特表2022-519807抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-25
(54)【発明の名称】抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220317BHJP
C07K 16/36 20060101ALI20220317BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220317BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220317BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220317BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220317BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220317BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220317BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220317BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220317BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220317BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/36 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
A61P7/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021541199
(86)(22)【出願日】2019-10-22
(85)【翻訳文提出日】2021-07-15
(86)【国際出願番号】 CN2019112412
(87)【国際公開番号】W WO2021022676
(87)【国際公開日】2021-02-11
(31)【優先権主張番号】201910729990.5
(32)【優先日】2019-08-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521132565
【氏名又は名称】上海博槿生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＢ－ＬＥＧＥＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 少雄
(72)【発明者】
【氏名】須 ▲ジュ▼華
(72)【発明者】
【氏名】周 ▲ウン▼華
(72)【発明者】
【氏名】陳 永峰
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA54
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA54
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZA54
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA24
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本願は、抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用を提供しており、前記抗体の抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体は、ＦＸＩａに特異的に結合できるが、ＦＸＩに結合せず、ヒトの血液凝固の内因性経路を抑制するが、外因性経路に影響を与えない作用を有し、動静脈シャント血栓の形成を顕著に抑制できるが、出血時間及び出血量を増加させることはなく、抗血栓薬物になる潜在的な可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合断片であって、前記抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ
前記抗原結合断片の軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に示されるアミノ酸配列を含む、抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９に示される核酸配列を含み、且つ前記抗原結合断片の軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２に示される核酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗原結合断片の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記抗原結合断片の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗原結合断片の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列を含み、且つ前記抗原結合断片の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される核酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片を含む、抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体。
【請求項6】
前記抗体は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せを含み、好ましくはヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片あるいは請求項５又は６に記載の抗体をコードするＤＮＡ断片を含む、核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項9】
前記発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターを含む、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項10】
請求項７に記載の核酸分子あるいは請求項８又は９に記載の発現ベクターによりトランスフェクトされる、宿主細胞。
【請求項11】
前記宿主細胞は哺乳動物細胞を含み、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片あるいは請求項５又は６に記載の抗体の調製方法であって、（１）抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＤＮＡ断片を発現ベクターに接続し、それをコンピテント細胞に移し、培養後にモノクローナル細胞をピックアップして選別するステップと、
