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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-28
(54)【発明の名称】タンパク質ヒドロゲル、調製方法、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20220318BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021543522
(86)(22)【出願日】2020-02-04
(85)【翻訳文提出日】2021-09-20
(86)【国際出願番号】 IB2020050867
(87)【国際公開番号】W WO2020161613
(87)【国際公開日】2020-08-13
(31)【優先権主張番号】19460008.6
(32)【優先日】2019-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521329800
【氏名又は名称】リアル リサーチ エスピー． ゼット オー．オー．
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＳＰ． Ｚ Ｏ．Ｏ．
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】クレイコウスキー， マルシン プシェミスワウ
(72)【発明者】
【氏名】クレイコウスカ， レナタ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA60
4H045FA83
(57)【要約】
本発明は、低濃度成分：試薬Ａ及び試薬Ｂに基づいて作製される新規のタンパク質ヒドロゲルと、タンパク質ヒドロゲルを調製する方法と、健康細胞及び新生細胞の両方、細胞株及び初代細胞の両方の、二次元及び三次元細胞培養物を含む細胞培養物のためのその使用と、に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゼラチン又はコラーゲンである試薬Ａと、架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂと、溶媒と、を含むタンパク質ヒドロゲルであって、試薬Ａは０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、試薬Ａと試薬Ｂとの比は前記ヒドロゲルの一部分において０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであることを特徴とする、タンパク質ヒドロゲル。
【請求項2】
前記試薬Ａの最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項3】
前記試薬Ａの最終濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇであることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項4】
ゼラチンが、少なくとも２２５のブルーム値、好ましくは３００のブルーム値のゼラチンであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項5】
前記溶媒が、水溶液であり、より好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳの群からであり、最も好ましくはＰＢＳであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項6】
請求項１～５で定義されるような前記タンパク質ヒドロゲルを生成する方法であって、（ａ）ゼラチン又はコラーゲンである適切な量の試薬Ａを水溶液に添加する工程であって、前記水溶液は好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳの群から選択され、最も好ましくはＰＢＳである、工程と、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を加熱して、ゲルを溶解させる工程と、
（ｃ）必要に応じて、前記ゲルを初期に安定化させる工程と、
（ｄ）架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で調製した試薬Ｂを、工程（ｃ）で調製した前記ゲルに添加する工程と、
（ｆ）必要に応じて、得られた前記混合物を混合する工程と、
（ｇ）架橋と
（ｈ）必要に応じて、過剰な試薬Ｂの前記ヒドロゲルを精製する工程と、を含み、
前記試薬Ａが０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、ここで前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであり、前記ゲルが温度０℃～１２℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約５分間である場合に、前記ゲルの前記初期安定化が起こり、工程（ｄ）～工程（ｇ）が約０℃～約１２℃の低温で行われ、工程（ｇ）では、前記架橋の持続時間が少なくとも１２時間であることを特徴とする、方法。
【請求項7】
前記試薬Ａの前記最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記試薬Ａの前記最終濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記初期安定化の持続時間が、３０分～４８時間、最も好ましくは４５分～２４時間であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記架橋の持続時間が、４８時間超、最も好ましくは７２時間超であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｈ）において前記ヒドロゲルの前記精製が行われる場合、水溶液、好ましくは細胞培養のための水溶液、好ましくはＰＢＳですすぐことによって、又は中和試薬Ｂ、好ましくはＬ－リジンを添加することによって行われることを特徴とする、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
細胞培養のための、請求項１～５に定義される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
【請求項13】
三次元細胞培養のための、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
工程（ｃ）における前記初期安定化の前記持続時間が、１０～９０分、好ましくは１５～６０分、最も好ましくは４０～５５分であり、前記低温における前記架橋反応の前記持続時間が６０時間を超え、前記試薬Ａの前記最終濃度が約０．３５～０．５５重量％であり、ここで、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が、０．８７５～１．３７５ｍｇ対０．０２４～０．０３６ｍｇである、血管新生アッセイを実施するための、請求項６に定義される前記方法によって生成される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
【請求項15】
