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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-24
(54)【発明の名称】処置誘導性の胃腸傷害を防止又は処置する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/165 20060101AFI20220316BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/655 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/5375 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/63 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/275 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/36 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20220316BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20220316BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220316BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220316BHJP
【ＦＩ】
A61K31/165
A61K31/506
A61K31/4985
A61K31/495
A61K31/655
A61K31/5375
A61K31/63
A61K31/275
A61K31/36
A61K31/4745
A61K31/513
A61P1/04
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021569250
(86)(22)【出願日】2020-02-03
(85)【翻訳文提出日】2021-10-01
(86)【国際出願番号】 US2020016302
(87)【国際公開番号】W WO2020163187
(87)【国際公開日】2020-08-13
(31)【優先権主張番号】62/801,185
(32)【優先日】2019-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521345604
【氏名又は名称】ユ，ジアン
(71)【出願人】
【識別番号】521345615
【氏名又は名称】ツァン，リン
(71)【出願人】
【識別番号】521345626
【氏名又は名称】レイボヴィッツ，ブライアン
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ジアン
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，リン
(72)【発明者】
【氏名】レイボヴィッツ，ブライアン
【テーマコード（参考）】
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA13
4C086BC43
4C086BC50
4C086CB05
4C086CB22
4C086DA19
4C086DA30
4C086GA07
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA10
4C086NA06
4C086NA14
4C086ZA68
4C086ZB26
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA04
4C206GA28
4C206HA14
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA14
4C206MA17
4C206NA06
4C206ZA68
(57)【要約】
本明細書では、化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置するための組成物及び方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置するための方法であって、【化1】
【化2】
からなる群から選択される治療有効量の化合物を対象に投与すること
を含み、
ここで、前記対象が化学療法又は放射線療法を受けていた、受けている、又は受ける予定である、方法。
【請求項2】
前記対象が、がんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんが、皮膚、乳房、膵臓、前立腺、卵巣、腎臓、食道、胃腸管、結腸、脳、肝臓、肺、頭及び／又は頸部のがんである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記化合物の投与が、少なくとも非がん細胞において、アポトーシスのｐ５３上方調節モジュレーター（ＰＵＭＡ）の活性を阻害し、それにより、前記化学療法又は放射線療法によって誘導される前記非がん細胞のアポトーシスを防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記非がん細胞が、ＬＧＲ５＋幹細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記化合物の投与が、前記化学療法又は放射線療法からがん細胞を保護しない、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記化学療法が、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記化合物が、重水素化される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
対象においてがんを処置するための方法であって、化学療法又は放射線療法を前記対象に投与すること；及び
【化3】
【化4】
からなる群から選択される治療有効量の化合物を前記対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項10】
前記化合物の投与が、前記化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記がんが、皮膚、乳房、膵臓、前立腺、卵巣、腎臓、食道、胃腸管、結腸、脳、肝臓、肺、頭及び／又は頸部のがんである、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記化合物の投与が、少なくとも非がん細胞において、ＰＵＭＡの活性を阻害し、それにより、前記化学療法又は放射線療法によって誘導される前記非がん細胞のアポトーシスを防止する、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記非がん細胞が、ＬＧＲ５＋幹細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記化合物の投与が、前記化学療法又は放射線療法からがん細胞を保護しない、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
前記化学療法が、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項16】
前記化合物が、重水素化される、請求項９に記載の方法。
【請求項17】
化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する薬剤をスクリーニングするための方法であって、化学療法又は放射線療法により、胃腸組織から調製されたオルガノイドを処置すること；及び
前記オルガノイドを候補薬剤に曝露して、前記オルガノイドのアポトーシスを防止する薬剤を同定すること
を含む、方法。
【請求項18】
前記オルガノイドが、結腸オルガノイドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記胃腸組織が、ヒト対象から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記オルガノイドが、少なくともがん細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記化学療法が、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
前記薬剤が、ｉｎ ｖｉｖｏで、化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する、請求項１７に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年２月５日に出願された、米国仮出願第６２／８０１，１８５号の優先権を主張する。
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年２月５日に出願された、米国仮出願第６２／８０１，１８５号の優先権を主張する。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、ＮＩＨによって与えられたＵ１９－Ａ１０６８０２１の下で政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、ＮＩＨによって与えられたＵ１９－Ａ１０６８０２１の下で政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0003】
背景技術
Ｉ．発明の分野
本開示は、一般に、医学、腫瘍学、及びがん治療の分野に関する。より詳細には、本開示は、化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する化合物、組成物、及び方法に関する。
Ｉ．発明の分野
本開示は、一般に、医学、腫瘍学、及びがん治療の分野に関する。より詳細には、本開示は、化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する化合物、組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
ＩＩ．関連技術の説明
胃腸（ＧＩ）副作用は、化学療法及び腹部放射線療法における主な投与量規制因子であり、元がん患者に長期合併症を引き起こし得る。例えば、結腸直腸がん患者を処置するために一般に使用される、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）が、５０％の患者で、化学療法誘導性の下痢を引き起こしたことが報告された。放射線及びほとんどの化学療法剤が、複数の組織及び器官系を損傷するが、一般に５－ＦＵと組み合わせて使用して結腸直腸がん患者を処置する、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）は、５０％より多くの患者で、重度の下痢及び嘔吐を伴う、選択的なＧＩ傷害を引き起こす。この急性毒性は、腸における、ＣＰＴ－１１の活性代謝物である、ＳＮ－３８の高濃度の蓄積、並びに腸内細菌による非毒性ＳＮ－３８グルクロニドのＳＮ－３８への変換後の腸内再吸収によって引き起こされる。ＳＮ－３８は、トポイソメラーゼＩの阻害剤であり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写の両方に重要な酵素であり、増殖する細胞において複製ストレス及びＤＮＡ損傷を引き起こす。下痢止め薬は、ＣＰＴ－１１誘導性の下痢の緩和を助けることができるが、長期のＧＩ機能障害を減少させる効果は限られている。現在は、ＣＰＴ－１１誘導性のＧＩ傷害又は合併症を防止又は処置するＵＳ ＦＤＡが認可した薬剤はない。したがって、化学療法又は放射線療法によって誘導されるＧＩ傷害を防止又は処置するための新しい治療剤又は方法を開発する必要性が急務である。
胃腸（ＧＩ）副作用は、化学療法及び腹部放射線療法における主な投与量規制因子であり、元がん患者に長期合併症を引き起こし得る。例えば、結腸直腸がん患者を処置するために一般に使用される、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）が、５０％の患者で、化学療法誘導性の下痢を引き起こしたことが報告された。放射線及びほとんどの化学療法剤が、複数の組織及び器官系を損傷するが、一般に５－ＦＵと組み合わせて使用して結腸直腸がん患者を処置する、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）は、５０％より多くの患者で、重度の下痢及び嘔吐を伴う、選択的なＧＩ傷害を引き起こす。この急性毒性は、腸における、ＣＰＴ－１１の活性代謝物である、ＳＮ－３８の高濃度の蓄積、並びに腸内細菌による非毒性ＳＮ－３８グルクロニドのＳＮ－３８への変換後の腸内再吸収によって引き起こされる。ＳＮ－３８は、トポイソメラーゼＩの阻害剤であり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写の両方に重要な酵素であり、増殖する細胞において複製ストレス及びＤＮＡ損傷を引き起こす。下痢止め薬は、ＣＰＴ－１１誘導性の下痢の緩和を助けることができるが、長期のＧＩ機能障害を減少させる効果は限られている。現在は、ＣＰＴ－１１誘導性のＧＩ傷害又は合併症を防止又は処置するＵＳ ＦＤＡが認可した薬剤はない。したがって、化学療法又は放射線療法によって誘導されるＧＩ傷害を防止又は処置するための新しい治療剤又は方法を開発する必要性が急務である。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、例えば、化学療法又は放射線療法によって誘導される、処置誘導性の胃腸傷害を防止又は処置することができる化合物を提供する。一実施形態では、化合物は、
【0006】
【化1】
【化2】
【0007】
特定の実施形態では、化合物は、重水素化される。
【0008】
別の態様では、本開示は、処置誘導性の胃腸傷害を防止又は処置するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書に記載の治療有効量の化合物を対象に投与することを含み、ここで対象は、化学療法又は放射線療法を受けていた、受けている、又は受ける予定である。
【0009】
ある特定の実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、がんは、皮膚、乳房、膵臓、前立腺、卵巣、腎臓、食道、胃腸管、結腸、脳、肝臓、肺、頭及び／又は頸部のがんである。
【0010】
ある特定の実施形態では、化合物の投与は、少なくとも非がん細胞において、アポトーシスのｐ５３上方調節モジュレーター（ＰＵＭＡ）の活性を阻害し、それにより、化学療法又は放射線療法によって誘導される非がん細胞のアポトーシスを防止する。ある特定の実施形態では、非がん細胞は、ＬＧＲ５＋幹細胞である。
【0011】
ある特定の実施形態では、化合物の投与は、化学療法又は放射線療法からがん細胞を保護しない。
【0012】
ある特定の実施形態では、化学療法は、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）からなる群から選択される。
【0013】
別の態様では、本開示は、対象においてがんを処置するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、化学療法又は放射線療法を対象に投与すること、及び本明細書に記載の治療有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【0014】
別の態様では、本開示は、化学療法又は放射線療法によって誘導される傷害を防止又は処置する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、方法は：化学療法又は放射線療法によりオルガノイドを処置すること；及びオルガノイドを候補薬剤に曝露して、オルガノイドのアポトーシスを防止する薬剤を同定することを含む。
【0015】
ある特定の実施形態では、オルガノイドは、ヒト対象からの組織に由来する。ある特定の実施形態では、オルガノイドは、胃腸組織に由来する。ある特定の実施形態では、オルガノイドは、結腸オルガノイドである。ある特定の実施形態では、オルガノイドは、がん組織に由来する。ある特定の実施形態では、オルガノイドは、少なくともがん細胞を含む。
【0016】
ある特定の実施形態では、同定された薬剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで、化学療法又は放射線療法によって誘導される胃腸傷害を防止又は処置する。
【0017】
本明細書に記載の任意の方法又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施され得ると考えられる。本開示の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の例は、本発明の特定の実施形態を示すが、本開示の精神及び範囲内の様々な変更及び改変が、この詳細な説明から当業者には明らかになるため、例示の目的によってのみ与えられると理解されるべきである。
【0018】
図面の簡単な説明
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書で提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、より理解され得る。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書で提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、より理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1-1】図１Ａ～図１Ｆは、ＰＵＭＡがＣＰＴ－１１誘導性の腸傷害を媒介することを示す図である。示した遺伝子型のマウスを、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で１回又は指定したように処置し、示した時間で分析した。（図１Ａ）６時間での腸陰窩における末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色の代表的な画像。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を使用して核を染色した。スケールバー、５０μｍ。（図１Ｂ）図１Ａの陰窩底部（ＣＢＣ）及び＋４～９細胞におけるＴＵＮＥＬ＋円柱細胞の定量。（図１Ｃ）示したタンパク質の発現を、６時間でウェスタンブロッティングにより分析した。ライセートは、３匹のマウスの腸粘膜からプールした。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。（図１Ｄ）６時間での陰窩におけるＰｕｍａ ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）。スケールバー、２０μｍ。（図１Ａ）及び（図１Ｄ）では、矢印は、パネート細胞下の位置１～３におけるＣＢＣを示し、アスタリスクは、ＣＢＣ上の位置４～９における＋４～９細胞を示す。（図１Ａ）～（図１Ｄ）では、群当たりｎ＝３匹のマウス。（図１Ｂ）では、値は、平均＋ＳＥＭである。＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側スチューデントのｔ検定）、ノックアウト（ＫＯ）対野生型（ＷＴ）。（図１Ｅ）０、１、及び２日目に、３日連続で１日用量のＣＰＴ－１１（１日当たり２１５ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスの生存。ＷＴ対Ｐｕｍａ ＫＯ、Ｐ＝０．０００４；ＷＴ対ｐ５３ ＫＯ、ｐ＝０．３８２（ログランク検定）。（図１Ｆ）（図１Ｅ）のように処置した５日目の、マウスからの小腸のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。スケールバー、２００μｍ。
