特表 2022-520098 免疫細胞の効力をアッセイするための形質膜粒子、リポソーム、およびエクソソームの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-28

(54)【発明の名称】免疫細胞の効力をアッセイするための形質膜粒子、リポソーム、およびエクソソームの使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20220318BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220318BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220318BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220318BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20220318BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220318BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220318BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALN20220318BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20220318BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

A61K35/17 Z

A61K35/15 Z

A61P35/00

A61P35/04

G01N33/50 Z

G01N33/53 D

G01N33/53 P

C12Q1/06

C12N5/078

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021547364

(86)(22)【出願日】2020-02-14

(85)【翻訳文提出日】2021-10-12

(86)【国際出願番号】 US2020018384

(87)【国際公開番号】W WO2020168254

(87)【国際公開日】2020-08-20

(31)【優先権主張番号】62/805,359

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515041446

【氏名又は名称】リサーチ インスティテュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＡＴ ＮＡＴＩＯＮＷＩＤＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】リー，ディーン アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】タッカー，アーロヒ

(72)【発明者】

【氏名】ホール，マーク

(72)【発明者】

【氏名】マシンスキ，ジェニファー

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045CA11

2G045CA18

2G045CA21

2G045DA36

2G045FB03

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QS33

4B065AA94X

4B065AC14

4B065BB23

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087DA18

4C087DA20

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

(57)【要約】

免疫細胞の効力を決定する方法が記載されている。本方法は、免疫細胞を有効な量の細胞エクソソームと接触させるステップと、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出するステップと、を含む。免疫細胞の効力をアッセイするためのキットについても記載する。効力アッセイは、免疫療法細胞などの新しい生物学的薬剤に対するＦＤＡの要件を満たすために重要である。強力な免疫細胞を免疫療法的治療として使用する方法を記載する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソームと接触させることと、前記免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記産生されるサイトカインの量を、免疫療法において前記免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

複数のサイトカインの量が決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、またはＣＡＲ ＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記エクソソームが、がん細胞エクソソームである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記サイトカインの量が、イムノアッセイを使用して検出される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記サイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－６、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ（ＩＦＮ－γ）、Ｂ細胞活性化因子／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ（ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＴＮＦ－α、分化クラスター（ＣＤ）１６３（ＣＤ１６３）、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－ａ２、ＩＬ－６Ｒａ、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ－１）、オステオカルシン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ペントラキシン－３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－受容体１（ＴＮＦ－Ｒ１）、ＴＮＦ－Ｒ２、胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびケモカインマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α（ＭＩＰ－１α）、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＮＦに関連する弱いアポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）／ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１２（ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記免疫細胞が、有効な量の前記形質膜粒子、前記リポソーム、または前記エクソソームと少なくとも４時間接触する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記形質膜粒子、前記リポソーム、または前記エクソソームが、５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

免疫細胞の効力をアッセイするためのキットであって、有効な量の形質膜粒子および／またはエクソソームと免疫細胞に適した緩衝液とを含む容器を含む、キット。

【請求項12】

前記形質膜粒子、前記リポソーム、または前記エクソソームが、５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

前記容器が、エッペンドルフマイクロ遠心チューブである、請求項１１に記載のキット。

【請求項14】

前記キットが、免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激するために前記キットを使用するための説明書をさらに含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項15】

免疫療法方法であって、
ａ．複数の免疫細胞上で請求項１～１４のいずれかに記載の方法を実行して、各免疫細胞の効力を決定することと、
ｂ．検出されたサイトカインの量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、
ｃ．治療に有効な量の前記強力な免疫細胞を、免疫療法薬としてそれを必要とする対象に投与することと、を含む、免疫療法方法。

【請求項16】

前記免疫細胞の前記効力をアッセイする前に、同種または自己ドナーから前記複数の免疫細胞を抽出することをさらに含む、請求項１５に記載の免疫療法方法。

【請求項17】

治療に有効な量の前記強力な免疫細胞を送達する前に、前記少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、請求項１５に記載の免疫療法方法。

【請求項18】

前記複数の免疫細胞または前記強力な免疫細胞を特定の抗原に応答するように指令することをさらに含む、請求項１５に記載の免疫療法方法。

【請求項19】

前記複数の免疫細胞または前記強力な免疫細胞を、キメラ抗原受容体を提示するように遺伝子改変することをさらに含む、請求項１８に記載の免疫療法方法。

【請求項20】

対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法であって、
ａ．１つ以上の免疫細胞を得ることと、
ｂ．免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソームと接触させることと、
ｃ．前記免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出することと、
ｄ．検出された前記サイトカインの量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、
ｅ．前記対象に治療に有効な量の前記強力な免疫細胞を投与することと、を含む、方法。

【請求項21】

前記１つ以上の免疫細胞が、同種または自己ドナーから得られる、請求項２０に記載の対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法。

【請求項22】

同種または自己ドナーから前記複数の免疫細胞を抽出することをさらに含む、請求項２０に記載の対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法。

【請求項23】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、またはＣＡＲ ＮＫ細胞である、請求項２０～２２のいずれかに記載の対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法。

【請求項24】

治療に有効な量の前記少なくとも１つの強力な免疫細胞を送達する前に、前記少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、請求項２０～２３のいずれかに記載の対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／８０５，３５９号（参照によりその全体が本明細書に援用される）の利益を主張する。

【0002】

本発明は、免疫療法に関し、より具体的には、免疫細胞のエフェクター機能の試験に関する。

【背景技術】

【0003】

免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによる疾患の治療である。免疫系に由来する細胞は、免疫機能および特徴を改善するために使用され得る。近年、免疫療法は、特に種々の形態のがんを治療するというその約束において、研究者、臨床医、および製薬会社にとって大きな関心事となっている。免疫調節レジメンは、微生物疾患を治療するときに耐性を生み出す可能性が低いことを含め、既存の薬物よりも少ない副作用を有することが多い。

【0004】

従来のがん治療は、化学療法、手術、および／または放射線を用いて、がん細胞を殺傷または除去することに焦点を当てている。しかしながら、治療用免疫細胞の分野は急速に成長しており、がんの発症を治療、予防、または遅らせるために、従来の治療と組み合わせて、または場合によっては、従来の治療の代わりに使用することができる。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞の表面に発現する異常な抗原を標的とすることにより、自然に協働して身体をがんから防御する。最近のがん治療の開発は、患者の免疫系に腫瘍を攻撃し、破壊するように指令することに焦点を当てている。様々な戦略が使用されているか、または研究および試験が行われている。