前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が、１～１．２５ｍｇ対０．０２７～０．０３３ｍｇである、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が、１～０．０３ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであり、このような割合は、１ｍｇの量の前記試薬Ａの質量に対して０．０３ｍｇの前記試薬Ｂとなるように前記ヒドロゲルの一部分において維持される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質ヒドロゲルと、その調製方法と、健康細胞及び新生細胞の両方、細胞株及び初代細胞の両方の、二次元及び三次元細胞培養物を含む細胞培養物のためのその使用である、三次元条件におけるヒドロゲルでの遊走及び浸潤アッセイのための使用、血管新生アッセイの実施、及び大動脈発芽（ａｏｒｔｉｃ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）アッセイの実施のための使用と、に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、三次元環境における細胞培養のための多くの異なるタイプの培地が存在する。これらは、一般的に、タンパク質ヒドロゲル、合成ヒドロゲル、足場、懸滴法等のいくつかのタイプに分けることができる。
【0003】
タンパク質ヒドロゲルの利点は、これらが細胞増殖のための生理学的環境に最も近いことである。現在、三次元条件における細胞培養で最も頻繁に使用される材料は、ヒドロゲルであり、その組成は細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）タンパク質で構成されている。とりわけ合成ペプチドから生成された他のヒドロゲルもまた入手可能であるが、これらはあまり一般的には使用されていない。一方で、コラーゲン及びゼラチンは、二次元細胞培養において培養表面をコーティングするために使用される。
【0004】
コラーゲンはまた、三次元培養にも使用される。典型的には、ｐＨ変化で架橋されたヒドロゲルが使用される。低ｐＨでは、コラーゲン、例えばラット尾コラーゲンが溶解され、より中性ｐＨの培養培地がそれに添加された後、コラーゲンがゲル化し、培養物をその上で増殖させることができる。ゼラチンはコラーゲン繊維の部分加水分解の生成物である。入手可能なゼラチン種のうち、２つの塩基性タイプ、つまり酸性タイプ、すなわち加水分解が酸性環境で起こるタイプと、アルカリタイプ、すなわち加水分解がアルカリ性環境で起こるタイプとを同定することができる。ゲル化の強度を決定する値に応じて、異なるブルーム値のゼラチンが同定される。ブルーム値が高いほど、ゲル化の強度が高くなる。
【0005】
現在、三次元細胞培養及び血管新生アッセイを可能にするヒドロゲルが市販されている。血管新生アッセイの実施を可能にする製品のいくつかの例のうちの１つは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（及びその誘導体）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分は、マウス新生物から抽出されたラミニン、ＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカン、エンタクチン、及び増殖因子である、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）肉腫である。米国特許第４８２９０００号は、細胞培養のための組成物、及び生物活性抽出物を生成する方法について開示している。また、Ｏｒｃｉら、「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ ｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第９巻第１０号（１９８５年１０月）から、血管新生アッセイを行うためのコラーゲンの使用が知られているが、このコラーゲンの使用は先行技術では、労働集約的であり、かつ再現性の低い結果を与えるものとして記載されている。基本的な建築材料が、ゼラチン、具体的にはメタクリル化ゼラチン（ＦａｓｔＬｉｎｋ ＧｅｌＭＡ）であるヒドロゲルもまた市販されており、そのようなヒドロゲルの例示的な製造業者はＳｔｅｍｏｒｇａｎ Ｉｎｃ．である。しかしながら、これらのヒドロゲルは、本発明で提案されるゼラチン濃度範囲を有意に超える約１０％の濃度のゼラチンを使用する。その上、ＧｅｌＭＡ中のゼラチンは、ＵＶ照射の影響下においてフリーラジカルを生成する開始剤と架橋される。
【0006】
本発明の目的は、低濃度混合物に基づくヒドロゲルを提供することであり、これは、先行技術から知られている既存の問題を解決し、生産コストを削減し、生産効率を高めながらも、毒性がより低い。使用される成分のために、新規のヒドロゲルは、先行技術から知られているヒドロゲルと比較して有意に高い再現性をもたらす。この再現性は、新規のヒドロゲルの２つの基本的な特徴から生じる。まず、先行技術から知られているヒドロゲルと比較して、新規のヒドロゲルは増殖因子を実質的に含まない。これは次の２つの理由に起因する：第一に、ゼラチン生成技術は増殖因子の生存率を劇的に低下させ、第二に、グルタルアルデヒド（ＧＴＡ）とのゼラチン架橋反応中に、増殖因子の可能な残留量が不活性化される。新規のヒドロゲルの再現性の第２の根拠は、その成分の濃度の再現性である。
【0007】
先行技術では、ＤＯＩＬＬＯＮら、「Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻第２１６９～２１７８頁（２００４年）から、フィブリンを添加したコラーゲンを新生細胞培養物の三次元モデルの成分として使用することが知られている。加えて、Ｙａｍａｄａ及びＥｖｅｎ－Ｒａｍ、「Ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ３Ｄ ｍａｔｒｉｘ」（２００５年）から、ヒドロゲル内に浸潤及び遊走する新生細胞の可能性を試験するためのコラーゲン及びフィブリンに基づく使用である、三次元細胞培養の使用が知られている。
【0008】
先行技術では、ＭＯＮＴＥＳＡＮＯら、「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ ｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第９巻第１０号（１９８５年１０月）から、コラーゲン及びフィブリンに基づく使用であり、血管新生アッセイを行うことを可能にする、三次元内皮細胞培養物の使用もまた知られている。しかしながら、これらのヒドロゲルはＧＴＡを含有しない。
【0009】
ＧＴＡ（グルタルアルデヒド）は、特に、リジンの遊離アミノ基又はポリペプチド鎖のヒドロキシリジンのアミノ酸残基と、アルデヒド基との反応による、コラーゲン材料の非常に効果的な安定化のため、最も頻繁に使用される化学架橋剤の１つである。しかし、細胞培養にあっては、その欠点とは、非常に低い濃度ですら毒性であることである。Ｏｕ及びＹａｎｇ、「Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ（ＧＡ）－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ（２００５年）に開示されているように、４５％ＧＴＡで濡らした後、残留物を除去するためにヒドロゲルを水で洗浄することによって、この問題を解決しようと試みたが、追加のすすぎ工程の後でさえ、使用されたＧＴＡ濃度は非常に高く、開示された方法に従って生成されたヒドロゲルは本発明のヒドロゲルとは異なる品質を有する。
