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特表2022-520063組み合わせ遺伝子修飾を有する操作された細胞の産生および追跡
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-28
(54)【発明の名称】組み合わせ遺伝子修飾を有する操作された細胞の産生および追跡
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220318BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220318BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220318BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220318BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220318BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220318BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12Q1/6869 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021546268
(86)(22)【出願日】2020-02-07
(85)【翻訳文提出日】2021-09-30
(86)【国際出願番号】 US2020017315
(87)【国際公開番号】W WO2020163779
(87)【国際公開日】2020-08-13
(31)【優先権主張番号】62/803,242
(32)【優先日】2019-02-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(71)【出願人】
【識別番号】514256885
【氏名又は名称】ガバメント・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・オブ・コマース
【氏名又は名称原語表記】ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ， ＡＳ ＲＥＰＲＥＳＥＮＴＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＣＯＭＭＥＲＣＥ
【住所又は居所原語表記】Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １００ Ｂｕｒｅａｕ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｔｏｐ ２２００， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ ２０８９９－２２００， Ｕ．Ｓ．Ａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サリット，マーク
(72)【発明者】
【氏名】シュタインメッツ，ラルス・エム
(72)【発明者】
【氏名】セント・オンジェ，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ジャステン・ディー
(72)【発明者】
【氏名】ロイ，ケビン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QX01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
遺伝子バリアント（設計もしくはランダム）または構築物（遺伝子もしくはそうでなければ任意のＤＮＡ）の組み合わせを細胞の集団に導入することによって、遺伝子修飾された細胞を作製するための、およびバーコード遺伝子座と呼ばれる一般的な遺伝子座（染色体またはプラスミド）におけるバーコードのアレイを順次に構築することによって各バリアントの組み合わせを追跡するための方法が、本明細書に記載される。また、そのような方法で作製される細胞も記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の遺伝子操作された細胞を産生するための方法であって、前記方法が、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤および第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された前記第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を含む、形成することと、
（ｂ）前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤および第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された前記第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を含む、形成することと、を含み、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生する、方法。
【請求項2】
複数の遺伝子操作された細胞を産生するための方法であって、前記方法が、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第１の固有の遺伝子修飾を含む第１の複数の遺伝子編集された細胞を産生することと、
（ｂ）前記第１の複数の遺伝子編集された細胞に、第１の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第１の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された前記第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および前記第１の固有の遺伝子修飾を含む、形成することと、
（ｃ）前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第２の固有の遺伝子修飾を含む第２の複数の遺伝子編集された細胞を産生することと、
（ｄ）前記第２の複数の遺伝子編集された細胞に、第２の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第２の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々バーコード遺伝子座に挿入されるようにし、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された前記第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および前記第２の固有の遺伝子修飾を含む、形成することと、を含み、
それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生する、方法。
【請求項3】
ステップ（ｂ）を１回以上繰り返すことをさらに含み、ステップ（ｂ）の各繰り返しが、同じまたは異なる複数の組換えポリヌクレオチドを用い、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（ｃ）および（ｄ）を１回以上繰り返すことをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）の各繰り返しが、同じまたは異なる複数の組換えポリヌクレオチドを用い、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における前記第１の固有の遺伝子修飾に関連する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分が、前記第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の前記第１の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における前記第２の固有の遺伝子修飾に関連する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分が、前記第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の前記第２の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記バーコード遺伝子座を配列決定することによって、前記複数の遺伝子操作された細胞の各々における遺伝子変異を同定することをさらに含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードに隣接して付加される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの上流に付加される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの下流に付加される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
各固有のポリヌクレオチドバーコードには、組換えポリヌクレオチド上で、右相同性アームおよび／または左相同性アームが隣接している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
各第１の固有のポリヌクレオチドバーコードには、前記第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、前記第１の右相同性アーム、第２の右相同性アーム、および左相同性アームが隣接し、前記第１の右相同性アームおよび前記左相同性アームが、前記バーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
各第２の固有のポリヌクレオチドバーコードには、前記第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、前記第２の右相同性アーム、前記左相同性アーム、および任意に第３の右相同性アームが隣接し、前記第２の右相同性アームおよび前記左相同性アームが、前記バーコード遺伝子座への前記第１の固有のポリヌクレオチドバーコードの統合後の前記バーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドが、前記左相同性アームと前記第２の右相同性アームとの間に第１のマーカーポリヌクレオチドを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドが、前記左相同性アームと前記第３の右相同性アームとの間に第２のマーカーポリヌクレオチドを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記マーカーポリヌクレオチドが、前記固有のポリヌクレオチドバーコードと共に前記バーコード遺伝子座に組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
各固有のポリヌクレオチドが、相同組換えによって前記バーコード遺伝子座に挿入される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
各固有のポリヌクレオチドが、非相同末端結合によって前記バーコード遺伝子座に挿入される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
各固有のポリヌクレオチドが、インテグラーゼを使用して前記バーコード遺伝子座に挿入される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
各組換えポリヌクレオチドが、マーカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記マーカーポリヌクレオチドが、前記固有のポリヌクレオチドバーコードと共に前記バーコード遺伝子座に組み込まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記マーカーポリヌクレオチドの存在に関して細胞を選択することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
前記マーカーポリヌクレオチドの非存在に関して細胞を選択することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項26】
前記第１の複数の組換えポリヌクレオチド中の前記マーカーポリヌクレオチドが、前記第２の複数の組換えポリヌクレオチド中の前記マーカーポリヌクレオチドとは異なる、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記第１の遺伝子編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導ニッカーゼ、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記第２の遺伝子編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導ニッカーゼ、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記第１の遺伝子編集剤および前記第２の遺伝子編集剤が同じである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記第１の遺伝子編集剤および前記第２の遺伝子編集剤が異なる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記バーコード遺伝子座が配列決定される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
少なくとも１つの遺伝子修飾が、配列決定によって決定される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
固有のポリヌクレオチドバーコードを用いて、少なくとも１つの遺伝子修飾を同定することをさらに含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
（ｉ）各細胞の前記バーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することであって、前記バーコード遺伝子座が、前記新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入する前に、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードをすでに含む、挿入することと、（ｉｉ）前記新しい固有のポリヌクレオチドバーコードが前記少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、前記バーコード遺伝子座を配列決定することとをさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
（ｉｉｉ）各細胞の前記バーコード遺伝子座から、前記少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ）を繰り返し、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生することをさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第１および／または第２の遺伝子編集剤が、メガヌクレアーゼである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記メガヌクレアーゼが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、またはＩ－Ｄｍｏである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記第１および／または第２の遺伝子編集剤が、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導ニッカーゼである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導ニッカーゼが、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系のものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
各組換えポリヌクレオチドが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする第３のポリヌクレオチドヌクレオチドをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項44】
各組換えポリヌクレオチドが、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導ニッカーゼが、前記細胞の前記ゲノムに統合されたベクターまたは第２の核酸配列によって提供される、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
各組換えポリヌクレオチドが、ベクターによって提供される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記ベクターが、高コピー数ベクターである、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項49】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導ニッカーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼである、請求項２７～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼが、Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＦｎＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（例えば、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１）、Ｍａｄ７、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＬｓｈＣ２ｃ２、Ｃａｓ１４、ｄＳｐＣａｓ９－ＦｏｋＩ、スプリット－ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ニッカーゼ、またはそれらのバリアントである、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記細胞を、前記組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸配列と接触させることをさらに含み、前記ガイドＲＮＡが、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体が前記組換えポリヌクレオチドを切断するようにする、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記組換えポリヌクレオチドが、プラスミドベクターであり、前記ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体が、前記プラスミドベクターを線形化する、請求項５２記載の方法。
【請求項54】
前記細胞を、前記組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡをコードする第２の核酸配列と接触させることをさらに含み、前記ガイドＲＮＡが、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体が前記バーコード遺伝子座を切断するようにする、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記組換えポリヌクレオチドが、前記ガイドＲＮＡを含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記ガイドＲＮＡが、前記バーコードとは異なる組換えポリヌクレオチド上にある、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記バーコード遺伝子座が、染色体バーコード遺伝子座である、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記遺伝子修飾が、設計された遺伝子修飾である、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記ベクターが、前記細胞から除去される、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記ベクターが、前記ヌクレアーゼによって切断される、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記ベクターが、前記細胞から受動的に失われる、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法によって作製された、複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞。
【請求項63】
請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法によって作製された、遺伝子編集およびバーコード化された細胞。
【請求項64】
複数のバーコード化された細胞を産生するための方法であって、（ａ）複数の細胞を、第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記第１の複数の細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第１の複数のバーコード化された細胞を形成することと、
（ｂ）前記第１の複数のバーコード化された細胞を、第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された複数の細胞の各々の前記バーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することと、を含み、
それによって複数のバーコード化されたた細胞を産生する、方法。
【請求項65】
ステップ（ｂ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、各細胞内の遺伝子修飾に関連している、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項67】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードに隣接して付加される、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの上流に付加される、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
各固有のポリヌクレオチドバーコードが、前記バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの下流に付加される、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
各固有のポリヌクレオチドバーコードには、組換えポリヌクレオチド上で、右相同性アームおよび／または左相同性アームが隣接している、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
各固有のポリヌクレオチドが、相同組換えによって前記バーコード遺伝子座に挿入される、請求項６４～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
各組換えポリヌクレオチドが、マーカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記マーカーポリヌクレオチドが、前記固有のポリヌクレオチドバーコードと共に前記バーコード遺伝子座に組み込まれる、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
任意のステップ後の前記マーカーの存在に関して細胞を選択することをさらに含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項75】
前記第１の複数の組換えポリヌクレオチド中の前記マーカーが、前記第２の複数の組換えポリヌクレオチド中の前記マーカーとは異なる、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
（ｉ）各細胞の前記バーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することであって、前記バーコード遺伝子座が、前記新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入する前に、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードをすでに含む、挿入することと、（ｉｉ）前記新しい固有のポリヌクレオチドバーコードが前記少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、前記バーコード遺伝子座を配列決定することとをさらに含む、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
ステップ（ａ）および／または（ｂ）を繰り返し、それによって複数の順次にバーコード化された細胞を産生することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記バーコード遺伝子座が、染色体バーコード遺伝子座である、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記バーコード遺伝子座が、プラスミドバーコード遺伝子座である、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
請求項６４～７９のいずれか一項に記載の方法によって作製された、複数のバーコード化された細胞。
【請求項81】
請求項６４～７９のいずれか一項に記載の方法によって作製された、バーコード化された細胞。
【請求項82】
ポリヌクレオチド情報を細胞内の単一バーコードに圧縮するための方法であって、（ａ）バーコード遺伝子座内に少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを含む細胞を得ることと、
（ｂ）前記細胞の前記バーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することと、
（ｃ）前記新しい固有のポリヌクレオチドバーコードが前記少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、前記バーコード遺伝子座を配列決定することと、を含む、方法。
【請求項83】
（ｄ）前細胞胞の前記バーコード遺伝子座から、前記少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
前記バーコード遺伝子座が、染色体バーコード遺伝子座である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項85】
請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法によって作製された、複数のバーコード化された細胞。
【請求項86】
請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法によって作製された、バーコード化された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月８日に出願された米国仮出願第６２／８０３，２４２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年２月８日に出願された米国仮出願第６２／８０３，２４２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＨＧ０００２０５および米国標準技術局によって授与された契約７０ＮＡＮＢ１５Ｈ２６８の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＨＧ０００２０５および米国標準技術局によって授与された契約７０ＮＡＮＢ１５Ｈ２６８の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
複雑な表現型の遺伝的基盤を明らかにし、所望の特性を有する生物系を操作することは、定量的遺伝学および合成生物学における中心的な課題である。これらの目標を達成するためには、多くの異なる遺伝子バリアントおよび経路の機能的出力を並行して試験することを可能にする技術が必要である。ＤＮＡ合成の最近の進歩により、ＣＲＩＳＰＲガイドライブラリ、ペアガイドＲＮＡ－ドナーＤＮＡライブラリ、および遺伝子バリアントライブラリの容易な構築が可能になり、遺伝子バリアントの大きいプールが生成されることを可能にしている。各細胞が単一の摂動を有する多重化アッセイにおけるそのような個々のバリアントを追跡するための方法は存在するが、現在、プールされた形式で遺伝子バリアントの高次の組み合わせを産生および追跡するために利用可能な、スケーラブルな方法はほとんどない。そのような技術は、バリアントがどのように相互作用して表現型を調節するかを理解するために重要である。
【0004】
したがって、単一細胞内で任意の数の遺伝的変化を誘発および追跡する、より効率的で、柔軟性があり、スケーラブルな方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、遺伝子バリアント（設計もしくはランダム）または構築物（遺伝子もしくはそうでなければ任意のＤＮＡ）の組み合わせを細胞の集団に導入するための、およびバーコード遺伝子座と呼ばれる一般的な遺伝子座（染色体またはプラスミド）におけるバーコードのアレイを順次に構築することによって各バリアントの組み合わせを追跡するための方法に関する。各バリアント、遺伝子構築物、または遺伝子修飾は、アレイ内の固有のバーコードによって表され、バーコードアレイのＤＮＡ配列決定により、配列決定ベースのカウントによって集団内の各バリアントの組み合わせの存在量を追跡することが可能になるようにする。重要なことに、本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集との関連に制限されず、設計されたまたはランダムな遺伝子変化をもたらす任意の遺伝子修飾プロセス、またはＤＮＡ内の任意のデジタル情報の保存および圧縮により幅広い用途を有する。
【0006】
一態様では、本開示は、複数の遺伝子操作された細胞を作製するための方法に関する。実施形態では、方法は、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤および第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を有する、形成することと、（ｂ）第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤および第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を有する、形成することとを含み、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生する。実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）を１回以上繰り返すことを含み、ステップ（ｂ）の各繰り返しは、バーコード遺伝子座が組換えポリヌクレオチドバーコードの固有の組み合わせを有するバーコードアレイを含むように、複数の組換えポリヌクレオチドを用いる。
【0007】
一態様では、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第１の固有の遺伝子修飾を有する第１の複数の遺伝子編集された細胞を産生すること、（ｂ）第１の複数の遺伝子編集された細胞に、第１の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第１の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を有する、形成すること、（ｃ）前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第２の固有の遺伝子修飾を有する第２の複数の遺伝子編集された細胞を産生すること、ならびに（ｄ）第２の複数の遺伝子編集された細胞に、第２の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第２の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を有する、形成すること、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生することによって、複数の遺伝子操作された細胞を産生するための方法が提供される。実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）および（ｄ）を１回以上繰り返すことを含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）の各繰り返しは、バーコード遺伝子座が組換えポリヌクレオチドバーコードの固有の組み合わせを含有するバーコードアレイを含むように、複数の組換えポリヌクレオチドを用いる。
【0008】
実施形態では、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードは、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における第１の固有の遺伝子修飾に関連する。実施形態では、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分は、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の第１の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される。
【0009】
