特表 2022-519680 修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-24

(54)【発明の名称】修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/12 20060101AFI20220316BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20220316BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20220316BHJP

【ＦＩ】

C12N9/12 ZNA

C12P19/34 Z

C12N15/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021545969

(86)(22)【出願日】2020-02-04

(85)【翻訳文提出日】2021-08-24

(86)【国際出願番号】 GB2020050247

(87)【国際公開番号】W WO2020161480

(87)【国際公開日】2020-08-13

(31)【優先権主張番号】1901501.5

(32)【優先日】2019-02-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521345741

【氏名又は名称】ニュークレラ・ニュークリークス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】チェン，マイケル・チュン・ハオ

(72)【発明者】

【氏名】マッキンロイ，ゴードン・ロス

(72)【発明者】

【氏名】チェン，シホン

(72)【発明者】

【氏名】クック，イアン・ハストン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD11

4B050LL05

4B064AF27

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA16

(57)【要約】

本発明は、操作された末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素、または任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、または任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列、および核酸合成の方法におけるその使用に関し、核酸を合成する方法に関し、そして核酸合成法における前記酵素を含むキットの使用に関する。本発明はまた、テンプレート非依存性核酸合成法における、新規末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸の使用にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型配列、配列番号１またはその一部切除型、あるいは他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列、あるいは任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、あるいは任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列に比較した際、アミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、アミノ酸が、アミノ酸：

【化1】

の１つまたはそれより多くで修飾されている、前記酵素。

【請求項2】

野生型配列またはその一部切除型に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰ、または他の種における相同領域、または任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同領域、または任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素。

【請求項3】

野生型配列、配列番号１または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素。

【請求項4】

少なくとも配列：

【化2】

または他の種における相同領域、または任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同領域、または任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同領域を含む、請求項１～３のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、該配列が、配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰの１つまたはそれより多くで１つまたはそれより多くのアミノ酸修飾を有する、前記酵素。

【請求項5】

野生型配列、配列番号１、または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって；
ａ． 第一の修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される
前記酵素。

【請求項6】

アミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ中の修飾が、野生型配列に比較して、酵素溶解度を改善し、そしてＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰにおける修飾（単数または複数）が３’位に修飾を有するヌクレオチドの取り込みを改善する、請求項５記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、野生型配列が
ｇｉ｜７６８ ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）
ｇｉ｜４６０１６３ セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）
ｇｉ｜４９４９８７ アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）
ｇｉ｜１３５４４７５ ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）
ｇｉ｜２１４９６３４ ハイイロジネズミオポッサム（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）
ｇｉ｜１２８０２４４１ マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜２８８５２９８９ メキシコサンショウウオ（Ａｍｂｙｓｔｏｍａ ｍｅｘｉｃａｎｕｍ）
ｇｉ｜３８６０３６６８ トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）
ｇｉ｜４００３７３８９ ラジャ・エグランテリア（Ｒａｊａ ｅｇｌａｎｔｅｒｉａ）
ｇｉ｜４０２１８５９３ コモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ）
ｇｉ｜４６３６９８８９ ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）
ｇｉ｜７３９９８１０１ イヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）
ｇｉ｜１３９００１４７６ ワオキツネザル（Ｌｅｍｕｒ ｃａｔｔａ）
ｇｉ｜１３９００１４９０ ハイイロネズミキツネザル（Ｍｉｃｒｏｃｅｂｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）
ｇｉ｜１３９００１５１１ ガーネットガラゴ（Ｏｔｏｌｅｍｕｒ ｇａｒｎｅｔｔｉｉ）
ｇｉ｜１４８７０８６１４ マウス
ｇｉ｜１４９０４０１５７ ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
ｇｉ｜１４９７０４６１１ ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）
ｇｉ｜１６４４５１４７２ ウシ
ｇｉ｜１６９６４２６５４ ネッタイツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ（Ｓｉｌｕｒａｎａ） ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）
ｇｉ｜２９１３９４８９９ アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜２９１４０４５５１ アナウサギ
ｇｉ｜３０１７６３２４６ ジャイアントパンダ（Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ）
ｇｉ｜３１１２７１６８４ イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）
ｇｉ｜３２７２８００７０ グリーンアノール（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜３３４３１３４０４ ハイイロジネズミオポッサム
ｇｉ｜３４４２７４９１５ アフリカゾウ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ）
ｇｉ｜３４５３３０１９６ カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ）
ｇｉ｜３４８５８８１１４ モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）
ｇｉ｜３５１６９７１５１ ハダカデバネズミ（Ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｇｌａｂｅｒ）
ｇｉ｜３５５５６２６６３ アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）
ｇｉ｜３９５５０１８１６ タスマニアデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）
ｇｉ｜３９５５０８７１１ タスマニアデビル
ｇｉ｜３９５８５００４２ ガーネットガラゴ
ｇｉ｜３９７４６７１５３ ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）
ｇｉ｜４０３２７８４５２ ボリビアリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜４１０９０３９８０ トラフグ
ｇｉ｜４１０９７５７７０ イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）
ｇｉ｜４３２０９２６２４ ミオティス・ダヴィディー（Ｍｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ）
ｇｉ｜４３２１１３１１７ ミオティス・ダヴィディー
ｇｉ｜４４４７０８２１１ ツパイア・チネンシス（Ｔｕｐａｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜４６０４１７１２２ イベリアトゲイモリ（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌ）
ｇｉ｜４６６００１４７６ オルカ（Ｏｒｃｉｎｕｓ ｏｒｃａ）
ｇｉ｜４７１３５８８９７ フロリダマナティ（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ）
ｇｉ｜４７８５０７３２１ ミナミシロサイ（Ｃｅｒａｔｏｔｈｅｒｉｕｍ ｓｉｍｕｍ ｓｉｍｕｍ）
ｇｉ｜４７８５２８４０２ ミナミシロサイ
ｇｉ｜４８８５３０５２４ ココノオビアルマジロ（Ｄａｓｙｐｕｓ ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ）
ｇｉ｜４９９０３７６１２ メイランディア・ゼブラ（Ｍａｙｌａｎｄｉａ ｚｅｂｒａ）
ｇｉ｜５０４１３５１７８ アメリカナキウサギ（Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）
ｇｉ｜５０５８４４００４ ヨーロッパトガリネズミ（Ｓｏｒｅｘ ａｒａｎｅｕｓ）
ｇｉ｜５０５８４５９１３ ヨーロッパトガリネズミ
ｇｉ｜５０７５３７８６８ ヒメミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ ｊａｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜５０７５７２６６２ ヒメミユビトビネズミ
ｇｉ｜５０７６２２７５１ デグー（Ｏｃｔｏｄｏｎ ｄｅｇｕｓ）
ｇｉ｜５０７６４０４０６ ヒメハリテンレック（Ｅｃｈｉｎｏｐｓ ｔｅｌｆａｉｒｉ）
ｇｉ｜５０７６６９０４９ ヒメハリテンレック
ｇｉ｜５０７９３０７１９ ホシバナモグラ（Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ ｃｒｉｓｔａｔａ）
ｇｉ｜５０７９４０５８７ ホシバナモグラ
ｇｉ｜５１１８５０６２３ フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）
ｇｉ｜５１２８５６６２３ ネッタイツメガエル
ｇｉ｜５１２９５２４５６ ハダカデバネズミ
ｇｉ｜５２４９１８７５４ ゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）
ｇｉ｜５２７２５１６３２ セキセイインコ（Ｍｅｌｏｐｓｉｔｔａｃｕｓ ｕｎｄｕｌａｔｕｓ）
ｇｉ｜５２８４９３１３７ ゼブラフィッシュ
ｇｉ｜５２８４９３１３９ ゼブラフィッシュ
ｇｉ｜５２９４３８４８６ ハヤブサ（Ｆａｌｃｏ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ）
ｇｉ｜５３０５６５５５７ 西部ニシキガメ（Ｃｈｒｙｓｅｍｙｓ ｐｉｃｔａ ｂｅｌｌｉｉ）
ｇｉ｜５３２０１７１４２ プレーリーハタネズミ（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｏｃｈｒｏｇａｓｔｅｒ）
ｇｉ｜５３２０９９４７１ ジュウサンセンジリス（Ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ）
ｇｉ｜５３３１６６０７７ チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）
ｇｉ｜５３３１８９４４３ チンチラ
ｇｉ｜５３７２０５０４１ チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）
ｇｉ｜５３７２６３１１９ チャイニーズハムスター
ｇｉ｜５４３２４７０４３ ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）
ｇｉ｜５４３３５１４９２ ヒメサバクガラス（Ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｏｃｅｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）
ｇｉ｜５４３７３１９８５ カワラバト（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ）
ｇｉ｜５４４４２０２６７ カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）
ｇｉ｜５４５１９３６３０ ウマ
ｇｉ｜５４８３８４５６５ プンダミリア・ニエレレイ（Ｐｕｎｄａｍｉｌｉａ ｎｙｅｒｅｒｅｉ）
ｇｉ｜５５１４８７４６６ サザンプラティフィッシュ（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）
ｇｉ｜５５１５２３２６８ サザンプラティフィッシュ
ｇｉ｜５５４５８２９６２ ウスリホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｂｒａｎｄｔｉｉ）
ｇｉ｜５５４５８８２５２ ウスリホオヒゲコウモリ
ｇｉ｜５５６７７８８２２ チベットカモシカ（Ｐａｎｔｈｏｌｏｐｓ ｈｏｄｇｓｏｎｉｉ）
ｇｉ｜５５６９９０１３３ ラティメリア・カルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ）
ｇｉ｜５５７２９７８９４ ヨウスコウアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５５８１１６７６０ シナスッポン（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５５８２０７２３７ トビイロホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）
ｇｉ｜５６０８９５９９７ フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｆｅｒｕｓ）
ｇｉ｜５６０８９７５０２ フタコブラクダ
ｇｉ｜５６２８５７９４９ ツパイア・チネンシス
ｇｉ｜５６２８７６５７５ ツパイア・チネンシス
ｇｉ｜５６４２２９０５７ アメリカアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５６４２３６３７２ アメリカアリゲーター
ｇｉ｜５６４３８４２８６ ラット
より選択される、前記酵素。

【請求項8】

アミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ内の修飾が下線のアミノ酸の１つまたはそれより多くでのものである、請求項１～７のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項9】

アミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ内の修飾が、ＱＬＬＰＫＶＩＮＬＷＥＫＫＧＬＬＬＹＹＤＬＶへのものである、請求項８記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項10】

修飾が、アミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰの１つまたはそれより多くより選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項11】

修飾が、アミノ酸

【化3】

の１つまたはそれより多くより選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項12】

修飾が、アミノ酸

【化4】

の１つまたはそれより多くより選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項13】

修飾が、アミノ酸領域ＦＭＲＡ、ＱＡＤＮＡ、ＥＡＱＡ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰの下線で示すアミノ酸の１つまたはそれより多くより選択される、請求項１０記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項14】

