１２５μｍ～約６００μｍ；約１５０μｍ～約５００μｍ；約２００μｍ～約４００μｍ；約２００μｍ～約３００μｍとすることができる。

【0038】

上述の構造因子は、細胞培養マトリクスの表面積（単層の細胞培養基材であるか、又は基材の複数の層を有する細胞培養マトリクスであるか）を決定できる。例えばある特定の実施形態では、円形の形状及び６ｃｍの直径を有する織布メッシュ基材の単層は、約６８ｃｍ^２の有効表面積を有することができる。本明細書中で使用される場合、「有効表面積（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）」は、細胞の付着及び成長に利用できる基材材料の部分における、繊維の全表面積である。特段の記載がない限り、「表面積（ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）」に対する言及は、この有効表面積を指す。１つ以上の実施形態によると、直径６ｃｍの単一の織布メッシュ基材層は：約５０ｃｍ^２～約９０ｃｍ^２；約５３ｃｍ^２～約８１ｃｍ^２；約６８ｃｍ^２；約７５ｃｍ^２；又は約８１ｃｍ^２の有効表面積を有してよい。これらの有効表面積の範囲は単なる例として提供されており、いくつかの実施形態は、異なる有効表面積を有してよい。細胞培養マトリクスはまた、本明細書中の実施例において記載されるように、多孔率に関して特性決定することもできる。

【0039】

基材メッシュは、例えばポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、酸化ポリエチレン、ポリピロール、及び酸化ポリプロピレンを含む、細胞培養用途に適合したポリマー材料の、モノフィラメント又はマルチフィラメント繊維から製造できる。メッシュ基材は、例えば編み、経編み、又は織り（例えば平織り、綾織り、畳織り、５本針織り（ｆｉｖｅ ｎｅｅｄｌｅ ｗｅａｖｅ））を含む、様々なパターン又は織りを有してよい。

【0040】

メッシュフィラメントの表面の化学的性質は、所望の細胞付着特性を提供するために改変する必要があり得る。このような改変は、メッシュのポリマー材料の化学処理によって、又は細胞接着分子をフィラメント表面にグラフト重合することによって、行うことができる。あるいは、メッシュを、例えばコラーゲン又はマトリゲル（登録商標）を含む、細胞付着特性を示す生体適合性ハイドロゲルの薄層でコーティングすることができる。あるいは、メッシュのフィラメント繊維の表面に、当該業界で公知の様々なタイプのプラズマ、プロセスガス、及び／又は化学物質を用いた処理プロセスによって、細胞付着特性を与えることができる。しかしながら、１つ以上の実施形態では、メッシュは、表面処理を行わなくても、効率的な細胞成長表面を提供できる。

【0041】

図２Ａ～２Ｃは、本開示のいくつかの考えられる実施形態による織布メッシュの異なる複数の例を示す。これらのメッシュの繊維直径及び開口サイズを、同等の２Ｄ表面に対する、各メッシュの単層によって提供される細胞培養表面積の増大のおおよその大きさと共に、以下の表１にまとめる。表１では、メッシュＡは図２Ａのメッシュを指し、メッシュＢは図２Ｂのメッシュを指し、メッシュＣは図２Ｃのメッシュを指す。表１の３つのメッシュのジオメトリは単なる例であり、本開示の実施形態はこれらの具体例に限定されない。メッシュＣが最大の表面積を提供するため、細胞の付着及び増殖において高い密度を達成するのに有利となり得、従って細胞培養のための最も効率的な基材を提供できる。しかしながら、いくつかの実施形態では、例えば培養チャンバ内での所望の細胞分布又は流れ特性を達成するためには、細胞培養マトリクスが、表面積がより小さなメッシュ、例えばメッシュＡ若しくはメッシュＢ、又は表面積が異なる複数のメッシュの組み合わせを含むことが有利となり得る。

【0042】

【表1】

【0043】

上の表に示されているように、メッシュの３次元的品質によって、同等のサイズの平坦な２Ｄ表面に比べて、細胞の付着及び増殖のための表面積が増大する。この表面積の増大は、本開示の実施形態によって達成される拡張可能なパフォーマンスの助けとなる。プロセス開発研究及びプロセス検証研究のためには、試薬コストを削減して実験スループットを向上させるために、小規模バイオリアクターが必要となることが多い。本開示の実施形態は、このような小規模研究にも適用可能であるが、産業又は生産規模にも拡張できる。例えば、直径２．２ｃｍの円の形状のメッシュＣの１００個の層を、内直径２．２ｃｍの円筒形充填層に充填し、細胞の付着及び増殖に利用できる総表面積を約９３５ｃｍ^２とする。このようなバイオリアクターを１０倍拡張するためには、内直径７ｃｍの円筒形充填層、及び同一のメッシュの１００個の層の、同様の設定を使用できる。このような場合、総表面積は９，３５０ｃｍ^２となる。いくつかの実施形態では、利用可能な表面積は約９９，０００ｃｍ^２／Ｌ以上である。充填層内でのプラグタイプの灌流により、ｍｌ／分／充填層断面表面積（ｃｍ^２）を単位として表される同一の流量を、小規模バージョン及び大規模バージョンのバイオリアクターに使用できる。表面積が大きいほど、播種密度及び細胞成長密度を高くすることができる。１つ以上の実施形態によると、本明細書に記載の細胞培養基材は、最高２２，０００個／ｃｍ^２以上の細胞播種密度を示した。参考までに、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）の播種密度は、２次元表面上で２０，０００個／ｃｍ^２程度である。

【0044】

表面積が大きく、細胞播種又は成長密度が高いことの別の利点は、本明細書で開示される実施形態のコストを、競合ソリューションに対して同等以下とすることができることである。具体的には、細胞産物あたりの（例えば細胞あたり、又はウイルスゲノムあたりの）コストを、他の充填層バイオリアクター以下とすることができる。

【0045】

以下に記載の本開示の更なる実施形態では、織布メッシュ基材を、バイオリアクター内に、円筒状ロールフォーマットで充填できる（図８及び９を参照）。このような実施形態では、充填層バイオリアクターのスケーラビリティは、メッシュストリップの全長及びその長さを増大させることによって達成できる。この円筒状ロール構成で使用されるメッシュの量は、充填層の所望の充填密度に基づいて変化させることができる。例えば、円筒状ロールを、緊密なロールで密に充填することも、緩いロールで緩く充填することもできる。充填の密度は多くの場合、所与の用途又は規模に必要な細胞培養基材の表面積によって決定されることになる。一実施形態では、メッシュの必要な長さは、以下の式：

【0046】

【数1】

【0047】

を用いて、充填層バイオリアクターの直径から計算でき、ここでＬは、バイオリアクターの充填に必要なメッシュの全長（即ち図８のＨ）であり、Ｒは、充填層培養チャンバの内半径であり、ｒは、メッシュが周りに巻きつけられる内部支持体（図９の支持体３６６）の半径であり、ｔは、メッシュの１つの層の厚さである。このような構成では、バイオリアクターのスケーラビリティは、充填層の円筒状ロールの直径若しくは幅（即ち図８のＷ）を増大させ、及び／又は充填層の円筒状ロールの高さＨを増大させて、付着細胞の播種及び成長のためにより多くの基材表面積を提供することによって、達成できる。

【0048】

構造的に定義された十分な剛性の培養マトリクスを使用することにより、マトリクス又は充填層にわたる、高い流れ抵抗の均一性（ｈｉｇｈ‐ｆｌｏｗ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ）が達成される。様々な実施形態によると、マトリクスは、単層又は多層フォーマットで展開できる。これにより、拡散の制限が柔軟に排除され、マトリクスに付着した細胞への栄養素及び酸素の均一な送達が提供される。更に、粗いタイプのマトリクスは、充填層構成内に細胞捕捉領域を含まず、これにより、培養の終了時に、高い生存率で細胞を完全に採取できる。マトリクスはまた、充填層に充填の均一性をもたらし、プロセス開発ユニットから大規模産業バイオプロセッシングユニットへの直接のスケーラビリティを実現できる。充填層から細胞を直接採取できることにより、マトリクスを撹拌又は機械的振盪容器内で再懸濁する必要がなくなる。この再懸濁は、複雑さを増し、また細胞に有害なせん断応力を与える可能性があるものであった。更に、細胞培養マトリクスの高い充填密度は、産業規模で管理可能な量で、高いバイオプロセス生産性をもたらす。

【0049】

図３Ａは、多層基材２００を有するマトリクスの実施形態を示し、図３Ｂは、同じ多層基材２００の平面図である。多層基材２００は、第１のメッシュ基材層２０２、及び第２のメッシュ基材層２０４を含む。第１の基材層２０２と第２の基材層２０４との重なりにもかかわらず、メッシュのジオメトリ（例えば繊維直径に対する開口直径の比）は、図３Ｂのフィラメントを含まない開口２０６によって示されているように、第１の基材層２０２及び第２の基材層２０４の開口が重なり、多層基材２００の厚さ全体を通って流体が流れるための経路を提供するようなものである。

【0050】

図４は、図３Ｂの線Ｂ‐Ｂにおける多層基材２００の断面図を示す。矢印２０８は、第２の基材層２０４の開口を通った後、第１の基材層２０２内のフィラメントの周りを通る、可能な流体流路を示す。メッシュ基材層のジオメトリは、１つ又は複数の基材層を通る効率的で均一な流れを可能とするように設計される。更に、マトリクス２００の構造は、マトリクスを通る複数の配向の流体流を収容できる。例えば図４に示されているように、（矢印２０８によって示されているような）バルク流体流の方向は、第１の基材層２０２及び第２の基材層２０４の大面に対して垂直である。しかしながら、基材層のこれらの面がバルク流方向に対して平行となるように、マトリクスを流れに対して配向することもできる。図５は、図４の線Ｃ‐Ｃに沿った多層基材２００の断面図を示し、マトリクス２００の構造は、多層基材２００内の複数の流体経路を通る流体流（矢印２１０）を可能とするものである。流体流が、メッシュ層の第１及び第２の側部に対して垂直又は平行となることに加えて、マトリクスは、複数の中間角度の複数の基材片によって、又は流体流に対してランダムな配置で、構成される。このような配向の柔軟性は、織布基材の、基本的に等方性の流れ挙動によって可能となる。対照的に、既存のバイオリアクターにおける付着細胞用の基材は、この挙動を示さず、代わりにその充填層は、優先的な流れチャネルを形成する傾向を有し、異方性の透過率を備えた基材材料を有する。本開示のマトリクスの柔軟性により、バイオリアクター容器全体を通して更に良好で更に均一な透過率を実現しながら、様々な用途、及びバイオリアクター又はコンテナの設計においてこのマトリクスを使用できるようになる。

【0051】

本明細書中で記載されているように、細胞培養基材は、１つ以上の実施形態によると、バイオリアクター容器内で使用できる。例えば上記基材は、充填層バイオリアクター構成内で使用でき、又は他の構成では、３次元培養チャンバ内で使用できる。しかしながら、実施形態は３次元培養空間に限定されず、２次元培養表面構成とみなすことができる基材の使用も考えることができ、この場合は、基材の１つ以上の層を、例えば平底培養皿の中に平坦に配置して、細胞のための培養基材を提供する。汚染に関する懸念から、容器は使用後に廃棄可能な単回使用容器とすることができる。

【0052】

１つ以上の実施形態によると、細胞培養マトリクスをバイオリアクター容器の培養チャンバ内で使用する、細胞培養システムが提供される。図６は、バイオリアクター容器３０２を含む細胞培養システム３００の一例を示し、このバイオリアクター容器３０２は内部に細胞培養チャンバ３０４を有する。細胞培養チャンバ３０４内には、基材層３０８の積層体からなる細胞培養マトリクス３０６が存在する。基材層３０８は、ある１つの基材層の第１又は第２の側部が、隣接する１つの基材層の第１又は第２の側部と対面する状態で積層される。バイオリアクター容器３０２は、一方の端部に、培地、細胞、及び／又は栄養素を培養チャンバ３０４内に入れるための入口３１０を有し、また反対側の端部に、培地、細胞、又は細胞産物を培養チャンバ３０４から取り出すための出口３１２を有する。基材層をこのように積層することにより、システムは、構造が画定されており、積層された基材を通る流体流が効率的であるため、細胞の付着及び増殖に悪影響を与えることなく容易に拡張できる。容器３０２は一般に、入口３１０及び出口３１２を有するものとして説明され得るが、いくつかの実施形態は、入口３１０及び出口３１２のうちの一方又は両方を、培地、細胞、又は他の内容物を培養チャンバ３０４内へ及び培養チャンバ３０４から外に流すために使用してよい。例えば、入口３１０は、細胞播種、灌流、又は培養段階の間は、培地又は細胞を培養チャンバ３０４内へと流すために使用できるが、採取段階においては、培地、細胞、及び細胞産物のうちの１つ以上を、入口３１０を通して取り出すためにも使用できる。用語「入口（ｉｎｌｅｔ）」及び「出口（ｏｕｔｌｅｔ）」は、これらの開口の機能を制限することを意図したものではない。

【0053】

１つ以上の実施形態では、充填層の流れ抵抗及び体積密度は、異なるジオメトリの基材層を交互配置することによって制御できる。特に、メッシュサイズ及びジオメトリ（例えば繊維直径、開口直径、及び／又は開口ジオメトリ）は、充填層フォーマットの流体の流れ抵抗を定義する。異なるサイズ及びジオメトリのメッシュを交互配置することにより、バイオリアクターの１つ以上の特定の部分において、流れ抵抗を制御又は変更できる。これにより、充填層内での液体の灌流の均一性を改善できる。例えば、１０層のメッシュＡ（表１）、続いて１０層のメッシュＢ（表１）、更に続いて１０層のメッシュＣ（表１）を積層して、所望の充填層特性を達成できる。別の例としては、充填層を１０層のメッシュＢで始めることができ、続いて５０層のメッシュＣ、更に続いて１０層のメッシュＢとすることができる。このような反復パターンを、バイオリアクター全体にメッシュが充填されるまで継続してよい。これらは単なる例であり、可能な組み合わせを制限する意図なく、説明のために使用されている。実際には、細胞成長表面の体積密度及び流れ抵抗の様々なプロファイルを得るために、異なるサイズのメッシュの様々な組み合わせが可能である。例えば、異なるサイズのメッシュを交互配置することによって、様々な体積細胞密度の複数のゾーン（例えば低／高／低／高等の密度のパターンを形成する一連のゾーン）を有する、充填層コラムを組み立てることができる。

【0054】

図６では、バルク流方向は、入口３１０から出口３１２への方向であり、この例では、基材層３０８の第１及び第２の大面は、バルク流方向に対して垂直である。対照的に、図７に示されている例は、システム３２０が、バイオリアクター容器３２２と、培養チャンバ３２４内の基材３２８の積層体とを含み、培養チャンバ３２４はバルク流方向に対して平行な第１及び第２の側部を有し、バルク流方向は、入口３３０に入る流れ線及び出口３３２から出る流れ線によって示されている方向に対応する、実施形態のものである。よって、本開示の実施形態のマトリクスは、いずれの構成で採用できる。システム３００及び３２０のそれぞれにおいて、基材３０８、３２８は、培養チャンバ３０４、３２４によって画定される内部空間を充填するようにサイズ設定及び成形され、これにより、細胞成長表面が単位体積あたりの細胞数に関して効率を最大化するために、各容器内の培養空間が充填される。図７は複数の入口３３０及び複数の出口３３２を図示しているが、システム３２０は、単一の入口によって供給を受け、また単一の出口を有することも考えられる。しかしながら、本明細書中の様々な実施形態によると、分配プレートを用いて、培地、細胞、又は栄養素の、充填層の断面にわたる分配を補助でき、またこれによって、充填層を通る流体流の均一性を改善できる。従って、複数の入口３３０は、より均一な流れを形成するために、充填層の断面にわたる複数の孔を分配プレートにどのように設けることができるかを示すものである。