実施形態では、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードは、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における第２の固有の遺伝子修飾に関連する。実施形態では、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分は、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の第２の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される。
【0010】
実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座を配列決定することによって、複数の遺伝子操作された細胞の各々における遺伝子変異を同定することを含む。
【0011】
一態様では、複数のバーコード化された細胞を産生するための方法が提供される。実施形態では、方法は、（ａ）複数の細胞を、第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第１の複数の細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第１の複数のバーコード化された細胞を形成することを含む。実施形態では、（ｂ）第１の複数のバーコード化された細胞を、第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含有し、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された複数の細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することをさらに含む。
【0012】
一態様では、ポリヌクレオチド情報を細胞内の単一バーコードに圧縮するための方法が提供される。実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座（バーコードアレイ）内に少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを有する細胞を得ることと、細胞のバーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することと、新しい固有のポリヌクレオチドバーコード（コンプレッサーバーコード）が、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、バーコード遺伝子座を配列決定することとを含む。実施形態では、方法は、コンプレッサーバーコードがバーコード遺伝子座に残ったまま、細胞のバーコード遺伝子座から少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することをさらに含む。このプロセスは、「バーコード圧縮」と称され得る。
【0013】
一態様では、本明細書に記載される方法によって作製された、複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞が提供される。
【0014】
一態様では、本明細書に記載される方法によって作製された、遺伝子編集およびバーコード化された細胞が提供される。
【0015】
実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードに隣接して付加される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの上流に付加される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの下流に付加される。
【0016】
実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードには、組換えポリヌクレオチド上で、右相同性アームおよび／または左相同性アームが隣接している。すなわち、右相同性アームは、固有のポリヌクレオチドバーコードの一方の側にあり得、左側の相同性アームは、他方の側にあり得る。例えば、図１Ａ～１Ｄを参照されたい。実施形態では、各第１の固有のポリヌクレオチドバーコードには、第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、第１の右相同性アーム、第２の右相同性アーム、および左相同性アームが隣接し、第１の右相同性アームおよび左相同性アームが、バーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする。実施形態では、各第２の固有のポリヌクレオチドバーコードには、第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、第２の右相同性アーム、左相同性アーム、および任意に第３の右相同性アームが隣接し、第２の右相同性アームおよび左相同性アームが、バーコード遺伝子座への第１の固有のポリヌクレオチドバーコードの統合後のバーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする。
【0017】
実施形態では、第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドは、左相同性アームと第２の右相同性アームとの間に第１のマーカーポリヌクレオチドを含む。実施形態では、第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドは、左相同性アームと第３の右相同性アームとの間に第２のマーカーポリヌクレオチドを含む。実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコードと共にバーコード遺伝子座に組み込まれる。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、マーカーポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコードと共にバーコード遺伝子座に組み込まれる。実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座に統合するマーカーポリヌクレオチドの存在に関して、細胞を選択することを含む。実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座から除去されるマーカーポリヌクレオチドの非存在に関して、細胞を選択することを含む。実施形態では、第１の複数の組換えポリヌクレオチド中のマーカーポリヌクレオチドは、第２の複数の組換えポリヌクレオチド中のマーカーポリヌクレオチドとは異なる。
【0018】
実施形態では、各固有のポリヌクレオチドは、相同組換えによってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドは、非相同末端結合によってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドは、インテグラーゼまたはトランスポザーゼを使用してバーコード遺伝子座に挿入される。
【0019】
実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである。実施形態では、第１および／または第２の遺伝子編集剤は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。実施形態では、第１の遺伝子編集剤および第２の遺伝子編集剤は同じである。実施形態では、第１の遺伝子編集剤および第２の遺伝子編集剤は異なる。
【0020】
実施形態では、方法は、第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することを含む。実施形態では、方法は、第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することを含む。実施形態では、バーコード遺伝子座は、配列決定される。実施形態では、少なくとも１つの遺伝子修飾は、配列決定によって決定される。
【0021】
実施形態では、方法は、固有のポリヌクレオチドバーコードを用いて少なくとも１つの遺伝子修飾を同定することを含む。
【0022】
実施形態では、方法は、（ｉ）各細胞のバーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することを含み、バーコード遺伝子座は、新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入する前に、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを含有する。実施形態では、方法は、（ｉｉ）新しい固有のポリヌクレオチドバーコードが少なくとも２つの以前の固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、バーコード遺伝子座を配列決定することを含む。実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）各細胞のバーコード遺伝子座から、少なくとも２つの以前の固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することを含む。実施形態では、方法は、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ）を繰り返し、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生することを含む。実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）を繰り返し、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生することを含む。
【0023】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（またはニッカーゼ）をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、細胞のゲノムに統合されたベクターまたは第２の核酸配列によって提供される。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼである。実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＦｎＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（例えば、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１）、Ｍａｄ７、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＬｓｈＣ２ｃ２、Ｃａｓ１４、ｄＳｐＣａｓ９－ＦｏｋＩ、スプリット－ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ニッカーゼである。
【0024】
実施形態では、任意のまたは各組換えポリヌクレオチドは、ベクターによって提供される。実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。実施形態では、ベクターは、高コピー数ベクターである。実施形態では、任意のまたは各組換えポリヌクレオチドは、例えば、レトロン系を介して発現および逆転写される。
【0025】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＸ）をコードする、第２の核酸配列をさらに含む。実施形態では、ガイドＲＮＡは、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成し、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体が組換えポリヌクレオチドを切断するようにする。実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、プラスミドベクターであり、ヌクレアーゼ複合体（例えば、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体）は、プラスミドベクターを線形化する。
【0026】
実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド）は、細胞から除去される（例えば、挿入ステップの後）。実施形態では、ベクターは、細胞内のヌクレアーゼによって切断される。実施形態では、ベクターは、例えば、ベクターの保持に関して選択しない培地中での細胞の増殖によって、細胞から受動的に失われる。
【0027】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＸ）をコードする、第２の核酸配列をさらに含み、ガイドＲＮＡは、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成し、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体がバーコード遺伝子座を切断するようにする。実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、ドナーＤＮＡおよび／またはバーコードポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド上にある。実施形態では、細胞は、バーコードポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとは別のステップで、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列と接触させられる。
【0028】
実施形態では、バーコード遺伝子座は、染色体バーコード遺伝子座である。実施形態では、バーコード遺伝子座は、プラスミドバーコード遺伝子座である。
【0029】
実施形態では、遺伝子修飾は、設計された遺伝子修飾である。
【0030】
主題の開示のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示を考慮して当業者に容易に想到されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1A】再帰的バーコード連結の要素を示す。図１Ａは、バーコード化方法論の例示的な使用を示す。図１Ｂ～１Ｄは、再帰的バーコード化の例示的な動作を示す。選択可能なマーカーによって補助されるか（左）、または選択可能なマーカーを含まないか（右）によって定義される、バーコード再帰の２つのバージョンが示される。バーコードは、左相同性（ＬＨ）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる２つの相同性アームを利用する、宿主細胞相同組換え（ＨＲ）によって可能になる。
【図1B】再帰的バーコード連結の要素を示す。図１Ａは、バーコード化方法論の例示的な使用を示す。図１Ｂ～１Ｄは、再帰的バーコード化の例示的な動作を示す。選択可能なマーカーによって補助されるか（左）、または選択可能なマーカーを含まないか（右）によって定義される、バーコード再帰の２つのバージョンが示される。バーコードは、左相同性（ＬＨ）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる２つの相同性アームを利用する、宿主細胞相同組換え（ＨＲ）によって可能になる。
【図1C】再帰的バーコード連結の要素を示す。図１Ａは、バーコード化方法論の例示的な使用を示す。図１Ｂ～１Ｄは、再帰的バーコード化の例示的な動作を示す。選択可能なマーカーによって補助されるか（左）、または選択可能なマーカーを含まないか（右）によって定義される、バーコード再帰の２つのバージョンが示される。バーコードは、左相同性（ＬＨ）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる２つの相同性アームを利用する、宿主細胞相同組換え（ＨＲ）によって可能になる。
【図1D】再帰的バーコード連結の要素を示す。図１Ａは、バーコード化方法論の例示的な使用を示す。図１Ｂ～１Ｄは、再帰的バーコード化の例示的な動作を示す。選択可能なマーカーによって補助されるか（左）、または選択可能なマーカーを含まないか（右）によって定義される、バーコード再帰の２つのバージョンが示される。バーコードは、左相同性（ＬＨ）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる２つの相同性アームを利用する、宿主細胞相同組換え（ＨＲ）によって可能になる。
【図2A】バーコード圧縮の一例を示す。図２Ａは、複数の細胞に統合されるバーコードアレイを表し、各細胞は、バーコード遺伝子座内に多くのバーコードをすでに含有している。図２Ｂは、複数のバーコード（ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、ｂｃ１）をすでに含有しているバーコード遺伝子座への、コンプレッサーバーコード（ｂｃ１．．４）の挿入、その後に続く、ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、およびｂｃ１をｂｃ１．．４に「圧縮する」ためのバーコードの配列決定を示す。図２Ｃに示すように、後続の読み取りで圧縮バーコードを配列決定する必要なく、追加の再帰的バーコード連結が実行され得る。
【図2B】バーコード圧縮の一例を示す。図２Ａは、複数の細胞に統合されるバーコードアレイを表し、各細胞は、バーコード遺伝子座内に多くのバーコードをすでに含有している。図２Ｂは、複数のバーコード（ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、ｂｃ１）をすでに含有しているバーコード遺伝子座への、コンプレッサーバーコード（ｂｃ１．．４）の挿入、その後に続く、ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、およびｂｃ１をｂｃ１．．４に「圧縮する」ためのバーコードの配列決定を示す。図２Ｃに示すように、後続の読み取りで圧縮バーコードを配列決定する必要なく、追加の再帰的バーコード連結が実行され得る。
【図2C】バーコード圧縮の一例を示す。図２Ａは、複数の細胞に統合されるバーコードアレイを表し、各細胞は、バーコード遺伝子座内に多くのバーコードをすでに含有している。図２Ｂは、複数のバーコード（ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、ｂｃ１）をすでに含有しているバーコード遺伝子座への、コンプレッサーバーコード（ｂｃ１．．４）の挿入、その後に続く、ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、およびｂｃ１をｂｃ１．．４に「圧縮する」ためのバーコードの配列決定を示す。図２Ｃに示すように、後続の読み取りで圧縮バーコードを配列決定する必要なく、追加の再帰的バーコード連結が実行され得る。
【図3A】バーコードの除去および挿入要素の再利用によるバーコード圧縮を示す。図３Ａは、複数のバーコード（ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、ｂｃ１）をすでに含有しているバーコード遺伝子座への、コンプレッサーバーコード（ｂｃ１．．４）の挿入、その後に続く、ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、およびｂｃ１をｂｃ１．．４に「圧縮する」ためのバーコードの配列決定を示す。図３Ｂは、もはや必要とされなくなった連結されたバーコードの除去を可能にする次のバーコード化ラウンドを示す。この例では、ｂｃ５は、ｂｃ１．．４の左側に隣接して挿入され、プロセスにおいて、ｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、およびｂｃ４、ならびにＲＨ１、ＲＨ２、ＲＨ３、ＲＨ４、およびＲＨ５、およびそれらに関連する切断部位を除去する。これにより、次の一連のバーコード化ラウンドでのこれらの要素の再利用が可能になる。
【図3B】バーコードの除去および挿入要素の再利用によるバーコード圧縮を示す。図３Ａは、複数のバーコード（ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、ｂｃ１）をすでに含有しているバーコード遺伝子座への、コンプレッサーバーコード（ｂｃ１．．４）の挿入、その後に続く、ｂｃ４、ｂｃ３、ｂｃ２、およびｂｃ１をｂｃ１．．４に「圧縮する」ためのバーコードの配列決定を示す。図３Ｂは、もはや必要とされなくなった連結されたバーコードの除去を可能にする次のバーコード化ラウンドを示す。この例では、ｂｃ５は、ｂｃ１．．４の左側に隣接して挿入され、プロセスにおいて、ｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、およびｂｃ４、ならびにＲＨ１、ＲＨ２、ＲＨ３、ＲＨ４、およびＲＨ５、およびそれらに関連する切断部位を除去する。これにより、次の一連のバーコード化ラウンドでのこれらの要素の再利用が可能になる。
【図4A】再帰的バーコード圧縮を示す。図４Ａは、第２のバーコード圧縮ラウンドを示し、これは、第１のラウンド（例えば、図３Ａ～３Ｂに示される）と構造的に同一であり得、同じＲＨ要素の使用を伴うが、左側へのさらなるバーコード連結および右側へのバーコード圧縮のための異なる相同性および切断部位を伴う。バーコード圧縮のこの例示的なラウンドにおいて、入ってくるバーコードｂｃ１．．７は、連結されたバーコードｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４の両方を圧縮する。図４Ｂに示すように、左側へのバーコード連結の次のラウンドは、ｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４を除去し、次の一連のバーコード化ラウンドで、すでに使用された挿入要素の再利用を可能にする。
【図4B】再帰的バーコード圧縮を示す。図４Ａは、第２のバーコード圧縮ラウンドを示し、これは、第１のラウンド（例えば、図３Ａ～３Ｂに示される）と構造的に同一であり得、同じＲＨ要素の使用を伴うが、左側へのさらなるバーコード連結および右側へのバーコード圧縮のための異なる相同性および切断部位を伴う。バーコード圧縮のこの例示的なラウンドにおいて、入ってくるバーコードｂｃ１．．７は、連結されたバーコードｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４の両方を圧縮する。図４Ｂに示すように、左側へのバーコード連結の次のラウンドは、ｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４を除去し、次の一連のバーコード化ラウンドで、すでに使用された挿入要素の再利用を可能にする。
【図5A】再帰的バーコード連結および圧縮の例示的な動作を示す。
【図5B】再帰的バーコード連結および圧縮の例示的な動作を示す。
【図6】ガイド－ドナーを固有のＤＮＡバーコードと連結するための、ライブラリクローニングの例示的な方法を示す。
【図7】自己破壊プラスミドを介した同時の編集およびバーコード統合の例示的な方法を示す。
【図8】バーコードの高次ガイド－ドナー編集およびバーコードの順次の連結の例示的な方法を示す。
【図9】ガイド－ドナーバーコード圧縮の例示的な方法を示す。
【図10】バーコード圧縮を介した超高次編集の例示的な方法を示す。
【図11A】開始（ラウンド０）細胞の異なる選択可能なマーカーを有する、例示的なバーコード遺伝子座を示す。
【図11B】開始（ラウンド０）細胞の異なる選択可能なマーカーを有する、例示的なバーコード遺伝子座を示す。
【図12】ガイド－ドナー統合なしのバーコード統合のための、例示的なクローニングバーコード化ガイド－ドナーライブラリを示す。
【図13】ガイド－ドナー統合なしのバーコード統合のための、一連のラウンドに特異的な挿入物の構築の一例を示す。
【図14】ガイド－ドナー統合なしのバーコード統合のための、ガイド－ドナーバーコードを挿入物バーコードに関連付けるための例示的な方法を示す。
【図15A】単一バーコードのための同時のゲノム編集、ガイド－ドナーバーコード統合、およびプラスミド自己破壊を示す。
【図15B】単一バーコードのための同時のゲノム編集、ガイド－ドナーバーコード統合、およびプラスミド自己破壊を示す。
【図15C】単一バーコードのための同時のゲノム編集、ガイド－ドナーバーコード統合、およびプラスミド自己破壊を示す。
【図16A】全体的な方法論を示す。ラウンド１からの２つの異なるバーコード化株を、単一バーコード化ＣＡＮ１ガイド－ドナープラスミドとの再帰的バーコード連結のラウンド２に供し、サンガーシーケンシングによってバーコード遺伝子座でのバーコード連結を確認した（図１６Ｃ）。
【図16B】全体的な方法論を示す。ラウンド１からの２つの異なるバーコード化株を、単一バーコード化ＣＡＮ１ガイド－ドナープラスミドとの再帰的バーコード連結のラウンド２に供し、サンガーシーケンシングによってバーコード遺伝子座でのバーコード連結を確認した（図１６Ｃ）。
【図16C】全体的な方法論を示す。ラウンド１からの２つの異なるバーコード化株を、単一バーコード化ＣＡＮ１ガイド－ドナープラスミドとの再帰的バーコード連結のラウンド２に供し、サンガーシーケンシングによってバーコード遺伝子座でのバーコード連結を確認した（図１６Ｃ）。
【図17】ＲＨ近位切断部位の存在下または非存在下での、ＲＨ長さに対するバーコード化効率の依存性を示す。すべての構築物には、ＬＨ近位切断部位を有する。
【図18】染色体統合部位に挿入するための、各々が遺伝子バリアントおよび関連するバーコードを含有するポリヌクレオチドのライブラリを構築するための例示的な方法を示す。
【図19】バーコード遺伝子座におけるバーコード化遺伝子の同時のバーコード連結および連鎖の例示的な方法を示す。
【図20】遺伝子ライブラリ全体をバーコード化するための例示的な方法、および任意の遺伝子座での遺伝子挿入のための経路を示す。
【図21】同時のバーコード遺伝子座でのバーコード挿入および任意の遺伝子座での遺伝子挿入を示す。
【図22A】ドナーに隣接するレトロン要素を有するガイド－ドナープラスミドの修飾を示す。ドナーは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって転写され、リボザイムは、５’キャップおよびポリ（Ａ）テールを除去し、レトロン要素（ｍｓｒ／ｍｓｄ）は、ドナーＲＮＡの逆転写を促進してドナーｃＤＮＡを生成する。この系の修飾では、標的バリアントの編集は、ドナーｃＤＮＡまたはプラスミドベースのドナーとの相同組換えのいずれかを通して行われ得る。
【図22B】ドナーに隣接するレトロン要素を有するガイド－ドナープラスミドの修飾を示す。ドナーは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって転写され、リボザイムは、５’キャップおよびポリ（Ａ）テールを除去し、レトロン要素（ｍｓｒ／ｍｓｄ）は、ドナーＲＮＡの逆転写を促進してドナーｃＤＮＡを生成する。この系の修飾では、標的バリアントの編集は、ドナーｃＤＮＡまたはプラスミドベースのドナーとの相同組換えのいずれかを通して行われ得る。
【図22C】ドナーに隣接するレトロン要素を有するガイド－ドナープラスミドの修飾を示す。ドナーは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって転写され、リボザイムは、５’キャップおよびポリ（Ａ）テールを除去し、レトロン要素（ｍｓｒ／ｍｓｄ）は、ドナーＲＮＡの逆転写を促進してドナーｃＤＮＡを生成する。この系の修飾では、標的バリアントの編集は、ドナーｃＤＮＡまたはプラスミドベースのドナーとの相同組換えのいずれかを通して行われ得る。
【図23A】ドナープラスミドおよびバーコード遺伝子座の複数の切断部位を介してガイド－ドナープラスミドを統合するための概略図を示す。所望の遺伝子座でのガイド－ドナー統合のための複数の切断部位配列の詳細。遺伝子編集に使用されるヌクレアーゼ（この例ではＣａｓ９）以外の誘導型ヌクレアーゼ（本明細書に示されるＣｐｆ１／Ｃａｓ１２ａおよびＩ－ＳｃｅＩ）は、プラスミドのガイド－ドナー部分のゲノムへの統合、および後続のガイド－ドナープラスミド破壊を可能にする。
【図23B】ドナープラスミドおよびバーコード遺伝子座の複数の切断部位を介してガイド－ドナープラスミドを統合するための概略図を示す。所望の遺伝子座でのガイド－ドナー統合のための複数の切断部位配列の詳細。遺伝子編集に使用されるヌクレアーゼ（この例ではＣａｓ９）以外の誘導型ヌクレアーゼ（本明細書に示されるＣｐｆ１／Ｃａｓ１２ａおよびＩ－ＳｃｅＩ）は、プラスミドのガイド－ドナー部分のゲノムへの統合、および後続のガイド－ドナープラスミド破壊を可能にする。
【図23C】ドナープラスミドおよびバーコード遺伝子座の複数の切断部位を介してガイド－ドナープラスミドを統合するための概略図を示す。所望の遺伝子座でのガイド－ドナー統合のための複数の切断部位配列の詳細。遺伝子編集に使用されるヌクレアーゼ（この例ではＣａｓ９）以外の誘導型ヌクレアーゼ（本明細書に示されるＣｐｆ１／Ｃａｓ１２ａおよびＩ－ＳｃｅＩ）は、プラスミドのガイド－ドナー部分のゲノムへの統合、および後続のガイド－ドナープラスミド破壊を可能にする。
【図24A】写真上に示されるバーコード化方法で、１２世代にわたってガラクトースに曝露されてきた酵母をプレーティングしたペトリ皿の写真である。Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａガイドを、ガイド転写物リーダーを除去するために、ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＲ）を用いてまたは用いずに、２つの異なるプロモーター（ＲＰＲ１－ＴｅｔＯおよびＧＡＬ７）の下で、２つの異なるガイド配列（Ｘ１およびＸ２）で発現した。Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａを、左端の５つのカラムについてＧａｌ－Ｌプロモーターの制御下に置いた。二重核局在化シグナル（ＮＬＳ）がある場合およびない場合のＩ－ＳｃｅＩヌクレアーゼを、示されたカラムについてＧａｌ－Ｌプロモーターの制御下に置いた。酵母の約１０００個の細胞を示された培地上にプレーティングした。ＹＰＤは、すべての生細胞がコロニーを形成することを可能にし、５ＦＣ－ＨＩＳは、バーコード統合およびプラスミド除去を受けた細胞を選択し、５ＦＯＡは、バーコード統合を受けた細胞を選択し、－ＵＲＡは、バーコード統合を受けていない細胞を選択する。ガイドなしおよびＳｃｅＩなしの対照は、ガイド切断がない場合、バーコード統合およびプラスミド除去が進行しないことを示す。
【図24B】時間ゼロ（ガラクトース誘導なし）で酵母をプレーティングしたペトリ皿の写真であり、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａ－ガイドＸ系またはＩ－ＳｃｅＩ系の漏れが最小限であることを示す。
【図24C】６世代にわたってガラクトースに曝露されてきた酵母をプレーティングしたペトリ皿の写真である。酵母の約１０００個の細胞を示された培地上にプレーティングした。異なる培地上での増殖は、バーコード統合およびプラスミド除去の異なる割合を示す。
【図25】１５３６密度のＹＰＤ寒天培地上での増殖中の受動的なＣａｓ９プラスミドの喪失を示す酵母コロニーアレイの写真である。ｙＫＲ４（ＵＲＡ３遺伝子が欠失した対照）、ｙＫＲ２６７（プラスミド上のＣａｓ９／ＵＲＡ３／ｈｐｈＭＸ）、およびｙＫＲ６４９（ゲノム内のＣａｓ９／ＵＲＡ３／ｈｐｈＭＸ）を含むコロニーアレイを最初にＹＰＤに貼り付け、各々のコロニー内の細胞の一部分がＣａｓ９プラスミドを失うことを可能にした（左上）。次いで、このアレイを、Ｃａｓ９の選択を維持するＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢ（ＹＰＤ＋Ｈｙｇ、左下）、Ｃａｓ９の選択を維持する－ＵＲＡ（右上）、およびコロニー増殖を可能にするＣａｓ９プラスミドの喪失を必要とする５－ＦＯＡからなる寒天培地にレプリカプレーティングした。ゲノムＣａｓ９（ｙＫＲ６４９）を有する株は、酵母ゲノムで安定して継承されるため、Ｃａｓ９／ＵＲＡ３／ｈｐｈＭＸ構築物を失うことはできない。
【図26】他のプラスミド構成成分と逆方向のＴＤＨ３－ＨＤＶ－ｍｓｒ／ｍｓｄレトロン配列を有する、ガイド－ドナープラスミドを示す概略図である。
【図27】ｙＫＲ６４９酵母をプレーティングしたペトリ皿の写真であり、一過性に発現したＳｃｅＩを有するバーコード統合を示す。ＳｃｅＩのＤＮＡをコードするＰＣＲ産物を、ドナープラスミドで同時形質転換した。ＳｃｅＩは、バーコードおよび反復部位の統合、ならびにドナープラスミド破壊のために、ゲノムおよびプラスミドの多重切断部位で切断する。プレートは、ＨＩＳ３遺伝子を含有するガイド－ドナープラスミドに対して、５－ＦＣ対抗選択培地上で、ｙＫＲ６４９酵母株でプレーティングされる。効率的なガイド－ドナーまたはバーコードの組み込みを有するプレートは、非効率的な組み込み（ゼロまたは少数のコロニー）と比較して、多数のコロニーを示す。
【図28A】ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略を提示する。図２８Ａ：図は、ドナーに隣接して、ｂｃ０とラベル付けされたバーコード配列が付加されたプラスミド骨格にクローニングされる、ガイド－ドナーオリゴヌクレオチドを示す。図２８Ｂ：この図は、ラウンド１プラスミドが最初に酵母または細菌中で解析されて、各ガイド－ドナーが完全で等しい存在量で存在するライブラリを作成することができ、次いで、ＭＡＲＶＥＬラウンド１挿入物が、インビトロＳｃｅＩ酵素処理によって除去され、左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を残すことができることを示す。図２８Ｃ：この図は、ＳｃｅＩ切断によって生成された線形化骨格が、適切なラウンドのＭＡＲＶＥＬ挿入物と共に酵母に直接変換され得ることを示す。酵母相同組換え修復は、ガイド－ドナー骨格およびバーコード化ＭＡＲＶＥＬ挿入物の両方に存在する左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を介して、プラスミドを集合させる。
【図28B】ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略を提示する。図２８Ａ：図は、ドナーに隣接して、ｂｃ０とラベル付けされたバーコード配列が付加されたプラスミド骨格にクローニングされる、ガイド－ドナーオリゴヌクレオチドを示す。図２８Ｂ：この図は、ラウンド１プラスミドが最初に酵母または細菌中で解析されて、各ガイド－ドナーが完全で等しい存在量で存在するライブラリを作成することができ、次いで、ＭＡＲＶＥＬラウンド１挿入物が、インビトロＳｃｅＩ酵素処理によって除去され、左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を残すことができることを示す。図２８Ｃ：この図は、ＳｃｅＩ切断によって生成された線形化骨格が、適切なラウンドのＭＡＲＶＥＬ挿入物と共に酵母に直接変換され得ることを示す。酵母相同組換え修復は、ガイド－ドナー骨格およびバーコード化ＭＡＲＶＥＬ挿入物の両方に存在する左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を介して、プラスミドを集合させる。
