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特表2022-520132生物活性Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ化合物および抗がん誘導体の合成；細胞の局在のためのエルゴステロールペルオキシドプローブ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-28
(54)【発明の名称】生物活性Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ化合物および抗がん誘導体の合成；細胞の局在のためのエルゴステロールペルオキシドプローブ
(51)【国際特許分類】
A61K 36/074 20060101AFI20220318BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220318BHJP
A61K 31/575 20060101ALI20220318BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20220318BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220318BHJP
【ＦＩ】
A61K36/074
A61P35/00
A61K31/575
A61K49/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021569252
(86)(22)【出願日】2020-02-06
(85)【翻訳文提出日】2021-09-30
(86)【国際出願番号】 US2020017053
(87)【国際公開番号】W WO2020163626
(87)【国際公開日】2020-08-13
(31)【優先権主張番号】62/802,525
(32)【優先日】2019-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521353366
【氏名又は名称】ウニベルシダッド セントラル デル カリベ
(71)【出願人】
【識別番号】517439719
【氏名又は名称】セイント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル、インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＴ．ＪＵＤＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＨＯＳＰＩＴＡＬ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】２６２ Ｄａｎｎｙ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｌａｃｅ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ ３８１０５，Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マルティネス－モンテマヨール ミシェル エム．
(72)【発明者】
【氏名】リバス， ファティマ
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C085HH11
4C085KA27
4C085KB65
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA11
4C086MA01
4C086MA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C088AA06
4C088AC17
4C088AC18
4C088CA03
4C088CA14
4C088NA14
4C088ZB26
(57)【要約】
抗がん活性に関与するＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物（ＧＬＥ）の生理活性化合物を、ＮＭＲ、Ｘ線結晶学および類似体誘導体化、ならびに抗がん活性研究を使用して解明した。７種の最も豊富なＧＬＥ化合物の構造が開示される。トリプルネガティブ（ＴＮＢＣ）および炎症性乳がん（ＩＢＣ）、ならびに他のヒトのがん細胞型（固形悪性疾患および血液悪性疾患）に対するそれらの選択的有効性が示され、抗がん剤としてのそれらの潜在的可能性を確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるがんに関係する症状を改変する方法であって、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分を含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記がんに関係する症状を改変する、方法。
【請求項2】
前記がんに関係する症状の改変が、活性酸素種（ＲＯＳ）の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞生存率の阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞の抗増殖活性の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞の細胞周期停止の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞のアポトーシスの誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞のＰＡＲＰ切断の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞のアポトーシスの誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞遊走の低減である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記がんに関係する症状の改変が、がん細胞浸潤性の低減である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記がんに関係する症状の改変が、腫瘍体積の減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記対象が、乳がんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記乳がんが、炎症性乳がんである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
対象におけるがんを処置する方法であって、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分を含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項24】
前記がんが、乳がんである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記乳がんが、炎症性乳がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項29】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項34】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項35】
Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分および標識化プローブを含む、組成物。
【請求項36】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項37】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項38】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項39】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項40】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項42】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項43】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項44】
前記標識化プローブが、蛍光色素である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項45】
前記蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）、およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）からなる群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項46】
前記蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項47】
前記蛍光色素が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項48】
前記蛍光色素が、ＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項49】
前記プローブが、標的を特定するためのプルダウン実験のために使用されるビオチン化ＥＰである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項50】
細胞における生物学的標的を評価する方法であって、（ａ）Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分および標識化プローブを含む組成物を、前記生物学的標的に接触させるステップと、
（ｂ）標識された前記標的の性質を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項51】
前記生物学的標的が、細胞内標的である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記生物学的標的が、サイトゾルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項53】
前記生物学的標的が、小胞体（ＥＲ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項54】
前記生物学的標的が、ミトコンドリアである、請求項５０に記載の方法。
【請求項55】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、請求項５０に記載の方法。
【請求項56】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、請求項５０に記載の方法。
【請求項57】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項58】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項59】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項61】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項62】
前記Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、請求項５８に記載の方法。
【請求項63】
前記標識化プローブが、蛍光色素である、請求項５０に記載の方法。
【請求項64】
前記蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）、およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項66】
前記蛍光色素が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項67】
前記蛍光色素が、ＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）である、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１９年２月７日出願の米国仮特許出願第６２／８０２，５２５号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年２月７日出願の米国仮特許出願第６２／８０２，５２５号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
真菌または植物などの様々な供給源由来の天然産物は、潜在的な抗がん可能性を有するヒット化合物を提供し続けている。ＧＬＥ由来の二次代謝産物には、ガノデリン酸ファミリーに属するトリテルペノイド、ステロール（すなわちラノステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド）、脂質、フラボノイド、およびリグナンが含まれる。ガノデリン酸およびステロールは、類似の分子足場を共有しており、後者の化合物の方がわずかに高い酸化状態を呈する。
【0003】
従来の（医薬）治療による毒性効果の増大、ならびに「自然」治療の有効性を証明する近年の報告からの証拠は、がん患者による「自然」治療の使用の高まりを引き起こしてきた。これらの治療には、丸ごとの薬用キノコであるＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍがあり、これは、２千年を超えて伝統的な漢方薬において使用されてきた。Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物（ＧＬＥ）を摂取しているがん患者は、患者の従来の治療への干渉なしに、クオリティ・オブ・ライフの改善および生存期間の延長を呈している。商業的に入手可能なＧＬＥについて最も一般的な使用には、高血圧、がん、および免疫学的障害の防止および処置が含まれる。Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍの子実体は、数十年間、伝統的な薬として使用されてきたが、ごく最近になって、胞子も研究の対象となってきた。胞子は、主に、ラノスタン型トリテルペンおよび子実体に見出されるものに類似の多糖類を含有しており、それらはＧＬＥの抗がん活性に寄与する主な化合物である。
【0004】
ＧＬＥによるがん防止の機構は、いくつかの報告にまとめられている。商業的に入手可能な丸ごとのキノコのＧＬＥは、乳がん細胞の生存を選択的に阻害し、様々なヒトのがんモデルにおいてアポトーシスを誘導し、浸潤を低下し、主要シグナル伝達分子を制御する。さらに、ＧＬＥは、マウス異種移植において単独でまたは従来の治療と組み合わせて投与される場合、マウスの腫瘍体積を約５０％減少する。
【0005】
エルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）天然産物（ＮＰ）は、植物、藻類、地衣類、アネモネ（anemonae）、珊瑚、およびキノコ、例えば中でもＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍから単離された化合物である。エルゴステロールペルオキシドは、抗腫瘍剤として報告されており、アポトーシス促進性の抗炎症性／免疫抑制効果、抗マイコバクテリア、およびがん細胞系に対する抗増殖活性を呈する。
【0006】
Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍのＥＰに富んだ抽出物の生物活性は、がん細胞モデルに対して用量依存的にアポトーシスを誘導する。ＥＰは、ステロイド系ファミリーのＮＰに属しており、それらは、エンドペルオキシド架橋を有するコレステロールコアを、その分子の反応性中心として共有する。活性の供給源は、おそらくこの官能性から生じており、いくつかの研究により、その潜在的な作用機序に関して報告されているが、がんにおけるＥＰの根本的な分子機構は、完全には理解されていない。
【0007】
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン、プロゲステロンおよびホルモン上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）の３種の一般的なタイプのタンパク質受容体について、乳がん細胞が検査でネガティブを示す場合に診断される。ＴＮＢＣは、診断時に、疾患進行期の悪性度が高い腫瘍と関連し、再発リスクが高く、５年生存率が低い（他の乳がんサブタイプに対して）ことと関連する。がんに関係するほとんどの死亡は、転移の結果であり、したがって、治療のために新しい生物学的標的を特定することの重要性は、ＴＮＢＣなどの侵襲性がんについては計り知れない。
【0008】
機構的に、転移性腫瘍細胞は遺伝的に不安定であり、ほとんどのがんにおいて、転移を調節する可能性が高い単一の優勢な経路はなく、したがって、がん依存性シグナル伝達経路において混線する一次分子および二次分子を介してその効果を誘導するのではなく、単一生物学的標的には影響を及ぼさないと思われるＮＰから生じる、新しい薬理学的処置の開発への関心が高まっている。ＥＰは、がんのサブタイプにわたっていくつかの経路を標的にしている文献においては、優先順位が高い。がんモデルにおいてＥＰが細胞死を誘導することは異議のない同意であるが、特異的な生物学的標的は、依然として捕らえることが困難である。Ｗｕおよび本発明者らは、ＥＰが、電子の最外殻に不対電子を１つだけ有するラジカルである活性酸素種（ＲＯＳ）を誘導することを示した。したがって、ＲＯＳを解毒する抗酸化タンパク質の発現は、正常細胞と比較してがん細胞において変化する。しかしＲＯＳは、他の機構の中でも、細胞増殖を低減し、ＤＮＡに損傷を与え、アポトーシスを誘導することによって、抗がん特性を呈する。
【0009】
エンドペルオキシドは、ラジカルを発生することが公知である。予測されるオキシルラジカルを発生させるためには、ペルオキシドの均等な切断が生じると思われ、それが、おそらく特異的タンパク質に結合すると思われる、より安定な炭素－炭素ラジカルを最終的にもたらすと仮定される。このような反応性は、ＥＰと鉄の同時処置研究時に、その媒介作用について鉄依存性または鉄によって媒介されると予測され得る。ＥＰは、ＴＮＢＣ細胞においてＲＯＳを誘導するが、ＥＰの細胞蓄積部位およびその特異的生物学的標的は、未知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
丸ごとのキノコであるＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍの最も豊富な化学的構成成分の構造的解明、およびトリプルネガティブ炎症性乳がん（ＩＢＣ）の処置におけるそれらの有効性が開示される。ＩＢＣは、研究頻度の低い、乳がんの稀な独特の侵襲性サブタイプである。