【0010】
対照的に、Ｂｉｇｉら、「Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ｆｉｌｍｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２２巻（２００１年）第７６３～７６８頁は、ＧＴＡ架橋ゼラチンを含有するヒドロゲル組成物が良好な安定性を特徴とすることを示している。０．１％～１％ＧＴＡの範囲で示された結果によれば、架橋の程度は６０％～１００％に増加し、それに応じて熱的特性及び機械的特性は異なり、このため、異なるＧＴＡ濃度を利用してフィルムの物理化学的特性を調節することが可能である。しかしながら、ＧＴＡ濃度は、この様式で調製されたヒドロゲル上での細胞培養を無効とするには充分高い。
【0011】
文献第ＣＮ１０５３１６２８５号は三次元細胞培養のための培地の生成方法を開示しており、この方法は、コラーゲンを酢酸中に溶解し、キトサンを酢酸中に溶解し、それらを混合し、乾燥させ、次いでＧＴＡを添加し、８～１６時間放置して架橋させ、得られたヒドロゲルを精製することを含む。
【0012】
低濃度のＧＴＡによるタンパク質の架橋によって作られるヒドロゲルは、現在、先行技術には存在しない。濃度を低下させると同時に、結合可能なリジンの量に対するＧＴＡの割合を低下させることによって、より良好な物理化学的品質及びより低い毒性のヒドロゲルが得られ、これにより、本発明のヒドロゲルを、健康細胞及び新生細胞の両方の二次元及び三次元細胞培養物のためと、三次元条件におけるヒドロゲルでの遊走及び浸潤アッセイのためと、血管新生アッセイの実施又は大動脈発芽アッセイの実施のためと、に使用することが可能になった。
【0013】
しかしながら、例えば密度、硬度、及び弾性などの正確に選択された品質のヒドロゲルを開発する必要は依然として存在し、このようにして、例えば血管新生アッセイを実施するための試験で広く使用することができよう。本発明では、密度及び硬度パラメータの正確な選択は、ゼラチン又はコラーゲン及びＧＴＡ濃度の修正によって適切に行われる。弾性は、上記２つのパラメータが修正された結果であり、ヒドロゲルの生成方法である。架橋のレベルは最終生成物のパラメータを決定し、本発明者らによって記載された技術のみが、本発明のヒドロゲルのパラメータを得られるほど充分に低いレベルまで濃度を低下させることができる。
【0014】
本発明の別の目的は、血管新生アッセイ（血管新生アッセイ、インビトロ血管新生管腔形成アッセイ、内皮細胞管形成アッセイ）を実施する際に使用するためのヒドロゲルを提供することである。新規のヒドロゲルはまた、他の細胞培養物、例えば、新生細胞培養物、ラボ・オン・チップ（ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）培養物、植物及び細菌細胞培養物、並びに流動培養物にも使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0015】
【特許文献1】米国特許第４８２９０００号
【非特許文献】
【0016】
【非特許文献1】Ｏｒｃｉら、「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ ｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第９巻第１０号（１９８５年１０月）
【非特許文献2】ＤＯＩＬＬＯＮら、「Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻第２１６９～２１７８頁（２００４年）
【非特許文献3】Ｙａｍａｄａ及びＥｖｅｎ－Ｒａｍ、「Ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ３Ｄ ｍａｔｒｉｘ」（２００５年）
【非特許文献4】ＭＯＮＴＥＳＡＮＯら、「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ ｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第９巻第１０号（１９８５年１０月）
【非特許文献5】Ｏｕ及びＹａｎｇ、「Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ（ＧＡ）－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ（２００５年）
【非特許文献6】Ｂｉｇｉら、「Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ｆｉｌｍｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２２巻（２００１年）第７６３～７６８頁
【発明の概要】
【0017】
本発明によって解決される更なる技術的問題は、ＧＴＡとゼラチンとの反応後に残る毒性の排除である。既に残留している本発明で使用されるＧＴＡの量を除去することにより、生成されたヒドロゲルは、最も感受性の高い細胞でさえも増殖させることができる。
加えて、本発明の極めて重要な特徴は、経済的側面である。第一に、ＧＴＡをゼラチンと反応させて、このような低濃度でヒドロゲルを作製することが可能である。その上、本発明で使用される比較的安価な試薬は、コストを有意に削減する一方で、製造の効率及び費用対効果を高め、特許請求される製品をはるかに大規模に機能させることが可能である。
加えて、本発明の極めて重要な特徴は、経済的側面である。第一に、ＧＴＡをゼラチンと反応させて、このような低濃度でヒドロゲルを作製することが可能である。その上、本発明で使用される比較的安価な試薬は、コストを有意に削減する一方で、製造の効率及び費用対効果を高め、特許請求される製品をはるかに大規模に機能させることが可能である。
【0018】
極めて重要な側面は、このような様式で作製されたタンパク質ヒドロゲルが、今日市販されている同様の範囲の用途を有する製品よりも、細胞培養のためのはるかに再現性のある製品であるという事実である。本発明のタンパク質ヒドロゲルは、このクラスの唯一の製品であり、増殖因子を含まず、製品の再現性も有意に向上している。市販の各成分の製造は、それらの中に存在し得る残留増殖因子を不活性化し、その上、この増殖因子はＧＴＡとの反応中に不活性化されるので、増殖因子を実質的に含まないか、又は含まない。本発明のタンパク質ヒドロゲル単独での高い再現性は、市販の成分から合成され、それによってそれらの濃度を最終生成物において非常に正確に選択及び制御することができるという事実に由来する。
【0019】
本発明の主題は、ゼラチン又はコラーゲンである試薬Ａと、架橋剤でありＧＴＡ（グルタルアルデヒド）である試薬Ｂと、溶媒と、を含むタンパク質ヒドロゲルであって、試薬Ａは０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在することを特徴とし、試薬Ａと試薬Ｂとの比は該ヒドロゲルの一部分において０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇである、タンパク質ヒドロゲルである。
【0020】
好ましくは、試薬Ａの最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇである。
【0021】
特に好ましくは、試薬Ａの最終濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇである。