【0005】

養子細胞移入（ＡＣＴ）は、患者への細胞の移入であり、肺癌、黒色腫、および他のがんに対して有望であることが示されている。細胞は、患者に由来し得るか（自己）、または別の個体に由来し得る（同種）。同種療法は、細胞を受け入れた患者とは別のドナーから単離され、増殖させた細胞を含む。あるいは、養子細胞移入を使用して、後の輸血のためにインビトロで自己の抽出された細胞を培養し、増殖することができる。例えば、自己免疫増強療法は、対象自身の末梢血由来ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、上皮細胞および他の関連する免疫細胞の抽出、これらの細胞のインビトロでの増殖、次いで、対象の身体へのこれらの細胞の再注入を伴う。

【0006】

いくつかの療法では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、同じ患者に戻される前に、インビトロで遺伝子改変され、増殖される。キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）は、対象からＴ細胞を採取し、次いでＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のコピーを含有するレトロウイルスでＴ細胞を感染させることを伴う。ＴＣＲ遺伝子は、腫瘍抗原（例えば、キメラ抗原受容体、またはＣＡＲ）を認識するように特化されている。ウイルスは、受容体をＴ細胞のゲノムに組み込む。細胞を非特異的に増殖し、および／または刺激する。次に細胞を再注入し、腫瘍細胞に対する免疫応答を生成する。

【0007】

最初のＣＡＲ－Ｔ療法が承認され、複数の営利企業が複数の臨床試験に関与したことで、この分野は商業的に拡大し、免疫療法の有望な将来性が示されている。この分野が１日おきの新しい臨床試験と共に進むにつれて、これらの治療用免疫細胞についての信頼性が高く、再現性のある効力試験の必要性は、その後増加している。免疫細胞のエフェクター機能を試験する業界の「ゴールドスタンダード」は、１９６０年代に開発されたクロミウム放出アッセイであり、標的腫瘍細胞によって引き起こされる放射性物質の使用および変動性に起因する懸念があるが、依然として使用されている。利用可能な代替は、カルセインベースのアッセイであり、異なる腫瘍標的の使用によって、腫瘍標的のアポトーシス体内でのカルセインの捕捉に起因して引き起こされる多くの変動性を依然として有する。

【0008】

これらの免疫細胞のエフェクター機能を視覚的に見るための異なる方法を開発するために他の努力がなされてきたが、これらの方法は、依然として標的腫瘍細胞を使用する。免疫細胞のエフェクター機能をチェックするための他の代理的な方法は、これらの細胞によって産生されるサイトカインをチェックすることであり、そのために、全ての従来の方法が標的腫瘍細胞を使用して、免疫細胞からのサイトカイン産生を誘導する。標的腫瘍細胞の使用は、腫瘍細胞の種類間の変動性に起因して、これらの試験の全てに生物学的変動性を加える。また、これらのアッセイには、これらのアッセイにバッチ効果を導入する面倒な設定が必要である。バッチ効果は、標的細胞の状態、プレートのローディングにおける個人間の変動性、プレートの状態、様々な試薬における変動性、読み出しの変動性などによって引き起こされる。これらの変動性の全てを除去し、信頼性が高く再現性のある結果を生み出すことができる免疫細胞効力アッセイが明らかに必要とされている。

【0009】

免疫細胞療法製品の品質を評価するために、信頼性が高く、再現性のある効力アッセイが必要とされる。承認プロセスは厳しく規制されており、承認を得るために医薬品開発者は医薬品に関する大量の情報を規制当局に提出する必要がある。これには、薬物製品の効力に関する情報およびこの効力を決定するためのアッセイが含まれ得る。ＦＤＡ（２１ ＣＦＲ ６１０．１０）によって要求されるように、細胞療法製品の効力は、これらの治療用免疫細胞のエフェクター機能を示し、効力を示すための適切な試験によって示されるべきであり、この試験は、これらの免疫細胞による関連するサイトカイン産生を測定するであろう。

【発明の概要】

【0010】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に明示されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。

【0011】

一態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム（人工リポソームを含む）、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、免疫細胞によって産生される１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することと、を含む、方法が本明細書に開示される。一態様では、本方法は、産生されるサイトカインの量を、免疫療法において免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較することをさらに含み得る。

【0012】

また、任意の先行する態様の免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、サイトカインの量が、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳｐｏｔ、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ（登録商標）、定量ＰＣＲ（限定されないが、ｑＲＴ－ＰＣＲを含む）、および／またはビーズアッセイ）を使用して検出される、方法が本明細書に開示される。

【0013】

一態様では、任意の先行する態様の免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を、有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０分間、３、４、５、６ ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４２、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４５、６０、６１、６２日間、３、４、５、または６ヶ月間接触させる、方法が本明細書に開示される。

【0014】

また、任意の先行する態様の免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）が、５μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度（限定されないが、５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度を含む）で提供される、方法が本明細書に開示される。

【0015】

一態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイするためのキットであって、有効な量の形質膜粒子および／またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と免疫細胞に適した緩衝液とを含む容器（例えば、マイクロ遠心チューブなど）を含む、キットが本明細書に開示される。いくつかの態様では、キットは、免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激するためにキットを使用するための説明書をさらに含み得る。

【0016】

また、任意の先行する態様の免疫細胞の効力をアッセイするためのキットであって、形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）が、５μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度（限定されないが、５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度を含む）で提供される、キットが本明細書に開示される。

【0017】

一態様では、免疫療法方法であって、ａ）任意の先行する態様の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法を複数の免疫細胞上で実施して、各免疫細胞の効力を決定することと、ｂ）検出されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、ｃ）治療に有効な量の強力な免疫細胞を、免疫療法薬としてそれを必要とする対象に投与することと、を含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。一態様では、本方法は、免疫細胞の効力をアッセイする前に、同種または自己ドナーから複数の免疫細胞を抽出することをさらに含み得る。

【0018】

また、任意の先行する態様の免疫療法方法であって、治療に有効な量の強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。

【0019】

一態様では、任意の先行する態様の免疫療法方法であって、複数の免疫細胞または強力な免疫細胞を特定の抗原に応答するように指令することをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。