【図1-2】同上。
【図2-1】図２Ａ～図２Ｆは、ＰＵＭＡｉが、ＣＰＴ－１１誘導性の腸傷害に対して保護することを示す図である。マウスは、ＰＵＭＡ阻害剤（ＰＵＭＡｉ）を伴って又は伴わずにＣＰＴ－１１によって処置した。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルは、ＣＰＴ－１１の２時間前又は特定したとおりに、腹腔内に与えられた。小腸又は示した組織は、示した時間で分析した。（図２Ａ）ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスの腸陰窩におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な画像。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。スケールバー、５０μｍ。矢印は、ＣＢＣを示し、アスタリスクは、＋４～９細胞を示す。（図２Ｂ）（図２Ａ）からのＴＵＮＥＬ＋ＣＢＣ及び移行増幅細胞（transit-amplifying cells）の定量。Ｉｎｈ、阻害剤。（図２Ｃ）単回注射後の異なる時間でのＰＵＭＡｉの組織分布。（図２Ｄ）ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）処置の６時間後のマウスにおけるＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＰＴ－１１処置の２時間前、又はＣＰＴ－１１処置の１時間後に与えられた。群当たりｎ＝３匹のマウス（図２Ｂ～図２Ｄ）。（図２Ｂ）及び（図２Ｄ）では、値は、平均＋ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検定）。Ｖｅｈ、ビヒクル。（図２Ｅ）ＣＰＴ－１１（１日当たり２１５ｍｇ／ｋｇ）の３回投与後のＷＴマウスの生存（図１Ｅにおける対照を用いて行った）。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前に与えられた。Ｐ＝０．００４７（ログランク検定）。（図２Ｆ）０、５、及び３０日目に、（図２Ｅ）のように処置したマウスからの小腸のＨ＆Ｅ染色。スケールバー、２００μｍ。
【図2-2】同上。
【図3-1】図３Ａ～図３Ｇは、ＰＵＭＡ欠損が、腫瘍担持マウスを化学療法誘導性のＧＩ傷害から保護することを示す図である。ルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍担持ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯマウスを、１１、１４、１７、１９、２３、及び２５日目に、１５日間にわたり６回、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。マウス又は腫瘍は、示した時間で分析した。（図３Ａ）腫瘍容積は、１１～２５日目に１日置きに測定した。ＣＴ、ビヒクル対照。（図３Ｂ）体重は、１１～２５日目の各マウスについて１１日目の体重のパーセンテージとして表した。（図３Ｃ）２５日目の小腸組織のＨ＆Ｅ染色。スケールバー、１００μｍ。（図３Ｄ）（図３Ｃ）からの絨毛高。測定結果は、マウス当たり最低限４０個の絨毛からである。（図３Ｅ）（図３Ｃ）の視野当たりの腸陰窩の定量。（図３Ｆ）２５日目に免疫蛍光によって検出された腸の好中球。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。スケールバー、１００μｍ。（図３Ｇ）（図３Ｆ）と同じスライドからの４００Å～視野当たりの好中球の定量。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｇでは、値は平均＋ＳＥＭである；群当たりｎ＝示した数（図３Ａ及び図３Ｂ）又は３～４匹のマウス（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｇ）。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側スチューデントのｔ検定）。Ｐｕｍａ ＫＯ、ＣＰＴ対対照（図３Ａ）；ＣＰＴ－１１処置、Ｐｕｍａ ＫＯ対ＷＴ（図３Ｂ）。
【図3-2】同上。
【図4-1】図４Ａ～図４Ｇは、ＰＵＭＡｉが、腫瘍担持マウスを化学療法誘導性のＧＩ傷害から保護することを示す図である。ＬＬＣ腫瘍担持ＷＴマウスを、１１、１４、１７、１９、２３、及び２５日目に、１５日間にわたり６回、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ビヒクル又はＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び２０時間後に与えられた。マウス又は腫瘍は、示した時間で分析した。（図４Ａ）腫瘍容積は、１１日目に測定を開始した。（図４Ｂ）体重は、１１～２５日目の各マウスについて１１日目の体重のパーセンテージとして表した。（図４Ｃ）２５日目の小腸組織のＨ＆Ｅ染色。スケールバー、１００μｍ。（図４Ｄ）（図４Ｃ）からの絨毛高。測定結果は、マウス当たり最低限４０個の絨毛からである。（Ｅ）（図４Ｃ）の視野当たりの腸陰窩の定量。（図４Ｆ）２５日目に免疫蛍光によって検出された腸の好中球。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。スケールバー、１００μｍ。（図４Ｇ）（図４Ｆ）と同じスライドからの４００Å～視野当たりの好中球の定量。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｅ、及び図４Ｇでは、値は平均＋ＳＥＭである；群当たりｎ＝示した（図４Ａ及び図４Ｂ）又は３～４匹のマウス（図４Ｄ、図４Ｅ、及び図４Ｇ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側スチューデントのｔ検定）。Ｐｕｍａｉ ＣＰＴ対対照（図４Ａ）；ＣＰＴ－１１処置マウス、ＰＵＭＡｉ対ＣＴ（図４Ｂ）。
【図4-2】同上。
【図5-1】図５Ａ～図５Ｇは、ＰＵＭＡの標的化が、ＣＰＴ－１１に対してＬＧＲ５＋幹細胞を保護することを示す図である。ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯマウスを、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置し、示した時間で分析した。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＰＴ－１１処置の２時間前に１回与えた。（図５Ａ）腸陰窩における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＬＧＲ５）及びＴＵＮＥＬ免疫蛍光染色。スケールバー、５０ｍ。矢印は、二重陽性細胞を示す。（図５Ｂ）（図５Ａ）からのＧＦＰ陽性陰窩当たりのＧＦＰ／ＴＵＮＥＬ二重陽性細胞の定量。（図５Ｃ）腸陰窩におけるＣＤ１６６についての免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。（図５Ｄ）陰窩における＋４～９領域のＣＤ１６６細胞の定量。（図５Ｅ）定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により、示したｍＲＮＡを分析した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、３匹のマウスからプールしたＲＮＡから合成した。値は、Ｇａｐｄｈ発現で標準化し、各遺伝子の自身の０時間対照と比較して表した。（図５Ｆ）腸陰窩における５３ＢＰ１免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。（図５Ｇ）ＣＰＴ－１１単回処置の６及び４８時間後、又は図２ＥのようにＣＰＴ－１１の３回の１日用量（１日当たり２１５ｍｇ／ｋｇ）による＃１２０時間での５３ＢＰ１＋陰窩細胞の定量。（図５Ｃ）及び（図５Ｆ）では、矢印はＣＢＣを示し、アスタリスクは＋４～９細胞を示す。図５Ａ、図５Ｃ、及び図５Ｆでは、ＤＡＰＩを使用して核を染色した。図５Ｂ、図５Ｅ、及び図５Ｇでは、値は平均＋ＳＥＭ；群当たりｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１［Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を各時点について別々に実施した］。（図５Ｄ）では、値は平均＋ＳＥＭ；群当たりｎ＝３匹のマウス。＊＊Ｐ＜０．０１（両側スチューデントのｔ検定）。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【図6-1】図６Ａ～図６Ｆは、ＰＵＭＡの標的化が、ＣＰＴ－１１の繰返し曝露後に、ＬＧＲ５＋幹細胞枯渇を防止することを示す図である。Ｌｇｒ５－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｃｒｅＥＲＴ２マーキングアレルを持つＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯマウスを、図５Ａ～図５Ｇのように２週間にわたりＣＰＴ－１１及びＰＵＭＡｉで処置し、腸の表現型について分析した。（図６Ａ）腸陰窩におけるＧＦＰ（ＬＧＲ５）免疫蛍光。矢印はＬＧＲ５＋（ＧＦＰ）陰窩を示す。スケールバー、１００μｍ。（図６Ｂ）少なくとも１つのＧＦＰ＋（ＬＧＲ５＋）細胞を含有する腸陰窩の定量。（図６Ｃ）上：腸陰窩におけるＯｌｆｍ４ ＲＮＡ ＩＳＨ。スケールバー、５０μｍ。アスタリスクは、Ｏｌｆｍ４＋陰窩細胞を示す。下：少なくとも１つのＯｌｆｍ４＋細胞を含有する陰窩のパーセンテージ。（図６Ｄ）腸陰窩におけるＭＭＰ７免疫蛍光。スケールバー、１００μｍ。（図６Ｅ）陰窩基底部（ＣＢＣ領域）におけるＭＭＰ７＋陰窩細胞の定量。（図６Ｆ）上：腸陰窩におけるＧＦＰ（ＬＧＲ５）及びＭＭＰ７免疫蛍光。スケールバー、２０μｍ。アスタリスクは、ＬＧＲ５＋／ＭＭＰ７＋細胞対を示す。下：陰窩当たりのＬＧＲ５＋／ＭＭＰ７＋細胞対の定量。（図６Ａ）、（図６Ｄ）、及び（図６Ｆ）では、ＤＡＰＩを使用して核を染色した。（図６Ｂ）、（図６Ｃ）、（図６Ｅ）、及び（図６Ｆ）では、値は平均＋ＳＥＭ；ｎ＝３匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【図7-1】図７Ａ～図７Ｈは、ＰＵＭＡｉが、ＣＰＴ誘導性の損傷に対して、マウス及びヒト結腸の培養を保護することを示す図である。（図７Ａ）ＣＰＴ処置の６日後のマウス結腸オルガノイドの代表的な画像。オルガノイドは、５０μＭ ＰＵＭＡｉを伴って又は伴わずに２４時間、ビヒクル対照（ＣＴ）又は５００ｎＭ ＣＰＴ（１日目）で処置し、７日目まで増殖をモニターした。スケールバー、５００μｍ。（図７Ｂ）（図７Ａ）の視野当たりの直径が１００μｍ以上のオルガノイドの定量。（図７Ｃ）ＣＰＴ処置の２４時間後のオルガノイドからの活性型（切断型）カスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）のウェスタンブロット。（図７Ｄ）ＣＰＴ処置の２４時間後、示したマウスのｍＲＮＡをｑＲＴＰＣＲによって分析した。ＮＳ、顕著ではない。（図７Ｅ）（図７Ａ）のように処置したヒト結腸オルガノイドの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。（図７Ｆ）（図７Ｅ）の視野当たりの直径が１００μｍ以上のオルガノイドの定量。（図７Ｇ）ＣＰＴ処置の２４時間後のヒトオルガノイドからの活性型（切断型）カスパーゼ３のウェスタンブロット。（図７Ｈ）示したヒトのｍＲＮＡを、ＣＰＴ処置の２４時間後に分析した。（図７Ｃ）及び（図７Ｇ）では、ライセートを３つのウェルから調製した。アクチンを、ローディングするタンパク質の対照として使用した。（図７Ｄ）及び（図７Ｈ）では、ｃＤＮＡを３つの培養したウェルからプールしたＲＮＡから合成した。値は、Ｇａｐｄｈで標準化し、ビヒクル対照と比較して表した。（図７Ｂ）、（図７Ｄ）、（図７Ｆ）、及び（図７Ｈ）では、値は平均＋ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図7-2】同上。
【図7-3】同上。
【図8】図８Ａ～図８Ｆは、ＰＵＭＡ ＫＯが、ＣＰＴ－１１誘導性の陰窩アポトーシスを阻害することを示す図である。マウスは、単回用量のＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置し、示した時間で分析した。（図８Ａ）示した時間での、ＷＴマウスにおけるＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。（図８Ｂ）６時間での、ＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。（図８Ｃ）６時間での、陰窩における活性型カスパーゼ３染色の代表的な画像。バー＝２５μｍ。（Ｄ）６時間での、活性型カスパーゼ３＋ＣＢＣ及び＋４～９細胞の定量。（図８Ｅ）示したｍＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ｃＤＮＡを、３匹のマウスからプールしたＲＮＡから合成した。（図８Ｆ）６時間での、示したタンパク質を、ウェスタンブロッティングにより分析した。ライセートは、３匹のマウスからの腸粘膜からプールした。代表的な結果を示し、同様の結果が少なくとも３回の独立した実験で得られた。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｄ、図８Ｅでは、値は平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝３匹のマウスである。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定、両側）。
【図9】図９は、ＣＰＴ－１１が、マウスにおいて用量依存的な致死を引き起こすことを示す図である。０、１、及び２日目に、１８０、２１５、又は２５０ｍｇ／ｋｇ／日の１日用量のＣＰＴ－１１で３日連続処置したＷＴマウスの生存。群当たりｎ＝１０匹のマウス。Ｐ値は、ログランク検定によって算出した。
【図10-1】図１０Ａ～図１０Ｅは、ＰＵＭＡｉが、ＣＰＴ－１１誘導性のアポトーシスに対して結腸がん細胞を保護しないことを示す図である。（図１０Ａ）ＰＵＭＡ阻害剤リード化合物（ＰＵＭＡｉ）の構造。（図１０Ｂ）２４時間、個々のプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞のライセートを、示した組合せで混合した。ライセートを、抗ＨＡ抗体による免疫沈降の前に、１５分間、ビヒクル又はＰＵＭＡ阻害剤（ＰＵＭＡｉ、２５μＭ）とインキュベートした。ＨＡ結合タンパク質及びインプットを、ウェスタンブロッティングにより分析した。（図１０Ｃ）２４時間、個々のプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞のライセートを、示した組合せで混合した。ライセートを、抗ＨＡ抗体による免疫沈降の前に、１５分間、ビヒクル又はＰＵＭＡ阻害剤（ＰＵＭＡｉ、２５μＭ）とインキュベートした。ＨＡ結合タンパク質及びインプットを、ウェスタンブロッティングにより分析した。（図１０Ｄ）示した結腸がん細胞株を、２４時間、カンプトテシン（ＣＰＴ、５００ｎＭ）で処置した。ＨＣＴ１１６細胞及びＰＵＭＡ ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞は、ＷＴ ｐ５３を有し、その他はｐ５３を有さず（ＫＯ）又は変異ｐ５３を有する。アポトーシスは、核断片化アッセイによって測定した。値は、平均＋ＳＥＭ；ｎ＝３の独立した実験。（図１０Ｅ）細胞は、２４時間、Ｄのように処置し、ウェスタンブロッティングにより分析した。代表的な結果を示し、同様の結果が少なくとも３回の独立した実験で得られた。
【図10-2】同上。
【図11-1】図１１Ａ～図１１Ｆは、ＰＵＭＡｉがＣＰＴ－１１誘導性のＣＢＣアポトーシスを阻害することを示す図である。マウスは、単回用量のＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で処置し、６時間で分析した。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ－１１の２時間前に与えられた。（図１１Ａ）示した処置をしたＷＴマウスの腸陰窩におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な画像である。バー＝２５μｍ。（図１１Ｂ）位置１～３（ＣＢＣ）又は４～９におけるＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。（図１１Ｃ）腸陰窩における活性型カスパーゼ３染色の代表的な画像。バー＝２５μｍ。（図１１Ｄ）位置１～３（ＣＢＣ）又は４～９における活性型カスパーゼ３＋陰窩細胞の定量。（図１１Ｅ）ＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。（図１１Ｆ）ＰＵＭＡｉ薬物動態実験のための処置及び組織回収スケジュールの概略。ＣＰＴ－１１は、０時間で投与した。Ｂ、Ｄ、及びＥは、値は平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝３匹のマウスである。Ａ及びＣは、アスタリスクはＴＡ細胞を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのＴ検定、両側）。
【図11-2】同上。