【0011】
生理活性化合物である５，６－デヒドロエルゴステロール（dehydroergosterol）の特徴および構造を、炎症性乳がん（ＳＵＭ－１４９）および非がん（ＢＪ）細胞において試験した。５，６－デヒドロエルゴステロールを、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物から精製し、その構造を開示する。
【0012】
Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ由来の５，６－デヒドロエルゴステロールのＸ線結晶についての詳細な報告が提供される。
【0013】
単一成分としてのエルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）は、ＩＢＣモデルに対して低マイクロモル濃度範囲の有望なＥＣ５０値を有し（ＳＵＭ－１４９）、正常細胞（ＢＪ、ＨＭＥＣ）において十分な治療指数を有する、最も生物活性が高い化合物である。
【0014】
改善されたＧＡ－０１の誘導体（ＧＡ－０１－ＭＥ）、エルゴステロールの誘導体（エルゴステロールスルホンアミド）、５，６－デヒドロエルゴステロールの誘導体（５，６－デヒドロエルゴステロールスルホンアミド）およびＥＰの誘導体（ＥＰスルホンアミド）を、それらの溶解度を改善するように合成した。
【0015】
ＧＡ－０１、エルゴステロール、５，６－デヒドロエルゴステロールおよびＥＰは、ＴＮＢＣおよびＩＢＣ細胞モデルにおいてＲＯＳを誘導する。
【0016】
抗がん効果を有するが、正常細胞には影響を及ぼさない化合物が開示される。
【0017】
化合物が細胞内の細胞内小器官と共局在することを特定するためのツール（プローブ）を作製した。
【0018】
これらの化学的ツールは、がん細胞におけるエルゴステロールペルオキシドの作用機構を描くための生細胞イメージング研究のために使用することができる。エルゴステロールペルオキシドプローブを合成するための、短い合成経路が開示される。これらのプローブは、細胞内特異性でサイトゾルに蓄積する。
【0019】
２種のＴＮＢＣ細胞系において、親和性ベースのプロテオミクス標的の特定を通じて標的を特定するために、ビオチン－ＥＰプローブ（３ｋ）を使用した。ＳＵＭ－１４９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞系の両方において２種の標的、つまりＲａｂ相互作用リソソームタンパク質様１（ＲＩＰＬ１）およびＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ（ＵＢＲ４）の２種の潜在的な生物学的標的が特定された。これらのタンパク質は、サイトゾルおよび原形質膜にわたって分布することが公知であり、そのことは共局在化の結果と一致する。ＲＩＰＬ１は、細胞タンパク質輸送を介して細胞形状および極性の制御に関与する。ＵＢＲ４は、ある特定のタンパク質のユビキチン化およびその後の分解に関与し、核内の網膜芽細胞腫関連タンパク質と相互作用するが、カルシウムと結合したカルモジュリンは、細胞質内に存在し、インテグリン媒介性シグナル伝達を制御する。
【0020】
蛍光色素のエルゴステロールペルオキシドコンジュゲートにより、生細胞イメージングがそれらの細胞内相互作用を探索できるようになる。さらに、蛍光プローブを、蛍光顕微鏡法を使用する共局在化研究のために、細胞内小器官－蛍光トラッカーにスペクトル的に直交するように合理的にデザインした。
【0021】
可能な場合には、細胞内小器官（小胞体、ミトコンドリア、およびリソソーム）を染色する、生細胞のための商業的に入手可能な化学的プローブを使用した。しかし、ゴルジ装置またはペルオキシソームを研究するためのプローブには、直交性色素は利用不可能である。したがって、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を一過的にトランスフェクトした、細胞内小器官を標識された細胞モデルを作製した。また、ｍＲｕｂｙ－ペルオキシソーム－２プラスミド２３ｂをトランスフェクトした、安定に形質転換したがん細胞系を作製した。
【0022】
実質的な共局在化は、プローブ３ｍと共に青色／白色小胞体トラッカーを使用して、小胞体を用いて検出した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＵＭ－１４９がん細胞系の両方について、一貫した観察が記録された。
【0023】
プローブ３ｍの抗増殖活性は、エルゴステロールペルオキシドの抗増殖活性に匹敵していた。
【0024】
ボランコアとエルゴステロールペルオキシドの間により長いリンカーを有するプローブ３ｎは、ミトコンドリアへの蓄積を示した。
【0025】
プローブの化学修飾は、特異的細胞内小器官への蓄積を引き起こして、より大きい細胞損傷を誘導することによって、優れた効力をもたらす。
【0026】
化合物（スルホンアミド）、タグ付きプローブ／エステルは、プロドラッグとみなされ、ＥＰの低い溶解度を克服するために使用される。エステルおよびケトン誘導体は、がん細胞に対して親化合物に由来する改善された効果を有することを「当業者の知識によって明らかに予測する」ことができない。
【0027】
以下の付番された実施形態（節）が意図されるが、それらは非限定的である。
【0028】
１．対象におけるがんに関係する症状を改変する方法であって、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、医薬組成物が、がんに関係する症状を改変する、方法。
【0029】
２．がんに関係する症状の改変が、活性酸素種（ＲＯＳ）の誘導である、節１の方法。
【0030】
３．がんに関係する症状の改変が、がん細胞生存率の阻害である、節１の方法。
【0031】
４．がんに関係する症状の改変が、がん細胞の抗増殖活性の誘導である、節１の方法。
【0032】
５．がんに関係する症状の改変が、がん細胞の細胞周期停止の誘導である、節１の方法。
【0033】
６．がんに関係する症状の改変が、がん細胞のアポトーシスの誘導である、節１の方法。
【0034】
７．がんに関係する症状の改変が、がん細胞のＰＡＲＰ切断の誘導である、節１の方法。
【0035】
８．がんに関係する症状の改変が、がん細胞のアポトーシスの誘導である、節１の方法。
【0036】
９．がんに関係する症状の改変が、がん細胞遊走の低減である、節１の方法。
【0037】
１０．がんに関係する症状の改変が、がん細胞浸潤性の低減である、節１の方法。
【0038】
１１．がんに関係する症状の改変が、腫瘍体積の減少である、節１の方法。
【0039】
１２．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、節１の方法。
【0040】
１３．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、節１の方法。
【0041】
１４．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、節１の方法。
【0042】
１５．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、節１の方法。
【0043】
１６．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、節１の方法。
【0044】
１７．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、節１６の方法。
【0045】
１８．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、節１６の方法。
【0046】
１９．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、節１６の方法。
【0047】
２０．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、節１の方法。
【0048】
２１．対象が、乳がんを有する、節１の方法。
【0049】
２２．乳がんが、炎症性乳がんである、節２１の方法。
【0050】
２３．対象におけるがんを処置する方法であって、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【0051】
２４．がんが、乳がんである、節２３の方法。
【0052】
２５．乳がんが、炎症性乳がんである、節２４の方法。
【0053】
２６．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロール、エルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、節２３の方法。
【0054】
２７．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、節２３の方法。
【0055】
２８．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、節２３の方法。
【0056】
２９．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、節２３の方法。
【0057】
３０．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、節２３の方法。
【0058】
３１．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、節３０の方法。
【0059】
３２．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、節３０の方法。
【0060】
３３．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、節３０の方法。
【0061】
３４．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、節２３の方法。
【0062】
３５．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分および標識化プローブを含む、組成物。
【0063】
３６．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、節３５の組成物。
【0064】
３７．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、節３５の組成物。
【0065】
３８．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、節３５の組成物。
【0066】
３９．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、節３５の組成物。
【0067】
４０．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、節３９の組成物。
【0068】
４１．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、節３９の組成物。
【0069】
４２．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、節３９の組成物。
【0070】
４３．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、節３５の組成物。
【0071】
４４．標識化プローブが、蛍光色素である、節３５の組成物。
【0072】
４５．蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）、およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン（dipyrromethne）誘導体）からなる群より選択される、節４４の組成物。
【0073】
４６．蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である、節４４の組成物。
【0074】
４７．蛍光色素が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）である、節４４の組成物。
【0075】
４８．蛍光色素が、ＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）である、節４４の組成物。
【0076】
４９．プローブが、標的を特定するためのプルダウン実験のために使用されるビオチン化ＥＰである、節３５の組成物（図１２を参照されたい）。
【0077】
５０．細胞における生物学的標的を評価する方法であって、
（ａ）Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分および標識化プローブを含む組成物を、生物学的標的に接触させるステップと、
（ｂ）標識された標的の性質を決定するステップと
を含む、方法。
（ａ）Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分および標識化プローブを含む組成物を、生物学的標的に接触させるステップと、
（ｂ）標識された標的の性質を決定するステップと
を含む、方法。
【0078】
５１．生物学的標的が、細胞内標的である、節５０の方法。
【0079】
５２．生物学的標的が、サイトゾルである、節５０の方法。
【0080】
５３．生物学的標的が、小胞体（ＥＲ）である、節５０の方法。
【0081】
５４．生物学的標的が、ミトコンドリアである、節５０の方法。
【0082】
５５．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、５，６－ジヒドロエルゴステロールである、節５０の方法。
【0083】
５６．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールである、節５０の方法。
【0084】
５７．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、エルゴステロールペルオキシドである、節５０の方法。
【0085】
５８．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体である、節５０の方法。
【0086】
５９．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールスルホンアミドである、節５８の方法。
【0087】
６０．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミドである、節５８の方法。
【0088】
６１．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ誘導体が、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミドである、節５８の方法。
【0089】
６２．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ成分が、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｊ、３ｋ、３ｌ、３ｍ、および３ｎからなる群より選択される化合物である、節５８の方法。
【0090】
６３．標識化プローブが、蛍光色素である、節５０の方法。
【0091】
６４．蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）、およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）からなる群より選択される、節６３の方法。
【0092】
６５．蛍光色素が、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である、節６３の方法。
【0093】
６６．蛍光色素が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）である、節６３の方法。
【0094】
６７．蛍光色素が、ＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）である、節６３の方法。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【0096】
【0097】
【図3】図３Ａ～３Ｃは、乳がん細胞系および正常線維芽細胞におけるＧＡ－０１、エルゴステロール、５，６－ジヒドロエルゴステロール、およびエルゴステロールペルオキシドの効果を示す。材料および方法のセクションに記載される通り、ＳＵＭ－１４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＳＵＭ－１９０、およびＢＪ細胞を播種し、処理した。図３Ａ．ＧＡ－０１は、様々な乳がん細胞系においてＥＣ５０＞５０μＭを有していた。図３Ｂ．エルゴステロールおよび５，６－ジヒドロエルゴステロールは、ＥＣ５０＞５０μＭを有しており、エルゴステロールは、ＳＵＭ－１４９細胞生存率を６４μＭで著しく低下した。図３Ｃ．ＢＪ細胞生存率は、試験された濃度の化合物によって影響を受けなかった。バーは、少なくとも３回の生物学的反復の平均±ＳＥＭを表す。ビヒクルと比較して＊＊Ｐ＜０．０１。
【0098】
【図4】図４Ａ～４Ｅは、乳がん細胞系におけるエルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）の効果を示す。材料および方法のセクションに記載される通り、ＳＵＭ－１４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＳＵＭ－１９０細胞を播種し、処理した。図４Ａ、４Ｂ．ＥＰで２４時間処理したＳＵＭ－１４９細胞は、細胞生存率が著しく低減した。図４Ｃ、４Ｄ．ＥＰを用いる７２時間の処理では、ＳＵＭ－１４９細胞生存率を、８μＭで始めてＥＣ５０＝２０μＭで著しく低下した。図４Ｅ．ＥＰを用いる処理後のＳＵＭ－１４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＳＵＭ－１９０細胞生存率の比較は、すべての乳がん細胞の生存率の低下を示す。バーは、少なくとも３回の生物学的反復の平均±ＳＥＭを表す。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0099】