修飾が、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの１つまたはそれより多くより選択される、請求項１３記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項15】

修飾が、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの２つまたはそれより多くより選択される、請求項１３記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項16】

修飾が、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの各々を含有する、請求項１５記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項17】

配列番号４～配列番号１７３またはその一部切除型より選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項18】

配列番号１７４～配列番号３４３より選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項19】

配列番号３４４～７２７より選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項記載の修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素。

【請求項20】

核酸合成法であって：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）請求項１～１９のいずれか一項に定義されるような末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の存在下で、イニシエーターオリゴヌクレオチドに３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸を付加し；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドからすべての試薬を除去し；
（ｄ）切断剤の存在下でブロッキング基を切断し；そして
（ｅ）切断剤を除去する
工程を含む、前記方法。

【請求項21】

工程（ｂ）～（ｅ）を反復することによって、１つより多いヌクレオチドを付加する、請求項２０において定義されるような方法。

【請求項22】

３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸が、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－アミノオキシ、３’－Ｏ－（Ｎ－オキシム）、３’－Ｏ－アリル３’－Ｏ－シアノエチル、３’－Ｏ－アセチル、３’－Ｏ－ナイトレート、３’－ホスフェート、３’－Ｏ－アセチルレブリン酸エステル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔブチルジメチルシラン、３’－Ｏ－トリメチル（シリル）エトキシメチル、３’－Ｏ－オルト－ニトロベンジル、または３’－Ｏ－パラ－ニトロベンジルより選択される基でブロッキングされている、請求項２０または請求項２１に定義されるような方法。

【請求項23】

３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸が３’－Ｏ－アジドメチル、３’－アミノオキシまたは３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロッキングされている、請求項２２に定義されるような方法。

【請求項24】

イニシエーターオリゴヌクレオチドおよび１つまたはそれより多くの３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸と組み合わせて、請求項１～１９のいずれか一項に定義されるような末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸合成の方法における、特異的末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素、または任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、または任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列の使用に関し、核酸を合成する方法に関し、そして核酸合成法における前記酵素を含むキットの使用に関する。本発明はまた、テンプレート非依存性核酸合成法における、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼまたは相同酵素、および３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

核酸合成は、現代バイオテクノロジーには極めて重要である。バイオテクノロジー分野での迅速なペースの発展は、科学コミュニティが人工的にＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を合成可能になったことによって可能になってきている。

【0003】

人工的ＤＮＡ合成によって、バイオテクノロジー企業および製薬会社は広範囲のペプチド療法剤、例えば糖尿病治療用のインスリンを開発することが可能になっている。これによって、研究者らは細胞タンパク質を特徴づけて、現代の高齢化しつつある集団が直面する疾患、例えば心臓病および癌の治療のための新規小分子療法を開発することが可能になっている。この技術は、ベンター研究所が２０１０年に人工的に合成したゲノムを細菌細胞に入れた際に立証したように、生命を作り出す道すら開いている。

【0004】

しかし、現代のＤＮＡ合成技術は、バイオテクノロジー産業の要求を満たしていない。成熟した技術であるにもかかわらず、長さ２００ヌクレオチドより長いＤＮＡ鎖を合成することは事実上不可能であり、そして大部分のＤＮＡ合成企業は、１２０ヌクレオチドまでしか提供しない。これに比較して、平均的なタンパク質コード遺伝子は、２０００～３０００の連続ヌクレオチド程度であり、染色体は、長さ少なくとも１００万の連続したヌクレオチドであり、そして平均的な真核ゲノムは合計数十億ヌクレオチドになる。長さ数千塩基対の核酸鎖を調製するため、今日の主要な遺伝子合成企業はすべて、多様な「合成およびスティッチ」技術に頼り、重複する４０～６０量体の断片を合成して、そして酵素でのコピーおよび伸長によってともに縫い合わせ（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）ている。現在の方法は、一般的に、ルーチンの製造で、長さ最大３ｋｂを可能にする。

【0005】

ＤＮＡが一度に１２０～２００ヌクレオチドを超えて合成不能である理由は、ＤＮＡを作製するために、一度に１つずつヌクレオチドをカップリングする合成化学反応（すなわちホスホラミダイト技術）を用いる、現在のＤＮＡ生成方法論のためである。各ヌクレオチドカップリング工程の効率が９９％有効であっても、許容されうる収率で２００ヌクレオチドより長いＤＮＡを合成することは、数学的に不可能である。ベンター研究所は、この労力がかかるプロセスを、４年および２０００万ＵＳドルを費やして、細菌の比較的小さいゲノムを合成することによって説明した。

【0006】

ＤＮＡ配列決定の既知の方法は、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、成長しつつある二本鎖基質に、３’－可逆的終結（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ヌクレオチドを付加する。「合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」プロセスにおいて、付加されるヌクレオチドは各々、色素を含有し、使用者がテンプレート鎖の正確な配列を同定することを可能にする。二本鎖ＤＮＡ上ではあるが、この技術は、長さ５００～１０００ｂｐの間の鎖を産生可能である。しかし、この技術は、テンプレートとして作用する核酸鎖の存在を要するため、デノボ核酸合成には適していない。

【0007】

デノボ一本鎖ＤＮＡ合成のため、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いる、多様な試みがなされてきている。制御されたものとは対照的に、制御されないデノボ一本鎖ＤＮＡ合成は、例えば次世代配列決定ライブラリー調製のため、ホモポリマーアダプター配列を生成するために、一本鎖ＤＮＡに対するＴｄＴのデオキシヌクレオシド５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）３’－テール付加特性を利用する。制御された伸長において、成長しつつあるＤＮＡ鎖の３’端へのｄＮＴＰの制御されない付加を防止するために、可逆的デオキシヌクレオシド５’－三リン酸終結技術を使用する必要がある。ＴｄＴを通じた制御された一本鎖ＤＮＡ合成プロセスの発展は、無水環境の必要性を取り除き、そして有機溶媒と不適合である多様なポリマーの使用を可能にするため、遺伝子組み立てまたはハイブリダイゼーションマイクロアレイのためのｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成には非常に有益である。

【0008】

しかし、ＴｄＴは、デノボ合成サイクルに必要な新生一本鎖ＤＮＡ鎖の構築のため、３’－Ｏ－可逆的終結部分を含有するヌクレオシド三リン酸を効率的に付加することが示されてきていない。３’－Ｏ－可逆的終結部分は、ＴｄＴのような末端トランスフェラーゼが、成長しつつあるＤＮＡ鎖の３’端および入ってくるヌクレオシド三リン酸の５’－三リン酸の間のヌクレオチドトランスフェラーゼ反応を触媒するのを妨げる。

【0009】

したがって、３’－Ｏ－可逆的終結ヌクレオチドを容易に取り込む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを同定する必要がある。前記修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、現在利用可能な方法に関連する問題を克服可能である改善された核酸合成法を提供するため、バイオテクノロジーおよび一本鎖ＤＮＡ合成プロセスに有用な方式で、３’－Ｏ－可逆的終結ヌクレオチドを取り込んでもよい。

【発明の概要】

【0010】

修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素、または任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、または任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列を本明細書に記載する。末端トランスフェラーゼ酵素は、天然に遍在性であり、そして多くの種に存在する。多くの既知のＴｄＴ配列がＮＣＢＩデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／中に報告されてきている。