【図28C】ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略を提示する。図２８Ａ：図は、ドナーに隣接して、ｂｃ０とラベル付けされたバーコード配列が付加されたプラスミド骨格にクローニングされる、ガイド－ドナーオリゴヌクレオチドを示す。図２８Ｂ：この図は、ラウンド１プラスミドが最初に酵母または細菌中で解析されて、各ガイド－ドナーが完全で等しい存在量で存在するライブラリを作成することができ、次いで、ＭＡＲＶＥＬラウンド１挿入物が、インビトロＳｃｅＩ酵素処理によって除去され、左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を残すことができることを示す。図２８Ｃ：この図は、ＳｃｅＩ切断によって生成された線形化骨格が、適切なラウンドのＭＡＲＶＥＬ挿入物と共に酵母に直接変換され得ることを示す。酵母相同組換え修復は、ガイド－ドナー骨格およびバーコード化ＭＡＲＶＥＬ挿入物の両方に存在する左相同性（ＣＹＣ１ｔ）および右相同性（ｍｓｄ）を介して、プラスミドを集合させる。
【発明を実施するための形態】
【0032】
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の用途において本明細書に記載される技術をどのように実施するかが当業者に明らかになるであろう。しかしながら、すべての様々な実施形態は、本明細書に記載されない。本明細書に提示される実施形態は、限定ではなく、ほんの一例としてのみ提示されることが理解されるであろう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載される本開示の範囲または幅を限定するものと解釈されるべきではない。
【0033】
以下に記載される態様は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはそれらの使用に限定されず、そのようなものは、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0034】
詳細な説明は、読者の便宜のためにのみ様々なセクションに分割されており、任意のセクションに見られる開示は、別のセクションの開示と組み合わされ得る。表題または副題は、読者の便宜のために本明細書で使用され得、本開示の範囲に影響を与えることを意図していない。
【0035】
定義
他の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるべきである多くの用語が参照される。
他の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるべきである多くの用語が参照される。
【0036】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。
【0037】
「任意の」または「任意に」とは、その次に記載される事象または状況が発生する可能性があるか、または発生しない可能性があり、この記載が、その事象または状況が発生する場合および発生しない場合を含むことを意味する。
【0038】
「約」という用語は、数値表示、例えば、範囲を含む温度、時間、量、濃度、およびそのような他のもの前に使用される場合、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはそれらの間の任意の部分範囲または部分値だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、量に関して使用される場合、その量が＋／－１０％変動し得ることを意味する。
【0039】
「含むこと」または「含む」とは、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる」とは、組成物および方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のために、組み合わせにとっていかなる本質的に重要な他の要素も除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しない。「からなる」とは、他の成分の微量以上の要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【0040】
「バーコード」は、バーコードが関連する核酸または細胞を同定するために使用される１つ以上のポリヌクレオチド配列を指す。バーコードは、３～１０００個以上のヌクレオチドの長さであり得る。実施形態では、長さは、好ましくは１０～２５０個のヌクレオチドである。実施形態では、長さは、１０～３０個のヌクレオチドである。実施形態では、長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドである。バーコードは、例えば、核酸が由来する単一細胞、細胞の亜集団、コロニー、または試料を同定するために使用され得る。バーコードはまた、細胞アレイ内のコロニーの位置、マルチウェルプレート内のウェルの位置、またはラック内のチューブ、フラスコ、もしくは他の容器の位置など、核酸が由来する細胞、コロニー、または試料の位置（すなわち、位置バーコード）を同定するためにも使用され得る。特に、バーコードは、核酸が由来する遺伝子修飾された細胞を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、特定のタイプのゲノム編集を同定するために使用される。例えば、ガイドＲＮＡドナーポリヌクレオチドカセット自体をバーコードとして使用して、核酸が由来する遺伝子修飾された細胞を同定することができる。あるいは、固有のバーコードを使用して、多重ゲノム編集で使用される各ガイド－ＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドカセットを同定することができる。さらに、複数のバーコードを組み合わせて使用して、核酸の異なる特徴を同定することができる。例えば、位置バーコード（例えば、アレイ、マルチウェルプレート、またはラック内の細胞、コロニー、培養物、または試料の位置を同定するための）は、ゲノム編集で使用されるガイド－ＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドカセットを同定するバーコードと組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、細胞の遺伝子修飾に使用されるガイド－ＲＮＡおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同定するために、ゲノム編集の各ラウンドで核酸に（例えば、「バーコード遺伝子座」で）挿入される。
【0041】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。完全長タンパク質およびその断片の両方がこの定義によって包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ヒドロキシル化なども含む。さらに、本開示の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を示す限り、天然配列への欠失、付加、および置換などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘発などを通して意図的であり得るか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーなどを通して、偶発的なものであり得る。
【0042】
「遺伝子修飾」という用語は、細胞のゲノム（染色体または染色体外、例えば、プラスミド、ミトコンドリア）内の任意の変化を指す。遺伝子修飾には、ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの変異、欠失、挿入、もしくは置換、ポリヌクレオチド配列の挿入、ポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子もしくは遺伝子の一部の欠失、ポリヌクレオチド配列の転座または相互転座、染色体融合、および／またはポリヌクレオチド配列に対するエピジェネティック修飾が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0043】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、任意の種由来のＩＩ型クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを包含し、また、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を保持する（すなわち、二本鎖切断を起こすためにＤＮＡの部位特異的切断を触媒する）、その生物学的に活性な断片、バリアント、類似体、および誘導体も含む。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、その結合したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に相補的な配列を含む部位でＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する。
【0044】
Ｃａｓ９ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、任意の供給源に由来する分子を指す。分子は、物理的に生物に由来する必要はないが、合成または組換えにより産生され得る。多くの細菌種由来のＣａｓ９配列が当技術分野でよく知られており、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに列挙されている。例えば、次に由来するＣａｓ９のＮＣＢＩエントリを参照されたい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＷＰ＿００２９８９９５５、ＷＰ＿０３８４３４０６２、ＷＰ＿０１１５２８５８３）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＷＰ＿０２２５５２４３５、ＹＰ＿００２３４４９００）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（ＷＰ＿０６０７８６１１６）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ（ＷＰ＿０５９４３４６３３）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣ＿０１５６８３、ＮＣ＿０１７３１７）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣ＿０１６７８２、ＮＣ＿０１６７８６）；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣ＿０２１２８４）；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣ＿０１７８６１）；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣ＿０２１８４６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ（ＮＣ＿０２１３１４）；Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ（ＮＣ＿０１８０１０）；Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓＩ（ＮＣ＿０１８７２１）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＹＰ＿８２０８３２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ＷＰ＿０６１０４６３７４、ＷＰ＿０２４７８６４３３）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（ＮＰ ４７２０７３）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＷＰ ０６１６６５４７２）；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（ＷＰ＿０６２７２６６５６）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＷＰ＿００１５７３６３４）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０３２７２９８９２、ＷＰ＿０１４５４８４２０）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＷＰ＿０４８４８２５９５、ＷＰ＿０３２９６５１７７）；およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＷＰ＿０６１７０４９４９、ＹＰ ００２３４２１００）。これらの配列のすべて（本出願の出願日までに入力された）は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの配列のいずれか、またはそれと少なくとも約７０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意の同一性パーセント、例えば、それと７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列を含むそのバリアントが、本明細書に記載されるように、ゲノム編集のために使用され得、バリアントは、Ｃａｓ９部位特異的エンドヌクレアーゼ活性などの生物学的活性を保持する。これらの配列のいずれかから作製されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約７０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意の同一性パーセント、例えば、それと７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントが、本明細書に記載されるように、ゲノム編集のために使用され得、バリアントは、Ｃａｓ９部位特異的エンドヌクレアーゼ活性などの生物学的活性を保持する。配列比較、ならびにＣａｓ９の遺伝的多様性および系統発生分析の考察について、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（４）：２５７７－９０、Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８（５）：７９７－８０７、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６０（３）：３８５－３９７、およびＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（１０）：６０９１－６１０５も参照されたい。
【0045】
本明細書に記載されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ニッカーゼであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ変異体は、野生型Ｃａｓ酵素によって生じた二本鎖切断の代わりに、ｇＲＮＡ標的一本鎖切断をＤＮＡに導入する。
【0046】
「誘導体」とは、天然ポリペプチドの所望の生物学的活性が保持される限り、目的の天然ポリペプチド、天然ポリペプチドの断片、またはそれらのそれぞれの類似体の任意の好適な修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、ポリマーコンジュゲーション（ポリエチレングリコールを用いたものなど）、または外来部分の他の付加を意味する。ポリペプチド断片、類似体、および誘導体を作製するための方法は、当技術分野で一般的に利用可能である。
【0047】
「断片」とは、無傷の完全長配列および構造の一部のみからなる分子を意味する。断片は、ポリペプチドのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／または内部欠失を含み得る。特定のタンパク質またはポリペプチドの活性断片は、一般に、完全長分子の少なくとも約５～１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは完全長分子の少なくとも約１５～２５個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは完全長分子の少なくとも約２０～５０個以上の連続するアミノ酸残基、または５個のアミノ酸と完全長配列との間の任意の整数を含み、ただし、問題の断片が、Ｃａｓ９部位特異的エンドヌクレアーゼ活性などの生物学的活性を保持していることを条件とする。
【0048】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、それが存在する試料の大部分の割合を構成するような、物質の単離を指す。典型的には、試料中、実質的に精製された構成成分は、試料の５０％、好ましくは８０％～８５％、より好ましくは９０～９５％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および密度に応じた沈降を含む。
【0049】
「単離された」とは、ポリペプチドを指す場合、示された分子が、その分子が自然界に見られる生物全体から分離して別個であるか、または同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関する「単離された」という用語は、自然界で通常それに関連する配列を全体的もしくは部分的に欠いている核酸分子、または自然界に存在するが、それに関連して異種配列を有する配列、または染色体から解離された分子である。
【0050】
本明細書で使用される場合、「不均一な細胞集団」という語句は、少なくとも２つのタイプの細胞の混合物を指し、一方のタイプは、目的の細胞である（例えば、目的のゲノム修飾を有する）。不均一な細胞集団は、任意の生物に由来し得る。
【0051】
目的のゲノム修飾を有する細胞または細胞集団を選択する文脈において本明細書で使用される場合、「単離すること」および「単離」という用語は、正もしくは負の選択、または複雑なコロニーアレイからのクローン単離などによって、目的のゲノム修飾を有する細胞または細胞集団を、不均一な細胞集団から分離することを指す。
【0052】
「選択マーカー」または「マーカー」という用語は、正の選択（マーカーを発現する細胞の選択）または負の選択（マーカーを発現する細胞の除外）のいずれかによって、不均一な細胞集団からの細胞集団の同定または濃縮に使用され得るマーカーを指す。
【0053】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを含むために本明細書で使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語には、三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＲＮＡが含まれる。これはまた、メチル化および／またはキャッピングなどによる修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．からＮｅｕｇｅｎｅとして市販）、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、ただし、ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有することを条件とする。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語間で長さの意図された区別はなく、これらの用語は互換的に使用される。したがって、これらの用語は、例えば、３’－デオキシ－２’，５’－ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホルアミデート、２’－Ｏ－アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、また、既知のタイプの修飾、例えば、当技術分野で知られている標識、メチル化、自然発生的ヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体による「キャップ」置換（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシンＣ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）を有するもの、負荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、および正荷電連結（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの、ペンダント部分、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなどを含む）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、修飾された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態も含む。この用語はまた、ロックド核酸（例えば、２’－酸素原子と４’－炭素原子との間にメチレン架橋を有するリボヌクレオチドを含む）も含む。例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：１９１１－１９１８、Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ２：５５８－５６１、Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：２３９－２４３、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７－３６３０、Ｏｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：５４０１－５４０４を参照されたい。
【0054】
「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、ワトソン－クリック塩基対を介して複合体を形成するのに十分に相補的である、ヌクレオチド配列間の複合体の形成を指す。
【0055】
「相同領域」という用語は、別の核酸領域との相同性を有する核酸の領域を指す。したがって、「相同領域」が核酸分子内に存在するかどうかは、同じまたは異なる分子内の別の核酸領域を参照して決定される。さらに、核酸はしばしば二本鎖であるため、「相同領域」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子が互いにハイブリダイズする能力を指す。例えば、一本鎖核酸分子は、互いにハイブリダイズすることができる２つの相同領域を有することができる。したがって、「相同領域」という用語は、相補的な配列を有する核酸セグメントを含む。相同領域は長さが異なり得るが、典型的には、４～５００個のヌクレオチド（例えば、約４～約４０、約４０～約８０、約８０～約１２０、約１２０～約１６０、約１６０～約２００、約２００～約２４０、約２４０～約２８０、約２８０～約３２０、約３２０～約３６０、約３６０～約４００、約４００～約４４０など）である。
【0056】
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、互いに塩基対を形成することができるポリヌクレオチドを指す。塩基対は、典型的には、ポリヌクレオチド鎖間の逆平行配向におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン－クリック様式（例えば、ＡからＴ、ＡからＵ、ＣからＧ）で、または二本鎖の形成を可能にする任意の他の様式で、塩基対合することができる。当業者が知っているように、ＤＮＡではなくＲＮＡを使用する場合、チミン（Ｔ）ではなくウラシル（Ｕ）が、アデノシンに相補的であると考えられる塩基である。しかしながら、本開示の文脈においてウラシルが示される場合、特に明記しない限り、チミンを置換する能力が暗示される。「相補性」は、２つのＲＮＡ鎖の間、２つのＤＮＡ鎖の間、またはＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に存在し得る。２つ以上のポリヌクレオチドは「相補的」であり、完全ではないかまたは１００％未満の相補性を有するにもかかわらず、二本鎖を形成することができ得ることが、一般に理解されている。相補性の領域を含む各ポリヌクレオチド配列の少なくとも連続部分が、そのような領域内でミスマッチまたは遮断なしに他のポリヌクレオチドと完全に塩基対合する場合、２つの配列は、「完全に相補的」または「１００％相補的」である。各ポリヌクレオチド内の相補性の連続領域が他の領域と完全にハイブリダイズすることができる限り、いずれかまたは両方のポリヌクレオチドが追加の非相補的配列を含有する場合でさえ、２つ以上の配列は、「完全に相補的」または「１００％相補的」と見なされる。「完全ではない」相補性とは、そのような相補性の領域内のすべてではない連続ヌクレオチドが互いに塩基対合することができる状況を指す。２つのポリヌクレオチド配列間の相補性のパーセンテージを決定することは、当業者の問題である。Ｃａｓ９標的化の目的のために、ｇＲＮＡは、二本鎖を形成するのに十分な塩基対合が可能な標的配列（例えば、メジャーまたはマイナー対立遺伝子）に「相補的な」配列を含み得る（すなわち、ｇＲＮＡが標的配列とハイブリダイズする）。さらに、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含み得、ｇＲＮＡはまた、標的ＤＮＡ中のＰＡＭ配列とハイブリダイズする。
【0057】
「標的部位」または「標的配列」は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはドナーポリヌクレオチドの相同性アームによって認識される（すなわち、ハイブリダイゼーションに対して十分に相補的である）核酸配列である。標的部位は、対立遺伝子特異的であり得る（例えば、メジャーまたはマイナー対立遺伝子）。
【0058】
「ドナーポリヌクレオチド」という用語は、ＨＤＲによって標的遺伝子座でゲノムに統合されることを意図した編集の配列を提供する、ポリヌクレオチドを指す。
【0059】
「相同性アーム」とは、細胞内で編集されるゲノム配列にドナーポリヌクレオチドを標的化することに関与するドナーポリヌクレオチドの一部分を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、ゲノムＤＮＡに対する意図した編集を含むヌクレオチド配列に隣接する３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。相同性アームは、本明細書において、５’および３’（すなわち、上流および下流）相同性アームと称され、これは、ドナーポリヌクレオチド内の意図した編集を含むヌクレオチド配列に対する相同性アームの相対位置に関係する。５’および３’相同性アームは、修飾されるゲノムＤＮＡの標的遺伝子座内の領域にハイブリダイズし、これらは、本明細書において、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称される。意図した編集を含むヌクレオチド配列は、５’および３’相同性アームによって認識される（すなわち、ハイブリダイゼーションに対して十分に相補的である）ゲノム標的遺伝子座で、ＨＤＲによってゲノムＤＮＡに統合される。
【0060】
ドナーポリヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、またはＣａｓ９発現系などの核酸を細胞に「投与すること」は、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、転座、融合、貪食、シュート方法または弾丸方法など、すなわち、核酸が細胞膜を越えて輸送され得る任意の手段を含む。
【0061】
ガイドＲＮＡに関して「選択的に結合する」とは、ガイドＲＮＡが目的の標的配列に優先的に結合するか、または他のゲノム配列よりもその標的配列に対してより高い親和性で結合することを意味する。例えば、ｇＲＮＡは、実質的に相補的な配列に結合し、無関係の配列には結合しない。特定の変異型対立遺伝子（例えば、置換、挿入、または欠失を含む対立遺伝子）などの特定の対立遺伝子に「選択的に結合する」ｇＲＮＡは、特定の標的対立遺伝子に優先的に結合するが、野生型対立遺伝子または他の配列にはより低い程度で結合する。特定の標的ＤＮＡ配列に選択的に結合するｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の結合を、無関係の配列ではなく、標的部位の実質的に相補的な配列に選択的に誘導する。
【0062】
本明細書で使用される場合、「組換え標的部位」という用語は、標的部位で結合し、標的部位でＤＮＡの特定の配列の組換えを触媒する部位特異的リコンビナーゼによって認識される、結合部位または配列特異的モチーフを含む核酸分子の領域を意味する。部位特異的リコンビナーゼは、そのような２つの標的部位間の組換えを触媒する。標的部位の相対的な配向が組換えの結果を決定する。例えば、組換え標的部位が別々のＤＮＡ分子上にある場合、転座が生じる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「標識」および「検出可能な標識」という用語は、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、半導体ナノ粒子、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などが挙げられるがこれらに限定されない、検出が可能な分子を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲の蛍光を示すことができる物質またはその一部分を指す。本開示の実施で使用され得る標識の特定の例には、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲゴールド、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ染料、例えば、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、およびＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ染料、例えば、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｑｕａｓａｒ ６７０、およびＱｕａｓａｒ ７０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７８４、シアニン染料、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７、フルオレセイン、２’，４’，５’，７’－テトラクロロ－４－７－ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＦＩＴＣ、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｔｅｘａｓレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびα－β－ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【0064】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントを指す。２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列は、配列が分子の定義された長さにわたって、少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％～８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９５％～９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される場合、実質的に相同であるとは、特定の配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。
【0065】
一般に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。同一性パーセントは、配列をアラインし、２つのアラインした配列間の正確な一致数を数え、短い方の配列の長さで割り、結果に１００を掛けることによって、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定され得る。ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ ４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを採用する、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３ ３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣなど、すぐに利用可能なコンピュータープログラムを使用して、分析を補助することができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＡＰプログラムで利用可能であり、これらもスミス－ウォーターマンアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメータを用いて簡単に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、デフォルトのスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いた使用したスミス－ウォーターマンの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【0066】