【0020】

また、任意の先行する態様の免疫療法方法であって、複数の免疫細胞または強力な免疫細胞を、キメラ抗原受容体を提示するように遺伝子改変することをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。

【0021】

一態様では、対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法であって、ａ）同種または自己ドナーから得られる１つ以上の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）を得ることと、ｂ）免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、ｃ）免疫細胞によって産生されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することと、ｄ）検出されたサイトカインの量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、ｅ）対象に治療に有効な量の強力な免疫細胞を投与することと、を含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、本方法は、自己または同種ドナーから免疫細胞を抽出することをさらに含み得る。

【0022】

また、任意の先行する態様のがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法であって、治療に有効な量の少なくとも１つの強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、方法が本明細書に開示される。

【0023】

また、少なくとも１つの免疫細胞または細胞集団の同一性（例えば、分化Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、γδＴ細胞、または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、休止ＮＫ細胞、増殖したＮＫ細胞）を、その細胞型に関連するサイトカインシグネチャに基づいて決定する方法が、本明細書に開示される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】エクソソーム（Ｋ５６２細胞由来）によって誘導されるＮＫ細胞サイトカイン放出と、ＰＨＡによって誘導されるＮＫ細胞サイトカイン放出との間の相関を示すプロットを提供する（ｐｇ／１００万個の細胞／ｈｒで）。

【図2】新たに単離したＮＫ細胞サイトカイン放出（Ｋ５６２エクソソームによって誘導される）と、エクソソームによって誘導される増殖したＮＫ細胞サイトカイン放出との間の相関を示すプロットを提供する（ｐｇ／１００万個の細胞／ｈｒで）。

【図3】４つの異なる濃度のエクソソーム（６０、１００、２００、および４００ｍｇ／ｍＬ）への曝露時の総サイトカイン濃度を示す。

【図4】２つの異なるエクソソーム濃度の用量相関を示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、免疫細胞を有効な量のエクソソームと接触させることと、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出することとを含む、免疫細胞の効力を決定する方法を提供する。本開示は、がん免疫療法との関連で与えられるが、本明細書に開示される概念および革新は、他の疾患および障害の免疫療法に適用され得る。例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患および／または細菌感染に対する免疫療法に使用される免疫細胞も、本明細書に開示されるアッセイを使用して、効力について試験することができる。

【0026】

定義
理解を明確化し、参照を容易にするために、簡単な説明の章全体および明細書の残りの箇所で使用される用語のリストが、ここでまとめられている。いくつかの用語は、分野全体を通して周知であり、明確にするためにここで定義されるが、いくつかの用語は、本出願に固有であり、したがって、本出願を適切に理解するために定義される必要がある。

【0027】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」といった単数形は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞（それらの混合物を含む）を含む。複数形が本明細書で使用される場合、一般に単数形を含む。

【0028】

本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、そのある特定の値から、および／またはその他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各終点は、他の終点と関連して、および他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数値を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が「～以下」であることが開示される場合、「その値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５の間に加えて、１０より大きい、１０以上、１０未満、１０以下、および１０に等しい、１５より大きい、１５以上、１５未満、１５以下、および１５に等しい値が開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」とは、組み合わせに対する任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法から微量汚染物質および薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを除外しない。「～からなる」とは、本発明の組成物を投与するための他の成分の微量要素を超えるもの、および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0030】

「増加」は、より多くの量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。増加は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個々の値、中央値、または平均の増加であり得る。したがって、増加は、その増加が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の増加であり得る。

【0031】

「減少」は、より少ない量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。ある物質はまた、その物質を含む遺伝子産物の遺伝的出力が、その物質を含まない遺伝子産物の出力と比較して少ない場合に、遺伝子の遺伝的出力を減少させると理解される。また、例えば、減少は、症状が以前に観察されたものよりも少ないような、障害の症状の変化であり得る。減少は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個々の値、中央値、または平均の減少であり得る。したがって、減少は、その減少が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の減少であり得る。

【0032】

「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去が含まれ得るが、これらに限定されない。これには、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％低減も含まれ得る。したがって、低減は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。

【0033】

「低減する」または他の形態の単語、例えば「低減すること」または「低減」とは、事象または特徴（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは典型的には、いくつかの標準値または期待値に関連しており、換言すれば、それは相対的であるが、標準値または相対値を参照することが必ずしも必要ではないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減する」とは、標準または対照と比較して、腫瘍の成長速度を低減させることを意味する。

【0034】

「予防する」または単語の他の形態、例えば「予防すること」または「予防」とは、特定の事象または特徴を停止すること、特定の事象または特徴の発達または進行を安定化させるか、または遅らせること、あるいは特定の事象または特徴が発生する可能性を最小限に抑えることを意味する。予防は、典型的には、例えば、低減よりも絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用される場合、何かを低減することができるが、予防することができない場合があるが、低減される何かを予防することができる場合もある。同様に、何かを予防することができるが、低減することができない場合があるが、予防される何かを低減することができる場合もある。低減または予防が使用される場合、特に具体的に指定しない限り、他の単語の使用も明示的に開示されることを理解されたい。

【0035】

「治療に有効な」という用語は、副作用（例えば、代替療法に典型的に関連する副作用）を回避しつつ、疾患の重症度を減少させるという目標を達成する活性剤（免疫療法細胞など）の数または量を限定することを意図している。治療に有効な量を、１つ以上の用量で投与してもよい。治療に有効である治療としては、疾患の転帰自体を改善しない場合であっても、対象の生活の質を改善する治療が挙げられる。

【0036】

「有効な量」は、一般に、本出願に記載される特定の所望の効果を達成することを含め、例えばサイトカイン形成を刺激するのに有効な、所望の局所的効果または全身効果を提供する量を意味する。例えば、有効な量は、有益な、または所望の臨床結果を実現するのに十分な量である。

【0037】

「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。一態様では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコであり得る。対象はまた、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス、またはモールであってもよい。したがって、対象は、ヒトまたは獣医患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。