（２）選別した発現ベクターを宿主細胞に移し、培養して上清を回収し、分離・精製し
て前記抗体を得るステップとを含む、方法。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片、請求項５又は６に記載の抗体、請求項７に記載の核酸分子、請求項８又は９に記載の発現ベクター、あるいは請求項１０又は１１に記載の宿主細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せを含む薬物組成物であって、好ましくは、前記薬物組成物は、薬学的に許容されるベクター、賦形剤又は希釈剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せをさらに含む、薬物組成物。
【請求項14】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片、請求項５又は６に記載の抗体、請求項７に記載の核酸分子、請求項８又は９に記載の発現ベクター、請求項１０又は１１に記載の宿主細胞、あるいは請求項１３に記載の薬物組成物のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せに接続する治療剤であって、好ましくは、前記治療剤は、薬学的に許容されるベクター、賦形剤又は希釈剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せをさらに含む、治療剤。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合断片、請求項５又は６に記載の抗体、請求項７に記載の核酸分子、請求項８又は９に記載の発現ベクター、請求項１０又は１１に記載の宿主細胞、請求項１３に記載の薬物組成物、あるいは請求項１４に記載の治療剤の、抗血栓薬物の調製における、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、生物工学の分野に属し、抗体並びにその調製方法及び使用に関し、特に、抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
血液凝固は複雑なプロセスであり、大まかに、プロトロンビン活性化剤の形成、プロトロンビンからトロンビンへの変換、及びフィブリノーゲンからフィブリンへの変換といった３つの段階に分けられている。プロトロンビン活性化剤の形成には、２種類の異なるメカニズムがあり、それぞれが内因性経路と外因性経路であり、それらの２種類のメカニズムはトロンビン形成とフィブリン形成に纏められるため、後の両者は共通経路とも呼ばれる。凝固反応はカスケードメカニズムを用いて凝固シグナルを段階的に増幅し、その生化学的本質は血漿中の血液凝固因子の一連の酵素反応であり、上流因子がその下流因子を活性化し、最終的に可溶性フィブリノーゲン（ＦＩ）を不溶性のフィブリン（ＦＩａ）に変換する。
【0003】
血液凝固因子ＸＩの活性型因子ＸＩａ（Ｆａｃｔｏｒ ＸＩａ，ＦＸＩａ）は、内因性血液凝固経路に関与するプロトロンビン凝固因子ＸＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ，ＦＸＩ）が切断されて生成されたトロンビンである。ヒトＦＸＩ遺伝子は染色体４（４ｑ３２－３５）にあり、全長は２３ｋｂで１５個のエクソンが含まれる。ヒトＦＸＩタンパク質の分子量は１６０ｋＤでホモダイマー構造であり、各サブユニットは、１本の重鎖と１本の軽鎖を含む６０７個のアミノ酸で構成され、そのうち、重鎖には４つのＡｐｐｌｅドメイン（Ａ ｄｏｍａｉｎ）が含まれ、軽鎖は主に酵素活性領域である。人体内のＦＸＩタンパク質は主に肝細胞により合成され、血漿中のＦＸＩの濃度は約５μｇ／ｍＬで、半減期は約５２時間である。凝固経路で、ＦＸＩは活性化された血液凝固因子ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）及びトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）により活性化され、ＦＸＩａが生成され、さらにＦＩＸ及び下流の血液凝固反応が活性化されることができる。
【0004】
ＦＸＩ欠損症のヒトは、通常、自発的な出血を引き起こしなく、出血なし、又はごくわずかな出血傾向がある。最近の疫学研究は、ＦＸＩ欠損症が虚血性脳卒中による死亡のリスクと負の関係があることを示している。ＦＸＩ欠損症の人々では、血栓による虚血性脳卒中の発症率は、正常な人々よりも明らかに低くなる。それに対して、ＦＸＩの発現レベルが高い人々では、静脈血栓の発症率は正常な人々よりも高くなる。一例とするＦＸＩアンチセンス核酸のヌクレオチドの第ＩＩ相臨床試験では、２００ｍｇのＦＸＩアンチセンス核酸のヌクレオチドは、膝関節置換手術を受ける患者の深部静脈血栓の発症率を大幅に減らすことができ、且つ被験者の人々の出血リスクを増加させない。これにより、ＦＸＩとその内因性血液凝固経路は、病的状態での体内の血栓形成に重要な役割を果たす可能性があることがわかった。したがって、ＦＸＩ、特にその活性型ＦＸＩａは、理想的な抗血栓治療標的である。
【0005】
ＣＮ１０４６８４９３２Ａは、血液凝固因子ＸＩ及び／又はその活性型因子ＸＩａに結合できる抗体及びその用途を開示しており、前記モノクローナル抗体は血小板の凝集を抑制し、それによって止血を損害することなく血栓の形成を抑制することができるが、前記モノクローナル抗体はＦＸＩとＦＸＩａの両方ともに結合作用がある。
【0006】
ＣＮ１０７９２２５０５Ａは、血液凝固因子ＸＩ抗体及びその使用方法を開示しており、前記抗体は、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの触媒ドメイン内に結合し、ＦＸＩ又はＦＸＩａに特異的に結合する機能を有さない。
【0007】
したがって、従来の技術における血液凝固因子ＸＩ抗体は、ＦＸＩとＦＸＩａの両方ともに結合作用を有し、ＦＸＩａに特異的な結合機能を有さず、そして、ＦＸＩａはＦＸＩよりも理想的な抗血栓治療標的であり、選別によりＦＸＩａに特異的に結合する抗体を得ることは、病理学的血栓治療の分野で非常に重要である。
【発明の概要】
【0008】
従来技術の不足について、本願は、抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用を提供しており、前記抗体は、ＦＸＩａに特異的に結合できるが、ＦＸＩに結合せず、抗血栓薬物になる潜在的な可能性がある。
【0009】
この目的を達成するために、本願は下記の技術案を講じた。
第１の態様では、本願は抗原結合断片を提供しており、前記抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるアミノ酸配列を含み、