【0055】

図８は、基材が円筒状ロール３５０へと成形されている、マトリクスの一実施形態を示す。例えば、メッシュ基材３５２を含むマトリクス材料のシートを、中心長手方向軸ｙの周りに巻いて円筒とする。円筒状ロール３５０は、中心長手方向軸ｙに対して垂直な寸法に沿った幅Ｗと、中心長手方向軸ｙに対して平行な方向に沿った高さＨとを有する。１つ以上の好ましい実施形態では、円筒状ロール３５０は、中心長手方向軸ｙが、円筒状ロールを格納するバイオリアクター又は培養チャンバを通る流体のバルク流Ｆの方向に対して平行になるように、バイオリアクター容器内に置かれるように設計される。図９は、このような円筒状ロール構成の細胞培養マトリクス３６４を格納したバイオリアクター容器３６２を有する、細胞培養システム３６０を示す。図８の円筒状ロール３５０と同様に、細胞培養マトリクス３６４は中心長手方向軸を有し、これは図９では紙面に向かって延在する。システム３６０は更に中心支持部材３６６を含み、その周りに細胞培養マトリクス３６４が位置決めされる。中心支持部材３６６は、細胞培養マトリクス３６４の物理的支持及び／又は位置合わせのためだけに設けることができるが、いくつかの実施形態によると、他の機能を提供することもできる。例えば中心支持部材３６６は、マトリクスの長さＨに沿って細胞培養マトリクス３６４に培地を供給するための、１つ以上の開口を備えることができる。他の実施形態では、中心支持部材３６６は、細胞培養マトリクス３６４の１つ以上の部分を円筒状ロールの内側部分に保持するための、１つ以上の取り付け部位を含んでよい。これらの取り付け部位は、フック、クラスプ、ポスト、クランプ、又はメッシュシートを中心支持部材３６６に取り付ける他の手段であってよい。

【0056】

図１０Ａは、１つ以上の実施形態による細胞培養システム４００を示す。システム４００は、本明細書で開示される１つ以上の実施形態の細胞培養マトリクスを格納する、バイオリアクター４０２を含む。バイオリアクター４０２は、培地調質用容器４０４に流体接続でき、上記システムは、調質用容器４０４内の細胞培養培地４０６をバイオリアクター４０２に供給できる。培地調質用容器４０４は、浮遊培養、流加培養、又は灌流培養のためにバイオプロセッシング産業で使用される典型的なバイオリアクターに見られる、センサ及び制御部品を含むことができる。これらは、ＤＯセンサ、ｐＨセンサ、酸素供給器／ガス散布ユニット、温度プローブ、並びに栄養素添加及び塩基添加ポートを含むが、これらに限定されない。散布ユニットに供給されるガス混合物は、Ｎ_２、Ｏ_２、及びＣＯ_２ガスに関するガス流コントローラによって制御できる。培地調質用容器４０４はまた、培地の混合のための羽根車を内包する。上述のセンサによって測定された全ての培地パラメータは、培地調質制御ユニット４１８によって制御でき、これは培地調質用容器４０４と通信しており、細胞培養培地４０６の状態の測定、及び／又は所望のレベルへの調整を行うことができる。図１０Ａに示されているように、培地調質用容器４０４は、バイオリアクター容器４０２とは別個の容器として設けられる。これは、細胞が培養されている場所から離れて培地を調質でき、その後で、調質済みの培地を細胞培養空間に供給できるという点で、有利であり得る。しかしながらいくつかの実施形態では、培地の調質をバイオリアクター容器４０２内で実施できる。

【0057】

培地４０６の調質用容器４０４からの培地は、入口４０８を介してバイオリアクター４０２へと送達され、入口４０８は、細胞接種材料を播種して細胞の培養を開始するための注入ポートを含んでもよい。バイオリアクター容器４０２は１つ以上の出口４１０も含んでよく、細胞培養培地４０６はこれを通って容器４０２を出る。更に、細胞又は細胞産物を、出口４１０を通して出すこともできる。バイオリアクター４０２から出る流れの内容物を分析するために、１つ以上のセンサ４１２をライン内に設けてよい。いくつかの実施形態では、システム４００は、バイオリアクター４０２内への流れを制御するための流れ制御ユニット４１４を含む。例えば、流れ制御ユニット４１４は、１つ以上のセンサ４１２（例えばＯ_２センサ）から信号を受信でき、この信号に基づいて、バイオリアクター４０２への入口４０８の上流のポンプ４１６（例えば蠕動ポンプ）に信号を送信することによって、バイオリアクター４０２への流れを調整できる。よって、センサ４１２によって測定される因子のうちの１つ、又はこれらの因子の組み合わせに基づいて、ポンプ４１６は、所望の細胞培養条件が得られるように、バイオリアクター４０２への流れを制御できる。

【0058】

培地の灌流速度は、信号処理ユニット４１４によって制御され、これは、培地調質用容器４０４、及び充填層バイオリアクターの出口４１０に配置されたセンサから、センサ信号を収集して比較する。充填層バイオリアクター４０２を通る培地の灌流の流れの特性を原因として、栄養素、ｐＨ、及び酸素勾配が、充填層に沿って発生する。バイオリアクターの灌流流量は、図１１のフローチャートに従って、蠕動ポンプ４１６に動作可能に接続された流れ制御ユニット４１４によって自動的に制御できる。

【0059】

本開示の１つ以上の実施形態は、従来の方法とは異なる細胞接種ステップを提供する。従来の方法では、従来のマトリクスによる充填層を、培養培地で満たし、濃縮した接種材料を培地循環ループに注入する。細胞懸濁液を、高流量でバイオリアクターを通してポンピングすることにより、従来の充填層マトリクス上での捕捉による細胞播種の不均一性を低減する。このような従来の方法では、循環ループ内での細胞の高流量でのポンピングは、充填層バイオリアクターに細胞の大半が捕捉されるまで、おそらく数時間にわたって継続される。しかしながら、従来の充填層バイオリアクターの、深層ろ過が不均一であるという性質により、細胞は充填層内で不均一に分布し、バイオリアクターの入口領域の細胞密度が高く、バイオリアクターの出口領域の細胞密度が低くなる。

【0060】

対照的に、本開示の実施形態によると、バイオリアクターの培養チャンバの空隙容積と等しい体積の細胞接種材料を、バイオリアクター４０２の入口４０８の細胞接種材料注入ポートを通して、充填層に直接注入する（図１０Ａ）。続いて、本明細書に記載の細胞培養マトリクス中に存在する均一で連続した流体経路により、細胞懸濁液が充填層内に均一に分布する。初期播種段階における重力による細胞の沈降を防止するために、接種材料注入の直後に培地の灌流を開始できる。灌流流量は、重力とのバランスを取るため、及び細胞が充填層バイオリアクターから洗い落とされるのを防止するために、事前にプログラムされた閾値未満に維持される。よって、初期の細胞付着段階では、細胞は充填層内で緩やかに転がされ、利用可能な基材表面に対する均一な細胞の分布及び付着が達成される。

【0061】

図１０Ｂは、１つ以上の実施形態による、細胞培養システム４２０の更に詳細な概略図を示す。システム４２０の基本的な構造は図１０Ａのシステム４００と同様であり、充填層バイオリアクター４２２は、ＰＥＴ織布メッシュ等の細胞培養材料の充填層を内包した容器と、別個の培地調質用容器４２４とを有する。しかしながら、システム４００とは対照的に、システム４２０は、センサ、ユーザインタフェース及びコントロール、並びに培地及び細胞用の様々な入口及び出口を含む、システムの細部を示している。いくつかの実施形態によると、培地調質用容器４２４は、適切な温度、ｐＨ、Ｏ_２、及び栄養素を提供するために、コントローラ４２６によって制御される。いくつかの実施形態では、バイオリアクター４２２もコントローラ４２６によって制御できるが、他の実施形態では、バイオリアクター４２２は別個の灌流回路４２８内に設けられ、ここでは、ポンプを用いて、灌流回路４２８を通る培地の流量を、バイオリアクター４２２の出口又はその付近のＯ_２の検出に基づいて制御する。

【0062】

図１０Ａ及び１０Ｂのシステムは、１つ以上の実施形態によるプロセスステップに従って動作させることができる。図１１Ａに示されているように、これらのプロセスステップは、プロセスの準備（Ｓ１）、細胞の播種及び付着（Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ）、細胞の増殖（Ｓ３）、トランスフェクション（Ｓ４ａ、Ｓ４ｂ）、ウイルスベクターの産生（Ｓ５ａ、Ｓ５ｂ）、並びに採取（Ｓ６ａ、Ｓ６ｂ）を含むことができる。

【0063】

図１１は、図１０Ａ又は１０Ｂのシステム４００等の灌流バイオリアクターシステムの流れを制御するための方法４５０の例を示す。方法４５０によると、ステップＳ２１において、システム４００の特定のパラメータを、バイオリアクター最適化用運転によって事前に決定する。これらの最適化用運転から、ｐＨ_１、ｐＯ_１、［グルコース］_１、ｐＨ_２、ｐＯ_２、［グルコース］_２、及び最大流量の値を決定できる。ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１の値は、ステップＳ２２においてバイオリアクター４０２の細胞培養チャンバ内で測定され、ｐＨ_２、ｐＯ_２、及び［グルコース］_２は、ステップＳ２３においてバイオリアクター容器４０２の出口でセンサ４１２によって測定される。Ｓ２２及びＳ２３におけるこれらの値に基づいて、灌流ポンプ制御ユニットは、Ｓ２４において、灌流流量を維持又は調整するための決定を行う。例えば、ｐＨ_２≧ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２≧ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２≧［グルコース］_２ｍｉｎのうちの少なくとも１つであれば、細胞培養チャンバへの細胞培養培地の灌流流量を現在の流量で継続してよい（Ｓ２５）。現在の流量が、細胞培養システムの事前に決定された最大流量以下である場合、灌流流量を増大させる（Ｓ２７）。更に、現在の流量が、細胞培養システムの事前に決定された最大流量より多い場合、細胞培養システムのコントローラは：（１）ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎ；（２）ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１；並びに（３）バイオリアクター容器の高さ、のうちの少なくとも１つを再評価できる（Ｓ２６）。

【0064】

細胞培養マトリクスは、所望のシステムに応じて、培養チャンバ内に複数の構成で配設できる。例えば１つ以上の実施形態では、システムは、培養チャンバ内の所定の細胞培養空間の幅にわたって延在する幅を有する、基材の１つ以上の層を含む。基材の複数の層を、所定の高さまでこのようにして積層してよい。上述のように、基材層は、１つ以上の層の第１及び第２の側部が、培養チャンバ内の所定の培養空間を通る培養培地のバルク流方向に対して垂直となるように配設されていてよく、又は１つ以上の層の第１及び第２の側部は、上記バルク流方向に対して平行であってよい。１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、バルク流に対して第１の配向の、１つ以上の基材層と、上記第１の配向とは異なる第２の配向の、１つ以上の他の層とを含む。例えば、様々な層は、バルク流方向に対して平行又は垂直であるか、あるいはこれらの間の何らかの角度を有する、第１の及び第２の側部を有してよい。

【0065】

１つ以上の実施形態では、細胞培養システムは、細胞培養基材の複数の別個の片を、充填層構成内に含み、これらの基材の片の長さ及び幅は、培養チャンバに比べて小さい。本明細書中で使用される場合、「基材の片（ｐｉｅｃｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」は、基材の片の長さ及び／又は幅が培養空間の長さ及び／又は幅の約５０％以下である場合に、培養チャンバに比べて小さな長さ及び／又は幅を有するものとみなされる。よって、細胞培養システムは、培養空間内に所望の配置で充填された、基材の複数の片を含んでよい。基材片の配置は、ランダム若しくはセミランダムであってよく、又は複数の片が略同様の配向（例えばバルク流方向に対して水平、垂直、若しくは０°～９０°のある角度）で配向されている等の、所定の秩序若しくは整列を有してよい。

【0066】

本明細書中で使用される場合、「所定の培養空間（ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｐａｃｅ）」は、細胞培養マトリクスに占有され、細胞の播種及び／又は培養が行われることになる、培養チャンバ内の空間を指す。所定の培養空間は、培養チャンバの略全体を占めることができ、又は培養チャンバ内の空間の一部分を占めてもよい。本明細書中で使用される場合、「バルク流方向（ｂｕｌｋ ｆｌｏｗ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」は、細胞の培養中、及び／又は培養チャンバに対する培養培地の流入若しくは流出中に、細胞培養マトリクスを通る、又は細胞培養マトリクスを越える、流体又は培養培地のバルク質量流の方向として定義される。

【0067】

１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、固定機構によって培養チャンバ内で固定される。上記固定機構は、細胞培養マトリクスの一部分を、上記マトリクスを取り囲む培養チャンバの壁に、又は培養チャンバの一方の端部のチャンバ壁に、固定できる。いくつかの実施形態では、固定機構は、細胞培養マトリクスの一部分を、培養チャンバの長手方向軸に対して平行に延在する部材等の、培養チャンバを通って延在する部材に、又は上記長手方向軸に対して垂直に延在する部材に、付着させる。しかしながら、１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスは、チャンバ又はバイオリアクター容器の壁に固定して取り付けられることなく、培養チャンバ内に内包されていてよい。例えば、マトリクスは、培養チャンバの境界又は他の構造部材によって内包されていてよく、これにより、マトリクスをこれらの境界又は構造部材に固定せずに、マトリクスがバイオリアクター容器の所定のエリア内に保持される。

【0068】

いくつかの実施形態の一態様は、ローラーボトル構成のバイオリアクター容器を提供する。培養チャンバは、本開示に記載された実施形態のうちの１つ以上による細胞培養マトリクス及び基材を内包できる。ローラーボトル構成では、バイオリアクター容器は、バイオリアクター容器をこの容器の中心長手方向軸の周りで動かすための手段に、動作可能に取り付けることができる。例えば、バイオリアクター容器は、中心長手方向軸の周りで回転させることができる。この回転は、連続的（例えば一方向に連続するもの）であっても、不連続（例えば単一方向若しくは交互の方向の間欠的回転、若しくは前後回転方向の振動）であってもよい。動作時、バイオリアクター容器の回転により、チャンバ内の細胞及び／又は流体の運動が引き起こされる。この運動は、チャンバの壁に対して相対的なものと考えることができる。例えば、バイオリアクター容器がその中心長手方向軸の周りで回転する際、重力は、流体、培養培地、及び／又は付着していない細胞を、チャンバの下部に向かわせ続けることができる。しかしながら、１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは容器に対して基本的に固定されており、従って容器と共に回転する。１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスを取り付けずに、容器が回転する際に容器に対して所望の程度だけ自由に移動できるようにすることができる。容器の運動によって、細胞を、細胞培養培地又は液体と、培養チャンバ内の酸素又は他のガスとに曝露しながら、細胞を細胞培養マトリクスに付着させることができる。