【0022】
好ましくは、本発明のタンパク質ヒドロゲルは、ゼラチンが、少なくとも２２５のブルーム値、好ましくは３００のブルーム値のゼラチンであることを特徴とする。
【0023】
好ましくは、本発明のタンパク質ヒドロゲルは、溶媒が、水溶液であり、より好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳの群から選択され、最も好ましくはＰＢＳであることを特徴とする。
【0024】
本発明の別の主題は、本発明のタンパク質ヒドロゲルを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳの群から選択され、最も好ましくはＰＢＳである、ゼラチン又はコラーゲンである適切な量の試薬Ａを水溶液に添加することと、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を加熱して、ゲルを溶解させることと、
（ｃ）必要に応じて、該ゲルを初期に安定化させることと、
（ｄ）架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製することと、
（ｅ）工程（ｄ）で調製した試薬Ｂを、工程（ｃ）で調製した該ゲルに添加することと、
（ｆ）必要に応じて、得られた該混合物を混合することと、
（ｇ）架橋と
（ｈ）必要に応じて、過剰な試薬Ｂの該ヒドロゲルを精製することと、を含み、
試薬Ａが０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、ここで該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであって、該ゲルが温度０℃～１２℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約５分間である場合に、該ゲルの該初期安定化が起こり、工程（ｄ）～工程（ｇ）が約０℃～約１２℃の低温で行われ、工程（ｇ）では該架橋の持続時間が少なくとも１２時間であることを特徴とする。
（ａ）好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳの群から選択され、最も好ましくはＰＢＳである、ゼラチン又はコラーゲンである適切な量の試薬Ａを水溶液に添加することと、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を加熱して、ゲルを溶解させることと、
（ｃ）必要に応じて、該ゲルを初期に安定化させることと、
（ｄ）架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製することと、
（ｅ）工程（ｄ）で調製した試薬Ｂを、工程（ｃ）で調製した該ゲルに添加することと、
（ｆ）必要に応じて、得られた該混合物を混合することと、
（ｇ）架橋と
（ｈ）必要に応じて、過剰な試薬Ｂの該ヒドロゲルを精製することと、を含み、
試薬Ａが０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、ここで該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであって、該ゲルが温度０℃～１２℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約５分間である場合に、該ゲルの該初期安定化が起こり、工程（ｄ）～工程（ｇ）が約０℃～約１２℃の低温で行われ、工程（ｇ）では該架橋の持続時間が少なくとも１２時間であることを特徴とする。
【0025】
工程（ｃ）で調製したゲルへの工程（ｄ）で調製した試薬Ｂの添加は、試薬Ｂをゲルに添加するか、又は試薬Ｂを既にゲル化したゲルに添加することによって行うことができる。
【0026】
好ましくは、試薬Ａの最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇである。
【0027】
特に好ましくは、試薬Ａの濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、該ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇである。
【0028】
好ましくは、初期安定化の持続時間が、３０分～４８時間、最も好ましくは４５分～２４時間である。
【0029】
好ましくは、架橋の持続時間は４８時間超、最も好ましくは７２時間超である。
【0030】
工程（ｈ）において該ヒドロゲルの精製が行われる場合、水溶液、好ましくは細胞培養のための水溶液、好ましくはＰＢＳですすぐことによって、又は中和試薬Ｂ、好ましくはＬ－リジンを添加することによって行われることが好ましい。
【0031】
本方法の上記工程（ｈ）における過剰の試薬Ｂのヒドロゲルの任意の精製は、－ＣＨＯ基と反応し、－ＣＨＯ基を不活性化することができるあらゆる物質によって行われる。そのような物質の例はＬ－リジンであるが、リジンの非結合側鎖－ＮＨ２を含むタンパク質でもある。この物質は毒性架橋物質を中和するために使用される、例えば、２つの－ＣＨＯ基を含むＧＴＡである。この物質は、ヒドロゲルが生成されるときに添加される－ＣＨＯ基のモル濃度の乗算である濃度で使用される。例えば、３０μＬの０．１％ＧＴＡを使用する場合、約０．６×１０－３モルの－ＣＨＯ基がそのような体積中に存在する。１０×（１０倍）濃度のＬ－リジンの使用は、ヒドロゲルを生成するために－ＣＨＯ基を添加した場合よりも１０倍モルが多いＬ－リジンを添加することを意味する。Ｌ－リジンは側鎖に－ＮＨ２基を１つのみ含み、該基は－ＣＨＯ基に結合することができ、そして典型的には、ヒドロゲルの初期体積に等しい体積で添加される。
【0032】
本発明の別の主題は、細胞培養、好ましくは三次元細胞培養のための、本発明のタンパク質ヒドロゲルの使用である。
【0033】
本発明の更に別の主題は、工程（ｃ）における初期安定化の持続時間が、１０～９０分、好ましくは１５～６０分、最も好ましくは４０～５５分であり、架橋反応の持続時間が６０時間を超え、試薬Ａの最終濃度が約０．３５～０．５５重量％であり、ここで、このような割合は、０．８７５～１．３７５ｍｇの範囲である試薬Ａの質量に対して０．０２４ｍｇ～０．０３６ｍｇの試薬Ｂとなるようにヒドロゲルの一部分において維持される、血管新生アッセイを実施するための本発明の方法によって生成されたタンパク質ヒドロゲルにかかる使用である。
【0034】
好ましくは、このような割合は、１ｍｇ～１．２５ｍｇの範囲の試薬Ａの質量に対して、０．０２７ｍｇ～０．０３３ｍｇの試薬Ｂとなるようにヒドロゲルの一部分において維持される。
【0035】
特に好ましくは、このような割合は、１ｍｇの量の試薬Ａの質量に対して、０．０３ｍｇの試薬Ｂとなるように、ヒドロゲルの一部分において維持される。
【0036】
ＧＴＡが０．１５％～１．５％の濃度のゼラチン（すなわち、それぞれ２５０μＬ又は３００μＬまで）に添加されているＧＴＡの濃度を、０．１５ｍｇ（すなわち、３０μＬで０．５％又は３００μＬで０．０５％）未満の値に低下させることは、その毒性を低下させる（その後除去がより容易になる）のみならず、最も重要なことは、ヒドロゲルの弾性及び粘度を修正することを可能とし、したがって細胞増殖のパラメータに影響を及ぼし、完全に新しい機会を提供することである。
【0037】
本明細書で使用される用語は当技術分野で一般的に受け入れられている意味を有する。
【0038】