前記抗原結合断片の軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に示されるアミノ酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列はＥＬＳＭＨであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列はＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるミノ酸配列はＤＲＰＶＲＧＶＩＰＹＹＹＹＹＧＭＤＶであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列はＳＧＳＲＳＮＩＧＳＲＰＶＮであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列はＩＤＨＱＲＰＳであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列はＡＡＷＤＤＳＬＤＡＹＶである。
第１の態様では、本願は抗原結合断片を提供しており、前記抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３に示されるアミノ酸配列を含み、
前記抗原結合断片の軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６に示されるアミノ酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列はＥＬＳＭＨであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列はＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるミノ酸配列はＤＲＰＶＲＧＶＩＰＹＹＹＹＹＧＭＤＶであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列はＳＧＳＲＳＮＩＧＳＲＰＶＮであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列はＩＤＨＱＲＰＳであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列はＡＡＷＤＤＳＬＤＡＹＶである。
【0010】
好ましくは、前記抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９に示される核酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される核酸配列はＧＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される核酸配列は
ＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される核酸配列は
ＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される核酸配列はＧＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される核酸配列は
ＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される核酸配列は
ＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣである。
【0011】
好ましくは、前記抗原結合断片の軽鎖可変領域のＣＤＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２に示される核酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される核酸配列は
ＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＡＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される核酸配列はＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される核酸配列は
ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される核酸配列は
ＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＡＣであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される核酸配列はＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡであり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される核酸配列は
ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣである。
【0012】
好ましくは、前記抗原結合断片の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列は
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＹＴＬＴＥＬＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＥＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＤＲＰＶＲＧＶＩＰＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列は
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＹＴＬＴＥＬＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＥＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＤＲＰＶＲＧＶＩＰＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【0013】
好ましくは、前記抗原結合断片の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列は
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＴＶＴＩＳＣＳＧＳＲＳＮＩＧＳＲＰＶＮＷＹＱＨＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＩＤＨＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＤＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＤＡＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列は
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＴＶＴＩＳＣＳＧＳＲＳＮＩＧＳＲＰＶＮＷＹＱＨＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＩＤＨＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＤＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＤＡＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【0014】