【図5-1】図５Ａ～５Ｇは、ＳＵＭ－１４９乳がん細胞に対するＥＰの効果を示す。図５Ａ．Ｐ１＝ビヒクル、Ｐ２＝ＥＰ（２０μＭ）。ＥＰで４８時間処理した細胞の細胞周期進行アッセイは、Ｇ１における細胞の百分率の増大およびＧ２／Ｍにおける細胞の百分率の低減を示す。図５Ｂ．図５Ａの結果のグラフ。図５Ｃ．細胞死アッセイは、ＥＰ処理の４８時間後に、生細胞の低減、および初期アポトーシスの細胞の百分率の増大を示す。図５Ｄ．グラフは、ＥＰが生存率を低減し、アポトーシス活性を増大することを示す。図５Ｅ～５Ｆ．ＥＰは、乳がん細胞においてカスパーゼ３／７活性を介してアポトーシスを誘導する。Ｔｒｉｐｌｅｘ Ｇｌｏアッセイを使用して、生存細胞（ＧＦ－ＡＦＣ、閉じた灰色の円）、膜完全性による化合物の細胞傷害（ビス－ＡＡＦ－ＲＦ１１０、閉じた灰色の四角）またはアポトーシス細胞（カスパーゼ３／７活性、黒色の三角）を決定した。図５Ｅ．ＳＵＭ－１４９細胞。図５Ｆ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞。図５Ｇ．ＥＰで７２時間処理した細胞におけるコロニー形成アッセイ。事前処理した細胞をグラフの２００細胞／ｍＬで播種した１０日後に、写真を撮影した。バーは、平均±ＳＥＭを表す。ビヒクルと比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【0100】
【0101】
【0102】
【図8-1】図８Ａ～８Ｇは、ＥＰが、乳がん細胞の遊走および浸潤に影響を及ぼし、がん細胞のシグナル伝達をモジュレートすることを示す。ＳＵＭ－１４９細胞を、材料および方法のセクションに記載される通り、様々な濃度のＥＰで７２時間処理した。図８Ａ．ＥＰは、がん細胞遊走を低減する。図８Ｂ．がん細胞の浸潤が、濃度依存的に低減する。図８Ｃ．ＥＰは、乳がん細胞におけるがん細胞の生存、細胞死、および増殖シグナル伝達経路をモジュレートする。β－アクチンまたはβ－チューブリンをローディング対照として使用した。図８Ｄ．濃度測定分析を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して行った。図８Ｅ．ＥＰ（３０μＭ）は、ＥＰ処理後２４時間目にＰＡＲＰ切断を誘導する。図８Ｆ．Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用する全ＰＡＲＰの濃度測定分析。図８Ｇ．Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用する切断されたＰＡＲＰの濃度測定分析。提示されたすべてのウエスタンブロットを、明りょうさを改善するためにトリミングした。バーは、三連のもの平均±ＳＥＭを表す。ビヒクルと比較して＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。ビヒクルと比較して２４時間での切断されたＰＡＲＰにおける＊Ｐ＝０．０３。
【図8-2】同上。
【0103】
【0104】
【0105】
【0106】
図１１は、ＥＰおよびその類似体の合成を示す。
【0107】
【0108】
【0109】
【図14-2】同上。
【0110】
【0111】
【図16】図１６Ａ～１６Ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＧＦＰ細胞（５．０×１０５）を、雌の無毛重症複合免疫不全マウスの右下乳房脂肪体に注射したことを示す。図１６Ａ．注射当日（１週目）から開始する原発腫瘍の生体内蛍光画像分析。処理［ビヒクルまたはエルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）を、週３回ｉ．ｐ．投与した］は６週目に開始した（赤色の四角）。画像は、処置群当たり８匹のうち代表マウス１匹の腫瘍進行を示す。図１６Ｂ．乳房腫瘍成長を、５週目に対するＧＦＰ蛍光の集積密度の変化として定量した。結果は、ＥＰが腫瘍成長速度を著しく低減することを示している（Ｐ＜０．０４）。処置当たり代表的なマウス３匹の平均±ＳＥＭ。
【0112】
【0113】
【0114】
【0115】
【発明を実施するための形態】
【0116】
本開示は、ＧＬＥの生物活性に関与するＧＬＥの化学的構成成分に関し、様々ながん細胞モデル、特に炎症性乳がんにおける単剤としてのそれらの有効性を特徴付ける。本明細書では、ＮＭＲ研究、Ｘ線結晶学および類似体誘導体化による、ＧＬＥ（丸ごとのキノコであるＲｅｉｓｈｉＭａｘ（登録商標））の７種の最も豊富な化学成分の構造が開示される。トリテルペンおよびステロールを含むこれらの化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性は、様々ながんモデルにおいて実証される。低い溶解度特性を克服するために、乳がんの侵襲性モデルに対して優れた効力を呈する改善された誘導体を合成した。
【0117】
修飾され、したがって自然には存在しない化合物には、スルホンアミド誘導体が含まれる。ＥＰを含めたすべての誘導体を、合成的に作出した。
【0118】
７種の化合物のうちの３種（エルゴステロール、５，６－デヒドロエルゴステロールおよびエルゴステロールペルオキシド）は、著しいｉｎ ｖｉｔｒｏ抗がん活性を示した。ＴＮＢＣ／ＩＢＣ細胞において、エルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）は、Ｇ１期の細胞周期停止、カスパーゼ３／７活性化を介するアポトーシス誘導、およびＰＡＲＰ切断を通じて、抗増殖効果を呈する。ＥＰは、試験したＩＢＣ細胞における全ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＢＣＬ－ＸＬ、サイクリンＤ１およびｃ－Ｍｙｃの発現を阻害すると同時に、がん細胞の遊走および浸潤的効果を低減した。これらの化合物は、細胞の運命を損なう活性酸素種を誘導する。さらに、優れた誘導体であるエルゴステロールペルオキシドスルホンアミドを作製した。この化合物は、ＩＢＣ細胞における効力が改善されており、正常細胞と比較して十分な治療指数（ＴＩ＞１０）を有する。組合せ研究では、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物由来のＥＰが、抗がん剤としてのさらなる探索に有望な分子足場となることが示される。過去の報告は、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物（ＧＬＥ）が、トリプルネガティブ炎症性乳がんモデルに対して著しい抗がん活性を実証したことを示している。本明細書では、この抗がん活性に関与するＧＬＥの生理活性化合物を特定した。
【0119】
プロドラッグの使用の背後にある理論的根拠は、親化合物の吸収、分布、代謝、排出、および望ましくない毒性を最適化することであった。スルホンアミドの選択は、溶解度特性を克服するための明白な手法ではなかったが、このような化合物の特性に関する内部情報が、細胞モデルにおいて発見された。
【0120】
正常細胞に対して最小限の効果を有し、侵襲性悪性疾患、例えばトリプルネガティブおよび炎症性乳がんのための潜在的治療として働く、抗がん活性を有する化合物が開示される。侵襲性腫瘍を有する患者は、特にこの発見から利益を得ることが予測される。また、化合物の細胞内小器官特定のための、ツール化合物を作製した。
【0121】
乳がん（ＳＵＭ－１４９）および正常（ＢＪ）細胞において試験した生理活性化合物である５，６－デヒドロエルゴステロールの特徴および構造が開示される。改善された誘導体には、ガノデリン酸Ａ－メチルエステル、エルゴステロールスルホンアミド、５，６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミド、およびＥＰスルホンアミドが含まれる。５，６－デヒドロエルゴステロールを、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物から精製し、その化学的構造を提供する。エルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）の細胞内小器官の局在、ならびに固形腫瘍および血液腫瘍に対する有効性が実証される。本明細書に記載される化合物は、抗がん効果を有するが、正常細胞には影響を及ぼさない。
【0122】
丸ごとのキノコであるＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍの最も豊富な化学的構成成分の構造の解明を行い、がんモデルにおけるそれらの有効性を試験した。ＧＬＥの単離された化合物は、複数のがん細胞系にわたってある度合いの効力と共に生物活性を呈する。ここでの結果は、ｉ）ＧＬＥの単一成分としてのＥＰが、侵襲性炎症性乳がんモデルに対して最も生物活性が高い化合物であり、低マイクロモル濃度範囲の有望なＥＣ５０値および正常細胞における十分な治療指数を有すること、ｉｉ）Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ由来の５，６－デヒドロエルゴステロールのＸ線結晶、ならびにｉｉｉ）溶解度によって対処された、ＧＡ－０１、エルゴステロール、５，６－デヒドロエルゴステロールおよびＥＰの改善された誘導体が開発されたことを、初めて実証する。多くの天然産物とは異なり、ＧＡ－０１およびＥＰは、タンパク質合成を阻害することによって細胞増殖に対して作用するのではない。むしろ、がん依存機構（例えば、ＡＫＴ生存促進経路）のモジュレーションを通じるカスパーゼ活性化によって、細胞死が媒介される。データは、ＧＡ－０１、エルゴステロール、５，６－デヒドロエルゴステロールおよびＥＰが、乳がん細胞モデルにおいてＲＯＳを誘導したことを示しており、そのことは、ＲＯＳ媒介性機構が、細胞死シグナル伝達経路の開始に寄与することを示唆している。シグナル伝達事象のカスケードをよりよく理解するために、結果により、ＥＰがＡＫＴをモジュレートし、その後、がん細胞の生存、増殖、および進行に関与するタンパク質（例えば、サイクリンＤ１、ｃ－Ｍｙｃ）を減少することが実証される。最後に、ＥＰスルホンアミドなどのより強力な化合物を開発した。
【0123】
エルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）は、広範な疾患に対して細胞傷害を選択的に呈する。しかし、その作用機序は、依然として未知である。ＥＰの効率的な合成は、生細胞研究およびプロテオミクスプロファイリングのための化学的プローブへのアクセスを提供した。ＥＰ類似体は、乳がん細胞モデルに対して有望な抗増殖活性を示し、優れた類似体を開発するための、この天然産物の構造と活性の関係に関する情報を提供する。本明細書における本発明の結果は、ＥＰが、サイトゾルにわたって分布し、がん細胞系のＥＲに著しく蓄積することを実証している。また、これらのＥＰ化学的ツールは、乳がん細胞系におけるその潜在的な生物学的標的の発見を可能にする。
【0124】
乳がん細胞モデルにおける特異的標的に対処するための取り組みが開示される。したがって、本開示では、乳がん細胞モデルにおけるＥＰの潜在的機構を回復するために、ＥＰ化学的プローブを作製して、細胞内共局在を研究した。ＥＰおよびエルゴステロール由来のその類似体の効率的な合成手法を開発した。結果として得られたＥＰ化合物を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ、およびヨウ化プロピジウムアッセイにより、細胞傷害／アポトーシスについて評価した。
【0125】
ＥＰプローブの合成を実施して、潜在的な生物学的標的を評価した。ＥＰ類似体は、改善されたエルゴステロールペルオキシド誘導体の開発を助ける、構造と活性の関係に関する情報を提供した。これらの化学的ツールは、細胞系にわたる生細胞の研究にとって、またがん細胞におけるＥＰの正確な作用機構を描くために有用であり、これらの化学的プローブは、潜在的な抗がん剤のための理想的な分子足場となる。生細胞研究のためのＥＰプローブの短い合成を開示した。ＥＰは、サイトゾルにわたって分布して、ＥＲに著しく蓄積することが見出された。ＥＰプローブは、固形腫瘍細胞モデルに対して有望な抗増殖活性を示し、この天然産物の構造と活性の関係および潜在的な生物学的標的に関する情報を提供する。
【0126】
構築されたプローブは、蛍光源としてＢｏｄｉｐｙ発色団を用いる、ＥＰのエステル化による蛍光プローブの「慣例的化学」合成を使用すると思われる。しかし、本発明の手法は、リンカーのサイズを戦略的に減少して、Ｂｏｄｉｐｙタグの潜在的効果を最小限に抑えた（細胞へのＥＰの細胞蓄積に影響を及ぼす）。結果は、そのプローブがこの蛍光タグによっては方向付けられなかったことを実証するための、対応するＢｏｄｉｐｙタグ対照の作製を含む。対応する細胞モデル（安定に一過的にトランスフェクトされた）を、蛍光プローブに対して直交するように作製すると、その手法は、ユニークで非慣例的なものになった。得られた結果は、ＥＰが、ＥＲおよびサイトゾルに蓄積することを示している。ＥＰの親供給源であるエルゴステロールは、本来、内部の細胞内小器官膜を含めた細胞膜にわたってそれ自体を組み込むことができるので、これにより細胞内の潜在的標的が絞り込まれる。
【0127】
ＧＬＥの化学的構成成分
ほとんどのキノコは、約９０重量％の水を含有しており、残りの１０％は、タンパク質、脂肪、炭水化物、繊維、ビタミン、およびミネラルからなる。Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍなどの薬用キノコは、様々な生理活性分子、すなわちトリテルペン、ステロイド、フェノール、ヌクレオチド、糖タンパク質、および多糖類も含有する。トリテルペン、多糖類、およびペプチドグリカンは、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍにおける３種の主な生理的に活性な構成成分である。初期のスクリーニングでは、ごくわずかな画分が、がん細胞系において選択的細胞死を誘導したことが明らかになった。しかし、微量の画分の未特定のさらなる化合物も、抗がん活性を有し、または特定化合物と相乗的に相互作用すると思われる。それらの初期スクリーニングでは、単一分子の抗がん活性ではなく、各画分（すなわち画分Ａ～Ｆ）の総抗がん活性をモニタリングした。生理活性成分のさらなる特徴付けおよび精製によって、合計１００の画分からいくつかの豊富な化合物が得られた。ＧＬＥを、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器で、イソプロパノール（１ｍＬ／１０ｍｇ）中、２４時間抽出した。バイオアッセイにより導かれた粗製抽出物の分別は、ガノデリン酸およびエルゴステロール（化合物１～６）シリーズ由来の四環系トリテルペン（ＴＬＣおよびＭＳによる）、ならびに脂質（化合物７）の存在を示した。
ほとんどのキノコは、約９０重量％の水を含有しており、残りの１０％は、タンパク質、脂肪、炭水化物、繊維、ビタミン、およびミネラルからなる。Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍなどの薬用キノコは、様々な生理活性分子、すなわちトリテルペン、ステロイド、フェノール、ヌクレオチド、糖タンパク質、および多糖類も含有する。トリテルペン、多糖類、およびペプチドグリカンは、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍにおける３種の主な生理的に活性な構成成分である。初期のスクリーニングでは、ごくわずかな画分が、がん細胞系において選択的細胞死を誘導したことが明らかになった。しかし、微量の画分の未特定のさらなる化合物も、抗がん活性を有し、または特定化合物と相乗的に相互作用すると思われる。それらの初期スクリーニングでは、単一分子の抗がん活性ではなく、各画分（すなわち画分Ａ～Ｆ）の総抗がん活性をモニタリングした。生理活性成分のさらなる特徴付けおよび精製によって、合計１００の画分からいくつかの豊富な化合物が得られた。ＧＬＥを、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器で、イソプロパノール（１ｍＬ／１０ｍｇ）中、２４時間抽出した。バイオアッセイにより導かれた粗製抽出物の分別は、ガノデリン酸およびエルゴステロール（化合物１～６）シリーズ由来の四環系トリテルペン（ＴＬＣおよびＭＳによる）、ならびに脂質（化合物７）の存在を示した。
【0128】
化合物１～７のさらなる特徴付け（図１）では、パルミチン酸（化合物７）が、重量により抽出物において最も豊富な化合物であったことが明らかになった。これらの化合物は文献に報告されているが、それらの精製は、特に保持時間が類似しているガノデリン酸については困難が伴う。実際、純粋なガノデリン酸Ａ（ＧＡ－０１、化合物１）を得るためには、未特定化合物から容易に分離され得るガノデリン酸Ａのメチルエステル（ＧＡ－０１－ＭＥ）（図９、化合物１ａを参照）を作製することに頼る必要があった。塩基を用いるメチルエステルの加水分解により、報告された特徴付けデータと一致して、ＧＡ－０１が非晶質固体として提供された。ガノデレン酸Ａおよびガノデレン酸Ｄ（それぞれ化合物２～３）は、他の異性体とオーバーラップしており、シリカゲルカラムにおいて同時溶離し、その後の生物学的研究のために十分な材料をもたらさなかったので、微量で単離された。カラムクロマトグラフィーの繰返しによって、３種のステロールが提供され、それらの分光学的特性（１Ｈ－および１３Ｃ－ＮＭＲ）により、エルゴステロール（化合物４）、５，６－デヒドロエルゴステロール（化合物５）、およびエルゴステロールペルオキシド（化合物６）であることが確認された。図１を参照されたい。
【0129】
エルゴステロールは、流動性、ならびに原形質膜の生合成および機能を制御する、主な真菌膜ステロールである。重要なことに、エルゴステロールおよび５－６－ジヒドロエルゴステロールの構造が、それらをＸ線結晶学の供することによってさらに確認された。エルゴステロールについてはいくつかのＸ線結晶構造が報告されていたが、本明細書に記載される結果は、５－６－ジヒドロエルゴステロールのＸ線構造を報告しており、これは過去に報告されていなかった。二量体単位格子のＯＲＴＥＰ構造は、図２に図示されている。Ｘ線分子構造の球棒表示を、詳細なパラメータによってまとめた結晶学的データに示す。
【0130】
最も生物活性が高い化合物であるエルゴステロールペルオキシド（ＥＰ、化合物６）の構造的解明を、２Ｄ ＮＭＲ実験と組み合わせた質量分析、すなわちＣＯＳＹ（１Ｈ－１Ｈ相関）、ＨＭＱＣ（１Ｈ－１３Ｃ相関）、ＨＭＢＣ（１Ｈ－１３Ｃ相関）、およびＮＯＥＳＹによって確認し、それによってエルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）の構造を特定した。ＥＰの物理的データおよび分光学的データの両方は、エルゴステロールペルオキシドについて過去に報告された他のデータと完全に一致する。
【実施例】
【0131】
実施例は、例示目的で提供され、本開示の範囲を制限することを企図されない。
（実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのがん細胞に対するＧＬＥ化合物の効果）
ＧＬＥ化学的構成成分はがん細胞生存率を低減する
精製されたＧＬＥ化合物が抗がん活性を発揮するかどうかを調査するために、乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ－７）および炎症性乳がん（ＩＢＣ、ＳＵＭ－１４９およびＳＵＭ－１９０）モデルで細胞生存アッセイを実施した。化合物の活性を、ヒトおよびマウス白血病（ＫＯＰＮ８、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＵｏＣＢ－１、ＳＵＰ－Ｂ１５、ＮＡＬＭ０６）細胞系でも評価した。対照として、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＢＪ）細胞および非がん乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）を使用した。