用語「低温」とは、約０℃～約１２℃、好ましくは約０℃～約８℃、特に好ましくは氷上の範囲内の温度を意味し、「冷蔵庫温度」という表現と互換的に使用することができる。
【0039】
用語「約」とは、所与の数値が定義された値を有するが、しかしながら、１０％の誤差が生じる可能性があることを示すことを意図する。
【0040】
用語「水溶液」とは、好ましくは細胞培養用の水溶液を意味し、好ましくはｄＨ２Ｏ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、の群から選択され、特に好ましくはＰＢＳを意味する。
【0041】
用語「架橋剤」、「試薬Ｂ」とは、２つ以上のタンパク質鎖を連結する機能を果たす化学化合物を意味する。タンパク質鎖はタンパク質の末端のアミノ酸側鎖又はアミノ酸によって連結されている。タンパク質の連結は、タンパク質鎖が連結された結果として、ヒドロゲルとも呼ばれるタンパク質のネットワークが形成される場合、架橋と呼ばれる。例示的なタンパク質架橋機構が列挙されている、Ｓｕｎｇら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ａｓ ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９年）で示されるように、タンパク質架橋は、例として、－ＮＨ２又は－ＣＯＯＨ官能基によって起こり得る。Ｂｉｇｉらに開示されているように、架橋剤は、好ましくはペンタン－１，５－ジーアル（グルタルアルデヒド、ＧＴＡ）である。ＧＴＡは、タンパク質間で－ＮＨ２基を共有結合することによって、更には１つのタンパク質内のそれらの基を結合することによって、ゼラチン又はコラーゲンを架橋し、したがってそれらを安定化する。
【0042】
用語「タンパク質ヒドロゲル部分／ウェル」とは、特許請求の範囲に記載された割合を重視して作製された、例示的な部分を意味する。「部分」の２つの例を使用し、２５０μＬのゲルに３０μＬのＧＴＡを添加した（ゲル中に、その結果、目標体積は２８０μＬのヒドロゲル）。部分の別の例は３００μＬのゲル部分であり、その表面に３００μＬのＧＴＡが添加される。ここでは、ゲルの表面に添加されたＧＴＡはゲル自体とは混合せず、したがって最終的に得られるヒドロゲルの体積は増加しないので、該部分は３００μＬのヒドロゲルに限定される。適用された試薬Ｂはこのような様式でゲル中に拡散し、そこで架橋反応が起こり、残りの過剰分がヒドロゲルの表面から吸引によって除去される。本発明の目的のために、上で記載され、実施形態で開示されたヒドロゲル部分の体積を提示した。しかしながら、この保護はまた、より少量及びより多量の試薬Ａ及びＢも対象とし、本明細書に記載されるような試薬Ａと試薬Ｂの割合が重視される。
【0043】
「試薬Ａ」とは、ゼラチン又はコラーゲンを意味するが、ゼラチン又はコラーゲンと同じ又は類似のアミノ酸配列の任意の他のタンパク質でもあって、生物から得られるタンパク質、及び組換えタンパク質、すなわち遺伝子組換え体での産生によって得られるタンパク質も意味する。
【0044】
本発明の主題は実施形態及び図面に示されている。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【発明を実施するための形態】
【0046】
実施形態を以下に示すが、これらは本発明の例示にすぎず、限定する性質のものではない。
【0047】
実施例Ｉ－タンパク質ヒドロゲルの生成
０．４％の濃度の６０個のヒドロゲル部分を生成するために、０．０６ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．９４ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングし、冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫で４５分間安定化させた。残り１２個のゲル部分は未使用のままであった。０．０３ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫で３０分間冷却した。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、３０μＬのＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約０．０３ｍｇのＧＴＡが存在していた。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。その後、得られたヒドロゲルを、Ｌ－リジンを添加することによるヒドロゲル中和によって、過剰ＧＴＡから精製した。ＰＢＳ中に１０倍濃度で溶解したＬ－リジンを使用した。リジンをヒドロゲルと２４時間インキュベートさせた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
０．４％の濃度の６０個のヒドロゲル部分を生成するために、０．０６ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．９４ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングし、冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫で４５分間安定化させた。残り１２個のゲル部分は未使用のままであった。０．０３ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫で３０分間冷却した。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、３０μＬのＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約０．０３ｍｇのＧＴＡが存在していた。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。その後、得られたヒドロゲルを、Ｌ－リジンを添加することによるヒドロゲル中和によって、過剰ＧＴＡから精製した。ＰＢＳ中に１０倍濃度で溶解したＬ－リジンを使用した。リジンをヒドロゲルと２４時間インキュベートさせた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
【0048】
実施例ＩＩ－タンパク質ヒドロゲルの生成
０．７％の濃度の５０個のヒドロゲル部分を生成するために、０．１０５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．８９５ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００２１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。ゲルを４８ウェルプレートに３００μＬ／ウェルでピペッティングした。残り２個のゲル部分は未使用のままであった。この様式で調製したプレートを冷蔵庫に２時間置いた。０．０６ｍｇのＧＴＡを回収し、３００μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．０２％ＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫で最低でも３０分間冷却した。ゲル化したゲルの表面に３００μＬのＧＴＡ溶液を静かに注ぎ、冷蔵庫に２４時間置いた。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約０．０６ｍｇのＧＴＡが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