好ましくは、前記抗原結合断片の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列は
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列は
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣである。
【0015】
好ましくは、前記抗原結合断片の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される核酸配列を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される核酸配列は
ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される核酸配列は
ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡである。
【0016】
第２の態様では、本願は抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体を提供しており、前記抗体は第１の態様に記載の抗原結合断片を含む。
【0017】
好ましくは、前記抗体は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せを含み、好ましくはヒトＩｇＧ１定常領域である。
【0018】
本願によれば、ヒト血漿中のＦＸＩ及びＦＸＩａの濃度は、それぞれ約５μｇ／ｍＬ（３０ｎＭ）及び０．６ｎｇ／ｍＬ（４ｐＭ）であり、同時に、人体内での約５２時間のＦＸＩの半減期に基づいて肝臓で新たに合成されたＦＸＩは１日あたり～１６ｍｇに達することができ、これにより、人体内のＦＸＩの濃度はＦＸＩａの濃度よりもはるかに高いこ
とがわかり、したがって、ＦＸＩには結合せず、ＦＸＩａのみに結合する抗体を選別することで、ＦＸＩａとＦＸＩの両方に結合する抗体よりも、臨床応用時の投与量をはるかに低くすることができる。また、ＦＸＩａのみに結合する抗体は、ＦＸＩａとＦＸＩの両方に結合できる抗体よりも臨床的な安全性が高い。
とがわかり、したがって、ＦＸＩには結合せず、ＦＸＩａのみに結合する抗体を選別することで、ＦＸＩａとＦＸＩの両方に結合する抗体よりも、臨床応用時の投与量をはるかに低くすることができる。また、ＦＸＩａのみに結合する抗体は、ＦＸＩａとＦＸＩの両方に結合できる抗体よりも臨床的な安全性が高い。
【0019】
本願では、抗体はＦＸＩａに強い結合力を持っているが、ＦＸＩに結合せず、活性化部分トロンボプラスチン時間を増加させることができ、プロトロンビン時間に顕著な影響を与えず、人の血液凝固の内因性経路を抑制するが、外因性経路に影響しない作用を有する。
【0020】
第３の態様では、本願は核酸分子を提供しており、前記核酸分子は第１の態様に記載の抗原結合断片及び／又は第２の態様に記載の抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。
【0021】
第４の態様では、本願は発現ベクターを提供しており、前記発現ベクターは第３の態様に記載の核酸分子を含む。
【0022】
好ましくは、前記発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターを含む。
【0023】
第５の態様では、本願は宿主細胞を提供しており、前記宿主細胞に第３の態様に記載の核酸分子及び／又は第４の態様に記載の発現ベクターがトランスフェクトされる。
【0024】
好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物細胞を含み、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【0025】
第６の態様では、本願は、第１の態様に記載の抗原結合断片及び／又は第２の態様に記載の抗体の調製方法を提供しており、前記方法は、
（１）抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＤＮＡ断片を発現ベクターに接続し、それをコンピテント細胞に移し、培養後にモノクローナル細胞をピックアップして選別するステップと、
（２）選別した発現ベクターを宿主細胞に移し、培養して上清を回収し、分離・精製して前記抗体を得るステップとを含む。
（１）抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＤＮＡ断片を発現ベクターに接続し、それをコンピテント細胞に移し、培養後にモノクローナル細胞をピックアップして選別するステップと、
（２）選別した発現ベクターを宿主細胞に移し、培養して上清を回収し、分離・精製して前記抗体を得るステップとを含む。
【0026】
第７の態様では、本願は薬物組成物を提供しており、前記薬物組成物は第１の態様に記載の抗原結合断片、第２の態様に記載の抗体、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載の発現ベクター、あるいは第５の態様に記載の宿主細胞のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せを含む。
【0027】
好ましくは、前記薬物組成物は、薬学的に許容されるベクター、賦形剤又は希釈剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せをさらに含む。
【0028】
第８の態様では、本願は治療剤を提供しており、前記治療剤は第１の態様に記載の抗原結合断片、第２の態様に記載の抗体、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載の発現ベクター、第５の態様に記載の宿主細胞、あるいは第７の態様に記載の薬物組成物のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せに接続する。
【0029】
好ましくは、前記治療剤は、薬学的に許容されるベクター、賦形剤又は希釈剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合せをさらに含む。
【0030】
第９の態様では、本願は第１の態様に記載の抗原結合断片、第２の態様に記載の抗体、第３の態様に記載の核酸分子、第４の態様に記載の発現ベクター、第５の態様に記載の宿
主細胞、第７の態様に記載の薬物組成物、あるいは第８の態様に記載の治療剤の、抗血栓薬物の調製における使用を提供する。
主細胞、第７の態様に記載の薬物組成物、あるいは第８の態様に記載の治療剤の、抗血栓薬物の調製における使用を提供する。
【0031】
従来の技術に比べて、本願は以下の有益な効果を有する。
（１）本願の１４６２４モノクローナル抗体はＦＸＩａに強い結合力を有し、ＥＣ５０は０．０５６ｎＭであるが、ＦＸＩに結合せず、１４６２４モノクローナル抗体はＦＸＩａに高い親和性を有し、ＫＤは２．３１４Ｅ－１１Ｍである。