【0011】

ＧＩ番号 種 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｇｉ｜７６８ ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）
ｇｉ｜４６０１６３ セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）
ｇｉ｜４９４９８７ アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）
ｇｉ｜１３５４４７５ ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）
ｇｉ｜２１４９６３４ ハイイロジネズミオポッサム（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）
ｇｉ｜１２８０２４４１ マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜２８８５２９８９ メキシコサンショウウオ（Ａｍｂｙｓｔｏｍａ ｍｅｘｉｃａｎｕｍ）
ｇｉ｜３８６０３６６８ トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）
ｇｉ｜４００３７３８９ ラジャ・エグランテリア（Ｒａｊａ ｅｇｌａｎｔｅｒｉａ）
ｇｉ｜４０２１８５９３ コモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ）
ｇｉ｜４６３６９８８９ ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）
ｇｉ｜７３９９８１０１ イヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）
ｇｉ｜１３９００１４７６ ワオキツネザル（Ｌｅｍｕｒ ｃａｔｔａ）
ｇｉ｜１３９００１４９０ ハイイロネズミキツネザル（Ｍｉｃｒｏｃｅｂｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）
ｇｉ｜１３９００１５１１ ガーネットガラゴ（Ｏｔｏｌｅｍｕｒ ｇａｒｎｅｔｔｉｉ）
ｇｉ｜１４８７０８６１４ マウス
ｇｉ｜１４９０４０１５７ ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
ｇｉ｜１４９７０４６１１ ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）
ｇｉ｜１６４４５１４７２ ウシ
ｇｉ｜１６９６４２６５４ ネッタイツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ（Ｓｉｌｕｒａｎａ） ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）
ｇｉ｜２９１３９４８９９ アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜２９１４０４５５１ アナウサギ
ｇｉ｜３０１７６３２４６ ジャイアントパンダ（Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ）
ｇｉ｜３１１２７１６８４ イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）
ｇｉ｜３２７２８００７０ グリーンアノール（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜３３４３１３４０４ ハイイロジネズミオポッサム
ｇｉ｜３４４２７４９１５ アフリカゾウ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ）
ｇｉ｜３４５３３０１９６ カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｎａｔｉｎｕｓ）
ｇｉ｜３４８５８８１１４ モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）
ｇｉ｜３５１６９７１５１ ハダカデバネズミ（Ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｇｌａｂｅｒ）
ｇｉ｜３５５５６２６６３ アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）
ｇｉ｜３９５５０１８１６ タスマニアデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）
ｇｉ｜３９５５０８７１１ タスマニアデビル
ｇｉ｜３９５８５００４２ ガーネットガラゴ
ｇｉ｜３９７４６７１５３ ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）
ｇｉ｜４０３２７８４５２ ボリビアリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜４１０９０３９８０ トラフグ
ｇｉ｜４１０９７５７７０ イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）
ｇｉ｜４３２０９２６２４ ミオティス・ダヴィディー（Ｍｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ）
ｇｉ｜４３２１１３１１７ ミオティス・ダヴィディー
ｇｉ｜４４４７０８２１１ ツパイア・チネンシス（Ｔｕｐａｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜４６０４１７１２２ イベリアトゲイモリ（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌ）
ｇｉ｜４６６００１４７６ オルカ（Ｏｒｃｉｎｕｓ ｏｒｃａ）
ｇｉ｜４７１３５８８９７ フロリダマナティ（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ ｍａｎａｔｕｓ ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ）
ｇｉ｜４７８５０７３２１ ミナミシロサイ（Ｃｅｒａｔｏｔｈｅｒｉｕｍ ｓｉｍｕｍ ｓｉｍｕｍ）
ｇｉ｜４７８５２８４０２ ミナミシロサイ
ｇｉ｜４８８５３０５２４ ココノオビアルマジロ（Ｄａｓｙｐｕｓ ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ）
ｇｉ｜４９９０３７６１２ メイランディア・ゼブラ（Ｍａｙｌａｎｄｉａ ｚｅｂｒａ）
ｇｉ｜５０４１３５１７８ アメリカナキウサギ（Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）
ｇｉ｜５０５８４４００４ ヨーロッパトガリネズミ（Ｓｏｒｅｘ ａｒａｎｅｕｓ）
ｇｉ｜５０５８４５９１３ ヨーロッパトガリネズミ
ｇｉ｜５０７５３７８６８ ヒメミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ ｊａｃｕｌｕｓ）
ｇｉ｜５０７５７２６６２ ヒメミユビトビネズミ
ｇｉ｜５０７６２２７５１ デグー（Ｏｃｔｏｄｏｎ ｄｅｇｕｓ）
ｇｉ｜５０７６４０４０６ ヒメハリテンレック（Ｅｃｈｉｎｏｐｓ ｔｅｌｆａｉｒｉ）
ｇｉ｜５０７６６９０４９ ヒメハリテンレック
ｇｉ｜５０７９３０７１９ ホシバナモグラ（Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ ｃｒｉｓｔａｔａ）
ｇｉ｜５０７９４０５８７ ホシバナモグラ
ｇｉ｜５１１８５０６２３ フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）
ｇｉ｜５１２８５６６２３ ネッタイツメガエル
ｇｉ｜５１２９５２４５６ ハダカデバネズミ
ｇｉ｜５２４９１８７５４ ゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）
ｇｉ｜５２７２５１６３２ セキセイインコ（Ｍｅｌｏｐｓｉｔｔａｃｕｓ ｕｎｄｕｌａｔｕｓ）
ｇｉ｜５２８４９３１３７ ゼブラフィッシュ
ｇｉ｜５２８４９３１３９ ゼブラフィッシュ
ｇｉ｜５２９４３８４８６ ハヤブサ（Ｆａｌｃｏ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ）
ｇｉ｜５３０５６５５５７ 西部ニシキガメ（Ｃｈｒｙｓｅｍｙｓ ｐｉｃｔａ ｂｅｌｌｉｉ）
ｇｉ｜５３２０１７１４２ プレーリーハタネズミ（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｏｃｈｒｏｇａｓｔｅｒ）
ｇｉ｜５３２０９９４７１ ジュウサンセンジリス（Ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ）
ｇｉ｜５３３１６６０７７ チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）
ｇｉ｜５３３１８９４４３ チンチラ
ｇｉ｜５３７２０５０４１ チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）
ｇｉ｜５３７２６３１１９ チャイニーズハムスター
ｇｉ｜５４３２４７０４３ ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）
ｇｉ｜５４３３５１４９２ ヒメサバクガラス（Ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｏｃｅｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）
ｇｉ｜５４３７３１９８５ カワラバト（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ）
ｇｉ｜５４４４２０２６７ カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）
ｇｉ｜５４５１９３６３０ ウマ
ｇｉ｜５４８３８４５６５ プンダミリア・ニエレレイ（Ｐｕｎｄａｍｉｌｉａ ｎｙｅｒｅｒｅｉ）
ｇｉ｜５５１４８７４６６ サザンプラティフィッシュ（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）
ｇｉ｜５５１５２３２６８ サザンプラティフィッシュ
ｇｉ｜５５４５８２９６２ ウスリホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｂｒａｎｄｔｉｉ）
ｇｉ｜５５４５８８２５２ ウスリホオヒゲコウモリ
ｇｉ｜５５６７７８８２２ チベットカモシカ（Ｐａｎｔｈｏｌｏｐｓ ｈｏｄｇｓｏｎｉｉ）
ｇｉ｜５５６９９０１３３ ラティメリア・カルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ）
ｇｉ｜５５７２９７８９４ ヨウスコウアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５５８１１６７６０ シナスッポン（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５５８２０７２３７ トビイロホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）
ｇｉ｜５６０８９５９９７ フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｆｅｒｕｓ）
ｇｉ｜５６０８９７５０２ フタコブラクダ
ｇｉ｜５６２８５７９４９ ツパイア・チネンシス
ｇｉ｜５６２８７６５７５ ツパイア・チネンシス
ｇｉ｜５６４２２９０５７ アメリカアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ）
ｇｉ｜５６４２３６３７２ アメリカアリゲーター
ｇｉ｜５６４３８４２８６ ラット
ｇｉ｜５７３８８４９９４ スポッテッドガー（Ｌｅｐｉｓｏｓｔｅｕｓ ｏｃｕｌａｔｕｓ）
多様な記載される末端トランスフェラーゼの配列は、異なる種間で、非常に保存された配列のいくつかの領域、および非常に多様であるいくつかの領域を示す。選択した種からの配列に関する配列整列を図２に示す。

【0012】

本発明者らは、スポッテッドガーＴｄＴ(ｓｐｏｔｔｅｄ ｇａｒ)（配列番号１として示す）由来の末端トランスフェラーゼを修飾した。しかし、図２に示すものまたはその一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型を含め、多様なＮＣＢＩエントリーで上に列挙する配列を含めて、任意の他の種由来の類似の末端トランスフェラーゼ配列内に、対応する修飾を導入してもよい。

【0013】

スポッテッドガー（Ｌｅｐｉｓｏｓｔｅｕｓ ｏｃｕｌａｔｕｓ）のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号１）

【0014】

【化1】

【0015】

この配列の操作された変異体は、以前、公報ＷＯ２０１６／１２８７３１に配列番号８として同定された。この公表配列に対するさらに操作された改善を本明細書に記載する。本明細書に開示する修飾配列は、先行技術に開示される配列番号８とは異なる。ＷＯ２０１６／１２８７３１の配列番号２は、「誤注釈（ｍｉｓ－ａｎｎｏｔａｔｅｄ）」野生型ガー配列である。

【0016】

公報ＷＯ２０１６／１２８７３１中の配列番号８を、操作された突然変異が同定された形で以下に示す：

【0017】

【化2】

【0018】

本発明者らは、改善された特性を有するアミノ酸配列中に多様なアミノ酸修飾を同定している。特定の領域は、酵素の溶解度および取り扱いを改善する。特定の他の領域は、修飾を含むヌクレオチドを取り込む能力を改善する；これらの修飾には、糖の３’位での修飾および塩基への修飾が含まれる。

【0019】

野生型配列、配列番号１またはその一部切除型、あるいは他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列、あるいは任意の種のＰｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、あるいは任意の種のＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列に比較した際、アミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、アミノ酸が、アミノ酸：

【0020】

【化3】

【0021】

の１つまたはそれより多くで修飾されている、前記酵素を本明細書に記載する。
溶解度を改善する修飾には、以下の配列で強調して示されるアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ内の修飾が含まれる。

【0022】

【化4】

【0023】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。突然変異データ（図１および３）、配列整列（図２）、ならびにＤＮＡおよび３’－修飾ｄＮＴＰと共結晶したスポッテッドガーＴｄＴから得られた構造データ（図４～１４）にしたがって領域を選択した。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＹＹＤＩＶ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0024】

【化5】

【0025】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する特定の修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0026】

【化6】

【0027】

野生型配列、配列番号１または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素を本明細書に記載する。

【0028】

特定の配列への言及には、その一部切除が含まれる。野生型配列、配列番号１またはその一部切除型、あるいは他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素が本明細書に含まれる。

【0029】

一部切除タンパク質には、少なくとも以下に示す領域が含まれてもよい。

【0030】

【化7】

【0031】

少なくとも配列：

【0032】

【化8】

【0033】

または他の種における相同領域を含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、該配列が、配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰの１つまたはそれより多くにおける１つまたはそれより多くのアミノ酸修飾を有する、前記酵素を本明細書に記載する。

【0034】

【化9】

【0035】

野生型配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素を本明細書に開示する。

【0036】

野生型配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素を本明細書に開示する。

【0037】

野生型配列、配列番号１または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素が本明細書に含まれる。

【0038】

相同は、同じ生物種におけるスーパーファミリー由来のタンパク質、ならびに異なる種由来の相同タンパク質を含む、共通の進化起源を所持する２つまたはそれより多くのタンパク質の間のタンパク質配列を指す。こうしたタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、同一性パーセントに関するか、または特定の残基またはモチーフおよび保存された位の存在によってのいずれかでの、配列類似性によって反映されるように、配列相同性を有する。多様なタンパク質（およびそれらをコードする核酸）配列整列ツールを用いて、配列相同性を決定してもよい。例えば、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）によって提供されるＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多数配列整列プログラムを用いて、配列相同性または相同領域を決定してもよい。

【0039】

本明細書に記載するような改善された配列は、以下の両方の修飾を含有してもよく、すなわち
ａ． 第一の修飾は、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾は、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される。

【0040】

配列は一部切除されていてもよい。
本明細書に記載するような改善された配列は、以下の両方の修飾を含有してもよく、すなわち
ａ． 第一の修飾は、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾は、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される。

【0041】

他の種との比較として、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＴｄＴの配列を以下に示す：

【0042】

【化10】

【0043】

配列中の相同領域を以下に強調する。
溶解度を改善する修飾には、以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＱＬＬＰＫＶＩＮＬＷＥＫＫＧＬＬＬＹＹＤＬＶ内の修飾が含まれる。

【0044】

【化11】

【0045】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。第二の修飾は、以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＬＮＮＹＮＨＩ、ＮＥＶＳＹＶＴＦＭＲＡ、ＦＴＩＩＳＭ、ＤＫＶＫＣ、ＭＧＦＲＳ、ＭＳＤＫＴ、ＫＦＴＫＭＱＫ、ＶＳＣＶＴＲ、ＥＡＥＡ、ＡＶＷＡＦＬ、ＧＫＫＩ、ＳＰＧＳＡＥ、ＹＹＤＬＶ、ＤＨＦＱＫ、ＭＣＰＹＥＮＲ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＲ、およびＤＹＩＥＰの１つまたはそれより多くより選択されてもよい。

【0046】

【化12】

【0047】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＮＮＹＮＨ、ＦＭＲＡ、ＦＴＩ、ＶＫＣ、ＦＲＳ、ＭＳＤＫＴ、ＭＱＫ、ＥＡＥＡ、ＡＶＷ、ＫＫＩ、ＳＰＧＳＡＥ、ＤＨＦＱ、ＭＣＰＹＥＮ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡ、およびＹＩＥＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0048】