本開示の文脈でパーセント同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＣｏｒｐ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって流通しているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スミス－ウォーターマンアルゴリズムが用いられ得、デフォルトパラメータがスコアリングテーブルに使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１、ギャップ６）。生成されたデータから、「一致」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための他の好適なプログラムは、当技術分野で一般に知られており、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用され得る。遺伝子コード＝標；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はすぐに利用可能である。
【0067】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定した二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後に続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について定義されるように、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（上記）を参照されたい。
【0068】
「組換え」は、核酸分子を説明するために本明細書で使用される場合、その起源または操作により、それが自然界で関連するポリヌクレオチドの全部または一部分に関連していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般に、以下でさらに説明されるように、目的の遺伝子はクローニングされ、次いで形質転換された生物において発現される。宿主生物は、外来遺伝子を発現して、発現条件下でタンパク質を産生する。
【0069】
「形質転換」という用語は、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、直接の取り込み、形質導入、および接合またはｆ接合による細胞間融合が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは宿主ゲノムに統合され得る。
【0070】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞実体として培養された微生物または高等真核細胞株を示す他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の導入されたＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか、または使用されており、形質転換された元の細胞の元の子孫を含む、細胞を指す。特定の実施形態では、遺伝子修飾される細胞は、真核細胞または原核細胞である。実施形態では、細胞は、一倍体または二倍体酵母細胞であり得る酵母細胞である。実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、真菌細胞、または植物細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
【0071】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御要素」）の制御下に置かれたときに、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定され得る。コード配列には、ウイルス、原核または真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終止配列は、コード配列の３’に位置し得る。
【0072】
典型的な「制御要素」には、転写プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、イントロン（ＲＮＡの任意の場所に位置する）、および翻訳終止配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0073】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成成分がそれらの通常の機能を実行するように構成されている要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を誘導するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然として、コード配列に「作動可能に連結されている」と見なされ得る。
【0074】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。この用語は、遺伝物質の安定した取り込みおよび一時的な取り込みの両方を指し、ペプチドまたは抗体に連結したＤＮＡの取り込みを含む。
【0075】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に導入することができる（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、微粒子担体、およびリポソーム）。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的の核酸の発現を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。
【0076】
「バリアント」、「類似体」、および「ムテイン」という用語は、部位特異的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性などの所望の活性を保持する参照分子の生物学的に活性な誘導体を指す。一般に、「バリアント」および「類似体」という用語は、修飾が生物学的活性を破壊せず、以下に定義されるように参照分子と「実質的に相同」である限り、天然分子と比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、置換（一般に、本質的に保存的）、および／または欠失を有する、天然ポリペプチド配列および構造を有する化合物を指す。一般に、そのような類似体のアミノ酸配列は、２つの配列がアラインされている場合、参照配列に対して高度の配列相同性、例えば、５０％を超える、一般に６０％～７０％を超える、さらにより具体的には８０％～８５％以上、例えば、少なくとも９０％～９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する。多くの場合、類似体は、同じ数のアミノ酸を含むが、本明細書で説明されるように置換を含む。「ムテイン」という用語は、アミノおよび／またはイミノ分子のみを含む化合物を含むがこれに限定されない、１つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチド、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノなどを含む）を含有するポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当技術分野で既知の他の修飾、天然および非天然（例えば、合成）の両方、環化、分岐の分子などをさらに含む。この用語はまた、１つ以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）、および他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子も含む。（例えば、ペプトイドの説明について、米国特許第５，８３１，００５号、同第５，８７７，２７８号、および同第５，９７７，３０１号、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３－４７３、ならびにＳｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７－９３７１を参照されたい）。ポリペプチド類似体およびムテインを作製するための方法は、当技術分野で既知であり、以下でさらに説明される。
【0077】
上で説明したように、類似体は一般に、本質的に保存的である置換、すなわち、それらの側鎖において関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。具体的には、アミノ酸は一般に、４つのファミリーに分けられる。（１）酸性－アスパラギン酸およびグルタミン酸、（２）塩基性－リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性－アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに（４）非荷電極性－グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリントレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類される場合がある。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置き換えは、生物学的活性に対する主な影響を有しないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能が損なわれないままである限り、最大約５～１０個の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらには最大約１５～２５個の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または５～２５の間の任意の整数を含み得る。当業者は、当技術分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化に耐えることができる目的の分子の領域を容易に決定することができる。
【0078】
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法または系を指す。そのような方法は、統合されていない導入ＤＮＡの一過性発現、染色体外複製、および導入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの導入遺伝物質の統合をもたらし得る。遺伝子送達発現ベクターには、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、およびワクシニアウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
「に由来する」という用語は、本明細書において、分子の元の供給源を同定するために使用されるが、例えば、化学合成または組換え手段によるものであり得る、分子が作製される方法を限定することを意味するものではない。
【0080】
指定された配列「に由来する」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち、それに同一または相補的である、およそ少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０～１２個のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５～２０個のヌクレオチドの連続配列を含む、ポリヌクレオチド配列を指す。誘導されたポリヌクレオチドは、必ずしも目的のヌクレオチド配列に物理的に由来するとは限らないが、ポリヌクレオチドが由来する領域内の塩基の配列によって提供される情報に基づく、化学合成、複製、逆転写、または転写を含むがこれらに限定されない任意の様式で生成され得る。したがって、これは、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配向のいずれかを表し得る。
【0081】
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示目的のみのためであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるべきである。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0082】
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の配合またはプロセスパラメータに限定されず、そのようなものは、当然のことながら、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、本開示の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0083】
本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料が、本開示の実施で使用され得るが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。
【0084】
方法
遺伝子バリアント（設計もしくはランダム）または構築物（遺伝子もしくはそうでなければ任意のＤＮＡ）の組み合わせを細胞の集団に導入することための、およびバーコード遺伝子座と呼ばれる一般的な遺伝子座（染色体またはプラスミド）におけるバーコードのアレイを順次に構築することによって各バリアントの組み合わせを追跡するための方法が、本明細書に記載される。各バリアント、遺伝子構築物、または遺伝子修飾は、固有のバーコードによって表され、バーコードおよびその隣接するバーコードを配列決定することにより、配列決定ベースのカウントによって細胞集団内の各バリアント並べ替えの存在量を追跡することが可能になるようにする。
遺伝子バリアント（設計もしくはランダム）または構築物（遺伝子もしくはそうでなければ任意のＤＮＡ）の組み合わせを細胞の集団に導入することための、およびバーコード遺伝子座と呼ばれる一般的な遺伝子座（染色体またはプラスミド）におけるバーコードのアレイを順次に構築することによって各バリアントの組み合わせを追跡するための方法が、本明細書に記載される。各バリアント、遺伝子構築物、または遺伝子修飾は、固有のバーコードによって表され、バーコードおよびその隣接するバーコードを配列決定することにより、配列決定ベースのカウントによって細胞集団内の各バリアント並べ替えの存在量を追跡することが可能になるようにする。
【0085】
一態様では、本開示は、複数の遺伝子操作された細胞を作製するための方法に関する。実施形態では、方法は、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤および第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を含む、形成することと、（ｂ）第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤および第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を含む、形成することとを含み、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生する。実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）を１回以上繰り返すことを含み、ステップ（ｂ）の各繰り返しは、同じまたは異なる複数の組換えポリヌクレオチドを用い、各組換えポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含む。
【0086】
一態様では、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第１の固有の遺伝子修飾を含む第１の複数の遺伝子編集された細胞を産生すること、（ｂ）第１の複数の遺伝子編集された細胞に、第１の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第１の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を含む、形成することによって、複数の遺伝子操作された細胞を産生するための方法が提供される。このようにして、細胞は、未知の（例えば、ランダムな）変異または他の変化によって遺伝子修飾され得、バーコードは、細胞内で変異／変化が行われた後、その変化に関連付けられ得る。実施形態では、方法は、（ｃ）前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第２の固有の遺伝子修飾を有する第２の複数の遺伝子編集された細胞を産生することと、（ｄ）第２の複数の遺伝子編集された細胞に、第２の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第２の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を含む、形成することとを含み、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生する。実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）および（ｄ）を１回以上繰り返すことを含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）の各繰り返しは、同じまたは異なる複数の組換えポリヌクレオチドを用い、各組換えポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含む。
【0087】
一実施形態では、複数の遺伝子操作された細胞は、（ａ）複数の細胞を、第１の遺伝子編集剤および第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第１の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第１の固有の遺伝子修飾を含む、形成すること、ならびに（ｂ）前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を、第２の遺伝子編集剤と接触させ、それによって各々が第２の固有の遺伝子修飾を含む第２の複数の遺伝子編集された細胞を産生すること、ならびに（ｃ）第２の複数の遺伝子編集された細胞に、第２の複数の組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトし、各組換えポリヌクレオチドが、第２の固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することであって、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、各遺伝子編集およびバーコード化された細胞が、バーコード遺伝子座に挿入された第２の固有のポリヌクレオチドバーコード、および第２の固有の遺伝子修飾を含む、形成することの任意の組み合わせによって作製され得る。ステップ（ａ）および（ｂ）／（ｃ）は、任意の順序で実行され得る。実施形態では、ステップ（ａ）および／または（ｂ）／（ｃ）は、１回以上繰り返されて、複数の細胞をさらに遺伝子修飾する。
【0088】
複数の細胞は、すべて同じ細胞（例えば、同じ細胞の属／種、および／もしくは各細胞内で同じ遺伝子配列を有する）で構成され得るか、または異なる細胞であり得る（例えば、少なくともいくつかの細胞は、複数の細胞内の別の細胞（複数可）と比較して、ゲノム配列の少なくとも１つの塩基対の変化を有する）。本明細書で使用される場合、「ゲノム配列」または「ゲノム」という用語は、染色体、プラスミド、またはミトコンドリアＤＮＡを含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの遺伝子をコードする細胞内の任意のＤＮＡであり得る。
【0089】
「固有のポリヌクレオチドバーコード配列」または「固有のポリヌクレオチドバーコード」という用語は、複数の細胞内の細胞の多くまたはすべてが、その中に異なるポリヌクレオチドバーコード配列を有することを示す。実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライブラリであり、各ポリヌクレオチドは、異なるバーコード配列を含む。当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドライブラリは、所与の組換えポリヌクレオチドの複数のコピーを含み得るが、複数の組換えポリヌクレオチド内には、各々が異なる配列を有する組換えポリヌクレオチドの集団が存在する。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドはまた、遺伝子修飾を含有する（および／または細胞内で遺伝子修飾を生じさせるために使用され得る）配列（例えば、ドナーＤＮＡ配列）も含む。そのような実施形態では、バーコードおよび遺伝子修飾は、（例えば、データベースにおいて）関連付けられ、その結果、どのバーコードがバーコード遺伝子座に存在するかを、（例えば、配列決定によって）決定することによって、細胞が遺伝子修飾を有するものと同定され得る。同様に、「固有の遺伝子修飾」は、複数の細胞内の細胞の多くまたはすべてが、その中に異なる遺伝子修飾を有することを示す。
【0090】
実施形態では、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードは、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における第１の固有の遺伝子修飾に関連する。この文脈における「関連する」とは、バーコードの知識（例えば、細胞が特定のバーコードを含有すること）が、その細胞が対応する遺伝子修飾を含有することを示すような、バーコードによる遺伝子修飾の対応を指す。実施形態では、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分は、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の第１の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される。実施形態では、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードは、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々における第２の固有の遺伝子修飾に関連する。実施形態では、前述の第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞の各々のバーコード遺伝子座およびゲノムの少なくとも一部分は、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、データベース内の第２の固有の遺伝子修飾に関連するように配列決定される。例えば、バーコード遺伝子座、および遺伝子修飾を含有するゲノムの少なくとも一部分は、特定の固有のバーコードを含有する細胞内にどの遺伝子修飾が存在するかを同定するために細胞内で配列決定され、その情報は、バーコードが遺伝子修飾に関連しているようなデータベースに入力される。これにより、将来的にバーコード遺伝子座のみを配列決定することによって、細胞が遺伝子修飾を有するものと同定されることが可能になる。
【0091】
いくつかの実施形態では、バーコードは、複数の細胞を、複数の組換えポリヌクレオチドと接触させる前に、（例えば、データベース内の）遺伝子修飾に関連付けられる。つまり、各組換えポリヌクレオチドは、固有のバーコードおよび固有の遺伝子修飾の両方（例えば、標的細胞内に修飾を含むおよび／または修飾を引き起こすドナーＤＮＡまたは他の配列）を含有し得、固有のバーコードおよび固有の遺伝子修飾は、複数の細胞を組換えポリヌクレオチドと接触させる前に関連付けられる（例えば、組換えポリヌクレオチドの配列決定によって）。
【0092】
実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座を配列決定することによって、複数の遺伝子操作された細胞の各々における遺伝子変異を同定することを含む。各細胞（または各細胞のクローンコロニー）内のバーコード遺伝子座の配列決定は、各細胞内に存在するバーコード配列を決定する。これを使用して、データベースをクエリし、そのバーコードに関連付けられている遺伝子修飾を決定することができる。複数のバーコードが存在する場合、データベースは、各バーコード配列についてクエリされ、これにより、単一細胞内の複数の遺伝子修飾の決定が可能になる。さらに、バーコードが存在する順序は、修飾が行われた順序を示す。
【0093】
一態様では、複数のバーコード化された細胞を産生するための方法が提供される。実施形態では、方法は、（ａ）複数の細胞を、第１の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、第１の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第１の複数の細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第１の複数のバーコード化された細胞を形成することを含む。実施形態では、（ｂ）第１の複数のバーコード化された細胞を、第２の複数の組換えポリヌクレオチドと接触させ、各組換えポリヌクレオチドが、固有のポリヌクレオチドバーコード配列を含み、第２の固有のポリヌクレオチドバーコードが、前述の第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された複数の細胞の各々のバーコード遺伝子座に挿入されるようにし、それによって第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞を形成することをさらに含む。そのような細胞内のバーコードは、データベース内の任意の関連情報にリンク／関連付けられ得、バーコード遺伝子座の配列決定およびデータベースのクエリが、各細胞に関する情報を提供するようにする。例えば、バーコードは、遺伝子変異、欠失、挿入、置換、転座、エピジェネティック修飾、導入遺伝子の付加、調節配列の修飾、ＤＮＡ集合、人工染色体、ＣＲＩＳＰＲ干渉のための機能的ガイドＲＮＡ配列構築物、または任意の他の情報に関連付けられ得る。
【0094】
一態様では、ポリヌクレオチド情報を細胞内の単一バーコードに圧縮するための方法が提供される。実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座内に少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを含む細胞を得ることと、細胞のバーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することと、新しい固有のポリヌクレオチドバーコード（コンプレッサーバーコード）が、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、バーコード遺伝子座を配列決定することとを含む。実施形態では、方法は、細胞のバーコード遺伝子座から、少なくとも２つの以前の固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することをさらに含む。このプロセスは、「バーコード圧縮」と称され得る。
【0095】
一態様では、本明細書に記載される方法によって作製された、複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞が提供される。
【0096】
一態様では、本明細書に記載される方法によって作製された、遺伝子編集およびバーコード化された細胞が提供される。
【0097】
実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードに隣接して付加される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの上流に付加される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、バーコード遺伝子座内の以前の固有のポリヌクレオチドバーコードの下流に付加される。
【0098】
実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードには、組換えポリヌクレオチド上で、右相同性アームおよび／または左相同性アームが隣接している。実施形態では、各第１の固有のポリヌクレオチドバーコードには、第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、第１の右相同性アーム、第２の右相同性アーム、および左相同性アームが隣接し、第１の右相同性アームおよび左相同性アームが、バーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする。第２の右相同性アームは、第１の右相同性アームと左相同性アームとの間に位置し、バーコード遺伝子座で第１の固有のポリヌクレオチドバーコードと統合するようにする。実施形態では、各第２の固有のポリヌクレオチドバーコードには、第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチド上で、第２の右相同性アーム、左相同性アーム、および任意に第３の右相同性アームが隣接し、第２の右相同性アームおよび左相同性アームが、バーコード遺伝子座への第１の固有のポリヌクレオチドバーコードの統合後のバーコード遺伝子座の配列と相同であるようにする。
【0099】
実施形態では、第１の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドは、左相同性アームと第２の右相同性アームとの間に第１のマーカーポリヌクレオチドを含む。実施形態では、第２の複数のポリヌクレオチドの各組換えポリヌクレオチドは、左相同性アームと第３の右相同性アームとの間に第２のマーカーポリヌクレオチドを含む。実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコードと共にバーコード遺伝子座に組み込まれる。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、マーカーポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、固有のポリヌクレオチドバーコードと共にバーコード遺伝子座に組み込まれる。実施形態では、方法は、マーカーポリヌクレオチドの存在に関して、細胞を選択することを含む。実施形態では、方法は、マーカーポリヌクレオチドの非存在に関して、細胞を選択することを含む。実施形態では、第１の複数の組換えポリヌクレオチド中のマーカーポリヌクレオチドは、第２の複数の組換えポリヌクレオチド中のマーカーポリヌクレオチドとは異なる。
【0100】
ポリヌクレオチド（および任意選択で、任意の関連配列、例えば、マーカー配列、相同性アームなど）は、任意の手段によってバーコード遺伝子座に挿入され得る。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、相同組換えによってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、非相同末端結合によってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、インテグラーゼを使用してバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のポリヌクレオチドバーコードは、トランスポザーゼを使用してバーコード遺伝子座に挿入される。
【0101】
実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである。実施形態では、第１および／または第２の遺伝子編集剤は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。実施形態では、第１の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ系である。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。実施形態では、第２の遺伝子編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ系である。
【0102】
実施形態では、第１の遺伝子編集剤および第２の遺伝子編集剤は同じである。実施形態では、第１の遺伝子編集剤および第２の遺伝子編集剤は異なる。
【0103】
実施形態では、方法は、第１の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することを含む。実施形態では、方法は、第２の複数の遺伝子編集およびバーコード化された細胞からの細胞の染色体の少なくとも一部分を配列決定することを含む。実施形態では、バーコード遺伝子座は、配列決定される。実施形態では、少なくとも１つの遺伝子修飾は、配列決定によって決定される。
【0104】
実施形態では、方法は、固有のポリヌクレオチドバーコードを用いて少なくとも１つの遺伝子修飾を同定することを含む。
【0105】
実施形態では、方法は、（ｉ）各細胞のバーコード遺伝子座に新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入することを含み、バーコード遺伝子座は、新しい固有のポリヌクレオチドバーコードを挿入する前に、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを含む。実施形態では、方法は、（ｉｉ）新しい固有のポリヌクレオチドバーコードが少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードに関連するように、バーコード遺伝子座を配列決定することを含む。実施形態では、方法は、（ｉｉｉ）各細胞のバーコード遺伝子座から、少なくとも２つの固有のポリヌクレオチドバーコードを除去することを含む。実施形態では、方法は、遺伝子修飾／バーコード化ステップ（例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ））を繰り返し、それによって複数の遺伝子操作された細胞を産生することを含む。