０．７％の濃度の５０個のヒドロゲル部分を生成するために、０．１０５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．８９５ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００２１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。ゲルを４８ウェルプレートに３００μＬ／ウェルでピペッティングした。残り２個のゲル部分は未使用のままであった。この様式で調製したプレートを冷蔵庫に２時間置いた。０．０６ｍｇのＧＴＡを回収し、３００μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．０２％ＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫で最低でも３０分間冷却した。ゲル化したゲルの表面に３００μＬのＧＴＡ溶液を静かに注ぎ、冷蔵庫に２４時間置いた。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各ヒドロゲル部分には約０．０６ｍｇのＧＴＡが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
【0049】
実施例ＩＩＩ
実施例Ｉで調製したヒドロゲル上に、内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を４８ウェルプレートの１５，０００細胞／ウェルの密度で播種した（特定の細胞株バッチ及び細胞分裂数に応じて、播種細胞の密度は４８ウェルプレートの５，０００細胞／ウェルから５０，０００細胞／ウェルまで変動し得る）。内皮細胞をＥＧＭ（商標）－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）Ｌｏｎｚａ培地で培養した。実験結果は、内皮細胞によってヒドロゲルの表面に形成された管腔であった（図１）。
実施例Ｉで調製したヒドロゲル上に、内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を４８ウェルプレートの１５，０００細胞／ウェルの密度で播種した（特定の細胞株バッチ及び細胞分裂数に応じて、播種細胞の密度は４８ウェルプレートの５，０００細胞／ウェルから５０，０００細胞／ウェルまで変動し得る）。内皮細胞をＥＧＭ（商標）－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）Ｌｏｎｚａ培地で培養した。実験結果は、内皮細胞によってヒドロゲルの表面に形成された管腔であった（図１）。
【0050】
実施例ＩＶ
実施例ＩＩで調製したヒドロゲル上に、新生物４Ｔ１（マウス乳がん）細胞を、４８ウェルプレートの１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。実験結果は、新生細胞によって形成されたスフェロイドであった（図２）。
実施例ＩＩで調製したヒドロゲル上に、新生物４Ｔ１（マウス乳がん）細胞を、４８ウェルプレートの１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。実験結果は、新生細胞によって形成されたスフェロイドであった（図２）。
【0051】
実施例Ｖ（先行技術の濃度を用いた比較例）
ヒドロゲルを先行技術（Ｂｉｇｉら）に開示されている方法に従ってヒドロゲルを生成するアッセイを実施した。その目的のために、５％Ａ型ブルーム３００ゼラチン（質量）、及び表１～表８に記載された質量濃度のＧＴＡの組成物のヒドロゲルを調製した。表１、表２、表３、及び表４に示した実験では、タンパク質ヒドロゲルを２４時間乾燥させた（この乾燥はＢｉｇｉらの刊行物の記載に従った）が、一方で表５、表６、表７、及び表８では、調製したタンパク質ヒドロゲルを２４時間架橋させた。ここで、Ａとはヒドロゲルをすすがなかったことを意味し、ＢとはｄＨ２Ｏで５回すすいだことを意味し、ＣとはＰＢＳで５回すすいだことを意味する。すすぎ工程は引用文献に記載されていない。実験後、得られた細胞を評価した：０－扁平細胞なし；おそらく全て死亡；１－扁平細胞が少数存在；２－扁平細胞が多数存在。以下の表は得られた結果を示す。
ヒドロゲルを先行技術（Ｂｉｇｉら）に開示されている方法に従ってヒドロゲルを生成するアッセイを実施した。その目的のために、５％Ａ型ブルーム３００ゼラチン（質量）、及び表１～表８に記載された質量濃度のＧＴＡの組成物のヒドロゲルを調製した。表１、表２、表３、及び表４に示した実験では、タンパク質ヒドロゲルを２４時間乾燥させた（この乾燥はＢｉｇｉらの刊行物の記載に従った）が、一方で表５、表６、表７、及び表８では、調製したタンパク質ヒドロゲルを２４時間架橋させた。ここで、Ａとはヒドロゲルをすすがなかったことを意味し、ＢとはｄＨ２Ｏで５回すすいだことを意味し、ＣとはＰＢＳで５回すすいだことを意味する。すすぎ工程は引用文献に記載されていない。実験後、得られた細胞を評価した：０－扁平細胞なし；おそらく全て死亡；１－扁平細胞が少数存在；２－扁平細胞が多数存在。以下の表は得られた結果を示す。
【0052】
播種細胞株：Ｐａｎｃ＿０２
【0053】
播種細胞株：ＨＵＶＥＣ
【0054】
上記のデータは、先行技術によるより高濃度のヒドロゲル上では、細胞が増殖しないか又は扁平には増殖しないことを示している。ＨＵＶＥＣ細胞株の場合、血管の形成、すなわち血管新生アッセイの実施が妨げられる。Ｐａｎｃ＿０２細胞株の場合、これは、架橋剤が適切に除去／中和されている場合に細胞は増殖することができるが、この増殖は、標準的な二次元培養に典型的であるように、細胞が平坦となるように、硬質培地上で行われ得ることを意味する。
【0055】
実施例ＶＩ－ｄＨ２Ｏ溶媒によるタンパク質ヒドロゲルの生成
０．３％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各３００μＬ）を生成するために、０．０４５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．９５５ｍＬのｄＨ２Ｏ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．０００９ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、３００μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で２３時間安定化させた。０．０１０５ｍｇのＧＴＡを回収し、３００μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．００３５％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、安定化し、ゲル化したゲルの表面に、冷却したＧＴＡ溶液３００μＬを添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０１０５ｍｇのＧＴＡが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