【化13】

【0049】

他の種との比較として、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの配列を以下に示す：

【0050】

【化14】

【0051】

溶解度を改善する修飾には、以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＱＬＬＨＫＶＴＤＦＷＫＱＱＧＬＬＬＹＣＤＩＬ内の修飾が含まれる。

【0052】

【化15】

【0053】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＬＮＮＹＮＱＬ、ＮＥＧＳＣＬＡＦＭＲＡ、ＦＰＩＴＳＭ、ＤＫＶＫＳ、ＭＧＦＲＴ、ＱＳＤＫＳ、ＲＦＴＱＭＱＫ、ＶＳＣＶＮＲ、ＥＡＥＡ、ＡＶＶＴＦＬ、ＧＫＭＴ、ＳＰＥＡＴＥ、ＤＨＦＱＫ、ＳＧＱ、ＭＣＰＹＤＲＲ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡＬＹＤＲＴ、Ｒ、およびＤＹＩＥＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0054】

【化16】

【0055】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＬＮＮＹＮＱ、ＮＥＧＳＣＬＡＦＭＲＡ、ＦＰＩ、ＶＫＳ、ＦＲＴ、ＳＫＩＱＳＤＫＳ、ＭＱＫ、ＶＳＣＶＮＲ、ＥＡＥＡ、ＡＶＶ、ＫＭＴ、ＳＰＥＡＴＥ、ＤＨＦＱＫ、ＭＣＰＹＤＲ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡ、およびＹＩＥＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0056】

【化17】

【0057】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＮＮＹＮＱ、ＦＭＲＡ、ＦＰＩ、ＶＫＳ、ＦＲＴ、ＱＳＤＫＳ、ＭＱＫ、ＶＳＣＶＮＲ、ＥＡＥＡ、ＡＶＶ、ＫＭＴ、ＳＰＥＡＴＥ、ＤＨＦＱ、ＭＣＰＹＤＲ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡ、およびＹＩＥＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0058】

【化18】

【0059】

したがって、配列を整列するプロセスによって、他の種由来の末端トランスフェラーゼの配列中のどの領域が、配列番号１に示すスポッテッドガー配列に関して、本明細書に記載する配列に対応するかは直ちに明らかである。

【0060】

配列相同性は、ファミリーＸポリメラーゼ、例えばＤＮＡ Ｐｏｌμ（ＤＮＡポリメラーゼミューまたはＰＯＬＭとしてもまた知られる）、ＤＮＡ Ｐｏｌβ（ＤＮＡポリメラーゼベータまたはＰＯＬＢとしてもまた知られる）、およびＤＮＡ Ｐｏｌλ（ＤＮＡポリメラーゼラムダまたはＰＯＬＬとしてもまた知られる）のすべての修飾または野生型メンバーにも拡張される。ＴｄＴがメンバーであるファミリーＸメンバーポリメラーゼはすべて、末端トランスフェラーゼ活性を有するか、または末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ２０１０ Ｍａｙ； １８０４（５）： １１３６－１１５０）と類似の末端トランスフェラーゼ活性を獲得するように操作されてもよいことが周知である。例えば、以下のヒトＴｄＴループ１アミノ酸配列

【0061】

【化19】

【0062】

で、以下のヒトＰｏｌμアミノ酸残基

【0063】

【化20】

【0064】

を置換するよう操作した際、ヒトＴｄＴループ１を含有するキメラヒトＰｏｌμは、ロバストな末端トランスフェラーゼ活性を獲得した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００６ Ｓｅｐ； ３４（１６）： ４５７２－４５８２）。

【0065】

さらに、米国特許出願第２０１９／００７８０６５号において、ファミリーＸポリメラーゼは、ＴｄＴループ１キメラを含有するように操作された際、ロバストな末端トランスフェラーゼ活性を獲得しうることが、一般的に立証された。さらに、ＴｄＴが、ループ１モチーフ中の特定の突然変異を通じて、テンプレート依存性ポリメラーゼに変換可能であることが立証された（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｕｎ ２００９， ３７（１４）：４６４２－４６５６）。当該技術分野に示されている通り、ファミリーＸポリメラーゼはテンプレート依存性またはテンプレート非依存性ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性のいずれかを示すように自明に修飾可能である。したがって、本特許において示されるすべてのモチーフ、領域、および突然変異は、修飾Ｘファミリーポリメラーゼが３’－修飾ヌクレオチド、可逆的終結ヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド一般を取り込んで、核酸合成法を達成可能になるように修飾されたＸファミリーポリメラーゼに自明に拡張されうる。

【0066】

他のファミリーＸポリメラーゼとの比較として、ヒトＰｏｌμ配列を以下に示す：

【0067】

【化21】

【0068】

溶解度を改善する修飾には、以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＧＬＬＰＲＶＭＣＲＬＱＤＱＧＬＩＬＹＨＱＨＱ内の修飾が含まれる。

【0069】

【化22】

【0070】

修飾ヌクレオチドの取り込みを改善する修飾は、以下に示す選択される領域の１つまたはそれより多くでのものであってもよい。以下の配列中で強調して示されるアミノ酸領域ＶＡＩＹ、ＬＧＡ、ＬＴＨＨＮＴＧ、ＳＥＧＲＬＬＴＦＣＲＡＡ、ＳＰＶＴＴＬ、ＥＨＳＳＲ、ＥＧＬＲＴ、ＲＥＱＰ、ＫＬＴＱＱＱＫＡ、ＳＴＰＶＬＲ、ＤＶＤＡ、ＡＶＧＱＡ、ＧＫＬＱ、ＨＰＫＥＧＱ、ＹＨＱＨＱ、ＤＡＦＥＲ、ＶＡＰＶＳＱ、ＦＳＲＫＥＫＧＬＷＬＮＳＨＧＬＦＤＰＥＱＫ、およびＥＹＬＰＰの１つまたはそれより多くから、第二の修飾を選択してもよい。

【0071】

【化23】

【0072】

したがって、配列を整列するプロセスによって、任意の種由来のすべてのファミリーＸポリメラーゼの配列中のどの領域が、配列番号１に示すスポッテッドガー配列に関して、本明細書に記載する配列に対応するかは直ちに明らかである。

【0073】

さらに、Ａファミリーポリメラーゼ、ＤＮＡ Ｐｏｌθ（ＤＮＡポリメラーゼ・シータまたはＰＯＬＱとしてもまた知られる）は、ロバストな末端トランスフェラーゼ能を示すことが立証された（ｅＬｉｆｅ． ２０１６； ５： ｅ１３７４０）。ＤＮＡ Ｐｏｌθはまた、核酸合成法においても有用であることが立証された（英国特許出願第２５５３２７４号）。米国特許出願第２０１９／００７８０６５号において、ＤＮＡ ＰｏｌθおよびファミリーＸポリメラーゼのキメラは、ロバストな末端トランスフェラーゼ活性を獲得するように操作可能であり、そして核酸合成法に適格であるようにすることが可能であることが立証された。したがって、本特許に示すすべてのモチーフ、領域、および突然変異は、修飾Ａファミリーポリメラーゼが３’－修飾ヌクレオチド、可逆的終結ヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド一般を取り込んで、核酸合成法を達成可能になるように修飾されたＡファミリーポリメラーゼ、特にＤＮＡ Ｐｏｌθに自明に拡張されうる。

【図面の簡単な説明】

【0074】

【図1】末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、配列番号１～１７３による３’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ_３ヌクレオシド５’－三リン酸の取り込み。１分あたり、ＴｄＴ １ナノグラムあたりの一本鎖ＤＮＡ分子の３’端への可逆的終結ヌクレオシド５’－三リン酸取り込みの量（ｐｍｏｌ）によって、取り込み速度を定義する。ｙ軸＝０近傍の点線によって、野生型ウシＴｄＴ活性を示す。アッセイのダイナミックレンジは、１分あたり、ＴｄＴ １ナノグラムあたりの２．０ｐｍｏｌの取り込みで飽和する。

【図2】欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）多数配列整列サイトによって提供されるＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ多数配列整列プログラムを用いた、野生型末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの選択したオルソログの配列整列。

【図3】上部パネル：塩基修飾基質Ａ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、およびＴ^＊を、単一ヌクレオチド取り込みアッセイにおいて、操作された変異体に供給した。Ａ^＊は３’－アミノオキシ６－アジド２’－デオキシアデノシン５’－三リン酸を示し；Ｃ^＊は３’-アミノオキシ４－アジド５－メチル２’－デオキシシチジン５’－三リン酸を示し；Ｇ^＊は３’－アミノオキシ２－アジド２’－デオキシグアノシン５’－三リン酸を示し；Ｔ^＊は３’－アミノオキシ５－（－ヒドロキシ－１－ブチニル）２’－デオキシウリジン５’－三リン酸を示す。縮重端を持つＤＮＡイニシエーターのプールを固体支持体に固定し、そして（１）ＴｄＴ変異体、（２）中性ｐＨ緩衝剤、（３）一価塩、（４）塩化コバルト、および（５）３’－ＯＮＨ_２－ｄＸＴＰ、式中、ＸはＡ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、またはＴ^＊を生じる修飾核酸塩基である、を含有するヌクレオチド付加混合物（ＮＡＭ）溶液に曝露した。インキュベーション温度は３７℃であり、そして反応時間は２．５分間であった。次いで、固体支持体を中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した後、中性ｐＨの低塩溶液で洗浄した。イニシエータープールを配列決定ライブラリーに変換し、そしてＰＥ３０読み取りを伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００上で、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって分析した。Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ変換ソフトウェアでＢｃｌファイルをｆａｓｔｑファイルに変換し、そしてＲにおいて分析した。取り込み効率（［Ｎ＋１産物を含有する読み取り］／｛［Ｎイニシエーターを含有する読み取り］＋［Ｎ＋１産物を含有する読み取り］｝）を、すべてのありうるイニシエーター背景に対する、各修飾塩基の付加に関して計算した。すべての背景に渡る平均取り込み効率を図３に示す（上部パネル）。塩基修飾可逆的終結ヌクレオチドＡ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、およびＴ^＊の、野生型ウシおよび野生型スポッテッドガーＴｄＴによる単一ヌクレオチド取り込みを、点線によって示す。該アッセイにおいて、野生型ウシまたはスポッテッドガーＴｄＴはこれらの塩基修飾可逆的終結ヌクレオチドを取り込むことが不可能であるため、点線はｙ＝０に存在する。ＴｄＴ変異体における提示した突然変異はすべて、野生型ウシおよび野生型スポッテッドガーＴｄＴに比較して、ＴｄＴにおいて、修飾塩基取り込みの改善を生じた。 下部パネル：３’－ＯＮＨ_２ヌクレオシド５’－三リン酸と末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、配列番号１および３４４～７２７を用いた、８ｎｔ核酸配列の固体支持体合成。固体支持体に結合したＤＮＡイニシエーターを、（１）ＴｄＴ、（２）中性ｐＨ緩衝剤、（３）一価塩、（４）塩化コバルト、および（５）３’－ＯＮＨ_２－ｄＮＴＰ、式中、Ｎはアデニン、チミン、シトシン、またはグアニンより選択される、を含有するヌクレオチド付加混合物（ＮＡＭ）溶液に反復して曝露することによって、ＤＮＡ配列５’－ＡＴＣＧＡＴＣＧ－３’を合成した。サイクルは、以下からなる：（Ａ）明記するＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧの可逆的終結ヌクレオチドを含むＮＡＭ溶液を、固体支持体上、３７℃で５分間インキュベーションした；（Ｂ）次いで、固体支持体を中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した；（Ｃ）次いで、固体支持体を酸性水性亜硝酸ナトリウムに曝露した；そして（Ｄ）次いで、固体支持体を（Ｂ）と同じ中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した。次いで、（Ａ）～（Ｄ）をさらに７回反復して、所望の８ｎｔ配列を合成した。変性ポリアクリルアミドゲル上で反応を泳動することによって、合成したＤＮＡを分析し、そしてＤＮＡイニシエーターに共有結合したフルオロフォアによって定量化した。８ｎｔバンドの蛍光強度を測定し、そして総レーン強度で割ることによって、全長（８ｎｔ種）の率を決定した。全長の率に関するような野生型ウシおよびスポッテッドガーＴｄＴ活性を点線で示す。ＴｄＴ変異体に含まれるすべての突然変異は、野生型ウシおよびスポッテッドガーＴｄＴに比較して、ＴｄＴの改善を生じた。