【0106】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ベクターによって提供される。実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。実施形態では、ベクターは、高コピー数ベクターである。特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、直鎖状ＤＮＡとして提供される。特定の実施形態では、直鎖状またはベクターＤＮＡ上の各組換えポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されて、宿主細胞内の転写を可能にし、かつＲＮＡ配列要素と作動可能に連結されて、組換えＲＮＡの逆転写を可能にして、一本鎖ドナーＤＮＡを生成する。一本鎖ＤＮＡを生成する方法は当業者に既知であり、細菌レトロン系（例えば、Ｅｃ８６レトロン）、またはウイルス逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）の使用を含む。例えば、方法は、ＰＣＲ産物として提供されるゲノム編集カセットを含む組換えポリヌクレオチドを増幅することをさらに含み得る。
【0107】
実施形態では、バーコード遺伝子座は、染色体バーコード遺伝子座である。
【0108】
実施形態では、遺伝子修飾は、設計された遺伝子修飾である。
【0109】
重要なことに、本明細書に記載されるバーコードは、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集構築物との関連に制限されないが、既知または未知の遺伝子変化をもたらす任意の遺伝子修飾プロセス、またはＤＮＡ内の任意のデジタル情報の保存および圧縮により幅広い用途を有する。そのような用途の非限定的な例には、ゲノム修飾、遺伝子構築物、エピジェネティック修飾、および系統追跡が含まれる（図１Ａ）。
【0110】
遺伝子編集剤は、当技術分野で既知である。遺伝子編集剤は、誘導された（設計された）遺伝子修飾を引き起こす薬剤、または自発的な（ランダムな）遺伝子変異を引き起こす物理的および化学的薬剤（例えば、変異原）であり得る。実施形態では、遺伝子編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、熱、放射線、化学薬品、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼである。
【0111】
実施形態では、遺伝子編集剤は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ系である。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＦｎＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（例えば、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１）、Ｍａｄ７、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＬｓｈＣ２ｃ２、Ｃａｓ１４、ｄＳｐＣａｓ９－ＦｏｋＩ、スプリット－ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ニッカーゼを含むがこれらに限定されない、任意のそのような系であり得る。さらなるＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｈ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３（７６０３）：４２０－４に記載されるように既知であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0112】
実施形態では、バーコード遺伝子座でのバーコードの統合は、部位特異的リコンビナーゼ系を使用して実行される。この目的のために使用され得る例示的な部位特異的リコンビナーゼ系には、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ部位特異的リコンビナーゼ系、Ｆｌｐ－ＦＲＴ部位特異的リコンビナーゼ系、ＰｈｉＣ３１－ａｔｔ部位特異的リコンビナーゼ系、およびＤｒｅ－ｒｏｘ部位特異的リコンビナーゼ系が含まれる。使用され得るこれらおよび他の部位特異的リコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（５）：４１１－４１９、Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ６（１）：７－２８、Ｂｉｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６１：２４５－２６３、Ｂｕｃｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．Ｍａｙ ２９（１５）ｐｉｉ：７１８、Ｎｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８（３４）：１４１９８－１４２０３、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８（２）：３８８－３９４、Ｔｕｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２５（１２）：４０８８－４１０７、Ｇａｒｃｉａ－Ｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１１０８－１１３６、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１１（１）：１－１５、Ｋｒａｐｐｍａｎｎ（２０１４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８（５）：１９７１－１９８２、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ４（１）：６５－８０、およびＬｏｐａｔｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．５６（４）：５４７－５５０を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0113】
部位特異的組換えによる統合を可能にするために、部位特異的リコンビナーゼの組換え標的部位がバーコード遺伝子座に付加され得る。さらに、組換えポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチド上の組換え標的部位とバーコード遺伝子座における組換え標的部位との間の部位特異的組換えが、バーコード遺伝子座でのゲノム編集カセットの統合をもたらすように、部位特異的リコンビナーゼの適合する組換え標的部位を有して設計され得る。
【0114】
特定の実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を阻害することをさらに含む。例えば、ＮＨＥＪは、細胞を、ウォルトマンニンおよびＳｃｒ７からなる群から選択される小分子阻害剤と接触させることによって阻害され得る。あるいは、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲ干渉を使用して、ＮＨＥＪ経路のタンパク質構成成分の発現を阻害することができる。
【0115】
他の実施形態では、方法は、ＨＤＲエンハンサーまたは能動的ドナー動員を使用して、細胞内のＨＤＲの頻度を増加させることをさらに含む。特定の実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を使用して、ＨＤＲによって遺伝子修飾された細胞の頻度をさらに増加させる。ＮＨＥＪ経路の阻害剤の例には、ＮＨＥＪ経路における任意のタンパク質構成成分の発現または活性のいずれかを阻害または遮断する任意の化合物（薬剤）が含まれる。ＮＨＥＪ経路のタンパク質構成成分には、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡプロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、Ｒａｄ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびＸＲＣＣ４が含まれまるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤は、ＮＨＥＪ経路の少なくとも１つのタンパク質構成成分（例えば、ＤＮＡ－ＰＫ）を阻害するウォルトマンニンである。別の例示的な阻害剤は、ＤＳＢの結合を阻害するＳｃｒ７（５，６－ビス（（Ｅ）－ベンジリデンアミノ）－２－メルカプトピリミジン－４－オール）である（Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（５）：５３８－５４２、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：３４５３１）。ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲ干渉はまた、ＮＨＥＪ経路のタンパク質構成成分（例えば、ＤＮＡ－ＰＫまたはＤＮＡリガーゼＩＶ）の発現を遮断するためにも使用され得る。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、およびインビボで切断または解離されてｓｉＲＮＡを形成することができる他のＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡ種を使用して、ＲＮＡ干渉によってＮＨＥＪ経路を阻害し得る。あるいは、ＮＨＥＪ経路の遺伝子のプロモーターまたはエクソン配列に相補的な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共に、非活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を、ＣＲＩＳＰＲ干渉による転写抑制に使用することができる。あるいは、ＲＳ－１などのＨＤＲエンハンサーを使用して、細胞内のＨＤＲの頻度を増加させ得る（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０５４８）。
【0116】
ゲノム編集は、目的の単一細胞または細胞集団に対して実行され得、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物、および動物を含む、原核生物、真核生物、または古細菌生物に由来する任意の細胞を含む、任意のタイプの細胞に対して実行され得る。組織、臓器、および生検からの細胞、ならびに組換え細胞、遺伝子修飾された細胞、インビトロで培養された細胞株由来の細胞、および人工細胞（例えば、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、または核酸を封入するマイクロカプセル）はすべて、本明細書に記載される方法および組成物の実施で使用され得る。本明細書に記載される方法は、核酸を含む細胞断片、細胞構成成分、または細胞小器官（例えば、動物および植物細胞内のミトコンドリア、植物細胞および藻類の色素体（例えば、葉緑体））中の核酸の編集にも適用可能である。細胞は、本明細書に記載されるようにゲノム編集を実行する前または後に、培養または増殖され得る。一実施形態では、細胞は、酵母細胞である。
【0117】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ系
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ベクターによって提供される。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、細胞のゲノムに統合された第２の核酸配列によって提供される。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼである。実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、固有のバーコード配列と同じ組換えポリヌクレオチド上に提供される。実施形態では、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ドナーＤＮＡ）および／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドは、各細胞に組み込まれる。実施形態では、ｇＲＮＡは、修飾されるゲノム標的遺伝子座でハイブリダイズすることができる。実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、ゲノム標的遺伝子座に統合される意図した編集を含むヌクレオチド配列に隣接する３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、複数の組換えポリヌクレオチドが１つ以上のゲノム標的遺伝子座で複数の異なる意図した編集をもたらすことができるように、異なるガイドＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドの組み合わせを含む異なるゲノム編集カセットを含む。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、１つ以上のゲノム標的遺伝子座で細胞のゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生じさせ、各細胞内に存在するドナーポリヌクレオチドは、複数の遺伝子修飾された細胞が産生されるような相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、その５’相同性および３’相同性アームによって認識されるゲノム標的遺伝子座で統合される。
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ベクターによって提供される。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、細胞のゲノムに統合された第２の核酸配列によって提供される。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼまたは操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼである。実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、固有のバーコード配列と同じ組換えポリヌクレオチド上に提供される。実施形態では、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ドナーＤＮＡ）および／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドは、各細胞に組み込まれる。実施形態では、ｇＲＮＡは、修飾されるゲノム標的遺伝子座でハイブリダイズすることができる。実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、ゲノム標的遺伝子座に統合される意図した編集を含むヌクレオチド配列に隣接する３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、複数の組換えポリヌクレオチドが１つ以上のゲノム標的遺伝子座で複数の異なる意図した編集をもたらすことができるように、異なるガイドＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドの組み合わせを含む異なるゲノム編集カセットを含む。実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、１つ以上のゲノム標的遺伝子座で細胞のゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生じさせ、各細胞内に存在するドナーポリヌクレオチドは、複数の遺伝子修飾された細胞が産生されるような相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、その５’相同性および３’相同性アームによって認識されるゲノム標的遺伝子座で統合される。
【0118】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ベクターによって提供される。実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。実施形態では、ベクターは、高コピー数ベクターである。特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、直鎖状ＤＮＡとして提供される。例えば、方法は、ＰＣＲ産物として提供されるゲノム編集カセットを含む組換えポリヌクレオチドを増幅することをさらに含み得る。
【0119】
特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはまた、ベクターによって提供される。特定の実施形態では、ゲノム編集カセットおよびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、単一ベクターまたは別個のベクターによって提供される。別の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノムに統合される。
【0120】
ガイドＲＮＡの転写は、一般に、ゲノム編集カセット、ベクター、またはゲノム編集カセットが挿入されているゲノム遺伝子座（例えば、バーコード遺伝子座）に含まれ得るプロモーターの存在に依存する。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであり得る。特定の実施形態では、各ゲノム編集カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の実施形態では、バーコード遺伝子座は、バーコード遺伝子座で統合する任意のゲノム編集カセットのガイドＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるようになるプロモーターを含む。別の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ベクターによって提供され、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはドナーＤＮＡカセットは、組換えポリヌクレオチドバーコードと共にバーコード遺伝子座に統合される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドバーコードのみがバーコード遺伝子座に統合する。
【0121】
特定の実施形態では、遺伝子編集剤（任意に、ドナーポリヌクレオチドおよび／またはガイドＲＮＡと組み合わせて）は、単一遺伝子内の複数の部位で変異をもたらすことができる。他の実施形態では、遺伝子編集剤は、異なる遺伝子内の複数の部位またはゲノム内の任意の場所で変異をもたらすことができる。例えば、遺伝子編集剤（例えば、ドナーポリヌクレオチド）は、挿入、欠失、または置換などの異なる変異を遺伝子に導入し得る。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集剤（例えば、ドナーポリヌクレオチド）は、遺伝子を不活性化する変異を導入する。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集剤（例えば、ドナーポリヌクレオチド）は、遺伝子から変異を除去する。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子編集剤（例えば、ドナーポリヌクレオチド）は、正確な遺伝的変化をゲノムＤＮＡに挿入する。
【0122】
特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、ゲノム編集カセットに隣接する一対の制限部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、制限部位は、ＤＮＡ二本鎖切断をもたらすメガヌクレアーゼ（例えば、ＳｃｅＩ）によって認識される。メガヌクレアーゼの発現は、誘導性プロモーターによって制御され得る。
【0123】
別の実施形態では、ゲノム編集カセットは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の５’末端に、ｔＲＮＡ遺伝子をさらに含む。
【0124】
別の実施形態では、ゲノム編集カセットは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の５’末端に、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態では、ゲノム編集カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターに隣接するガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の５’末端に、ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＲ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態では、ゲノム編集カセットは、リボザイム、例えば、ＣＰＥＢ３、ＰＭＡＲ１、またはＲｉｂｏＪをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【0125】
別の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ１２ａ）、または操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼである。
【0126】
別の実施形態では、ゲノム編集カセットには、メガヌクレアーゼによって認識される制限部位が隣接している。
【0127】
実施形態では、各ゲノム編集カセットは、各ゲノム編集カセットによってコードされるガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドを同定するための、固有のバーコード配列をさらに含む。一実施形態では、方法は、バーコード遺伝子座で統合されたガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを欠失させる一方で、欠失した配列を表す前述のバーコード遺伝子座に固有のバーコードを保持することをさらに含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも１つの遺伝子修飾された細胞のバーコード遺伝子座でバーコードを配列決定して、前述の細胞を遺伝子修飾する際に使用されるゲノム編集カセットを同定することをさらに含む。
【0128】
特定の実施形態では、方法は、各ゲノム編集カセットを配列決定することをさらに含む。バーコードを特定のｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドの組み合わせに連結するためのゲノム編集カセットの配列決定は、例えば、ゲノム編集カセットをベクターにライゲーションする前、または細胞をトランスフェクトする前の中間クローニングステップで実行され得る。あるいはまたは加えて、バーコード遺伝子座で統合されているゲノム編集カセットの配列決定を使用して、遺伝子修飾された細胞に対して実行されるゲノム編集を決定し得る。
【0129】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、そのガイドＲＮＡ配列を改変することによって、特定のゲノム配列（すなわち、修飾されるゲノム標的配列）に標的化され得る。標的特異的ガイドＲＮＡは、ゲノム標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、それによって標的部位でのハイブリダイゼーションによるヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体の結合を媒介する。例えば、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体を変異部位に標的化するために、マイナー対立遺伝子の配列に相補的な配列を有して設計され得る。変異は、挿入、欠失、または置換を含み得る。例えば、変異は、一塩基多様性、遺伝子融合、転座、逆位、重複、フレームシフト、ミスセンス、ナンセンス、または目的の表現型または疾患に関連する他の変異を含み得る。標的化マイナー対立遺伝子は、一般的な遺伝子バリアントまたはまれな遺伝子バリアントであり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体の一塩基多型（ＳＮＰ）への結合を可能にするために、単一の塩基対識別でマイナー対立遺伝子に選択的に結合するように設計されている。特に、ｇＲＮＡは、遺伝子から変異を除去するためのゲノム編集のために、目的の疾患関連の変異を標的化するように設計され得る。あるいは、ｇＲＮＡは、欠失、または置換など、細胞のゲノムＤＮＡ内の遺伝子に変異を導入するゲノム編集の目的で、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体を対立遺伝子に標的化するために、メジャーまたは野生型対立遺伝子の配列に相補的な配列を有して設計され得る。そのような遺伝子修飾された細胞は、例えば、表現型を改変する、新しい特性を付与する、または薬物スクリーニングのための疾患モデルを作るために使用され得る。
【0130】
特定の実施形態では、ゲノム修飾に使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）系Ｃａｓヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ系タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩのＣａｓヌクレアーゼを含む、ＨＤＲ機構によるドナーポリヌクレオチドの統合を可能にするための、ＤＮＡの部位特異的切断を触媒することができる任意のＲＮＡ誘導Ｃａｓヌクレアーゼが、ゲノム編集で使用され得る。Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘｌ２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ、Ｍａｄ７、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾型が含まれる。
【0131】
特定の実施形態では、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが使用される。任意の種由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を保持する（すなわち、ＤＮＡの部位特異的切断を触媒して二本鎖切断をもたらす）その生物学的に活性な断片、バリアント、類似体、もしくは誘導体を使用して、本明細書に記載されるゲノム修飾を実行し得る。Ｃａｓ９は、物理的に生物に由来する必要はないが、合成または組換えにより産生され得る。多くの細菌種由来のＣａｓ９配列が当技術分野でよく知られており、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに列挙されている。例えば、次に由来するＣａｓ９のＮＣＢＩエントリを参照されたい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＷＰ＿００２９８９９５５、ＷＰ＿０３８４３４０６２、ＷＰ＿０１１５２８５８３）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＷＰ＿０２２５５２４３５、ＹＰ＿００２３４４９００）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（ＷＰ＿０６０７８６１１６）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ（ＷＰ＿０５９４３４６３３）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣ＿０１５６８３、ＮＣ＿０１７３１７）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣ＿０１６７８２、ＮＣ＿０１６７８６）；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣ＿０２１２８４）；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣ＿０１７８６１）；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣ＿０２１８４６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ（ＮＣ＿０２１３１４）；Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ（ＮＣ＿０１８０１０）；Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓＩ（ＮＣ＿０１８７２１）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＹＰ＿８２０８３２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ＷＰ＿０６１０４６３７４、ＷＰ＿０２４７８６４３３）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（ ＮＰ＿４７２０７３）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＷＰ ０６１６６５４７２）；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（ＷＰ ０６２７２６６５６）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＷＰ＿００１５７３６３４）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０３２７２９８９２、ＷＰ＿０１４５４８４２０）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＷＰ＿０４８４８２５９５、ＷＰ＿０３２９６５１７７）；およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＷＰ＿０６１７０４９４９、ＹＰ＿００２３４２１００）。これらの配列のすべて（本出願の出願日までに入力された）は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの配列のいずれか、またはそれと少なくとも約７０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意の同一性パーセント、例えば、それと７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列を含むそのバリアントが、本明細書に記載されるように、ゲノム編集のために使用され得る。配列比較、ならびにＣａｓ９の遺伝的多様性および系統発生分析の考察について、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（４）：２５７７－９０、Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８（５）：７９７－８０７、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６０（３）：３８５－３９７、およびＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（１０）：６０９１－６１０５も参照されたい。
【0132】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、細菌および古細菌内で自然に発生し、そこで、外来ＤＮＡに対するＲＮＡ媒介適応免疫において役割を果たす。細菌クラス２タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、エンドヌクレアーゼであるＣａｓ９を使用し、これは、相補的なゲノム標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、切断を触媒して二本鎖切断をもたらす。Ｃａｓ９の標的化は、典型的には、ｇＲＮＡ結合部位のちょうど３’のＤＮＡ内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在にさらに依存する。
【0133】
ゲノム標的部位は、典型的には、ｇＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を含み、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をさらに含み得る。特定の実施形態では、標的部位は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の場合、３塩基対ＰＡＭに加えて、２０～３０個の塩基対を含む。典型的には、ＰＡＭの第１のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであり得るが、他の２つのヌクレオチドは、選択された特定のＳｐＣａｓ９バリアントに依存する。例示的なＰＡＭ配列は、当業者に既知であり、ＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧを含むがこれらに限定されず、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを表す。特定の実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される対立遺伝子は、対立遺伝子内にＰＡＭを作る変異を含み、ＰＡＭは、対立遺伝子へのＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の結合を促進する。
【0134】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、長さが５～５０個のヌクレオチド、１０～３０個のヌクレオチド、１５～２５個のヌクレオチド、１８～２２個のヌクレオチド、もしくは１９～２１個のヌクレオチド、または例えば、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５個のヌクレオチドを含む、記載された範囲の間の任意の長さである。ガイドＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子内にｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一ガイドＲＮＡであり得るか、またはガイドＲＮＡは、別個のＲＮＡ分子内に存在するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有する２つのＲＮＡ分子を含み得る。