【図12】図１２Ａ～図１２Ｄは、ＰＵＭＡｉが、化学療法及び放射線療法誘導性の致死に対して保護することを示す図である。（図１２Ａ）及び（図１２Ｂ）０、１、及び２日目に、それぞれ１８０ｍｇ／ｋｇ／日（Ａ）及び２５０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｂ）の１日用量のＣＰＴ－１１で３回処置したＷＴマウスの生存。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び最終投与の２０時間後に与えられた。（図１２Ｃ）及び（図１２Ｄ）９．５Ｇｙ（図１２Ｃ）及び１５Ｇｙ（図１２Ｄ）での全身放射線照射（ＴＢＩ）後のＷＴマウスの生存。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＴＢＩの３０分前及び３０分後に、次いで４日間毎日与えられた。Ｃの９．５ＧｙでのＴＢＩの生存者は、４０日目に屠殺され、明らかな健康問題はなかった。Ｐ値は、ログランク検定によって算出された。
【図13-1】図１３Ａ～図１３Ｅは、ＰＵＭＡの標的化が、ＣＰＴ－１１への腫瘍応答を損なわないことを示す図である。（図１３Ａ）腫瘍確立及び処置の概略。マウスは、４００万個のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を、それらの脇腹の皮下に注射された。腫瘍を１１日間確立させ、マウスを、２週間にわたり６回、２００ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ－１１で処置した（Ｃ）。ＰＵＭＡｉ（Ｐ）は、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び２０時間後に１１回与えられた。マウスは、ＣＰＴ－１１の最終投与の４時間後に屠殺された。（図１３Ｂ）処置の２週間後に回収された腫瘍の代表的な画像。バー＝１ｃｍ。（図１３Ｃ）ＣＰＴ－１１処置の２週間後の、ＬＬＣ腫瘍におけるＰＣＮＡ、ＴＵＮＥＬ、及び活性型（切断型）カスパーゼ３染色の代表的な画像。バー＝１００μｍ。（図１３Ｄ）Ｃでの視野当たりのＰＣＮＡ＋、ＴＵＮＥＬ＋、及び切断型カスパーゼ３＋細胞の定量。値は、平均±ＳＥＭ、群当たりｎ＝３個の腫瘍。＊＊Ｐ＜０．０１。＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのＴ検定、両側）。（図１３Ｅ）Ａのように処置した腫瘍からの示したタンパク質のウェスタンブロット。各レーンは１つの腫瘍を表す。
【図13-2】同上。
【図14】図１４Ａ～図１４Ｆは、５－ＦＵ－誘導性のＬＧＲ５＋細胞のアポトーシスが、ＰＵＭＡ依存的であることを示す図である。ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯ ＬＧＲ５－ＥＧＦＰマウスは、２４時間、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＦＵで処置した。（図１４Ａ）腸陰窩におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な画像。バー＝２５μｍ。（図１４Ｂ）ＴＵＮＥＬ＋陰窩細胞の定量。（図１４Ｃ）腸陰窩における切断型カスパーゼ３染色の代表的な画像。バー＝２５μｍ。（図１４Ｄ）活性型（切断型）カスパーゼ３＋陰窩細胞の定量。（図１４Ｅ）腸陰窩における、ＬＧＲ５（ＧＦＰ）／ＴＵＮＥＬ二重免疫蛍光の代表的な画像。（図１４Ｆ）ＧＦＰ陽性陰窩における、ＧＦＰ／ＴＵＮＥＬ二重陽性細胞の定量。Ｂ、Ｄ、及びＦは、値は平均±ＳＥＭ、群当たりｎ＝３匹のマウスである。＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのＴ検定、両側）。
【発明を実施するための形態】
【0020】
例示的な実施形態の詳細な説明
本開示の以下の説明は、単に、本開示の様々な実施形態を例示することを意図する。したがって、議論する特定の改変が、本開示の範囲の制限として解釈されるべきではない。様々な等価物、変更、及び改変が、本開示の範囲を逸脱することなく行われ得ることは当業者には明らかであり、かかる等価な実施形態が本明細書に含まれることが理解される。論文、特許、及び特許出願を含む、本明細書に引用する全ての参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の以下の説明は、単に、本開示の様々な実施形態を例示することを意図する。したがって、議論する特定の改変が、本開示の範囲の制限として解釈されるべきではない。様々な等価物、変更、及び改変が、本開示の範囲を逸脱することなく行われ得ることは当業者には明らかであり、かかる等価な実施形態が本明細書に含まれることが理解される。論文、特許、及び特許出願を含む、本明細書に引用する全ての参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0021】
Ｉ．定義
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が、例示及び説明のみであり、請求した本発明を制限するものではないことが理解されるであろう。この出願では、単数の使用は、特に他に言及しない限り、複数を含む。この開示では、用語「又は」は、代替物のみを指すと明確に示すか、又は代替物が互いに排他的であるかでない限り、「及び／又は」を意味する。本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも２番目以上を意味し得る。さらに、用語「含む（including）」、並びに他の形態、例えば「含む（includes）」及び「included」の使用は、限定されない。また、用語、例えば「要素（element）」又は「構成要素（component）」は、特に他に言及しない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素と１つより多くのサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。また、用語「一部分（portion）」の使用は、部分の一部又は全部分の一部を含み得る。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が、例示及び説明のみであり、請求した本発明を制限するものではないことが理解されるであろう。この出願では、単数の使用は、特に他に言及しない限り、複数を含む。この開示では、用語「又は」は、代替物のみを指すと明確に示すか、又は代替物が互いに排他的であるかでない限り、「及び／又は」を意味する。本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも２番目以上を意味し得る。さらに、用語「含む（including）」、並びに他の形態、例えば「含む（includes）」及び「included」の使用は、限定されない。また、用語、例えば「要素（element）」又は「構成要素（component）」は、特に他に言及しない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素と１つより多くのサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。また、用語「一部分（portion）」の使用は、部分の一部又は全部分の一部を含み得る。
【0022】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈がはっきりと他に示さない限り、複数の参照を含む。
【0023】
本明細書で使用する場合、用語「アポトーシス」は、多細胞生物において生じるプログラム細胞死の形態を指す。アポトーシスは、細胞が細胞ストレスを感じた場合に内因性経路を通して、又は他の細胞からのシグナルによる外因性経路を通して開始され得る、高度に調節及び制御されたプロセスである。アポトーシスのプロセスの間、細胞は、ブレブ形成、細胞収縮、核の断片化、クロマチン凝縮、染色体ＤＮＡ断片化、及び全体的なｍＲＮＡ分解を含む、一連の特徴的な変化を受ける。
【0024】
本明細書で使用する場合、用語「がん」は、異常な細胞増殖を含む任意の疾患を指し、体内の任意の組織、器官又は細胞に影響する疾患の全てのステージ及び全ての形態を含む。用語は、悪性、良性、軟組織、又は固形と特徴づけられようとなかろうと、全ての公知のがん及び新生物病態、並びに転移前及び転移後のがんを含む、全てのステージ及び悪性度のがんを含む。一般に、がんは、そこからがんが局在する又は生じる組織又は器官、並びに癌性組織及び細胞の形態学に従って、分類され得る。本明細書で使用する場合、がんの型は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門がん、星状細胞腫、小児小脳又は大脳、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、脳がん、乳がん、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、気腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング腫瘍、ユーイング肉腫、胃（gastric (stomach)）がん、膠腫、頭頚部がん、心臓がん、Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、膵島細胞癌（膵臓内分泌部）、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、髄芽腫、メラノーマ、神経膠芽腫、非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん（pharyngeal cancer）、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌（腎臓がん）、網膜芽細胞腫、皮膚がん、胃がん、テント上の初期の神経外肺葉性腫瘍、精巣がん、咽頭がん（throat cancer）、甲状腺がん、膣がん、視覚路及び視床下部膠腫を含む。
【0025】
本明細書で使用する場合、「細胞」は、原核又は真核であり得る。原核細胞は、例えば、細菌を含む。真核細胞は、例えば、真菌、植物細胞、及び動物細胞を含む。動物細胞（例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞）の型は、例えば、循環／免疫系又は器官からの細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（例えば、好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球、及び過分葉好中球）、単球又はマクロファージ、赤血球（例えば、網状赤血球）、マスト細胞、血小板又は巨核球、及び樹状細胞；内分泌系又は器官からの細胞、例えば、甲状腺細胞（例えば、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、上皮小体細胞（例えば、上皮小体主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（例えば、クロム親和性細胞）、及び松果体細胞（pineal cell）（例えば、松果体細胞（pinealocyte））；神経系又は器官からの細胞、例えば、グリア芽細胞（例えば、星状膠細胞及び乏突起膠細胞）、小神経膠細胞、巨細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチェル細胞、及び下垂体細胞（例えば、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、及びプロラクチン産生細胞）；呼吸器系又は器官からの細胞、例えば、肺細胞（Ｉ型肺細胞及びＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、及び肺胞マクロファージ；循環系又は器官からの細胞（例えば、心筋細胞及び周皮細胞）；消化系又は器官からの細胞、例えば、胃主細胞、壁細胞、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、及び肝臓細胞（例えば、肝細胞及びクッパー細胞）；外皮系又は器官からの細胞、例えば、骨細胞（bone cell）（例えば、骨芽細胞、骨細胞（osteocyte）、及び破骨細胞）、歯細胞（例えば、セメント芽細胞、及びエナメル芽細胞）、軟骨細胞（cartilage）（例えば、軟骨芽細胞及び軟骨細胞（chondrocyte））、皮膚／有毛細胞（例えば、糸胞、ケラチノサイト、及びメラノサイト（母斑細胞）、筋細胞（例えば、ミオサイト）、脂肪細胞、線維芽細胞、及び腱細胞；泌尿器系又は器官からの細胞（例えば、有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、及びマクラデンサ細胞）；並びに生殖器系又は器官からの細胞（例えば、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵母細胞）を含む。細胞は、正常、健康な細胞；又は疾患若しくは非健康な細胞（例えば、がん細胞）であり得る。細胞は、さらに、哺乳動物接合子又は胚性幹細胞、胎生幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞を含む幹細胞を含む。幹細胞は、未分化状態を維持しながら、及び特定の細胞型へと分化しながら、細胞分裂のサイクルを行うことができる細胞である。幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、少能性幹細胞、及び単能性幹細胞であってよく、そのいずれも体細胞から誘導され得る。幹細胞は、がん幹細胞も含み得る。哺乳動物細胞は、齧歯動物細胞、例えば、マウス、ラット、ハムスター細胞であってよい。哺乳動物細胞は、ウサギ類細胞、例えば、ウサギ細胞であり得る。哺乳動物細胞はまた、霊長類細胞、例えばヒト細胞でもあり得る。
【0026】
本明細書で使用する場合、用語「化学療法」は、１つ以上の抗がん剤を使用するがん処置を指す。抗がん剤は、限定はされないが、アバスチン、ベバシズマブ、カンプトサー（塩酸イリノテカン）、カペシタビン、セツキシマブ、サイラムザ、エロキサチン（オキサリプラチン）、アービタックス、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、フシレフ（ロイコボリンカルシウム）イピリムマブ、キイトルーダ、ロンサーフ（トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩）、ニボルマブ（オプジーボ）、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ラムシトルマブ、レゴラフェニブ、スチバーガ、Ｚｉｖ－アフリベルセプトを含む。
【0027】
本明細書で使用する場合、用語「オルガノイド」は、小型化及び単純化した器官を模倣し、写実的な微小解剖を示す、インビトロの三次元培養を指す。オルガノイドは、自己複製及び分化により、組織、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞からの１つ又はわずかな細胞に由来する。
【0028】
本明細書で使用する場合、用語「放射線療法」は、イオン化放射線を使用して悪性細胞を制御する又は死滅させる治療を指す。放射線療法は、通常、線形加速器によって送達される。放射線療法は、多くの型のがんが身体の１つの領域に局在する場合、それらを処置するために使用され得る。放射線療法は、補助療法の一部としても使用され、原発性悪性腫瘍を除去する外科手術後の腫瘍再発を防止し得る。放射線療法は、化学療法と相乗的であってもよく、感受性のがんにおいて化学療法の前、間、及び後に使用されてきた。
【0029】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト又は任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、患者であってよく、疾患の診断又は処置のために医療提供者に提示されるヒトを指す。用語「対象」は、本明細書では、「個体」又は「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患又は障害を患っている又は疾患又は障害に感受性であってよいが、疾患又は障害の症状を示しても示さなくてもよい。
【0030】
用語「治療有効量」又は「有効投与量」は、本明細書で使用する場合、疾患又は病状を処置するために有効な薬物の投与量又は濃度を指す。例えば、化学療法又は放射線療法によって誘導されるＧＩ傷害を処置する、本明細書に開示されるそれらの小分子化合物の使用に関して、治療有効量は、化学療法又は放射線療法によって誘導されるＧＩ傷害を防止又は緩和することができる化合物の投与量又は濃度である。
【0031】
病状の「処置する」又は「処置」は、本明細書で使用する場合、病状を防止又は緩和すること、病状の発症又は進行速度を緩徐化すること、病状の進行のリスクを減少させること、病状と関連する症状の進行を防止又は遅らせること、病状と関連する症状を減少させる又は終わらせること、病状の完全又は部分的な回帰をもたらすこと、病状を治癒すること、又はこれらのいくつかの組合せを含む。
【0032】
ＩＩ．処置誘導性の胃腸傷害
胃腸（ＧＩ）上皮は、最も早く再生する成人組織であり、組織特異的幹細胞によって維持される。処置誘導性のＧＩ副作用は、化学療法及び腹部放射線療法の主な投与量規制因子であり、がん患者及び元がん患者の生活の質を下げ得る。例えば、結腸直腸がん患者を処置するために一般に使用される、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）は、５０％の患者で、化学療法誘導性の下痢を引き起こしたことが報告された。放射線及びほとんどの化学療法剤が、複数の組織及び器官系を損傷するが、一般に５－ＦＵと組み合わせて使用され、結腸直腸がん患者を処置する、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）は、５０％より多くの患者で、重度の下痢及び嘔吐を伴う、選択的なＧＩ傷害を引き起こす。この急性毒性は、腸における、ＣＰＴ－１１の活性代謝物である、ＳＮ－３８の高濃度の蓄積、並びに腸内細菌による非毒性ＳＮ－３８グルクロニドのＳＮ－３８への変換後の腸の再吸収によって引き起こされる。ＳＮ－３８は、トポイソメラーゼＩの阻害剤であり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写の両方に重要な酵素であり、増殖する細胞において複製ストレス及びＤＮＡ損傷を引き起こす。下痢止め薬は、ＣＰＴ－１１誘導性の下痢の緩和を助けることができるが、長期のＧＩ機能障害を減少させる効果は限られている。現在は、ＣＰＴ－１１誘導性のＧＩ傷害又は合併症を防止又は処置するＵＳ ＦＤＡが認可した薬剤はない。