（２）本願の１４６２４モノクローナル抗体はａＰＴＴを増加させるが、ＰＴに顕著な影響を与えず、人の血液凝固の内因性経路を抑制するが、外因性経路に影響を与えない作用を有する。
（３）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａを介したＦＩＸのその活性型ＦＩＸａへの変換に対して顕著な抑制作用を有し、ＦＸＩを介したＦＩＸａの生成を抑制できる。
（４）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａに対して特異的な抑制作用を有し、内因性及び外因性の血液凝固経路上の他の血液凝固因子への特異的な結合を有さない。
（５）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、動静脈シャント血栓の形成を顕著に抑制できるが、出血時間及び出血量を増加させることはなく、ａＰＴＴを顕著に高めることができるが、ＰＴ及び血小板数に影響を与えない。
（６）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、抗血栓薬物とする潜在的な可能性がある。
（１）本願の１４６２４モノクローナル抗体はＦＸＩａに強い結合力を有し、ＥＣ５０は０．０５６ｎＭであるが、ＦＸＩに結合せず、１４６２４モノクローナル抗体はＦＸＩａに高い親和性を有し、ＫＤは２．３１４Ｅ－１１Ｍである。
（２）本願の１４６２４モノクローナル抗体はａＰＴＴを増加させるが、ＰＴに顕著な影響を与えず、人の血液凝固の内因性経路を抑制するが、外因性経路に影響を与えない作用を有する。
（３）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａを介したＦＩＸのその活性型ＦＩＸａへの変換に対して顕著な抑制作用を有し、ＦＸＩを介したＦＩＸａの生成を抑制できる。
（４）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａに対して特異的な抑制作用を有し、内因性及び外因性の血液凝固経路上の他の血液凝固因子への特異的な結合を有さない。
（５）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、動静脈シャント血栓の形成を顕著に抑制できるが、出血時間及び出血量を増加させることはなく、ａＰＴＴを顕著に高めることができるが、ＰＴ及び血小板数に影響を与えない。
（６）本願の１４６２４モノクローナル抗体は、抗血栓薬物とする潜在的な可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図2】図２（Ａ）はヒト血漿中で活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響であり、図２（Ｂ）はヒト血漿中でプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響である。
【図3】図３（Ａ）はカニクイザル血漿中で活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響であり、図３（Ｂ）はカニクイザル血漿中でプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響である。
【図4】図４（Ａ）はニュージーランド白ウサギ血漿中で活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響であり、図４（Ｂ）はニュージーランド白ウサギ血漿中でプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するモノクローナル抗体１４６２４の影響である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、本願で採用される技術的手段及びその効果をさらに説明するために、実施例及び図面を参照しながら、本願をさらに説明する。ここで説明する具体的実施形態は、本願を説明するためのものに過ぎず、本願を限定するものではないことを理解できる。
【0034】
実施例に、具体的技術又は条件が明確に示されていない場合、本分野内の文献で説明される技術又は条件に従うか、あるいは製品の説明書に従う。メーカーが示されていないあらゆる試薬又は機器は、いずれも正式なチャネルを通じて購入できる通常の製品である。
【0035】
実施例１ 抗体分子の選別及び構築
ビオチン標識のヒト天然ファージＦａｂライブラリーにより選別された抗原ＦＸＩａとＦＸＩ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、標識キットはＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．ＮＯ：２１４３５）であり、Ｚｅｂａの脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．ＮＯ：８９８９１）を用いて脱塩した。
ビオチン標識のヒト天然ファージＦａｂライブラリーにより選別された抗原ＦＸＩａとＦＸＩ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、標識キットはＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．ＮＯ：２１４３５）であり、Ｚｅｂａの脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．ＮＯ：８９８９１）を用いて脱塩した。
【0036】
抗体の選別策略は、ＦＸＩａに結合するが、ＦＸＩに結合しないＦａｂ断片を選択し、選別及び配列した後、２０個の固有の配列を取得し、ＰＣＲにより重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列をそれぞれ増幅し、それをｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、培養細胞から分泌された上清を精製し、全長のＩｇＧ１モノクローナル抗体１４６２４を得ることであり、前記モノクローナル抗体１４６２４の配列情報はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１６に示される。
【0037】
陽性対照とするクローン０７６Ｄ－Ｍ００７－Ｈ０４－ＣＤＲＬ３－Ｎ１１０Ｄの軽鎖及び重鎖可変領域の配列は、Ｂａｙｅｒ社の米国特許ＵＳ９７８３６１４Ｂ２に由来し、軽鎖及び重鎖可変領域の配列を合成した後、同様に、ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、培養細胞から分泌された上清を精製し、全長のＩｇＧ１モノクローナル抗体Ｎ１１０Ｄを得て、陽性対照抗体とした。
【0038】
実施例２ 抗ヒトＦＸＩａ完全ヒトモノクローナル抗体１４６２４の特異的機能の検証
抗ヒトＦＸＩａ完全ヒトモノクローナル抗体１４６２４と血液凝固因子ＦＸＩａ又はＦＸＩの結合力をＥＬＩＳＡにより検出した。
抗ヒトＦＸＩａ完全ヒトモノクローナル抗体１４６２４と血液凝固因子ＦＸＩａ又はＦＸＩの結合力をＥＬＩＳＡにより検出した。
【0039】