（実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのがん細胞に対するＧＬＥ化合物の効果）
ＧＬＥ化学的構成成分はがん細胞生存率を低減する
精製されたＧＬＥ化合物が抗がん活性を発揮するかどうかを調査するために、乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ－７）および炎症性乳がん（ＩＢＣ、ＳＵＭ－１４９およびＳＵＭ－１９０）モデルで細胞生存アッセイを実施した。化合物の活性を、ヒトおよびマウス白血病（ＫＯＰＮ８、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＵｏＣＢ－１、ＳＵＰ－Ｂ１５、ＮＡＬＭ０６）細胞系でも評価した。対照として、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＢＪ）細胞および非がん乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）を使用した。
【0132】
ＧＬＥから抽出された異なる濃度の生理活性化学成分を、７２時間の処理期間で試験した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏまたはＰＩ染色生存アッセイを使用する、ＧＬＥから抽出された特定化学成分の用量依存性研究では、ＧＡ－０１および５－６－ジヒドロエルゴステロールの中程度の活性が示された。それらの有効性は、試験条件下で様々な乳がん細胞系についてより高いマイクロモル濃度範囲（＞５０μＭ）のものである（図３Ａ）。エルゴステロールは、乳がん細胞モデルにおいて６４μＭで開始してがん細胞生存率を著しく低下した（図３Ｂ）。重要なことに、ＧＡ－０１、５，６－デヒドロエルゴステロール、エルゴステロールまたはＥＰは、正常ＢＪ細胞においては細胞傷害効果を誘導しなかった（図３Ｃ）。さらに、パルミチン酸は、評価した細胞系において、試験された濃度では活性を示さなかった。
【0133】
７種の単離された生理活性化合物から、ＥＰが、最大の抗がん活性を示した。ＥＰは、ＳＵＭ－１４９ ＴＮＢＣ／ＩＢＣ細胞の生存率の時間依存的および濃度依存的な低減を誘導する（Ｐ＜０．０５）ことが初めて実証され、２４時間目および７２時間目にそれぞれ３４μＭおよび２０μＭのＥＣ５０値が報告された（図４Ａ～Ｄ）。さらに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞およびＳＵＭ－１９０ ＩＢＣ細胞についてのこれらの結果は、やはりＥＰによる濃度依存的な生存率の阻害を示し、ＥＣ５０はそれぞれ１９μＭおよび４３μＭである（図４Ｅ）。これらの結果は、ＴＮＢＣ細胞が、ＥＰに対してより高い感受性を呈し得ることを示唆している。ＥＰ処理時にＳＵＭ－１４９細胞数が減少すると同時に、その形態が影響を受け、液胞の存在が検出された。ＥＰはまた、さらなるがん細胞モデルにおいて生存率の低下を呈し、報告されたＥＣ５０値は７μＭ～２２μＭの範囲であったが、正常ヒト線維芽細胞であるＢＪ細胞（図３Ｃ）およびＭＣＦ１０Ａ非がん乳房上皮細胞においては、ＥＰは細胞傷害を誘導しなかった。したがって、ＥＰは、丸ごとのキノコ抽出物（ＧＬＥ）を用いて得られた効果に類似の、がん細胞生存率に対する選択的効果を発揮し、この化合物についての十分な治療ウインドウを示す。
【0134】
ＥＰは細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する
ＥＰによって誘導された細胞生存率の阻害が、細胞周期進行に対する効果に起因するものかどうかを決定するために、ＳＵＭ－１４９ ＴＮＢＣ／ＩＢＣ細胞における化合物の効果を調査した。結果は、ＳＵＭ－１４９細胞における細胞周期段階に対するＥＰの著しい効果を示している（図５Ａ）。具体的には、Ｇ１期において細胞の百分率の有意な（Ｐ＜０．００１）増大（約２０％）が検出され、Ｇ２／Ｍにおいては細胞の百分率が有意に低下し（Ｐ＜０．０５）（約１０％）、Ｇ１における停止を示した。
ＥＰによって誘導された細胞生存率の阻害が、細胞周期進行に対する効果に起因するものかどうかを決定するために、ＳＵＭ－１４９ ＴＮＢＣ／ＩＢＣ細胞における化合物の効果を調査した。結果は、ＳＵＭ－１４９細胞における細胞周期段階に対するＥＰの著しい効果を示している（図５Ａ）。具体的には、Ｇ１期において細胞の百分率の有意な（Ｐ＜０．００１）増大（約２０％）が検出され、Ｇ２／Ｍにおいては細胞の百分率が有意に低下し（Ｐ＜０．０５）（約１０％）、Ｇ１における停止を示した。
【0135】
細胞は、一般に、変異またはＤＮＡ損傷に起因して周期のＧ１期を迂回できず、それによってアポトーシスが生じ得る。したがって、ＥＰが、ＳＵＭ－１４９細胞においてプログラム細胞死を誘導するかどうかを決定するために、処理した細胞をアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ色素で二重染色して、初期対後期アポトーシスの細胞の百分率、ならびに生存細胞の百分率を決定した。図５Ｂに示される通り、初期アポトーシスの細胞の百分率（アネキシン＋、７ＡＡＤ－）は、有意に増大し（Ｐ＜０．０００１）、４８時間のＥＰ処理後の生細胞の百分率は、低減し（約１５％；アネキシン－、７ＡＡＤ－）（Ｐ＜０．０００１）、アポトーシス誘導の予想が確認された。さらに、カスパーゼ３／７活性アッセイを、アポトーシス検出の代替法として実施した。ＧＡ－０１およびＥＰは（図５Ｃ）、共にカスパーゼ３／７活性を増大し、ＳＵＭ－１４９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞の両方の生存率を低減し、ＧＬＥの化学的生理活性構成成分の死滅誘導効果を実証している。最後に、ＳＵＭ－１４９細胞のＥＰ処理時に、形成されたコロニーの数およびサイズの濃度依存的低減（図５Ｄ）が示され、ＥＰの細胞周期停止および死滅誘導効果がさらに確認された。
【0136】
タンパク質合成およびＲＯＳ形成に対するＥＰ効果
過去には、丸ごとのキノコのＧＬＥの２４時間の処理が、ＳＵＭ－１４９ ＴＮＢＣ細胞において約５０％のタンパク質合成阻害を誘導することが示された。ＧＬＥから誘導されたＧＡ－０１またはＥＰが、新規タンパク質合成阻害を誘導するかどうかを試験するために、それらを、ＴＮＢＣモデルにおいて細胞内クリック新規タンパク質合成アッセイに従って、公知のタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドのために使用される条件と同じ条件下で細胞を２時間処理することによって試験した。結果は、ＥＰおよびＧＡ－０１が、これらの実験条件下で新規タンパク質合成を阻害しないことを示している（図６）。
過去には、丸ごとのキノコのＧＬＥの２４時間の処理が、ＳＵＭ－１４９ ＴＮＢＣ細胞において約５０％のタンパク質合成阻害を誘導することが示された。ＧＬＥから誘導されたＧＡ－０１またはＥＰが、新規タンパク質合成阻害を誘導するかどうかを試験するために、それらを、ＴＮＢＣモデルにおいて細胞内クリック新規タンパク質合成アッセイに従って、公知のタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドのために使用される条件と同じ条件下で細胞を２時間処理することによって試験した。結果は、ＥＰおよびＧＡ－０１が、これらの実験条件下で新規タンパク質合成を阻害しないことを示している（図６）。
【0137】
個々の化合物がＳＵＭ－１４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１においておよびＭＣＦ－７乳がん細胞において活性酸素種（ＲＯＳ）形成に影響を及ぼすかどうかについて決定した。酸化ストレス検出のための生細胞ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）アッセイを実行して、ＧＡ－０１、エルゴステロール、５－６－ジヒドロエルゴステロールおよびＥＰが、ＲＯＳを誘導することによって内因性アポトーシス経路を誘発するかどうかを評価した。ＣｅｌｌＲｏｘ（登録商標）緑色試薬は、還元状態でも弱い蛍光を有する透過性色素であり、ＲＯＳによる酸化時に明るい緑色の光安定性の蛍光を示す。メナジオンまたはｔ－ブチルヒドロゲンペルオキシド（ＴＢＨＰ）は、陽性対照であり（図７およびＳ５）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）と同時処理して、シグナルが化合物によって誘導されたＲＯＳ形成に起因していることを確認した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＵＭ－１４９細胞において、メナジオン処理は類似の効果を引き起こし、ＮＡＣの存在下でＲＯＳ形成が有意に約２０％低下したが（Ｐ＜０．０００１）、このことは、グルタチオンレベルの増大、システインジスルフィド分子を発生するＲＯＳとの直接相互作用、または化合物への直接的な妨害を示すと思われる。ＥＰは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１については２倍のＲＯＳ形成（Ｐ＜０．００１）（図７Ａ）およびＳＵＭ－１４９細胞においては４倍のＲＯＳ形成（Ｐ＜０．０００１）（図７Ｂ）を、有意に誘導した。重要なことに、ＮＡＣの存在下では、ＳＵＭ－１４９細胞におけるＲＯＳ形成が有意に約２０％低下し（Ｐ＜０．００１）、ＥＰの効果が、ＳＵＭ－１４９細胞において最も顕著であることを示唆している。ＭＣＦ－７乳がん細胞において、ＴＢＨＰ処理は、ＮＡＣの存在下でＲＯＳ形成をほぼ５０％低下した。ＧＡ－０１、エルゴステロール、５－６－ジヒドロエルゴステロールおよびＥＰは、少なくとも２倍のＲＯＳの増大を誘導したが、ＴＢＨＰとは異なり、ＮＡＣと同時処理した場合、わずか９～２５％しかＲＯＳ形成の低下が観察されず、これらの結果のいずれも、統計的に有意ではなかった。さらに、エンドペルオキシドモチーフがＮＡＣと反応する可能性を評価した。ＥＰを、ＤＭＳＯ中ＮＡＣと共に３７℃で２４時間インキュベートした。反応混合物を、ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳによってモニタリングしたが、観察できるほどのオレフィン移動もエンドペルオキシドの開環も検出されなかった。したがって、ＲＯＳを誘導するＥＰの能力は、潜在的に、ＭＣＦ－７細胞におけるＴＢＨＰの能力とは異なる機構によるものであり得る。
【0138】
ＥＰは乳がん細胞における細胞遊走、浸潤、および主要シグナル伝達経路を低下する
過去には、ＳＵＭ－１４９細胞における丸ごとのキノコのＧＬＥの抗遊走性活性が報告された。細胞遊走に対するＥＰの効果を調査するために、Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイを使用し、浸潤を調査するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバを使用した。本発明者らの結果は、ＥＰが、報告されたＥＣ５０よりも低用量（１０μＭ）でがん細胞遊走を低減することを示している（図８Ａ）。１０μＭで処理すると浸潤細胞の有意な低下（Ｐ＜０．０５）が観察されたので、ＥＰは、がん細胞の浸潤の濃度依存的な低減を示す。さらに、細胞を非致死性用量の１５μＭのＥＰで処理すると、さらなる低減（４３％）が見られた（Ｐ＜０．０１）（図８Ｂ）。これらの結果は、ＳＵＭ－１４９ ＩＢＣ細胞におけるＥＰの抗遊走性効果を実証する最初のものである。
過去には、ＳＵＭ－１４９細胞における丸ごとのキノコのＧＬＥの抗遊走性活性が報告された。細胞遊走に対するＥＰの効果を調査するために、Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイを使用し、浸潤を調査するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバを使用した。本発明者らの結果は、ＥＰが、報告されたＥＣ５０よりも低用量（１０μＭ）でがん細胞遊走を低減することを示している（図８Ａ）。１０μＭで処理すると浸潤細胞の有意な低下（Ｐ＜０．０５）が観察されたので、ＥＰは、がん細胞の浸潤の濃度依存的な低減を示す。さらに、細胞を非致死性用量の１５μＭのＥＰで処理すると、さらなる低減（４３％）が見られた（Ｐ＜０．０１）（図８Ｂ）。これらの結果は、ＳＵＭ－１４９ ＩＢＣ細胞におけるＥＰの抗遊走性効果を実証する最初のものである。
【0139】
がん細胞の生存および浸潤シグナル伝達の駆動因子に焦点を合わせた研究では、乳がんにおけるＡＫＴアイソフォームの重要な役割が示される。ＡＫＴ１およびＡＫＴ３は、乳がん浸潤と関連しており、ＰＴＥＮ欠損腫瘍は、維持および生存のためにＡＫＴ２に依存する。開示された結果は、ＥＰ処理が、ＳＵＭ－１４９細胞（Ｓ６）においてｐ－ＡＫＴ１の発現を有意に低減し（Ｓｅｒ４７３、Ｐ＜０．０１）、全ＡＫＴ１（Ｐ＜０．０５）およびＡＫＴ２レベル（Ｐ＜０．００１）を低減するが（図８Ｃおよび８Ｄ）、ＡＫＴ３レベルには影響を及ぼさないことを示している。ＥＰによるＡＫＴアイソフォームの発現の制御は、同じ乳がん細胞系において丸ごとのキノコのＧＬＥを用いて本発明者らが報告したものに極めて類似している。
【0140】
ＥＰはアポトーシスを誘導したので、ミトコンドリアからのチトクロムＣの放出をブロックする、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ－２およびＢＣＬ－ＸＬの発現に対するその効果を調査した。図８Ｃおよび８Ｄに示される通り、ＥＰは、乳がん細胞における細胞周期進行および増殖に関与するシグナル伝達分子である、ＢＣＬ－ＸＬの発現（Ｐ＜０．００１）、ならびにサイクリンＤ１（Ｐ＜０．０５）およびｃ－Ｍｙｃ（Ｐ＜０．００１）の発現を有意に低下する。ＳＵＭ－１４９細胞におけるＥＰのアポトーシス誘導効果を、ＰＡＲＰ切断をモニタリングすることによって調査した。本明細書で開示される結果は、ＥＰが、ＳＵＭ－１４９細胞における２４時間の処理後に、全ＰＡＲＰレベルを有意に低下し（Ｐ＜０．０００１）、ＰＡＲＰ切断を誘導する（Ｐ＜０．０２）ことを実証する。この結果の組合せは、遊走および死滅誘導プロセスに影響を及ぼす、がん細胞に対するＥＰの阻害効果、ならびにがん進行において極めて重要な役割を果たす主要タンパク質の発現を実証する。
【0141】
（実施例２：有効性を改善するための化合物の修飾）
ＥＰ誘導体
化学修飾が、エルゴステロール、５－６－ジヒドロエルゴステロールおよびＥＰの生物活性を改善し得るかどうかを調査するために、それらの対応する中性Ｃ－３ベンゼンスルホニルカルバメート誘導体をデザインし、合成した。これらの化合物の観察された中程度の生理活性は、化合物の溶解度または膜透過性に部分的に起因していた。したがって、プロドラッグ戦略としてカルバメート官能基の導入を使用して、細胞活性を改善した。これらの誘導体の合成が示され（図９）、その合成は、ベンゼンスルホニルクロリド（１．１当量）を、ＴＨＦ中エルゴステロール（化合物４ａ、エルゴステロールスルホンアミド）、５－６－ジヒドロエルゴステロール（化合物５ａ、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミド）およびＥＰ（化合物６ａ、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミド）にＲＴで添加することを含んでいた。反応は、良好から優れた収率（８７～９３％）で完了した。弱塩基性化合物は、それらの環境のｐＨおよび官能基（－ＯＨ、－ＣＯ２Ｈ）のｐＫａに応じて、非イオン化またはイオン化形態で存在することができる。イオン化化合物は、脂質二重層にわたって、非イオン化化合物の透過性と比較して低い透過性を有することができる。中性カルバメート誘導体であるエルゴステロールスルホンアミド、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミド、およびＥＰスルホンアミドは、改善された溶解度を有し、細胞膜を通過し、好ましい緩慢な細胞内蓄積を生じさせるはずである。
ＥＰ誘導体
化学修飾が、エルゴステロール、５－６－ジヒドロエルゴステロールおよびＥＰの生物活性を改善し得るかどうかを調査するために、それらの対応する中性Ｃ－３ベンゼンスルホニルカルバメート誘導体をデザインし、合成した。これらの化合物の観察された中程度の生理活性は、化合物の溶解度または膜透過性に部分的に起因していた。したがって、プロドラッグ戦略としてカルバメート官能基の導入を使用して、細胞活性を改善した。これらの誘導体の合成が示され（図９）、その合成は、ベンゼンスルホニルクロリド（１．１当量）を、ＴＨＦ中エルゴステロール（化合物４ａ、エルゴステロールスルホンアミド）、５－６－ジヒドロエルゴステロール（化合物５ａ、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミド）およびＥＰ（化合物６ａ、エルゴステロールペルオキシドスルホンアミド）にＲＴで添加することを含んでいた。反応は、良好から優れた収率（８７～９３％）で完了した。弱塩基性化合物は、それらの環境のｐＨおよび官能基（－ＯＨ、－ＣＯ２Ｈ）のｐＫａに応じて、非イオン化またはイオン化形態で存在することができる。イオン化化合物は、脂質二重層にわたって、非イオン化化合物の透過性と比較して低い透過性を有することができる。中性カルバメート誘導体であるエルゴステロールスルホンアミド、５－６－ジヒドロエルゴステロールスルホンアミド、およびＥＰスルホンアミドは、改善された溶解度を有し、細胞膜を通過し、好ましい緩慢な細胞内蓄積を生じさせるはずである。
【0142】
乳がん細胞における化合物の細胞傷害評価では、それらの対応する親構造の効果を上回る改善された細胞傷害効果が示された（図１０Ａ）。ＥＰスルホンアミドは、がん細胞生存率の有意な低下を示し（Ｐ＜０．０００１）、ＥＣ５０＝１２μＭである。これらの細胞をＥＰスルホンアミドで処理した場合、ヒト正常ＢＪ線維芽細胞に対する毒性は最小限であり、この化合物ががん細胞を選択的に標的にすることを示した（図１０Ｂ）。一般に、プロドラッグの使用の背後にある理論的根拠は、親化合物と同じ生物学的プロファイルを維持しながら、化合物の生理化学的特性を最適化することである。
【0143】
本願では、ＧＬＥにおけるトリテルペン含量は、１～３％の範囲であったが、脂質含量は３つの異なるバッチで依然として一貫していた。トリテルペン含量の変動は、キノコによるテルペン生成の差または抽出方法に起因して起こり得る。本明細書では、ＧＬＥにおける７種の最も豊富な化合物が提示され、それには、ガノデリン酸（ＧＡ－０１）、ガノデレン酸Ａ、ガノデレン酸Ｄ、エルゴステロール、５，６－デヒドロエルゴステロール、エルゴステロールペルオキシド（ＥＰ）、およびパルミチン酸が含まれていた。過去には、エルゴステロールの結晶構造が報告されていたが、本発明の研究では、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ由来の５－６－ジヒドロエルゴステロールのＸ線構造が初めて提供された。
【0144】