【0135】
別の実施形態では、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａ）が使用され得る。Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９との類似点を有するクラス２タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼであり、類似的に使用され得る。Ｃａｓ９とは異なり、Ｃａｓ１２ａは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、そのガイドＲＮＡ内のｃｒＲＮＡのみに依存し、これにより、Ｃａｓ９よりも短いガイドＲＮＡが、標的化のためにＣａｓ１２ａで使用され得るという利点が提供される。Ｃａｓ１２ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを切断することができる。Ｃａｓ１２ａによって認識されるＰＡＭ部位は、Ｃａｓ９によって認識されるＧリッチＰＡＭ部位とは対照的に、５’－ＹＴＮ－３’を有する（ここで、「Ｙ」はピリミジン、「Ｎ」は任意の核酸塩基である）、またはより一般的には５’－ＴＴＴＶ－３’（ここで、「Ｖ」はＴ以外の任意の塩基である）の配列を有する。ＤＮＡのＣａｓ１２ａ切断は、４または５のヌクレオチドのオーバーハングを有する粘着末端を有する二本鎖切断をもたらす。Ｃａｓ１２ａの考察については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ．５２６（７５７１）：１７－１７、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９－７７１、Ｍｕｒｏｖｅｃ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１５（８）：９１７－９２６、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８：１７７、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｏｓｔｅｐｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（３）：３１５－３２６を参照されたい。
【0136】
Ｃ２ｃ１は、使用され得る別のクラス２タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ１は、Ｃａｓ９と同様に、標的部位への誘導についてｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。Ｃ２ｃ１の説明については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．６０（３）：３８５－３９７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８：１７７を参照されたい。
【0137】
さらに別の実施形態では、操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼが使用され得る。ＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼは、不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの融合（ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９）を含み、ｄＣａｓ９部分は、ＦｏｋＩ上にガイドＲＮＡ依存性標的化を付与する。操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼの説明については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｖｌｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（２）：３４２－３５５、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．６：３５７９４、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（６）：５６９－５７６を参照されたい。
【0138】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと複合体を形成したヌクレアーゼなどのタンパク質の形態で提供され得るか、またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）もしくはＤＮＡ（例えば、発現ベクター）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸によって提供され得る。コドン使用は、特定の細胞または生物内のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの産生を改善するために最適化され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、酵母細胞、細菌細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞内でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸が細胞に導入されると、タンパク質は、一時的に、条件付きで、または構成的に細胞内で発現され得る。
【0139】
ドナーポリヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、標準的な技術、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９２）４８：２２２３－２３１１、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１３（１ Ａｐｒｉｌ １９８７）に開示されるようなホスホルアミダイト化学による固相合成によって容易に合成される。他の化学合成には、例えば、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０によって記載されるホスホトリエステル法、およびＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９によって開示されるホスホジエステル法が含まれる。短い長さのｇＲＮＡ（典型的には、長さが約２０個のヌクレオチド）およびドナーポリヌクレオチド（典型的には、約１００～１５０個のヌクレオチド）を考慮して、ｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドカセットは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術によって産生され、続いてベクターにライゲーションされ得る。さらに、数千のゲノム標的に対するｇＲＮＡドナーポリヌクレオチドカセットのライブラリは、高並列アレイベースのオリゴヌクレオチドライブラリ合成法を使用して容易に作成され得る（例えば、Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：２４１－２４８、Ｓｖｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４９０６を参照されたい）。
【0140】
さらに、アダプター配列をオリゴヌクレオチドに付加して、ハイスループットの増幅または配列決定を容易にすることができる。例えば、アダプター配列の対をオリゴヌクレオチドの５’および３’末端に付加して、同じプライマーセットによる複数のオリゴヌクレオチドの同時の増幅または配列決定を可能にすることができる。さらに、制限部位をオリゴヌクレオチドに組み込んで、オリゴヌクレオチドのベクターへのクローニングを容易にすることができる。例えば、ｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドカセットを含むオリゴヌクレオチドは、ゲノム修飾ベクターへのライゲーションを容易にするために、共通の５’制限部位および共通の３’制限部位を有して設計され得る。共通の５’制限部位および共通の３’制限部位で各オリゴヌクレオチドを選択的に切断する制限消化が実行されて、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）にクローニングされ得る制限断片を産生し、続いてｇＲＮＡドナーポリヌクレオチドカセットを含むベクターで、細胞を形質転換する。
【0141】
ｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドカセットをコードするポリヌクレオチドの増幅は、例えば、ゲノム修飾ベクターへのライゲーションの前、または配列決定の前、およびバーコード化の後に実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられるがこれらに限定されない、オリゴヌクレオチドを増幅するための任意の方法が使用され得る。一実施形態では、ゲノム編集カセットは、ユニバーサルプライマーのセットと並行してｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチド配列の増幅を可能にするための、共通の５’および３’プライミング部位を含む。別の実施形態では、選択的プライマーのセットが使用されて、プールされた混合物からｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドのサブセットを選択的に増幅する。
【0142】
ゲノム編集カセットを含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞は、原核細胞または真核細胞であり得、好ましくは、形質転換によるｇＲＮＡ－ドナーポリヌクレオチドライブラリの高効率の組み込みのために設計され得る。核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野でよく知られている。一般的に使用される形質転換の方法には、典型的には二価の陽イオン（例えば、ＣａＣｌ２）を使用する化学的に誘導された形質転換、およびエレクトロポレーションが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0143】
ＤＮＡ切断への細胞内ドナーＤＮＡのランダムな拡散は、相同的修復の律速となり得る。能動的ドナー動員を使用して、ＮＨＥＪおよび細胞死の競合経路よりもＨＤＲを優先することによって、ドナーＤＮＡによって遺伝子修飾された細胞の頻度を増加させ得る。能動的ドナー動員のための方法は、ａ）核酸結合ドメインを含むポリペプチドに接続されたＤＮＡ切断に選択的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質を、細胞に導入することと、ｂ）ｉ）ＤＮＡ切断に隣接する配列にハイブリダイズするのに十分に相補的なヌクレオチド配列、およびｉｉ）融合タンパク質の核酸結合ドメインによって認識される結合部位を含むヌクレオチド配列を含むドナーポリヌクレオチドを、細胞に導入し、核酸結合ドメインは、ドナーポリヌクレオチド上の結合部位に選択的に結合して、ドナーポリヌクレオチドと融合タンパク質との間の複合体を産生し、それによってドナーポリヌクレオチドをＤＮＡ切断に動員し、ＨＤＲを促進することとを含む。
【0144】
ＤＮＡ切断は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣ２ｃ１）、操作されたＲＮＡ誘導ＦｏｋＩヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、またはＩ－ＤｍｏＩ）、ホーミングエンドヌクレアーゼなどであるがこれらに限定されない、部位特異的ヌクレアーゼによって生じ得る。ドナーポリヌクレオチドの標的統合部位で配列を選択的に切断する任意の部位特異的ヌクレアーゼが使用され得る。
【0145】
ＤＮＡ切断は、一本鎖（ニック）または二本鎖ＤＮＡ切断であり得る。ＤＮＡ切断が一本鎖ＤＮＡ切断である場合、使用される融合タンパク質が、一本鎖ＤＮＡ切断に選択的に結合するタンパク質を含む一方で、ＤＮＡ切断が二本鎖ＤＮＡ切断である場合、使用される融合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡ切断に選択的に結合するタンパク質を含む。
【0146】
融合において、ＤＮＡ切断に選択的に結合するタンパク質は、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ１２ａ）などのＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、または操作されたＲＮＡ誘導性ＦｏｋＩヌクレアーゼであり得る。
【0147】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得、ＲＮＡまたはＤＮＡで構成され得る。ＤＮＡを含むドナーポリヌクレオチドは、必要に応じて、細菌レトロン系内などの逆転写酵素を使用するか、またはウイルス逆転写酵素を用いる逆転写によって、ＲＮＡを含むドナーポリヌクレオチドから産生され得る。融合タンパク質内の核酸結合ドメインのタイプに応じて、ドナーポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ結合ドメインによって認識されるＲＮＡ配列、またはＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列を含む、対応する結合部位を含み得る。例えば、融合タンパク質は、ドナーポリヌクレオチド内の対応するＬｅｘＡ結合部位と適合されるように、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインで構築され得る。別の例では、融合タンパク質は、ドナーポリヌクレオチド内の対応するＦｋｈ１結合部位と適合されるように、Ｆｋｈ１ ＤＮＡ結合ドメインで構築され得る。
【0148】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ホスホトレオニン結合ドメイン（例えば、ＦＨＡ）をさらに含み得、ドナーポリヌクレオチドは、ホスホトレオニン結合ドメインがリン酸化トレオニン残基に結合するために、ＤＮＡ切断に十分に近く位置するリン酸化トレオニン残基を含むタンパク質を有するＤＮＡ切断に選択的に動員される。ホスホトレオニン結合ドメインは、ドナー動員のために任意のＤＮＡ結合ドメインと組み合わされ得る（例えば、ＬｅｘＡ－ＦＨＡを生成するためのＬｅｘＡとの融合）。
【0149】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＸ）をコードする、第２の核酸配列をさらに含む。実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体が組換えポリヌクレオチドを切断するように、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成する。実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、プラスミドベクターであり、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体は、プラスミドベクターを線形化する。
【0150】
実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＸ）をコードする、第２の核酸配列をさらに含み、ガイドＲＮＡは、各細胞内のヌクレアーゼと複合体を形成し、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼ複合体がバーコード遺伝子座を切断するようにする。
【0151】
配列検証
特定の実施形態では、方法は、複数の遺伝子修飾された細胞の配置、続いて、アレイ内の各コロニーのバーコード遺伝子座の高並列配列検証をさらに含む。例は、米国特許公開第２０１６／０１２２７４８号で見られ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態では、方法は、ａ）遺伝子修飾された細胞の増殖に適した培地上に、順序付けられたアレイで、複数の遺伝子修飾された細胞をプレーティングすることと、ｂ）複数の遺伝子修飾された細胞を、各遺伝子修飾された細胞が順序付けられたアレイでクローンのコロニーを産生する条件下で培養することと、ｃ）順序付けられたアレイ内のコロニーからバーコーダー細胞にゲノム修飾バーコードを導入することであって、バーコーダー細胞が、部位特異的リコンビナーゼの組換え標的部位、およびゲノム修飾バーコードが対応する順序付けられたアレイ内のコロニーの位置を同定する隣接バーコード配列を含む核酸を含む、導入することと、ｄ）部位特異的リコンビナーゼ系を使用して、ゲノム修飾バーコードを、バーコーダー細胞のバーコード配列に隣接する位置に移動させることであって、バーコーダー細胞の組換え標的部位での部位特異的組換えは、ゲノム修飾バーコードに連結されたバーコード配列を含む核酸を生成する、移動させることと、ｅ）ゲノム修飾バーコードに連結されたバーコーダー細胞のバーコード配列を含む核酸を配列決定して、コロニーからゲノム修飾バーコードの配列を同定することであって、バーコーダー細胞のバーコード配列が、ゲノム修飾バーコードが由来する順序付けられたアレイ内のコロニーの位置を同定するために使用される、同定することと、ｆ）バーコーダー細胞のバーコードによって同定される順序付けられたアレイ内のコロニーから、ゲノム修飾バーコードを含むクローンを選択することとを含む。ゲノム修飾バーコードが対応するゲノム編集カセット（例えば、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチド）、例えば、ゲノム修飾バーコードおよびゲノム修飾カセットが存在するベクターは、トランスフェクション前に、配列決定によって以前に決定されたゲノム編集カセット－バーコード関連のデータベースから同定され得る。実施形態では、方法は、バーコーダー細胞のバーコードによって同定される順序付けられたアレイ内のコロニーから、遺伝子修飾バーコードを含むクローンを選択することを含む。実施形態では、方法は、複数のクローンが選択および配列決定されるように並行して行われる。
特定の実施形態では、方法は、複数の遺伝子修飾された細胞の配置、続いて、アレイ内の各コロニーのバーコード遺伝子座の高並列配列検証をさらに含む。例は、米国特許公開第２０１６／０１２２７４８号で見られ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態では、方法は、ａ）遺伝子修飾された細胞の増殖に適した培地上に、順序付けられたアレイで、複数の遺伝子修飾された細胞をプレーティングすることと、ｂ）複数の遺伝子修飾された細胞を、各遺伝子修飾された細胞が順序付けられたアレイでクローンのコロニーを産生する条件下で培養することと、ｃ）順序付けられたアレイ内のコロニーからバーコーダー細胞にゲノム修飾バーコードを導入することであって、バーコーダー細胞が、部位特異的リコンビナーゼの組換え標的部位、およびゲノム修飾バーコードが対応する順序付けられたアレイ内のコロニーの位置を同定する隣接バーコード配列を含む核酸を含む、導入することと、ｄ）部位特異的リコンビナーゼ系を使用して、ゲノム修飾バーコードを、バーコーダー細胞のバーコード配列に隣接する位置に移動させることであって、バーコーダー細胞の組換え標的部位での部位特異的組換えは、ゲノム修飾バーコードに連結されたバーコード配列を含む核酸を生成する、移動させることと、ｅ）ゲノム修飾バーコードに連結されたバーコーダー細胞のバーコード配列を含む核酸を配列決定して、コロニーからゲノム修飾バーコードの配列を同定することであって、バーコーダー細胞のバーコード配列が、ゲノム修飾バーコードが由来する順序付けられたアレイ内のコロニーの位置を同定するために使用される、同定することと、ｆ）バーコーダー細胞のバーコードによって同定される順序付けられたアレイ内のコロニーから、ゲノム修飾バーコードを含むクローンを選択することとを含む。ゲノム修飾バーコードが対応するゲノム編集カセット（例えば、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチド）、例えば、ゲノム修飾バーコードおよびゲノム修飾カセットが存在するベクターは、トランスフェクション前に、配列決定によって以前に決定されたゲノム編集カセット－バーコード関連のデータベースから同定され得る。実施形態では、方法は、バーコーダー細胞のバーコードによって同定される順序付けられたアレイ内のコロニーから、遺伝子修飾バーコードを含むクローンを選択することを含む。実施形態では、方法は、複数のクローンが選択および配列決定されるように並行して行われる。
【0152】
「バーコーダー細胞」という用語は、バーコード配列を含む核酸を含む細胞を指す。一実施形態では、バーコードは、バーコーダー細胞を含むコロニーの位置を同定する。
【0153】
例えば、遺伝子修飾された細胞は、一倍体酵母細胞であり得、バーコーダー細胞は、遺伝子修飾された細胞と交配することができる一倍体酵母細胞であり得、順序付けられたアレイ内の遺伝子修飾された一倍体酵母コロニーからのゲノム編集カセットバーコードを、バーコーダー一倍体酵母細胞に導入することは、コロニーからの一倍体酵母クローンをバーコーダー一倍体酵母細胞と交配させて、二倍体酵母細胞を産生することを含む。後続の部位特異的組換えは、本明細書に記載されるように、二倍体酵母細胞内のゲノム編集カセットに連結されたバーコード配列を含む核酸を生成する。遺伝子修飾された細胞は、ＭＡＴα株であり得、バーコーダー酵母細胞は、ＭＡＴａ株であり得る。あるいは、遺伝子修飾された細胞は、ＭＡＴａ株であり得、バーコード酵母細胞は、ＭＡＴα株であり得る。
【0154】
特定の実施形態では、バーコーダー細胞内のリコンビナーゼ系は、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ部位特異的リコンビナーゼ系、Ｆｌｐ－ＦＲＴ部位特異的リコンビナーゼ系、ＰｈｉＣ３１－ａｔｔ部位特異的リコンビナーゼ系、またはＤｒｅ－ｒｏｘ部位特異的リコンビナーゼ系である。一実施形態では、バーコーダー細胞の組換え標的部位は、ｌｏｘＰ組換え部位を含む。
【0155】
別の実施形態では、バーコーダー細胞内のリコンビナーゼ系は、メガヌクレアーゼを使用してＤＮＡ二本鎖切断をもたらす。別の実施形態では、バーコーダー細胞内のメガヌクレアーゼは、ガラクトース誘導性ＳｃｅＩメガヌクレアーゼである。別の実施形態では、ゲノム編集カセットには、メガヌクレアーゼによって認識される制限部位が隣接している。
【0156】
別の実施形態では、方法は、部位特異的組換えに成功したクローンを選択する選択可能なマーカーを使用することをさらに含む。
【0157】
別の実施形態では、方法は、ＨＤＲによる１つ以上のゲノム標的遺伝子座でのドナーポリヌクレオチドの統合に成功したクローンを選択する選択可能なマーカーを使用することをさらに含む。
【0158】
別の実施形態では、方法は、順序付けられたアレイ内の少なくとも１つのクローンを表現型決定することをさらに含む。
【0159】
別の実施形態では、方法は、順序付けられたアレイ内の少なくとも１つのクローンの全ゲノムを配列決定することをさらに含む。
【0160】
別の実施形態では、方法は、順序付けられたアレイ内のすべてのコロニーに対して、ゲノム編集カセットバーコード（ならびにしたがって、それが対応するガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチド）の配列を同定するために、順序付けられたアレイ内のすべてのコロニーでステップ（ａ）～（ｅ）を繰り返すことをさらに含む。
【0161】
別の態様では、本明細書に記載される方法によって産生された遺伝子修飾された細胞のクローンを含むコロニーの順序付けられたアレイが提供され、コロニーは、所望のバーコードに従って再配置される。一実施形態では、アレイの元のセット上で同定された各固有のゲノム編集カセットバーコードに対して、単一コロニーが選択される。これにより、すべてのコロニーが所望のゲノム編集の固有のバーコードに対応するライブラリの統合が可能になる。さらなる実施形態では、この統合されたアレイ内のコロニーは、競合増殖長実験のために一緒にプールされ得、各バーコード化された株の開始存在量がほぼ等しいため、ライブラリバイアスがより少ないという利点がある。
【0162】
例示的な実施形態および方法
この方法論の基礎となる１つの原理は、例えば、相同組換え（ＨＤＲ）による、別のバーコードに隣接する１つのバーコードの挿入であり、同じＤＮＡ分子上のバーコードの物理的連結をもたらす（図１Ｂ～１Ｄ）。複数の個々のバーコードが効果的に組み合わされて、より大きい単一バーコードを生成し、バーコードの順序は、ゲノム編集の付加の順序を表し、バーコード（すなわち、バリアント）の並べ替えまたは組み合わせを同定およびカウントすることをできる配列決定ベースのアプローチを可能にする。本開示は、後続のバーコード化ラウンドを可能にするいくつかの新規の方法で、米国仮出願第６２／５５９，４９３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるバーコード化系に基づく。
この方法論の基礎となる１つの原理は、例えば、相同組換え（ＨＤＲ）による、別のバーコードに隣接する１つのバーコードの挿入であり、同じＤＮＡ分子上のバーコードの物理的連結をもたらす（図１Ｂ～１Ｄ）。複数の個々のバーコードが効果的に組み合わされて、より大きい単一バーコードを生成し、バーコードの順序は、ゲノム編集の付加の順序を表し、バーコード（すなわち、バリアント）の並べ替えまたは組み合わせを同定およびカウントすることをできる配列決定ベースのアプローチを可能にする。本開示は、後続のバーコード化ラウンドを可能にするいくつかの新規の方法で、米国仮出願第６２／５５９，４９３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるバーコード化系に基づく。
【0163】
ＤＮＡバーコードは、既知の（つまり、配列決定された）または未知のＤＮＡ構築物の同時送達によって媒介されるものを含む、細胞に対する様々な変化をコードすることができる。バーコードおよびＤＮＡ構築物は、同じベクターまたはアンプリコン上などで物理的に連結され得、ベクターの配列決定は、バーコードをＤＮＡ構築物と連結することができる。バーコードは、ランダム変異誘発または進化ベースのアプローチによって生成されるものなど、未知のＤＮＡ修飾を表すことができる。バーコードはまた、エピジェネティック修飾を示すこともでき、細胞集団の系統を追跡するために使用され得る。一般に、バーコードプールの複雑さは、バーコード化されるＤＮＡまたは細胞集団の複雑さよりもはるかに大きく、同じバーコード配列が２つの異なる細胞またはＤＮＡ構築物に関連付けられる可能性は十分に低くなる。
【0164】
バーコード（および関連するポリヌクレオチド配列）は、任意の手段によってバーコード遺伝子座に統合され得る。実施形態では、各固有のバーコードは、相同組換えによってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のバーコードは、非相同末端結合によってバーコード遺伝子座に挿入される。実施形態では、各固有のバーコードは、インテグラーゼを使用してバーコード遺伝子座に挿入される。
【0165】
実施形態では、バーコードは、選択可能なマーカーを有するバーコード遺伝子座に統合される。実施形態では、選択可能なマーカーは使用されない。図１Ａ～１Ｄは、選択可能なマーカーを使用した場合（左側）または使用しない場合（右側）のバーコード連結再帰の例を示す。バーコードは、左相同性（ＬＨ）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる２つの相同性アームを利用する、宿主細胞相同組換え（ＨＲ）によって可能になり得る。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼによる切断を使用して、ＨＲ効率を大幅に高めることができる。あるいは、切断非依存性ＨＲを使用して、入ってくるバーコード構築物を統合することができる。デュアル選択可能／対抗選択可能なマーカーの使用は任意であり、所望の場所でバーコードが組み込んでいない細胞の一部を除去するのに役立つ。
【0166】
選択可能なマーカーは、当技術分野でよく知られている。使用する選択可能なマーカーの選択は、例えば、細胞のタイプ（例えば、真核または原核）、細胞培養系などに依存し、当業者によって決定され得る。本明細書に記載される方法で使用され得る選択可能なマーカーには、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、代謝拮抗物質マーカー遺伝子、およびレポーター遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【0167】
実施形態では、バーコードの挿入は、さらに別のバーコードの挿入を可能にする配列要素の同時挿入を伴う。図１Ｃに示すように、これらの挿入要素は、部位特異的ヌクレアーゼの切断部位２、新しい右相同性（ＲＨ２）、および任意に、新しいマーカー（マーカー偶数）を含み得る。バーコード化のラウンドＮは、ラウンドＮ＋１が後に続くことができ、任意のマーカーが、各ラウンドの間に変化し、例えば、マーカー奇数とマーカー偶数との間で交互に切り替わる（図１Ｄ）。バーコードは、右相同性アーム（ＲＨ１、ＲＨ２、ＲＨ３など）によって分離され、互いに隣接して蓄積し続ける。短いバーコードの密接な連結により、複雑なプール内のバーコードの組み合わせを追跡するための効率的かつ経済的なハイスループット配列決定アプローチが可能になる。
【0168】
実施形態では、バーコードの各ラウンドは、バーコードの片側に、修復相同性の短い（典型的には４０～６０ｂｐ）の伸長によって分離された、新しいバーコード（典型的には長さが２０～３０ｂｐ）を付加する。したがって、バーコード連鎖の連続したラウンドでは、６０～９０ｂｐを付加する。３～５ラウンドを超えるバーコード化は、ハイスループット配列決定が実用的または経済的に横断するにはあまりに大きい構築物をもたらすため、バーコードアレイの長さには実際的な制限がある。この問題を回避するために、「バーコード圧縮」と呼ばれる特別なバーコード化ラウンドを使用して、複数のバーコード（例えば、４～８個のバーコード）を単一の短いバーコードにマッピングすることができる。
【0169】
ＤＮＡバーコードは、任意の情報をコードすることができる。これにより、バーコードは、バーコード遺伝子座で蓄積されたものなど、他の連結されたバーコードのアレイを表すことができる。この設定では、バーコードアレイに隣接して統合されるまで、バーコードは何にも連結されない。上で考察したように、バーコードプールの複雑さは、バーコード化される細胞集団の複雑さよりもはるかに大きいことが報告されている。
【0170】
図２Ａ～２Ｃは、「コンプレッサー」バーコードのセットがどのように挿入され得るかの一例を示し、これにより、１回の長い配列決定読み取りが、連結されたバーコードのセットを１つの圧縮バーコードに「圧縮する」ことが可能になる。その後、このバーコードの組み合わせは、単純に単一バーコードを配列決定することによって同定され得る。図２Ｂは、４つのバーコードの単一のｂｃ１．．４への圧縮を示す。バーコード圧縮の後に、再帰的バーコード連結のさらなるラウンドが続くことができ、もはや必要とされなくなった（かつもはや配列決定されなくなった）バーコードが右側に蓄積する。圧縮を周期的に実行して、集団を調査するのに必要な配列決定読み取りの長さを最小限に抑えることができる。
【0171】
このアプローチの１つの欠点は、意図的ではない組換えがバーコードアレイの部分を除去する可能性があるため、右相同性（ＲＨ）要素を後続のラウンドで再び使用することができないことである。これに対処するために、専用のバーコード圧縮部位が、ユニバーサル右相同性（ＲＨ）および確保された切断部位１＊を使用して、ならびにマーカー１＊および２＊の異なるセットを任意に用いて、例えば、図３Ａに示すようにバーコード遺伝子座の右側に導入され得る。この圧縮バーコードの右側には、将来のバーコード圧縮ラウンドために確保されている挿入要素が統合される。この圧縮バーコードの左側には、ＲＨ圧縮と呼ばれる特別な相同性およびＮ＋１切断部位が導入される。これらにより、次のバーコード化ラウンドが、ｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、およびｂｃ４を置き換え、バーコード遺伝子座から古いバーコードを除去することが可能になる。図３Ｂに示すように、連結されたバーコードの圧縮バーコードへの配列決定および計算マッピングの後、次のバーコード化ラウンドにより、もはや必要とされなくなった連結されたバーコードの除去が可能になる。圧縮バーコードはまた、後続のバーコード連結ラウンドのために切断部位および相同性を導入し得る。この例では、ｂｃ５は、ｂｃ１．．４の左側に隣接して挿入され、プロセスにおいて、ｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、およびｂｃ４、ならびにＲＨ１、ＲＨ２、ＲＨ３、ＲＨ４、およびＲＨ５、およびそれらに関連する切断部位を除去する。これにより、以前の挿入要素の再利用が可能になり、バーコード遺伝子座が継続的に増殖するのを防止する。再帰的バーコード連結と同様に、この圧縮バーコードもまた任意に、将来の圧縮ラウンドのためにマーカー、相同性、および切断部位を導入する（図４Ａ～４Ｂ）。
【0172】
図４Ａ～４Ｂに示すように、第２のバーコード圧縮ラウンドは、第１のラウンドと構造的に同一であり得、同じＲＨ要素の使用を伴うが、左側へのさらなるバーコード連結および右側へのバーコード圧縮のための異なる相同性および切断部位を伴う。バーコード圧縮のこの例示的なラウンドにおいて、入ってくるバーコードｂｃ１．．７は、連結されたバーコードｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４の両方を圧縮する。左側へのバーコード連結の次のラウンドは任意に、ｂｃ５、ｂｃ６、およびｂｃ７、ならびにすでに圧縮されたｂｃ１．．４を除去し、次の一連のバーコード化ラウンドで、すでに使用された挿入要素の再利用を可能にする。
【0173】
（１）左側へのバーコード連結、（２）右側での圧縮バーコード挿入、（３）次のバーコードによるバーコードアレイ除去のプロセス全体が、任意の回数繰り返され得る。このプロセスのための例示的な方法を図５Ａ～５Ｂに示す。