胃腸（ＧＩ）上皮は、最も早く再生する成人組織であり、組織特異的幹細胞によって維持される。処置誘導性のＧＩ副作用は、化学療法及び腹部放射線療法の主な投与量規制因子であり、がん患者及び元がん患者の生活の質を下げ得る。例えば、結腸直腸がん患者を処置するために一般に使用される、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）は、５０％の患者で、化学療法誘導性の下痢を引き起こしたことが報告された。放射線及びほとんどの化学療法剤が、複数の組織及び器官系を損傷するが、一般に５－ＦＵと組み合わせて使用され、結腸直腸がん患者を処置する、塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）は、５０％より多くの患者で、重度の下痢及び嘔吐を伴う、選択的なＧＩ傷害を引き起こす。この急性毒性は、腸における、ＣＰＴ－１１の活性代謝物である、ＳＮ－３８の高濃度の蓄積、並びに腸内細菌による非毒性ＳＮ－３８グルクロニドのＳＮ－３８への変換後の腸の再吸収によって引き起こされる。ＳＮ－３８は、トポイソメラーゼＩの阻害剤であり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写の両方に重要な酵素であり、増殖する細胞において複製ストレス及びＤＮＡ損傷を引き起こす。下痢止め薬は、ＣＰＴ－１１誘導性の下痢の緩和を助けることができるが、長期のＧＩ機能障害を減少させる効果は限られている。現在は、ＣＰＴ－１１誘導性のＧＩ傷害又は合併症を防止又は処置するＵＳ ＦＤＡが認可した薬剤はない。
【0033】
化学療法又は放射線誘導性急性腸疾患は、増殖する陰窩細胞の欠損、上皮性関門の崩壊、及び処置中又は処置直後の炎症によって特徴づけられる。多くの患者では、遅発性の腸疾患が治療の数か月後又はそれ以降に起こり得、血管硬化症及び進行性の腸壁繊維症など、上皮及び間質区画における病理変化と関連する腸機能障害によって特徴づけられる。新たな証拠は、慢性腸損傷が初期の毒性の結果のようであると示唆している。ＣＰＴ－１１及び５－ＦＵなどの、化学療法によって引き起こされる腸毒性は、マウス及びヒトにおける急な陰窩のアポトーシスと関連する。小腸上皮は、最も早く再生する成人組織であり、陰窩の底部に局在する腸幹細胞（ＩＳＣ）は、傷害後の新生及び再生を駆動する。ＩＳＣは、陰窩底部に円柱細胞（ＣＢＣ）及び陰窩底部と比較して位置４にいくつかの細胞（＋４細胞）を含む。ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質（ヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質）－結合受容体５－発現（ＬＧＲ５＋）ＣＢＣの遺伝子破壊は、根底にあるメカニズムは未知のままであるが、健常なマウスで十分に忍容性であるが、放射線誘導性の腸傷害を強く悪化させる。
【0034】
ＤＮＡ損傷後のｐ５３の活性化は、腫瘍抑制又は急性毒性などの、組織及び標的特異的転機をもたらす。ｐ５３の活性化は、高用量の放射線後の腸の再生の制御において諸刃の剣である。一方では、ｐ５３依存的ＰＵＭＡ誘導は、ほとんどの放射線誘導性アポトーシス及び腸細胞及び造血幹細胞及び前駆細胞の急性喪失の原因となり、ＰＵＭＡ欠損又は下方調節は、放射線誘導性の致死及びリンパ腫形成に対して保護する。しかしながら、ｐ２１、及びおそらく他の標的のｐ５３依存的誘導は、ＤＮＡ損傷蓄積、複製ストレス、及び非アポトーシス細胞死の遅延を防ぐことによる増殖性の腸の再生に必須であり、ｐ５３／ｐ２１欠損は腸傷害を悪化させる。化学療法誘導性のＧＩ傷害におけるｐ５３の役割は、よく分かっていない。ｐ５３阻害剤、ピフィスリンαは、ラットにおいて最初の数時間以内にＣＰＴ－１１誘導性の腸のアポトーシスを減少させたが、細胞死の遅延又は粘膜炎の発症に影響しなかった。
【0035】
ＩＩＩ．治療用化合物
本明細書に開示するように、本発明者らは、驚くべきことに、ｐ５３欠損ではなく、小分子化合物の群によるＰｕｍａの薬理学的阻害が、ＣＰＴ－１１への単回又は繰返し曝露によって誘導されるＧＩ傷害に対して強力な保護を提供するが、インビボでのその抗腫瘍活性を損なわないことを発見した。この保護は、ＬＧＲ５＋幹細胞、肝細胞ニッチ、及びゲノムの完全性の選択的な保存と関連する。
本明細書に開示するように、本発明者らは、驚くべきことに、ｐ５３欠損ではなく、小分子化合物の群によるＰｕｍａの薬理学的阻害が、ＣＰＴ－１１への単回又は繰返し曝露によって誘導されるＧＩ傷害に対して強力な保護を提供するが、インビボでのその抗腫瘍活性を損なわないことを発見した。この保護は、ＬＧＲ５＋幹細胞、肝細胞ニッチ、及びゲノムの完全性の選択的な保存と関連する。
【0036】
ある特定の実施形態では、小分子化合物は：
【0037】
【化3】
【化4】
からなる群から選択される。
【0038】
ある特定の実施形態では、上記の化合物は、重水素化される。本明細書で使用する場合、「重水素化化合物」は、１つ以上の水素原子が、重水素同位体によって置き換えられた化合物を指す。合成に使用した化学物質の起源に依存して、合成した化合物において天然の同位体存在度のいくらかの変動が生じることが理解される。したがって、化合物の調製物は、少量の重水素化化合物を本質的に含有するであろう。天然に豊富な安定した水素及び炭素同位体の濃度は、本明細書に記載の重水素化化合物の安定した同位体置換の程度と比較して小さく、重要ではない。本明細書に記載の重水素化化合物では、重水素を持つように特定の位置が指定される場合、その位置における重水素の存在度が、０．０１５％である天然の重水素の存在度よりも実質的に大きいことが理解される。重水素を持つように指定された位置は、典型的には、少なくとも３０００（４５％重水素取り込み）、例えば少なくとも３５００（５２．５％重水素取り込み）、少なくとも４０００（６０％重水素取り込み）、少なくとも４５００（６７.５％重水素取り込み）、少なくとも５０００（７５％重水素）、少なくとも５５００（８２．５％重水素取り込み）、少なくとも６０００（９０％重水素取り込み）、少なくとも６３３３．３（９５％重水素取り込み）、少なくとも６４６６．７（９７％重水素取り込み）、少なくとも６６００（９９％重水素取り込み）、又は少なくとも６６３３．３（９９．５％重水素取り込み）の最小の同位体濃縮因子を有する。
【0039】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される重水素化化合物は、
【0040】
【化5】
［式中、「Ｄ」は重水素を指す］
の構造を有する。
【0041】
本明細書に記載の小分子化合物の合成は、当技術分野で公知の方法を使用して、合成化学の通常の技術によって容易に達成され得る。かかる方法は、本明細書で描写した化合物を合成するために、相当する重水素化及び任意に、他の同位体含有試薬及び／又は中間体を利用して、又は同位体原子を化学構造に導入するための当技術分野で公知の標準的な合成プロトコールを実施して、行われ得る。
【0042】
ＩＶ．製剤及び投与
本開示は、処置誘導性のＧＩ傷害を防止又は処置するために使用される医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本明細書に開示される予防又は治療有効量の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、動物、及びより具体的にはヒトでの使用のため、連邦又は州政府の規制当局によって承認され、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識される薬局方に掲載されることを意味する。かかる医薬担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む、水及び油など、滅菌液であり得る。水は、医薬組成物が静脈に投与される場合に特有の担体である。生理食塩溶液及びブドウ糖水溶液及びグリセリン溶液も、液体担体、特に注射可能溶液として用いることができる。他の好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。
本開示は、処置誘導性のＧＩ傷害を防止又は処置するために使用される医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本明細書に開示される予防又は治療有効量の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、動物、及びより具体的にはヒトでの使用のため、連邦又は州政府の規制当局によって承認され、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識される薬局方に掲載されることを意味する。かかる医薬担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む、水及び油など、滅菌液であり得る。水は、医薬組成物が静脈に投与される場合に特有の担体である。生理食塩溶液及びブドウ糖水溶液及びグリセリン溶液も、液体担体、特に注射可能溶液として用いることができる。他の好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。
【0043】
所望であれば、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤等の形態をとり得る。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、標準的な担体を含み得る。好適な医薬品の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載される。かかる組成物は、患者への適切な投与の形態を提供するように、好適な量の担体と共に、予防又は治療有効量の化合物を含有するであろう。製剤は、経口、静脈内、動脈内、頬内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入、又は機械的人工呼吸による送達であり得る、投与の様式に合わせるべきである。
【0044】
本明細書で記載するように、本開示の化合物は、非経口投与のために製剤化、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、又は腹腔内経路さえも介する注射のために製剤化され得る。あるいは、化合物は、例えば、点鼻、吸入により、又は噴霧器により、粘膜への直接的に、局所経路により投与され得る。薬学的に許容される塩は、酸性塩を含み、それらは、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成した塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄の水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも由来し得る。
【0045】
一般に、本開示の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示す、アンプル又はサシェなどの密閉容器中で、凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に、又は単位剤形中に共に混合されて供給される。組成物が点滴によって投与される場合、滅菌の医薬品等級の水又は生理食塩水を含有する輸液ボトルによって分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0046】
本開示の組成物は、中性又は塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンで形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄の水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの陽イオンで形成されるものを含む。
【0047】
本明細書に開示される化合物又は医薬組成物は、処置誘導性の傷害を防止又は処置するように、治療有効量で対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、治療有効量は、約０．００１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、ここで、組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、一週間に１回、一週間に２回、一週間に３回、又は２週間当たり１回投与される。ある特定の実施形態では、有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約３．５ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約４．５ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約５．５ｍｇ／ｋｇ体重、又は約６ｍｇ／ｋｇ体重である。ある特定の実施形態では、組成物の単位用量は、約０．００１ｍｇ～約１０ｍｇの間（例えば、約０．００５ｍｇ、約０．０１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）である。ある特定の実施形態では、有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１ｍｇ／ｋｇ体重であり、ここで、組成物は、１日１回投与される。ある特定の実施形態では、有効量は、５ｍｇ／ｋｇ体重であり、ここで、組成物は一週間に１回投与される。
【0048】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を実証するために含まれる。本発明者らによって発見された代表的な技術に従う実施例において開示される技術が、本発明の実施によく機能することは当業者によって理解されるはずであり、その実施のための例示的な様式を構成するだけと考えられるべきである。当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができると理解するはずである。
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を実証するために含まれる。本発明者らによって発見された代表的な技術に従う実施例において開示される技術が、本発明の実施によく機能することは当業者によって理解されるはずであり、その実施のための例示的な様式を構成するだけと考えられるべきである。当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができると理解するはずである。
【0049】
例１．材料及び方法
化合物のスクリーニング及び調製
候補ＰＵＭＡ阻害剤構造及び類似物は、ＺＩＮＣ８．０データベースのｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニング、及び先に記載したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＡＤＭＥ／Ｔｏｘｉｃｉｔｙプロファイルを使用して同定された（Mustata G. et al. Curr Top Med Chem (2011) 11:281-290, incorporated herein by reference）。ＰＵＭＡｉと関連する化合物は、販売会社から得た。
化合物のスクリーニング及び調製
候補ＰＵＭＡ阻害剤構造及び類似物は、ＺＩＮＣ８．０データベースのｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニング、及び先に記載したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＡＤＭＥ／Ｔｏｘｉｃｉｔｙプロファイルを使用して同定された（Mustata G. et al. Curr Top Med Chem (2011) 11:281-290, incorporated herein by reference）。ＰＵＭＡｉと関連する化合物は、販売会社から得た。
【0050】
研究デザイン
本研究の目的は、ＰＵＭＡ及びｐ５３依存的アポトーシスが、化学療法誘導性の腸幹細胞喪失及び腸疾患を媒介するかどうか、並びにその遺伝学的及び薬理学的阻害が腸の化学防御を提供するかどうかを決定することである。非腫瘍担持及び腫瘍担持マウス、ｐ５３及びＰｕｍａ ＫＯマウス、小分子ＰＵＭＡｉ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス及びヒトの結腸オルガノイドを使用して、化学療法後の腸傷害及び再生、並びに腫瘍応答へのＰＵＭＡ阻害の効果を測定した。試料サイズは、公表された研究及び検出力計算を使用して決定した。実験者は、データの取得中、処置群を盲検にしなかった。
本研究の目的は、ＰＵＭＡ及びｐ５３依存的アポトーシスが、化学療法誘導性の腸幹細胞喪失及び腸疾患を媒介するかどうか、並びにその遺伝学的及び薬理学的阻害が腸の化学防御を提供するかどうかを決定することである。非腫瘍担持及び腫瘍担持マウス、ｐ５３及びＰｕｍａ ＫＯマウス、小分子ＰＵＭＡｉ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス及びヒトの結腸オルガノイドを使用して、化学療法後の腸傷害及び再生、並びに腫瘍応答へのＰＵＭＡ阻害の効果を測定した。試料サイズは、公表された研究及び検出力計算を使用して決定した。実験者は、データの取得中、処置群を盲検にしなかった。
【0051】
マウス及び処置
全ての動物実験の手順は、ピッツバーグ大学の動物実験委員会によって承認された。Ｐｕｍａ＋／＋（ＷＴ）及びＰｕｍａ－／－（Ｐｕｍａ ＫＯ）マウス（５２）は、異型接合体育種によって組織内で作製した。ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯアレルは、記載されるように尾の切れ端から単離したゲノムＤＮＡから遺伝子型を同定した（５２）。ｐ５３－／－（ｐ５３ ＫＯ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から購入した。ＬＧＲ５マーキングマウスＬｇｒ５－ＥＧＦＰ（Ｌｇｒ５－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｃｒｅＥＲＴ２）が記載されている（５３）。全ての株が、１０世代（Ｆ１０）より多く、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドと戻し交配された。マウスは、自由に水と食事にアクセスしながら、０７：００から１９：００まで照明をつけた部屋（１２：１２時間明／暗サイクル）の、マイクロアイソレーターケージ内で飼育した。ＣＰＴ－１１（塩酸イリノテカン；カンプトサー、Ｐｆｉｚｅｒ）処置を、他に指定しない限り、腹腔内注射により、生理食塩水中２００ｍｇ／ｋｇで投与した（２０ｇのマウスに２００μｌ）。ＰＵＭＡｉは、ＨＰＬＣ／質量分析（ＭＳ）による最低純度９５％で、Ｃｈｅｍｐｒｉｄｇｅによってカスタム合成され、ジメチルスルホキシド中にストック（５０ｍｇ／ｍｌ）として調製され、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で新しく希釈され（２ｍｇ／ｍｌ）、腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇで与えられた（２０ｇのマウスに２００μｌ）。