結果は図１（Ａ）及び表１に示すように、本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａに強い結合を有し、ＥＣ５０は０．０５６ｎＭであり、陽性の照合抗体Ｎ１１０Ｄに相当し、図１（Ｂ）に示すように、本願の１４６２４モノクローナル抗体はＦＸＩに結合しながった。
【0040】
【表1】
【0041】
実施例３ 活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）とプロトロンビン時間（ＰＴ）の、ヒト血漿中の抗体の抗血液凝固活性に対する決定
ａＰＴＴは、内因性及び共通経路の血液凝固因子の活性を検出するために用いられ、ＰＴは、外因性及び共通経路の血液凝固因子の活性を検出するために用いられる。具体的な手順は次のとおりである。
９０μＬの標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及び１０μＬの異なる濃度（０～８μＭ）の検出される抗体を取って混合し、５分間インキュベートしてから、ａＰＴＴキット及びＰＴキット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてＣＡ－６００全自動血液凝固分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ Ｌｔｄ．）で分析して検出した。
ａＰＴＴは、内因性及び共通経路の血液凝固因子の活性を検出するために用いられ、ＰＴは、外因性及び共通経路の血液凝固因子の活性を検出するために用いられる。具体的な手順は次のとおりである。
９０μＬの標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及び１０μＬの異なる濃度（０～８μＭ）の検出される抗体を取って混合し、５分間インキュベートしてから、ａＰＴＴキット及びＰＴキット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてＣＡ－６００全自動血液凝固分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ Ｌｔｄ．）で分析して検出した。
【0042】
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示すように、本願の１４６２４モノクローナル抗体は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を増加でき、低濃度範囲内で一定の濃度依存性を示しているが、プロトロンビン時間（ＰＴ）に顕著な影響を与えず、これは、モノクローナル抗体１４６２４がヒトの血液凝固の内因性経路を抑制できるが、外因性経路に影響を与えないことを示した。
【0043】
実施例４ 活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）とプロトロンビン時間（ＰＴ）での非ヒト血漿中の抗体の抗血液凝固活性の検出
実施例３の方法に従って、カニクイザル血漿（ｃｙｎｏ ｐｌａｓｍａ）及びニュージーランド白ウサギ血漿（ｒａｂｂｉｔ ｐｌａｓｍａ）中のモノクローナル抗体１４６２４の抗血液凝固活性を検出した。
実施例３の方法に従って、カニクイザル血漿（ｃｙｎｏ ｐｌａｓｍａ）及びニュージーランド白ウサギ血漿（ｒａｂｂｉｔ ｐｌａｓｍａ）中のモノクローナル抗体１４６２４の抗血液凝固活性を検出した。
【0044】
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、モノクローナル抗体１４６２４はサル血漿に活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を増加でき、低濃度範囲内で一定の濃度依存性を示しているが、プロトロンビン時間（ＰＴ）に顕著な影響を与えず、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示すように，モノクローナル抗体１４６２４はウサギ血漿にも同様に活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を増加でき、低濃度範囲内で一定の濃度依存性を示しているが、プロトロンビン時間（ＰＴ）に顕著な影響を与えない。これは、モノクローナル抗体１４６２４はカニクイザル及びニュージーランド白ウサギのＦＸＩａに対して交差反応性を有することを示した。ヒト、カニクイザル及びニュージーランド白ウサギの血漿のａＰＴＴ倍増加に必要な濃度値は表２に示すとおりである。
【0045】
【表2】
【0046】
実施例５ ヒトＦＸＩａに対する抗ＦＸＩａ抗体の親和性の検出
本実施例では、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出法により、ＦＸＩａとモノクローナル抗体１４６２４の間の親和性をリアルタイムで定量的に検出し、抗ＦＸＩａ抗体とＦＸＩａの結合及び解離の動的特性を評価した。具体的な手順は次のとおりである。
（１）抗体の捕捉：検出される抗体を１×ＰＢＳ緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、流速を１０μＬ／ｍｉｎに設定し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで抗体を捕捉する時間は１５ｓであり、それぞれＮ１１０Ｄ抗体及び１４６２４抗体をＦｃ２及びＦｃ４チャネルに捕捉した。
（２）サンプル試験条件：手動モードでＦＸＩａと抗体の結合特性を初期測定及び評価を行い、１０ｎＭをＦＸＩａの最高分析濃度として確定し、２倍の勾配で希釈し、０ｎＭ、０．０１９５３ｎＭ、０．０３９６２５ｎＭ、０．０７８１２５ｎＭ、０．１５６２５ｎＭ、０．３１２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ及び１０ｎＭの合計１０個の分析濃度を設定し、サンプル分析時に流速を３０μＬ／ｍｉｎ、結合時間を１２０ｓ、解離時間を６００ｓに設定した。
（３）再生条件：他の実験を参照し、手動モードで初期測定と評価を行い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出される抗体とＦＸＩａの結合力を分析するときに、再生緩衝液としてＧｌｙ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝１．５）を用いることを確定し、再生時の流速を３０μＬ／ｍｉｎに設定し、３０秒間再生した。
（４）動的パラメータの測定：実験はマルチサイクルで実行され、その応答信号は分析時間を横軸とし、応答値を縦軸とし、得られたデータをＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェアによりフィッティングし、使用されるフィッティングモデルは１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルであり、結合速度定数、解離速度定数、結合及び解離定数などの動的定数を確定した。
本実施例では、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出法により、ＦＸＩａとモノクローナル抗体１４６２４の間の親和性をリアルタイムで定量的に検出し、抗ＦＸＩａ抗体とＦＸＩａの結合及び解離の動的特性を評価した。具体的な手順は次のとおりである。