【0069】

織布又はメッシュ基材を含むマトリクスといった、本開示の実施形態による細胞培養マトリクスを使用することによって、付着細胞の付着、増殖、及び官能化に利用可能な表面積が増大した、ローラーボトル容器が提供される。特に、モノフィラメントポリマー材料の織布メッシュの基材をローラーボトル内で使用すると、表面積を、標準的なローラーボトルの約２．４～約４．８倍、又は約１０倍まで増大させることができる。本明細書に記載されているように、メッシュ基材のモノフィラメントの線はそれぞれ、付着細胞が付着するための２Ｄ表面として、それ自体を提示できる。更に、複数のメッシュの層をローラーボトル内に配置できるため、利用可能な総表面積が、標準的なローラーボトルの約２～２０倍に増大する。よって、細胞の播種、培地の交換、及び細胞の採取を含む、既存のローラーボトル設備及び処理を、既存の動作インフラストラクチャ及び加工ステップに対する影響を最小限に抑えながら、本明細書で開示される改良された細胞培養マトリクスの追加によって改変できる。

【0070】

バイオリアクター容器は任意に、入口及び／又は出口手段に取り付けることができる１つ以上の出口を含む。上記１つ以上の出口を通して、液体、培地、又は細胞を、チャンバに供給する、又はチャンバから取り出すことができる。容器の単一のポートを、入口及び出口の両方として機能させてもよく、又は複数のポートを、入口及び出口専用に設けてもよい。

【0071】

１つ以上の実施形態の充填層細胞培養マトリクスは、織布細胞培養メッシュ基材からなるものとすることができ、細胞培養マトリクス内に他のいずれの形態の細胞培養基材も配置されず、又は散在しない。即ち、本開示の実施形態の織布細胞培養メッシュ基材は、既存のソリューションで使用される不規則な不織布タイプの基材を必要としない、効果的な細胞培養基材である。これにより、設計及び構造が簡略化された細胞培養システムを実現できると同時に、高密度細胞培養基材に、流れの均一性、採取のしやすさ等に関して本明細書に記載されている他の利点を提供できる。

【0072】

本明細書に記載されているように、ここで提供される細胞培養基材及びバイオリアクターシステムは、多数の利点を提供する。例えば、本開示の実施形態は、ＡＡＶ（全血清型）及びレンチウイルスといった多数のウイルスベクターのうちのいずれの産生をサポートでき、また、インビボ及びエクスビボ遺伝子治療用途に適用できる。均一な細胞の播種及び分布により、容器あたりのウイルスベクターの収率が最大化され、またこれらの設計により、生存細胞の採取が可能となり、これは、同一のプラットフォームを用いた複数の増殖期間からなるシードトレインのために有用となり得る。更に、本明細書中の実施形態は、プロセス開発規模から生産規模へと拡張可能であり、これにより最終的に、開発時間及びコストが節約される。本開示の方法及びシステムはまた、細胞培養プロセスの自動化及び制御を可能にすることにより、ベクター収率を最大化し、再現性を改善する。最後に、ウイルスベクターの生産レベル規模に到達するために必要な容器の個数（例えばバッチあたり１０^１６～１０^１８個のＡＡＶ ＶＧ）を、他の細胞培養ソリューションに比べて大幅に削減できる。

【0073】

実施形態は、中心長手方向軸の周りで回転する容器に限定されない。例えば容器は、容器に対して中心以外に位置する軸の周りで回転してよい。更に、回転軸は水平又は垂直軸であってよい。

【実施例】

【0074】

本開示の細胞培養マトリクス、細胞培養システム、及びこれらに関連する方法の有効性を実証するために、以下の実施例に従って、細胞の播種及び培養に関する研究を実施した。

【0075】

実施例１
実施例１では、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）織布メッシュ基材を有する細胞培養マトリクス（図１２を参照）を、静止細胞培養条件において試験した。ＰＥＴメッシュをエタノールで洗浄し、酸素ＲＦプラズマ中でプラズマ処理した。細胞の付着を促進するために、メッシュのフィラメントの表面にゼラチンを吸着させた。メッシュのディスク状の片をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ｕｌｔｒａ‐ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（ＵＬＡ）６ウェルプレートに入れた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、異なる複数の播種密度（５０Ｋ／ｃｍ^２、７５Ｋ／ｃｍ^２、１００Ｋ／ｃｍ^２）でメッシュディスク上に播種し、細胞培養を３日間実施した。フィラメント表面上の細胞を、蛍光グリーン細胞トラッカー染料で染色した。図１２は、フィラメント表面上の細胞をこのように可視化した結果を示す。細胞のサイズに対するメッシュフィラメントのサイズにより、モノフィラメント繊維は、細胞の付着及び増殖のための２次元表面として有効に作用できる。メッシュから細胞を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＶｉ‐Ｃｅｌｌ（登録商標）細胞カウンタで計数することによって、細胞の増殖を測定した。結果は、静止細胞培養条件下における、細胞培養マトリクス上での良好な細胞の付着及び増殖を示していた。例えば図１３Ａは、２４、４８、及び７２時間後における、播種済みの各メッシュに関する１ウェルあたりの総細胞数を示す。細胞の個数に加えて、細胞の生存率が図１３Ｂに示されており、この図は、複数の播種密度にわたって極めて高い生存率を実証している。

【0076】

実施例２
実施例２では、本開示の一実施形態の一例による、図６に示されているもののような充填層バイオリアクターシステムで、細胞を培養した。充填層は円筒状であり、それぞれ円形又はディスク状の複数の細胞培養機材の積層体で作製されている。具体的には、実施例２において、充填層は約２５ｍｍの高さを有し、また直径がそれぞれ約２０ｍｍの１００個のＰＥＴ織布メッシュ基材を含んでいた。使用したメッシュは、表１のメッシュＣに対応する。細胞の付着に利用できる２次元表面積の合計は、約７６０ｃｍ^２であったと推定される。バイオリアクターに接種を行うために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（細胞２００万個／ｍｌ）を充填層に直接注入した。培地の灌流を、細胞懸濁液の導入の直後に開始し、灌流流量は３ｍｌ／分に設定した。この流量での灌流を２４時間継続し、その後、流量を１ｍｌ／分まで減少させた。その後、灌流流量を調整して、バイオリアクターの出口において、ｐＯ_２≧５０％飽和、及びｐＨ≧７を維持した。２～３日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、バイオリアクターを分解して、マトリクス内での細胞の付着の均一性を確認した。図１４Ａ及び１４Ｂは、クリスタルバイオレット染料で染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞が付着した充填層マトリクスのディスクを３枚に１枚ずつ示す。図１４Ａは、静止条件下で播種されたバイオリアクターからの結果を示す。染色のばらつきに基づいて、３日の培養の後に、不均一な細胞の付着が存在することが観察された。具体的には、（図１４Ａの画像の底部のディスクに対応する）充填層の底部では細胞の濃度が高く、（図１４Ａの画像の上部のディスクに対応する）充填層の上部では細胞が少なかった。図１４Ｂは、ある好ましい実施形態による播種方法で播種されたバイオリアクターからの結果を示し、この播種方法では、初期付着段階中、細胞を充填層内で連続的に転がした。その結果、反応器の上部から底部まで（及び図１４Ｂの画像の上部から底部まで）の複数のディスクにおける細胞の一貫した染色によって証明されるように、２日間の細胞培養後に、充填層の全ての部分において均一な細胞分布が観察される。これは、細胞播種段階においてバイオリアクターを連続的に灌流した場合に、均一な細胞分布が達成されたことを示す。

【0077】

実施例３
実施例３では、細胞を充填層バイオリアクターシステムで培養し、バイオリアクター内でのアデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）産生のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを実施した。実施例２と同一のバイオリアクターの設定を実施例３で使用した（例えば図６を参照）。充填層は、ＰＥＴメッシュ（表１のメッシュＣ）の１００個のディスクを内包していた。各ディスクの直径は約２０ｍｍであり、充填層の高さは約２５ｍｍであり、細胞の付着及び増殖に利用可能な２次元表面積は合計約７６０ｃｍ^２であった。バイオリアクターに接種を行うために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（細胞２００万個／ｍｌ）を充填層に直接注入した。約５０ｍｌの培地を内包した培地貯蔵容器を、バイオリアクター容器に流体接続した。７２時間にわたって、細胞を、１０％のＦＢＳ及び６ｍＭのＬ‐グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）ＡＴＣＣ（登録商標）培地で培養した。貯蔵容器内の培地のｐＨが７未満に降下した場合、培地を新鮮な培地供給分に交換した。これに伴って灌流流量を調整して、バイオリアクターの出口において、ｐＯ_２≧５０％飽和、及びｐＨ≧７を維持した。７２時間後、細胞培地を、１０％のＦＢＳ及び６ｍＭのＬ‐グルタミンを含む５０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５‐０１８）に交換し、トランスフェクション試薬を、１ｍｌのＡＡＶ２及びＰＥＩｐｒｏ（１：２の比）につき２μｇという最終濃度になるまで添加した。これに続く７２時間の間に、貯蔵ボトル内のｐＨが７未満に降下した場合、細胞培地を新鮮な供給分に交換した。これに伴って灌流流量を調整して、バイオリアクターの出口において、ｐＯ_２≧５０％飽和、及びｐＨ≧７を維持した。５Ｘ ＴｒｙｐＬＥを用いて細胞を採取した。トランスフェクション効率を、蛍光フローサイトメーターで分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価を、ＥＬＩＳＡ及びＰＣＲアッセイで分析した。細胞培養結果を表２に示す。ここで「ＶＰ」は「ウイルスタンパク質（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」を表し、「ＧＣ」は「ゲノムコピー（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ）」を表す。

【0078】

【表2】

【0079】

実施例４
実施例４では、ローラーボトル細胞培養システムの一実施形態を試験した。Ｃｏｒｎｉｎｇローラーボトル＃４３０１９５を使用し、表面積は４９０ｃｍ^２であった。細胞が組織培養処理表面に付着するのを防止するために、ローラーボトルをＢＳＡの０．５％溶液で最低１６時間処理し、水で洗浄してから、各実験を実施した。細胞を標準的な２Ｄ表面（Ｔフラスコ）上で成長させ、標準的なプロトコルを用いて採取した。この標準的なプロトコルでは、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を表面から放出させた後で、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）を含有する完全培地の添加によってトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を不活性化する。次に上記細胞を、細胞カウンタで計数し、細胞を、総容積２００ｍＬの中で細胞約５×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で、細胞培養メッシュを含む及び含まないローラーボトル内に播種した。図１５及び１６に示されているように、細胞培養メッシュ５０２を含むローラーボトル５００に関して、上記メッシュは、ボトルの口５０１を通して挿入できるように密な円筒状ロール５０３へと巻かれており、ボトルの内部への挿入後、細胞培養メッシュの巻きを部分的に解いて、ローラーボトルの壁に向かって（矢印５０４によって示されているように）広げた。細胞培養メッシュの長さは、ローラーボトル内で広げた後に、図１５及び１６に示されているように、細胞培養メッシュの二重層がローラーボトルの内周を巡るように設けられるよう、十分に長かった。細胞を、１６＋時間にわたって、５％のＣＯ_２及び９５％の相対湿度を有する３７℃のインキュベータ内で、様々な回転速度（０．５～４ｒｐｍ）の表面に付着させた。細胞の付着後、速度は、ローラーボトル内の細胞の標準的な成長に関して約１ｒｐｍに減少した。培地の測定を周期的に実施し、培地の交換が必要な時点を決定した。ローラーボトル内において、メタノール及びパラホルムアルデヒドを含有する溶液中のクリスタルバイオレットを用いて、メッシュ表面に付着した細胞の可視化を実施した。細胞の染色後、メッシュをローラーボトルから取り外して撮像した。

【0080】

図１７Ａ及び１７Ｂは、実施例４のローラーボトルから取り外されたメッシュを示し、ローラーボトル内の二重層メッシュに付着した、染色されたＨＥＫ２９３細胞の存在を実証している。付着細胞が付着のために利用できる総表面積は、本開示のある実施形態によるローラーボトルでは２４５０ｃｍ^２であり、その一方で、メッシュ基材を含まないローラーボトルでは４９０ｃｍ^２であった。図１７Ａは、ローラーボトル内で２層構造に自己整列したＰＥＴメッシュ（表１のメッシュＣに対応）に付着した細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。細胞は、ローラーボトルの速度が０．５ｒｐｍである状態で、播種された。なお、ボトルの壁に面するメッシュの外側層に、主に細胞が播種されていた。図１７Ｂは、ローラーボトル内で２層構造に自己整列したＰＥＴメッシュ（表１のメッシュＣに対応）に付着した細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。細胞は、４ｒｐｍのローラーボトル速度で播種された。なお、２つのメッシュ層に均一に細胞が播種された。図１７Ａ及び１７Ｂから確認できるように、細胞の播種の均一性は、播種ステップ中のローラーボトルの回転速度に依存していた。通常のローラーボトル播種プロトコルとは対照的に、メッシュの利用可能な付着表面上に細胞を均一に播種するためには、速い回転速度が必要であった。

【0081】

本開示の実施形態は、細胞培養及びウイルスベクター産生のための既存のプラットフォームを上回る利点を有する。なお、本開示の実施形態は、例えば付着又は半付着細胞、ヒト胎児腎臓（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ：ＨＥＫ）細胞（例えばＨＥＫ２３）（トランスフェクトされた細胞を含む）、レンチウイルス（幹細胞、ＣＡＲ‐Ｔ）及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルスベクターを含む、多数のタイプの細胞及び細胞副産物の産生に使用できる。これらは、本明細書で開示されるバイオリアクター又は細胞培養基材のいくつかの一般的な用途の例であるが、本開示の実施形態の使用又は用途に対する限定を意図したものではなく、当業者であれば、これらの実施形態を他の使用のために適用できることを理解するだろう。

【0082】

実施例５
上述のように、本開示の実施形態の１つの利点は、細胞培養基材を通る流れの均一性である。理論によって束縛されることを望むものではないが、細胞培養基材の規則的な又は均一な構造が、それを通して培地を流すことができる一貫した均一な物体を提供すると考えられる。対照的に、既存のプラットフォームは、主に不規則又はランダムな基材、例えばフェルト状又は不織布繊維材料に依存するものである。本開示の基材の均一な特性は、この基材において達成される均一で一貫した細胞の播種を検査することによって説明できる。例えば図１８Ａは、本開示のいくつかの実施形態による、実施例５からの基材材料の３つのディスク（１８０１、１８０２、１８０３）を示す。図１８Ａのディスクは、本明細書に記載の織布ＰＥＴメッシュ材料であり、それぞれ約６０ｍｍの直径を有する。１０～３００個の同様のディスクの層が充填されたバイオリアクターに関する表面積は、約６７８～２０，３００ｃｍ^２となる。この例では、細胞の培養を、１００個のディスクの積層体を用いて実施した。第１のディスク１８０１は、バイオリアクター内のこのようなディスクの積層体の一番上のディスクであり、第２のディスク１８０２は、積層体の真ん中のディスクであり、第３のディスク１８０３は積層体の底部のディスクであった。積層体内の異なる位置に配置されているにもかかわらず、図１８Ａの染色は、極めて一貫した細胞の付着を示している。