がんの病理生物学の潜在的な差を捉えるために、単離された化合物の効果を、乳がん細胞モデルの代表的パネルで試験した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＵＭ－１４９は、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞であり、すなわちそれらは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）が欠けており、それぞれ間葉系様乳がんおよび上皮様炎症性乳がんの２種の別個の乳がんサブタイプを表す。ＳＵＭ－１９０は、ＥＲ／ＰＲ－ネガティブであるがＨＥＲ２がん遺伝子を発現するＩＢＣ細胞系であり、ＭＣＦ－７細胞は、ＥＲ／ＰＲ受容体（ＥＲ／ＰＲ－ポジティブ／ＨＥＲ２－ネガティブ）を発現する。最も侵襲性が高い乳がんの患者コホートにおいて処置を成功させるための治療剤が欠けているため、調査は、最も侵襲性が高い乳がんモデル（ＴＮＢＣおよびＩＢＣ）に対して化合物を試験することに焦点を当てた。
【0145】
７種の単離された化合物のうち、エルゴステロールは、ＨＥＰＧ２、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞系における過去のエルゴステロール研究と一致して、ＳＵＭ－１４９細胞に対して中程度の生物活性を呈した。ＥＰは、試験した細胞系において最大の選択的抗がん活性を呈した。ＥＰは、環式ペルオキシド（－Ｏ－Ｏ－）を特徴とし、これらの化合物は、まとめてエンドペルオキシドとして公知である。このクラスの化合物の典型的な例は、薬物耐性寄生虫の拡散の低下を助け、細胞傷害活性が実証された抗マラリア薬物であるアルテミシニンにおいて特徴付けられる。ＥＰは、肝細胞癌細胞モデルにおいて、様々なシグナル伝達経路（例えば、ＡＫＴおよびｃ－ｍｙｃ）の制御により抗がん細胞成長特性を有することが示されている。同様に、本発明の結果は、ＥＰが、様々ながんモデルにおいてがん細胞生存率に選択的に影響を及ぼし、ここでは、ＳＵＭ－１４９ ＩＢＣ細胞が最も高い感受性を呈することを示している。興味深いことに、正常ＢＪおよび非がん乳房上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞において、ＥＰ処理は著しい細胞傷害を示さなかった。本明細書で報告された研究では、ＥＰが、細胞周期におけるＧ１停止を誘導し、それには、サイクリンＤ１およびｃ－ｍｙｃ発現の低減、ならびにＳＵＭ－１４９細胞の初期アポトーシスの増大が伴うことが明らかになった。同等の制御的な結果が、結腸直腸および肝細胞がん細胞モデルにおいてＥＰ処理時に得られ、ほとんどの細胞が周期の初期段階で停止した。さらに、ＥＰは、生存促進性ｐ－ＡＫＴ１の発現、ならびに全ＡＫＴ１およびＡＫＴ２のレベルを、ｐ－ＡＫＴ２に影響を及ぼさずに低下する。ＥＰは、全タンパク質に対して得られた阻害効果を克服するためのシグナルを誘導するフィードバック機構を介して、ｐ－ＡＫＴ２に影響を及ぼさずに全ＡＫＴ２を低減することが可能である。ｐ－ＡＫＴ２は、著しく上方制御されないが、リン酸化レベルは、全ＡＫＴ２の喪失を相殺するように安定化されると思われる。ＥＰの細胞シグナル伝達制御効果を理解するためのさらなる研究が進行中である。
【0146】
ＳＵＭ－１４９細胞のＥＰ処理は、細胞生存率を低下し、２４時間の処理後に、カスパーゼ－３／７活性およびＰＡＲＰ切断の増大によって検出されたアポトーシスを誘導した。ＳＵＭ－１４９（ＴＮＢＣ／ＩＢＣ）細胞におけるＥＰの細胞傷害プロファイルは、細胞周期停止および初期アポトーシスを誘導する化合物に曝露した細胞のものと一致する。それとは対照的に、ＥＰは、がん細胞生存率を低減すると同時に、カスパーゼ３／７活性化を介してアポトーシスを誘導し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞の細胞傷害を増大した。結果の組合せは、２種のＴＮＢＣ細胞系に対するＥＰの死滅誘導効果が、異なる機構によって起こることを示唆している。試験したすべての化合物は、レベルが異なっていても、乳がん細胞においてＲＯＳを誘導する。具体的には、ＥＰは、ＳＵＭ－１４９細胞においてより高い能力でＲＯＳの形成を増大し、その効果は、ＮＡＣと同時処理すると低下した。したがって、細胞内ＲＯＳは、ＥＰの観察されたアポトーシス効果のさらなる寄与因子であると思われる。重要なことに、結果は、過去に別個の供給源から得られた、結腸直腸、前立腺、および白血病細胞を含む様々なｉｎ ｖｉｔｒｏがんモデルにおいて実証されたＥＰのアポトーシス誘導効果と一致する。
【0147】
それらの病原性を増大するさらなるがん細胞特性には、遠隔臓器部位に遊走し、浸潤するそれらの能力が含まれる。したがって、ＳＵＭ－１４９細胞の運動性および浸潤に対する非致死用量のＥＰの制御効果を調査した。ＥＰは、細胞遊走および浸潤の低下を呈し、これらの結果は、乳がん細胞の浸潤能力の低下が実証されたＧＬＥの過去の研究と一致する。さらに、本発明の結果は、ＳＵＭ－１４９乳がん細胞におけるＥＰの抗遊走効果を実証し、乳がん系において文献で報告された投薬量よりも低い投薬量で抗浸潤効果を実証する、最初のものである。
【0148】
ＥＰに伴う傾向の１つは、部分的に水溶性であり、部分的に水不溶性の特徴を有する両親媒性分子であるコレステロールと、そのコアを共有することである。したがって、細胞膜を容易に透過できる一方、純粋化合物を送達する能力は、課題に直面する。ＤＭＳＯまたは水へのＥＰの溶解度特性は、３０℃まで加温されない限り低い。しかし、この報告では、ＥＰの誘導体であるＥＰスルホンアミドは、ＤＭＳＯに１０ｍＭで可溶性であった。したがって、ＥＰよりも高い効力およびＢＪ正常細胞と比較して十分な治療ウインドウを有する選択的抗がん化合物の作製を達成した。
【0149】
（実施例３：プローブの構築）
まず、ＥＰを、出発材料としてのエルゴステロールから、ＭｅＯＨ中ラジカル開始剤（触媒作用的）の存在下で酸素を用いて処理することによって、ヘテロディールス・アルダー反応を介して、精製後に単一化合物として優れた収率（収率９３％、ＳＩ参照）で作製した。Ｃ３における遊離ヒドロキシル基は、さらなる官能化のための手段を提供する。したがって、いくつかのＥＰ類似体（３ａ～３ｋ）（図１２）を作製して、細胞傷害に関してＣ３－ヒドロキシル基とのリンカーの長さおよび性質（極性基）の影響を評価した。過去には、ＥＰのベンジルカルバメートが、おそらくは溶解度特性の改善に起因して、改善された生物学的活性を呈することが観察された。
まず、ＥＰを、出発材料としてのエルゴステロールから、ＭｅＯＨ中ラジカル開始剤（触媒作用的）の存在下で酸素を用いて処理することによって、ヘテロディールス・アルダー反応を介して、精製後に単一化合物として優れた収率（収率９３％、ＳＩ参照）で作製した。Ｃ３における遊離ヒドロキシル基は、さらなる官能化のための手段を提供する。したがって、いくつかのＥＰ類似体（３ａ～３ｋ）（図１２）を作製して、細胞傷害に関してＣ３－ヒドロキシル基とのリンカーの長さおよび性質（極性基）の影響を評価した。過去には、ＥＰのベンジルカルバメートが、おそらくは溶解度特性の改善に起因して、改善された生物学的活性を呈することが観察された。
【0150】
化合物３をＴＰＡＰ／ＮＭＯでＲＴにおいて酸化して、エノン系３ａを提供した。並行して、３ｂ～３ｃ、３ｈ、３ｉ、３ｊおよび３ｋの合成では、ＥＰを対応するカルボン酸、塩化アシル、または無水物でエステル化した（詳細な情報についてはＳＩを参照）。３ｄ～３ｇの合成は、ＳＮ２タイプの反応を含んでいた。ビオチン化化合物の合成は、ＥＰを、良好な収率でビオチンの混合無水物とカップリングすることを含んでいた。合成した化合物を、１Ｈおよび１３Ｃ（１Ｄおよび２Ｄ）ＮＭＲ、ならびに質量分析によって特徴付けた。次に、ＥＰ蛍光プローブ（３ｌ～３ｎ）の作製を、細胞内小器官の検出および機能に関する研究を含む生細胞分析のために作製した（図１５）。ＥＰと、蛍光色素、例えばＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート誘導体）、およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素－ジピロメテン誘導体）とのコンジュゲーションが意図された。これらの蛍光プローブは、蛍光顕微鏡を使用する共局在研究中、他の細胞内小器官－蛍光トラッカーに対して直交性でなければならない。Ｂｕらは、ミトコンドリアに蓄積することが公知のＥＰのクマリン蛍光プローブを作製した。本明細書で開示される不偏性蛍光ＥＰプローブは、蛍光タグの影響なしに特異的部位へのＥＰの蓄積を明らかにする（undercover）ことを企図されたものであり、ＥＰの機構への洞察を提供する。蛍光試薬は、親化合物の運動性および蓄積部位に影響を及ぼす場合があり、リンカーのサイズの最小化を、親ＥＰと比較して分子量範囲を維持するために最小化した。ローダミンプローブ（テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ）の構造は、図１５に示される。
【0151】
商業的に入手可能な５－ＴＡＭＲＡ（５－カルボキシテトラメチルローダミン）、プロパルギルアミン（２当量）をＰｙｐＯＰおよびヒューニッヒ塩基で処理することにより、対応するＦＩＴＣ－プロパルギルアミドを得られた（収率９０％）。次に、ＥＰ－アジドの合成を、（ａ）ＥＰを塩化アシルでアシル化し、続いて（ｂ）塩基条件下でアジドを置き換えることによって達成した。銅触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を、ｔ－ＢｕＯＨおよび水中アスコルビン酸ナトリウムの存在下で触媒作用的な硫酸銅によって媒介して、３Ｉを６８％で提供した。ＢＯＤＩＰＹに由来するプローブを、ＢＯＤＩＰＹプロピオネート（propianate）をＥｔ３Ｎの存在下で活性化２，４，６－トリクロロベンゾイルクロリドで処理し、その後ＥＰを付加して化合物３ｍを生じることによって作製した。ＢＯＤＩＰＹディープレッド蛍光試薬の対応するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルの単一ステップによる縮合により、３ｎが収率６０％で得られた。
【0152】
ＥＰの構造と活性の関係をより良く理解するために、そのコアを、ステロイド骨格のＣ３位置で修飾した。エルゴステロールの評価から、エンドペルオキシドは、がん細胞モデルに対する強力な活性に必要な官能基であることが、本発明者らに明らかになっていた。これらの化合物の細胞傷害を評価するために、ＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）を、表１に示される通り７２時間使用した。トリプルネガティブ乳がん細胞系：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＳＵＭ－１４９、およびＥＲポジティブ細胞Ｔ４７Ｄ。正常細胞系であるＨＭＥＣおよびＢＪ細胞の両方も評価して、治療指数を決定した。結果は、ＴＮＢＣモデルであるＳＵＭ－１４９が、すべての化合物に対して最も感受性が高い細胞系であり、一方、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は応答性が少なかったことを示した。ＥＲポジティブ細胞系であるＴ４７Ｄは、研究条件下では応答性が最も低かった。ＥＰ（化合物３）は、がん細胞系にわたって様々な効力を有することが報告されており、それはその溶解度が低いことに直接的に起因し得る。３は、驚くべきことに安定であると同時に、ほんの一報の報告が、おそらくは逆（retro）－ディールス・アルダー反応（react）を介する３からエルゴステロールへの変換を開示した。ＰＢＳ中ＭＳ／ＭＳによる分解は、３７℃で７２時間にわたって観察されなかった。しかし、化合物３の沈殿がＲＴで１６８時間にわたって形成され、モル濃度に影響を及ぼす。さらに、作製された化合物の一部は、やはり低い溶解度特性を呈し、この潜在的傾向を克服するために、リポソーム送達が好適な将来的戦略になることを示している。
【0153】
注目すべきことには、酸化した化合物３ａは、改善された活性を呈し、それが溶解度特性の改善に部分的に起因した。対応するアミン（３ｂ）、クロリド（３ｃ）、アジド（３ｄ）は、ＳＵＭ－１４９に対して有望な活性を示し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＴ４７Ｄにおいては、試験された濃度において活性はほとんどまたは全く観察されなかった。対応するアルキニルエーテル３ｅは、より良好な活性を示したが、より長い鎖を含有する化合物３ｊは、細胞系にわたって優れた活性を示した。ホスホン酸エステル３ｆは、改善された活性を示したが、対応するホスホン酸（３ｇ）、ホスホコリン（３ｈ）およびグルタル酸エステル（３ｉ）は低い活性を呈し、これは、おそらくこれらの化合物の帯電性質に起因していた。ビオチン化化合物３ｋは、親化合物３に匹敵する細胞傷害を示した。ＴＡＭＲＡ－プローブ３ｌは、低い溶解度特性を示し、ＤＭＳＯまたはＰＢＳ中で容易に沈殿した。洗い流し実験では、化合物３ｌが、細胞に全く蓄積しなかったことが明らかになった。観察された細胞傷害は、あるとしても短い細胞内滞在時間に起因して、アポトーシスによるものではなく栄養素摂取の妨害から生じている可能性がある。最後に、蛍光プローブ３ｍは、親化合物３に匹敵する細胞傷害を実証した。しかし、３ｎは、優れた活性を示した。化合物３およびその化学的な類似体は、試験された濃度において、ＦＤＡ承認薬物（カペシタビン）に匹敵する中程度の治療指数を呈し、特に化合物３ｋ、３ｍ～３ｎが有望であったことを強調しておくことも重要である。これらの化合物の抗増殖効果だけでなく、アポトーシスを誘導する能力も、３ｋ、３ｍ～３ｎについて、ヨウ化プロピジウムアッセイにより妥当性を検証した。
【0154】
次に、ＥＰの細胞内共局在を評価するために、作出された直交性細胞モデルを作製した。合成化学的プローブは、細胞の遺伝子操作よりも費用効率が高く、より多量に入手可能である。それらのプローブはまた、広範な報告および標的化一体型の特色を有することができ、それによってプローブは多目的な調査ツールになる。細胞におけるそれらの使用は、細胞の形質転換または操作を必要としない。化学的プローブは、商業的に入手可能な色素と共に使用されたが、ゴルジおよびペルオキシソームを研究するための本発明者らの化学的プローブに利用可能な直交性色素はなかった。したがって、一過的にトランスフェクトされた細胞モデルについて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＵＭ－１４９のためにＢａｃＭａｍ技術を適用した（図３Ａ～３Ｂに示される通り）。
【0155】
Ｒｕｂｙ－ペルオキシソームタグ付き細胞内小器官のために、安定なＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を作製した（図１３）。
【0156】
ＥＰは、エンドペルオキシドであり、ペルオキシソームに蓄積する可能性が高いと思われる。まず、プローブ３ｌを評価したが、前述の通り、その化合物は細胞への透過に困難を有するので、細胞染色は観察されなかった。プローブ３ｍの洗い流し実験に示される通り、その化合物は、サイトゾルにわたって分布することが示された。次に、化合物３ｍを、Ｒｕｂｙ－赤色ペルオキシソームが安定にトランスフェクトされた細胞で評価したが（図１４Ａ）、共局在は観察されなかった。同じ観察を、ゴルジ－ＲＦＰ細胞について決定した（図１４Ｂ）。３ｍがリソソームに蓄積したかどうかを評価するために、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを使用したが（図１４Ｃ）、共局在は記録されなかった。次に、ディープレッドｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを使用して、ミトコンドリアの共局在を評価したが、オーバーラップは検出されなかった（図１４Ｄ）。最後に、３ｍとともに青色／白色ＥＲトラッカーを使用することによって、良好な共局在が記録された（図１４Ｅ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＵＭ－１４９がん細胞の両方において、観察の一致が記録された。この化学的プローブは、細胞においてＥＰと類似の有効性を有していたので、結果の組合せは、ＥＰが細胞のサイトゾルに存在し、ＥＲに部分的に共局在する可能性が高いことを示唆している。
【0157】
また、ディープレッドＥＰプローブ（３ｎ）を作製し、評価して、類似の局在パターンが観察され得るかどうかを決定した。ＧＦＰ－ペルオキシソーム細胞系において、図５Ａに示される通り、３ｍから異なるパターンが観察された。蓄積は全く異なるように見えたので、緑色ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを使用して、細胞内の化合物分布を調査した。予想外に、３ｎは、ミトコンドリアに選択的に蓄積した。このような知見は、この化合物が、ミトコンドリアに存在する場合にはより大きい細胞損傷を誘導し得るので、細胞系にわたって評価したすべての誘導体のうち最も強力な化合物であったという本発明者らの知見と合致した。
【0158】
ＮＰおよび薬物の作用機序を研究するための標的デコンボリューションは、依然として、今日の化学生物学において最も困難なものの１つである。しかし、親和性ベースのプロテオミクスは、今もなお、薬物の発見における生物学的標的の特定を加速する最も一般的で有力な方法である。したがって、プルダウン実験を、ＥＰに類似の有効性を示したビオチン化プローブ３ｋを用いてデザインした。ビーズに結合したビオチン化プローブを細胞溶解物と共にインキュベーションすることにより、化合物の溶解度と関係する問題の一部および細胞死中の二次的効果が回避される。対照としての非細胞傷害性ビオチン化コレステロールプローブは、優れたプローブであると証明され、すべての非選択的タンパク質を標的とする著しい利点を付加した。成果は、潜在的なタンパク質相互作用物質への洞察を提供する。ＳＵＭ－１４９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞モデルにおいて３ｋと相互作用する潜在的な生物学的標的の分布は、図１８に示される。潜在的標的の有意なｐ値を十分に呈するスペクトルカウントを実施した。ＳＵＭ－１４９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞系の両方において、２種の標的（ＲＩＰＬ２およびＵＢＲ４）が特定されたが、それらは共に、サイトゾルおよび原形質膜にわたって分布し、そのことは本発明者らの共局在研究と合致すると思われる。Ｒａｂ相互作用リソソームタンパク質様１（ＲＬＰ１、またＲＩＬＰＬ１として公知）は、細胞タンパク質輸送におけるその役割に起因して、細胞形状および極性を制御する上である役割を果たす。Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ（ＵＢＲ４）は、核内で網膜芽細胞腫関連タンパク質と相互作用し、細胞質内でカルシウム結合カルモジュリンと相互作用する。ＵＢＲ４は、Ｎ末端則経路の成分でもあり、不安定化しつつある特異的Ｎ－末端残基を担持するタンパク質を、Ｎ末端則に従って認識し、それに結合して、それらをユビキチン化し、その後分解する。クラスリンとカップリングしたこのタンパク質は、膜の形態形成および細胞骨格の組織化に関与する網目構造を形成し、インテグリン媒介性シグナル伝達を制御する。この天然産物の正確な作用機序を解明するために、さらなる検証研究は当然である。ＥＰは、さらなる治療開発のためのヒット化合物としての潜在可能性を有しており、化学修飾は、特異的な細胞内小器官に蓄積して、より高い細胞効果を誘導することによって、優れた効力をもたらすことができる。