（１）抗体の捕捉：検出される抗体を１×ＰＢＳ緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、流速を１０μＬ／ｍｉｎに設定し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで抗体を捕捉する時間は１５ｓであり、それぞれＮ１１０Ｄ抗体及び１４６２４抗体をＦｃ２及びＦｃ４チャネルに捕捉した。
（２）サンプル試験条件：手動モードでＦＸＩａと抗体の結合特性を初期測定及び評価を行い、１０ｎＭをＦＸＩａの最高分析濃度として確定し、２倍の勾配で希釈し、０ｎＭ、０．０１９５３ｎＭ、０．０３９６２５ｎＭ、０．０７８１２５ｎＭ、０．１５６２５ｎＭ、０．３１２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ及び１０ｎＭの合計１０個の分析濃度を設定し、サンプル分析時に流速を３０μＬ／ｍｉｎ、結合時間を１２０ｓ、解離時間を６００ｓに設定した。
（３）再生条件：他の実験を参照し、手動モードで初期測定と評価を行い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出される抗体とＦＸＩａの結合力を分析するときに、再生緩衝液としてＧｌｙ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝１．５）を用いることを確定し、再生時の流速を３０μＬ／ｍｉｎに設定し、３０秒間再生した。
（４）動的パラメータの測定：実験はマルチサイクルで実行され、その応答信号は分析時間を横軸とし、応答値を縦軸とし、得られたデータをＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェアによりフィッティングし、使用されるフィッティングモデルは１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルであり、結合速度定数、解離速度定数、結合及び解離定数などの動的定数を確定した。
【0047】
固定された１４６２４抗体及びＮ１１０Ｄ抗体のＦＸＩａに結合するＳＰＲグラフは図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示すように、ＦＸＩａの濃度が徐々に増加するにつれて、抗体の応答は徐々に増加していた。表３はＦＸＩａに対する抗体の解離定数（ＫＤ）であり、ＫＤ≦１０－７Ｍのときに高親和性と認められるため、Ｎ１１０Ｄ抗体及び１４６２４抗体はいずれもＦＸＩａとの高親和性を有した。
【0048】
【表3】
【0049】
実施例６ ＦＸＩａに対する抗体の機能的な中和
本実施例では、ＦＸＩａを用いてその特異的化学基質Ｓ－２３６６（Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）を酵素切断し、マイクロプレートリーダーを用いて酵素切断した生成物の吸光度の変化を継続的に監視し、ヒトＦＸＩａの活性を確定した。抗ＦＸＩａ抗体の活性に対する抑制を検出するために、ＦＸＩａを緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１のＢＳＡ）で最終濃度の２．５ｎＭに希釈し、異なる濃度の抗体と室温条件で５分間インキュベートしてから、抗体－抗原混合溶液にＳ－２３６６を加え、最終濃度を４ｍＭにし、即時にＳｐｅｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）によって吸光度の４０５ｎｍでの連続変化を動的モードで１５秒ごとに３０分間継続的に監視し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。
本実施例では、ＦＸＩａを用いてその特異的化学基質Ｓ－２３６６（Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）を酵素切断し、マイクロプレートリーダーを用いて酵素切断した生成物の吸光度の変化を継続的に監視し、ヒトＦＸＩａの活性を確定した。抗ＦＸＩａ抗体の活性に対する抑制を検出するために、ＦＸＩａを緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１のＢＳＡ）で最終濃度の２．５ｎＭに希釈し、異なる濃度の抗体と室温条件で５分間インキュベートしてから、抗体－抗原混合溶液にＳ－２３６６を加え、最終濃度を４ｍＭにし、即時にＳｐｅｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）によって吸光度の４０５ｎｍでの連続変化を動的モードで１５秒ごとに３０分間継続的に監視し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。
【0050】
結果は図６及び表４に示すように、抗体濃度の対数値を横軸とし、酵素反応速度を縦軸としてプロットし、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメータ方程式で曲線をフィッティングしてＩＣ５０値を得て、ＩＣ５０は、酵素反応速度を５０％抑制したときの抗体濃度を示し、ＩＣ５０値が小さいほど、抗体の活性に対する抑制が強くなり、１４６２４はＮ１１０Ｄよりも強いＦＸＩａ酵素活性に対する抑制能力を有することを示した。
【0051】
【表4】
【0052】
実施例７ ＦＸＩａを介したＦＩＸのその活性型ＦＩＸａへの変換に対する抗体の抑制作用
最終濃度が２００ｎＭのヒトＦＩＸ、最終濃度が５ｎＭのヒトＦＸＩａ及び１μＭの検出される抗体を緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１％のＢＳＡ）に室温でインキュベートし、それぞれ０、１５、３０、４５及び６０分後、５０μＬの反応溶液をサンプル添加用緩衝液で反応停止させ、サンプルを１０％非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに入れて電気泳動により分離してから、ＰＶＤＦ膜に転写した。マウス抗ヒトＦＩＸ
ＩｇＧ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＷｅｓｔｅｒｎブロッティングを行い、ＦＩＸ及びＦＩＸａの発現レベルを検出した。
最終濃度が２００ｎＭのヒトＦＩＸ、最終濃度が５ｎＭのヒトＦＸＩａ及び１μＭの検出される抗体を緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１％のＢＳＡ）に室温でインキュベートし、それぞれ０、１５、３０、４５及び６０分後、５０μＬの反応溶液をサンプル添加用緩衝液で反応停止させ、サンプルを１０％非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに入れて電気泳動により分離してから、ＰＶＤＦ膜に転写した。マウス抗ヒトＦＩＸ
ＩｇＧ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＷｅｓｔｅｒｎブロッティングを行い、ＦＩＸ及びＦＩＸａの発現レベルを検出した。
【0053】