【図4】ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰに結合した、好ましい操作されたＮｕｃｌｅｒａ ＴｄＴ変異体の共結晶構造に基づく、スポッテッドガーＴｄＴ相同性構造。ＢＲＣＴドメイン一部切除を含む操作されたＴｄＴ変異体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で発現させ、そして固定金属アフィニティクロマトグラフィ後、サイズ排除クロマトグラフィを通じて精製した。次いで、以下のリザーバー溶液：それぞれ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（２７ｍＭ）、２２％ｗ／ｖ ＰＥＧ３３５０またはＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（１０ｍＭ）および２７．５％ｗ／ｖ ＰＥＧ ＭＭＥ５００中、ｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２（１ｍＭ）の非存在下（上部）または存在下（下部）で、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’－ＴＴＴＴＴ［ｄｄＣ］－３’；１２０マイクロモル）、塩化コバルト（１ｍＭ）を用い、１９℃でのシッティングドロップ蒸気拡散によって、前述のＴｄＴ（６０マイクロモル）を共結晶化した。平面様の結晶が現れ、そして１週間に渡って４００ｘ５０ｘ５μｍ^３の最大寸法まで成長し、そしてそれぞれ２．６および２．５オングストロームに回折し、空間群はＰ２_１２_１２_１であり、そして単位格子寸法は、それぞれ、ａ＝５６．５Å、ｂ＝８０．０Å、ｃ＝８８．２Å、およびａ＝５５．６Å、ｂ＝７９．１Å、ｃ＝８８．６Åであった。Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで、自動化ソフトウェアパイプラインを用いて、データをインデックス化し、統合し、そしてスケーリングした。Ｌｅｐｉｓｏｓｔｅｕｓ ｏｃｕｌａｔｕｓ（スポッテッドガー）の相同性モデルで分子置換した後、剛体が散在する手動モデル構築、アニーリングシミュレーション、エネルギー最小化および個々の等方性Ｄ因子のサイクルを行い、完全構造モデルを生じた（Ｒ_ｆｒｅｅ＝それぞれ２７．８％および２８．６％）。異常分散によって、コバルトイオンを同定した。ＢＲＣＴドメイン一部切除を含むスポッテッドガーＴｄＴ野生型配列（＞９５％配列同一性）を２つの構造上にモデリングした。

【図5】黒で強調された、ＥＮＨＮＱモチーフを含むＭＥＮＨＮＱＩモチーフを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＭＥＮＨＮＱＩおよびＥＮＨＮＱモチーフは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位へのアクセスを制御し、そして本特許に示す突然変異は、このモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図6】黒で強調された、ＦＭＲＡモチーフを含むＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面提示（右は左の図を１８０度回転した図）。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＳＥＧＰＬＣＬＡＦＭＲＡおよびＦＭＲＡモチーフは、（１）立体効果および静電相互作用を通じて、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への可逆的終結ヌクレオチドのアクセスを制御し、そして（２）非常に重要なＴＧＳＲモチーフに対して直接パッキングし、該モチーフは可逆的終結ヌクレオチドと直接接触する。特にＴＧＳＲモチーフに関して、ＳＥＧＰＬＣＬＡＦＭＲＡおよびＦＭＲＡモチーフは直接接触し、そしてＲ４３８の配置を調節し、該残基が可逆的終結ヌクレオチドと直接接触する。本特許に示す突然変異は、これらのモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図7】黒で強調された、ＭＱＫモチーフを含むＨＦＴＫＭＱＫモチーフを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＨＦＴＫＭＱＫおよびＭＱＫモチーフは、核酸イニシエーターに結合し、そして入ってくるヌクレオチドに対する求核攻撃のため、イニシエーターの３’端の配置を補助する。本特許に示す突然変異は、このモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図8】黒で強調されたＳＡＡＶＣＫモチーフを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＳＡＡＶＣＫモチーフは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への可逆的終結ヌクレオチドのアクセスを制御する。本特許に示す突然変異は、このモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図9】黒で強調された、ＫＥＣモチーフを含むＧＫＥＣモチーフを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面（左）および漫画／球体（右）提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＧＫＥＣおよびＫＥＣモチーフは、可逆的終結ヌクレオチドのヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位へのアクセスを制御し、そしてその結合を導く。本特許に示す突然変異は、このモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図10】黒で強調された、ＤＨＦＱモチーフを含むＤＨＦＱＫモチーフを持つ、図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造上にモデリングされたスポッテッドガーＴｄＴ相同性構造の表面提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＤＨＦＱＫおよびＤＨＦＱモチーフは、核酸イニシエーターに立体的に作用することによって、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への核酸イニシエーターのアクセスを制御する。本特許に示す突然変異は、このモチーフを突然変異させると、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図11】黒い球体で強調されたＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡモチーフを持つ、ＤＮＡイニシエーターおよびｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２に結合した図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造の漫画提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡモチーフは、ヌクレオチドおよびイニシエーターに立体的に作用することによって、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位におけるヌクレオチドおよび核酸イニシエーター結合を制御する。さらに、モチーフＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡは、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡに突然変異される。ＡｓｎからＡｒｇへの突然変異は、触媒性コバルトイオンの２つのうち１つに直接結合したＡｒｇ残基を生じ、これは活性に必要とされる。本特許に示す突然変異は、このモチーフ内の残基を突然変異させると、Ｃｏ^２＋、可逆的終結ヌクレオチド、および／または核酸イニシエーターのいずれかと接触する非常に重要なアミノ酸の配置が調節されて、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図12】黒い球体で強調されたＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫモチーフを持つ、ＤＮＡイニシエーターおよびｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２に結合した図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造の漫画提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫモチーフは、ヌクレオチドおよびイニシエーターに立体的に作用することによって、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位におけるヌクレオチドおよび核酸イニシエーター結合を制御する。さらに、モチーフＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫは、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡＬＹＤＫＴＫＫに突然変異される。ＡｓｎからＡｒｇへの突然変異は、触媒性コバルトイオンの２つのうち１つに直接結合したＡｒｇ残基を生じ、これは活性に必要とされる。本特許に示す突然変異は、このモチーフ内の残基を突然変異させると、Ｃｏ^２＋、可逆的終結ヌクレオチド、および／または核酸イニシエーターのいずれかと接触する非常に重要なアミノ酸の配置が調節されて、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じることを立証する。

【図13】黒い球体で強調された、ＹＩＤＰモチーフを含有するＤＹＩＤＰモチーフを持ち、ＤＮＡイニシエーターおよびｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２に結合した図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造の漫画提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＤＹＩＤＰおよびＹＩＤＰモチーフは、活性部位内のＡ４９４の配置を調節することによって、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位におけるヌクレオチド結合を制御する。この最もＣ末端の残基（Ａｌａ４９４）は、入ってくるヌクレオチドに立体的に作用する。ＹＩＤＰモチーフを突然変異させると、最もＣ末端のＡｌａ残基の配置が調節され、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じる。

【図14】黒い球体で強調されたＹＹＤＩＶモチーフを持つ、ＤＮＡイニシエーターおよびｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２に結合した図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造の漫画提示。ＴｄＴは、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位への２つの入口を含有し、この中に、ＤＮＡイニシエーターおよび可逆的終結ｄＮＴＰが進入し、そして結合しうる。活性部位のモデリングおよび視覚的検査によって決定されるように、ＹＹＤＩＶモチーフは、核酸イニシエーター中の端から三番目（ＩＩＩ）、端から二番目（ＩＩ）、および最も端の（Ｉ）３’－ヌクレオチドに立体的に作用することによって、核酸イニシエーターの配置を制御する。特に、このモチーフは、ピリミジン（左、結晶化した場合、球体提示で示されるＩおよびＩＩ）に作用するが、特にプリン（右、プリンとして構造内にモデリングされるＩＩ）に作用する。ＹＹＤＩＶモチーフを突然変異させると、ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性部位内への核酸イニシエーターの配置およびアクセスが調節され、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加が生じる。

【図15】黒い球体で強調された、ＡＰＰＶＤＮモチーフを含有するＡＰＰＶＤＮＦモチーフを持ち、ＤＮＡイニシエーターおよびｄＡＴＰ－ＯＮＨ_２に結合した図４に記載したような操作されたＴｄＴ変異体の結晶構造の漫画提示。該構造において、ＡｌａからＭｅｔへの突然変異でＭＰＰＶＤＮＦになる、ＡＰＰＶＤＮＦモチーフが示される。モデリングを通じて、ＡＰＰＶＤＮＦおよびＡＰＰＶＤＮモチーフは、どちらも明るい灰色の球体で示されるＹＹＤＩＶ（上部右）およびＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ（下部左）モチーフに対して直接パッキングすることによってこれらのモチーフの配置を制御する。さらに、モデリングを通じて決定されるように、ＡＰＰＶＤＮＦおよびＡＰＰＶＤＮモチーフは、どちらも明るい灰色の球体で示される、ヌクレオチドトランスフェラーゼ機構に非常に重要である、ＴＧＳＲモチーフ（上部左）およびアスパラギン酸の触媒性３つ組（下部右）のループコンホメーションを決定することによって、これらのモチーフの配置を制御する。ＡＰＰＶＤＮＦおよびＡＰＰＶＤＮモチーフを突然変異させると、前述の非常に重要なタンパク質モチーフが、可逆的終結ヌクレオチドおよび核酸イニシエーターとの接触を調節する方式に直接影響がある。本特許に示されているＡＰＰＶＤＮＦおよびＡＰＰＶＤＮモチーフ中の突然変異は、可逆的終結ヌクレオチドのＴｄＴ取り込み活性の増加を生じる。