【0038】

「治療に許容される担体」という用語は、一般に安全であり、非毒性の組成物を調製するのに有用な担体または賦形剤を意味し、獣医学的使用および／またはヒトへの使用に許容される担体を含む。静脈内送達方法は、（例えば、静脈内使用に安全な浸透圧およびｐＨレベルで）生理学的にバランスのとれた治療に許容される担体を利用する。本明細書で使用される場合、「治療に許容される担体」という用語は、生理食塩水、リンガー、リン酸緩衝生理食塩水、水、デキストロース水溶液、およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、ならびに様々な種類の湿潤剤など、標準的な担体のいずれかを包含する。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または治療製剤で使用するための当該技術分野でよく知られた他の材料を包含する。治療に許容される担体はまた、免疫細胞の生存能および／または効力を維持するものなどの保存剤（凍結保存剤を含む）を含み得る。本明細書および特許請求の範囲で使用される「治療に許容される担体」は、１つのこのような担体および１つより多いこのような担体を両方とも含む。

【0039】

「治療」という用語は、疾患、病的な状態、または障害を治癒し、軽減し、安定化し、または予防する意図を有する患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病的な状態、または障害の改善に特異的に向けられた治療を含み、原因治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、または障害の原因の除去に向けられた治療も含む。加えて、この用語は、緩和的治療、すなわち、疾患、病的な状態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に阻害することに向けられた治療、および補助的治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、または障害の改善に向けられた別の特定の療法を補充するために使用される治療を含む。

【0040】

対象への「投与」には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術）などを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される「同時投与」（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、またはａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または本質的に互いに直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」とは、例えば、循環系またはリンパ系への入口を通して、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％を超える領域）に薬剤を導入または送達する経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域またはそれに直接隣接する領域に薬剤を導入または送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、または無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。

【0041】

「治療する」、「治療すること」、「治療」、およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患または状態の強度または頻度、疾患または状態の症状、あるいは疾患または状態の根本的な原因を、部分的もしくは完全に予防し、遅らせ、治癒し、快癒し、緩和し、和らげ、変化させ、治療し、軽減し、改善し、安定化し、鎮静し、および／または低減することを意図するか、あるいは目的とする組成物の投与を含む。本発明による治療は、予防的、防止的、緩和的、または対症的に適用され得る。防止的治療は、発症前（例えば、がんの明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、がんの初期の兆候および症状時）、または確立されたがんの発達後に対象に投与される。防止的投与は、疾患または感染の症状の発現の１日（数日）前から数年前に行われ得る。

【0042】

本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体で、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に援用される。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で論じられ、それらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に援用される。

【0043】

免疫効力アッセイ
一態様では、本発明は、免疫細胞の効力を決定する方法を提供する。本方法は、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（例えば、がん細胞エクソソームまたは操作されたエクソソーム）と接触させるステップと、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出するステップと、を含む。例えば、エクソソームを細胞培地に懸濁し、免疫細胞を細胞培地に曝露することによって、免疫細胞を形質膜粒子またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることができる。

【0044】

いくつかの実施形態では、本方法は、産生されるサイトカインの量を、免疫療法において免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較するステップを含む。効力アッセイは、製品（すなわち、免疫細胞）を特性決定し、ロット間の一貫性を監視し、製品の安定性を保証するのに役立ち、したがって、製品の作用機序および機能に影響を及ぼす可能性があり、それによって潜在的な臨床的重要性を有する差異を検出するのに十分に高感度であるべきである。このアッセイは、細胞媒介性免疫療法のための予測バイオマーカーまたは薬力学的アッセイとしても使用することができる。効力アッセイは、製品の推定される生理学的／薬理学的活性と可能な限り最も近い関係を有することが好ましい。本明細書に記載の効力アッセイは、製品仕様内の効力値を測定する能力、潜在的な臨床的重要性の差異を検出するための高い感度、製品の作用機序および推定される生理学的／薬理学的活性との密接な関係を提供する。好ましくは、効力アッセイはまた、以下の二次基準を満たす。（製品仕様を裏付けるために必要な精度を得るために）十分に低いアッセイ内およびアッセイ間の変動、十分なロバスト性、ならびに高スループット分析に適していること。いくつかの実施形態では、このアッセイは、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞の機能を定量化するための臨床アッセイ（ＮＫ細胞免疫不全の診断、免疫抑制剤または免疫活性化剤の有効性を監視するためのバイオマーカー）として使用される。

【0045】

上述のように、開示される方法は、免疫細胞の効力を決定するために提供される。免疫細胞は、本明細書で定義されるように、サイトカインを産生する免疫系の任意の細胞（すなわち、サイトカイン産生免疫細胞）である。サイトカイン産生免疫細胞の例としては、リンパ球、好中球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞が挙げられる。リンパ球は、Ｂ細胞およびＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含む）の両方を含む。一態様では、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫを含み得る。免疫細胞は、細胞培養物から得ることができ、または対象（例えば、同種ドナーまたは自己ドナーなど）から得ることができる。

【0046】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫に中心的な役割を果たし、細胞表面にＴ細胞受容体が存在することによって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞の例としては、Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞）、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞または「抑制性」Ｔ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞から区別され、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドではなく糖脂質抗原を認識する。異なる種類のＴ細胞は、そのサイトカイン産生のパターンにおいて、互いに異なる）が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞であり得る。さらに、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含み得る。

【0047】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。ナチュラルキラー細胞は、免疫系の細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速な応答を提供し、形質転換された細胞に応答する。典型的には、免疫細胞は、感染した細胞の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される病原体からペプチドを検出し、サイトカイン放出の引き金となり、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、病原体由来のペプチドがＭＨＣ分子上に存在するかどうかにかかわらず、ストレスを受けた細胞を認識する能力を有するため、独特である。これらの細胞は、標的を死滅させるために事前の活性化を必要としないという初期の考えから、「ナチュラルキラー」と名付けられた。ＮＫ細胞は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、骨髄で分化し、成熟し、そこから循環に入ることが知られている。いくつかの態様では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ ＮＫ細胞であり得る。

【0048】

したがって、一態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、免疫細胞によって産生される１つ以上のサイトカインの量を検出することとを含む、方法が本明細書に開示される。一態様では、本方法は、産生されるサイトカインの量を、免疫療法において免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較することをさらに含み得る。

【0049】

本アッセイは、免疫細胞をエクソソームで刺激した後に、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出するステップを含む。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達、特に免疫細胞によって産生され得る免疫調節において重要である小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）を指す。サイトカインの例には、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれる。検出されたサイトカインは、評価される免疫細胞によって産生されることが知られているサイトカインを含み得るか、または検出は、免疫細胞によって産生されることが知られていないサイトカインを含む、より広範な種類のサイトカインを包含することができる。