【0159】
（実施例４：腫瘍進行生成におけるエルゴステロールペルオキシドの有効性のｉｎ ｖｉｖｏ研究）
１．実験デザイン
雌の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（２１日齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、特定病原体除去条件下で収容した。マウスには、フィトエストロゲンを含まないオートクレーブしたＡＩＮ７６－Ａ餌（Ｔｅｋ Ｇｌｏｂａｌ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および水を、自由に摂取させた。このプロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ｄｅｌ Ｃａｒｉｂｅ ＩＡＣＵＣによって承認された。細胞接種は、本発明者らが過去に記載した通り実施した（ＰＭＩＤ：２０５１７６３７、ＰＭＩＤ：２３４６８９８８、ＰＭＩＤ：２６９５８０８５、ＰＭＩＤ：３０５４２５０７、ＰＭＩＤ：３１６５８６４３）。マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＧＦＰ細胞（５×１０５）を、乳房脂肪体に注射した。腫瘍確立後に、動物を、対照群および実験群に無作為に分けた。処置は、接種後、腫瘍が約１００ｍｍ３になった５週目に開始した。ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８匹／群）に、ビヒクル（１×ＰＢＳ中１０％ＥＴＯＨ）、１００ｕＬ体積中１００ｍｇ／ｋｇのＢＷエルゴステロールペルオキシドを週３回ｉ．ｐ．注射した。
１．実験デザイン
雌の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（２１日齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、特定病原体除去条件下で収容した。マウスには、フィトエストロゲンを含まないオートクレーブしたＡＩＮ７６－Ａ餌（Ｔｅｋ Ｇｌｏｂａｌ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および水を、自由に摂取させた。このプロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ｄｅｌ Ｃａｒｉｂｅ ＩＡＣＵＣによって承認された。細胞接種は、本発明者らが過去に記載した通り実施した（ＰＭＩＤ：２０５１７６３７、ＰＭＩＤ：２３４６８９８８、ＰＭＩＤ：２６９５８０８５、ＰＭＩＤ：３０５４２５０７、ＰＭＩＤ：３１６５８６４３）。マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＧＦＰ細胞（５×１０５）を、乳房脂肪体に注射した。腫瘍確立後に、動物を、対照群および実験群に無作為に分けた。処置は、接種後、腫瘍が約１００ｍｍ３になった５週目に開始した。ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８匹／群）に、ビヒクル（１×ＰＢＳ中１０％ＥＴＯＨ）、１００ｕＬ体積中１００ｍｇ／ｋｇのＢＷエルゴステロールペルオキシドを週３回ｉ．ｐ．注射した。
【0160】
２．生体内イメージング
マウスを、腫瘍確立後およびその後週１回、画像化した。腫瘍進行を、ＵＶＰ ｉＢｏｘ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）で撮影した蛍光画像分析によってモニタリングし、ＰＭＩＤ：２０５１７６３７の通り定量した。相対的な腫瘍成長を、イメージング当日に各腫瘍の蛍光強度として計算した。腫瘍進行についての定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用し、処置投与の０１日目（５週目）の同じ腫瘍の蛍光強度に対する、処置した各腫瘍の蛍光強度を使用して計算した。
マウスを、腫瘍確立後およびその後週１回、画像化した。腫瘍進行を、ＵＶＰ ｉＢｏｘ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）で撮影した蛍光画像分析によってモニタリングし、ＰＭＩＤ：２０５１７６３７の通り定量した。相対的な腫瘍成長を、イメージング当日に各腫瘍の蛍光強度として計算した。腫瘍進行についての定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用し、処置投与の０１日目（５週目）の同じ腫瘍の蛍光強度に対する、処置した各腫瘍の蛍光強度を使用して計算した。
【0161】
３．統計的分析
統計単位としての計画対象期間（time horizon）を説明するために、一般線形モデル反復測定ＡＮＯＶＡ手法を使用した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後試験を多重比較のために使用し、有意レベル（α）は≦０．０５に設定した。
統計単位としての計画対象期間（time horizon）を説明するために、一般線形モデル反復測定ＡＮＯＶＡ手法を使用した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後試験を多重比較のために使用し、有意レベル（α）は≦０．０５に設定した。
【0162】
結果については、図１６（Ａ、Ｂ）を参照されたい。
【0163】
材料および方法
Ａ．実験化学手順
１．一般情報：
粉末化Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物（ＧＬＥ）子実体および破砕した胞子からなる、商業的に入手可能な丸ごとのキノコであるＲｅｉｓｈｉＭａｘ ＧＬｐ（商標）（Ｐｈａｒｍａｎｅｘ Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｖｏ、ＵＴ）のカプセル（５００ｍｇ）を使用した［１２～１４］。すべての操作を、別段の注記がない限り、不活性ガス雰囲気下で行った。無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、トルエン（ＰｈＣＨ３）、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、メタノール（ＭＥＯＨ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、溶媒乾燥系から得た。入手可能な最高の質の試薬を、商業的に購入し、別段記述されない限りさらなる精製なしに使用した。標題化合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって、Ｅ．Ｍｅｒｃｋのシリカゲル（６０、粒径０．０４０～０．０６３ｍｍｏｌ）またはＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｆｏｕｒと共に順相シリカゲルを使用して精製した。反応を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、０．２５ｍｍｏｌのＥ．Ｍｅｒｃｋのシリカゲルプレート（６０Ｆ－２５４）上で、可視化のためのＵＶ光およびアニスアルデヒドのエタノール溶液、またはＰＭＡ、ＣＡＭ溶液および展開剤としての熱を使用してモニタリングした。また、反応を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣＭＳおよび低共鳴エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モデルと共に２５４ｎｍにおけるＵＶ検出を使用することによってモニタリングした。合成した化合物の構造を、４００または５００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ＮＭＲで記録した１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲによって確認した。化学シフトを、溶媒残留ピークに対してｐｐｍで報告した（ＣＨＣｌ３：１Ｈについて７．２６ｐｐｍ、１３Ｃについて７７．２ｐｐｍ；アセトン－ｄ６：１Ｈについて２．０５ｐｐｍ、１３Ｃについて２９．９ｐｐｍ；ピリジンｄ５：１Ｈについて２．５０ｐｐｍ、１３Ｃについて３９．５ｐｐｍ）。データを、以下の通り報告する。化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｕｉｎｔ＝五重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード）、カップリング定数（Ｈｚ）、および積分値。データを、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａを使用することによって処理した。旋光度を、ＤＣＩＦ偏光計（ＪＡＳＣＯ Ｐ－１０１０）で、経路長１００ｍｍを有する２ｍＬセルを使用して測定した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳＩ－ＴＯＦ（飛行時間）質量分析計で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）もしくはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用して、またはＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴｏＦ質量分析計で記録した。化合物を、ＥＳＩをポジティブイオンモードで使用することによって分析した。合成した各化合物の純度を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ－ＭＳシステムで、Ｃ１８逆相カラムを使用し、０．１％ギ酸／水－０．１％ギ酸／アセトニトリルを溶媒として使用して決定した。合成したすべての化合物は、分析用ＨＰＬＣおよびＮＭＲに基づいて、少なくとも９５％純粋であった。化学的収率は、精製した化合物について言及するものである（１Ｈ－ＮＭＲ）。
Ａ．実験化学手順
１．一般情報：
粉末化Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ抽出物（ＧＬＥ）子実体および破砕した胞子からなる、商業的に入手可能な丸ごとのキノコであるＲｅｉｓｈｉＭａｘ ＧＬｐ（商標）（Ｐｈａｒｍａｎｅｘ Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｖｏ、ＵＴ）のカプセル（５００ｍｇ）を使用した［１２～１４］。すべての操作を、別段の注記がない限り、不活性ガス雰囲気下で行った。無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、トルエン（ＰｈＣＨ３）、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、メタノール（ＭＥＯＨ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、溶媒乾燥系から得た。入手可能な最高の質の試薬を、商業的に購入し、別段記述されない限りさらなる精製なしに使用した。標題化合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって、Ｅ．Ｍｅｒｃｋのシリカゲル（６０、粒径０．０４０～０．０６３ｍｍｏｌ）またはＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｆｏｕｒと共に順相シリカゲルを使用して精製した。反応を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、０．２５ｍｍｏｌのＥ．Ｍｅｒｃｋのシリカゲルプレート（６０Ｆ－２５４）上で、可視化のためのＵＶ光およびアニスアルデヒドのエタノール溶液、またはＰＭＡ、ＣＡＭ溶液および展開剤としての熱を使用してモニタリングした。また、反応を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣＭＳおよび低共鳴エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モデルと共に２５４ｎｍにおけるＵＶ検出を使用することによってモニタリングした。合成した化合物の構造を、４００または５００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ＮＭＲで記録した１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲによって確認した。化学シフトを、溶媒残留ピークに対してｐｐｍで報告した（ＣＨＣｌ３：１Ｈについて７．２６ｐｐｍ、１３Ｃについて７７．２ｐｐｍ；アセトン－ｄ６：１Ｈについて２．０５ｐｐｍ、１３Ｃについて２９．９ｐｐｍ；ピリジンｄ５：１Ｈについて２．５０ｐｐｍ、１３Ｃについて３９．５ｐｐｍ）。データを、以下の通り報告する。化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｕｉｎｔ＝五重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード）、カップリング定数（Ｈｚ）、および積分値。データを、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａを使用することによって処理した。旋光度を、ＤＣＩＦ偏光計（ＪＡＳＣＯ Ｐ－１０１０）で、経路長１００ｍｍを有する２ｍＬセルを使用して測定した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳＩ－ＴＯＦ（飛行時間）質量分析計で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）もしくはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用して、またはＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－ＴｏＦ質量分析計で記録した。化合物を、ＥＳＩをポジティブイオンモードで使用することによって分析した。合成した各化合物の純度を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ－ＰＤＡ－ＥＬＳＤ－ＭＳシステムで、Ｃ１８逆相カラムを使用し、０．１％ギ酸／水－０．１％ギ酸／アセトニトリルを溶媒として使用して決定した。合成したすべての化合物は、分析用ＨＰＬＣおよびＮＭＲに基づいて、少なくとも９５％純粋であった。化学的収率は、精製した化合物について言及するものである（１Ｈ－ＮＭＲ）。
【0164】
２．ＧＬＥからの生理活性の分別（画分１～１００）
Ｔｕによって過去に記載された通り［１５］、分取ＨＰＬＣによる分離を、Ｇｅｍｉｎｉ ５μｍ Ｃ１８ １１０Ａカラム（３０×５０ｍｍ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で実施した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８Ａバイナリ分取ポンプと共にＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０Ａ ＶＰシステムコントローラーを、Ｇｉｌｓｏｎ ２１５オートサンプラーおよびＧｉｌｓｏｎ ２１５画分収集器（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）に接続した。検出は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオード－アレイ検出器およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＥＬＳＤ－ＬＴ ＩＩ蒸発光散乱検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）によって実施した。移動相は、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）：０分、９８：２；０．５分、９８：２；６．５分、０：１００；１２．３分、０：１００；１２．５分、９８：２；１２．９５分、停止からなっていた。流量は２５ｍＬ／分であった。簡潔には、画分（Ａ－画分１～６、Ｂ－画分７～９、Ｃ－画分１０～１７、Ｄ－画分１８～３１、Ｅ－画分３２～４１、Ｆ－画分４２～１００）を収集し、質量スペクトルデータに基づいて組み合わせ、それらのＴＬＣプロファイルおよび生物学的特性を評価した。
Ｔｕによって過去に記載された通り［１５］、分取ＨＰＬＣによる分離を、Ｇｅｍｉｎｉ ５μｍ Ｃ１８ １１０Ａカラム（３０×５０ｍｍ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で実施した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８Ａバイナリ分取ポンプと共にＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０Ａ ＶＰシステムコントローラーを、Ｇｉｌｓｏｎ ２１５オートサンプラーおよびＧｉｌｓｏｎ ２１５画分収集器（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）に接続した。検出は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオード－アレイ検出器およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＥＬＳＤ－ＬＴ ＩＩ蒸発光散乱検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）によって実施した。移動相は、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）：０分、９８：２；０．５分、９８：２；６．５分、０：１００；１２．３分、０：１００；１２．５分、９８：２；１２．９５分、停止からなっていた。流量は２５ｍＬ／分であった。簡潔には、画分（Ａ－画分１～６、Ｂ－画分７～９、Ｃ－画分１０～１７、Ｄ－画分１８～３１、Ｅ－画分３２～４１、Ｆ－画分４２～１００）を収集し、質量スペクトルデータに基づいて組み合わせ、それらのＴＬＣプロファイルおよび生物学的特性を評価した。
【0165】
３．エルゴステロール（化合物４）および５，６－デヒドロエルゴステロール（化合物５）の結晶構造