【発明を実施するための形態】

【0075】

修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を本明細書に記載する。末端トランスフェラーゼ酵素は、天然に遍在性であり、そして多くの種に存在する。多くの既知のＴｄＴ配列が、ＮＣＢＩデータベースに報告されてきている。本明細書に記載する配列は、スポッテッドガーの配列から修飾されているが、対応する変化を、他の種由来の相同配列内に導入してもよい。Ｐｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、またはＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列もまた、末端トランスフェラーゼ活性を所持する。末端トランスフェラーゼへの言及にはまた、こうした配列が末端トランスフェラーゼ活性を所持する場合、Ｐｏｌμ、Ｐｏｌβ、Ｐｏｌλ、およびＰｏｌθの相同アミノ酸配列、またはＸファミリーポリメラーゼの相同アミノ酸配列が含まれる。

【0076】

野生型配列と比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素を本明細書に開示する。

【0077】

少なくとも配列番号７２９：

【0078】

【化24】

【0079】

または他の種における同等の相同領域を含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、配列が、該配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、ＭＥＮＨＮＱＩ、ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、ＨＡＩＳＳＳ、ＤＱＴＫＡ、ＫＧＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＨＦＴＫＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲＬＩ、ＧＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱＫ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮＦ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、およびＤＹＩＤＰの１つまたはそれより多くに１つまたはそれより多くのアミノ酸修飾を有する、前記酵素を本明細書に記載する。３５５アミノ酸の上記配列を、酵素の機能に影響を及ぼすことなく、他のアミノ酸に付着させてもよい。例えば、プロテアーゼ切断部位として単に取り込まれるさらなるＮ末端配列、例えば配列ＭＥＮＬＹＦＱＧが存在してもよい。

【0080】

野生型配列、配列番号１、または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩ、ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される、前記酵素を開示する。

【0081】

野生型配列、配列番号１、または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって；
ａ． 第一の修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾が、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される
前記酵素をさらに開示する。

【0082】

ウシＴｄＴ；配列番号２の配列に比較した際、
ａ． 第一の修飾は、配列番号２の配列のアミノ酸領域ＱＬＬＰＫＶＩＮＬＷＥＫＫＧＬＬＬＹＹＤＬＶまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾は、配列番号２の配列のアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＮＮＹＮＨ、ＦＭＲＡ、ＦＴＩ、ＶＫＣ、ＦＲＳ、ＭＳＤＫＴ、ＭＱＫ、ＥＡＥＡ、ＡＶＷ、ＫＫＩ、ＳＰＧＳＡＥ、ＭＣＰ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡ、およびＹＩＥＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される。

【0083】

マウスＴｄＴ；配列番号３の配列に比較した際、
ａ． 第一の修飾は、配列番号３の配列のアミノ酸領域ＱＬＬＨＫＶＴＤＦＷＫＱＱＧＬＬＬＹＣＤＩＬまたは他の種における相同領域内であり；そして
ｂ． 第二の修飾は、配列番号３の配列のアミノ酸領域ＬＶＬＦ、ＭＧＡ、ＮＮＹＮＱ、ＦＭＲＡ、ＦＰＩ、ＶＫＳ、ＦＲＴ、ＱＳＤＫＳ、ＭＱＫ、ＶＳＣＶＮＲ、ＥＡＥＡ、ＡＶＶ、ＫＭＴ、ＳＰＥＡＴＥ、ＤＨＦＱ、ＭＣＰＹＤＲ、ＹＡＴＨＥＲＫＭＭＬＤＮＨＡ、およびＹＩＥＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択される。

【0084】

修飾は、野生型配列と異なる任意のアミノ酸から選択可能である。アミノ酸は天然存在アミノ酸であってもよい。修飾アミノ酸は、ａｌａ、ａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｃｙｓ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｇｌｙ、ｈｉｓ、ｉｌｅ、ｌｅｕ ｌｙｓ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｔｒｐ、ｖａｌ、およびｓｅｃより選択されてもよい。

【0085】

簡潔にするため、修飾は、配列番号１に関連してさらに記載されるが、修飾は、他の種由来の配列、例えばＮＣＢＩデータベース中の配列を有する、上に列挙する配列に適用可能である。配列修飾はまた、配列番号１の一部切除型に適用可能である。

【0086】

記載する領域に加えた位で配列を修飾してもよい。本発明に対する態様には、こうした配列が末端トランスフェラーゼ活性を保持する限り、例えば、定義する位の外側のアミノ酸に対する修飾を有する配列が含まれてもよい。本発明の態様には、こうした配列が末端トランスフェラーゼ活性を保持する限り、例えば、定義する位の外側のアミノ酸の一部切除を有する配列が含まれてもよい。例えば、配列は、活性を保持するかまたは改善しつつ、Ｎ末端からアミノ酸が除去されている、出願ＷＯ２０１８２１５８０３に記載されるように一部切除されたＢＲＣＴであってもよい。請求する領域外のアミノ酸位に対する改変、付加、挿入または欠失または一部切除は、したがって、定義するように請求する領域が請求するように修飾されている限り、本発明の範囲内である。本明細書に記載する配列は、典型的には長さ少なくとも３００アミノ酸である、ＴｄＴ酵素を指す。本明細書に記載するすべての配列は、少なくとも３００アミノ酸を有することがわかる。請求項は、末端トランスフェラーゼ酵素として機能しないペプチド断片または配列を含まない。

【0087】

領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶまたは他の種由来の対応する領域内の修飾は、酵素の溶解度の改善を補助する。アミノ酸領域ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ内の修飾は、１つまたはそれより多くの下線で示すアミノ酸でのものであってもよい。

【0088】

特定の変化は、Ｗ－Ｑ、Ｎ－Ｐ、Ｒ－Ｋ、Ｌ－Ｖ、Ｒ－Ｌ、Ｌ－Ｗ、Ｑ－Ｅ、Ｎ－Ｋ、Ｑ－ＫまたはＩ－Ｌより選択されてもよい。
配列ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶはＱＬＬＰＫＶＩＮＬＷＥＫＫＧＬＬＬＹＹＤＬＶに改変されてもよい。

【0089】

第二の修飾は、野生型配列に比較して、３’位での修飾を有するヌクレオチドの取り込みを改善する。第二の修飾は、配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の１つまたはそれより多くより選択されてもよい。第二の修飾は、以下の配列で強調して示される配列番号１の配列のアミノ酸領域ＶＡＩＦ、ＥＤＮ、ＭＧＡ、ＥＮＨＮＱ、ＦＭＲＡ、ＨＡＩ、ＴＫＡ、ＦＨＳ、ＱＡＤＮＡ、ＭＱＫ、ＳＡＡＶＣＫ、ＥＡＱＡ、ＴＶＲ、ＫＥＣ、ＴＰＥＭＧＫ、ＤＨＦＱ、ＬＡＡＧ、ＡＰＰＶＤＮ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰまたは他の種における相同領域の２つまたはそれより多くより選択されてもよい。

【0090】

【化25】

【0091】

同定される位は、位、Ｖ３２、Ｍ１０８、Ｆ１８２、Ｔ２１２、Ｄ２７１、Ｍ２７９、Ｅ２９８、Ａ４２１、Ｌ４５６、Ｙ４８６で始まる。本明細書に開示する修飾は、定義される位で少なくとも１つの修飾を含有する。

【0092】

以下の配列において、修飾領域を以下のように番号付ける。

【0093】

【化26】

【0094】

ＷＬＬＮＲＬＩＮＲＬＱＮＱＧＩＬＬＹＹＤＩＶ、３４９～３７０
ＶＡＩＦ、３２～３５
ＭＧＡ、１０８～１１０
ＭＥＮＨＮＱＩ、１５２～１５８
ＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ、１７５～１８５
ＨＡＩＳＳＳ、１９４～１９９
ＤＱＴＫＡ、２１０～２１４
ＫＧＦＨＳ、２６０～２６４
ＱＡＤＮＡ、２６９～２７３
ＨＦＴＫＭＱＫ、２７５～２８１
ＳＡＡＶＣＫ、２９１～２９６
ＥＡＱＡ、２９８～３０１
ＴＶＲＬＩ、３０９～３１３
ＧＫＥＣ、３２８～３３１
ＴＰＥＭＧＫ、３４１～３４６
ＤＨＦＱＫ、３８８～３９２
ＬＡＡＧ、４０３～４０６
ＡＰＰＶＤＮＦ、４２１～４２７
ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫ、４４７～４６７
ＤＹＩＤＰ、４８５～４８９
修飾アミノ酸は、領域ＦＭＲＡ中にあってもよい。修飾アミノ酸は、領域ＱＡＤＮＡ中にあってもよい。修飾アミノ酸は、領域ＥＡＱＡ中にあってもよい。修飾アミノ酸は、領域ＡＰＰ中にあってもよい。修飾アミノ酸は、領域ＬＤＮＨＡ中にあってもよい。修飾アミノ酸は、領域ＹＩＤＰ中にあってもよい。領域ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡは、修飾における基質バイアスを除去するために好適である。ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ領域は、種に渡って非常に保存されているようである。

【0095】

アミノ酸領域、ＦＭＲＡ、ＱＡＤＮＡ、ＥＡＱＡ、ＡＰＰ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、およびＹＩＤＰの１つまたはそれより多くより選択される修飾は、下線アミノ酸（単数または複数）でのものであってもよい。

【0096】

定義されるドメインにおける修飾によって記載される発明ではなく、特定の定義されたアミノ酸での修飾によって、配列を定義してもよい。野生型配列、配列番号１またはその一部切除型、あるいは他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、アミノ酸修飾を含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、アミノ酸が、アミノ酸

【0097】

【化27】

【0098】

の１つまたはそれより多くで修飾されている、前記酵素を本明細書に記載する。
野生型配列、配列番号１または他の種における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素の相同アミノ酸配列に比較した際、アミノ酸修飾を含む、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素であって、アミノ酸が、アミノ酸