【0050】

いくつかの実施形態では、検出されるサイトカインは、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞によって産生されることが知られているサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞によって産生されることが知られているサイトカインを含む。Ｔ細胞には、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞が含まれ、Ｔｈ１細胞は、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α（ＴＮＦ－α）、およびＩＬ－２を主に産生し、Ｔｈ２細胞は、インターロイキン（ＩＬ）－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、およびＩＬ－２２を産生する。刺激を受けたナチュラルキラー細胞によって産生されるサイトカインの例としては、ＩＬ－ｌα、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびケモカインマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α（ＭＩＰ－１α）、ＭＩＰ－１β、およびＲＡＮＴＥＳが挙げられる。免疫細胞の効力を決定するのに有用な他のサイトカインとしては、限定されないが、Ｂ細胞活性化因子／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ（ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、分化クラスター（ＣＤ）１６３（ＣＤ１６３）、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ－１）、オステオカルシン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ペントラキシン－３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－受容体１（ＴＮＦ－Ｒ１）、ＴＮＦ－Ｒ２、胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、またはＴＮＦに関連する弱いアポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）／ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１２（ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）が挙げられる。したがって、一態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、免疫細胞によって産生される１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β 、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することとを含む、方法が本明細書に開示される。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、免疫細胞によって産生される１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することとを含む、方法が本明細書に開示される。一態様では、本方法は、産生されるサイトカインの量を、免疫療法において免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、複数のサイトカインのレベルが決定される。さらなる実施形態では、サイトカインは、インターロイキン－２、インターロイキン－６、およびインターフェロン－γからなる群から選択される。

【0051】

本アッセイは、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を検出するステップを含む。サイトカインを検出するための多種多様な方法は、当業者には既知であり、検出されるサイトカインに応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、複数の異なるサイトカインの存在を検出および／または定量化するために、１つの方法または複数の方法を使用することができる。サイトカインは、例えば、特定の試薬キットまたはイムノアッセイの使用によって検出され得る。サイトカインは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（商標）、Ｌｕｍｉｎｅｘ、およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）などの商業的プロバイダーから入手可能なキットを使用して検出することができる。サイトカインを検出するのに好適なキットの例は、迅速なサイトカインインスペクター（ＣＤ４／ＣＤ８）キット、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞のいずれかによって形成されるサイトカインを検出することができるＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカインＴ／ＮＫキットであり、これらは両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（商標）によって販売されている。

【0052】

いくつかの実施形態では、サイトカインの量は、イムノアッセイを使用して検出される。イムノアッセイには、多くの異なる形式およびバリエーションがある。イムノアッセイは、試薬を添加し、アッセイの異なる時点で洗い流されるか、または分離される複数のステップで実施されてもよい。イムノアッセイには、複数のステップを含む不均一イムノアッセイと、試薬と試料とを単純に混合し、物理的測定を行うことを伴う均一イムノアッセイとが含まれる。イムノアッセイは、多くの場合、問題となる分析対象物を含むことが知られている溶液であるキャリブレータを利用し、その分析対象物の濃度は、一般的に知られている。キャリブレータによって生成されたアッセイの応答と、実際の試料に対するアッセイの応答を比較することにより、試料中の分析対象物の存在または濃度の観点からシグナル強度を解釈することが可能になる。イムノアッセイの種類には、競争的な均一イムノアッセイ、競争的な不均一イムノアッセイ、一部位非競争的イムノアッセイ、および二部位非競争的イムノアッセイが含まれる。イムノアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩｓｐｏｔ）アッセイ、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色、抗体アレイアッセイおよびビーズベースのアッセイ、磁気イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および定量ＰＣＲ（限定されないが、ｑＲＴ－ＰＣＲを含む）も含まれる。一態様では、アッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ（登録商標）を含む。

【0053】

免疫細胞の効力を決定する方法は、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子および／またはエクソソーム（例えば、操作されたエクソソームなど）と接触させるステップを含む。形質膜（ＰＭ）粒子は、細胞の形質膜から作製されるか、または人工的に作製される（すなわち、リポソーム）小胞である。ＰＭ粒子は、脂質二重層または単に脂質の単一層を含有し得る。ＰＭ粒子は、単一ラメラ形態、多重ラメラ形態、または反転形態で調製され得る。ＰＭ粒子は、米国特許第９，６２３，０８２号（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、既知の形質膜調製プロトコルまたはリポソームを調製するためのプロトコルを使用して、本明細書に記載されるようなＦｃ結合フィーダー細胞から調製することができる。特定の態様では、本明細書に開示されるＰＭ粒子は、平均直径が約１７０～約３００ｎｍの範囲である。

【0054】

エクソソームは、多くの、おそらく全ての真核生物の流体中に存在する細胞由来の小胞である。エクソソームは、由来となる細胞型を反映するＲＮＡ、タンパク質、脂質、および代謝産物を含む。報告されているエクソソームの直径は、３０～１００ｎｍである。エクソソームは、多胞体が形質膜と融合すると細胞から放出されるか、または形質膜から直接放出されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、エクソソームは、がん細胞から得られる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、白血病細胞エクソソームである。本開示は、免疫細胞の効力を決定するためにエクソソームを使用する文脈で与えられるが、他の細胞外小胞もまた、免疫細胞の効力を決定するために使用されてもよい。本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」という用語には、任意の機序によって細胞から放出される全ての小胞が含まれるが、これらに限定されない。「細胞外小胞」は、多胞体から放出されるエクソソームおよび細胞表面から流出する微小小胞を含む。「細胞外小胞」には、エキソサイトーシスまたはエクトサイトーシスによって作製される小胞が含まれる。「細胞外小胞」は、多胞体から放出されるエクソソーム、逆出芽によって放出される小胞、膜（複数可）の分裂、多胞体エンドソーム、エクトソーム、微小小胞、微粒子、およびアポトーシス体によって放出される小胞、ならびに形質膜成分を含有するハイブリッド小胞を包含する。細胞外小胞は、由来となる細胞に共通のタンパク質、核酸、脂質および他の分子を含有し得る。