【0083】

図１８Ａ及び１８Ｂの画像を生成した実験において、バイオリアクターを細胞培養培地で事前に満たし、この系を一晩にわたって予備調質して、ｐＨ７．２、Ｄ．Ｏ．１００％、及び３７℃の定常状態を達成した。４００ｍｌのＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳ＋６ｍＭのＬ‐グルタミンを用いて、バイオリアクターシステム全体を満たした。３０ｍｌの懸濁液中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞５００万個／ｍＬ）を、３方向ポートを通して充填層に直接注入し、接種を行った。最初の４８時間にわたって、予備調質された培地を３０ｍＬ／分の速度でバイオリアクターに灌流して、充填層内での均一な細胞分布、付着、及び初期成長を実現した。４８時間の培養の後、２００ｍｌの新鮮な完全ＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地をシステムに添加して、グルコースレベルを１ｇ／Ｌより高く維持した。灌流流量を自動的に調整して、バイオリアクターの出口においてＤＯ_{ｅｘｔｅｒｎａｌ}≧培地の飽和の４５％を維持した。接種の７２時間後、培養培地を５００ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５－０１８）＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭのＬ‐グルタミンに交換し、２時間灌流させた。トランスフェクション混合物（プラスミドＤＮＡ及びＰＥＩの１：２の比での複合体；細胞１００万個あたり０．８μｇの合計ＤＮＡ）を、トランスフェクションの２４時間後の培地１ｍｌあたり２μｇの合計ＤＮＡという最終濃度になるまで添加し、培養培地を、５００ｍｌの新鮮な完全Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５‐０１８）培地に交換して、消費された栄養素を補充した。灌流流量を自動的に調整して、バイオリアクターの出口においてＤＯ_{ｅｘｔｅｒｎａｌ}≧４５％飽和を維持した。これに続く４８時間の培養の間、グルコースレベルを監視し、必要に応じて培地の添加又は交換によって供給して、０．３ｇ／Ｌより高いレベルを維持した。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１Ｘ Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて採取した。トランスフェクション効率を、蛍光フローサイトメトリーで分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価を、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲアッセイで分析した。

【0084】

クリスタルバイオレット染色を用いて、図１８Ａのディスクの表面全体にわたる細胞の均一な成長を強調した。第１のディスク１８０１、第２のディスク１８０２、及び第３のディスク１８０３は、細胞培養マトリクスの積層体全体に広がっているにも関わらず、３つのディスク全てにわたって細胞の成長は一貫している。図１８Ａの画像は、７２時間の培養の後、細胞を基材から採取する前に撮影された。図１８Ｂは、細胞を採取した後の、同じ３つのディスク（１８０１’、１８０２’、及び１８０３’）を示す。図１８Ｂにおいてクリスタルバイオレット染色が相対的に少ないことによって示されているように、細胞は、各ディスクの表面にわたって、及び細胞培養マトリクス積層体のこれら３つのディスクにわたって、均一に採取されている。分析に基づくと、細胞の９５％超がバイオリアクターから回収された。６７８０ｃｍ^２の総表面積を有する直径６０ｍｍのこれらの基材積層体／容器における、ＡＡＶ産生の細胞培養結果を、以下の表３に示す。これは、トランスフェクトされた細胞の収率、トランスフェクション効率、及び収量１ｃｍ^２あたりのウイルスゲノム数を示す。ここでもまた、基材の均一な構造、及び均一な流れ特性が、この効率的で均一な成長、及び採取しやすさに寄与していると考えられる。

【0085】

【表3】

【0086】

以下の表４は、異なる直径（２９ｍｍ及び６０ｍｍ）の複数のバイオリアクター容器を含む複数の実験の文脈での、上述の結果を示す。データは、小さい方（例えば直径２９ｍｍ、表面積１６００ｃｍ^２）と大きい方（例えば直径６０ｍｍ、表面積６７８０ｃｍ^２）の容器及び／又は充填層マトリクスの間での、良好なスケーラビリティを示す。

【0087】

【表4】

【0088】

上述のように、本開示の実施形態は、比較的小さい実用的なフットプリントで、高密度の細胞の培養を可能にする、充填層細胞培養マトリクス及び／又はバイオリアクターを提供できる。例えば、上述の表３及び４の例の中の、６０ｍｍの細胞培養マトリクスは、約６８７０ｃｍ^２の表面積を有する。参考までに、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋ（登録商標）は、約１７２０ｃｍ^２の表面積を有している。表３及び４の、直径６０ｍｍの細胞培養マトリクスは、ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋよりも小さなバイオリアクターに格納できるにもかかわらず、採取時の細胞数をより多く、また容器１つあたりの総ゲノムコピー（ＧＣ）又はウイルスゲノム（ＶＧ）数をより多くすることができる。図１９は、ＨＹＰＥＲｆｌａｓｋと比較した、表３及び４からの直径６０ｍｍの基材を含む２つのバイオリアクター容器に関するこれらの数を示し、同時に１ｃｍ^２あたりのＧＣも示しており、この１ｃｍ^２あたりのＧＣはＨＹＰＥＲｆｌａｓｋよりは低いものの、それをより大きな表面積で補っている。

【0089】

実施例６
本開示の基材の流れの均一性又は透過率を更に調べるために、モデリングを用いて、３次元細胞培養マトリクスの多孔率を理解した。織布ＰＥＴメッシュ基材のシートを、密に充填した構成、及び緩く充填した構成でモデリングした。これらは、モデリングされている特定のメッシュシートに関する、基材積層体の充填密度の上限及び下限を表す。特に、図２０Ａは、密に充填した構成の平面図を示し、図２０Ｂは、同じ積層体の断面側面図を示す。図２１Ａ及び２１Ｂはそれぞれ、緩く充填した構成の平面図及び断面図を示す。モデリングした構成それぞれに関して、サンプルセル６００、６０２を画定した。サンプルセルは、サンプルセル６００、６０２の単位体積あたりの多孔率を分析するために、同一体積のメッシュ材料を内包する。各セル内の開放空間の、モデリングした体積を、（密に充填した積層体について）図２２Ａ及び（緩く充填した積層体について）図２２Ｂに示す。開放空間のパーセンテージとしての多孔率は、緩く充填したセルについて約４０．８％であり、密に充填したセルについて６１．４％であった。図２０Ａ～２１Ｂのモデリングした積層体は、所与のメッシュ材料の、最も密に充填した構成、及び最も緩く充填した構成を表しているため、４０．８％及び６１．４％という多孔率は、この特定のメッシュ材料に関する多孔率の上限及び下限である。このメッシュ材料を使用する場合の、位置合わせ、及び現実での充填密度に応じて、多孔率はこれらの極値の間に入ることができる。しかしながら、本開示の実施形態はこの多孔率範囲に限定されない。というのは、細胞培養容器内の基材のメッシュ寸法及び配置の変化が、異なる範囲の多孔率をもたらす可能性があるためである。

【0090】

モデリングした多孔率範囲に加えて、実際のＰＥＴ織布メッシュ基材の充填層を用いて、多孔率を測定した。この測定は、ランダムな位置合わせで積層した、それぞれ直径が２２．４ｍｍである１００個のディスクを用いて行われた。１００個のディスクの積層体の総重量は、５．６５±０．２ｇであった。この積層体のＰＥＴ材料の体積を、ＰＥＴ密度を１．３８ｇ／ｃｍ^３と仮定して、以下の式：

【0091】

【数2】

【0092】

を用いて計算した。これにより、（直径２２．４ｍｍの１００個のディスクに関する）５．６５ｇのＰＥＴについてのＰＥＴ体積Ｖ_ＰＥＴは、４．１ｍｌであるものと計算された。次に、ＰＥＴ体積Ｖ_ＰＥＴと、積層体内の開放空間の体積とを含む、積層体の総体積Ｖ_{ｔｏｔａｌ}を、以下の式：

【0093】

【数3】

【0094】

を用いて計算した。１００個のディスクの積層体は、２５±１ｍｍの積層体高さを有していた。よって、ディスクの直径が２２．４ｍｍであることにより、Ｖ_{ｔｏｔａｌ}は９．８５ｍｌであることが分かった。従って、積層された充填層の多孔率は、以下の式：

【0095】

【数4】

【0096】

を用いて計算できる。式４及び上述の複数の値を用いて、多孔率は５８．４％であるものと計算された。これはモデルによって予測された範囲内である。

【0097】

実施例７
実施例７では、様々なＰＥＴ織布メッシュ基材材料の透過率を比較した。表５は、この比較に使用したＰＥＴメッシュ試料を示す。

【0098】

【表5】

【0099】

メッシュ試料Ａ～Ｆの写真が図２３に示されている。各メッシュ試料Ａ～Ｆの透過率の結果は、図２４に示されている。図２５は、試料Ａ～Ｃに関する圧力降下試験の結果を示し、ここで圧力降下試験は、試料Ａに関して、異なる構成及び充填密度の複数の積層体で実施された。点線は、メッシュ試料Ａに関する密な及び緩い充填密度を表し、試料Ａ_１は、Ａ_２に比べて緩く充填された積層体である。センチメートルあたりの圧力の変化（Ｐａ）に関する圧力降下が、Ｑ／Ａに対してプロットされている。

【0100】

実施例８
本明細書に記載されているように、本開示の実施形態は、拡張可能であり、かつ細胞集団を漸増させるための細胞シードトレインを提供するために使用できる、細胞培養基材、バイオリアクターシステム、及び細胞又は細胞副産物の培養方法を提供する。既存の細胞培養溶液の１つの問題は、所与のバイオリアクターシステムの技術をシードトレインの一部とすることができない点である。その代わり、細胞集団は通常、様々な細胞培養基材上で拡張される。これは細胞集団に悪影響を及ぼす可能性がある。というのは、細胞は特定の表面に順応し、異なるタイプの表面に移されることが非効率性につながり得るためである。よって、複数の細胞培養基材又は技術の間でのこのような移動を、最小限に抑えることが望ましい。本開示の実施形態によって実現できるように、シードトレインにわたって同一の細胞培養基材を使用することによって、細胞集団の拡張の効率が向上する。図２６は、１つ以上の実施形態の一例を示し、ここでは、本出願の織布細胞培養基材をシードトレインの一部として使用することにより、比較的小さなバイオリアクターが、比較的大きなバイオリアクターに播種できるようにする。具体的には、図２６に示されているように、シードトレインは開始細胞のバイアルを用いて開始でき、これは第１の容器（例えばＣｏｒｎｉｎｇ製のＴ１７５フラスコ）、次に第２の容器（例えばＣｏｒｎｉｎｇ製のＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標））、次に本発明の実施形態によるプロセス開発規模のバイオリアクターシステム（基材の有効表面積＝約２０，０００ｃｍ^２）、そして本発明の実施形態による比較的大きなバイオリアクターパイロットシステム（基材の有効表面積＝約３００，０００ｃｍ^２）へと播種される。このシードトレインの最後には、細胞を、本開示の実施形態による製造規模のバイオリアクター容器に播種でき、これは例えば約５，０００，０００ｃｍ^２の表面積を有する。その後、細胞培養の完了時に採取及び精製ステップを実施できる。図２６に示されているように、採取は、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００等）を用いたインサイチュでの細胞溶解によって、又は機械的溶解によって、達成でき、更に必要に応じて下流の処理を実施できる。

【0101】

シードトレイン内で（例えばプロセス開発レベルからパイロットレベルまで、又は更に製造レベルまで）同一の細胞培養基材を使用する利点としては：シードトレイン及び製造段階中、細胞が同一の表面に適応していることによって得られる効率；シードトレインの複数のフェーズの間の手動の自由操作の数の削減；本明細書に記載されているような均一な細胞分布及び流体流による、充填層のより効率的な使用；並びにウイルスベクターの採取中の機械的又は化学的溶解の使用の柔軟性が挙げられる。

【0102】

実施例９
本開示の基材のウイルス産生収率の潜在的な改善を理解するために、ＰＥＴ織布メッシュ基材の性能を、ｉＣｅｌｌｉｓで使用される基材の性能と比較した。表６は、これらの基材を簡略化されたバイオリアクター内で使用して産生されるウイルス粒子の総数をまとめたものである。

【0103】

【表6】

【0104】

表６の結果から、特定の個数のウイルス粒子を産生するために必要な基材材料の体積を計算できる。例えば、製造規模のウイルスベクター産生の目標が、表７に示されているように、３．００Ｅ＋１８のウイルス粒子である場合、必要なＰＥＴ織布メッシュの体積は、必要なｉＣｅｌｌｉｓ基材の量の約１／７である。

【0105】

【表7】

【0106】

実施例１０
本開示の粗メッシュ基材を通る均一な流れを実証するために、充填層バイオリアクターを通る流体の流速をモデリングした。図２７Ａは、ＰＥＴ織布メッシュディスクの充填層領域６２２を有する容器６２０に関する、モデリング結果を示し、上記充填層領域６２２は、６ｃｍの直径及び１０ｃｍの充填層高さを有し、ＰＥＴ織布メッシュ基材の３５７個のディスクからなる。流体速度の大きさを、図示されているスケールに従って示す。流速は入口６２４及び出口６２６の付近で高いが、この速度は、充填層領域６２２全体を通して、例えば充填層の高さに沿って、及び充填層の幅にわたって、一定である。点線６２８が示す領域を図２７Ｂに拡大して示すが、これは、流体が細胞培養マトリクスの均一な粗い構造に入ると、速度が比較的一定となることを示している。この実施例の充填層は、約２４，２１４ｃｍ^２の総表面積に相当する。モデルで示される所与の均一な流れについて、（平均速度から２．５％超の偏差として定義される）均一でない流れに曝露されるこの表面積のパーセンテージは０％であった。

【0107】

容器のサイズを拡張してもこの均一な流れが持続する程度を実証するために、図２７Ａと同様に、ただし幅が漸増する複数の容器（充填層の幅も広くなる）を用いて、更なるモデリングを実施した。これらのより大きな容器からの不均一な流れのパーセンテージを表８にまとめる。図示されているように、反応器を直径６０ｃｍまで拡張した場合であっても、不均一な流れの量は、基材の表面積の約１／２パーセント以下のままである。これは、本明細書に記載の均一な粗織布メッシュが、既存の細胞培養基材とは異なり、充填層全体にわたる均一な流れを実現できることを示している。

【0108】

【表8】

【0109】

実施例１１
本開示の織布メッシュ基材と、既存の市場にある不織布の不規則な基材との間の透過率の差を、より良好に理解するために、これらの材料の透過率を測定するための実験を実施した。特に、ＰＥＴ織布メッシュを、ｉＣｅｌｌｉｓで使用される不織布基材、及び市販の同様の不織布の、整然とした構成ではない基材と比較した。積層されたディスクの充填層の織布メッシュ基材総に対して垂直な流れ、不織布基材のランダムな充填層を通る流れ、及び不織布基材材料の固定されたシートを通る流れについて、透過率の測定を実施した。不織布メッシュは、約２０μｍの繊維直径、約０．１８ｍｍの厚さ、及び９１％の多孔率を有していた。織布メッシュ基材は、約１６０μｍの直径、及び２５０μｍの開口直径を有していた。

【0110】

メッシュの透過率に関して、細胞培養培地をシミュレートするための試験に水を使用した。
バイオリアクター内で基材が典型的に受ける流れ条件をシミュレートするために、蠕動ポンプを用いて、流量を１５～５０ｍｌ／ｃｍ^２／分となるように制御した。試験条件下で試料が受ける圧力降下が小さいため、試料間の圧力差を測定するために圧力計を使用した。基材のタイプ及び充填方法が異なるため、基材はわずかに異なる方法で保持された。

【0111】

不織布メッシュを横断する流れを測定するために、試料を直径１２ｍｍのディスクに切断し、Ｏリングで封止された２つの開放円筒状チャンバの間に、１０段のメッシュを保持した。圧力計を上記開放チャンバに直接接続して、圧力降下を測定した。

【0112】

ランダムに充填された不織布メッシュを通る流れを測定するために、メッシュを５ｍｍ×２５ｍｍのストリップに切断し、直径２９ｍｍの円筒状チャンバに充填した。合計３ｇのメッシュストリップを、３０ｍｌ、及び充填層の高さ約４５ｍｍとなるように、充填した。充填されたストリップの各側では、２つの粗織布メッシュのディスクを用いて充填層を閉じ込めた。充填層の各側には厚さ約３ｍｍの開放空間が存在し、厚さ１０ｍｍの２つの多孔質材料の片を用いて、入口及び出口において流れを再分配した。