全ての動物実験の手順は、ピッツバーグ大学の動物実験委員会によって承認された。Ｐｕｍａ＋／＋（ＷＴ）及びＰｕｍａ－／－（Ｐｕｍａ ＫＯ）マウス（５２）は、異型接合体育種によって組織内で作製した。ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯアレルは、記載されるように尾の切れ端から単離したゲノムＤＮＡから遺伝子型を同定した（５２）。ｐ５３－／－（ｐ５３ ＫＯ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から購入した。ＬＧＲ５マーキングマウスＬｇｒ５－ＥＧＦＰ（Ｌｇｒ５－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｃｒｅＥＲＴ２）が記載されている（５３）。全ての株が、１０世代（Ｆ１０）より多く、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドと戻し交配された。マウスは、自由に水と食事にアクセスしながら、０７：００から１９：００まで照明をつけた部屋（１２：１２時間明／暗サイクル）の、マイクロアイソレーターケージ内で飼育した。ＣＰＴ－１１（塩酸イリノテカン；カンプトサー、Ｐｆｉｚｅｒ）処置を、他に指定しない限り、腹腔内注射により、生理食塩水中２００ｍｇ／ｋｇで投与した（２０ｇのマウスに２００μｌ）。ＰＵＭＡｉは、ＨＰＬＣ／質量分析（ＭＳ）による最低純度９５％で、Ｃｈｅｍｐｒｉｄｇｅによってカスタム合成され、ジメチルスルホキシド中にストック（５０ｍｇ／ｍｌ）として調製され、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で新しく希釈され（２ｍｇ／ｍｌ）、腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇで与えられた（２０ｇのマウスに２００μｌ）。
【0052】
腫瘍実験のため、４００万個のＬＬＣ細胞［アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection）］を、ＷＴ及びＰｕｍａＫＯマウスの脇腹に注射し、１１日間増殖させた。次いで、マウスを、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）で、２週間、１週間当たり３回処置した。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル対照を、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び２０時間後に、腹腔内注射により投与した。マウスは、最後のＣＰＴ－１１処置の４時間後に屠殺した。
【0053】
ＣＰＴ－１１（塩酸イリノテカン；カンプトサー、Ｐｆｉｚｅｒ）処置を、他に指定しない限り、ｉ．ｐ．により、２００ｍｇ／ｋｇで投与した。ＰＵＭＡ阻害剤（ＰＵＭＡｉ）は、ＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍｌストックとして調製され、次いでＰＢＳ中で新しく２ｍｇ／ｍｌに希釈され、他に指定しない限り、化学療法処置の２時間前に、ｉ．ｐ．により、１０ｍｇ／ｋｇで与えられた。生存実験のため、マウスを、連続３日間、ＣＰＴ－１１で処置した。ＰＵＭＡｉは、４回、各化学療法の２時間前及び最後の化学療法の２２時間後に与えた。
【0054】
腫瘍実験のため、マウスを、ＣＰＴ－１１で、２週間、１週間当たり３回処置した。ＰＵＭＡｉを受けるマウスを、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び２０時間後に、処置した。マウスは、最後のＣＰＴ－１１処置の４時間後に屠殺した（図１３Ａ）。腫瘍容積は、カリパスで測定し、容積＝（長さ×幅２）／２として算出した。マウスは７～９週齢であり、大体等しい数の雄及び雌の動物を使用した。開始時の体重の差異を考慮するため、図３及び図４の値は、最初のＣＰＴ－１１処置の時点でのそれぞれのマウスの重さのパーセンテージとして表した。
【0055】
５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）処置を、２００ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．で投与した。全身照射実験のため、ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、照射の３０分前と３０分後に与え、続いて４日間１日用量を与えた。
【0056】
組織プロセシング及び組織学的分析
屠殺の直後、約１０ｃｍの空腸の一部を除去し、氷冷した生理食塩水で注意深くすすいだ。組織は、長軸方向に開き、１０％ホルマリン中で終夜固定するために発泡ボードに鋲で留めた。次いで、組織を、「スイスロール」状に巻き、パラフィンに包埋した。腫瘍分析のため、脇腹の腫瘍を除去し、測定し、ホルマリン固定又はドライアイス／エタノール浴中での瞬間冷凍のいずれかのために薄片に切った。組織切片（５μｍ）を脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。組織学的分析は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって実施した。
屠殺の直後、約１０ｃｍの空腸の一部を除去し、氷冷した生理食塩水で注意深くすすいだ。組織は、長軸方向に開き、１０％ホルマリン中で終夜固定するために発泡ボードに鋲で留めた。次いで、組織を、「スイスロール」状に巻き、パラフィンに包埋した。腫瘍分析のため、脇腹の腫瘍を除去し、測定し、ホルマリン固定又はドライアイス／エタノール浴中での瞬間冷凍のいずれかのために薄片に切った。組織切片（５μｍ）を脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。組織学的分析は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって実施した。
【0057】
平均絨毛高は、群当たり少なくとも３匹の異なる動物からの、小腸の異なる位置から４０～５０の絨毛を測定することによって決定し、平均Å｝ＳＥＭとして記録した。測定は、１００Å～Ｈ＆Ｅ画像及びＳＰＯＴ５．１Ａｄｖａｎｃｅｄソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して、陰窩の上部から絨毛の上部まで行った。
【0058】
免疫組織化学及び免疫蛍光法
再水和した切片を、３％過酸化水素（免疫化学のみ）により処置し、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡを含む、煮沸０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間抗原回復した。アポトーシスは、製造業者の説明書に従って、ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるＴＵＮＥＬ染色によって分析した。
再水和した切片を、３％過酸化水素（免疫化学のみ）により処置し、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡを含む、煮沸０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間抗原回復した。アポトーシスは、製造業者の説明書に従って、ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるＴＵＮＥＬ染色によって分析した。
【0059】
活性型カスパーゼ３ ＩＨＣ。切片を脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。次いで、再水和した切片を、３％過酸化水素により処置し、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡを含む、煮沸０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間抗原回復した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、１：１００希釈したウサギ抗カスパーゼ３（切断型、Ａｓｐ１７５）（９６６１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体（＃３１８２２；Ｐｉｅｒｃｅ）と、室温で１時間インキュベートし、ＡＢＣキット及びＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で現像した。
【0060】
ＬＧＲ５（ＧＦＰ） ＩＦ。切片を脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。１ｍＭ ＥＤＴＡを含む、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間煮沸により抗原回復を実施した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、１：５０希釈したマウス抗ＧＦＰ（ｓｃ－９９９６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００；ＡＡ１１００１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートした（５８）。次いで、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いてマウントした。
【0061】
ＬＧＲ５（ＧＦＰ）／ＴＵＮＥＬ ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、１：５０希釈したマウス抗ＧＦＰ（ｓｃ－９９９６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００；ＡＡ１１００５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＴＵＮＥＬ染色を、製造業者の説明書に従って、ＡｐｏｐＴａｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて実施した（３７、４６）。
【0062】
ＭＭＰ７ ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％トリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片をＰＢＳ中で洗浄し、１：１００希釈したヤギ抗ＭＭＰ７（ＡＦ２９６７；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－コンジュゲートウサギ抗ヤギ二次抗体（１：２００；ＡＡ１１０８０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で洗浄し、可視化のためＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いてマウントした。
【0063】
ＬＧＲ５（ＧＦＰ）／ＭＭＰ７ ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％トリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。次いで、切片を上記のようにＧＦＰを染色し、続いて上記のようにＭＭＰ７を染色した。
【0064】
ＰＣＮＡ ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、１：１００希釈したマウス抗ＰＣＮＡ（ｓｃ５６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いてマウントした。
【0065】
ＣＤ１６６ ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ウサギ血清（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してブロッキングした。切片を、ヤギ抗マウスＣＤ１６６抗体（１:１００；ＡＦ１１７２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－ウサギ抗ヤギ二次抗体（１：２００；Ａ１１０８０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートし、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩを用いて対比染色した（５９）。
【0066】
ｐ５３ ＢＰ１ ＩＦ：切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、ウサギ抗マウス５３ＢＰ１抗体（１:１００；ＩＨＣ－００００１；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００；Ａ１１０１２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートし、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩを用いて対比染色した。
【0067】
好中球ＩＦ。切片は、上記のように調製した。非特異的抗体の結合を、３０分間室温で、２０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してブロッキングした。切片を、ラット抗マウスＬｙ－６Ｂ．２（１:１００；ＭＣＡ７７１ＧＴ；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）と、加湿したチャンバー内で、４℃で終夜インキュベートした（５６）。次いで切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－ヤギ抗ラット二次抗体（１：２００；Ａ１１００７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、室温で１時間インキュベートし、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩを用いて対比染色した。
【0068】
ＰＵＭＡｉのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量
アセトニトリル及び水（全てＨＰＬＣ等級）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ギ酸及びトリフルオロ酢酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰＵＭＡｉ及び［Ｄ５］－ＰＵＭＡｉ内部標準のストック溶液は、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬで調製し、アセトニトリル中で１０倍に希釈し、次いで－８０℃で保存した。アッセイの当日に、溶液をアセトニトリル中で段階希釈（１０倍段階で）し、０．０１及び０．００１ｍｇ／ｍＬの低濃度の校正希釈標準溶液を得た。これらの校正希釈標準溶液は、マウス血漿（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で希釈し、以下の分析物濃度を作製した：１０、３０、５０、１００、３００、５００、１０００、３０００ｎｇ／ｍＬ。各一連の校正のため、ゼロ（１０ｎｇ／ｍＬの内部標準を含有する）及びブランク試料も５０μＬのＬａｍｐｉｒｅ血漿から調製した。品質管理（ＱＣ）ストック溶液を、Ｌａｍｐｉｒｅマウス血漿中で希釈し、以下のＱＣ試料を作製した：ＱＣ Ｌｏｗ（ＱＣＬ）２０ｎｇ／ｍＬ；ＱＣ Ｍｉｄ（ＱＣＭ）２００ｎｇ／ｍＬ、及びＱＣ Ｈｉｇｈ（ＱＣＨ）２５００ｎｇ／ｍＬ。
アセトニトリル及び水（全てＨＰＬＣ等級）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ギ酸及びトリフルオロ酢酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰＵＭＡｉ及び［Ｄ５］－ＰＵＭＡｉ内部標準のストック溶液は、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬで調製し、アセトニトリル中で１０倍に希釈し、次いで－８０℃で保存した。アッセイの当日に、溶液をアセトニトリル中で段階希釈（１０倍段階で）し、０．０１及び０．００１ｍｇ／ｍＬの低濃度の校正希釈標準溶液を得た。これらの校正希釈標準溶液は、マウス血漿（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で希釈し、以下の分析物濃度を作製した：１０、３０、５０、１００、３００、５００、１０００、３０００ｎｇ／ｍＬ。各一連の校正のため、ゼロ（１０ｎｇ／ｍＬの内部標準を含有する）及びブランク試料も５０μＬのＬａｍｐｉｒｅ血漿から調製した。品質管理（ＱＣ）ストック溶液を、Ｌａｍｐｉｒｅマウス血漿中で希釈し、以下のＱＣ試料を作製した：ＱＣ Ｌｏｗ（ＱＣＬ）２０ｎｇ／ｍＬ；ＱＣ Ｍｉｄ（ＱＣＭ）２００ｎｇ／ｍＬ、及びＱＣ Ｈｉｇｈ（ＱＣＨ）２５００ｎｇ／ｍＬ。
【0069】
ＰＵＭＡｉを抽出するために、本発明者らは、１０μＬの内部標準溶液（アセトニトリル中１０００ｎｇ／ｍＬの［Ｄ５］－ＰＵＭＡｉ）を微小遠心管中の５０μＬの血漿試料に添加した。２５０μＬのアセトニトリルを添加し、試料を３０秒間ボルテックスした。試料は、５分間１２，０００×ｇで遠心分離し、生じる上清を、１２×７５ｍｍガラスチューブ内で、３４℃での窒素下で乾燥状態に蒸発させた。乾燥残渣は、１００μＬのアセトニトリル／水（ｖ／ｖ）で再構成し、１０μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
【0070】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ及びバイナリポンプ、並びにＷａｔｅｒｓ Ｑｕａｔｔｒｏｍｉｃｒｏタンデム質量分析装置から構成された。液体クロマトグラフィーは、Ａ：アセトニトリル／０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）及びＢ：水／０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）からなるグラジエント移動相で実施した。移動相は、流速０．３ｍＬ／分でポンプし、分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μｍ ＰＦＰ（１００ａ １５０×２ｍｍ）カラムを使用して達成した。グラジエント移動相は、以下の通りである：０～５分、溶媒Ａは１５％であった。次いで、溶媒Ａは１２分で８０％まで直線的に増加させ、１６分まで８０％で維持した。１６．１分で、溶媒Ａは１５％まで下げ、２２分まで１５％で維持した。実行時間は２２分であった。