【0055】

一態様では、形質膜粒子、またはエクソソームは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞など）を刺激するフィーダー細胞から精製され得る。本明細書に開示される形質膜粒子を作製するかまたはエクソソームを作製する際に使用するための請求される本発明で使用するための免疫細胞を刺激するフィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくは同種ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、７２１．２２１、Ｋ５６２細胞、ＥＢＶ－ＬＣＬ、１つ以上の膜結合ＩＬ－２１、膜結合ＩＬ－１５、膜結合４－１ＢＢＬ、膜結合ＯＸ４０Ｌおよび／または膜ＴＮＦ－αでトランスフェクトされたＴ細胞（例えば、膜結合ＩＬ－２１でトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合ＩＬ－１５および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞）、膜結合ＩＬ－２１でトランスフェクトされたＮＫ細胞（限定されないが、ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞を含む）、膜結合４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（限定されないが、ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞を含む）、膜結合ＩＬ－１５および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（限定されないが、ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞を含む）、または膜結合ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（限定されないが、ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞を含む）、ならびに他のＨＬＡを発現しないか、もしくは低ＨＬＡ発現細胞株、または患者由来の原発腫瘍のいずれかであり得る。

【0056】

本開示の方法で使用される形質膜粒子および／またはエクソソームは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞など）を増殖および／または活性化するための追加のエフェクター剤をさらに含み得る。したがって、一態様では、免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、開示されるエクソソームまたは形質膜粒子を生成するために使用されるフィーダー細胞は、その細胞表面に少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤をさらに含み、少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤は、サイトカイン、接着分子、または免疫細胞活性化剤（例えば、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＣＣＲ７、ＯＸ４０Ｌ、ＵＢＬＰ２、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ－１、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ウィングレス、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト）である、方法が本明細書に開示される。一態様では、少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤は、ＩＬ－２１、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５、またはＩＬ－１５および４－１ＢＢＬを含む。したがって、一態様では、上述のフィーダー細胞によって生成され、本明細書に開示される免疫細胞の効力をアッセイする方法で使用される形質膜粒子およびエクソソームは、免疫細胞活性化剤（例えば、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＣＣＲ７、ＯＸ４０Ｌ、ＵＢＬＰ２、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ－１、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ウィングレス、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト）の任意の組み合わせの膜結合態様を含み得る。例えば、エクソソームまたは形質膜粒子は、それらの膜の上にＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および／または４－１ＢＢＬを有し得る。

【0057】

免疫細胞は、サイトカインを産生するために誘導される期間、粒子またはエクソソームに曝露されなければならないことが理解され、本明細書で企図される。一態様では、免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、免疫細胞を、有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０分間、３、４、５、６ ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４２、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４５、６０、６１、６２日間、３、４、５、または６ヶ月間接触させる、方法が本明細書に開示される。

【0058】

また、任意の先行する態様の免疫細胞の効力をアッセイする方法であって、形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）が、５μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度で提供される、方法が本明細書に開示される。一態様では、粒子またはエクソソームの濃度は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ １０００μｇ／ｍＬである。一態様では、エクソソームまたは粒子の濃度は、約５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬである。好ましくは、エクソソームまたは粒子の濃度は、約５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬである。

【0059】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、非修飾Ｋ５６２などの非修飾がん細胞由来のエクソソームを使用して刺激される。しかしながら、他の実施形態では、抗原特異的細胞は、抗原発現細胞からのエクソソームを使用して刺激される。例えば、抗原発現エクソソームおよび患者血液細胞を使用して、抗原特異的治療細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞）は、抗原発現Ｋ５６２からのエクソソーム、または標的細胞エンゲージャー（二重特異性エンゲージャー、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ、ＴｒｉＮＫＥＴ）で刺激され得る。

【0060】

一態様では、免疫細胞の効力を決定するために産生される同じサイトカインを使用して、サイトカインを産生する細胞を特定することもできることが理解され、本明細書で企図される。免疫細胞は、当該技術分野で周知の明確な発現プロファイルを有する。また、少なくとも１つの免疫細胞または細胞集団の同一性（例えば、分化Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、γδＴ細胞、または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、休止ＮＫ細胞、増殖したＮＫ細胞）を、その細胞型に関連するサイトカインシグネチャに基づいて決定する方法が、本明細書に開示される。したがって、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）を特定する方法であって、免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、免疫細胞によって産生される１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することとを含み、免疫細胞の同一性が、発現されるサイトカインのプロファイルに基づいて明らかにされる、方法が本明細書に開示される。

【0061】

免疫細胞の効力を評価するためのキット
本発明の別の態様は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力を決定するためのキットであって、有効な量の粒子またはエクソソーム（例えば、エクソソーム（限定されないが、操作されたエクソソームを含む）または形質膜粒子など）と免疫細胞に適した緩衝液とを含む容器を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キット中のエクソソームは、５μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度で提供される。一態様では、粒子またはエクソソームの濃度は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ １０００μｇ／ｍＬである。一態様では、エクソソームまたは粒子の濃度は、約５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬである。好ましくは、エクソソームまたは粒子の濃度は、約５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、容器は、マイクロ遠心チューブ（例えば、エッペンドルフマイクロ遠心チューブなど）である。キットはまた、対象から試料を得るためのツール、例えば、１つ以上の免疫細胞を含む試料を得るためのシリンジを含むことができる。好適な緩衝液は、ＲＰＭＩである。

【0062】

キットはまた、イムノアッセイを実施するために必要な構成要素（例えば固相）を含んでいてもよく、これに対し、捕捉抗体および／またはサンドイッチイムノアッセイ形式の検出抗体として機能する抗体が結合する。固相は、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、石英結晶、フィルム、フィルター紙、ディスクまたはチップなどの材料であり得る。キットはまた、検出抗体として機能する抗体などの抗体にコンジュゲートし得るか、またはコンジュゲートする検出可能標識を含み得る。検出可能標識は、例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア、蛍光体、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンであってもよい、直接標識であり得る。試験キットは、任意選択的に、標識を検出するために必要な任意の追加の試薬を含んでいてもよい。

【0063】

このキットは、免疫細胞の効力を評価するために、免疫細胞によるサイトカイン産生を刺激するためにキットを使用するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、細胞の効力を決定するためにサイトカインの量を使用するための説明書をさらに含む。キットに含まれる説明書は、包装材料に貼付することもでき、または添付文書として含むことができる。説明書は、典型的には、書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。このような説明書を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、この開示によって企図される。かかる媒体は、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などを含む。本明細書で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