（１）バーコード連結操作は、遺伝子座を左側（図５Ａ）または右側（図５Ｂ）に伸長させ、入ってくる各バーコードは、同じＬＨユニバーサル、ラウンド特異的（ＲＨｘ）相同性を使用し、それと共に、将来のバーコード連結ラウンドのための左側の相同性（ＲＨｘ＋１）をもたらす。
（２）バーコード圧縮は、遺伝子座を右側（図５Ａ）または左側（図５Ｂ）に伸長させ、任意の数の連結バーコード内に保存されたデータを単一バーコードに圧縮することを可能にする。元の遺伝子座は、任意のラウンド数のバーコード連結の後に生じ得るバーコード圧縮ラウンドのために確保される、ＲＨユニバーサルおよびＬＨｙ圧縮相同性を有する。
（３）遺伝子座収縮を伴うバーコード連結により、将来のバーコード連結および圧縮ラウンドのためのＬＨおよびＲＨ要素の再利用が可能になる。圧縮バーコードには、右側に、さらにもう１回の将来の圧縮ラウンドのためのＬＨｙ＋１圧縮相同性が伴い、左側に、バーコード連結の次のラウンドが以前に連結されたバーコードを除去し、遺伝子座を収縮させることを可能にするＲＨｘ＋１（圧縮）相同性が伴う。（図５Ａ）および（図５Ｂ）に示すように、操作のセット全体は対称的である。この方法により、単一バーコードまたは短いバーコードアレイのいずれかを用いて、高次の組み合わせの遺伝子修飾が構築および追跡されることが可能になる。
（１）バーコード連結操作は、遺伝子座を左側（図５Ａ）または右側（図５Ｂ）に伸長させ、入ってくる各バーコードは、同じＬＨユニバーサル、ラウンド特異的（ＲＨｘ）相同性を使用し、それと共に、将来のバーコード連結ラウンドのための左側の相同性（ＲＨｘ＋１）をもたらす。
（２）バーコード圧縮は、遺伝子座を右側（図５Ａ）または左側（図５Ｂ）に伸長させ、任意の数の連結バーコード内に保存されたデータを単一バーコードに圧縮することを可能にする。元の遺伝子座は、任意のラウンド数のバーコード連結の後に生じ得るバーコード圧縮ラウンドのために確保される、ＲＨユニバーサルおよびＬＨｙ圧縮相同性を有する。
（３）遺伝子座収縮を伴うバーコード連結により、将来のバーコード連結および圧縮ラウンドのためのＬＨおよびＲＨ要素の再利用が可能になる。圧縮バーコードには、右側に、さらにもう１回の将来の圧縮ラウンドのためのＬＨｙ＋１圧縮相同性が伴い、左側に、バーコード連結の次のラウンドが以前に連結されたバーコードを除去し、遺伝子座を収縮させることを可能にするＲＨｘ＋１（圧縮）相同性が伴う。（図５Ａ）および（図５Ｂ）に示すように、操作のセット全体は対称的である。この方法により、単一バーコードまたは短いバーコードアレイのいずれかを用いて、高次の組み合わせの遺伝子修飾が構築および追跡されることが可能になる。
【0174】
ガイド－ドナーに加えて、ＣＲＩＳＰＲ干渉もしくは活性化のためのガイドＲＮＡ、またはスモールヘアピンＲＮＡカセットがバーコード化され得る。次いで、これらのバーコード化構築物は、形質転換によって細胞集団に円形または線形ベクターとして導入され得る。バーコード遺伝子座へのバーコード（および任意に、その関連する構築物）の挿入は、相同組換えを可能にするバーコードのいずれかの側の特定の相同配列によって媒介される。相同組換えは、受動的に生じ得るか、または例えば、部位特異的ヌクレアーゼ（タンパク質のみのヌクレアーゼもしくはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）によって、インビトロもしくはインビボでのバーコード化構築物の線形化によって、または能動的ドナー動員によって刺激され得る。一実施形態では、バーコード間の相同配列の組換えは、インビトロで実行され得る（例えば、ギブソンアセンブリによって）。
【0175】
一実施形態では、方法は、系統追跡を可能にするために、株の多様化または株の進化の間に未知の遺伝子修飾を追跡するために使用され得る。関連する実施形態では、バーコードは、遺伝子または経路のランダムなゲノムワイド変異誘発またはエラーが発生しやすいＰＣＲなどの誘導されていない遺伝子多様化プロセスの後に、バーコード遺伝子座に挿入され得る。この設定では、バーコードが表す遺伝子修飾は、最初は未知である。遺伝子多様化、バーコード連結、および選択の複数のラウンドは、系統樹の構築を可能にする。最終的に、所望の特性を有するクローンを配列決定すると、変化の組み合わせが最終的に目的の表現型をどのようにもたらすかについての豊富な情報が得られ得る。さらに、個々のクローンは、我々のリコンビナーゼによるインデックス化アプローチ（米国特許出願公開第２０１６／０１２２７４８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））によって、数千の未知のクローンの複雑なプールから迅速に単離され得る。さらに別の実施形態では、バーコードは、２ビットのＤＮＡコード空間内の任意のデジタル情報をコードすることができる。後続のバーコード連結を使用して情報を一時的に保存することができ、バーコード圧縮によりデータ圧縮が可能になる。
【0176】
さらに別の実施形態では、遺伝子全体などの遺伝子構築物がバーコード化（合成中、ＰＣＲ増幅中、またはＧＡＴＥＷＡＹクローニングなどの方法によるレシピエントベクターへのクローニング中のいずれか）および統合され得る。図１８に示すように、遺伝子バリアントライブラリは、多重化ギブソンアセンブリ（ステップ１）を含む様々なアプローチによって構築され得る。この例では、すべての遺伝子バリアントが、末端に共通の増幅配列を含有する。ロングリード技術を使用して、固有のｂｃ１配列を遺伝子配列に関連付けることができる（ステップ２）。ステップ３に示すように、遺伝子構築物をラウンド２の右相同性（Ｒ２ＲＨ）配列から分離する制限部位により、細菌および酵母特異的マーカーを有するＲ２ＬＨ配列の挿入が可能になる。ラウンド２の切断部位は、マーカーに隣接している。ガイド１およびＣａｓ９の形質転換および誘導により、バーコード遺伝子座での遺伝子バリアント構築物の挿入が可能になる（ステップ４）。
【0177】
上記のガイド－ドナー設定と同様のスタイルで再帰的統合要素を含むことにより、バーコード化遺伝子構築物のアレイがバーコード遺伝子座で鎖状に繋がれることが可能になる。図１９は、第２の遺伝子バリアント（遺伝子Ｂ）が、図１８からの遺伝子Ａカセットのマーカー部分の代わりに、ガイド２部位を介してバーコード遺伝子座に挿入されることを示す。その結果、遺伝子Ａと遺伝子Ｂ、およびｂｃ１とｂｃ２が鎖状に繋がれる。このプロセスを繰り返すと、図５Ａ～５Ｂにあるように、バーコード連結、その後に続く、バーコード圧縮およびバーコード遺伝子座収縮により、任意の数の遺伝子が一緒に挿入されることが可能になる。
【0178】
この方法のバリエーションは、ゲノム全体を通して所望の位置で遺伝子を導入することができ、プラスミド上の遺伝子には、所望のゲノム領域に対する相同性が隣接し、本質的に大きいゲノム挿入を伴うドナーＤＮＡになる（図２０および２１）。特に、これらのバーコード化方法は、方法の後続のラウンドで組み合わされ得、ラウンド１がゲノム編集のライブラリを表し、ラウンド２が遺伝子全体のライブラリを表す、などができるようにし、任意のバーコードタイプ（ゲノム編集、遺伝子全体、ＣＲＩＳＰＲ干渉／活性化カセット）が混合および適合され得る。
【0179】
この方法論の１つの制限には、順次的な編集およびバーコード化ステップの必要性が含まれる。別の制限は、非常に複雑なプール内の各クローンの全ゲノム配列決定によって、実際の編集または修飾をすべて確認することは実用的ではない可能性があることである。最後に、バリアントのプールが遺伝子構築物のプールと混合され、構築物が各バリアントにランダムに導入されるため、必然的に検査される組み合わせは、多対多、少対多、多対少、または少対少のアプローチなどのモダリティを伴い、全対全でなければならない。結果として、すべての所望のバリアントの組み合わせの完全な網羅を可能にするために必要とされる各形質転換のサイズは、編集およびバーコード化の各ラウンドで指数関数的に増加し、３ラウンドの編集後、１０００の初期バリアントは、１０００の選択３、または１０００＊９９９＊９９８／（３＊２＊１）＝１６６，１６７，０００の可能な組み合わせの数をもたらすようになり、さらなるラウンドで激増する。開始する所望のバリアントの選択（少対多）、または付加する遺伝子構築物の縮小（多対少）により、組み合わせ空間の管理が可能になる。この問題を管理する１つの方法は、リコンビナーゼによるインデックス化（ＲＥＤＩ）を使用して、編集後に株のアレイを作成することである。本明細書に記載される方法は、米国仮特許出願第６２／５５９，４９３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳述されるように、修飾株を解析するためのリコンビナーゼによるインデックス化に適合する。株をアレイ形式に解析した後、特定の株を選択して、２回目以降のラウンドのバーコード化カセットのライブラリを受け取ることができる。実験室で用いられる培養物量、およびバリアントの大集団の十分な網羅に必要とされる配列決定読み取りの数などの実際的な考慮事項によって、最終的に分析され得るバリアントの組み合わせの数が決定される。
【0180】
実施形態では、少なくとも２ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも３ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも４ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも５ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。
【0181】
実施形態では、２～１００ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～５０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１５ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～８ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～６ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～５ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～４ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、３～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、４～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、５～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、６～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、８～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、１０～２０ラウンドのバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。
【0182】
実施形態では、少なくとも２ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも３ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも４ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも５ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。
【0183】
実施形態では、２～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１５ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～８ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～６ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～５ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～４ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、３～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、４～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、５～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、６～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、８～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、１０～２０ラウンドのバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。
【0184】
実施形態では、少なくとも２ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも３ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも４ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。
【0185】
実施形態では、２～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～８ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～６ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～４ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、３～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、４～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、５～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、６～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、８～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。実施形態では、１０～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、複数の細胞に対して実行される。
【0186】
実施形態では、少なくとも２ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも３ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも４ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。
【0187】
実施形態では、２～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～１０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～８ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～６ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～５ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、２～４ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、３～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、４～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、５～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、６～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、８～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。実施形態では、１０～２０ラウンドの遺伝子修飾およびバーコード化が、バーコード圧縮の前に複数の細胞に対して実行される。
【0188】
実施形態では、１つのプラスミドライブラリのみが、細菌内でのクローニングによって作成される。実施形態では、最初のラウンド１のライブラリは、ガイド－ドナー骨格を線形化するために、メガヌクレアーゼ（例えば、ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ）を用いてインビトロで切断され得る。実施形態では、結果として生じるガイド－ドナーの単一ライブラリは、必要に応じて任意の将来の挿入ラウンドと共に、直接酵母に形質転換され得る。これにより、バーコード化／編集の各新しいラウンドに対して複数の困難なステップ２のクローニング手順の必要性を排除するだけでなく、線形断片がＨＤＲ機構を活性化するため、編集効率が大幅に高める。このアプローチは、ＨＤＲを強化するための３つの独立した直交法、ドナー動員、ドナー増幅、線形化ドナーベクターを特徴とする設定を示す。
【実施例】
【0189】
当業者は、本明細書に記載される粒子を作製および使用することの説明が、例示のみを目的とするものであり、本開示がこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
【0190】
実施例１．最初のラウンドのバーコード統合
ガイド－ドナーをコードするオリゴヌクレオチドを高密度アレイ形式で合成し、アレイ表面から切断して複雑なプールを生成する。ガイドＲＮＡ－ドナーＤＮＡ配列（ガイド－ドナー）を含有するオリゴヌクレオチドプールを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中にバーコード化し、ベクターにクローニングする（図６、ステップ１、２）。各オリゴは、特定のサブプールの増幅を可能にするガイド－ドナーカセットに隣接する共通の増幅配列を含有する。順方向プライマーは、その３’末端に制限部位（ＡｓｃＩ）を有し、逆方向プライマーは、その５’末端で別個の制限部位（ＮｏｔＩ）をコードし、その後に、不正な制限部位（ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、およびＢｓｐＱＩ）を除外する疑似ランダム配列（ＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮまたはＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮのいずれか）をコードする縮重バーコード（ｂｃ１）が続く。縮重バーコードには、ラウンド１相同性（ｒ１ｈ）およびラウンド２相同性（ｒ２ｈ）と呼ばれる５０ｂｐの相同性配列が隣接している。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位は、ガイドＲＮＡプロモーターの３’末端にＡｓｃＩ部位を有して、多重コピーレシピエントベクターへの粘着末端クローニングを可能にする。ガイド配列およびドナー配列は、ＩＩＳ型制限部位（ＢｓｐＱＩ）によって分離されており、これは、任意のオーバーハング（この場合はガイド配列のちょうど３’にあるＧＴＴＴ）でのクローニングを可能にして、ガイドＲＮＡの一定の構造構成成分内でのクローニングを可能にする。
ガイド－ドナーをコードするオリゴヌクレオチドを高密度アレイ形式で合成し、アレイ表面から切断して複雑なプールを生成する。ガイドＲＮＡ－ドナーＤＮＡ配列（ガイド－ドナー）を含有するオリゴヌクレオチドプールを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中にバーコード化し、ベクターにクローニングする（図６、ステップ１、２）。各オリゴは、特定のサブプールの増幅を可能にするガイド－ドナーカセットに隣接する共通の増幅配列を含有する。順方向プライマーは、その３’末端に制限部位（ＡｓｃＩ）を有し、逆方向プライマーは、その５’末端で別個の制限部位（ＮｏｔＩ）をコードし、その後に、不正な制限部位（ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、およびＢｓｐＱＩ）を除外する疑似ランダム配列（ＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮＶＨＴＧＮＮＮまたはＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮＴＧＶＨＮＮＮのいずれか）をコードする縮重バーコード（ｂｃ１）が続く。縮重バーコードには、ラウンド１相同性（ｒ１ｈ）およびラウンド２相同性（ｒ２ｈ）と呼ばれる５０ｂｐの相同性配列が隣接している。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位は、ガイドＲＮＡプロモーターの３’末端にＡｓｃＩ部位を有して、多重コピーレシピエントベクターへの粘着末端クローニングを可能にする。ガイド配列およびドナー配列は、ＩＩＳ型制限部位（ＢｓｐＱＩ）によって分離されており、これは、任意のオーバーハング（この場合はガイド配列のちょうど３’にあるＧＴＴＴ）でのクローニングを可能にして、ガイドＲＮＡの一定の構造構成成分内でのクローニングを可能にする。
【0191】
ガイド、ドナー、およびバーコードにわたる配列決定は、各バーコードに正確なガイド－ドナー配列を割り当てる（図６、ステップ３）。第１のステップのクローニング産物のハイスループット配列決定（ＨＴＳ）により、ガイド－ＢｓｐＱＩ－ドナー配列を固有のバーコード（ｂｃ１）に連結することが可能になる。対合末端配列決定を使用して、読み取り１と読み取り２の品質ベースの結合後に、ベースコールの信頼性を高めることができる。
【0192】
次いで、ガイドスキャフォールドおよび選択可能なマーカーを含有する挿入物を、ガイドとドナーとの間でクローニングする（図６、ステップ４、５）。ステップ４ａ、酵母特異的（例えば、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、またはＨＩＳ３）および細菌特異的（例えば、ｋａｎＲ）選択マーカーと共に、構造ガイドＲＮＡ構成成分を、５’末端でＢｓｐＱＩ配列を有するプライマーを用いて増幅する。逆方向プライマーは、ＢｓｐＱＩ部位の最初の位置にＧ－Ａ ＳＮＰを含有するように修飾された、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り２プライミング配列の３’に位置する追加のバーコード（ｂｃ＊、ＮＮＮＮＮＮまたはＮＮＮＮＮＮＨＶＶＮＨＢＢＨＢＨＤ）を含む。ステップ４ｂ、ＢｓｐＱＩによる第１のステップのクローニング産物の切断、その後に続く、ホスファターゼ処理により、構造ｇＲＮＡ挿入物のスカーレスクローニングが可能になる。これらの第２のステップのライブラリをカナマイシンで選択して、挿入物を有するベクターの濃縮を可能にする。ｂｃ＊－ドナーおよびｂｃ１の対合末端ＨＴＳを使用すると、バーコードを固有のガイド－ドナーの組み合わせにマッピングすることが可能になる（図６、ステップ５）。
【0193】
第２のクローニングステップ後のガイド－ドナーベクターを酵母に形質転換し、挿入物特異的マーカー（ＵＲＡ３）で選択した（図７）。各ドナーＤＮＡ／遺伝子構築物によって異なり得るガイドＲＮＡは、二本鎖切断の特定のゲノム遺伝子座を標的化し、これは、対応するドナーＤＮＡによって修復され、ゲノム全体にわたる所望の位置での正確なゲノム修飾をもたらす。レシピエント株を、対抗選択可能なマーカー（ＦＣＹ１）を有するバーコード統合遺伝子座を有するように修飾する。ライブラリからのガイド配列に加えて、ガイド－ドナープラスミドはまた、バーコード統合を促進するためのバーコードガイド１発現ユニットも有し、バーコードガイド１切断部位は、ＦＣＹ１に隣接している。形質転換後、ガイド－ドナープラスミドは、伸長により高いコピー数まで蓄積する。ガイド－ドナープラスミド上のラウンド１相同性（ｒ１ｈ）配列の右側には、バーコードガイド１切断部位が存在し、これにより、後のプラスミドの線形化が編集後のプラスミド損失を加速することが可能になる。
【0194】
第２のユニバーサルガイドＲＮＡまたは部位特異的ヌクレアーゼは、バーコード遺伝子座、ならびに／またはバーコード遺伝子座でのガイド－ドナープラスミド（プラスミドの線形化をもたらす）および相同組換えを標的化する。能動的ドナー動員を用いて、または用いずに（ＬｅｘＡ－Ｆｋｈ１またはＬｅｘＡ－ＦＨＡによって媒介されるなど）、バーコード遺伝子座でゲノムにバーコードを挿入し、他の場所で定義されたゲノム変化を行う、ガイド－ドナー構築物によって定義されるこの態様は、米国仮出願第６２／５５９，４９３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳述されている。加えてまたはあるいは、バーコード遺伝子座でのバーコードの組み込みは、能動的ドナー動員によって刺激され得る（米国仮出願第６２／５５９，４９３号を参照されたい）。
【0195】
Ｃａｓ９の誘導は、プラスミドおよびゲノムバーコード遺伝子座を切断するバーコードガイド１、ならびにゲノムの他の場所での編集ガイド１切断をもたらす。（ステップ２ａ）バーコードガイド１の切断は、ガイド－ドナープラスミド上および染色体バーコード部位内の両方に存在する５’ユニバーサル左相同性（ＬＨ）配列、ならびにラウンド特異的３’相同性を介して、ガイドＲＮＡ－ｂｃ＊－ドナーＤＮＡ－ｂｃ１カセット全体のゲノム統合をもたらす。（ステップ２ｂ）編集ガイド１切断の後に、ドナーＤＮＡによる相同組換えが続いて、編集＃１を生成する。
【0196】
実施例２．再帰的バーコード統合
バーコード化された各ガイド－ドナーは、次のラウンドのために相同性および切断部位と統合する。図８に示すように、
（１）ｂｃ１バリアントを有する株のプールを、ｂｃ２でタグ付けされたガイド－ドナープラスミドで形質転換して、第２の多重編集ラウンドを可能にし、ｂｃ１とｂｃ２のすべての可能な組み合わせで株のプールを生成する。ラウンド２ガイド－ドナープラスミドのクローニング戦略は次のとおりである。（ａ）同じユニバーサル左相同性（ＬＨ）がバーコードガイド３部位に隣接して、後続の編集ラウンド（ラウンド３）を可能にする、（ｂ）異なる酵母マーカー（ＬＹＳ２）を構造ガイドＲＮＡ挿入物で使用する、（ｃ）ラウンド２相同性（ｒ２ｈ）は、ガイド部位が３’末端に配置されていることを除いて、ラウンド１のガイド－ドナープラスミドに使用されるものと同じである（図６を参照されたい）、（ｄ）ｂｃ２の上流（ＵＳ）には、ラウンド３統合のための相同性（ｒ３ｈ）の伸長が存在し、バーコード３ガイド部位は、ｒ３ｈの５’末端にある。
（２）ＬＨおよびｒ２Ｈを介した統合の結果として、ｂｃ１がｂｃ２と一緒に密接に連結される。このステップでは、ｂｃ１によって表される以前のガイド－ドナーカセットは除去される。ラウンド１からの統合された酵母マーカー（ＵＲＡ３）の除去により、ラウンド３でのこのマーカーの再利用が可能になる。
（３）ｂｃ１配列およびｂｃ２配列がここで一緒に密接に連結されており、対合末端ＨＴＳが株の同定およびプールされた表現型決定の二重バーコードの組み合わせを同定することが可能になる。
（４）（ａ）編集およびバーコード化のラウンド３は、バーコードガイド４の切断部位を有する同じＬＨ、ｒ４ｈおよびｒ３ｈ配列が隣接するｂｃ３配列（各々はそれらに隣接するそれぞれのガイド標的を有する）、ならびにバーコードガイド３発現単位を有する、ガイドドナープラスミドを利用する。酵母の内部マーカーを、ラウンド１のものに交換して戻すことができる。対抗選択可能なマーカーの使用およびガイド－ドナープラスミドの自己破壊により、以前の編集ラウンドからマーカーが削除される。ラウンド１の後、ＵＲＡ３の選択、その後に続く、５－ＦＣによるＦＣＹ１の対抗選択は、ＵＲＡ３カセットの統合を保証する。ラウンド２の後、ＬＹＳ２の選択、その後に続く、５－ＦＯＡによるＵＲＡ３の対抗選択は、ＬＹＳ２カセットの統合を保証する。ラウンド３の後、ＵＲＡ３の選択、その後に続く、α－アミノアジペートによるＬＹＳ２の対抗選択は、ＵＲＡ３カセットの統合を保証する、などである。（ｂ）後続の編集ラウンド（ラウンドｎ）は、ｒ（ｎ＋１）ｈバーコード統合配列のＬＨの３’末端および５’末端の（ｎ＋１）バーコードガイド部位、ｒ（ｎ）ｈ３’末端の（ｎ）バーコードガイド部位、ならびにプラスミド上の他の場所にある（ｎ）編集ガイドのＰｏｌ ＩＩＩ発現単位を有する、ガイド－ドナーレシピエントベクターを構築することによって可能になる。各右相同配列ｒ（ｎ）ｈおよびｒ（ｎ＋１）ｈは、以前に使用された右相同配列と有意な相同性を有してはならない。これらを、Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ含有量の定義された範囲を有するランダムな５０－ｍｅｒを生成し、ＢＬＡＳＴを介して酵母ゲノムおよび他の正しい相同性配列との有意な相同性の欠如を確認することによって設計することができる。（ｎ）および（ｎ＋１）バーコードガイド部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有するゲノム内の他の部位といかなる有意な相同性も有してはならず、これを、ＢＬＡＳＴ、またはＲＮＡ誘導ヌクレオチド用に調整されたオフターゲットアルゴリズムを介して確認することができる。
バーコード化された各ガイド－ドナーは、次のラウンドのために相同性および切断部位と統合する。図８に示すように、
（１）ｂｃ１バリアントを有する株のプールを、ｂｃ２でタグ付けされたガイド－ドナープラスミドで形質転換して、第２の多重編集ラウンドを可能にし、ｂｃ１とｂｃ２のすべての可能な組み合わせで株のプールを生成する。ラウンド２ガイド－ドナープラスミドのクローニング戦略は次のとおりである。（ａ）同じユニバーサル左相同性（ＬＨ）がバーコードガイド３部位に隣接して、後続の編集ラウンド（ラウンド３）を可能にする、（ｂ）異なる酵母マーカー（ＬＹＳ２）を構造ガイドＲＮＡ挿入物で使用する、（ｃ）ラウンド２相同性（ｒ２ｈ）は、ガイド部位が３’末端に配置されていることを除いて、ラウンド１のガイド－ドナープラスミドに使用されるものと同じである（図６を参照されたい）、（ｄ）ｂｃ２の上流（ＵＳ）には、ラウンド３統合のための相同性（ｒ３ｈ）の伸長が存在し、バーコード３ガイド部位は、ｒ３ｈの５’末端にある。
（２）ＬＨおよびｒ２Ｈを介した統合の結果として、ｂｃ１がｂｃ２と一緒に密接に連結される。このステップでは、ｂｃ１によって表される以前のガイド－ドナーカセットは除去される。ラウンド１からの統合された酵母マーカー（ＵＲＡ３）の除去により、ラウンド３でのこのマーカーの再利用が可能になる。
（３）ｂｃ１配列およびｂｃ２配列がここで一緒に密接に連結されており、対合末端ＨＴＳが株の同定およびプールされた表現型決定の二重バーコードの組み合わせを同定することが可能になる。
（４）（ａ）編集およびバーコード化のラウンド３は、バーコードガイド４の切断部位を有する同じＬＨ、ｒ４ｈおよびｒ３ｈ配列が隣接するｂｃ３配列（各々はそれらに隣接するそれぞれのガイド標的を有する）、ならびにバーコードガイド３発現単位を有する、ガイドドナープラスミドを利用する。酵母の内部マーカーを、ラウンド１のものに交換して戻すことができる。対抗選択可能なマーカーの使用およびガイド－ドナープラスミドの自己破壊により、以前の編集ラウンドからマーカーが削除される。ラウンド１の後、ＵＲＡ３の選択、その後に続く、５－ＦＣによるＦＣＹ１の対抗選択は、ＵＲＡ３カセットの統合を保証する。ラウンド２の後、ＬＹＳ２の選択、その後に続く、５－ＦＯＡによるＵＲＡ３の対抗選択は、ＬＹＳ２カセットの統合を保証する。ラウンド３の後、ＵＲＡ３の選択、その後に続く、α－アミノアジペートによるＬＹＳ２の対抗選択は、ＵＲＡ３カセットの統合を保証する、などである。（ｂ）後続の編集ラウンド（ラウンドｎ）は、ｒ（ｎ＋１）ｈバーコード統合配列のＬＨの３’末端および５’末端の（ｎ＋１）バーコードガイド部位、ｒ（ｎ）ｈ３’末端の（ｎ）バーコードガイド部位、ならびにプラスミド上の他の場所にある（ｎ）編集ガイドのＰｏｌ ＩＩＩ発現単位を有する、ガイド－ドナーレシピエントベクターを構築することによって可能になる。各右相同配列ｒ（ｎ）ｈおよびｒ（ｎ＋１）ｈは、以前に使用された右相同配列と有意な相同性を有してはならない。これらを、Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ含有量の定義された範囲を有するランダムな５０－ｍｅｒを生成し、ＢＬＡＳＴを介して酵母ゲノムおよび他の正しい相同性配列との有意な相同性の欠如を確認することによって設計することができる。（ｎ）および（ｎ＋１）バーコードガイド部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有するゲノム内の他の部位といかなる有意な相同性も有してはならず、これを、ＢＬＡＳＴ、またはＲＮＡ誘導ヌクレオチド用に調整されたオフターゲットアルゴリズムを介して確認することができる。
【0197】
実施例３．バーコード圧縮
バーコードの圧縮は、コンプレッサーランディングパッドを標的化するガイド構築物、およびコンプレッサーバーコードを含有するＰＣＲ産物を用いて達成され得る（図９および１０）。後続の編集ラウンドがより長いバーコードを構築すると、必要な読み取り長が、対合末端配列決定の場合、およそ［（バーコード長）＊（バーコード数）＋（ホモロジー長）＊（バーコードの数－１）］を２で割ったものであるため、バーコードの組み合わせを同定するＨＴＳの実現可能性および実用性は、制限されるようになる。図９は、次のステップを示す。
（１）任意の数の編集ラウンド（例えば、５回）の後、１＊と呼ばれるガイドを有するプラスミド（＊＊は、このガイドがバーコード圧縮を可能にすることを示す）を、非常に複雑なバーコード（例えば、Ｎ３０）を有するＰＣＲアンプリコンと共に、編集された株のプールに形質転換する。図２Ａ～２Ｃに示すように、このアンプリコンを、選択のためのマーカーに連結することもできる。バーコードには、上流圧縮ラウンド１＊相同性（ＵＳ １＊＊）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる、ガイド１＊部位でのＨＤＲを可能にする配列が隣接している。さらなる編集およびバーコード化ラウンドを可能にするために、ラウンド６部位を、ｒ６ｈ配列と共にＵＳ １＊相同性に隣接して配置する。将来のバーコード圧縮ラウンドを可能にするために、ラウンド２＊部位を、ＵＳラウンド２＊相同性配列と共にＲＨ相同性に隣接して操作する。バーコードを、増幅のための一定の配列（左上）が隣接する縮重配列の伸長（例えば、Ｎ３０）として合成することができる。