【0099】

【化28】

【0100】

の１つまたはそれより多くで修飾されている、前記酵素を本明細書に提供する。
特定のアミノ酸変化には

【0101】

【化29】

【0102】

のいずれか１つが含まれてもよい。
アミノ酸変化には

【0103】

【化30】

【0104】

のいずれか２つまたはそれより多くが含まれる。
ＱＡＤＮＡからＫＡＤＫＡ、ＱＡＤＫＡ、ＫＡＤＮＡ、ＱＡＤＮＳ、ＫＡＤＮＴ、またはＱＡＤＮＴへの修飾は、核酸の３’端への３’－Ｏ修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込みおよび修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込み中の基質バイアスの除去に好適である。ＡＰＰＶＤＮからＭＣＰＶＤＮ、ＭＰＰＶＤＮ、ＡＣＰＶＤＲ、ＶＰＰＶＤＮ、ＬＰＰＶＤＲ、ＡＣＰＹＤＮ、ＬＣＰＶＤＮ、またはＭＡＰＶＤＮへの修飾は、核酸の３’端への３’－Ｏ修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込みおよび修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込み中の基質バイアスの除去に好適である。ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡからＷＡＲＨＥＲＫＭＩＬＤＮＨＡ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＩＬＤＮＨＡ、ＷＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、またはＦＡＲＨＥＫＫＭＬＬＤＮＨＡへの修飾もまた、核酸の３’端への３’－Ｏ修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込みおよび修飾ヌクレオシド三リン酸の取り込み中の基質バイアスの除去に好適である。

【0105】

修飾は、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの１つまたはそれより多くより選択されてもよい。第二の修飾が、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの２つまたはそれより多くから選択される、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素が含まれる。第二の修飾が、以下の配列ＦＲＲＡ、ＱＡＤＫＡ、ＥＡＤＡ、ＭＰＰ、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡ、およびＹＩＰＰの各々を含有する、修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素が含まれる。

【0106】

本明細書に示す結晶構造は、以下のドメインを示し、これらは修飾するドメインとして好ましい可能性もある：
図５． ＥＮＨＮＱモチーフを含むＭＥＮＨＮＱＩモチーフ（１５２～１５８）
図６． 黒で強調された、ＦＭＲＡモチーフを含むＳＥＧＰＣＬＡＦＭＲＡ（１７５～１８５）
図７． 黒で強調された、ＭＱＫモチーフを含むＨＦＴＫＭＱＫモチーフ（２７５～２８１）
図８． 黒で強調されたＳＡＡＶＣＫモチーフ（２９１～２９６）
図９． 黒で強調された、ＫＥＣモチーフを含むＧＫＥＣモチーフ（３２８～３３１）
図１０． 黒で強調された、ＤＨＦＱモチーフを含むＤＨＦＱＫモチーフ（３８８～３９２）
図１１． 黒い球体で強調されたＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡモチーフ（４４７～４６０）。さらに、モチーフＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡは、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡに突然変異された。

【0107】

図１２． 黒い球体で強調されたＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫモチーフ（４４７～４６７）。さらに、モチーフＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＮＨＡＬＹＤＫＴＫＫは、ＦＡＲＨＥＲＫＭＬＬＤＲＨＡＬＹＤＫＴＫＫに突然変異された。

【0108】

図１３． 黒い球体で強調された、ＹＩＤＰモチーフを含有するＤＹＩＤＰモチーフ（４８５～４８９）。
図１４． 黒い球体で強調されたＹＹＤＩＶモチーフ（３６６～３７０）。

【0109】

図１５． 黒い球体で強調された、ＡＰＰＶＤＮモチーフ（４２１～４２７）を含有するＡＰＰＶＤＮＦモチーフ。該構造において、ＡｌａからＭｅｔへの突然変異でＭＰＰＶＤＮＦになる、ＡＰＰＶＤＮＦモチーフが示される。

【0110】

発現された配列の精製を補助するため、アミノ酸をさらに修飾してもよい。例えば、アミノ酸配列は、末端に１つまたはそれより多いさらなるヒスチジン残基を含有してもよい。配列番号４～１７３またはその一部切除型の任意の１つを含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素が含まれる。配列４～１７３は、スポッテッドガー由来の全長配列である。配列番号１７４～３４３のいずれか１つを含む修飾末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素が含まれる。配列１７４～３４３は、スポッテッドガー/ウシキメラとしてのＮ－一部切除配列である。配列３４４～７２７は、一部切除型のスポッテッドガー配列である。さらに、これらの配列に関して、単にプロテアーゼ切断部位として取り込まれるＮ末端配列（ＭＥＮＬＹＦＱＧ．．．）がある。

【0111】

核酸合成法であって：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供し；
（ｂ）本明細書に定義するような末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の存在下で、前記イニシエーターオリゴヌクレオチドに３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸を付加し；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドからすべての試薬を除去し；
（ｄ）切断剤の存在下でブロッキング基を切断し；そして
（ｅ）切断剤を除去する
工程を含む、前記方法もまた開示する。

【0112】

工程（ｂ）～（ｅ）を反復することによって、１つより多いヌクレオチドを付加してもよい。
本明細書において、「ヌクレオシド三リン酸」への言及は、３つのリン酸基に結合したヌクレオシド（すなわちデオキシリボースまたはリボース糖分子に付着した塩基）を含有する分子を指す。デオキシリボースを含有するヌクレオシド三リン酸の例は：デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）またはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）である。リボースを含有するヌクレオシド三リン酸の例は：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）またはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）である。他のタイプのヌクレオシド、例えば天然存在修飾ヌクレオシドおよび人工ヌクレオシドが三リン酸に結合して、ヌクレオシド三リン酸を形成してもよい。

【0113】

したがって、本明細書において、「３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸」への言及は、さらなるヌクレオチドの付加を防止する、すなわち３’－ＯＨ基を保護基で置換することによってさらなる付加を防止する、さらなる基を３’端に有するヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰ）を指す。

【0114】

本明細書において、「３’－ブロック」、「３’－ブロッキング基」または「３’－保護基」への言及は、さらなるヌクレオチド付加を防止する、ヌクレオシド三リン酸の３’端に付着される基を指す。本方法は、切断によって除去されてさらなるヌクレオチドの付加を可能にしうる、可逆的３’－ブロッキング基を用いる。対照的に、不可逆的３’－ブロッキング基は、３’－ＯＨ基が切断によって曝露されないかまたは現れないかいずれかでありうるｄＮＴＰを指す。

【0115】

３’－ブロッキングされたヌクレオシド５’－三リン酸は、アンマスクされて３’－ＯＨを現しうる、任意の化学基によってブロッキングされてもよい。３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－アミノオキシ、３’－Ｏ－（Ｎ－オキシム）（３’－Ｏ－Ｎ＝ＣＲ_１Ｒ_２、式中、Ｒ_１およびＲ_２は、各々、Ｃ１～Ｃ３アルキル基、例えばＣＨ_３であり、したがって、オキシムはＯ－Ｎ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２（Ｎ－アセトンオキシム）であってもよい）、３’－Ｏ－アリル基、３’－Ｏ－シアノエチル、３’－Ｏ－アセチル、３’－Ｏ－ナイトレート、３’－Ｏ－ホスフェート、３’－Ｏ－アセチルレブリン酸エステル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔブチルジメチルシラン、３’－Ｏ－トリメチル（シリル）エトキシメチル、３’－Ｏ－オルト－ニトロベンジル、および３’－Ｏ－パラ－ニトロベンジルによってブロッキングされてもよい。

【0116】

３’－ブロッキングされたヌクレオシド５’－三リン酸はまた、化学連結、例えば銅触媒されるかまたは銅不含アジド－アルキンクリック反応およびテトラジン－アルケンクリック反応において直接利用されうる任意の化学基によってブロッキングされてもよい。３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸には、アジド、アルキン、アルケン、およびテトラジンを含有する化学部分が含まれてもよい。

【0117】

本明細書において、「切断剤」への言及は、３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸から３’－ブロッキング基を切断可能である物質を指す。１つの態様において、切断剤は化学的切断剤である。代替態様において、切断剤は、酵素的切断剤である。切断は、単一工程で行われてもよいし、または多工程でもよく、例えばオキシム（例えば３’－Ｏ－（Ｎ－オキシム）、３’－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２）を、アミノオキシ（Ｏ－ＮＨ_２）に変換し、その後、アミノオキシを切断してＯＨにしてもよい。

【0118】

当業者には、切断剤の選択は、用いる３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプに応じることが理解されるであろう。例えば、ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはｔｒｉｓ（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を用いて３’－Ｏ－アジドメチル基を切断してもよく、パラジウム錯体を用いて３’－Ｏ－アリル基を切断してもよく、または亜硝酸ナトリウムを用いて３’－アミノオキシ基を切断してもよい。したがって、１つの態様において、切断剤は：ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、パラジウム錯体または亜硝酸ナトリウムより選択される。

【0119】

１つの態様において、変性剤、例えば尿素、塩化グアニジウム、ホルムアミドまたはベタインを含む切断溶液の存在下で、切断剤を添加する。変性剤の添加は、ＤＮＡ中のいかなる望ましくない二次構造も破壊可能であるという利点を有する。さらなる態様において、切断溶液は、１つまたはそれより多い緩衝剤を含む。緩衝剤の選択は、正確な切断化学反応および必要な切断剤に応じることが当業者には理解されるであろう。

【0120】

本明細書において、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」または「イニシエーター配列」への言及は、３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸を付着させてもよい未結合（ｆｒｅｅ）３’端を持つ短いオリゴヌクレオチドを指す。１つの態様において、イニシエーター配列はＤＮＡイニシエーター配列である。別の態様において、イニシエーター配列はＲＮＡイニシエーター配列である。

【0121】

本明細書において、「ＤＮＡイニシエーター配列」への言及は、３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸を付着させてもよいＤＮＡの小分子配列を指し、すなわちＤＮＡはＤＮＡイニシエーター配列の末端から合成されるであろう。

【0122】

１つの態様において、イニシエーター配列は、長さ５～５０ヌクレオチドの間、例えば長さ５～３０ヌクレオチドの間（すなわち１０～３０の間）、特に長さ５～２０ヌクレオチドの間（すなわち長さおよそ２０ヌクレオチド）、より具体的には長さ５～１５ヌクレオチド、例えば長さ１０～１５ヌクレオチド、特に長さ１２ヌクレオチドである。

【0123】

１つの態様において、イニシエーター配列は一本鎖である。別の態様において、イニシエーター配列は二本鎖である。当業者には、３’－オーバーハング（すなわち未結合３’端）が効率的な付加を可能にすることが理解されるであろう。

【0124】

１つの態様において、イニシエーター配列を固体支持体上に固定する。これにより、合成された核酸を洗い流すことなく、ＴｄＴおよび切断剤を取り除くことが可能になる（それぞれ工程（ｃ）および（ｅ）において）。イニシエーター配列を、水性条件下で安定な固体支持体に付着させて、方法が流動セットアップを通じて容易に実行可能であるようにしてもよい。