【0071】
質量分析器は、ＭＲＭ検出を使用して、ＥＳＩポジティブモードで操作した。質量分析器のパラメーターは、以下の通りであった；キャピラリー１．０ｋＶ、コーン電圧４０Ｖ、脱溶媒和温度４００℃、脱溶媒和ガス流５５０Ｌ／ｈ、コーンガス流５０Ｌ／ｈ、ＬＭ及びＨＭ解像度１２、衝突エネルギー２５Ｖ、及びガスセルピラニ圧１．５＊１０－３ｍｂａｒ。モニターした質量変化は、ＰＵＭＡｉではｍ／ｚ３３１＞１４３であり、内部標準では３４５＞１５７であった。
【0072】
血漿からの回収を評価するため、本発明者らは、上記のように調製した１０００ｎｇ／ｍＬのＰＵＭＡｉでスパイクした対照の血漿からの面積を、水中のＰＵＭＡｉのニート溶液で得られた面積と比較した。腸粘膜は、対照の血漿を校正範囲内に希釈した後に分析した。腸粘膜は、空腸の１０ｃｍの部分から剥離することにより回収し、使用まで－８０℃で保存した。各処置群につき、３匹のマウスを使用した。
【0073】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ｏｌｆｍ４のＩＳＨは、製造業者の説明書に従って、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．０ ＢＲＯＷＮ ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。簡単に言うと、組織切片を６０AaＣで６０分間焼き、次いでキシレン中で脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。次いで、切片は、３つの前処置ステップ、プローブハイブリダイゼーション、６倍増幅ステップ、現像、及び対比染色を受けた。ＰｕｍａのＩＳＨは、前述のように行った。
Ｏｌｆｍ４のＩＳＨは、製造業者の説明書に従って、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．０ ＢＲＯＷＮ ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。簡単に言うと、組織切片を６０AaＣで６０分間焼き、次いでキシレン中で脱パラフィンし、等級のエタノールを通して再水和した。次いで、切片は、３つの前処置ステップ、プローブハイブリダイゼーション、６倍増幅ステップ、現像、及び対比染色を受けた。ＰｕｍａのＩＳＨは、前述のように行った。
【0074】
ウェスタンブロッティング
新しい粘膜の剥離物又は刻んだ腫瘍組織を、１ｍｌの氷冷したＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇでペレットにした。ペレットは、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡｆｒｅｅ ｍｉｎｉ，Ｒｏｃｈｅ）で補足した７００μｌのホモジナイゼーション緩衝液（０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁し、５０ストロークの乳棒を用いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。１６，０００ｇでの遠心分離による不純物除去後、上清中のタンパク質濃度を分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。
新しい粘膜の剥離物又は刻んだ腫瘍組織を、１ｍｌの氷冷したＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇでペレットにした。ペレットは、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡｆｒｅｅ ｍｉｎｉ，Ｒｏｃｈｅ）で補足した７００μｌのホモジナイゼーション緩衝液（０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁し、５０ストロークの乳棒を用いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。１６，０００ｇでの遠心分離による不純物除去後、上清中のタンパク質濃度を分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。
【0075】
タンパク質（３０μｇ）は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。代表的な結果を示し、同様の結果が少なくとも３回の独立した実験で得られた。使用した抗体は、ＰＵＭＡ（ａｂ９６４３，Ａｂｃａｍ）、ｐ５３、ｐ２１、ヘマグルチニン（ＨＡ）（ｓｃ－６２４３、ｓｃ－３９７、及びｓｃ－８０５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｖ５（Ｒ９６０－２５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、チューブリン（ＣＰ０６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、及びアクチン（Ａ５５４１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む。
【0076】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
１０ｃｍの空腸からの新しい粘膜の剥離物を、冷たいＰＢＳ中で洗浄し、７００μｌのＲＮＡ溶解緩衝液中に再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離した。オルガノイドは、ＲＮＡ単離の前に、記載したように、Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してＭａｔｒｉｇｅｌを含まなかった。相補的ＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムプライマーを使用して、マウスからの２μｇの全ＲＮＡから、又は結腸オルガノイドからの～１００ｎｇの全ＲＮＡから生成し、処置群当たり、３匹のマウス又はオルガノイド培養の３つのウェルからプールした。遺伝子発現は、Ｇａｐｄｈで標準化した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。マウス及びヒトプライマーの詳細は、表１及び２に見出される。
１０ｃｍの空腸からの新しい粘膜の剥離物を、冷たいＰＢＳ中で洗浄し、７００μｌのＲＮＡ溶解緩衝液中に再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離した。オルガノイドは、ＲＮＡ単離の前に、記載したように、Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してＭａｔｒｉｇｅｌを含まなかった。相補的ＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムプライマーを使用して、マウスからの２μｇの全ＲＮＡから、又は結腸オルガノイドからの～１００ｎｇの全ＲＮＡから生成し、処置群当たり、３匹のマウス又はオルガノイド培養の３つのウェルからプールした。遺伝子発現は、Ｇａｐｄｈで標準化した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。マウス及びヒトプライマーの詳細は、表１及び２に見出される。
【0077】
【表1】
【0078】
【表2】
【0079】
細胞及び処置
ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＳＷ４８０、及びＨＴ２９ヒト結腸がん細胞（ＡＴＣＣ）、並びにＨＣＴ１１６ ｐ５３ ＫＯ及びＰＵＭＡ ＫＯは、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補足した、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ヒト胚腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）は、同じサプリメントで補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。処置のため、細胞は、２４時間、～３０％密度で１２ウェルプレートにプレートし、次いで、ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置した。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴと同時に２５μＭで細胞に添加した。
ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＳＷ４８０、及びＨＴ２９ヒト結腸がん細胞（ＡＴＣＣ）、並びにＨＣＴ１１６ ｐ５３ ＫＯ及びＰＵＭＡ ＫＯは、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補足した、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ヒト胚腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）は、同じサプリメントで補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。処置のため、細胞は、２４時間、～３０％密度で１２ウェルプレートにプレートし、次いで、ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置した。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴと同時に２５μＭで細胞に添加した。
【0080】
アポトーシスの測定
処置後、浮遊及び接着細胞を回収し、ＰＢＳ中に３．７％ホルムアルデヒド、０．５％ＮＰ－４０、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する溶液中で染色した。アポトーシスは、先に記載されたように（参照により本明細書に組み込まれる、Yu J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2003) 100:1931-36）、濃縮及び断片化した核の顕微鏡による可視化によって評価した。処置当たり、最低３００個の細胞を、３回分析した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。
処置後、浮遊及び接着細胞を回収し、ＰＢＳ中に３．７％ホルムアルデヒド、０．５％ＮＰ－４０、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する溶液中で染色した。アポトーシスは、先に記載されたように（参照により本明細書に組み込まれる、Yu J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2003) 100:1931-36）、濃縮及び断片化した核の顕微鏡による可視化によって評価した。処置当たり、最低３００個の細胞を、３回分析した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。
【0081】
免疫沈降
ＨＥＫ２９３細胞を、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ＨＡ－タグＰＵＭＡ（ＨＡ－ＰＵＭＡ）、ＨＡ－タグ不活性化ＰＵＭＡ（ΔＢＨ３）、又はＶ５－タグＢｃｌ－ｘＬ（Ｖ５－Ｂｃｌ－ｘＬ）を発現する、先に記載したプラスミドでトランスフェクトした。ＰＵＭＡｉを試験するため、ＨＡ－ＰＵＭＡ又はＨＡ－ΔＢＨ３を含有する２９３ライセートを、２５μＭ ＰＵＭＡｉと１５分間インキュベートし、次いで、Ｖ５－Ｂｃｌ－ｘＬライセートと１時間混合し、抗ＨＡ抗体（ｓｃ－８０５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた免疫沈降を行った。ＢＩＭ／Ｍｃｌ－１相互作用は、ＨＡ－ＢＩＭ及びＶ５－Ｍｃｌ－１を含有するライセートを使用して、同じ様式で試験した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。
ＨＥＫ２９３細胞を、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ＨＡ－タグＰＵＭＡ（ＨＡ－ＰＵＭＡ）、ＨＡ－タグ不活性化ＰＵＭＡ（ΔＢＨ３）、又はＶ５－タグＢｃｌ－ｘＬ（Ｖ５－Ｂｃｌ－ｘＬ）を発現する、先に記載したプラスミドでトランスフェクトした。ＰＵＭＡｉを試験するため、ＨＡ－ＰＵＭＡ又はＨＡ－ΔＢＨ３を含有する２９３ライセートを、２５μＭ ＰＵＭＡｉと１５分間インキュベートし、次いで、Ｖ５－Ｂｃｌ－ｘＬライセートと１時間混合し、抗ＨＡ抗体（ｓｃ－８０５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた免疫沈降を行った。ＢＩＭ／Ｍｃｌ－１相互作用は、ＨＡ－ＢＩＭ及びＶ５－Ｍｃｌ－１を含有するライセートを使用して、同じ様式で試験した。代表的な結果を示し、同様の結果が、少なくとも３回の独立した実験で得られた。
【0082】
組織中のＰＵＭＡｉの測定
ＰＵＭＡｉ｛１－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－３－（２－ナフチルオキシ）－２－プロパノール二塩酸塩｝は、ＨＰＬＣ－ＭＳにより９５％の純度で、Ｃｈｅｍｐｒｉｄｇｅによって合成され、同位体内部標準ＰＵＭＡｉｈ７（Ｄ５、重水素によって置き換えられた５つの内部水素）は、ＨＰＬＣ－ＭＳにより１００％に達する純度で、Ａｌｓａｃｈｉｍによって合成された。核磁気共鳴は、９９．４％以上の同位体濃縮を確認した。未処置のマウスからプールした血漿は、対照の血漿として使用した。ＰＵＭＡｉのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデムＭＳ）定量の詳細な方法は、補遺の材料と方法に見出される。
ＰＵＭＡｉ｛１－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－３－（２－ナフチルオキシ）－２－プロパノール二塩酸塩｝は、ＨＰＬＣ－ＭＳにより９５％の純度で、Ｃｈｅｍｐｒｉｄｇｅによって合成され、同位体内部標準ＰＵＭＡｉｈ７（Ｄ５、重水素によって置き換えられた５つの内部水素）は、ＨＰＬＣ－ＭＳにより１００％に達する純度で、Ａｌｓａｃｈｉｍによって合成された。核磁気共鳴は、９９．４％以上の同位体濃縮を確認した。未処置のマウスからプールした血漿は、対照の血漿として使用した。ＰＵＭＡｉのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデムＭＳ）定量の詳細な方法は、補遺の材料と方法に見出される。
【0083】
マウス及びヒト結腸オルガノイド
ＷＲＮ馴化培地の調製
Ｌ－ＷＲＮ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－３２７６）は、コンフルエントになるまで、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ａｎｔ－ｇｎ－１，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ ハイグロマイシンＢ（１０６８７０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％ ＦＢＳ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。次いで、細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、それらがコンフルエント以上になるまで、３つのＴ７５細胞培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したＤＭＥＭ中に分けた。次いで、細胞は、５ｍｌの初代培養培地（１×ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％ ＦＢＳ［ｖｏｌ／ｖｏｌ］で補足したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でリンスし、同じ培地中で培養した（１５ｍｌ／フラスコ）。２４時間ごとに、初代培養培地（馴化培地）を回収し、新しい培地をフラスコに添加した。馴化培地は、室温で５分間、２，０００ｇで遠心分離し、上清をデカントし、使用まで－２０℃にてアリコットにして保存した。
ＷＲＮ馴化培地の調製
Ｌ－ＷＲＮ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－３２７６）は、コンフルエントになるまで、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ａｎｔ－ｇｎ－１，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ ハイグロマイシンＢ（１０６８７０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％ ＦＢＳ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。次いで、細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、それらがコンフルエント以上になるまで、３つのＴ７５細胞培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したＤＭＥＭ中に分けた。次いで、細胞は、５ｍｌの初代培養培地（１×ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％ ＦＢＳ［ｖｏｌ／ｖｏｌ］で補足したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でリンスし、同じ培地中で培養した（１５ｍｌ／フラスコ）。２４時間ごとに、初代培養培地（馴化培地）を回収し、新しい培地をフラスコに添加した。馴化培地は、室温で５分間、２，０００ｇで遠心分離し、上清をデカントし、使用まで－２０℃にてアリコットにして保存した。
【0084】
マウス陰窩単離、オルガノイド、及び処置