０．３％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各３００μＬ）を生成するために、０．０４５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１４．９５５ｍＬのｄＨ２Ｏ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．０００９ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、３００μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で２３時間安定化させた。０．０１０５ｍｇのＧＴＡを回収し、３００μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．００３５％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、安定化し、ゲル化したゲルの表面に、冷却したＧＴＡ溶液３００μＬを添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０１０５ｍｇのＧＴＡが存在していた。その後、得られたヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
【0056】
実施例ＶＩＩ－毒性ＧＴＡの残留物を除去する工程を実施する必要のない細胞培養物のためのヒドロゲル生成
０．６％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０７５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１２．４２５ｍＬのＰＢＳ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１５ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で６０分間安定化させた。０．０１８ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．０６％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０１８ｍｇのＧＴＡが存在していた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
０．６％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０７５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１２．４２５ｍＬのＰＢＳ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１５ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で６０分間安定化させた。０．０１８ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．０６％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０１８ｍｇのＧＴＡが存在していた。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
【0057】
実施例ＶＩＩＩ－Ｂ型ゼラチンを有するタンパク質ヒドロゲルの生成
０．４％の濃度の６０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０６ｇのＢ型ゼラチンを秤量し、１４．９４０ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。１２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で５０分間安定化させた。０．０４５ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１５％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、部分的に安定化させたが、ゲル化していないゲルに、３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各タンパク質ヒドロゲル部分には約０．０４５ｍｇのＧＴＡが存在していた。次いで、ＧＴＡを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。その後、得られたタンパク質ヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
０．４％の濃度の６０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０６ｇのＢ型ゼラチンを秤量し、１４．９４０ｍＬのＰＢＳ溶液中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。１２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で５０分間安定化させた。０．０４５ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１５％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し、部分的に安定化させたが、ゲル化していないゲルに、３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。各タンパク質ヒドロゲル部分には約０．０４５ｍｇのＧＴＡが存在していた。次いで、ＧＴＡを注いだゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。その後、得られたタンパク質ヒドロゲルを、ＰＢＳで３回すすぐことによって過剰ＧＴＡから精製した。この様式で調製したヒドロゲルは更なる使用の準備ができている。
【0058】
実施例ＩＸ－血管新生の再現性
０．４％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１２．４５ｍＬのＰＢＳ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で４０分間安定化させた。０．０３ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０３ｍｇのＧＴＡが存在していた。この様式で調製したタンパク質ヒドロゲルをＰＢＳで３回すすいだ。タンパク質ヒドロゲルを１０個の別々の生産バッチで調製し、毎回４度の複製を行った。
０．４％の濃度の５０個のヒドロゲル部分（各２５０μＬ）を生成するために、０．０５ｇのＡ型ブルーム３００ゼラチンを秤量し、１２．４５ｍＬのＰＢＳ中に溶解した。各ヒドロゲル部分は０．００１ｇのゼラチンを含有していた。溶液を３７℃で３０分間加熱してゲルを溶解し、次いで濾過によって滅菌した。この様式で調製したゲルを、２５０μＬ／ウェルで４８ウェルプレートにピペッティングした。２個の部分は廃棄するためピペッティングされずに残った。４８個のゲル部分を有する４８ウェルプレートを冷蔵庫に入れて冷却し、次いで冷蔵庫温度で４０分間安定化させた。０．０３ｍｇのＧＴＡを回収し、３０μＬのｄＨ２Ｏに補充することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１％（質量）のＧＴＡ溶液を先に調製し、冷蔵庫内で最低でも３０分間放置することによって、その温度を冷蔵庫温度まで下げた。冷却し安定化させたが、ゲル化していないゲルに、各３０μＬの冷却ＧＴＡ溶液を添加した。ＧＴＡの添加は氷上で行った。次いで、ＧＴＡを添加したゲルを有するプレートを冷蔵庫に７２時間入れた。各ヒドロゲル部分には約０．０３ｍｇのＧＴＡが存在していた。この様式で調製したタンパク質ヒドロゲルをＰＢＳで３回すすいだ。タンパク質ヒドロゲルを１０個の別々の生産バッチで調製し、毎回４度の複製を行った。