【0064】

免疫療法方法
免疫細胞の効力を決定する方法は、免疫療法剤としての免疫細胞の使用の前に行うことができる。例えば、１つまたは複数の免疫細胞の効力を決定する方法は、上述のように実施することができ、その後、少なくとも１つの強力な免疫細胞を（検出されたサイトカインの量に基づいて）選択することができ、治療に有効な量の強力な免疫細胞を、免疫療法薬として対象に送達することができる。したがって、一態様では、免疫療法方法であって、ａ）本明細書に開示される免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）の効力をアッセイする方法を複数の免疫細胞上で実施して、各免疫細胞の効力を決定することと、ｂ）検出されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、ｃ）治療に有効な量の強力な免疫細胞を、免疫療法薬としてそれを必要とする対象に投与することと、を含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。一態様では、本方法は、免疫細胞の効力をアッセイする前に、同種または自己ドナーから複数の免疫細胞を抽出することをさらに含み得る。

【0065】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫療法性免疫細胞である。免疫療法性免疫細胞は、がんなどの疾患の治療に有用なものである。Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６５，４７７－４８４（２０１６）。がんの治療のための増殖したＮＫ細胞の使用が記載されている。Ｒｅｚｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５７８（２０１５）。免疫療法中に多数の免疫細胞を投与することができることは有用であるため、いくつかの実施形態では、免疫細胞は、増殖した免疫細胞である。増殖した免疫細胞は、多数の免疫細胞を成長させるためにエクスビボで成長する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、増殖した免疫細胞は、免疫応答を誘発することなく容易に対象に投与することができる自己細胞である。しかしながら、いくつかの実施形態では、増殖した免疫細胞は、同種免疫細胞であり、それらの固有の同種反応性は、利益となり得る。さらなる実施形態では、増殖した免疫細胞は、免疫細胞が疾患組織を標的とするのを助けるために、キメラ抗原受容体を含むように遺伝子操作される。増殖した免疫細胞の調製は、免疫細胞を活性化させ、増殖させることを含む。Ｋｏｅｐｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，５３（２）：４０４－１０（２０１３）。いくつかのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、Ｉ型ＩＦＮ、およびＴＧＦ－β）は、免疫細胞をエクスビボで活性化し、増殖させるのに有用であることが示されている。例えば、いくつかの実施形態では、評価されるＮＫ細胞は、ＩＬ－２１によって増殖したＮＫ細胞である。したがって、一態様では、治療に有効な量の強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。

【0066】

増殖とは、ＮＫ細胞の集団が増加するような、ＮＫ細胞のエクスビボでの増殖を指す。ＮＫ細胞は、例えば、末梢血単核細胞から増殖させることができる。しかしながら、ＮＫ細胞はまた、造血幹細胞または前駆細胞などの他の種類の細胞から増殖させることもできる。初期の血液または幹細胞は、胎盤、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓または肝臓などの様々な異なる供給源から単離することができる。細胞培養培地中で増殖が起こる。好適な細胞培養培地は、当業者に既知である。増殖した細胞は、細胞株として提供することができ、細胞株は、細胞培養物中に維持され得る複数の細胞である。したがって、一態様では、治療に有効な量の強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、免疫細胞は、免疫細胞の効力を決定する方法を実施する前に、既知の方法を使用して対象から抽出されている。あるいは、免疫細胞は、細胞培養物の増殖から調達することができる。

【0067】

いくつかの態様では、免疫細胞は、特定の抗原に応答するように指令される。免疫細胞は、その効力を決定する方法の前、またはその効力を決定する方法の後に、応答するように指令することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、特定の抗原に応答するように遺伝子改変される。抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原であり得る。いくつかの態様では、免疫療法方法は、（免疫細胞の効力を決定する前または後のいずれかに）免疫細胞を、キメラ抗原受容体を提示するように遺伝子改変することを含む。

【0068】

全体にわたって指摘されるように、免疫細胞の効力を決定する方法は、養子細胞移入治療の一部として使用され得る。強力な免疫細胞は、治療に許容される担体を使用して対象に送達され得る。静脈内送達は、免疫療法細胞を送達するために従来から使用されているが、他の方法も考慮することができる（例えば、免疫療法を必要とする身体の局所領域への直接移植）。

【0069】

治療に有効な量は、免疫細胞によって産生されるサイトカインの量を、免疫療法における免疫細胞の使用に必要なサイトカイン効力レベルと比較することによって決定することができる。治療に有効な量は、投与される免疫細胞、治療される対象、および治療される疾患、障害、および／または状態に依存することが理解され、本明細書で企図される。当業者であれば、治療される対象に、治療に有効であろう免疫細胞の適切な用量を使用することを知っているであろう。

【0070】

治療に有効な量の強力な免疫細胞は、複数の強力な免疫細胞を包含する。例えば、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択した後、選択された細胞をインビトロで増殖させて、複数の強力な免疫細胞を産生することができる。

【0071】

強力な免疫細胞を受け入れる対象は、免疫療法から利益を受け得る任意の対象（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患、および／または細菌感染を有する対象など）であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、がん患者であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、がんを発症する高いリスクを有する個体、がんと診断された個体、がんについて治療される個体、または手術後にがんから回復しつつある個体であり得る。いくつかの実施形態では、強力な免疫細胞は、がんまたは転移の発症を予防し、阻害し、または遅らせるための予防剤として対象に送達され得る。

【0072】

疾患を治療する方法
本明細書で特定される強力な免疫細胞を、限定されないが、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患および／または細菌感染を含む治療に養子免疫療法を使用することができる任意の疾患または障害の治療で使用することができることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、対象においてがんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法であって、ａ）同種または自己ドナーから得られる１つ以上の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）を得ることと、ｂ）免疫細胞を有効な量の形質膜粒子、リポソーム、またはエクソソーム（操作されたエクソソームを含む）と接触させることと、ｃ）免疫細胞によって産生されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、キチナーゼ３様１、ｇｐ１３０、ＩＦＮ－α２、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２６、ＩＬ－２９／ＩＦＮ－ｌ１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＭＭＰ－１、オステオカルシン、ＯＰＮ、ペントラキシン－３、ＴＮＦ－Ｒ１、ＴＮＦ－Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２など）の量を検出することと、ｄ）検出されたサイトカインの量に基づき、少なくとも１つの強力な免疫細胞を選択することと、ｅ）対象に治療に有効な量の強力な免疫細胞を投与することと、を含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、本方法は、自己または同種ドナーから免疫細胞を抽出することをさらに含み得る。