マウス陰窩単離、オルガノイド作製、及び継代は、やや改変して、先に記載されたように行った。簡単に言うと、マウス腸オルガノイドの完全培養培地は、以下のようにわずかに改変された：ａｄｖａｎｃｅｄダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１２６３４－０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｓ１１１５０，ＡＴＬＡＮＴＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、及びＷＲＮ－馴化培地（５０％，ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足した。新しく単離した陰窩は、同じ培地＋１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｙ０５０３ Ｓｉｇｍａ）及び１００μｇ/ｍｌ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ａｎｔ－ｐｍ－１，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で培養した。ＣＰＴ及びＰＵＭＡｉ処置のため、腸オルガノイドを継代し、ＣＰＴ（０．５μＭ，Ｃ９９１１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＵＭＡｉ（５０μＭ）による処置の２４時間前に、２４ウェルプレートで２５μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に２４時間再プレートした。ＣＰＴ含有培地は、ＰＵＭＡｉ（５０μＭ）を含有する完全培地で置き換えた。３つの群（処置対照、ＣＰＴのみ、及びＣＰＴ＋ＰＵＭＡｉ）を設定した。直径１００μｍ以上のオルガノイドを、ＣＰＴ処置の６日後に列挙した。同様の結果が、各実験で３連のウェルによる、少なくとも３回の独立した実験から得られた。
マウス陰窩単離、オルガノイド作製、及び継代は、やや改変して、先に記載されたように行った。簡単に言うと、マウス腸オルガノイドの完全培養培地は、以下のようにわずかに改変された：ａｄｖａｎｃｅｄダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１２６３４－０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｓ１１１５０，ＡＴＬＡＮＴＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、及びＷＲＮ－馴化培地（５０％，ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足した。新しく単離した陰窩は、同じ培地＋１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｙ０５０３ Ｓｉｇｍａ）及び１００μｇ/ｍｌ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ａｎｔ－ｐｍ－１，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で培養した。ＣＰＴ及びＰＵＭＡｉ処置のため、腸オルガノイドを継代し、ＣＰＴ（０．５μＭ，Ｃ９９１１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＵＭＡｉ（５０μＭ）による処置の２４時間前に、２４ウェルプレートで２５μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に２４時間再プレートした。ＣＰＴ含有培地は、ＰＵＭＡｉ（５０μＭ）を含有する完全培地で置き換えた。３つの群（処置対照、ＣＰＴのみ、及びＣＰＴ＋ＰＵＭＡｉ）を設定した。直径１００μｍ以上のオルガノイドを、ＣＰＴ処置の６日後に列挙した。同様の結果が、各実験で３連のウェルによる、少なくとも３回の独立した実験から得られた。
【0085】
ヒト陰窩単離、オルガノイド作製、及び処置
外科的に切除した腸の組織は、ＵＰＭＣシェイディーサイド病院及びＵＰＭＣプレスビティリアン病院の健康科学組織バンク（ＨＳＴＢ：Health Science Tissue Bank）から得た。全ての試料は、インフォームドコンセントによって得られ、ピッツバーグ大学の倫理委員会によって承認された。ヒトの正常な結腸陰窩単離及びオルガノイド作製は、改変して、先に記載されたように実施した。正常なヒト結腸オルガノイドの完全培養培地は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（１５１４０－１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１５６３０－１０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ＸＢ２７（１７５０４－０４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ＸＮ２（１７５０２－０４８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ａ０７３７，Ｓｉｇｍａ）、１０ｎＭ 「ｌｅｕ－１５」－Ｇａｓｔｒｉｎ（Ｇ９１４５，Ｓｉｇｍａ），１０ｍＭ ニコチンアミド（Ｎ０６３６，Ｓｉｇｍａ）、１０μＭ ＳＢ２０２１９０（Ｓ７０６７，Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇ／ｍｌ組換えマウスＥＧＦ（３１５－０９，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μＭ Ａ８３－０１（２９３９，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０ｎＭ ＰＧＥ２（２２－９６１－０，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及び５０％ ＷＲＮ－馴化培地（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１２６３４－０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する。新しく単離した陰窩は、同じ培地＋１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１００μｇ／ｍｌ Ｐｒｉｍｏｃｉｎで培養した。直径１００μｍ以上のオルガノイドを、ＣＰＴ処置の６日後に列挙した。同様の結果が、各実験で３連のウェルを用いて、少なくとも３回の独立した実験から得られた。
外科的に切除した腸の組織は、ＵＰＭＣシェイディーサイド病院及びＵＰＭＣプレスビティリアン病院の健康科学組織バンク（ＨＳＴＢ：Health Science Tissue Bank）から得た。全ての試料は、インフォームドコンセントによって得られ、ピッツバーグ大学の倫理委員会によって承認された。ヒトの正常な結腸陰窩単離及びオルガノイド作製は、改変して、先に記載されたように実施した。正常なヒト結腸オルガノイドの完全培養培地は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（１５１４０－１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１５６３０－１０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ＸＢ２７（１７５０４－０４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ＸＮ２（１７５０２－０４８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ａ０７３７，Ｓｉｇｍａ）、１０ｎＭ 「ｌｅｕ－１５」－Ｇａｓｔｒｉｎ（Ｇ９１４５，Ｓｉｇｍａ），１０ｍＭ ニコチンアミド（Ｎ０６３６，Ｓｉｇｍａ）、１０μＭ ＳＢ２０２１９０（Ｓ７０６７，Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇ／ｍｌ組換えマウスＥＧＦ（３１５－０９，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μＭ Ａ８３－０１（２９３９，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０ｎＭ ＰＧＥ２（２２－９６１－０，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及び５０％ ＷＲＮ－馴化培地（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で補足したａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１２６３４－０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する。新しく単離した陰窩は、同じ培地＋１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１００μｇ／ｍｌ Ｐｒｉｍｏｃｉｎで培養した。直径１００μｍ以上のオルガノイドを、ＣＰＴ処置の６日後に列挙した。同様の結果が、各実験で３連のウェルを用いて、少なくとも３回の独立した実験から得られた。
【0086】
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ＩＶソフトウェアで実施した。応答の多重比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの事後検定により分析したが、２つの群間のものは両側、独立ｔ検定によって行った。生存データは、ログランク検定によって分析した。差は、偶然に生じる差の可能性が、１００のうち５より少ない（Ｐ＜０．０５）場合に、顕著であると考えた。試料サイズは、公表された研究及び検出力計算の組合せを使用して決定した。ＡＮＯＶＡのため、相互作用の試験のための検出力は、必要とされる試料サイズを算出するための混合線形成長モデルを構築することにより適用される二元配置要因分析で計算した。通常、群当たり５～１０が８０％検出力を提供し、１．５ＳＤの標準化相互作用を検出すると見積もられた。
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ＩＶソフトウェアで実施した。応答の多重比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの事後検定により分析したが、２つの群間のものは両側、独立ｔ検定によって行った。生存データは、ログランク検定によって分析した。差は、偶然に生じる差の可能性が、１００のうち５より少ない（Ｐ＜０．０５）場合に、顕著であると考えた。試料サイズは、公表された研究及び検出力計算の組合せを使用して決定した。ＡＮＯＶＡのため、相互作用の試験のための検出力は、必要とされる試料サイズを算出するための混合線形成長モデルを構築することにより適用される二元配置要因分析で計算した。通常、群当たり５～１０が８０％検出力を提供し、１．５ＳＤの標準化相互作用を検出すると見積もられた。
【0087】
例２．ＰＵＭＡは、化学療法誘導性の陰窩のアポトーシス及び致死を媒介する
化学療法誘導性の急性腸傷害におけるｐ５３依存的アポトーシスの潜在的な役割を調べるため、本発明者らは、野生型（ＷＴ）、ｐ５３ノックアウト（ＫＯ）、及びＰｕｍａ ＫＯマウスを、単回用量のイリノテカン（２００ｍｇ／ｋｇ；ＣＰＴ－１１）で処置した。ＷＴマウスにおけるＣＰＴ－１１誘導性の強い陰窩のアポトーシスは、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び活性型カスパーゼ３染色によって測定されるように、６時間でピークに達し、４８時間まで徐々に減少する。アポトーシスは、陰窩基底部の幹細胞（陰窩底部に対して位置１～３におけるＣＢＣ）と＋４～９細胞（陰窩底部に対して）の両方で観察されたが、ｐ５３ ＫＯ及びＰｕｍａ ＫＯマウスでは抑止された（図１Ａ及び１Ｂ、並びに図８Ａ～図８Ｄ）。ＣＰＴ－１１処置は、ＷＴの腸粘膜において６時間以内に、ｐ５３及びその標的ＰＵＭＡ及びｐ２１を誘導したが、ｐ５３ ＫＯマウスでは誘導しなかった（図1Ｃ及び図８Ｅ）。Ｐｕｍａ ＫＯは、ｐ５３又はｐ２１の発現に大きく影響しなかった（図１Ｃ）。ＢＨ－３ｏｎｌｙタンパク質であるＢＩＭ及びＮＯＸＡはＣＰＴ－１１によって誘導されず、Ｐｕｍａ ＫＯによって影響されなかった（図８Ｆ）。ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、Ｐｕｍａ ｍＲＮＡが未処置のＷＴマウスの陰窩で検出不可能であり、ＣＰＴ－１１処置によりＣＢＣ及びいくつかの＋４細胞において強く誘導されたことを確認した（図１Ｄ）。ＣＰＴ－１１は、マウスにおいて用量依存的な致死性のＧＩ傷害を引き起こす（２４）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの感受性を決定するため、３日連続の１日用量のＣＰＴ－１１後の生存をモニターした。１日当たり１８０、２１５、及び２５０ｍｇ／ｋｇの投与は、それぞれ、３０、９０、及び１００％の致死をもたらし、全ての死は５日から８日の間に起こり、致死性のＧＩ傷害の特徴である（図９）。ＷＴマウスの９０％致死量（ＬＤ９０）（３日間、１日当たり２１５ｍｇ／ｋｇ）では、全てのＰｕｍａ ＫＯマウスは３０日間生存したが、全てのｐ５３ ＫＯマウスは６日から９日の間に死んだ（図１Ｅ）。組織学的分析は、陰窩の重度の欠損及び絨毛の短縮を示す、５日目のＷＴ及びｐ５３ ＫＯマウスにおける致死性のＧＩ傷害を確認し、これは、Ｐｕｍａ ＫＯマウスでは抑止された（図１Ｆ）。放射線からの腸の回復におけるｐ５３の二重の役割と一致して（２０）、本発明者らのデータは、ｐ２１又は他の機能ではなく、ＰＵＭＡ及びアポトーシスのｐ５３依存的誘導の選択的阻害が、腸の化学保護をもたらすことを実証する。
化学療法誘導性の急性腸傷害におけるｐ５３依存的アポトーシスの潜在的な役割を調べるため、本発明者らは、野生型（ＷＴ）、ｐ５３ノックアウト（ＫＯ）、及びＰｕｍａ ＫＯマウスを、単回用量のイリノテカン（２００ｍｇ／ｋｇ；ＣＰＴ－１１）で処置した。ＷＴマウスにおけるＣＰＴ－１１誘導性の強い陰窩のアポトーシスは、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び活性型カスパーゼ３染色によって測定されるように、６時間でピークに達し、４８時間まで徐々に減少する。アポトーシスは、陰窩基底部の幹細胞（陰窩底部に対して位置１～３におけるＣＢＣ）と＋４～９細胞（陰窩底部に対して）の両方で観察されたが、ｐ５３ ＫＯ及びＰｕｍａ ＫＯマウスでは抑止された（図１Ａ及び１Ｂ、並びに図８Ａ～図８Ｄ）。ＣＰＴ－１１処置は、ＷＴの腸粘膜において６時間以内に、ｐ５３及びその標的ＰＵＭＡ及びｐ２１を誘導したが、ｐ５３ ＫＯマウスでは誘導しなかった（図1Ｃ及び図８Ｅ）。Ｐｕｍａ ＫＯは、ｐ５３又はｐ２１の発現に大きく影響しなかった（図１Ｃ）。ＢＨ－３ｏｎｌｙタンパク質であるＢＩＭ及びＮＯＸＡはＣＰＴ－１１によって誘導されず、Ｐｕｍａ ＫＯによって影響されなかった（図８Ｆ）。ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、Ｐｕｍａ ｍＲＮＡが未処置のＷＴマウスの陰窩で検出不可能であり、ＣＰＴ－１１処置によりＣＢＣ及びいくつかの＋４細胞において強く誘導されたことを確認した（図１Ｄ）。ＣＰＴ－１１は、マウスにおいて用量依存的な致死性のＧＩ傷害を引き起こす（２４）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの感受性を決定するため、３日連続の１日用量のＣＰＴ－１１後の生存をモニターした。１日当たり１８０、２１５、及び２５０ｍｇ／ｋｇの投与は、それぞれ、３０、９０、及び１００％の致死をもたらし、全ての死は５日から８日の間に起こり、致死性のＧＩ傷害の特徴である（図９）。ＷＴマウスの９０％致死量（ＬＤ９０）（３日間、１日当たり２１５ｍｇ／ｋｇ）では、全てのＰｕｍａ ＫＯマウスは３０日間生存したが、全てのｐ５３ ＫＯマウスは６日から９日の間に死んだ（図１Ｅ）。組織学的分析は、陰窩の重度の欠損及び絨毛の短縮を示す、５日目のＷＴ及びｐ５３ ＫＯマウスにおける致死性のＧＩ傷害を確認し、これは、Ｐｕｍａ ＫＯマウスでは抑止された（図１Ｆ）。放射線からの腸の回復におけるｐ５３の二重の役割と一致して（２０）、本発明者らのデータは、ｐ２１又は他の機能ではなく、ＰＵＭＡ及びアポトーシスのｐ５３依存的誘導の選択的阻害が、腸の化学保護をもたらすことを実証する。
【0088】
例３．小分子ＰＵＭＡｉは、化学療法誘導性の陰窩のアポトーシス及び致死に対して保護する。
本発明者らは、ＰＵＭＡ ＢＨ３ドメインのＢＣＬ－２ファミリータンパク質との重要な相互作用のファルマコフォアモデル、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ化合物スクリーニング、及びアポトーシスアッセイを使用して、多くの可能性のあるＰＵＭＡｉを同定した。これらの化合物（ＰＵＭＡｉ）の１つは、ＰＵＭＡ／ＢＣＬ－ｘＬの相互作用を阻害するが、ＢＩＭ／ＭＣＬ－１の相互作用は阻害しないことが確認された（図１０Ａ～図１０Ｃ）。ＰＵＭＡｉは、ｐ５３ ＷＴ（ＨＣＴ １１６）、ｐ５３欠損（ｐ５３ ＫＯ）、ｐ５３変異体（ＨＴ２９、ＳＷ４８０、及びＤＬＤ１）、又はＰＵＭＡ欠損（ＰＵＭＡ ＫＯ）を含む、異なるｐ５３又はＰＵＭＡ遺伝子型を有する結腸がん細胞株におけるカンプトテシン（ＣＰＴ）誘導性のアポトーシスを減少させなかった（図１０Ｄ）。ＰＵＭＡは、ｐ５３ ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞において、ＣＰＴ処置によってのみ誘導され、いずれのｐ５３欠損株でも誘導されなかった（図１０Ｅ）。基底量のＰＵＭＡは、マウス腸粘膜（図１Ｃ及び図１Ｄ）及び正常なヒト小腸及び結腸における非常に低い又は検出不可能な発現と比較して、ＨＣＴ１１６細胞において極めて高かった。
本発明者らは、ＰＵＭＡ ＢＨ３ドメインのＢＣＬ－２ファミリータンパク質との重要な相互作用のファルマコフォアモデル、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ化合物スクリーニング、及びアポトーシスアッセイを使用して、多くの可能性のあるＰＵＭＡｉを同定した。これらの化合物（ＰＵＭＡｉ）の１つは、ＰＵＭＡ／ＢＣＬ－ｘＬの相互作用を阻害するが、ＢＩＭ／ＭＣＬ－１の相互作用は阻害しないことが確認された（図１０Ａ～図１０Ｃ）。ＰＵＭＡｉは、ｐ５３ ＷＴ（ＨＣＴ １１６）、ｐ５３欠損（ｐ５３ ＫＯ）、ｐ５３変異体（ＨＴ２９、ＳＷ４８０、及びＤＬＤ１）、又はＰＵＭＡ欠損（ＰＵＭＡ ＫＯ）を含む、異なるｐ５３又はＰＵＭＡ遺伝子型を有する結腸がん細胞株におけるカンプトテシン（ＣＰＴ）誘導性のアポトーシスを減少させなかった（図１０Ｄ）。ＰＵＭＡは、ｐ５３ ＷＴ ＨＣＴ１１６細胞において、ＣＰＴ処置によってのみ誘導され、いずれのｐ５３欠損株でも誘導されなかった（図１０Ｅ）。基底量のＰＵＭＡは、マウス腸粘膜（図１Ｃ及び図１Ｄ）及び正常なヒト小腸及び結腸における非常に低い又は検出不可能な発現と比較して、ＨＣＴ１１６細胞において極めて高かった。