図７に示すように、ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ照合に比べて、１４６２４及び陽性抗体Ｎ１１０ＤはいずれもＦＸＩを介したＦＩＸａの生成を抑制できた。
【0054】
実施例８ ＦＸＩａに対する抗体の特異的抑制作用
本実施例では、ＥＬＩＳＡを用いて血液凝固因子ＰＫ、ＰＫａ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＦＸａ、ＦＶＩＩａ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎと濃度を段階希釈した抗体の結合能力を分析した。
本実施例では、ＥＬＩＳＡを用いて血液凝固因子ＰＫ、ＰＫａ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＦＸａ、ＦＶＩＩａ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎと濃度を段階希釈した抗体の結合能力を分析した。
【0055】
図８に示すように、検出される抗体及び陽性対照抗体と内因性及び外因性血液凝固経路上の他の血液凝固因子とはいずれも特異的な結合を有さない。
【0056】
実施例９ ニュージーランドウサギの動静脈バイパス血栓の形成に対する抗体の影響
オスのニュージーランドウサギ３０匹を、体重に応じてランダムに５群に分け、それぞれに６匹を入れ、投与量は、それぞれ生理食塩水陰性対照群（ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ）を１０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照群（Ｎ１１０Ｄ）を１ｍｇ／ｋｇ、抗体の低投与量群を１ｍｇ／ｋｇ、抗体の高投与量群を３ｍｇ／ｋｇにし、投与経路は耳静脈への単回静脈内ボーラス注射であった。
オスのニュージーランドウサギ３０匹を、体重に応じてランダムに５群に分け、それぞれに６匹を入れ、投与量は、それぞれ生理食塩水陰性対照群（ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ）を１０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照群（Ｎ１１０Ｄ）を１ｍｇ／ｋｇ、抗体の低投与量群を１ｍｇ／ｋｇ、抗体の高投与量群を３ｍｇ／ｋｇにし、投与経路は耳静脈への単回静脈内ボーラス注射であった。
【0057】
投与前（ｐｒｅ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）及び投与後（ｐｏｓｔ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の３０分間ですべての動物から血液サンプルを収集してプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及び血小板数（ＰＬＴ）を検出し、すべてのニュージーランドウサギの首に動静脈バイパス血流が形成されてから２分後、耳の静脈の同じ位置に３ｍｍの切口を切開し、動物の出血時間と出血量を記録し、投与した３０分後、血栓の湿重量を記録して血栓の形成に対する抑制率を計算した。
【0058】
統計ソフトウェアＳＰＳＳ１３．０を用いてデータを処理し、計量資料を平均値±標準誤差で表し、具体的な分析プロセスは次のとおりである。
Ｌｅｖｅｎｅ’ｓを用いて分散の均一性をチェックし、分散の均一性がある場合（Ｐ＞０．０５）、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて統計して分析し、ＡＮＯＶＡが統計的に有意である場合（Ｐ≦０．０５）、ＬＳＤ ｔｅｓｔ（パラメータ法）をさらに用いて比較して分析し、分散が均一でない場合（Ｐ≦０．０５）、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いてチェックし、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓにより統計的に有意であるとチェックした場合（Ｐ≦０．０５）、さらにＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて平均間のペアワイズ比較を行った。
Ｌｅｖｅｎｅ’ｓを用いて分散の均一性をチェックし、分散の均一性がある場合（Ｐ＞０．０５）、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて統計して分析し、ＡＮＯＶＡが統計的に有意である場合（Ｐ≦０．０５）、ＬＳＤ ｔｅｓｔ（パラメータ法）をさらに用いて比較して分析し、分散が均一でない場合（Ｐ≦０．０５）、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いてチェックし、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓにより統計的に有意であるとチェックした場合（Ｐ≦０．０５）、さらにＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて平均間のペアワイズ比較を行った。
【0059】
図９、図１０、図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）に示すように、抗体の低投与量群と高投与量群はいずれも動静脈シャント血栓の重量（ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｗｅｉｇｈｔ）及び血栓の形成（ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を顕著に抑制できるが、出血時間（ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ）及び出血量（ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）を増加させない。
【0060】
【0061】
要するに、本願の１４６２４モノクローナル抗体は、ＦＸＩａに強い結合を有するが、ＦＸＩに結合せず、ＦＸＩａに高い親和性を有し、１４６２４モノクローナル抗体はａＰＴＴを増加させるが、ＰＴに顕著な影響を与えず、人の血液凝固の内因性経路を抑制するが、外因性経路に影響を与えない作用を有し、ＦＸＩを介したＦＩＸａの生成を抑制でき、ＦＸＩａに対して特異的な抑制作用を有し、内因性及び外因性の血液凝固経路上の他の血液凝固因子への特異的な結合を有せず、動静脈シャント血栓の形成を顕著に抑制し、ａＰＴＴを高めることができ、抗血栓薬物になる潜在的な可能性がある。
【0062】
本願は、上記実施例によって本願の詳細な方法を説明したが、本願は上記詳細な方法に限定されるものではなく、すなわち、本願は上記詳細な方法でしか実施できないことを意味しないことを、出願人はここに声明する。当業者であれば、本願に対するすべての改良、本願の製品の各原料における同等置換及び補助成分の添加、具体的形態の選択等は、いずれも本願の保護範囲と開示範囲に入ることが分かるはずである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】