【0113】

粗織布メッシュを通る流れを測定するために、メッシュを、円筒状チャンバにフィットするように、直径２９ｍｍのディスクに切断した。合計１７０個のディスクを１層ずつ、充填層の高さが４５ｍｍとなるように充填した。メッシュの各段の繊維の配向は、互いに整列されていなかった。流れはメッシュディスクを横断する（即ちディスク表面に対して垂直な）ものであった。充填層の各側には厚さ約３ｍｍの開放空間が存在し、厚さ１０ｍｍの２つの多孔質材料の片を用いて、入口及び出口において流れを再分配した。

【0114】

透過率は、式（５）：

【0115】

【数5】

【0116】

を用いて計算され、ここで：Ｑ＝流量であり；Ｋ＝透過率であり；Ａ＝試料又は充填層の断面積であり；ｄＰ＝試験試料又は充填層にわたる圧力降下であり；μ＝水の粘度であり；ｄＬ＝全体としての試料の厚さ又は充填層の高さである。

【0117】

最終的に計算された透過率を図２８にまとめる。これらの結果は、不織布メッシュが、粗織布メッシュを横断する透過率の約１／５０である、約７．５×１０^－１２ｍ^２という極めて低い透過率を有していたことを示す。不織布メッシュを小さなストリップに切断してランダムに充填すると、その透過率は大幅に上昇し、粗織布メッシュと同程度となった。この透過率の上昇は、上述のチャネリング効果によって、流れのほとんどがメッシュストリップの周りを迂回した結果であると考えられる。

【0118】

測定された透過率に基づいて、不織布メッシュ及び粗織布メッシュを通る、並びにこれらの周りの、流れをシミュレートした。シミュレーションは、ＡＮＳＹＳ Ｆｌｕｅｎｔ ｖ１９．２ソフトウェアパッケージを用いて実施した。例示を目的として、図２９Ａ及び２９Ｂに示されているように、基材材料の表面を流れ方向に対して（ｉ）９０°及び（ｉｉ）４５°に整列させた２つのシナリオを研究した。いずれの場合においても、同一段の近隣のメッシュの間の間隔が５ｍｍである場合、流れのほとんどはメッシュの周りにあり、流れの約０．０２～０．００５％しかメッシュを通過しなかった。これにより、メッシュの背後に相当なデッドゾーンが形成され、充填層を通る不均一な流れが発生する。この不均一性は、不織布メッシュ片が流れ方向に対して完璧に垂直に位置合わせされていない場合に、より重度になる。

【0119】

粗織布メッシュの場合、粗い構造によって、流れがメッシュを容易に通ることができるようになり、粗メッシュ層の背後にデッドゾーンが形成されなかった。織布メッシュの規則的な構造も、各段を通る均一な流れの分布に寄与したと考えられる。そしてこれにより、充填層全体を通るより均一な流れを実現できる。図３０Ａ（不織布メッシュ片）及び３０Ｂ（粗織布メッシュ基材）に比較が明確に示されており、これらの図は、基材材料の縁部付近における流れの拡大図を示す。図３０Ａ及び３０Ｂの場合、６方向全てにおける近隣のメッシュ片との間の空隙は、１ｍｍに縮められており、このような１つのメッシュ片の周期的なドメインのみがシミュレートされている。図３０Ａは、不織布メッシュが極めて低い透過率を有することを示しており、これは、流れのほとんどが基材を迂回し、ごくわずかな流れしか基材自体を通らないためである。全質量流の０．１７％しか、不織布メッシュを通過しない。対照的に、粗織布メッシュははるかに高い透過率を有し、従って図３０Ｂに示されているように、より多くの流れが粗織布メッシュを通過する。上記空隙を通ってショートカットする流れは、上記２つのケースのカラーバーを比較すると弱くなっている。粗織布メッシュに関しては、総質量流量の１０．７％もが基材を通過しており、これは粗織布メッシュが、空隙を伴って充填された場合であっても優れた透過率を有することを実証している。

【0120】

本明細書に記載されているように、複数の織布メッシュディスクを、ディスク間の位置合わせについて無数のバリエーションで、ランダムに充填できる。しかしながら、可能な位置合わせの範囲は、充填密度（即ち最も密な充填及び最も緩い充填）に基づく、２つの理論上の限界へと削減できる。これら２つの理想的な又は限界の状態により、大きな充填層を小さな周期的ドメインへと簡略化できる。このモデルを用いると、基材を通る透過率が、最も密な充填の限界から最も緩い充填の限界までで、およそ１０倍異なることが分かった。実験によって測定された上述の透過率データは、この範囲内に十分収まっており、良好な検証ポイントとして機能した。またモデルは、いずれの充填条件においても、流れ方向における透過率が横断方向における透過率と同等であることも示した。これは、本開示の織布メッシュが、本発明者らが不織布基材において観察したほどには流れ方向を変化させず、基材の配向にかかわらず、流れをより均一にすることを示唆している。本開示の基材の流れの均一性の改善は、以下の実施例における滞留時間分布（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ：ＲＴＤ）測定によって更に実証された。

【0121】

実施例１２
滞留時間分布（ＲＴＤ）は、容器内の流れの研究に有用である。その理論、測定、及び分析については、教科書：Ｌｅｖｅｎｓｐｉｅｌ， Ｏ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ３ｅｄ． １９９９． Ｗｉｌｅｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで見ることができる。図５は、ＲＴＤを測定するための設定の概略図である。チャンバは、２９ｍｍの直径及び合計３６ｍｌの充填層容積を有する円筒状であり、３．６ｇの不織布メッシュ又は２００層の粗織布メッシュを容器のチャンバに満たした。１：２０００希釈済みＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｇｒｅｅｎ Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｏｒを、測定のトレーサーとして使用した。ＦｌｏｗｃｅｌｌによるＵＶ‐ｖｉｓを用いて、トレーサーの濃度の変化を監視した。２２．５ｍｌ／ｍｌの流量を全ての実験に使用した。チャンバをまず水で満たした。緑色染料に切り替えた後、ＯＤの変化を記録した。結果を図３２に示す。

【0122】

以下の式を用いて、平均滞留時間ｔ（式（６））及び分散σ（式（７））を計算した：

【0123】

【数6】

【0124】

【数7】

【0125】

ここでＦは、ステップトレーサー応答における正規化された濃度である。表９は、測定から計算された平均滞留時間及び偏差をまとめたものである。粗織布メッシュは比較的短い平均滞留時間を示し、これは、低い多孔率及びデッドゾーンの減少によるものと思われた。粗織布メッシュの充填層では多孔率は約６０％であり、その一方で、不織布メッシュは約９３％という比較的高い多孔率を有している。不織布メッシュの充填層で検出される正規化済みの偏差が極めて大きいことは、不織布メッシュの均一性が低かった、又は不織布メッシュが理想から遠かったことを示唆している。

【0126】

【表9】

【0127】

以上の透過率及び滞留時間の実験から、現行のバイオリアクターで使用されている不織布の不規則なタイプの細胞培養基材が、本開示の基材より低い透過率を有することが示されている。これらの不織布基材はまた、該不織布基材に対する流れの方向に応じて異なる透過率又は流量を有するが、本開示の基材は、基本的に等方性の流れ挙動を示す。上記不織布基材の不規則な流れ及び短い滞留時間を理由として、栄養素及びトランスフェクション試薬が、基材表面又は基材層の他の側部上の細胞に到達するまでに、本開示の均一な織布メッシュ基材に比べて長い時間がかかる可能性がある。これに加えて、ランダムに充填された不織布基材の透過率は高く、これは強いチャネリング効果と、これに伴う細胞又は栄養素の不均一な送達とを示唆する。

【0128】

例示的な実装形態
以下は、本開示の主題の実装形態の様々な態様の説明である。各態様は、本開示の主題の様々な特徴部分、特徴、又は利点のうちの１つ以上を含み得る。これらの実装形態は、本開示の主題のいくつかの態様を例示することを意図したものであり、全ての可能な実装形態の包括的又は網羅的説明として解釈してはならない。

【0129】

態様１は細胞培養マトリクスを対象とし、上記細胞培養マトリクスは：基材であって、上記基材は、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部と、上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さと、上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口とを備える、基材を含み、上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするように構成される。

【0130】

態様２は、上記基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0131】

態様３は、上記基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様１又は態様２に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0132】

態様４は、上記基材が、１つ以上の繊維を含む上記織布メッシュを含む、態様３に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0133】

態様５は、上記１つ以上の繊維が、平坦、円形、長方形、及び多角形のうちの少なくとも１つの断面形状を有する、態様４に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0134】

態様６は、上記１つ以上の繊維が、モノフィラメント繊維及びマルチフィラメント繊維のうちの少なくとも１つを含む、態様４又は態様５に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0135】

態様７は、上記１つ以上の繊維が、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様４～６のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0136】

態様８は、上記１つ以上の繊維が更に、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維を含む、態様７に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0137】

態様９は、上記第２の繊維直径が上記第１の繊維直径と異なる、態様８に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0138】

態様１０は、上記複数の開口が、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、態様１～９のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0139】

態様１１は、上記繊維直径が約２５０μｍ～約３００μｍであり、上記開口直径が約７５０μｍ～約８００μｍであるか；又は上記繊維直径が約２７０μｍ～約２７６μｍであり、上記開口直径が約７８５μｍ～約７９５μｍである、態様１０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0140】

態様１２は、上記繊維直径が約２００μｍ～約２３０μｍであり、上記開口直径が約５００μｍ～約５５０μｍであるか；又は上記繊維直径が約２１５μｍ～約２２５μｍであり、上記開口直径が約５１５μｍ～約５３０μｍである、態様１０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0141】

態様１３は、上記繊維直径が約１２５μｍ～約１７５μｍであり、上記開口直径が約２２５μｍ～約２７５μｍであるか；又は上記繊維直径が約１５０μｍ～約１６５μｍであり、上記開口直径が約２３５μｍ～約２５５μｍである、態様１０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0142】

態様１４は、上記繊維直径に対する上記開口直径の比が、約１．０～約３．５、約１．２５～約３．２５、約１．４～約３．０、約１．５～約２．９、約１．５～約２．４、又は約２．４～約２．９である、態様１０～１３のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0143】

態様１５は、上記複数の開口が、正方形、長方形、菱形、偏菱形、円形、又は楕円形の形状を有する開口を含む、態様１～１４のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0144】

態様１６は、上記複数の開口が規則的なパターンに配列されている、態様１～１５のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0145】

態様１７は、上記細胞培養マトリクスが単層基材を含む、態様１～１６のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0146】

態様１８は、上記細胞培養マトリクスが、少なくとも１つの第１の基材層及び少なくとも１つの第２の基材層を備える多層基材を含み、上記第１の基材層が、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部とを備え、上記第２の基材層が、第３の側部と、上記第３の側部の反対側の第４の側部とを備え、上記第２の側部が上記第３の側部と対面する、態様１～１７のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0147】

態様１９は、上記多層基材が、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対して所定の位置合わせを有するように構成される、態様１８に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0148】

態様２０は、上記多層基材が、上記第１の基材層の繊維の交点が上記第２の基材層の開口と対面するように構成される、態様１９に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0149】

態様２１は、上記第１の基材層の開口が、上記第２の基材層の上記開口と少なくとも部分的に重なる、態様１９又は態様２０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0150】

態様２２は、上記第１の基材層及び上記第２の基材層の上記開口が位置合わせされる、態様２１に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0151】

態様２３は、上記多層基材が、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対するランダムな位置合わせを有するように構成される、態様１８に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0152】

態様２４は、上記細胞培養マトリクスが複数の上記基材を含み、上記複数の基材はそれぞれ、上記複数の基材のうちの他の上記基材に対してランダムに配向される、態様１～２３のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0153】

態様２５は、上記細胞培養マトリクスが、積層構成の複数の上記基材を含む、態様１～２３のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0154】

態様２６は、上記複数の基材のうちの１つの、上記第１の側部及び上記第２の側部が、上記積層構成内の他の上記基材の上記第１の側部及び上記第２の側部に対して、略平行である、態様２５に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0155】

態様２７は、上記基材が円筒状ロール構成である、態様１～２３のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0156】

態様２８は、上記円筒状ロールが、上記培養チャンバ内に配置されたときに上記円筒状ロールが部分的に解けることによって、上記バイオリアクター容器内の培養チャンバの形状へと広がるよう構成される、態様２７に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0157】

態様２９は、上記円筒状ロールが、上記円筒状ロールが収縮状態にある間に上記培養空間に挿入され、上記培養空間内に配置されると上記培養空間内で広がるように構成される、態様２８に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0158】

態様３０は、上記細胞培養マトリクスが、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の基材を含み、上記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様１～２９のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0159】

態様３１は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、上記バイオリアクター容器内での所望の流れ特性に基づいて、所定の配置で並べられる、態様３０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0160】

態様３２は、上記所望の流れ特性が、上記細胞培養マトリクスにわたる液体培地の均一な灌流、及び上記細胞培養マトリクスにわたる細胞成長の分布のうちの少なくとも１つを含む、態様３１に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0161】

態様３３は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、第１のジオメトリを有する第１のメッシュ、及び第２のジオメトリを有する第２のメッシュを含み、上記所定の配置が、上記第１のメッシュを、上記細胞培養マトリクスを通る細胞培養培地の所望のバルク流方向に関して上記第２のメッシュの上流とすることを含む、態様３１又は３２に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0162】

態様３４は、上記所定の配置が、上記第１のメッシュの積層体を上記第２のメッシュの積層体の上流に配置することを含む、態様３３に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0163】

態様３５は、上記所定の配置が、上記第１のメッシュの複数の積層体と、上記第２のメッシュの複数の積層体との、上記バルク流方向に沿った交互配置を含む、態様３３又は態様３４に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0164】

態様３６は、上記細胞培養マトリクスが、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ‐ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つの、培養及び／又は採取のために構成される、態様１～３５のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0165】

態様３７は、上記基材が官能化表面を備え、上記官能化表面は、上記ポリマーメッシュ材料に対する上記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、態様１～３６のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0166】

態様３８は、上記細胞培養マトリクスが、上記メッシュの上記表面への上記培養培地中の成分の吸着又は吸収のために構成された、表面を備える、態様１～３７のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0167】

態様３９は、上記細胞培養マトリクスが、上記ポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを備え、上記コーティングは、上記付着細胞の付着を促進するよう構成される、態様１～３８のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0168】

態様４０は、上記細胞が上記コーティングに付着する、態様３９に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0169】

態様４１は、上記コーティングが、上記細胞培養マトリクスへの細胞の付着を促進するよう構成された、生物分子又は合成生体活性分子である、態様３９又は態様４０に記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0170】

態様４２は、上記コーティングが、ヒドロゲル、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、生体活性分子又はペプチド、及び生物タンパク質のうちの少なくとも１つである、態様３９～４１のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0171】

態様４３は、上記官能化表面がプラズマ処理される、態様３９～４２のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0172】

態様４４は、上記細胞が、上記織布メッシュに付着する、付着細胞、浮遊細胞、及び弱付着細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様１～４３のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0173】

態様４５は、バイオリアクターシステムを対象とし、上記バイオリアクターシステムは：少なくとも１つのリザーバを備える細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスを備え、上記細胞培養マトリクスは、細胞を付着させるために構成された表面を有する複数の織り合わされた繊維を有する、織布基材を含む。