画分９８および９９（収集した１０３の画分のうち）が沈殿し、結晶を、Ｃｕ Ｋα放射線（λ＝１．５４７８）を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｋａｐｐａ ＡＰＥＸ－ＩＩ ＣＣＤ回折計で実行される単結晶回折研究のために収集した。対象化合物の結晶を、酢酸エチル３５０μＬに試料およそ１ｍｇを溶解することによって成長させ、次に、それを数日にわたってペンタンと共に蒸気拡散させた。０．１１４×０．０８５×０．０７６ｍｍの無色ブロック片を、Ｐａｒａｔｏｎｅ油でＣｒｙｏｌｏｏｐにマウントした。データを、φおよびω走査を使用して、窒素ガスストリーム中１００（２）Ｋで収集した。結晶と検出器の間の距離は４０ｍｍとし、θに応じて様々な曝露時間（１０秒～６０秒）を使用し、走査幅１．０°を用いた。データ収集は、６７．６１４°のθまでで９６．２％完了した（０．８３Å）。指数－１２≦ｈ≦１２、－８≦ｋ≦８、－４０≦ｌ≦４０をカバーする、合計３７７５８の反射を収集した。合計８９７０の反射が、Ｒｉｎｔ０．０５８２で対称独立であることが見出された。指数付けおよび単位格子の精密化により、基本単斜格子が示された。空間群はＰ２１であることが見出された。データを、Ｂｒｕｋｅｒ ＳＡＩＮＴソフトウェアプログラムを使用することによって積分し、ＳＡＤＡＢＳソフトウェアプログラムを使用することによって調整した（ｓｃａｌｅ）。直接法（ＳＨＥＬＸＴ）によって解くと、提唱された構造と一致する完全位相モデルが生成された。
画分９８および９９（収集した１０３の画分のうち）が沈殿し、結晶を、Ｃｕ Ｋα放射線（λ＝１．５４７８）を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｋａｐｐａ ＡＰＥＸ－ＩＩ ＣＣＤ回折計で実行される単結晶回折研究のために収集した。対象化合物の結晶を、酢酸エチル３５０μＬに試料およそ１ｍｇを溶解することによって成長させ、次に、それを数日にわたってペンタンと共に蒸気拡散させた。０．１１４×０．０８５×０．０７６ｍｍの無色ブロック片を、Ｐａｒａｔｏｎｅ油でＣｒｙｏｌｏｏｐにマウントした。データを、φおよびω走査を使用して、窒素ガスストリーム中１００（２）Ｋで収集した。結晶と検出器の間の距離は４０ｍｍとし、θに応じて様々な曝露時間（１０秒～６０秒）を使用し、走査幅１．０°を用いた。データ収集は、６７．６１４°のθまでで９６．２％完了した（０．８３Å）。指数－１２≦ｈ≦１２、－８≦ｋ≦８、－４０≦ｌ≦４０をカバーする、合計３７７５８の反射を収集した。合計８９７０の反射が、Ｒｉｎｔ０．０５８２で対称独立であることが見出された。指数付けおよび単位格子の精密化により、基本単斜格子が示された。空間群はＰ２１であることが見出された。データを、Ｂｒｕｋｅｒ ＳＡＩＮＴソフトウェアプログラムを使用することによって積分し、ＳＡＤＡＢＳソフトウェアプログラムを使用することによって調整した（ｓｃａｌｅ）。直接法（ＳＨＥＬＸＴ）によって解くと、提唱された構造と一致する完全位相モデルが生成された。
【0166】
すべての非水素原子を、完全行列最小二乗法（ＳＨＥＬＸＬ－２０１４）によって異方的に精密化した。すべての水素原子を、騎乗モデル（riding model）を使用して置いた。それらの位置を、ＳＨＥＬＸＬ－２０１４において適したＨＦＩＸコマンドを使用することによって、それらの親原子に対して拘束した。分子の絶対立体化学を、Ｐａｒｓｏｎの方法を使用し、Ｆｌａｃｋパラメータ０．００２（２３０）を用いて異常分散によって確立した。結晶学的データは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＤＣ番号１４４２０２８）で保管された。
【0167】
Ｂ．細胞実験手順
１．細胞培養：
細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＬｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入し、抗生物質なしに、または供給者によって特定される通り培養した。すべての細胞系を３７℃でインキュベートし、適切な無菌細胞培養術に従って、５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で維持した［１６］。患者由来のトリプルネガティブＩＢＣ細胞系ＳＵＭ－１４９［１７］およびＥＲ／ＰＲ－ネガティブ／ＨＥＲ２－ポジティブＳＵＭ－１９０細胞系（Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ Ｅｔｈｉｅｒ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａによって寄贈された；共にＡｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩで入手可能）を、それぞれ、［１２、１４］の通り１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むハムＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および２％ＦＢＳを含むハムＦ１２培地で培養した。接着細胞を、別段特定されない限り８０％～９０％コンフルエンスまで成長させ、懸濁細胞を、使用前にＡｓｔｅｒａｎｄ、ＡＴＣＣ、またはＤＳＭＺによって推奨される密度まで成長させた。ＢＪ（ＣＲＬ－２５２２、正常ヒト包皮線維芽細胞）、ＭＣＦ－７（ＨＴＢ－２２、ヒト乳癌）を、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＴＢ－２６、ヒト乳癌、トリプルネガティブ乳がん）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養した。懸濁細胞ＫＯＰＮ８（ＭＬＬ－ＭＬＬｔ１／ＥＮＬ融合を伴う乳幼児ヒトＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病）、ＵｏＣ－Ｂ１（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｖａｎｓによって寄贈された）、ＳＵＰ－Ｂ１５（ＡＣＣ３８９）、ＮＡＬＭ－０６（ＡＣＣ１２８）またはＢＣＲ－ＡＢＬ（ＢＣＲ－ＡＢＬ融合を伴う小児再発ＡＬＬのマウスＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）マイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を用いて製造者の条件を使用することによって試験し、それらはネガティブとみなされた。細胞系は、ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）によって認証された。
１．細胞培養：
細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＬｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）から購入し、抗生物質なしに、または供給者によって特定される通り培養した。すべての細胞系を３７℃でインキュベートし、適切な無菌細胞培養術に従って、５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で維持した［１６］。患者由来のトリプルネガティブＩＢＣ細胞系ＳＵＭ－１４９［１７］およびＥＲ／ＰＲ－ネガティブ／ＨＥＲ２－ポジティブＳＵＭ－１９０細胞系（Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ Ｅｔｈｉｅｒ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａによって寄贈された；共にＡｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩで入手可能）を、それぞれ、［１２、１４］の通り１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むハムＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および２％ＦＢＳを含むハムＦ１２培地で培養した。接着細胞を、別段特定されない限り８０％～９０％コンフルエンスまで成長させ、懸濁細胞を、使用前にＡｓｔｅｒａｎｄ、ＡＴＣＣ、またはＤＳＭＺによって推奨される密度まで成長させた。ＢＪ（ＣＲＬ－２５２２、正常ヒト包皮線維芽細胞）、ＭＣＦ－７（ＨＴＢ－２２、ヒト乳癌）を、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＴＢ－２６、ヒト乳癌、トリプルネガティブ乳がん）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養した。懸濁細胞ＫＯＰＮ８（ＭＬＬ－ＭＬＬｔ１／ＥＮＬ融合を伴う乳幼児ヒトＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病）、ＵｏＣ－Ｂ１（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｖａｎｓによって寄贈された）、ＳＵＰ－Ｂ１５（ＡＣＣ３８９）、ＮＡＬＭ－０６（ＡＣＣ１２８）またはＢＣＲ－ＡＢＬ（ＢＣＲ－ＡＢＬ融合を伴う小児再発ＡＬＬのマウスＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）マイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を用いて製造者の条件を使用することによって試験し、それらはネガティブとみなされた。細胞系は、ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）によって認証された。
【0168】
２．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ生存アッセイ（ＣＴＧ）
１×１０３～４．８×１０３または４×１０２～１．２×１０３の細胞のいずれかを、それぞれ、９６ウェルまたは３８４ウェル白色ポリスチレン平底プレート（３６１０または８８０４ＢＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルの、１ウェル当たり１００μＬまたは３０μＬの培地に播種した。使用した濃度は、実験期間中に対数成長を確保し、ＤＭＳＯ曝露による細胞成長に対する有害効果を防止することが実験的に決定された。プレートを、処理前に５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。９つの３倍系列希釈の試験化合物のストック溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、ピンツール（Ｂｉｏｍｅｋ）により分注した。ＤＭＳＯの最終濃度は、各ウェル中０．３％（ｖ／ｖ）であった。プレートを、５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートし、次にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（９６ウェルプレート中５０μＬ／ウェル、３８４ウェルプレート中３０μＬ／ウェル）でＲＴにおいてクエンチした。陽性対照には、スタウロスポリン（１０μＭ）、ガンボギン酸（１０μＭ）、および社内で作製した毒性キノリンが含まれていた。次に、プレートをＲＴで２０分間インキュベートし、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。細胞傷害アッセイを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存アッセイキット（Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用することによって、製造者の指示に従って実施した。発光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で記録した。
１×１０３～４．８×１０３または４×１０２～１．２×１０３の細胞のいずれかを、それぞれ、９６ウェルまたは３８４ウェル白色ポリスチレン平底プレート（３６１０または８８０４ＢＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルの、１ウェル当たり１００μＬまたは３０μＬの培地に播種した。使用した濃度は、実験期間中に対数成長を確保し、ＤＭＳＯ曝露による細胞成長に対する有害効果を防止することが実験的に決定された。プレートを、処理前に５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。９つの３倍系列希釈の試験化合物のストック溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、ピンツール（Ｂｉｏｍｅｋ）により分注した。ＤＭＳＯの最終濃度は、各ウェル中０．３％（ｖ／ｖ）であった。プレートを、５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートし、次にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（９６ウェルプレート中５０μＬ／ウェル、３８４ウェルプレート中３０μＬ／ウェル）でＲＴにおいてクエンチした。陽性対照には、スタウロスポリン（１０μＭ）、ガンボギン酸（１０μＭ）、および社内で作製した毒性キノリンが含まれていた。次に、プレートをＲＴで２０分間インキュベートし、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。細胞傷害アッセイを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存アッセイキット（Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用することによって、製造者の指示に従って実施した。発光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で記録した。
【0169】
３．ＡｐｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）Ｔｒｉｐｌｅｘアッセイ
細胞（新しい培地７５μＬ中９．５×１０４／ウェル）を、９６ウェル黒色平底（８８０７ＢＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）プレートに分注した。細胞を、３７℃で１２時間インキュベートし、次に化合物（２５μＬ）で２４時間処理した。ＤＭＳＯを陰性対照として使用し、スタウロスポリンを陽性対照として使用した。生存／細胞傷害試薬を添加することによって実験を停止し、オービタルシェーカーによって簡潔に混合した（３００～５００ｒｐｍで約３０秒間）。プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで、以下の２つの波長の組：４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（生存）４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（細胞傷害）において測定した。次に、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を添加し、プレートを、オービタルシェーカーによって簡潔に混合し（３００～５００ｒｐｍで約３０秒間）、次にＲＴでさらに３０分間インキュベートした。次に、カスパーゼ３／７活性化と相関する発光を、プレートリーダーで記録して、アポトーシス誘導を決定した。
細胞（新しい培地７５μＬ中９．５×１０４／ウェル）を、９６ウェル黒色平底（８８０７ＢＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）プレートに分注した。細胞を、３７℃で１２時間インキュベートし、次に化合物（２５μＬ）で２４時間処理した。ＤＭＳＯを陰性対照として使用し、スタウロスポリンを陽性対照として使用した。生存／細胞傷害試薬を添加することによって実験を停止し、オービタルシェーカーによって簡潔に混合した（３００～５００ｒｐｍで約３０秒間）。プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで、以下の２つの波長の組：４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（生存）４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（細胞傷害）において測定した。次に、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を添加し、プレートを、オービタルシェーカーによって簡潔に混合し（３００～５００ｒｐｍで約３０秒間）、次にＲＴでさらに３０分間インキュベートした。次に、カスパーゼ３／７活性化と相関する発光を、プレートリーダーで記録して、アポトーシス誘導を決定した。
【0170】
４．細胞生存アッセイ：
ＳＵＭ－１４９、ＳＵＭ－１９０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＣＦ１０Ａ細胞において、本発明者らが過去に記載した通り［１４］、細胞生存アッセイ（ＭＴＴまたはＰＩ染色アッセイ）を実施した。
ＳＵＭ－１４９、ＳＵＭ－１９０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＣＦ１０Ａ細胞において、本発明者らが過去に記載した通り［１４］、細胞生存アッセイ（ＭＴＴまたはＰＩ染色アッセイ）を実施した。
【0171】
５．コロニー形成アッセイ：
ＳＵＭ－１４９細胞（１．５×１０６細胞／ウェル）を、６ウェルプレートに蒔いた。２日後、細胞培地を５％ＦＢＳに変更し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で１時間インキュベートした後、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）またはＥＰ（５～４０μＭ）を添加した。７２時間の処理後に、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレート中１ウェル当たり２００細胞／ｍＬで再び播種した。１０日間培養した後、コロニーを、クリスタルバイオレット染色によって可視化し、コロニー数を、顕微鏡下でカウントした。
ＳＵＭ－１４９細胞（１．５×１０６細胞／ウェル）を、６ウェルプレートに蒔いた。２日後、細胞培地を５％ＦＢＳに変更し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で１時間インキュベートした後、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）またはＥＰ（５～４０μＭ）を添加した。７２時間の処理後に、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレート中１ウェル当たり２００細胞／ｍＬで再び播種した。１０日間培養した後、コロニーを、クリスタルバイオレット染色によって可視化し、コロニー数を、顕微鏡下でカウントした。
【0172】
６．新規細胞内タンパク質合成：