【0059】
このような様式で調製したタンパク質ヒドロゲル上に細胞を播種し、１０時間のインキュベーション後、顕微鏡下において細胞を観察した。以下の表９はアッセイ結果を示す。
Ａ－細胞は良好な形の管腔を形成する
Ｂ－細胞が管腔を形成し始める
Ａ－細胞は良好な形の管腔を形成する
Ｂ－細胞が管腔を形成し始める
【0060】
実験は、本開示の主題である方法の特徴の１つは結果の再現性が高いことを示している。全４０回の試行において、血管新生アッセイは陽性の結果を返し、わずか２回だけ時間が遅れたが、これは統計誤差に起因し得る。上記の結果は、競合製品と比較して、血管新生アッセイの有効性の有意な改善を表す。
【0061】
本発明の主題であるタンパク質ヒドロゲルは、正確に選択されたパラメータ、例えばヒドロゲルの密度又は硬度を有する培地を得ることを可能にする。これらのパラメータは、細胞が自然に増殖する生理学的条件の再現に影響を及ぼす。これは次いで、ヒドロゲル内で遊走、スフェロイドを形成する能力等といったそれらの挙動に影響を及ぼす。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【手続補正書】
【提出日】2021-04-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゼラチンである試薬Ａと、架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂと、溶媒と、を含むタンパク質ヒドロゲルであって、試薬Ａは０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、試薬Ａと試薬Ｂとの比は前記ヒドロゲルの一部分において０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであることを特徴とし、前記溶媒がｄＨ
２
ＯまたはＰＢＳである、タンパク質ヒドロゲル。
【請求項2】
前記試薬Ａの最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項3】
前記試薬Ａの最終濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における試薬Ａと試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇであることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項4】
ゼラチンが、少なくとも２２５のブルーム値、好ましくは３００のブルーム値のゼラチンであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質ヒドロゲル。
【請求項5】
請求項１～４で定義されるような前記タンパク質ヒドロゲルを生成する方法であって、（ａ）ゼラチンである適切な量の試薬Ａを水溶液に添加する工程であって、前記水溶液はｄＨ２ＯまたはＰＢＳから選択される、工程と、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を加熱して、ゲルを溶解させる工程と、
（ｃ）前記ゲルを初期に安定化させる工程と、
（ｄ）架橋剤でありＧＴＡである試薬Ｂを水溶液中に溶解し、冷却することによって、調製する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で調製した試薬Ｂを、工程（ｃ）で調製した前記ゲルに添加する工程と、
（ｆ）必要に応じて、得られた前記混合物を混合する工程と、
（ｇ）架橋と
（ｈ）必要に応じて、過剰な試薬Ｂの前記ヒドロゲルを精製する工程と、を含み、
前記試薬Ａが０．１５重量％～１．５重量％の最終濃度で存在し、ここで前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．３７５～４．５ｍｇ対０．０１～０．１５ｍｇであり、前記ゲルが温度０℃～１２℃に達し、かつその持続時間が少なくとも約５分間である場合に、前記ゲルの前記初期安定化が起こり、工程（ｄ）～工程（ｇ）が約０℃～約１２℃の低温で行われ、工程（ｇ）では、前記架橋の持続時間が少なくとも１２時間であることを特徴とする、方法。
【請求項6】
前記試薬Ａの前記最終濃度が０．２５重量％～１重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．６２５～３ｍｇ対０．０１３５～０．０７５ｍｇであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記試薬Ａの前記最終濃度が０．３重量％～０．８重量％であり、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が０．７５～２．４ｍｇ対０．０２１～０．０４５ｍｇであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記初期安定化の持続時間が、３０分～４８時間、最も好ましくは４５分～２４時間であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記架橋の持続時間が、４８時間超、最も好ましくは７２時間超であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｈ）において前記ヒドロゲルの前記精製が行われる場合、水溶液、好ましくは細胞培養のための水溶液、好ましくはＰＢＳですすぐことによって、又は中和試薬Ｂ、好ましくはＬ－リジンを添加することによって行われることを特徴とする、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
細胞培養のための、請求項１～４に定義される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
【請求項12】
三次元細胞培養のための、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
工程（ｃ）における前記初期安定化の前記持続時間が、１０～９０分、好ましくは１５～６０分、最も好ましくは４０～５５分であり、前記低温における前記架橋反応の前記持続時間が６０時間を超え、前記試薬Ａの前記最終濃度が約０．３５～０．５５重量％であり、ここで、前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が、０．８７５～１．３７５ｍｇ対０．０２４～０．０３６ｍｇである、血管新生アッセイを実施するための、請求項５に定義される前記方法によって生成される前記タンパク質ヒドロゲルの使用。
【請求項14】
前記ヒドロゲルの一部分における前記試薬Ａと前記試薬Ｂとの比が、１～１．２５ｍｇ対０．０２７～０．０３３ｍｇである、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
割合は、１ｍｇの量の前記試薬Ａの質量に対して０．０３ｍｇの前記試薬Ｂとなるように前記ヒドロゲルの一部分において維持される、請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】