【0174】

態様４６は、上記織布基材が、上記複数の織り合わされた繊維の均一な配置を含む、態様４５に記載のシステムを対象とする。

【0175】

態様４７は、上記織布基材が、上記複数の繊維の間に配置された複数の開口を備える、態様４５又は態様４６に記載のシステムを対象とする。

【0176】

態様４８は、上記複数の繊維がポリマー繊維を含む、態様４５～４７のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0177】

態様４９は、上記ポリマー繊維が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様４８に記載のシステムを対象とする。

【0178】

態様５０は、上記細胞培養マトリクスが複数の織布基材を含む、態様４５～４９のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0179】

態様５１は、上記複数の基材それぞれが：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さを備え、上記複数の開口が上記基材の上記厚さを通過する、態様５０に記載のシステムを対象とする。

【0180】

態様５２は、上記複数の基材が互いに隣接して配設されることにより、ある上記基材の上記第１の側部及び上記第２の側部のうちの一方が、隣接する基材の上記第１の側部及び上記第２の側部のうちの他方と隣接する、態様５０又は態様５１に記載のシステムを対象とする。

【0181】

態様５３は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、スペーサ材料又はバリアによって隔てられていない、態様５０～５２のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0182】

態様５４は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、互いに物理的に接触している、態様５０～５３のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0183】

態様５５は、上記細胞培養容器が少なくとも１つのポートを備え、上記少なくとも１つのポートは、上記少なくとも１つのポートを通して、上記少なくとも１つのリザーバに対して材料を供給又は除去するよう構成される、態様４５～５４のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0184】

態様５６は、上記少なくとも１つのポートが、上記少なくとも１つのリザーバに材料を供給するための少なくとも１つの入口、及び上記少なくとも１つのリザーバから材料を除去するための少なくとも１つの出口を備える、態様５５に記載のシステムを対象とする。

【0185】

態様５７は、上記材料が、培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つを含む、態様５６に記載のシステムを対象とする。

【0186】

態様５８は：バイオリアクター容器と；上記バイオリアクター容器内に配置され、細胞を培養するために構成された、細胞培養マトリクスとを備える、細胞培養システムを対象とし、上記細胞培養マトリクスは：基材であって、上記基材は、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部と、上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さと、上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口とを備える、基材を含み、上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするように構成される。

【0187】

態様５９は、上記基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様５８に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0188】

態様６０は、上記基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様５８又は態様５９に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0189】

態様６１は、上記基材が、１つ以上の繊維を含む上記織布メッシュを含む、態様６０に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0190】

態様６２は、上記１つ以上の繊維が、平坦、円形、長方形、及び多角形のうちの少なくとも１つの断面形状を有する、態様６１に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0191】

態様６３は、上記１つ以上の繊維が、モノフィラメント繊維及びマルチフィラメント繊維のうちの少なくとも１つを含む、態様６１又は態様６２に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0192】

態様６４は、上記１つ以上の繊維が、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様６１～６３のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0193】

態様６５は、上記１つ以上の繊維が更に、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維を含む、態様６４に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0194】

態様６６は、上記第２の繊維直径が上記第１の繊維直径と異なる、態様６５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0195】

態様６７は、上記複数の開口が、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、態様５８～６４のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0196】

態様６８は、上記繊維直径が約２５０μｍ～約３００μｍであり、上記開口直径が約７５０μｍ～約８００μｍであるか；又は上記繊維直径が約２７０μｍ～約２７６μｍであり、上記開口直径が約７８５μｍ～約７９５μｍである、態様６７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0197】

態様６９は、上記繊維直径が約２００μｍ～約２３０μｍであり、上記開口直径が約５００μｍ～約５５０μｍであるか；又は上記繊維直径が約２１５μｍ～約２２５μｍであり、上記開口直径が約５１５μｍ～約５３０μｍである、態様６７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0198】

態様７０は、上記繊維直径が約１２５μｍ～約１７５μｍであり、上記開口直径が約２２５μｍ～約２７５μｍであるか；又は上記繊維直径が約１５０μｍ～約１６５μｍであり、上記開口直径が約２３５μｍ～約２５５μｍである、態様６７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0199】

態様７１は、上記繊維直径に対する上記開口直径の比が、約１．０～約３．５、約１．２５～約３．２５、約１．４～約３．０、約１．５～約２．９、約１．５～約２．４、又は約２．４～約２．９である、態様６７～７０のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0200】

態様７２は、上記複数の開口が、正方形、長方形、菱形、偏菱形、円形、又は楕円形の形状を有する開口を含む、態様５８～７１のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0201】

態様７３は、上記複数の開口が規則的なパターンに配列されている、態様５８～７２のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0202】

態様７４は、上記細胞培養マトリクスが単層基材を含む、態様５８～７３のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0203】

態様７５は、上記細胞培養マトリクスが多層基材を含み、上記多層基材が、少なくとも１つの第１の基材層及び少なくとも１つの第２の基材層を備え、上記第１の基材層が、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部とを備え、上記第２の基材層が、第３の側部と、上記第３の側部の反対側の第４の側部とを備え、上記第２の側部が上記第３の側部と対面する、態様５８～７４のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0204】

態様７６は、上記多層基材が、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対して所定の位置合わせを有するように構成される、態様７５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0205】

態様７７は、上記多層基材が、上記第１の基材層の繊維の交点が上記第２の基材層の開口と対面するように構成される、態様７６に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0206】

態様７８は、上記第１の基材層の開口が、上記第２の基材層の上記開口と少なくとも部分的に重なる、態様７６又は態様７７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0207】

態様７９は、上記第１の基材層及び上記第２の基材層の上記開口が位置合わせされる、態様７８に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0208】

態様８０は、上記多層基材が、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対するランダムな位置合わせを有するように構成される、態様７５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0209】

態様８１は、上記バイオリアクター容器を通る培地のバルク流方向が、上記第１の側部及び上記第２の側部に対して平行又は垂直となるように、上記細胞培養マトリクスが上記バイオリアクター容器内に配置される、態様５８～８０のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0210】

態様８２は、上記細胞培養マトリクスが、上記バイオリアクター容器内にランダムに充填された複数の上記基材を含む、態様５８～８１のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0211】

態様８３は、上記バイオリアクター容器が充填層バイオリアクターである、態様５８～８２のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0212】

態様８４は、上記バイオリアクター容器が：上記バイオリアクター容器内に配置され、上記細胞培養マトリクスを内包する、培養空間；上記培養空間に対して流体を供給又は除去するよう構成された１つ以上の開口を備える、態様５８～８３のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0213】

態様８５は、上記１つ以上の開口が、上記培養空間の内部に流体を供給するよう構成された入口と、上記バイオリアクター容器の上記培養空間から流体を除去できるように構成された出口とを含む、態様８４に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0214】

態様８６は、上記バイオリアクター容器が、上記入口を備える第１の端部と、上記第１の端部の反対側の、上記出口を備える第２の端部とを備え、上記培養空間が上記第１の端部と上記第２の端部との間に配置される、態様８５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0215】

態様８７は、上記細胞培養マトリクスが上記培養空間の形状に対応する形状を有する、態様８６に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0216】

態様８８は、上記細胞培養マトリクスが、円筒状ロール構成の上記ポリマーメッシュ材料を含む、態様５８～８７のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0217】

態様８９は、上記円筒状ロールの中心長手方向軸が、上記培地の流れ方向に対して平行である、態様８８に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0218】

態様９０は、上記円筒状ロールが、上記円筒状ロールが解けることによって、上記バイオリアクター容器内の上記培養空間の形状へと広がるよう構成される、態様８８又は態様８９に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0219】

態様９１は、上記円筒状ロールが、上記円筒状ロールが収縮状態にある間に上記培養空間に挿入され、上記培養空間内に配置されると上記培養空間内で広がるように構成される、態様８８～９０のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0220】

態様９２は、上記ポリマーメッシュ材料と上記培養空間の壁との間の摩擦力によって、上記ポリマーメッシュ材料が上記培養空間内の所定の位置に保持されるように、上記円筒状ロール及び上記培養空間が構成される、態様８８～９１のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0221】

態様９３は、上記円筒状ロールが、上記バイオリアクター容器の開口を通って上記培養空間に挿入されるよう構成される、態様９１に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0222】

態様９４は、上記開口が、上記バイオリアクター容器の上記入口及び上記出口のうちの一方である、態様９３に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0223】

態様９５は、上記バイオリアクター容器が、上記培養空間内に基材支持体を備え、上記基材支持体は、上記細胞培養マトリクスを、上記培養空間内でガイドする、整列させる、又は固定するよう構成される、態様８８～９４のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0224】

態様９６は、上記基材支持体が、上記第１の端部及び上記第２の端部のうちの一方から上記第１の端部及び上記第２の端部のうちの他方に向かって延在する支持部材を備え、上記円筒状ロールが、上記支持部材が上記円筒状ロールの上記中心長手方向軸に対して平行となるように、上記支持部材を取り囲むよう構成される、態様９５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0225】

態様９７は、上記バイオリアクター容器が、細胞培養中に上記バイオリアクター容器の中心長手方向軸の周りで回転するよう構成される、態様５８～９６のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0226】

態様９８は、上記中心長手方向軸が、細胞培養中に、重力の方向に対して垂直となる、態様９７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0227】

態様９９は、上記バイオリアクター容器の上記回転中に上記基材が細胞培養流体を通って移動するように、上記細胞培養システムが構成される、態様９７又は態様９８に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0228】

態様１００は、上記細胞培養システムが回転手段を更に備え、上記回転手段は、上記バイオリアクター容器に動作可能に連結され、また上記バイオリアクター容器を上記中心長手方向軸の周りで回転させるよう構成される、態様９７～９９のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0229】

態様１０１は、上記細胞培養マトリクスが、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の基材を含み、上記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様５８～１００のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0230】

態様１０２は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、上記バイオリアクター容器内での所望の流れ特性に基づいて、所定の配置で上記バイオリアクター容器内に配置される、態様１０１に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0231】

態様１０３は、上記所望の流れ特性が、上記細胞培養マトリクスにわたる液体培地の均一な灌流、及び上記細胞培養マトリクスにわたる細胞成長の分布のうちの少なくとも１つを含む、態様１０２に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0232】

態様１０４は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、第１のジオメトリを有する第１のメッシュ、及び第２のジオメトリを有する第２のメッシュを含み、上記所定の配置が、上記第１のメッシュを、上記バルク流方向に関して上記第２のメッシュの上流とすることを含む、態様１０２又は１０３に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0233】

態様１０５は、上記所定の配置が、上記第１のメッシュの積層体を上記第２のメッシュの積層体の上流に配置することを含む、態様１０４に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0234】

態様１０６は、上記所定の配置が、上記第１のメッシュの複数の積層体と、上記第２のメッシュの複数の積層体との、上記バルク流方向に沿った交互配置を含む、態様１０４又は態様１０５に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0235】

態様１０７は、上記付着細胞又は細胞副産物を採取するための手段を更に備える、態様５８～１０６のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0236】

態様１０８は、上記細胞副産物が、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つを含む、態様１０７に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0237】

態様１０９は、上記基材が官能化表面を備え、上記官能化表面は、上記ポリマーメッシュ材料に対する上記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、態様５８～１０８のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0238】

態様１１０は、上記細胞培養マトリクスが、上記メッシュの上記表面への上記培養培地中の成分の吸着又は吸収のために構成された、表面を備える、態様５８～１０９のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0239】

態様１１１は、上記細胞培養マトリクスが、上記ポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを備え、上記コーティングは、上記付着細胞の付着を促進するよう構成される、態様５８～１１０のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0240】

態様１１２は、上記細胞が上記コーティングに付着する、態様１１１に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0241】

態様１１３は、上記コーティングが、上記細胞培養マトリクスへの細胞の付着を促進するよう構成された、生物分子又は合成生体活性分子である、態様１１１又は態様１１２に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0242】

態様１１４は、上記コーティングが、ヒドロゲル、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、生体活性分子又はペプチド、及び生物タンパク質のうちの少なくとも１つである、態様１１１～１１３のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0243】

態様１１５は、上記官能化表面がプラズマ処理される、態様１１０～１１３のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0244】

態様１１６は、上記細胞が、上記織布メッシュに付着する、付着細胞、浮遊細胞、及び弱付着細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様５８～１１５のいずれか１つに記載の細胞培養マトリクスを対象とする。

【0245】

態様１１７は、培地を上記バイオリアクター容器の上記入口に供給するよう構成された、培地調質用容器を更に備える、態様５８～１１６のいずれか１つに記載の細胞培養システムを対象とする。

【0246】

態様１１８は、バイオリアクターシステムを対象とし、上記バイオリアクターシステムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを備える、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを備え、上記細胞培養マトリクスは、複数の織布基材を備え、各上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を含み、上記バイオリアクターシステムは、材料を、上記少なくとも１つのリザーバを通して、上記第１の端部から上記第２の端部への流れ方向に流すように構成され、また上記複数の織布基材は、各上記織布基材が他の各上記織布基材に対して略平行となり、また上記流れ方向に対して略垂直となるように、積層される。

【0247】

態様１１９は、各上記基材が：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さを備え、複数の開口が、上記基材の上記厚さを通過する、態様１１８に記載のシステムを対象とする。

【0248】

態様１２０は、上記基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１１８又は態様１１９に記載のシステムを対象とする。

【0249】

態様１２１は、上記複数の織り合わされた繊維が、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様１１８～１２０のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0250】

態様１２２は、上記複数の織り合わされた繊維が更に、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維を含む、態様１２１に記載のシステムを対象とする。

【0251】

態様１２３は、上記第２の繊維直径が上記第１の繊維直径以下である、態様１２２に記載のシステムを対象とする。

【0252】

態様１２４は、上記複数の開口が、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、態様１１９～１２３のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0253】

態様１２５は、上記繊維直径に対する上記開口直径の比が、約１．０～約３．５、約１．２５～約３．２５、約１．４～約３．０、約１．５～約２．９、約１．５～約２．４、又は約２．４～約２．９である、態様１１９～１２４のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0254】

態様１２６は、上記複数の開口が規則的なパターンに配列されている、態様１１９～１２５のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0255】

態様１２７は、上記細胞培養マトリクスが、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の基材を含み、上記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様１１８～１２６のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0256】

態様１２８は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、上記バイオリアクター容器内での所望の流れ特性に基づいて、所定の配置で並べられる、態様１２７に記載のシステムを対象とする。

【0257】

態様１２９は、上記細胞培養マトリクスが、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つの、培養及び／又は採取のために構成される、態様１１８～１２８のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0258】

態様１３０は、上記基材が官能化表面を備え、上記官能化表面は、上記ポリマーメッシュ材料に対する上記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、態様１１８～１２９のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0259】

態様１３１は、上記複数の織り合わされた繊維が、互いに対して、整然としたランダムでない配置で配置される、態様１１８～１３０のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0260】

態様１３２は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、スペーサ材料又はバリアによって隔てられていない、態様１１８～１３１のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0261】

態様１３３は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、互いに物理的に接触している、態様１１８～１３２のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0262】

態様１３４は、態様１１８～１３３のいずれか１つに記載のバイオリアクターシステム内で細胞を培養する方法を対象とし、上記方法は：細胞を上記細胞培養マトリクス上に播種するステップ；上記細胞を上記細胞培養マトリクス上で培養するステップ；及び上記細胞の上記培養の産物を採取するステップを含み、上記基材の上記複数の開口は、上記基材の上記厚さを通る、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの流れを可能とするように構成される。