【0125】

１つの態様において、イニシエーター配列は、可逆的相互作用部分、例えば化学的切断可能リンカー、抗体／免疫原性エピトープ、ビオチン／ビオチン結合タンパク質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）、またはグルタチオン－ＧＳＴタグを通じて、固体支持体上に固定される。したがって、さらなる態様において、該方法は、例えばプロテイナーゼＫとインキュベーションすることによって、イニシエーター配列中の可逆的相互作用部分を除去することによって、生じた核酸を抽出する工程をさらに含む。

【0126】

１つの態様において、イニシエーター配列は、酵素によって認識可能である塩基または塩基配列を含有する。酵素、例えばグリコシラーゼによって認識される塩基を除去して、化学的または酵素的手段によって切断可能である無塩基部位を生成してもよい。塩基配列は、制限酵素によって認識され、そして切断されることも可能である。

【0127】

さらなる態様において、イニシエーター配列を、化学的切断可能リンカー、例えばジスルフィド、アリル、またはアジドマスク化ヘミアミナールエーテルリンカーを通じて、固体支持体上に固定する。したがって、１つの態様において、該方法は、ジスルフィドリンカーに関してはｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジヒドロスレイトール（ＤＴＴ）；パラジウム錯体またはアリルリンカー；あるいはアジドマスク化ヘミアミナールエーテルリンカーに関してはＴＣＥＰの添加を通じて、化学的リンカーを切断することによって、生じた核酸を抽出する工程をさらに含む。

【0128】

１つの態様において、テンプレートとして、固体支持体に結合した核酸を用いて、生じた核酸を抽出し、そしてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。したがって、イニシエーター配列は、適切な順方向プライマー配列を含有し、そして適切な逆方向プライマー配列を合成してもよい。

【0129】

１つの態様において、１つまたはそれより多い緩衝剤（例えばＴｒｉｓまたはカコジル酸塩）、１つまたはそれより多い塩（例えば、すべて適切な対イオン、例えばＣｌとともに、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋等）、および無機ピロホスファターゼ（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）相同体）を含む伸長溶液の存在下で、本発明の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を添加する。緩衝剤および塩の選択は、最適な酵素活性および安定性に応じることが理解されるであろう。無機ピロホスファターゼの使用は、ＴｄＴによるヌクレオシド三リン酸加水分解によるピロリン酸の蓄積の減少を補助する。したがって、無機ピロホスファターゼの使用は、（１）逆方向反応および（２）ＴｄＴ鎖不均化の率を減少させる利点を有する。

【0130】

１つの態様において、工程（ｂ）を５～１０の間のｐＨ範囲で行う。したがって、ｐＨ５～１０の緩衝範囲を持つ任意の緩衝剤、例えばカコジル酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅ、特にカコジル酸塩またはＴｒｉｓを用いてもよいことが理解されるであろう。

【0131】

１つの態様において、工程（ｄ）を９９℃未満、例えば９５℃、９０℃、８５℃、８０℃、７５℃、７０℃、６５℃、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、または３０℃未満の温度で実行する。最適温度は、利用する切断剤に応じることが理解されるであろう。用いる温度は、ヌクレオチド付加中に形成されるいかなる二次構造の切断および破壊の補助も助ける。

【0132】

１つの態様において、工程（ｃ）および（ｅ）を、洗浄溶液を適用することによって実行する。１つの態様において、洗浄溶液は、本明細書に記載する伸長溶液中で用いるものと同じ緩衝剤および塩を含む。これは、方法工程を反復する際、工程（ｃ）の後に、洗浄溶液を収集し、そして工程（ｂ）における伸長溶液としてリサイクルすることを可能にするという利点を有する。

【0133】

イニシエーター配列および１つまたはそれより多くの３’－ブロッキングされたヌクレオシド三リン酸と組み合わせて、本明細書に定義するような末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を含むキットもまた開示する。

【0134】

本発明には、修飾末端トランスフェラーゼを発現するために用いられる核酸配列が含まれる。修飾末端トランスフェラーゼを発現するコドン最適化ｃＤＮＡ配列が本発明に含まれる。タンパク質変異体（配列番号４～７２７）の各々に関してコドン最適化されたｃＤＮＡ配列が含まれる。

【0135】

核酸配列は以下の配列（配列番号７２８）であってもよい：

【0136】

【化31】

【0137】

本発明には、修飾末端トランスフェラーゼを産生する細胞株が含まれる。

【実施例】

【0138】

ＴｄＴ変異体の発現
簡潔には、末端トランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有するプラスミドを、ＢＬ２１大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。スターター・ルリアブロス（ＬＢ）培養を３７℃で一晩増殖させて、そしてＬＢ発現培養内に接種した。発現培養を６００ｎｍで０．６の光学密度まで増殖させ、そしてＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することによって誘導した。培養を誘導し、そして２５℃で一晩増殖させた。翌朝、界面活性剤溶解溶液中で培養を溶解し、そして固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって均一に精製した。

【0139】

ＴｄＴ変異体による可逆的ターミネーターの取り込みのアッセイ
１７３の末端トランスフェラーゼ酵素を発現させ、精製し、そして野生型ウシＴｄＴ（配列番号２）に対して比較した。次いで、以下のアッセイで、精製操作ＴｄＴを用いた：蛍光標識１５ｎｔ ｓｓＤＮＡプライマーを、１ｘＴｄＴ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、酵母無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１ｍＵ／μｌ）、３’－アジドメチルｄＴＴＰまたは３’－アミノオキシｄＡＴＰ、および操作されたＴｄＴ（２４μｇ／μｌ）と、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、反応を停止するためにホルムアミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、そして試料を直接、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に装填し、そして分析した。ゲルを画像化し、そして生じたゲルバンドをＴｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ）で定量化した。

【0140】

１７３のＴｄＴ酵素（配列番号１～１７３）からの結果を図１に示す。
ＴｄＴ変異体による塩基修飾された可逆的ターミネーターの取り込みのアッセイ

【0141】

【化32】

【0142】

Ａ^＊は３’－アミノオキシ６－アジド２’－デオキシアデノシン５’－三リン酸を示し；Ｃ^＊は３’-アミノオキシ４－アジド５－メチル２’－デオキシシチジン５’－三リン酸を示し；Ｇ^＊は３’－アミノオキシ２－アジド２’－デオキシグアノシン５’－三リン酸を示し；Ｔ^＊は３’－アミノオキシ５－（－ヒドロキシ－１－ブチニル）２’－デオキシウリジン５’－三リン酸を示す。

【0143】

上述のように、１９２の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）変異体を発現させ、そして精製した。発現された変異体は配列番号：

【0144】

【化33】

【0145】

を有した。
単一ヌクレオチド取り込みアッセイにおいて、塩基修飾された可逆的ターミネーターＡ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、およびＴ^＊を基質として、操作された変異体に供給した。縮重端を持つＤＮＡイニシエーターのプール（・・・ＮＮＮ、式中、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を固体支持体に固定し、そして（１）ＴｄＴ変異体、（２）中性ｐＨ緩衝剤、（３）一価塩、（４）塩化コバルト、および（５）３’－ＯＮＨ_２－ｄＸＴＰ、式中、ＸはＡ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、またはＴ^＊を生じる修飾核酸塩基である、を含有するヌクレオチド付加混合物（ＮＡＭ）溶液に曝露した。インキュベーション温度は３７℃であり、そして反応時間は２．５分間であった。次いで、固体支持体を中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した後、中性ｐＨの低塩溶液で洗浄した。イニシエータープールを配列決定ライブラリーに変換し、そして対末端３０サイクル読み取り（ＰＥ３０読み取り）を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００上で、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって分析した。Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ変換ソフトウェアでＢｃｌファイルをｆａｓｔｑファイルに変換し、そしてＲにおいて分析した。取り込み効率（［Ｎ＋１産物を含有する読み取り］／｛［Ｎイニシエーターを含有する読み取り］＋［Ｎ＋１産物を含有する読み取り］｝）を、すべてのありうるイニシエーター背景に対する、各修飾塩基の付加に関して計算した。すべての背景に渡る平均取り込み効率を図３に示す（上部パネル）。塩基修飾可逆的終結ヌクレオチドＡ^＊、Ｃ^＊、Ｇ^＊、およびＴ^＊の、単一ヌクレオチド取り込みに関する、野生型ウシおよびスポッテッドガーＴｄＴの活性を、点線によって示す。本発明者らのアッセイにおいて、野生型ウシまたはスポッテッドガーＴｄＴはこれらの塩基修飾可逆的終結ヌクレオチドを取り込むことが不可能であるため、点線はｙ＝０に存在する。ＴｄＴ変異体における提示した突然変異はすべて、野生型ウシおよび野生型スポッテッドガーＴｄＴに比較して、ＴｄＴ修飾塩基取り込みの改善を生じた。

【0146】

ＴｄＴ変異体のマルチサイクリング能のアッセイ
３’－ＯＮＨ_２ヌクレオシド５’－三リン酸と末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）配列番号１および３４４～７２７を用いた８ｎｔ核酸配列の固体支持体合成。上述のようにＴｄＴ変異体を発現させ、そして精製した。固体支持体結合ＤＮＡイニシエーターを、（１）ＴｄＴ変異体、（２）中性ｐＨ緩衝剤、（３）一価塩、（４）塩化コバルト、および（５）３’－ＯＮＨ_２－ｄＮＴＰ、式中、Ｎはアデニン、チミン、シトシン、またはグアニンより選択される、を含有するヌクレオチド付加混合物（ＮＡＭ）溶液に反復して曝露することによって、ＤＮＡ配列５’－ＡＴＣＧＡＴＣＧ－３’を合成した。サイクルは、以下からなる：（Ａ）明記するＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧの可逆的終結ヌクレオチドを含むＮＡＭ溶液を、固体支持体上、３７℃で５分間インキュベーションした；（Ｂ）次いで、固体支持体を中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した；（Ｃ）次いで、固体支持体を酸性水性亜硝酸ナトリウムに曝露した；そして（Ｄ）次いで、固体支持体を（Ｂ）と同じ中性ｐＨの高塩溶液で洗浄した。次いで、（Ａ）～（Ｄ）をさらに７回反復して、所望の８ｎｔ配列を合成した。変性ポリアクリルアミドゲル上で反応を泳動することによって、合成したＤＮＡを分析し、そしてＤＮＡイニシエーターに共有結合したフルオロフォアによって定量化した。８ｎｔバンドの蛍光強度を測定し、そして総レーン強度で割ることによって、全長（８ｎｔ種）の率を決定した。全長の率に関するような野生型ウシおよびスポッテッドガーＴｄＴ活性を、ｙ＝０で、点線で示し、これは、これらのＴｄＴがいかなる８ｎｔ産物も合成不可能であることを示す。ＴｄＴ変異体に含まれるすべての突然変異は、野生型ウシおよびスポッテッドガーＴｄＴに比較して、ＴｄＴの改善を生じた。結果を図３（下部パネル）に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】