（２）バーコード遺伝子座全体のＨＴＳにより、個々のｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、ｂｃ４、およびｂｃ５配列を固有のｂｃ１：５圧縮バーコードに連結することが可能になる。その後、これらの株を、ｂｃ１：５のみを配列決定することによって表現型決定することができる。
バーコードの圧縮は、コンプレッサーランディングパッドを標的化するガイド構築物、およびコンプレッサーバーコードを含有するＰＣＲ産物を用いて達成され得る（図９および１０）。後続の編集ラウンドがより長いバーコードを構築すると、必要な読み取り長が、対合末端配列決定の場合、およそ［（バーコード長）＊（バーコード数）＋（ホモロジー長）＊（バーコードの数－１）］を２で割ったものであるため、バーコードの組み合わせを同定するＨＴＳの実現可能性および実用性は、制限されるようになる。図９は、次のステップを示す。
（１）任意の数の編集ラウンド（例えば、５回）の後、１＊と呼ばれるガイドを有するプラスミド（＊＊は、このガイドがバーコード圧縮を可能にすることを示す）を、非常に複雑なバーコード（例えば、Ｎ３０）を有するＰＣＲアンプリコンと共に、編集された株のプールに形質転換する。図２Ａ～２Ｃに示すように、このアンプリコンを、選択のためのマーカーに連結することもできる。バーコードには、上流圧縮ラウンド１＊相同性（ＵＳ １＊＊）および右相同性（ＲＨ）と呼ばれる、ガイド１＊部位でのＨＤＲを可能にする配列が隣接している。さらなる編集およびバーコード化ラウンドを可能にするために、ラウンド６部位を、ｒ６ｈ配列と共にＵＳ １＊相同性に隣接して配置する。将来のバーコード圧縮ラウンドを可能にするために、ラウンド２＊部位を、ＵＳラウンド２＊相同性配列と共にＲＨ相同性に隣接して操作する。バーコードを、増幅のための一定の配列（左上）が隣接する縮重配列の伸長（例えば、Ｎ３０）として合成することができる。
（２）バーコード遺伝子座全体のＨＴＳにより、個々のｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、ｂｃ４、およびｂｃ５配列を固有のｂｃ１：５圧縮バーコードに連結することが可能になる。その後、これらの株を、ｂｃ１：５のみを配列決定することによって表現型決定することができる。
【0198】
バーコードｂｃ１～ｂｃ５のｂｃ１：５への圧縮の後に、編集およびバーコード圧縮の反復ラウンドが続くことができる（図７および８にあるように）。図１０は、バーコード圧縮による高次編集のためのステップを示す。
（１）次のバーコード（ｂｃ６）を圧縮バーコード（ｂｃ１：５）に隣接して挿入し、ゲノムの他の場所での編集＃６を伴う（図示せず）。
（２）ガイド－ドナー－ｂｃ６カセットは、すべてのバーコードｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、ｂｃ４、およびｂｃ５を、それらの隣接する相同性と共に除去し、ｂｃ１：５のみを残す。これにより、バーコード遺伝子座のサイズが拡大するのを防ぎ、以前に使用したガイド１＊～５＊、およびそれらに関連する相同性ｒ１ｈ～ｒ５ｈの、後続の編集およびバーコード化ラウンドのための再利用を可能にする。
（３）再帰的バーコード化は、図４Ｂにあるように再開する。
（４）バーコードｂｃ６～ｂｃ１０をｂｃ１：５と組み合わせて、ｂｃ１：５の右側に部位２＊を標的化する２＊ガイドを用いて、さらに圧縮することができる。ＰＣＲアンプリコンは、部位５を部位１１に置き換え、部位２＊を３＊＊部位に置き換えることを除いて、ｂｃ１：５バーコードを生成したものと類似している。隣接する相同性ＵＳ ２＊（第１のバーコード圧縮ラウンドからのＤＳ １＊に相当）およびバーコード圧縮のラウンド１＊＊中に配置されたユニバーサル右相同性（ＲＨ）配列により、標的化が可能になる。
（５）バーコード遺伝子座全体のＨＴＳにより、個々のｂｃ１：５、ｂｃ６、ｂｃ７、ｂｃ８、ｂｃ９、およびｂｃ１０配列を単一バーコードｂｃ１：１０に連結することが可能になる。その後、これらの株を、ｂｃ１：１０を配列決定することによって検査することができる。
（６）さらなる編集およびバーコード化ラウンドをガイド１１＊で開始し、３＊＊部位を使用してさらに圧縮して、任意の数のバーコード化編集で生成することができる。
（１）次のバーコード（ｂｃ６）を圧縮バーコード（ｂｃ１：５）に隣接して挿入し、ゲノムの他の場所での編集＃６を伴う（図示せず）。
（２）ガイド－ドナー－ｂｃ６カセットは、すべてのバーコードｂｃ１、ｂｃ２、ｂｃ３、ｂｃ４、およびｂｃ５を、それらの隣接する相同性と共に除去し、ｂｃ１：５のみを残す。これにより、バーコード遺伝子座のサイズが拡大するのを防ぎ、以前に使用したガイド１＊～５＊、およびそれらに関連する相同性ｒ１ｈ～ｒ５ｈの、後続の編集およびバーコード化ラウンドのための再利用を可能にする。
（３）再帰的バーコード化は、図４Ｂにあるように再開する。
（４）バーコードｂｃ６～ｂｃ１０をｂｃ１：５と組み合わせて、ｂｃ１：５の右側に部位２＊を標的化する２＊ガイドを用いて、さらに圧縮することができる。ＰＣＲアンプリコンは、部位５を部位１１に置き換え、部位２＊を３＊＊部位に置き換えることを除いて、ｂｃ１：５バーコードを生成したものと類似している。隣接する相同性ＵＳ ２＊（第１のバーコード圧縮ラウンドからのＤＳ １＊に相当）およびバーコード圧縮のラウンド１＊＊中に配置されたユニバーサル右相同性（ＲＨ）配列により、標的化が可能になる。
（５）バーコード遺伝子座全体のＨＴＳにより、個々のｂｃ１：５、ｂｃ６、ｂｃ７、ｂｃ８、ｂｃ９、およびｂｃ１０配列を単一バーコードｂｃ１：１０に連結することが可能になる。その後、これらの株を、ｂｃ１：１０を配列決定することによって検査することができる。
（６）さらなる編集およびバーコード化ラウンドをガイド１１＊で開始し、３＊＊部位を使用してさらに圧縮して、任意の数のバーコード化編集で生成することができる。
【0199】
バーコードを有することは有利であり得るが、ゲノム統合ガイドと次のラウンドのために入っているガイドとの間の競合があり得、これが編集効率の低下をもたらす可能性があるため、ガイド－ドナー配列は統合しない（図７および８に最初に示されるように）。さらに、ドナーを統合しないことで、編集のより簡単なＷＧＳ検証が可能になり、これは、標的部位でバリアントコールを混乱させるドナーからの読み取りについて懸念する必要がないためである。
【0200】
ガイドまたはドナーを統合することなくバーコードを統合するために、ランディングパッドを、ガイド－ドナー間に存在する挿入物のみを統合するように設計することができる（図１１Ａ～１１Ｂ）。図１１Ａ～１１Ｂは、ラウンド１バーコードを受け取る前の最初のランディングパッドを示す。左相同性は、任意に長くてもよく、この場合、約１ｋｂのｋａｎＲ細菌／酵母シャトルマーカーを相同性として使用する。この方法は、異なる選択可能なマーカーの順序で進行することができるため、部位１ガイド切断標的が隣接するマーカーを用いて、様々な開始株を構築することができる。右相同性は、左相同性よりも短く、Ｌｏｘ７１部位に隣接しており、これは、リコンビナーゼによるインデックス化および他のＣｒｅ－Ｌｏｘを介したバーコード連結アプローチに使用され得る。開始株は、ゲノムまたはプラスミドのいずれかから発現されるトランス作用因子Ｃａｓ９、ＴｅｔＲ、およびＬｅｘＡ－ＦＨＡを有することができる。
【0201】
実施例４．ガイド－ドナー統合なしのバーコード統合のためのクローニングバーコード化ガイド－ドナーライブラリ
この設定のさらなる利点は、単一のステップ１ガイド－ドナープラスミドライブラリを使用して、複数のラウンドの挿入物を受け取ることができることである（図１２～１４）。これを実現するために、挿入物クローニングステップ中に追加のバーコードを付加し、これを、配列決定ステップによってガイド－ドナーバーコード（ｂｃ０）に関連付ける（図１４。バーコードを含有する挿入物の一部のみが下のプラスミド図に示されていることに留意されたい）。
この設定のさらなる利点は、単一のステップ１ガイド－ドナープラスミドライブラリを使用して、複数のラウンドの挿入物を受け取ることができることである（図１２～１４）。これを実現するために、挿入物クローニングステップ中に追加のバーコードを付加し、これを、配列決定ステップによってガイド－ドナーバーコード（ｂｃ０）に関連付ける（図１４。バーコードを含有する挿入物の一部のみが下のプラスミド図に示されていることに留意されたい）。
【0202】
このバージョンの方法では、ガイド－ドナーは統合せず、挿入物のみが統合する。クローニングのステップ１でガイド－ドナーに付加された最初のバーコードも統合しないが、ステップ２のクローニングで挿入物バーコードにマッピングされるため重要である。挿入物の統合ガイドは統合することに留意されたい。しかしながら、ＴｅｔＲ抑制に供されるため、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）がない場合は、入ってくるガイドと競合しない。あるいは、統合ガイドをＣａｓ１２ａなどの別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと対合させることができる。
【0203】
図１３は、各ラウンドのための挿入物を構築するために使用され得るステップを示す。構築されると、これらは、バーコード化されたラウンド特異的な挿入物を生成するためのＰＣＲのテンプレートとして使用される。これらの挿入物を構築するための例示的な戦略を次のとおりである。
ステップ１）ガイド部位を含有するｇＢｌｏｃｋを骨格にクローニングする。
ステップ２）ラウンドｎのための誘導性バーコード統合ガイドをクローニングする。
ステップ３）ｋａｎＲ酵母／細菌シャトルマーカーをクローニングする。これは、内部クローニングの背景を除去し、ユニバーサル左アーム相同性としても機能する。
ステップ４）各ラウンドについて最大３つの異なるマーカークローニングする。例えば、３回の編集ラウンドについて、３つのマーカーを用いて６つの異なる順序で進行することができる。
ａ）ＨＩＳ３－ＬＥＵ２－ＬＹＳ２
ｂ）ＨＩＳ３－ＬＹＳ２－ＬＥＵ２
ｃ）ＬＥＵ２－ＬＹＳ２－ＨＩＳ３
ｄ）ＬＥＵ２－ＨＩＳ３－ＬＹＳ２
ｅ）ＬＹＳ２－ＨＩＳ３－ＬＥＵ２
ｅ）ＬＹＳ２－ＬＥＵ２－ＨＩＳ３
ステップ１）ガイド部位を含有するｇＢｌｏｃｋを骨格にクローニングする。
ステップ２）ラウンドｎのための誘導性バーコード統合ガイドをクローニングする。
ステップ３）ｋａｎＲ酵母／細菌シャトルマーカーをクローニングする。これは、内部クローニングの背景を除去し、ユニバーサル左アーム相同性としても機能する。
ステップ４）各ラウンドについて最大３つの異なるマーカークローニングする。例えば、３回の編集ラウンドについて、３つのマーカーを用いて６つの異なる順序で進行することができる。
ａ）ＨＩＳ３－ＬＥＵ２－ＬＹＳ２
ｂ）ＨＩＳ３－ＬＹＳ２－ＬＥＵ２
ｃ）ＬＥＵ２－ＬＹＳ２－ＨＩＳ３
ｄ）ＬＥＵ２－ＨＩＳ３－ＬＹＳ２
ｅ）ＬＹＳ２－ＨＩＳ３－ＬＥＵ２
ｅ）ＬＹＳ２－ＬＥＵ２－ＨＩＳ３
【0204】
異なるマーカー順序でこの方法を実行することにより、遺伝子相互作用が、操作されたバリアントと各ラウンドでの細胞の特定の栄養要求性との間で生じるかどうかが確認される。
【0205】
図１４中、図１３からのラウンド特異的な挿入物テンプレートを、バーコード、短い右相同性（ＲＨ）、およびクローニング部位を含有する逆方向プライマーで増幅する。これらを、ＴｙｐｅＩＩＳ制限消化後の粘着末端ライゲーションによって、図１２からのステップ１ガイド－ドナーライブラリにクローニングする。挿入物バーコード、ドナー、およびガイド－ドナーバーコードを包含するアンプリコンにより、挿入物バーコード上でのガイド－ドナーバーコードの「マッピング」が可能になる。
【0206】
実施例５．単一バーコード統合のための同時のゲノム編集、ガイド－ドナーバーコード統合、およびプラスミド自己破壊。
バーコードの統合および編集を、誘導可能なＣａｓ９を使用して１００％まで誘導することができる。ＷＴおよびｎｅｊ１ΔをＧＡＬ－Ｃａｓ９およびガイド－ドナーカセットで形質転換して、ＡＤＥ２遺伝子に早期終止コドン（ＰＴＣ）を導入した。Ｃａｓ９発現をガラクトースによって誘導し、示された世代でアリコートを採取した。ＡＤＥ２遺伝子座をＮＧＳによって分析し、ＷＴ配列、ＮＨＥＪインデル、およびドナーＤＮＡによる編集（完全な修復または不完全な修復のいずれか）の割合を計算した（方法を参照されたい）。図１５Ａは、重複実験からの各世代における平均パーセンテージを示す。
バーコードの統合および編集を、誘導可能なＣａｓ９を使用して１００％まで誘導することができる。ＷＴおよびｎｅｊ１ΔをＧＡＬ－Ｃａｓ９およびガイド－ドナーカセットで形質転換して、ＡＤＥ２遺伝子に早期終止コドン（ＰＴＣ）を導入した。Ｃａｓ９発現をガラクトースによって誘導し、示された世代でアリコートを採取した。ＡＤＥ２遺伝子座をＮＧＳによって分析し、ＷＴ配列、ＮＨＥＪインデル、およびドナーＤＮＡによる編集（完全な修復または不完全な修復のいずれか）の割合を計算した（方法を参照されたい）。図１５Ａは、重複実験からの各世代における平均パーセンテージを示す。
【0207】
ガイド－ドナーバーコードの統合を、単一のＡＤＥ２ガイド－ドナープラスミド（図１５Ｂ、上）、ならびに１００，０００個を超えるバーコード化ガイド－ドナープラスミドの複雑なプール（下）の染色体バーコード遺伝子座を標的化する増幅によって分析した。クロップしていないゲル画像は、バーコード遺伝子座に検出可能なＮＨＥＪインデル事象がないことを示す。ガイド－ドナープラスミドの自己破壊を、一般的な順方向プライマー、およびガイド－ドナープラスミド特異的プライマー（上のバンド）またはＣａｓ９プラスミド特異的プライマー（下のバンド）のいずれかを用いた、３プライマーＰＣＲによって評価した。
【0208】
示された世代のガラクトース誘導の培養物を、富栄養培地（ＹＰＤ）およびＦＣＹ１対抗選択培地（５－ＦＣ）上に、１プレート当たり約１０００個の細胞の密度において、４連でプレーティングした（図１５Ｃ）。プレート上で生き残ったコロニーの割合を示す。すべての実験を、ガイド－ドナープラスミドの独立した形質転換から始まる３つの生物学的複製で繰り返した。
【0209】
実施例６．バーコード連結の原理証明
バーコード連結の原理証明のために、我々は、ラウンド１についてはガイド－ドナー編集ＡＤＥ２を、次いで、ラウンド２についてはガイド－ドナー編集ＣＡＮ１を導入した。バーコード連結がバーコード１とは独立して機能することを試験するために、異なるバーコードで２つのラウンド１株を生成し、単一のバーコード化ラウンド２プラスミドを各株に導入した（図１６Ａ）。図１６Ｂは、再帰的バーコード連結のラウンド１の前（上）、ラウンド１の後（中央）、およびラウンド２の後（下）のバーコード遺伝子座を示す。この原理証明では、ラウンド１ガイド－ドナープラスミドは、ＡＤＥ２遺伝子を標的化し、ラウンド２ガイド－ドナーは、ＣＡＮ１遺伝子を標的化する。
バーコード連結の原理証明のために、我々は、ラウンド１についてはガイド－ドナー編集ＡＤＥ２を、次いで、ラウンド２についてはガイド－ドナー編集ＣＡＮ１を導入した。バーコード連結がバーコード１とは独立して機能することを試験するために、異なるバーコードで２つのラウンド１株を生成し、単一のバーコード化ラウンド２プラスミドを各株に導入した（図１６Ａ）。図１６Ｂは、再帰的バーコード連結のラウンド１の前（上）、ラウンド１の後（中央）、およびラウンド２の後（下）のバーコード遺伝子座を示す。この原理証明では、ラウンド１ガイド－ドナープラスミドは、ＡＤＥ２遺伝子を標的化し、ラウンド２ガイド－ドナーは、ＣＡＮ１遺伝子を標的化する。
【0210】
小分子アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）でバーコード化ガイドを誘導すると、４５ｂｐ ＲＨ配列での組換えが成功し、バーコードを連結することができることを実証した（図１６Ｃ）。強調表示した配列は、バーコードを表す。
【0211】
実施例６．ＲＨ長およびＲＨ近位切断部位の存在の関数としてのバーコード化効率の決定
複数の対立する要因が、ＲＨ配列の所望の長さに影響を与える。一方で、ＲＨ配列は、効率的な相同組換えを促進するのに十分な長さである必要がある。他方では、ＲＨが短いほど、より多くのバーコードを一緒に連結して、所与の長さの読み取りに適合させることができる。さらに、バーコード連結の長さが短いほど、表現型決定プロセス中のＰＣＲ組換えは少なくなる。また、ＲＨが逆方向プライマーに含まれている必要があるため、これは、長さに対する追加の実際的な制約である。したがって、我々は、効率的な統合を支持するＲＨの最小長を見つけようとし、０、２０、３０、４０、５０、および６０ｂｐを試験した（図１７Ａ）。次いで、これらのプラスミドを、ＲＨに直接隣接する追加の切断部位を含有するように修飾した。これらのプラスミド（ＡＤＥ２ガイド－ドナーを含有する）を、Ｃａｓ９／ＴｅｔＲ／ＬｅｘＡ－ＦＨＡ発現株に導入し、－ＬＹＳ－ＬＥＵ培地内に保存して、早期バーコード統合を選択し、ガイド－ドナープラスミドを維持した。次いで、それらを－ＬＥＵ＋ＡＴｃ培地に移してバーコード化を誘導し、自動液体ハンドリングシステム（ＴＥＣＡＮ Ｅｖｏ）を使用して３世代毎にアリコートをサンプリングした。バーコード遺伝子座に隣接するプライマーを使用したＰＣＲは、未修飾遺伝子座（図１７Ｂ、下のバンド）の統合されたバーコード（上のバンド）に対する比率を示す。バーコード化された細胞のバーコード化されていない細胞に対する比率は、約９世代後に定常状態に達し、６０ｂｐの相同性であっても１５世代以降には完了しなかった。
複数の対立する要因が、ＲＨ配列の所望の長さに影響を与える。一方で、ＲＨ配列は、効率的な相同組換えを促進するのに十分な長さである必要がある。他方では、ＲＨが短いほど、より多くのバーコードを一緒に連結して、所与の長さの読み取りに適合させることができる。さらに、バーコード連結の長さが短いほど、表現型決定プロセス中のＰＣＲ組換えは少なくなる。また、ＲＨが逆方向プライマーに含まれている必要があるため、これは、長さに対する追加の実際的な制約である。したがって、我々は、効率的な統合を支持するＲＨの最小長を見つけようとし、０、２０、３０、４０、５０、および６０ｂｐを試験した（図１７Ａ）。次いで、これらのプラスミドを、ＲＨに直接隣接する追加の切断部位を含有するように修飾した。これらのプラスミド（ＡＤＥ２ガイド－ドナーを含有する）を、Ｃａｓ９／ＴｅｔＲ／ＬｅｘＡ－ＦＨＡ発現株に導入し、－ＬＹＳ－ＬＥＵ培地内に保存して、早期バーコード統合を選択し、ガイド－ドナープラスミドを維持した。次いで、それらを－ＬＥＵ＋ＡＴｃ培地に移してバーコード化を誘導し、自動液体ハンドリングシステム（ＴＥＣＡＮ Ｅｖｏ）を使用して３世代毎にアリコートをサンプリングした。バーコード遺伝子座に隣接するプライマーを使用したＰＣＲは、未修飾遺伝子座（図１７Ｂ、下のバンド）の統合されたバーコード（上のバンド）に対する比率を示す。バーコード化された細胞のバーコード化されていない細胞に対する比率は、約９世代後に定常状態に達し、６０ｂｐの相同性であっても１５世代以降には完了しなかった。
【0212】
驚くべきことに、統合効率は、３０ｂｐから２０ｂｐのＲＨに大幅に低下し、２０ｂｐのＲＨは、０ｂｐと同じように機能する。バーコード化のプロセスには、Ｃａｓ９：：ガイド複合体がゲノム統合部位のマーカーに隣接する２つの部位、ならびにガイド－ドナープラスミド上の長い左相同性（ＬＨ）の上流で切断することを伴う。我々は、追加の切断部位をＲＨに直接隣接して導入した場合、短いＲＨ配列がより効率的に認識されると仮定した。注目すべきことに、ＲＨ近位切断部位の付加は、バーコード化の動態を大幅に増加させ、わずか３世代後にほぼ完全なバーコード化をもたらしただけでなく、ＲＨ長に関係なく同等の効率で２０ｂｐ ＲＨの非常に効率的な利用をもたらした（図１７Ｃ）。これは、バーコード連結単位を３０ｂｐ（１０ｂｐバーコードおよび２０ｂｐ ＲＨ配列）まで小さくすることができ、圧縮ステップが必要とされる前により多くの連結ステップを可能にし、ＰＣＲ組換えがバリアントカウントで問題を引き起こす可能性を大幅に軽減することを示唆している。これは、ベクターを、ベクターのバーコード化マーカー部分を統合することによって、そのマーカーの選択を必要とする条件下で線形化することができるため、自己破壊／自己統合ベクターの固有の強度を強調する。
【0213】
実施例７．遺伝子ライブラリ全体のバーコード化、および任意の遺伝子座での遺伝子挿入のための経路
図２０は、遺伝子ライブラリ全体をバーコード化するための方法、および任意の遺伝子座での遺伝子挿入のための経路を示す。遺伝子バリアントライブラリのバーコード化およびクローニングを、実施例３にあるように実行する。ロングリード技術を使用して、実施例３にあるように、固有のｂｃ１配列を遺伝子配列に関連付けることができる（図１１Ａ～１１Ｂ）。Ｒ１ＬＨ＊とＲ１ＲＨ＊の２つの別個の相同性を利用して、任意の遺伝子座での遺伝子バリアントの挿入を可能にする。これらの＊相同性は、遺伝子挿入ガイド１の標的部位に隣接している。ｂｃ１およびそれに付随するマーカーは、バーコード遺伝子座で統合する。
図２０は、遺伝子ライブラリ全体をバーコード化するための方法、および任意の遺伝子座での遺伝子挿入のための経路を示す。遺伝子バリアントライブラリのバーコード化およびクローニングを、実施例３にあるように実行する。ロングリード技術を使用して、実施例３にあるように、固有のｂｃ１配列を遺伝子配列に関連付けることができる（図１１Ａ～１１Ｂ）。Ｒ１ＬＨ＊とＲ１ＲＨ＊の２つの別個の相同性を利用して、任意の遺伝子座での遺伝子バリアントの挿入を可能にする。これらの＊相同性は、遺伝子挿入ガイド１の標的部位に隣接している。ｂｃ１およびそれに付随するマーカーは、バーコード遺伝子座で統合する。
【0214】
実施例８同時のバーコード遺伝子座でのバーコード挿入および任意の遺伝子座での遺伝子挿入
図２１は、同時のバーコード遺伝子座でのバーコード挿入および任意の遺伝子座での遺伝子挿入を示す。実施例４（図１２）からのバーコード化された遺伝子バリアントプラスミドライブラリを、細胞に形質転換する。遺伝子挿入ガイド１を、バーコードガイド１とは別にまたは同時に誘導する。所望の標的遺伝子座での遺伝子バリアントの挿入、およびバーコード遺伝子座でのｂｃ１の挿入。このプロセスを繰り返すと、図５Ａ～５Ｂにあるように、バーコード遺伝子座がバーコード連結、その後に続く、バーコード圧縮およびバーコード遺伝子座収縮を受けることができる一方で、任意の数の遺伝子がゲノムにわたって予め定義された遺伝子座に挿入されることが可能になる。
図２１は、同時のバーコード遺伝子座でのバーコード挿入および任意の遺伝子座での遺伝子挿入を示す。実施例４（図１２）からのバーコード化された遺伝子バリアントプラスミドライブラリを、細胞に形質転換する。遺伝子挿入ガイド１を、バーコードガイド１とは別にまたは同時に誘導する。所望の標的遺伝子座での遺伝子バリアントの挿入、およびバーコード遺伝子座でのｂｃ１の挿入。このプロセスを繰り返すと、図５Ａ～５Ｂにあるように、バーコード遺伝子座がバーコード連結、その後に続く、バーコード圧縮およびバーコード遺伝子座収縮を受けることができる一方で、任意の数の遺伝子がゲノムにわたって予め定義された遺伝子座に挿入されることが可能になる。
【0215】
実施例９．生殖系列エディターからの非冗長ヌクレアーゼを使用したバーコード組み込みのための誘導性の自己破壊プラスミド
本実施例は、ゲノムＤＮＡへのドナーＤＮＡの組み込みの各ラウンド後にドナープラスミドを破壊する方法を示す。発現されると、ドナープラスミドの配列は、目的の酵母株のゲノムにすでに組み込まれている生殖系列編集ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）とは異なる非冗長ヌクレアーゼを生成する。図２３Ａ～２３Ｃに示すように、ヌクレアーゼＣｐｆ１を使用することができる。Ｃｐｆ１を、図２３Ａに示す多重切断部位を標的化するガイドＲＮＡ配列と共に、誘導性プロモーター、この場合はＧＡＬ７プロモーターの下で発現することができる。ガラクトースの存在下で、図２３Ｂに示すＣｐｆ１－ドナープラスミドを含有する細胞は、Ｃｐｆ１およびＣｐｆ１ガイドＲＮＡを発現する。ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方が、Ｃｐｆ１によって多重切断部位で切断される。Ｃｐｆ１切断によって生成されたドナープラスミド配列を、上流の相同性部位（ＵＨ）から始まり、ゲノムＤＮＡに組み込み、この場合、ドナーＤＮＡは、図２３Ｂに示すように、選択のためのＨＩＳ３遺伝子、バーコード配列を含む目的の配列、および下流の相同性部位（ＤＨ）を含有する。他の実施形態では、ドナーＤＮＡを、後続のラウンドのためのバーコードおよび位置（例えば、相同性ドメイン）のみを組み込むように制限することができる。
本実施例は、ゲノムＤＮＡへのドナーＤＮＡの組み込みの各ラウンド後にドナープラスミドを破壊する方法を示す。発現されると、ドナープラスミドの配列は、目的の酵母株のゲノムにすでに組み込まれている生殖系列編集ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）とは異なる非冗長ヌクレアーゼを生成する。図２３Ａ～２３Ｃに示すように、ヌクレアーゼＣｐｆ１を使用することができる。Ｃｐｆ１を、図２３Ａに示す多重切断部位を標的化するガイドＲＮＡ配列と共に、誘導性プロモーター、この場合はＧＡＬ７プロモーターの下で発現することができる。ガラクトースの存在下で、図２３Ｂに示すＣｐｆ１－ドナープラスミドを含有する細胞は、Ｃｐｆ１およびＣｐｆ１ガイドＲＮＡを発現する。ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方が、Ｃｐｆ１によって多重切断部位で切断される。Ｃｐｆ１切断によって生成されたドナープラスミド配列を、上流の相同性部位（ＵＨ）から始まり、ゲノムＤＮＡに組み込み、この場合、ドナーＤＮＡは、図２３Ｂに示すように、選択のためのＨＩＳ３遺伝子、バーコード配列を含む目的の配列、および下流の相同性部位（ＤＨ）を含有する。他の実施形態では、ドナーＤＮＡを、後続のラウンドのためのバーコードおよび位置（例えば、相同性ドメイン）のみを組み込むように制限することができる。
【0216】
図２４Ａは、ガラクトースの存在下で１２世代の増殖後の４つの別々の酵母増殖条件を示す（上から下へ：選択なし（ＹＰＤ）、プラスミド除去／バーコード化の正の選択（５ＦＣ－ＨＩＳ）、バーコード化（５ＦＯＡ）、およびバーコード化なし（－ＵＲＡ））。ドナープラスミドの様々な構成を試験した（左から右へ：Ｘ１またはＸ２ガイドＲＮＡを有するＲＰＲ１－ＨＨＲ、Ｘ１またはＸ２ガイドＲＮＡを有するＧＡＬ７－ＨＨＲ、ガイドなし、Ｇａｌ－ＳｃｅＩ、Ｇａｌ－ＮＬＳ－ＳｃｅＩ－ＮＬＳ、およびＳｃｅＩなし。ＮＬＳ：核局在化シグナル。
【0217】
図２４Ｂは、酵母の第１世代後（ガラクトースへの曝露前）の図２４Ａと同様のプラスミド構成を有する、プラスミド除去／バーコード化（５ＦＣ－ＨＩＳ）およびバーコード化なし（－ＵＲＡ）の条件を示し、ドナープラスミドの漏れが最小限であることを実証する。世代毎のドナープラスミドからゲノムＤＮＡへのバーコードの組み込み率を図２４Ｃに示す。ガラクトースの存在下での６世代の増殖後、Ｘ２ Ｃｐｆ１ガイド配列を含有するドナープラスミドは、５０％超交換され（交換％＝（５ＦＣ－ＨＩＳコロニー／（５ＦＣ－ＨＩＳコロニー＋－ＵＲＡコロニー））×１００％）、一方、Ｘ１ Ｃｐｆ１ガイドを含有するプラスミドの１％未満が交換される。ＳｃｅＩおよびＮＬＳ－ＳｃｅＩ－ＮＬＳを含有するドナープラスミドは、高度に交換される（それぞれ３７％および７０％）。
【0218】
バーコード統合およびプラスミド破壊を、ポリメラーゼ連鎖反応によって確認した。
【0219】
実施例１０．経時的な受動的ドナープラスミド喪失
経時的な受動的ドナープラスミド喪失を図２５に示す。３つの酵母株、ｙＫＲ４（野生型ｕｒａ３Δ、陰性対照）、ｙＫＲ２６７（ＵＲＡ３およびｈｐｈＭＸ主要薬剤耐性マーカーカセットを含むＣａｓ９プラスミドを含有する）、ならびにｙＫＲ６４９（ＵＲＡ３およびｈｐｈＭＸ ＤＤＲＭカセットを含むゲノム統合Ｃａｓ９））を、様々な選択マーカー（－ＵＲＡ、ＹＰＤ、ＹＰＤ－ＨＹＧ、またはハイグロマイシンＢ、および５－ＦＯＡ）を用いて２４時間増殖させた。大きいコロニーは、正の選択を示し、コロニーが非常に小さいか欠如していることは、様々な増殖培地の負の選択を示す。
経時的な受動的ドナープラスミド喪失を図２５に示す。３つの酵母株、ｙＫＲ４（野生型ｕｒａ３Δ、陰性対照）、ｙＫＲ２６７（ＵＲＡ３およびｈｐｈＭＸ主要薬剤耐性マーカーカセットを含むＣａｓ９プラスミドを含有する）、ならびにｙＫＲ６４９（ＵＲＡ３およびｈｐｈＭＸ ＤＤＲＭカセットを含むゲノム統合Ｃａｓ９））を、様々な選択マーカー（－ＵＲＡ、ＹＰＤ、ＹＰＤ－ＨＹＧ、またはハイグロマイシンＢ、および５－ＦＯＡ）を用いて２４時間増殖させた。大きいコロニーは、正の選択を示し、コロニーが非常に小さいか欠如していることは、様々な増殖培地の負の選択を示す。
【0220】
ＵＲＡ３遺伝子を欠く酵母株ＷＴｕｒａ３Δは、ＹＰＤ（陽性対照培地）、５－ＦＯＡ含有培地上で増殖し、（＋）ＨＹＧ培地（ｈｔｈＭＸ ＤＤＲＭカセットの陽性対照）上では増殖しない。酵母株ｙＫＲ２６７は、ＹＰＤ、ＹＰＤ－ＨＹＧ、－ＵＲＡ、および５－ＦＯＡ培地上で増殖し、Ｃａｓ９含有プラスミドがプラスミドなしの表現型培地（５－ＦＯＡ）、および陽性プラスミド選択培地（－ＵＲＡ）の両方で保持されていることを示す（したがって、この酵母は反対の選択で増殖する）。したがって、酵母株ｙＫＲ２６７は、プラスミドを組み込んだ場合および組み込まない場合で増殖することができる。酵母株ｙＫＲ６４９は、ＹＰＤ、ＹＰＤ－ＨＹＧ、および－ＵＲＡ上で増殖するが、５－ＦＯＡ培地上では増殖しない。したがって、ｙＫＲ６４９酵母株は、ＵＲＡ３活性を保持する。
【0221】
実施例１１．一過性に発現したＳｃｅＩを介したドナープラスミド破壊
本実施例では、酵母株ｙＫＲ６４９をｐＫＲ２５５プラスミドで形質転換する。さらに、ＳｃｅＩの様々な配列のＰＣＲ産物をプラスミドで同時形質転換して、小分子（例えば、ガラクトース）で誘導することなくＳｃｅＩの発現を一時的に上昇させる。本実施例のＳｃｅＩの配列は、完全長ＳｃｅＩ配列、二重ＮＬＳ隣接ＳｃｅＩ配列、および６００ｂｐ±二重ＮＬＳ隣接ＳｃｅＩ配列である。図２７に示すように、ＳｃｅＩ発現、ならびに多重切断部位でのゲノムおよびプラスミドの切断、ならびにＨＩＳ３選択を使用してバーコードを統合するための相同性修復機構を可能にするのに十分な増殖時間で細胞を増殖させた。ＳｃｅＩ ＰＣＲ産物の１：１００の希釈を評価し、生成された効率的なドナーＤＮＡ組み込みも評価した。
本実施例では、酵母株ｙＫＲ６４９をｐＫＲ２５５プラスミドで形質転換する。さらに、ＳｃｅＩの様々な配列のＰＣＲ産物をプラスミドで同時形質転換して、小分子（例えば、ガラクトース）で誘導することなくＳｃｅＩの発現を一時的に上昇させる。本実施例のＳｃｅＩの配列は、完全長ＳｃｅＩ配列、二重ＮＬＳ隣接ＳｃｅＩ配列、および６００ｂｐ±二重ＮＬＳ隣接ＳｃｅＩ配列である。図２７に示すように、ＳｃｅＩ発現、ならびに多重切断部位でのゲノムおよびプラスミドの切断、ならびにＨＩＳ３選択を使用してバーコードを統合するための相同性修復機構を可能にするのに十分な増殖時間で細胞を増殖させた。ＳｃｅＩ ＰＣＲ産物の１：１００の希釈を評価し、生成された効率的なドナーＤＮＡ組み込みも評価した。
【0222】
実施例１２．ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略
本実施例では、図２８Ａ～２８Ｃは、ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略を提示する。ガイド－ドナーオリゴヌクレオチドを、ドナーに隣接して、ｂｃ０とラベル付けされたバーコード配列が付加されたプラスミド骨格にクローニングする。このアプローチは、ＬｅｘＡ－ＦＨＡによるドナー動員およびレトロンによるｓｓＤＮＡドナー増幅を含む、ドナーＤＮＡ強化の複数の方法に適合する。ＢｓｐＱＩ切断により、ＭＡＲＶＥＬラウンド１挿入物でのクローニングが可能になり、これは、ラウンド１バーコード統合のＳＣＥＩ部位、および後続のラウンド２バーコード統合を可能にするＣＲＥＩ部位を有する。図２８Ｂは、ラウンド１プラスミドを最初に酵母または細菌内で解析して、各ガイド－ドナーが完全な配列であり、等しい存在量で存在するライブラリを作成することができることを示す。ＳＣＥＩ部位をインビトロでメガヌクレアーゼＳｃｅＩによって切断して、線形化ガイド－ドナー骨格のライブラリを作成する。このステップの主な機能は、長い相同性アームを導入することである（片側に約２００ｂｐのＣＹＣ１ｔ配列、および反対側に約４５ｂｐのｍｓｄレトロン配列）。図２８Ｃは、ＳｃｅＩ切断によって生成された線形化骨格が、適切なラウンドのＭＡＲＶＥＬ挿入物と共に酵母に直接変換され得ることを示す。プラスミドの線形化は、細菌内の追加のステップ２クローニングの必要性を排除するだけでなく、編集効率も高める。酵母は、編集と同時にプラスミドライブラリを集合させ、ドナー－ｂｃ０配列を、酵母プールを配列決定することによって新しいバーコード上にマッピングすることができる。ガラクトース誘導は、バーコードを統合し、プラスミドを除去する。奇数ラウンドの選択は５ＦＣ－ＨＩＳで、偶数ラウンドの選択は５ＦＣ－ＬＥＵで達成される。
本実施例では、図２８Ａ～２８Ｃは、ＭＡＲＶＥＬプラスミドのインビボ集合との同時編集のための戦略を提示する。ガイド－ドナーオリゴヌクレオチドを、ドナーに隣接して、ｂｃ０とラベル付けされたバーコード配列が付加されたプラスミド骨格にクローニングする。このアプローチは、ＬｅｘＡ－ＦＨＡによるドナー動員およびレトロンによるｓｓＤＮＡドナー増幅を含む、ドナーＤＮＡ強化の複数の方法に適合する。ＢｓｐＱＩ切断により、ＭＡＲＶＥＬラウンド１挿入物でのクローニングが可能になり、これは、ラウンド１バーコード統合のＳＣＥＩ部位、および後続のラウンド２バーコード統合を可能にするＣＲＥＩ部位を有する。図２８Ｂは、ラウンド１プラスミドを最初に酵母または細菌内で解析して、各ガイド－ドナーが完全な配列であり、等しい存在量で存在するライブラリを作成することができることを示す。ＳＣＥＩ部位をインビトロでメガヌクレアーゼＳｃｅＩによって切断して、線形化ガイド－ドナー骨格のライブラリを作成する。このステップの主な機能は、長い相同性アームを導入することである（片側に約２００ｂｐのＣＹＣ１ｔ配列、および反対側に約４５ｂｐのｍｓｄレトロン配列）。図２８Ｃは、ＳｃｅＩ切断によって生成された線形化骨格が、適切なラウンドのＭＡＲＶＥＬ挿入物と共に酵母に直接変換され得ることを示す。プラスミドの線形化は、細菌内の追加のステップ２クローニングの必要性を排除するだけでなく、編集効率も高める。酵母は、編集と同時にプラスミドライブラリを集合させ、ドナー－ｂｃ０配列を、酵母プールを配列決定することによって新しいバーコード上にマッピングすることができる。ガラクトース誘導は、バーコードを統合し、プラスミドを除去する。奇数ラウンドの選択は５ＦＣ－ＨＩＳで、偶数ラウンドの選択は５ＦＣ－ＬＥＵで達成される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【配列表】
【国際調査報告】