【0263】

態様１３５は、上記播種するステップが、上記細胞を上記基材に付着させるステップを含む、態様１３４に記載の方法を対象とする。

【0264】

態様１３６は、上記播種するステップが、細胞接種材料を上記細胞培養マトリクスに直接注入するステップを含む、態様１３５に記載の方法を対象とする。

【0265】

態様１３７は、上記細胞接種材料を注入する上記ステップの後、上記培養チャンバを通して細胞培地を灌流させるステップを更に含む、態様１３４～１３６のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0266】

態様１３８は：上記バイオリアクター容器に流体接続された培地調質用容器を提供するステップ；及び上記細胞培養培地を上記培地調質用容器から上記バイオリアクター容器に供給するステップを更に含む、態様１３４～１３７のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0267】

態様１３９は、培養中又は培養後に、上記培地の少なくとも一部分が、上記バイオリアクター容器から除去されて、上記培地調質用容器に戻される、態様１３８に記載の方法を対象とする。

【0268】

態様１４０は、上記細胞培養チャンバへの上記細胞培養培地の上記流れを制御するステップを更に含み、上記細胞培養培地が、細胞、細胞培養用栄養素、及び酸素のうちの少なくとも１つを含む、態様１３４～１３９のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0269】

態様１４１は、バイオリアクターシステムを対象とし、上記バイオリアクターシステムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを備える、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを備え、上記細胞培養マトリクスは、複数の織布基材を備え、各上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を含み、上記バイオリアクターシステムは、材料を、上記少なくとも１つのリザーバを通して、上記第１の端部から上記第２の端部への流れ方向に流すように構成され、また上記複数の織布基材は、各上記織布基材が他の各上記織布基材に対して略平行となり、また上記流れ方向に対して略平行となるように、積層される。

【0270】

態様１４２は、各上記基材が：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さを備え、複数の開口が、上記基材の上記厚さを通過する、態様１４１に記載のシステムを対象とする。

【0271】

態様１４３は、上記基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１４１又は態様１４２に記載のシステムを対象とする。

【0272】

態様１４４は、上記複数の織り合わされた繊維が、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様１４１～１４３のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0273】

態様１４５は、上記複数の織り合わされた繊維が更に、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維を含む、態様１４４に記載のシステムを対象とする。

【0274】

態様１４６は、上記第２の繊維直径が上記第１の繊維直径以下である、態様１４５に記載のシステムを対象とする。

【0275】

態様１４７は、上記複数の開口が、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、態様１４２～１４６のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0276】

態様１４８は、上記繊維直径に対する上記開口直径の比が、約１．０～約３．５、約１．２５～約３．２５、約１．４～約３．０、約１．５～約２．９、約１．５～約２．４、又は約２．４～約２．９である、態様１４２～１４７のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0277】

態様１４９は、上記複数の開口が規則的なパターンに配列されている、態様１４２～１４８のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0278】

態様１５０は、上記細胞培養マトリクスが、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の基材を含み、上記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様１４１～１４９のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0279】

態様１５１は、異なるジオメトリの上記織布メッシュが、上記バイオリアクター容器内での所望の流れ特性に基づいて、所定の配置で並べられる、態様１５０に記載のシステムを対象とする。

【0280】

態様１５２は、上記細胞培養マトリクスが、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つの、培養及び／又は採取のために構成される、態様１４１～１５１のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0281】

態様１５３は、上記基材が官能化表面を備え、上記官能化表面は、上記ポリマーメッシュ材料に対する上記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、態様１４１～１５２のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0282】

態様１５４は、上記複数の織り合わされた繊維が、互いに対して、整然としたランダムでない配置で配置される、態様１４１～１５３のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0283】

態様１５５は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、スペーサ材料又はバリアによって隔てられていない、態様１４１～１５４のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0284】

態様１５６は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、互いに物理的に接触している、態様１４１～１５５のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0285】

態様１５７は、態様１４１～１５６のいずれか１つに記載のバイオリアクターシステム内で細胞を培養する方法を対象とし、上記方法は：細胞を上記細胞培養マトリクス上に播種するステップ；上記細胞を上記細胞培養マトリクス上で培養するステップ；及び上記細胞の上記培養の産物を採取するステップを含み、上記基材の上記複数の開口は、上記基材の上記厚さを通る、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの流れを可能とするように構成される。

【0286】

態様１５８は、上記播種するステップが、上記細胞を上記基材に付着させるステップを含む、態様１５７に記載の方法を対象とする。

【0287】

態様１５９は、上記播種するステップが、細胞接種材料を上記細胞培養マトリクスに直接注入するステップを含む、態様１５８に記載の方法を対象とする。

【0288】

態様１６０は、上記細胞接種材料を注入する上記ステップの後、上記培養チャンバを通して細胞培地を灌流させるステップを更に含む、態様１５７～１５９のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0289】

態様１６１は：上記バイオリアクター容器に流体接続された培地調質用容器を提供するステップ；及び上記細胞培養培地を上記培地調質用容器から上記バイオリアクター容器に供給するステップを更に含む、態様１５７～１６０のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0290】

態様１６２は、培養中又は培養後に、上記培地の少なくとも一部分が、上記バイオリアクター容器から除去されて、上記培地調質用容器に戻される、態様１６１に記載の方法を対象とする。

【0291】

態様１６３は、上記細胞培養チャンバへの上記細胞培養培地の上記流れを制御するステップを更に含み、上記細胞培養培地が、細胞、細胞培養用栄養素、及び酸素のうちの少なくとも１つを含む、態様１５７～１６２のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0292】

態様１６４は、バイオリアクターシステムを対象とし、上記バイオリアクターシステムは：第１の端部と、第２の端部と、上記第１の端部と上記第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバとを備えた、細胞培養容器；及び上記少なくとも１つのリザーバ内に配置された、細胞培養マトリクスを備え、上記細胞培養マトリクスは、織布基材を含み、上記織布基材は、細胞を付着させるために構成された表面を有する、複数の織り合わされた繊維を備え、上記織布基材は、上記少なくとも１つのリザーバ内に、巻かれた構成で配置され、これにより、円筒状細胞培養マトリクスが提供され、上記織布基材の表面が、上記円筒状細胞培養マトリクスの長手方向軸に対して平行となる。

【0293】

態様１６５は、上記織布基材が、上記バイオリアクター容器の上記中心長手方向軸を少なくとも部分的に取り囲む円筒状基材として、上記少なくとも１つのリザーバ内に配置される、態様１６４に記載のシステムを対象とする。

【0294】

態様１６６は、上記バイオリアクターシステムが、材料を、上記少なくとも１つのリザーバを通して、上記第１の端部から上記第２の端部への流れ方向に流すよう構成される、態様１６４又は態様１６５に記載のシステムを対象とする。

【0295】

態様１６７は、上記円筒状基材の中心長手方向軸が、上記培地の流れ方向に対して平行である、態様１６６に記載のシステムを対象とする。

【0296】

態様１６８は、上記円筒状基材が、巻かれた織布基材を含み、上記巻かれた織布基材は、上記巻かれた織布基材を解くことによって、広がって、上記少なくとも１つのリザーバの壁に接触するよう構成される、態様１６４～１６７のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0297】

態様１６９は、上記巻かれた織布基材が、上記細胞培養容器内の上記少なくとも１つのリザーバの内部の形状へと広がるよう構成される、態様１６４～１６８のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0298】

態様１７０は、上記巻かれた織布基材が、上記巻かれた織布基材が収縮ロール状態にある間に上記培養空間に挿入され、上記リザーバ内に配置されると上記リザーバ内で広がるように構成される、態様１６９に記載のシステムを対象とする。

【0299】

態様１７１は、上記巻かれた基材と上記リザーバの壁との間の摩擦力によって、上記巻かれた基材が上記リザーバ内の略所定の位置に保持されるように、上記巻かれた織布基材及び上記リザーバが構成される、態様１６９又は態様１７０に記載のシステムを対象とする。

【0300】

態様１７２は、上記巻かれた織布基材が、上記細胞培養容器の開口を通って上記リザーバに挿入されるよう構成される、態様１６９～１７１のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0301】

態様１７３は、上記開口が、上記細胞培養容器の上記入口及び上記出口のうちの一方である、態様１７２に記載のシステムを対象とする。

【0302】

態様１７４は、上記細胞培養容器が、上記リザーバ内に基材支持体を備え、上記基材支持体は、上記織布基材を、上記培養空間内でガイドする、整列させる、又は固定するよう構成される、態様１６４～１７３のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0303】

態様１７５は、上記基材支持体が、上記第１の端部及び上記第２の端部のうちの一方から上記第１の端部及び上記第２の端部のうちの他方に向かって延在する支持部材を備え、上記円巻かれた織布基材が、上記支持部材が上記巻かれた織布基材の上記中心長手方向軸に対して平行となるように、上記支持部材の周の少なくとも一部分を取り囲むよう構成される、態様１７４に記載のシステムを対象とする。

【0304】

態様１７６は、上記中心長手方向軸が、細胞培養中に、重力の方向に対して垂直となる、態様１６４～１７５のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0305】

態様１７７は、上記リザーバ及び上記細胞培養マトリクスのうちの少なくとも一方が、細胞培養中に上記バイオリアクター容器の中心長手方向軸の周りで回転するよう構成される、態様１６４～１７５のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0306】

態様１７８は、上記細胞培養容器の上記回転中に上記基材が細胞培養流体を通って移動するように、上記バイオリアクターシステムが構成される、態様１７７に記載のシステムを対象とする。

【0307】

態様１７９は、上記バイオリアクターシステムが回転手段を更に備え、上記回転手段は、上記細胞培養容器に動作可能に連結され、また上記細胞培養容器を上記中心長手方向軸の周りで回転させるよう構成される、態様１７７又は態様１７８に記載の細胞培養システムを対象とする。

【0308】

態様１８０は、上記円筒状細胞培養マトリクスが織布細胞培養基材を含み、上記細胞培養基材の隣接する表面の間に他のいずれの固体材料も含まない、態様１６４～１７９のいずれか１つに記載のシステムを対象とする。

【0309】

態様１８１は、バイオリアクター内で細胞を培養する方法を対象とし、上記方法は：バイオリアクター容器を提供するステップであって、上記バイオリアクター容器は、上記バイオリアクター容器内の細胞培養チャンバと、上記細胞培養チャンバ内に配置され、その上で細胞を培養するために構成された、細胞培養マトリクスとを備え、上記細胞培養マトリクスは基材を含み、上記基材は、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部と、上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さと、上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口とを備える、ステップ；細胞を上記細胞培養マトリクス上に播種するステップ；上記細胞を上記細胞培養マトリクス上で培養するステップ；及び上記細胞を培養する上記ステップの産物を採取するステップを含み、上記基材の上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするよう構成される。

【0310】

態様１８２は、上記基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様１８１に記載の方法を対象とする。

【0311】

態様１８３は、上記基材がポリマー材料を含む、態様１８１又は態様１８２に記載の方法を対象とする。

【0312】

態様１８４は、上記ポリマー材料が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つである、態様１８３に記載の方法を対象とする。

【0313】

態様１８５は、上記播種するステップが、上記細胞を上記基材に付着させるステップを含む、態様１８１～１８４のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0314】

態様１８６は、上記播種するステップが、細胞接種材料を上記細胞培養マトリクスに直接注入するステップを含む、態様１８１～１８５のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0315】

態様１８７は、上記細胞接種材料が、上記バイオリアクター容器の細胞接種材料注入ポートを通して注入される、態様１８６に記載の方法を対象とする。

【0316】

態様１８８は、上記細胞接種材料の体積が、上記細胞培養チャンバの空隙容積と概ね等しい、態様１８６又は態様１８７に記載の方法を対象とする。

【0317】

態様１８９は、上記細胞接種材料を注入する上記ステップの後、上記培養チャンバを通して細胞培地を灌流させるステップを更に含む、態様１８６～１８８のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0318】

態様１９０は、培養中に、細胞培養培地及び酸素のうちの少なくとも一方を上記細胞に供給するステップを更に含む、態様１８１～１８９のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0319】

態様１９１は、上記細胞培養培地を供給する上記ステップが、上記細胞培養培地を、上記細胞培養チャンバを通るように、及び上記基材を横断するように、流すステップを含む、態様１９０に記載の方法を対象とする。

【0320】

態様１６１は、上記細胞培養培地を供給する上記ステップが：上記バイオリアクター容器に流体接続された培地調質用容器を提供するステップ；及び上記細胞培養培地を上記培地調質用容器から上記バイオリアクター容器に供給するステップを含む、態様１９０又は１９１に記載の方法を対象とする。

【0321】

態様１９３は、培養中又は培養後に、上記培地の少なくとも一部分が、上記バイオリアクター容器から除去されて、上記培地調質用容器に戻される、態様１９２に記載の方法を対象とする。

【0322】

態様１９４は、上記細胞培養チャンバへの上記細胞培養培地の上記流れを制御するステップを更に含み、上記細胞培養培地が、細胞、細胞培養用栄養素、及び酸素のうちの少なくとも１つを含む、態様１８１～１９３のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0323】

態様１９５は、上記バイオリアクター容器内の、又は上記バイオリアクター容器から出た、上記細胞培養培地、上記細胞、及び／又は上記細胞産物を分析するステップを更に含む、態様１８１～１９４のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0324】

態様１９６は、上記分析するステップが、ｐＨ_１、ｐＯ_１、［グルコース］_１、ｐＨ_２、ｐＯ_２、［グルコース］_２、及び流量のうちの少なくとも１つを測定するステップを含み、ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１は上記細胞培養チャンバ内で測定され、ｐＨ_２、ｐＯ_２、及び［グルコース］_２は、上記細胞培養チャンバ又は上記バイオリアクター容器の出口で測定される、態様１９５に記載の方法を対象とする。

【0325】

態様１９７は、上記細胞培養チャンバへの上記細胞培養培地の上記流れが、上記細胞培養培地、上記細胞、及び／又は上記細胞産物を分析する上記ステップの結果に少なくとも部分的に基づいて制御される、態様１９５又は態様１９６に記載の方法を対象とする。

【0326】

態様１９８は、ｐＨ_２≧ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２≧ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２≧［グルコース］_２ｍｉｎのうちの少なくとも１つである場合に、上記細胞培養チャンバへの上記細胞培養培地の灌流流量が現在の流量で継続され、ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎは上記細胞培養システムの設計に基づいて事前に決定される、態様１９６又は態様１９７に記載の方法を対象とする。

【0327】

態様１９９は、上記現在の流量が、上記細胞培養システムの所定の最大流量以下である場合、上記灌流流量を増大させる、態様１９６～１９８のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0328】

態様２００は、上記現在の流量が上記細胞培養システムの上記所定の最大流量より大きい場合、上記細胞培養システムのコントローラが：ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎ；ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１；並びに上記バイオリアクター容器のうちの少なくとも１つを再評価する、態様１９６～１９９のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0329】

態様２０１は、上記細胞が、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、又は少なくとも約７２時間にわたる培養後に、約９０％超又は約９５％超の生存率を有する、態様１８１～２００のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0330】

態様２０２は、上記細胞が、上記細胞培養マトリクスに付着する付着細胞、浮遊細胞、及び弱付着細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様１８１～２０１のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0331】

態様２０３は、上記細胞を培養する上記ステップの上記産物が、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つを含む、態様１８１～２０２のいずれか１つに記載の方法を対象とする。

【0332】

態様２０４は、上記細胞を培養する上記ステップの上記産物が、少なくとも８０％生存可能、少なくとも８５％生存可能、少なくとも９０％生存可能、少なくとも９１％生存可能、少なくとも９２％生存可能、少なくとも９３％生存可能、少なくとも９４％生存可能、少なくとも９５％生存可能、少なくとも９６％生存可能、少なくとも９７％生存可能、少なくとも９８％生存可能、又は少なくとも９９％生存可能な細胞を含む、態様２０３に記載の方法を対象とする。