【0073】

免疫療法中に多数の免疫細胞を投与することができることは有用であり、いくつかの実施形態では、免疫細胞が、増殖した免疫細胞であることが理解され、本明細書で企図される。増殖した免疫細胞は、多数の免疫細胞を成長させるためにエクスビボで成長する免疫細胞である。したがって、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患、細菌感染、がんおよび／または転移を治療し、阻害し、低減し、予防し、および／または軽減する方法であって、治療に有効な量の少なくとも１つの強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖させることをさらに含む、方法が本明細書に開示される。

【0074】

開示される治療方法を使用して、がんおよび転移を含むが、これらに限定されない制御不能な細胞増殖が起こる任意の疾患または状態を治療することができることが理解され、本明細書で企図される。強力な免疫細胞を使用する開示される方法を使用して治療することができる、代表的であるが、非限定的ながんのリストは、以下の通りである。リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽腫／膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、喉、喉頭、および肺の扁平上皮細胞癌、子宮癌、子宮癌腫、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌腫、頭頸部癌腫、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。

【0075】

開示される方法を使用して治療することができる自己免疫疾患の例としては、限定されないが、アカラシア、急性散在性脳脊髄炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、アジソン病、有痛脂肪症、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アルツハイマー病、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索および神経のニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜性類天疱瘡（Ｂｅｎｉｇｎ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、ビッカースタッフ脳炎、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、１型糖尿病、円板状紅斑、ドレスラー症候群、子宮内膜症、腱付着部炎、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、フェルティ症候群、線維筋痛、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、汗腺膿瘍（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス腎炎、ループス血管炎、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼良性粘膜類天疱瘡、視神経炎、Ｏｒｄ甲状腺炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲の脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維化症、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマチ性血管炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精液および精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、サザック症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎（ＳＯ）、全身性エリテマトーデス、全身性皮膚硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、蕁麻疹、蕁麻疹様血管炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、およびウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））が挙げられる。

【0076】

本発明の好ましい実施形態を示すために、以下の実施例が含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示され、なおかつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得る特定の実施形態において多くの変更を行うことができることを理解すべきである。

【実施例】

【0077】

本明細書に開示されるアッセイは、現在の標準的な方法について存在する問題に対処し、ＦＤＡの要件を満たす治療用免疫細胞の効力を試験することを意図する。これを達成するために、Ｋ５６２由来エクソソームは、免疫細胞におけるサイトカイン産生を誘導するための代理物質として使用される。Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病細胞株）は、免疫細胞の細胞傷害性アッセイにおける普遍的な対照標的細胞株として広く使用されている。これらのＫ５６２細胞は、エンドソーム膜の内側出芽によって形成されるエクソソーム－多胞体を定期的に放出する。エクソソームは、Ｋ５６２細胞のようなサイトカイン産生を誘導するが、標的腫瘍細胞の使用によって引き起こされる変動性を除去する。このアッセイは、複数の臨床注入部位で治療用免疫細胞の効力を試験するために完全に機能する研究室を有する必要性を排除し、そのような試験のためのより迅速なターンアラウンド時間を提供する。

【0078】

Ｋ５６２由来のエクソソームを刺激剤として使用して、治療用免疫細胞の効力を試験すること
免疫細胞の効力をアッセイするエクソソームの能力は、図１および図２に示されている。図１は、治療用ＮＫ細胞が、効力アッセイ－ＰＨＡまたはエクソソーム－効力アッセイまたはエクソソームのいずれかを介してＩＬ－２またはＩＦＮ－γを産生することができるグラフを提供し、このことは、エクソソーム効力アッセイを治療用ＮＫ細胞に使用することができることを示している。図２は、エクソソーム効力アッセイを使用して、高ＩＬ－２またはＩＦＮ－ｇ産生を介して、増殖した治療用ＮＫ細胞を特定することもできることを示すグラフを提供する。また、健康なドナーから新たに単離したＮＫ細胞は、この効力アッセイによって刺激を受け、患者においてＮＫ細胞欠損の診断に使用することができるＡＰＲＩＬ／ＴＮＳＦ１３、ＣＤ１６３、およびＢＡＦＦなどの他のサイトカインを分泌する。

【0079】

本願発明者らは、様々な濃度のＣＳＴＸ００２エクソソームに応答して９の異なるドナーからのＮＫ細胞による２９の異なるサイトカインおよびケモカインの産生を試験した。濃度間で発現パターンに差はなかった（図３）。エクソソームの濃度にわたる各サイトカインの再現性および変動を具体的に評価するために、９の異なるドナーからのＮＫ細胞による２９のサイトカインおよびケモカインにわたって、低（５０ｕｇ／ｍＬ）および高（４００ｕｇ／ｍＬ）濃度のエクソソームの相関を試験した。非常に高い相関（ｒ２＝０．９６４）および２％未満の変動（傾き－１）があり、このことは、広範囲のエクソソーム濃度が同一の結果をもたらすことを示している（図４）。

【0080】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、具体的には、参照により援用される。しかしながら、参照により本明細書に援用されるとされる特許、刊行物、または他の開示資料の全部または一部が、援用される資料が、本開示に記載される既存の定義、記述、または他の開示資料と抵触しない範囲でのみ本明細書に援用されることを理解されたい。したがって、必要な範囲で、本明細書に明示的に記載される開示は、参照により本明細書に援用される任意の相反する材料に優先する。参照により本明細書に援用されるとされるが、本明細書に記載される既存の定義、記述、または他の開示資料と矛盾する任意の資料、またはその一部は、その援用された資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲でのみ援用される。

【0081】

当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験を超えない実験を使用して確認することができるであろう。特定の実施形態および実施態様を参照して本発明を記載したが、本発明の範囲または本発明の発明概念から逸脱することなく、様々な変更および追加の変形を行うことができ、その要素のために等価物を代用することができることを理解されたい。加えて、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況またはデバイスを本発明の教示に適応させるために多くの修正を行うことができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。本発明は、本明細書に開示される特定の実施態様に限定されないが、本発明は添付の特許請求の範囲内にある全ての実施態様を含むことが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】