【0089】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＵＭＡｉの有効性を調べるため、ＷＴマウスを、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ）の単回投与の２時間前に、ビヒクル又はＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ、経験的な用量）で処置し、ＣＰＴ－１１投与の６時間及び２４時間後に陰窩のアポトーシスを分析した。ＰＵＭＡｉは、移行増幅（ＴＡ）、＋４～９、細胞と比較して、ＣＢＣにおいて優先的にＴＵＮＥＬ及び活性型カスパーゼ３染色を減少させた（図２Ａ及び図２Ｂ、並びに図１１Ａ～図１１Ｄ）。ＰＵＭＡｉ処置は、Ｐｕｍａ ＫＯマウスにおいて陰窩のアポトーシスをさらに減少させなかった（図１１Ｅ）。次いで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを行い、ＣＰＴ－１１投与（０時間）の－１．５、＋１、及び＋６時間の３時点で、腸粘膜及び血漿におけるＰＵＭＡｉ分布を評価した（図１１Ｆ）。ＰＵＭＡｉ濃度は、－１．５時間と比較して、＋１時間及び＋６時間ではそれぞれ、胃腸粘膜において６７％及び３０％に維持されたが、血漿ではより早く低下した（図２Ｃ）。ＣＰＴ－１１は、半減期およそ３６分で、血漿から急速に除去される。本発明者らは、ＣＰＴ－１１処置の１時間後に与えたＰＵＭＡｉが、依然としてアポトーシスを効果的に減少させることを見出し、ＰＵＭＡｉがＣＰＴ－１１転換又は腸吸収に影響しないことを示す（図２Ｄ）。
【0090】
さらに、ＰＵＭＡｉは、３回の異なる投与で、ＣＰＴ－１１誘導性の致死を低下させた（図２Ｅ及び図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ＬＤ９０では、ＰＵＭＡｉは生存を１０～７０％改善した。組織学的分析は、ＷＴマウスと比較して、ＰＵＭＡｉ及びＰｕｍａ ＫＯ群において５日目にＧＩ傷害の減少を確認した（図１Ｆ及び図２Ｆ）。ＰＵＭＡｉは、９．５及び１５グレイの全身照射後のマウスの生存も増加し（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）、他の機能ではなく、ｐ５３依存的アポトーシスの標的化が、処置誘導性の正常組織毒性を選択的に減少させるという考えをさらに支持した。
【0091】
例４．ＰＵＭＡ阻害は、ＣＰＴ－１１の抗腫瘍活性を低下させない
ＰＵＭＡ阻害が、選択的な腸の化学保護を提供するかどうか決定するため、本発明者らは、免疫応答性のＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯマウスにおいて皮下にルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍を確立した。腫瘍が、平均１００ｍｍ３に達した後（１１日目）、マウスは、２週間にわたり、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の６回投与を受けた（図１３Ａ）。腫瘍移植及びＣＰＴ－１１応答は、ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯ宿主において区別できなかった（図３Ａ及び図１３Ｂ）。反対に、ＣＰＴ－１１誘導性の体重減少は、Ｐｕｍａ ＫＯマウスで低下し（図３Ｂ）、高い絨毛高、陰窩数、及び好中球浸潤の低下によって証明される、保存された腸構造及びバリアと関係した（図３Ｃ～図３Ｇ）。
ＰＵＭＡ阻害が、選択的な腸の化学保護を提供するかどうか決定するため、本発明者らは、免疫応答性のＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯマウスにおいて皮下にルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍を確立した。腫瘍が、平均１００ｍｍ３に達した後（１１日目）、マウスは、２週間にわたり、ＣＰＴ－１１（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の６回投与を受けた（図１３Ａ）。腫瘍移植及びＣＰＴ－１１応答は、ＷＴ及びＰｕｍａ ＫＯ宿主において区別できなかった（図３Ａ及び図１３Ｂ）。反対に、ＣＰＴ－１１誘導性の体重減少は、Ｐｕｍａ ＫＯマウスで低下し（図３Ｂ）、高い絨毛高、陰窩数、及び好中球浸潤の低下によって証明される、保存された腸構造及びバリアと関係した（図３Ｃ～図３Ｇ）。
【0092】
次いで、ＰＵＭＡｉの効果を、腫瘍担持マウスで決定した。ＰＵＭＡｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを、ＣＰＴ－１１の各投与の２時間前及び２０時間後に与えた。ＰＵＭＡｉ群は、ビヒクル群と比較して、同等の腫瘍応答を示した（図４Ａ及び図１３Ｂ）が、ＣＰＴ－１１誘導性の体重減少、腸損傷（図４Ｂ～図４Ｇ）、及び致死（表３）に高度に耐性であった。さらに、ＰＵＭＡｉ又はＰＵＭＡ ＫＯ群は、毎日の検査に基づく研究を通して、グルーミング及び身体活動の改善を示した。３つのＣＰＴ－１１処置群全てにおいて、ＬＬＣ腫瘍は、増殖又はアポトーシスに同様の効果を示したが（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）、変異ｐ５３と一致して、ｐ５３、ＰＵＭＡ、又はｐ２１の誘導を欠損した（図１３Ｅ）。これらの研究は、ＰＵＭＡ阻害が、ＣＰＴ－１１誘導性の腸管毒性を減弱するが、免疫応答性宿主におけるｐ５３変異腫瘍の確立又は治療応答は減弱しないことを実証している。
【0093】
【表3】
【0094】
例５．ＰＵＭＡ標的化は、化学療法に対して、ＬＧＲ５＋幹細胞及びニッチを強力に保護する
傷害誘導性再生におけるＩＳＣニッチの役割についてはあまり分かっていない。本発明者らは、化学感受性ＴＡ細胞ほどではない、ＣＢＣの欠損が、ニッチ「排出能」を介して「傷害」シグナルを送り、残りの幹細胞を活性化するかどうか試験した。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ－１１誘導性のＣＢＣアポトーシスを選択的に遮断するため、これを試験する薬理学的な方法を提供する（図２Ｂ）。ＬＧＲ５－ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）レポーターマウスを使用して、本発明者らは、Ｐｕｍａ ＫＯ又はＰＵＭＡｉが、ＬＧＲ５＋細胞のＣＰＴ－１１誘導性のアポトーシスを、それぞれ９０％又は７０％より大きく低下させることを見出した（図５Ａ及び図５Ｂ）。Ｐｕｍａ ＫＯは、別の一般に使用される化学療法薬、５－ＦＵによって誘導されるＬＧＲ５＋細胞アポトーシスも遮断した（図１４）。ＣＤ１６６は、ホメオスタシスにおいて、陰窩底部のＣＢＣ及びパネート細胞を含む、ＩＳＣニッチをマークするＷＮＴ標的である。ＣＰＴ－１１処置は、ＷＴマウスにおいて４８～９６時間、ＣＤ１６６＋細胞の著しい増殖を誘導し、これは９６時間までにＰＵＭＡｉ処置によって完全に抑制された（図５Ｃ及び図５Ｄ）。これは、早くも６時間で、ＷＮＴ（Ｌｇｒ５、ＣＤ４４、及びＷｎｔ３Ａ）－及びＮＯＴＣＨ（Ｏｌｆｍ４、Ｍａｔｈ１、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、及びＤｌｌ１）－応答性遺伝子の一時的だが強い活性化によって先行され、これは、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ処置マウスにおいて大きく抑制された（図１５）。唯一の例外は、ＴＡマーカーＣＤ４４であり、これは、Ｐｕｍａ ＫＯによって強く抑制されたが、ＰＵＭＡｉによっては抑制されなかった（図５Ｅ）。次いで、本発明者らは、５３ＢＰ１遺伝子座による陰窩ＤＮＡ損傷をモニターし、これは６時間の、Ｐｕｍａ ＫＯ、ＰＵＭＡｉ、及び対照群で同等であった。しかしながら、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群におけるＤＮＡ損傷は、ＣＰＴ－１１の単回投与の４８時間後に低く、ＣＰＴ－１１の３回投与の１２０時間後により低かった（図５Ｆ及び図５Ｇ）。これらのデータは、ＬＧＲ５＋細胞の欠損が、ニッチを破壊し、ＷＮＴ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達、並びに化学療法後の腸再生をトリガーし、ＬＧＲ５＋細胞喪失の遮断が代償性の増殖を遅らせ、ＤＮＡ修復を改善するようであることを強く示している。
傷害誘導性再生におけるＩＳＣニッチの役割についてはあまり分かっていない。本発明者らは、化学感受性ＴＡ細胞ほどではない、ＣＢＣの欠損が、ニッチ「排出能」を介して「傷害」シグナルを送り、残りの幹細胞を活性化するかどうか試験した。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ－１１誘導性のＣＢＣアポトーシスを選択的に遮断するため、これを試験する薬理学的な方法を提供する（図２Ｂ）。ＬＧＲ５－ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）レポーターマウスを使用して、本発明者らは、Ｐｕｍａ ＫＯ又はＰＵＭＡｉが、ＬＧＲ５＋細胞のＣＰＴ－１１誘導性のアポトーシスを、それぞれ９０％又は７０％より大きく低下させることを見出した（図５Ａ及び図５Ｂ）。Ｐｕｍａ ＫＯは、別の一般に使用される化学療法薬、５－ＦＵによって誘導されるＬＧＲ５＋細胞アポトーシスも遮断した（図１４）。ＣＤ１６６は、ホメオスタシスにおいて、陰窩底部のＣＢＣ及びパネート細胞を含む、ＩＳＣニッチをマークするＷＮＴ標的である。ＣＰＴ－１１処置は、ＷＴマウスにおいて４８～９６時間、ＣＤ１６６＋細胞の著しい増殖を誘導し、これは９６時間までにＰＵＭＡｉ処置によって完全に抑制された（図５Ｃ及び図５Ｄ）。これは、早くも６時間で、ＷＮＴ（Ｌｇｒ５、ＣＤ４４、及びＷｎｔ３Ａ）－及びＮＯＴＣＨ（Ｏｌｆｍ４、Ｍａｔｈ１、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、及びＤｌｌ１）－応答性遺伝子の一時的だが強い活性化によって先行され、これは、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ処置マウスにおいて大きく抑制された（図１５）。唯一の例外は、ＴＡマーカーＣＤ４４であり、これは、Ｐｕｍａ ＫＯによって強く抑制されたが、ＰＵＭＡｉによっては抑制されなかった（図５Ｅ）。次いで、本発明者らは、５３ＢＰ１遺伝子座による陰窩ＤＮＡ損傷をモニターし、これは６時間の、Ｐｕｍａ ＫＯ、ＰＵＭＡｉ、及び対照群で同等であった。しかしながら、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群におけるＤＮＡ損傷は、ＣＰＴ－１１の単回投与の４８時間後に低く、ＣＰＴ－１１の３回投与の１２０時間後により低かった（図５Ｆ及び図５Ｇ）。これらのデータは、ＬＧＲ５＋細胞の欠損が、ニッチを破壊し、ＷＮＴ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達、並びに化学療法後の腸再生をトリガーし、ＬＧＲ５＋細胞喪失の遮断が代償性の増殖を遅らせ、ＤＮＡ修復を改善するようであることを強く示している。
【0095】
例６．ＬＧＲ５＋細胞は、ＰＵＭＡｉによる腸の化学保護において重要な標的である
本発明者らは、ＬＧＲ５＋細胞欠損によってトリガーされるＷＮＴ及びＮＯＴＣＨ活性化が、残りの幹細胞を繰返し曝露及び幹細胞枯渇に対して感受性を増加させるようであることをさらに試験した。ＣＰＴ－１１処置の６回投与後、ＬＧＲ５＋陰窩細胞及びＬＧＲ５＋陰窩の画分は、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群の４０～６０％のみと比較して、ＷＴマウスにおいて９０％より減少した（図６Ａ及び図６Ｂ）。Ｏｌｆｍ４ ＲＮＡ ＩＳＨは、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群の、それぞれ８％及び４９％と比較して、ＷＴマウスにおいて、Ｏｌｆｍ４＋陰窩の９３％低下を示した（図６Ｃ）。パネート細胞は、ＬＧＲ５＋細胞のニッチであり、ＭＭＰ７発現によりマークされる。単回処置ではなく、繰返しＣＰＴ－１１処置は、上皮にわたって散在する顕著な誤った局在化及びＭＭＰ７＋及びＬＧＲ５＋細胞の接触者のほぼ完全な喪失を伴い、陰窩内のＭＭＰ７＋細胞を減少させ、これはＰｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群で抑制された（図６Ｄ～図６Ｆ）。全体的に、これらのデータは、化学療法誘導性の腸管毒性を受ける重要なメカニズムとしてＬＧＲ５＋細胞の枯渇を実証し、これは、ＰＵＭＡｉにより効果的に標的化され得る。
本発明者らは、ＬＧＲ５＋細胞欠損によってトリガーされるＷＮＴ及びＮＯＴＣＨ活性化が、残りの幹細胞を繰返し曝露及び幹細胞枯渇に対して感受性を増加させるようであることをさらに試験した。ＣＰＴ－１１処置の６回投与後、ＬＧＲ５＋陰窩細胞及びＬＧＲ５＋陰窩の画分は、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群の４０～６０％のみと比較して、ＷＴマウスにおいて９０％より減少した（図６Ａ及び図６Ｂ）。Ｏｌｆｍ４ ＲＮＡ ＩＳＨは、Ｐｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群の、それぞれ８％及び４９％と比較して、ＷＴマウスにおいて、Ｏｌｆｍ４＋陰窩の９３％低下を示した（図６Ｃ）。パネート細胞は、ＬＧＲ５＋細胞のニッチであり、ＭＭＰ７発現によりマークされる。単回処置ではなく、繰返しＣＰＴ－１１処置は、上皮にわたって散在する顕著な誤った局在化及びＭＭＰ７＋及びＬＧＲ５＋細胞の接触者のほぼ完全な喪失を伴い、陰窩内のＭＭＰ７＋細胞を減少させ、これはＰｕｍａ ＫＯ及びＰＵＭＡｉ群で抑制された（図６Ｄ～図６Ｆ）。全体的に、これらのデータは、化学療法誘導性の腸管毒性を受ける重要なメカニズムとしてＬＧＲ５＋細胞の枯渇を実証し、これは、ＰＵＭＡｉにより効果的に標的化され得る。
【0096】
例７．ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ誘導性の傷害に対して、マウス及びヒト結腸オルガノイドを保護する
ＰＵＭＡｉが、陰窩細胞に直接作用するかどうか決定するため、本発明者らは、放射線誘導性の、ＰＵＭＡ依存的ＬＧＲ５＋細胞のアポトーシスを実証するために先に使用した、三次元の上皮オルガノイド又はエンテロイド系を使用した。ＣＰＴは、マウス結腸オルガノイドにおける増殖抑制及びカスパーゼ３の活性化を誘導し、それはＰＵＭＡｉによって強く遮断された（図７Ａ～図７Ｃ）。ＰＵＭＡｉは、ＷＮＴ及びＮＯＴＣＨ標的（Ｌｇｒ５、ＣＤ４４、及びＯｌｆｍ４）のＣＰＴ誘導性の活性化も抑制した（図７Ｄ）。ＴＡマーカーであるＣＤ４４の抑制は、Ｌｇｒ５又はＯｌｆｍ４と比較して顕著ではなく、本発明者らがｉｎ ｖｉｖｏで観察したものと類似していた。
ＰＵＭＡｉが、陰窩細胞に直接作用するかどうか決定するため、本発明者らは、放射線誘導性の、ＰＵＭＡ依存的ＬＧＲ５＋細胞のアポトーシスを実証するために先に使用した、三次元の上皮オルガノイド又はエンテロイド系を使用した。ＣＰＴは、マウス結腸オルガノイドにおける増殖抑制及びカスパーゼ３の活性化を誘導し、それはＰＵＭＡｉによって強く遮断された（図７Ａ～図７Ｃ）。ＰＵＭＡｉは、ＷＮＴ及びＮＯＴＣＨ標的（Ｌｇｒ５、ＣＤ４４、及びＯｌｆｍ４）のＣＰＴ誘導性の活性化も抑制した（図７Ｄ）。ＴＡマーカーであるＣＤ４４の抑制は、Ｌｇｒ５又はＯｌｆｍ４と比較して顕著ではなく、本発明者らがｉｎ ｖｉｖｏで観察したものと類似していた。
【0097】
ＰＵＭＡｉの翻訳能力を実証するため、本発明者らは、原発性のヒト結腸オルガノイドを使用した。ＰＵＭＡｉは、オルガノイド増殖を増強し（図７Ｅ及び図７Ｆ）、ＣＰＴ誘導性のカスパーゼ３活性化を阻害した（図７Ｇ）。ＰＵＭＡｉは、ＣＰＴ誘導性のＷＮＴ及びＮＯＴＣＨ標的の発現を抑制し（図７Ｈ）、ＬＧＲ５＋細胞のｐ５３－及びＰＵＭＡ－依存的喪失が、上皮画分内のＩＳＣ関連経路の実質的な活性化をトリガーすることを確証した。
【0098】
例８．ＰＵＭＡ誘導性のアポトーシスを阻害するさらなる化合物
ＰＵＭＡｉに加えて、いくつかの化合物が同定され、先に記載されたように(Mustata G. et al. Curr Top Med Chem (2011) 11:281-290、参照により本明細書に組み込まれる)、ＺＩＮＣ ８．０データベースのｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニング、及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＡＤＭＥ／Ｔｏｘｉｃｉｔｙプロファイルを使用して、ＰＵＭＡ誘導性のアポトーシスの阻害を実証した。本発明者らは、結腸がん細胞株ＤＬＤ１及びＨＣＴ－１１６においてＰＵＭＡ誘導性のアポトーシスを減少させるそれらの能力について、ＰＵＭＡｉと関連する化合物の群も試験した。これらのさらなる化合物の構造及びアポトーシス阻害効果を以下の表に列挙する。
ＰＵＭＡｉに加えて、いくつかの化合物が同定され、先に記載されたように(Mustata G. et al. Curr Top Med Chem (2011) 11:281-290、参照により本明細書に組み込まれる)、ＺＩＮＣ ８．０データベースのｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニング、及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＡＤＭＥ／Ｔｏｘｉｃｉｔｙプロファイルを使用して、ＰＵＭＡ誘導性のアポトーシスの阻害を実証した。本発明者らは、結腸がん細胞株ＤＬＤ１及びＨＣＴ－１１６においてＰＵＭＡ誘導性のアポトーシスを減少させるそれらの能力について、ＰＵＭＡｉと関連する化合物の群も試験した。これらのさらなる化合物の構造及びアポトーシス阻害効果を以下の表に列挙する。
【0099】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【0100】
本明細書に開示及び請求する全ての組成物及び方法は、本開示に照らして不適当な実験を含まずに行われ、遂行され得る。本発明の組成物及び方法は、例示的な実施形態に関して記載されるが、変更が、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び方法、並びに方法のステップ又は方法のステップの順序に適用され得ることが、当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的にも生理的にも関連するある特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤と置換され得るが、同じ又は類似の結果が達成されることは明らかであろう。当業者には明らかである全てのかかる類似の置換及び改変は、添付の請求項によって規定されるように、本発明の精神、範囲及び概念内であると思われる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】