【0333】

態様２０５は、細胞培養マトリクスを対象とし、上記細胞培養マトリクスは、織り合わされた複数の繊維と、上記複数の繊維の間に配置された複数の開口とを含む、織布基材を含み、上記繊維はそれぞれ、細胞を付着させるよう構成された表面を備える。

【0334】

態様２０６は、上記繊維の上記表面が、細胞を着脱可能に付着させるよう構成される、態様２０５に記載のマトリクスを対象とする。

【0335】

態様２０７は、上記複数の繊維がポリマー繊維を含む、態様２０５又は態様２０６に記載のマトリクスを対象とする。

【0336】

態様２０８は、上記ポリマー繊維が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様２０７に記載のマトリクスを対象とする。

【0337】

態様２０９は、上記細胞培養マトリクスが更に複数の織布基材を含む、態様２０５～２０８のいずれか１つに記載のマトリクスを対象とする。

【0338】

態様２１０は、上記複数の基材それぞれが：第１の側部；上記第１の側部の反対側の第２の側部；上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さを備え、上記複数の開口が上記基材の上記厚さを通過する、態様２０９に記載のマトリクスを対象とする。

【0339】

態様２１１は、上記複数の基材が互いに隣接して配設されることにより、ある上記基材の上記第１の側部及び上記第２の側部のうちの一方が、隣接する基材の上記第１の側部及び上記第２の側部のうちの他方と隣接する、態様２０９又は態様２１０に記載のマトリクスを対象とする。

【0340】

態様２１２は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、スペーサ材料又はバリアによって隔てられていない、態様２０９～２１１のいずれか１つに記載のマトリクスを対象とする。

【0341】

態様２１３は、上記複数の基材の少なくとも一部分が、互いに物理的に接触している、態様２０５～２１２のいずれか１つに記載のマトリクスを対象とする。

【0342】

定義
「完全合成（ｗｈｏｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ、又はｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）」は、全体が合成原材料で構成され、いずれの動物由来材料若しくは動物をソースとする材料を含まない、マイクロキャリア又は培養容器の表面といった細胞培養物品を指す。本開示の完全合成細胞培養物品は、異種間の汚染のリスクを排除する。

【0343】

「…を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」等の用語は、対象を含むがそれに限定されないこと、即ち包括的であって排他的ではないことを意味する。

【0344】

「ユーザ（ｕｓｅｒ）」は、本明細書で開示されるシステム、方法、物品、又はキットを使用する人を指し、細胞若しくは細胞産物の採取のために細胞を培養する人、又は本明細書中の実施形態に従って培養及び／若しくは採取される細胞若しくは細胞産物を使用する人を含む。

【0345】

本開示の実施形態の説明において使用される、例えば組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、粘度等の値、及びその範囲、又は構成部品の寸法等の値、及びその範囲を修飾する、「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば：材料、組成物、複合体、濃縮物、構成部品、製造物品、又は使用配合物（ｕｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の調製に使用される典型的な測定及び取り扱い手順によって；これらの手順における偶発的なエラーによって；方法の実施に使用される開始材料又は成分の製造、ソース、又は純度の違いによって；並びに他の考慮事項によって生じ得る、数量の変動を指す。用語「約」はまた、組成物又は配合物の経年劣化を原因とする、特定の初期濃度又は混合とは異なる量、及び組成物又は配合物の混合又は加工を原因とする、特定の初期濃度又は混合とは異なる量も包含する。

【0346】

「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は：その後に説明されるイベント又は状況が発生してもしなくてもよいこと；並びにこの記述が、該イベント又は状況が発生した場合、及び発生しなかった場合を含むことを意味する。

【0347】

不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」、及びこれに対応する定冠詞「ｔｈｅ」は、本明細書中で使用される場合、特段の記載がない限り、少なくとも１つ、又は１つ以上を意味する。

【0348】

当業者に公知の略語を使用する場合がある（例えば時間に関する「ｈ」又は「ｈｒｓ」、グラムに関する「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルに関する「ｍＬ」、室温に関する「ｒｔ」、ナノメートルに関する「ｎｍ」、及び同様の略語）。

【0349】

構成要素、成分、添加物、寸法、状態等といった側面に関して開示される具体的な好ましい値、及びその範囲は、単なる例示であり、他の定義された値、又は定義された範囲内の他の値を排除するものではない。本開示のシステム、キット、及び方法は、本明細書中に記載のいずれの値、又はこれらの値、具体的な値、更に具体的な値、及び好ましい値の組み合わせ（明示された又は含意されている中間値及び中間範囲を含む）を含むことができる。

【0350】

特段の記載がない限り、本明細書に記載のいずれの方法は、その複数のステップをある特定の順序で実施することを要求するものとして解釈されることを、全く意図していない。従って、ある方法クレームが、その複数のステップが従うべき順序を実際に記載していない場合、又はこれらのステップがある特定の順序に限定されることが、特許請求の範囲若しくは説明において具体的に述べられていない場合、いずれの特定の順序を暗示することは全く意図されていない。

【0351】

本開示の実施形態の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更を実施できることは、当業者には明らかであろう。本開示の実施形態の精神及び実体を組み込んだ、これらの実施形態の修正、組み合わせ、部分的組み合わせ、及び変更は、当業者に想起され得るものであるため、本開示の実施形態は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある全てを含むものと解釈されるものとする。

【0352】

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

【0353】

実施形態１
細胞培養マトリクスであって、
上記細胞培養マトリクスは：
基材であって、上記基材は、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部と、上記第１の側部と上記第２の側部とを隔てる厚さと、上記基材に形成されて、上記基材の上記厚さを通過する、複数の開口とを備える、基材
を含み、
上記複数の開口は、細胞培養培地、細胞、及び細胞産物のうちの少なくとも１つの、上記基材の上記厚さを通る流れを可能とするように構成される、細胞培養マトリクス。

【0354】

実施形態２
上記基材は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0355】

実施形態３
上記基材は、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷格子シート、及び織布メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0356】

実施形態４
上記基材は、１つ以上の繊維を含む上記織布メッシュを含む、実施形態３に記載の細胞培養マトリクス。

【0357】

実施形態５
上記１つ以上の繊維は、平坦、円形、長方形、及び多角形のうちの少なくとも１つの断面形状を有する、実施形態４に記載の細胞培養マトリクス。

【0358】

実施形態６
上記１つ以上の繊維は、モノフィラメント繊維及びマルチフィラメント繊維のうちの少なくとも１つを含む、実施形態４に記載の細胞培養マトリクス。

【0359】

実施形態７
上記１つ以上の繊維は、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、実施形態４に記載の細胞培養マトリクス。

【0360】

実施形態８
上記１つ以上の繊維は更に、約５０μｍ～約１０００μｍ、約５０μｍ～約６００μｍ、約５０μｍ～約４００μｍ、約１００μｍ～約３２５μｍ、又は約１５０μｍ～約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維を含む、実施形態７に記載の細胞培養マトリクス。

【0361】

実施形態９
上記第２の繊維直径は上記第１の繊維直径と異なる、実施形態８に記載の細胞培養マトリクス。

【0362】

実施形態１０
上記複数の開口は、約１００μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、又は約２２５μｍ～約８００μｍの開口直径を有する、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0363】

実施形態１１
上記繊維直径は約２５０μｍ～約３００μｍであり、上記開口直径は約７５０μｍ～約８００μｍであるか；又は
上記繊維直径は約２７０μｍ～約２７６μｍであり、上記開口直径は約７８５μｍ～約７９５μｍである、実施形態１０に記載の細胞培養マトリクス。

【0364】

実施形態１２
上記繊維直径は約２００μｍ～約２３０μｍであり、上記開口直径は約５００μｍ～約５５０μｍであるか；又は
上記繊維直径は約２１５μｍ～約２２５μｍであり、上記開口直径は約５１５μｍ～約５３０μｍである、実施形態１０に記載の細胞培養マトリクス。

【0365】

実施形態１３
上記繊維直径は約１２５μｍ～約１７５μｍであり、上記開口直径は約２２５μｍ～約２７５μｍであるか；又は
上記繊維直径は約１５０μｍ～約１６５μｍであり、上記開口直径は約２３５μｍ～約２５５μｍである、実施形態１０に記載の細胞培養マトリクス。

【0366】

実施形態１４
上記繊維直径に対する上記開口直径の比は、約１．０～約３．５、約１．２５～約３．２５、約１．４～約３．０、約１．５～約２．９、約１．５～約２．４、又は約２．４～約２．９である、実施形態１０に記載の細胞培養マトリクス。

【0367】

実施形態１５
上記複数の開口は、正方形、長方形、菱形、偏菱形、円形、又は楕円形の形状を有する開口を含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0368】

実施形態１６
上記複数の開口は規則的なパターンに配列されている、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0369】

実施形態１７
上記細胞培養マトリクスは単層基材を含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0370】

実施形態１８
上記細胞培養マトリクスは、少なくとも１つの第１の基材層及び少なくとも１つの第２の基材層を備える多層基材を含み、
上記第１の基材層は、第１の側部と、上記第１の側部の反対側の第２の側部とを備え、上記第２の基材層は、第３の側部と、上記第３の側部の反対側の第４の側部とを備え、上記第２の側部は上記第３の側部と対面する、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0371】

実施形態１９
上記多層基材は、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対して所定の位置合わせを有するように構成される、実施形態１８に記載の細胞培養マトリクス。

【0372】

実施形態２０
上記多層基材は、上記第１の基材層の繊維の交点が上記第２の基材層の開口と対面するように構成される、実施形態１９に記載の細胞培養マトリクス。

【0373】

実施形態２１
上記第１の基材層の開口は、上記第２の基材層の上記開口と少なくとも部分的に重なる、実施形態１９又は２０に記載の細胞培養マトリクス。

【0374】

実施形態２２
上記第１の基材層及び上記第２の基材層の上記開口は位置合わせされる、実施形態２１に記載の細胞培養マトリクス。

【0375】

実施形態２３
上記多層基材は、上記第１の基材層が上記第２の基材層に対するランダムな位置合わせを有するように構成される、実施形態１８に記載の細胞培養マトリクス。

【0376】

実施形態２４
上記細胞培養マトリクスは複数の上記基材を含み、上記複数の基材はそれぞれ、上記複数の基材のうちの他の上記基材に対してランダムに配向される、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0377】

実施形態２５
上記細胞培養マトリクスは、積層構成の複数の上記基材を含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0378】

実施形態２６
上記複数の基材のうちの１つの、上記第１の側部及び上記第２の側部は、上記積層構成内の他の上記基材の上記第１の側部及び上記第２の側部に対して、略平行である、実施形態２５に記載の細胞培養マトリクス。

【0379】

実施形態２７
上記基材は円筒状ロール構成である、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0380】

実施形態２８
上記細胞培養マトリクスは、異なるジオメトリの織布メッシュを含む複数の前記基材を含み、上記異なるジオメトリは、繊維直径、開口直径、又は開口ジオメトリのうちの少なくとも１つにおいて異なっている、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0381】

実施形態２９
異なるジオメトリの上記織布メッシュは、上記バイオリアクター容器内での所望の流れ特性に基づいて、所定の配置で並べられる、実施形態２８に記載の細胞培養マトリクス。

【0382】

実施形態３０
上記所望の流れ特性は、上記細胞培養マトリクスにわたる液体培地の均一な灌流、及び上記細胞培養マトリクスにわたる細胞成長の分布のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２９に記載の細胞培養マトリクス。

【0383】

実施形態３１
異なるジオメトリの上記織布メッシュは、第１のジオメトリを有する第１のメッシュ、及び第２のジオメトリを有する第２のメッシュを含み、
上記所定の配置は、上記第１のメッシュを、上記細胞培養マトリクスを通る細胞培養培地の所望のバルク流方向に関して上記第２のメッシュの上流とすることを含む、実施形態２９に記載の細胞培養マトリクス。

【0384】

実施形態３２
上記所定の配置は、上記第１のメッシュの積層体を上記第２のメッシュの積層体の上流に配置することを含む、実施形態３１に記載の細胞培養マトリクス。

【0385】

実施形態３３
上記所定の配置は、上記第１のメッシュの複数の積層体と、上記第２のメッシュの複数の積層体との、上記バルク流方向に沿った交互配置を含む、実施形態３１に記載の細胞培養マトリクス。

【0386】

実施形態３４
上記細胞培養マトリクスは、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微小胞、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つの、培養及び／又は採取のために構成される、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0387】

実施形態３５
上記基材は官能化表面を備え、上記官能化表面は、上記ポリマーメッシュ材料に対する上記付着細胞の付着を改善するために、物理的又は化学的に修飾される、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0388】

実施形態３６
上記細胞培養マトリクスは、上記メッシュの上記表面への上記培養培地中の成分の吸着又は吸収のために構成された、表面を備える、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0389】

実施形態３７
上記細胞培養マトリクスは、上記ポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを備え、上記コーティングは、上記付着細胞の付着を促進するよう構成される、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【0390】

実施形態３８
上記細胞は上記コーティングに付着する、実施形態３７に記載の細胞培養マトリクス。

【0391】

実施形態３９
上記コーティングは、上記細胞培養マトリクスへの細胞の付着を促進するよう構成された、生物分子又は合成生体活性分子である、実施形態３７に記載の細胞培養マトリクス。

【0392】

実施形態４０
上記コーティングは、ヒドロゲル、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、生体活性分子又はペプチド、及び生物タンパク質のうちの少なくとも１つである、実施形態３７に記載の細胞培養マトリクス。

【0393】

実施形態４１
上記官能化表面はプラズマ処理される、実施形態３７に記載の細胞培養マトリクス。

【0394】

実施形態４２
上記細胞は、上記織布メッシュに付着する、付着細胞、浮遊細胞、及び弱付着細胞のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１に記載の細胞培養マトリクス。

【符号の説明】

【0395】

１００ 細胞培養基材
１０２ 第１の複数の繊維
１０４ 第２の複数の繊維
１０６ 開口
１０８ 第１の側部
１１０ 第２の側部
２００ 多層基材、マトリクス
２０２ 第１のメッシュ基材層
２０４ 第２のメッシュ基材層
２０６ 開口
３００、３２０、３６０、４００、４２０ 細胞培養システム
３０２、３２２、３６２、４０２ バイオリアクター容器
３０４、３２４ 細胞培養チャンバ
３０６、３６４ 細胞培養マトリクス
３０８、３２８ 基材層、基材
３１０、３３０、４０８ 入口
３１２、３３２、４１０ 出口
３５０ 円筒状ロール
３５２ メッシュ基材
３６６ 支持体、中心支持部材
４０４、４２４ 培地調質用容器
４０６ 細胞培養培地
４１２ センサ
４１４ 流れ制御ユニット、信号処理ユニット
４１６ ポンプ、蠕動ポンプ
４１８ 培地調質制御ユニット
４２２ 充填層バイオリアクター、バイオリアクター
４２６ コントローラ
４２８ 灌流回路
５００ ローラーボトル
５０１ ボトルの口
５０２ 細胞培養メッシュ
５０３ 円筒状ロール
６００、６０２ サンプルセル
６２０ 容器
６２２ 充填層領域
６２４ 入口
６２６ 出口
１８０１、１８０１’ 第１のディスク
１８０２、１８０２’ 第２のディスク
１８０３、１８０３’ 第３のディスク

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31】

【図32】

【国際調査報告】