まず、２．５×１０４細胞／ウェルを、８ウェルのμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ（登録商標）、番号８０８２６）に播種し、３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を、ビヒクル、化合物ガノデリン酸Ａ、すなわちＥＰ、またはシクロヘキシミド（陽性対照）で２時間処理して、ＢｉｏｖｉｓｉｏｎのＥＺＣｌｉｃｋ（商標）Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（番号Ｋ７１５－１００、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して作製した新生タンパク質としてタンパク質合成を決定した。アッセイは、アルキンを含有するｏ－プロパルギル－ピューロマイシン（ＯＰ－ｐｕｒｏ）プローブに基づくロバストな化学的方法を含み、それによって、新生ポリペプチド鎖と共有結合性コンジュゲートを形成することによって翻訳を停止させる。トランケートされたポリペプチドは、プロテアソームによって急速にターンオーバーし、その後の蛍光性アジドとのクリック反応に基づいて検出することができる。反応は、製造者のプロトコールに従って実行した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２走査型共焦点顕微鏡を用いて２０倍で画像化し、画像モンタージュ全体を、Ｇｅｎ５ソフトウェアおよびＬｉｏｎｈｅａｒｔ（商標）ＦＸ自動化顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用することによって定量した。
まず、２．５×１０４細胞／ウェルを、８ウェルのμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ（登録商標）、番号８０８２６）に播種し、３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を、ビヒクル、化合物ガノデリン酸Ａ、すなわちＥＰ、またはシクロヘキシミド（陽性対照）で２時間処理して、ＢｉｏｖｉｓｉｏｎのＥＺＣｌｉｃｋ（商標）Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（番号Ｋ７１５－１００、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して作製した新生タンパク質としてタンパク質合成を決定した。アッセイは、アルキンを含有するｏ－プロパルギル－ピューロマイシン（ＯＰ－ｐｕｒｏ）プローブに基づくロバストな化学的方法を含み、それによって、新生ポリペプチド鎖と共有結合性コンジュゲートを形成することによって翻訳を停止させる。トランケートされたポリペプチドは、プロテアソームによって急速にターンオーバーし、その後の蛍光性アジドとのクリック反応に基づいて検出することができる。反応は、製造者のプロトコールに従って実行した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｃ２走査型共焦点顕微鏡を用いて２０倍で画像化し、画像モンタージュ全体を、Ｇｅｎ５ソフトウェアおよびＬｉｏｎｈｅａｒｔ（商標）ＦＸ自動化顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用することによって定量した。
【0173】
７．活性酸素種（ＲＯＳ）測定：
ＳＵＭ－１４９またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、黒色９６ウェル透明底組織培養プレート中、それぞれ２×１０４および１×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で２４時間インキュベートした。ｍＲｕｂｙ－Ｍｉｔｏ－７プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから得た（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄａｖｉｄｓｏｎから番号５５８７４）。ＭＣＦ－７の安定なクローンを、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用することによって作製して、ネオマイシン選択下で細胞（２×１０５）にプラスミド（２．０μｇ）をトランスフェクトした。安定な細胞系を、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍＬ）を使用して２週間にわたって選択し、フローサイトメトリーによって分類し、その後Ｇ４１８の下で維持した。トランスフェクトされたＭＣＦ－７細胞を、黒色９６ウェル透明底組織培養プレート中、２×１０４細胞／ウェルの密度で蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。ＲＯＳの形成について試験し、バックグラウンドを除去するために、細胞に、２％ＦＢＳを含む新しいＰＢＳを供給し、所望の化合物で３７℃において１時間処理した。ＤＭＳＯ（０．５％）を陰性対照として使用する一方で、メナジオン（Ｍｅｎａ、１０μＭにおける）または１００μＭ最終濃度におけるｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）を陽性対照として使用した。ＲＯＳ形成阻害に対する化合物の効果を評価するために、フリーラジカルスカベンジャーであるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を使用した。細胞を、ＮＡＣ（５００μＭまたは１００μＭ）と共に、またはそれなしに１時間処理し、次にＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）緑色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ番号Ｃ１０４４４）を、最終濃度５μＭまで添加し、細胞を、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて４％パラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）で１５分間固定し、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。蛍光強度を、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ（登録商標）プレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）で５３５ｎｍにおいて測定した。
ＳＵＭ－１４９またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、黒色９６ウェル透明底組織培養プレート中、それぞれ２×１０４および１×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で２４時間インキュベートした。ｍＲｕｂｙ－Ｍｉｔｏ－７プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから得た（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄａｖｉｄｓｏｎから番号５５８７４）。ＭＣＦ－７の安定なクローンを、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用することによって作製して、ネオマイシン選択下で細胞（２×１０５）にプラスミド（２．０μｇ）をトランスフェクトした。安定な細胞系を、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍＬ）を使用して２週間にわたって選択し、フローサイトメトリーによって分類し、その後Ｇ４１８の下で維持した。トランスフェクトされたＭＣＦ－７細胞を、黒色９６ウェル透明底組織培養プレート中、２×１０４細胞／ウェルの密度で蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。ＲＯＳの形成について試験し、バックグラウンドを除去するために、細胞に、２％ＦＢＳを含む新しいＰＢＳを供給し、所望の化合物で３７℃において１時間処理した。ＤＭＳＯ（０．５％）を陰性対照として使用する一方で、メナジオン（Ｍｅｎａ、１０μＭにおける）または１００μＭ最終濃度におけるｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）を陽性対照として使用した。ＲＯＳ形成阻害に対する化合物の効果を評価するために、フリーラジカルスカベンジャーであるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を使用した。細胞を、ＮＡＣ（５００μＭまたは１００μＭ）と共に、またはそれなしに１時間処理し、次にＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）緑色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ番号Ｃ１０４４４）を、最終濃度５μＭまで添加し、細胞を、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて４％パラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）で１５分間固定し、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。蛍光強度を、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ（登録商標）プレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）で５３５ｎｍにおいて測定した。
【0174】
８．細胞周期アッセイ：
ＳＵＭ－１４９細胞を、ＥＰで４８時間処理し、次に収集し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞（５×１０５）を固定し、さらに分析するまで、７０％エタノール中で－２０℃において透過処理した。ＤＮＡ含量を測定するために、細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１５０μＬに再懸濁させ、次に１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）１００μＬ中でＲＴにおいて１５分間インキュベートし、次に５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）２５０μＬを添加した。試料をＲＴで１０分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ１０、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。
ＳＵＭ－１４９細胞を、ＥＰで４８時間処理し、次に収集し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞（５×１０５）を固定し、さらに分析するまで、７０％エタノール中で－２０℃において透過処理した。ＤＮＡ含量を測定するために、細胞を洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１５０μＬに再懸濁させ、次に１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）１００μＬ中でＲＴにおいて１５分間インキュベートし、次に５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）２５０μＬを添加した。試料をＲＴで１０分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ１０、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。
【0175】
９．アネキシンＶアポトーシス検出：
ＳＵＭ－１４９細胞（５×１０５）を播種し、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）、または２０μＭのＥＰもしくは陽性対照としてのピューロマイシン（２００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで４８時間処理した。処理後に浮遊細胞を収集し、すべての細胞を回収し、カウントした。処理した細胞を、ＦＩＴＣアネキシン－Ｖ／７ＡＡＤアポトーシス検出キット（製品番号６４０９２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造者の指示に従って使用することによって、細胞死について分析した。簡潔には、細胞を、アネキシン結合緩衝液に再懸濁させ、アネキシンＶ－ＦＩＴＣおよび／または７－ＡＡＤで染色し、４℃で３０分間インキュベートした。データを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ血球計数器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ１０、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用することによって分析した。
ＳＵＭ－１４９細胞（５×１０５）を播種し、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）、または２０μＭのＥＰもしくは陽性対照としてのピューロマイシン（２００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで４８時間処理した。処理後に浮遊細胞を収集し、すべての細胞を回収し、カウントした。処理した細胞を、ＦＩＴＣアネキシン－Ｖ／７ＡＡＤアポトーシス検出キット（製品番号６４０９２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造者の指示に従って使用することによって、細胞死について分析した。簡潔には、細胞を、アネキシン結合緩衝液に再懸濁させ、アネキシンＶ－ＦＩＴＣおよび／または７－ＡＡＤで染色し、４℃で３０分間インキュベートした。データを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ血球計数器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ１０、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用することによって分析した。
【0176】
１０．遊走および浸潤アッセイ：
細胞遊走および浸潤を、［１２、１４］に記載される通り、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（商標）細胞培養インサートを使用し、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤アッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実施することによって測定した。
細胞遊走および浸潤を、［１２、１４］に記載される通り、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（商標）細胞培養インサートを使用し、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤アッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実施することによって測定した。
【0177】
１１．免疫ブロット：
ビヒクルまたはＥＰで処理した乳がん細胞を溶解し、等しい全タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、過去に記載される通り［１２、１４、１８］、示された抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｂｃａｍ、Ｓｉｇｍａ）で免疫ブロットした。
ビヒクルまたはＥＰで処理した乳がん細胞を溶解し、等しい全タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、過去に記載される通り［１２、１４、１８］、示された抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｂｃａｍ、Ｓｉｇｍａ）で免疫ブロットした。
【0178】
Ｃ．統計的分析：
ＣＴＧアッセイについては、実験条件ごとに３回反復または４回反復アッセイを実行し、細胞アッセイのために最低３回の独立した実験を実行した。各実験処理群の平均発光を、未処理対照の平均強度の百分率として正規化した。ＥＣ５０値（μＭ）を、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって計算した。生存アッセイからのＥＣ５０値（μＭ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することによって、用量反応曲線フィットから非線形回帰により計算した。細胞生存率、コロニー形成、細胞周期進行、細胞死、およびウエスタンブロットアッセイについては、分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用することによって、条件（濃度、細胞周期段階、アポトーシス事象、細胞系）ごとに事後検定を用いて一元または二元ＡＮＯＶＡにより実施した。
ＣＴＧアッセイについては、実験条件ごとに３回反復または４回反復アッセイを実行し、細胞アッセイのために最低３回の独立した実験を実行した。各実験処理群の平均発光を、未処理対照の平均強度の百分率として正規化した。ＥＣ５０値（μＭ）を、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって計算した。生存アッセイからのＥＣ５０値（μＭ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することによって、用量反応曲線フィットから非線形回帰により計算した。細胞生存率、コロニー形成、細胞周期進行、細胞死、およびウエスタンブロットアッセイについては、分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用することによって、条件（濃度、細胞周期段階、アポトーシス事象、細胞系）ごとに事後検定を用いて一元または二元ＡＮＯＶＡにより実施した。
【0179】
表１．ＣＴＧアッセイによるＥＰプローブの細胞傷害。ＥＣ５０値は３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表される。
引用された刊行物
これらの刊行物は、本明細書に開示される材料および方法に関する範囲で、参照により組み込まれる。
ＧＬＣ化合物
ＥＰプローブ
【表1】
これらの刊行物は、本明細書に開示される材料および方法に関する範囲で、参照により組み込まれる。
ＧＬＣ化合物
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】